ES2727103T3

ES2727103T3 - Conjugado anticuerpo-fármaco para IGF-1R y su utilización para el tratamiento del cáncer

Info

Publication number: ES2727103T3
Application number: ES15720045T
Authority: ES
Inventors: Ian Rilatt; Michel Perez; Liliane Goetsch; Matthieu Broussas; Charlotte Beau-Larvor; Jean-François Haeuw; Thierry Champion; Alain Robert
Original assignee: Pierre Fabre Medicament SA
Current assignee: Pierre Fabre Medicament SA
Priority date: 2014-04-25
Filing date: 2015-04-27
Publication date: 2019-10-14
Anticipated expiration: 2035-04-27
Also published as: HRP20190888T1; US10633448B2; CN106456800B; WO2015162291A1; CA2946469C; MA47811A; PT3134124T; BR112016024619A2; RU2016145444A; US20170043031A1; IL248455A0; UA120364C2; SI3134124T1; US11661457B2; DK3134124T3; EP3498301A1; TN2016000472A1; CA2946469A1; PL3134124T3; CY1121783T1

Abstract

Conjugado anticuerpo-fármaco de la fórmula (I) siguiente: Ab-(L-D)n (I) o sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que Ab es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, apto para unirse al IGF-1R humano, comprendiendo dicho anticuerpo las tres CDR de cadena pesada de secuencia SEC ID nº 1, 2 y 3 y las tres CDR de cadena ligera de secuencia SEC ID nº 4, 5 y 6; L es un ligador; D es una porción de fármaco de la fórmula (II) siguiente: **Fórmula** en el que: R2 es COOH, COOCH3 o tiazolilo; R3 es H o alquilo (C1-C6); R9 es H o alquilo (C1-C6); m es un número entero comprendido entre 1 y 8; la línea ondulada indica el punto de fijación a L; y n es 1 a 12.

Description

DESCRIPCIÓN

Conjugado anticuerpo-fármaco para IGF-1R y su utilización para el tratamiento del cáncer.

La presente invención se refiere a un conjugado anticuerpo-fármaco apto para unirse a IGF-1R. A partir de un aspecto, la invención se refiere a un conjugado anticuerpo-fármaco que comprende un anticuerpo apto para unirse a IGF-1R, estando dicho anticuerpo conjugado a por lo menos un fármaco seleccionado de entre derivados de dolastatina 10 y auristatinas. La invención comprende asimismo dicho conjugado anticuerpo-fármaco para su utilización en el tratamiento del cáncer y divulga un procedimiento de tratamiento.

Antecedentes de la invención

El receptor del factor 1 de crecimiento similar a la insulina denominado IGF-1R (o en ocasiones IGF1R o IGF-IR) es un receptor con actividad de tirosina cinasa que presenta un 70% de homología con respecto al receptor de insulina IR. El IGF-1R es una glucoproteína con peso molecular de aproximadamente 350.000. Es un receptor hetero-tetramérico en el que cada mitad, unida por puentes disulfuro, se compone de una subunidad-a extracelular y de una subunidad-p transmembranaria. El IGF-1R se une a IGF1 y IGF2 con una muy elevada afinidad (Kd #1 nM) pero es igualmente capaz de unirse a la insulina con una afinidad 100 a 1000 veces menor. Por el contrario, IR se une a la insulina con una afinidad muy elevada aunque los IGF sólo se unen al receptor de insulina con una afinidad 100 veces menor. El dominio tirosina cinasa de IGF-1R y de IR presenta una homología de secuencia muy elevada, aunque las zonas con homología más débil conciernen respectivamente a la región rica en cisteína situada en la subunidad-a y la parte c-terminal de la subunidad-p. Las diferencias en la secuencia observadas en la subunidad-a se sitúan en la zona de unión de los ligandos y, por lo tanto, en el origen de las afinidades relativas de IGF-1R y de IR para los IGF e insulina, respectivamente. Las diferencias en la parte C-terminal de la subunidadp dan como resultado una divergencia en las vías de señalización de los dos receptores; IGF-1R que interviene en los efectos mitogénicos, de diferenciación y antiapoptóticos, mientras que la activación de IR implica principalmente unos efectos a nivel de las vías metabólicas.

Las proteínas de tirosina cinasa citoplásmica se activan mediante la unión del ligando al dominio extracelular del receptor. La activación de las cinasas a su vez implica la estimulación de diferentes sustratos intracelulares, incluyendo IRS-1, IRS-2, Shc y Grb 10. Los dos principales sustratos de IGF-1R son IRS y Shc que intervienen en la activación de numerosos efectores en dirección 3', la mayoría de los efectos de crecimiento y diferenciación están conectados con la fijación de IGF a este receptor. La disponibilidad de sustratos puede dictar, en consecuencia, el efecto biológico final relacionado con la activación de IGF-1R. Cuando predomina IRS-1, las células tienden a proliferar y a transformarse. Cuando Shc domina, las células tienden a diferenciarse. Parece que la vía principalmente involucrada para los efectos de la protección contra la apoptosis, es la vía de fosfatidil-inositol 3-cinasas (PI 3-cinasas).

La función del sistema IGF en la carcinogénesis se ha convertido en un tema de exhaustiva investigación en los últimos diez años. Este interés surgió después del descubrimiento de que además de sus propiedades mitogénicas y antiapoptóticas, IGF-1R parece ser necesario para el establecimiento y mantenimiento de un fenotipo transformado. De hecho, se ha establecido correctamente que una sobreexpresión o una activación constitutiva de IGF-1R conlleva, en una gran variedad de células, una proliferación de las células indistintamente del soporte en medios carentes de suero fetal de ternera, y a la formación de tumores en ratones desnudos. Esto, en sí mismo, no es una propiedad exclusiva ya que una gran variedad de productos de genes sobreexpresados puede transformar las células, incluyendo una gran cantidad de receptores de factores del crecimiento. Sin embargo, el crucial descubrimiento que ha demostrado claramente la principal función desempeñada por IGF-1R en la transformación, ha sido la demostración de que las células iGR-1 R-, en donde el gen que codifica IGF-1R se ha desactivado, son totalmente resistentes a la transformación por diferentes agentes que generalmente pueden transformar células, tales como la proteína E5 del virus del papiloma bovino, una sobreexpresión de EGFR o PDGFR , el antígeno T de SV40, ras activado o la combinación de estos dos últimos factores.

El IGF-1R se expresa en una gran variedad de tumores y estirpes tumorales y los IGF amplifican el crecimiento tumoral a través de su adhesión a IGF-1R. Otros argumentos a favor de la función de IGF-1R en carcinogénesis provienen de estudios que utilizan los anticuerpos monoclonales murinos con especificidad de objetivo hacia el receptor o mediante el uso de dominantes negativos de IGF-1R. En realidad, los anticuerpos monoclonales murinos con especificidad de objetivo hacia IGF-1R inhiben la proliferación de numerosas estirpes celulares en cultivo y el crecimiento de células tumorales in vivo. Así mismo, se ha demostrado que un dominante negativo de IGF-1R resulta apto para inhibir la proliferación tumoral.

Se ha iniciado un gran número de proyectos para desarrollar anticuerpos de IGF-1 R desnudos para el tratamiento de cánceres (por ejemplo el documento WO 2012/142164). Sin embargo, actualmente, no ha resultado exitoso ninguno de estos proyectos y no existen anticuerpos anti-IGF-IR en el mercado.

Además, ha fracasado una serie de ensayos clínicos que implicaron anticuerpos anti-IGF-1R combinados con anticuerpos anti-EGFR para dianizar tanto a EGFR como a IGF-1R, ya que ninguno de estos anticuerpos pudo tratar a los pacientes con KRAS imitante.

Como consecuencia, IGF-1R no se considera actualmente como un objetivo principal y, en la investigación de potenciales anticuerpos terapéuticos, ya no se considera más a IGF-1R como de interés particular.

No obstante, asimismo se debe observar que los intentos de generar anticuerpos IGF-1R se centraron en anticuerpos desnudos, es decir, anticuerpos útiles por sus propiedades intrínsecas. En este sentido, el IGF-1R se considera como un objetivo específico no apto para la generación de un ADC como un conjugado anticuerpofármaco (al que se hace referencia como "ADC") ya que IGF-1R se describe como un objetivo específico expresado asimismo ampliamente por las células normales, incluyendo los vasos sanguíneos. En este sentido, puede observarse que el anticuerpo IGF-1 R más reciente, es decir, AVE1642, se desarrolla como un anticuerpo desnudo no "armado" con un fármaco. Es lo mismo con los otros anticuerpos IGF-1R actualmente en desarrollo y con todos aquellos que fracasaron en los ensayos clínicos.

En este contexto, la invención se refiere a un ADC o conjugado y su utilización para el tratamiento contra el cáncer, y más particularmente, cánceres que expresan IGF-1R.

Los ADC combinan la especificidad de unión de un anticuerpo con la potencia de los fármacos como, por ejemplo, agentes citotóxicos. La tecnología asociada con el desarrollo de anticuerpos monoclonales, la utilización de medicamentos más eficaces y el diseño de ligadores químicos para enlazar covalentemente estos componentes ha progresado rápidamente en los últimos años.

El uso de los ADC permite la administración local de fármacos que, si se administran como fármacos no conjugados, puede resultar en niveles inaceptables de toxicidad para las células normales.

Es decir, se busca así una máxima eficacia con mínima toxicidad. Los esfuerzos para diseñar y perfeccionar el ADC se han centrado en la selectividad del anticuerpo así como el mecanismo de acción del fármaco, unión a fármacos, proporción fármaco/anticuerpo (recarga o DAR) y propiedades de liberación del fármaco. Las porciones (“moieties”) de fármaco pueden conferir sus efectos citotóxicos y citostáticos mediante mecanismos que incluyen el agrupamiento de tubulina, unión al ADN, proteasoma, anomalía de la función del ribosoma, inhibición de proteosíntesis y/o topoisomerasa. Algunos fármacos citotóxicos tienden a ser inactivos o menos activos cuando se conjugan a un anticuerpo de gran tamaño.

Cada anticuerpo se debe caracterizar por separado, con un ligador apropiado que haya sido diseñado, y un agente citotóxico adecuado que haya sido identificado para que mantenga su potencia en el momento de su administración a las células tumorales. Se debe considerar la densidad del antígeno en el objetivo específico del cáncer y si los tejidos normales expresan el antígeno objetivo. Otras consideraciones incluyen si todo el ADC es internalizado en el momento de la unión con el objetivo; si un fármaco citotóxico o citostático es preferible al considerar la posible exposición del tejido normal y/o el tipo y etapa del cáncer que se somete a tratamiento; y, si el ligador que conecta el anticuerpo a la carga del fármaco es un enlace escindible o no escindible. Además, la proporción de la conjugación del anticuerpo con respecto a la porción de fármaco debe ser suficiente sin comprometer la actividad de unión del anticuerpo y la potencia del fármaco y sin modificar las propiedades fisicoquímicas del ADC resultando en agregación o propiedades perjudiciales con respecto al futuro proceso de desarrollo del compuesto.

Un ADC es una molécula biológica compleja y los desafíos para el desarrollo de un ADC eficaz siguen siendo un importante problema.

Sumario de la invención

La presente invención tiene la intención de abordar este tema y se refiere a un ADC de la siguiente fórmula (I):

Ab-(L-D)n (I)

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,

en el que:

Ab es un anticuerpo, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, capaz de unirse al IGF-1R humano,

comprendiendo dicho anticuerpo tres CDR de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 1, 2 y 3 y tres CDR de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 4, 5 y 6;

L es un ligador;

D es una porción de fármaco de la siguiente fórmula (II):

en el que:

R2 es COOH, COOCH3 o tiazolilo;

R3 es H o alquilo(C1-C6);

R9 es H o alquilo(C1-C6);

m es un número entero comprendido entre 1 y 8;

la línea ondulada indica el punto de fijación a L; y

n tiene un valor de 1 a 12.

Una forma de realización de la invención se refiere a un ADC en el que Ab es seleccionado de entre:

a) un anticuerpo que comprende las tres CDR de cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 7, 2 y 3 y las tres CDR de cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 9, 5 y 11;

b) un anticuerpo que comprende las tres CDR de cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 7, 2 y 3 y las tres CDR de cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 10, 5 y 11;

c) un anticuerpo que comprende las tres CDR de cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 7, 2 y 3 y las tres CDR de cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 9, 5 y 12; y

d) un anticuerpo que comprende las tres CDR de cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 8, 2 y 3 y las tres CDR de cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 9, 5 y 11.

a) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 13 y las tres CDR de cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 9, 5 y 11;

b) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 14 y las tres CDR de cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 10, 5 y 11;

c) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 15 y las tres CDR de cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 9, 5 y 12;

d) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 16 y las tres CDR de cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 9, 5 y 11; y

e) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 17 y las tres CDR de cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 9, 5 y 12.

a) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 18 y las tres CDR de cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 7, 2 y 3;

b) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 19 y las tres CDR de cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 7, 2 y 3;

c) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 20 y las tres CDR de cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 7, 2 y 3;

d) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 21 y las tres CDR de cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 8, 2 y 3; y

e) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 22 y las tres CDR de cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 7, 2 y 3.

En una forma de realización, la invención se refiere a un ADC en el que Ab es seleccionado de entre los anticuerpos 208F2, 212A11,214F8, 219D6y213B10.

Una forma de realización de la invención se refiere a un ADC en el que Ab es un anticuerpo humanizado.

un anticuerpo que comprende:

a) una cadena pesada con CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de las secuencias SEC ID n° 7, 2 y 3 respectivamente, y FR1, FR2 y FR3 que derivan de la estirpe germinal humana IGHV1-46*01 (Se C iD n° 46), y FR4 que deriva de la estirpe germinal humana IGHJ4*01 (SEC ID n° 48); y

b) una cadena ligera con CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de las secuencias SEC ID n° 9, 5 y 11 respectivamente, y FR1, FR2 y FR3 que derivan de la estirpe germinal humana IGKV1-39*01 (SEC ID n° 47), y FR4 que deriva de la estirpe germinal humana IGKJ4*01 (SEC ID n° 49).

En una forma de realización de la invención, Ab se selecciona de entre:

a) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 33 o cualquier secuencia que presente por lo menos 80% de identidad con respecto a SEC ID n° 33; y las tres CDR de cadena ligera de las secuencias SEC ID n° 9, 5 y 11; y

b) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 34 o cualquier secuencia que presente por lo menos 80% de identidad con respecto a SEC ID n° 34; y las tres CDR de cadena ligera de las secuencias SEC ID n° 9, 5 y 11.

En una forma de realización de la invención, Ab se selecciona de entre:

a) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 35 o cualquier secuencia que presente por lo menos 80% de identidad con respecto a SEC ID n° 35; y las tres CDR de cadena pesada de las secuencias SEC ID n° 7, 2 y 3; y

b) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 36 o cualquier secuencia que presente por lo menos 80% de identidad con respecto a SEC ID n° 36; y las tres CDR de cadena pesada de las secuencias SEC ID n° 7, 2 y 3.

En una forma de realización de la invención, Ab se selecciona de entre:

a) un anticuerpo que comprende o consiste en una cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 37 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a la SEC ID n° 37 y una cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 39 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a la SEC ID n° 39; y

b) un anticuerpo que comprende o consiste en una cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 38 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a la SEC ID n° 38 y una cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 40 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a la SEC ID n° 40.

En una forma de realización de la invención, Ab se selecciona de entre:

a) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de la secuencia seleccionada de entre SEC ID n° 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 y 80 o cualquier secuencia con por lo menos 80% de identidad con respecto a Se C ID n° 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 u 80; y las tres CDR de cadena ligera de las secuencias SEC ID n° 9, 5 y 11;

b) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena ligera de la secuencia seleccionada de entre SEC ID n° 57 y 60 o cualquier secuencia con por lo menos 80% de identidad con respecto a SEC ID n° 57 o 60; y las tres CDR de cadena pesada de las secuencias SEC ID n° 7, 2 y 3; y

c) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de la secuencia seleccionada de entre SEC ID n° 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 y 80 o cualquier secuencia con por lo menos 80% de identidad con respecto a SEC ID n° 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 u 80; y un dominio variable de cadena ligera de la secuencia seleccionada de entre SEC ID n° 57 o 60 o cualquier secuencia con por lo menos 80% de identidad con SEC ID n° 57 o 60.

En una forma de realización de la invención, Ab se selecciona de entre:

a) una cadena pesada de la secuencia seleccionada de entre SEC ID n° 58, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 y 81 o cualquier secuencia con por lo menos 80% de identidad con respecto a SEC ID n° 58, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 u 81; y

b) una cadena ligera de la secuencia seleccionada de entre SEC ID n° 59 y 61 o cualquier secuencia con por lo menos 80% de identidad con respecto a SEC ID n° 59 o 61.

En una forma de realización, la invención relaciona con un ADC en el que L es un ligador de la siguiente fórmula

en el que

L2 es cicloalquil(C4-C1ü)-carbonilo, alquilo(C2-C6), o alquil(C2-C6)-carbonilo;

W es una unidad aminoacídica; w es un número entero comprendido entre 0 y 5;

Y es PAB-carbonilo con PAB que es

y es 0 o 1;

el asterisco indica el punto de fijación a D; y

la línea ondulada indica el punto de fijación a Ab.

Una forma de realización de la invención se refiere a un ADC en el que L2 es de la siguiente fórmula:

en el que

el asterisco indica el punto de fijación a (W)w; y

la línea ondulada indica el punto de fijación al átomo de nitrógeno de la porción maleimida de la fórmula:

En una forma de realización de la invención, w = 0 y w = 2 y a continuación (W)w se selecciona de entre:

en el que

el asterisco indica el punto de fijación a (Y)y; y

la línea ondulada indica el punto de fijación a L2.

Una forma de realización de la invención se refiere a un ADC en el que L es seleccionado de entre:

en el que el asterisco indica el punto de fijación a D, y la línea ondulada indica el punto de fijación a Ab.

Una forma de realización de la invención se refiere a un ADC en el que (L-D) es seleccionado de entre:

en el que la línea ondulada indica el punto de fijación a Ab.

Una forma de realización de la invención se refiere a un ADC que presenta la fórmula seleccionada de entre:

y sus sales farmacéuticamente aceptables,

en el que Ab es seleccionado de entre el grupo que consiste en:

i) los anticuerpos 208F2, 212A11, 214F8, 219D6 y 213B10;

ii) los anticuerpos que compiten por la unión a IGF-1R con los anticuerpos de i); y

iii) los anticuerpos que se unen al mismo epítopo de IGF-1R como los anticuerpos de i).

Una forma de realización de la invención se refiere a

el que n tiene un valor de 2.

Una forma de realización de la invención se refiere a

el que n tiene un valor de 4.

Una forma de realización de la invención se refiere a

el que Ab es un medicamento.

Una forma de realización de la invención se refiere a una composición que comprende un ADC como se describ anteriormente.

Una forma de realización de la invención se refiere a una composición que comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Una forma de realización de la invención se refiere a una composición para su utilización en el tratamiento de

cáncer que expresa IGF-1R, o cánceres relacionados con IGF-1R.

El cáncer que expresa IGF-1R o los cánceres relacionados con IGF-1R incluyen células tumorales que expresan

0 sobreexpresan todo o parte del IGF-1R en su superficie.

Una forma de realización de la invención se refiere a una composición, en la que dicho cáncer que expresa IGF-1R es un cáncer seleccionado de entre cáncer de mama, de colon, carcinoma esofágico, hepatocelular, gástrico,

glioma, pulmonar, melanoma, osteosarcoma, ovárico, prostático, rabdomiosarcoma, renal, tiroideo, uterino, cáncer endometrial, mesotelioma, carcinoma bucal escamoso y cualquier cáncer resistente a los medicamentos.

La presente descripción divulga un método para el tratamiento de un cáncer que expresa IGF-1 R en un sujeto en

necesidad del mismo, que comprende administrarle al sujeto una cantidad eficaz de por lo menos un conjugado anticuerpo-fármaco o de una composición según la invención.

Una forma de realización de la invención se refiere a un kit que comprende por lo menos i) un conjugado anticuerpofármaco o una composición como se describe anteriormente y ii) una jeringa o frasco o ampolla en la/el que se

desecha dicha composición o conjugado anticuerpo-fármaco.

Descripción detallada de la invención

1 - El anticuerpo (Ab)

Los términos "anticuerpo","anticuerpos", "ab", "Ab", "MAb" o "inmunoglobulina" se usan indistintamente en el

sentido más amplio e incluyen anticuerpos monoclonales, anticuerpos aislados, manipulados mediante ingeniería

genética, o recombinantes (por ejemplo, anticuerpos monoclonales intactos o de cadena completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multivalentes o anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y asimismo fragmentos de anticuerpos de los mismos, siempre que presenten la actividad biológica deseada.

En una forma de realización, el anticuerpo del ADC de la invención consiste en un anticuerpo recombinante. El término "anticuerpo recombinante" se refiere a un anticuerpo que resulta de la expresión de ADN recombinante en células vivas. Un anticuerpo recombinante de ADC de la invención se obtiene mediante métodos de laboratorio de recombinación genética, conocidos por el experto en la materia, creando secuencias de ADN que no se encuentran en organismos biológicos.

En otra forma de realización, el anticuerpo del ADC de la invención consiste en un anticuerpo químicamente sintetizado.

Más particularmente, dicha molécula consiste en una glucoproteína formada mediante por lo menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada se compone de una región (o dominio) variable de cadena pesada (abreviado en la presente memoria como HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada se compone de tres dominios, CH1, CH2, y CH3. Cada cadena ligera se compone de una región variable de cadena ligera (abreviado en la presente memoria como LCVR o VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera compone de un dominio, c L. Las regiones VH y VL pueden subdividirse aún más en las regiones de hipervariabilidad, llamadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), entremezcladas con las regiones más conservadas, llamadas regiones estructurales (FR). Cada VH y VL se compone de tres CDR y cuatro FR, dispuestas de amino-terminal a carboxi-terminal en el siguiente orden: FR1 CDR1 FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras contienen un dominio de unión que interacciona con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden intervenir en la unión de la inmunoglobulina a los tejidos del hospedador o los factores, incluyendo varias células del sistema inmunitario (por ejemplo células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema del complemento vía clásica.

Mediante los términos "fragmento de unión al antígeno" o "fragmento de unión a IGF-IR" de un anticuerpo del ADC según la invención, se pretende hacer referencia a cualquier péptido, polipéptido o proteína que conserva la capacidad de enlazarse al objetivo específico (comúnmente conocido asimismo como antígeno) del anticuerpo.

En una forma de realización, se seleccionan tales "fragmentos de unión al antígeno" en el grupo formado por fragmentos Fv, scFv (sc para indicar que es monocatenario), Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc o diacuerpos o cualquier fragmento del que se hubiera aumentado el tiempo de vida media por modificación química, como la adición de poli(alquilen)glicol como poli(etilen)glicol ("PEGilación") (fragmentos pegilados llamados Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab')2-PEG o Fab'-PEG) ("PEG" para indicar Poli(Etilen)Glicol), o mediante incorporación en un liposoma, donde tales fragmentos presentan por lo menos una de las características CDR del anticuerpo según la invención. Preferentemente, tales "fragmentos de unión al antígeno" constituirán o comprenderán una secuencia parcial de la cadena variable pesada o ligera del anticuerpo del cual deriva, tal secuencia parcial es suficiente para conservar la misma especificidad de unión del anticuerpo del cual derivan y una una afinidad suficiente, preferentemente de por lo menos igual a 1/100, de una manera más preferida por lo menos de 1/10 , de la afinidad del anticuerpo del cual derivan, con respecto al objetivo específico. Más preferentemente, tales "fragmentos de unión al antígeno" se constituirán o comprenderán de por lo menos los tres CDR: CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de la cadena de variable pesada y los tres CDR: CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de la cadena de variable ligera del anticuerpo del cual derivan.

Mediante el término "unión", "se une" o similar, se pretende que el anticuerpo, o cualquier fragmento de unión al antígeno del mismo, forme un complejo con un antígeno que sea relativamente estable en condiciones fisiológicas. Una unión específica se caracteriza por una constante de disociación en equilibrio de por lo menos 1x10-6 M. Los métodos para la determinación de si dos moléculas se unen son bien conocidos en la técnica y son, por ejemplo, equilibrio dialítico, resonancia plasmónica superficial, ensayos radiomarcados y similares. Para evitar cualquier duda, no significa que dicho anticuerpo no pudiera unirse o interferir, a un bajo nivel, con otro antígeno. Sin embargo, como una forma de realización, dicho anticuerpo se une únicamente a dicho antígeno.

Como se utiliza en la presente memoria, la expresión "anticuerpo IGF-1R" debe ser interpretada como similar a "anticuerpo anti-IGF-1R" y significa un anticuerpo apto para unirse a IGF-1R.

En una forma de realización de la presente solicitud, el epítopo del anticuerpo se localiza preferentemente en el dominio extracelular de la IGF-1R humana (al que se hace referencia asimismo como IGF-1R ECD).

En una forma de realización particular, el anticuerpo, o cualquier fragmento de unión al antígeno del mismo, es apto para unirse a IGF-1R con una EC50 que comprende entre 10x10"10 a 1x10"10 y más preferentemente entre 8x10-10 a 2x10-10.

El término máxima concentración efectiva media (EC50) corresponde a la concentración de un fármaco, anticuerpo o tóxico que induce una respuesta a la mitad entre el valor inicial de referencia y el valor máximo después de cierto período de tiempo especificado de exposición. Se utiliza comúnmente como una medida de la potencia del fármaco.

El EC50 de una curva de respuesta a la dosis gradual por lo tanto, representa la concentración de un compuesto donde se observa el 50% de su efecto máximo. El EC50 de una curva de respuesta a la dosis cuántica representa la concentración de un compuesto donde el 50% de la población muestra una respuesta, después de una duración especificada de exposición. Las medidas de concentración normalmente siguen una curva sigmoidal, aumentando rápidamente respecto a un cambio relativamente pequeño en la concentración. Esto se puede determinar matemáticamente mediante derivación de la línea de mejor ajuste.

Como una forma de realización preferida, la EC50, determinada en la presente invención, caracteriza a la potencia del anticuerpo para que se una al ECD de IGF-1R en células tumorales humanas. El parámetro de EC50 se determina mediante análisis FACS. El parámetro de EC50 refleja la concentración de anticuerpos para la que se obtiene el 50% del máximo de unión en IGF-1R de humano expresado en células tumorales humanas. Cada valor de EC50 se calculó como el punto medio de la curva de respuesta a la dosis usando un programa (Prism Software) de ajuste de la curva con regresión de cuatro parámetros. Este parámetro ha sido seleccionado como representante de afecciones fisiológicas/patológicas.

El término "epítopo" es una región de un antígeno que está unida por un anticuerpo. Los epítopos pueden definirse como estructurales o funcionales. Los epítopos funcionales son generalmente un subconjunto de los epítopos estructurales y presentan los residuos que contribuyen directamente a la afinidad de la interacción. Los epítopos asimismo pueden ser conformacionales, es decir, compuestos por aminoácidos no lineales. En ciertas formas de realización, los epítopos pueden incluir factores determinantes que son agrupamientos de superficie químicamente activos de moléculas como aminoácidos, cadenas secundarias de azúcar, grupos fosforilo o grupos sulfonilo y, en ciertas formas de realización, pueden presentar unas específicas características estructurales tridimensionales o características de carga específica.

La competición por la unión a IGF-1R puede ser determinada por cualquier método o técnicas conocidas por el experto en la materia tales como, entre otras, radioactividad, Biacore, ELISA, citometría de flujo, etc. Referirse a "que compite por la unión a IGF-1 R" implica que compite en por lo menos 20%, preferentemente por lo menos 50% y más preferentemente por lo menos 70%.

La determinación de la unión al mismo epítopo se puede determinar por cualquiera de los métodos o técnicas conocidas por el experto en la materia tales como, entre otras, radioactividad, Biacore, ELISA, citometría de flujo, etc. Referirse a "que se unen al mismo epítopo IGF-1R", implica que compite en por lo menos 20%, preferentemente por lo menos 50% y más preferentemente por lo menos 70%.

Como mencionó anteriormente, y en contraposición al conocimiento general, la presente invención se centra en los anticuerpos específicos de iGF-1 R que presentan una elevada capacidad de ser internalizados tras su unión al IGF-1R. Como se utiliza en la presente memoria, un anticuerpo que "es internalizado" o que "se internaliza" (ambas expresiones son similares) es uno que es captado por (que significa que "entra") la célula al unirse a IGF-1R en una célula de mamífero. Dicho anticuerpo es interesante como parte de ADC, así que se encarga o dirige el agente citotóxico ligado hacia las células cancerosas específicas. Una vez internalizado, el agente citotóxico desencadena la muerte de células neoplásicas.

Sorprendentemente, los anticuerpos según la invención presentan en su totalidad las mismas secuencias para CDR-H2, CDR-H3 y CDR-L2, las otras 3 CDR son diferentes. Esta observación parece coherente ya que es parte del conocimiento general que, con respecto a la especificidad de unión de un anticuerpo, se describe a CDR-H3 como la más importante y la más implicada en el reconocimiento del epítopo.

Se cree que las claves importantes para obtener éxito mediante terapia con ADC son la especificidad del antígeno con especificidad de objetivo y la internalización de los complejos antígeno-anticuerpo en las células neoplásicas. Obviamente, los antígenos no internalizantes son menos eficaces que los antígenos internalizantes para suministrar agentes citotóxicos. Los procesos de internalización son variables entre antígenos y dependen de varios parámetros que pueden ser influidos por los anticuerpos.

En el ADC, el citotóxico confiere la actividad citotóxica y el anticuerpo utilizado es responsable de la especificidad contra las células neoplásicas, así como un vector para introducirse dentro de las células para encargarse correctamente del citotóxico. Por lo tanto para mejorar el ADC, el anticuerpo puede mostrar elevada capacidad de internalizarse en las células neoplásicas específicas. La eficiencia de la internalización regulada por anticuerpos difiere significativamente según el epítopo con especificidad de objetivo. La selección de potentes anticuerpos internalizantes de IGF-1R requiere diversos datos experimentales que estudien no sólo la regulación lentificadora de IGF-1R sino asimismo el seguimiento de la internalización del anticuerpo IGF-1R en las células.

En una forma de realización, la internalización del anticuerpo del ADC según la invención puede ser evaluada mediante inmunofluorescencia o FACS (citometría de flujo) (como se ejemplifica en adelante en la presente solicitud) o cualquier método o proceso conocido por el experto en la materia específico para el mecanismo de internalización. En una forma de realización preferida, el anticuerpo del ADC según la invención puede inducir internalización después de su unión a IGF-1R de por lo menos 30%, preferentemente de 50% y, más preferentemente, 80%.

El complejo IGF-1R/anticuerpo es internalizado después de la unión de los anticuerpos al ECD de dicho IGF-1R, y que sea inducida una reducción en la cantidad de iGF-1 R sobre la superficie de las células. Esta reducción puede ser cuantificada mediante cualquier método conocido por el experto en la materia tal como los ejemplos no limitativos de transferencia western, FACS e inmunofluorescencia.

En una forma de realización, esta reducción que refleja así la internalización, puede preferentemente cuantificarse mediante FACS y expresarse como la diferencia o delta entre la intensidad dedia de fluorescencia (MFI) cuantificada a 4°C con la MFI cuantificada a 37°C tras 4 horas de incubación con el anticuerpo.

Como ejemplo no limitativo, esta delta se determina sobre la base de las MFI obtenidas con las células no tratadas y las células tratadas con el anticuerpo utilizando i) células MCF7 de cáncer de mama tras un período de incubación de 4 horas con el anticuerpo descrito y ii) un anticuerpo secundario marcado con Alexa488. Este parámetro se define como se calcula mediante la siguiente fórmula: Mf I^4°c-MFI^37°c).

Esta diferencia entre las MFI refleja la regulación lentificadora de IGF-1R ya que las MFI son proporcionales al IGF-1R expresado sobre la superficie celular.

En un aspecto ventajoso, los anticuerpos consisten en anticuerpos desencadenando una MFU^°c- MFI^37°c) en MCF-7 de por lo menos 280, preferentemente de por lo menos 400.

Con mayor detalle, la delta anteriormente mencionada puede cuantificarse según el siguiente proceso, que debe ser considerado como un ejemplo ilustrativo y no limitativo:

a) tratamiento e incubación de las células neoplásicas de interés con el anticuerpo de la invención ya sea en medio de cultivo completo frío (4°C) o tibio (37°C);

b) tratamiento de las células sometidas a tratamiento en la etapa a) y, paralelamente, las células sin tratamiento con un anticuerpo secundario;

c) medición de la MFI (representativa de la cantidad de IGF-1R presente en la superficie) para las células tratadas y sin tratamiento con un anticuerpo secundario marcado que pueden unirse al anticuerpo de la invención; y

d) calcular la delta como la sustracción de la MFI obtenida con las células tratadas a partir de la MFI obtenida a partir de las células sin tratamiento.

A partir de esta delta del MFI, puede determinarse un porcentaje de internalización como:

100x(MFI^4°c-MFI^37°c)/MFI^{4°c .}

Los anticuerpos del ADC según la invención, preferentemente presentan en MCF7 un porcentaje de internalización comprendido entre 50 y 99%, 70% y 90%, preferentemente entre 75% y 87%.

Una ventaja particular de los anticuerpos descritos se basa en la tasa de internalización.

En términos generales, es conocido que para un ADC, es deseable que los anticuerpos usados muestren una rápida tasa de internalización, preferentemente dentro de las 24 horas desde la administración del anticuerpo y, más preferentemente dentro de 12 horas y aún más preferentemente, dentro de las 6 horas.

En la presente invención, la tasa de internalización, asimismo denominada disminución del anticuerpo unido a superficie celular o decaimiento del anticuerpo de la superficie celular, se expresa como t1/2 (semivida) y corresponde al tiempo necesario para obtener una disminución del 50% de AMFI (este aspecto se pondrá más claramente de manifiesto con respecto a los siguientes ejemplos).

Una ventaja particular es que los anticuerpos del ADC de la invención presentan una t1/2 comprendida entre 5 y 25 minutos y preferentemente, entre 10 y 20 minutos.

Una particular forma de realización de la invención se refiere a un ADC en el que el anticuerpo Ab comprende tres CDR de cadena pesada con un CDR-H2 de la secuencia SEC ID n° 2 y un CDR-H3 de la secuencia SEC ID n° 3 y tres CDR de cadena ligera con un CDR-L2 de la secuencia SEC ID n° 5.

Una particular forma de realización de la invención se refiere a un ADC en el que el anticuerpo Ab comprende las tres CDR de cadena pesada de las secuencias SEC ID n° 1,2 y 3 y las tres CDR de cadena ligera de las secuencias SEC ID n° 4, 5 y 6.

Una forma de realización del ADC comprende un anticuerpo que comprende las tres CDR de cadena pesada que comprenden o consisten en las secuencias SEC ID n° 1, 2 y 3, o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad con respecto a SEC ID n° 1, 2 o 3; y las tres CDR de cadena ligera que comprenden o consisten en las secuencias SEC ID n° 4, 5 y 6, o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad con respecto a SEC ID n° 4, 5 o 6.

En otra forma de realización, el anticuerpo, o cualquier fragmento de unión al antígeno del mismo, comprende las tres CDR de cadena pesada que comprenden las secuencias SEC ID n° 1, 2 y 3; y las tres CDR de cadena ligera que comprenden las secuencias SEC ID n° 4, 5 y 6.

La numeración exclusiva de IMGT se ha definido para comparar los dominios variables cualquiera que sea el receptor del antígeno, el tipo de cadena o las especies [Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997)/Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999)/Lefranc, M.-P., Pommié, C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. y Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)]. En la numeración exclusiva de IMGT, los aminoácidos conservados siempre presentan la misma posición, por ejemplo cisteína 23 (1ei-CYS), triptófano 41 (TRP-CONSERVADO), aminoácido hidrófobo 89, cisteína 104 (2o-CYS), fenilalanina o triptófano 118 (J-PHE o J-TRP). La numeración exclusiva de IMGT proporciona una delimitación estandarizada de las regiones base estructurales (FR1-IMGT: posiciones 1 a 26, FR2-IMGT: 39 a 55, FR3-IMGT: 66 a 104 y FR4-IMGT: 118 a 128) y de las regiones determinantes de complementariedad: CDR1-IMGT: 27 a 38, CDR2-IMGT: 56 a 65 y CDR3-IMGT: 105 a 117. Como las separaciones representan posiciones desocupadas, las longitudes de CDR-IMGT (mostradas entre corchetes y separadas por puntos, por ejemplo [8.8.13]) resultan una información crucial. La numeración exclusiva de IMGT es utilizada en representaciones gráficas bidimensionales, designadas como IMGT Colliers de Perles [Ruiz, M. y Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002)/Kaas, Q. y Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)] y en estructuras tridimensionales en IMGT/3Dstructure-DB [Kaas, Q., Ruiz, M. y Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004).

Debe apreciarse que, sin especificación contradictoria en la presente memoria, las regiones determinantes de complementariedad o las CDR, hacen referencia a las regiones hipervariables de las cadenas pesadas y ligeras de las inmunoglobulinas como se definen según el sistema de numeración IMGT.

No obstante, las CDR asimismo se pueden definir según el sistema de numeración Kabat (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5a Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991, y ediciones posteriores). Existen tres CDR de cadena pesada y tres CDR de cadena ligera. En la presente memoria, los términos "CDR" y "las CDR" se utilizan para indicar, según el caso, una o más, o incluso todas las regiones que contienen la mayoría de los residuos aminoacídicos responsables de la afinidad de unión del anticuerpo para el antígeno o epítopo que reconoce. Para simplificar la lectura de la presente solicitud, no se definen las CDR según Kabat. No obstante, resulta evidente para el experto en la materia, utilizando la definición de las CDR según IMGT, poder definir las CDR según Kabat.

En el contexto de la presente invención, la "identidad" o "porcentaje de identidad" entre dos secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos es el porcentaje de nucleótidos o residuos aminoacídicos idénticos entre ambas secuencias que se van a comparar, obtenido después de una óptima alineación, este porcentaje es puramente estadístico y las diferencias entre ambas secuencias se distribuyen aleatoriamente a lo largo de su longitud. La comparación de dos secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos normalmente se lleva a cabo comparando las secuencias después de haberlas alineado óptimamente, tal comparación puede llevarse a cabo por segmentos o mediante una "ventana de alineación". La alineación óptima de las secuencias para la comparación puede llevarse a cabo, además de compararse manualmente, mediante el algoritmo de homologación local de Smith y Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482], mediante el algoritmo de homologación local de Neddleman y Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48:443], mediante el método de búsqueda de semejanzas de Pearson y Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 85:2444] o por medio de programas informáticos que utilizan estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, o por el software de comparación BLAST NR o BLAST P).

El porcentaje de identidad se calcula determinando el número de posiciones en las que el nucleótido o residuo aminoacídico son idénticos entre ambas secuencias, preferentemente entre las dos secuencias completas, dividiendo la cantidad de posiciones idénticas por la cantidad total de posiciones en la ventana de alineación y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad entre ambas secuencias.

Por ejemplo, el programa informático BLAST, "BLAST 2 sequences" (Tatusova et al., "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol., 1999, Lett. 174:247-250) disponible en el sitio http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html, puede utilizarse con los parámetros predeterminados (en particular, para los parámetros "open gap penalty": 5 y "extension gap penalty": 2; la matriz seleccionada, es por ejemplo la matriz "BLOSUM 62" propuesta por el programa); se calcula directamente mediante el programa, el porcentaje de identidad entre ambas secuencias que van a compararse.

Para la secuencia de aminoácidos que presente por lo menos un 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad con respecto a una secuencia aminoacídica de referencia, los ejemplos preferidos incluyen aquellos que contienen la secuencia de referencia, ciertas modificaciones, en particular una supresión, adición o sustitución de por lo menos un aminoácido, truncamiento o extensión. En el caso de sustitución de uno o más los aminoácidos consecutivos o no consecutivos, se prefieren las sustituciones en las que los aminoácidos sustituidos son reemplazados por aminoácidos "equivalentes". En la presente memoria, la expresión "aminoácidos equivalentes" indica cualquiera de los aminoácidos capaces de ser sustituidos por uno de los aminoácidos estructurales sin modificar, sin embargo, las actividades biológicas de los anticuerpos correspondientes y de los ejemplos concretos definidos a continuación.

Los aminoácidos equivalentes pueden ser determinados ya sea por su homología estructural con los aminoácidos para los cuales son sustituidos o por los resultados de pruebas comparativas de la actividad biológica entre los diversos anticuerpos que pueden ser generados.

Como ejemplo no limitativo, la siguiente tabla 1 resume las posibles sustituciones con probabilidad de llevarse a cabo sin resultar en una modificación significativa de la actividad biológica del anticuerpo modificado correspondiente; las sustituciones inversas son naturalmente posibles en las mismas condiciones.

Tabla 1

Un aspecto particular de la invención es que el anticuerpo del ADC no se une al receptor de insulina (IR). Este aspecto es de interés ya que el anticuerpo descrito en la presente memoria no tendrá ningún impacto negativo sobre el IR, lo que significa el metabolismo de insulina.

En otra forma de realización, aún otro aspecto ventajoso del anticuerpo del ADC de la invención es que resulta apto para unirse no sólo al IGF-1R de humano sino asimismo al IGF-1R de primate y más particularmente al IGF-1R de mono Cynomolgus. Este aspecto es de interés ya que facilitará la evaluación de toxicidad requerida para los ensayos clínicos.

En otra forma de realización adicional, el anticuerpo del ADC de la invención consiste en un anticuerpo monoclonal.

En la presente memoria, el término "anticuerpo monoclonal" o "Mab" se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales de la población son idénticos excepto por las posibles mutaciones que ocurren naturalmente que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales tienen elevada especificidad, siendo dirigidos hacia un solo epítopo. Tal anticuerpo monoclonal se puede producir mediante un solo clon de linfocitos B o de hibridoma. Los anticuerpos monoclonales asimismo pueden ser recombinantes, es decir, producirse mediante síntesis química o ingeniería proteínica. Los anticuerpos monoclonales asimismo pueden aislarse de las genotecas de anticuerpos fágicos. Además, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales que comúnmente incluyen varios anticuerpos dirigidos hacia varios determinantes o epítopos, cada anticuerpo monoclonal se dirige hacia un solo epítopo del antígeno.

El anticuerpo monoclonal en la presente memoria incluye el anticuerpo de origen murino, quimérico y humanizado, tal como se describe a continuación.

El anticuerpo preferentemente deriva de un hibridoma de origen murino presentado dentro de la colección francesa de cultivos de microorganismos (CNCM, Instituto Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, Francia), dicho hibridoma se obtiene mediante la fusión de esplenocitos/linfocitos de ratones inmunizados con Balb/C y de la estirpe de células de mieloma Sp 2/O-Ag 14.

En una forma de realización, el anticuerpo IGF-1R del ADC de la invención consiste en un anticuerpo murino, al que se hace referencia a continuación como m[nombre del anticuerpo].

En una forma de realización, el anticuerpo IGF-1R consiste en un anticuerpo quimérico,al que se hace referencia a continuación como c[nombre del anticuerpo].

En una forma de realización, el anticuerpo IGF-1R consiste en un anticuerpo humanizado, al que se hace referencia a continuación como hz[nombre del anticuerpo].

Para evitar cualquier duda, en la descripción siguiente, las expresiones "anticuerpo IGF-1R" y "[nombre del anticuerpo]' son similares e incluyen (sin especificación contraria) las versiones murinas, quiméricas, y humanizadas de dicho anticuerpo IGF-1R o del mencionado "[nombre del anticuerpo]'. Cuando sea necesario, se utiliza el prefijo m-(murino), c-(quimérico) o hz-(humanizado).

Para más claridad, la siguiente tabla 2 presenta las secuencias de CDR, definidas según IMGT, para los anticuerpos preferidos.

Tabla 2

Resulta evidente para el experto en la materia que cualquier combinación de 6 CDR como se describe anteriormente, se debe considerar como parte de la presente invención.

Como se puede observar a partir de esta tabla 2, todos los anticuerpos descritos en la presente memoria presentan las mismas secuencias para CDR-H2, CDR-H3 y CDR-L2, siendo esta propiedad de particular interés como se describe anteriormente.

Un aspecto específico se refiere a un ADC en el que el anticuerpo es un anticuerpo murino, caracterizado por que dicho anticuerpo asimismo comprende regiones constantes de cadena ligera y de cadena pesada derivadas de un anticuerpo de una especie heteróloga con el ratón, en particular con el hombre.

Otro aspecto específico se refiere a un ADC en el que el anticuerpo es un anticuerpo (c) quimérico, caracterizado por que tal anticuerpo asimismo comprende regiones constantes de cadena ligera y de cadena pesada derivadas de un anticuerpo de una especie heteróloga con el ratón, en particular con el humano.

Un anticuerpo quimérico es uno que contiene una región variable natural (cadenas ligeras y cadenas pesadas) derivada de un anticuerpo de una especie dada combinada con las regiones constantes de las cadenas ligeras y cadenas pesadas de un anticuerpo de una especie heteróloga a tales especies determinadas.

Los anticuerpos quiméricos pueden prepararse utilizando las técnicas de recombinación genética. Por ejemplo, el anticuerpo quimérico podría ser producido por clonación de ADN recombinante que contenga un promotor y una secuencia que codifique la región variable de un anticuerpo monoclonal no humano, en particular murino, y una secuencia que codifique la región constante de anticuerpos de especies heterólogas, preferentemente la humana. Un anticuerpo quimérico del ADC según la invención codificado por tal gen recombinante podría ser, por ejemplo, una quimera de ratón-humano, la especificidad de este anticuerpo está determinada por la región variable, derivada del ADN murino y su isotipo determinado por la región constante derivada del ADN de origen humano.

En una forma de realización preferida, pero no limitativa, el anticuerpo del ADC de la invención se selecciona de entre:

a) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 13 o cualquier secuencia que presente por lo menos 80% de identidad con respecto a SEC ID n° 13; y las tres CDR de cadena ligera de las secuencias SEC ID n° 9, 5 y 11;

b) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 14 o cualquier secuencia que presente por lo menos 80% de identidad con respecto a SEC ID n° 14; y las tres CDR de cadena ligera de las secuencias SEC ID n° 10, 5 y 11;

c) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 15 o cualquier secuencia que presente por lo menos 80% de identidad con respecto a SEC ID n° 15; y las tres CDR de cadena ligera de las secuencias SEC ID n° 9, 5 y 12;

d) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 16 o cualquier secuencia que presente por lo menos 80% de identidad con respecto a SEC ID n° 16; y las tres CDR de cadena ligera de las secuencias SEC ID n° 9, 5 y 11; y

e) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 17 o cualquier secuencia que presente por lo menos 80% de identidad con respecto a SEC ID n° 17; y las tres CDR de cadena ligera de las secuencias SEC ID n° 9, 5 y 12.

Mediante la expresión "cualquier secuencia que presente por lo menos 80%, preferentemente de 85%, 90%, 95% y 98% de identidad con respecto a SEC ID n° 13 a 17", se pretende hacer referencia a las secuencias que presentan las tres CDR de cadena pesada SEC ID n° 1, 2 y 3, y además, que presentan por lo menos un 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad con respecto a las secuencias completas SEC ID n° 13 a 17 no considerando las secuencias correspondientes a las CDR (es decir, SEC ID n° 1,2, y 3).

En otra forma de realización preferida, pero no limitativa, el anticuerpo del ADC de la invención se selecciona de entre:

a) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 18 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a SEC ID n° 18; y las tres CDR de cadena pesada de las secuencias SEC ID n° 7, 2 y 3;

b) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 19 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a SEC ID n° 19; y las tres CDR de cadena pesada de las secuencias SEC ID n° 7, 2 y 3;

c) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 20 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a SEC ID n° 20; y las tres CDR de cadena pesada de las secuencias SEC ID n° 7, 2 y 3;

d) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 21 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a SEC ID n° 21; y las tres CDR de cadena pesada de las secuencias SEC ID n° 8, 2 y 3; y

e) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 22 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a SEC ID n° 22; y las tres CDR de cadena pesada de las secuencias SEC ID n° 7, 2 y 3.

Mediante la expresión "cualquier secuencia que presente por lo menos 80%, preferentemente de 85%, 90%, 95% y 98% de identidad con respecto a SEC ID n° 18 a 22", se pretende hacer referencia a las respectivas secuencias que presentan las tres CDR de cadena ligera SEC ID n° 4, 5 y 6, y además, que presentan por lo menos un 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad con respecto a las secuencias completas SEC ID n° 18 a 22 no considerando las secuencias correspondientes a las CDR (es decir, SEC ID n° 4, 5, y 6).

Una forma de realización de la invención se refiere a un ADC en el que Ab es un anticuerpo seleccionado de entre:

a) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 13 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a la SEC ID n° 13 y un dominio variable de cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 18 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a la SEC ID n° 18;

b) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 14 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a la SEC ID n° 14 y un dominio variable de cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 19 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a SEC ID n° 19;

c) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 15 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a la SEC ID n° 15 y un dominio variable de cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 20 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a la SEC ID n° 20;

d) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 16 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a la SEC ID n° 16 y un dominio variable de cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 21 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a la SEC ID n° 21; y

e) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 17 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a la SEC ID n° 17 y un dominio variable de cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 22 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a la SEC ID n° 22.

Los anticuerpos quiméricos descritos en la presente memoria asimismo pueden caracterizarse por el dominio constante y, más particularmente, tales anticuerpos quiméricos pueden seleccionarse o diseñarse tales como, entre otros, IgG1, IgG2, IgG3, IgM, IgA, IgD, o IgE. Preferentemente, en el contexto de la presente invención, dichos anticuerpos quiméricos son IgG1 o IgG4.

Una forma de realización de la invención se refiere a un ADC en el que Ab es un anticuerpo quimérico que comprende dominios variables VH y VL como se describen anteriormente en el formato de IgG1. Más preferentemente, dicho anticuerpo quimérico comprende un dominio constante para el VH de la secuencia SEC ID n° 43 y un dominio Kappa para el VL de la secuencia SEC ID n° 45.

Una forma de realización de la invención se refiere a un ADC en el que Ab es un anticuerpo quimérico que comprende dominios variables VH y VL como se describen anteriormente en el formato de IgG4. Más preferentemente, dicho anticuerpo quimérico comprende un dominio constante para el VH de la secuencia SEC ID n° 44 y un dominio Kappa para el VL de la secuencia SEC ID n° 45.

a) un anticuerpo que comprende o consiste en una cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 23 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a la SEC ID n° 23 y una cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 28 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a la SEC ID n° 28;

b) un anticuerpo que comprende o consiste en una cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 24 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a la SEC ID n° 24 y una cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 29 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a la SEC ID n° 29;

c) un anticuerpo que comprende o consiste en una cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 25 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a la SEC ID n° 25 y una cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 30 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a la SEC ID n° 30;

d) un anticuerpo que comprende o consiste en una cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 26 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a la SEC ID n° 26 y una cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 31 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a la SEC ID n° 31; y

e) un anticuerpo que comprende o consiste en una cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 27 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a la SEC ID n° 27 y una cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 32 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a la SEC ID n° 32.

Para más claridad, la siguiente tabla 3 presenta las secuencias de VH y VL, respectivamente, para los anticuerpos quiméricos preferidos.

Tabla 3

Todavía otro aspecto específico de la presente invención se refiere a un ADC en el que "Ab" es que un anticuerpo humanizado caracterizado por que las regiones constantes de la cadena ligera y la cadena pesada derivadas de anticuerpos humanos son, respectivamente, la región lambda o kappa y la región gamma-1, gamma-2 o gamma-4.

El término "anticuerpos humanizados" significa un anticuerpo que contiene regiones CDR derivadas de un anticuerpo de origen no humano, las otras partes de la molécula de anticuerpo derivan de uno (o varios) anticuerpos humanos. Además, algunos de los residuos de segmentos del esqueleto (denominados FR) pueden modificarse para preservar su afinidad de unión.

Los anticuerpos humanizados o fragmentos de los mismos se pueden preparar mediante técnicas conocidas por el experto en la materia. Tales anticuerpos humanizados se prefieren para su uso en métodos que implican métodos de diagnóstico en vitro o tratamiento preventivo o terapéutico en vivo. Otras técnicas de humanización, que asimismo se conocen por el experto en la materia, como, por ejemplo, la técnica de "injertos de CDR" descrita por PDL en las patentes EP 0451 216, EP 0682 040, EP 0939 127, EP 0566 647 o US n° 5.530.101, US n° 6.180.370, US n° 5.585.089 y US n° 5.693.761. Asimismo se pueden mencionar las patentes US n° 5.639.641 o n° 6.054.297, n° 5.886.152 y n° 5.877.293.

Como una particular forma de realización de la invención, y como se explica con mayor detalle en los siguientes ejemplos, en la presente memoria se describe un anticuerpo que consiste en hz208F2. Tal humanización asimismo puede aplicarse a la otra parte de los anticuerpos de la presente invención.

En una forma de realización preferida, el anticuerpo de la ADC según la presente invención comprende un dominio variable (VH) de cadena pesada que presenta:

i) CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de las secuencias SEC ID n° 7, 2 y 3, respectivamente, y

II) FR1, FR2 y FR3 que derivan de la estirpe germinal humana IGHV1-46*01 (SEC ID n° 46), y

iii) FR4 que deriva de la estirpe germinal humana IGHJ4*01 (SEC ID n° 48).

En una forma de realización preferida, el anticuerpo de la ADC según la presente invención comprende un dominio variable (VH) de cadena ligera que presenta:

i) CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de las secuencias SEC ID n° 9, 5 y 11, respectivamente, y

II) FR1, FR2 y FR3 que derivan de la estirpe germinal humana IGKV1-39*01 (SEC ID n° 47), y

iii) FR4 que deriva de la estirpe germinal humana IGKJ4*01 (SEC ID n° 49).

En una forma de realización de la invención preferida, pero no limitativa, el anticuerpo comprende:

a) una cadena pesada con CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de las secuencias SEC ID n° 7, 2 y 3 respectivamente, y FR1, FR2 y FR3 que derivan de la estirpe germinal humana IGHV1-46*01 (SEC iD n° 46), y FR4 que deriva de la estirpe germinal humana IGHJ4*01 (SEC ID n° 48); y

En una forma de realización, el anticuerpo del ADC según la invención comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) de secuencia SEC ID n° 33 y un dominio variable de cadena ligera (VL) de secuencia SEC ID n° 35. Dicho anticuerpo humanizado se denomina en adelante hz208F2 ("Variable 1" o "Var 1").

En otra forma de realización, el anticuerpo del ADC según la presente invención, comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) de la secuencia SEC ID n° 33, en el que dicha secuencia SEC ID n° 33 comprende por lo menos 1 retromutación seleccionada de entre los residuos 20, 34, 35, 38, 48, 50, 59, 61,62, 70, 72, 74, 76, 77, 79, 82 y 95.

Mediante las expresiones "retromutación" o "mutación inversa", se hace referencia a una mutación o reemplazo del residuo humano presente en la estirpe germinal por el residuo correspondiente inicialmente presente en la secuencia murina.

En otra forma de realización, el anticuerpo del ADC según la presente invención, comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) de la secuencia SEC ID n° 33, en el que dicha secuencia SEC ID n° 33 comprende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o 17 retromutaciones seleccionadas de entre los residuos 20, 34, 35, 38, 48, 50, 59, 61,62, 70, 72, 74, 76, 77, 79, 82 y 95.

Para más claridad, la siguiente tabla 4 presenta las retromutaciones preferidas.

Tabla 4

En una forma de realización, el anticuerpo del ADC según la presente invención, comprende un dominio variable de cadena ligera (VL) de la secuencia SEC ID n° 35, en el que dicha secuencia SEC ID n° 35 comprende por lo menos 1 retromutación seleccionada de entre los residuos 22, 53, 55, 65, 71, 72, 77 y 87.

En una forma de realización, el anticuerpo del ADC según la presente invención, comprende un dominio variable de cadena ligera (VL) de la secuencia SEC ID n° 35, en el que dicha secuencia SEC ID n° 35 comprende 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 retromutaciones seleccionadas de entre los residuos 22, 53, 55, 65, 71, 72, 77 u 87.

En otra forma de realización, el anticuerpo del ADC según la presente invención, comprende:

a) un dominio variable de cadena pesada (VH) de la secuencia SEC ID n° 33 en el que dicha secuencia SEC ID n° 33 comprende por lo menos 1 retromutación seleccionada de entre los residuos 20, 34, 35, 38, 48, 50, 59, 61, 62, 70, 72, 74, 76, 77, 79, 82 y 95; y

b) un dominio variable de cadena ligera (VL) de la secuencia SEC ID n° 35, en el que dicha secuencia SEC ID n° 35 comprende por lo menos 1 retromutación seleccionada de entre los residuos 22, 53, 55, 65, 71, 72, 77 y 87.

Para más claridad, la siguiente tabla 5 presenta las retromutaciones preferidas.

Tabla 5

En dicha forma de realización, el anticuerpo del ADC según la invención comprende todas las retromutaciones anteriormente mencionadas y corresponde a un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) de la secuencia SEC ID n° 34 y un dominio variable de cadena ligera (VL) de secuencia SEC ID n° 36. Dicho anticuerpo humanizado se denomina en adelante hz208F2 ("Variante 3" o "Var 3").

En otra forma de realización, todas las formas humanizadas comprendidas entre la variante 1 y la variante 3 asimismo están comprendidas en la presente invención. Es decir, el anticuerpo según la invención corresponde a un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) de la secuencia de "consenso" SEC ID n° 41 y un dominio variable de cadena ligera (VL) de la secuencia de "consenso" SEC ID n° 42. Ese anticuerpo humanizado, como tal, se denomina en adelante hz208F2 ("Variante2" o "Var.2").

a) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 33 o cualquier secuencia que presente por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad con respecto a SEC ID n° 33; y las tres CDR de cadena ligera de las secuencias SEC ID n° 9, 5 y 11; y

b) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 34 o cualquier secuencia que presente por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad con respecto a SEC ID n° 34; y las tres CDR de cadena ligera de las secuencias SEC ID n° 9, 5 y 11; y

Mediante la expresión "cualquier secuencia que presente por lo menos 80%, preferentemente de 85%, 90%, 95% y 98% de identidad con respecto a SEC ID n° 33 o 34", se pretende hacer referencia a las secuencias que presentan las tres CDR de cadena pesada SEC ID n° 1, 2, y 3, y además, que presenten por lo menos un 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad con respecto a la secuencia completa SEC ID n° 33 o 34 sin considerar las secuencias correspondientes a las CDR (es decir, SEC ID n° 1, 2, y 3).

Si no se indica en los párrafos concernientes, en la presente descripción, por cualquier secuencia o una secuencia que presente por lo menos el 80% con una secuencia particular, debe entenderse que tal secuencia presenta por lo menos un 80% y, preferentemente, 85%, 90%, 95% y 98% de identidad con respecto a la secuencia de referencia.Si estas secuencias contienen secuencias de CDR, se pretende indicar que las secuencias que presentan por lo menos estas CDR de manera idéntica a la secuencia de referencia CDR, el 80%, preferentemente el 85%, 90%, 95%, y 98% de identidad con respecto a la secuencia completa que se calcula para la secuencia restante situada fuera de las secuencias correspondientes a estas CDR.

En una forma de realización preferida pero no limitativa, el anticuerpo de la invención se selecciona de entre:

a) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 35 o cualquier secuencia que presente por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad con respecto a SEC ID n° 35 y las tres CDR de cadena pesada de las secuencias SEC ID n° 7, 2 y 3; y

b) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 36 o cualquier secuencia que presente por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad con respecto a SEC ID n° 36 y las tres CDR de cadena pesada de las secuencias SEC ID n° 7, 2 y 3.

Mediante la expresión "cualquier secuencia que presente por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95%, y 98% de identidad con respecto a SEC ID n° 35 o 36", se pretende hacer referencia a las secuencias que presenten las tres CDR de cadena ligera SEC ID n° 4, 5, y 6, y además, que presenten por lo menos un 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad con respecto a la secuencia completa SEC ID n° 35 o 36 sin considerar las secuencias correspondientes a las CDR (es decir, SEC ID n° 4, 5, y 6).

Los anticuerpos humanizados descritos en la presente memoria asimismo pueden caracterizarse por el dominio constante y, más particularmente, tales anticuerpos humanizados pueden seleccionarse o diseñarse tal como, entre otros, IgG1, IgG2, IgG3, IgM, IgA, IgD, o IgE. Más preferentemente, en el contexto de la presente invención dichos anticuerpos humanizados son IgG1 o IgG4.

Una forma de realización de la invención se refiere a un ADC en el que "Ab" es un anticuerpo humanizado que comprende dominios variables VH y VL como se describen anteriormente en el formato IgG1. Más preferentemente, dicho anticuerpo humanizado comprende un dominio constante para el VH de la secuencia SEC ID n° 43 y un dominio Kappa para el VL de la secuencia SEC ID n° 45.

Una forma de realización de la invención se refiere a un ADC en el que "Ab" es un anticuerpo humanizado que comprende dominios variables VH y VL como se describen anteriormente en el formato IgG4. Más preferentemente, dicho anticuerpo humanizado comprende un dominio constante para el VH de la secuencia SEC ID n° 44 y un dominio Kappa para el VL de la secuencia SEC ID n° 45.

Incluso otra forma de realización de la invención se refiere a un ADC en el que "Ab" es un anticuerpo seleccionado de entre:

a) un anticuerpo que comprende o consiste en una cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 38 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a la SEC ID n° 38 y una cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 40 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a la SEC ID n° 40.

Para más claridad, la siguiente tabla 6a presenta unos ejemplos no limitativos de secuencias de VH y VL de la variante 1 (Var. 1) y la variante 3 (Var. 3) del anticuerpo humanizado hz208F2. Asimismo comprende la secuencia de consenso para la variante 2 (Var. 2).

Tabla 6a

a) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de la secuencia seleccionada de entre SEC ID n° 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 y 80 o cualquier secuencia con por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad con respecto a SEC ID n° 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 y 80; y las tres CDR de cadena ligera de las secuencias SEC ID n° 9, 5 y 1;

b) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena ligera de la secuencia seleccionada de entre SEC ID n° 57 o 60 o cualquier secuencia con por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad con respecto a SEC ID n° 57 o 60; y las tres CDR de cadena pesada de las secuencias SEC ID n° 7, 2 y 3; y

c) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de la secuencia seleccionada de entre SEC ID n° 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 y 80 o cualquier secuencia con por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad con respecto a SEC ID n° 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 y 80; y un dominio variable de cadena ligera de la secuencia seleccionada de entre SEC ID n° 57 o 60 o cualquier secuencia con por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad con SEC ID n° 57 o 60.

Todavía otra forma de realización de la invención se refiere a un ADC en el que el anticuerpo "Ab" es seleccionado de entre:

a) un anticuerpo que comprende una cadena pesada de la secuencias SEC ID n° 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 y 80 o cualquier secuencia que presente por lo menos 80% de identidad con respecto a SEC ID n° 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 u 80; y una cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 57 o cualquier secuencia que presente por lo menos 80% de identidad con respecto a SEC ID n° 57; y

b) un anticuerpo que comprende una cadena pesada de las secuencias SEC ID n° 56, 64, 68 y 78 o cualquier secuencia que presente por lo menos 80% de identidad con respecto a SEC ID n° 56, 64, 68 o 78 y una cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 60 o cualquier secuencia que presente por lo menos 80% de identidad con respecto a SEC ID n° 60.

Todavía otra forma de realización de la invención se refiere a un ADC en el que "Ab" es un anticuerpo seleccionado de entre:

a) un anticuerpo que comprende o consiste en una cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 58 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a la SEC ID n° 58 y una cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 59 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a la SEC ID n° 59;

b) un anticuerpo que comprende o consiste en una cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 58 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a la SEC ID n° 58 y una cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 61 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a la SEC ID n° 61;

c) un anticuerpo que comprende o consiste en una cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 63 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a la SEC ID n° 63 y una cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 59 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a la SEC ID n° 59;

d) un anticuerpo que comprende o consiste en una cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 65 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a la SEC ID n° 65 y una cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 59 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a la SEC ID n° 59;

e) un anticuerpo que comprende o consiste en una cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 65 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a la SEC ID n° 65 y una cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 61 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a la SEC ID n° 61;

f) un anticuerpo que comprende o consiste en una cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 67 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a la SEC ID n° 67 y una cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 59 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a la SEC ID n° 59;

g) un anticuerpo que comprende o consiste en una cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 69 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a la SEC ID n° 69 y una cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 59 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a la SEC ID n° 59;

h) un anticuerpo que comprende o consiste en una cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 69 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a la SEC ID n° 69 y una cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 61 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a la SEC ID n° 61;

i) un anticuerpo que comprende o consiste en una cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 71 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a la SEC ID n° 71 y una cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 59 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a la SEC ID n° 59;

j) un anticuerpo que comprende o consiste en una cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 73 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a la SEC ID n° 73 y una cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 59 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a la SEC ID n° 59;

k) un anticuerpo que comprende o consiste en una cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 75 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a la SEC ID n° 75 y una cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 59 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a la SEC ID n° 59;

l) un anticuerpo que comprende o consiste en una cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 77 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a la SEC ID n° 77 y una cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 59 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a la SEC ID n° 59;

m) un anticuerpo que comprende o consiste en una cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 79 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a la SEC ID n° 79 y una cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 59 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a la SEC ID n° 59;

n) un anticuerpo que comprende o consiste en una cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 79 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a la SEC ID n° 79 y una cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 61 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a la SEC ID n° 61; y

o) un anticuerpo que comprende o consiste en una cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 81 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a la SEC ID n° 81 y una cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 59 o cualquier secuencia que presente por lo menos un 80% de identidad con respecto a la SEC ID n° 59;

Es decir, la invención se refiere a un ADC en el que Ab es un anticuerpo que comprende:

a) una cadena pesada de la secuencia seleccionada de entre SEC ID n° 58, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 y 81 o cualquier secuencia con por lo menos 80% de identidad con respecto a SEC ID n° 58, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 y 81; y

b) una cadena ligera de la secuencia seleccionada de entre SEC ID n° 59 y 61 o cualquier secuencia con por lo menos 80% de identidad con respecto a SEC ID n° 59 y 61.

Para más claridad, la siguiente tabla 6b presenta unos ejemplos no limitativos de secuencias de VH y VL (del dominio variable y de cadena completa) para las diferentes variantes del anticuerpo humanizado hz208F2. Tabla 6b

Otro aspecto de la presente invención es un ADC en el que Ab es un anticuerpo producido por el hibridoma I-4757, I-4773, I-4775, I-4736 o I-4774 depositados en la CNc M, Instituto Pasteur de Francia el 30 de mayo de 2013, 26 de junio de 2013, 26 de junio de 2013, 24 de abril de 2013 y 26 de junio de 2013, respectivamente.

De hecho, en la presente memoria se describe el hibridoma de origen murino seleccionado de entre el hibridoma I-4757, I-4773, I-4775, I-4736 y I-4774 depositados en la CNCM, Instituto Pasteur de Francia el 30 de mayo de 2013, 26 de junio de 2013, 26 de junio de 2013, 24 de abril de 2013 y 26 de junio de 2013, respectivamente.

También se describe el ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo, según la invención.

Los términos "ácido nucleico", "secuencia nucleica", "secuencia de ácidos nucleicos", "polinucleótido", "oligonucleótido", "secuencia de polinucleótidos" y "secuencia de nucleótidos", utilizados indistintamente en la presente descripción, hacen referencia a una secuencia exacta de nucleótidos, modificados o no, que define un fragmento o una región de un ácido nucleico que contiene o no nucleótidos no naturales, y que es ya sea un ADN bicatenario, un ADN monocatenario, o productos de la transcripción de tales ADN.

Estas secuencias han sido aisladas y/o purificadas, es decir, se muestrearon directamente o indirectamente, por ejemplo mediante una copia, donde su entorno ha sido modificado por lo menos parcialmente. Asimismo se deben mencionar en la presente memoria los ácidos nucleicos aislados obtenidos mediante técnicas de recombinación genética, o por ejemplo, mediante células hospedadoras, u obtenidos a partir de síntesis química.

Asimismo se describe un vector compuesto por un ácido nucleico que codifica un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo, del ADC según la invención, particularmente vectores de clonación y/o expresión que contienen tal secuencia de nucleótidos.

Los vectores contienen preferentemente elementos que permiten la expresión y/o la secreción de secuencias de nucleótidos en una determinada célula hospedadora. Así, el vector puede contener un promotor, señales de iniciación y terminación de la traducción, así como adecuadas regiones reguladoras de la transcripción. Debe ser poder mantenerse de manera estable en la célula hospedadora y opcionalmente, puede tener señales específicas que especifican para la secreción de la proteína traducida. Estos diversos elementos se seleccionan y optimizan por un experto en la materia de acuerdo con la célula hospedadora utilizada. Para este propósito, las secuencias de nucleótidos pueden insertarse en vectores autoreplicantes en el hospedador seleccionado o pueden ser vectores integrantes del hospedador seleccionado.

Por ejemplo, los vectores son vectores de origen viral o plásmido. Se utilizan para transformar las células hospedadoras para clonar o expresar para las secuencias de nucleótidos de la invención.

Tales vectores son preparados por métodos comúnmente utilizados por un experto en la materia y los clones resultantes pueden ser introducidos en un hospedador adecuado por métodos convencionales como lipofección, electroporación, conjugación, choque térmico o métodos químicos.

Estas células hospedadoras aisladas se transforman mediante o comprenden un vector como se describe anteriormente.

La célula hospedadora puede seleccionarse de entre sistemas procariotas o eucariotas como células bacterianas, por ejemplo, pero asimismo las células de levadura o células de animales, especialmente células de mamífero (excepto de seres humanos). Asimismo pueden utilizarse células de insectos o vegetales.

Asimismo es divulgado un método para la producción de un anticuerpo de la ADC según la invención, o un fragmento de la unión del antígeno mismo, en el que dicho método comprende las etapas siguientes:

a) cultivar en un medio con las condiciones de cultivo adecuadas para una célula hospedadora como se describió anteriormente; y

b) recuperar el anticuerpo producido de este modo a partir del medio de cultivo o de dichas células cultivadas.

Las células transformadas son utilizadas en métodos para la preparación de anticuerpos recombinantes de la ADC de acuerdo con la invención. Los métodos para la preparación de anticuerpos de manera recombinante utilizando un vector y/o una célula transformada por un vector como se ha descrito anteriormente, son comprendidos asimismo en la presente memoria. Preferentemente, una célula transformada por un vector como se describe anteriormente se cultiva en condiciones que permiten la expresión del anticuerpo y la recuperación de dicho anticuerpo mencionado anteriormente.

Como se menciona anteriormente, la célula hospedadora se puede seleccionar de entre los sistemas procariotas o eucariotas. En particular, es posible identificar las secuencias de nucleótidos que facilitan la secreción en un sistema de este tipo procariota o eucariota. Un vector tal como se da a conocer anteriormente portador de una secuencia de este tipo por lo tanto se puede utilizar ventajosamente para la producción de proteínas recombinantes que van a secretarse. De hecho, la purificación de estas proteínas recombinantes de interés resulta facilitada por el hecho de que están presentes en el sobrenadante del cultivo celular en vez de en el interior de células hospedadoras.

El anticuerpo de la ADC de la presente invención asimismo se puede preparar por síntesis química. Uno de tales métodos de preparación es asimismo un objeto de la invención. Un experto en la materia conoce métodos para la síntesis química, tales como técnicas de fase sólida o técnicas de fase sólida parciales, por condensación de fragmentos o por síntesis convencional en solución. Los polipéptidos obtenidos mediante síntesis química y aptos para contener aminoácidos no naturales correspondientes pueden asimismo citarse.

El anticuerpo que va a ser obtenido de manera probable por el método descrito anteriormente asimismo está comprendido en la presente invención.

Según un aspecto particular, la invención se refiere a un ADC en el que AB es un anticuerpo, o un antígeno fragmento de unión del mismo, como se describió anteriormente para su uso como un vehículo de especificidad para el suministro de un agente citotóxico en un sitio diana hospedador, consistiendo dicho sitio diana hospedador en un epítopo localizado en IGF-1R, preferentemente el dominio extracelular de IGF-1R, más preferentemente, el IGF-1R humano (SEC ID n° 50) y aún más preferentemente el dominio extracelular de IGF-1R humano (SEC ID n° 51), y aún más preferentemente a N-terminal del dominio extracelular de IGF-1R humano (SEC ID n° 52), o cualquier variante de secuencia natural del mismo.

En una forma de realización preferida, dicho sitio diana hospedador es un sitio diana de una célula de mamífero, más preferentemente de una célula humana, más preferentemente células que, naturalmente o por medio de recombinación genética, expresan IGF-1R.

En una forma de realización adicional, dicho sitio hospedador de destino es un sitio diana de una célula de paciente, preferentemente humano, que presenta un cáncer, preferentemente un cáncer que expresa IGF-1R, o cánceres relacionados con IGF-1R.

El cáncer que expresa IGF-1R o los cánceres relacionados con IGF-1R incluyen células tumorales que expresan o sobreexpresan para la totalidad o parte de IGF-1R en su superficie.

II - El fármaco (D)

La porción de fármaco según la invención presenta la siguiente fórmula (II)

en la que:

- R2 es COOH, COOCH3 o tiazolilo (tal como tiazol-2-ilo),

- R3 es H o un alquilo(C1-C6) (tal como metilo), en particular un grupo alquilo(C1-C6),

- R9 es H o alquilo(C1-C6) (tal como metilo),

- m es un número entero comprendido entre 1 y 8, y

- la línea ondulada indica el punto de fijación a L.

En la presente invención, el término "alquilo" hace referencia a una cadena de hidrocarburo saturada, lineal o ramificada. Por ejemplo, se pueden mencionar metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, pentilo o hexilo.

Mediante "alquilo(Cx-Cy)" en la presente invención se hace referencia a una cadena de alquilo tal como se ha definido anteriormente, que comprende x a y átomos de carbono. Por lo tanto, un grupo alquilo(C1-C6) es una cadena de alquilo que presenta de 1 a 6 átomos de carbono.

El alquilo(C1-C6) es ventajosamente un alquilo(C1-C4), preferentemente un alquilo(C1-C2).

De entre los compuestos de la invención, una clase particularmente apreciada de porciones de fármacos corresponde a las porciones de fármacos de fórmula (II) en las que R 2 representa un grupo COOH.

Otra clase particularmente apreciada de porciones corresponde a la fórmula (II) porciones en las que R2 es un tiazol (en particular un grupo tiazol-2-il).

Otra clase de porciones particularmente apreciadas corresponde a las porciones de fórmula (II) en las que R2 es COOMe.

Según una forma de realización particular de la presente invención, R2 es más particularmente un COOH, COOMe o un grupo tiazol-2-ilo.

De acuerdo con una primera forma de forma de realización preferida, R2 es COOH.

Según una segunda forma de forma de realización preferida, R2 es COOMe.

R3 particularmente representa un alquilo(Ci-C6), ventajosamente un grupo metilo.

m es un número entero comprendido entre 1 y 8, particularmente entre 1 y 6, ventajosamente entre 1 y 4, preferentemente es 1 o 2.

En una forma de realización preferida, R2 es COOH, R3 es un grupo metilo y m es 1 o 2.

De entre las porciones de fármaco de la invención, una clase particularmente apreciada de porciones de fármacos corresponde a las porciones de fármaco de fórmula (II) en las que R9 representa un grupo metilo o hidrógeno. En una forma de realización preferida:

- R2 es COOH, R3 es un grupo metilo, R9 es un grupo metilo y m es 1 o 2, o

- R2 es COOH, R3 es un grupo metilo, R9 es un hidrógeno y m es 1 o 2.

Según una forma de realización preferida, el grupo NR9 se encuentra en el anillo de fenilo en una posición para en relación con el grupo (CH2)m.

Ventajosamente, la porción de fármaco se selecciona de entre las siguientes porciones:

Preparación del fármaco (de la fórmula DH):

El fármaco puede ser preparado usando los métodos generales descritos en los siguientes esquemas de síntesis, opcionalmente complementados por cualquier operación estándar cuando se necesita que se describe en la literatura o bien conocidos por el experto en la materia, o se describen en los ejemplos en la parte experimental de la presente memoria.

El Esquema de reacción 1 representa el primer método general que puede ser utilizado para preparar el medicamento. En las fórmulas generales anteriores, R1 = H, R2 y R3 son tales como se han definido anteriormente para la fórmula II, R4 representa

R4a representa un grupo R4 tal como se ha definido anteriormente, opcionalmente en forma protegida y G es un grupo protector.

La primera etapa consiste en la condensación del compuesto (II), protegido en su función amina por un grupo protector G, con el compuesto (III). X puede representar un grupo saliente tal como un átomo de cloro. En este caso, la primera etapa consiste en la reacción entre un cloruro de ácido y una amina. Esta reacción puede llevarse a cabo usando métodos y técnicas bien conocidos por los expertos en la materia. En un método particularmente apreciado, las dos entidades se hacen reaccionar en presencia de una base orgánica o inorgánica, por ejemplo, Et3N, iPr2NEt, piridina, NaH, Cs2CO3, K2CO3 en un disolvente tal como THF, diclorometano, DMF, DMSO, a una temperatura en particular entre -20°C y 100°C. X asimismo puede ser hidroxilo (OH). En este caso, la primera etapa es una reacción de condensación entre el ácido carboxílico (II) y la amina (III). Esta reacción puede llevarse a cabo usando métodos y técnicas bien conocidos por los expertos en la materia. En un método particularmente apreciado, estas dos entidades se hacen reaccionar en presencia de un agente de acoplamiento tal como 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etil-carbodiimida (EDC), 3-hidroxi-1,2,3-benzotriazin-4(3H)-ona, una amina terciaria tal como diisopropiletilamina, en un disolvente aprótico polar tal como diclorometano o DMF, a una temperatura en particular entre -15°C y 40°C. En otro método particularmente apreciado, estas dos entidades se hacen reaccionar en presencia de fosforocianidato de dietilo (DEPC), una amina terciaria tal como trietilamina, en un disolvente aprótico polar tal como diclorometano o DMF, a una temperatura de entre -15°C y 40°C. Otro método particularmente apreciado consiste en hacer reaccionar estas dos entidades en presencia de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametil-uroniumhexafluorofosfato (HATU), una amina terciaria tal como diisopropiletilamina, en un disolvente aprótico polar tal como diclorometano o DMF, a una temperatura de entre -15°C y 100°C.

Después de la desprotección de los productos intermedios usando técnicas bien conocidas por los expertos en la materia ( «Protective Groups in Organic Synthesis», T.W. Greene, John Wiley & Sons, 2006 y « Protecting Groups », P.J. Kocienski, Tieme Verlag, 1994), el compuesto (IV) se puede condensar con el compuesto (V) siguiendo los métodos y técnicas descritos anteriormente para dar lugar al compuesto (VI) después de una etapa de desprotección. Este compuesto puede entonces, después de la condensación con el producto intermedio (VII) y la desprotección opcional, conducir a la formación del fármaco. El compuesto (VI) asimismo se puede acoplar con un compuesto (VII ') en el que R'3 es un precursor de R3, en particular un grupo R3 protegido por un grupo protector. Un acoplamiento seguido de desprotección del grupo R'3 para llevar a R3 puede llevarse a cabo siguiendo los mismos procedimientos como se describe anteriormente.

Esquema de reacción 2

El esquema de reacción 2 representa el segundo método general que puede ser utilizado para preparar el medicamento. En las fórmulas generales anteriores, G es un grupo protector, R1 = H, R2, R3 y R4a son tales como

se han definido anteriormente, y R4b representa

En la primera etapa, el compuesto (IX) protegido en su función amina por un grupo protector G se condensa con el compuesto (VI). X puede representar un grupo saliente tal como cloro. En este caso, la primera etapa consiste en la reacción entre un cloruro de ácido y una amina. Esta reacción puede llevarse a cabo usando métodos y técnicas bien conocidos por los expertos en la materia. En un método particularmente apreciado, las dos entidades se hacen reaccionar en presencia de una base orgánica o inorgánica, por ejemplo, Et3N, iPr2NEt, piridina, NaH, Cs2CO3, K2CO3 en un disolvente tal como THF, diclorometano, DMF, DMSO, a una temperatura en particular entre -20°C y 100°C. X asimismo representa un hidroxilo. En este caso, la primera etapa es una reacción de condensación entre el ácido carboxílico (IX) y amina (VI). Esta reacción puede llevarse a cabo usando métodos y técnicas bien conocidos por los expertos en la materia. En un método particularmente apreciado, las dos entidades se hacen reaccionar en presencia de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etil-carbodiimida (EDC), 3-hidroxi-1,2,3-benzotriazin-4(3H)ona, una amina terciaria tal como diisopropiletilamina, en un disolvente aprótico polar tal como diclorometano o DMF, a una temperatura en particular entre -15°C y 40°C. En otro método particularmente apreciado, estas dos entidades se hacen reaccionar en presencia de fosforocianidato de dietilo (DEPC), una amina terciaria tal como trietilamina, en un disolvente aprótico polar tal como diclorometano o DMF, a una temperatura en particular entre -15°C y 40°C.

Después de la desprotección del producto intermedio, usando técnicas bien conocidas por el experto en la materia, el compuesto obtenido (VIII) puede conducir al fármaco después de la reacción con R4Y. En este caso, Y es un grupo saliente tal como Cl, Br, I, OSO2CH3, OSO2CF3 o O-tosilo. La reacción se lleva a cabo en presencia de una base orgánica o inorgánica tal como Et3N, iPr2 Red, NaH, Cs2 CO3, K2CO3, en un disolvente anhidro polar tal como diclorometano, THF, DMF, DMSO a una temperatura en particular entre -20° y 100°C. En otro método particularmente apreciado, el compuesto (VIII) se hace reaccionar con un aldehído de fórmula R4b -CHO en el que R4b corresponde a un precursor de R4. En este caso, la reacción es una aminación reductora en presencia de un agente reductor tal como NaBH4 , NaBH3 CN, NaBH (OAc)3 , en un disolvente polar tal como 1,2-dicloroetano, diclorometano, THF, DMF, MeOH, en la presencia opcional de isopropóxido de titanio (IV), a un pH que puede ser controlado por la adición de un ácido tal como ácido acético a una temperatura en particular entre -20°C y 100°C.

En los esquemas de síntesis anteriores, un fármaco puede conducir a otro fármaco después de una etapa de reacción adicional, como por ejemplo saponificación usando métodos bien conocidos por el experto en la materia por el que un R2 grupo que representa un éster (COOMe) se cambia a un R2 grupo que representa un ácido carboxílico (COOH).

Si se desea aislar un fármaco que contiene por lo menos una función de base en el estado de una sal de adición de ácido, esto es posible por tratamiento de la base libre del fármaco (que contiene por lo menos una función base) con un ácido adecuado, preferentemente en una cantidad equivalente. El ácido adecuado puede ser en particular, el ácido trifluoroacético.

III - El ligador (L)

Los términos "ligador", "unidad ligadora", "L" o "ligamiento" hacen referencia, en la presente invención, a una porción química que comprende un enlace covalente o una cadena de átomos que une covalentemente un anticuerpo a por lo menos un medicamento.

Los ligadores se pueden preparar usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como (2-piridilditio) propionato de succinimidilo-3- N (SPDP), succinimidil-4- (N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato de etilo (SMCC), iminotiolano ( IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como dimetil adipimidato HCl), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tales como bis(p-azidobenzoil) hexanodiamina), bis-diazonio derivados (tales como bis- (pdiazoniobenzoil) etilendiamina), diisocianatos (tales como tolueno 2,6-diisocianato) y compuestos de flúor bisactivos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilentriaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono-14 es un ejemplo de agente quelante para la conjugación de agentes citotóxicos para el sistema de especificidad. Otros reactivos de reticulación pueden ser BMPS, EMCS, GMBS, HBVs, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS , sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, y sulfo-SMPB, y SVSB (succinimidil- (4-vinilsulfona) benzoato) que están disponibles comercialmente (por ejemplo, de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, Ill., US).

El ligador puede ser "no escindible" o "escindible".

En una forma de realización preferida, consiste en un "ligador escindible" que facilita la liberación del fármaco en la célula. Por ejemplo, pueden usarse un ligador lábil en medio ácido, un ligador sensible a peptidasa, un ligador fotolábil, ligador de dimetilo o ligador que contiene disulfuro. El ligador es, en una forma de realización preferida, escindible en condiciones intracelulares, de modo que la escisión del ligador libera el fármaco a partir del anticuerpo en el medio intracelular.

Por ejemplo, en algunas formas de realización, el ligador es escindible por un agente de escisión que está presente en el medio intracelular (por ejemplo, dentro de un lisosoma o endosoma o caveolea). El ligador puede ser, por ejemplo, un ligador de peptidilo que se escinde por una peptidasa intracelular o una enzima proteasa, incluyendo de manera no limitativa, una proteasa lisosómica o endosómica. Típicamente, el ligador peptídico comprende por lo menos dos aminoácidos sucesivos o por lo menos tres aminoácidos sucesivos o es por lo menos de dos aminoácidos de longitud o por lo menos tres aminoácidos de longitud. Los agentes de escisión pueden incluir las catepsinas B y D y la plasmina, todos los cuales son conocidos por hidrolizar derivados de fármacos dipeptídicos dando como resultado la liberación del fármaco activo dentro de las células diana. Por ejemplo, un ligador de peptidilo que es escindible por el tiol dependiente de la proteasa catepsina-B, que está altamente expresado en el tejido canceroso, se puede utilizar (por ejemplo, un ligador que comprende o ser Phe-Leu o Gly-Phe-Leu-Gly). En unas formas de realización específicas, el ligador de peptidilo escindible mediante una proteasa intracelular comprende o es Val-Cit o Phe-Lys. Una ventaja de usar la liberación proteolítica intracelular del fármaco es que el medicamento está típicamente atenuado cuando se conjugan y las estabilidades séricas de los conjugados son generalmente altas.

En otras formas de realización, el ligador escindible es sensible al pH, es decir, sensible a la hidrólisis a ciertos valores de pH. Típicamente, el ligador sensible al pH es hidrolizable en condiciones ácidas. Por ejemplo, puede utilizarse un ligador lábil en medio ácido que es hidrolizable en el lisosoma (por ejemplo, una hidrazona, semicarbazona, tiosemicarbazona, cis-aconítico amida, ortoéster, acetal, cetal, o similares). Tales ligadores son relativamente estables en condiciones de pH neutro, tales como las de la sangre, pero son inestables por debajo de un pH 5,5 o 5,0, el pH aproximado del lisosoma. En determinadas formas de realización, el ligador hidrolizable es un ligador de tioéter (tales como, por ejemplo, un tioéter unido al fármaco a través de un enlace acilhidrazona).

Todavía en otras formas de realización, el ligador es escindible en condiciones reductoras (por ejemplo, un ligador disulfuro). Una variedad de ligadores disulfuro son conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, los que se pueden formar utilizando SATA (N-succinimidil-S-acetiltioacetato), SPDP (N-succinimidil-3- (2-piridilditio) propionato), SPDB (N-succinimidil-3-(2-piridilditio) butirato) y SMPT (N-succinimidil-oxicarbonilo-alfa-metil-alfa-(2-piridil-ditio) tolueno).

En determinadas formas de realización preferidas, la unidad ligadora puede presentar la fórmula general siguiente:

-(T)a-(W)w-(Y)y-

en la que:

T es una unidad extensora;

a presenta un valor de 0 o 1;

W es una unidad aminoacídica;

w es un número entero comprendido entre 0 y 12;

Y es una unidad separadora;

y presenta un valor de 1 o 2;

La unidad extensora (T), cuando está presente, vincula el anticuerpo a una unidad de aminoácidos (W) cuando esté presente, o a la unidad separadora cuando esté presente o directamente al fármaco. Los grupos funcionales útiles que pueden estar presentes en el anticuerpo ya sea naturalmente o por manipulación química, incluyen sulfidrilo, amino, hidroxilo, el grupo de hidroxilo anomérico de un carbohidrato y carboxilo. Los grupos funcionales adecuados son sulfhidrilo y amino. Los grupos sulfhidrilo se pueden generar por reducción de los enlaces disulfuro intramoleculares del anticuerpo, si están presentes. Alternativamente, los grupos sulfhidrilo se pueden generar mediante la reacción de un grupo amino de una porción de lisina del anticuerpo con 2-iminotiolano u otros reactivos generadores de sulfhidrilo. En unas formas de realización específicas, el anticuerpo se ha concebido para portar una o más lisinas. Más preferentemente, el anticuerpo puede concebirse para portar una o más cisteínas (cf. ThioMAb).

En ciertas formas de realización específicas, la unidad extensora forma un enlace con un átomo de azufre del anticuerpo. El átomo de azufre puede derivar de un grupo sulfhidrilo (-SH) de un anticuerpo reducido.

En otras determinadas formas de realización específicas, la unidad extensora está ligada al anticuerpo a través de un enlace disulfuro entre un átomo de azufre del anticuerpo y un átomo de azufre de la unidad extensora.

En otras formas de realización específicas, el grupo reactivo del extensor contiene un sitio reactivo que puede ser reactivo a un grupo amino del anticuerpo. El grupo amino puede ser el de una arginina o una lisina. Los sitios reactivos de amina adecuada incluyen, pero no se limitan a, ésteres activados (tales como ésteres de succinimida, ésteres de 4-nitrofenilo, ésteres de pentafluorofenilo), anhídridos, cloruros de ácido, cloruros de sulfonilo, isocianatos e isotiocianatos.

Todavía en otro aspecto, la función reactiva del extensor contiene un sitio reactivo que es reactivo con un grupo carbohidrato modificado que puede estar presente en el anticuerpo. En una forma de realización específica, el anticuerpo está glicosilado enzimáticamente para proporcionar una porción de carbohidrato o está glicosilado de forma natural. El hidrato de carbono puede ser ligeramente oxidado con un reactivo tal como peryodato de sodio y la unidad de carbonilo resultante del carbohidrato oxidado se puede condensar con un extensor que contiene una funcionalidad tal como una hidrazida, una oxima, una amina reactiva, una hidrazina, una tiosemicarbazida, un carboxilato de hidrazina, o un arilhidrazida.

De acuerdo con una forma de realización particular, la unidad extensora presenta la siguiente fórmula:

en la que

L2 es cicloalquil(C4-C10)-carbonilo, alquilo(C4-C10) o alquil(C4-C10)-carbonilo (las porciones cicloalquilo o alquilo que están unidas al átomo de nitrógeno de la porción de maleimida),

el asterisco indica el punto de fijación a la unidad separadora si está presente, o al fármaco D; y

la línea ondulada indica el punto de fijación al anticuerpo Ab.

Mediante "cicloalquilo(C4-C10)" en la presente invención se hace referencia a un ciclo hidrocarbonado que presenta de 4 a 10 átomos de carbono incluyendo de manera no limitativa ciclopentilo, ciclohexilo y similares.

Ventajosamente, L2 es alquil(C2-C6)-carbonilo tal como un pentil-carbonilo de la siguiente fórmula:

en la que

la línea ondulada indica el punto de fijación al átomo de nitrógeno de la porción de maleimida.

La unidad de aminoácido (W), cuando está presente, une la unidad extensora (T) si está presente, o de lo contrario el anticuerpo a la unidad espaciadora (Y) si la unidad espaciadora está presente, o al fármaco si la unidad espaciadora está ausente.

Como se menciona anteriormente, (W)w está ausente (w = 0) o puede ser una unidad dipéptido, tripéptido, tetrapéptido, pentapéptido, hexapéptido, heptapéptido, octapéptido, nonapéptido, decapéptido, undecapéptido o dodecapéptido, en la que los aminoácidos que forman los péptidos pueden ser diferentes entre sí.

Por lo tanto (W)w puede representarse por la siguiente fórmula: (W1)w1(W2)w2(W3)w3(W4)w4(W5)w5, en la que cada uno de W1 a W5 representa, independientemente entre sí, una unidad de ácido amino y cada w1 a w5 es 0 o 1. En algunas formas de realización, la unidad de ácido amino (W)w puede comprender residuos de aminoácidos, tales como los que se producen de forma natural, así como los aminoácidos menores y análogos de aminoácidos que se producen de manera no natural, tales como citrulina.

Los residuos de aminoácidos de la unidad de ácido amino (W)w incluyen de manera no limitativa alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptófano, prolina, lisina protegida o no con acetilo o formilo, arginina, arginina protegida o no con grupos tosilo o nitro, histidina, ornitina, ornitina protegida con acetilo o formilo, y citrulina. Los componentes de ligador aminoacídico ejemplificativos incluyen preferentemente un dipéptido, un tripéptido, un tetrapéptido o un pentapéptido, en particular un dipéptido o un tripéptido.

Los dipéptidos ejemplificadores incluyen: Val-Cit, Ala-Val, Ala-Ala, Val-Ala, Lys-Lys, Cit-Cit, Val-Lys, Ala-Phe, Phe-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, Phe-Ala, Phe-N9-tosil-Arg, Phe-N9-Nitro-Arg.

Los tripéptidos ejemplificadores incluyen: Val-Ala-Val, Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Ala-Ala-Asn, Phe-Phe-Lys, Gly-Gly-Gly, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys.

Los tetrapéptidos ejemplificadors incluyen: Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO. 53), Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO. 54). Los pentapéptidos ejemplificadores incluyen: Pro-Val-Gly-Val-Val (SEQ ID NO. 55).

Según una forma de realización en particular, (W)w puede ser un dipéptido (es decir, w = 2) tal como Val-Cit o el ligador carece de una unidad aminoacídica (w = 0). Cuando el ligador carece de una unidad aminoacídica, preferentemente asimismo carece de una unidad separadora.

Según una forma de realización preferida, w = 0 (es decir, (W)w es un solo enlace) o w = 2 (es decir, (W)w es un dipéptido) y (W)w puede seleccionarse de entre:

y, en particular es Val-Cit,

en donde

la línea ondulada indica el punto de fijación a L2.

Los componentes ligadores del aminoácido pueden ser diseñados y optimizados en su selectividad para escisión enzimática por una enzima particular, por ejemplo, una proteasa asociada a tumor, catepsina B, C y D o una proteasa plasmina.

La unidad de aminoácidos del ligador puede ser enzimáticamente escindida por una enzima, incluyendo, pero no limitado a, una proteasa asociada a tumor para liberar el fármaco.

La unidad de aminoácidos puede ser diseñada y optimizada en su selectividad para la escisión enzimática por una proteasa particular asociada a tumores. Las unidades adecuadas son aquellas cuya escisión está catalizada por las proteasas, catepsina B, C y D, y plasmina.

La unidad separadora (Y), cuando está presente, une una unidad de aminoácidos si está presente, o la unidad extensora si está presente, o de otro modo el anticuerpo al fármaco. Las unidades espaciadoras son de dos tipos generales: autodestructiva y no autodestructiva. Una unidad espaciadora no autodestructiva es una en la que parte o la totalidad de la unidad espaciadora permanece unida al fármaco después de la escisión enzimática de una unidad de ácido amino del conjugado anticuerpo-fármaco. Los ejemplos de una unidad espadadora no autodestructiva incluyen de manera no limitativa unidad espaciadora (glicina-glicina) y una unidad de glicina espaciadora. Para liberar el fármaco, una reacción de hidrólisis independiente debe tener lugar dentro de la célula diana para escindir el enlace de la unidad glicina-fármaco.

En una forma de realización particular, una unidad espaciadora no autodestructiva (Y) es Gly.

Alternativamente, un conjugado anticuerpo-fármaco que contiene una unidad espaciadora autodestructiva puede liberar el fármaco sin la necesidad de una etapa de hidrólisis separada. En estas formas de realización, (Y) es un residuo de una unidad de alcohol p-aminobencílico (PAB) que está ligado a (W)w a través del átomo de nitrógeno del grupo PAB, y conectado directamente al fármaco a través de un éster, carbonato, carbamato o grupo éter. Otros ejemplos de espaciadores autodestructivos incluyen de manera no limitativa compuestos aromáticos que son electrónicamente equivalentes al grupo PAB tales como residuos de derivados de 2-aminoimidazol-5-metanol y orto o para-aminobencilacetales. Los espaciadores que pueden ser utilizados se someten a ciclación fácil tras la hidrólisis del enlace amida, tales como amidas sustituidas y no sustituidas de 4-aminobutírico, apropiadamente sistemas de anillo sustituidos biciclo [2.2.1] y biciclo [2.2.2] y amidas de ácido 2-aminofenilpropionico.

En una forma de realización alternativa, la unidad espaciadora es una unidad de bis (hidroximetil)estireno (BHMS) ramificado, que se puede utilizar para incorporar fármacos adicionales.

En una forma de realización particular, la unidad espaciadora (Y) es PAB-carbonilo con PAB siendo

(estando el oxígeno de la unidad de PAB unido al carbonilo), e y = 1 o el ligador carece de una unidad espaciadora (y = 0).

En una forma de realización particular, el ligador presenta la fórmula (III) siguiente:

en la que

L2 es cicloalquil(C4-C10)-carbonilo, alquilo(C2-C6) o alquil(C2-C6)-carbonilo (el carbonilo de estas porciones, cuando presente, está ligado a (W)w),

W es una unidad aminoacídica; w es un número entero comprendido entre 0 y 5;

Y es PAB-carbonilo, siendo PAB

(estando el oxígeno de la unidad de PAB unido al carbonilo), e y es 0 o 1 (preferentemente y es 0 cuando w es 0 e y es 0 o 1 cuando w está comprendido entre 1 y 5),

el asterisco indica el punto de fijación al fármaco D; y

la línea ondulada indica el punto de fijación al anticuerpo Ab.

en la que

el asterisco indica el punto de fijación a (W)w; y

la línea ondulada indica el punto de fijación al átomo de nitrógeno de la porción maleimida.

Según una forma de realización preferida, el ligador L se selecciona de entre:

en el que el asterisco indica el punto de fijación al fármaco D, y la línea ondulada indica el punto de fijación al fármaco Ab.

IV - El conjugado anticuerpo-fármaco (ADC)

En una forma de realización preferida, el conjugado de anticuerpo-fármaco de la invención puede prepararse por cualquier método conocido por el experto en la materia tales como, sin limitación, i) reacción de un grupo nucleófilo del anticuerpo con un reactivo de ligador bivalente seguido de reacción con un grupo nucleófilo del fármaco o el ii) la reacción de un grupo nucleófilo del fármaco con un reactivo de ligador bivalente seguido de reacción con un grupo nucleófilo del anticuerpo.

Los grupos nucleófilos sobre anticuerpos incluyen de manera no limitativa grupos amina N-terminales, grupos amina de cadena lateral (por ejemplo, lisina), grupos de tiol de la cadena de lado y azúcar hidroxilo o grupos amino cuando el anticuerpo está glucosilado.

Los grupos nucleófilos del fármaco incluyen, sin limitación, amina, tiol, grupos del oxhidrilo y preferentemente grupos amina.

Los grupos amina, tiol e hidroxilo son nucleófilos y aptos para reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrófilos en porciones de ligador y reactivos de ligador incluyendo, sin limitación, ésteres activos tales como ésteres NHS, ésteres TOHB, haloformatos y haluros de ácido; haluros de alquilo y bencilo como haloacetamidas; aldehídos; cetonas; carboxilo; y grupos de maleimida. El anticuerpo puede presentar disulfuros intercatenarios reducibles, es decir puentes de cisteína. El anticuerpo puede ser realizado reactivo para la conjugación con reactivos de ligador mediante el tratamiento con un agente reductor, tal como DTT (ditiotreitol). Cada puente de cisteína forma así, teóricamente, dos nucleófilos de tiol reactivos. Unos grupos nucleófilos adicionales pueden introducirse en el anticuerpo a través de cualquier reacción conocida por el experto en la materia. A título de ejemplo no limitativo, unos grupos tiol reactivos pueden introducirse en el anticuerpo mediante la introducción de uno o más residuos de cisteína.

Los conjugados de anticuerpo-fármaco se pueden producir asimismo por modificación de anticuerpos al introducir porciones electrófilas, que pueden reaccionar con sustituyentes nucleófilos en el reactivo de ligador. Los azúcares del anticuerpo glucosilado pueden ser oxidados para formar grupos aldehído o cetona que pueden reaccionar con el grupo amina de reactivo de ligador o fármaco. Los grupos de base de Schiff imina resultantes pueden formar un enlace estable, o pueden ser reducidos para formar unos enlaces amina estables. En una forma de realización, la reacción de la parte de carbohidratos de un anticuerpo glucosilado con galactosa oxidasa o sodio meta-peryodato puede proporcionar grupos carbonilo (aldehído y cetona) en la proteína que pueden reaccionar con grupos apropiados en el fármaco. En otra forma de realización, las proteínas que contienen residuos de serina o treonina N-terminales pueden reaccionar con el sodio meta-peryodato, dando como resultado la producción de un aldehído en lugar del primer aminoácido.

En una forma de realización preferida, el conjugado anticuerpo-fármaco de la invención se prepara mediante la preparación de la porción de fármaco-ligador seguido de acoplamiento entre un grupo nucleófilo del anticuerpo (por ejemplo el grupo SH de una porción de cisteína) y un grupo electrófilo de la porción de fármaco-ligador (por ejemplo una maleimida).

1. Fármaco-Ligador

La porción fármaco-ligador se puede preparar por acoplamiento:

- el ligador con el fármaco,

- una parte del ligador con el fármaco antes de completar la síntesis del ligador,

- el ligador con una parte o un precursor del fármaco antes de completar la síntesis del fármaco, o - una parte del ligador con una parte o un precursor del fármaco antes de completar la síntesis del fármaco.

Las reacciones de acoplamiento son reacciones bien conocidas por el experto en la materia entre un grupo nucleófilo y un grupo electrófilo.

El grupo nucleófilo puede ser en particular un grupo amina, tiol o hidroxilo. En una forma de realización preferida es un grupo amina primaria o secundaria.

El grupo electrófilo puede ser un grupo de ácido carboxílico (COOH) opcionalmente en forma activa o en una porción de éster de carbonato activado.

Se entiende por "forma activa" de un ácido carboxílico un ácido carboxílico en el que la porción de OH de la función COOH se ha sustituido por un grupo saliente activado (LG) que permite el acoplamiento del grupo activado de ácido carboxílico con un grupo amino para formar un enlace amida y liberar el compuesto de LG-H. Las formas activadas pueden ser ésteres activados, amidas activadas, anhídridos o haluros de acilo como los cloruros de acilo. Los ésteres activados incluyen derivados formados por la reacción del grupo ácido carboxílico N-hidroxibenzotriazol o N-hidroxisuccinimida.

El término "éster de carbonato activado" hace referencia a un éster de carbonato que comprende una porción -OC(O) en la que OR representa un grupo saliente bueno que permite el acoplamiento del éster de carbonato activado con un grupo amino para formar una porción carbamato y liberar el compuesto ROH. El grupo R del éster de carbonato activado incluye de manera no limitativa los grupos fenil-nitro-p, pentafluorofenil, 2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il y bencilo, preferentemente los grupos p-nitro-fenil y pentafluorofenil.

Cuando el ligador presenta la fórmula (III) siguiente:

la porción fármaco-ligador presenta la fórmula (IV) siguiente:

y la última etapa de la síntesis de la porción de fármaco-ligador es generalmente el acoplamiento entre un compuesto de la siguiente fórmula (V):

en la que L2 es como se define anteriormente y LG representa un grupo saliente en particular un haluro tal como un cloruro o un grupo derivado de N-hidroxisuccinimida,

y un compuesto de la fórmula (VI) siguiente:

Cuando y = 1 e Y = PAB-carbonilo, el compuesto de fórmula (VI) puede ser preparado por el acoplamiento entre el fármaco (DH) y un compuesto de la siguiente fórmula (VII), preferentemente una forma protegida del mismo:

donde W y w son como se define anteriormente y R es como se define en la definición de "éster de carbonato activado", y G es H o un grupo de protección.

Cuando el compuesto de fórmula (VII) está en forma protegida, resulta necesaria una etapa final de desprotección.

Cuando y = 0, el compuesto (VI) presenta la fórmula H-(W)w-D, en la que (W)w y preferentemente D se componen de unidades de ácido amino. Por lo tanto, el compuesto (VI) puede ser preparado en este caso por un método de síntesis de péptido convencional conocido por el experto en la materia.

2. Ab-Ligador-fármaco

Una forma de forma de realización preferida según la invención consiste en un acoplamiento entre una cisteína presente en el anticuerpo y un grupo electrófilo de la porción de fármaco-ligador, preferentemente con una porción maleimida presente en la porción de fármaco-ligador.

El acoplamiento de maleimida-cisteína puede realizarse por métodos conocidos por el experto en la materia.

Generalmente, los anticuerpos no contienen muchos, si alguno, grupos tiol de cisteína libre y reactiva que pueden ser ligados a una porción de fármaco. La mayoría de residuos de tiol de cisteína en los anticuerpos existen como puentes disulfuro y debe ser reducidos con un agente reductor como el ditiotreitol (DTT) o TCEP, bajo condiciones de reducción parciales o totales. La carga (proporción de fármaco/anticuerpo) de un ADC puede ser controlada de varias maneras diferentes, incluyendo: (i) limitar el exceso molar de producto intermedio de fármaco-ligador (D-L) o reactivo de ligador respecto al anticuerpo, (ii) limitar el tiempo de reacción verbal o la temperatura, y (iii) condiciones de reducción limitadas o parciales para la modificación de tiol de cisteína.

La estructura del enlace de disulfuro de IgGs humanas está bien establecida (revisado en Liu y mAb 4 (2012): 17 23). De hecho existen muchas similitudes y algunas diferencias con respecto a las estructuras del enlace de disulfuro de las 4 subclases de IgG humanas, es decir, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Todas las subclases de IgG contienen invariablemente 12 puentes de disulfuro intracadena y las diferencias residen en su intercadena de disulfuro formada entre cadenas pesadas y ligeras. Cada enlace disulfuro intracadena se asocia con un dominio de IgG individual, es decir, variable (VL y VH) y dominios constantes (CL, CH1, CH2 y CH3). Las 2 cadenas pesadas están unidas en su región de bisagra por un número variable de puentes disulfuro: 2 para la IgG1 e IgG4, 4 de IgG2 y 11 para IgG3. Las cadenas ligeras y pesadas de la IgG1 están conectadas por un enlace disulfuro entre el último residuo de cisteína de la cadena ligera y el quinto residuo de la cadena pesada, mientras que para las otras subclases IgG2, IgG3 e IgG4, la cadena ligera está ligada a la cadena pesada por un enlace disulfuro entre el último residuo de cisteína de la cadena ligera y el tercer residuo de cisteína de la cadena pesada, que se encuentra en la interfaz de los dominios VH y CH1. Las estructuras de enlace disulfuro distintas a las que se han descrito son estructuras clásicas de IgG2 e IgG4 (revisado en Liu y mAb 4 (2012): 17-23). Los enlaces disulfuro entre cadenas son muy expuestos al solvente y en consecuencia mucho más reactivos que los enlaces de disulfuro intracadena, que se ocultan en estructuras de láminas beta antiparalelas dentro de cada dominio y no son solventes expuestos. Por estas razones, cualquiera que sea el isotipo de anticuerpo, el acoplamiento se llevará a cabo en residuos de cisteína expuesta intercadena después de la leve reducción. Cada puente disulfuro intercadena puede así formar, teóricamente, dos sitios de conjugación.

Unos grupos nucleófilos adicionales pueden introducirse en los anticuerpos a través de la reacción de lisinas con 2-iminotiolano (reactivo de Traut) resultando en la conversión de una amina en un tiol. Unos grupos tiol reactivos pueden asimismo introducirse en el anticuerpo (o fragmentos del mismo) por genomanipulación de uno, dos, tres, cuatro o más residuos de cisteína (por ejemplo, preparar anticuerpos mutantes que comprenden uno o más residuos no naturales del aminoácido cisteína). La patente US n° 7.521.541 muestra ingeniería de anticuerpos por la introducción de aminoácidos cisteína reactiva.

Los aminoácidos de cisteína pueden diseñarse en los sitios reactivos en un anticuerpo y que no forman enlaces intracatenarios o disulfuro intermoleculares (Junutula, et al., 2008b Nature Biotech., 26(8):925-932; Dornan et al (2009) Blood 114(13):2721-2729; documentos US 7521541; US 7723485; WO2009/052249). Los tioles de cisteína genomanipulados pueden reaccionar con los reactivos de ligador o los reactivos de fármacos-ligador de la presente invención que presentan grupos tiol-reactivos, electrófilos tales como maleimida alfa-halo amidas para formar ADC con anticuerpos genomanipulados de cisteína y las porciones de fármaco. La ubicación de la porción de fármaco puede así ser diseñada, controlada y conocida. La carga de fármaco puede ser controlada ya que los grupos tiol de cisteína genomanipulada por lo general reaccionan con reactivos de ligador reactivos al tiol o reactivos de fármaco-ligador en alto rendimiento. La genomanipulación de un anticuerpo IgG para la introducción de un aminoácido cisteína por la sustitución en un solo sitio de la cadena pesada o ligera proporciona dos cisteínas nuevas en el anticuerpo simétrico. Una carga del fármaco próxima a 2 se logra con casi homogeneidad del producto de conjugación ADC.

Cuando más de un grupo nucleófilo o electrófilo del anticuerpo reacciona con un producto intermedio de fármacoligador o reactivo de ligador seguido por reactivo de porción de fármaco, entonces el producto resultante es una mezcla de compuestos de ADC con una distribución de porciones de fármaco unidas a un anticuerpo, por ejemplo, 1, 2, 3, etcétera. Los métodos de cromatografía líquida de fase inversa polimérica (PLRP) como la interacción hidrófoba (HIC) pueden separar los compuestos en la mezcla por valor de la carga de fármaco. Las preparaciones de ADC con un solo valor (p) de concentración del fármaco pueden ser aisladas, sin embargo, estos ADC de valor de carga única todavía puede ser mezclas heterogéneas porque las porciones de fármaco pueden fijarse mediante el ligador, en diferentes sitios en el anticuerpo.

Para algunos conjugados de anticuerpo-fármaco, el cociente del fármaco puede resultar limitado por el número de sitios de unión en el anticuerpo. Una elevada concentración del fármaco, por ejemplo, cociente del fármaco >5, puede causar agregación, insolubilidad, toxicidad o pérdida de la permeabilidad celular de ciertos fármacos de anticuerpos conjugados. Típicamente, menos porciones de fármaco que el máximo teórico son conjugadas a un anticuerpo durante una reacción de conjugación.

La carga del fármaco asimismo a la que se hace referencia asimismo como la relación anticuerpo-fármaco (DAR) es el número medio de fármacos por agente de unión a la célula.

En el caso de isotipos de anticuerpo IgG1 e IgG4, cuando los fármacos están unidos a cisteínas después de la reducción parcial del anticuerpo, la carga del fármaco puede variar desde 1 a 8 fármacos (D) por anticuerpos, es decir, cuando porciones de fármaco 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8 se unen covalentemente al anticuerpo.

En el caso de isotipo de anticuerpo IgG2, cuando los fármacos están unidos a cisteínas después de la reducción parcial del anticuerpo, la carga del fármaco puede variar desde 1 a 12 fármacos (D) por anticuerpos, es decir, cuando las porciones de fármaco 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12 se unen covalentemente al anticuerpo.

Las composiciones de ADC incluyen colecciones de agentes aglutinantes de células, por ejemplo, anticuerpos, conjugados con una amplia gama de fármacos, de 1 a 80, 1 a 40, 1 a 20, 1 a 8 o 1 a 12.

El número medio de fármacos por anticuerpos en preparaciones de la ADC a partir de reacciones de conjugación puede caracterizarse por medios convencionales como UV, HPLC de fase inversa, HIC, espectrometría de masas, ensayo ELISA y electroforesis.

Como forma de realización no limitativa, en la presente memoria se presenta la conjugación con el anticuerpo c208F2 (ar. 1). En este caso, el fármaco se acopla a por lo menos una cisteína seleccionada de entre i) para la cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 28, el residuo Cys. en la posición 214 y ii) para la cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 23, los residuos Cys. en la posición 223, 229 y 232.

Como forma de realización no limitativa, en la presente memoria se presenta la conjugación con el anticuerpo c208F2 (ar. 1). En este caso, el fármaco se acopla a dos, tres o cuatro cisteínas seleccionadas a partir de i) para la cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 28, el residuo Cys. en la posición 214 y ii) para la cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 23, los residuos Cys. en la posición 223, 229 y 232.

Como forma de realización no limitativa, en la presente memoria se presenta la conjugación con el anticuerpo hz208F2 (var. 1). En este caso, el fármaco se acopla a por lo menos una cisteína seleccionada de entre i) para la cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 39, el residuo Cys. en la posición 214 y ii) para la cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 37, los residuos Cys. en la posición 223, 229 y 232.

Como forma de realización no limitativa, en la presente memoria se presenta la conjugación con el anticuerpo hz208F2 (var. 3). En este caso, el fármaco se acopla a dos, tres o cuatro cisteínas seleccionadas a partir de i) para la cadena ligera de la secuencia SEC ID n° 40, el residuo Cys. en la posición 214 y ii) para la cadena pesada de la secuencia SEC ID n° 38, los residuos Cys. en la posición 223, 229 y 232.

Una alternativa consiste en el acoplamiento de lisina. Un anticuerpo puede contener, por ejemplo, muchos residuos de lisina que no reaccionan con el producto intermedio fármaco-ligador (D-L) o un reactivo de ligador. Sólo los grupos lisina más reactivos pueden reaccionar con un reactivo de ligador reactivo para amina. Asimismo, sólo los grupos cisteína tiol más reactivos pueden reaccionar con un reactivo de ligador reactivo para tiol.

Cuando los compuestos de la invención están limitados por lisinas, la concentración del fármaco puede comprender desde 1 a 80 fármacos (D) por anticuerpo celular, aunque se puede preferir un límite superior de 40, 20, 10 u 8. Las composiciones de ADC son colecciones de agentes aglutinantes de células, por ejemplo, anticuerpos, conjugados con un amplio intervalo de fármacos, de 1 a 80, 1 a 40, 1 a 20, 1 a 10 o 1 a 8.

El ADC de la fórmula (I) según la invención puede estar en forma de una sal farmacéuticamente aceptable.

En la presente invención mediante "farmacéuticamente aceptable" se hace referencia a que puede ser utilizado en la preparación de una composición farmacéutica que por lo general es segura y sin toxicidad, y tampoco es biológicamente ni de otra manera indeseable, y que es aceptable para uso veterinario así como para su uso farmacéutico en humanos.

Mediante "sal farmacéuticamente aceptable" de un compuesto, se hace referencia a una sal que es farmacéuticamente aceptable tal como se define en la presente memoria y que presenta la actividad farmacológica deseada del compuesto de origen.

Las sales farmacéuticamente aceptables comprenden particularmente:

(1) las sales de adición de un ácido farmacéuticamente aceptable formado con ácidos inorgánicos farmacéuticamente aceptables como el clorhídrico, bromhídrico, fosfórico, sulfúrico y ácidos similares; o formado con ácidos orgánicos farmacéuticamente aceptables tales como el acético, trifluoroacético, propiónico, succínico, fumárico, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, maleico, glutámico, benzoico, salicílico, toluensulfónico, metansulfónico, esteárico, láctico y ácidos similares; y

(2) las sales de adición de una base farmacéuticamente aceptable que se forma cuando un protón ácido presente en el compuesto de origen es ya sea sustituido por un ion metálico, por ejemplo, un ion de metal alcalino, un ion de metal alcalinotérreo o un ion de aluminio; o coordinado con una base orgánica farmacéuticamente aceptable como lisina, arginina y similares; o con una base inorgánica farmacéuticamente aceptable tal como hidróxido de sodio, potasa, hidróxido de calcio y similares.

Estas sales pueden prepararse a partir de los compuestos de la invención que contienen una función ácida o alcalina y los correspondientes ácidos o bases mediante el uso de métodos químicos convencionales.

V - Tratamiento

Finalmente, la invención se refiere a un ADC como se describe anteriormente para su utilización como un fármaco, en particular en el tratamiento del cáncer.

Un objeto adicional de la presente invención es un compuesto de fórmula (I) como se define anteriormente para su utilización como medicamento, en particular para el tratamiento del cáncer.

La presente invención asimismo se refiere a la utilización de un compuesto de fórmula (I) tal como se definió anteriormente para producir un medicamento, particularmente destinado al tratamiento del cáncer.

La presente descripción divulga asimismo a un método para tratar el cáncer que comprende la administración a una persona en necesidad de la misma de una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula (I), tal como se definió anteriormente.

Los cánceres pueden ser seleccionados preferentemente de entre cánceres relacionados con IGF-1R que incluyen células tumorales que expresan o sobreexpresan la totalidad o parte de la proteína IGF-1R en su superficie.

Más particularmente, dichos cánceres son el cáncer de mama, cáncer de colon, carcinoma del esófago, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico, glioma, cáncer de pulmón, melanoma, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer de próstata, rabdomiosarcoma, cáncer renal, cáncer de tiroides, cáncer de endometrio uterino, schwanoma, neuroblastoma, cáncer escamoso oral, mesotelioma, leiomiosarcoma y cualquier fenómeno de resistencia a fármacos o cánceres.

Para evitar cualquier duda, por cánceres que expresan IGF-1R con resistencia a fármacos, deben ser entendidos no sólo los cánceres resistentes que inicialmente expresan IGF-1R sino asimismo cánceres que inicialmente no expresan o sobreexpresan IGF-1R, pero que expresan IGF-1R, una vez que han devenido resistentes a un tratamiento previo.

Otro objeto de la invención es una composición farmacéutica que comprende ADC como se describe en la memoria descriptiva.

Más particularmente, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende ADC de la invención con por lo menos un excipiente o vehículo farmacéutico aceptable.

En la presente descripción, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" o "excipiente" pretende indicar un compuesto o una combinación de compuestos que entran en una composición farmacéutica que no provoca reacciones secundarias y que permite, por ejemplo, facilitar la administración del/de los compuesto/s activo/s, un aumento en su vida útil o en su eficacia en el cuerpo, un aumento de su solubilidad en la solución o bien una mejora en su conservación. Estos vehículos farmacéuticamente aceptables y excipientes son bien conocidos y se adaptarán por el experto en la materia en función de la naturaleza y del modo de administración del/de los compuesto/s activos seleccionados.

El principio activo puede ser administrado en forma de unidad de administración, en una mezcla con los portadores farmacéuticos convencionales, a animales o a seres humanos. Las formas unitarias convenientes para su administración comprenden formas de vía oral y formas para la administración por vía parenteral (subcutánea, intradérmica, intramuscular o intravenosa).

Como composiciones sólidas, para administración oral, puede hacerse uso de comprimidos, píldoras, polvos (cápsulas de gelatina dura o blanda) o gránulos. En estas composiciones, el principio activo de la invención es mezclado con uno o más disolventes inertes tales como almidón, celulosa, sacarosa, lactosa o sílice, en una corriente de argón. Estas composiciones pueden asimismo comprender sustancias que no sean disolventes, por ejemplo uno o más lubricantes tales como estearato de magnesio o talco, un agente colorante, una capa (comprimidos recubiertos) o un barniz.

Las composiciones estériles para administración parenteral preferentemente pueden ser acuosas o no acuosas, soluciones, suspensiones o emulsiones. Como disolvente o vehículo, pueden utilizarse agua, propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales, especialmente aceite de oliva, ésteres orgánicos inyectables por ejemplo, oleato de etilo u otros solventes orgánicos adecuados. Estas composiciones pueden contener coadyuvantes, en particular agentes humectantes, isotónicos, emulsionantes, dispersantes y estabilizantes. La esterilización puede realizarse de varias maneras, por ejemplo, por filtración de higienización, incorporando agentes esterilizantes en la composición, por radiación o por calentamiento. Asimismo pueden ser preparados en forma de sólidas composiciones estériles que se pueden disolver en el momento de la utilización de agua estéril o cualquier otro medio estéril inyectable.

Preferentemente, estos ADC se administrarán por vía sistémica, en particular por la vía intravenosa, por vía intramuscular, intradérmica, intraperitoneal o subcutánea o por vía oral. De una manera más preferida, la composición que comprende la ADC según la invención será administrada varias veces, de una manera secuencial.

La invención se refiere asimismo a un kit que comprende por lo menos i) un conjugado anticuerpo-fármaco o una composición como se describe anteriormente y ii) una jeringa o frasco o ampolla en la/el que se dispone dicha composición o conjugado anticuerpo-fármaco.

Sus modos de administración, dosis y óptimas formas farmacéuticas pueden determinarse según los criterios considerados generalmente en el establecimiento de un tratamiento adaptado al paciente como, por ejemplo, la edad o el peso del cuerpo del paciente, la gravedad de su estado general, la tolerancia al tratamiento y los efectos secundarios observados.

Otras características y ventajas de la invención aparecen en la continuación de la descripción con los ejemplos y las figuras cuyas leyendas son representadas a continuación.

Leyendas de las figuras

Figuras 1A-1C: unión de anticuerpos a IGF-1R humano de origen natural mediante análisis FACS. La figura 1A representa la curva de titulación, en la estirpe celular MCF-7. IMF representa la media de intensidad de fluorescencia. La figura 1B representa la EC50 de anticuerpos anti-IGF-1 R de origen murino y quiméricos en la estirpe celular MCF-7. La figura 1 representa la Bmáx de anticuerpos anti-IGF-1 R quiméricos en la estirpe celular MCF-7.

Figuras 2A-2B: Evaluación del reconocimiento de hIGF-1R utilizando células transfectadas vs no transfectadas. La figura 2A) representa las curvas de titulación de un Ab anti-IGF-1R quimérico en estirpe celular IGF-1R+. IMF representa la media de intensidad de fluorescencia. La figura 2B representa la unión de Ab anti-IGF-1R quiméricos en la estirpe celular humana IGF-1R-.

Figuras 3A-3B: Evaluación de la especificidad de los Ab para IGF-1R vs hIR usando células transfectadas. La figura 3A representa la unión de Ab anti-IGF-1R de origen murino en la estirpe de células transfectadas hIR+. La figura 3B representa la unión de Ab anti-IGF-1 R quimérico en la estirpe celular IR+. IMF representa la media de intensidad de fluorescencia. Se introdujo GRO5 anti-hIR Mab (Calbiochem) como control positivo.

Figura 4: unión de Ab anti-IGF-1R de origen murino sobre la estirpe celular IM-9. IMF representa la media de intensidad de fluorescencia. Se introdujo GRO5 anti-hIR Mab como control positivo.

Figuras 5A-5C: Evaluación del reconocimiento del IGF-1R de mono. La figura 5A representa las curvas de titulación del Ab anti-IGF-1 R quimérico en la estirpe celular COS-7. IMF representa la media de intensidad de fluorescencia. La figura 5B representa la EC50 de anticuerpos anti-IGF-1R tanto de origen murino como quimérico en la estirpe celular COS-7. La figura 5C representa la EC50 de anticuerpos anti-IGF-1R quiméricos en células transfectadas hIGF-1 R+ y estirpe celular COS-7.

Figura 6: Los sensogramas obtenidos mediante Biacore X100 sobre la base de una tecnología SPR usando un sensorchip CM5 activado con más de 11000 RU de anticuerpo de ratón anti-Tag His químicamente injertado a la matriz de carboximetil-dextrán. El experimento se llevó a cabo con una velocidad de flujo de 30pl/min a 25°C utilizando HBS-EP+ como el amortiguador de dilución circulante y de las muestras. La figura mostró la superposición de 4 sensogramas independientes alineados en el eje X al principio de la primera inyección de los analitos y en el eje Y por el valor inicial de referencia definido justo antes de esta primera inyección. Los sensogramas obtenidos mediante la captura de la secuencia basada en humanos de la IGF1R soluble recombinante están marcados por rombos. Los sensogramas obtenidos mediante la captura de la secuencia basada en mono Cynomolgus de la IGF-1R soluble recombinante están marcados por triángulos. Los símbolos blancos corresponden a los ciclos en blanco (5 inyecciones del amortiguador circulante) y los símbolos negros corresponden a las inyecciones del creciente intervalo de concentraciones de c208F2 (5, 10, 20, 40 y 80 nM). Figura 7: Evaluación del efecto intrínseco de anticuerpos anti-hIGF-1R en la fosforilación del receptor en comparación con IGF1.

Figura 8: Inhibición de la fosforilación de IGF-1R en respuesta a IGF-1 por el anti-hIGF-1R de origen murino. Figura 9: La intensidad de señal en la superficie celular de los anticuerpos anti-IGF-1R se regula por disminución tras la incubación de las células a 37°C. Se incubaron las células MCF-7 a 4°C o 37°C durante 4 h con 10 pg/ml de Ab. La figura representa AMFI.

Figuras 10A-10B: Deterioro superficial del anticuerpo. Se evaluó el anticuerpo unido a la superficie celular después de 10, 20, 30, 60 y 120 min a 37°C. La figura 10A representa el% del IGF-1R restante en comparación con la intensidad de la señal cuantificada a 4°C. La figura 10B representa el cálculo de la media vida utilizando Software Prims y usando ajuste exponencial de deterioro.

Figura 11: Los Ab anti-hIGF-IR se internalizan. Las células se incubaron con 10 pg/ml de Ab murinos durante 0, 30 y 60 min a 37°C. Las células fueron permeabilizadas o no, y se incubaron con IgG-Alexa 488 secundaria antirratón. La membrana corresponde a la intensidad de señal sin permeabilización. El total corresponde a la intensidad de señal después de la permeabilización celular y citoplásmico corresponde al Ab internalizado. El nombre de cada anticuerpo evaluado se muestra en la parte superior de cada gráfico.

Figuras 12A-12B: Formación de imagen de la internalización del Ab. Figura 12A: Células MCF-7 incubadas con m208F2 durante 20 min a 4°C y lavadas antes de su incubación (W) a 37°C durante 15 (X), 30 (Y) y 60 (Z) min. Las células se fijaron y permeabilizaron. El Ab de m208F2 se reveló usando la IgG Alexa488 antirratón y Lamp-1 usando un anticuerpo de conejo anti-Lamp-1 y con una IgG Alexa 555 anticonejo secundaria. Figura 12B: Las células MCF-7 fueron incubadas durante 30 minutos a 37°C con anticuerpos murinos anti-hIGF-1R y se tiñeron como se describió anteriormente. La colocalización se identificó usando el programa informático accesorio del marcador de colocalización del software ImageJ.

Figura 13: Participación de la vía lisosómica en la degradación de anticuerpos.

Figura 14: El pH ácido disminuye la capacidad de unión de los cinco anticuerpos anti-IGF-1R de origen murino. Figuras 15A-15D: unión característica de la primera forma humanizada de c208F2 Mab. Propiedades de la unión de hz208F2 VH3/VL3 mAb se evaluaron sobre la estirpe celular humana MCF-7 (A), en la estirpe celular de mono COS-7 (B) y en la estirpe celular transfectada de origen murino que expresan el receptor de insulina humana (C). La unión tanto del 208F2 mAb murinos como el quimérico se evaluó en paralelo. El clon GRO5 del anticuerpo anti-h IR fue utilizado para verificar la expresión de hIR en la estirpe de células transfectadas (D). Figura 16: Desintegración superficial de anticuerpo hz208F2 VH3/VL3.

Figura 17: Superposición de sensogramas obtenidos con un dispositivo Biacore X100 basado en SPR a una temperatura de 25°C con un chip de sensor CM5 activado en ambas celdas de flujo de células con aproximadamente 12.000 RU de anticuerpos monoclonales anti-TagHis de ratón químicamente injertados a la matriz de carboximetildextrano utilizando HBS-EP+ como el amortiguador de corrimiento con una velocidad de flujo de 30pl/min. Cada uno de los sensogramas (el primero de ellos marcado por triángulos y el segundo marcado por rombos) corresponde a un ciclo completo:

1- Inyección durante un minuto de una solución de h-IGF-1R recombinante (10 pg/ml) en la segunda celda de flujo.

2- Para el primer sensograma: 5 inyecciones de amortiguador de corrimiento durante 90 seg cada una. Para el segundo sensograma: cinco inyecciones en el intervalo de concentraciones cada vez mayor de las soluciones de anticuerpo anti-IGF-1 R c208F2 durante 90 s cada una.

3- Un retraso de 300 s para la determinación de las tasas de la cinética de disociación.

4- Una regeneración de la superficie mediante una inyección durante 45 s de un amortiguador de 10 mM glicina, HCl a pH 1.5.

Figura 18: El sensograma correspondiente a la resta del sensograma en blanco (5 inyecciones de HBS-EP+) al sensograma obtenido con el intervalo cada vez mayor de concentraciones de soluciones anti-IGF1R c208F2 se presenta en color gris. El sensograma teórico correspondiente al modelo 1: 1 con los siguientes parámetros: ken = (1.206 ± 0.036) x 106 M ^s -1, kde = (7.81 ± 0.18) x 10-5 s-1, Rmáx = 307.6 ± 0.3 RU es presentado por una fina línea negra. Se informa de las concentraciones calculadas de c208F2 en el gráfico: sólo la concentración más alta (24 nM) se considera como una constante).

Figura 19: Las constantes de disociación corresponden a la media de los cuatro experimentos de ejecución para cada anticuerpo y corresponden a la relación: koffkon x 1012 que debe ser expresada en la unidad pM. Las barras de error corresponden al error estándar (n = 4).

Figura 20: las semividas corresponden a la media de los cuatro experimentos ejecutados para cada anticuerpo y corresponden a la relación: Ln(2)/koff/3600 que va a ser expresada en la unidad h. Las barras de error corresponden al error estándar (n = 4).

Figura 21: Citotoxicidad celular de anti-IGF-1R, junto con tres compuestos diferentes. Cinco anticuerpos quiméricos anti-IGF-1R se acoplaron con E-13, G-13 o F-63. Un anticuerpo irrelevante c9G4 asimismo se acopló con los mismos compuestos.

Figuras 22A-22C: evaluación en vivo de c208F2-E-13 (figura 22A), c208F2-G-13 (figura 22B) y c208F2-F-63 (figura 22) en el modelo de xenoinjerto de MCF-7.

Figuras 23A-23B: evaluación en vivo de c208F2-E-13 (figura 23A), c208F2-G-13 (figura 23B) comparado con el control ADC (c9G4-E13 y c9G4-G-13) en el modelo de xenoinjerto de MCF-7.

Figuras 24A y B: El pH ácido disminuye la capacidad de unión de los anticuerpos IGF-1R humanizados de hz208F2 H076/L024 (A) y hz208F2 (H077/L018. Figura 25: Evaluación de la citotoxicidad de c208F2-G-13 en las células normales.

Figura 26: Citotoxicidad celular de las variantes humanizadas de hz208F2 acoplado a G-13. Un anticuerpo irrelevante c9G4 asimismo se acopló con el mismo compuesto.

Figura 27: evaluación in vivo de formas humanizadas de 208F2-G-13 vs c208F2-G-13 en el modelo de xenoinjerto MCF-7.

Figuras 28A y 28B: evaluación in vivo ya sea de c208F2-G-13 (28A) o de hz208F2-4-G-13 (28B) inyectado 4 veces en comparación con una sola inyección en el modelo de xenoinjerto MCF-7.

Figuras 29A y 29B: evaluación in vivo de c208F2-E-13 (29A) y c208F2-G-13 (29B) en el modelo de xenoinjerto CaOV-3.

Ejemplos

Ejemplo 1: Generación de anticuerpos murinos creados contra ECD de IGF-1R

Para generar anticuerpos monoclonales murinos (MAb) contra el dominio extracelular (ECD) del receptor IGF-1 humano (hIGF-1R), se inmunizaron 5 ratones BALB/c s.c. 3 veces con 10 pg de la proteína rhIGF-1R (R&D Systems, Cat No. 391-GR). Alternativamente, se realizaron tres inmunizaciones adicionales con 10 pg del dominio extracelular (ECD) murino de IGF-1R (R&D Systems, Cat N° 6630-GR /Fc) en algunos animales. La primera inmunización se realizó en presencia de adyuvante completo de Freund (Sigma, St. Louis, MD, EUA). Se agregó adyuvante incompleto de Freund (Sigma) para las siguientes inmunizaciones. Tres días antes de la fusión, los ratones inmunizados fueron potenciados con 10 pg de proteína rhIGF-1R. Los esplenocitos y linfocitos se prepararon mediante perfusión del bazo y maceración de los ganglios linfáticos proximales, respectivamente, se recuperaron de 1 de cada 5 ratones inmunizados (seleccionados después de la titulación del suero de todos los ratones) y se fusionaron las células de mieloma SP2/0-Ag14 (ATCC, Rockville, MD, EUA). El protocolo de fusión es descrito por Kohler y Milstein (Nature, 256:495-497, 1975). A continuación las células fusionadas se someten a una selección HAT. En general, para la preparación de anticuerpos monoclonales o sus fragmentos funcionales, especialmente de origen murino, es posible hacer referencia a técnicas que se describen particularmente en el manual "Antibodies" (Harlow y Lano, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988). Aproximadamente 10 días después de la fusión, se detectaron las colonias de células híbridas. Para la detección primaria, unos sobrenadantes de hibridomas se evaluaron para la secreción de MAb generados contra la proteína ECD de IGF-1R por análisis FACS utilizando células tumorales MCF7 de mama (ATCC) o las células COS7 de mono (mono verde africano riñón-SV40 transformado) que expresan IGF-1R de mono sobre su superficie celular. Más precisamente, para la selección por citometría de flujo, 105 células (MCF7 o COS7) fueron dispuestas en placas en cada pocillo de una placa de 96 pozos en PBS con 1% BSA y 0.01% de azida sódica (amortiguador FACS) a 4°C. Después de una centrifugación de 2 min a 2000 rpm, el amortiguador fue retirado y fueron agregados los sobrenadantes de hibridoma que se van a someter a prueba. Después de 20 min de incubación a 4°C, las células se lavaron dos veces y un Alexa 488-conjugado anticuerpo de cabra antirratón de 1/500° diluidos en amortiguador FACS (# A11017, Molecular Probes Inc., Eugene, EuA) se añadió y se incubaron durante 20 min a 4°C. Después de un lavado final con amortiguador FACS, las células se analizaron por FACS (FACSCalibur, Becton-Dickinson) después de la adición de yoduro de propidio a cada tubo a una concentración final de 40 mg/ml. Los pocillos que contienen solamente las células y las células se incubaron con el anticuerpo secundario conjugado con Alexa 488 fueron incluidas como controles negativos. Los controles de isotipo fueron utilizados en cada experimento (Sigma, ref M90351MG). Por lo menos 5000 células fueron evaluadas para calcular el valor medio de intensidad de fluorescencia (IMF).

Además se realizó un análisis de la internalización para seleccionar únicamente la internalización de los anticuerpos. Para este ensayo, una estirpe de células MCF7 tumor fue cultivada en 1640 RMPI sin rojo de fenol con 1% L-glutamina y 10% de FACS durante 3 días antes del experimento. Las células fueron separadas a continuación utilizando tripsina y 100pl de una suspensión 4.105 células/ml se disponen en placas en las placas de 96 multipocillos en RPMI1640 sin rojo de fenol con 1% L-glutamina y 5% FBS. Después de una centrifugación de 2 min a 2000 rpm, las células fueron suspendidas nuevamente en 50pl de sobrenadante de hibridomas o soluciones de anticuerpos de control (controles de isotipo y positivo a 1 pg/ml). Después de un tiempo de incubación de 20 minutos a 4°C, las células fueron centrifugadas a 2 min a 2000 rpm y resuspendió en medio de cultivo completo frío (4°C) o caliente (37°C). Las células a continuación se incubaron durante 2 horas a 37°C o a 4°C. Entonces las células se lavaron tres veces con amortiguador FACS. Un anticuerpo de cabra marcado con Alexa 488 anti-ratón IgG se incubó durante 20 minutos y las células se lavaron tres veces antes del análisis FACS sobre población de célula negativa de yoduro de propidio.

Tras el análisis FACS, se determinaron dos parámetros: (i) la diferencia de la señal fluorescente que se detecta en la superficie de las células que se incubaron a 4°C con los obtenidos con las células que se incubaron a 37°C con un sobrenadante de hibridoma y (ii) el porcentaje del IGF-1R restante en la superficie celular.

El porcentaje del hIGF 1R restante se calcula como sigue: % de IGF-1R restante = (MFI Ab 37°c/ MFI Ab 4°c) x 100.

Además, tres pruebas ELISA fueron realizadas (antes o después de la clonación) para estudiar la unión de los anticuerpos en los humanos recombinantes (hIGF-1 R) y con proteínas murinas (mIGF-1 R) y en la proteína humana recombinante del receptor de insulina (hIR). Se conservaron anticuerpos secretores de hibridoma mostrando unión a rh- y/o rm-IGF-1 R y ninguna unión a rhIR. En resumen, las placas ELISA de 96 pocillos (Costar 3690, Corning, NY, EUA) fueron recubiertas a 100pl/pocillo ya sea con proteína rhIGF-1R (R&D Systems, cat No. 391-GR) a 0.6 pg/ml o con proteína rmIGF-1R (R&D Systems, cat No.6630-GR/Fc) a 1 pg/ml o proteína rhIR (R&D Systems, cat No.1544-IR/CF) 1 pg/ml en PBS durante la noche a 4°C. Las placas entonces fueron bloqueadas con PBS que contiened 0.5% de gelatina (#22151, Serva Electroforesis GmbH, Heidelberg, Alemania) durante 2h a 37°C. Una vez que se desechó el amortiguador de saturación sacudiendo las placas, se agregaron 100pl de cada dilución del sobrenadante a cada pocillo (ya sea el sobrenadante de hibridoma sin diluir o bien diluciones seriadas del sobrenadante) y se incubaron durante 1 h a 37°C. Después de tres lavados, se agregaron 100pl de suero policlonal de cabra anti-IgG de ratón conjugado con peroxidasa de rábano (#115-035-164, Jackson Immuno-Research Laboratories, Inc., West Grove, PA, EUA), a una dilución 1/5000 en PBS con 0.1% de gelatina y un 0.05% de Tween 20 (p:p) durante 1 h a 37°C. Luego, las placas ELISA se lavaron 3 veces y se añadió el sustrato TMB (#UP664782, Uptima, Interchim, Francia). Después de un tiempo de incubación de 10 min a temperatura ambiente, se finalizó la reacción usando 1M ácido sulfúrico, y se mide la densidad óptica a 450nm.

Los anticuerpos secretores del hibridoma de interés se expandieron y clonaron mediante dilución de límites. Una vez que se determinó el isotipo, se expandió y congeló un clon de cada código. Cada anticuerpo de interés fue producido mediante sistemas de producción in vitro llamados CellLine (Integra Biosciences) para una mayor caracterización.

Se llevaron a cabo unos ensayos adicionales para la cuestión de los análisis FACS para determinar la especificidad de unión en células IM9 (IR de humano que expresa linfoblastos B) así como células hIGF-1R transfectadas, con respecto a células no transfectadas.

Todos los datos correspondientes a los anticuerpos seleccionados fueron resumidos en la tabla 7 y demostraron que los cinco anticuerpos seleccionados reconocieron en gran medida el IGF-1R humano de origen natural expresado en células neoplásicas MCF-7 de mama o en células transfectadas. Asimismo reconocen a IGF-1R de mono en células COS-7. Estos anticuerpos no reaccionan en forma cruzada con el receptor insulínico humano muy expresado en las células IM9. Debe observarse que estos anticuerpos no reconocen bien la proteína ECD de rhIGF-1 R cuando se cubren directamente a las placas de ELISA.

Ejemplo 2: unión de anticuerpos a IGF-1R humano de origen natural mediante los análisis FACS

Los cinco anticuerpos IGF-1R de origen murino fueron quimerizados. Las propiedades de unión de los anticuerpos IGF-1R tanto quiméricos como murinos se evaluaron mediante análisis FACS de estirpe celular humana MCF-7 de adenocarcinoma de mama (ATCC #HTB-22) utilizando concentraciones cada vez mayores de anticuerpos. Para ello, las células (1x106 células/ml) se incubaron con anticuerpos IGF-1R durante 20 min a 4°C en amortiguador FACS (PBS, BSA 0.1%, 0.01% Nal\b). A continuación fueron lavados 3 veces y se incubaron con el anticuerpo secundario apropiado acoplado con Alexa 488 durante 20 minutos adicionales a 4°C en la oscuridad antes de ser lavados 3 veces en amortiguador FACS. Inmediatamente se realizó la unión de anticuerpos anti-IGF-1 R en células viables que se identificaron utilizando yoduro de propidio (que tiñe las células muertas). El máximo de intensidad de la señal obtenido con cada anticuerpo fue diseñado como Bmax y expresado en media de intensidad de fluorescencia (IMF). La CE50 de unión expresada en molaridad (M) se calculó mediante un análisis de regresión no lineal (GraphPad Prims 4.0).

La curva de titulación de cada Ab murino o quimérico demostró que los anticuerpos generados son capaces de reconocer la forma de origen natural del IGF-1 R con un perfil común de saturación (figura 1A). Para catalogar por importancia a los anticuerpos y comparar las propiedades de unión de los Ab murinos y quiméricos, la EC50 de la unión cada uno de ellos se determinó mediante un análisis de regresión no lineal. La comparación de la EC50 de cada Ab murino con su correspondiente forma quimérica demostró que las 2 formas mostraron las mismas propiedades de unión, lo que demuestra que la quimerización de Ab no afectó al reconocimiento de IGF-1 R (figuras 1B-C). En la tabla 8 se resumen los valores de CE50 y Bmax para los anticuerpos quiméricos.

Tabla 8

Ejemplo 3: Confirmación de la especificidad del anticuerpo utilizando células transfectadas de IGF-1R o IR o células IM9 que expresan niveles sign ificativos de IR

Para confirmar la especificidad de los anticuerpos generados para IGF-1R versus IR, se evaluaron mediante análisis FACS los transfectantes estables que expresan hIGF-1R o hIR. En resumen, las concentraciones cada vez mayores de mAb quiméricos se incubaron con células durante 20 min a 4°C en un amortiguador FACS (PBS, 0.1% BSA, 0.01% NaN3). A continuación las células fueron lavadas 3 veces y se incubaron con el anticuerpo secundario apropiado acoplado con Alexa 488 antes de incubarse durante 20 minutos adicionales a 4°C a oscuras y a continuación se lavaron 3 veces en amortiguador FACS. Inmediatamente se realizó la unión de anticuerpos anti-IGF-1R en células viables que se identificaron utilizando yoduro de propidio (que tiñe las células muertas). La CE50 de la unión expresada en molaridad (M) se calculó mediante un análisis de regresión no lineal (GraphPad Prims 4.0).

Las curvas de titulación obtenidas de la estirpe de células transfectadas hIGF-1R (figura 2A) con respecto a las células no transfectadas (figura 2B) confirmaron la especificidad de unión del Ab quimérico para el IGF-1 R humano. En la tabla 9 se resumen los valores de CE50 y Bmax.

Tabla 9

Para verificar la falta de unión de anticuerpos murinos y quiméricos en hIR, se utilizó una estirpe celular estable que expresa IR humano (hIR). El reconocimiento del hIR de la superficie celular de humano tanto por parte del Ab murino como quimérico fue realizado mediante análisis FACS. Las concentraciones cada vez mayores ya sea de mAb murinos o quiméricos se incubaron en la estirpe de células transfectadas hIR+ durante 20 minutos a 4°C en amortiguador FACS (PBS, 0.1% BSA, 0.01% NaNa). A continuación las células fueron lavadas 3 veces y se incubaron con el anticuerpo secundario apropiado acoplado con Alexa 488 antes de incubarse durante 20 minutos adicionales a 4°C a oscuras y a continuación se lavaron 3 veces en amortiguador FACS. Inmediatamente se realizó la unión de anticuerpos anti-IGF-1 R en células viables que se identificaron utilizando yoduro de propidio (que tiñe las células muertas). La CE50 de la unión expresada en molaridad (M) se calculó mediante un análisis de regresión no lineal (GraphPad Prims 4.0). El clon GRO5 del anticuerpo anti-hIR fue utilizado como controles positivos. Los anticuerpos murinos y quiméricos 9G4 se presentaron como anticuerpos irrelevantes.

El elevado nivel de expresión de hIR en la superficie celular de las células transfectadas fue confirmado usando el anticuerpo anti-hIR comercial GRO5 (figuras 3A y 3B). Incluso utilizando altas concentraciones de Ab de hIGF-1 R murinos (figura 3A) o el quiméricos (figura 3B), no se observó ninguna unión sobre la superficie de las células de hIR+ transfectadas. Estos resultados demostraron que los Ab anti-hIGF-1R de origen quimérico ni murino reconocieron el hIR.

Esta especificidad de reconocimiento de hIGF-1R versus IR asimismo se ha demostrado, por análisis FACS, usando células IM9, una estirpe celular de linfoma B que expresa hIR (figura 4). Para este análisis FACS, el protocolo era el mismo que el descrito anteriormente y los anticuerpos murinos fueron utilizados para evitar la reactividad cruzada del Ab antihumano secundario (células IM9 expresan Ig humana en su superficie celular). Los resultados presentados en la figura 4 demuestran una vez más que la señal esperada se observó utilizando el anticuerpo anti-hIR de GRO5 mientras que ninguno del anticuerpo murino evaluado muestra cualquier señal de enlace significativo en esta estirpe celular.

Ejemplo 4: unión de anticuerpos a IGF-1R natural de mono mediante análisis FACS y Biacore.

Uno de los primeros prerrequisitos para los estudios toxicológicos regulatorios es encontrar una especie animal relevante para evaluar el compuesto seleccionado. Como la serie de anticuerpos descritos no es capaz de reconocer el IGF-1R murino, la especie más probable para la evaluación toxicológica es el primate no humano (NHP).

Para evaluar la unión de anticuerpos anti-IGF-1R en IGF-1R de mono, la unión de anticuerpos anti-hIGF-1R murinos y quiméricos primero fue evaluada por análisis FACS en estirpe de células COS-7 con el aumento de las concentraciones de anticuerpos. Para ello, las células (1x106 células/ml) se incubaron con anticuerpos IGF-1R durante 20 min a 4°C en amortiguador FACS (PBS, 0.1%, BSA, 0.01% NaN3). Luego, las células fueron lavadas 3 veces y se incubaron con el anticuerpo secundario apropiado acoplado con Alexa 488 antes de incubarse durante 20 minutos adicionales a 4°C a oscuras y a continuación se lavaron 3 veces en amortiguador FACS. Inmediatamente se evaluó la unión de anticuerpos anti-IGF-1R en células viables que se identificaron utilizando yoduro de propidio (que tiñe las células muertas). La CE50 de la unión expresada en molaridad (M) se calculó mediante un análisis de regresión no lineal (GraphPad Prims 4.0).

Las curvas de titulación obtenidas en la estirpe de células COS-7 de mono demostraron que todos los Ab antihIGF-1R reconocen específicamente el IGF-1R expresado en la superficie de la estirpe celular de mono (figura 5A). La determinación de la EC50 para cada Ab murino y quimérico demostró que las 2 formas se compararon bien en cuanto a sus propiedades de enlace en IGF-1R de mono (figura 5B). Los resultados mostraron que todos los anti-hIGF-1R generados reconocen a IGF-1R de primate no humano.

Una comparación de enlace EC50 en las células COS-7 versus células IGF-1R transfectadas se realizó con el fin de verificar la magnitud del reconocimiento del anticuerpo quimérico en IGF-1R de humano versus mono. Los resultados que se muestran en la figura 5 demuestran un reconocimiento de IGF-1R de humano y mono por todos los anticuerpos.

Para confirmar el reconocimiento en otro tipo de mono, las células fueron transfectadas con la forma de IGF-1R mono Cynomolgus para producir IGF-1R ECD de mono soluble y fueron realizados unos experimentos Biacore con uno de los anticuerpos quiméricos (c208F2) para comparar sus propiedades de enlace de la hIGF-1 R o el IGF-1R de Cynomolgus.

Los experimentos de reconocimiento se ejecutan en un dispositivo de Biacore X 100 usando un chip de sensor CM5 activado por un anticuerpo anti-etiqueta His (su kit de captura de número de catálogo de GE Healthcare 28 9950-56). Más de 11000 r U de anticuerpos químicamente se injertan en la matriz de carboximetildextrano utilizando la química de kit de amina. Los experimentos se llevaron a cabo a 25°C con un caudal de 30pl/min usando el amortiguador de HBS-EP (GE Healthcare) como el funcionamiento y el amortiguador de dilución de la muestra. El esquema cinético de ciclo único se utilizó para definir los parámetros cinéticos de la unión de la forma quimérica del anticuerpo 208F2 (c208F2) en hIGF-1R frente a IGF-1R de macaco.

Una solución de una versión recombinante soluble del heterotetrámero de IGF-1R compuesto por 2a cadenas y los dominios extracelulares de 2p cadenas expresados con una etiqueta de 10-His C-terminal adicional, sobre la base de la secuencia del ser humano (número de catálogo de sistemas de R&D 305-GR-50) o de uno de los Cynomolgus (producida de manera doméstica) se inyectó 1 minuto en la segunda celda de flujo en una dilución definida para capturar alrededor 160 RU del antígeno. Después de la fase de captura, el amortiguador corriente se inyectó 5 veces (90 s cada inyección) o se inyectó un intervalo creciente de 5 concentraciones de c208F2 (90 s cada inyección) en ambos flujos de celda. Al final de la quinta inyección el amortiguador corriente fue pasado para definir la tasa de disociación.

La superficie entonces fue regenerada con una inyección de 10 mM glicina, amortiguador de pH 1.5 de HCl durante 30 s.

La señal computada corresponde a la diferencia entre la respuesta de la celda de flujo 2 (con IGF-1R capturado) y la respuesta de la celda de flujo 1 (sin ninguna molécula de IGF-1R) (figura 6).

Para cada molécula de IGF-1R (humano o cyno), la señal debida a las inyecciones del intervalo creciente de las concentraciones de c208F2 fue corregida por la resta de la señal obtenida con las 5 inyecciones de amortiguador (doble referencia). Los sensogramas resultantes se analizaron mediante el software Biaevaluation con un modelo 1:1. Las tasas cinéticas son bien evaluadas independientemente (2 tipos de cinética de la unión de la c208F2 en cada IGF-1R) o de manera común (las mismas tasas cinéticas del enlace de c208F2 en el ser humano y los IGF-1R de Cynomolgus). Se evaluó la calidad de la conexión por un cociente de Chi2/Rmáx inferior a 0.05 RU.

Las tasas de la cinética del enlace (ver tabla 10) definidas por separado para cada IGF-1R son estrechas y una conexión de dos sensogramas con las mismas tasas cinéticas es de buena calidad.

El anticuerpo c208F2 reconoce así el IGF-1R humano recombinante y de Cynomolgus con una constante de disociación (KD) de 0.2 nM. Las afinidades en este estudio corresponden a las afinidades funcionales (ansias) de los anticuerpos para un nivel de IGF-1R capturado de humano y mono Cynomolgus en aproximadamente 160 RU.

Tabla 10

Ejemplo 5: Efecto intrínseco de anticuerpos generados en la fosforilación de IGF-1R

Es bien conocido que los anticuerpos podrían inducir un efecto agonístico cuando se unen a receptores de tirosina cinasa. Como sería deseable seleccionar tales anticuerpos agonistas, la evaluación de la fosforilación de hIGF-1R fue estudiada usando los anticuerpos quiméricos.

Para ello, se incubaron las células MCF-7 en medio libre de suero durante la noche. Entonces, IGF-1 (100 nM) o Ab a prueba fueron agregados (10 pg/ml) durante 10 minutos a 37°C. El medio fue desechado y las células se rasparon en un amortiguador de lisis (pH 7,5) que contiene 10 mM amortiguador Tris HCl (pH 7.5), 15% NaCl (1 M), 10% de mezcla de detergente (10 mM Tris-HCl, 10% Igepal amortiguador de lisis) (Sigma Chemical Co.), desoxicolato de sodio 5% (Sigma Chemical Co.), 1 tabla TM completa de cóctel de inhibición de proteasa (Roche), 1% de juego de cóctel inhibidor de la fosfatasa II (Calbiochem), durante 90 minutos a 4°C. Los productos lisados se clarificaron mediante centrifugación a 4°C, se calentaron durante 5 minutos a 100°C y a -20°C o fueron directamente cargados en geles SDS-PAGE 4-12%. La incubación del anticuerpo primario fue realizada durante 2 h a temperatura ambiente y a continuación la incubación con los anticuerpos secundarios ligados por la HRP se realizó durante 1 h a temperatura ambiente. Las membranas fueron lavadas en TBST antes de la visualización de proteínas con ECL. Las manchas blancas se cuantificaron utilizando el software de Image J. Los valores de fosfoproteína se normalizaron con GAPDH. La fosforilación de hIGF-1R en respuesta a la IGF-1 se considera como 100% de estimulación. Se determinó el efecto de Ab anti-hIGF-1R en la fosforilación de la hIGF-1R como% de la fosforilación inducida por IGF-1.

Los resultados descritos en la figura 7 representan la media del% de pIGF-1R en respuesta al Ab anti-IGF-1R quimérico de 3 experimentos independientes -Dakota del sur en comparación con IGF-1. Como se ilustra no se detectó fosforilación significativa o menor (<10%) de hIGF-1R cuando se incubaron células MCF-7 con 10 g de Ab anti-IGF-1R.

Ejemplo 6: Inhibición de la fosforilación de IGF-1 R en respuesta a IGF-1 por anticuerpos IGF-1 R de origen murino.

Para caracterizar los anticuerpos seleccionados, se estudió su capacidad para inhibir la fosforilación inducida por IGF1. Para ello, se incubaron las células MCF-7 en medio libre de suero durante la noche. Luego, las células se incubaron durante 5 minutos y Ab murino anti-hIGF-1R antes de la adición de IGF-1 durante 2 minutos a 37°C. El medio fue desechado y las células se rasparon en un amortiguador de lisis (pH 7,5) que contiene 10 mM amortiguador Tris HCl (pH 7.5), 15% NaCl (1 M), 10% de mezcla de detergente (10 mM Tris-HCl, 10% Igepal amortiguador de lisis) (Sigma Chemical Co.), desoxicolato de sodio 5% (Sigma Chemical Co.), 1 tableta Tm completa de cóctel de inhibidor de proteasa (Roche), 1% de juego de cóctel inhibidor de la fosfatasa II (Calbiochem), durante 90 minutos a 4°C. Los productos lisados se clarificaron mediante centrifugación a 4°C, se calentaron durante 5 minutos a 100°C y a -20°C o fueron directamente cargados en geles SDS-PAGE 4-12%. La incubación del anticuerpo primario fue realizada por 2 h a temperatura ambiente y a continuación la incubación con los anticuerpos secundarios ligados por la HRP se realizó durante 1 h a temperatura ambiente. Las membranas fueron lavadas en TBST antes de la visualización de proteínas con ECL. Las manchas blancas se cuantificaron utilizando el software de Image J. Los valores de fosfo-proteína se normalizaron con GAPDH. La fosforilación de hIGF-1R en respuesta a la IGF-1 se considera como 100% de estimulación. Se determinó el efecto de Ab antihIGF-1R en la fosforilación de la hIGF-1R como% de la fosforilación inducida por IGF-1.

Toda la anti-IGF-1R Ab inhibe fuertemente la fosforilación de hIGF-1R en respuesta a IGF-1 (disminución de > 80%) (figura 8). Los mejores inhibidores de la fosforilación inducida por IGF1, de hIGF-1R, son los Mab m208F2, m212A11 y m214F8.

Ejemplo 7: Estudio de la internalización de IGF-1R después de agrupar los anticuerpos IGF-1R generados mediante los análisis FACS

Se incubaron las células MCF-7 con 10pg/ml de anticuerpos quiméricos a 4°C durante 20 min. Luego, las células se lavaron y se incubaron a 4°C o 37°C durante 4h. La cantidad de anticuerpo unido a superficie celular se determinó usando un anticuerpo secundario. El FI que se define como la diferencia entre el MFI cuantificado a 4°C y el MFI cuantificado a 37 C después de un período de incubación de 4 horas correspondió a la cantidad de Ab internalizado. El FI se presenta en la figura 9 y la tabla 11. El porcentaje de internalización a 10 pg/ml de Ab se calcula como sigue 100*(MFI a 4°C -MFI a 37°C)/MFI a 4°C y presenta en la tabla 11.

Tabla 11

Para determinar si los anticuerpos que reconocen asimismo el IGF-1 R de mono fueron capaces de interiorizar este receptor, se realizó el mismo experimento de internalización. Los resultados resumidos en la tabla 12 demostraron que todos los anticuerpos analizados fueron capaces de regular la internalización del IGF-1 R de mono.

Tabla 12

La cinética de la disminución del anticuerpo unido a superficie celular se evaluó aún más. Para ello, las células MCF-7 se siembran en placas de 96 pocillos y se incubaron con 10 pg/ml de murino durante 20 min a 4°C. Las células se lavaron después para retirar el anticuerpo no unido y en los medios a 37°C durante 10, 20, 30, 60 o 120 minutos. En cada punto temporal, las células se centrifugaron y a continuación se marcaron en la superficie sobre hielo con IgG-Alexa488 secundaria antirratón para determinar la cantidad de anticuerpo restante en la superficie celular. La intensidad de fluorescencia para cada Ab murino y para cada punto del tiempo fue normalizada por la señal a 4°C (% restante IGF-1R) y equipada para un deterioro exponencial para determinar la semivida (t1/2). La t1/2 fue considerada como el tiempo necesario para obtener una disminución del 50% de la señal. Como se ilustra en la figura 10, el nivel superficial de toda la cantidad de Ab murinos disminuyó rápidamente durante los primeros 30 min y la disminución fue casi máxima después de 60 min de incubación (figura 10A). La vida media calculada fue comprendida entre 10 a 18 min según el Ab murino (figura 10B).

Para validar que la disminución de la señal de superficie de célula fue debida a la internalización de Ab y no del receptor de pérdida, las células se incubaron con Ab murinos de 0, 30 y 60 min a 37°C (figura 11). Las células fueron fijadas y permeabilizadas o no para determinar el anticuerpo unido a la superficie celular (sin permeabilización) y la señal de anticuerpo total correspondiente a Ab internalizado unido a la superficie celular (con permeabilización). La cantidad de Ab internalizado (citoplásmico) fue determinada como sigue: MFI después de permeabilización - IMF sin permeabilización. Este experimento demostró que la disminución de la superficie de la célula limita Ab fue debido a un aumento de Ab citoplásmico demostrando que fueron internalizados Ab (figura 11). Además, la degradación de los Ab comenzó después de 1h de incubación, como se indica por la disminución de la señal después de la permeabilización (Total).

Ejemplo 8: Estudio de la internalización de IGF-1R después de unir los anticuerpos IGF-1R generados mediante análisis confocales

Para confirmar aún más la internalización de anticuerpos, la microscopía confocal fue realizada para evaluar la distribución subcelular de anticuerpos después del desplazamiento celular. Las células fueron incubadas con antihIGF-1R Ab a 37°C, se fijaron y permeabilizaron. Por lo tanto, las células fueron teñidas con un anticuerpo secundario Alexa 488 y con anticuerpos anti-Lamp-1 que se revelaron usando una IgG Alexa 555 anticonejo secundaria. Antes de la incubación a 37°C, el Ab 208F2 murino fue localizado en la membrana de células MCF-7 (figura 12A). No existe una colocalización con el marcador de lisosoma, lamp-1 se observó utilizando el plug-in highliter de colocalización del software Image J. El anticuerpo unido a la superficie celular disminuye dramáticamente después de 15 min de incubación a 37°C. De manera simultánea a la disminución del anticuerpo unido a la superficie celular, el anticuerpo intracelular fue detectado en las vesículas. Se pudo observar una rara colocalización con lamp-1. Después de 30 min de incubación, el anticuerpo unido a la superficie celular fue detectado apenas. Sin embargo, aumentó la colocalización de Ab en el lisosoma. Después de 1 h de incubación, la tinción intracelular de Ab disminuyó así como el número de colocalización con lamp-1. Esta cinética del anticuerpo unido a la superficie celular y su acumulación intracelular correlacionó con la cinética de la medición de deterioro superficial de anticuerpos por FACS. Además, como se ha descrito anteriormente con estudios de FACS, se inició la degradación de Ab murinos después de 1 h de incubación por microscopia confocal.

La internalización de todos los demás anticuerpos murinos de hIGF-1R y su colocalización con lamp-1 asimismo fueron evaluados (figura 12B). Después de 30 min de incubación a 37°C, se detectaron anticuerpos intracelulares y pudo observarse colocalización con lamp-1 lo que indica que todos los anticuerpos anti-IGF-1R seleccionados fueron efectivamente internalizados en lisosomas.

Ejemplo 9: Inhibición de la degradación de Ab utilizando un inh ib idor de lisosoma, bafilom icina A1

A fin de confirmar que los anticuerpos alcanzaron al lisosoma donde son degradados, las células fueron o no tratadas con bafilomicina A1, un potente inhibidor de las funciones del lisosoma. A continuación las células fueron incubadas con 10 pg/ml del Ab que va a ser analizado a 4°C, se lavaron y se incubaron durante 2 h a 37°C. El Ab internalizado se detectó después de la permeabilización celular utilizando un Ab anti-IgG Alexa-488 secundario de ratón. La adición de bafilomicina A1 previene la degradación de Ab intracelular (figura 13) indicando que los Ab fueron internalizados y degradados efectivamente a lisosomas.

Ejemplo 10: Efecto del pH sobre la unión de anticuerpo-IGF-1R

Ya que los anticuerpos fueron seleccionados sobre la base de su potencial de internalización y mostraron anteriormente localizarse conjuntamente con endosomas tempranos antes de entrar en el compartimento lisosomal, un enfoque interesante consistió en la selección de anticuerpos para que la estabilidad del enlace Ab/hIGF-1R fuera regulada en cuanto al pH circundante y, preferentemente, los anticuerpos que se disociaron preferencialmente del IGF-1R, cuando el pH circundante se acidificó. De hecho, la diferencia principal entre los lisosomas y endosomas tempranos es su pH luminal: en el compartimiento del endosoma el pH es aproximadamente 6 mientras que en el compartimento lisosomal el pH es de 4.5.

Es bien conocido que una vez interiorizado después de la unión de ligando (IGF1), hIGF-1R vuelve a la superficie de la célula a través de una vía de reciclaje.

Sin limitarse a una teoría, una hipótesis descrita en la presente memoria es que los anticuerpos más propensos a ser liberados de su diana de manera temprana a un pH ácido probablemente favorecerán el reciclado de diana a la membrana y por lo tanto podrían considerarse como mejores candidatos para las aproximaciones de ADC.

Con el fin de investigar si algunos de los presentes anticuerpos presentan dicha propiedad y correlacionan esta propiedad para actividad citotóxica, la unión de los MAb anti-hIGF-1 R murinos en estirpe de células MCF-7 se realizó en amortiguadores a pH diferentes. Concentraciones crecientes de mAb murino se incubaron en la estirpe de células MCF-7 durante 20 min a 4°C en diferentes pH entre 5 y 8. Las células fueron lavadas 3 veces y se incubaron con el anticuerpo secundario apropiado unido con Alexa 488 en amortiguador FACS. Las células fueron incubadas durante 20 minutos adicionales a 4°C a oscuras y lavadas 3 veces en amortiguador FACS. Inmediatamente se realizó la unión de anticuerpos anti-1R en células viables que se identificaron utilizando yoduro de propidio (que tiñe las células muertas). La CE50 de la unión expresada en molaridad (M) se calculó mediante un análisis de regresión no lineal (GraphPad Prims 4.0). Los anticuerpos anti-IGFR humanizados mostraron una menor capacidad enlazante a un pH ácido como se ilustra en la figura 14.

La unión de los Mab anti-IGF-1R humanizados en la estirpe de células MCF-7 se realizó en amortiguadores a pH diferentes. Concentraciones crecientes de mAb murino se incubaron en la estirpe de células MCF-7 durante 20 min a 4°C en diferentes pH entre 5 y 8. Las células fueron lavadas 3 veces y se incubaron con el anticuerpo secundario apropiado unido con Alexa 488 en amortiguador FACS. Las células fueron incubadas durante 20 minutos adicionales a 4°C a oscuras y y lavadas 3 veces en amortiguador FACS. Inmediatamente se realizó la unión de anticuerpos anti-IGF-1R en células viables que se identificaron utilizando yoduro de propidio (que tiñe las células muertas). La CE50 de la unión expresada en molaridad (M) se calculó mediante un análisis de regresión no lineal (GraphPad Prims 4.0). Los anticuerpos anti-IGFR humanizados mostraron una menor capacidad enlazante a un pH ácido como se ilustra en la figura 24.

Ejemplo 12: Evaluación de una forma humanizada del Mab 208F2

12.1 Evaluación de la unión e internalización de la primera forma humanizada de hz208F2 VH3/VL3 (al que se hace referencia asimismo como hz208F2 H026/L024)

La unión de la primera forma humanizada del mAb c208F2 fue evaluada en estirpes celulares MCF-7, COS-7 y NIH 3T3 IR+. Las concentraciones cada vez mayores de m208F2, c208F2 o hz208F2 VH3VL3 fueron agregadas en cada estirpe celular durante 20 min a 4°C. A continuación se lavaron las células y la unión del mAb probada fue revelada con el correspondiente anticuerpo secundario. Con el fin de validar la expresión de IR de humano en la estirpe de células transfectadas, el clon de anticuerpo anti-hIR comercial GRO5 fue utilizado y su perfil de reconocimiento ejemplificado en (figura 15D).

La comparación de la forma humanizada con las murinas o quiméricas en células MCF-7 (figura 15A) o COS-7 de mono (figura 15B) mostró unos perfiles próximos a las 3 formas probadas. El proceso de humanización no modificó la especificidad de reconocimiento del anticuerpo que es perfectamente comparable con las formas murinas y quiméricas con respecto a la ausencia de reactividad en el receptor de la insulina humana (figura 15C) cruzada.

La CE50s calculada de la primera forma humanizada de 208F2 en la célula humana MCF-7 y la estirpe de células de mono COS-7 eran similares a la determinada con la forma murina o quimérica de mAb 208F2.

La capacidad de mAb hz208F2 VH3/VL3 a internalizarse se evaluó por citometría de flujo. Se incubaron las células MCF-7 con 10 pg/ml de anticuerpos a 4°C durante 20 min. Luego, las células se lavaron y se incubaron a 4°C o 37°C durante 4 h. La cantidad de anticuerpo unido a la superficie celular se determinó usando un anticuerpo secundario. El AMFI que se define como la diferencia entre el MFI cuantificado a 4°C y el MFI cuantificado a 37°C después de un período de incubación de 4 horas correspondió a la cantidad de Ab internalizado. El AMFI se presentó en la figura 16 y la tabla 13. El porcentaje de internalización a 10 pg/ml de Ab se calcula como sigue 100*(MFI a 4°C -MFI a 37°C)/MFI a 4°C y se presenta en la tabla 13. Por lo tanto, el hz208F2 VH3/VL3 humanizado tuvo propiedades similares de unión e internalización como el que se cuantificó con los correspondientes anticuerpos murinos y quiméricos de 208F2.

Tabla 13a

12.2 Evaluación de la unión de las subsiguientes formas humanizadas de hz208F2

El mAb 208F2 fue humanizado y se evaluaron las propiedades de unión de dieciséis variantes humanizadas (incluyendo la primera forma que se describe en 12.1). Se evaluaron las propiedades de unión de las variantes humanizadas mediante análisis FACS sobre la estirpe celular humana MCF-7 de adenocarcinoma de mama y la estirpe celular Cos-7 de primate no humano usando concentraciones cada vez mayores de anticuerpos. Para ello, las células (1x106 células/ml) se incubaron con anticuerpos anti-IGF-1R durante 20 min a 4°C en un amortiguador FACS (PBS, 0.1% BSA, 0.01% NaN3). A continuación se lavaron 3 veces y se incubaron con el anticuerpo secundario apropiado acoplado con Alexa 488 durante 20 minutos adicionales a 4°C a oscuras antes de lavadas 3 veces en amortiguador FACS. Inmediatamente se realizó la unión de anticuerpos anti-IGF-1 R en células viables que se identificaron utilizando yoduro de propidio (que tiñe las células muertas). La CE50 de unión expresada en molaridad (M) se calculó mediante un análisis de regresión no lineal (GraphPad Prims 4.0).

La CE50 de variantes humanizadas demostró que todas las variantes humanizadas muestran las propiedades de unión equivalentes tanto en estirpes celulares de humano como de primate no humano.

Las EC50 de anticuerpos humanizados fueron resumidas en la tabla 13b.

Tabla 13b

12.3 Evaluación de la internalización de otra forma humanizada de hz208F2

Se incubaron células MCF-7 con 10 |jg/ml de anticuerpos humanizados a 4°C durante 20 min. Luego, las células fueron lavadas y se incubaron a 4°C o 37°C durante 4 h. La cantidad de anticuerpo unido a superficie celular se determinó usando un anticuerpo secundario en un citómetro FacsCalibur Flow. El AMFI que se define como la diferencia entre el MFI cuantificado a 4°C y el MFI cuantificado a 37°C después de un período de incubación de 4 horas correspondió a la cantidad de Ab internalizado. El AMFI se presentó en la tabla 13c. Se calculó el porcentaje de internalización a 10 jg/m l de Ab como sigue 100*(MFI a 4°C -Mf I a 37°C)/MFI a 4°C. El anticuerpo humanizado hz208F2 H077/L018 es capaz de inducir una internalización significativa de IGF-1R.

Tabla 13c

Ejemplo 13: Definición de la constante de disociación (Kd) de la unión de cinco anticuerpos quiméricos anti-IGF-IR (c208F2, c213B10, c212A11, c214F8 y c219D6) y una versión humanizada (VH3/VL3) del anticuerpo 208F2 en un IGF-1R recombinante soluble de origen humano

Las constantes de disociación (K^d) de la unión de los anticuerpos en un IGF-1R recombinante soluble de origen humano se definen por la relación entre la tasa de disociación (koff) y la tasa de asociación (kon). Los experimentos cinéticos se ejecutaron en un dispositivo Biacore X100 usando un chip de sensor CM5 activado por un anticuerpo monoclonal de ratón anti-Tag His. Aproximadamente 12000 RU de anticuerpos químicamente se injertan en la matriz de carboximetildextano utilizando la química de kit de amina.

Los experimentos se llevaron a cabo a 25°C con un caudal de 30jl/min usando el amortiguador de HBS-EP (GE Healthcare) como el funcionamiento y el amortiguador de dilución de la muestra.

El esquema cinético de ciclo único se utilizó para definir los parámetros cinéticos de la unión de los anticuerpos anti-IGF-1 R en un IGF-1R humano recombinante soluble capturado por sus dos 10 histidina-etiqueta C-terminales.

1- Una solución de una versión recombinante soluble del heterotetrámero de IGF-1R humano: las cadenas 2a y los dominios extracelulares de las cadenas 2p expresadas con una etiqueta 10-His C-terminal (número de catálogo de sistemas de R&D 305-GR-50) fue inyectada durante un minuto en la segunda celda de flujo con una concentración de 10jg/ml. Una media de 587 RU (con una desviación estándar 24 RU) del receptor soluble fueron capturados en cada uno de los 24 ciclos realizados para este estudio.

2- Después de la fase de captura, el amortiguador corriente inyectó 5 veces (90 s cada inyección) o se inyectó un intervalo creciente de 5 concentraciones de c208F2 (90 s cada inyección) en ambos flujos de celda. Al final de la quinta inyección el amortiguador corriente fue pasado para definir la tasa de disociación.

3- La superficie entonces fue regenerada con una inyección de 10 mM glicina, amortiguador de pH 1.5 de HCl durante 45 s.

La señal computada corresponde a la diferencia entre la respuesta de la celda de flujo 2 (con IGF-1R capturado) y la respuesta de la celda de flujo 1 (sin ninguna molécula de IGF-1R)

Para cada IGF-1R la señal debida a las inyecciones del intervalo creciente de las concentraciones de un anticuerpo fue corregida por la resta de la señal obtenida con las 5 inyecciones de amortiguador (doble referencia). Ver figura 17.

Los sensogramas resultantes se analizaron mediante el software Biaevaluation con un modelo 1:1.

Se ejecutaron cuatro experiencias para cada anticuerpo utilizando dos diferentes intervalos de concentraciones: 40, 20, 10, 5 y 2.5 nM para los dos primeros experimentos y: 24, 12, 6, 3 y 1.5 nM para los dos últimos experimentos ejecutados para cada anticuerpo.

Para los 6 anticuerpos probados en este experimento los datos experimentales se ajustaron bien con un modelo 1:1 con valores de Koff significativos cuando la concentración más alta fue definida como una constante y las otras cuatro concentraciones se calculan (ver figura 18).

Las constantes de disociación (Kd) se calcularon como el cociente: koffkon y la vida media de los complejos calculada como el cociente: Ln(2)/koff se representan en las figuras 19 y 20. Corresponden a la media de los cuatro experimentos independientes para cada anticuerpo. Las barras de error corresponden al error estándar (n = 4) de los valores.

Las constantes de disociación se encuentran en el intervalo de 10 a 100 pM. El anticuerpo c208F2 presenta la afinidad más débil (mayor valor de constante de disociación) para el h-IGF-1R (con Kd unos 75 pM) y su versión humanizada es por lo menos tan buena como la versión quimérica (con una Kd de aproximadamente 60 pM). Los cuatro otros anticuerpos anti-IGF-1R quiméricos presentan una afinidad similar para el hIGF1-R (con una Kd de aproximadamente 30 pM). La diferencia de las afinidades está ligada principalmente a la tasa de disociación o la vida media resultante de los complejos. Con 208F2 la vida media del complejo está entre 2 y 3 horas con las versiones quimérica y humanizada (VH3/VL3). Para los cuatro otros anticuerpos quiméricos la media de la vida media es entre 7.0 y 9.4 h.

Estas cinéticas de disociación muy lentas están claramente ligadas a la estructura bivalente de los anticuerpos que son capaces de enlazar simultáneamente por ambos de sus brazos Fab a dos moléculas adyacentes de h-IGF-1R. En este caso el nivel de moléculas capturadas de IGF-1R puede tener un impacto en la tasa de disociación. Las afinidades en este estudio corresponden a las afinidades funcionales (o ansiedades) de los anticuerpos para un nivel de IGF-1R capturado de humano y mono Cynomolgus en aproximadamente 600 RU. La diferencia de 3 veces del KD observado entre los datos que se muestran anteriormente (tabla 10) y los valores presentados en el ejemplo 13 está vinculada a un cambio del nivel de captura de hIGF-1R (600RU con respecto a 160 RU en el ejemplo 4).

Ejemplo 14: Síntesis de los fármacos de la invención

En los ejemplos siguientes se utilizan las siguientes abreviaturas:

aq. acuosa

ee exceso enantiomérico

equiv equivalente

ESI ionización por electroaspersión

LC/MS cromatografía de líquidos asociada a espectrometría de masas

HPLC cromatografía de líquidos de alta resolución

NMR resonancia magnética nuclear

sat. saturado

UV ultravioleta

Compuesto de referencia 1

Ácido (S)-2-((S)-2-((3-aminopropil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-W-((3R,4S,5S)-3-metoxi-1-((S)-2-((1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-(((S)-2-fenil-1-(tiazol-2-il)etil)amino)propil)pirrolidin-1-il)-5-metil-1-oxoheptan-4-il)-W,3-dimetilbutanamida, bis trifluoroacético

Compuesto 1A: (4R, 5S)-4-metil-5-fenil-3-propanoil-1,3-oxazolidin-2-ona

en una atmósfera inerte se disolvió en tetrahidrofurano (THF, 120 ml) (4R, 5S)-4-metil-5-fenil-1,3-oxazolidin-2-ona. La mezcla se enfrió a -78°C y fue añadido n-butilitio (14.4 ml) gota a gota. Después de la agitación durante 30 minutos a -78°C, se añadió cloruro de propanoilo (5.7 ml). La agitación fue continuada durante 30 minutos a -78 °C y a continuación durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se concentró y volvió a disolverse en 200 ml de agua. El pH de la solución se ajustó a 7 con solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio. Esta fase acuosa se extrajo 3 veces con 100 ml de acetato de etilo (EtOAc). Las fases orgánicas fueron combinadas, secadas sobre sulfato de sodio, filtradas y concentradas para producir 6.8 g (89%) del compuesto 1A en forma de un aceite amarillo.

Compuesto 1B: (2S)-2-[(1R,2R)-1-hidroxi-2-metil-3-[(4R,5S)-4-metil-2-oxo-5-fenil-1,3-oxazolidin-3-il]-3-oxopropil]pirrolidin-1 -carboxilato de terc-butilo

El compuesto 1A (17.6 g, 75.45 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en diclorometano (DCM, 286 ml) en una atmósfera inerte. Esta solución se enfrió con un baño helado. Trietilamina (TEA, 12,1 ml, 1,15 equiv) y Bu 2 BOTf (78,3 ml, 1,04 equiv) se añadieron gota a gota mientras se mantiene la temperatura de la mezcla de reacción por debajo de 2°C. La agitación continuó a 0°C durante 45 minutos, después de lo cual la reacción se enfrió a -78°C. Se añade una solución de terc-sec butilo (2S)-2-formilpirrolidin-1- carboxilato de etilo (8.5 g, 42.66 mmol, 0,57 equiv) en DCM (42 ml) gota a gota. La agitación fue continuada durante 2 horas a -78°C, a continuación 1 hora a 0°C y finalmente 1 hora a temperatura ambiente. La reacción fue neutralizada con 72 ml de amortiguador fosfato (pH = 7.2-7.4) y 214 ml de metanol y se enfría a 0°C. Una solución de peróxido de hidrógeno 30% en metanol (257 ml) fue añadida gota a gota, manteniendo la temperatura por debajo de 10°C. La agitación fue continuada durante 1 hora a 0°C. La reacción fue neutralizada con 142 ml de agua, a continuación se concentró a presión reducida. La solución acuosa resultante se extrajo 3 veces con 200 ml EtOAc. Las fases orgánicas fueron combinadas, secadas sobre sulfato de sodio, filtradas y concentradas. El residuo se purificó en una columna de sílice con una mezcla de EtOAc y éter de petróleo (EtOAc: PE = 1:8) para producir 13.16 g (40%) del compuesto 1B en forma de un aceite incoloro.

Compuesto 1C: Ácido (2R,3R)-3-[(2S)-1-[(terc-butoxi)carbonil]pirrolidin-2-il]-3-hidroxi-2-metilpropanoico

El compuesto 1B (13.16 g, 30.43 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en THF (460 ml) en presencia de peróxido de hidrógeno (30% en agua, 15.7 ml), después se enfrió con un baño helado. Se añadió gota a gota mientras se mantiene la temperatura de reacción por debajo de 4°C una solución acuosa de hidróxido de litio (0.4 mol/L, 152.1 ml). Una solución acuosa de Na2 SO3 (1 mol/l, 167.3 ml) se añadió gota a gota mientras se mantuvo la temperatura a 0°C. La mezcla de reacción se agitó 14 horas a temperatura ambiente, después se neutralizó con 150 ml de solución saturada de bicarbonato de sodio frío y se lavó 3 veces con 50 ml de DCM. Se ajustó el pH de la solución acuosa con una solución acuosa de 1 M de KHSO4. Esta fase acuosa se extrajo 3 veces con 100 ml de EtOAc. Las fases orgánicas fueron combinadas, secadas sobre sulfato de sodio, filtradas y concentradas para producir 7.31 g (88%) del compuesto 1A en forma de un aceite amarillo.

Compuesto 1D: Ácido (2R,3R)-3-[(2S)-1-[(terc-butoxi)carbonil]pirrolidin-2-il]-3-metoxi-2-metilpropanoico

El compuesto 1C (7.31 g, 26.74 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en una atmósfera inerte en THF (135 ml) en presencia de yodometano (25.3 ml). El medio de reacción se enfrió con un baño helado después de lo cual se añadió NaH (60% en aceite, 4.28 g) en partes. La reacción se dejó en agitación de 3 días a 0 C y después se neutralizó con 100 ml de solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio y se lavó 3 veces con 50 ml de éter. Se ajustó el pH de la solución acuosa con una solución acuosa de 1 M de KHSO4. Esta fase acuosa se extrajo 3 veces con 100 ml de EtOAc. Las fases orgánicas fueron combinadas, secadas sobre sulfato de sodio, filtradas y concentradas para producir 5.5 g (72%) del compuesto 1a en forma de un aceite amarillo.

Compuesto 1E: W-metoxi-W-metil-2-fenilacetamida

Un ácido 2-fenilacético (16,2 g, 118,99 mmol, 1,00 equiv) se disolvió en dimetilformamida (DMF, 130 ml) después se enfrió a -10°C. Se añadió dietil fosforocianidato (DEPC, 19.2 ml) de hidrocloruro de metoxi (metil) amina (12.92 g, 133.20 mmol, 1,12 equiv) y trietilamina (33.6 ml). La mezcla de reacción se agitó 30 minutos a - 10°C después de 2.5 horas a temperatura ambiente. A continuación fue extraída dos veces con 1 litro de EtOAc. Las fases orgánicas fueron combinadas, se lavaron dos veces con 500 ml de NaHCO3 (sat.), una vez con 400 ml de agua, a continuación secadas sobre sulfato de sodio, filtradas y concentradas. El residuo se purificó en una columna de sílice con una mezcla de EtOAc y PE (1:100 a 1:30) para producir 20,2 g (40%) de un compuesto 1E parcialmente purificado en forma de un aceite amarillo.

Compuesto 1F: 2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etan-1-ona

Se disolvió tetrametiletilendiamina (TMEDA, 27.2 ml) en THF 300 ml) en una atmósfera inerte, después se enfrió a -78°C antes de la adición gota a gota de n-BuLi (67.6 ml, 2.5 M). 2-bromo-1,3-tiazol (15,2 ml) se añadió gota a gota y la agitación continuó 30 minutos a -78°C. Compuesto 1E (25 g, 139,50 mmol, 1,00 equiv) disuelto en THF (100 ml) se añadió gota a gota. La agitación fue continuada durante 30 minutos a -78°C a continuación 2 horas a -10°C. La reacción fue neutralizada con 500 ml de KHSÜ4 (sat.), a continuación se extrae 3 veces con 1 litro de EtOAc. Las fases orgánicas se combinaron, lavaron dos veces con 400 ml de agua y dos veces con 700 ml de NaCl (sat.), a continuación se secaron sobre sulfato de sodio, filtrado y concentrado. El residuo se purificó en una columna de sílice con una mezcla de EtOAc y PE (1:100 a 1:10) para producir 25 g (40%) de un compuesto 1F parcialmente purificado en forma de un aceite amarillo.

Compuesto 1G: (1R)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etan-1-ol

En una atmósfera inerte, una solución del compuesto 1F (15 g, 73,8 mmol, 1,00 eq.) en éter, se añadió gota a gota a (+)-B-clorodiisopinocanfeilborano ((+)-Ipc2BCl, 110.8 ml). La mezcla de reacción se agitó 24 horas a 0°C, después se neutralizó con 300 ml de una (1: 1) mezcla de NaÜH (10% en agua) y H2 O2 (30% en agua), y finalmente se extrajo tres veces con 500 ml de EtOAc. Las fases orgánicas fueron combinadas, se lavaron dos veces con 300 ml de NaHCO3 (sat.), una vez con 500 ml de agua, a continuación secadas sobre sulfato de sodio, filtradas y concentradas. El residuo se purificó en una columna de sílice con una mezcla de EtOAc y PE (1:100 a 1:10) para producir 6,3 g (40%) de un compuesto 1G parcialmente purificado en forma de un aceite amarillo.

Compuesto 1H: 2-[(1S)-1-azido-2-feniletil]-1,3-tiazol

Se disolvió el Compuesto 1G (6 g, 29.23 mmol, 1,00 eq.) en una atmósfera inerte en THF (150 ml) en presencia de trifenilfosfina (13g, 49.56 mmol, 1.70 eq.), después se enfrió a 0°C. Se añadió azodicarboxilato de dietilo (DEAD, 7,6 ml) gota a gota, seguido de difenilfosforilazida (DPPA, 11 ml), el baño frío se retiró y la solución se dejó agitando 48 horas a temperatura ambiente. El medio se concentró a presión reducida. El residuo se purificó en una columna de sílice con una mezcla de EtOAc y PE (1:100 a 1:30) para producir 8g (40%) de un compuesto 1H parcialmente purificado en forma de un aceite amarillo. El compuesto 1H se utilizó como tal en la siguiente etapa.

Compuesto 1I: W-[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]carbamato de tere-butilo.

Se disolvió el Compuesto 1H (6.5 g, 28.2 mmol, 1.00 eq.) en una atmósfera inerte en THF (100 ml) en presencia de trifenilfosfina (6.5 g, 33.9 mmol, 1.20 eq.), después se calentó a 50°C durante 2h. Después, se añadió amoniaco (70 ml) y continuó el calentamiento durante 3 horas. La reacción se enfrió, se neutralizó con 500 ml de agua, después se extrajo 3 veces con 500 ml de EtOAc. Las fases orgánicas se combinaron y se extrajeron dos veces con 500ml de 1N HCl. Las fases acuosas se combinaron, se determinaron a pH 8-9 mediante la adición de una solución de hidróxido de sodio (10% en agua), después se extrajo 3 veces con 500ml de DCM. Las fases orgánicas fueron combinadas, secadas sobre sulfato de sodio, filtradas y concentradas para producir 4.8 g (83%) del compuesto 1A en forma de un aceite amarillo. Este compuesto a continuación fue protegido con un Boc grupo ((tere-butoxi)carbonilo) de modo que podía ser purificado. Fue disuelto en una atmósfera inerte en 1 ,4-dioxano (40 ml), a continuación enfriado a 0°C. (Boc)2O (10.26 g, 47.01 mmol, 2.00 equiv) diluido en 20 ml de 1 ,4-dioxano se añadió gota a gota. El baño frío fue retirado y la solución puesta bajo agitación durante la noche a temperatura ambiente antes de ser neutralizada con 300 ml de agua y se extrae dos veces con 500 ml de EtOAc. Las fases orgánicas fueron combinadas, secadas sobre sulfato de sodio, filtradas y concentradas. El residuo se purificó en una columna de sílice con una mezcla de EtOAc y PE (1: 100 a 1:20, ee = 93%). A continuación fue recristalizado en una mezcla de hexano/acetona (~ 5-10/1, 1 g/10 ml) para producir 6 g (84%) del compuesto 1I en forma de un sólido blanco (ee > 99%).

Compuesto 1J : (2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-2-[[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]carbamoil]etil]pirrolidin-1-carboxilato de ferc-butilo

El Compuesto 1I (3g, 9.86 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en una atmósfera inerte con 10 ml de DCM. Se añadió ácido trifluoroacético (TFA, 10 ml) y la solución se dejó en agitación durante la noche a temperatura ambiente, después se concentró a presión reducida para proporcionar 2,0 g (64%) de (1S)-2-fenil-1- (1,3- tiazol-2-il) etan-1-amina; ácido trifluoroacético en forma de un aceite amarillo. Este producto intermedio fue redisuelto en 20 ml de DCM tras lo que se añadieron compuesto 1 D (1,8 g, 6.26 mmol, equivalente 1.05), DEPC (1,1 g, 6,75 mmol, equivalente 1.13) y diisopropiletilamina (DIEA, 1,64 g, 12.71 mmol, equivalente 2.13). La mezcla de reacción se dejó en agitación toda la noche a temperatura ambiente, a continuación se concentró a presión reducida. El residuo se purificó en una columna de sílice con una mezcla de EtOAc y PE (1:100 a 1:10) para producir 2,3 g (40%) de un compuesto 1F parcialmente purificado en forma de un aceite amarillo.

Compuesto 1K: (2R, 3R)-3-metoxi-2-metil-W-[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]-3-[(2S)pirrolidin-2-il]propanamida; ácido trifluoroacético

El Compuesto 1J (2.25 g, 4.75 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en una atmósfera inerte con 10 ml de DCM. Se le añadió TFA (10 ml) y la solución se dejó en agitación durante la noche a temperatura ambiente, a continuación se concentró a presión reducida para producir 2.18g (94%) del compuesto 1K en forma de un aceite amarillo.

Compuesto 1L: Ácido (2S,3S)-2-(bencilamin)-3-metilpentanoico

Se añadió (2S, 3S)-2-amino-3-metilpentanoico (98.4 g, 750 mmol, 1.00 equiv) a temperatura ambiente y en partes a una solución de hidróxido de sodio 2 N (375 ml). Se añade benzaldehído (79.7 g, 751.02 mmol, equivalente 1.00) rápidamente y la solución resultante se agitó 30 minutos. Borohidruro de sodio (10.9 g, 288.17 mmol, equivalente 0.38) fue agregado en pequeñas partes, mientras que se mantiene la temperatura entre 5 y 15°C. La agitación fue continuada durante 4 horas a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se diluye con 200 ml de agua, a continuación se lavó dos veces con 200 ml de EtOAc. Se ajustó el pH de la solución acuosa con una solución acuosa de 1 M de KHSO4. El precipitado formado se recogió por filtrado y proporcionó 149,2 g (90%) del compuesto 1L en forma de un sólido blanco.

Compuesto 1M: Ácido (2S,3S)-2-[bencil(metil)amino]-3-metilpentanoico

El compuesto 1L (25 g, 112.97 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en una atmósfera inerte en THF (135 ml) en presencia de yodometano (25.3 ml). La solución fue agitada 3 horas a 90°C y a continuación se concentró a presión reducida. El residuo fue triturado en 250 ml de acetona y a continuación concentrado. Esta operación de trituración/evaporación fue repetida dos veces con 500 ml de acetona para producir 21,6 g (81%) del compuesto 1 M en la forma de un sólido blanco.

Compuesto 1N: (2S,3S)-2-[bencil(metil)amino]-3-metilpentan-1-ol

LiAlH4 (0.36 g) se suspendió en 10 ml de THF en una atmósfera inerte a 0°C. Al compuesto 1M se le añadieron (1.5 g, 6.37 mmol, 1.00 equiv) en pequeñas partes mientras se mantuvo la temperatura entre 0 y 10°C. La mezcla de reacción se agitó 2 horas a 65°C, después se enfrió de nuevo a 0°C antes de ser neutralizada con adiciones sucesivas de 360 l de agua, 1 ml de hidróxido de sodio al 15% y 360 l de agua. Las sales de aluminio fueron retiradas por filtración. Las fases orgánicas fueron combinadas, secadas sobre sulfato de sodio, filtradas y concentradas. El residuo se purificó en una columna de sílice con una mezcla de EtOAc y PE (1:100 a 1:50) para producir 820 mg (40%) de un compuesto 1F parcialmente purificado en forma de un aceite amarillo.

Compuesto 1O: (2S,3S)-2-[bencil(metil)amino]-3-metilpentanal

El cloruro de oxalilo (0.4 ml) se disolvió en DCM (15 ml) en una atmósfera inerte. La solución se enfría a -70°C y una solución de dimetilsulfóxido (DMSO (0.5 ml) en DCM (10 ml) se añadió gota a gota durante 15 minutos. La mezcla de reacción fue agitada 30 minutos después de que una solución de compuesto 1N (820 mg, 3.70 mmol, equivalente 1.00) en DCM (10 ml) se añadiera gota a gota durante 15 minutos. La mezcla de reacción se agitó a 30 minutos más a baja temperatura, a continuación se añadió lentamente trietilamina (2.5 ml). La mezcla de reacción se agitó 1 hora a -50°C, el baño frío entonces fue retirado y la reacción neutralizada con 25 ml de agua que permite a la temperatura volver a la normalidad. La solución fue lavada una vez con 30 ml de solución acuosa saturada de NaCl -, a continuación secada sobre sulfato de sodio, filtrada y concentrada. El residuo se purificó en una columna de sílice con una mezcla de EtOAc y PE (1:200 a 1:10) para producir 0.42 g (40%) de un compuesto 1O parcialmente purificado en forma de un aceite amarillo.

Compuesto 1P: (2S,3S)-W-bencil-1,1-dimetoxi-W,3-dimetilpentan-2-amina

El compuesto 1O (4,7 g, 21,43 mmol, 1,00 equiv) se disolvió en 20 ml de metanol a 0°C. Se añadió gota a gota ácido sulfúrico concentrado (4,3 ml) y la agitación continuó durante 30 minutos a 0°C. Se añadió ortoformiato de trimetilo (21.4 ml), el baño frío eliminado y el medio de reacción se deja bajo agitación durante 3 horas a temperatura ambiente. El medio de reacción se diluyó con 200 ml de EtOAc, lavado sucesivamente con 100 ml de 10% Na2CO3 y 200 ml de NaCI saturado, a continuación secados sobre sulfato de sodio, filtrado y concentrado a presión reducida para obtener 3,4 g (60%) del compuesto 1 P en forma de un aceite amarillo pálido.

Compuesto 1Q: [[1-(terc-butoxi)etenil]oxi](terc-butil)dimetilsilano

Diisopropilamina (20 g, 186.71 mmol, 1,08 equiv) se disolvió en 170 ml de THF en una atmósfera inerte y se enfrió a -78°C. Se añadió BuLi (2,4 M, 78,8 ml) gota a gota y la solución se agita 30 minutos a baja temperatura (para proporcionar LDA diisopropilamida-litio) antes de añadir tere acetato de butilo (20 g, 172,18 mmol, 1,00 equiv). La mezcla de reacción se agitó 20 minutos a -78°C antes de añadir hexametilfosforamida (HMPA, 25,8 ml) y una solución de terc-butil dimetilclorosilano (TBDMSCl, 28 g, 185.80 mmol, equivalente 1.08) en 35 ml de THF. La agitación fue continuada durante otros 20 minutos a baja temperatura, y entonces fue retirado el baño frío. El medio se concentró a presión reducida. El residuo fue redisuelto en 100 ml de agua y se extrae 3 veces con 100 ml de PE. La solución fue lavada una vez con 500 ml de solución acuosa saturada de NaCl -, a continuación secada sobre sulfato de sodio, filtrada y concentrada. El residuo se purificó por destilación a 16,6 g (83%) de compuesto 1Q en la forma de un aceite incoloro.

Compuesto 1R: heptanoato de terc-butil (3R,4S,5S)-4-[bencil(metil)amino]-3-metoxi-5-metilo

El compuesto 1P (2,0 g, 7,54 mmol, 1,00 equiv) y el compuesto 1T (2,6 g, 11,28 mmol, 1,50 equiv) se disolvieron en 33 ml de DCM en una atmósfera inerte. La solución se enfría a 0°C. DMF (1,2 g) se añadió gota a gota junto con una solución de BF3- Et2O (2,1 g) en 7.5 ml de DCM. La agitación fue continuada durante 24 horas a 0°C. El medio de reacción fue lavado una vez con 30 ml de carbonato de sodio (10%) y dos veces con 50 ml de solución acuosa saturada de NaCl -, a continuación secado sobre sulfato de sodio, filtrado y concentrado. El residuo se purificó en una columna de sílice con una mezcla de EtOAc y PE (1:100 a 1:10) para producir 1,82 g (40%) de un compuesto 1R parcialmente purificado en forma de un aceite amarillo.

Compuesto 1S: clorhidrato de (3R,4S,5S)-3-metoxi-5-metil-4-(metilamin)heptanoato

El compuesto 1R (2,4 g, 6,87 mmol, 1,00 equiv) se disolvió en una atmósfera inerte en 35 ml de etanol en presencia de Pd/C (0,12 g) y ácido clorhídrico concentrado (0,63 ml). La atmósfera de nitrógeno fue reemplazada por una atmósfera de hidrógeno y el medio de reacción se dejó en agitación 18 horas a temperatura ambiente. El medio se filtró y concentró a presión reducida. El residuo fue triturado en 50 ml de hexano y el sobrenadante retirado que, después de secado a presión reducida, proporciona 1.66 g (82%) del compuesto 1S en la forma de un sólido blanco.

Compuesto 1T: terc-butil (3R,4S,5S)-4-[(2S)-2-[[(benciloxi)carbonil]amino]-W,3-dimetilbutanamido]-3-metoxi-5-metilheptanoato

Un ácido (2S)-2-[[carbonil (benciloxi)amino]-3-metilbutanoico (15 g, 0.40 mmol, equivalente 1.00) fue disuelto en 300 ml de DCM en presencia de DIEA (38,3 ml) y hexafluorofosfato de bromotripirrolidinofosfonio (PyBrOP, 32,3 g). La solución fue agitada 30 minutos a temperatura ambiente antes de agregar el compuesto 1S (15.99 g, 0.42 mmol, equivalente 1.07). El medio de reacción se agitó 2 horas y a continuación concentrado. El residuo se purificó en una columna de sílice con una mezcla de EtOAc y PE (30:70 a 1:10) para producir 17 g (40%) de un compuesto 1T parcialmente purificado en forma de un aceite amarillo.

Compuesto 1U: terc-butil (3R,4S,5S)-4-[(2S)-2-amino-W,3-dimetilbutanamido]-3-metoxi-5-metilheptanoato

El compuesto 1T (76 mg, 0,15 mmol, 1,00 equiv) se disolvió en una atmósfera inerte en 10 ml de etanol en presencia de Pd/C (0.05 g) y ácido clorhídrico concentrado (0,63 ml). La atmósfera de nitrógeno fue reemplazada por una atmósfera de hidrógeno y el medio de reacción se dejó en agitación 2 horas a temperatura ambiente. El medio de reacción se filtra y se concentró a presión reducida para obtener 64 mg de compuesto 1U en forma de un aceite incoloro.

Compuesto 1V: (3R,4S,5S)-4-[(2S)-2-[[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil] amino]-W,3-dimetilbutanamido]-3-metoxi-5-metilheptanoato

El compuesto 1U (g 18,19, 50.74 mmol, equivalente 1.00) fue disuelto en 400 ml de una mezcla de 1, 4-dioxano/agua (1:1) en presencia de bicarbonato de sodio (12,78 g, 152 mmol, equivalente 3.00) y 9 H-fluoren-9-ilmetil cloroformiato (Fmoc-Cl g 19,69, 76 mmol, equivalente 1.50), agitado a continuación 2 horas a temperatura ambiente. La reacción se enfrió, se neutralizó con 500 ml de agua, después se extrajo 3 veces con 200 ml de EtOAc. Las fases orgánicas fueron combinadas, secadas sobre sulfato de sodio, filtradas y concentradas para producir 40 g (88%) del compuesto 1A en forma de un aceite amarillo.

Compuesto 1W: ácido (3R,4S,5S)-4-[(2S)-2-[[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil] amino]-W,3-dimetilbutanamido]-3-metoxi-5-metilheptanoico

El compuesto 1V (40 g, 68.88 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en una atmósfera inerte con 600 ml de DCM. Se añadió TFA (300 ml). La solución se agitó 2 horas a temperatura ambiente, después se concentró a presión reducida. El residuo se purificó en una columna de sílice con una mezcla de EtOAc y PE (1:100 a 1:10) para producir 23,6 g (40%) de un compuesto 1W parcialmente purificado en forma de un aceite amarillo.

Compuesto 1X: 9H-fluoren-9-ilmetilo de W-[(1S)-1-[[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-2-[[(1 S)-2-fenil-1 -(1,3-tiazol-2-il)etil]carbamoil]etil]pirrolidin-1-il]-5-metil-1-oxoheptan-4-il](metil)carbamoil]-2-metilpropil]carbamato

El compuesto 1W (2.53 g, 4.82 mmol, 1.08 equiv) se disolvió en 20 ml de DCM en presencia de compuesto 1K (2.18 g, 4.47 mmol, 1.00 equiv), DEPC (875 mg, 5.37 mmol, 1.20 equiv) y DIEA (1.25 g, 9.67 mmol, 2.16 equiv). La mezcla de reacción se dejó bajo agitación durante la noche a temperatura ambiente, después se lavó sucesivamente con 50 ml de KHSO4 saturado y 100 ml de agua, se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se concentró. El residuo se purificó en una columna de sílice con una mezcla de EtOAc y PE (1:200 a 1:10) para producir 2,8 g (40%) de un compuesto 1F parcialmente purificado en forma de un aceite amarillo.

Compuesto 1Y: (2S)-2-amino-N-[(3R,5S)-3-metoxi-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-2-[[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]carbamoil]etil]pirrolidin-1-il]-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-W,3-dimetilbutanamida

EL compuesto 1X (2,8 g, 3,18 mmol, equivalente 1.00) fue disuelto en acetonitrilo (ACN, 12 ml) en presencia de piperidina (3 ml) y dejado en agitación 18 horas a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se diluye con 50 ml de agua, a continuación se lava dos veces con 100 ml de EtOAc. Las fases orgánicas fueron combinadas, secadas sobre sulfato de sodio, filtradas y concentradas. El residuo se purificó en una columna de sílice con una mezcla de EtOAc y PE (1:100 a 1:10) para producir 1,2 g (40%) de un compuesto 1Y parcialmente purificado en forma de un aceite amarillo.

Compuesto 1ZA: ácido (2S)-2-[[(ferc-butoxi)carbonil](metil)amino]-3-metil butanoico

El ácido (2S)-2-[[(ferc-butoxi)carbonil]amino]-3-metil butanoico (63 g, 289.97 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en una atmósfera inerte en THF (1000 ml) en presencia de yodometano (181 ml). La solución fue enfriada a 0°C antes de agregar el hidruro de sodio (116 g, 4.83 mol, 16.67 equiv) en pequeñas partes. La mezcla de reacción se agitó durante 1,5 horas a 0°C, el baño frío entonces fue retirado y la agitación continuó durante 18 horas. La reacción fue neutralizada con 200 ml de agua y a continuación se concentró a presión reducida. La fase acuosa residual se diluyó con 4 litros de agua, lavada una vez con 200 ml de EtOAc y su pH ajustado a entre 3 y 4 con una solución de 1N de ácido clorhídrico. La mezcla obtenida se extrajo 3 veces con 1.2l de EtOAc. Las fases orgánicas fueron combinadas, secadas sobre sulfato de sodio, filtradas y concentradas para producir 60 g (89%) del compuesto 1ZA en forma de un aceite amarillo.

Compuesto 1ZB: (2S)-2-[[(ferc-butoxi)carbonil](metil)amino]-3-metilbutanoato de bencilo

El compuesto 1ZA (47 g, 203.21 mmol, equivalente 1.00) fue disuelto en DMF (600 ml) en presencia de LÍ2CO3 (15,8 g, 213.83 mmol, equivalente 1.05). La solución se enfría a 0°C y el bromuro de bencilo (57.9 BnBr g, 338.53 mmol, equivalente 1.67) se añadió gota a gota. La mezcla de reacción se deja en agitación toda la noche antes de ser neutralizado con 400 ml de agua y filtrada. La solución obtenida se extrae dos veces con 500 ml de EtOAc. Las fases orgánicas fueron combinadas, secadas sobre sulfato de sodio, filtradas y concentradas. El residuo se purificó en una columna de sílice con una mezcla de EtOAc y PE (1:100 a 1:20) para producir 22.5 g (40%) de un compuesto 1ZB parcialmente purificado en forma de un aceite amarillo.

Compuesto 1ZC: clorhidrato de (2S)-3-metil-2-(metilamino)butanoato de bencilo

El compuesto 1ZB (22,5 g, 70.00 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en una atmósfera inerte con 150 ml de DCM. El ácido clorhídrico gaseoso se burbujeó. La reacción fue agitada 1 hora a temperatura ambiente y a continuación concentrada a presión reducida para proporcionar 17 g (94%) del compuesto 1ZC bajo la forma de un sólido amarillo.

Compuesto 1ZD: terc-butil W-(3,3-dietoxipropil)carbamato

3.3-diethoxipropan-1-amina (6 g, 40.76 mmol, equivalente 1.00) fue disuelto en 1 ,4-dioxano (30 ml) en presencia de TEA (4,45 g, 43.98 mmol, equivalente 1.08), a continuación enfriado a 0°C. (Boc) 2 O (9,6 g, 43.99 mmol, equivalente 1.08) diluido en 20 ml de 1, 4-dioxano se añadió gota a gota. La solución se agitó 2 horas a 0°C y a continuación durante la noche a temperatura ambiente antes de ser neutralizada con 10 ml de agua. Se ajustó el pH a 5 con HCl (1%). Esta fase acuosa se extrajo 3 veces con 50 ml de EtOAc. Las fases orgánicas fueron combinadas, secadas sobre sulfato de sodio, filtradas y concentradas para producir 8,21 g (81%) del compuesto 1A en forma de un aceite amarillo.

Compuesto 1ZE: terc-butil W-(3-oxopropil)carbamato

EL compuesto 1ZD (8,20 g, 33,15 mmol, equivalente 1.00) fue disuelto en acetonitrilo (ACN, 18,75 ml) en presencia de piperidina (3 ml) y dejado en agitación 18 horas a temperatura ambiente. Este medio de reacción se extrajo 3 veces con 30 ml de EtOAc. Las fases orgánicas fueron combinadas, secadas sobre sulfato de sodio, filtradas y concentradas para producir 5 g (87%) del compuesto 1ZE en forma de un aceite color rojo oscuro.

Compuesto 1ZF: ácido (2S)-2-[(3-[[(ter-butoxi)carbonil]amino]propil)(metil)amino]-3-metilbutanoico

El compuesto 1ZE (2.4 g, 13.86 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en 50 ml de DCM en presencia de compuesto 1K (3.56 g, 13.81 mmol, 1.00 equiv), DEPC (875 mg, 5.37 mmol, 1.20 equiv) y DIEA (1.25 g, 9.67 mmol, 4.00 equiv). La solución fue agitada 30 minutos a temperatura ambiente antes de agregar el compuesto 1S (5.87 g, 27.70 mmol, equivalente 2.00). La agitación fue continuada durante la noche, entonces la reacción se neutraliza con 100 ml de agua y extrae 3 veces con 50 ml de EtOAc. Las fases orgánicas fueron combinadas, secadas sobre sulfato de sodio, filtradas y concentradas. El residuo se purificó en una columna de sílice con una mezcla de EtOAc y PE (1: 100 a 1:20, ee = 93%). El producto en bruto obtenido fue redisuelto en 20 ml de metanol en presencia de Pd/C (1,2 g) e hidrogenado durante 20 minutos a presión y temperatura normal. El medio de reacción se filtra y se concentra a presión reducida para obtener 200 mg de compuesto 1ZF en forma de un aceite incoloro.

Compuesto 1ZG: terc-butil N-(3-[[(1S)-1-[[(1S)-1-[[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-2-[[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]carbamoil]til]pirrolidin-1-il]-5-metil-1-oxoheptan-4il](metil)carbamoil]-2-metilpropil]carbamoil]-2-metilpropil](metil)amino]propil)carbamato

El compuesto 1Y (50 mg, 0.08 mmol, 1.00 equiv) se disuelve en 2 ml de DMF en presencia del compuesto 1ZF (26.2 mg, 0.09 mmol, 1.20 equiv), DIEA (37.7 ml) y hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-W,W,W’,W-tetrametiluronio (HATU, 43.3 mg, 0.11 mmol, 1.50 equiv). La reacción se enfrió, se neutralizó con 10 ml de agua, después se extrajo 3 veces con 5 ml de EtOAc. Las fases orgánicas fueron combinadas, secadas sobre sulfato de sodio, filtradas y concentradas para producir 100 mg (81%) del compuesto 1ZG en forma de un aceite incoloro.

El compuesto 1ZG (90 mg, 0.10 mmol, equivalente 1.00) se disolvió en un ambiente neutro en 2 ml de la solución de DCM y fue enfriado con un baño de hielo. TFA (1 ml) fue añadido y la reacción se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente, que a continuación se concentró a presión reducida. El residuo se purificó por HPLC preparativa (SHIMADZU Pre-CLAR-001, columna SunFire Prep C18 OBD, 5 pm, 19 x 150 mm; fase de elución: agua/ACN amortiguado con 0.05% de TFA; gradiente de 18% a 31% en 7 minutos y 31% a 100% ACN ACN en 2 minutos; detector de UV de Waters 2489 a 254 nm y 220 nm). El Compuesto 1 fue obtenido con un rendimiento del 25% (23 mg) en forma de un sólido blanco.

LC/MS/UV (columnas Atlantis T3, 3 pm, 4,6 x 100 mm; 35°C; 1 ml/min, de 30% a 60% ACN en agua (acetato de amonio de 20 mM en 6 minutos); ESI (C44H73N7O6S, masa exacta 827.53) m/z: 829 (MH+), 5.84 min (93.7%, 254 nm).

1 H NMR (300MHz, CD3OD, ppm): ó (presencia de rotámeros) 7.85 - 7.80 (m, 1H); 7.69 - 7.66 (m, 1H), 7.40 - 7.10 (m, 5H), 5.80 - 5.63 (m, 1H), 4.80 - 4.65 (m, 2H), 4.22 -4.00 (m, 1H), 3.89 - 0.74 (m, 58H).

Compuesto de referencia 2

Acido (S)-2-((S)-2-((2-aminopiridin-4-il)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-W-((3R,4S,5S)-1 -((S)-2-((S)-2-((1S,2R)-1-hidroxi-2-metil-3-oxo-3-(((S)-1-fenil-2-(tiazol-2-il)etil)amino)propil)pirrolidin-1-il)-5-metil-1-oxoheptan-4-il)-W,3-dimetilbutanamida, trifluoroacético

Compuesto 2A: terc-butil (S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il)amino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil)pirrolidin-1-carboxilato

El compuesto 1 D (2,5 g, 8,70 mmol, equivalente 1.00) y (1S,2R)-2-amino-1-fenilpropan-1-ol (1,315 g, 8,70 mmol, equivalente a 1.00) fueron disueltos en una atmósfera inerte en DMF (35 ml). La solución se enfría a 0°C y a continuación se añaden DEPC (1.39 ml) y TEA (1.82 ml) gota a gota. La mezcla de reacción se agitó 2 minutos a -10°C después de 4 horas a temperatura ambiente. La reacción se enfrió, se neutralizó con 200 ml de agua, después se extrajo 3 veces con 50 ml de EtOAc. Las fases orgánicas se combinaron, lavaron una vez con 50 ml de KHSO4 (1 mol/L), una vez con 50 ml de NaHCO3 (sat.), una vez con 50 ml de NaCl (sat.), a continuación secados sobre sulfato de sodio, filtrado y concentrado a presión reducida para producir 3.6 g (98%) del compuesto 2A en la forma de un sólido amarillo.

Compuesto 2B: (2R,3R)-W-((1S,2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il)-3-metoxi-2-metil-3-((S)-pirrolidin-2-il)propanamida2,2,2-trifluoroacetato

El compuesto 2A (2.7 g, 6.42 mmol, equivalente 1.00) fue disuelto en una atmósfera inerte en DCM (40 ml) a continuación se enfría a 0°C. Se añade TFA (25 ml) y la solución se agita durante 2 horas a 0°C. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida para proporcionar 4,4 g de compuesto 2B en forma de un aceite amarillo.

Compuesto 2C: (9H-fluoren-9-il)metil((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il)amino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil)pirrolidin-1-il)-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il) (metil)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)carbamato

Los compuestos 2B (4,4 g, 10,13 mmol, equivalente 1.00) y 1W (5.31 g, 10,12 mmol, equivalente 1.00) fueron disueltos en una atmósfera inerte en DMF (45 ml). La solución se enfría a 0°C y a continuación se añade DEPC (1.62 ml) y TEA (8.4 ml) gota a gota. La mezcla de reacción se agitó durante 2 horas a 0°C y a temperatura ambiente durante la noche. La reacción se enfrió, se neutralizó con 100 ml de agua, después se extrajo 3 veces con 50 ml de EtOAc. Las fases orgánicas se combinaron, se lavaron una vez con 50 ml de KHSO4 (1 mol/L), una vez con 50 ml de NaHCO3 (sat.), una vez con 50 ml de NaCl (sat.), a continuación se secaron sobre sulfato de sodio, filtrado y concentrado a presión reducida para producir 3.3 g (39%) del compuesto 2C en la forma de un sólido amarillo.

Compuesto 2D: (S)-2-amino-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il)amino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil)pirrolidin-1-il)-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il)-W,3-dimetilbutanamida

El compuesto 2C (300 mg, 0.36 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en una atmósfera inerte en THF (2 ml) en presencia de yodometano (0.5 ml). La solución se dejó en agitación a temperatura ambiente durante la noche a continuación se evaporó a sequedad a presión reducida. El residuo se purificó en una columna de sílice con una mezcla de EtOAc y PE (1:100 a 1:10) para producir 150 mg (40%) de un compuesto 2D parcialmente purificado en forma de un sólido blanco.

Compuesto 2E: metil 2-((terc-butoxicarbonil)amino)isonicotinato

Metil 2-aminopiridina - 4-carboxilato (2 g, 13.14 mmol, equivalente 1.00) se disolvió en tere- butanol (20 ml) después de que se añadiera di-terc-dicarbonato butílico (4,02 g, 18.42 mmol, equivalente 1.40). La mezcla de reacción se agitó a 60°C durante la noche y a continuación la reacción se detiene mediante la adición de una acuosa 1M solución de NaHCO3 (50 ml). El sólido se recuperó por filtración, lavado con 50 ml de EtOH y a continuación secado en vacuo a 2,5 g (75%) del compuesto 2E en la forma de un sólido blanco.

Compuesto 2F: (4-(hidroximetil)fenil)carbamato de terc-butilo

El compuesto 2E (2.5 g, 9.91 mmol, equivalente 1.00) y CaCb (1.65 g) se disolvió en EtOH (30 ml). La solución se enfría a 0°C y a continuación gradualmente se añadió NaBH4 (1.13 g, 29.87 mmol, equivalente 3.01). La solución se dejó en agitación toda la noche a temperatura ambiente y a continuación la reacción se detuvo con la adición de agua (50 ml). Esta fase acuosa se extrajo 3 veces con 20 ml de EtOAc. Las fases orgánicas fueron combinadas, secadas sobre sulfato de sodio, filtradas y concentradas para producir 2.0 g (90%) del compuesto 2F en forma de un aceite amarillo.

Compuesto 2G: terc-butil (4-formilpiridin-2-il)carbamato

El compuesto 2F (2.5 g, 11.15 mmol, equivalente 1.00) se disolvió en DCE (25 ml) y a continuación se añadieron 19.4 g (mmol 223.14, 20.02 equiv) de MnO2. La mezcla se dejó en agitación toda la noche a 70°C y a continuación los sólidos fueron retirados por filtración. El residuo se purificó por destilación a 1.4 g (57%) de compuesto 2G en la forma de un aceite incoloro.

Compuesto de 2H: bencil (S)-2-(((2-((terc-butoxicarbonil)amino)piridin-4-il)metil) (metil)amino)-3-metilbutanoato

El compuesto 2G (2.3 g, 10.35 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en 25 ml de THF en presencia de compuesto 1ZC (2.93 g, 11.37 mmol, 1.10 equiv), DEPC (5.39 g, 41.71 mmol, 4.03 equiv) y DIEA (4.39 g, 20.71 mmol, 2.00 equiv). La mezcla de reacción se agitó 6 horas a temperatura ambiente, después se neutralizó con 60 ml de solución saturada de bicarbonato de sodio frío y se lavó 3 veces con 20 ml de d Cm . La solución fue lavada una vez con 20 ml de solución acuosa saturada de NaCl, a continuación secada sobre sulfato de sodio, filtrada y concentrada. El residuo se purificó en una columna de sílice con una mezcla de EtOAc y PE (1:100 a 1:10) para producir 2,7 g (40%) de un compuesto 2H parcialmente purificado en forma de un aceite amarillo.

Compuesto 2I: ácido (S)-2-(((2-((ferc-butoxicarbonil)amino)piridin-4-il)metil) (metil)amino)-3-metilbutanoico

El compuesto 2 H (500 mg, 1.17 mmol, equivalente 1.00) fue disuelto en 10 ml de AcOEt y 2 ml de metanol en presencia de Pd/C (250 mg) e hidrogenado durante 3 horas a temperatura ambiente y presión atmosférica. El medio de reacción se filtra y se concentró a presión reducida para obtener 254 mg de compuesto 2I en forma de un aceite incoloro.

Compuesto 2J: terc-butil (4-((3S,6S,9S,10R)-9-((S)-sec-butil)-10-(2-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-hidroxi-1-fenilpropan-2-il)amino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil)pirrolidin-1-il)-2-oxoetil)-3,6-diisopropil-2,8-dimetil-4,7-dioxo-11-oxa-2,5,8-triazadodecil)piridin-2-il)carbamato

El compuesto 2J se preparó de manera similar al compuesto 1ZG de la amina 2D (85,2 mg, 0.14 mmol, equivalente 1.50), el ácido 2I (31,7 mg, 0.09 mmol, equivalente 1.00), HATU (42,9 mg, 0.11 mmol, equivalente de 1,20) y la DIEA (36,7 mg, 0,28 mmol, equivalente 3.02) en DMF (3 ml). Después de la evaporación a sequedad, se obtuvieron 100 mg de producto en bruto en forma de un sólido blanco.

El compuesto 2J (100 mg, 0.11 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en una atmósfera inerte con 1 ml de TFA. La reacción se agitó durante 1 hora a temperatura ambiente, después se concentró a presión reducida. El residuo se purificó por HPLC preparativa (SHIMADZU Pre-CLAR-001, columna SunFire Prep C18 OBD, 5 pm, 19 x 150 mm; fase de elución: agua/ACN amortiguado con 0.05% de TFA; gradiente de 20% a 40% en 10 minutos y 40% a 100% ACN ACN en 2 minutos; detector de UV Waters 2489 a 254 nm y 220 nm). El Compuesto 2 fue obtenido con un rendimiento del 6% (6,3 mg) en forma de un sólido blanco.

LC/MS/UV (Ascentis Express C18 columna, 2,7 pm, 4,6 x 100 mm; 40°C, 1.8 ml/min, de 10% a 95% ACN en agua (0.05% TFA) en 6 minutos); ESI (C45H73N7O7, masa exacta 823.56) m/z: 824.5 (MH+) y 412.9 (M.2H+/2, 100%), 3.21 min (99.2%, 210 nm)

1H NMR (400MHz, CD3OD, ppm): 8 (presencia de rotámeros) 7.81 - 7.79 (m, 1H); 7.39 - 7.29 (m, 5H); 6.61 - 6.59 (m, 2H); 4.84 - 4.52 (m, 1H); 4.32 - 4.02 (m, 1H); 3.90 - 2.98 (m, 10H); 2.90 - 2.78 (m, 1H); 2.55 - 0.81 (m, 39H).

Compuesto de referencia 3

ácido metil((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1 -((3R,4S,5S)-4-((S)-W,3-dimetM-2-((S)-3-metil-2-(metN(piridin-4-ilmetil)amino)butanamido)butanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanamido)-3-fenilpropanoato, trifluoroacético

Compuesto 3A: ferc-butil (S)-2-((1R,2R)-1-metoxi-3-(((S)-1-metoxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il)amino)-2-metil-3-oxopropil)pirrolidin-1-carboxilato

El compuesto 1D (3 g, 10,44 mmol, equivalente 1.00) y metil(S)-2-amino-3-fenilpropanoato (2,25 g, 12,55 mmol, equivalente 1.20) fueron disueltos en una atmósfera inerte en DMF (40 ml). La solución se enfría a 0°C y a continuación se añade DEPC (1.67 ml) y TEA (3.64 ml) gota a gota. La mezcla de reacción se agitó durante 2 horas a 0°C y a temperatura ambiente durante la noche. La reacción se enfrió, se neutralizó con 100 ml de agua, después se extrajo 3 veces con 50 ml de EtOAc. Las fases orgánicas se combinaron, lavaron una vez con 100 ml de KHSO4 (1 mol/L), una vez con 100 ml de NaHCO3 (sat.), una vez con 100 ml de NaCl (sat.), a continuación secadas sobre sulfato de sodio, filtradas y concentradas a presión reducida para producir 4 g (85%) del compuesto 2C en la forma de un sólido amarillo.

Compuesto 3B: 2,2,2-trifluoroacetato de metil(S)-2-((2R,3R)-3-metoxi-2-metil-3-((S)-pirrolidin-2-il)propanamido)-3-fenilpropanoato

El compuesto 3A (5 g, 11.15 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en una atmósfera inerte en DCM (40 ml). TFA (25 ml) fue añadido y la solución se agita durante 2 horas. El medio de reacción se filtra y se concentró a presión reducida para obtener 8 g de compuesto 1U en forma de un aceite incoloro.

Compuesto 3C: metil(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanamido)-3-fenilpropanoato

Los compuestos 3B (8,03 g, 17,36 mmol, equivalente 1.00) y 1W (9.1 g, 17,34 mmol, equivalente 1.00) fueron disueltos en una atmósfera inerte en DMF (80 ml). La solución se enfría a 0°C y a continuación se añade DEPC (2.8 ml) y té (12 ml) gota a gota. La mezcla de reacción se agitó durante 2 horas a 0°C y a temperatura ambiente durante la noche. La reacción se enfrió, se neutralizó con 200 ml de agua, después se extrajo 3 veces con 50 ml de EtOAc. Las fases orgánicas se combinaron, lavaron una vez con 50 ml de KHSÜ4 (1 mol/L), una vez con 50 ml de NaHCÜ3 (sat.), una vez con 50 ml de NaCl (sat.), a continuación secadas sobre sulfato de sodio, filtrado y concentradas a presión reducida para producir 5 g (34%) del compuesto 3C en la forma de un sólido amarillo.

Compuesto 3D: metil(S)-2 -((2R, 3R)-3 -((S)-1 -((3R, 4S, 5S)-4 -((S)-2-amino-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil) pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanamido)-3- fenilpropanoato

El compuesto 3C (5.5 g, 6.43 mmol, equivalente 1.00) se disolvió en una atmósfera inerte en una solución de fluoruro de tetrabutilamonio (TBAF, 2,61 g, 9.98 mmol, quiv 1.55) en DMF (100 ml). La reacción se enfrió, se neutralizó con 100 ml de agua, después se extrajo 3 veces con 50 ml de EtOAc. Las fases orgánicas fueron combinadas, secadas sobre sulfato de sodio, filtradas y concentradas para producir 3,3 g (81%) del compuesto 3D en forma de un aceite amarillo.

Compuesto 3E: bencil (S)-3-metil-2-(metil(piridin-4-ilmetil)amino) butanoato

El piridin-4-carbaldehído (1 g, 9.34 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en 10 ml de 1,2-dicloroetano (DCE) en presencia de compuesto 1ZC (2.9 g, 11.25 mmol, 1.21 equiv), e isopropóxido de titanio (IV) (4,19 ml, 1.40 equiv). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos a continuación 2,77 g de NaBH(OAc)3 (13.07 mmol, equivalente 1.40) fueron agregados. El medio de reacción se dejó en agitación durante toda la noche a continuación se neutraliza con 100 ml de agua y la mezcla se extrae 3 veces con 50 ml de AcOEt. Las fases orgánicas combinadas y se evaporaron a sequedad. El residuo se purificó en una columna de sílice con una mezcla de EtOAc y PE (1:100 a 1:10) para producir 1,3 g (40%) de un compuesto 3E parcialmente purificado en forma de un aceite amarillo.

Compuesto 3F: ácido (S)-3-metil-2-(metil(piridin-4-ilmetil)amino)butanoico

El compuesto 3E (800 mg, 2.56 mmol, equivalente 1.00) fue disuelto en 30 ml de AcOEt y 2 ml de metanol en presencia de Pd/C (300 mg) e hidrogenado durante 3 horas a temperatura ambiente y presión atmosférica. El medio se filtró y concentró a presión reducida. El residuo se purificó en una columna de sílice con una mezcla de EtOAc y PE (1:1 a 1:10) para producir 100 mg (40%) de un compuesto 3F parcialmente purificado en forma de un sólido blanco.

Los compuestos 3D (50 mg, 0.08 mmol, 1,00 equiv) y 3F (26,34 mg, 0,12 mmol, 1,50 equiv) se disolvieron en 3 ml de DCM. La solución se enfría a 0°C y a continuación se agregaron 0.018 ml de DEPC y 0.0392 ml de DIEA. La reacción se agitó a 0°C durante 2 horas y a continuación a temperatura ambiente durante la noche. El residuo se purificó por HPLC preparativa (SHIMADZU Pre-CLAR-001, columna SunFire Prep C18 OBD, 5 pm, 19 x 150 mm; fase de elución: agua/ACN amortiguado con 0.05% de TFA; gradiente de 20% a 40% en 10 minutos y 40% a 100% ACN ACN en 2 minutos; detector de UV Waters 2545 254 nm y 220 nm). El Compuesto 3 fue obtenido con un rendimiento del 27% (20 mg) en forma de un sólido blanco.

LC/MS/UV (Ascentis Express C18 columna, 2,7 pm, 4,6 x 100 mm; 40°C, 1.5 ml/min, de 10% a 95% ACN en agua (0.05% TFA) en 8 minutos); ESI (C46H72N6O8, masa exacta 836.5) m/z: 837.5 (MH+) y 419.4 (M.2H+/2 (100%)), 7.04 min (90.0%, 210 nm)

1H NMR (400MHz, CD3OD, ppm): 8 (presencia de rotámeros) 8.76 - 8.74 (m, 2H); 8.53 - 8.48 (m, 0.4H, NHCO intercambio incompleto); 8.29 - 8.15 (m, 0.8H, NHCO intercambio incompleto); 8.01 (s, 2H), 7.31 - 7.22 (m, 5H), 4.88 - 4.68 (m, 3H); 4.31 - 4.07 (m, 2H); 3.94 - 2.90 (m, 18H); 2.55 - 0.86 (m, 38H).

Compuesto de referencia 4

Ácido (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1 -((3R,4S,5S)-4-((S)-W,3-dimetil-2-((S)-3-metil-2-(metil(piridin-4-ilmetil)amino)butanamido)butanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanamido)-3-fenilpropanoico, ácido trifluoroacético

El compuesto 3 se disolvió (100 mg, 0.11 mmol, 1.00 eq.) en una mezcla de agua (5 ml), ACN (5 ml) y piperidina (2.5 ml). La mezcla de reacción se dejó en agitación toda la noche a temperatura ambiente, a continuación se concentró a presión reducida. El residuo se purificó por HPLC preparativa (SHIMADZU Pre-CLAR-001, columna SunFire Prep C18 OBD, 5 pm, 19 x 150 mm; fase de elución: agua/ACN amortiguado con 0.05% de TFA; gradiente de 20% a 40% en 10 minutos y 40% a 100% ACN ACN en 2 minutos; detector de UV Waters 2545 a 254 nm y 220 nm).

LC/MS/UV (Ascentis Express C18 columna, 2,7 pm, 4,6 x 100 mm; 40°C, 1.5 ml/min, de 10% a 95% ACN en agua (0.05% TFA) en 8 minutos); ESI (C45H70N6O8, masa exacta 822.5) m/z: 823.5 (MH+) y 412.4 (M.2H+/2, 100%), 6.84 min (89.1%, 210 nm).

1H NMR (400MHz, CD3OD, ppm): 8 (presencia de rotámeros) 8.79 - 8.78 (m, 2H); 8.09 (m, 2H); 7.30 - 7.21 (m, 5H); 4.80 - 4.80 (m, 1H), 4.36 - 0.87 (m, 58H).

Compuesto de referencia 6

metil(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((3-aminopropil) (metil)amino)-3-metilbutanamido)-W,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanamido)-3-fenilpropanoato, bis ácido trifluoroacético

Compuesto 6A: metil(2S)-2-[(2R)-2-[(R)-[(2S)-1-[(3R,4S,5S)-4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(3-[[(tercbutoxi)carbonil]amino]propil)(metil)amino]-3-metil butanamido]-W,3-dimetilbutanamido]-3-metoxi-5-metilheptanoil]pirrolidin-2-il](metoxi)metil]propanamido]-3-fenilpropanoato

El compuesto 3D (157,5 mg, 0.25 mmol, equivalente 1.00) fue disuelta en 0°C en una atmósfera inerte en 3 ml de DCM en presencia de ácido carboxílico 1ZF (78,7 mg, 0.27 mmol, equivalente 1.10), con DEPC (46pl) DIEA (124pl). La mezcla de reacción se agitó durante 2 horas a 0°C, el baño frío entonces fue retirado y la agitación continuó durante 4 horas. El medio de reacción se filtra y se concentró a presión reducida para obtener 200 mg de compuesto 1U en forma de un aceite incoloro. Se utilizó como tal en la siguiente etapa.

El compuesto 6A (200 mg, 0.22 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en una atmósfera inerte con 2 ml de DCM. TFA (1 ml) fue añadido gota a gota y se retira el baño frío. La mezcla de reacción se agitó 1 hora a temperatura ambiente, después se concentró a presión reducida. El residuo se purificó por HPLC preparativa (SHIMADZU Pre-CLAR-001, columna SunFire Prep C18 OBD, 5 pm, 19 x 150 mm; fase de elución: agua/ACN amortiguado con 0.05% de TFA; gradiente de 20% a 40% en 10 minutos y 40% a 100% ACN ACN en 2 minutos; detector de UV Waters 2489 a 254 nm y 220 nm).

LC/MS/UV (Ascentis Express C18 columna, 3,5 pm, 4,6 x 150 mm; 40°C, 1.5 ml/min, de 10% a 80% ACN en agua (0.1% TFA) en 18 minutos); ESI (C43H74N6O8, masa exacta 802.56) m/z: 804 (MH+); 11.50 min (91.5%, 210 nm).

1H NMR (300MHz, CD3OD, ppm): ó (presencia de rotámeros) 8.52 (d, 0.3H, NHCO intercambio incompleto); 8.25 (d, 0.5H, NHCO intercambio incompleto); 7.30-7.22 (m, 5H); 4.9-4.6 (m, 3H); 4.2-4.0 (m, 1H); 4.0-0.86 (m, 61H).

Compuesto de referencia 7

Acido (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5SH-((S)-2-((S)-2-((3-aminopropil) (metil)amino)-3-metilbutanamido)-W,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil) pirrolidin-2-M)-3-metoxi-2-metilpropanamido)-3-fenilpropanoico, bis ácido trifluoroacético

Se disolvió el compuesto 6 (70 mg, 0.08 mmol, 1.00 eq.) en una mezcla de agua (5 ml), ACN (2.5 ml) y piperidina (5 ml). La mezcla de reacción se dejó en agitación toda la noche a temperatura ambiente, a continuación se concentró a presión reducida. El residuo se purificó por HPLC preparativa (SHIMADZU Pre-CLAR-001, columna SunFire Prep C18 OBD, 5 pm, 19 x 150 mm; fase de elución: agua/ACN amortiguado con 0.05% de TFA; gradiente de 20% a 40% en 10 minutos y 40% a 100% ACN ACN en 2 minutos; detector de UV Waters 2489 a 254 nm y 220 nm).

LC/MS/UV (Ascentis Express C18 columna, 2,7 pm, 4,6 x 100 mm; 40°C, 1.5 ml/min, de 10% a 80% ACN en agua (0.05% TFA) en 8 minutos); ESI (C42H72N6O8, masa exacta 788.54) m/z: 790 (MH+), 5.71 min (96.83%, 210 nm).

1H NMR (300MHz, CD3OD, ppm): ó (presencia de rotámeros) 8.42 (d, 0.3H, NHCO intercambio incompleto); 8.15 (d, 0.2H, NHCO intercambio incompleto); 7.31-7.21 (m, 5H); 4.9-4.6 (m, 3H); 4.25-4.0 (m, 1H); 4.0-0.86 (m, 59H).

Compuesto 11

(S)-N-((3R,4S,5S)-3-metoxi-1-((S)-2-((1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-(((S)-2-fenil-1 -(tiazol-2-il)etil)amino)propil)pirrolidin-1-il)-5-metil-1-oxoheptan-4-il)-N,3-dimetil-2-((S)-3-metil-2-(metil(4-(metilamino)fenetil)amino)butanamida, ácido trifluoroacético

Compuesto 11A: W-[4-(2-hidroxietil)fenil]carbamato de ferc-butilo

Di-ferc-dicarbonato butílico (16,7 g, 77 mmol, 1.05 eq.) ha sido añadido a una solución de 2-(4-aminofenil) etanol (10 g, 72,9 mmol, 1 eq.) en THF (200 ml) y la reacción que se agitó toda la noche a temperatura ambiente. La mezcla se diluyó con EtOAc (200 ml), lavó con agua (200 ml), a continuación HCl 1M (100 ml), a continuación una solución acuosa saturada de NaHCO3 (100 ml) a continuación salmuera (100 ml). La fase orgánica fue secada sobre MgSO4 a continuación se evaporó a sequedad a presión reducida. El producto en bruto fue triturado dos veces con heptano (150 ml) y secado bajo vacío para proporcionar el compuesto 11A como un sólido blanco (14.7 g, 84%).

Compuesto 11B: W-[4-(2-oxoetil)fenil]carbamato de ferc-butilo

El compuesto 11A (2.5 g, 10,5 mmol, equivalente 1.00) se disolvió en 25 ml de DCM a continuación enfriado a -78°C. Una solución Periodinane de Dess-Martin (DMP, 6,71 g, 15,8 mmol, 1.5 equiv) en DCM (10 ml) fue añadida gota a gota. El baño frío fue retirado y la agitación continuó durante 1 hora a temperatura ambiente. La reacción fue neutralizada con 60 ml de una mezcla 50/50 de solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio - y el Na2S2O3- solución acuosa saturada. Esta fase acuosa se extrajo 3 veces con 30 ml de EtOAc. La solución fue lavada una vez con 500 ml de solución acuosa saturada de NaCl -, a continuación secada sobre sulfato de sodio, filtrada y concentrada. El residuo se purificó en una columna de sílice con una mezcla de EtOAc y PE (1:100 a 1:50) para producir 1,0 g (40%) de un compuesto 11B parcialmente purificado en forma de un aceite amarillo.

Compuesto 11C: bencil (2S)-2-[[2-(4-[[(ferc-butoxi)carbonil]amino]fenil) etil](metil)amino]-3-metilbutanoato.

El compuesto 1ZC (3.5 g, 13.6 mmol, equivalente 1.1) se disolvió en THF (30 ml) en presencia de la DIEA (6.4 g, 49.7 mmol, equivalente 4.0), aldehído 11B (2.9 g, 12.3 mmol, 1,0 equiv) y sodio triacetoxiborohidruro (5.23 g, 49.7 mmol, equivalente 2.0). La mezcla de reacción se dejó en agitación toda la noche a temperatura ambiente, a continuación neutralizada con 60 ml de solución saturada de bicarbonato de sodio. Esta fase acuosa se extrajo 3 veces con 30 ml de EtOAc. La solución fue lavada una vez con 500 ml de solución acuosa saturada de NaCl -, a continuación secada sobre sulfato de sodio, filtrada y concentrada. El residuo se purificó en una columna de sílice con una mezcla de EtOAc y PE (1:100 a 1:50) para producir 3,7 g (68%) de un compuesto 11C en forma de un aceite amarillo.

Compuesto 11D: ácido (2S)-2-[(4-[[(ferc-butoxi)carbonil]amino]propil)(metil)amino]-3-metilbutanoico

El compuesto 11C (2 g, 4.5 mmol, equivalente 1) fue disuelto en 10 ml de AcOEt y 2 ml de metanol en presencia de Pd/C (2 g) y se hidrogenó durante 2 horas a temperatura y presión normales. El medio de reacción se filtra y se concentró a presión reducida para obtener 1.2 g de compuesto 11D en forma de un aceite amarillo.

Compuesto 11E: ácido (2S)-2-[(4-[[(ferc-butoxi)carbonil]amino]propil)(metil)amino]-3-metilbutanoico

El compuesto 11D (1.2 g, 3.4 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en una atmósfera inerte en DCM (20 ml). El medio de reacción se enfrió con un baño de hielo después de que NaH (60% en aceite, 13.7 mmol, mg 549, 4.0 equiv) se añada en partes, seguido de yodometano (4.9 g, 34 mmol, 10 equiv). La reacción se enfrió, se neutralizó con 10 ml de agua, después se extrajo 3 veces con 100 ml de EtOAc. El pH de la solución acuosa se ajustó a 6-7 con ácido clorhídrico 1N. Esta fase acuosa se extrajo 3 veces con 100 ml de EtOAc. Las fases orgánicas fueron combinadas, secadas sobre sulfato de sodio, filtradas y concentradas para producir 800 mg (64%) del compuesto 11E en forma de un solido amarillo.

Compuesto 11F: terc-butil N-[4-(2-[[(1S)-1-[[(1S)-1-[[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-met¡l-2-[[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]carbamoil]etil]pirrolidin-1 -il]-5-metil-1 -oxoheptan-4il] (metil)carbamoil]-2-metilpropil]carbamoil]-2-metilpropil](metil)amino] etil)fenil]-W-metilcarbamato

El compuesto 11F se preparó de manera similar al compuesto 6A de la amina 1Y (150 mg, 0,22 mmol, equivalente 1.2) y el ácido 11E (70 mg, 0.19 mmol, 1.0 equiv). Después de la purificación en gel de sílice (EtOAc/PE 1:1) 100 mg (52%) del producto deseado se obtuvieron en forma de un sólido amarillo pálido.

El compuesto 11 fue preparado de la misma manera que el compuesto 1 del producto intermedio 11F (100 mg, 0.1 mmol). El residuo se purificó por HPLC preparativa (SHIMADZU Pre-CLAR-001, columna SunFire Prep C18 OBD, 5 pm, 19 x 150 mm; fase de elución: agua/ACN amortiguado con 0.05% de TFA; gradiente de 20% a 40% en 10 minutos y 40% a 100% ACN ACN en 2 minutos; detector de UV Waters 2489 a 254 nm y 220 nm). El Compuesto 11 fue obtenido con un rendimiento del 39% (39,7 mg) en forma de un sólido blanco.

LC/MS/UV (Ascentis Express C8 columna, 3,5 pm, 4,6 x 150 mm; 40°C, 1 ml/min, de 10% a 95% ACN en agua (0.05% TFA) en 18 minutos); ESI (C50H77N7O6, masa exacta 903.57) m/z: 904,5 (MH+), 7.53 min (93.68%, 254 nm).

1H NMR (300MHz, CD3OD, ppm): ó (presencia de rotámeros) 8.84 (d, 0.5H, NHCO intercambio incompleto); 8.7 8.5 (m, 0.9H, NHCO intercambio incompleto); 7.76-7.73 (m, 1H); 7.55 - 7.4 (m, 1H); 7.28-7.22 (m, 7H); 7.08-7.05 (m, 2H); 5.51-5.72 (m, 1H); 4.9-4.80 (m, 2H); 4.3-0.7 (m, 60H).

Compuesto 12

metil(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1 -((3R,4S,5S)-4-((S)-W,3-dimetil-2-((S)-3-metil-2-(metil(4-(metilamino)fenetil)amino)butanamido)butanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanamido)-3- fenilpropanoato, ácido trifluoroacético

En la misma manera que para las fases finales en la síntesis del compuesto 1, el compuesto 12 se preparó en dos etapas a partir de la amina 3D (118 mg, 0,19 mmol) y el ácido 11E (82 mg, 0,22 mmol). El residuo se purificó por HPLC preparativa (SHIMADZU Pre-CLAR-001, columna SunFire Prep C18 OBD, 5 pm, 19 x 150 mm; fase de elución: agua/ACN amortiguado con 0.05% de TFA; gradiente de 20% a 40% en 10 minutos y 40% a 100% ACN ACN en 2 minutos; detector de UV Waters 2489 a 254 nm y 220 nm). El Compuesto 12 fue obtenido con un rendimiento del 7% (13,7 mg) en forma de un sólido blanco.

LC/MS/UV (Ascentis Express C8 columna, 3,5 pm, 4,6 x 150 mm; 40°C, 1 ml/min, de 10% a 95% ACN en agua (0.05% TFA) en 18 minutos); ESI (C40H78N6O8, masa exacta 878.59) m/z: 879,7 (MH+), 10.07 min (90.6%, 254 nm).

1H:NMR (300MHz, CD3OD, ppm): ó (presencia de rotámeros) 7.40 (se, 2H); 7.38-7.22 (m, 7H); 4.95-4.7 (m, 3H); 4.2-4.0 (m, 1H); 3.9-0.86 (m, 62H).

Compuesto 13

ácido (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-W,3-dimetil-2-((S)-3-metil-2-(metil(4-(metilamino)fenetil)amino)butanamido)butanamido)-3-metoxi-5-metil heptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanamido)-3-fenilpropanoico, ácido trifluoroacético

El compuesto 13 fue preparado de la misma manera que el compuesto 7 del producto intermedio 12 (100 mg, 0.10 mmol). El residuo se purificó por HPLC preparativa (SHIMADZU Pre-CLAR-001, columna SunFire Prep C18 OBD, 5 pm, 19 x 150 mm; fase de elución: agua/ACN amortiguado con 0.05% de TFA; gradiente de 20% a 40% en 10 minutos y 40% a 100% ACN ACN en 2 minutos; detector de UV Waters 2489 a 254 nm y 220 nm). El Compuesto 13 fue obtenido con un rendimiento del 20% (20 mg) en forma de un sólido blanco.

LC/MS/UV (Ascentis Express C18 columna, 2,7 pm, 4,6 x 100 mm; 40°C, 1.5 ml/min, de 10% a 95% ACN en agua (0.05% TFA) en 8 minutos); ESI (C48H76N6O8, masa exacta 864.57) m/z: 865,6 (MH+), 6.05 min (90.9%, 210 nm).

1H NMR: (300MHz, CD3OD, ppm): ó (presencia de rotámeros) 7.32-7.19 (m, 9H); 4.9-4.65 (m, 3H); 4.2-4.0 (m, 1H); 3.9-0.86 (m, 59H).

Compuesto 14

(S)-2-((S)-2-((3-aminobencil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-W-((3R,4S,5S)-3-metoxi-1-((S)-2-((1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-(((S)-2-fenil-1 -(tiazol-2-il)etil)amino)propil)pirrolidin-1-il)-5-metil-1-oxoheptan-4-il)-W,3-dimetilbutanamida, ácido trifluoroacético

Compuesto 14A: (3-(hidroximetil)fenil)carbamato de terc-butilo

El (3-aminofenil)metanol (3 g, 24.36 mmol, equivalente 1.00) se disolvió en terc-butanol (60 ml) después de lo cual se añadió a continuación di-ferc-dicarbonato butílico (6,38 g, 29.23 mmol, equivalente 1.20). La mezcla de reacción se dejó en agitación toda la noche a temperatura ambiente y a continuación se diluyó la reacción agregando 200 ml de agua. Se extrajo el producto 3 veces con 100 ml de AcOEt y las fases orgánicas entonces se recombinan, secadas sobre sulfato de sodio, filtradas y concentradas a presión reducida para obtener el producto en bruto (13,85 g de compuesto 14A) en la forma de un aceite amarillo.

Compuesto 14B: (3-formilfenil)carbamato de terc-butilo

El compuesto 14A (13,8 g, 61.81 mmol, equivalente 1.00) se disolvió en DCE (400 ml) y MnO2 (54 g, 621.14 mmol, 10.05 equiv) entonces fue agregado. La mezcla se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 3 días después de que los sólidos fueron retirados por filtración. El residuo se purificó en una columna de sílice con una mezcla de EtOAc y PE (1:100 a 1:10) para producir 3 g (40%) de un compuesto 14B parcialmente purificado en forma de un sólido blanco.

Compuesto 14C: bencil (S)-2-((3-((ferc-butoxicarbonil)amino)bencil) (metil)amino)-3-metilbutanoato

El compuesto 14B (1 g, 4.52 mmol, 1.00 equiv) se disolvió en 20 ml de THF en presencia de compuesto 1ZC (1.16 g, 4.50 mmol, 1.00 equiv), DIEA (3 ml) y NaBH(OAc)3 (1.92 g, 9.06 mmol, 2.01 equiv). La mezcla de reacción se deja bajo agitación durante la noche a temperatura ambiente y se neutraliza a continuación con 100 ml de agua y se extrajo 3 veces con 50 ml de EtOAc. Las fases orgánicas fueron combinadas, secadas sobre sulfato de sodio, filtradas y concentradas. El residuo se purificó en una columna de sílice con una mezcla de EtOAc y PE (1:100 a 1:10) para producir 1,9 g (40%) de un compuesto 14C parcialmente purificado en forma de un aceite amarillo.

Compuesto 14D: Ácido (S)-2-(((3-((ferc-butoxicarbonil)amino)piridin-4-il)metil) (metil)amino)-3-metilbutanoico

El compuesto 14C (1 g, 2.34 mmol, equivalente 1.00) fue disuelto en 30 ml de AcOEt y 4 ml de metanol en presencia de Pd/C (400 mg) e hidrogenado durante 1 hora a temperatura ambiente y presión atmosférica. El medio de reacción se filtra y se concentró a presión reducida para obtener 680 mg de compuesto 14D en forma de un aceite incoloro.

Compuesto 14E: terc-butil (3-((3S,6S,9S,10R)-9-((S)-sec-butil)-3,6-diisopropil-10-(2-((S)-2-((1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-(((S)-2-fenil-1 -(tiazol-2-il)etil)amino)propil)pirrolidin-1 -il)-2-oxoetil)-2,8-dimetil-4,7-dioxo-11 -oxa-2,5,8- triazadodecil)fenil)carbamato

El compuesto 14E fue sintetizado de la misma manera que el compuesto 3 de la amina 1Y (100 mg, 0,15 mmol, equivalente 1.00), el ácido D 14 (mg 102,27, 0.30 mmol, equivalente 2.00), DEPC (0.053 ml) e DIEA (0.046 ml) en DCM (3 ml). El residuo se purificó en una columna de sílice con una mezcla de EtOAc y PE (1:1 a 1:10) para producir 100 mg (40%) de un compuesto 14E parcialmente purificado en forma de un aceite amarillo.

El compuesto 14 fue sintetizado de la misma manera que el compuesto 2 del producto intermedio 14E (100 mg, 0.10 mmol, 1.00 equiv). El residuo se purificó por HPLC preparativa (SHIMADz U Pre-CLAR-001, columna SunFire Prep C18 OBD, 5 pm, 19 x 150 mm; fase de elución: agua/ACN amortiguado con 0.05% de TFA; gradiente de 20% a 40% en 10 minutos y 40% a 100% ACN ACN en 2 minutos; detector de UV Waters 2545 a 254 nm y 220 nm). El Compuesto 14 fue obtenido con un rendimiento del 10% (10 mg) en forma de un sólido blanco.

LC/MS/UV (Ascentis Express C8 columna, 3,5 pm, 4,6 x 150 mm; 40°C, 1.8 ml/min, de 40% a 95% ACN en agua (0.05% TFA) en 18 minutos); ESI (C48H73N7O6, masa exacta 875.5) m/z: 876.5 (MH+) y 438.9 (M.2H+/2, 100%), 11.35 min (95.6%, 210 nm).

1H NMR (400MHz, CD3OD, ppm): 6 (presencia de rotámeros) 8.92 - 8.86 (m, 0.4H, NH intercambio incompleto); 8.70 - 8.54 (m, 0.6H, NH intercambio incompleto); 7.88 - 7.78 (m, 1H); 7.60 - 7.50 (m, 1H); 7.45 - 6.97 (m, 9H); 5.80 - 5.65 (m, 1H); 4.85 - 4.70 (m, 1H); 4.40 - 0.80 (m, 56H).

Compuesto 15

metil(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1 -((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((3-aminobencil) (metil)amino)-3-metilbutanamido)-W,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanamido)-3-fenilpropanoato, ácido trifluoroacético

Compuesto 15A: metil(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((3-((tercbutoxicarbonil)amino)bencil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-W,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanamido)-3-fenilpropanoato

El compuesto 15A fue sintetizado de la misma manera que el compuesto 3 de la amina 3D (200 mg, 0,32 mmol, equivalente 1.00), el ácido 14D (mg 102,27, 0.63 mmol, equivalente 2.00), DEPC (0,1103 ml) e DIEA (0,157 ml) en DCM (5 ml). El residuo se purificó en una columna de sílice con una mezcla de EtOAc y PE (1:1 a 1:10) para producir 200 mg (40%) de un compuesto 15A parcialmente purificado en forma de un sólido amarillo.

Compuesto 15: el compuesto 15 fue preparado de la misma manera que el compuesto 2 del producto intermedio 15A (200 mg, 0.21 mmol, 1.00 equiv). El producto en bruto se purificó por HPLC preparativa (SHIMADZU Pre-CLAR-001, columna SunFire Prep C18 OBD, 5 pm, 19 x 150 mm; fase de elución: agua/ACN amortiguado con 0.05% de TFA; gradiente de 20% a 40% en 10 minutos y 40% a 100% ACN ACN en 2 minutos; detector de UV Waters 2545 a 254 nm y 220 nm). El Compuesto 15 fue obtenido con un rendimiento del 19% (38,6 mg) en forma de un sólido blanco.

LC/MS/UV (Ascentis Express C18 columna, 2,7 pm, 4,6 x 100 mm; 40°C, 1.5 ml/min, de 10% a 95% ACN en agua (0.05% TFA) en 8 minutos); ESI (C47H74N6O8, masa exacta 850.5) m/z: 851.5 (MH+) y 426.4 (M.2H+/2, 100%), 6.61 min (91.1%, 210 nm).

1 H NMR (400MHz, CD3OD, ppm): 5 (presencia de rotámeros) 7.53 - 7.42 (m, 1H); 7.35 - 7.18 (m, 8H), 4.88 - 4.79 (m, 2H), 4.42 - 4.00 (m, 3H), 3.93 - 2.71 (m, 22H), 2.61 -4.00 (m, 1H), 3.89 - 0.81 (m, 33H).

Compuesto 20

(S)-2-((S)-2-((4-aminobencil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-W-((3R,4S,5S)-3-metoxi-1-((S)-2-((1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-(((S)-2-fenil-1-(tiazol-2-il)etil)amino)propil)pirrolidin-1-il)-5-metil-1-oxoheptan-4-il)-M,3-dimetilbutanamida, ácido trifluoroacético

El compuesto 20 fue preparado de la misma manera que el compuesto 1 del producto intermedio 1ZC (100 mg, 0.1 mmol).

El 4-nitrobenzaldehído que participó en la preparación del compuesto 20 era de origen comercial.

La síntesis del compuesto 20 se completó mediante la reducción del grupo nitro. Esto se llevó a cabo de la siguiente forma: (2S)-W-[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1 R,2R)-2-[[(1 S,2R)-1 -hidroxi-1-fenilpropan-2-il]carbamoil]-1-metoxi-2-metiletil]pirrolidin-1-il]-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-W,3-dimetil-2-[(2S)-3-metil-2-[metil[(4-nitrofenil)metil]amino]butanamido]butanamida (40 mg, 0.05 mmol, 1.0 equiv) se disolvió en 15 ml de etanol. Se agregó cloruro de estaño dihidratado (II) (317 mg, 1.4 mmol, equivalente 30) y la solución se dejó en agitación durante 3 días a temperatura ambiente. La reacción se neutralizó con 50 ml de agua, después se extrajo 3 veces con 50 ml de EtOAc. Las fases orgánicas fueron combinadas, secadas sobre sulfato de sodio anhidro, filtradas y concentradas a presión reducida para proporcionar el compuesto 20 en estado crudo (pureza: 93.2%; cantidad: 21.6 mg).

El compuesto se purificó por HPLC preparativa (SHIMADZU Pre-CLAR-001, columna SunFire Prep C18 OBD, 5 pm, 19 x 150 mm; fase de elución: agua/ACN amortiguado con 0.05% de TFA; gradiente de 20% a 40% en 10 minutos, a continuación 40% a 100% ACN en 2 minutos; detector UV Waters 2489 a 254 nm y 220 nm), para producir las sales TFA correspondientes en forma de sólidos color blanco.

1H NMR: (400MHz, CD3OD, ppm): ó (presencia de rotámeros) 7.85-7.80 (m, 1H); 7.6-7.5 (m, 1H); 7.4-7.15 (m, 5H); 7.1-7.05 (m, 2H); 6.73-6.70 (m, 2H); 5.8-5.55 (m, 1H); 5.0-4.7 (m, 2H); 4.25-4.05 (m, 1H); 4.0-0.8 (m, 54H). LC/MS/UV ESI: (C48H73N7O7S, masa exacta 875.53) m/z 876 (MH+), 439 [75%, (M.2H+)/2]; UV: RT = 4.83 min (96.8%, 254 nm). 1H NMR (400MHz, CD3OD, ppm): ó (presencia de rotámeros) 7.85-7.80 (m, 1H); 7.6-7.5 (m, 1H); 7.4-7.1 (m, 7H); 6.76-6.72 (m, 2H); 5.8-5.55 (m, 1H); 4.9-4.65 (m, 2H); 4.25-4.05 (m, 1H); 4.0-0.8 (m, 54H).

Compuesto 29

ácido (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((3-aminobencil) (metil)amino)-3-metilbutanamido)-W,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanamido)-3-fenilpropanoico, ácido trifluoroacético

Se disolvió el Compuesto 15 (100 mg, 0.10 mmol, 1.00 eq.) en una mezcla de agua (5 ml), ACN (5 ml) y piperidina (2.5 ml). La mezcla de reacción se dejó agitando toda la noche a temperatura ambiente, a continuación se concentró a presión reducida. El compuesto se purificó por HPLC preparativa (SHIMADZU Pre-CLAR-001, columna SunFire Prep C18 OBD, 5 pm, 19 x 150 mm; fase de elución: agua/ACN amortiguado con 0.05% de TFA; gradiente de 20% a 40% en 10 minutos, a continuación 40% a 100% ACN en 2 minutos; detector UV Waters 2489 a 254 nm y 220 nm), para producir 20mg (20%) del compuesto 29 en forma de un solido color blanco.

1,0 ml/minLC/MS/UV (Ascentis Express C8 columna, 3,5 pm, 4,6 x 150 mm; 40°C, 1.0 ml/min, de 40% a 95% ACN en agua (0.05% TfA) en 18 minutos); ESI (C46H72N6O8, masa exacta 836.54) m/z: 837.5 (MH+) y 419.4 (M.2H+/2, 100%), 10.61 min (92.5%, 210 nm).

1H NMR: (400MHz, CD3OD, ppm): ó (presencia de rotámeros) 7.38 - 7.15 (m, 6H); 7.00 - 6.99 (m, 3H); 4.85 -4.68 (m, 2H); 4.37 - 3.38 (m, 11H); 3.31 - 2.70 (m, 8H); 2.60 - 0.82 (m, 35H).

Compuesto 61

(S)-2-((S)-2-((4-aminofenetil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-W-((3R,4S,5S)-3-metoxi-1-((S)-2-((1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-(((S)-2-fenil-1 -(tiazol-2-il)etil)amino)propil)pirrolidin-1-il)-5-metil-1-oxoheptan-4-il)-W,3-dimetilbutanamida

Compuesto 61A: diclorhidrato de (4-aminofenetil)-W-metil-L-valina

El compuesto 11D (962 mg, 2.75 mmol) se disolvió en 10 ml de una solución disponible en el mercado de HCl en propan-2-ol (5-6 M), y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. El análisis TLC indica un consumo completo del material de partida. El disolvente se evaporó a presión reducida, y el resultante amarillo sólido triturado con Et2O (2 x 10 ml). El producto fue secado bajo vacío para proporcionar el compuesto 61A como un sólido amarillo (322 mg, 47%).

Compuesto 61: ácido carboxílico 61A (73 mg, 0,23 mmol, 1 eq.) y la amina 1Y (150 mg, 0,23 mmol, 1 eq.) se disolvieron en DMF seco (2 ml). Se agregaron DIEA (158pl, 0.90 mmol, 4 eq.) y DECP (también llamado DEPC) (pL 51, 0.34 mmol, 1,5 eq.) y la reacción se agita durante 4 horas a temperatura ambiente. El análisis por LC-MS demostró un consumo completo de material de partida. El solvente fue evaporado bajo presión reducida y el residuo purificado mediante cromatografía flash sobre Silicagel (DCM/MeOH) para proporcionar un compuesto 61 como un sólido amarillo claro (83 mg, 40%).

1H NMR: (500MHz, DMSO-cfe, ppm): 6 (presencia de rotámeros), 8.86 (d, 0.5H, NHCO); 8.65 (d, 0.5H, NHCO), 8.11-8.05 (m, 1H, NHCO), 7.80 (d, 0.5H, tiazol), 7.78 (d, 0.5H, tiazol), 7.65 (d, 0.5H, tiazol), 7.63 (d, 0.5H, tiazol), 7.32 - 7.12 (m, 5H), 6.83 (d, J=8.3 Hz, 2H), 6.45 (d, J=8.3 Hz, 2H), 5.56 - 5.49 (m, 0.5 H), 5.42 - 5.35 (m, 0.5H), 4.78 (s, 2H, NH2), 4.74 - 4.46 (m, 2H), 4.01 - 0.66 (m, 57H).

HPLC (Xbridge Shield C18, 3,5 pm, 4,6 x 50 mm; 3.5 ml/min, de 40°C, 0 a 95% MeCN en agua (0.1% TFA) en 2.25 minutos entonces 95% MeCN durante 0,5 minutos, Tr = 1,31 minuto (96.5%, 220 nm).

m/z (Q-TOF ESI+) 890.5558 (2%, MH+, C49H76N7O6S requiere 890.5572), 445.7834 (100%, (MH2)2+, C49H77N7O6S requiere 445.7823).

Compuesto 62

Metil((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-aminofenetil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-W,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoil)-L-fenilalaninato

El compuesto 62 fue preparado de la misma manera que el compuesto 61, utilizando ácido carboxílico 61A (69 mg, 0.21 mmol, 1 eq.), amina 3D (135 mg, 0.21 mmol, 1 eq.), D iEa (75pl, 0.43 mmol, 2 eq.) y DECP (49pl, 0.32 mmol, 1.5 eq.). El producto en bruto se purificó mediante cromatografía flash sobre Silicagel (DCM/MeOH) para proporcionar el compuesto 62 como un sólido amarillento (82 mg, 45%).

1H NMR: (500MHz, DMSO-cfe, ppm): 6 (presencia de rotámeros), 8.50 (d, J=8.3, 0.5H, NHCO); 8.27 (d, J=8.0, 0.5H, NHCO), 8.15-8.04 (m, 1H, NHCO), 7.27 - 7.13 (m, 5H), 6.86 - 6.79 (m, 2H), 6.48 - 6.42 (m, 2H), 4.78 (s, 2H, NH2), 4.74 - 4.44 (m, 3H), 4.01 - 3.72 (m, 1.5H), 3.66 (s, 1.5H, CO2Me), 3.63 (s, 1.5H, CO2Me), 3.57 - 0.65 (m, 55.5H).

HPLC (Xbridge Shield C18, 3,5 pm, 4,6 x 50 mm; 3.5 ml/min, de 40°C, 0 a 95% MeCN en agua (0.1% TFA) en 2.25 minutos entonces 95% MeCN durante 0,5 minutos, Tr = 1,31 minuto (95.3%, 220 nm).

m/z (Q-TOF ESI+) 865.5800 (2%, MH+, C48H77N6O8 requiere 865.5797), 433.2937 (100%, (MH2)2+, C48H78N6O8 requiere 433.2935).

Compuesto 63

((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-aminofenetil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-W,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoil)-L-fenilalanina 2,2,2-trifluoroacetato

Se disolvió el Compuesto 62 (23 mg, 0.03 mmol, 1.00 eq.) en una mezcla de agua (1 ml), ACN (5 ml) y piperidina (1 ml). Se añade piperidina (0.75 ml) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 5 horas. El análisis TLC indica un consumo completo del material de partida. El residuo se purificó por HPLC (SHIMADZU Pre-CLAR-001, columna SunFire Prep C18 OBD, 5 pm, 19 x 150 mm; fase de elución: agua/ACN amortiguado con 0.1% de TFA; gradiente de 20% a 40% en 10 minutos y 40% a 100% ACN ACN en 2 minutos; detector de UV Waters 2545a 254 nm y 220 nm). El compuesto 63 se obtuvo como un sólido blanco (14 mg, 66%).

1H NMR: (500MHz, DMSO-cfe, ppm): ó (presencia de rotámeros), 12.7 (s(br), 1H, CO2H), 9.58 (m(br), 1H); 9.04 -8.89 (m, 1H), 8.41 (d, 0.6H, NHCO), 8.15 (d, 0.4H, NHCO), 7.27 - 7.13 (m, 5H), 7.13 - 6.99 (m(br), 2H), 6.90 - 6.64 (s(br), 2H), 4.77 - 3.40 (m, 10H), 3.34 - 2.75 (m, 20H), 2.34 - 1.94 (m, 4H), 1.90 - 0.7 (m, 25H).

HPLC (Xbridge Shield C18, 3,5 pm, 4,6 x 50 mm; 3.5 ml/min, de 40°C, 0 a 95% MeCN en agua (0.1% TFA) en 2.25 minutos entonces 95% MeCN durante 0,5 minutos, Tr = 1,31 minuto (100%, 220 nm).

m/z (Q-TOF ESI+) 851.5641 (6%, MH+, C47H75N6O8 requiere 851.5641), 426.2854 (100%, (MH2)2+, C47H76N6O8 requiere 426.2857).

Ejemplo 15: Actividad antiproliferativa de los fármacos

Método:

Cultivo celular. Fueron cultivadas las células (cáncer pulmonar de células no pequeñas - ATCC CCL-185) A549 y MDA-MB-231 (adenocarcinoma de mama - ATCC HTB-26), en un medio esencial mínimo de Eagle (MEM) con suero de ternera fetal al 5% (FCS) y medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con 10% de FCS, respectivamente. Las células MCF7 (carcinoma ductal de mama - ATCC HTB-22) y SN - 12C (carcinoma de riñón - ATCC) se mantuvieron en medio RPMI1640 (sin rojo fenol para células MCF7) con 10% FCS. Todos los medios fueron suplementados con fungizona (1.25 pg/ml) y estreptomicina-penicilina (100 U/100 pg/ml). Las células fueron cultivadas bajo condiciones estándares en una incubadora a 37°C, 5% CO2 y 95% de humedad atmosférica.

Actividad antiproliferativa en 4 estirpes celulares tumorales. Los medicamentos seleccionados fueron investigados por su actividad antiproliferativa usando un ensayo de proliferación ATPlite (Perkin Elmer, Villebon sur Yvette, Francia) en un panel amplio de 4 estirpes celulares. Las células fueron sembradas en placas de 96 pocillos (103 células/pocillo para A549, 2.103 MCF7, MDA-MB-231 y SN12C) en el día 0 a una concentración para asegurar que las células permanecieran en fase de crecimiento logarítmico celular durante todo el período de tratamiento con fármacos de 72 h. Después de un período de incubación de 24h, todas las células fueron tratadas con diluciones seriadas de los compuestos probados (11pL de una solución de X 10 en DMSO 1% - 6 pocillos/condición). Para evitar la adherencia de los compuestos en las puntas, las puntas fueron cambiadas entre cada dos diluciones consecutivas. Las células se colocaron después en incubadora a 37°C, 5% CO2. En el día 4, la viabilidad celular fue evaluada cuantificando el ATP liberado por las células viables. Se analizó la cantidad de células viables en comparación con el número de células tratadas con solvente. Se determinaron los valores CE50 con análisis de ajuste de curva (modelo de regresión no lineal con una respuesta sigmoidea a la dosis, coeficiente variable de crestas y valles), realizado con el algoritmo proporcionado por GraphPad Software (GraphPad Software Inc., CA, EUA).

Resultados:

Diversos fármacos:

Se sometieron a pruebas diversos fármacos para determinar su actividad antiproliferativa en la estirpe de celular MDA-MB-231 siguiendo el método anteriormente descrito. Las actividades cuantificadas proporcionaron unos valores de EC50 < 0.1 pM.

Unos cuantos de los siguientes ejemplos seleccionados de entre los fármacos anteriormente ejemplificados ilustran sus propiedades antiproliferativas muy notables:

Ejemplo 12: EC50 = 5.80x10"10 M; Ejemplo 13: EC50 = 7.95x10-8 M; Ejemplo 15: EC50 = 1.70x10-10 M; Ejemplo 27: EC50 = 1.20x10-10 M.

Diversas estirpes celulares:

El Compuesto 15 se sometió a pruebas en diferentes estirpes celulares (A549, MDA-MB-231, MCF-7, SN12C) siguiendo el método descrito anteriormente. Las actividades cuantificadas proporcionaron unos valores de EC50 < 0.1pM en todas las estirpes celulares sometidas a pruebas.

Ejemplos comparativos:

La sustitución en el anillo fenilo (amino vs. carboxilo) se estudió en los siguientes ejemplos comparativos que presentan la actividad antiproliferativa mejorada de los fármacos según la invención que comprende un sustituyente amino.

Ejemplo 16: Síntesis de porción fármaco-ligador

Compuesto E-11

2,2,2-trifluoroacetato de 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)bencil(4-((3R,4S,7S,10S)-4-((S)-sec-butil)-7,10-diisopropil-3-(2-((S)-2-((1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-(((S)-2-fenil-1-(tiazol-2-il)etil)amino)propil)pirrolidin-1-il)-2-oxoetil)-5,11-dimetil-6,9-dioxo-2-oxa-5,8,11-triazatridecan-13-il)fenil)(metil)carbamato

Compuesto E-11-1: clorhidrato de metil(S)-2-amin-5-ureidopentanoato

Se añade cloruro de acetilo (10 ml) gota a gota a MeOH (120 ml) a 0°C con agitación. Después de 20 minutos, se añade L-citrulina (10 g, 57 mmol, 1.00 eq.) y la mezcla se calienta a reflujo durante la noche. El disolvente se evaporó a presión reducida para obtener 15 g (116%) del compuesto E-11-1 como un sólido blanco. El producto fue utilizado en la etapa siguiente sin secado adicional.

Compuesto E-11-2: metil(S)-2-((S)-2-((ferc-butoxicarbonil)amino)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanoato

El compuesto E-11-1 (13 g, 57.6 mmol, 1.1 eq.) fue disuelto en DMF (140 ml) a 0°C bajo una atmósfera inerte. DIEA (30 ml, 173 mmol, 3.0 eq.), hidroxibenzotriazol (TOHB - 10,59 g, 69,1 mmol, 1,2 eq.) y éster de Boc-L-valina hidroxisuccinimida (Boc-Val-OSu - 18,1 g, 57.6 mmol, 1.0 eq.) fueron agregados. La mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente, a continuación el disolvente se evaporó a presión reducida. El residuo fue disuelto en agua (100 ml) y extrae dos veces con DCM (150 ml). Las fases orgánicas se combinaron, secaron sobre Na2SO4 y se concentraron a presión reducida. El disolvente se evaporó a presión reducida para obtener 18.8 g (84%) del compuesto E-11-2 como un sólido blanco.

Compuesto E-11-3: ácido (S)-2-((S)-2-((ferc-butoxiicarbonil)amino)-3-metil-butanamido)-5-ureidopentanoico

El compuesto E-11-2 (18,8 g, 48,4 mmol, 1 eq.) se disolvió en MeOH (200 ml) a 0°C. Una solución de NaOH 1M (ml 72, 72 mmol, 1,5 eq.) fue agregada y se agitó la mezcla durante 2 horas a temperatura ambiente. El MeOH se eliminó a presión reducida y el residuo de la solución acuosa se acidifica con HCl 1M. El disolvente se evaporó a presión reducida para obtener 18 g (99%) del compuesto E-11-3 como un sólido blanco.

Compuesto E-11-4: ((S)-1-(((S)-1-((4-(hidroximetil)fenil)amino)-1-oxo-5-ureidopentan-2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)carbamato de terc-butilo

El compuesto E-11-3 (5g, 13.4 mmol, 1 equiv) se disolvió en una atmósfera inerte en THF (65 ml) en presencia de yodometano (35 ml). Fueron agregados metanol (4-aminofenil) (1,81 g, 14,7 mmol, 1.1 eq.) y W-ethoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroquinolina (EEDQ - 6.60 g, 26.7 mmol, 2 eq.) y la mezcla se agitó en la oscuridad durante la noche. El disolvente se evaporó a presión reducida para obtener 5,2 g (73%) del compuesto E-11-4 como un sólido blanco.

Compuesto E-11-5: terc-butil ((S)-3-metil-1-(((S)-1-((4-((((4-nitrofenoxi)carbonil)oxi)metil)fenil)amino)-1-oxo-5-ureidopentan-2-il)amino)-1-oxobutan-2-il)carbamato

El compuesto E-11-4 (1,1 g, 2.29 mmol, 1 eq.) fue disuelto en DMF (5 ml) a 0°C bajo una atmósfera inerte. Carbonato de bis(4-nitrofenil) (1,40 g, 4.59 mmol, 2 eq.) fue agregado, seguido por DIEA (600pl, 3.44 mmol, 1,5 eq.), y la solución resultante amarilla se agita durante la noche. El disolvente se evaporó a presión reducida para obtener 1,27 g (84%) del compuesto E-11-5 como un sólido blanco.

Compuesto E-11-6: 2,2,2-trifluoroacetato de 4-((S)-2-((S)-2-((terc-butoxicarbonil)amino)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)bencil (4-((3R,4S,7S,10S)-4-((S)-sec-butil)-7,10-d¡¡soprop¡l-3-(2-((S)-2-((1R,2R)-1-metox¡-2-metil-3-oxo-3-(((S)-2-fenil-1 -(tiazol-2-il)etil)amino)propil)pirrolidin-1 -il)-2-oxoetil)-5,11 -dimetil-6,9-dioxo-2-oxa-5,8,11-triazatridecan-13-il)fenil)(metil)carbamato

Se disolvieron en DMF seco (4 ml) el carbonato E-11-5 (114 mg, 0.177 mmol, 1.2 eq.) y la anilina 11F (150 mg, 0.147 mmol, 1 eq.). Se agregaron HOBt (38 mg, 0.295 mmol y DIEA (pL 54, 0.295 mmol, 2 eq.) y se dejó la reacción durante 4 horas a temperatura ambiente. La DMF fue evaporada bajo presión reducida y el residuo purificado mediante cromatografía flash en sílice, liberador con DCM. El residuo se purificó por HPLC preparativa (SHIMADZU Pre-CLAR-001, columna SunFire Prep C18 OBD, 5 pm, 19 x 100 mm; fase de elución: agua/ACN amortiguado con 0.1% de TFA; gradiente de 20% a 40% en 10 minutos y 5% a 100% ACN ACN en 15 minutos; detector UV marca Waters 2487 a 254 nm y 220 nm). Las fracciones seleccionadas fueron combinadas y liofilizadas para proporcionar el compuesto E-11-6 como un sólido blanco (89 mg, 39%).

Compuesto E-11:

El compuesto E-11-6 (21 mg, 0.014 mmol, 1.0 eq.) fue disuelto en DMF (0,25 ml) a 0°C bajo una atmósfera inerte. La solución se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente, después de lo cual, un análisis LC-MS indica un consumo completo del material de partida. La mezcla fue enfriada (baño de nitrógeno líquido), mientras se añade simultáneamente DMF (0.5 ml) a continuación DIEA (100pl) con el fin de neutralizar TFA. El baño de enfriamiento entonces se retiró y 2,5-dioxopirrolidin-1-il 6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoato (4 mg, 0.012 mmol, 1 eq.) se agregó. El residuo se purificó por HPLC preparativa (SHIMADZU Pre-CLAR-001, columna SunFire Prep C18 OBD, 5 pm, 19 x 100 mm; fase de elución: agua/ACN amortiguado con 0.1% de TFA; gradiente de 20% a 40% en 10 minutos y 5% a 100% ACN ACN en 15 minutos; detector UV marca Waters 2487 a 254 nm y 220 nm). Las fracciones seleccionadas fueron combinadas y liofilizadas para proporcionar el compuesto E-11 como un sólido blanco (11 mg, 54%).

m/z (Q-TOF MS ESI+) 1524.8282 (2%, MNa+, CreHuaN^NaO^S requiere 1524.8299), 751.9283 (100%, (MH2)2+, C79H117N13O14S requiere 751.9276).

Compuesto E-12

2,2,2-trifluoroacetato de metil((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)bencil)oxi)carbonil)(metil)amino)fenetil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-W,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoil)-L-fenilalaninato

Compuesto E-12-1: tere-butilo ((S)-3-metil-1-oxo-1-(((S)-1-oxo-1-((4-(((perfluorofenoxi)carbonil)oxi)metil)fenil)amino)-5-ureidopentan-2-il)amino)butan-2-il)carbamato

El compuesto E-11-4 (670 mg, 1.26 mmol, 1 eq.) fue disuelto en DMF (6 ml) a 0°C bajo una atmósfera inerte. Se añade carbamato de bis(4-nitrofenil) (991 mg, 2.51 mmol, 2 eq.), seguido por DIEA (329pl, 1.89 mmol, 1,5 eq.), y la solución resultante amarilla se agita durante la noche. El disolvente se evaporó a presión reducida para obtener 836 mg (96%) del compuesto E-12-1 como un sólido blanco.

Compuesto E-12-2: 2,2,2-trifluoroacetato de metil((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-((tere-butoxicarbonil)amino)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)bencil)oxi)carbonil)(metil)amino)fenetil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-W,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoil)-L-fenilalaninato

La anilina 12 (165 mg, 0.189 mmol, 1.0 eq.) fue disuelta en DMF (5 ml) a 0°C bajo una atmósfera inerte. Se añaden carbonato E-12-1 (194 mg, 0,282 mmol, 1,5 eq.), TOHB (51 mg, 0,375 mmol, 2 eq.) y la DIEA (j L 66, 0,375 mmol, 2 eq.) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 8 horas. El residuo se purificó por HPLC preparativa (Sh IMAd ZU Pre-CLAR-001, columna SunFire Prep C18 OBD, 5 jm , 19 x 100 mm; fase de elución: agua/ACN amortiguado con 0.1% de TFA; gradiente de 20% a 40% en 10 minutos y 5% a 100% ACN ACN en 15 minutos; detector UV marca Waters 2487 a 254 nm y 220 nm). Las fracciones seleccionadas fueron combinadas y liofilizadas para preparar el compuesto E12-7 como un sólido blanco (247 mg, 77%).

Compuesto E-12-3: bis(2,2,2-trifluoroacetato) de metil((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-amino-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)bencil)oxi)carbonil)(metil)amino)fenetil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-W,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoil)-L-fenilalaninato

El compuesto E-12-2 (5.6 mg, 5.58 pmol, 1.0 eq.) fue disuelto en TFA (100pl). Después de 5 minutos, se agrega agua (1 ml) y la solución liofilizada durante la noche para proporcionar el compuesto E-12-3 como un sólido blanco (5.6 mg, 98%).

Compuesto E-12:

El compuesto E-12-3 (5,6 mg, 4 pmol, 1.0 eq.) fue disuelto en acetonitrilo (0.5 ml) y se añade DIEA (5pl, 7 eq.), seguido por 2,5-dioxopirrolidin-1-il 6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoato (2.5 mg, 8 pmol, 2 eq.). La mezcla se agitó durante 16 horas a temperatura ambiente. El residuo se purificó por HPLC preparativa (SHIMADZU Pre-CLAR-001, columna SunFire Prep C18 OBD, 5 pm, 19 x 100 mm; fase de elución: agua/ACN amortiguado con 0.1% de TFA; gradiente de 20% a 40% en 10 minutos y 5% a 100% ACN ACN en 15 minutos; detector UV marca Waters 2487 a 254 nm y 220 nm). Las fracciones seleccionadas fueron combinadas y liofilizadas para proporcionar el compuesto E-12 como un sólido blanco (4,6 mg, 70%).

m/z (Q-TOF MS ESI+) 739.4389 (100%, (MH2)2+, C78H118N12O16 requiere 739.4389).

Compuesto E-13

2,2,2-trifluoroacetato de metil((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-(6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido)bencil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-W,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoil)-L-fenilalaninato

Compuesto E-13-1: ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-((fercbutoxicarbonil)amino)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)bencil)oxi)carbonil)(metil)amino)fenetil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-W,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoil)-E-fenilalanina

Se disolvió el Compuesto E-12-2 (185 mg, 0.123 mmol, 1.00 eq.) en una mezcla de agua (5 ml) y acetonitrilo (5 ml) a temperatura ambiente. Se añade piperidina (3.67 ml, 300 eq.) y se agitó la mezcla durante 6 horas a temperatura ambiente. Los solventes se evaporaron a sequedad bajo presión reducida y el residuo triturado con Et2O (60 ml). El sólido se enjuagó con doble Et2O (20 ml) y secado bajo vacío para producir el compuesto E-13-1 como un sólido blanco (175 mg, 95%).

Compuesto E-13-2: bis(2,2,2-trifluoroacetato) de ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-amino-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)bencii)oxi)carbonil)(metil)amino)fenetil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-W,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoil)-L-fenilalanina

El compuesto E-13-1 (175 mg, 5.58 pmol, 1.0 eq.) fue disuelto en TFA (200pl). Después de 5 minutos, se agrega agua (1 ml) y la solución liofilizada durante la noche para proporcionar el compuesto E-13-2 como un sólido blanco (180 mg, 87%).

Compuesto E-13: 2,2,2-trifluoroacetato de ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)bencil)oxi)carbonil)(metil)amino)fenetil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-W,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil) pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoil)-L-fenilalanina

El compuesto E-13-2 (80 mg, 0.058 mmol, 1,0 equiv) se disolvió en una atmósfera inerte en DMF (1.5 ml) en presencia de yodometano (0.4 ml). Se añade DIEA (50pl, 0.289 mmol, 5 eq.), seguido por 6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-il (36 mg, 0.116 mmol, 2 eq.). La mezcla se agitó durante 3 horas a temperatura ambiente. El residuo se purificó por HPLC preparativa (SHIMADZU Pre-CLAR-001, columna SunFire Prep C18 OBD, 5 pm, 19 x 100 mm; fase de elución: agua/ACN amortiguado con 0.1% de TFA; gradiente de 20% a 40% en 10 minutos y 5% a 100% ACN ACN en 15 minutos; detector UV marca Waters 2487 a 254 nm y 220 nm). Las fracciones seleccionadas fueron combinadas y liofilizadas para proporcionar el compuesto E-13 como un sólido blanco (32 mg, 35%).

m/z (Q-TOF MS ESI+) 1461.8336 (100%, MNa+, C77HmN12NaO16 requiere 1461.8403), 725.4223 (100%, (MH2)2+, C77H115N12O16 requiere 1463.8549), 732.4317 (100%, (MH2)2+, C77H116N12O16 requiere 732.4311).

Compuesto E-15

2,2,2-trifluoroacetato de metil((2R,3R)-3-((S)-1 -((3RJ4SJ5S)-4-((S)-2-((S)-2-((3-(6-(2J5-dioxo-2J5-dihidro-1 H-pirrol-1-il)hexanamido)bencil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoil)-L-fenilalaninato

Compuesto E-15-1: 2,2,2-trifluoroacetato de metil((2R,3^)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((3-((((4-((S)-2-((S)-2-((terc-butoxicarbonil)amino)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)bencil)oxi)carbonil)amino)bencil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoil)-L-fenilalaninato

El compuesto E-15-1 fue preparado según el método mismo como compuesto E-11-6, usando carbonato E-11-5 (28 mg, 0.044 mmol, 1 eq.), anilina 15 (42 mg, 0.044 mmol, 1 eq.), TOHB (3 mg, 0.022 mmol, 0.5 eq.) y la DIEA (15pl, 0.087 mmol, 2 eq.) en DMF (2 ml). El compuesto E-15-1 se obtuvo como un sólido blanco (8.2 mg, 13%). Compuesto E-15-2: 2,2,2-trifluoroacetato de metil((2R>3^)-3-((S)-1-((3R>4S>5S)-4-((S)-2-((S)-2-((3-((((4-((S)-2-((S)-2-((terc-butoxicarbonil)amino)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)bencil)oxi)carbonil)amino)bencil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-W,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoil)-L-fenilalaninato

El compuesto E-15-1 (8.2 mg, 5.58 pmol, 1.0 eq.) fue disuelto en TFA (200pl). Después de 5 minutos, se agrega agua (1 ml) y la solución liofilizada durante la noche para proporcionar el compuesto E-15-8 como un sólido blanco (7.6 mg, 99%).

Compuesto E-15:

El Compuesto E-15 fue preparado según el mismo métido que el compuesto E-12, con amina E-15-2 (7.6 mg, 5.55 pmol, 1 eq.), 2,5-dioxopirrolidin-1-il 6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirroM-N)hexanoato (2 mg, 6.65 pmol, 1.2 eq.) y la DIEA (5pl, 0.028 mmol, 5 eq.) en acetonitrilo (0.5 ml). El compuesto E-15 se obtuvo como un sólido blanco (4.2 mg, 48%).

m/z (Q-TOF MS ESI+) 1471.8169 (2%, MNa+, C76Hn2N^NaO16 requiere 1471.8211), 725.4223 (100%, (MH2)2+, C76H114N12O16 requiere 725.4232), 483.9482 (10%, (MHa)3+, C76H115N12O16 requiere 483.9513).

Compuesto F-13

Compuesto F-13-1: N-(4-((terc-butoxicarbonil)(metil)amino) de bencilo; N)-A/-metil-L- valinato de bencilo

El compuesto 11 C (250 mg, 0.567 mmol, 1 eq.) se disolvió en THF (10 ml) seguido por la adición de NaH (60% suspensión en aceite mineral, 68 mg, 1.702 mmol, 3 eq.). La mezcla se agitó durante 5 minutos antes de añadir yodometano (106pl, 1.702 mmol, 3 eq.). La reacción se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente antes de enfriarse con agua y separarse entre EtOAc (100 ml) y agua (50 ml). La fase orgánica se secó sobre MgSO4 y se evaporó hasta sequedad para obtener el compuesto F-13-1 como un aceite amarillo (250 mg, 97%), que se utilizó sin posterior purificación.

Compuesto F-13-2: W-metil-W-(4-(metilamino)fenetil)-L-valinato de bencilo

La anilina F-13-1 protegida por Boc (250 mg, 0.550 mmol, 1 eq) se disolvió en MeOH (5 ml) seguido por la adición de 1 ml de una solución de ácido clorhídrico disponible comercialmente PrOH (5 - 6 M). La solución se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas antes de evaporar hasta sequedad a presión reducida. El aceite amarillo resultante fue triturado con Et2O para producir compuestos F-13-2 como un sólido amarillo (202 mg, 94%).

Compuesto F-13-3: W-(4-((S)-2-((S)-2-((terc-butoxicarbonil)amino)-3-metilbutanamido)-W-metil-5-ureidopentanamido)fenetil)-W-metil-L-valinato de bencilo

El ácido E-11-3 (190 mg, 0.508 mmol, 1.5 eq.) fue disuelto en seco DMF (1 ml), seguido por la adición de DIEA (118pl, 0.677 mmol, 2 eq.), benzotriazol-1 -il-oxitripirrolidinofosfonio hexafluorofosfato (PyBOP - 264 mg, 0.508 mmol, 1,5 eq.) y anilina F-13-2 (120 mg, 0.339 mmol, 1 eq.). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche y los disolventes se evaporaron bajo presión reducida. El residuo se purificó por HPLC preparativa (SHIMADZU Pre-CLAR-001, columna SunFire Prep C18 OBD, 5 pm, 19 x 100 mm; fase de elución: agua/ACN amortiguado con 0.1% de TFA; gradiente de 20% a 40% en 10 minutos y 5% a 100% ACN ACN en 15 minutos; detector UV marca Waters 2487 a 254 nm y 220 nm). Las fracciones seleccionadas fueron combinadas y liofilizadas para proporcionar el compuesto F-13-3 como un sólido blanco (140 mg, 45%).

Compuesto F-13-4: W-(4-((S)-2-((S)-2-((terc-butoxicarbonil)amino)-3-metilbutanamido)-W-metil-5-ureidopentanamido)fenetil)-W-metil-L-valina

El compuesto F-13-3 (116 mg, 0.163 mmol, equivalente 1) fue disuelto en 30 ml de AcOEt y 5 ml de metanol en presencia de Pd/C (30 mg) e hidrogenado durante 2 horas a temperatura ambiente y presión atmosférica. El medio de reacción se filtra y se concentró a presión reducida para obtener 110 mg de compuesto F-13-4 en forma de un aceite incoloro.

Compuesto F-13-5: metil((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-((tercbutoxicarbonil)amino)-3-metilbutanamido)-W-metil-5-ureidopentanamido)fenetil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)W,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoil)-E-fenilalaninato 2,2,2-trifluoroacetato

La amina 3D (89 mg, 0.140 mmol, 1 eq.) y el ácido F-13-4 (145 mg, 0.210 mmol, 1.5 eq.) se disuelven en DMF seca (4 ml) y PyBOP (109 mg, 0.210 mmol, 1,5 eq.) y DIEA (73pl, 0.420 mmol, 3 eq.) fueron agregados. La mezcla se agitó durante 1 hora a temperatura ambiente y el solvente evaporado. El residuo fue separado entre EtOAc y agua y la fase orgánica secada sobre MgSO4, filtrado y evaporado a presión reducida. El residuo se purificó por HPLC preparativa (SHIMADZU Pre-CLAR-001, columna SunFire Prep C18 OBD, 5 pm, 19 x 100 mm; fase de elución: agua/ACN amortiguado con 0.1% de TFA; gradiente de 20% a 40% en 10 minutos y 5% a 100% ACN ACN en 15 minutos; detector UV marca Waters 2487 a 254 nm y 220 nm). Las fracciones seleccionadas fueron combinadas y liofilizadas para proporcionar el compuesto F-13-5 como un sólido blanco (140 mg, 73%).

Compuesto F-13-6: ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-((ferc-butoxicarbonil)amino)-3-metilbutanamido)-N-metil-5-ureidopentanamido)fenetil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoil)-E-fenilalanina 2,2,2-trifluoroacetato

Se disolvió el compuesto E-13-5 (140 mg, 0.104 mmol, 1.00 eq.) en una mezcla de agua (4 ml) y acetonitrilo (2 ml) a temperatura ambiente. El residuo se purificó por HPLC preparativa (SHIMADZU Pre-CLAR-001, columna SunFire Prep C18 OBD, 5 pm, 19 x 100 mm; fase de elución: agua/ACN amortiguado con 0.1% de TFA; gradiente de 20% a 40% en 10 minutos y 5% a 100% ACN ACN en 15 minutos; detector UV marca Waters 2487 a 254 nm y 220 nm). Las fracciones seleccionadas fueron combinadas y liofilizadas para proporcionar el compuesto F-13-6 como un sólido blanco (115 mg, 83%).

Compuesto F-13:

El Compuesto F-13 fue preparado según el mismo método que el compuesto E-11, con amina protegida con Boc F-13-6 (55 mg, 0.041 mmol, 1.0 eq.) en DCM (0.5 ml) y TFA (100pl, 30 eq.), seguido por dilución con DMF (1 ml), enfriado rápido con DIEA (320pl, eq 45) a continuación la reacción con 2,5-dioxopirrolidin-1-il 6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoato (15 mg 0.049 mmol, 1,2 eq.). Después de la purificación por HPLC preparativa y la liofilización, se obtuvo el compuesto F-13 como un sólido blanco (14 mg, 24%).

m/z (Q-TOF MS ESI+) 1314.8067 (2%, MH+, C69H108N11O14 requiere 1314.8072), 657.9067 (100%, (MH2)2+, C69H109N11O14 requiere 657.9072).

Compuesto F-61

2,2,2-trifluoroacetato de N-((S)-1-(((S)-1-((4-((3R,4S,7S,10S)-4-((S)-sec-butil)-7,10-diisopropil-3-(2-((S)-2-((1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-(((S)-2-fenil-1-(tiazol-2-il)etil)amino)propil)pirrolidin-1-il)-2-oxoetil)-5,11-dimetil-6,9-dioxo-2-oxa-5,8,11-triazatridecan-13-il)fenil)amino)-1-oxo-5-ureidopentan-2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)-6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1 -il)hexanamida

Compuesto F-61-1: N-(4-aminofenetil)-N-metil-L-valinato dihidrocloruro de bencilo

El compuesto 11C (1.0 g, 2.27 mmol, 1 eq) se disolvió en MeOH (5 ml) seguido por la adición de 8 ml de una solución de ácido clorhídrico disponible comercialmente PrOH (5 - 6 M). La mezcla se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente antes de evaporar hasta sequedad a presión reducida. El sólido se enjuagó con doble Et2O (30 ml) y secado bajo vacío para producir el compuesto F-61-1 como un sólido blanco (916 mg, 98%).

Compuesto F-61-2: W-(4-((S)-2-((S)-2-((ferc-butoxicarbonil)amino)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)fenetil)-W-metil-L-valinato de bencilo

El ácido E-11-3 (769 mg, 2.05 mmol, 1.5 eq.) fue disuelto en seco DMF (2.5 ml), seguido por la adición de DIEA (957pl, 5.48 mmol, 4 eq.), benzotriazol-1-il-oxitripirrolidinofosfonio hexafluorofosfato (PyBOP - 1,07 g, 2.05 mmol, 1,5 eq.) y anilina F-13-2 (120 mg, 0.339 mmol, 1 eq.). Se añade anilina F-61-1 (566 mg, 1,369 mmol, 1 eq.) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. El disolvente se evaporó a presión reducida para obtener 969 mg (102%) del compuesto F-61-2 como un sólido blanco.

Compuesto F-61-3: W-(4-((S)-2-((S)-2-((ferc-butoxicarbonil)amino)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)fenetil)-W-metil-L-valina

El compuesto F-61-2 (969 mg, 1.28 mmol, equivalente 1) fue disuelto en 30 ml de AcOEt y 20 ml de metanol en presencia de Pd/C (270 mg) e hidrogenado durante 3 horas a temperatura ambiente y presión atmosférica. El medio de reacción se evaporó a presión reducida para obtener 520 mg (67%) del compuesto F-61-3 como un sólido blanco.

Compuesto F-61-4: ((S)-1-(((S)-1-((4-((3R,4S,7S,10S)-4-((S)-sec-butil)-7,10-d¡¡soprop¡l-3-(2-((S)-2-((1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-(((S)-2-fenil-1 -(tiazol-2-il)etil)amino)propil)pirrolidin-1-il)-2-oxoetil)-5,11 -dimetil-6,9-dioxo-2-oxa-5,8,11-triazatridecan-13-il)fenil)amino)-1-oxo-5-ureidopentan-2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)carbamato 2,2,2-trifluoroacetato de ferc-butilo

El ácido F-61-3 (67.5 mg, 0.111 mmol, 1.5 eq.) se disolvió en DMF seco (2 ml) y se añadieron DECP (17 pl, 0.111 mmol, 1.5 eq.) y DIEA (39 pl, 0.223 mmol, 3 eq.). Después de agitar durante 15 minutos a temperatura ambiente, se añade amina 1Y (50 mg, 0.074 mmol, 1 eq.) y la solución se agita durante la noche. El residuo se purificó por HPLC preparativa (SHIMADZU Pre-CLAR-001, columna SunFire Prep C18 OBD, 5 pm, 19 x 100 mm; fase de elución: agua/ACN amortiguado con 0.1% de TFA; gradiente de 20% a 40% en 10 minutos y 5% a 100% ACN ACN en 15 minutos; detector UV marca Waters 2487 a 254 nm y 220 nm). Las fracciones seleccionadas fueron combinadas y liofilizadas para proporcionar el compuesto F61-4 como un sólido blanco (28 mg, 28%).

Compuesto F-61-5: (S)-2-((S)-2-amino-3-metilbutanamido)-N-(4-((3R,4S,7S,10S)-4-((S)-sec-butil)-7,10-diisopropil-3-(2-((S)-2-((1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-(((S)-2-fenil-1-(tiazol-2-il)etil)amino)propil)pirrolidin-1-il)-2-oxoetil)-5,11-dimetil-6,9-dioxo-2-oxa-5,8,11-triazatridecan-13-il)fenil)-5-ureidopentanamida bis(2,2,2-trifluoroacetato)

El compuesto F-61-4 (28 mg, 5.58 pmol, 1.0 eq.) fue disuelto en TFA (200pl). Después de 5 minutos, se añade agua (2 ml) y la solución liofilizada durante la noche para proporcionar el compuesto F-61-5 como un sólido blanco (38 mg, 134%).

Compuesto F-61:

El compuesto F-61-5 (28.3 mg, 0.020 mmol, 1 eq.) fue disuelto en acetonitrilo (0.5 ml), seguido de 2,5-dioxopirrolidin-1-il 6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirroM-¡l)hexanoato (9 mg, 0.029 pmol, 1.4 eq.) y la DIEA (25pl, 0.143 mmol, 7 eq.). La mezcla se agitó durante 4.5 horas, después de dicho tiempo el análisis por HPLC mostró la presencia de material de partida pero el consumo total de la succinimida. Por lo tanto, fue agregado 2,5-dioxopirrolidin-1-il 6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirroM-¡l)hexanoato complementario (3 mg, 0.01 pmol, 0.5 eq.) y la reacción se agitó durante 1.5 horas. El análisis por HPLC indica un consumo completo del material de partida. El disolvente se evaporó hasta sequedad y el residuo triturado dos veces con una mezcla de EtOAc Et2Ü (80/20) para producir compuestos F-61 como un sólido blanco (19.4 mg, 70%).

m/z (Q-TOF MS ESI+) 1361.7725 (2%, MNa+, C70H106N12NaO12S requiere 1361.7666), 670.3961 (100%, (MH2)2+, C70H108N12O12S requiere 670.3960).

Compuesto F-62:

2,2,2-trifluoroacetato de metil((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((-2-(6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido)bencil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-W,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoil)-L-fenilalaninato

Compuesto F-62-1: 2,2,2-trifluoroacetato de metil((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-((ferc-butoxicarbonil)amino)-3-metilbutanamido)-N-metil-5-ureidopentanamido)fenetil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-W,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoil)-L-fenilalaninato

El compuesto F-62-1 se preparó de manera similar al compuesto F-61-4 a partir de la amina 3D (100 mg, 0.158 mmol, equivalente 0.9), el ácido F-61-3 (108 mg, 0,178 mmol, equivalente 1), DECP (42,9 mg, 0.267 mmol, equivalente de 1,5) y la DIEA (36,7 mg, 0,534 mmol, equivalente 3) en DMF (2 ml). Después de la purificación por HPLC preparativa y la liofilización, se obtuvo el compuesto F-62-1 como un sólido blanco (93 mg, 39%).

Compuesto F-62-2: bis(2,2,2-trifluoroacetato) de metil((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-amino-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)fenetil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-W,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil) pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoil)-L-fenilalaninato

El compuesto F-62-1 (35 mg, 5.58 pmol, 1.0 eq.) fue disuelto en TFA (200pl). Después de 10 minutos, se agrega agua (2 ml) y la solución liofilizada durante la noche para proporcionar el compuesto F-62-2 como un sólido blanco (34 mg, 105%).

Compuesto F-62:

El compuesto F-62-2 (34 mg, 5.58 pmol, 1 eq.) fue disuelto en acetonitrilo (3 ml). El baño de enfriamiento entonces se retiró y se agregó 2,5-dioxopirrolidin-1-il 6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoato (2 mg, 6.65 pmol, 1.2 eq.). El análisis por HPLC indica un consumo completo del material de partida. El disolvente se evaporó hasta sequedad y el residuo triturado con una mezcla de EtOAc Et2O (80/20). El residuo se purificó por HPLC preparativa (SHIMADZU Pre-CLAR-001, columna SunFire Prep C18 OBD, 5 pm, 19 x 100 mm; fase de elución: agua/ACN amortiguado con 0.1% de TFA; gradiente de 20% a 40% en 10 minutos y 5% a 100% ACN ACN en 15 minutos; detector UV marca Waters 2487 a 254 nm y 220 nm). Las fracciones seleccionadas fueron combinadas y liofilizadas para proporcionar el compuesto F-62 como un sólido blanco (5,5 mg, 13%).

m/z (Q-TOF MS ESI+) 1336.7859 (2%, MNa+, C69H w N 11NaO14 requiere 1336.7891), 657.9073 (100%, (MH2)2+, C69H109N11O14 requiere 657.9072).

Compuesto F-63:

Compuesto F-63-1: ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-((ferc-butoxicarbonil)amino)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)fenetil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-W,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoil)-L-fenilalanina

Se disolvió el compuesto F-62-1 (157 mg, 0.118 mmol, 1.00 eq.) en una mezcla de agua (4.5 ml) y acetonitrilo (3.5 ml) a temperatura ambiente. Los solventes se evaporaron hasta sequedad bajo presión reducida y el residuo triturado con Et2O (60 ml). El sólido fue recogido por la filtración y enjuagado dos veces con Et2O (10 ml) para producir compuestos F-63-1 como un sólido blanco (153 mg, 100%).

Compuesto F-63-2: bis 2,2,2-trifluoroacetato de ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-amino-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)fenetil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-W,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil) pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoil)-L-fenilalanina

El compuesto F-63-1 (153 mg, 5.58 pmol, 1.0 eq.) fue disuelto en TFA (200pl). Después de 10 minutos, se agrega agua (2 ml) y la solución liofilizada durante la noche para proporcionar el compuesto F-63-2 como un sólido blanco (34 mg, 105%).

Compuesto F-63:

El compuesto F-63-2 (100 mg, 0.082 mmol, 1 eq.) fue disuelto en acetonitrilo (2 ml), seguido de 2,5-dioxopirrolidin-1-il 6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirroM-il)hexanoato (45 mg, 0.029 pmol, 1.8 eq.) y la DIEA (71pl, 0.409 mmol, 5 eq.). Después de la agitación a temperatura ambiente durante 4.5 horas, el disolvente se evaporó a presión reducida. El residuo se purificó por HPLC preparativa (SHIMADZU Pre-CLAR-001, columna SunFire Prep C18 OBD, 5 pm, 19 x 100 mm; fase de elución: agua/ACN amortiguado con 0.1% de TFA; gradiente de 20% a 40% en 10 minutos y 5% a 100% ACN ACN en 15 minutos; detector UV marca Waters 2487 a 254 nm y 220 nm). Las fracciones seleccionadas fueron combinadas y liofilizadas para proporcionar el compuesto F-63 como un sólido blanco (42 mg, 36%).

m/z (Q-TOF MS ESI+) 1300.7901 (2%, MH+, C68H106N11O14 requiere 1300.7915), 650.8990 (100%, (MH2)2+, C68H107N11O14 requiere 650.8994).

Compuesto G-12

2,2,2-trifluoroacetato de metil((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-(6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)metilhexanamido)fenetil)(metil)ammo)-3-metilbutanamido)-Af,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidm-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoil)-L-femlalamnato

Compuesto G-12-1: dihidrocloruro de bencil N-(4-aminofenetil)-N-metil-L-valinato

En cloruro de oxalilo (3 ml) fue disuelto el ácido 6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoico (200 mg, 0.947 mmol, 1 eq.). La solución se agitó a temperatura ambiente durante 5 horas antes de evaporar hasta sequedad a presión reducida. El compuesto G-12-1 fue obtenido como un sólido amarillento (217 mg, 100%) y utilizado en la etapa siguiente sin purificación.

Compuesto G-12:

La anilina 12 (40 mg, 0.045 mmol, 1 eq.) se disolvió en DMF seco (1 ml) y se añadieron DECP (17 pl, 0.111 mmol, 1.5 eq.) y DIEA (8 pl, 0.045 mmol, 1 eq.). Después de agitarse durante 30 minutos, una solución de compuesto G-12-1 (10 mg, 0.45 mmol, 1 eq.) en DCM seco (1 ml) fue introducida y la reacción se agitó durante 1 hora a 0°C. La mezcla se diluye con DCM (25 ml) y se lava dos veces con agua (20 ml), una vez con salmuera (10 ml). La fase orgánica se secó sobre Na2SÜ4, filtró y evaporó bajo presión reducida para producir el producto en bruto como un sólido marrón claro (54 mg). Se purificó mediante cromatografía rápida (SHIMADZU Pre-CLAR-001, columna SunFire Prep C18 OBD, 5 pm, 19 x 100 mm; fase de elución: agua/ACN amortiguado con 0.1% de TFA; gradiente de 20% a 40% en 10 minutos y 5% a 100% ACN ACN en 15 minutos; detector UV marca Waters 2487 a 254 nm y 220 nm). El producto aislado fue liofilizado para producir un sólido blanco (23 mg), que fue repurificado por HPLC preparativa y las fracciones seleccionadas combinadas y liofilizadas para proporcionar compuesto G-12 como un sólido blanco (9 mg, 16%).

m/z (Q-TOF MS ESI+) 1094.6543 (20%, MNa+, C59H89N7NaOn requiere 1094.6512), 1072.6722 (16%, MH+, C59H90N7O11 requiere 1072.6693), 536.8358 (100%, (MH2)2+, C59H91N7O11 requiere 536.8383).

Compuesto G-13

2,2,2-trifluoroacetato de metil((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-(6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)metilhexanamido)fenetil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-W,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoil)-L-fenilalanina

Compuesto G-13:

La anilina 13 (15 mg, 0.015 mmol, 1 eq.) se disolvió en DMF seco (1.5 ml) y se agregó DECP (17 pl, 0.111 mmol, 1.5 eq.) y DIEA (8 pl, 0.046 mmol, 3 eq.). Una solución de compuesto G-12-1 (3,5 mg, 0.046 mmol, 1 eq.) en seco DCM (0.5 ml) fue introducida y la reacción se agitó durante 1,5 horas a 0°C. El solvente fue evaporado bajo presión reducida y el producto en bruto purificado por HPLC preparativa (aguas 600E, columna SunFire Prep C18 OBD, 5 pm, 19 x 100 mm; fase de elución: agua/MeCN amortiguado con 0.1% TFA; gradiente de 5% a 100% MeCN en 15 minutos; 2487 Detector UV de Waters 2487 a 220 nm). Las fracciones seleccionadas fueron combinadas y liofilizadas para proporcionar el compuesto G-13 como un sólido blanco (11.4 mg, 62%).

m/z (Q-TOF MS ESI+) 1058.6510 (30%, MH+, C58H88N7O11 requiere 1058.6536), 529.8285 (100%, (MH2)2+, C58H89N7O11 requiere 529.8305).

Compuesto G-15

2,2,2-trifluoroacetato de metil((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((3-(6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido)bencil)(metil)amino)-3-metilbutanamido)-W,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoil)-L-fenilalaninato

Compuesto G-15:

La anilina 15 (40 mg, 0.047 mmol, 1 eq.) se disolvió en DMF seco (2 ml) y se añadieron DECP (17 pl, 0.111 mmol, 1.5 eq.) y DIEA (10 pl, 0.056 mmol, 1,2 eq.). Una solución de compuesto G-12-1 (108 mg, 0.47 mmol, 10 eq.) en DCM seco (1 ml) fue introducida y la reacción se agitó durante 1.5 hora a 0°C. La mezcla se diluye con DCM (10 ml) y se lava dos veces con agua (20 ml), una vez con salmuera (5 ml). La fase orgánica se secó sobre Na4SO4, filtró y evaporó bajo presión reducida para producir el producto en bruto como un sólido marrón claro (54 mg). El residuo se purificó por HPLC preparativa (SHIMADZU Pre-CLAR-001, columna SunFire Prep C18 Ob D, 5 pm, 19 x 100 mm; fase de elución: agua/ACN amortiguado con 0.1% de TFA; gradiente de 20% a 40% en 10 minutos y 5% a 100% ACN ACN en 15 minutos; detector UV marca Waters 2487 a 254 nm y 220 nm). Las fracciones seleccionadas fueron combinadas y liofilizadas para proporcionar el compuesto G15 como un sólido blanco (27 mg, 50%).

m/z (Q-TOF MS ESI+) 1066.6517 (2%, MNa+, Cs/^sNyNaOn requiere 1066.6199), 522.8224 (100%, (MH2)2+, C57H87N7O11 requiere 522.8226).

Ejemplo 17: Síntesis, purificación y caracterización de ADC

El procedimiento descrito a continuación se aplica a las formas quiméricas y humanizadas de IgG1. Debe apreciarse que para cualquier otra forma, como IgG2, IgG4, etc., el experto en la materia podría adaptar este procedimiento usando el conocimiento general.

Los anticuerpos (1-5 mg/ml) fueron reducidos parcialmente con Tris(2-carboxietil) clorhidrato de fosfina (TCEP) en 10 mM borato de amortiguador pH 8,4 con 150 mM de NaCl y 2 mM EDTA durante 2 h a 37°C. Por lo general, se utilizaron 2.5-3 molares equivalentes de TCEP a un cociente de fármacos al anticuerpo (DAR) de aproximadamente 4, respectivamente. La reducción parcial del anticuerpo fue confirmada por análisis de SDS-PAGE bajo condiciones de no reducción. Antes del acoplamiento ligador-fármacos a los residuos de cisteína intercatenarios liberados, se dejó a la mezcla de reducción enfriar a temperatura ambiente. La concentración de anticuerpos se ajustó a continuación a 1 mg/ml, con 10 mM borato de amortiguador pH 8,4 con 150 mM de NaCl y 2 mM de EDTA, y un exceso molar 5 de fármacos fue agregado al anticuerpo a partir de una solución 10 mM en dimetil sulfóxido (DMSO). Se ajustó la concentración final de DMSO al 10% para mantener la solubilidad del fármaco en el medio acuoso durante el acoplamiento. La reacción se llevó a cabo durante 1 h a temperatura ambiente. El exceso de fármacos finalizó por la adición de 1.5 mol de N-acetilcisteína por mol de fármacos e incubación durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de diálisis contra amortiguador 25 mM His pH 6,5 que contiene 150 mM NaCl durante la noche a 4°C, los conjugados de anticuerpos fármaco fueron purificados por métodos conocidos por el experto en la materia sobre la base de columnas de cromatografía comerciales y unidades de ultrafiltración. En primer lugar, el fármaco no acoplado y los agregados de ADC fueron eliminados por cromatografía por exclusión de tamaño (SEC) en S200 (g E Life Sciences) o columna TSK G3000 SW (Tosoh). Los monómeros de ADC purificados se concentraron a 2-3 mg/ml por ultrafiltración en 30 o 50 unidades de filtración de MWCO de kDa o por cromatografía de afinidad en proteína A. La ADC purificada se almacena a 4°C después de la filtración estéril en filtro de 0.2 pm. Fueron analizadas además por SDS-PAGE bajo condiciones de reducción y sin reducción para confirmar la conjugación de fármacos y por SEC en columnas analíticas S200 o TSK G3000 SWXL para determinar el contenido de monómeros y formas agregadas. Las concentraciones de proteínas se determinaron mediante el análisis de ácido bicinchoninic (BCA) con IgG como estándar. El DAR se estimó para cada ADC purificada por HIC y LC-MS. Típicamente, el contenido de las formas agregadas fue inferior al 5% y el DAR estaba comprendido entre 3.5 y 5.

Ejemplo 18: Evaluación de la citotoxicidad de anticuerpos IGF-1R asociados a diferentes fármacos

18.1 Evaluación de anticuerpos quiméricos en las células MCF-7

Se mostró que los cinco anticuerpos IGF-1R son internalizados rápidamente en lisosomas y presentan una capacidad de unión inferior en ambientes ácidos. En ese sentido, estos Ab tenían todas las propiedades para ser utilizados como ADC. Así, los cinco anticuerpos anti-IGF-1R quiméricos fueron acoplados a tres compuestos diferentes (G-13; E-13 y F-63). El cociente de anticuerpo del fármaco de los ADC fue de aproximadamente 4. Para evaluar la citotoxicidad no específica, la c9G4 de un anticuerpo quimérico irrelevante asimismo fue acoplada con estos compuestos en el mismo DAR. Se incubaron las células MCF-7 con el aumento de las concentraciones de cada ADC a 37°C durante 6 días en medio de cultivo completo. La viabilidad celular se evaluó mediante un análisis de viabilidad de células luminiscentes (CellTiter-Glo, Promega). La señal luminiscente se lee mediante un lector de placa de Mithras (Berthold Technologies). El anticuerpo quimérico irrelevante c9G4 acoplado a E-13, G-13 o F-63 no mostró ninguna o mostró una discreta actividad citotóxica en células MCF-7 (figura 21). Por el contrario, la adición de otros ADC obtenidos después del acoplamiento de anticuerpos anti-IGF-1 R con cualquiera de E-13, G-13 o F-63 disminuye dramáticamente la viabilidad de las células MCF-7.

18.2 Evaluación de anticuerpos quiméricos en las células normales

Los niveles de expresión de IGF-1R se evaluaron en las células normales primarias (PromoCell GmbH) utilizando c208F2 mAb. Para ello, las células (0.5x106 células/ml) se incubaron con 10 pg/ml de anticuerpos c208F2 durante 20 min a 4°C en un amortiguador FACS (PBS, 0.1% BsA, 0.01% NaN3). A continuación se lavaron 3 veces y se incubaron con el anticuerpo secundario apropiado acoplado con Alexa 488 durante 20 minutos adicionales a 4°C a oscuras antes de lavarse 3 veces en amortiguador FACS. Inmediatamente se realizó la unión de anticuerpos anti-IGF-1 R en células viables que se identificaron utilizando yoduro de propidio (que tiñe las células muertas). El nivel de expresión (Bmax) fue bajo en las células normales (tabla 14) en comparación con la expresión de IGF-1R en células MCF-7 (ver Ejemplo 2, tabla 8).

Tabla 14

Se evaluó la citotoxicidad de ADC c208F2-G-13 en las células normales. Las células se incubaron con concentraciones crecientes de c208F2-G-13 a 37°C durante 6 días en un medio de cultivo completo. La viabilidad celular se evaluó mediante un análisis de viabilidad de células luminiscentes (CellTiter-Glo, Promega). La señal luminiscente se lee mediante un lector de placa de Mithras (Berthold Technologies). No se observó gran citotoxicidad en HBSMC, HPMEC, HAoEC y HREpC (figura 25). Se cuantificó la toxicidad celular menor en HUC sólo en altas concentraciones de c208F2-G-13.

18.3 Evaluación de las variantes humanizadas de hz208F2

Las dieciséis variantes humanizadas de 208F2 se acoplaron con el compuesto G-13. El cociente de anticuerpo del fármaco de los ADC fue de aproximadamente 4. Para evaluar la citotoxicidad no específica, la c9G4 de un anticuerpo quimérico irrelevante asimismo se acopló con estos compuestos en el mismo DAR. El anticuerpo quimérico c208F2 asimismo fue acoplado con G-13. Se incubaron las células MCF-7 con el aumento de las concentraciones de cada ADC a 37°C durante 6 días en medio de cultivo completo. La viabilidad celular se evaluó mediante un análisis de viabilidad de células luminiscentes (CellTiter-Glo, Promega). La señal luminiscente se lee mediante un lector de placa de Mithras (Berthold Technologies). El anticuerpo quimérico irrelevante c9G4 acoplado con G-13 no mostró ninguna o mostró una discreta actividad citotóxica en células MCF-7 (figura 26). Por el contrario, la adición de otros ADC obtenidos después de acoplamiento de anticuerpos anti-IGF-1R con G-13 disminuye drásticamente la viabilidad de las células MCF-7. La capacidad de las dieciséis variantes humanizadas para inducir citotoxicidad celular fue por lo menos equivalente e incluso mejor a la que se midió con la forma quimérica c208F2-G-13, como se muestra en la tabla 15 y se ilustra con una variante humanizada en la figura 26.

Tabla 15

Ejemplo 19: Actividad in vivo del anticuerpo c208F2 conjugado con compuestos E-13, G-13 o F-63 en el modelo MCF-7 de xenoinjerto.

Para confirmar que la eficacia in vitro de c208F2 asociada a compuestos G-13, E-13 o F-63 podría traducirse in vivo, se han probado en el modelo MCF-7 de xenoinjerto.

Todos los procedimientos con animales fueron realizados según las directrices de la Directiva 2010/63/UE sobre la protección de los animales utilizados para fines científicos. El protocolo fue aprobado por el Animal Ethical Committee del Pierre Fabre Institute. Cinco millones de células MCF-7 fueron inyectadas subcutáneamente en viejos ratones desnudos/Swiss de 7 semanas de edad. Antes de la inyección de la célula, se implantaron gránulos de estrógeno (Innovative Research of America) en el costado izquierdo a los ratones para liberar los estrógenos necesarios para el crecimiento in vivo de tumores MCF-7.

Veinte días después de la implantación de células MCF-7, cuando los tumores alcanzaron un tamaño medio de 120-150 mm3, los animales fueron divididos en grupos de 5 ratones según el tamaño del tumor y su aspecto. Los diferentes tratamientos fueron inoculados por inyección intraperitoneal. El estado de salud de los animales fue supervisado diariamente. Se cuantificó el volumen tumoral dos veces a la semana con una pinza calibradora electrónica hasta el final del estudio. El volumen tumoral se calcula con la siguiente fórmula: n/6 x longitud x anchura x altura. La toxicidad se evaluó siguiendo el peso de los animales tres veces por semana. Se realizaron análisis estadísticos en cada cuantificación mediante una prueba de Mann-Whitney. Todos los compuestos fueron inyectados por vía intraperitoneal (i.p.). En este ejemplo, se evaluó la actividad antitumoral de mAb c208F2 acoplado con E-13, F-13 o F-63 en aproximadamente DAR 4 tras 2 inyecciones de una dosis de 7 mg/kg en D20 y d 27 (figuras 22A, 22B y 22C). Paralelamente las porciones de fármaco con adición de caperuza E-13, F-13 y F-63 fueron inyectados con la dosis equivalente de la correspondiente a 7 mg/kg de c208F2-E-13, c208F2-F-13 y c208F2-F-63 DAR aproximadamente 4.

La inyección de cualquier c208-E-13 (figura 22A), c208F2-G-13 (figura 22B) c208F2-F-63 (figura 22) inhibió significativamente o incluso indujo una regresión de crecimiento completa del tumor (p < vs 0.05 fármaco con adición de caperuza correspondiente). No se aprecia ninguna diferencia de actividad estadística entre c208-E-13, c208F2-G-13 y c208F2-F-63. Los fármacos con adición de caperuza no tuvieron ningún efecto sobre el crecimiento tumoral de m CF-7 (p > 0.05 vs grupo control)

Un segundo conjunto de experimentos se realizó con c208F2 acoplado con E-13 o G-13 y con el anticuerpo irrelevante c9G4 acoplado con E-13 o G-13 en modelos de xenoinjerto de MCF-7 como el descrito anteriormente. Los ratones fueron inyectados i.p. con 7 mg/kg de cada ADC en D20 y D27 (figuras 23A y 23B).

La inyección de c9G4-E-13 y c9G4-F-13 afectó de manera moderada y temporal el crecimiento de tumores de xenoinjerto de MCF-7. Sin embargo, este segundo experimento confirmó que las inyecciones ya sea de C208-E-13 o c208F2-G-13 indujeron la regresión completa del tumor, ya que D43 muestra una elevada actividad antitumoral de los ADC.

Ejemplo 20: Actividad in vivo del anticuerpo hz208F2 conjugado al compuesto G-13 en el modelo de xenoinjerto 3+ MCF-7.

Las formas humanizadas de 208F2 acopladas al compuesto G-13 han sido evaluadas en vivo, en el modelo de xenoinjerto MCF-7.

Todos los procedimientos con animales fueron realizados según las directrices de la Directiva 2010/63/UE sobre la protección de los animales utilizados para fines científicos. El protocolo fue aprobado por el Animal Ethical Committee del Pierre Fabre Institute. Cinco millones de células MCF-7 fueron inyectadas subcutáneamente en viejos ratones desnudos/Swiss de 7 semanas de edad. Antes de la inyección de la célula, se implantaron unos gránulos de estrógeno (Innovative Research of America) en el costado izquierdo a los ratones para liberar estrógenos necesarios para el crecimiento in vivo de tumores MCF-7.

Veinte días después de la implantación de células MCF-7, cuando los tumores alcanzaron un tamaño medio de 120-150 mm3, los animales fueron divididos en grupos de 6 ratones según el tamaño del tumor y su aspecto. Los diferentes tratamientos fueron inoculados mediante inyecciones intraperitoneales como un protocolo de 4 inyecciones; una inyección cada cuatro días (Q4d4). El estado de salud de los animales fue supervisado diariamente. Se cuantificó el volumen tumoral dos veces a la semana con una pinza calibradora electrónica hasta el final del estudio. El volumen tumoral se calcula con la siguiente fórmula: n/6 x longitud x anchura x altura. La toxicidad se evaluó siguiendo el peso de los animales tres veces por semana. Se realizaron análisis estadísticos en cada cuantificación mediante una prueba de Mann-Whitney. Todos los compuestos fueron inyectados por vía intraperitoneal (i.p.). En este ejemplo, se comparó la actividad antitumoral del mAb c208F2 acoplado al compuesto G-13 con respecto a diferentes formas humanizadas asimismo acopladas a G-13 (figura 27). Las formas humanizadas sometidas a pruebas se describen en la siguiente tabla 16:

Tabla 16

La inyección de las formas humanizadas des c208-G-13 o 208F2 inhibió significativamente e incluso indujo una completa regresión del crecimiento tumoral (p <0.05 vs control correspondiente). No se observó ninguna diferencia estadística de actividad entre c208F2-G-13 y las formas humanizadas sometidas a pruebas.

Se llevó a cabo un segundo conjunto de experimentos con c208F2 o hz208F2-4 acoplado a G-13 en modelos de xenoinjerto MCF-7 como se describió anteriormente (figuras 28A y 28B, respectivamente). Los ratones se inyectaron i.p. con 3 mg/kg de cada ADC, cada cuatro días para 4 inyecciones (Q4d4) o únicamente una vez.

Se observó la misma fuerte actividad antitumoral cuando el ADC se inyectó cuatro veces o únicamente una vez en el modelo de xenoinjerto MCF.

Ejemplo 21: Actividad in vivo del anticuerpo 208F2 conjugado a los compuestos G-13 o E-13 en el modelo de xenoinjerto 2+ CaOV-3.

Se estudió asimismo la actividad antitumoral en un tumor expresivo para 2+, el modelo de xenoinjerto CaOV-3 que es una estirpe celular de carcinoma ovárico. Para esa propuesta, se inyectaron ratones por vía subcutánea en D0 con 7x106 células. Cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 120 mm3 (19 días posteriores a la inyección de células tumorales), los animales se dividieron en 5 grupos de 5 ratones con un tamaño de tumor comparable y

Claims

REIVINDICACIONES

1. Conjugado anticuerpo-fármaco de la fórmula (I) siguiente:

Ab-(L-D)n (I)

o sal farmacéuticamente aceptable del mismo,

en el que

Ab es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, apto para unirse al IGF-1R humano, comprendiendo dicho anticuerpo las tres CDR de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 1, 2 y 3 y las tres CDR de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 4, 5 y 6;

L es un ligador;

D es una porción de fármaco de la fórmula (II) siguiente:

en el que:

R2 es COOH, COOCH3 o tiazolilo;

R3 es H o alquilo (C1-C6);

R9 es H o alquilo (C1-C6);

m es un número entero comprendido entre 1 y 8;

la línea ondulada indica el punto de fijación a L; y

n es 1 a 12.

2. Conjugado anticuerpo-fármaco según la reivindicación 1, en el que Ab es seleccionado de entre:

a) un anticuerpo que comprende las tres CDR de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 7, 2 y 3 y las tres CDR de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 9, 5 y 11;

b) un anticuerpo que comprende las tres CDR de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 7, 2 y 3 y las tres CDR de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 10, 5 y 11;

c) un anticuerpo que comprende las tres CDR de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 7, 2 y 3 y las tres CDR de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 9, 5 y 12; y

d) un anticuerpo que comprende las tres CDR de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 8, 2 y 3 y las tres CDR de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 9, 5 y 11.

3. Conjugado anticuerpo-fármaco según la reivindicación 1 o 2, en el que Ab es seleccionado de entre: a) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 13 y las tres CDR de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 9, 5 y 11;

b) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 14 y las tres CDR de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 10, 5 y 11;

c) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 15 y las tres CDR de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 9, 5 y 12;

d) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 16 y las tres CDR de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 9, 5 y 11; y

e) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 17 y las tres CDR de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 9, 5 y 12.

4. Conjugado anticuerpo-fármaco según la reivindicación 1 o 2, en el que Ab es seleccionado de entre:

a) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 18 y las tres CDR de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 7, 2 y 3;

b) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 19 y las tres CDR de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 7, 2 y 3;

c) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 20 y las tres CDR de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 7, 2 y 3;

d) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 21 y las tres CDR de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 8, 2 y 3; y

e) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 22 y las tres CDR de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 7, 2 y 3.

5. Conjugado anticuerpo-fármaco según la reivindicación 1, en el que Ab se selecciona de entre los anticuerpos 208F2, 212A11,214F8, 219D6y213B10.

6. Conjugado anticuerpo-fármaco según la reivindicación 1, en el que Ab comprende:

b) un dominio variable de cadena ligera (VL) de la secuencia SEC ID n° 35, en el que dicha secuencia SEC ID n° 35 comprende por lo menos 1 retromutación seleccionada de entre los residuos 22, 53, 55, 65, 71, 72, 77 u 87.

7. Conjugado anticuerpo-fármaco según la reivindicación 1, en el que Ab es seleccionado de entre:

a) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de la secuencia seleccionada de entre SEC ID n° 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 y 80 o cualquier secuencia con una identidad de por lo menos 80% con SEC ID n° 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 u 80; y las tres CDR de cadena ligera de las secuencias SEC ID n° 9, 5 y 11;

b) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena ligera de la secuencia seleccionada de entre SEC ID n° 57 o 60 o cualquier secuencia con una identidad de por lo menos 80% con SEC ID n° 57 o 60; y las tres CDR de cadena pesada de las secuencias SEC ID n° 7, 2 y 3; y

c) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada de la secuencia seleccionada de entre SEC ID n° 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 y 80 o cualquier secuencia con una identidad de por lo menos 80% con SEC ID n° 56, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 u 80; y un dominio variable de cadena ligera de la secuencia seleccionada de entre SEC ID n° 57 o 60 o cualquier secuencia con una identidad de por lo menos 80% con SEC ID n° 57 o 60.

8. Conjugado anticuerpo-fármaco según la reivindicación 1, en el que Ab comprende:

a) una cadena pesada de la secuencia seleccionada de entre SEC ID n° 58, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 y 81 o cualquier secuencia con una identidad de por lo menos 80% con SEC ID n° 58, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 u 81; y

b) una cadena ligera de la secuencia seleccionada de entre SEC ID n° 59 y 61 o cualquier secuencia con una identidad de por lo menos 80% con SEC ID n° 59 o 61.

9. Conjugado anticuerpo-fármaco según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que L es un ligador de la fórmula (III) siguiente:

en el que

L2 es cicloalquilo (C4-C10)-carbonilo, alquilo (C2-C6), alquilo (C2-C6)-carbonilo,

W es una unidad de aminoácido; w es un número entero comprendido entre 0 y 5;

Y es PAB-carbonilo con PAB siendo

y es 0 o 1;

el asterisco indica el punto de fijación a D; y

la línea ondulada indica el punto de fijación a Ab.

10. Conjugado anticuerpo-fármaco según la reivindicación 9, en el que L2 es de la fórmula siguiente:

en el que

el asterisco indica el punto de fijación a (W)w; y

11. Conjugado anticuerpo-fármaco según la reivindicación 9, en el que (W)w se selecciona de entre: un solo enlace,

y

en el que

el asterisco indica el punto de fijación a (Y)y; y

la línea ondulada indica el punto de fijación a L2.

12. Conjugado anticuerpo-fármaco según la reivindicación 9, en el que w = 0; o w = 2 y (W)w se selecciona de entre:

en el que

el asterisco indica el punto de fijación a (Y)y; y

la línea ondulada indica el punto de fijación a L2.

13. Conjugado anticuerpo-fármaco según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que (L-D) se selecciona de entre:

en el que la línea ondulada indica el punto de fijación a Ab.

14. Conjugado anticuerpo-fármaco según la reivindicación 1, que presenta la fórmula seleccionada de entre:

y las sales farmacéuticamente aceptables del mismo,

en el que Ab se selecciona de entre el grupo que consiste en los anticuerpos 208F2, 212A11, 214F8, 219D6 y 213B10.

15. Conjugado anticuerpo-fármaco según la reivindicación 14, en el que Ab se selecciona de entre el grupo que consiste en:

- un anticuerpo que presenta un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 56 y un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 57;

- un anticuerpo que presenta un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 56 y un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 60;

- un anticuerpo que presenta un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 62 y un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 57;

- un anticuerpo que presenta un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 64 y un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 57;

- un anticuerpo que presenta un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 64 y un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 60;

- un anticuerpo que presenta un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 66 y un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 57;

- un anticuerpo que presenta un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 68 y un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 57;

- un anticuerpo que presenta un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 68 y un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 60;

- un anticuerpo que presenta un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 70 y un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 57;

- un anticuerpo que presenta un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 72 y un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 57;

- un anticuerpo que presenta un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 74 y un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 57;

- un anticuerpo que presenta un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 76 y un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 57;

- un anticuerpo que presenta un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 78 y un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 57;

- un anticuerpo que presenta un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 78 y un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 60; y

- un anticuerpo que presenta un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 80 y un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 57.

16. Conjugado anticuerpo-fármaco según la reivindicación 15, en el que Ab es seleccionado de entre el grupo que consiste en:

- un anticuerpo que presenta una cadena pesada de secuencia SEC ID n° 58 y una cadena ligera de secuencia Se C ID n° 59;

- un anticuerpo que presenta una cadena pesada de secuencia SEC ID n° 58 y una cadena ligera de secuencia Se C ID n° 61;

- un anticuerpo que presenta una cadena pesada de secuencia SEC ID n° 63 y una cadena ligera de secuencia Se C ID n° 59;

- un anticuerpo que presenta una cadena pesada de secuencia SEC ID n° 65 y una cadena ligera de secuencia Se C ID n° 59;

- un anticuerpo que presenta una cadena pesada de secuencia SEC ID n° 65 y una cadena ligera de secuencia Se C ID n° 61;

- un anticuerpo que presenta una cadena pesada de secuencia SEC ID n° 67 y una cadena ligera de secuencia Se C ID n° 59;

- un anticuerpo que presenta una cadena pesada de secuencia SEC ID n° 69 y una cadena ligera de secuencia Se C ID n° 59;

- un anticuerpo que presenta una cadena pesada de secuencia SEC ID n° 69 y una cadena ligera de secuencia Se C ID n° 61;

- un anticuerpo que presenta una cadena pesada de secuencia SEC ID n° 71 y una cadena ligera de secuencia Se C ID n° 59;

- un anticuerpo que presenta una cadena pesada de secuencia SEC ID n° 73 y una cadena ligera de secuencia Se C ID n° 59;

- un anticuerpo que presenta una cadena pesada de secuencia SEC ID n° 75 y una cadena ligera de secuencia Se C ID n° 59;

- un anticuerpo que presenta una cadena pesada de secuencia SEC ID n° 77 y una cadena ligera de secuencia Se C ID n° 59;

- un anticuerpo que presenta una cadena pesada de secuencia SEC ID n° 79 y una cadena ligera de secuencia Se C ID n° 59;

- un anticuerpo que presenta una cadena pesada de secuencia SEC ID n° 79 y una cadena ligera de secuencia Se C ID n° 61; y

- un anticuerpo que presenta una cadena pesada de secuencia SEC ID n° 81 y una cadena ligera de secuencia Se C ID n° 59.

17. Conjugado anticuerpo-fármaco según la reivindicación 14, que presenta la fórmula siguiente:

en el que Ab se selecciona de entre el grupo que consiste en:

- un anticuerpo que presenta un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 80 y un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 57; y

- un anticuerpo que presenta un dominio variable de cadena pesada de secuencia SEC ID n° 34 y un dominio variable de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 36.

18. Conjugado anticuerpo-fármaco según la reivindicación 17, en el que Ab se selecciona de entre el grupo que consiste en:

un anticuerpo que presenta una cadena pesada de secuencia SEC ID n° 71 y una cadena ligera de secuencia Se C ID n° 59;

un anticuerpo que presenta una cadena pesada de secuencia SEC ID n° 75 y una cadena ligera de secuencia Se C ID n° 59;

un anticuerpo que presenta una cadena pesada de secuencia SEC ID n° 81 y una cadena ligera de secuencia Se C ID n° 59; y

un anticuerpo que presenta una cadena pesada de secuencia SEC ID n° 38 y una cadena ligera de secuencia Se C ID n° 40.

19. Conjugado anticuerpo-fármaco según la reivindicación 1, en el que n es 2.

20. Conjugado anticuerpo-fármaco según la reivindicación 1, en el que n es 4.

21. Conjugado anticuerpo-fármaco según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para una utilización como un medicamento.

22. Composición que comprende por lo menos un conjugado anticuerpo-fármaco según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

23. Composición según la reivindicación 22, que comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.

24. Composición según la reivindicación 22 o 23, para una utilización en el tratamiento de un cáncer que expresa IGF-1R.

25. Composición según la reivindicación 24, en la que dicho cáncer que expresa IGF-1R es un cáncer seleccionado de entre cáncer de mama, de colon, carcinoma esofágico, hepatocelular, gástrico, glioma, pulmonar, melanoma, osteosarcoma, ovárico, de próstata, rabdomiosarcoma, renal, de tiroides, cáncer endometrial uterino, mesotelioma, carcinoma bucal escamoso y cualquier cáncer resistente a fármacos.