WO2009119794A1

WO2009119794A1 - 感染症予防、治療剤

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Publication number: WO2009119794A1
Application number: PCT/JP2009/056265
Authority: WO
Inventors: 睦佐野; 真弓飴本; さつき百々; 泰広川野; 郁之進加藤
Original assignee: タカラバイオ株式会社
Priority date: 2008-03-27
Filing date: 2009-03-27
Publication date: 2009-10-01
Also published as: JPWO2009119794A1; US20110028697A1; EP2260863A1

Abstract

　本発明により、細菌トキシン－アンチトキシン系を構成するトキシン又はアンチトキシンに結合し、トキシン－アンチトキシン間相互作用を阻害する抗体、又はその遺伝子を有効成分として含有する細菌性感染症の予防又は治療剤が提供される。

Description

感染症予防、治療剤

　本発明は、感染症治療に有用な機能性抗体、及び当該機能性抗体又はその遺伝子を有効成分とする感染症治療剤に関する。

　原核生物のプラスミドの中には、宿主でのプラスミドを維持するためにプラスミドが脱落した宿主を殺すｐｏｓｔ－ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ　ｋｉｌｌｉｎｇ（ＰＳＫ）の機能を有するものが報告されている。これらのプラスミドにはトキシン－アンチトキシン系（以下、ＴＡ系と記載する。また、ＴＡモジュール、ＴＡ複合体、アディクションモジュールと称されていることがある）をコードする遺伝子（以下、ＴＡ遺伝子と記載する。）が存在している。アンチトキシンは細胞内でトキシンと結合して複合体を形成することによってトキシンを不活化しているが、アンチトキシンはトキシンに比べて細胞内で不安定であり、アンチトキシンがプロテアーゼにより分解される事によってより安定なトキシンが活性化される（非特許文献１）。

　現在までに多数のＴＡ系が報告されている。これらはＣｃｄＡ－ＣｃｄＢ、ＲｅｌＢ－ＲｅｌＥ、ＰａｒＤ－ＰａｒＥ、ＨｉｇＡ－ＨｉｇＢ、ＭａｚＥ／ＰｅｍＩ－ＭａｚＦ／ＰｅｍＫ、Ｐｈｄ－Ｄｏｃ、ならびにＶａｐＢ－ＶａｐＣの７つの２コンポーネントファミリーと、ω－ε－ζという３コンポーネントファミリーに分類される（非特許文献１）。

　このようなＴＡ系のひとつとして多数のバクテリアのクロモソームに存在するＭａｚＥ－ＭａｚＦ系がある。井上らはトキシンであるＭａｚＦ（ＣｈｐＡＫ）は、リボソーム非依存的に特定の塩基配列（ＡＣＡ）を認識してｍＲＮＡを切断するエンドリボヌクレアーゼであることを証明している。Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎらは、トキシンであるＲｅｌＥが３塩基の特定のコドンを認識してｍＲＮＡを切断するエンドリボヌクレアーゼであることを報告している。また、同グループはトキシンであるＣｈｐＡＫ、ＣｈｐＢＫ及びＹｏｅＢも同様にコドン依存的にｍＲＮＡを切断するエンドリボヌクレアーゼであることを報告している。また大腸菌以外にもＭａｚＦのホモログとして、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ　ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓのＤＲ０６６２、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｏｖｉｓ　ＢＣＧのＭｂ２０１４ｃなどの遺伝子（特許文献１）やＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのＭａｚＦホモログ（非特許文献２）が報告されている。最近、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓにもＭａｚＦのホモログが見つかっている（非特許文献３）。

　当初、大腸菌のＭａｚＥＦは大腸菌に細胞死を引き起こすと報告された（非特許文献４）。しかしながらその後、ＭａｚＦの過剰発現はｍＲＮＡを分解してタンパク質の翻訳を抑制し、その結果大腸菌のコロニー形成能は低下するが、アンチトキシンであるＭａｚＥ遺伝子を発現させる事によって細胞増殖が回復するという研究結果などが示された。このことから、現在ではＭａｚＦは大腸菌に細胞死を引き起こすものではないとされている（非特許文献１）。

　それにも関らずＴＡ系は新しい抗生物質の創薬ターゲットとして有用である可能性が指摘されている。特許文献２及び３にはＴＡ系複合体形成を阻害する物質のスクリーニング方法が開示されている。これらの文献にはＴＡ系の複合体形成を阻害する物質が細菌の増殖を抑制する抗生物質として働く可能性について述べられているが、いずれも科学的根拠の無い単なる推測として記載されているに過ぎない。したがって、現在のところＴＡ系の複合体形成を阻害して細菌の増殖抑制や細胞死が起こるかどうかは明らかでなかったし、トキシン－アンチトキシン間相互作用を阻害する抗体により感染症疾患を治療した例や治療可能であることを裏付ける証拠は示されていない。たとえある細菌の増殖とＴＡ系複合体形成との関連が知られていたとしても、実際にトキシンあるいはアンチトキシンに結合する抗体がその細菌による感染症の治療に有効かどうかは不明である。細菌は多くのＴＡ系を有することが分かっている。それぞれのＴＡ系は細胞のなかで他のＴＡ系と複雑なネットワークを作っていると考えられているので、単にある細菌のトキシンあるいはアンチトキシンの働きのみを阻害しただけで当該細菌による感染症疾患が治療できるかどうかは知られていなかった。ある細菌のトキシン－アンチトキシン間相互作用を阻害して当該細菌による感染症疾患の治療に有効な性能を有する機能性抗体はおろか、低分子化合物さえも発見されていない。
国際公開第２００７／０１３２６５号パンフレット特開２００７－３９３９８号公報国際公開第２００７／１０９７８１号パンフレットネイチャー・レビューズ・マイクロバイオロジー（Ｎａｔｕｒｅ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、第３巻、第３７１～３８２頁（２００５）ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２８１巻、第１８６３８～１８６４３頁（２００６）ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、第１８９巻、第８８７１～８８７９頁（２００７）プロシーディングス　オブ　ナショナル　アカデミー　オブ　サイエンス（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）　ＵＳＡ、第９３巻、第６０５９～６０６３頁（１９９６）

　近年、多剤耐性菌の出現は医療現場の大きな問題となっており、特定の細胞機能を標的とした新規な感染症治療薬の開発が望まれている。
　従って、本発明は上記のような問題を解決し、新規な感染症治療薬を提供すべくなされたものである。

　本発明者らは、細菌の持つトキシンに特異的に反応する抗体を検索したところ、それらの中に、トキシンのエンドリボヌクレアーゼ活性を保持したまま、アンチトキシンとトキシンとの複合体形成を阻害し、細菌の増殖を抑制、もしくは細菌を死滅させる作用を有するという特異な性質の機能性抗体を見出し、この性質の抗体、当該抗体の活性断片及びこれらをコードする遺伝子は、各感染菌の感染治療薬として広く有用であることを見出し、本発明を完成させるに至った。

　本発明を概説すれば、
［１］細菌トキシン－アンチトキシン系を構成するトキシン又はアンチトキシンに結合し、トキシン－アンチトキシン間相互作用を阻害する抗体、又はその遺伝子を有効成分として含有する細菌性感染症の予防又は治療剤、
［２］前記抗体がトキシン又はアンチトキシンに対するモノクローナル抗体である［１］の予防又は治療剤、
［３］前記抗体が大腸菌、結核菌及びブドウ球菌からなる群より選択される細菌のトキシン又はアンチトキシンに対するモノクローナル抗体である［２］の予防又は治療剤、
［４］前記トキシン－アンチトキシン系が、配列特異的なエンドリボヌクレアーゼ活性を有するトキシンを含有するトキシン－アンチトキシ系である［１］～［３］のいずれかに記載の予防又は治療剤、
［５］前記抗体が組換え型抗体である［１］～［４］のいずれかに記載の予防又は治療剤、
［６］前記抗体がヒト化抗体又は完全ヒト抗体である［１］～［５］のいずれかに記載の予防又は治療剤、
［７］細菌性感染症が、結核、ＭＲＳＡ感染症及びＶＲＥ感染症からなる群より選択される感染症である、［１］～［６］のいずれかに記載の予防又は治療剤、
［８］細菌トキシン－アンチトキシン系を構成するトキシン又はアンチトキシンに結合し、トキシン－アンチトキシン間相互作用を阻害する抗体を有効成分として含有する細菌性感染症における体重減少抑制剤、
である。

　本発明により、トキシン又はアンチトキシンに特異的に結合し、かつトキシン－アンチトキシン間の相互作用を阻害することにより、トキシン－アンチトキシン複合体形成を妨害し、もって細菌の増殖を抑制もしくは細菌を死滅させる効果を発揮する抗体又は当該抗体の抗原結合部位を含む断片あるいはそれらをコードする遺伝子を有効成分とする細菌感染症の予防・治療剤が提供される。

本発明の実施例４に係る細菌ＴＡ系の相互作用阻害を示す図である。本発明の実施例５に係る細菌ＴＡ系の相互作用阻害を示す図である。本発明の実施例６に係る細菌ＴＡ系の相互作用阻害を示す図である。本発明の実施例７に係る細菌ＴＡ系の相互作用阻害を示す図である。本発明の実施例７に係る細菌ＴＡ系の相互作用阻害を示す図である。本発明の実施例７に係る細菌ＴＡ系の相互作用阻害を示す図である。本発明の実施例７に係る細菌ＴＡ系の相互作用阻害を示す図である。本発明の実施例７に係る細菌ＴＡ系の相互作用阻害を示す図である。本発明の実施例８に係る細菌の生育を示す図である。本発明の実施例９に係る細菌生菌数を示す図である。

　本発明において、「抗体」とは免疫原（抗原）と特異的に反応する免疫グロブリン及び抗原結合部位を含むその断片を意味する。本発明において、Ｂ細胞が産生する抗体又は抗原結合部位を含むその断片を使用することができる。抗原結合部位を含むその断片としては、重鎖（Ｈ鎖、Ｈｅａｖｙ　ｃｈａｉｎ）、軽鎖（Ｌ鎖、Ｌｉｇｈｔ　ｃｈａｉｎ）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、可変領域（Ｖ_Ｈ、Ｖ_Ｌ）又は定常領域などを単独で、あるいは組み合わせて使用することができる。一般的に重鎖には、γ鎖、μ鎖、α鎖、δ鎖及びε鎖の５種類があり、軽鎖にはλ鎖とκ鎖の２種類が存在する。これらの分子の組み合わせによって、サブクラスがＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥの各抗体分子が形成される。本発明において使用する抗体としては、ヒト、あるいはマウスのような非ヒト動物由来のモノクローナル抗体、キメラ抗体を含むヒト化抗体、完全ヒト抗体、ポリクローナル抗体、多価抗体（例えば、バイバレント抗体）、マルチ特異性抗体（例えば、バイスペシフィック抗体）又は１本鎖抗体（単鎖抗体、ｓｃＦｖ）、さらにラクダやラマの持つＨ鎖のみからなる抗体から開発されたナノ抗体（Ｎａｎｏｂｏｄｙ）やサメのＩｇＮＡＲなどの抗体様分子などが例示される。
　本発明に用いられる抗体は、標的細菌のトキシンの活性を保持したままトキシン又はアンチトキシンを認識し、これに結合して、トキシン―アンチトキシンの相互作用を阻害しうる特異性及び性能を有していればよい。

　本発明において、「トキシン（Ｔｏｘｉｎ）」及び「アンチトキシン（Ａｎｔｉｔｏｘｉｎ）」とは、それぞれ、細菌（バクテリア）のプラスミドＤＮＡ又は染色体ＤＮＡ上にコードされたタンパク質性毒素及び抗毒素のことを意味する。トキシンは「毒素（ｐｏｉｓｏｎ）」と、アンチトキシンはしばしば「解毒剤（アンチドート、Ａｎｔｉｄｏｔｅ）」とも呼ばれる。細菌細胞内でトキシンはアンチトキシンと安定なＴＡ複合体を形成し、そのためにトキシンは細胞に対して毒性を発揮することがないが、細胞に対する様々なストレスに応答して、不安定なアンチトキシンがプロテアーゼによって分解を受けるとトキシンがその毒性を発揮して、ＤＮＡ複製やタンパク質合成を制御する。以上に説明したトキシンとアンチトキシンとで構成される細菌の増殖制御システムは、トキシン－アンチトキシン系（ＴＡ系）あるいはアディクションモジュールと呼ばれている。現在までに多数のＴＡ系が報告されている。本発明の抗体によりその機能が調節されるＴＡ系としては、特に本発明を限定するものではないが、以下のようなＴＡ系が例示される。

　Ｋｅｎｎ　Ｇｅｒｄｅｓらのレビュー［Ｎａｔｕｒｅ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第３巻、第３７１～３８２頁（２００５）］によれば、細菌には７つのＴＡ系ファミリーが存在している。レビュー中の表１には、それぞれのＴＡ系をコードするローカス名、トキシン名、アンチトキシン名、トキシンの作用及び原核生物ゲノム中のローカス数などがまとめられている。これらの中で、ｒｅｌＢＥローカスにコードされているトキシンＲｅｌＥとｍａｚＥＦ（別名ＣｈｐＡ）ローカスにコードされるトキシンＭａｚＦ（ＰｅｍＫ）は、ｍＲＮＡを分解するリボヌクレアーゼである。大腸菌のＭａｚＥ（ＰｅｍＩ）（アンチトキシン）／ＭａｚＦ（トキシン）は最もよく解析されているＴＡ系である。ＭａｚＦがリボソーム非依存的にｍＲＮＡ中のＡＣＡ配列を特異的に切断することが井上らによって示されている［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｅｌｌ、第１２巻、第９１３～９２３頁（２００３）］。ＲｅｌＥに関してもリボソーム依存的に３塩基の特定コドンを認識してｍＲＮＡを切断するエンドリボヌクレアーゼであると報告されている。従ってＲｅｌＥやＭａｚＦの毒性はｍＲＮＡを分解することによって翻訳を抑制することにある。ごく最近、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＶａｐＣ－１トキシンとＶｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅのＨｉｇＢトキシンについてもｍＲＮＡを分解するリボヌクレアーゼ活性を持つことが報告されている［Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、第１８９巻、第５０４１～５０４８頁（２００７）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第６２巻、第３９７～４１１頁（２００６）］。なお、ＭａｚＦは病原性大腸菌Ｏ－１５７株にも存在する。また、ごく最近大腸菌ＭａｚＥ－ＭａｚＦはバンコマイシン耐性腸球菌に存在することが報告された［Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ、第１０４巻、第３１１～３１６頁（２００７）］。

　なお、本明細書では大腸菌以外の細菌由来のＭａｚＦ及びＭａｚＥファミリーのトキシン及びアンチトキシンについて、起源細菌名をＭａｚＦ又はＭａｚＥに付して表示することがある。ＭａｚＦ（ＢＣＧ）及びＭａｚＥ（ＢＣＧ）はそれぞれＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｏｖｉｓ　ＢＣＧ由来のＭａｚＦ及びＭａｚＥを、また、ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）及びＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）はそれぞれＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ由来のＭａｚＦ及びＭａｚＥを指す。ＭａｚＦ（ＢＣＧ）及びＭａｚＥ（ＢＣＧ）のアミノ酸配列は、下記の結核菌由来のＭａｚＦ及びＭａｚＥのアミノ酸配列と同一である。

　以下、ＭａｚＦファミリー及びＭａｚＥファミリーのアミノ酸配列を例示する。
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）のＭａｚＦ（配列番号１）
結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のＭａｚＦ（配列番号２）
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）のＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（配列番号３）
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）のＭａｚＥ（配列番号４）
結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のＭａｚＥ（配列番号５）
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）のＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（配列番号６）

　（Ｉ）本発明の抗体
　本発明の抗体は、標的細菌のＴＡ系を構成するトキシン又はアンチトキシンを特異的に認識して結合し、当該トキシンと対応するアンチトキシンとの間の相互作用を阻害する能力をもつ抗体であれば、抗体の作製方法又は製造方法には限定されず、一般的な方法に従って当該抗体を取得することができる。本発明の好適な態様として、ｍＲＮＡを配列特異的に切断するエンドリボヌクレアーゼ活性を有するトキシン又はそのアンチトキシンを認識する抗体が例示される。以下に大腸菌のＴＡ系の一つであるＭａｚＥ－ＭａｚＦ系を構成するトキシンであるＭａｚＦ、及びアンチトキシンであるＭａｚＥを例として本発明の抗体について説明する。

（１）抗原の調製
　抗ＭａｚＥ抗体や抗ＭａｚＦ抗体を得るために用いられる抗原としては、タンパク質であるＭａｚＥやＭａｚＦそのもの、あるいはその少なくとも３残基の連続した部分アミノ酸配列からなるＭａｚＥあるいはＭａｚＦ由来ペプチド、あるいは抗原性を向上させる目的で、これらにヘルパーＴ細胞エピトープペプチドやアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などのキャリアタンパク質を付加した誘導体などが用いられる。

　ＭａｚＥやＭａｚＦをそのまま抗原として用いる場合は、当該タンパク質は大腸菌の菌体から直接精製する事ができるが、ＭａｚＥやＭａｚＦをコードするＤＮＡをクローニングして遺伝子組換え技術を使用して組換え体タンパク質として発現させたものを用いることができる。公知の方法に従って、原核細胞の適当な宿主、例えば大腸菌や枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）での発現に適したプラスミドベクターにＭａｚＥ遺伝子あるいはＭａｚＦ遺伝子を搭載しこれらの宿主細胞でＭａｚＥやＭａｚＦを発現させることができる。動物への免疫抗原としては、細胞抽出液やその濃縮物など組換え体ＭａｚＥやＭａｚＦを含む粗抽出画分を用いることができる。免疫抗原を精製して用いる場合には、発現産物の精製を容易にするために、抗原性を変化させない範囲でＨｉｓ－Ｔａｇ又はＨＡ－Ｔａｇなどのタグ配列を抗原タンパク質のＣ末端あるいはＮ末端に付加することができる。Ｃ末端Ｈｉｓ－Ｔａｇ付きＭａｚＥあるいはＭａｚＦの大腸菌での発現、精製はモレキュラー　セル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｅｌｌ）第１２巻、第９１３～９２３頁（２００３）に記載の方法に従って行う事ができる。Ｎ末端Ｈｉｓ－Ｔａｇ付きＭａｚＥあるいはＭａｚＦ組換えタンパク質についても上記文献記載の方法に順じて調製することができる。組み換え体ＭａｚＥやＭａｚＦの発現量やタンパク質の溶解性を向上させる目的で、国際公開第２００７／１０９６９７号パンフレットに記載の方法に従ってＭａｚＥ又はＭａｚＦをＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓのＰｒｏｔｅｉｎ　Ｓとのキメラ型タンパク質として発現させても良い。

（２）本発明に用いられる抗ＭａｚＦ抗体あるいは抗ＭａｚＥ抗体の調製
　本発明のポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体は、それぞれ［メソッズ　イン　エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第１８２巻、第６６３～６７０頁（１９９０）］又は［モノクローナル　アンタイボディーズ：プリンシプル　アンド　プラクティス（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ）アカデミックプレス（１９９６）］に記載の方法に従って（１）で調製した抗原を用いて適当な動物を免疫することによって取得することができる。ポリクローナル抗体の場合は免疫動物の血清を次のスクリーニングに使用する。抗原に対する特異性や抗体の機能、あるいは抗体遺伝子を取得する観点から見れば、モノクローナル抗体の方が好適に用いられる。モノクローナル抗体の場合は、免疫動物の脾臓やリンパ節から調製した抗体産生細胞とミエローマ細胞とを細胞融合したハイブリドーマを次のスクリーニングに使用することができる。

　ヒト以外の動物を免疫して得られた抗体については、ヒトに投与する場合の免疫原性の軽減のために、動物由来の抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に接合した「ヒト化キメラ抗体」を作成することができる（特開平７－１９４３８４号公報）。また、可変部領域の抗原性をアミノ酸置換・ヒト化によりヒトの抗原性に変換し、リガンド結合性は損なうことなく免疫原性を低下させることもできる（特開平８－２８０３８７公報）。さらに、動物抗体（ドナー）由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）部分のみをヒト由来の抗体（アクセプター）に移植する方法（再構成）によってヒト化抗体を製造することができる。ＣＤＲのみならずフレームワーク部分の一部のアミノ酸を、ドナーのそれに合わせることによってより抗原性を低めつつ、元の抗体の反応性を維持したヒト化抗体を作成することもできる（特許２８２８３４０号公報、特開平１１－４６９４号公報、特開平１１－２４３９５５号公報）。

　さらにヒト抗体を生産するマウスやウシなどのトランスジェニック動物を（１）に記載のＭａｚＥやＭａｚＦタンパク質で免疫することによって、完全ヒトモノクローナル抗体を得ることもできる（特開平１０－１４６１９４号公報、特開平１０－１５５４９２号公報、特許２９３８５６９号公報、特開平１１－２０６３８７号公報、特表平８－５０９６１２号公報、特表平１１－５０５１０７号公報）。

　本発明のモノクローナル抗体は、上記のように免疫動物の抗体産生細胞から取得する方法の他に、抗体の遺伝子ライブラリーを作成して、そのライブラリーから抗体ディスプレイ技術を用いて抗原であるＭａｚＥやＭａｚＦに特異的な抗体を選抜する方法によって取得することもできる。
　抗体遺伝子ライブラリーとしては、
（ｉ）（１）で作成した免疫抗原を用いて免疫した動物やヒトの抗体産生細胞から抗体のＨ鎖及びＬ鎖の遺伝子を増幅し、Ｆａｂや単鎖抗体（ｓｃＦｖ）のフォーマットで発現するように作成した免疫ライブラリー、
（ｉｉ）非免疫動物、ヒトの末梢血リンパ球などから抗体のＨ鎖及びＬ鎖の遺伝子を増幅し、Ｆａｂや単鎖抗体（ｓｃＦｖ）のフォーマットで発現するように作成した非免疫（ナイーブ）ライブラリー、又は
（ｉｉｉ）動物やヒトの特定の抗体分子のＶ遺伝子の相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　Ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲ）を、適当な長さのランダムなアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチドで置換して作成した合成ライブラリー、
などを用いることができる。

　抗体ディスプレイ技術として最も一般的なものは、繊維状ファージ（例えばＭ１３ファージ）の外殻タンパク質（ｇ３ｐ）上に抗体をＦａｂやｓｃＦｖの形で提示するファージディスプレイ法である。ＦａｂあるいはｓｃＦｖを提示するファージディスプレイライブラリーは、［ファージディスプレイ　ア　ラボラトリー　マニュアル（Ｐｈａｇｅ　Ｄｉｓｐｌａｙ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（２００１）］に記載の方法に従って構築することができる。ファージディスプレイライブラリー以外に、酵母表層ディスプレイ法、リボソームディスプレイ法、又は動物細胞表面ディスプレイ法などで作製されたライブラリーを利用することもできる。

　得られた抗体を適当なプロテアーゼで消化することによって、抗原結合部位を含む低分子化抗体を作成することができる。プロテアーゼ限定消化による抗体の低分子化は古典的で良く知られた手法であって、例えば、ＩｇＧ１をペプシンで消化することによってＦ（ａｂ’）_２を、パパインで消化することによってＦａｂを調製することができる。これらの低分子化抗体の調製には、例えばピアス社製のＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ（登録商標）Ｆａｂ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｋｉｔなどを用いることができる。

（３）本発明に用いられる抗体のスクリーニング
　免疫動物血清中の抗体力価の測定やモノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングにおける抗体力価の測定は一般的にはＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、又はフローサイトメトリなどの方法を用いて行う事ができる。例えば、ＥＬＩＳＡ法で行う場合にプレートをコーティングする抗原には、免疫抗原をそのまま使用することもできるが、免疫抗原とは異なるＭａｚＦを用いることが好ましい。例えば、免疫抗原としてＨｉｓ－Ｔａｇ付きＭａｚＥもしくはＭａｚＦを用いた場合は、抗体力価測定用にはＨｉｓ－Ｔａｇを持たない精製（部分精製）ＭａｚＥもしくはＭａｚＦを用いるか、あるいは、Ｎ－末端Ｈｉｓ－Ｔａｇ付きＭａｚＥもしくはＭａｚＦを免疫抗原とした場合には、力価測定用にはＣ－末端Ｈｉｓ－Ｔａｇ付きＭａｚＥもしくはＭａｚＦを使用してＴａｇ配列そのもの、あるいはＴａｇ配列を含むＭａｚＥもしくはＭａｚＦの配列に反応する抗体を排除してＭａｚＥもしくはＭａｚＦに特異的に反応する抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。また、ＢＳＡなど目的抗原とは関係のないタンパク質に対する力価を測定して非特異的な抗体を排除することができる。モノクローナル抗体の場合は、ハイブリドーマのスクリーニングの過程で、抗体力価の高いクローンから低いクローンまで、さまざまなモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。

　また、得られたハイブリドーマのｍＲＮＡから適当なプライマーによって抗体分子をコードするｃＤＮＡの配列情報を得ることができる。例えばマウスのハイブリドーマであれば、選択した抗体を産生するハイブリドーマのトータルＲＮＡを鋳型として、既報の方法［Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ、第１７８巻、第２４１－２５１頁（１９９５）］を用いて、重鎖ＣＨ１及び軽鎖ＣＬ部分に設計されたプライマーと逆転写酵素を用いたファーストストランド合成、それに引き続きＰＣＲ反応を行う事によって抗体重鎖、軽鎖可変部位（ＶＨ、ＶＬ）をコードするＤＮＡをクローニングし、それらの塩基配列をＤＮＡシークエンサーを用いて決定することができる。このようにして、抗ＭａｚＥ抗体、あるいは抗ＭａｚＦ抗体の抗原結合部位を含む抗体断片をコードする遺伝子を得ることができる。得られた遺伝子の核酸配列を決定することによって、抗ＭａｚＥ抗体、あるいは抗ＭａｚＦ抗体の抗原結合部位を含む抗体断片のアミノ酸配列情報を得ることもできる。得られた抗原結合部位を含む抗体断片をコードする遺伝子の配列をもとにして、抗体可変領域をコードする遺伝子と抗体定常領域をコードする遺伝子と連結することによって完全抗体を発現する発現プラスミドを構築することができる。また、完全抗体以外にも、Ｆａｂ、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体の二量体（Ｄｉａｂｏｄｙ）、単鎖抗体の三量体（Ｔｒｉａｂｏｄｙ）又はミニボディー（Ｍｉｎｉｂｏｄｙ）などの抗原結合部位を含む低分子化抗体をコードするｃＤＮＡをデザインすることができ、これらの遺伝子を適切な宿主で発現させるためのプロモーターの下流に連結することによって抗原結合部位を含む低分子化抗体発現用プラスミドを構築することができる。これらの抗体断片発現プラスミドを大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などの適当な宿主で発現させることによって、上記の抗体や低分子化抗体を組換えタンパク質として得ることができる。

　ファージディスプレイのような抗体ディスプレイ技術を用いて抗体可変部位遺伝子を含むＦａｂや単鎖抗体（ｓｃＦｖ）ライブラリーからＭａｚＦに特異的な抗体を得るためには、バイオパニングと呼ばれる操作を行う。公知の方法、例えば［ファージディスプレイ　ア　ラボラトリー　マニュアル（Ｐｈａｇｅ　Ｄｉｓｐｌａｙ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（２００１）］に記載の方法に従って、Ｍ１３ファージ抗体ライブラリーからＭａｚＥもしくはＭａｚＦに結合するファージを選択する操作を行えばよい。基本操作としては、プラスティックプレートやチューブに固相化したＭａｚＥもしくはＭａｚＦにＭ１３ファージ抗体ライブラリーを接触させ、適当な緩衝液、例えば０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）などを用いて結合しない非特異的なファージを洗浄して除去した後に、結合ファージを酸性溶液、例えば０．１Ｍ　グリシン―塩酸（ｐＨ２．２）などを用いて溶出、中和して大腸菌に感染させて増殖させるという操作を数回繰り返すことによって目的抗原であるＭａｚＥあるいはＭａｚＦに特異的な抗体をディスプレイしているファージを濃縮する。ファージ内部には提示された抗体をコードする遺伝子を含むファージミドベクターがパッケージングされているため、このファージミドベクターの抗体遺伝子挿入部分の核酸塩基配列を決定することによって、選抜取得した抗体の遺伝子をクローニングし、その配列情報を決定することができる。固相に固定化する抗原（ＭａｚＥあるいはＭａｚＦ）の量、又は固定化方法などを変えることによってさまざまな親和性とエピトープ特異性を持った抗体Ｖ領域を選択することができる。

　上記のようにＭａｚＥあるいはＭａｚＦに特異的に結合する抗体として選択されたものの中から、ＭａｚＦのトキシンとしての活性、すなわち抗体あるいはその機能性断片の配列特異的リボヌクレアーゼ活性阻害能を測定することによって、ＭａｚＥ又はＭａｚＦに結合し、かつ、トキシンとしての活性を完全には阻害しない抗体をスクリーニングすることができる。さらに、ＭａｚＥとＭａｚＦの存在下、当該抗体を共存させて配列特異的リボヌクレアーゼ活性を測定することによって、トキシンであるＭａｚＦとアンチトキシンであるＭａｚＥの相互作用を阻害する抗体をスクリーニングすることができる。

　ＭａｚＥあるいはＭａｚＦに対する結合活性の強さと、ＭａｚＥ－ＭａｚＦのＴＡ複合体形成阻害活性の強さとは、必ずしも相関しない事を考慮すると、ＭａｚＥあるいはＭａｚＦに対する結合活性の強い抗体だけでなく、ＭａｚＥやＭａｚＦに対する結合活性がそれほど強くない抗体についてもＭａｚＦのトキシン活性に対する影響や、ＭａｚＥ－ＭａｚＦ相互作用に対する影響を測定することが望ましい。

　大腸菌ＭａｚＦのリボヌクレアーゼ活性は、例えば合成オリゴＲＮＡあるいはＤＮＡ－ＲＮＡキメラオリゴヌクレオチドを基質として、文献［モレキュラー　セル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｅｌｌ）、第１２巻、第９１３～９２３頁（２００３）、アナリティカル　バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第３７１巻、第１７３～１８３頁（２００７）］に記載された方法に従って測定する事ができる。また、ＭａｚＦによる切断位置の５’側にリボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ－ＲＮＡキメラオリゴヌクレオチドの５’末端を蛍光物質ＲＯＸで、３’末端を消光物質Ｅｃｌｉｐｓｅでそれぞれ標識した合成基質を使用してＭａｚＦのリボヌクレアーゼ活性を高感度に測定する方法が国際公開第２００７／１０９７８１号パンフレットに記載されている。さらに、ＭａｚＦの活性を無細胞タンパク質合成系を用いて測定する方法がモレキュラー　セル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｅｌｌ）、第１２巻、第９１３～９２３頁（２００３）に記載されている。

　これらの活性測定系に本発明の抗体を添加した際に、ＭａｚＦのリボヌクレアーゼ活性に影響を全く及ぼさないか、影響を及ぼすとしても５０％程度まで、好ましくは２０％程度までの阻害効果を示す抗体が本発明の抗体としては好ましい。

　上述のＭａｚＦのリボヌクレアーゼ活性測定系にＭａｚＥを共存させることによってＭａｚＦの活性は抑制される。ＭａｚＥとＭａｚＦの比率は特に限定はないが、１：１０から２：１のモル比の範囲でアッセイ系の感度によって適宜設定すれば良い。上記の論文によればＭａｚＥをＭａｚＦに対してほぼ等モル加えることによってＭａｚＦの無細胞タンパク質合成系での活性は抑制されている。合成オリゴＲＮＡを基質としてＭａｚＦのリボヌクレアーゼ活性を測定する系では、ＭａｚＥとＭａｚＦのモル比が約１：４の条件でＭａｚＦのリボヌクレアーゼ活性の阻害効果を確認することができる。このようなＭａｚＥ共存下でのＭａｚＦ活性測定系に本発明の抗体を加えることによって、本発明の抗体によるＭａｚＥ－ＭａｚＦ間相互作用の阻害効果を測定することができる。すなわち、ＭａｚＥによるＭａｚＦの活性阻害効果が確認できる条件下で本抗体を添加し、ＭａｚＥによるＭａｚＦ活性の阻害効果が抑制されるような抗体を選択することによって、本発明の抗体、すなわちＭａｚＥ又はＭａｚＦを特異的に認識して結合し、当該ＭａｚＦとＭａｚＥ間の相互作用を阻害する能力をもつ抗体を得ることができる。

　上記のようにＭａｚＦのリボヌクレアーゼ活性を利用したアッセイ系の他に、ＴＡ複合体（ＭａｚＥ－ＭａｚＦ複合体）の解離を直接観察する方法が国際公開第２００７／１０９７８１号パンフレットに記載されている。すなわち、トキシンあるいはアンチトキシンをＧＦＰのような蛍光蛋白質との融合タンパク質として発現、精製し、対応するアンチトキシンあるいはトキシンにＨｉｓ－Ｔａｇを付加して、蛍光蛋白質－トキシン／アンチトキシンとアンチトキシン／トキシン－Ｈｉｓ－Ｔａｇの複合体を形成させ、この複合体をニッケルアガロースビーズなどに固定化し、この固定化複合体に対してＴＡ複合体形成阻害剤を添加して、遊離する蛍光強度（蛍光蛋白質－トキシン／アンチトキシン）を測定するという方法である。この測定系に本発明の抗体を添加して、遊離してくる蛍光強度を測定することによって、本発明のＴＡ複合体を構成するトキシンに特異的に結合し、当該トキシンとアンチトキシンとの間の相互作用を阻害する能力をもつ抗体を選択することができる。

　ＭａｚＥ－ＭａｚＦ複合体形成阻害活性は、以下の方法によって測定することもできる。ＭａｚＥもしくはＭａｚＦを容器に固相化し、ＢＳＡやミルクカゼインなどでブロッキングした後、ＭａｚＥを固相化した場合はＴａｇ配列を付加したＭａｚＦを、ＭａｚＦを固相化した場合はＴａｇ配列を付加したＭａｚＥを加える。室温あるいは３７℃で適当な時間インキュベーションした後、容器を洗浄し、次いで容器表面に結合したＭａｚＥあるいはＭａｚＦをそれぞれに付加されたＴａｇ配列に対する抗体を用いて検出する。この目的のために、ＭａｚＦとＭａｚＥには精製用のＴａｇ配列（例えばＨｉｓ－Ｔａｇ配列）の他にそれぞれ異なるＴａｇ配列、例えばＭｙｃ－ｔａｇ配列やＨＡ－ｔａｇ配列などを付加しておくことが望ましい。ＭａｚＥやＭａｚＦとＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓとのキメラ型タンパク質を用いれば、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓに対する抗体を用いて検出することができる。ＭａｚＥあるいはＭａｚＦの固相化プレート上でＭａｚＥ－ＭａｚＦ相互作用のアッセイを行う系に本発明の抗体を添加してＭａｚＥ－ＭａｚＦ複合体形成阻害活性を測定する場合、一定量のＭａｚＥあるいはＭａｚＦと濃度を変化させた抗体を混合してＭａｚＦあるいはＭａｚＥ固相化プレートにそれぞれ添加し、固相上のＭａｚＥあるいはＭａｚＦに結合するＭａｚＦあるいはＭａｚＥを検出する事によって複合体形成阻害活性を測定する事ができる。逆に、濃度を変化させたＭａｚＥあるいはＭａｚＦと競合する抗体量を抗マウス標識抗体などで検出定量することによっても、本発明の治療剤に用いられる抗体のＭａｚＥ－ＭａｚＦ複合体形成阻害活性を測定する事ができる。

　本発明の別の態様では、得られた抗体又は当該抗体の抗原結合部位を含む断片をコードする遺伝子を、標的とする細菌内、つまり抗体又は当該抗体の抗原結合部位を含む断片が作用するＴＡ系を有する細菌内で発現させ、ＴＡ系複合体の形成を阻害することができる。前記抗体又は抗原結合部位を含むその断片の細菌内での発現のため、適切なプロモーターの制御下に前記の抗体又はその断片をコードする遺伝子を含有する適切なベクターを作製することができる。ベクターには特に限定はないが、プラスミドベクター、ウイルスベクター、又はファージベクター等を使用することができる。標的とする細菌内での前記遺伝子の発現は、前記のプロモーターに適した発現誘導因子又は遺伝子発現抑制因子などにより制御されていることが好ましい。

　以上に説明したＭａｚＥ／ＭａｚＦと同様に、他のＴＡ系のトキシン、アンチトキシンについても本発明に使用できる抗体を取得することができる。

（ＩＩ）本発明の感染症治療剤
　本発明の感染症治療剤は、（Ｉ）に記載したＴＡ系のトキシン又はアンチトキシンに結合し、当該ＴＡ系複合体形成を阻害する活性を有する抗体又は当該抗体の抗原結合部位を含む断片、もしくは当該抗体又は当該抗体の抗原結合部位を含む断片をコードする遺伝子を有効成分として含有する感染症治療剤である。本発明の感染症治療剤は、有効成分となる抗体又は当該抗体の抗原結合部位を含む断片が作用するＴＡ系を有する細菌に対し、増殖抑制又はプログラム細胞死誘導などを引き起こす。したがって、本発明の感染症治療剤は、細菌感染の治療において有用であり、場合により細菌の感染予防にも使用できる。

　細菌による感染症としては、例えば、（病原性）大腸菌、結核菌、黄色ブドウ球菌、リステリア（リステリア・モノサイトゲネス）菌、サルモネラ菌又は緑濃菌などによる感染症が挙げられ、特に本発明は多剤耐性菌に起因する感染症に有用である。本発明の感染症治療剤のターゲットとなるＭａｚＥ－ＭａｚＦ系と相同性を有するＴＡ系は大腸菌の他にも結核菌［Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　第２８１巻、第１８６３８～１８６４３頁（２００６）］、黄色ブドウ球菌［Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、第１８９巻、第８８７１～８８７９頁（２００７）］に存在することが知られている。また最近、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）の薬剤耐性遺伝子がのったプラスミド上に大腸菌のＭａｚＥ－ＭａｚＦ　ＴＡモジュールが存在していることが示されている［Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ＵＳＡ、第１０４巻、第３１１～３１６頁（２００７）］。従って本発明の感染症治療剤は大腸菌、結核菌、黄色ブドウ球菌、腸球菌ならびにこれらと同種の抗生物質耐性株の治療に有効である。

　本発明の感染症治療剤は、医薬製剤の製造法で一般的に用いられている公知の手段に従って、本発明の抗体又は当該抗体の抗原結合部位を含む断片を、そのまま、あるいは薬理学的に許容される担体と混合して、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、注射剤、坐剤又は徐放剤等の医薬製剤として安全に投与することができる。

　抗体又は当該抗体の抗原結合部位を含む断片の製剤中の含有量は、製剤全体の１～１００重量％であればよいが、１０～１００％が好ましく、５０～１００％がより好ましい。本発明の感染症治療剤は、投与対象、対象臓器、症状又は投与方法などにより異なり特に制限されないが、一般的に、患者（体重６０ｋｇとして）に対して、一日につき約５～２０００ｍｇ、好ましくは約１０～１０００ｍｇ、より好ましくは約２０～５００ｍｇ投与されることが望ましい。投与方法は適宜選択され、特に制限されないが、好ましくは静脈注射である。

　薬理学的に許容される担体としては、例えば固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤及び崩壊剤、あるいは液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤及び無痛化剤等が挙げられる。更に必要に応じ、通常の防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、吸着剤又は湿潤剤等の添加物を適宜、適量用いることもできる。

　本発明の抗体又は当該抗体の抗原結合部位を含む断片をコードする遺伝子を有効成分として含有する感染症治療剤は、前記遺伝子を含むネーキッド型、ベクター型等の核酸とし、任意の剤形とすることができる。ここで、ネーキッド型とは前記遺伝子の発現システムの他に核酸自体の自己複製機能や粒子（ファージ又はウイルス）への組み込み機能を有しない核酸を指す。ベクター型の感染症治療剤に使用できるベクターは、遺伝子の安定性、細菌への遺伝子導入効率により適宜選択すればよく、具体的にはプラスミドベクター、ウイルスベクター、又はファージベクターである。

　本発明の抗体又は当該抗体の抗原結合部位を含む断片をコードする遺伝子を有効成分とする細菌感染症治療剤に用いられるベクターとして、ファージベクター又はファージミドベクターが好適に用いられる。ファージはバクテリオファージとも呼ばれる細菌に感染するウイルスである。ファージベクターはファージゲノムを改良してベクター化したもので、１つのベクター内にファージの全ゲノムを含み、単独でファージを形成することが可能である。一方、ファージミドベクターはファージへのパッケージングシグナルを含んだプラスミドベクターであり、ファージミドベクターにはファージ構成タンパク質の一部のみがコードされているので、そのままではファージを形成することができない。ファージ粒子の形成には、その他のファージ粒子形成に必要なファージ構成タンパク質を供給するためのヘルパーファージが必要で、このヘルパーファージをファージミドベクターと重感染させることによって初めてファージ粒子を形成することができる。これらのファージベクターあるいはファージミドベクターに本発明の抗体又は当該抗体の抗原結合部位を含む断片をコードする遺伝子を挿入することによって、これらの治療用遺伝子を効率よく目的の細菌内に導入し、本発明の抗体又は当該抗体の抗原結合部位を含む断片を目的細菌内で発現させることができる。本発明で用いられるファージは特に限定されるものではないが、例えば大腸菌のλファージに代表される溶原性ファージやＴ４ファージやＴ７ファージ、Ｍ１３ファージなどの毒性ファージが挙げられる。また、大腸菌以外の細菌に感染するバクテリオファージとしては、例えばブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）に感染するＰｈａｇｅ　Ｋ［Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　１８６，２８６２－２８７１（２００４）］や結核菌に感染するＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅなどを含めて多数のバクテリオファージが報告されており、これらのファージあるいはファージミドベクターを標的の細菌に合わせて適宜用いることができる。

　本発明の抗体又は当該抗体の抗原結合部位を含む断片をコードする遺伝子を有効成分として含有する感染症治療剤は、細菌への遺伝子導入を促進する物質、又は医学的に許容される添加剤をさらに含んでもよい。細胞への遺伝子導入を促進する物質としてはカチオン性脂質、カチオン性ポリマー又は疎水性ポリマーがある。医学的に許容される添加剤としては生体親和性材料がある。前記遺伝子又はベクターは、生体親和性材料に担持されていてもよい。生体親和性材料は具体的にはコラーゲン、ゼラチン又はそれらの混合物である。

　以下に実施例により、さらに詳細に本発明を説明するが、本発明は実施例の範囲内に限定されるものではない。

参考例１　大腸菌ＭａｚＦ［ＭａｚＦ（Ｅ．ｃｏｌｉ）］発現プラスミドベクターの構築とＭａｚＦ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の発現、精製
　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉのＭａｚＦのアミノ酸配列（配列番号１）から国際公開第２００４／１１３４９８号パンフレットの記載に従って、ＭａｚＦ（Ｅ．ｃｏｌｉ）をコードする遺伝子配列からＡＣＡ配列を当該配列にコードされるアミノ酸残基を変化させることなく、他の塩基配列に置き換えたＤＮＡを構築した。なお、精製を簡便に行うためにＨｉｓ－Ｔａｇ配列をＭａｚＦ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＮ末端側に付加し、ＭａｚＦ（Ｅ．ｃｏｌｉ）をコードする遺伝子配列のコドンを大腸菌でのコドン使用頻度を考慮して最適化した。このＤＮＡを含むＤＮＡ断片を化学的に合成し、Ｔ７プロモーターからターミネーター間の遺伝子配列中のＡＣＡ配列を他の塩基配列に置き換えたｐＥＴ２１（ノバジェン社製）遺伝子発現用プラスミドベクターのＮｃｏＩ－ＨｉｎｄＩＩＩサイト間に挿入した組換えプラスミド、ｐＥＴＡＬＨＮＭａｚＦ２を作製した。

　このプラスミドにより大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。得られた形質転換体１コロニーを５ｍＬのＬＢ培地中で３７℃にて８時間振とう培養した後、８０ｍＬのＬＢ培地で拡大培養し、菌体からＱＩＡ　ｆｉｌｔｅｒ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍａｘｉ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてプラスミドｐＥＴＡＬＨＮＭａｚＦ２を精製した。得られたプラスミドｐＥＴＡＬＨＮＭａｚＦ２で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、得られた形質転換体を３ＬのＬＢ培地中でＪａｒ培養した。
　得られた菌体を４００ｍＭのＮａＣｌ及び１０ｍＭのイミダゾールを含むＰＢＳに懸濁後、超音波処理して無細胞抽出液を調製し、これよりＨｉｓ　Ｔｒａｐ　ＨＰ（ＧＥヘルスケア社製）を用いてＭａｚＦ（Ｅ．ｃｏｌｉ）を精製した。

参考例２　大腸菌ＭａｚＥ［ＭａｚＥ（Ｅ．ｃｏｌｉ）］発現プラスミドベクターの構築とＭａｚＥ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の発現、精製
　国際公開第２００４／１１３４９８号パンフレットの記載に従って、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉのＭａｚＥのアミノ酸配列（配列番号４）のＮ末端側にＨｉｓ－Ｔａｇ配列とＭｙｃ－Ｔａｇ配列を付加したタンパク質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡ断片を化学的に合成し、遺伝子発現用プラスミドベクター、ｐＥＴ２１ａ（ノバジェン社製）のＮｄｅＩサイト－ＥｃｏＲＩサイト間に挿入した組換えプラスミド、ｐＨｉｓＭｙｃＭａｚＥを作製した。

　このプラスミドにより大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。得られた形質転換体１コロニーを５ｍＬのＬＢ培地中で３７℃にて８時間振とう培養した後、８０ｍＬのＬＢ培地で拡大培養し、菌体からＱＩＡ　ｆｉｌｔｅｒ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍａｘｉ　Ｋｉｔを用いてプラスミドｐＨｉｓＭｙｃＭａｚＥを精製した。得られたプラスミドｐＨｉｓＭｙｃＭａｚＥで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、得られた形質転換体を３ＬのＬＢ培地中でＪａｒ培養した。ＯＤ６００ｎｍが０．５付近になった時点で終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加して発現を誘導し、引き続き４時間培養を続けた。得られた菌体を４００ｍＭのＮａＣｌ及び１０ｍＭのイミダゾールを含むＰＢＳに懸濁後、超音波処理して無細胞抽出液を調製し、これよりＨｉｓ　Ｔｒａｐ　ＨＰを用いてＭａｚＥ（Ｅ．ｃｏｌｉ）を精製した。

参考例３　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｏｖｉｓ　ＢＣＧのＭａｚＦ［ＭａｚＦ（ＢＣＧ）］ならびにＭａｚＥ［ＭａｚＥ（ＢＣＧ）］の発現、精製。
　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｏｖｉｓ　ＢＣＧのＭａｚＦ［ＭａｚＦ（ＢＣＧ）］ならびにＭａｚＥ［ＭａｚＥ（ＢＣＧ）］の発現プラスミドベクターの構築とタンパク質発現・精製は以下のようにして行った。国際公開第２００７／０１３２６５号パンフレット、ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒ、第２７４巻、第７３～８２頁（２００７）ならびにＴｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２８１巻、第１８６３８～１８６４３頁（２００７）の記載を参考にして、ＭａｚＦ（ＢＣＧ）をコードする遺伝子を含むＤＮＡ（配列番号７）を合成し、これを制限酵素Ｎｄｅ　Ｉ及びＸｈｏ　Ｉで消化した。このＤＮＡをｐＥＴ２１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）ベクターの制限酵素サイトＮｄｅ　Ｉ－Ｘｈｏ　Ｉ間にクローニングしたＭａｚＦ（ＢＣＧ）発現プラスミドベクター、ｐＥＴ－Ｍｂ２０１４ｃを構築した。また、ＭａｚＥ（ＢＣＧ）をコードする遺伝子を含むＤＮＡ（配列番号８）を合成し、これを制限酵素Ｎｄｅ　Ｉ及びＨｉｎｄ　ＩＩＩで消化した。このＤＮＡをｐＥＴ２１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）ベクターの制限酵素サイトＮｄｅ　Ｉ－Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ間にクローニングしたＭａｚＥ（ＢＣＧ）発現プラスミドベクター、ｐＨｉｓＭａｚＥｍｂを構築した。

　これら２種類のプラスミドベクターでそれぞれ大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、得られた形質転換体を３ＬのＬＢ培地中でＪａｒ培養した。ＯＤ６００ｎｍが０．５付近になった時点で終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加して発現を誘導し、引き続き２時間培養を続けた。得られた菌体を４００ｍＭのＮａＣｌ及び１０ｍＭのイミダゾールを含むＰＢＳに懸濁後、超音波処理して無細胞抽出液を調製し、これからＨｉｓ　Ｔｒａｐ　ＨＰを用いてＭａｚＦ（ＢＣＧ）とＭａｚＥ（ＢＣＧ）を精製した。
　なお、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓにはＭａｚＦ（ＢＣＧ）及びＭａｚＥ（ＢＣＧ）と同一のＴＡ系が存在する。

参考例４　Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓのＭａｚＦ［ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）］ならびにＭａｚＥ［ＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）］の発現、精製。
　Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓのＭａｚＦ［ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）］ならびにＭａｚＥ［ＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）］の発現プラスミドベクターの構築とタンパク質発現・精製は以下のようにして行った。Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、第１８９巻、第８８７１～８８７９頁（２００７）の記載を参考にして、ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）をコードする遺伝子を含むＤＮＡ（配列番号９）を合成し、これを制限酵素Ｎｄｅ　Ｉ及びＢａｍＨ　Ｉで消化した。このＤＮＡをｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）ベクターの制限酵素サイトＮｄｅ　Ｉ－ＢａｍＨ　Ｉ間にクローニングしたＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）発現プラスミドベクター、ｐＥＴ２８ｍａｚＦｓａを構築した。また、ＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）をコードする遺伝子を含むＤＮＡ（配列番号１０）を合成し、これを制限酵素Ｎｃｏ　Ｉ及びＢａｍＨ　Ｉで消化した。このＤＮＡをｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）ベクターの制限酵素サイトＮｃｏ　Ｉ－ＢａｍＨ　Ｉ間にクローニングしたＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）発現プラスミドベクター、ｐＨｉｓＰｒＳ２ＭａｚＥｓａを構築した。ｐＨｉｓＰｒＳ２ＭａｚＥｓａは、ＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＮ末端側にＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓのＰｒｏｔｅｉｎ　Ｓが２分子結合した形のキメラタンパク質の発現ベクターである。

　これら２種類のプラスミドベクターでそれぞれ大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、得られた形質転換体を３ＬのＬＢ培地中でＪａｒ培養した。ＯＤ６００ｎｍが０．５付近になった時点で終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加して発現を誘導し、引き続き４時間培養を続けた。得られた菌体を４００ｍＭのＮａＣｌ及び１０ｍＭのイミダゾールを含むＰＢＳに懸濁後、超音波処理して無細胞抽出液を調製し、これからＨｉｓ　Ｔｒａｐ　ＨＰを用いてＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）とＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を精製した。

実施例１　抗ＭａｚＦ抗体、抗ＭａｚＥ抗体の作製
　参考例１から参考例４で調製したＭａｚＦ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ＭａｚＥ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ＭａｚＦ（ＢＣＧ）、ＭａｚＥ（ＢＣＧ）、ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）とＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を１ｍｇ／ｍＬの抗原溶液とした。以下、本実施例１では、ＭａｚＦあるいはＭａｚＥの由来にかかわらず、単にＭａｚＥ、ＭａｚＦと記載することがある。これらの抗原溶液をそれぞれＢＡＬＢ／ｃマウス４匹に投与し、メソッズ　イン　エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第１８２巻（１９９０）及びモノクローナル　アンタイボディーズ：プリンシプル　アンド　プラクティス（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ）アカデミックプレス（１９９６）に記載の方法に従って、抗血清及びハイブリドーマを得た。この抗血清又はハイブリドーマ培養上清について、参考例１から参考例４で調製したＭａｚＦあるいはＭａｚＥを定法に従って固相化した９６－ウェル　マイクロプレートを用いてＥＬＩＳＡを行う事によってＭａｚＦあるいはＭａｚＥに特異的に結合する抗体を選択した。

　抗ＭａｚＦ抗体及び抗ＭａｚＥ抗体は、抗体遺伝子ライブラリーからスクリーニングすることによって得ることもできる。抗体遺伝子ライブラリーとしては、例えば健常人の末梢血リンパ球を材料として抗体可変部（ＶＨ、ＶＬ）から定常領域（ＣＨ１、ＣＬ）をコードする遺伝子を増幅して適当なベクターにクローニングすることによって作成することができる。抗体遺伝子ライブラリーや、ファージディスプレイライブラリーの作成方法については以下に挙げるラボマニュアルならびにそこに引用されている原著論文などを参考にして作成する事ができる。
［Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌｕｍｅ　２４８　”Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”、　Ｅｄｉｔｅｄ　ｂｙ　Ｂｅｎｎｙ　Ｋ．Ｃ．　Ｌｏ、　Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ（２００４）］
［”Ｐｈａｇｅ　Ｄｉｓｐｌａｙ，　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”、Ｅｄｉｔｅｄ　ｂｙ　Ｃａｒｌｏｓ　Ｆ．　Ｂａｒｂａｓ　ＩＩＩ，　Ｄｅｎｎｉｓ　Ｒ．　Ｂｕｒｔｏｎ，　Ｊａｍｉｅ　Ｋ．　Ｓｃｏｔｔ，　Ｇｒｅｇｇ　Ｊ．　Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（２００１）］

　このようにして、抗ＭａｚＦ（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗体２Ｃ７、２１Ｂ－８Ｈ、４０ー１０Ａ、２Ｈ１０、２Ｈ８、３Ｂ７、３Ｂ１１、抗ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗体７Ｂ－７Ｆ、８Ａー５Ｅ、抗ＭａｚＦ（ＢＣＧ）抗体２Ａ－７Ｇ、１１Ａ－５Ｄを取得し、以下の実施例に使用するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体のＦａｂ断片及びこれらをコードする遺伝子を適宜調製した。

　参考例１から参考例４で調製したＭａｚＦあるいはＭａｚＥを定法に従って固相化したプラスティックチューブを用いて上記の参考文献などを参考にしてバイオパニングを行うことによって、ＭａｚＦあるいはＭａｚＥに特異的に結合するＦａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、軽鎖、ＶＨ、ＶＬ、ならびにこれらの抗体断片をコードする遺伝子とその核酸配列情報を得ることができる。

実施例２　ＭａｚＦ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のリボヌクレアーゼ活性に対する抗体の影響
　ＭａｚＦ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のリボヌクレアーゼ活性は以下のようにして測定した。ＭａｚＦ（Ｅ．ｃｏｌｉ）７５ｎｇ及びＭａｚＥ（Ｅ．ｃｏｌｉ）を１５ｎｇ含むか又は含まない終濃度１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－塩酸バッファーｐＨ７．５を３７℃で１５分間プレインキュベーションした後に、基質であるオリゴヌクレオチドＭａｚＧ３０（配列番号１１）を１００ｐｍｏｌと抗体サンプルを添加して３７℃で３０分間反応させた。２５ｍＭ　ＥＤＴＡを含む９５％ホルムアルデヒドを等量加えて反応を停止させた。反応停止液を１５％アクリルアミドゲルを使用した電気泳動にて分析した。その結果、基質ＭａｚＧ３０とＭａｚＦだけを添加した場合、基質ＭａｚＧ３０は分解されて１４ｍｅｒ相当の位置にバンドが生じた。基質ＭａｚＧ３０にＭａｚＥ及びＭａｚＦを加えた場合は、基質ＭａｚＧ３０の分解が阻害され１４ｍｅｒ相当の位置のバンドが減少した。さらに、基質ＭａｚＧ３０にＭａｚＥ、ＭａｚＦ、及び実施例１で得られた抗ＭａｚＦ（Ｅ．ｃｏｌｉ）モノクローナル抗体のＦａｂ断片を添加した場合は、基質ＭａｚＧ３０は分解されて１４ｍｅｒ相当の位置にバンドが生じた。

実施例３　抗体によるＭａｚＥ－ＭａｚＦ相互作用阻害の高感度測定方法
　ＭａｚＦのリボヌクレアーゼ活性を高感度に測定するため、蛍光物質と消光物質で標識されたキメラオリゴヌクレオチドを用いた活性測定系を以下の文献を参考にして構築した。

国際公開第２００７／１０９７８１号パンフレット
Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３７１巻、第１７３～１８３頁（２００７）
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第６９巻、第５５９～５６９頁（２００８）
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ　ｏｎｌｉｎｅ　ａｈｅａｄ　ｏｆ　ｐｒｉｎｔ　ｏｎ　２７　Ｆｅｂｒｕａｒｙ　２００９

　このアッセイ系では、ＭａｚＦのリボヌクレアーゼ活性によって二重標識キメラオリゴヌクレオチドが切断される結果、蛍光物質と消光物質の距離が離れ蛍光が生じる。活性測定系にＭａｚＦとともにＭａｚＥが共存する場合は、ＭａｚＥ－ＭａｚＦ複合体が形成されるためにＭａｚＦのリボヌクレアーゼ活性は抑制され基質は分解されないが、反応系にＭａｚＥ－ＭａｚＦ相互作用を阻害する抗体が共存する場合は、ＭａｚＥ－ＭａｚＦ複合体の解離が起こり、ＭａｚＦのリボヌクレアーゼ活性が発揮される結果、基質が分解されて蛍光シグナルが観測される。
　ＭａｚＦのリボヌクレアーゼ活性測定用基質として、上記文献を参考にして表１に記載する蛍光標識キメラオリゴヌクレオチドを用いた。表１において、ｒＵはリボヌクレオチド（ウラシル）を表す。

実施例４　ＭａｚＥ－ＭａｚＦ相互作用に対する抗ＭａｚＦ（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗体の影響
　実施例３の方法を用いた抗ＭａｚＦ（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗体によるＭａｚＥ（Ｅ．ｃｏｌｉ）－ＭａｚＦ（Ｅ．ｃｏｌｉ）相互作用阻害活性の測定は以下のようにして行った。
　蛍光測定用マイクロプレートを用いて、１μＭのＭａｚＦ（Ｅ．ｃｏｌｉ）１０μＬと、抗体溶液２５μＬを混合して３７℃で１５分間反応させた後、１μＭのＭａｚＥ（Ｅ．ｃｏｌｉ）を５μＬ加えて４℃で６０分間反応させた。その後、基質溶液、１０μＬを加えて３７℃で９０分間反応させ、励起波長：４８５ｎｍ；蛍光波長：５３５ｎｍでの蛍光強度を蛍光プレートリーダー（ベルトールド社製）で測定した。基質溶液の組成は、３１２．５ｎＭの基質１、１６．７５Ｕ／ｍＬのＲＮａｓｅインヒビター（タカラバイオ社製）、２．５倍濃度のｃｏｍｐｌｅｔｅ，ＥＤＴＡ－ｆｒｅｅプロテアーゼインヒビターカクテル（ロッシュ社製）を含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－塩酸バッファーｐＨ７．５である。

　抗体溶液として、実施例１で作成した抗ＭａｚＦ（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗体２Ｃ７及び２Ｈ１０のＨ鎖Ｆｄフラグメント（ＶＨ－ＣＨ１）をＰＲＯＴＥＩＯＳ（商標）　Ｗｈｅａｔ　ｇｅｒｍ　ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｋｉｔ（東洋紡）を用いた無細胞系でタンパク質合成したものを使用した結果を図１に示す。コントロールとしては抗体ＦｄフラグメントのｍＲＮＡを加えずにタンパク質合成反応を行ったものを使用した。

　コントロール溶液を添加した場合、蛍光シグナルの増加は見られず、ＭａｚＦ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のリボヌクレアーゼ活性はＭａｚＥ（Ｅ．ｃｏｌｉ）によって抑制されたままであるのに対し、合成した２Ｃ７及び２Ｈ１０のＦｄフラグメントを添加した場合、ＭａｚＦ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のリボヌクレアーゼ活性によって基質が分解され反応時間とともに蛍光シグナルが増加した。

実施例５　ＭａｚＥ－ＭａｚＦ相互作用に対する抗ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗体の影響
　実施例３の方法を用いた抗体によるＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）－ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）相互作用阻害活性の測定は以下のようにして行った。
　蛍光測定用マイクロプレートを用いて、０．５μＭのＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）１０μＬと、抗体溶液２５μＬ（２５ｐｍｏｌ）を混合して３７℃で１５分間反応させた後、０．５μＭのＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を５μＬ加えて４℃で６０分間反応させた。その後、基質溶液、１０μＬを加えて３７℃で９０分間反応させ、励起波長：４８５ｎｍ；蛍光波長：５３５ｎｍでの蛍光強度を蛍光プレートリーダーで測定した。基質溶液の組成は３１２．５ｎＭの基質３、１６．７５Ｕ／ｍＬのＲＮａｓｅインヒビター及び２．５倍濃度のｃｏｍｐｌｅｔｅ，ＥＤＴＡ－ｆｒｅｅプロテアーゼインヒビターカクテルを含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－塩酸バッファーｐＨ７．５である。

　抗体溶液として、実施例１で作成したマウス抗ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）モノクローナル抗体である７Ｂ－７Ｆのマウス腹水からの精製抗体を使用した結果を図２に示す。コントロールとしては１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－塩酸バッファーｐＨ７．５を使用した。

　コントロール溶液を添加した場合、蛍光シグナルの増加は見られず、ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のリボヌクレアーゼ活性はＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）によって抑制されたままであるのに対し、モノクローナル抗体７Ｂ－７Ｆを添加した場合、ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のリボヌクレアーゼ活性によって基質が分解され反応時間とともに蛍光シグナルが増加した。

実施例６　ＭａｚＥ－ＭａｚＦ相互作用に対する抗ＭａｚＦ（ＢＣＧ）抗体の影響
　実施例３の方法を用いた抗体によるＭａｚＥ（ＢＣＧ）－ＭａｚＦ（ＢＣＧ）相互作用阻害活性の測定は以下のようにして行った。
　蛍光測定用マイクロプレートを用いて、４μＭのＭａｚＦ（ＢＣＧ）１０μＬと、抗体溶液２５μＬ（８０ｐｍｏｌ）を混合して３７℃で１５分間反応させた後、４μＭのＭａｚＥ（ＢＣＧ）を５μＬ加えて４℃で６０分間反応させた。その後、基質溶液、１０μＬを加えて３７℃で９０分間反応させ、励起波長：４８５ｎｍ；蛍光波長：５３５ｎｍでの蛍光強度を蛍光プレートリーダーで測定した。基質溶液の組成は３１２．５ｎＭの基質２、１６．７５Ｕ／ｍＬのＲＮａｓｅインヒビター及び２．５倍濃度のｃｏｍｐｌｅｔｅ，ＥＤＴＡ－ｆｒｅｅプロテアーゼインヒビターカクテルを含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－塩酸バッファーｐＨ７．５である。

　抗体溶液として、実施例１で作成したマウス抗ＭａｚＦ（ＢＣＧ）モノクローナル抗体である２Ａ－７Ｇ、１１Ａ－５Ｄのマウス腹水からの精製抗体を使用した結果を図３に示す。コントロールとしては１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－塩酸バッファーｐＨ７．５を使用した。

　コントロール溶液を添加した場合、蛍光シグナルの増加は見られず、ＭａｚＦ（ＢＣＧ）のリボヌクレアーゼ活性はＭａｚＥ（ＢＣＧ）によって抑制されたままであるのに対し、モノクローナル抗体２Ａ－７Ｇ又は１１Ａ－５Ｄを添加した場合、ＭａｚＦ（ＢＣＧ）のリボヌクレアーゼ活性によって基質が分解され反応時間とともに蛍光シグナルが増加した。

実施例７　ＭａｚＥ－ＭａｚＦ相互作用に対する抗ＭａｚＦ抗体の影響
　抗体によるＭａｚＥ－ＭａｚＦ相互作用阻害活性の測定は抗原固相化プレートを用いた競合アッセイ法でも行った。ヌンク社製９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに、大腸菌又は黄色ブドウ球菌のＭａｚＥ又はＭａｚＦをそれぞれ２μｇ／ｍＬの濃度で固相化した。固相化は４℃で１４時間行った。
　まず、固相化したＭａｚＦに相互作用するＭａｚＥに対して、抗ＭａｚＦ抗体の濃度を変化させて添加する競合アッセイを行った。ＭａｚＦ固相化プレートを０．１％のＴｗｅｅｎ２０（シグマ社製）及び１％のＢＳＡ（シグマ社製）を含むＰＢＳ溶液でブロッキングした。実施例１で作製した抗体とＭａｚＥの混合液をＭａｚＦ固相化プレートに添加し、さらに４℃、６０分間インキュベーションし、その後プレートを０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液で洗浄した。コントロールとして、抗体希釈液である０．１％のＴｗｅｅｎ２０及び１％のＢＳＡを含むＰＢＳ溶液を用いた。固相プレート上に結合しているＭａｚＥを検出するために、ＭａｚＥに付加したＭｙｃ－Ｔａｇ配列［ＭａｚＥ（Ｅ．ｃｏｌｉ）］又はＰｒｏｔｅｉｎＳ［ＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）］に対する抗体を用いた。ＨＲＰ標識抗Ｍｙｃ－Ｔａｇ配列抗体の反応は濃度２μｇ／ｍＬの抗体溶液を、ＨＲＰ標識抗ＰｒｏｔｅｉｎＳ抗体の反応は濃度０．２μｇ／ｍＬの抗体溶液を加えて室温、６０分間反応させた。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液で洗浄した後、基質である３，３’，５，５’－Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ、シグマ社製）を添加して発色させ、１Ｎの硫酸を等量加えて反応を停止させた。その後、４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。

　実施例１で作製した抗ＭａｚＦ（Ｅ．ｃｏｌｉ）モノクローナル抗体２１Ｂ－８Ｈ又は４０－１０ＡによるＭａｚＥ－ＭａｚＦ相互作用阻害の結果を図４に示す。抗体濃度を上げると、プレートに固相化したＭａｚＦに結合するＭａｚＥ量が減少した。一方コントロールではＭａｚＥ量に変化は無かった。
　実施例１で作成した抗ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）モノクローナル抗体７Ｂ－７Ｆ又は８Ａ－５ＥによるＭａｚＥ－ＭａｚＦ相互作用阻害の結果を図５に示す。抗体濃度に依存してプレートに固相化したＭａｚＦに結合するＭａｚＥ量が減少した。一方コントロールではＭａｚＥ量に変化は無かった。

　次に、ＭａｚＥ又はＭａｚＦの濃度を変化させて添加する競合アッセイを行った。抗ＭａｚＦ抗体の影響を評価する場合はＭａｚＦ固相化プレートを用い、抗ＭａｚＥ抗体の場合はＭａｚＥ固相化プレートを用いた。固相化プレートは０．１％のＴｗｅｅｎ２０及び１％のＢＳＡを含むＰＢＳ溶液でブロッキングしたが、ＭａｚＦ（Ｅ．ｃｏｌｉ）固相化プレートの場合だけは１％のＢＳＡを含むＰＢＳ溶液でブロッキングを行った。抗体とＭａｚＥ又はＭａｚＦの混合液を、ＭａｚＥ又はＭａｚＦ固相化プレートに添加し、さらに４℃、６０分間インキュベーションし、その後プレートを０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液で洗浄した。抗体の濃度を、抗ＭａｚＦ（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗体の場合は５０ｎｇ、抗ＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗体の場合は２５ｎｇ、抗ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗体の場合は２５ｎｇとした。固相プレート上に結合している抗体は、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体を添加して検出した。２次抗体の反応は室温、６０分間である。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液でプレートを洗浄した後、ＴＭＢを添加して発色させ、１Ｎの硫酸を等量加えて反応を停止させた。その後、４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。

　実施例１で作成した抗ＭａｚＦ（Ｅ．ｃｏｌｉ）モノクローナル抗体２１Ｂ－８Ｈ又は４０－１０ＡによるＭａｚＥ－ＭａｚＦ相互作用阻害の結果を図６に示す。ＭａｚＥ量を上げると、プレートに固相化したＭａｚＦに結合する抗ＭａｚＦ（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗体２１Ｂ－８Ｈと４０－１０Ａの量が添加したＭａｚＥ量に応じて減少した。
　実施例１で作成した抗ＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）モノクローナル抗体１４Ａ－８Ｇ又は１６Ｃ－３ＡによるＭａｚＥ－ＭａｚＦ相互作用阻害の結果を図７に示す。プレートに固相化したＭａｚＥに結合する抗ＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）モノクローナル抗体１４Ａ－８Ｇと１６Ｃ－３Ａが添加したＭａｚＦ量に依存して減少した。
　実施例１で作成した抗ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）モノクローナル抗体７Ｂ－７Ｆ又は８Ａ－５ＥによるＭａｚＥ－ＭａｚＦ相互作用阻害の結果を図８に示す。プレートに固相化したＭａｚＦに結合する抗ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）モノクローナル抗体７Ｂ－７Ｆと８Ａ－５Ｅが添加したＭａｚＥ量に依存して減少した。

実施例８　大腸菌の生育に対する抗ＭａｚＦ抗体の影響
　実施例１で作製した抗ＭａｚＦ（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗体２Ｃ７のＦａｂフラグメント、２Ｈ１０、２Ｈ８、３Ｂ７、３Ｂ１１のＨ鎖Ｆｄフラグメント（ＶＨ－ＣＨ１）をコードする遺伝子を、ファージミドベクターのＬａｃプロモーターの下流に作動可能になるように挿入し、発現用ファージミドベクターを作製した。この発現用ファージミドベクターとＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージを用いて治療用Ｍ１３ファージ（２Ｃ７、２Ｈ１０、２Ｈ８）とコントロール用Ｍ１３ファージ３Ｂ７、３Ｂ１１を作製した。作製したファージを感染させて大腸菌ＨＢ２１５１株を形質転換し、終濃度１ｍＭのＩＰＴＧ及び終濃度１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを添加してＦａｂフラグメント遺伝子、もしくは、Ｆｄフラグメント遺伝子の発現を誘導した。大腸菌の増殖曲線の結果を図９に示す。２Ｃ７のＦａｂフラグメント、又は、２Ｈ１０、２Ｈ８のＨ鎖Ｆｄフラグメントを発現させたサンプルにおいて、宿主大腸菌の生育が阻害された。一方、ＩＰＴＧを添加しない場合にはすべてのサンプルにおいて、宿主大腸菌の生育阻害は観察されなかった。

実施例９　抗ＭａｚＦ抗体遺伝子を用いたマウスの大腸菌感染症治療モデル
　実施例８で用いた治療用Ｍ１３ファージ（２Ｃ７、２Ｈ１０及び２Ｈ８）ならびにコントロール用Ｍ１３ファージ３Ｂ１１を作製した。マウスを用いた感染モデル実験は以下のように行った。大腸菌ＨＢ２１５１株を２ｍＬの２×ＹＴ培地で３７℃、一晩しんとう培養した。翌朝、培養液を新しい２×ＹＴ培地、１００ｍＬに１％植菌したものを、３７℃で１．５時間しんとう培養後集菌し、菌体に２×ＹＴを加えて５ｘ１０８　ｃｆｕ／ｍＬの菌濃度に調整した。この大腸菌希釈液０．２ｍＬ（１ｘ１０８　ｃｆｕ）を６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に投与した。その直後に、１２５ｍＭのＩＰＴＧを含む、５×１０８ｃｆｕ／ｍＬの治療用Ｍ１３ファージ液、又は、コントロールＭ１３ファージ液０．２ｍＬを大腸菌液を投与した側とは反対側の腹腔内に投与した。５時間後、７ｍＬのＰＢＳで腹腔内細胞を回収し、この腹腔液を２×ＹＴで希釈して１００μｇ／ｍＬのアンピシリン及び２％のグルコースを含む２×ＹＴ寒天プレート上に撒いて出てくるコロニーを計数して、生菌数を測定した。実験結果を図１０に示す。治療用Ｍ１３ファージ投与群では、コントロールＭ１３ファージ３Ｂ１１投与群に比べてマウス腹腔内の大腸菌数が減少していた。

　以上の結果から、細菌ＴＡ系のトキシンの活性を抑制することなく、トキシン又はアンチトキシンに特異的に結合し、かつトキシン―アンチトキシンの相互作用を阻害することにより、病原性細菌の増殖を抑制もしくは細菌を死滅させる効果を発揮する抗体又は当該抗体の抗原結合部位を含む断片及びそれらをコードする遺伝子が提供される。さらに、これらの抗体又は当該抗体の抗原結合部位を含む断片を有効成分として含有する感染症治療剤、これらの有効成分をコードする遺伝子を利用する感染症治療剤が提供され、現在深刻な問題となっている多剤耐性菌への治療方法が提供される。

SEQ ID NO:1: Amino acid sequence of E.coli MazF.
SEQ ID NO:2: Amino acid sequence of Mycobacterium tuberclosis MazF.
SEQ ID NO:3: Amino acid sequence of Staphylococcus aureus MazF (S.aureus).
SEQ ID NO:4: Amino acid sequence of E.coli MazE.
SEQ ID NO:5: Amino acid sequence of Mycobacterium tuberclosis MazE.
SEQ ID NO:6: Amino acid sequence of Staphylococcus aureus MazE (S.aureus).
SEQ ID NO:7: Nucleic acid sequence containing MazF(BCG).
SEQ ID NO:8: Nucleic acid sequence containing MazE(BCG).
SEQ ID NO:9: Nucleic acid sequence containing MazF (S.aureus).
SEQ ID NO:10: Nucleic acid sequence containing MazE (S.aureus).
SEQ ID NO:11: Synthetic oligonucleotide MazG30.
SEQ ID NO:12: Nucleic acid sequence of substrate-1.
SEQ ID NO:13: Nucleic acid sequence of substrate-2.
SEQ ID NO:14: Nucleic acid sequence of substrate-3.

Claims

　細菌トキシン－アンチトキシン系を構成するトキシン又はアンチトキシンに結合し、トキシン－アンチトキシン間相互作用を阻害する抗体、又はその遺伝子を有効成分として含有する細菌性感染症の予防又は治療剤。
　前記抗体がトキシン又はアンチトキシンに対するモノクローナル抗体である請求項１に記載の予防又は治療剤。
　前記抗体が大腸菌、結核菌、及びブドウ球菌からなる群より選択される細菌のトキシン又はアンチトキシンに対するモノクローナル抗体である請求項２に記載の予防又は治療剤。
　前記トキシン－アンチトキシン系が、配列特異的なエンドリボヌクレアーゼ活性を有するトキシンを含有するトキシン－アンチトキシ系である請求項１～３のいずれか１項に記載の予防又は治療剤。
　前記抗体が組換え型抗体である請求項１～４のいずれか１項に記載の予防又は治療剤。
　前記抗体がヒト化抗体又は完全ヒト抗体である請求項１～５のいずれか１項に記載の予防又は治療剤。
　細菌性感染症が、結核、ＭＲＳＡ感染症、及びＶＲＥ感染症からなる群より選択される感染症である、請求項１～６のいずれか１項に記載の予防又は治療剤。
　細菌トキシン－アンチトキシン系を構成するトキシン又はアンチトキシンに結合し、トキシン－アンチトキシン間相互作用を阻害する抗体を有効成分として含有する細菌性感染症における体重減少抑制剤。