JP2009520468A - 融合タンパク質ライブラリーの作製法およびスクリーニング法、ならびにそれらの使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、融合タンパク質のライブラリー、特に免疫毒素(immunotoxin)のライブラリーを作製する方法に関する。本発明は、ライブラリーそのもの、および癌細胞などの標的細胞に特異的な融合タンパク質のスクリーニングを行うためのライブラリーの使用にも関する。加えて本発明は、免疫毒素の親和性成熟の方法、および結果として得られる免疫毒素に関する。
所望のエフェクター機能を有するタンパク質に連結する、標的細胞に結合するタンパク質を含む融合タンパク質には多くの応用がある。エフェクタータンパク質が検出用試薬の場合は、そのような融合タンパク質は、標的細胞、または標的細胞で発現されるタンパク質に関連する条件の検出または診断に使用することができる。エフェクタータンパク質が治療用薬剤の場合は、そのような融合タンパク質は、治療用薬剤を標的細胞に輸送するために使用することができる。治療用の融合タンパク質の例は、癌細胞を死滅させることが可能なトキシンに連結する癌特異的なリガンドを含む免疫毒素を含む。
本発明者らは、融合タンパク質をコードする核酸配列を含む、新しい組換え細胞のライブラリー、融合タンパク質のライブラリー、ライブラリーの作製法、およびライブラリーの使用を開発した。融合タンパク質は、1)標的分子に結合可能なリガンドタンパク質、ならびに2)標的を検出可能な、標的に作用可能な、および/または標的分子を含む標的細胞を処理可能なエフェクター分子を含む。疾患の検出または治療に使用可能な融合タンパク質のライブラリーの作製は、有用な融合タンパク質のスクリーニングおよび選択を大きく促進する。特にスクリーニングは、融合タンパク質の個々の部分を個別に対象とするのではなく、融合タンパク質の全体を対象に実施可能である。
(a)個々のベクターが、融合タンパク質をコードし、かつ2)エフェクター分子をコードする核酸配列と、これに連結された1)標的分子に結合するリガンドタンパク質をコードする核酸配列とを含む、ベクターのライブラリーを構築する工程;および
(b)ベクターのライブラリーで宿主細胞を形質転換して、組換え細胞のライブラリーを作製する工程。
(a)個々のベクターが、融合タンパク質をコードし、かつ2)エフェクター分子をコードする核酸配列と、これに連結された1)標的分子に結合するリガンドタンパク質をコードする核酸配列とを含む、ベクターのライブラリーを構築する工程;
(b)ベクターのライブラリーで宿主細胞を形質転換して、組換え細胞のライブラリーを作製する工程;
(c)形質転換された宿主細胞をクローニングする工程;および
(d)融合タンパク質が宿主細胞によって発現される可溶性タンパク質である、融合タンパク質のライブラリーを発現させる工程。
(a)本発明の融合タンパク質のライブラリーを提供する工程;
(b)融合タンパク質に標的分子を接触させる工程;および
(c)標的分子に対する1つもしくは複数の融合タンパク質の結合を判定する工程。
(a)本発明の融合タンパク質のライブラリーを提供する工程;
(b)融合タンパク質に標的細胞を接触させる工程;および
(c)標的細胞に対する1つもしくは複数の融合タンパク質の細胞毒性を判定する工程。
(a)標的分子に結合可能なリガンドタンパク質をコードする核酸配列を提供する工程;
(b)少なくとも1つの点突然変異を、リガンドタンパク質をコードする核酸配列中に導入して、変種のリガンドタンパク質をコードする核酸配列のライブラリーを作製する工程;
(c)個々のベクターが、融合タンパク質をコードし、かつ2)エフェクター分子をコードする核酸配列と、これに連結された1)工程(b)で作製された変種のリガンドタンパク質の核酸配列の1つとを含む、ベクターのライブラリーを構築する工程;
(d)ベクターのライブラリーで宿主細胞を形質転換して、組換え細胞のライブラリーを作製する工程;
(e)形質転換された宿主細胞をクローニングする工程;
(f)融合タンパク質が宿主細胞によって発現される可溶性タンパク質である、融合タンパク質のライブラリーを発現させる工程;ならびに
(g)融合タンパク質のライブラリーを、非修飾型の融合タンパク質と比較した活性の改善に関してスクリーニングする工程であって、活性の改善が改良型の融合タンパク質を示す工程。
(a)抗体または免疫毒素の軽鎖可変領域および重鎖可変領域の核酸配列を提供する工程;
(b)少なくとも1つの点突然変異を、軽鎖可変領域および/または重鎖可変領域をコードする核酸配列中に導入して、変種の軽鎖可変領域および/または重鎖可変領域をコードする核酸配列のライブラリーを作製する工程;
(c)個々のベクターが、免疫毒素をコードし、かつ変種の軽鎖可変領域の核酸配列の1つ、および/または変種の重鎖の可変領域の核酸配列の1つを含み、変種の軽鎖可変領域の核酸配列および/または変種の重鎖可変領域の核酸配列が、細胞毒素をコードする核酸配列に操作可能に連結されている、ベクターのライブラリーを構築する工程;
(d)ベクターのライブラリーで宿主細胞を形質転換して、組換え細胞のライブラリーを作製する工程;
(e)形質転換された宿主細胞をクローニングする工程;
(f)免疫毒素が宿主細胞によって発現される可溶性タンパク質である、免疫毒素のライブラリーを発現させる工程;ならびに
(g)免疫毒素のライブラリーを、工程(a)の非修飾型の抗体もしくは免疫毒素と比較した、標的細胞に対する結合の改良および/または細胞毒性の改良に関してスクリーニングする工程であって、非修飾型の抗体もしくは免疫毒素と比較した、標的細胞に対する結合の改良および/または細胞毒性の改良が、免疫毒素の改良を示す工程。
(a)抗体または免疫毒素の軽鎖可変領域および重鎖可変領域の核酸配列を提供する工程;
(b)軽鎖可変領域中のホットスポットを同定する工程;
(c)少なくとも1つの点突然変異を、軽鎖可変領域をコードする核酸配列中のホットスポットに導入して、変種の軽鎖可変領域をコードする核酸配列のライブラリーを作製する工程;
(d)個々のベクターが、免疫毒素をコードし、かつ工程(c)で作製された変種の軽鎖可変領域の核酸配列の1つ、および/または(a)に由来する1つの重鎖可変領域の核酸配列を含み、変種の軽鎖可変領域の核酸配列もしくは重鎖可変領域の核酸配列が、細胞毒素をコードする核酸配列に操作可能に連結されている、ベクターのライブラリーを構築する工程;
(e)ベクターのライブラリーで宿主細胞を形質転換して、組換え細胞のライブラリーを作製する工程;
(f)形質転換された宿主細胞をクローニングする工程;
(g)免疫毒素が宿主細胞によって発現される可溶性タンパク質である、免疫毒素のライブラリーを発現させる工程;ならびに
(h)免疫毒素のライブラリーを、(a)の非修飾型の抗体もしくは免疫毒素と比較した標的細胞に対する結合の改良および/または細胞毒性の改良に関してスクリーニングする工程であって、非修飾型の抗体もしくは免疫毒素と比較した、標的細胞に対する結合の改良および/または細胞毒性の改良が、免疫毒素の改良を示す工程。
(a)抗体または免疫毒素の軽鎖可変領域および重鎖可変領域の核酸配列を提供する工程;
(b)重鎖可変領域中のホットスポットを同定する工程;
(c)少なくとも1つの点突然変異を、重鎖可変領域をコードする核酸配列中のホットスポットに導入して、変種の重鎖可変領域をコードする核酸配列のライブラリーを作製する工程;
(d)個々のベクターが、免疫毒素をコードし、かつ(c)で作製された変種の重鎖可変領域の核酸配列の1つ、および/または工程(a)に由来する1つの軽鎖可変領域の核酸配列を含み、変種の重鎖可変領域の核酸配列もしくは軽鎖可変領域の核酸配列が、細胞毒素をコードする核酸配列に操作可能に連結されている、ベクターのライブラリーを構築する工程;
(e)ベクターのライブラリーで宿主細胞を形質転換して、組換え細胞のライブラリーを作製する工程;
(f)形質転換された宿主細胞をクローニングする工程;
(g)免疫毒素が宿主細胞によって発現される可溶性タンパク質である、免疫毒素のライブラリーを発現させる工程;ならびに
(h)免疫毒素のライブラリーを、(a)の非修飾型の抗体もしくは免疫毒素と比較した標的細胞に対する結合の改良および/または細胞毒性の改良に関してスクリーニングする工程であって、非修飾型の抗体もしくは免疫毒素と比較した、標的細胞に対する結合の改良および/または細胞毒性の改良が、免疫毒素の改良を示す工程。
(a)抗体または免疫毒素の軽鎖可変領域および重鎖可変領域の核酸配列を提供する工程;
(b)少なくとも1つの点突然変異を、軽鎖可変領域をコードする核酸配列中に導入して、変種の軽鎖可変領域をコードする核酸配列のライブラリーを作製する工程;
(c)個々のベクターが、免疫毒素をコードし、かつ工程(b)で作製された変種の軽鎖可変領域の核酸配列の1つ、および/または工程(a)に由来する1つの重鎖可変領域の核酸配列を含み、変種の軽鎖可変領域の核酸配列もしくは重鎖可変領域の核酸配列が、細胞毒素をコードする核酸配列に操作可能に連結されている、ベクターのライブラリーを構築する工程;
(d)ベクターのライブラリーで宿主細胞を形質転換して、組換え細胞のライブラリーを作製する工程;
(e)形質転換された宿主細胞をクローニングする工程;
(f)免疫毒素が宿主細胞によって発現される可溶性タンパク質である、免疫毒素のライブラリーを発現させる工程;
(g)免疫毒素のライブラリーを、工程(a)の非修飾型の抗体もしくは免疫毒素と比較した標的細胞に対する結合および/または細胞毒性の改良に関してスクリーニングする工程であって、非修飾型の抗体もしくは免疫毒素と比較した、標的細胞に対する結合および/または細胞毒性の改良が、免疫毒素の改良を示す工程;
(h)少なくとも1つの点突然変異を、重鎖可変領域をコードする核酸配列中に導入して、変種の重鎖可変領域をコードする核酸配列のライブラリーを作製する工程;
(i)個々のベクターが、免疫毒素をコードし、かつ工程(h)で作製された変種の重鎖可変領域の核酸配列の1つ、および/または工程(h)で同定された改良型の免疫毒素の変種の軽鎖可変領域の核酸配列を含み、変種の重鎖可変領域の核酸配列もしくは変種の軽鎖可変領域の核酸配列が、細胞毒素をコードする核酸配列に操作可能に連結されている、ベクターのライブラリーを構築する工程;
(j)ベクターのライブラリーで宿主細胞を形質転換して、組換え細胞のライブラリーを作製する工程;
(k)形質転換された宿主細胞をクローニングする工程;
(l)免疫毒素が宿主細胞によって発現される可溶性タンパク質である、免疫毒素のライブラリーを発現させる工程;ならびに
(m)免疫毒素のライブラリーを、非修飾型の抗体もしくは免疫毒素と比較した、標的細胞に対する結合の改良および/または細胞毒性の改良に関してスクリーニングする工程であって、非修飾型の抗体もしくは免疫毒素と比較した、標的細胞に対する結合の改良および/または細胞毒性の改良が、免疫毒素の改良を示す工程。
(a)抗体または免疫毒素の軽鎖可変領域および重鎖可変領域の核酸配列を提供する工程;
(b)少なくとも1つの点突然変異を、重鎖可変領域をコードする核酸配列中に導入して、変種の重鎖可変領域をコードする核酸配列のライブラリーを作製する工程;
(c)個々のベクターが、免疫毒素をコードし、かつ工程(b)で作製された変種の重鎖可変領域の核酸配列の1つ、および/または工程(a)に由来する1つの軽鎖可変領域の核酸配列を含み、変種の重鎖可変領域の核酸配列もしくは軽鎖可変領域の核酸配列が、細胞毒素をコードする核酸配列に操作可能に連結されている、ベクターのライブラリーを構築する工程;
(d)ベクターのライブラリーで宿主細胞を形質転換して、組換え細胞のライブラリーを作製する工程;
(e)形質転換された宿主細胞をクローニングする工程;
(f)免疫毒素が宿主細胞によって発現される可溶性タンパク質である、免疫毒素のライブラリーを発現させる工程;
(g)免疫毒素のライブラリーを、工程(a)の非修飾型の抗体もしくは免疫毒素と比較した、標的細胞に対する結合の改良および/または細胞毒性の改良に関してスクリーニングする工程であって、非修飾型の抗体もしくは免疫毒素と比較した、標的細胞に対する結合の改良および/または細胞毒性の改良が、免疫毒素の改良を示す工程;
(h)少なくとも1つの点突然変異を、軽鎖可変領域をコードする核酸配列中に導入して、変種の軽鎖可変領域をコードする核酸配列のライブラリーを作製する工程;
(i)個々のベクターが、免疫毒素をコードし、かつ工程(h)で作製された変種の軽鎖可変領域の核酸配列の1つ、および/または工程(g)で同定された改良型の免疫毒素の変種の重鎖可変領域の核酸配列を含み、変種の軽鎖可変領域の核酸配列もしくは変種の重鎖可変領域の核酸配列が、細胞毒素をコードする核酸配列に操作可能に連結されている、ベクターのライブラリーを構築する工程;
(j)ベクターのライブラリーで宿主細胞を形質転換して、組換え細胞のライブラリーを作製する工程;
(k)形質転換された宿主細胞をクローニングする工程;
(l)免疫毒素が宿主細胞によって発現される可溶性タンパク質である、免疫毒素のライブラリーを発現させる工程;ならびに
(m)免疫毒素のライブラリーを、非修飾型の抗体もしくは免疫毒素と比較した、標的細胞に対する結合の改良および/または細胞毒性の改良に関してスクリーニングする工程であって、非修飾型の抗体もしくは免疫毒素と比較した、標的細胞に対する結合の改良および/または標的細胞に対する細胞毒性の改良が、免疫毒素の改良を示す工程。
(a)抗体または免疫毒素の軽鎖可変領域および重鎖可変領域の核酸配列を提供する工程;
(b)軽鎖可変領域中のホットスポットを同定する工程;
(c)少なくとも1つの点突然変異を、軽鎖可変領域をコードする核酸配列中のホットスポットに導入して、変種の軽鎖可変領域をコードする核酸配列のライブラリーを作製する工程;
(d)個々のベクターが、免疫毒素をコードし、かつ工程(c)で作製された変種の軽鎖可変領域の核酸配列の1つ、および/または工程(a)に由来する1つの重鎖可変領域の核酸配列を含み、変種の軽鎖可変領域の核酸配列もしくは重鎖可変領域の核酸配列が、細胞毒素をコードする核酸配列に操作可能に連結されている、ベクターのライブラリーを構築する工程;
(e)ベクターのライブラリーで宿主細胞を形質転換して、組換え細胞のライブラリーを作製する工程;
(f)形質転換された宿主細胞をクローニングする工程;
(g)免疫毒素が宿主細胞によって発現される可溶性タンパク質である、免疫毒素のライブラリーを発現させる工程;
(h)免疫毒素のライブラリーを、工程(a)の非修飾型の抗体もしくは免疫毒素と比較した、標的細胞に対する結合および/または細胞毒性の改良に関してスクリーニングする工程であって、非修飾型の抗体もしくは免疫毒素と比較した、標的細胞に対する結合および/または細胞毒性の改良が、免疫毒素の改良を示す工程;
(i)重鎖可変領域中のホットスポットを同定する工程;
(j)少なくとも1つの点突然変異を、重鎖可変領域をコードする核酸配列中のホットスポットに導入して、変種の重鎖可変領域をコードする核酸配列のライブラリーを作製する工程;
(k)個々のベクターが、免疫毒素をコードし、かつ工程(j)で作製された変種の重鎖可変領域の核酸配列の1つ、および/または工程(h)で同定された改良型の免疫毒素の変種の軽鎖可変領域の核酸配列を含み、変種の重鎖可変領域の核酸配列もしくは変種の軽鎖可変領域の核酸配列が、細胞毒素をコードする核酸配列に操作可能に連結されている、ベクターのライブラリーを構築する工程;
(l)ベクターのライブラリーで宿主細胞を形質転換して、組換え細胞のライブラリーを作製する工程;
(m)形質転換された宿主細胞をクローニングする工程;
(n)免疫毒素が宿主細胞によって発現される可溶性タンパク質である、免疫毒素のライブラリーを発現させる工程;ならびに
(o)免疫毒素のライブラリーを、非修飾型の抗体もしくは免疫毒素と比較した、標的細胞に対する結合の改良および/または細胞毒性の改良に関してスクリーニングする工程であって、非修飾型の抗体もしくは免疫毒素と比較した、標的細胞に対する結合の改良および/または細胞毒性の改良が、免疫毒素の改良を示す工程。
(a)抗体または免疫毒素の軽鎖可変領域および重鎖可変領域の核酸配列を提供する工程;
(b)重鎖可変領域中のホットスポットを同定する工程;
(c)少なくとも1つの点突然変異を、重鎖可変領域をコードする核酸配列中のホットスポットに導入して、変種の重鎖可変領域をコードする核酸配列のライブラリーを作製する工程;
(d)個々のベクターが、免疫毒素をコードし、かつ工程(c)で作製された変種の重鎖可変領域の核酸配列の1つ、および/または工程(a)に由来する1つの軽鎖可変領域の核酸配列を含み、変種の重鎖可変領域の核酸配列もしくは軽鎖可変領域の核酸配列が、細胞毒素をコードする核酸配列に操作可能に連結されている、ベクターのライブラリーを構築する工程;
(e)ベクターのライブラリーで宿主細胞を形質転換して、組換え細胞のライブラリーを作製する工程;
(f)形質転換された宿主細胞をクローニングする工程;
(g)免疫毒素が宿主細胞によって発現される可溶性タンパク質である、免疫毒素のライブラリーを発現させる工程;
(h)免疫毒素のライブラリーを、工程(a)の非修飾型の抗体もしくは免疫毒素と比較した、標的細胞に対する結合の改良および/または細胞毒性の改良に関してスクリーニングする工程であって、非修飾型の抗体もしくは免疫毒素と比較した、標的細胞に対する結合の改良および/または細胞毒性の改良が、免疫毒素の改良を示す工程;
(i)軽鎖可変領域中のホットスポットを同定する工程;
(j)少なくとも1つの点突然変異を、軽鎖可変領域をコードする核酸配列中のホットスポットに導入して、変種の軽鎖可変領域をコードする核酸配列のライブラリーを作製する工程;
(k)個々のベクターが、免疫毒素をコードし、かつ工程(j)で作製された変種の軽鎖可変領域の核酸配列の1つ、および/または工程(h)で同定された改良型の免疫毒素の変種の重鎖可変領域の核酸配列を含み、変種の軽鎖可変領域の核酸配列または変種の重鎖可変領域の核酸配列が、細胞毒素をコードする核酸配列に操作可能に連結されている、ベクターのライブラリーを構築する工程;
(l)ベクターのライブラリーで宿主細胞を形質転換して、組換え細胞のライブラリーを作製する工程;
(m)形質転換された宿主細胞をクローニングする工程;
(n)免疫毒素が宿主細胞によって発現される可溶性タンパク質である、免疫毒素のライブラリーを発現させる工程;ならびに
(o)免疫毒素のライブラリーを、非修飾型の抗体もしくは免疫毒素と比較した、標的細胞に対する結合の改良および/または細胞毒性の改良に関してスクリーニングする工程であって、非修飾型の抗体もしくは免疫毒素と比較した、標的細胞に対する結合の改良および/または標的細胞に対する細胞毒性の改良が、免疫毒素の改良を示す工程。
(A)定義
「アミノ酸」という用語は、天然のアミノ酸ならびに修飾型アミノ酸の全てを含む。
前述したように、融合タンパク質を発現する細胞のライブラリーを作製することは、治療または診断に有用な融合タンパク質のスクリーニングを迅速化するために有益である。本発明のいくつかの利点は、以下を含むが、これらに限定されない:
1.融合タンパク質の作製前に、最初にリガンドのスクリーニングを行う工程を避けられるために、リガンドタンパク質ではなく融合タンパク質のスクリーニングが有効なこと;
2.抗体などのリガンドタンパク質の選択が改良され、結合および内部移行性が融合タンパク質フォーマットで損なわれないこと;
3.エフェクター分子が精製されていなくとも有効なために、未精製上清のスクリーニングが可能なこと;
4.標的細胞上の未知の抗原と結合する融合タンパク質の選択が可能なこと。このような場合、エフェクター分子はトキシンの場合があり、およびスクリーニングのパラメータは細胞死の場合がある。
(a)個々のベクターが、融合タンパク質をコードし、かつ2)エフェクター分子をコードする核酸配列と、これに連結された1)標的分子に結合するリガンドタンパク質をコードする核酸配列とを含む、ベクターのライブラリーを構築する工程;ならびに
(b)ベクターのライブラリーで宿主細胞を形質転換して、組換え細胞のライブラリーを作製する工程。
(a)個々のベクターが、免疫毒素をコードし、かつ核酸配列のライブラリーに由来する1つの軽鎖可変領域の核酸配列および/または1つの重鎖可変領域の核酸配列を含み、軽鎖可変領域の核酸配列または重鎖可変領域の核酸配列が、細胞毒素をコードする核酸配列に操作可能に連結されている、ベクターのライブラリーを構築する工程;ならびに
(b)ベクターのライブラリーで宿主細胞を形質転換して、組換え細胞のライブラリーを作製する工程。
(a)本発明の融合タンパク質のライブラリーを提供する工程;
(b)融合タンパク質に標的分子を接触させる工程;ならびに
(c)標的分子に対する1つもしくは複数の融合タンパク質の結合を判定する工程。
(a)本発明の融合タンパク質のライブラリーを提供する工程;
(b)融合タンパク質に標的細胞を接触させる工程;および
(c)標的細胞に対する1つもしくは複数の融合タンパク質の細胞毒性を判定する工程。
本発明の別の局面は、融合タンパク質を改良する方法である。本発明者らは、親和性成熟を利用して、本発明のライブラリーを使用して免疫毒素の結合および/または細胞毒性を改良する新たな方法を開発した。本発明の方法は、融合タンパク質である免疫毒素の結合領域をコードするヌクレオチド配列に変異を導入する工程を含む。
(a)標的分子に結合するリガンドをコードする核酸配列を提供する工程;
(b)少なくとも1つの点突然変異を、リガンドをコードする核酸配列中に導入して、変種のリガンドタンパク質をコードする核酸配列のライブラリーを作製する工程;
(c)個々のベクターが、融合タンパク質をコードし、かつ工程(b)で作製された変種のリガンドの核酸配列の1つと、これに連結されたエフェクター分子をコードする核酸配列を含む、ベクターのライブラリーを構築する工程;
(d)ベクターのライブラリーで宿主細胞を形質転換して、組換え細胞のライブラリーを作製する工程;
(e)形質転換された宿主細胞をクローニングする工程;
(f)融合タンパク質が宿主細胞によって発現される可溶性タンパク質である、融合タンパク質のライブラリーを発現させる工程;ならびに
(g)融合タンパク質のライブラリーを、非修飾型の融合タンパク質と比較した、活性の改善に関してスクリーニングする工程であって、非修飾型の融合タンパク質と比較時の活性の改善が、融合タンパク質の改良を示する工程。
(a)抗体または免疫毒素の軽鎖可変領域および重鎖可変領域の核酸配列を提供する工程;
(b)少なくとも1つの点突然変異を、軽鎖可変領域をコードする核酸配列中に導入して、変種の軽鎖可変領域をコードする核酸配列のライブラリーを作製する工程;
(c)個々のベクターが、免疫毒素をコードし、かつ工程(b)で作製された変種の軽鎖可変領域の核酸配列の1つ、および/または工程(a)に由来する1つの重鎖可変領域の核酸配列を含み、変種の軽鎖可変領域の核酸配列もしくは重鎖可変領域の核酸配列が、細胞毒素をコードする核酸配列に操作可能に連結されている、ベクターのライブラリーを構築する工程;
(d)ベクターのライブラリーで宿主細胞を形質転換して、組換え細胞のライブラリーを作製する工程;
(e)形質転換された宿主細胞をクローニングする工程;
(f)免疫毒素が宿主細胞によって発現される可溶性タンパク質である、免疫毒素のライブラリーを発現させる工程;ならびに
(g)免疫毒素のライブラリーを、工程(a)の非修飾型の抗体もしくは免疫毒素と比較した、標的細胞に対する結合の改良および/または細胞毒性の改良に関してスクリーニングする工程であって、非修飾型の抗体もしくは免疫毒素と比較した、標的細胞に対する結合の改良および/または細胞毒性の改良が、免疫毒素の改良を示す工程。
(a)抗体または免疫毒素の軽鎖可変領域および重鎖可変領域の核酸配列を提供する工程;
(b)軽鎖可変領域中のホットスポットを同定する工程;
(c)少なくとも1つの点突然変異を、軽鎖可変領域をコードする核酸配列中のホットスポットに導入して、変種の軽鎖可変領域をコードする核酸配列のライブラリーを作製する工程;
(d)個々のベクターが、免疫毒素をコードし、かつ工程(c)で作製された変種の軽鎖可変領域の核酸配列の1つ、および/または工程(a)に由来する1つの重鎖可変領域の核酸配列を含み、変種の軽鎖可変領域の核酸配列もしくは重鎖可変領域の核酸配列が、細胞毒素をコードする核酸配列に操作可能に連結されている、ベクターのライブラリーを構築する工程;
(e)ベクターのライブラリーで宿主細胞を形質転換して、組換え細胞のライブラリーを作製する工程;
(f)形質転換された宿主細胞をクローニングする工程;
(g)免疫毒素が宿主細胞によって発現される可溶性タンパク質である、免疫毒素のライブラリーを発現させる工程;ならびに
(h)免疫毒素のライブラリーを、工程(a)の非修飾型の抗体もしくは免疫毒素と比較した、標的細胞に対する結合の改良および/または細胞毒性の改良に関してスクリーニングする工程であって、非修飾型の抗体もしくは免疫毒素と比較した、標的細胞に対する結合の改良および/または細胞毒性の改良が、免疫毒素の改良を示す工程。
(a)抗体または免疫毒素の軽鎖可変領域および重鎖可変領域の核酸配列を提供する工程;
(b)少なくとも1つの点突然変異を、重鎖可変領域をコードする核酸配列中に導入して、変種の重鎖可変領域をコードする核酸配列のライブラリーを作製する工程;
(c)個々のベクターが、免疫毒素をコードし、かつ工程(b)で作製された変種の重鎖可変領域の核酸配列の1つ、および/または工程(a)に由来する1つの軽鎖可変領域の核酸配列を含み、変種の重鎖可変領域の核酸配列もしくは軽鎖可変領域の核酸配列が、細胞毒素をコードする核酸配列に操作可能に連結されている、ベクターのライブラリーを構築する工程;
(d)ベクターのライブラリーで宿主細胞を形質転換して、組換え細胞のライブラリーを作製する工程;
(e)形質転換された宿主細胞をクローニングする工程;
(f)免疫毒素が宿主細胞によって発現される可溶性タンパク質である、免疫毒素のライブラリーを発現させる工程;ならびに
(g)免疫毒素のライブラリーを、工程(a)の非修飾型の抗体もしくは免疫毒素と比較した、標的細胞に対する結合の改良および/または細胞毒性の改良に関してスクリーニングする工程であって、非修飾型の抗体もしくは免疫毒素と比較した、標的細胞に対する結合の改良および/または細胞毒性の改良が、免疫毒素の改良を示す工程。
(a)抗体または免疫毒素の軽鎖可変領域および重鎖可変領域の核酸配列を提供する工程;
(b)重鎖可変領域中のホットスポットを同定する工程;
(c)少なくとも1つの点突然変異を、重鎖可変領域をコードする核酸配列中のホットスポットに導入して、変種の重鎖可変領域をコードする核酸配列のライブラリーを作製する工程;
(d)個々のベクターが、免疫毒素をコードし、かつ(c)で作製された変種の重鎖可変領域の核酸配列の1つ、および/または工程(a)に由来する1つの軽鎖可変領域の核酸配列を含み、変種の重鎖可変領域の核酸配列もしくは軽鎖可変領域の核酸配列が、細胞毒素をコードする核酸配列に操作可能に連結されている、ベクターのライブラリーを構築する工程;
(e)ベクターのライブラリーで宿主細胞を形質転換して、組換え細胞のライブラリーを作製する工程;
(f)形質転換された宿主細胞をクローニングする工程;
(g)免疫毒素が宿主細胞によって発現される可溶性タンパク質である、免疫毒素のライブラリーを発現させる工程;ならびに
(h)免疫毒素のライブラリーを、工程(a)の非修飾型の抗体もしくは免疫毒素と比較した、標的細胞に対する結合の改良および/または細胞毒性の改良に関してスクリーニングする工程であって、非修飾型の抗体もしくは免疫毒素と比較した、標的細胞に対する結合の改良および/または細胞毒性の改良が、免疫毒素の改良を示す工程。
(a)抗体または免疫毒素の軽鎖可変領域および重鎖可変領域の核酸配列を提供する工程;
(b)少なくとも1つの点突然変異を、軽鎖可変領域をコードする核酸配列中に導入して、変種の軽鎖可変領域をコードする核酸配列のライブラリーを作製する工程;
(c)個々のベクターが、免疫毒素をコードし、かつ工程(b)で作製された変種の軽鎖可変領域の核酸配列の1つ、および/または工程(a)に由来する1つの重鎖可変領域の核酸配列を含み、変種の軽鎖可変領域の核酸配列もしくは重鎖可変領域の核酸配列が、細胞毒素をコードする核酸配列に操作可能に連結されている、ベクターのライブラリーを構築する工程;
(d)ベクターのライブラリーで宿主細胞を形質転換して、組換え細胞のライブラリーを作製する工程;
(e)形質転換された宿主細胞をクローニングする工程;
(f)免疫毒素が宿主細胞によって発現される可溶性タンパク質である、免疫毒素のライブラリーを発現させる工程;
(g)免疫毒素のライブラリーを、工程(a)の非修飾型の抗体もしくは免疫毒素と比較した、標的細胞に対する結合および/または細胞毒性の改良に関してスクリーニングする工程であって、非修飾型の抗体もしくは免疫毒素と比較した、標的細胞に対する結合および/または細胞毒性の改良が、免疫毒素の改良を示す工程;
(h)少なくとも1つの点突然変異を、重鎖可変領域をコードする核酸配列中に導入して、変種の重鎖可変領域をコードする核酸配列のライブラリーを作製する工程;
(i)個々のベクターが、免疫毒素をコードし、かつ工程(h)で作製された変種の重鎖可変領域の核酸配列の1つ、および/または工程(g)で同定された改良型の免疫毒素の変種の軽鎖可変領域の核酸配列を含み、変種の重鎖可変領域の核酸配列もしくは変種の軽鎖可変領域の核酸配列が、細胞毒素をコードする核酸配列に操作可能に連結されている、ベクターのライブラリーを構築する工程;
(j)ベクターのライブラリーで宿主細胞を形質転換して、組換え細胞のライブラリーを作製する工程;
(k)形質転換された宿主細胞をクローニングする工程;
(l)免疫毒素が宿主細胞によって発現される可溶性タンパク質である、免疫毒素のライブラリーを発現させる工程;ならびに
(m)免疫毒素のライブラリーを、非修飾型の抗体もしくは免疫毒素と比較した、標的細胞に対する結合の改良および/または細胞毒性の改良に関してスクリーニングする工程であって、非修飾型の抗体もしくは免疫毒素と比較した、標的細胞に対する結合の改良および/または細胞毒性の改良が、免疫毒素の改良を示す工程。
(a)抗体または免疫毒素の軽鎖可変領域および重鎖可変領域の核酸配列を提供する工程;
(b)少なくとも1つの点突然変異を、重鎖可変領域をコードする核酸配列中に導入して、変種の重鎖可変領域をコードする核酸配列のライブラリーを作製する工程;
(c)個々のベクターが、免疫毒素をコードし、かつ工程(b)で作製された変種の重鎖可変領域の核酸配列の1つ、および/または工程(a)に由来する1つの軽鎖可変領域の核酸配列を含み、変種の重鎖可変領域の核酸配列もしくは軽鎖可変領域の核酸配列が、細胞毒素をコードする核酸配列に操作可能に連結されている、ベクターのライブラリーを構築する工程;
(d)ベクターのライブラリーで宿主細胞を形質転換して、組換え細胞のライブラリーを作製する工程;
(e)形質転換された宿主細胞をクローニングする工程;
(f)免疫毒素が宿主細胞によって発現される可溶性タンパク質である、免疫毒素のライブラリーを発現させる工程;
(g)免疫毒素のライブラリーを、工程(a)の非修飾型の抗体もしくは免疫毒素と比較した、標的細胞に対する結合の改良および/または細胞毒性の改良に関してスクリーニングする工程であって、非修飾型の抗体もしくは免疫毒素と比較した、標的細胞に対する結合の改良および/または細胞毒性の改良が、免疫毒素の改良を示す工程;
(h)少なくとも1つの点突然変異を、軽鎖可変領域をコードする核酸配列中に導入して、変種の軽鎖可変領域をコードする核酸配列のライブラリーを作製する工程;
(i)個々のベクターが、免疫毒素をコードし、かつ工程(h)で作製された変種の軽鎖可変領域の核酸配列の1つ、および/または工程(g)で同定された改良型の免疫毒素の変種の重鎖可変領域の核酸配列を含み、変種の軽鎖可変領域の核酸配列もしくは変種の重鎖可変領域の核酸配列が、細胞毒素をコードする核酸配列に操作可能に連結されている、ベクターのライブラリーを構築する工程;
(j)ベクターのライブラリーで宿主細胞を形質転換して、組換え細胞のライブラリーを作製する工程;
(k)形質転換された宿主細胞をクローニングする工程;
(l)免疫毒素が宿主細胞によって発現される可溶性タンパク質である、免疫毒素のライブラリーを発現させる工程;ならびに
(m)免疫毒素のライブラリーを、非修飾型の抗体もしくは免疫毒素と比較した、標的細胞に対する結合の改良および/または細胞毒性の改良に関してスクリーニングする工程であって、非修飾型の抗体もしくは免疫毒素と比較した、標的細胞に対する結合の改良および/または標的細胞に対する細胞毒性の改良が、免疫毒素の改良を示す工程。
(a)抗体または免疫毒素の軽鎖可変領域および重鎖可変領域の核酸配列を提供する工程;
(b)軽鎖可変領域中のホットスポットを同定する工程;
(c)少なくとも1つの点突然変異を、軽鎖可変領域をコードする核酸配列中のホットスポットに導入して、変種の軽鎖可変領域をコードする核酸配列のライブラリーを作製する工程;
(d)個々のベクターが、免疫毒素をコードし、かつ工程(c)で作製された変種の軽鎖可変領域の核酸配列の1つ、および/または工程(a)に由来する1つの重鎖可変領域の核酸配列を含み、変種の軽鎖可変領域の核酸配列もしくは重鎖可変領域の核酸配列が、細胞毒素をコードする核酸配列に操作可能に連結されている、ベクターのライブラリーを構築する工程;
(e)ベクターのライブラリーで宿主細胞を形質転換して、組換え細胞のライブラリーを作製する工程;
(f)形質転換された宿主細胞をクローニングする工程;
(g)免疫毒素が宿主細胞によって発現される可溶性タンパク質である、免疫毒素のライブラリーを発現させる工程;
(h)免疫毒素のライブラリーを、工程(a)の非修飾型の抗体もしくは免疫毒素と比較した、標的細胞に対する結合および/または細胞毒性の改良に関してスクリーニングする工程であって、非修飾型の抗体もしくは免疫毒素と比較した、標的細胞に対する結合および/または細胞毒性の改良が、免疫毒素の改良を示す工程;
(i)重鎖可変領域中のホットスポットを同定する工程;
(j)少なくとも1つの点突然変異を、重鎖可変領域をコードする核酸配列中のホットスポットに導入して、変種の重鎖可変領域をコードする核酸配列のライブラリーを作製する工程;
(k)個々のベクターが、免疫毒素をコードし、かつ工程(j)で作製された変種の重鎖可変領域の核酸配列の1つ、および/または工程(h)で同定された改良型の免疫毒素の変種の軽鎖可変領域の核酸配列を含み、変種の重鎖可変領域の核酸配列もしくは変種の軽鎖可変領域の核酸配列が、細胞毒素をコードする核酸配列に操作可能に連結されている、ベクターのライブラリーを構築する工程;
(l)ベクターのライブラリーで宿主細胞を形質転換して、組換え細胞のライブラリーを作製する工程;
(m)形質転換された宿主細胞をクローニングする工程;
(n)免疫毒素が宿主細胞によって発現される可溶性タンパク質である、免疫毒素のライブラリーを発現させる工程;ならびに
(o)免疫毒素のライブラリーを、非修飾型の抗体もしくは免疫毒素と比較した、標的細胞に対する結合の改良および/または細胞毒性の改良に関してスクリーニングする工程であって、非修飾型の抗体もしくは免疫毒素と比較した、標的細胞に対する結合の改良および/または細胞毒性の改良が、免疫毒素の改良を示す工程。
(a)抗体または免疫毒素の軽鎖可変領域および重鎖可変領域の核酸配列を提供する工程;
(b)重鎖可変領域中のホットスポットを同定する工程;
(c)少なくとも1つの点突然変異を、重鎖可変領域をコードする核酸配列中のホットスポットに導入して、変種の重鎖可変領域をコードする核酸配列のライブラリーを作製する工程;
(d)個々のベクターが、免疫毒素をコードし、かつ(c)で作製された変種の重鎖可変領域の核酸配列の1つ、および/または工程(a)に由来する1つの軽鎖可変領域の核酸配列を含み、変種の重鎖可変領域の核酸配列もしくは軽鎖可変領域の核酸配列が、細胞毒素をコードする核酸配列に操作可能に連結されている、ベクターのライブラリーを構築する工程;
(e)ベクターのライブラリーで宿主細胞を形質転換して、組換え細胞のライブラリーを作製する工程;
(f)形質転換された宿主細胞をクローニングする工程;
(g)免疫毒素が宿主細胞によって発現される可溶性タンパク質である、免疫毒素のライブラリーを発現させる工程;
(h)免疫毒素のライブラリーを、工程(a)の非修飾型の抗体もしくは免疫毒素と比較した、標的細胞に対する結合の改良および/または細胞毒性の改良に関してスクリーニングする工程であって、非修飾型の抗体もしくは免疫毒素と比較した、標的細胞に対する結合の改良および/または細胞毒性の改良が、免疫毒素の改良を示す工程;
(i)軽鎖可変領域中のホットスポットを同定する工程;
(j)少なくとも1つの点突然変異を、軽鎖可変領域をコードする核酸配列中のホットスポットに導入して、変種の軽鎖可変領域をコードする核酸配列のライブラリーを作製する工程;
(k)個々のベクターが、免疫毒素をコードし、かつ工程(j)で作製された変種の軽鎖可変領域の核酸配列の1つ、および/または工程(h)で同定された改良型の免疫毒素の変種の重鎖可変領域の核酸配列を含み、変種の軽鎖可変領域の核酸配列もしくは変種の重鎖可変領域の核酸配列が、細胞毒素をコードする核酸配列に操作可能に連結されている、ベクターのライブラリーを構築する工程;
(l)ベクターのライブラリーで宿主細胞を形質転換して、組換え細胞のライブラリーを作製する工程;
(m)形質転換された宿主細胞をクローニングする工程;
(n)免疫毒素が宿主細胞によって発現される可溶性タンパク質である、免疫毒素のライブラリーを発現させる工程;ならびに
(o)免疫毒素のライブラリーを、非修飾型の抗体もしくは免疫毒素と比較した、標的細胞に対する結合の改良および/または細胞毒性の改良に関してスクリーニングする工程であって、非修飾型の抗体もしくは免疫毒素と比較した、標的細胞に対する結合の改良および/または標的細胞に対する細胞毒性の改良が、免疫毒素の改良を示す工程。
本発明は、本発明の方法で作製された改良型の融合タンパク質も含む。特に、実施例4に記載されているように、本発明者らは、本発明の親和性成熟を使用して、改良型の免疫毒素を作製した。1つの親和性成熟型の抗体の配列を図10に示す(SEQ ID NO: 1および2)。したがって1つの態様では、免疫毒素は、SEQ ID NO:2に示された軽鎖可変領域、および/またはSEQ ID NO:1に示された重鎖可変領域を含む。
実施例1:免疫ライブラリーの構築およびスクリーニング
可溶性の発現系を使用してライブラリーを構築する。VH断片およびVLCL断片の増幅を、癌患者から単離されたリンパ節組織を使用してRT-PCRで行う。同定される抗体または細胞表面標的のタイプに依存して、正常対象に由来する試料か、または他の医学的条件に罹患している対象に由来する試料が望ましい場合がある。ライブラリーが形質細胞から得られるのであれば、リンパ節組織がB細胞の適切な供給源である。なぜならリンパ節組織は、B細胞が抗原曝露後に抗体を活発に分泌する形質細胞に成熟する部位だからである。形質細胞に由来するmRNAのRT-PCRによる増幅で、腫瘍に反応する抗体の可変領域をコードするcDNAが得られる。
B細胞の分化および成熟のプロセスは、複数の工程を含む(Molecular Immunology, Second Edition. Edited by Hames B. D. and Glover D. M. IRL Press)。初期相は、骨髄表面に極めて多数の非抗原誘導性の、基本的にランダムな表面Igのレパートリーを提示する、プレB細胞がバージン(virgin)B細胞に成熟する骨髄中で生じる。これらの細胞は、脾臓およびリンパ節に移行し、そこで抗原に曝露され、ならびに関連クローンが増幅されて、最終的に形質細胞に成熟する。
形質細胞のライブラリーの実際の増幅工程に先だって、得られると推定されるライブラリーのサイズは、テンプレートとして使用される臨床試料中における利用可能な形質細胞のプールサイズを定量することで推定される。これは例えば、抗CD38で標識された細胞を一次抗体として使用するフローサイトメトリーで実施することができる。CD38は、形質細胞によって強く発現される表面マーカーである(Harada H. H., Kawano M. M., Huang N., Harada Y., Iwato K., Tanabe O., Tanaka H., Sakai A., Asaoku H. and Kuramato A. 1993 「Phenotypic Difference of Normal Plasma Cells from Mature Myeloma Cells」 Blood 81 :2658-2663)。大規模な形質細胞集団を生じる臨床試料が最も有用である。106コロニー形成単位以上の最終ライブラリーサイズが望ましく、したがってテンプレートとして使用される試料中における同様のサイズのプールの形質細胞が望ましい。所望の数の形質細胞を得る目的で、複数の癌患者に由来する試料を一括してプールすることも可能である。仮に試料が、複数の癌患者からプールされるのであれば、この操作は、腫瘍に対する免疫応答に由来する抗体を含まないライブラリーのスクリーニング回数を最小化することにもなる。
個々の軽鎖(κおよびλ)ならびに重鎖(γ)の増幅を、制限酵素切断部位を5'端および3'端に含む特異的なプライマーを使用して、臨床試料から抽出されたmRNAをテンプレートとして使用するRT-PCRで行う。結果として得られた断片を、適切な制限酵素を使用して、Xomaベクター中にランダムにクローニングする。ライブラリーのサイズは重要である。標準的なライブラリースクリーニングプロトコルでは、106 CFU(コロニー形成単位)以上が望ましい。この目的を達成するために、以下の複数の工程を行う:
この工程は通常、ライブラリー作製時のボトルネックとなっている(Directed Evolution, Library Creation, Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology, vol. 231 , edited by Frances H Arnold and George Georgiu, 2003, Humana Press)。したがって、高い効率の連結が求められており、および慎重な最適化が必要である。切断挿入物/ベクターの複数の比が検討されている。連結反応物は、ライブラリー作製の最適条件でインキュベートされる(Arnold and Georgiu, 2003)。連結の効率は、アガロースゲル電気泳動によって半定量的に、ならびに大腸菌へのエレクトロポレーション、およびプレート上の形質転換コロニーを数えることで定量的に評価される。
エレクトロポレーションは、効率が良くて迅速な形質転換法である。波長、電圧、および抵抗などのパラメータは、容易に最適化することができる。このプロトコルでは、市販のエレクトロコンピテントセル(electrocompetent cell)が使用される。
個々の形質転換には最小量のDNAを使用する一方で、妥当な数の個々のエレクトロポレーションが実施される、適切なサイズのライブラリーが得られることが望ましい。
ライブラリーのスクリーニングは、自動コロニーピッカーの使用と、これに続く、マイクロウェル中に含まれる液体成長培地へのコロニーの播種によって効率的に実施可能である。液相の効率的な扱いは、自動リキッドハンドラーによってなされる。この工程では、各プレートに集密化(over-crowding)を引き起こすことなくプレーティング可能な細胞の量を決定することが重要である。任意のサイズのライブラリーの効率的なプレーティングに必要なプレートの数が決定される。T字形のディスポーザブルの滅菌済みのループをプレーティングに使用する。
大腸菌の可溶性ディスプレイ(soluble display)を使用した高処理能スクリーニングに適した免疫ライブラリーが構築されている。この方法は、結腸癌患者のリンパ節に由来する形質B細胞の濃縮集団を使用する、抗体の可変領域のRT-PCRによる増幅に基づく。ガンマ鎖およびカッパ鎖の可変ドメインのcDNAを、Fab-ETA(252-608)コンストラクトとしてXoma pING3302ベクターにランダムにクローニングし、ならびに大腸菌細胞を形質転換した。作製された2.105クローンのライブラリーを、検討クローンの100%を対象とした各鎖のPCR増幅によって検証した。加えて、配列決定の結果、全てのクローンが固有のCDRループを有することが判明し、免疫応答の多様性があることが確認された。加えて、L-アラビノースによる誘導によって、適切な発現レベルが、96ウェルプレート中で成長させたクローンの上清中に検出された。切断型の緑膿菌外毒素Aとの融合によって、内在化クローンの選択が、アポトーシスの測定によって可能となり、およびTMAスクリーニング法に適したものとなる。
形質B細胞は、抗原に特異的な抗体を産生するため、免疫ライブラリー作製のための対象集団となる。IgD細胞表面マーカーに結合する抗IgD抗体を使用して、ナイーブB細胞を除去した。結腸癌患者から除去された3個の凍結リンパ節を、形質B細胞の供給源として使用した。DMSO中に保存されたリンパ節の凍結細胞を、37℃に設定した水浴中で速やかに溶解し、および47 mLのDMEM+10% FBSで希釈した。2000 RPMで3分間の遠心分離後に、細胞を20 mLのDMEM+10% FBSで洗浄し、および1 mLの同培地中に再び懸濁した。抗IgD mAb(250 ng)(1)、および抗THY-1 mAb(50 ng)(2)(いずれの抗体ともビオチンに結合)を使用して、ナイーブB細胞とT細胞をそれぞれ除去した。氷上で1.5時間、静置後に細胞を遠心分離し、および1 mLの新鮮なDMEM+10% FBS中に再懸濁した。ストレプトアビジンでコーティングされた等容積の磁気ビーズ(1 mLのPBS緩衝液で事前に3回洗浄済み)を細胞に添加して氷上で1時間、ときおり混合しながらインキュベートした(3)。インキュベーション時間の終了時に、ビーズに結合したナイーブB細胞およびT細胞を磁力を利用して分離し、ならびに形質B細胞の濃縮集団を含む上清を回収して氷上に維持した。
形質B細胞のmRNAを、Oligotex(商標)キット(5)を使用して、生存率が50%の2.6・106細胞のプールから抽出した。簡単に説明すると、細胞を4℃で2000 rpmで3分間、遠心分離し、および600μLの溶解緩衝液に再懸濁した。次に細胞溶解物を、事前に保温済みの17.5μLのOligotex(商標)粒子と室温で10分間インキュベートした。次に、Oligotex(商標)粒子を洗浄緩衝液で洗浄し、結合状態のmRNAを50μL 溶出用緩衝液で溶出した。
Fab-ETA(252-608)結腸免疫ライブラリーを作製する目的で、PelB-VH断片およびVL-CL(κ)断片をPCRで作製し、続いてPelBリーダー配列との融合をサブクローニング工程(VH)によって行い、ならびにEcoRI-ApaI-CH-ETA(252-608)-PelB-SfiI-XhoI/3302プラスミド中に、それぞれEcoRI/ApaI制限酵素切断部位およびSfiI/XhoI制限酵素切断部位を使用してランダムに挿入した。リンパ節で生じる免疫応答の大半を捕捉する目的で、異なるサブクラスのカッパ鎖およびガンマ鎖に対応する5'プライマーの混合物をPCR反応に使用した。ガンマ鎖およびカッパ鎖用の3'プライマーは、鎖の定常ドメインおよび3'端にそれぞれアニーリングするように設計された。VH断片およびVL-CL(κ)断片を、形質B細胞から抽出されたcDNAを使用してPCRで増幅した。VL-CL(κ)断片のクローニングに必要な制限酵素切断部位をプライマー中に含めた。増幅されたNcoI-VH-ApaI断片を、サブクローンベクター中に含まれるEcoRI-ETA(252-608)IB-NcoIドメインの下流に融合させた。こうすることで、クローニングに適したEcoRI/ApaI端を有するPelB-VH断片が得られた。PCRで増幅されたNcoI-VH-ApaI断片は、ユニバーサルクローニングベクターEcoRI-ApaI-CH-ETA(252-608)-PelB-SfiI-XhoI/3302中に直接クローニングされなかった(NcoI部位が同ベクター中に複数存在するため)。しかしながら、同部位はサブクローンベクターからは除去されていた。PelB-VHとVL-CL(κ)のいずれの断片とも、EcoRI-ApaI-CH-ETA(252-608)-PelB-SfiI-XhoI/3302 DNAプラスミド中のEcoRI/ApaI制限酵素切断部位およびSfiI/XhoI制限酵素切断部位を介して連結され、ならびに連結反応物で10B細胞が形質転換された。軽鎖および重鎖の連結に関する形質転換体の数はいずれも2・105個であった。これとは対照的に、挿入物なしで実施された同じ連結反応では、上記の場合と比較して、10%に満たない形質転換体しか得られなかった。Fab-ETA(252-608)としてランダムにクローニングされた重鎖およびカッパ鎖を含む最終プラスミド集団でJM109の形質転換を行ったところ、収率は、10B細胞から精製された2μLのスーパーコイルDNAを使用時の個々のエレクトロポレーションあたり約0.5・105クローンであった(29)。
a.PelB-VH断片
PelB-VH断片をVHドメインのPCR増幅と、これに続くサブクローニング工程によるPelBリーダー配列との融合を含む2工程のアプローチによってアセンブルした:
10X PCR用緩衝液 5μL
2 mM dNTP 5μL
プライマー5' 20 pmol
プライマー3' 20 pmol
Taq DNAポリメラーゼ、EasyA 2.5 U
DNA 10μL
PCR反応物は、合成cDNA(10μL)をテンプレートとして使用し、プライマー1〜9およびプライマー10の混合物を含むようにした。この結果、5'端がNcoI切断部位に、また3'端がApaI切断部位に挟まれた450 bpのVH断片の混合物が得られた。
PelBリーダー配列を、入手済みのVH断片と融合させる目的で、サブクローニング工程が必要であった。サブクローンベクターを以下の手順で作製した:EcoRI-XhoI断片をユニバーサルクローニングベクターEcoRI-ApaI-CH-ETA(252-608)-PelB-SfiI-XhoI/3302から切り出して、同様に切断されたpSV-73補助プラスミド中に挿入した。望ましくないNcoI制限酵素切断部位を含むSalI-XhoI断片を切り出し後に、SalIおよびXhoIによる切断が共通の末端を生じることを利用してベクターを自己連結させた。ゲルから精製した約100 ngのVH断片、および200 ngのサブクローンベクターを、総容量20μL中でApaI(1.5μL)で25℃で2時間かけて切断した。次に温度を37℃に上昇させ、およびNcoIを添加し(1.5μL)、さらに2時間インキュベートした。全ての切断産物はゲル精製した。切断済みのガンマ重鎖(50 ng)を、100 ngの切断済みプラスミドと、2000単位のT4 DNAリガーゼの存在下で16℃で一晩かけて連結させた。次に連結反応混合物を、Zymo Research(商標) Concentratorキットを使用して精製し、および最終容量が16μLとなるように溶出した。EasyShock(商標) 10Bエレクトロコンピテントセルに、2μLの精製済みの連結反応物をエレクトロポレーションで導入し、および1 mLのSOC培地中に再懸濁した。連結の効率は、1/10および1/100の希釈倍率の形質転換混合物を、アンピシリン(100 μg/mL)が添加されたLB寒天プレートにプレーティングして評価した。1 mLの一晩培養物からプラスミドを抽出した。抽出されたプラスミド(900 ng)を、20μLの総容量で、37℃で2時間かけて、1.5μLのEcoRIで切断し、Zymo Research(商標) Concentratorキットで精製し、および20μLの総容量で、25℃で2時間かけて、1.5μLのApaIでさらに切断した。
PCR反応を、プライマー1〜6(フォワード反応)およびプライマー7(リバース反応)を使用して行い、cDNA(10μL)をテンプレートとして使用して、VL-CL(κ)断片を構築して増幅した。SfiIおよびXhoIの制限酵素切断部位(太字)を加えることで、EcoRI-ApaI-CH-ETA(252-608)-PelB-SfiI-XhoI/3302プラスミド中へのVL-CL(κ)のクローニングを迅速化した。カッパ軽鎖には、クローニングを容易にするためにVI領域を含めた。
ライブラリーの質を確認するために、以下の3つの試験を実施した;個々の連結反応後のPCRによるスクリーニング、無作為に選択された重鎖およびカッパ鎖の独立クローンの配列決定と、これに続く発現ベクターへの挿入、ならびに続く96ウェルプレート上におけるライブラリーの集合および発現。
カッパ軽鎖のクローニング
配列の多様性が配列決定によって確認されたら、カッパ鎖のPCR反応物(約100 ng)を、ユニバーサルクローニングベクターEcoRI-ApaI-CH-ETA(252-608)-PelB-SfiI-XhoI/3302中に、1か所のみを切断する制限酵素であるSfiIおよびXhoIを使用してクローニングした。カッパ鎖のPCR反応物およびEcoRI-ApaI-CH-ETA(252-608)-PelB-SfiI-XhoI/3302プラスミドをXhoI(1.5μL)とともに37℃で2時間、BSAの存在下で、最終容量が50μLとなるようにインキュベートした後に、1.5μLのSfiIを添加した。50℃で2時間のインキュベーション後に、切断後のカッパ軽鎖およびプラスミドをアガロースゲルにロードし、Zymo Research(商標)ゲル精製キット(7)を使用して精製し、および16μLに溶出した。
EcoRIおよびApaIで二重切断済みのPelB-VH断片100 ngと、同じ酵素で切断済みのCH-ETA(252-608)-PelB-VL-CL(κ)/3302ベクターの連結を、文献に記載された手順で行った。連結物の精製、形質転換、およびPCRによるスクリーニングは、文献に記載された手順で行った(ガンマプライマーの使用は除く)。
クローニングされたプラスミドを、Zippyミニプレップで精製し、および予備実験で最高の発現細胞であることが判明したエレクトロコンピテントJM109株にエレクトロポレーションによって導入した。得られたライブラリーのサイズを、15 μg/mLのテトラサイクリンを含むLB寒天プレートに、形質転換混合物を1/10および1/100の希釈倍率でプレーティング後のコロニー数を数えることで評価した。
PelB-VH鎖およびカッパ鎖の挿入物を含む独立クローンの配列決定を行い、わずかな重複が生成ライブラリー中に存在することが確認された。表1および表2に示すように、各鎖のCDRループのアミノ酸配列は固有であった。予想通り、重鎖のCDR3領域の長さの多様性が、最小11残基〜最大19残基の範囲で得られた。加えて、カッパ断片および重鎖断片のサブクラスを示す。
15個の独立クローンの発現レベルを、ライブラリーのスクリーニング中に使用される条件で誘導後にウェスタンブロットで評価した(図2)。15 μg/mLのテトラサイクリンが添加された150μLの2xYTを含む96ウェルプレートのウェルに、1個の形質転換JM109コロニー/ウェルを添加し、および37℃で一晩、一定の速度で振盪しながらインキュベートした。一晩成長させた種培養物20μLを、130μLのTBを含むウェルに添加し、および37℃で7〜8時間インキュベートした。次に培養物を、17.5μLの2% L-アラビノースで誘導し、および25℃で一晩インキュベートした。5000 RPMで30分間、遠心分離した後に、15個の異なるウェルに由来する16μLの上清をSDS-PAGEアクリルアミドゲルに非還元条件でロードし、ならびにHRPを結合させた抗ヒトカッパ軽鎖抗体を使用したウェスタンブロットで解析して、組換えタンパク質の有無およびサイズを確認した。Fab-ETA(252-608)の完全長の発現が、3クローンについて検出され、および発現のレベルは、陽性対照であるVB6-845-Fab-ETA(252-608)と同等であった。他の2つのクローンについては、低レベルの発現が観察された(右側のブロットのレーン3および6)。加えて、切断型の産物も検出され、パターンは陽性対照と同等であった。
個々のクローンを増幅させ、および96ウェルプレートの1つのウェル中の培地にアラビノースを添加して発現させた。各ウェルの上清を、選択された標的細胞株のアポトーシスを誘導する能力に関して検討した。
各ウェルの上清10μLを、SW-480腫瘍細胞(96ウェルプレートに添加済み)に添加する。量的データを得るために、Annexin VおよびCentri-Redによる染色を使用する生/死アッセイ法(live/death assay)を実施する。野生型VB6-845-ETA(252-608)を陽性対照として使用する。FMATプレートを37℃で24時間インキュベートする。20μLのAnnexin-Alexa-Fluor 647/Centri-Red(商標)溶液を各ウェルに添加し、およびプレートを室温で1時間、暗条件でインキュベートする。次にプレートをFMATリーダーで読みとる。アポトーシス陽性の細胞は、Annexin色素と結合する。全ての細胞が、Centri-Red色素によって染色される。アポトーシス率(%)を、Annexin陽性イベント数をCentri-Red陽性イベント数で割った比として計算する。アポトーシスが、空の発現ベクター(pING-3302)を含む細胞に由来する陰性対照上清のアポトーシスの20%を上回るクローンを陽性と見なす。
選択された陽性クローンを発現する細胞を成長させる。2つの振盪フラスコに等分割した2xYT+テトラサイクリン(25 mg/L)の100 mLのスターター培養物(starter culture)に、グリセロール10%中の1 mLの凍結細胞ストックを添加し、および37℃で一晩攪拌しながら成長させた。翌日、12本の振盪フラスコ(各0.5 L)に分けた6 LのTB培地に、60 mLのスターター培養物(各5 mL)を添加し、および37℃で振盪しながらOD600が約2.0となるまで成長させた。この工程で、タンパク質の発現を、アラビノースを最終濃度が0.2%となるように添加して誘導した後に、25℃で振盪しながら一晩インキュベートした。翌日、細胞を8000 RPM(Sorvall(商標))で4℃で50分間かけて遠心分離して除去した後に、カートリッジフィルター(Sartorius(商標))を通して粗濾過を行った。上清を、NaPO4 20 mM pH-7.5の緩衝液で、30 KDaのMWCO膜を使用したダイアフィルトレーションで濃縮し、容量を6 Lから0.5Lにした。
フローサイトメトリーで、陽性スクリーニング用の細胞株(SW-480)に対する結合を測定し、および選択された陽性クローンの親和性を判定する。結合を評価するために、精製済みのクローンの上清を一定数のSW-480細胞とともにインキュベートして、飽和曲線を描く。結合は、ウサギ抗ETA(252-608)を使用して検出され、ならびに陽性対照であるVB6-845PE(高親和性)およびVB6-011 ETA(252-608)(中親和性)と比較される。親和性を判定するために、高濃度の精製クローンの上清をインキュベートする。解離定数KDで表される結合親和性は、メジアン蛍光の逆数を抗体濃度の逆数の関数としてプロットするラインウィーバー・バーク(Lineweaver-Burk)法によって計算される。解離定数は、以下の方程式で決定される:1/F=1/FMax+(KD/FMax)(1/[scFv]);同式でFは、バックグラウンドを差し引いたメジアン蛍光に対応し、およびFMaxはプロットから計算される。8個の許容クローンの4個に関する結合評価の結果を表4に示す。
MTSアッセイ法で、陽性細胞株SW-480、および無関係の癌タイプに由来する陰性細胞株CA-46を使用して、選択された陽性クローンのIC50値が決定される。MTSアッセイ法の結果を表4に要約する。
「ホットスポット修飾」かランダム変異導入のいずれかによって作製された親和性成熟抗体のスクリーニングを効率的に行う目的で、各候補のFabフォーマットを、細胞毒性タンパク質である緑膿菌外毒素Aの変種に連結した。Fab-ETA(252-608)フォーマット(本明細書ではVB6-ETA(252-608)フォーマットとも表記)は、腫瘍細胞に対する結合活性および力価の評価に適しており、高親和性抗体を発現するクローンの迅速な同定を可能とする。加えて同フォーマットは、TMAのプロファイリングによる正常組織および腫瘍組織に対する迅速なスクリーニングも可能とする。
「ホットスポット法」:
a.ホットスポットの同定
インビボで生じる体細胞の過剰変異は、「ホットスポット」と呼ばれる特定の配列を標的とする(Neuberger M. S and Milstein C. 1995. Somatic hypermutation. Curr. Opin. Immunol. 7:248-254)。ホットスポット配列は、特定のコドンで表されるコンセンサスのヌクレオチド配列であると定義可能である。コンセンサス配列は、四ヌクレオチドRGYWである(RはAまたはGのいずれかであり、YはCまたはTであり、およびWはAまたはTのいずれかを取り得る)(Neuberger M.S. et al., 1995)。加えて、ヌクレオチドAGYにコードされるセリン残基は主に可変ドメインのCDR領域中に、潜在的なホットスポット配列に対応するTCNにコードされる残基を上回って存在する(Wagner S. D., Milstein C. and Neuberger M.S. 1995. Codon bias targets mutation. Nature, 376, p732)。構造解析から、CDRループ(特にCDR3ループ)が、抗原結合の多くに寄与することが報告されている(Giudicelli V., Chaume D. and Lefranc M.P. 2004. IMGT/V-QUEST, an integrated software program for immunoglobulin and T cell receptor V-J and V-D-J rearrangement analysis. Nucleic Acids Res. 32:435-440)。したがって、各候補の重鎖および軽鎖のCDRのヌクレオチド配列が、ホットスポット配列およびAGYコドンの有無に関してスキャンされる。重鎖および軽鎖のCDR領域の同定されたホットスポットと、胚の重鎖および軽鎖の配列の比較は、International ImMunoGen Ticsデータベース(IMGT, http://imgt.cines.fr/textes/vquest/)(Davies D.R., Padlan E.A. and Sheriff S. 1990. Antibody-antigen complexes. Annu. Rev. Biochem. 59:439-473)を使用して行うことができる。生殖系列であると同定された配列は、体細胞変異が起こらなかったことを示唆し;したがって、ランダムな変異が、インビボで生じる体細胞イベントに似たように導入される。これとは対照的に、異なる配列は、一部の体細胞変異が既に生じていることを示している。インビボで体細胞変異が最適か否かは明らかにされていない。CDRの内部に存在するアミノ酸、すなわち保存されたアミノ酸をコードするホットスポットには、変異は導入されないと考えられる。このような残基は通常、全体的な構造に重要であり、および内部に存在するために、抗原と相互作用する可能性は低い。加えて、この解析を、体細胞変異が多く生じる生殖系列中の配列の推定位置と比較する(TomLinson I. M., Cox J. P. L., Gherardi E., Lesk A.M. and Chotia C. 1995. The structural repertoire of the human Vλdomain. EMBO J. 14:4628-4638;TomLinson I. M., Walter G., Jones P.T., Dear P.H., Sonnhammer E.L.L. and Winter G. 1996. The imprint of Somatic hypermutation on the repertoire of human germLine V genes. J. Mol. Biol. 256:813-817)。類似の戦略を、BL22 scFvの親和性成熟に応用した。重鎖のCDR3中に導入された点突然変異は、さまざまなCD22陽性細胞株に対する結合活性の5〜10倍の上昇をもたらした(Salvatore G., Beers R., Margulies I., Kreitman R.J. and Pastan I. 2002. Improved cytotoxic activity toward cell lines and fresh leukemia cells of a mutant anti-CD22 immunotoxin obtained by antibody phage display. Clinical Cancer Research, 8:995-1002.)。さらに、CDR1ループおよびCDR2ループ中のさまざまなアミノ酸の変異も、親和性が3倍〜7倍高まる変異体を生じた(Ho M., Kreitman J., Onda M. and Pastan I. 2005. In vitro antibody evolution targeting germLine hot spots to increase activity of an anti-CD22 immunotoxin. J. Biol. Chem., 280:607-617)。
ホットスポットが同定されたら、縮重コドン(NNS、同式でNはA、G、C、またはTであり、およびSはGまたはCである)を含むオリゴヌクレオチドを使用して、可能な全てのアミノ酸を標的位置に導入する(TAAおよびTGAの終止コドンは除く)。過去の研究では、軽鎖のCDRの変異誘発と続く重鎖のCDRの変異誘発が、両鎖について独立に単離された変異と比較して、親和性の上昇につながることが示唆されている。したがって、各候補の親和性成熟は、軽鎖の最適化から開始される。VLドメインのCDR中に同定されたホットスポットに、PCRによってランダムに変異が導入される。得られたPCR断片は、発現ベクターVB6-ETA(252-608)/3302中への直接クローニングに適した、固有の制限酵素切断部位を含む。大腸菌をエレクトロポレーションで形質転換し、および適切な抗生物質を使用したプレーティングによる選択後に、20個のコロニーを成長させ、ならびに単離されたプラスミドの配列を決定する。配列の解析を行って、標的位置に導入された多様性を評価する。
発現:
15 μg/mLのテトラサイクリンが添加された150μLの2xYTを含む96ウェルプレートのウェルに、1個の形質転換JM109コロニー/ウェルを添加し、および37℃で一晩、一定の速度で振盪しながらインキュベートした。一晩成長させた種培養物(20μL)を、130μLのTBを含む96ウェルプレートに添加し、および37℃で7〜8時間インキュベートした。続いて培養物を、17.5μLの2% L-アラビノースで誘導し、および25℃で一晩インキュベートして、上清中へのFab-ETA(252-608)の分泌を可能とした。PCRによる配列決定で同定された変異体を、可溶性の組換えVB6-ETA(252-608)フォーマットで発現させ、および腫瘍細胞に対する結合/死滅の上昇に関するスクリーニングを行う。簡単に説明すると、培地を含む96ウェルプレート中に1個のコロニーをコロニーピッカーで添加してスクリーニングを開始する。次にプレートを振盪インキュベーターで37℃でインキュベートする。OD600が2となった時点で、各ウェルの培養物のアリコートを回収し、およびグリセロールの存在下で凍結する。次に細菌を、誘導物質の添加によって誘導し、25℃で一晩インキュベートして、上清中へのFab-ETA(252-608)の分泌を可能とする。
5000 RPMで30分間の遠心後に、各ウェルの上清を生腫瘍細胞(96ウェルプレートに添加済み)に添加し、およびVB6-ETA(252-608)の結合活性を、VB6-ETA(252-608)フォーマット(抗Fabまたは抗ETA(252-608)のいずれか)に対するウサギ抗体と、これに続く抗ウサギ-FITCで検出する。96ウェルプレートをFMAT(商標)プレートリーダーで読みとる。2種類のポリクローナル抗体で増幅される蛍光の検出は、アッセイ法の感度を高め、ならびに野生型、ひいては強化型の結合性分子を検出するのに十分であることが予想される。野生型より高い結合反応性を有するVB6-ETA(252-608)の変種を発現する任意のクローンを選択し、および反応性を確認する。プレートリーダーによるデータ解析は定量的であり、反応性を元にクローンをランク付け可能なことが予想される。表現型に基づくスクリーニングの主な利点は、アッセイ法が迅速に行われる点である。
加えて、Annexin Vまたはカルセインによる染色を使用する生/死アッセイ法を実施することができる。VB6-ETA(252-608)の上清を、96ウェルのFMATプレートに添加された腫瘍細胞とインキュベートし、および細胞毒性のレベルを24時間にわたって評価する。評価後、変異導入クローンの力価を測定し、および野生型VB6-ETA(252-608)と比較する。各クローンについて標的が同じであることをふまえて、死滅活性の上昇が親和性の上昇と相関することが一般に想定される。細胞毒性作用の測定に必要なインキュベーション時間のために、生/死アッセイ法は、腫瘍細胞の表現型決定より時間を要する。
仮に、いくつかの親和性成熟型の免疫毒素のような、変異型融合タンパク質によって認識されるエピトープまたはリガンド(すなわち標的分子)が既知の場合は、対応するタンパク質もしくはペプチドまたは化合物で96ウェルプレートをコーティングし、および誘導された上清と室温で2時間インキュベートする。誘導クローンの野生型(当初の抗体)および空のベクター3302に由来する上清を、エピトープ認識の陽性対照および陰性対照として使用する。次に、エピトープに対する親和性成熟抗体の結合をELISAで評価する。陽性クローンの反応性を確認するために、次に上清を、選択された標的腫瘍細胞とインキュベートし、および結合状態の膜関連の免疫毒素をフローサイトメトリーで検出する。
最高10個のクローンの反応性が確認されたら、プラスミドDNAを抽出して配列を決定する。仮に配列決定で、ホットスポットの位置に固有のアミノ酸が同定されたら、最終的なコンストラクトは、その残基を含むように作製される。しかしながら、仮に複数の残基が得られたら、異なる位置における最適化された残基を有するコンビナトリアルライブラリーを構築し、文献に記載された手順でスクリーニングが行われる。最適なクローンが選択されたら、野生型VB6-ETA(252-608)および親抗体に対する競合アッセイ法で特異性を評価する。軽鎖Fab-ETA(252-608)タンパク質の最適化CDRは、両タンパク質と競合することが予想される。
前述した同じ戦略を用いて、VH領域のCDRの同定されたホットスポット中にランダム変異を作製する。次にPCR断片を挿入して、固有の制限酵素切断部位を使用して、Fd-ETA(252-608)ライブラリーを作製する。最適な軽鎖が作製されたら、異なるFd-ETA(252-608)ライブラリーにクローニングする。連結反応物を大腸菌細胞にエレクトロポレーションによって導入し、および適切な選択を行った後に、1個のコロニーのスクリーニングを前述の手順で行う。最適化された軽鎖クローンと比較して、より高いVB6-ETA(252-608)反応性を有するクローンを選択してランク付けを行う。最高5個の候補の反応性が確認されたら、プラスミドDNAを抽出して配列を決定する。重鎖および軽鎖のCDR中の組み合わされた変異を有する最終コンストラクトを次に作製し、生物学的活性に関して検討を行う。親和性成熟型のFabと親抗体間の競合アッセイ法を実施して、当初の結合特異性が保存されていることを確認する。
可溶性の親和性成熟型Fab-ETA(252-608)、野生型Fab-ETA(252-608)、およびVB6-845-ETA(252-608)を含む上清を、抗原陽性腫瘍細胞(選択パニングに使用)および抗原陰性腫瘍細胞に添加する。37℃における3日間のインキュベーション後に、可溶性の親和性成熟型Fab-ETA(252-608)のIC50を、野生型Fab-ETA(252-608)およびVB6-845-ETA(252-608)と比較する。以下のさまざまなシナリオが可能である:A)仮にIC50が許容範囲内(<10 pM)、および陰性腫瘍細胞より少なくとも2対数長い場合は、クローンを成長させる。精製産物を、Proxinium(商標)を使用して、確立された手順でTMAで検討し、正常の重要組織と比較して選択的な結合が腫瘍組織で観察されることを確認する。仮にクローンがTMAを通過すれば、反応性のFab-ETA(252-608)はさらに、15の異なる指標を含む本発明者らの腫瘍細胞バンクのパネルに対する特異性および交差反応性に関して、フローサイトメトリーで解析される。B)仮にIC50が10 pMより高く、したがって前臨床開発に適していなければ、軽鎖および重鎖のCDR3中の3〜4個のアミノ酸のブロックにランダムに変異を導入する(ただし、構造的役割を果たすアミノ酸、およびN付加セグメント中のアミノ酸は除く)。別のアプローチでは、VH領域およびVL領域に、誤りの多いPCRでランダムに変異が導入される。複数の論文で、フレームワーク中に導入された変異が、CDRループの調節によって親和性の上昇につながる可能性があり、ひいては抗原との相互作用の改良につながることが報告されている(Daugherty P. S., Chen G., Iverson B. L. and Georgiou G. 2000. Quantitative analysis of the effect of the mutation frequency on the affinity maturation of single chain Fv antibodies. Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:2029-2034)。例えば、APExディスプレイを使用することができる。生物学的な検討は、ホットスポット変異誘発に関して記載された手順で進められ、適切なIC50値を有するクローンが、臨床上の候補として、さらなる開発が考慮される。
1.目的
Fab-de-ボウガニン融合タンパク質として作製された、精製済みのVB6-011は、親抗体であるVB1-011と競合し、組換えフォーマットと親抗体の間で特異性が保存されたことがわかる。しかしながら、VB6-011の親和性(10-6〜10-7 M)は、VB1-011より5〜10倍低く、IC50は350 nMとなる。したがってVB6-011は、有効な治療薬としてのさらなる臨床開発に適切なものとするために、親和性成熟工程を必要とする。この試験プロトコルを、VB6-011-PEの作製、CDR領域への点突然変異の導入、ならびにライブラリーの構築およびスクリーニングの手順について説明する。
VB6-011の親和性成熟に使用される組換えフォーマットは、KDEL配列が追加された緑膿菌外毒素Aの変種に連結された011-Fab断片である。過去の研究では、形質転換された大腸菌の誘導に伴って、同フォーマットは、上清中にの可溶性材料の発現につながることが報告されている。次に、可溶状態で発現されるFab-ETA(252-608)タンパク質は、「mix and read」アッセイ法に使用されて、腫瘍細胞との結合が、Fab部分とその同種抗原の相互作用を介して評価され、またMTSアッセイ法に使用されて、細胞毒性活性が測定され、およびTMA染色に適している。
VB6-011-ETA(252-608)の作製は、ApaI-CH-ETA(252-608)-PelB-SfiI-XhoI挿入物を含む3302プラスミドDNA中におけるPelB-VH11断片およびVL11-CLκ断片の連結によって実施される。
VB6-011-ETA(252-608)を含む、形質転換されたE104細胞およびJM109細胞を、250 mLの振盪フラスコ中の30 mLのTB培地(1%を接種)中で37℃で、225 rpmで約5時間、浸透しながら、光学密度(O.D. 600 nm)が2に達するまで増殖させる。この時点で、最終濃度が0.1%となるL-(+)アラビノースによって培養物を16時間かけて誘導し、および25℃でインキュベートする。続いて上清を、14000 rpmで5分間、遠心分離して回収し、ならびに抗ヒトカッパ軽鎖(Sigma A-7164)を使用するウェスタンブロットで、還元条件および非還元条件で解析して、免疫毒素の存在およびサイズを確認する。
フローサイトメトリーで、上清に含まれるVB6-011-ETA(252-608)の結合特異性の評価を、抗原陽性細胞株であるA-375およびSaos-2、ならびに抗原陰性細胞株であるPanc-1を使用して行う。結合は、ウサギ抗ETA(252-608)(1/100)を使用して検出される。加えてMTSアッセイ法で、上清に含まれるVB6-011-ETA(252-608)の細胞毒性が、抗原陽性細胞株であるA-375およびSaos-2、ならびに抗原陰性細胞株であるPanc-1を使用して測定され得るか否かを判定する。
生殖系列およびVB1-011のVH配列およびVL配列の解析から、軽鎖のCDRループ中の13個のコドン、および重鎖のCDRループ中の7個のコドンがホットスポットすなわちAGY配列を含むことが判明した。したがって、軽鎖および重鎖をそれぞれカバーするために、5および3のライブラリーを構築する。
PCRによって、標的位置にランダム化ヌクレオチドを含むPCR断片を作製する。プライマー1およびプライマー4は全ライブラリーに共通であり、ならびにプライマー2およびプライマー3は各ライブラリーに特異的である。PCR断片中に存在するSfiIおよびXhoIの制限酵素切断部位を利用して、VB6-011-ETA(252-608)ライブラリーを作製する。
1) 5'プライマー1
2) 3'プライマー2
3) 5'プライマー3
4) 3'カッパ-XhoI
10X PCR緩衝液 5μL
2 mM dNTP 5μL
50 mM MgCl2 2μL
プライマー5' 20 pmol
プライマー3' 20 pmol
Taq DNAポリメラーゼ 2.5 U
DNAテンプレート 50 ng
プライマー1およびプライマー2を使用して、5'端にPelB領域を、また3'端に、標的ランダム化ヌクレオチドを有するCDRループを含む、5'ライブラリーのPCR断片を増幅する。第2のPCR反応では、プライマー3およびプライマー4を使用して、5'端に、標的ランダム化ヌクレオチドを有するCDRループを、また3'端に2つの終止コドンおよびXhoI制限酵素切断部位を含む、3'ライブラリーのPCR断片を増幅する。
第2のPCR反応では、プライマー1およびプライマー4を、各PCR産物に由来する1μLとともに使用して、対応するCDRループ(818 bp)中の特定の位置にランダム化ヌクレオチドを含むPCR断片を作製する。
a.成長および誘導
15 μg/mLのテトラサイクリンが添加された150μLの2xYTを含む96ウェルプレートのウェルに、1個の形質転換されたJM 109コロニー/ウェルを添加し、および37℃で一晩、一定の速度で振盪しながらインキュベートした。20μLの種培養物を、130μLのTBを含む96ウェルプレートに添加し、および37℃で7〜8時間インキュベートした。次に培養物を、17.5μLのL-アラビノースで一晩かけて誘導することで、VB6-011-ETA(252-608)を上清中に分泌させた。図4は、VB6-011-ETA(252-608)軽鎖クローンのウェスタンブロットの結果を示す。
野生型VB6-011-ETA(252-608)の滴定結合曲線を使用して、FMAT(商標)による最適なシグナルを得るための、室温におけるインキュベーション時間を決定する。各ウェルの上清(10μL)をSaos-2腫瘍細胞(96ウェルプレートに添加済み)に添加し、およびVB6-011-ETA(252-608)変異型クローンの結合活性を、AlexaFluor 647 (1/250)に結合させたヤギ抗ヒトIgG(H+L)抗体で検出する。加えて各実験では、野生型VB6-011-ETA(252-608)を陽性対照として使用する。結合反応性が野生型より高いVB6-011--ETA(252-608)変種を発現する任意のクローンを選択して反応性を確認する。
しかしながら、仮にデータが定量的でない場合は、生/死アッセイ法をAnnexin VおよびCentri-Redによる染色で実施する。野生型VB6-011-ETA(252-608)の上清を腫瘍細胞とインキュベートし、および細胞毒性のレベルを24時間にわたって評価し、ならびに野生型(当初の配列)のVB6-011-ETA(252-608)と比較する。比較後、変異導入クローンの力価を測定し、および野生型VB6-011-ETA(252-608)と比較する。各クローンについて標的が同じことから、死滅活性の上昇が親和性の上昇と相関することが一般に想定される。
最高10個のクローンの反応性が確認されたら、それらのプラスミドDNAを抽出して配列を決定する。仮に配列決定で、ホットスポット位置に固有のアミノ酸が同定されたら、この残基を含むように最終コンストラクトを作製する。しかしながら仮に多数の残基が得られたら、異なる位置に最適化された残基を有するコンビナトリアルライブラリーを構築し、および文献に記載された手順でスクリーニングを行う。VB6-011 ETA(252-608)の軽鎖の親和性精製から得られた修飾型の軽鎖モチーフを表5に列挙する。VB6-011の結合を、文献に記載された手順にしたがってフローサイトメトリーで測定する。最適なクローンは、図7に示すように、野生型クローンまたは競合クローンのいずれかより高い平均蛍光によって決定され、および抗原に対するELISA結合によって検証される。VB6-011の場合は、これは図8に示すように、固定化された硫酸コンドロイチンに対するELISAである。
標的位置にランダム化ヌクレオチドを含むPCR断片をPCRで作製する。プライマー1およびプライマー4は全ライブラリーに共通であり、ならびにプライマー2およびプライマー3は各ライブラリーに特異的である。PCR断片中のEcoRIおよびApaIの制限酵素切断部位を利用して、VB6-011-ETA(252-608)ライブラリーを作製する。
1) 5'プライマー1
2) 3'プライマー2
3) 5'プライマー3
4) 3' VH-CH-ApaI
プライマー1およびプライマー2を使用して、5'端にPelB領域を、また3'端に標的ランダム化ヌクレオチドを有するCDRループを含む5'ライブラリーのPCR断片を増幅する。第2のPCR反応では、プライマー3およびプライマー4を使用して、5'端に標的ランダム化ヌクレオチドを有するCDRループを、ならびに3'端に2つの終止コドンおよびApaI制限酵素切断部位を含む3'ライブラリーのPCR断片を増幅する。
第2のPCR反応では、プライマー1およびプライマー4を、各PCR産物に由来する1μLとともに使用して、対応するCDRループ(527 bp)中の特定の位置にランダム化ヌクレオチドを含むPCR断片を作製する。
最終クローン2D3を、de-ボウガニントキシンを用いて、ApaI制限酵素およびSfiI制限酵素を使用して作製した。簡単に説明すると、VB6-011 ETA(252-608)をApaIおよびSfiIで切断して2つの断片を得た。第1の断片は、VHおよびVL-CLを含むpING3302プラスミドに対応し、ならびに第2の断片はCH-ETA(252-608)に対応する。第1の断片を精製し、および同じ酵素で切断済みのCH-de-ボウガニン断片と連結して、VB6-011-Boug-2D3/3302ベクターを得た。VB6-011-2D3クローンの回分発酵を、GMM培地を使用して20 LのCHEMAP発酵槽で実施した(14)。25 μg/mLのテトラサイクリンを含み、ならびに微量元素D、塩化カルシウム、ニコチン酸、およびチアミンが添加された500 mLのGMMを含む2 Lの振盪フラスコに、MCBのバイアルを1本添加した。細胞を、28℃に設定された振盪インキュベーター中に、200 rpmで一定の速度で振盪しながら維持した。培養物を、OD600が2.0〜2.5になるまで成長させた。次に150 mLの種培養物を使用して、追加成分が文献に記載されたように添加された15 LのGMM培地を含む20 L chemapバイオリアクターに添加した。温度を28℃に設定し、およびpH制御ループを介して50%水酸化アンモニウム溶液を添加して、発酵の全期間にわたってpHを7.0に維持した。攪拌速度を300 rpmに、また空気流量を3 slpmに設定し、および600 rpmおよび6 slpmに、ならびに後に1000 rpmおよび10 slpmとなるように、バッチ相中に41%を上回る溶存酸素が維持されるように連続的に増加させた。バッチ培地の炭素源が枯渇したら、溶存酸素は90%以上に上昇し、これによってフィード1溶液(50%グリセロール溶液)の添加が誘導される。次にD0セットポイントを41%に設定し、および供給を、DOの読み値のカスケード制御に基づいて行った。光学密度が100となった時点で、フィード2溶液(50%グリセロール+30 g/Lアラビノース溶液)に切り替えることで培養物を誘導し、およびフィード1の場合と同じ制御下で誘導を48時間かけて実施した。
a.フローサイトメトリーによる、Bougの修飾の検証
野生型VB6-011 bougに関して、VB6-011 2D3 bougの親和性が改良されたことを検証するために、フローサイトメトリーを、高011結合細胞株(Cal-27)、および中〜低結合細胞株PANC-1を使用して実施した。結果を図11および表8に示す。
フローサイトメトリーで、VB6-011-Bougの親和性を測定する。高濃度の精製済みのVB6-011-Bougを、一定数のCal-27細胞とともにインキュベートして飽和曲線を得る。結合を、ウサギ抗bougを使用して検出し、および野生型VB6-011と比較する。解離定数KDで表される結合親和性を、メジアン蛍光の逆数を、抗体濃度の逆数の関数としてプロットするラインウィーバー・バーク法で計算する。解離定数は、以下の方程式で決定される:1/F=1/FMax+(KD/FMax)(1/[scFv])、同式でFは、バックグラウンドを差し引いたメジアン蛍光に対応し、およびFMaxはプロットから計算される。
VB6-011-Bougを最初に、最適な染色条件を明らかにするために、一定数のsaos-2細胞株ペレットについて検討する。続いてIHCを実施する。
MTSアッセイ法で、抗原陽性細胞株であるA-375およびSaos-2、ならびに抗原陰性細胞株であるPanc-1を使用して、変種のIC50値を決定する。変種のIC50を決定し、およびVB6-011-Boug野生型と比較する。
Claims (43)
- 個々の組換え細胞が融合タンパク質をコードする核酸配列を含む、組換え細胞のライブラリーを作製する方法であって、以下の工程を含む方法:
(a)個々のベクターが、融合タンパク質をコードし、かつ2)エフェクター分子をコードする核酸配列と、これに連結した1)標的分子に結合するリガンドタンパク質をコードする核酸配列とを含む、ベクターのライブラリーを構築する工程;および
(b)ベクターのライブラリーで宿主細胞を形質転換して、組換え細胞のライブラリーを作製する工程。 - 個々の組換え細胞が免疫毒素(immunotoxin)を発現する、請求項1記載の組換え細胞のライブラリーを作製する方法であって、以下の工程を含む方法:
(a)個々のベクターが、1つの軽鎖可変領域の核酸配列および/または1つの重鎖可変領域の核酸配列を含み、軽鎖可変領域の核酸配列または重鎖可変領域の核酸配列が、細胞毒素をコードする核酸配列に操作可能に連結された、ベクターのライブラリーを構築する工程;ならびに
(b)ベクターのライブラリーで宿主細胞を形質転換して、組換え細胞のライブラリーを作製する工程。 - 軽鎖可変領域および重鎖可変領域がB細胞から単離される、請求項2記載の方法。
- B細胞が成熟B細胞である、請求項3記載の方法。
- B細胞が、癌を有する対象に由来する、請求項3または4記載の方法。
- 細胞毒素がリボソーム不活性化ポリペプチドである、請求項2〜5のいずれか一項記載の方法。
- 細胞毒素が、ゲロニン(gelonin)、ボウガニン(bouganin)、サポリン、リシン、リシンA鎖、ブリョジン(bryodin)、ジフテリア、リストリクトシン(restrictocin)、および緑膿菌(Pseudomonas)外毒素A、またはそれらの変種からなる群より選択される、請求項6記載の方法。
- 細胞毒素が、修飾型のボウガニンまたはその変種である、請求項7記載の方法。
- 細胞毒素が、機能性の細胞結合ドメインを有さない緑膿菌外毒素Aの変種である、請求項7記載の方法。
- 細胞毒素が、アミノ酸252〜608またはその変種および小胞体保持配列からなる切断型の緑膿菌外毒素Aである、請求項8記載の方法。
- 宿主細胞が大腸菌である、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
- 個々の組換え細胞が、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法に従い調製された融合タンパク質を発現する、組換え細胞のライブラリー。
- 以下の工程を含む、融合タンパク質のライブラリーを作製する方法:
(a)請求項1〜10のいずれか一項記載の組換え細胞のライブラリーを作製する工程;
(b)組換え細胞をクローニングする工程;および
(c)融合タンパク質が組換え細胞によって発現される可溶性タンパク質である、融合タンパク質のライブラリーを発現させる工程。 - 請求項13記載の方法に従い調製される融合タンパク質のライブラリー。
- 複数の重鎖可変領域および複数の軽鎖可変領域を含む免疫毒素のライブラリーであって、ライブラリー中の個々の免疫毒素が、1つの重鎖可変領域および1つの軽鎖可変領域を有し、軽鎖可変領域または重鎖可変領域が細胞毒素に連結されている、ライブラリー。
- 細胞毒素がリボソーム不活性化ポリペプチドである、請求項15記載のライブラリー。
- 細胞毒素が、ゲロニン、ボウガニン、サポリン、リシン、リシンA鎖、ブリョジン、ジフテリア、リストリクトシン、および緑膿菌外毒素A、またはそれらの変種からなる群より選択される、請求項16記載のライブラリー。
- 細胞毒素が修飾型のボウガニンまたはその変種である、請求項17記載のライブラリー。
- 細胞毒素が、機能的な細胞結合ドメインを有さない緑膿菌外毒素Aの変種である、請求項17記載のライブラリー。
- 細胞毒素が、アミノ酸252〜608またはその変種および小胞体保持配列からなる切断型の緑膿菌外毒素Aである、請求項19記載のライブラリー。
- 軽鎖可変領域および重鎖可変領域がB細胞から単離される、請求項15〜20のいずれか一項記載のライブラリー。
- B細胞が成熟B細胞である、請求項21記載のライブラリー。
- B細胞が、癌を有する対象に由来する、請求項21または22記載のライブラリー。
- 以下の工程を含む、融合タンパク質のライブラリーを、標的細胞に対する結合に関してスクリーニングする方法:
(a)請求項14記載の融合タンパク質のライブラリーを提供する工程;
(b)融合タンパク質に標的分子を接触させる工程;および
(c)標的分子に対する融合タンパク質の結合を判定する工程。 - 以下の工程を含む、融合タンパク質のライブラリーを、標的細胞に対する細胞毒性に関してスクリーニングする方法:
(a)請求項14記載の融合タンパク質のライブラリーを提供する工程;
(b)融合タンパク質に標的細胞を接触させる工程;および
(c)標的細胞に対する融合タンパク質の細胞毒性を判定する工程。 - 融合タンパク質が免疫毒素である、請求項24または25記載の方法。
- 標的細胞が癌細胞である、請求項25または26記載の方法。
- 以下の工程を含む、改良型の融合タンパク質を作製する方法:
(a)標的分子に結合可能なリガンドタンパク質をコードする核酸配列を提供する工程;
(b)少なくとも1つの点突然変異を、リガンドタンパク質をコードする核酸配列中に導入して、変種のリガンドタンパク質をコードする核酸配列のライブラリーを作製する工程;
(c)個々のベクターが、融合タンパク質をコードし、かつ2)エフェクター分子をコードする核酸配列と、これに連結された1)工程(b)で作製された変種のリガンドタンパク質の核酸配列の1つとを含む、ベクターのライブラリーを構築する工程;
(d)ベクターのライブラリーで宿主細胞を形質転換して、組換え細胞のライブラリーを作製する工程;
(e)形質転換された宿主細胞をクローニングする工程;
(f)融合タンパク質が宿主細胞によって発現される可溶性タンパク質である、融合タンパク質のライブラリーを発現させる工程;ならびに
(g)融合タンパク質のライブラリーを、非修飾型の融合タンパク質と比較した活性の改善に関してスクリーニングする工程であって、活性の改善が改良型の融合タンパク質を示す工程。 - 融合タンパク質が改良型の免疫毒素である、請求項28記載の方法であって、以下の工程を含む方法:
(a)ベクターのライブラリーを構築する前に、少なくとも1つの点突然変異が、軽鎖可変領域および/または重鎖可変領域をコードする核酸配列中に導入されている、請求項2〜12のいずれか一項記載の組換え細胞のライブラリーを調製する工程;
(b)免疫毒素を発現する形質転換宿主細胞をクローニングする工程;
(c)免疫毒素が宿主細胞によって発現される可溶性タンパク質である、免疫毒素のライブラリーを発現させる工程;ならびに
(d)免疫毒素のライブラリーを、非修飾型の抗体もしくは免疫毒素と比較して、標的細胞に対する結合の改良および/または細胞毒性の改良に関してスクリーニングする工程であって、非修飾型の抗体もしくは免疫毒素と比較した、標的細胞に対する結合の改良および/または細胞毒性の改良が、免疫毒素の改良を示す工程。 - 変異が軽鎖可変領域に導入される、請求項29記載の方法。
- 変異が重鎖可変領域に導入される、請求項29記載の方法。
- 変異が、軽鎖可変領域と重鎖可変領域の両方に導入される、請求項29記載の方法。
- 変異が、軽鎖可変領域および/または重鎖可変領域をコードする核酸配列中のホットスポットに少なくとも1つの点突然変異を含む、請求項29〜32のいずれか一項記載の方法。
- 点突然変異が軽鎖可変領域中のホットスポットに導入される、請求項33記載の方法。
- 点突然変異が重鎖可変領域中のホットスポットに導入される、請求項33記載の方法。
- 点突然変異が軽鎖可変領域と重鎖可変領域の両方のホットスポットに導入される、請求項33記載の方法。
- 標的細胞が癌細胞である、請求項29〜36のいずれか一項記載の方法。
- 請求項28〜37のいずれか一項記載の方法に従い作製される融合タンパク質。
- SEQ ID NO:2で示される軽鎖可変領域を含む免疫毒素。
- SEQ ID NO:1で示される重鎖可変領域を含む免疫毒素。
- SEQ ID NO:2で示される軽鎖可変領域を含む、請求項40記載の免疫毒素。
- 疾患を予防または治療するための、請求項38〜41のいずれか一項記載の免疫毒素の使用。
- 癌を予防または治療するための、請求項42記載の免疫毒素の使用。
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2014506259A (ja) * | 2011-01-17 | 2014-03-13 | ノヴォ ノルディスク アー/エス | Il−21リガンド |
JP2016220687A (ja) * | 2011-04-28 | 2016-12-28 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー | 試料に関連するポリヌクレオチドの同定 |
Families Citing this family (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101550605B (zh) * | 2009-05-15 | 2012-04-18 | 江南大学 | 一种基于体内同源重组构建酵母整合型基因突变文库的方法 |
IL287490B (en) | 2014-01-27 | 2022-08-01 | Molecular Templates Inc | Shiga toxin nonvaccine effector subunit-containing polypeptides for mammalian applications |
US11142584B2 (en) | 2014-03-11 | 2021-10-12 | Molecular Templates, Inc. | CD20-binding proteins comprising Shiga toxin A subunit effector regions for inducing cellular internalization and methods using same |
CA2947048C (en) | 2014-06-11 | 2023-10-17 | Molecular Templates, Inc. | Protease-cleavage resistant, shiga toxin a subunit effector polypeptides and cell-targeted molecules comprising the same |
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IL292708B1 (en) | 2015-05-30 | 2024-04-01 | Molecular Templates Inc | Vaccine-free Shiga toxin A subunit scaffolds and cell-targeting molecules containing them |
AU2017373962B2 (en) | 2016-12-07 | 2022-03-31 | Molecular Templates, Inc. | Shiga toxin a subunit effector polypeptides, shiga toxin effector scaffolds, and cell-targeting molecules for site-specific conjugation |
US20200024312A1 (en) | 2017-01-25 | 2020-01-23 | Molecular Templates, Inc. | Cell-targeting molecules comprising de-immunized, shiga toxin a subunit effectors and cd8+ t-cell epitopes |
WO2019143884A1 (en) * | 2018-01-19 | 2019-07-25 | Vanderbilt University | Conserved hiv antibody clonotypes and methods of use |
IL268443B1 (en) | 2018-04-17 | 2024-03-01 | Molecular Templates Inc | HER2-targeted molecules containing Shiga toxin subunit A scaffolds, without vaccination |
WO2022060838A1 (en) * | 2020-09-15 | 2022-03-24 | Albert Einstein College Of Medicine | Antibodies or antibody-fragments thereof targeting alphaviruses, and compositions and methods comprising same |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2003533228A (ja) * | 2000-05-16 | 2003-11-11 | カリフォルニア インスティテュート オブ テクノロジー | オキシダーゼ酵素の指向的進化 |
JP2004503201A (ja) * | 1997-08-04 | 2004-02-05 | アプライド モレキュラー エボリューション,インコーポレイテッド | リガンド特異的結合分子の同定方法 |
WO2005090579A1 (en) * | 2004-03-19 | 2005-09-29 | Merck Patent Gmbh | Modified bouganin proteins, cytotoxins and methods and uses thereof |
WO2005121341A1 (en) * | 2004-06-10 | 2005-12-22 | Viventia Biotech Inc. | Tumor specific antibody |
Family Cites Families (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1992015327A1 (en) * | 1991-03-08 | 1992-09-17 | Protein Design Labs, Inc. | Recombinant double chain immunotoxins |
CA2120153C (en) * | 1991-09-30 | 2006-06-06 | Ira Pastan | Recombinant immunotoxins |
US20030044772A1 (en) * | 1997-08-04 | 2003-03-06 | Applied Molecular Evolution [Formerly Ixsys] | Methods for identifying ligand specific binding molecules |
EP1007967A2 (en) | 1997-08-04 | 2000-06-14 | Ixsys, Incorporated | Methods for identifying ligand specific binding molecules |
US20030064435A1 (en) * | 1998-05-28 | 2003-04-03 | Weiner Joel Hirsch | Compositions and methods for protein secretion |
US6410271B1 (en) | 2000-06-23 | 2002-06-25 | Genetastix Corporation | Generation of highly diverse library of expression vectors via homologous recombination in yeast |
US6406863B1 (en) * | 2000-06-23 | 2002-06-18 | Genetastix Corporation | High throughput generation and screening of fully human antibody repertoire in yeast |
US20050260213A1 (en) * | 2004-04-16 | 2005-11-24 | Scott Koenig | Fcgamma-RIIB-specific antibodies and methods of use thereof |
PT2829283T (pt) | 2003-04-30 | 2017-09-08 | Univ Zuerich | Método para tratamento do cancro utilizando uma imunotoxina |
WO2005063817A2 (en) | 2003-12-22 | 2005-07-14 | Amgen Inc. | Methods for identifying functional antibodies |
US7335744B2 (en) * | 2003-12-23 | 2008-02-26 | The Regents Of The California University | Prostate cancer specific internalizing human antibodies |
ATE467641T1 (de) | 2004-03-26 | 2010-05-15 | Molecular Templates Inc | Bibliothek von toxin mutanten und deren verwendung |
-
2006
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-
2008
- 2008-06-16 IL IL192222A patent/IL192222A0/en unknown
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2004503201A (ja) * | 1997-08-04 | 2004-02-05 | アプライド モレキュラー エボリューション,インコーポレイテッド | リガンド特異的結合分子の同定方法 |
JP2003533228A (ja) * | 2000-05-16 | 2003-11-11 | カリフォルニア インスティテュート オブ テクノロジー | オキシダーゼ酵素の指向的進化 |
WO2005090579A1 (en) * | 2004-03-19 | 2005-09-29 | Merck Patent Gmbh | Modified bouganin proteins, cytotoxins and methods and uses thereof |
WO2005121341A1 (en) * | 2004-06-10 | 2005-12-22 | Viventia Biotech Inc. | Tumor specific antibody |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
JPN6012043373; J.Biol.Chem.,2005 Jan 7,280(1),p.607-17 * |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2014506259A (ja) * | 2011-01-17 | 2014-03-13 | ノヴォ ノルディスク アー/エス | Il−21リガンド |
JP2016220687A (ja) * | 2011-04-28 | 2016-12-28 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー | 試料に関連するポリヌクレオチドの同定 |
JP2018193389A (ja) * | 2011-04-28 | 2018-12-06 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー | 試料に関連するポリヌクレオチドの同定 |
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