JP2019505206A - 多様性を変化させた足場ドメインを有する結合メンバー - Google Patents
多様性を変化させた足場ドメインを有する結合メンバー Download PDFInfo
- Publication number
- JP2019505206A JP2019505206A JP2018535425A JP2018535425A JP2019505206A JP 2019505206 A JP2019505206 A JP 2019505206A JP 2018535425 A JP2018535425 A JP 2018535425A JP 2018535425 A JP2018535425 A JP 2018535425A JP 2019505206 A JP2019505206 A JP 2019505206A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- library
- binding
- domain
- donor
- fusion protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1037—Screening libraries presented on the surface of microorganisms, e.g. phage display, E. coli display
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
- C07K16/4208—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B30/00—Methods of screening libraries
- C40B30/04—Methods of screening libraries by measuring the ability to specifically bind a target molecule, e.g. antibody-antigen binding, receptor-ligand binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
- C40B40/02—Libraries contained in or displayed by microorganisms, e.g. bacteria or animal cells; Libraries contained in or displayed by vectors, e.g. plasmids; Libraries containing only microorganisms or vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
- C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
- C40B40/10—Libraries containing peptides or polypeptides, or derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
- C40B50/14—Solid phase synthesis, i.e. wherein one or more library building blocks are bound to a solid support during library creation; Particular methods of cleavage from the solid support
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/567—Framework region [FR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2318/00—Antibody mimetics or scaffolds
- C07K2318/20—Antigen-binding scaffold molecules wherein the scaffold is not an immunoglobulin variable region or antibody mimetics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
- C12N2015/8518—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic expressing industrially exogenous proteins, e.g. for pharmaceutical use, human insulin, blood factors, immunoglobulins, pseudoparticles
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Structural Engineering (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
【選択図】なし
Description
(i)結合メンバーの親ライブラリー(founder library)を用意すること、であって、親ライブラリー中のそれぞれの結合メンバーが融合タンパク質および必要に応じて、融合タンパク質と結合したパートナードメインを含み、
融合タンパク質が、レシピエント多様性足場ドメイン中に挿入されたドナー多様性足場ドメインを含み、必要に応じて、ドナー多様性足場ドメインのNおよびC末端が、4個のアミノ酸またはそれ未満のアミノ酸のリンカーを用いて、それぞれレシピエント多様性足場ドメインに連結されており、
ドナー多様性足場ドメインがドナー足場およびドナー相互作用配列を含み、レシピエント多様性足場ドメインがレシピエント足場およびレシピエント相互作用配列を含み、1個または複数のドナー相互作用配列、レシピエント相互作用配列およびリンカーが、前記親ライブラリー中で多様性を有すること、
(ii)親ライブラリーの結合活性を示す親結合メンバー(founder binding member)をスクリーニングすること、および
(iii)親ライブラリー中の、結合活性を示す1個または複数の親結合メンバーを特定すること、を含む。
いくつかの実施形態では、リンカーは、前記親ライブラリー中で多様性を有する。
(iv)1個または複数の特定された親結合メンバーのアミノ酸配列中の、1個または複数の位置に多様なアミノ酸残基を導入し、結合メンバーの改変ライブラリーを生成すること、
(v)改変ライブラリーから結合活性を示す改変結合メンバーをスクリーニングすること、および
(vi)改変ライブラリー中の、結合活性を示す1個または複数の改変結合メンバーを特定すること。
いくつかの実施形態では、多様なアミノ酸残基は、1個または複数の特定された親結合メンバーの、ドナー相互作用配列、レシピエント相互作用配列および/またはパートナードメイン中に導入され得る。
(vii)1個または複数の特定された結合メンバーまたは改変結合メンバー由来の融合タンパク質を、パートナー結合ドメイン(パートナー鎖)の多様性集団と結合させて、結合メンバーのシャッフルライブラリーを生成すること、
(viii)シャッフルライブラリーの、結合活性を示すシャッフル結合メンバーをスクリーニングすること、
(ix)結合活性を示す1個または複数のシャッフル結合メンバーを特定すること。
レシピエント多様性足場ドメイン中に挿入されたドナー多様性足場ドメインを含む、融合タンパク質の多様性集団をコードする核酸集団を用意することであって、必要に応じて、ドナー多様性足場ドメインのNおよびC末端が、それぞれの末端の4個のアミノ酸またはそれ未満のアミノ酸のリンカーを用いて、レシピエント多様性足場ドメインに連結されており、
ドナー多様性足場ドメインがドナー足場およびドナー相互作用配列を含み、レシピエント多様性足場ドメインがレシピエント足場およびレシピエント相互作用配列を含み、
1個または複数のドナー相互作用配列、レシピエント相互作用配列およびリンカーが、前記集団中で多様性を有すること、
前記核酸集団を発現して、多様性集団を生成すること、および
必要に応じて、融合タンパク質をパートナードメインの集団と結合させて、それにより、結合メンバーのライブラリーを生成すること、を含む。
レシピエント多様性足場ドメインに挿入されたドナー多様性足場ドメインを含む融合タンパク質の多様性集団であって、
ドナー多様性足場ドメインがドナー足場およびドナー相互作用配列を含み、レシピエント多様性足場ドメインがレシピエント足場およびレシピエント相互作用配列を含み、必要に応じて、ドナー多様性足場ドメインのNおよびC末端がそれぞれ、4個のアミノ酸またはそれ未満のアミノ酸のリンカーを用いてレシピエント多様性足場ドメインに連結されており、
ドナー多様性足場ドメインがドナー足場およびドナー相互作用配列を含み、レシピエント多様性足場ドメインがレシピエント足場およびレシピエント相互作用配列を含み、
1個または複数のドナー相互作用配列、レシピエント相互作用配列およびリンカーが、前記集団中で多様性を有し、
必要に応じて、融合タンパク質が結合パートナーに結合し、ヘテロダイマーを形成する集団、を含む。
ドナー多様性足場ドメインがドナー足場およびドナー相互作用配列を含み、レシピエント多様性足場ドメインがレシピエント足場およびレシピエント相互作用配列を含み、必要に応じて、ドナー多様性足場ドメインのNおよびC末端が、4個のアミノ酸またはそれ未満のアミノ酸のリンカーを用いてレシピエント多様性足場ドメインに連結されている。
レシピエント多様性足場ドメイン中に挿入されたドナー多様性足場ドメインを含む、融合タンパク質の多様性集団またはレパートリーをコードする核酸集団を用意することであって、必要に応じて、ドナー多様性足場ドメインのNおよびC末端が、それぞれの末端の4個までのアミノ酸リンカーを用いて、レシピエント多様性足場ドメインに連結されており、
ドナー多様性足場ドメインがドナー足場およびドナー相互作用配列を含み、レシピエント多様性足場ドメインがレシピエント足場およびレシピエント相互作用配列を含み、
ドナー相互作用配列、レシピエント相互作用配列およびリンカーの内の1つ、2つまたは3つ全てが、前記集団中で多様性を有し、
前記核酸集団を発現して、多様性集団またはレパートリーを生成すること、および
必要に応じて、融合タンパク質を、パートナードメインまたはパートナードメインの集団と結合させて、それにより結合メンバーのライブラリーを生成すること、を含み得る。
レシピエント多様性足場ドメイン中に挿入されたドナー多様性足場ドメインを含む、融合タンパク質の多様性集団であって、必要に応じて、ドナー多様性足場ドメインのNおよびC末端が、それぞれ、末端の4個までのアミノ酸リンカーを用いて、レシピエント多様性足場ドメインに連結されており、
ドナー多様性足場ドメインがドナー足場およびドナー相互作用配列を含み、レシピエント多様性足場ドメインがレシピエント足場およびレシピエント相互作用配列を含み、
ドナー相互作用配列、レシピエント相互作用配列およびリンカーの内の1つ、2つまたは3つ全てが、前記集団中で多様性を有し、
必要に応じて、集団中のそれぞれの融合タンパク質がパートナードメインと結合している、融合タンパク質の多様性集団を含んでよい。
(i)本明細書に記載のように、結合メンバーの親ライブラリーを用意することであって、
ドナー相互作用配列、レシピエント相互作用配列およびリンカーの内の1つ、2つまたは3つ全てが、前記親ライブラリー中で多様性を有すること;
(ii)結合活性を示す結合メンバーでライブラリーをスクリーニングすること、および
(iii)結合活性を示す、親ライブラリー中の1個または複数の結合メンバーを特定すること、を含み得る。
本明細書に記載のように、結合メンバーの親ライブラリーを用意すること、
親ライブラリーを標的分子と接触させること、および
標的分子に結合する1個または複数の親ライブラリーメンバーを選択すること、を含み得る。
(iv)本明細書に記載の1個または複数の結合メンバー、例えば、親ライブラリーから特定された1個または複数の結合メンバー、のアミノ酸配列中の1個または複数の位置に多様なアミノ酸残基を導入し、結合メンバーの改変ライブラリーを生成すること、
(v)改変ライブラリーから結合活性を示す改変結合メンバーをスクリーニングすること、および
(vi)改変ライブラリー中の、結合活性を示す1個または複数の改変結合メンバーを特定すること、をさらに含み得る。
上述のように、結合メンバーの改変ライブラリーを用意すること、
改変ライブラリーを標的分子と接触させること、および
標的分子に結合する1個または複数の改変ライブラリーメンバーを特定すること、を含み得る。
本明細書に記載のスクリーニング方法は、
(vii)上述の、1個または複数の特定された結合メンバーまたは改変結合メンバー由来の融合タンパク質を、パートナードメインの多様性集団と結合させて、結合メンバーのシャッフルライブラリーを生成すること、
(viii)シャッフルライブラリーから結合活性を示すシャッフル結合メンバーをスクリーニングすること、
(ix)結合活性を示す1個または複数のシャッフル結合メンバーを特定すること、をさらに含み得る。
1.概要
トリプシン阻害剤;テッポウウリトリプシン阻害剤−II(EETI−II)を用いて、ドナー多様性足場(例えば、ノッチン)のレシピエント多様性足場ドメイン(例えば、抗体VLドメイン)への融合を、本明細書で最初に例示した。このノッチン足場では、トリプシンへの親和性結合は、ノッチンの適切な折り畳みに依存する。ノッチン遺伝子を抗体軽鎖レシピエントのCDR1またはCDR2に挿入した(カッパおよびラムダ軽鎖の両方に対し実証した)。レシピエントのバリアントのライブラリーを作成し、組み込まれるドナーを収容し得るレシピエントバリアントの選択を可能とした。ドナーおよびレシピエントドメインは、近接並置されていた。下記実施例では、組み込まれるドナーは、CDRループを置換し、組み込まれるドナードメインの末端は、隣接抗体フレームワーク残基、すなわち、コア構造のβ鎖配列に融合された。下記のいくつかの実施例では、フレームワーク残基は、ランダム配列により置換された。したがって、結合メンバーは、追加の残基がほとんど加えられないか全く加えないように、ドナーおよびレシピエント足場を連結する配列長さを制限する方式で構築した。いくつかの事例では、ドナーおよびレシピエントの二次構造エレメントの直接融合により生成されるはずのものに比べて、フレームワーク残基とドナードメインとの間の接合部内に、より少ない残基であった。バリアントのライブラリーが作成され、組み込まれるドメインのNおよびC末端境界のアミノ酸残基の配列は変化したが、立体配置の可撓性を制限する短いリンカー長さは維持された。このライブラリーは、ノッチン挿入物に続く領域中の天然軽鎖レパートリーから導入された多様性を有するノッチンの前に固定カッパまたはラムダ配列を有する適切な融合体組み合わせを特定するために設計された。したがって、ノッチンのCDR1への挿入に関して、フレームワーク2(FW2)からVLドメインの末端までの配列は、天然レパートリーに由来する。同様に、CDR2への挿入物の後に、フレームワーク3からVLドメインの末端までの、天然レパートリー由来の配列が続く。
ファージディスプレイベクターのpSANG428は、ファージミドベースファージディスプレイベクターで、これは単鎖Fv(scFv)フォーマット抗体の容易なクローニングを可能とする。scFvフォーマットでは、VH遺伝子およびVL遺伝子が、可撓性リンカーペプチドをコードするDNAにより連結されている。pSANG4を用いて、scFv遺伝子がNco1およびNot1部位に挿入され、Nco1部位の前に配置されるM13リーダー配列およびNot1部位の後ろに配置されるgene3によりコードされるマイナーコートタンパク質を有するインフレーム融合体が作成される(図1A)。
合成EETI−IIノッチンドナー遺伝子を作製し、これを、Pml1およびMfe部位(これはPCRにより導入された)を有するPCR断片を作成して、pIONTAS1_KB_KappaおよびpIONTAS1_KB_lambda中に挿入することにより、軽鎖レシピエント中のCDR1位置を置換するのに使用した。フレームワークおよびCDR表記は、international ImMunoGeneTics Information system(IMGT)29により記載の通りである。PCRプライマーはまた、制限部位とノッチン遺伝子との間に可変アミノ酸配列を導入した。PCRプライマーPml1−5EETaおよびPml1−5EETbは、それぞれ、配列VNS(V=ACまたはG、N=ACGまたはT、S=CまたはG)でコードされた3個の可変コドンをPml制限酵素部位のすぐ後ろに導入した。「VNS」縮重コドンは、それぞれのランダム化位置で、24のコドンの組み合わせから、16個のアミノ酸(システイン、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニンおよび停止コドンを除く)をコードする。
Pml1−5EETa GTGT VNS VNS VNS TGC CCG CGT ATC CTG ATG CGT TGC(配列番号45)
Pml1−5EETb GTGT gga VNS VNS VNS TGC CCG CGT ATC CTG ATG CGT TGC(配列番号46)
1−5EETMfe GTCAGTCCAATTGNBSNBCCCGCA GAAGCCGTTCGGACCGCA(配列番号48)
ノッチンドナーは、PCRにより導入されたPst1およびBspE1部位を有するPCR断片を作成することにより、pIONTAS1_KB_lambdaおよびpIONTAS1_KB_KappaのCDR2位置に導入された。Pst1部位をIGKV1D−39Vカッパ遺伝子のCDR2領域の最初の2個の残基中(Ala−Ala配列内)に導入することが可能である。クローニング上の便宜上、同じ制限酵素部位およびコード残基を、Vラムダ生殖系列遺伝子IGLV1−36のフレームワーク2の末端に導入した。ラムダ生殖系列ではまた、BspE1部位を、Ser−GlyをコードするFW3領域の4番目および5番目の残基中に導入することも可能である(図3E)。再度、この制限酵素部位およびコードアミノ酸をVカッパ遺伝子中に導入した(図3F)。
PST1−5EETa ATC TAT GCT GCA GNS VNS TGC CCG CGT ATC CTG ATG CGT TGC(配列番号49)
1−5EETBse GTCAGAGACTCCGGASNBSNBCCCGCA GAAGCCGTTCGGACCGCA(配列番号50)
ヒトでは、2種の異なるクラスの抗体軽鎖(カッパまたはラムダ)があり、これらは、それぞれ、約50および40個の生殖系列遺伝子によりコードされている。これらはそれぞれ、配列相同性を基準にして7種の異なるカッパファミリー(Vカッパ1−Vカッパ7)に、および11種の異なるラムダファミリー(Vラムダ1−Vラムダ11)に分類される。生殖系列配列29の調査により、異なる生殖系列VL遺伝子ファミリーに特異的なセンス鎖プライマー(「順方向プライマー」)の設計が可能となる。
VカッパおよびVラムダ生殖系列遺伝子ファミリーの配列を整列させ(データはIMGT29から入手)、フレームワーク2から始まるVLレパートリーの増幅を可能とするPCRプライマーを設計した。Vラムダ1、2および3のFW2領域から増幅可能なラムダ特異的プライマー(「Mfelam」)を設計した。これらのプライマーはまた、上記ノッチン遺伝子の末端に導入されたMfe1部位と適合性があり、インフレームのMfe1部位(下線)を導入するようにも設計した。同様にして、Vカッパ1、2および3のFW2領域から増幅可能なカッパ特異的プライマー(「Mfekap」)を設計した。
Mfelam 1 GTGTGGAGGTGGC AAT TGG TAC CAG CAG CTC CCA GG(配列番号:51)
Mfelam 2 GTGTGGAGGTGGC AAT TGG TAC CAA CAG CAC CCA GG(配列番号:52)
Mfelam 3 GTGTGGAGGTGGC AAT TGG TAC CAG CAG AAG CCA GG(配列番号:53)
Mfekap1 GTGTGGAGGTGGC AAT TGG TAT CAG CAG AAA CCA GG(配列番号:54)
Mfekap2 GTGTGGAGGTGGC AAT TGG TAC CTG CAG AAG CCA GG(配列番号:55)
Mfekap3 GTGTGGAGGTGGC AAT TGG TAC CAG CAG AAA CCT GG(配列番号:56)
JLFORQP2 TGAGATGAGTTTTTGTTCTGCGGCCGCGGGCTGACCTAG(配列番号57)
JKFOR_Thr2 TGAGATGAGTTTTTGTTCTGCGGCCGCGGTACGTTTGAT(配列番号58)
対でのカッパまたはラムダ順方向および逆方向プライマーを用いた増幅により、下記をコードするPCR産物を生成した。
Mfe1−FW2−CDR2−FW3−CDR3−FW4−Not1(配列番号59)。
類似の手法により、ラムダVL遺伝子(「Bsplam」プライマー)またはカッパ(「Bspkap」プライマー)FW3の先頭部分とハイブリダイズし、同時に、上記ノッチン構築物中に導入されたBspE1部位と適合するBspE1制限酵素部位を導入するセンス鎖順方向プライマーを設計した。導入されたBspE1部位は下線を引き、Bsplam1aおよびBspkap1aの配列は、それぞれ、図3Eおよび3FのFW3の初めに示されている。
Bsplam1a ATCTATGCTGCAGGAGGTGGC TCC GGA GTC TCT GAC CGA TTC TCT GG (配列番号60)
Bsplam1e ATCTATGCTGCAGGAGGTGGC TCC GGA GTC cCT GAC CGA TTC TCT GG (配列番号61)
Bsplam2 ATCTATGCTGCAGGAGGTGGC TCC GGA TCC AAG TCT GGC AAC ACG GG (配列番号62)
Bsplam3 ATCTATGCTGCAGGAGGTGGC TCC GGA ATC CCT GAG CGA TTC TCT GG (配列番号63)
BspKap1a ATCTATGCTGCAGGAGGTGGC TCC GGA GTC CCA TCA AGG TTC AGT GG (配列番号64)
BspKap1b ATCTATGCTGCAGGAGGTGGC TCC GGA GTC CCA TCA AGG TTC AGC GG (配列番号65)
BspKap2 ATCTATGCTGCAGGAGGTGGC TCC GGA GTC CCA GAC AGG TTC AGT GG (配列番号 66)
BspKap3 ATCTATGCTGCAGGAGGTGGC TCC GGA ATC CCA GcC AGG TTC AGT GG (配列番号67)
BspE1−FW3−CDR3−FW4−Not1
ファージディスプレイ技術は、繊維状ファージ105の表面上に提示され得るタンパク質およびペプチドをベースにした大きなコンビナトリアルレパートリーからのいずれか所定の標的に対する結合物質の単離を容易にする。KnotBodyライブラリーから機能性ノッチン抗体融合体を単離するために、トリプシン(EETI−IIドナーに対する同族抗原)に対する複数ラウンドのファージディスプレイ選択を実施した。トリプシン切断可能なヘルパーファージ102,106を使って、KnotBodyライブラリーをレスキューすることにより、ストレプトアビジン(ラウンド1に対し)またはニュートラアビジン(ラウンド2に対し)コートMaxisorp(商標)免疫チューブ(Thermo Scientific、カタログ番号444202)に固定された10μg/mlビオチン化トリプシンに対し、2ラウンドのファージディスプレイ選択を実施した。選択の両ラウンドにおいて、ファージライブラリーをストレプトアビジンコート常磁性ビーズ(Thermo Fisher Scientific、カタログ番号11205D)と共にプレインキュベートした。これらのビーズをファージの抗原チューブに添加する前に除去し、ストレプトアビジン結合物質が選択物質中に入るのを制限した。時間分解蛍光法(TRF)結合アッセイを使って、ラウンド2選択産物からのポリクローナルファージ調製物のトリプシン結合の分析を行った。このアッセイでは、ニュートラアビジン(Thermo Fisher Scientific、カタログ番号31000)コートMaxisorp(商標)プレート(Thermo Scientific、カタログ番号437111)に固定されたビオチン化トリプシンに対するポリクローナルファージ結合を、マウス抗M13抗体(GE Healthcare、カタログ番号27−9420−01)、続いて、ユーロピウム標識抗マウス抗体(Perkin Elmer、カタログ番号AD0124)を使って検出した。
KnotBodyの結晶構造を生成するために、EETI−II CDR2ライブラリー(表3)から単離した18個のクローンをFabとして再フォーマットした。このフォーマットでは、VH(D1A12由来)遺伝子をヒトIgG1重鎖定常ドメイン1(CH1)に融合し、EETI−IIを含むレシピエントVL鎖を軽鎖定常ドメイン(CL)に融合する。哺乳動物細胞における一時的発現による抗体発現方法は、当業者に周知である108。哺乳動物細胞中のこれらのKnotBody Fabの発現を可能とするために、プライマーLLINK2(CTCTGGCGGTGGCGCTAGC;配列番号69)およびNotMycSeq(GGCCCCATTCAGATCCTCTTCTGAGATGAG;配列番号70)を用いてノッチンをコードするVL鎖をPCR増幅した。増幅したVL遺伝子を制限酵素NheIおよびNotIで消化し、同じ酵素で予め消化したpINT12ベクター(D1A12重鎖をコードする)に連結した。pINT12ベクター(図7)は、二重プロモーター発現カセットを有し、それにより重鎖発現がサイトメガロウィルス(CMV)プロモーターにより制御され、軽鎖発現が伸長因子1アルファ(EF1−アルファ)プロモーターにより推進される。
2つの異なる標的抗原に結合できる二重特異的抗体の概念は、薬物開発においてますます一般的になってきている112。従来の二重特異的抗体は通常、異なる特異性を有する2つのVH−VL対(すなわち、それぞれ異なる抗原を認識する2つのVH−VL対)から構成されている。この実施例では、我々は、二重特異的KnotBodyフォーマットの開発について記載する。このフォーマットでは、2つの別々の抗原の認識に必要な結合決定基は、単一のVH−VL対内に組み込まれる。これは、1つの結合特異性を媒介するVH、および別の結合特異性を媒介するノッチン−VL融合体を用いて達成された。
前に記載の実施例では、我々は、ノッチン足場が、1つはレシピエント−ドナー融合体(すなわち、VL−ノッチン)上にある、もう1つはVH上にある、別々のパラトープを介して2つの異なる抗原に結合する能力を示した。同じ原理は、単一の標的抗原内の2つの異なるエピトープを標的とするように適用でき、この場合、VH誘導結合は、元の相互作用(ノッチンにより媒介される)の親和性および/または特異性を高めるために使用し得る。この手法により、VHドメインの追加の結合特性を利用して、ノッチンベース薬物の効力または特異性を改善できる。あるいは、結合に対するこのような追加の寄与は、実施例2に記載の手法を使って、VL CDR3によっても誘導され得る。この実施例では、我々は、独立にトリプシンに結合する新規重鎖パートナーを導入して、抗トリプシンKnotBody(KB_A07およびKB_A12、実施例3参照)の親和性を改善することにより、ノッチン足場の二重エピトープ結合能力を示した。
正常なイオンチャネル機能動作における異常は、疼痛性障害および自己免疫疾患を含む多くの病状の発病に関与している。例えば、電位開口型ナトリウムチャネル1.7(Nav1.7)の機能における欠陥は、疼痛に対する過敏症および非感受性の両方において大きな役割を果たしている。電位開口型カリウムチャネル1.3(Kv1.3)は、T細胞媒介自己免疫に結びつけられている。酸感受性イオンチャネル1a(ASIC1a)は、疼痛シグナルの検知および処理に関与している。したがって、イオンチャネルの特異的モジュレーターは、疼痛および種々の自己免疫障害の処置において、大きな治療可能性を提供する。多くの天然ノッチンは、イオンチャネルブロッキング毒素として機能する。前で考察のように、治療薬として承認されたノッチンベース薬物(Ziconotide)のみが、イモガイの毒液から誘導されたN型電位開口型カルシウムチャネルブロッカーである。
KnotBodyフォーマット(実施例6および7を参照)で発現されたノッチン Kv1.3およびASIC1aブロッカーを、イオンチャネル標的の機能を阻害するそれらの能力を試験した。これらのKnotBodyのヒトKv1.3(huKv1.3)またはヒトASIC1aチャネルを発現している細胞に対する効果を、QPatch自動化ホールセルパッチクランプ電気生理学法(Sophion)を用いて評価した。
本実施例は、非ノッチンドナー多様性足場ドメインのレシピエントVLドメインへの融合について記載する。ジスルフィド結合を欠く非ノッチンドナー多様性足場ドメインは、ノッチンに対する有用な代替物であり得る。前に考察したように、多くのタンパク質足場が新規結合特異性を目的として設計されてきた38,114。ここで、我々は、adhironと呼ばれる小さいタンパク質足場(約、100個のアミノ酸)を使用する。これは、植物由来フィトシスタチン(システインプロテアーゼのタンパク質阻害剤)のコンセンサス配列に基づいている。adhironは高い熱的安定性を示し、大腸菌中でよく発現する46。それらは構造上ノッチンとは別々であり、なんらシステイン残基を含まない。
実施例1で記載のドナーノッチン配列のレシピエントIgドメインへの挿入方法は、可能なドナー挿入部位としての他の足場の二次構造エレメントを連結する配列の特定に適用できる。
他の研究者により採用された、ドメイン連結のために長い可撓性リンカーを利用するペプチド融合手法とは対照的に、KnotBodyフォーマットは、短い非可撓性リンカー配列を用いて、ドナーとレシピエントドメイン間の相対運動を制限する。これは、本発明の重要な側面である。2つの融合構造ドメインの適切な折り畳みを可能とする好適なリンカーを特定するために、我々は、リンカー中に多様性を有するライブラリーを作製する手法を採用した。実施例3および実施例12では、我々は、EETI−II(ドナードメイン)をVLまたはVHドメイン(レシピエント)のフレームワーク残基と連結する、選択された短い非可撓性リンカー配列を有するいくつかの機能性KnotBody分子の単離について記載した。
実施例5および6は、KnotBodyの結合パートナードメイン内に配列多様性を生成して、追加の特異性または改善された結合動力学を有するバリアントを選択するためのVHシャッフリングの使用を示した。両実施例では、パートナードメイン(VHドメイン)に対して多様化を実施し、ドナードメイン(ノッチン)の元の結合特異性は変化しなかった。実施例2および3では、我々は、VLレシピエントドメインへの多様性の導入を示した。この実施例では、我々は、KnotBodyのドナードメイン中の配列多様性の導入に対する異なる手法:ドナーノッチン中の既存のループを、ランダムアミノ酸配列で置換する手法を示す。この特許で記載のKnotBodyのトリプシン結合能力は、ノッチンEETI−IIのループ1配列(PRILMR)により付与された。ここで、我々は、KB_A12 KnotBodyのループ1配列を可変長さ(6、8、9および10個の残基)のランダム化配列で置換して、多様性ならびに可能な結合表面を増大させた。その後、得られたループライブラリーを使い、ファージディスプレイ技術を用いて、cMETおよびβ−ガラクトシダーゼ結合特異性を生成した。
血液脳関門(BBB)の通過は、神経障害(例えば、慢性疼痛、アルツハイマー病、多発性硬化症、てんかん)を処置するためにペプチドおよび抗体を脳に送達する際の主要な課題である。例えば、循環抗体の約0.1%が脳内へ通過する(Zuchero,Y.J.Y.et al.Neuron 89 p70−82(2015))。あるいは、ジコノチド(イモガイ毒液由来のノッチン)などの治療薬は、侵入的および高価なクモ膜下腔内注射法を用いて投与される。したがって、分子をBBBを通過して送達するための有効な戦略の開発は、医薬品産業にとって長年にわたる目標となってきた(Niewoehner,J.et al.Neuron 81,49−60(2014))。近年、この研究の主要注力は、内在性栄養素輸送系、例えば、受容体介在性トランスサイトーシス(RMT)を利用することにより、薬物部分にBBBを通過させて折返し輸送できる分子の生成であった。これは通常、「分子シャトル」および活性な薬物部分を含む二重特異的フォーマットを用いて実現されている。例えば、Yuおよび共同研究者は、トランスフェリン受容体(TFR)に結合する「分子シャトル」を用いて、抗ベータ分泌酵素−1(BACE)阻害剤をBBBを通って輸送する従来の特異的抗体を報告している(Yu,Y.J.et al.Sci Transl Med 3,84ra44−84ra44(2011))。この特異的抗体フォーマットは、TFRまたはBACEを個別に認識する2つの別々のVH:VL対(すなわち、2つの異なるFabアーム)からなる。実施例5では、我々は、2つの別々の抗原の認識に必要な結合決定基が単一のVH−VL対内に組み込まれている、二重特異的KnotBodyの生成を実証した。この実施例では、我々は、TFRに対して選択されたVHドメインがそれらのパートナーノッチン−VL融合体ドメインを、RMTを介してBBBを通過して折り返し輸送する、同じフォーマットの二重特異的KnotBodyの生成について記載する。
ウシ抗体は、20Åの長さの溶媒曝露二本鎖逆平行シート(ストークと呼ばれる)を含む、3個のジスルフィド結合により安定化された折り畳まれたドメイン(ノブと呼ばれる)を提示する、天然の極めて長いVH CDR3を有するとして説明されてきた10。Zhangおよび共同研究者は、これらの極めて長いウシVH CDR3抗体(ULVC−Ab)のノブドメインが、エリスロポエチンなどの他の折り畳まれたタンパク質で置換できることを示した13。この実施例では、我々は、ウシULVC−Abの、機能性ノッチン融合体をファージ上に提示する能力をKnotBodyと比較して評価する。ノッチン−ウシUCLA融合体を生成するために、ウシULVC−Ab BLV1H12のノブ領域の最初と最後のシステインを、トリプシン結合ノッチン;EETI−IIの配列と置換した(EETI−II ウシULVC−Ab)。この構築物をコードする遺伝子断片を合成した(Integrated DNA technologies、表21)。この合成遺伝子を、制限酵素部位NcoIおよびNotIを用いて、ファージディスプレイベクターpSANG4に挿入し、大腸菌TG1細胞に形質転換した。その後、ノッチン−ウシULVC−Ab融合体の性能を、トリプシン結合アッセイを用いて、KnotBody KB_A12(これは、ノッチンEETI−IIをVL CDR2融合体として提示する)と比較した。このアッセイでは、EETI−II ウシULVC−Abからレスキューしたファージ、およびKB_A12のトリプシンに対する結合を、抗M13抗体、これに続く、ユーロピウム標識抗マウス抗体を使って検出した(実施例3で記載のように)。KnotBody KB_A12は、EET−II−ウシULVC−Ab融合体に比べて、優れたトリプシンに対する結合を示した(図25)。
実施例1、2、3、5、6、9、12および13で、ファージディスプレイ技術を用いて、KnotBodyまたは誘導体ライブラリーのディスプレイおよびそれらの選択を可能とした。ファージディスプレイに代えて、結合物質のディスプレイが、細菌、酵母および哺乳動物細胞上で実施された。これらの方法では、流動選別を使用して、結合分子の結合および発現ならびに標的への結合を測定することが可能である。このように、細胞、例えば、哺乳動物細胞の表面上のKnotBodyのライブラリーのディスプレイは、蛍光活性化セルソーター(FACS)により、最終的scFv−Fc、FabまたはIgGフォーマットの数千万個のクローンの、標的に対する増大した親和性および発現レベルのスクリーニングと選択を可能とするであろう。その他の系におけるディスプレイライブラリーの構築およびディスプレイライブラリーの使用方法は、当業者に既知である。
実施例1、2、および3は、抗体VL CDR1およびVL CDR2へのノッチンの挿入、ファージ表面上の得られたKnotBodyのディスプレイおよび機能性KnotBodyの選択を実証した。実施例1、2、および3では、可変融合体配列が、ドナーとレシピエントとの間に導入されたライブラリーが生成され、その後、これがファージディスプレイにより選択され、選別されて、機能性ノッチンのディスプレイのための最適融合体配列が特定された。この特定された短いリンカー配列は、実施例11に記載のように、機能性ノッチンのディスプレイのためには、長い可撓性リンカーより優れていた。VL CDR1またはVL CDR2へのノッチンの挿入は、VLおよびVH CDRからの追加の結合への寄与を可能とする。いくつかの用途に対しては、代替立体配置の利点が存在することがあり、この場合、ノッチンは、VHまたはVL上の代替CDRに挿入される。実施例3で記載のように、ドナーノッチンをそれぞれのCDRに連結する一部の可変融合体配列のみが、ノッチンの機能性ディスプレイを可能とする可能性がある。全ての抗体CDRで機能性ノッチンを提示することが可能であることを示すために、scFvとしてフォーマットされたD1A12のバリアント(Tape、C.J.et al.(2011)PNAS USA 108,p5578−5583)を、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2およびVL CDR3中の、ノッチン挿入物で設計した。この場合、ノッチンに隣接した2つのコドンをランダム化し、図28に示すように、「リンカーライブラリー」ノッチン構築物の生成を可能とした。親抗TACE scFv101の配列を表23に示す。さらに、KB_A07のリンカーライブラリーを生成し、図28に示すように、EETI−IIドナーノッチンをVL CDR2に挿入した。ランダム化リンカー配列を有する、ノッチンをコードするインサートを、6個のD1A12のCDRのそれぞれに挿入し、当業者に既知の標準的分子生物学技術(例えば、Schofield et al 200728)を用いて、実施例15に記載の3フラグメントアセンブリによりランダム化隣接アミノ酸を有するノッチンをVL CDR2中に挿入したKB_A07のリンカーライブラリーを生成した。実施例3に記載のように、ファージディスプレイベクターpSANG4中に挿入することにより、ファージディスプレイライブラリーを生成し(Schofield et al 2007)、トリプシンに対する結合で選択し、個々のクローンでモノクローナルファージELISAを実施した。陽性クローンを得たことにより、抗体可変重鎖および軽鎖の両方において、全てのCDRループ内でノッチンの機能性ディスプレイが可能であることが示された。
上記実施例では、シスリッチペプチド(以後では、構造およびジスルフィド結合パターンに関係なくノッチンと呼ぶ)の天然のN末端およびC末端が、抗体フレームワークに融合したNおよびC末端を有するノッチンの天然の線形配列を保持するように、抗体CDR残基中に挿入される。しかし、レシピエント抗体とドナーノッチンとの間の代替「フレーミング」戦略が可能であり、これは、ここで例示される。以下の説明では、ドナー中の逐次システイン間の配列は、「ループ」と呼ばれ、天然の順序に基づいて、1〜5と番号が付けられる。例えば、ループ1は、第1のシステインと第2のシステインとの間に伸びる。ループ5は、5番目と6番目のシステインの間に伸びる。サイクロチドなどのいくつかのシステインリッチペプチドは、環状型で見つかり、NおよびC末端はペプチド配列により連結される。例えば、MoCoTは、「線形」型(すなわち、遊離NおよびC末端を有する)または環状型で見つかることがある。環状型で、第1(N末端)および6番目(C末端)のシステインを連結する追加のペプチド配列は、「ループ6」(Jagadish et al,(2010)Peptide Science 94 p611−616)と呼ばれ、下記実施例で、元のNおよびC末端を連結するために使用される。
5−3フレーミングを有する合成EETI−IIノッチンドナー遺伝子を作製し、これを、Pml1およびMfe部位(これはPCRにより導入された)を有するPCR断片を作成して、pIONTAS1_KB_KappaおよびpIONTAS1_KB_lambda中に挿入することにより、軽鎖レシピエント中のCDR1位置を置換するのに使用した。フレームワークおよびCDR表記は、international ImMunoGeneTics Information system(IMGT)29により記載の通りである。PCRプライマーはまた、制限部位とノッチン遺伝子との間に可変アミノ酸配列を導入した。PCRプライマーPml5−3EETaおよびPml5−3EETbは、それぞれ、配列VNS(V=A、CまたはG、N=A、C、GまたはT、S=CまたはG)でコードされた3個の可変コドンをPml制限酵素部位のすぐ後ろに導入した。「VNS」縮重コドンは、それぞれのランダム化位置で、24のコドンの組み合わせから、16個のアミノ酸(システイン、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニンおよび停止コドンを除く)をコードする。Pml5−3EETbはまた、Pml5−3EETaに比べて、追加のグリシン残基をドナーとレシピエントの間に導入する。
Pml5−3EETa GTGT VNS VNS VNS TGC GGT CCG AAC GGC TTC TGC(配列番号79)
Pml5−3EETb GTGT gga VNS VNS VNS TGC GGT CCG AAC GGC TTC TGC(配列番号80)
5−3EETMfe GTCAGTCCAATTGNBSNBGCAGCCGGCCAGGCAGTCTGA(配列番号81)
ノッチンドナーは、PCRにより導入されたPst1およびBspE1部位を有するPCR断片を生成することにより、pIONTAS1_KB_lambdaおよびpIONTAS1_KB_KappaのCDR2位置に導入された。Pst1部位をIGKV1D−39Vカッパ遺伝子のCDR2領域の最初の2個の残基中(Ala−Ala配列内)に導入することが可能であった。クローニング上の便宜上、同じ制限酵素部位およびコード残基を、Vラムダ生殖系列遺伝子IGLV1−36のフレームワーク2の末端に導入した。ラムダ生殖系列ではまた、BspE1部位を、Ser−GlyをコードするFW3領域の4番目および5番目の残基中に導入することも可能であった(図3E)。再度、この制限酵素部位およびコードアミノ酸をVカッパ遺伝子中に導入した(図3F)。
PST5−3EETa ATC TAT GCT GCA GNS VNS TGC GGT CCG AAC GGC TTC TGC(配列番号82)
5−3EETBse GTCAGAGACTCCGGASNBSNBCCCGCAGCCGGCCAGGCAGTCTGA(配列番号83)。
Kv1.3は、T細胞受容体の活性化後のカルシウムシグナル伝達の維持に重要な役割を果たし、それにより、T細胞活性化、増殖およびエフェクター記憶型T(TEM)細胞のサイトカイン放出を調節する。TEM細胞は、Tリンパ球媒介自己免疫疾患の発病において重要な役割を果たし、従って、Kv1.3活性の遮断は、治療的介入ポイントとなる可能性がある。
1.Jones,P.T.,et al.Nature 321,522−525(1986).
2.Barbas,C.F.,et al.PNAS USA 90,10003−10007(1993).
3.Frederickson,S.et al.PNAS USA,14307−14312(2006).
4.Wrighton,N.C.et al.Science(New York,N.Y 273,458−464(1996).
5.Liu,T.et al.J.Am.Chem.Soc.136,10557−10560(2014).
6.Kogelberg,H.et al.Journal of molecular biology 382,385−401(2008).
7.Man,Y.K.S.et al.PLoS ONE 8,e70452(2013).
8.Saini,S.S.et al Eur.J.Immunol.29,2420−2426(1999).
9.Saini,S.S.,et al.Int.Immunol.15,845−853(2003).
10.Wang,F.et al.Cell 153,1379−1393(2013).
11.Zhang,Y.et al.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.53,132−135(2014).
12.Zhang,Y.et al..Angew.Chem.Int.Ed.Engl.52,8295−8298(2013).
13.Zhang,Y.et al.AACS Chem.Biol.8,2117−2121(2013).
14.Liu,T.et al.PNAS USA 112,1356−1361(2015).
15.Peng,Y.et al.Chem.Biol.22,1134−1143(2015).
16.Melidoni,A.N.et al.PNAS USA 110,17802−17807(2013).
17.Betton,J.M.et al.Nature(1997).
18.Collinet,B.et al.275,17428−17433(2000).
19.Ruth,N.et al.FEBS Journal 275,5150−5160(2008).
20.Vandevenne,M.et al.Protein Engineering Design and Selection 21,443−451(2008).
21.Crasson,O.et al.Protein Eng.Des.Sel.28,451−460(2015).
22.Neylon,C.Nucleic Acids Res.32,1448−1459(2004).
23.Banta,S.et al.Annu Rev Biomed Eng 15,93−113(2013).
24.Kimura,R.H.et al.PLoS ONE 6,e16112(2011).
25.Takacs,Z.et al.PNAS 106,22211−22216(2009).
26.Gui,J.et al.Curr.Biol.(2014).doi:10.1016/j.cub.2014.01.013
27.Dyson,M.R.et al.Anal Biochem 417,25−35(2011).
28.Schofield,D.J.et al..Genome biology 8,R254(2007).
29.Lefranc,M.−P.et al.Nucleic Acids Res.43,D413−22(2015).
30.Katz,B.A.e.Biochemistry 34,15421−15429(1995).
31.Katz,B.A.Annu Rev Biophys Biomol Struct 26,27−45(1997).
32.Lowman,H.B.Annu Rev Biophys Biomol Struct 26,401−424(1997).
33.Giebel,L.B.et al.Biochemistry 34,15430−15435(1995).
34.Holler,P.D.et al.PNAS USA 97,5387−5392(2000).
35.Li,Y.et al.Nat.Biotechnol.23,349−354(2005).
36.Wozniak−Knopp,G.et al.Protein Eng.Des.Sel.23,289−297(2010).
37.Ying,T.et al.Biochim.Biophys.Acta 1844,1977−1982(2014).
38.Binz,H.K.et al.Nature biotechnology 23,1257−1268(2005).
39.Skerra,A.Curr.Opin.Biotechnol.18,295−304(2007).
40.Gebauer,M.& Skerra,A.Curr Opin Chem Biol 13,245−255(2009).
41.Hufton,S.E.et al..FEBS Lett.475,225−231(2000).
42.Nord,K.et al.Nat.Biotechnol.15,772−777(1997).
43.Nygren,P.−A.& Skerra,A.J Immunol Methods 290,3−28(2004).
44.Koide,A.et al.Journal of molecular biology 415,393−405(2012).
45.Steiner,D.et al.Journal of Molecular Biology 382,1211−1227(2008).
46.Tiede,C.et al.Protein Eng.Des.Sel.27,145−155(2014).
47.Gebauer,M.& Skerra,A.Meth.Enzymol.503,157−188(2012).
48.Colas,P.et al.Nature 380,548−550(1996).
49.De Meyer,T et al.Trends Biotechnol.32,263−270(2014).
50.Shao,C.−Y.et al.Mol.Immunol.44,656−665(2007).
51.Kruziki,M.A.,et al.Chem.Biol.22,946−956(2015).
52.Nygren,P.−A.FEBS J.275,2668−2676(2008).
53.Jost,C.& Pluckthun,A.Curr.Opin.Struct.Biol.27,102−112(2014).
54.Kolmar,H.FEBS J.275,2684−2690(2008).
55.Mouhat,S.et al Current Pharmaceutical Design 14,2503−2518(2008).
56.Wang,X.et al.Nat.Struct.Biol.7,505−513(2000).
57.Gracy,J.et al.Nucleic Acids Res.36,D314−9(2008).
58.England,S.& de Groot,M.J.Br.J.Pharmacol.158,1413−1425(2009).
59.Clare,J.J.Expert Opin Investig Drugs 19,45−62(2010).
60.Kolmar,H.Expert Rev Mol Diagn 10,361−368(2010).
61.Gelly,J.−C.et al.Nucleic Acids Res.32,D156−9(2004).
62.Combelles,et al.Proteins 73,87−103(2008).
63.Heitz,A.,et al.Eur.J.Biochem.233,837−846(1995).
64.Cheek,S.et al.Journal of molecular biology 359,215−237(2006).
65.Yu,F.H.Pharmacological Reviews 57,387−395(2005).
66.Escoubas,P.Mol.Divers.10,545−554(2006).
67.Klint,J.K.et al.Toxicon 60,478−491(2012).
68.Shu,Q.et al.Protein Sci.11,245−252(2002).
69.Ueberheide,B.M.et al PNAS USA 106,6910−6915(2009).
70.Yang,S.et al.NAS USA(2013).doi:10.1073/pnas.1306285110
71.Peng,K.et al.The Journal of biological chemistry 277,47564−47571(2002).
72.Xiao,Y.et al.Mol Pharmacol 78,1124−1134(2010).
73.Crest,M.et al.The Journal of biological chemistry 267,1640−1647(1992).
74.Tudor,J.E.et al.Nat.Struct.Biol.3,317−320(1996)
75.Galat,A.,et al.FEBS J.275,3207−3225(2008).
76.McCafferty,J et al.Nature 348,552−554
77.Hoogenboom,H.R.et al.Nucleic Acids Res.19,4133−4137(1991).
78.Zhang,H.et al.PNAS USA 109,15728−15733(2012).
79.Xie,J.et al.PNAS USA 110,8099−8104(2013).
80.Nishimiya,D.Appl.Microbiol.Biotechnol.98,1031−1042(2014).
81.Vendel,M.C.et al.Arch.Biochem.Biophys.526,188−193(2012).
82.Bagal,S.K.et al.J.Med.Chem.56,593−624(2013).
83.Hubner,C.A.& Jentsch,T.J.Hum.Mol.Genet.11,2435−2445(2002).
84.Jentsch,T.J.,et al.Nat.Cell Biol.6,1039−1047(2004).
85.Lu,Q.& An,W.F.Combinatorial chemistry & high throughput screening 11,185−194(2008).
86.Tate,C.G..FEBS Lett.504,94−98(2001).
87.Shintre,C.A.et al.PNAS USA 110,9710−9715(2013).
88.Suharni et al.Monoclon Antib Immunodiagn Immunother 33,378−385(2014).
89.Pavlidou,M.et al..PLoS ONE 8,e72272(2013).
90.Tillotson,B.J.et al..Protein Eng.Des.Sel.26,101−112(2013).
91.Zhang,H.et al.Chem.Biol.20,734−741(2013).
92.Gunasekera,S.et al.J.Med.Chem.51,7697−7704(2008).
93.Keller,T.et al..PLoS ONE 10,e0127169(2015).
94.Jung,S.& Pluckthun,A.Protein Eng.10,959−966(1997).
95.Akerstrom,B.et al.J Immunol Methods 177,151−163(1994).
96.Jespers,L et al.Nat.Biotechnol.22,1161−1165(2004).
97.Richler,E.et al.Nature methods 5,87−93(2007).
98.Podust,V.N.et al.J Control Release(2015).doi:10.1016/j.jconrel.2015.10.038
99.Schlapschy,M.et al.Protein Eng.Des.Sel.26,489−501(2013).
100.Pershad,K.et al.Protein Engineering Design and Selection 23,279−288(2010).
101.Tape,C.J.et al.PNAS USA 108,5578−5583(2011).
102.Vaughan,T.J.et al.Nature biotechnology 14,309−314(1996).
103.Favel,A.et al.Int.J.Pept.Protein Res.33,202−208(1989).
104.Chiche,L.et al.Current Protein & Peptide Science 5,341−349
105.Azzazy,H.M.E.& Highsmith,W.E..Clin.Biochem.35,425−445(2002).
106.Goletz,S.et al..Journal of molecular biology 315,1087−1097(2002).
107.Lee,C.M.Y.,et al.Nature Protocols 2,3001−3008(2007).
108.Hacker,D.L.et al.Protein expression and purification 92,67−76(2013).
109.Phaser crystallographic software.40,658−674(2007).
110.PHENIX:a comprehensive Python−based system for macromolecular structure solution.66,213−221(2010).
111.Afonine,P.V.et al.Acta Crystallogr.D Biol.Crystallogr.68,352−367(2012).
112.Spiess,C.Mol.Immunol.67,95−106(2015).
113.Falk,R.et al.Methods 58,69−78(2012).
114.Hosse,R.J.et al.Protein Sci.15,14−27(2006).
115.Fernandez−Suarez,X.M.,et al.Nucleic Acids Res.42,D1−6(2014).
116.Rocha,L..Journal of Molecular Structure(2014).
117.Dickinson,C.D.et al.Journal of molecular biology 236,1079−1092(1994).
118.Dawson,R.J.P.et al.Nat Commun 3,936(2012).
119.Hernandez et al Biochemistry 39(19),5722−5730(2000)
120.Obermeier,B et al.Nat Med 19,1584−1596(2013))
121.Ubogu,E.E..J.Vasc.Res.50,289−303(2013)).
122.Diochot S et al,Nature 490,552−555(2012).
123.Kawahara,M.et al Biochem Biophys Res Commun,315,132−138.(2004)
124.Kawahara,M.et al Journal of Biotechnology,133,154−161 .(2008).
125.Kawahara,M.et al Cytokine,55,402−408.(2011)
Claims (127)
- スクリーニング方法であって、
(i)結合メンバーの親ライブラリーを用意することであって、前記ライブラリー中のそれぞれの結合メンバーが融合タンパク質および必要に応じて、前記融合タンパク質と結合したパートナードメインを含み、
前記融合タンパク質が、レシピエント多様性足場ドメイン中に挿入されたドナー多様性足場ドメインを含み、必要に応じて、前記ドナー多様性足場ドメインのNおよびC末端が、4個までのアミノ酸のリンカーを用いて、前記レシピエント多様性足場ドメインに連結されており、
前記ドナー多様性足場ドメインがドナー足場およびドナー相互作用配列を含み、前記レシピエント多様性足場ドメインがレシピエント足場およびレシピエント相互作用配列を含み、前記ドナー相互作用配列、前記レシピエント相互作用配列および前記リンカーの内の1つ、2つまたは3つ全てが、前記親ライブラリー中で多様性を有すること、
(ii)結合活性を示す結合メンバーで前記ライブラリーをスクリーニングすること、および
(iii)結合活性を示す、前記親ライブラリー中の1個または複数の結合メンバーを特定すること、を含む、方法。 - 前記親ライブラリー中の結合メンバーが多様なドナー相互作用配列および元のままのレシピエント相互作用配列を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記親ライブラリー中の結合メンバーが多様なレシピエント相互作用配列および元のままのドナー相互作用配列を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記親ライブラリー中の結合メンバーが多様なレシピエントおよびドナー相互作用配列を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記親ライブラリー中の結合メンバーが多様なリンカー配列を有する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記親ライブラリー中の結合メンバーが元のままのレシピエントおよびドナー相互作用配列を有する、請求項5に記載の方法。
- 下記により前記1個または複数の結合メンバーをさらに濃縮することを含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法:
(a)前記1個または複数の結合メンバーを回収すること、
(b)前記回収した結合メンバーを前記結合活性による選択に供すること、
(c)前記1個または複数の選択された結合メンバーを回収すること、
(d)必要に応じて、ステップ(b)および(c)を1回または複数回繰り返すこと。 - 下記をさらに含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法:
(iv)1個または複数の特定された親結合メンバーのアミノ酸配列中の、1個または複数の位置に多様なアミノ酸残基を導入し、結合メンバーの改変ライブラリーを生成すること、
(v)前記改変ライブラリーから結合活性を示す改変結合メンバーをスクリーニングすること、および
(vi)前記改変ライブラリー中の、前記結合活性を示す1個または複数の改変結合メンバーを特定すること。 - 前記多様なアミノ酸が、ランダム変異誘発または部位特異的変異誘発により導入される、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記1個または複数の位置が、前記1個または複数の特定された結合メンバーのドナー足場、ドナー相互作用配列、レシピエント足場、レシピエント相互作用配列、リンカーまたはパートナードメインのアミノ酸配列内にある、請求項8または請求項9に記載の方法。
- 前記1個または複数の改変結合メンバーの結合活性が、ステップ(iii)で特定された前記1個または複数の親結合メンバーに比べて改善されている、請求項8〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 下記により前記1個または複数の結合メンバーをさらに濃縮することを含む、請求項8〜11のいずれか1項に記載の方法:
(e)前記1個または複数の改変結合メンバーを回収すること、
(f)前記回収した改変結合メンバーを前記結合活性による選択に供すること、
(g)前記1個または複数の選択された結合メンバーを回収すること、および
(h)必要に応じて、ステップ(f)および(g)を1回または複数回繰り返すこと。 - 前記1個または複数の特定された結合メンバーまたは改変結合メンバー中のドナー多様性足場ドメインを、代わりのドナー多様性足場ドメインで置換することを含む、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ドナー多様性足場ドメインおよび前記代わりのドナー多様性足場ドメインが、同じ足場クラスを含む、請求項13に記載の方法。
- 前記ドナー多様性足場ドメインおよび前記代わりのドナー多様性足場ドメインが、同じドナー足場および異なるドナー相互作用配列を含む、請求項14に記載の方法。
- 前記ドナー多様性足場ドメインおよび前記代わりのドナー多様性足場ドメインが、両方ともノッチンである、請求項14または請求項15に記載の方法。
- 前記ドナー多様性足場および前記代わりのドナー多様性足場が、異なるドナー足場および異なるドナー相互作用配列を含む、請求項14に記載の方法。
- 前記代わりのドナー多様性足場が、多様な相互作用配列を含む、請求項13〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 下記を含む、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法:
(vii)前記1個または複数の特定された結合メンバーまたは改変結合メンバー由来の前記融合タンパク質を、結合パートナーの多様性集団と結合させて、結合メンバーのシャッフルライブラリーを生成すること、
(viii)前記シャッフルライブラリーから結合活性を示すシャッフル結合メンバーをスクリーニングすること、
(ix)前記結合活性を示す1個または複数のシャッフル結合メンバーを特定すること。 - 下記により前記1個または複数のシャッフル結合メンバーをさらに濃縮することを含む、請求項19に記載の方法:
(i)前記1個または複数のシャッフル結合メンバーを回収すること、
(j)前記回収したシャッフル結合メンバーを前記結合活性による選択に供すること、
(k)前記1個または複数の選択された結合改変メンバーを回収すること、および
(l)必要に応じて、ステップ(j)および(k)を1回または複数回繰り返すこと。 - 前記シャッフル結合メンバーの結合活性が、ステップ(iii)および/またはステップ(vi)で特定された前記1個または複数の結合メンバーに比べて改善されている、請求項19、または請求項20に記載の方法。
- 追加のアミノ酸配列を、前記親ライブラリー、改変ライブラリーおよび/またはシャッフルライブラリー由来の前記1個または複数の特定された結合メンバーの前記融合タンパク質またはパートナードメイン中に導入することを含む、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記追加のアミノ酸配列が標的結合配列である、請求項22に記載の方法。
- 前記融合タンパク質のドナーおよびレシピエントの両方の多様性足場が、前記融合タンパク質の結合活性に寄与する、請求項1〜23のいずれか1項に記載の方法。
- 前記結合活性が標的分子への結合である、請求項1〜24のいずれか1項に記載の方法。
- 前記結合メンバーが、前記標的分子のアンタゴニストまたは阻害剤である、請求項25に記載の方法。
- 前記結合メンバーが、前記標的分子のアゴニスト、エンハンサーまたは活性化因子である、請求項25に記載の方法。
- 前記ドナー多様性足場ドメイン、レシピエント多様性足場ドメインおよびパートナードメインの内の1個が、前記標的分子に結合し、前記方法が、前記1個または複数の特定された結合メンバー中のドナー多様性足場ドメイン、レシピエント多様性足場ドメインまたはパートナードメインを改変するまたは置換することを含む、請求項1〜27のいずれか1項に記載の方法。
- 前記親ライブラリー、改変ライブラリーまたはシャッフルライブラリーが、前記ライブラリー中の結合メンバーの標的分子に対する結合を測定することにより選別され、前記標的分子および前記親ライブラリー、改変ライブラリーまたはシャッフルライブラリーの内の1つが固定される、請求項1〜28のいずれか1項に記載の方法。
- 前記親ライブラリー、改変ライブラリーまたはシャッフルライブラリーが、レポーター細胞中で前記ライブラリーを発現させて、変化した表現型を有する1個または複数のレポーター細胞を特定することによりスクリーニングされる、請求項1〜29のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的分子または変化した表現型への結合が、フローサイトメトリー、免疫組織化学またはELISAにより検出される、請求項29または30に記載の方法。
- 前記1個または複数の特定された結合メンバーを安定性による選択に供することをさらに含む、請求項1〜31のいずれか1項に記載の方法。
- 前記親ライブラリー、改変ライブラリーおよび/またはシャッフルライブラリーを、前記ドナー多様性足場および/または前記レシピエント多様性足場が活性な高次構造をとっている結合メンバーでの選択に供することを含む、請求項1〜32のいずれか1項に記載の方法。
- 前記レシピエント多様性足場ドメインが、免疫グロブリン配列であり、前記方法が、免疫グロブリン結合分子を使って前記ライブラリーをスクリーニングすることをさらに含む、請求項33に記載の方法。
- 前記免疫グロブリン結合分子が、プロテインL、プロテインAまたは抗Ig抗体または抗体断片である、請求項34に記載の方法。
- 前記ライブラリー、前記改変ライブラリーおよび/または前記シャッフルライブラリー由来の1個または複数の特定された結合メンバーを単離および/または精製することを含む、請求項1〜35のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ライブラリー中の結合メンバーが、前記結合メンバーをコードする核酸を含むリボソーム、細胞またはウイルスの表面上に提示される、請求項1〜36のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ライブラリー、前記改変ライブラリーおよび/または前記シャッフルライブラリー由来の前記1個または複数の特定された結合メンバーを提示する前記リボソーム、細胞またはウイルスを単離および/または精製することを含む、請求項1〜37のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ライブラリー、前記改変ライブラリーおよび/または前記シャッフルライブラリー由来の前記1個または複数の特定された結合メンバーをコードする前記核酸を単離および/または精製することを含む、請求項37または38に記載の方法。
- 前記ライブラリー、前記改変ライブラリーおよび/または前記シャッフルライブラリー由来の前記1個または複数の特定された結合メンバーをコードする前記核酸を増幅および/またはクローニングすることを含む、請求項37〜39のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ライブラリー、前記改変ライブラリーおよび/または前記シャッフルライブラリー由来の前記1個または複数の特定された結合メンバーをコードする前記核酸をシーケンシングすることを含む、請求項37〜40のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ライブラリー、前記改変ライブラリーおよび/または前記シャッフルライブラリー由来の1個または複数の特定された結合メンバーを合成または組み換え発現させることを含む、請求項1〜41のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ライブラリー、改変ライブラリーおよび/またはシャッフルライブラリーから特定された前記1個または複数の結合メンバーの、前記標的分子の活性に対する効果を測定することを含む、請求項1〜42のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的分子が、イオンチャネルであり、前記1個または複数の特定された結合メンバーの、前記チャネルを通るイオン流に対する効果が測定される、請求項43に記載の方法。
- 前記親ライブラリー、前記改変ライブラリーおよび/または前記シャッフルライブラリー由来の1個または複数の特定された結合メンバーから単離されたドナー多様性足場ドメインを合成または組み替え発現させることを含む、請求項1〜44のいずれか1項に記載の方法。
- 1個または複数の前記特定された結合メンバーを、scFv、Fab、scFv−Fc、Fc、IgA、IgD、IgMまたはIgGとして再フォーマットすることを含む、請求項1〜45のいずれか1項に記載の方法。
- 治療薬部分、半減期延長部分または検出可能な標識を、前記1個または複数の特定された結合メンバーに付加することを含む、請求項1〜46のいずれか1項に記載の方法。
- 前記親ライブラリー、前記改変ライブラリーおよび/または前記シャッフルライブラリーまたは前記単離されたドナー多様性足場ドメイン由来の前記1個または複数の特定された結合メンバーを、薬学的に許容可能な賦形剤と共に処方することを含む、請求項1〜47のいずれか1項に記載の方法。
- 結合メンバーのライブラリー生成方法であって、
レシピエント多様性足場ドメインに挿入されたドナー多様性足場ドメインを含む融合タンパク質の多様性集団をコードする核酸の集団を用意することであって、
前記ドナー多様性足場ドメインがドナー足場およびドナー相互作用配列を含み、前記レシピエント多様性足場ドメインがレシピエント足場およびレシピエント相互作用配列を含み、必要に応じて、前記ドナー多様性足場ドメインのNおよびC末端が、4個までのアミノ酸リンカーを用いて前記レシピエント多様性足場ドメインに連結されて、前記ドナー相互作用配列、前記レシピエント相互作用配列および前記リンカーの内の1つ、2つまたは3つ全てが、前記集団中で多様性を有すること、
前記核酸集団を発現させて、前記多様性集団を生成すること、および
必要に応じて、前記融合タンパク質をパートナードメインの集団と結合させて、それにより、結合メンバーのライブラリーを生成すること、を含む、方法。 - 前記核酸が、細胞中でまたは無細胞のリボソーム中で発現される、請求項49に記載の方法。
- 前記細胞が原核細胞である、請求項50に記載の方法。
- 前記細胞が真核細胞である、請求項50に記載の方法。
- 前記真核細胞が、植物、酵母、昆虫または哺乳動物細胞である、請求項52に記載の方法。
- 結合メンバーのライブラリーであって、
レシピエント多様性足場ドメインに挿入されたドナー多様性足場ドメインを含む融合タンパク質の多様性集団を含み、
前記ドナー多様性足場ドメインがドナー足場およびドナー相互作用配列を含み、前記レシピエント多様性足場ドメインがレシピエント足場およびレシピエント相互作用配列を含み、必要に応じて、前記ドナー多様性足場ドメインのNおよびC末端が、4個までのアミノ酸リンカーを用いて前記レシピエント多様性足場ドメインに連結され、
前記ドナー相互作用配列、前記レシピエント相互作用配列および前記リンカーの内の1つ、2つまたは3つ全てが、前記集団中で多様性を有し、
必要に応じて、前記融合タンパク質が結合パートナーに結合してヘテロダイマーを形成する、ライブラリー。 - 結合メンバーが下記を含む、請求項54に記載のライブラリー:
(i)多様なドナー相互作用配列および元のままのレシピエント相互作用配列、
(ii)多様なレシピエント相互作用配列および元のままのドナー相互作用配列、または
(iii)多様なレシピエントおよびドナー相互作用配列。 - 前記ライブラリー中の結合メンバーが多様なリンカー配列を有する、請求項55に記載のライブラリー。
- 前記ライブラリー中の結合メンバーが元のままのレシピエントおよびドナー相互作用配列ならびに多様なリンカー配列を有する、請求項56に記載のライブラリー。
- 前記ライブラリー中の結合メンバーが多様なパートナードメインを有する、請求項54〜57のいずれか1項に記載のライブラリー。
- 請求項49〜53のいずれか1項に記載の方法により生成される、請求項54〜58のいずれか1項に記載のライブラリー。
- 前記ライブラリー中のそれぞれの結合メンバーが、前記結合メンバーをコードする核酸を含むリボソーム、細胞またはウイルスの表面上に提示される、請求項49〜59のいずれか1項に記載の方法またはライブラリー。
- 前記結合メンバーが、バクテリオファージまたは真核細胞の表面上に提示される、請求項60に記載の方法またはライブラリー。
- 前記結合メンバーの前記融合タンパク質が、繊維状ファージのコートタンパク質に融合される、請求項54〜61のいずれか1項に記載の方法またはライブラリー。
- レシピエント多様性足場ドメイン中に挿入されたドナー多様性足場ドメインを含む融合タンパク質であって、前記ドナー多様性足場ドメインがドナー足場およびドナー相互作用配列を含み、前記レシピエント多様性足場ドメインがレシピエント足場およびレシピエント相互作用配列を含む、融合タンパク質。
- 請求項63に記載の融合タンパク質およびパートナードメインを含む、結合メンバー。
- 結合メンバーの生成方法であって、
ドナー多様性足場ドメインをコードする核酸を、レシピエント多様性足場ドメインをコードする核酸に挿入して、融合タンパク質をコードするキメラ核酸を生成することであって、
前記ドナー多様性足場ドメインがドナー足場およびドナー相互作用配列を含み、前記レシピエント多様性足場ドメインがレシピエント足場およびレシピエント相互作用配列を含むこと、
前記キメラ核酸を発現させて、前記融合タンパク質を生成すること、および
必要に応じて、前記融合タンパク質をパートナードメインに付加すること、を含む、方法。 - 前記結合メンバーまたは融合タンパク質が、前記単離されたドナー多様性足場ドメインに比べて、改善されたインビボ半減期を有する、請求項1〜65のいずれか1項に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
- 前記融合タンパク質が、共有結合または非共有結合を介して、前記パートナードメインに結合される、請求項1〜66のいずれか1項に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
- 前記融合タンパク質のレシピエント多様性足場ドメインが、パートナードメインに結合される、請求項67に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
- 前記融合タンパク質のドナー多様性足場ドメインが、パートナードメインに結合される、請求項67に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
- 前記結合メンバーがヘテロダイマーである、請求項1〜69のいずれか1項に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
- 前記結合メンバーが複数のパートナードメインを含む、請求項1〜69のいずれか1項に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
- 前記結合メンバーがマルチマーである、請求項71に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
- 前記ドナーおよびレシピエント多様性足場ドメインの相互作用配列が、標的分子の同じエピトープと相互作用する、請求項1〜72のいずれか1項に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
- 前記融合タンパク質および前記パートナードメインが、同じ標的分子に結合する、請求項1〜73のいずれか1項に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
- 前記標的分子が膜内在性タンパク質である、請求項1〜74のいずれか1項に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
- 前記膜内在性タンパク質がイオンチャネル、GPCRまたはI型受容体である、請求項75に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
- 前記結合メンバーが第1の標的分子および第2の標的分子に結合する、請求項1〜76のいずれか1項に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
- 前記融合タンパク質および前記パートナードメインの内の1つが第1の標的分子に結合し、前記融合タンパク質および前記パートナードメインのもう一方が第2の標的分子に結合する、請求項1〜76のいずれか1項に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
- 前記標的分子が同じ細胞の表面上にある、請求項77または請求項78に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
- 前記結合メンバーの前記第1の標的分子への結合が、前記結合メンバーの前記第2の標的分子への結合を高める、請求項79に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
- 前記第1の標的分子が、血液脳関門受容体または血液神経関門受容体である、請求項77〜80のいずれか1項に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
- 片方または両方の多様性足場ドメインが、複数のジスルフィド結合を含む、請求項1〜81のいずれか1項に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
- 前記レシピエント多様性足場ドメインが、免疫グロブリン、免疫グロブリンドメイン、VHドメイン、VLドメイン、ノッチン、プロテインA、「設計アンキリンリピートタンパク質」(DARPin)、adhiron、フィブロネクチンドメイン、アンチカリンおよびT7ファージ遺伝子2タンパク質(Gp2)からなる群から選択される、請求項1〜82のいずれか1項に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
- 前記レシピエント多様性足場ドメインが、免疫グロブリンの全体またはその一部である、請求項83に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
- 前記レシピエント多様性足場ドメインが、抗体可変ドメインの全体またはその一部である、請求項84に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
- 前記レシピエント多様性足場ドメインが、抗体軽鎖可変(VL)ドメインである、請求項85に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
- 前記抗体軽鎖可変(VL)ドメインが、表23に示すアミノ酸配列(配列番号270)またはそのバリアントである、請求項86に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
- 前記パートナードメインが、抗体重鎖可変(VH)ドメインである、請求項86または87に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
- 前記抗体重鎖可変(VH)ドメインが、表20に示すアミノ酸配列(配列番号249〜257)またはそのバリアントを有する、請求項88に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
- 前記レシピエント多様性足場ドメインが、抗体重鎖可変(VH)ドメインである、請求項85に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
- 前記パートナードメインが、抗体軽鎖可変(VL)ドメインである、請求項90に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
- 前記VLドメインおよび前記VHドメインが可撓性リンカーにより連結されている、請求項88または請求項91に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
- 前記ドナー多様性足場ドメインが、前記抗体可変ドメインのVH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2またはVL CDR3の全体またはその一部を置換する、請求項83〜90のいずれか1項に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
- 前記ドナー多様性足場ドメインが、前記抗体VLドメインのCDR1またはCDR2の全体またはその一部を置換する、請求項91に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
- 前記ドナー多様性足場ドメインの相互作用配列および前記抗体可変ドメインの1個または複数のCDRが、前記標的分子の同じエピトープと相互作用する、請求項85〜94のいずれか1項に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
- 前記ドナー多様性足場ドメインの相互作用配列および前記抗体可変ドメインのCDR3が、前記標的分子の同じエピトープと相互作用する、請求項95に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
- 前記ドナー多様性足場ドメインが、少なくとも15個のアミノ酸、好ましくは少なくとも20個のアミノ酸からなる、請求項1〜96のいずれか1項に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
- 前記ドナー多様性足場ドメインが、免疫グロブリン、免疫グロブリンドメイン、VHドメイン、VLドメイン、プロテインA、毒液ペプチドまたはノッチンなどのシステインリッチペプチド、「設計アンキリンリピートタンパク質」(DARPin)、adhiron、フィブロネクチンドメイン、アンチカリンおよびT7ファージ遺伝子2タンパク質(Gp2)からなる群から選択される、請求項1〜97のいずれか1項に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
- 前記ドナー多様性足場ドメインが、システインリッチペプチドである、請求項98に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
- ドナー多様性足場ドメインが、毒液ペプチドである、請求項99に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
- 前記ドナー多様性足場ドメインがノッチンである、請求項97〜100のいずれか1項に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
- 前記ノッチンが、テッポウウリトリプシン阻害剤−II(EETI−II)、KCoTI−II、Huwentoxin−IV、ProTx−II、SSm6a、カリオトキシン,MoKa−1、Shk、PcTx1およびコノトキシン−ω、またはこれらのバリアントである、請求項101に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
- 前記ドナー多様性足場ドメインの天然のNおよびC末端が、前記レシピエント多様性足場ドメインに連結されている、請求項97〜102のいずれか1項に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
- 前記ノッチンが、表17A(配列番号211〜233)、表17B(配列番号234〜244)、または図29(配列番号342)に示すアミノ酸配列またはそれらのバリアントを含む、請求項103に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
- 前記レシピエント多様性足場ドメインが、表1に示すレシピエント結合ドメインのアミノ酸配列を含み、必要に応じて、前記リンカーが、表1に示すリンカーのアミノ酸配列を含む、請求項97〜104のいずれか1項に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
- 前記融合タンパク質が、表1(配列番号84〜139)または表8B(配列番号31〜35)に示すアミノ酸配列またはそれらのバリアントを含む、請求項103〜105のいずれか1項に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
- 前記ドナー多様性足場ドメインの環化および直線化により生成された人工のNおよびC末端が、前記レシピエント多様性足場ドメインに連結されている、請求項97〜102のいずれか1項に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
- 前記ドナー多様性足場ドメインが、表28(配列番号302〜307)に示すアミノ酸配列またはそのバリアントを含むノッチンである、請求項107に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
- 前記融合タンパク質が、表29(配列番号308〜317)または図29(配列番号349および351)に示すアミノ酸配列またはそれらのバリアントを含む、請求項107または108に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
- 前記結合メンバーがパートナードメインを含み、前記パートナードメインがVHドメインである、請求項106または請求項109に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
- 前記ドナー多様性足場ドメインが、adhironである、請求項97または86に記載の方法、ライブラリー、融合タンパク質または結合メンバー。
- 請求項63〜66のいずれか1項に記載の融合タンパク質または請求項64および66〜111のいずれか1項に記載の結合メンバーをコードする核酸。
- 請求項112に記載の核酸をコードするベクター。
- 融合タンパク質または結合メンバーの生成方法であって、
請求項112に記載の核酸を発現させることを含む、方法。 - 請求項54〜62および65〜111のいずれか1項に記載のライブラリーをコードする核酸の集団。
- 前記ライブラリーをコードする核酸が発現ベクター中に含まれている、請求項115に記載の集団。
- 請求項54〜62および65〜111のいずれか1項に記載のライブラリーおよび/または請求項115または請求項116に記載の集団を含むウイルス粒子の集団。
- 請求項54〜62および65〜111のいずれか1項に記載のライブラリーまたは請求項115もしくは請求項116に記載の集団を含む宿主細胞の集団。
- 請求項63および66〜111のいずれか1項に記載の融合タンパク質または請求項64および66〜111のいずれか1項に記載の、毒素、治療薬部分、半減期延長部分または検出可能標識に融合または結合した結合メンバー。
- 請求項63、66〜111および119のいずれか1項に記載の融合タンパク質または請求項64、66〜111および119のいずれか1項に記載の結合メンバーならびに薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物。
- 薬物として使用するための、請求項63、66〜111および119のいずれか1項に記載の融合タンパク質または請求項64、66〜111および119のいずれか1項に記載の結合メンバーまたは請求項120に記載の組成物。
- イオンチャネル機能障害に関連するまたはイオンチャネル機能障害により特徴付けられる疾患または状態の処置に使用するための、請求項63、66〜111および119のいずれか1項に記載の融合タンパク質または請求項64、66〜111および119のいずれか1項に記載の結合メンバーまたは請求項120に記載の組成物。
- 前記疾患または状態が、疼痛、癌、感染症、または自己免疫疾患である、請求項122に記載の融合タンパク質、結合メンバーまたは組成物。
- イオンチャネル機能障害に関連するまたはイオンチャネル機能障害により特徴付けられる疾患または状態の処置のための薬物の製造における、請求項63、66〜111および119のいずれか1項に記載の融合タンパク質または請求項64、66〜111および119のいずれか1項に記載の結合メンバーまたは請求項120に記載の組成物の使用。
- 前記疾患または状態が、疼痛、癌、感染症、または自己免疫疾患である、請求項124に記載の使用。
- イオンチャネル機能障害に関連するまたはイオンチャネル機能障害により特徴付けられる疾患または状態の処置方法であって、請求項63、66〜111および119のいずれか1項に記載の融合タンパク質または請求項64、66〜111および119のいずれか1項に記載の結合メンバーまたは請求項120に記載の組成物の、それを必要としている個体への投与を含む、方法。
- 疼痛または自己免疫疾患の処置のための、請求項126に記載の処置方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2022047896A JP2022084834A (ja) | 2016-01-08 | 2022-03-24 | 多様性を変化させた足場ドメインを有する結合メンバー |
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB1600341.0 | 2016-01-08 | ||
GBGB1600341.0A GB201600341D0 (en) | 2016-01-08 | 2016-01-08 | Diversity scaffolds |
GB1621070.0 | 2016-12-12 | ||
GBGB1621070.0A GB201621070D0 (en) | 2016-12-12 | 2016-12-12 | Diversity scaffolds |
PCT/EP2017/050337 WO2017118761A1 (en) | 2016-01-08 | 2017-01-09 | Binding members with altered diversity scaffold domains |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2022047896A Division JP2022084834A (ja) | 2016-01-08 | 2022-03-24 | 多様性を変化させた足場ドメインを有する結合メンバー |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2019505206A true JP2019505206A (ja) | 2019-02-28 |
JP2019505206A5 JP2019505206A5 (ja) | 2020-02-13 |
JP7308505B2 JP7308505B2 (ja) | 2023-07-14 |
Family
ID=57868216
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018535425A Active JP7308505B2 (ja) | 2016-01-08 | 2017-01-09 | 多様性を変化させた足場ドメインを有する結合メンバー |
JP2022047896A Pending JP2022084834A (ja) | 2016-01-08 | 2022-03-24 | 多様性を変化させた足場ドメインを有する結合メンバー |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2022047896A Pending JP2022084834A (ja) | 2016-01-08 | 2022-03-24 | 多様性を変化させた足場ドメインを有する結合メンバー |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20190256840A1 (ja) |
EP (2) | EP3277810B8 (ja) |
JP (2) | JP7308505B2 (ja) |
KR (1) | KR20180100132A (ja) |
CN (1) | CN108473987B (ja) |
AU (1) | AU2017205706B2 (ja) |
BR (1) | BR112018013883A2 (ja) |
CA (1) | CA3010231A1 (ja) |
GB (1) | GB2562933B (ja) |
SG (1) | SG11201805493YA (ja) |
WO (1) | WO2017118761A1 (ja) |
Families Citing this family (23)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR102423377B1 (ko) | 2013-08-05 | 2022-07-25 | 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 | 드 노보 합성된 유전자 라이브러리 |
CA2975852A1 (en) | 2015-02-04 | 2016-08-11 | Twist Bioscience Corporation | Methods and devices for de novo oligonucleic acid assembly |
WO2016172377A1 (en) | 2015-04-21 | 2016-10-27 | Twist Bioscience Corporation | Devices and methods for oligonucleic acid library synthesis |
CN108368482A (zh) | 2015-09-18 | 2018-08-03 | 特韦斯特生物科学公司 | 寡核酸变体文库及其合成 |
KR20180058772A (ko) | 2015-09-22 | 2018-06-01 | 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 | 핵산 합성을 위한 가요성 기판 |
CN108603307A (zh) | 2015-12-01 | 2018-09-28 | 特韦斯特生物科学公司 | 功能化表面及其制备 |
JP6854340B2 (ja) | 2016-08-22 | 2021-04-07 | ツイスト バイオサイエンス コーポレーション | デノボ合成された核酸ライブラリ |
KR102217487B1 (ko) | 2016-09-21 | 2021-02-23 | 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 | 핵산 기반 데이터 저장 |
EA201991262A1 (ru) | 2016-12-16 | 2020-04-07 | Твист Байосайенс Корпорейшн | Библиотеки вариантов иммунологического синапса и их синтез |
EP3586255A4 (en) | 2017-02-22 | 2021-03-31 | Twist Bioscience Corporation | NUCLEIC ACID-BASED DATA STORAGE |
WO2018170169A1 (en) | 2017-03-15 | 2018-09-20 | Twist Bioscience Corporation | Variant libraries of the immunological synapse and synthesis thereof |
CA3066744A1 (en) | 2017-06-12 | 2018-12-20 | Twist Bioscience Corporation | Methods for seamless nucleic acid assembly |
WO2018231864A1 (en) | 2017-06-12 | 2018-12-20 | Twist Bioscience Corporation | Methods for seamless nucleic acid assembly |
CA3075505A1 (en) | 2017-09-11 | 2019-03-14 | Twist Bioscience Corporation | Gpcr binding proteins and synthesis thereof |
GB2583590A (en) | 2017-10-20 | 2020-11-04 | Twist Bioscience Corp | Heated nanowells for polynucleotide synthesis |
JP7191448B2 (ja) | 2018-01-04 | 2022-12-19 | ツイスト バイオサイエンス コーポレーション | Dnaベースのデジタル情報ストレージ |
AU2019270243A1 (en) | 2018-05-18 | 2021-01-07 | Twist Bioscience Corporation | Polynucleotides, reagents, and methods for nucleic acid hybridization |
CN109106942B (zh) * | 2018-09-18 | 2019-11-22 | 深圳瑞健生物科技有限公司 | 一种可通过血脑屏障的多肽在制备药物中的应用 |
SG11202109283UA (en) | 2019-02-26 | 2021-09-29 | Twist Bioscience Corp | Variant nucleic acid libraries for antibody optimization |
WO2020176678A1 (en) | 2019-02-26 | 2020-09-03 | Twist Bioscience Corporation | Variant nucleic acid libraries for glp1 receptor |
CN114729342A (zh) | 2019-06-21 | 2022-07-08 | 特韦斯特生物科学公司 | 基于条形码的核酸序列装配 |
WO2023016454A1 (en) * | 2021-08-12 | 2023-02-16 | The University Of Hong Kong | Materials and methods to comprehensively define adaptive immune responses |
CN115035947B (zh) * | 2022-06-10 | 2023-03-10 | 水木未来(北京)科技有限公司 | 蛋白质结构建模方法及装置、电子设备和存储介质 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2014504270A (ja) * | 2010-11-08 | 2014-02-20 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー | 改変ノッチンペプチドを含む融合タンパク質及びその使用 |
WO2015166272A2 (en) * | 2014-05-02 | 2015-11-05 | Iontas Limited | Preparation of libraries of protein variants expressed in eukaryotic cells and use for selecting binding molecules |
Family Cites Families (28)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4275149A (en) | 1978-11-24 | 1981-06-23 | Syva Company | Macromolecular environment control in specific receptor assays |
US4318980A (en) | 1978-04-10 | 1982-03-09 | Miles Laboratories, Inc. | Heterogenous specific binding assay employing a cycling reactant as label |
GB9206318D0 (en) | 1992-03-24 | 1992-05-06 | Cambridge Antibody Tech | Binding substances |
US6172197B1 (en) | 1991-07-10 | 2001-01-09 | Medical Research Council | Methods for producing members of specific binding pairs |
GB9015198D0 (en) | 1990-07-10 | 1990-08-29 | Brien Caroline J O | Binding substance |
US5962255A (en) | 1992-03-24 | 1999-10-05 | Cambridge Antibody Technology Limited | Methods for producing recombinant vectors |
US6492160B1 (en) | 1991-05-15 | 2002-12-10 | Cambridge Antibody Technology Limited | Methods for producing members of specific binding pairs |
US5858657A (en) | 1992-05-15 | 1999-01-12 | Medical Research Council | Methods for producing members of specific binding pairs |
US6225447B1 (en) | 1991-05-15 | 2001-05-01 | Cambridge Antibody Technology Ltd. | Methods for producing members of specific binding pairs |
US5871907A (en) | 1991-05-15 | 1999-02-16 | Medical Research Council | Methods for producing members of specific binding pairs |
US5565332A (en) | 1991-09-23 | 1996-10-15 | Medical Research Council | Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach |
US5872215A (en) | 1991-12-02 | 1999-02-16 | Medical Research Council | Specific binding members, materials and methods |
PT1024191E (pt) | 1991-12-02 | 2008-12-22 | Medical Res Council | Produção de auto-anticorpos a partir de reportórios de segmentos de anticorpo e exibidos em fagos |
US5733743A (en) | 1992-03-24 | 1998-03-31 | Cambridge Antibody Technology Limited | Methods for producing members of specific binding pairs |
EP1642910B1 (en) | 2000-12-05 | 2012-02-08 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Rationally designed antibodies |
US7396917B2 (en) * | 2000-12-05 | 2008-07-08 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Rationally designed antibodies |
EP1660534A2 (en) * | 2003-08-22 | 2006-05-31 | MedImmune, Inc. | Humanization of antibodies |
TWI333977B (en) * | 2003-09-18 | 2010-12-01 | Symphogen As | Method for linking sequences of interest |
ATE512671T1 (de) * | 2005-04-05 | 2011-07-15 | Affimed Therapeutics Ag | Verwendung von antikörpern gegen den lamininrezeptor oder den lamininrezeptorvorläufer zur diagnose von krebs |
US8012714B2 (en) | 2008-04-14 | 2011-09-06 | Innovative Targeting Solutions, Inc. | Sequence diversity generation in immunoglobulins |
WO2010017103A2 (en) * | 2008-08-04 | 2010-02-11 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Servic | Fully human anti-human nkg2d monoclonal antibodies |
BRPI1011195B1 (pt) * | 2009-05-20 | 2020-10-13 | Novimmune S.A | métodos para produzir uma coleção de ácidos nucleicos |
CN104520321A (zh) * | 2012-01-09 | 2015-04-15 | 斯克利普斯研究所 | 超长互补决定区及其用途 |
US9914929B2 (en) | 2012-03-14 | 2018-03-13 | Innovative Targeting Solutions Inc. | Generating targeted sequence diversity in fusion proteins |
US9587001B2 (en) * | 2012-10-19 | 2017-03-07 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Conjugated knottin mini-proteins containing non-natural amino acids |
GB201302597D0 (en) | 2013-02-14 | 2013-04-03 | Univ Leeds | Novel Synthetic Proteins |
EP3022224A2 (en) * | 2013-07-18 | 2016-05-25 | Fabrus, Inc. | Antibodies with ultralong complementarity determining regions |
GB201720351D0 (en) * | 2017-12-06 | 2018-01-17 | Iontas Ltd | Selecting for developability in drug discovery |
-
2017
- 2017-01-09 JP JP2018535425A patent/JP7308505B2/ja active Active
- 2017-01-09 WO PCT/EP2017/050337 patent/WO2017118761A1/en active Application Filing
- 2017-01-09 EP EP17701045.1A patent/EP3277810B8/en active Active
- 2017-01-09 US US16/066,638 patent/US20190256840A1/en active Pending
- 2017-01-09 KR KR1020187019613A patent/KR20180100132A/ko unknown
- 2017-01-09 GB GB1812040.2A patent/GB2562933B/en active Active
- 2017-01-09 AU AU2017205706A patent/AU2017205706B2/en active Active
- 2017-01-09 BR BR112018013883-5A patent/BR112018013883A2/pt unknown
- 2017-01-09 CA CA3010231A patent/CA3010231A1/en active Pending
- 2017-01-09 EP EP20164530.6A patent/EP3786292A1/en active Pending
- 2017-01-09 SG SG11201805493YA patent/SG11201805493YA/en unknown
- 2017-01-09 CN CN201780006059.3A patent/CN108473987B/zh active Active
-
2022
- 2022-03-24 JP JP2022047896A patent/JP2022084834A/ja active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2014504270A (ja) * | 2010-11-08 | 2014-02-20 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー | 改変ノッチンペプチドを含む融合タンパク質及びその使用 |
WO2015166272A2 (en) * | 2014-05-02 | 2015-11-05 | Iontas Limited | Preparation of libraries of protein variants expressed in eukaryotic cells and use for selecting binding molecules |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
CURR TOP MED CHEM, vol. Vol.15, No.12, p.1082-1101, JPN6021002753, 2015, ISSN: 0004433919 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20190256840A1 (en) | 2019-08-22 |
JP7308505B2 (ja) | 2023-07-14 |
JP2022084834A (ja) | 2022-06-07 |
AU2017205706B2 (en) | 2022-10-20 |
KR20180100132A (ko) | 2018-09-07 |
BR112018013883A2 (pt) | 2018-12-18 |
GB2562933A (en) | 2018-11-28 |
CN108473987A (zh) | 2018-08-31 |
GB2562933B (en) | 2022-06-29 |
CA3010231A1 (en) | 2017-07-13 |
RU2018123301A (ru) | 2020-02-10 |
CN108473987B (zh) | 2024-01-02 |
RU2018123301A3 (ja) | 2020-06-30 |
GB2562933A8 (en) | 2018-12-19 |
WO2017118761A1 (en) | 2017-07-13 |
EP3786292A1 (en) | 2021-03-03 |
AU2017205706A1 (en) | 2018-08-16 |
EP3277810A1 (en) | 2018-02-07 |
EP3277810B1 (en) | 2020-05-27 |
EP3277810B8 (en) | 2020-07-15 |
GB201812040D0 (en) | 2018-09-05 |
SG11201805493YA (en) | 2018-07-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7308505B2 (ja) | 多様性を変化させた足場ドメインを有する結合メンバー | |
US9982253B2 (en) | Stabilized fibronectin domain compositions, methods and uses | |
US10202438B2 (en) | Synthetic library of specific binding molecules | |
US9109223B2 (en) | Methods for generating and screening fusion protein libraries and uses thereof | |
US11932673B2 (en) | Sodium channel inhibitors | |
RU2778694C2 (ru) | Связывающие элементы с измененными диверсифицированными доменами остова | |
US20230331827A1 (en) | Potassium channel inhibitors | |
AU2015271900B2 (en) | Stabilized fibronectin domain compositions, methods and uses |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20180710 |
|
RD01 | Notification of change of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7426 Effective date: 20180710 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20191224 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20191224 |
|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20201007 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20201007 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210202 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20210430 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210622 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20211124 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220324 |
|
C60 | Trial request (containing other claim documents, opposition documents) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C60 Effective date: 20220324 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20220324 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20220412 |
|
C21 | Notice of transfer of a case for reconsideration by examiners before appeal proceedings |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C21 Effective date: 20220419 |
|
A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20220624 |
|
C211 | Notice of termination of reconsideration by examiners before appeal proceedings |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C211 Effective date: 20220628 |
|
C876 | Explanation why request for accelerated appeal examination is justified |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C876 Effective date: 20221205 |
|
C305 | Report on accelerated appeal examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C305 Effective date: 20221213 |
|
C22 | Notice of designation (change) of administrative judge |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C22 Effective date: 20221221 |
|
C13 | Notice of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C13 Effective date: 20230110 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230407 |
|
C302 | Record of communication |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C302 Effective date: 20230413 |
|
C23 | Notice of termination of proceedings |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C23 Effective date: 20230425 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20230627 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7308505 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |