CN108473987A - 具有改变的多样性支架结构域的结合成员 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及各自包含融合蛋白的结合成员的文库，所述融合蛋白包含插入受体多样性骨架结构域(例如抗体恒定或可变结构域)内的供体多样性骨架结构域(例如富含半胱氨酸的蛋白质)。提供了文库和生成文库的方法、以及筛选方法、结合成员和使用所述结合成员的方法。

Description

具有改变的多样性支架结构域的结合成员
技术领域
本发明涉及具有改变的多样性支架结构域的结合成员、这种结合成员的文库产生、以及选择和筛选来自这些文库的结合成员。
背景技术
抗体人源化涉及将动物CDR与人框架组合。CDR嫁接是用于抗体人源化的公认方法。对动物免疫产生的抗体进行测序，鉴定CDR环，并制备杂交分子，其由具有一个或多个衍生自动物抗体1的CDR的人框架组成。在CDR嫁接中，可能需要引入的肽采用特定的结构来保持原始的结合特异性，并且通常需要通过改变包括框架区内的支持残基的加成残基来“微调”人源化过程。
来自其它来源的非抗体肽也已被移植到抗体框架中。Barbas等(1993)将天然存在的整联蛋白结合序列插入人抗体2的VH CDR3区，并且Frederickson等(2006)3克隆了已知结合血小板生成素(TPO)受体进入抗破伤风类毒素抗体的几个CDR区的14聚体肽。将肽的每个末端的2个氨基酸随机化并通过噬菌体展示选择所得到的文库。在US 20100041012A1中描述了同样的工作，以及插入已知与促红细胞生成素受体4结合的18个氨基酸的肽。原始的促红细胞生成素受体结合肽序列含有两个半胱氨酸，由于抗体二硫醚键形成的预期问题，其被去除。在这些情况下，2-3个密码子在插入的肽编码区和受体框架之间的连接处被随机化，以从所得噬菌体展示文库中选择最佳连接序列。Liu等将对CXCR4具有结合活性的14-16个氨基酸的肽插入2个不同的CDR(VH CDR3和VH CDR25)中。Kogelberg将采用发夹：α螺旋基序的αVβ617聚体肽插入鼠抗体6的VH CDR3中。该肽含有已知可直接与αVβ6结合的核心RGDLxxL元件。该工作致力于基于文库的方法，重点在于VH CDR3，其试图模仿原始插入物的发夹：α螺旋结构7。在所有这些情况下，该抗体起到引入肽的载体的作用，而不参与靶结合。
Gallo等使用另一种多样化方法将肽插入VH CDR3中。抗体多样化天然存在于B细胞内，US8012714描述了在异源哺乳动物细胞内复制这种多样化过程的方法。在成熟的B细胞中，抗体基因通过重组分开的V、D和J区段通过“重组激活基因”(RAG1和RAG2)的活性而组装，导致插入序列的大片段的缺失。在US8012714中，将RAG1和RAG2与包含重组底物的质粒一起引入人胚胎肾细胞(HEK293)中以在非B细胞中复制重组V-D-J连接。这种基于RAG1/2重组的方法利用了哺乳动物细胞的DNA修复和切除机制，并且尚未在原核细胞中得到证实。
在WO2013134881A1中使用了相同的基于哺乳动物细胞的体外系统，其中D区段有效地被编码衍生自两个其它结合分子的肽片段的DNA替代。由于RAG1/RAG2驱动的多样化只发生在哺乳动物细胞中，因此该系统不能直接用于原核方法如噬菌体展示。WO2013134881A1例举由Frederickson3和Bowdish(US20100041012A1)使用的相同14聚体肽片段的重链CDR3的引入。将TPO受体结合构建体引入CDR3的中部，因此保留了CDR序列以及在另外的氨基酸中移植以在抗体框架和引入肽之间产生总共12个或更多个氨基酸。WO2013134881A1例举与产生为在抗体框架与9-14个氨基酸范围内的引入肽之间具有组合连接子长度的伸展蛋白-4的抗体融合。
Saini等8,9报道了在牛抗体的VH结构域内出现超长的富含半胱氨酸的CDR3。这些构成9％牛抗体应答的40-67个氨基酸的超长VH CDR通常限于与特定Vλ1轻链配对。最近，两种这样的牛抗体的结构已经通过X射线晶体学10测定，揭示了由上升和下降β链形成的异常茎结构，该β链由包含具有由半胱氨酸对形成的多个二硫醚键的肽的“突起”突出。该茎：突起结构由VH结构域的CDR3形成，但茎受到与VH CDR1、VH CDR2以及配偶体Vλ1链的所有CDR的相互作用的支持。因此，这些抗体的整个CDR多样性致力于表现“突起”结构，其自身表现为从支撑框架到“突起”11的第一半胱氨酸为大约38埃的距离。因此，其它CDR与由突起识别的相同表位相互作用的可能性被废除或严重受限。
在随后的工作中，“突起”被细胞因子代替，如粒细胞集落刺激因子12和促红细胞生成素13，它们在N和C端连接处通过柔性Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：1)序列(Gly4Ser)与茎连接。随后显示，刚性β片层茎结构可以用刚性反平行卷曲螺旋结构11代替。将柔性Gly4Ser和Gly-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO：2)连接子再次置于卷曲螺旋序列的每一端以“优化所得抗体的折叠和稳定性”。这种结构也使得表现粒细胞集落刺激因子成为可能。Liu等采用了相同方法在两个连接处使用与柔性肽缀合的刚性茎结构以将瘦素和生长激素融合到VH CDR3和VH CDR2和VL CDR314中。在该示例中，保留的抗体结合被认为是潜在的缺点，并且建议使用“无效”抗体配偶体例如抗RSV抗体以避免宿主抗体结合的贡献。
Peng等(2015)报道了以保留激动活性的方式将两种天然激动剂(瘦素和促卵泡激素)作为“客体”插入抗体VH CDR3中15。产生了融合文库，其中在每个N端和C端末端的结构域之间插入了5-15个氨基酸的柔性肽以及在每个末端处的随机3个氨基酸(即总连接子长度为16-36个氨基酸)。在HEK293细胞中表达了107个融合变体的文库，并且通过在基于自分泌的筛选方法中的报道基因激活来鉴定保留“客体”的激动剂活性的融合物。抗体的有益半衰期性质延伸到引入客体。
Peng等(2015)的方法使用自分泌报道系统在哺乳动物细胞中进行，其中细胞在半固体培养基中生长并且分泌抗体融合物保留在生产细胞附近。因此，在细胞紧邻附近累积的分泌产物浓度相对较高16，这使得难以区分文库中具有改变的表达/稳定性或结合特性的克隆。因此，Peng等(2015)描述的系统内严格性存在限制。此外，功能筛选方法也限于相关受体/报道系统可用的筛选。工作克隆的比例很低(尽管受哺乳动物细胞内源性伴侣蛋白辅助折叠的益处)。
抗体代表通常使用的结合支架。作为替代，已经证实了基于非抗体支架的结合成员的产生38,39。这些工程化蛋白质来源于变体文库，其中暴露的表面残基在核心支架38-40上多样化。
Betton等(1997)17报道了使用9-10个氨基酸的连接子(DPGG插入物-YPGDP(SEQ IDNO：3,4)和PDPGG插入物-YPGGP(SEQ ID NO：5,6))将β-内酰胺酶融合到麦芽糖结合蛋白中的几个适应允许位点。Collinet18报道了在N末端插入点使用氨基酸残基SGG或GG并在C末端插入点使用GAG，将β-内酰胺酶或二氢叶酸还原酶插入磷酸甘油酸激酶的允许位点。赋予细菌对氨苄青霉素的抗性的酶β-内酰胺酶的研究也揭示了肽插入可以适应的潜在位点19。Vandevenne等报道了使用在插入的N和C末端各引入6-7个氨基酸的构建体而插入人巨噬细胞壳三糖苷酶20的几丁质结合结构域蛋白的这些位点之一中。Crasson等21通过将纳米抗体插入连接两个螺旋的β-内酰胺酶的允许位点而展示了纳米抗体的功能化。
发明内容
本发明人已经发现，在第二结合结构域(“受体支架结构域”)内并入结合结构域(“供体多样性支架结构域”)增加了结合成员群体的多样性，并且允许从这些群体中选择和分离具有有利特性的结合成员。这对于例如选择与靶分子(例如离子通道，其难以用常规抗体靶向)结合的结合成员可能是有用的。
本发明的一个方面提供了一种筛选方法，其包括：
(i)提供结合成员的创始文库，
创始文库中的每个结合成员包含融合蛋白和任选的与融合蛋白结合的配偶体结构域，
其中融合蛋白包含插入受体多样性支架结构域内的供体多样性支架结构域，任选地其中供体多样性支架结构域的N和C末端各自连接到具有4个氨基酸或更少的连接子的受体多样性支架结构域，
其中供体多样性支架结构域包含供体支架和供体相互作用序列，受体多样性支架结构域包含受体支架和受体相互作用序列，并且所述创始文库中的一个或多个供体相互作用序列、受体相互作用序列和连接子不同，
(ii)针对显示结合活性的创始结合成员来筛选创始文库，以及
(iii)对显示结合活性的创始文库中的一个或多个创始结合成员进行鉴定。
在一些实施方式中，所述创始文库中的连接子不同。
该方法可以进一步包括：
(iv)在一种或多种鉴定的创始结合成员的氨基酸序列中的一个或多个位置处引入不同的氨基酸残基以产生修饰的结合成员文库，
(v)针对显示结合活性的修饰的结合成员来筛选修饰的文库，以及
(vi)对显示结合活性的修饰的文库中的一种或多种修饰的结合成员进行鉴定。
在一些实施方式中，可以将不同的氨基酸残基引入一种或多种鉴定的创始结合成员的供体相互作用序列、受体相互作用序列和/或配偶体结构域中。
该方法可以进一步包括：
(vii)将来自一种或多种鉴定的结合成员或修饰的结合成员的融合蛋白与不同群体的配偶体结合结构域(配偶体链)相关联以产生改组的结合成员文库，
(viii)针对显示结合活性的改组的结合成员筛选改组的文库，
(ix)对显示结合活性的一种或多种改组的结合成员进行鉴定。
本发明的另一方面提供了生产结合成员文库的方法，其包括：
提供编码不同种群的包含插入受体多样性支架结构域的供体多样性支架结构域的融合蛋白的核酸群体，任选地其中供体多样性支架结构域的N和C末端在每个末端连接到具有4个氨基酸或更少的连接子的受体多样性支架结构域，
其中供体多样性支架结构域包含供体支架和供体相互作用序列，并且受体多样性支架结构域包含受体支架和受体相互作用序列，并且
所述群体中的一个或多个供体相互作用序列、受体相互作用序列和连接子不同，
表达所述核酸群体以产生不同的群体，以及
任选地将融合蛋白与配偶体结构域群体相关联，从而产生结合成员文库。
本发明的另一方面提供一种结合成员文库，其包含：
包含插入受体多样性支架结构域的供体多样性支架结构域的不同群体的融合蛋白，
其中供体多样性支架结构域包含供体支架和供体相互作用序列，并且受体多样性支架结构域包含受体支架和受体相互作用序列，任选地其中供体多样性支架结构域的N和C末端各自连接到具有4个氨基酸或更少的连接子的受体多样性支架结构域，
其中供体多样性支架结构域包含供体支架和供体相互作用序列，并且受体多样性支架结构域包含受体支架和受体相互作用序列，并且
所述群体中的一种或多种供体相互作用序列、受体相互作用序列和连接子不同，
任选地其中所述融合蛋白与结合配偶体相关联以形成异二聚体。
本发明的另一个方面提供包含插入受体多样性支架结构域的供体多样性支架结构域的融合蛋白，
其中供体多样性支架结构域包含供体支架和供体相互作用序列，并且受体多样性支架结构域包含受体支架和受体相互作用序列，任选地其中供体多样性支架结构域的N和C末端连接到具有4个氨基酸或更少的连接子的受体多样性支架结构域。
本发明的另一方面提供包含本文所述的融合蛋白和与融合蛋白相关的配偶体结构域的结合成员。
本发明的其它方面提供来自如本文所述的鉴定和/或分离的结合成员的分离的供体多样性支架结构域、受体多样性支架结构域或配偶体结构域，例如如本文所述工程化的分离的供体多样性支架结构域或分离的受体多样性支架结构域或配偶体结构域，其可用于异源结合成员，例如不包括原始供体多样性支架结构域的结合成员。
附图说明
图1A显示了pIONTAS1的图示，显示了包含lacI启动子、M13前导序列scFv抗体基因-基因3(未按比例)的盒。该盒存在于具有氨苄青霉素抗性基因和coleE1起点以及f1噬菌体复制起点的pUC119的Hind3/EcoR1克隆位点内。VH基因侧接Nco1和Xho1限制性位点，VL基因侧接Nhe1和Not1限制性位点，允许简单地克隆到相容性载体中。图1B显示了显示框架区(FW)和CDR区的位置的VL结构域的图示。结蛋白供体已被插入VL受体的CDR1位置。Pml1和Mfe1位点允许克隆供体文库。从FR2到FR4末端的区域来源于轻链集28。图1C是对图1B的描述，但是使用Pst1和BspE1位点以使结蛋白供体取代VL基因的CDR2。
图2显示了结体构建中使用的合成单链Fv基因的序列。在结体构建体内使用现有抗体D12的VH。图2A显示了VH序列侧接限制性位点Nco1和Xho1以及将VH连接至VL的柔性连接子。这随后是编码Vlamda1a(IGLV1-36)种系的序列。显示VL的CDR1并且在其之前是Pml1克隆位点。引入Ser至Thr突变以使框架1的末端包含Pml1位点。该位点允许将结蛋白克隆至VL的CDR1位置。在合成基因的VL框架2的末端是允许将结蛋白克隆到CDR2位置的Pst1位点。图2B与图2A相同，但显示了Vκ种系序列IGKV1D-39。
图3显示了将EETI-II供体结蛋白插入VL受体中。图3A显示了加粗的具有半胱氨酸残基的结蛋白供体EETI-II的序列和加下划线的参与胰蛋白酶结合的核心序列(“PRIL”)。图3B显示了EETI-II供体插入λ种系基因IGLV1-36的CDR1或CDR2中的图示。边界根据国际ImMunoGeneTics信息系统(IMGT)29定义。氨基酸由IUPAC单字母氨基酸代码表示。图3Bi显示了在插入结蛋白之前在CDR1处的Vλ受体结构域的序列。图3ii和3iii显示了插入供体EETI-II供体后的序列。(图3Biii由与3Bii相比在引物和框架残基之间引入额外的Gly残基的引物产生)。图3Biv显示了在供体插入之前在CDR2处的Vλ受体结构域的序列，并且图3Bv显示了在插入EETI-II供体后。加下划线显示抗体框架残基，并以小写字母显示来自抗体受体的丢失残基。在交叉点处，随机化残基显示为x，其中代替框架或供体残基的那些显示为小写字母x。显示域之间连接子内的任何“额外的”残基以大写字母(A、Z或X)显示。Z意指来自Val、Ala、Asp或Gly的任何氨基酸。X代表由密码子VNC(编码12个氨基酸)或VNS(总共编码16个氨基酸)编码的氨基酸。(V＝A、C或G和S＝C或G)。图3C-F显示了由将EETI-II结蛋白供体分别插入IGLV1-36的C.CDR1、IGKV1D-39的CDR1、IGLV1-36的E.CDR2和F.IGKV1D-39的CDR2中引起的构建体的DNA和氨基酸序列。(IGLV1-36是Vλ种系基因，IGKV1D-39是Vκ种系基因)。突出显示了用于克隆的限制性位点，并鉴定框架和CDR区。
图4显示了来自第2轮选择输出的多克隆噬菌体的分析。测试来自EETI-II CDR1文库(B)和EETI-II CDR2文库(C)的第2轮淘选的多克隆噬菌体(X轴)与胰蛋白酶的结合。当EETI-II与基因-III(A)的N-末端直接融合时，胰蛋白酶结合不能实现。Y轴显示荧光单位(FU)的胰蛋白酶结合。
图5显示了来自第2轮选择输出的结体克隆的单克隆结合测定。将来自EETI-IICDR1(A)和EETI-II CDR2(B)文库选择输出(第2轮)的94个个体克隆挑取到96孔培养板中，并从每个克隆制备噬菌体。测试每个克隆的噬菌体上清液与固定在中性亲和素包被的MaxisorpTM平板上的生物素化胰蛋白酶的结合。使用小鼠抗M13抗体，然后是铕缀合的抗小鼠抗体检测噬菌体与胰蛋白酶的结合。X轴显示克隆号，Y轴显示荧光单位(FU)的胰蛋白酶结合。
图6显示了结体克隆及其GlyAla突变体的蛋白质印迹分析。使用小鼠抗-pIII抗体在蛋白质印迹上分析从11个(随机选择的)结体(称为W1-W11)及其GlyAla突变体(称为M1-M11)制备的噬菌体。野生型(WT)基因III和结体(KB)-基因III融合物通过抗小鼠680(LI-COR，目录号926-32220)二级抗体显现。
图7显示了pINT12载体系统中的结体Fab表达盒。在该质粒中，编码EETI-IIVL融合蛋白和CL结构域的轻链盒的转录在EF1-α启动子的控制下。编码与IgG1恒定结构域1(CH1)融合的D1A12VH的重链盒的转录受CMV启动子控制。
图8A显示了在HEK-293F细胞(代表性实例)中表达的IgG1结体的SDS-PAGE分析。使用CaptureSelect亲和基质纯化的结体Fab使用考马斯染色在SDS-PAGE凝胶上可视化。对于在非还原条件下制备的样品观察到的约50kD的主要条带对应于完整的结体Fab分子(泳道2和4)。对于在还原条件下制备的样品(泳道3和泳道5)观察到的较高条带(约27kD)和较低条带(约23kD)分别对应于VH-CH1融合和结蛋白-VL-CL融合。泳道1装载有Biorad蛋白质梯(Biorad，161-0373)。图8B显示了使用Superdex200 PC3.2/30柱(GE Healthcare)通过尺寸排除色谱分析的结体的色谱图。
图9显示了EETI-抗体VL CDR2融合物的结构。KB_A05(A)的晶体结构在处，KB_A12(B)的晶体结构在处。
图10A(i)显示了先前公布的以色带模式(PDB代码1H9I)显示的EETI-II结构。图10A(ii)EETI-II作为VL CDR2融合物。图10A(iii)先前公开的EETI-II结构和EETI-II的叠加作为VL CDR2融合物。图10B显示了FabKB_A05的VH和VL(与EETI-II融合)。VH CDR残基以黑色突出显示，注释了VH CDR3。
图11显示了结体VH改组文库的噬菌体展示选择的多克隆噬菌体输出分析。重链改组的KB_A07和KB_A12(组合)文库在5种不同抗原上选择：cMET-Fc(A)、GAS6-CD4(B)、FGFR4-CD4(C)、uPA(D)和B-gal(E)。测试来自5种选择的多克隆噬菌体各自与胰蛋白酶、用于选择的所有抗原、中性亲和素和链霉亲和素的结合以确定背景结合。X轴显示固定在MaxisorpTM平板上的抗原，并且Y轴显示与荧光单位(FU)的抗原结合的多克隆噬菌体。
图12显示了与胰蛋白酶和cMET-Fc或胰蛋白酶和GAS6-CD4结合的单克隆双特异性结体(来自cMET-Fc和GAS6-CD4选择)的代表性实例。使用小鼠抗-M13抗体，然后是铕缀合的抗小鼠抗体检测与固定在MaxisorpTM平板上的抗原结合的单克隆噬菌体。X-轴显示克隆号，Y-轴显示荧光单位(FU)的抗原结合。
图13显示了选自生物素化胰蛋白酶的“重链改组”结体文库的噬菌体选择级联。第2轮和第3轮的最佳抗原浓度通过选择针对胰蛋白酶浓度范围的噬菌体结体并将输出数量与“无抗原对照”进行比较以凭经验确定。
图14显示了结体捕获测定的形式。KnitBody-scFv-Fc(B)捕获在用抗-Fc抗体(A)包被的MaxisorpTM平板上，使用链霉亲和素缀合的铕(D)检测生物素化胰蛋白酶(C)与结体的结合。
图15显示了结体Fc捕获测定中亲和力提高的克隆的表现的代表性实例。结体-scFv-Fc捕获在用抗-Fc抗体包被的MaxisorpTM平板上，使用链霉亲和素缀合的铕检测生物素化胰蛋白酶与结体的结合。将从亲和力成熟选择中分离的克隆所观察到的结合信号与亲本克隆KB_A12和KB_A07进行比较。X轴显示结体的克隆ID，Y轴显示荧光单位的结体与胰蛋白酶结合。
图16显示了重链改组后胰蛋白酶结合的改善。将选自重链改组文库的克隆KB_Tr_F03的解离速率与两个亲本结体KB_A07和KB_A12进行比较。X轴以秒显示解离速率分析，Y轴显示共振单位(RU)。
图17显示了pINT3-hg1载体系统中的结体表达盒。在该质粒中，编码结蛋白/毒素VL融合物和CL结构域的轻链盒的转录在EF1-α启动子的控制下。编码D1A12VH和IgG1恒定结构域(CH1-CH2-CH3)的重链盒的转录受CMV启动子控制。轻链基因(受体)中的PstI和BspEI位点允许将结蛋白(供体)插入CDR2位置。
图18显示了在HEK-293F细胞中表达的IgG1结体的SDS-PAGE分析。使用蛋白质-A亲和层析纯化的结体使用考马斯染色在还原性SDS-PAGE凝胶上显现。顶部条带对应于抗体重链(HC)，并且底部条带对应于展示结蛋白/毒素作为CDR2融合物的抗体轻链。样品1-4是KB_A12抗体受体融合的NaV1.7阻断剂(虎纹捕鸟蛛毒素-IV，ProTx-II，Ssm6a和Ssm6a_GGS)。样品5-10是与KB_A07抗体(5、6和7)或KB_A12抗体(8、9和10)融合的Kv1.3阻断剂(短肤蝎毒素，Moka-1和Shk)。样品11和12分别是亲本结体克隆(EETI-II融合物)KB_A07和KB_A12。
图19显示了两种粘蛋白抗体融合蛋白与LOX-1蛋白的特异性结合。在该测定中，使用小鼠抗-M13抗体，然后是铕缀合的抗小鼠抗体检测展示粘蛋白-抗体融合物的噬菌体与LOX1的结合。包含结体KB_A07和KB_A12(EETI-II融合物)作为对照。使用蛋白质cMET-FC、GAS6-CD4、FGFR4-CD4、UPA和B-gal检查非特异性结合。所有抗原直接固定在MaxisorpTM平板上。
图20显示了覆盖在一级序列上的二级结构的图示。
图20A显示了纤连蛋白的第10个III型细胞粘附结构域的序列。二级结构元件(β片)加下划线。在域上表面连接β片的残留物显示为小写字母。图20B显示了具有β片和α螺旋区标记的gp2蛋白的序列。供体插入或多样化的潜在位点以小写字母显示。去除而不影响结构的N和C末端残基以斜体和较小的字体显示。
图21表示显示了结体对huKv1.3通道电流的浓度依赖性抑制的浓度-响应曲线。将毒素融合结体KB_A12_Shk(Shk毒素，正方形)，KB_A07_Shk(Shk毒素，三角形)和KB_A07_KTX(短肤蝎毒素，圆形)的Log[M]浓度(x轴)相对于剩余％电流(y轴)作图。从这些浓度-响应曲线确定50％电流抑制时的浓度(IC50；总结见表11)。
图22显示了结体连接子变体与胰蛋白酶的结合比较。使用小鼠抗CH1抗体，然后是铕缀合的抗小鼠抗体将结体Fab(X轴)与固定在链霉亲和素包被的MaxisorpTM平板上的生物素化胰蛋白酶结合。Y轴显示了标准化的结合信号(％)，其中Gly4Ser对照的结合针对它们各自的亲本克隆的结合被标准化(即100％结合)。
图23显示了选自结体环文库的克隆与β-半乳糖苷酶(A)和cMET(B)的单克隆噬菌体结合。使用小鼠抗M13抗体，然后通过铕缀合的抗小鼠抗体检测与直接固定在MaxisorpTM平板上的抗原结合的单克隆噬菌体。X-轴显示克隆号，Y-轴显示荧光单位(FU)的抗原结合。
图24显示了结体结合物对大鼠TFR的筛选的代表性实例。使用小鼠抗-M13抗体，然后是铕缀合的抗小鼠抗体检测与固定在MaxisorpTM平板上的大鼠TFR结合的单克隆噬菌体。X轴显示克隆号，Y轴显示荧光单位(FU)的噬菌体与TFR结合的信号。
图25显示了结体KB_A12和由牛抗体与天然“超长VH CDR3(”牛ULVC-Ab“)组成的形式的结合比较。母牛ULVC-Ab的富含半胱氨酸的突起被EETI-II结蛋白(“EETI-II牛ULVC-Ab”)取代。将编码这些构建体的基因克隆到pSANG4中，并从KB_A12或EETI-II牛ULVC-Ab融合构建体(X轴)中拯救噬菌体并进行PEG沉淀。测试12.5x(A)和0.5x(B)噬菌体(相对于初始培养体积)与固定在链霉亲和素包被的MaxisorpTM平板上的生物素化胰蛋白酶的结合。使用抗M13抗体，然后是铕缀合的抗小鼠抗体检测噬菌体与胰蛋白酶的结合。Y轴显示荧光单位(FU)的噬菌体结合信号。
图26显示了哺乳动物展示载体pD6的示意图。抗体基因靶向位于编码蛋白质磷酸酶1、调节亚基12C、PPP1R12C的基因的第一和第二外显子之间的4428bp内含子内的人AAVS基因座。一对针对该区域的Tale核酸酶用于在该位点切割基因组。在裂解位点的5'和3'位点上的700-800bp序列分别作为左和右同源臂(HA)整合到供体载体中。pD6供体载体用于插入形成为与人IgG1的Fc区融合的单链Fv(scFv)的抗体基因。该载体还具有驱动scFv-Fc基因表达的CMV启动子和编码来自“血小板衍生生长因子受体(PDGFR-TM)”的跨膜结构域的外显子。编码scFv-Fc抗体融合物的转基因区域侧接有左和右同源臂(左侧HA，右侧HA)，表示侧接在AAVS基因座中的切割位点的序列。载体也编码无启动子的杀稻瘟菌素基因，其通过与AAVS基因座内的外显子1的框内剪接而变得激活。
图27显示了结体在细胞表面的功能表达。所有细胞都用PE标记的抗Fc(FL2通道)和APC标记的链霉亲和素/生物素化胰蛋白酶复合物(FL4通道)染色。转染后，在杀稻瘟菌素中选择细胞并在转染后15天通过流式细胞术分析。图显示了(A)KB_A07(B)KB_A12或(C)未转染的HEK293细胞的结果。
图28显示了将EETI-II供体结蛋白插入VH CDR1(A)、VH CDR2(B)、VH CDR3(C)、VLCDR1(D)、VL CDR2(E)和VL CDR3(F)的抗TACE抗体D1A12scFv(表23，Tape，CJ，PNAS USA108,5578-5583(2011))的图示。另外，为KB_A07创建了连接子文库，其中EETI-II供体结蛋白被插入VL CDR2(G)中。根据由Chothia(Chothia等，J.Mol.Biol.264,220-232(1996))定义的标准，根据V BASE数据库(MRC，Cambridge UK)定义本实施例中的边界。氨基酸由IUPAC单字母氨基酸代码表示。图28Ai显示了在插入结蛋白之前在CDR1处的VH受体结构域的序列。图28Aii显示了在插入供体EETI-II供体后的序列。图28Bi显示了在插入结蛋白之前在CDR2处的VH受体结构域的序列。图28Bii显示了在插入供体EETI-II供体后的序列。图28Ci显示了在插入结蛋白之前在CDR3处的VH受体结构域的序列。图28Cii显示了在插入供体EETI-II供体后的序列。图28Di显示了在插入结蛋白之前在CDR1处的VL受体结构域的序列。图28Dii显示了在插入供体EETI-II供体后的序列。图28Ei显示在插入结蛋白之前在CDR2处的VL受体结构域的序列。图28Eii显示了在插入供体EETI-II供体后的序列。图28Fi显示在插入结蛋白之前在CDR3处的VL受体结构域的序列。图28Fii显示了在插入供体EETI-II供体后的序列。图28Gi显示了在连接子随机化之前在CDR2处“野生型”KB_A07VL受体结构域的序列。图28Gii显示了在连接子残基随机化后的序列。在交叉点，随机化残基显示为X。
图29显示了将可选框5-3EETI-II结蛋白供体插入VL受体中。将可选框架式结蛋白插入Vκ(IGKV1D-39)或Vλ(IGLV1-36)轻链的CDR1或CDR2中。图29A显示了可选框架式结蛋白构建体EET 5-3的核酸和氨基酸序列，其用作VL受体的CDR1和CDR2中的供体。半胱氨酸残基被加粗并且涉及胰蛋白酶结合的核心序列(“PRIL”)加下划线。图29B显示了将5-3ETI-II供体插入λ种系基因IGLV1-36的CDR1或CDR2中的图示。根据国际ImMunoGeneTics信息系统(IMGT)29定义边界。氨基酸由IUPAC单字母氨基酸代码表示。图29Bi显示了在插入结蛋白之前在CDR1处的Vλ受体结构域的序列。图29Bii和29Biii显示了在插入5-3EETI-II供体后的序列。(图29Biii中的序列由与29B ii相比在引物和框架残基之间引入额外Gly残基的引物产生)。图29Biv显示了在供体插入之前在CDR2处的Vλ受体结构域的序列，并且图29Bv显示了在插入EETI-II供体后。加下划线显示抗体框架残基，并以小写字母显示来自抗体受体的丢失残基。在交叉点处，随机化残基显示为x，其中代替框架或供体残基的那些为小写字母x。显示域之间连接子内的任何“额外的”残基以大写字母(A、Z或X)显示。Z意指来自Val、Ala、Asp、Gly或Glu(由GNS密码子编码)的任何氨基酸。X代表由密码子VNC(编码12个氨基酸)或VNS(总共编码16个氨基酸)编码的氨基酸。(V＝A、C或G和S＝C或G)。图29C-D显示了将由将5-3EETI-II结蛋白供体插入IGLV1-36的CDR1(C)或CDR2(D)中引起的构建体的DNA和氨基酸序列。相同的5-3EET形式也被引入作为Vκ种系基因的IGKV1D-39的CDR1和CDR2中，并且使用EETI-II的天然(1-5)取向在图3中显示了其描述，但是，应用与实施例16中所述相同的方法并且如图29所示插入5-3EETI-II形式。突出显示用于克隆的限制性位点，并鉴定框架和CDR区。
图30显示了包含Kv1.3阻断供体结构域(Shk)的结体减少T细胞中的细胞因子分泌。将PBMC用抗-CD3抗体活化，并与其中供体多样性结构域是Shk(KB_A12_Shk)或EET(KB_A12)的结体共温育。无Shk也被用作阳性对照。图显示了在PBMC中T细胞活化后的干扰素γ(IFNγ)(图30A)；颗粒酶(图30B)、白细胞介素7A(IL17A)(图30C)和TNF-α(图30D)的水平。
具体实施方式
本发明涉及包含插入受体多样性支架结构域内的供体多样性支架结构域的结合成员的不同群体和文库，以及从这些群体和文库中分离的结合成员。
本发明人已经示出了整个供体多样性支架结构域在插入受体结合结构域后能够正确折叠成稳定的功能构象，其中两个结构域保持生物学活性。发现受体结合结构域能容纳进入的供体结构域而不损害其结构。此外，具有多个半胱氨酸残基的供体和受体结构域各自在融合蛋白内形成正确的二硫醚键形式。
如本文所述的供体和受体多样性支架结构域的组合可用于增加结合成员的群体和文库的多样性。例如，抗体是天然进化的多样性支架，但大多数多样性集中在CDR3区内，特别是抗体重链的CDR3区内。将供体多样性支架结构域引入受体抗体VH和/或VL结构域大大增加了嵌合供体/抗体结合成员的可用多样性。
此外，如果供体多样性支架结构域倾向于结合特定类别的靶分子(例如离子通道)，则可以将该倾向赋予包含供体多样性支架结构域的结合成员。因此，结合成员可以保留供体多样性支架结构域的结合活性(例如，结合到离子通道的结蛋白)，同时还显示受体多样性支架结构域(例如，抗体)的体内半衰期。
优选地，本发明的嵌合结合成员的供体和受体多样性支架结构域直接连接在一起或通过短连接子连接以限制或约束结构域之间的柔性和相对运动，使得结合成员相对刚性。较长的非结构化连接子更容易发生蛋白水解降解，并且还可能通过增加构象柔性以促进形成不正确的二硫醚键。另外，较长的相对非结构化肽的构象柔性会损害相互作用的亲和力。在2个分子(如抗体和抗原)之间的相互作用中，在复合物形成时构象熵消失。随着供体和受体多种支架结构域之间的连接子更长，可能存在更多的构象，使得复合物形成在能量上不利。相反，涉及更多结构化融合蛋白与短链或缺失连接子的复合物形成将在熵上更有利，可能导致更高的亲和力相互作用30,31,32,33。
由于构象柔性对结合相互作用携带热力学“熵惩罚”，因此如本文所述限制供体和受体多样性支架结构域之间的构象关系使相互作用的熵惩罚最小化，最终有利于结合成员的所得相互作用的亲和力。
鉴于供体和受体多样性支架结构域的紧密接近，供体和受体支架结构域表面上的氨基酸可能有助于与靶分子或复合物内不同的靶分子结合的互补位。与单独的支架结构域相比，这可以增加结合成员的亲和力或特异性。供体或受体多样性支架结构域的结构域也可能有助于结合靶分子。任何供体、受体或配偶体结构域都可能与靶分子或复合物上的密集位点接触。
本文所述的结合成员可以包含融合蛋白。融合蛋白是包含两个多样性支架结构域；供体多样性支架结构域和受体多样性支架结构域的嵌合分子。
供体多样性支架结构域位于受体多样性支架结构域内，即供体多样性支架结构域在其N和C末端侧接受体多样性支架结构域。
优选地，融合蛋白的供体和受体多样性支架结构域都有助于融合蛋白的结合活性，例如结合相同或不同的靶分子。
在其它实施方式中，融合蛋白的供体和受体多样性支架结构域中的一个、优选供体多样性支架结构域负责融合蛋白的结合活性，例如靶分子的结合。
在一些优选的实施方式中，融合蛋白适合展示在噬菌体的表面上，例如用于通过噬菌体展示进行选择。用于展示的融合蛋白可以进一步包含噬菌体外壳蛋白，如来自Ff噬菌体的pIII、pVI、pVIII、pVII和pIX或T7噬菌体的基因10衣壳蛋白。噬菌体外壳蛋白可以位于融合蛋白的N或C末端，优选位于融合蛋白的C末端。
多样性支架结构域是具有稳定三级结构的独立折叠结构域，其能够呈现具有介导与靶分子结合的潜力的多种相互作用序列。多样性支架结构域包括在旁系同源或直系同源基团内表示的结构域，其已经用于驱动所述支架与其它分子的相互作用的发展。多样性支架结构域还包括经过工程化以显示多样性的天然结构域，以及发展或设计以形成稳定的自折叠结构的完全合成蛋白质。
本领域已知的多样性支架结构域的示例包括免疫球蛋白结构域41、富含半胱氨酸的肽如结蛋白和毒液毒素肽、亲和体(蛋白A结构域的工程化Z结构域)42,43、单体(即工程化纤连蛋白)44、设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)45、粘蛋白46、抗蛋白47、硫氧还蛋白48、单结构域抗体49,50和T7噬菌体基因2蛋白(Gp2)51。
在一些优选的实施方式中，多样性支架结构域可以包含由支架结构域内的半胱氨酸残基形成的多个二硫桥。
如本文所用的优选多样性支架结构域包括抗体的VH和VL结构域。T细胞受体与其靶标的结合也由存在于可变Ig结构域(α和β)内的CDR环指导，其中β链的CDR3中存在最大多样性。这些已经在体外用于呈现多样化的序列34,35。其它Ig结构域，例如抗体重链(例如CH1、CH2和CH3)和轻链(Cκ、Cλ)中的恒定Ig结构域也可以是用作多样性支架36,37。除了抗体和T细胞受体之外，Ig结构域已经充当了多样性支架，其在发展时间尺度上扩展和发展，并且在涉及分子识别的数百种不同蛋白质中发现Ig结构域。来自这些蛋白质的Ig结构域可以如本文所述用作多样性支架结构域。
多样性支架结构域的支架是维持结合形成该结构域的稳定核心结构的二级结构元件的框架。支架包含多个连续或不连续的支架残基，其与该结构域中的其它支架残基的侧链或肽支架形成共价和非共价相互作用。相互作用可能包括氢键、二硫醚键、离子相互作用和疏水相互作用。支架残基可以形成结构域的二级结构元件，例如α螺旋、β链、β折叠和其它结构基序。由于它们有助于多样性支架结构域的核心结构，所以支架残基是保守的并且多样性支架结构域内的支架残基的取代受到限制。
支架的示例包括抗体可变结构域的框架区或结蛋白的半胱氨酸连结框架(例如形成特征性连结结构的六个或更多个半胱氨酸残基)以及结蛋白β片和310螺旋基序。
多样性支架结构域的相互作用序列是由支架的稳定核心结构呈现的连续或非连续的氨基酸序列。相互作用序列可以与其它分子相互作用并介导结构域的结合活性，例如与靶分子的结合。在一些实施方式中，结构域的相互作用序列可以包含一个或多个不同的残基，从而允许选择具有特定结合活性的结合成员以从文库中分离。
相互作用序列的残基可以是完全非结构的，并且可能不支持或有助于结构域的三级结构。例如，相互作用残基可以位于二级结构元件或基序之间的环或转角处。由于它们不参与多样性支架结构域的核心结构，所以相互作用序列的残基保守性较低，并且多样性支架结构域内的相互作用残基的取代较少受到限制。在一些实施方式中，多样性支架结构域的相互作用序列可以包含蛋白质的非环面中的残基43,44,52。
相互作用序列的实例包括抗体可变结构域的CDR和连接稳定的自我折叠蛋白结构域的二级结构元件的环，例如结蛋白的连接环，如EETI-II的环1的PRIL基序。支架结构域内的相互作用序列的其它示例在本领域已知34-38,41-48,51,53。
在一些实施方式中，结构域可以含有对结合和二级结构都有贡献的残基。这些残基可以构成支架和相互作用序列。这用亲和体(蛋白A结构域的工程化Z结构域)43,52和单体(基于纤连蛋白结构域的工程化支架)44来说明。有助于二级结构和结合的残基可以在本文描述的结合成员中变得多样化。例如，可以使用常规选择技术在文库中鉴定保留二级结构的结合成员。在一些实施方式中，有助于二级结构和结合的残基可能不是多样化的。
多样性支架结构域可以用作本文所述融合蛋白和结合成员中的供体或受体多样性支架结构域。
供体多样性支架结构域包含供体支架和供体相互作用序列。
优选地，供体多样性支架结构域在结构域的天然结构内具有彼此邻近的N和C末端。供体末端之间的距离例如可以在受体多样性支架结构域中插入位点末端之间的距离的20％以内，更优选相同的距离。具有近端的供体结构域的示例包括结蛋白54、粘蛋白46和Gp2支架51。
在其它实施方式中，供体多样性支架结构域可以具有在结构域的天然结构中不接近的N和C末端。具有非近端N和C末端的供体多样性支架结构域可以如本文所述插入到受体多样性支架结构域中，使用足够长的连接子以允许供体结构域的末端与受体多样性支架结构域的环融合，使得连接子跨接供体和受体域的末端之间的间隙。可选地，可以截短供体多样性支架结构域以产生N和C末端接近的供体结构域，或者可以截短受体多样性支架结构域以产生其中插入位点的末端与供体结构域的末端接近的受体结构域。最终结果将是由于供体和受体结构域的融合而产生的残基损失。连接子或截短可以将供体结构域的末端之间的距离减小到受体支架中插入位点的末端之间的距离的20％内，或者更优选相同的距离。
供体多样性支架结构域可以由至少15个，至少20个，至少25个，至少30个或至少40个氨基酸组成。供体多样性支架结构域可以由400或更少，300或更少，200或更少或100或更少的氨基酸组成。例如，供体多样性支架结构域可以由20至400个氨基酸组成。
供体多样性支架结构域可以包含在支架结构域中形成二硫醚键的2、4、6、8、10个或更多个半胱氨酸残基(即该结构域可以含有1、2、3、4、5个或更多个二硫醚键)。
在一些实施方式中，供体多样性支架可以由至少15个氨基酸组成并且包含4个或更多个半胱氨酸残基。
合适的供体多样性支架结构域的实例包括免疫球蛋白、免疫球蛋白结构域、VH结构域、VL结构域、亲和体、富含半胱氨酸的肽如毒液毒素肽或结蛋白，“设计的锚蛋白重复蛋白”(DARPin)、粘蛋白、纤连蛋白结构域、抗蛋白、T7噬菌体基因2蛋白(Gp2)单体、单结构域抗体49,50或亲和体。
优选的供体多样性支架结构域包括富含半胱氨酸的肽，例如离子通道调节肽、毒液毒素肽和结蛋白。
富含半胱氨酸的肽包含二硫醚键网络作为核心结构元件。富含半胱氨酸肽的结构构象在本领域中是公知的55,6。
包含多个二硫醚键的离子通道调节肽(激动剂和拮抗剂)是本领域是公知的。示例包括来自有毒物种如蜘蛛、蛇、蝎子和毒蛇的毒液毒素肽26,55。
毒液毒素肽的结构构象和二硫醚键形式在本领域中也是公知的。例如，对蜘蛛和其它动物的毒液分析揭示了许多二硫醚键连接的构象和模式55,65,66,67。例如，蜘蛛毒素虎纹捕鸟蛛毒素-II具有I-III、II-V、IV-VI的二硫醚键连接模式68，“Janus-facedatracotoxin”(J-ACTX)具有I-IV、II-VII、III-IV和V-VIII的二硫醚键连接模式(包括2个相邻半胱氨酸之间的不寻常的“邻位”二硫醚键)56，其中罗马数字对指的是每个半胱氨酸出现在序列中的顺序以及与其形成二硫醚键的配偶体半胱氨酸的位置。
富含半胱氨酸的肽可以具有“二硫醚键指导的β发夹”(DDH)结构，其包含由2个二硫醚键稳定的反平行β发夹56。DDH核心结构在广泛研究的“抑制性半胱氨酸结”结构(以下称为半胱氨酸连结小蛋白或结蛋白)中发现。
结蛋白是富含半胱氨酸的小蛋白质，其具有交织的二硫醚键结合框架、三条β片折叠和一个或多个溶剂暴露环。结蛋白通常包含至少3个二硫桥，并且特征在于当半胱氨酸III和VI之间的二硫醚键跨过由另外两个二硫化物(二硫化物I-IV和II-V)和互连主链形成的大环时实现的二硫醚键连结。这些桥稳定了反平行β-片形成的常见三级折叠，并且在某些情况下为短的310螺旋。(罗马数字对指的是每个半胱氨酸出现在序列中的顺序以及与其形成二硫醚键的配偶体半胱氨酸的位置)。结蛋白为20-60个残基长，通常为26-48个残基，存在于从节肢动物、软体动物和蛛形纲动物到植物等多种生物体中57。特别是由芋螺蜗牛(芋螺毒素)产生的结蛋白已被广泛研究54,58-60。已经确定了数千种其它结蛋白，并且它们的序列和结构可以公开获得57,61,62，例如来自在线数据库(例如结蛋白在线数据库57，Centerde Biochimie Structural，CNRS，法国)。
在一些实施方式中，结蛋白的总体正确二级结构可以由半胱氨酸的正确分布和间隔赋予。在其它实施方式中，可能需要一个或多个额外的支架残基以赋予正确的二级结构。例如，在没有任何二硫醚键的情况下，EETI-II的残基11-15和22-25分别指向11-15个310-螺旋区域和22-25个β-转角区域的折叠倾向。
结蛋白显示了高度的序列柔性，并可以容纳大量的非本地序列。例如，EETI-II可以容纳超过50％的非本地序列(通过随机化2个循环)24。
用作本文所述的多样性支架的合适的富含半胱氨酸的肽可以例如包含虎纹捕鸟蛛毒素-IV，ProTx-II，Ssm6a，短肤蝎毒素，莫卡毒素-1，芋螺毒素-ω，MCoTI-II，Shk，PcTX1或曼巴毒素(如表8A中所示；SEQ ID NO：7-25)的氨基酸序列或在结蛋白数据库中所示的其它序列，或可以是保留正确折叠结构的该序列的片段或变体。
结蛋白作为参考结蛋白序列(例如表8A(SEQ ID NO：7-25)中所示或结蛋白数据库中所示的序列)的变体，可以包含与参考序列具有至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或至少98％的序列同一性的氨基酸序列。特定的氨基酸序列变体可以通过插入、添加、取代或缺失1个氨基酸，2、3、4、5、6、7、8、9或10或10个以上的氨基酸而与表8A(SEQ ID NO：7-25)的结蛋白序列不同。
序列相似性和同一性通常参考算法GAP(Wisconsin Package，Accelerys，SanDiego USA)来定义。GAP使用Needleman和Wunsch算法对两个完整序列进行比对，以最大限度地增加匹配数量并最大限度地减少空隙数量。一般而言，使用默认参数，其中空隙产生罚分＝12，空隙延伸罚分＝4。使用GAP可能是优选的，但是可以使用其它算法，例如BLAST(其使用Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：405-410的方法)，FASTA(其使用Pearson和Lipman(1988)PNAS USA 85：2444-2448的方法)，或Smith-Waterman算法(Smith和Waterman(1981)J.Mol Biol.147：195-197)或Altschul等人(1990)同上的TBLASTN程序，通常采用默认参数。具体而言，可以使用psi-Blast算法(Nucl.Acids Res.(1997)25 3389-3402)。
可以在本文描述的相关序列的全长上进行序列比较。
结蛋白的环内的一个或多个残基，例如，结蛋白的环1、2、3、4或5内的一个或多个残基可以是多样化的或随机的。在一些实施方式中，靶标结合基序中的一个或多个，诸如EETI-II的环1中的胰蛋白酶结合基序PRIL或不同的结蛋白中的相应残基可以是多样化的。例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个残基可以多样化。
以下举例说明供体和受体多样性中天然二硫醚键连接形式的形成以及融合蛋白的支架结构域内正确的二级结构的采用。
在其它优选的实施方式中，供体多样性支架是粘蛋白。粘蛋白是基于植物来源的植物细胞因子的约80-100个氨基酸的肽46。合适的粘蛋白序列在本领域中是公知的并且在本文其它地方描述。例如，如本文所述用作多样性支架的合适载体可以包含表12中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO：26、27)或可以是该序列的片段或变体。
作为参考亲和序列的变体如表12(SEQ ID NO：26和27)中所示序列的变体可以包含与参考序列具有至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或至少98％的序列同一性的氨基酸序列。特定氨基酸序列变体可以通过插入、添加、取代或缺失1个氨基酸，2、3、4、5、6、7、8、9或10或10个以上的氨基酸而与表12(SEQ ID NO：26和27)的序列不同。
本文描述的方法不需要知道供体多样性支架结构域的结构。结合成员的选择可以基于与靶分子的结合(如果已知的话)或受体结构域的正确折叠。供体多样性支架结构域可以在文库内提供，从中可以选择具有适当折叠受体支架的克隆，或者可以将其插入到容纳进入的供体多样性支架的现有受体多样性支架中。
一个支架结构域折叠的失败将影响所得融合蛋白的总体表达和稳定性，因此也可以在缺乏结构知识的情况下引入多样化并筛选折叠支架结构域的保留表达。然而，在已知供体多样性支架结构域的情况下，文库建设中的多样化位点可以由该结构指导。
受体多样性支架结构域和供体多样性支架结构域优选是异源的，即它们通过重组手段人工结合并且在自然界中不相关。在一些优选的实施方式中，供体和受体多样性支架结构域来自不同的支架类别，例如它们不都是免疫球蛋白，不都是富含半胱氨酸的蛋白质，不都是结蛋白或不都是粘蛋白。
受体多样性支架结构域包含受体支架和受体相互作用序列。
在一些实施方式中，受体多样性支架结构域可能缺少形成二硫醚键的半胱氨酸残基。例如，支架结构域可以包含0或1个半胱氨酸残基。在其它实施方式中，受体多样性支架结构域可以包含2、4、6、8、10个或更多个在支架结构域中形成二硫醚键的半胱氨酸残基(即该结构域可以包含1、2、3、4、5个或更多个二硫醚键)。
合适的受体多样性支架结构域的实例包括免疫球蛋白结构域、VH结构域、VL结构域、结蛋白、蛋白A、富含半胱氨酸的肽、毒液毒素、设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)、粘蛋白、纤连蛋白结构域、抗蛋白和T7噬菌体基因2蛋白(Gp2)。
供体多样性支架结构域和连接子序列的插入位点的选择可以由受体结构域的结构来指导，其中结构是已知的64,53,23,75,49,43。例如，合适的插入位点可以是位于连接受体多样性支架结构域的二级结构元件的区域，如β链或α螺旋。在图20A中显示了纤连蛋白的第10个III型细胞粘附结构域内的插入位点的合适区域(SEQ ID NO：28)，并且在图20B中显示了T7Gp2蛋白内插入位点的区域(SEQ ID NO：29)。在下面的实施例10中更详细地描述了合适的插入位点的鉴定。结构性知识也可以用来指导文库建设的多样化。
优选地，受体多样性支架结构域是全部或部分免疫球蛋白，最优选全部或部分抗体可变区。例如，受体多样性支架结构域可以是抗体轻链可变(VL)结构域或抗体重链可变(VH)结构域。
进入的供体多样性支架结构域将受体多样性支架结构域在插入受体的位置处分成N末端和C末端部分。供体多样性支架结构域在受体多样性支架结构域内部融合，使得供体多样性支架结构域的N末端和C末端直接或通过连接子连接至受体多样性支架结构域的N和C末端部分。在一些实施方式中，供体多样性支架结构域或受体多样性支架结构域的N和/或C末端处的一个或多个残基可以被去除和/或随机化。受体多样性支架结构域保留其原始的N和C末端，这不受供体多样性支架结构域插入内部插入位点的影响。
在一些实施方式中，可以通过将受体多样性支架结构域连接至供体多样性支架结构域内的不同位置来改变进入的供体多样性支架结构域相对于受体多样性支架结构域的取向。例如，可以通过环化供体多样性支架结构域，通过天然N和C末端的连接以及在氨基酸序列的不同位置线性化以产生人工N和C末端来设计旋转的供体多样性支架结构域。这些人工末端可以与融合蛋白内的受体多样性支架结构域连接。换句话说，供体多样性支架结构域的天然N和C末端(例如富含半胱氨酸的肽)可以直接或通过肽序列连接在一起，并且可以在供体多样性支架结构域的序列中的不同位置处产生人工N和C末端。在使用这些人工N和C末端产生的融合蛋白中，与包含具有天然N和C末端的供体多样性支架结构域的融合蛋白相比，供体多样性支架结构域相对于受体多样性支架结构域旋转。例如，供体多样性支架结构域内的环的顺序可以改变。表28中显示了具有改变取向的EETI-II供体多样性支架结构域的实例(SEQ ID NO：302-307)。
优选地，供体多样性支架结构域完全取代受体多样性支架结构域的一些或全部环序列，使得供体多样性支架结构域直接连接至受体多样性支架结构域的支架残基。例如，连接受体结构域中的二级结构元件的环序列(例如，连接抗体可变结构域中的β片框架元件的2个β链的CDR)可以全部去除。在一些实施方式中，可以从供体多样性支架结构域或受体多样性支架结构域去除或取代一个或多个支架残基，以减少它们之间的距离，同时实现融合蛋白的组成部分的折叠。
优选地，供体多样性支架结构域位于靠近受体多样性支架结构域的相互作用序列的融合蛋白中。例如，供体多样性支架可以位于距受体供体支架小于20埃的位置，例如在本文例示的结蛋白插入的情况下为8-13埃；计算为从前一个框架的末端到供体/连结基序的第一个半胱氨酸。这种接近性允许两种相互作用序列与靶分子或复合物上相同或密集的位点相互作用，使得供体和受体结构域可以同时促成结合。例如，融合蛋白可能缺乏刚性茎和柔性连接子以将供体多样性支架结构域连接至受体多样性支架结构域。
在一些优选的实施方式中，受体多样性支架是抗体可变结构域，例如抗体VH或VL结构域。
VH、VLκ或VLλ受体结构域的支架可以包含结构域的残基1-26、39-55和66-104(IMGT编号)。支架还可以包含由重链的J区段编码的最后11个残基和由κ和λ轻链的J区段编码的最后10个残基编码的框架4的残基。VH、VLκ或VLλ结构域的相互作用序列可以包含残基27至38(CDR1)、56至65(CDR2)和105至117(CDR3)(IMGT编号)。
表1中显示了优选的受体多样性支架结构域的实例，其中插入有供体多样性支架结构域。
其它优选的受体支架包括抗体恒定结构域，例如重链或轻链CH1、CH2或CH3结构域。
供体多样性支架结构域可以取代受体抗体可变结构域中的部分或更优选全部CDR(即CDR1，CDR2或CDR3)。
优选地，供体多样性支架结构域替代抗体可变结构域的全部或部分CDR1或CDR2。这允许更多样化和中心的CDR3以有助于结合活性以及配偶体抗体可变结构域。下面举例说明了将供体多样性支架结构域插入CDR1和CDR2中。
供体多样性支架结构域和受体抗体可变结构域或配偶体结构域的一个或多个CDR的相互作用序列可以与靶分子上的相同表位相互作用。例如，供体多样性支架结构域和抗体可变结构域和/或配偶体结构域的CDR3的相互作用序列可以与靶分子上的相同表位相互作用。
在一些优选的实施方式中，受体多样性支架结构域是抗体可变结构域，例如VH或VL结构域，并且供体多样性支架结构域是结蛋白或粘蛋白。表1中显示了包含结蛋白供体多样性支架结构域和VL结构域受体多样性支架的结合成员的实例。包含抗体可变结构域受体和富含半胱氨酸的供体结构域的结合成员在本文中被称为“结体”。
在一组优选的实施方式中，受体多样性支架结构域是抗体VL结构域，而供体多样性支架结构域是取代VL结构域的CDR2的结蛋白。合适的结蛋白可以结合离子通道如Kv1.3，并且可包括ShK和短肤蝎毒素。受体抗体VL结构域可能不显示靶结合，或可能结合至与结蛋白相同的靶分子、与结蛋白靶分子复合的相关蛋白、或与结蛋白不同的靶分子。
合适的结合成员可以例如包含具有SEQ ID NO：31至35中任一个的氨基酸序列(如表8B中所示)的融合蛋白，或者可以是这种序列的片段或变体。结合成员可以进一步包含与融合蛋白相关的配偶体结构域。合适的配偶体结构域包括任何VH结构域，例如表8B中所示的D12 A12 VH结构域(SEQ ID NO：30)。
合适的VH结构域可以是非结合物，可以与融合蛋白结合不同的靶分子，或者可以与融合蛋白结合相同的靶分子，例如增加融合蛋白的结合亲和力。
融合蛋白是参考序列的变体，如表1(SEQ ID NO：84-139)、表8B(SEQ ID NO：31至35)、表29(SEQ ID NO：308-317)或图29(SEQ ID NO：349和351)中所示的序列可以包含与参考序列具有至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或至少98％的序列同一性的氨基酸序列。特定的氨基酸序列变体可以由表1(SEQ ID NO：84-139)、表8B(SEQ ID NO：31至35)、表29(SEQ ID NO：308-317)或图29(SEQID NO：349和351)通过插入、添加、取代或缺失1个氨基酸，2、3、4、5、6、7、8、9或10或10个以上的氨基酸来完成。
在其它优选的实施方式中，受体多样性支架结构域可以是免疫球蛋白恒定结构域，例如来自抗体重链或轻链的免疫球蛋白恒定结构域，并且供体多样性支架结构域可以是结蛋白或粘蛋白。
优选地，使受体多样性支架结构域和供体多样性支架结构域的框架残基之间的距离最小化以降低结构域之间的蛋白水解不稳定性和/或相对柔性。这可能有助于促进结合亲和力。例如，供体多样性支架结构域的N端和C端可以各自直接连接至受体多样性支架结构域而无需连接子，或者通过1、2、3或4个氨基酸的连接子。可以使用相同或不同的连接子序列将供体多样性支架结构域的N和C末端连接至受体多样性支架结构域。
合适的连接子序列的实例显示在表2、26和27中。
在一些实施方式中，可能优选的是供体和受体多样性支架结构域通过不同于GGSG(SEQ ID NO：2)的连接子、不同于GGGS(SEQ ID NO：32)的连接子或不包含GG如SGG或GG的连接子来连接。
连接子长度是指融合在一起时从供体和受体结构域的支架元件获得或损失的氨基酸残基的数量。例如，去除支架残基并使用相同数量的随机化残基以连接供体和受体多样性支架结构域在本文中被认为是去除框架残基的随机化而不是引入另外的连接子残基。
在一些实施方式中，供体多样性支架结构域的N和/或C末端处的1、2、3或4个氨基酸和/或受体支架的插入位点每侧的1、2、3或4个氨基酸可以通过诱变和/或随机化来置换。
融合蛋白可以通过共价键或非共价键与配偶体结构域结合。
配偶体结构域可以与融合蛋白的受体多样性支架结构域和/或供体多样性支架结构域结合。优选地，配偶体结构域与受体多样性支架结构域相关联。
在一些优选的实施方式中，受体多样性支架结构域是抗体轻链可变(VL)结构域，并且配偶体结构域是抗体重链可变(VH)结构域。在其它优选的实施方式中，受体多样性支架结构域是抗体重链可变(VH)结构域，并且配偶体结构域是抗体轻链可变(VL)结构域。
在一些实施方式中，如本文所述的结合成员的抗体重链和轻链可变结构域可以通过柔性连接子连接，例如以scFv形式。
本文所述的结合成员包含融合蛋白。结合成员可以进一步包含与融合蛋白结合的配偶体结构域。例如，结合成员可以是异二聚体。
在一些实施方式中，结合成员可以包含两个或更多个融合蛋白或配偶体结构域。例如，结合成员可以是多聚体的。在一些实施方式中，结合成员的受体或供体多样性支架结构域可以形成同型多聚体，例如同型二聚体。结合成员的受体或供体多样性支架结构域可以与不同形式的相同结构域(例如野生型或诱变形式的结构域)配合。
除了融合蛋白和任选的配偶体结构域之外，结合成员还可以包含治疗性部分、半衰期延长部分或可检测标记。该部分或标记可以共价或非共价连接至融合蛋白或配偶体结构域。
在一些实施方式中，可以将结合成员展示在颗粒或分子复合物如细胞、核糖体或噬菌体上，例如用于筛选和选择。结合成员可以进一步包含展示部分，例如噬菌体外壳蛋白，以便于在颗粒或分子复合物上展示。噬菌体外壳蛋白可以融合或共价连接至融合蛋白或配偶体结构域。
在一些实施方式中，如本文所述的结合成员可展示有利特性，例如相对于分离的供体和/或受体多样性支架结构域增加的亲和力、稳定性、溶解性、表达、特异性或体内半衰期。
本发明的其它方面涉及如本文所述的结合成员文库的产生。
生产结合成员文库的方法可以包括：
提供编码包含插入受体多样性支架结构域的供体多样性支架结构域的融合蛋白质的多样化群体或集的核酸群体，任选地其中供体多样性支架结构域的N和C末端用至多4个氨基酸的连接子连接至受体多样性支架结构域，
其中供体多样性支架结构域包含供体支架和供体相互作用序列，并且受体多样性支架结构域包含受体支架和受体相互作用序列，并且
供体相互作用序列、体相互作用序列和连接子中的一者、两者或全部三者在所述群体中是不同的，
表达所述核酸群体以产生不同的群体或集，以及
任选地将融合蛋白与配偶体结构域或配偶体结构域群体相关联，从而产生结合成员文库。
核酸群体可以通过以下方法提供，该方法包括将编码供体多样性支架结构域的第一核酸群体插入到编码受体多样性支架结构域的第二核酸群体中，任选地其中第一和第二核酸与编码至多4个氨基酸的连接子的第三核酸群体连接，其中第一、第二和第三核酸群体中的一者、两者或全部三者是不同的。
核酸可以包含在载体中，例如表达载体。合适的载体包括基于噬菌体76或基于噬菌粒77的噬菌体展示载体。
核酸可以使用无细胞体外翻译系统如核糖体在细胞中或溶液中重组表达以产生文库。在一些优选的实施方式中，文库在其中结合成员的功能能够分离其编码核酸的系统中表达。例如，可以将结合成员展示在颗粒或分子复合物上以实现选择和/或筛选。在一些实施方式中，结合成员文库可以在珠、无细胞核糖体、噬菌体、原核细胞或真核细胞上展示。或者，编码的结合成员可以存在于乳剂内，其中结合成员的活性引起可识别的变化。或者，编码的结合成员可以在细胞内或其附近表达，其中结合成员的活性引起报道基因表达中的一个或多个表型改变16,78,79。
真核细胞受益于伴侣系统以协助分泌蛋白结构域的折叠80，并且这些在细菌表达系统中不存在。下面列出的数据显示了哺乳动物伴侣系统对于本文描述的结合成员的正确折叠不是必需的。此外，使用原核噬菌体展示系统鉴定的结合成员在定义上可以在噬菌体展示系统内进一步工程化以产生改善的结合物。原核系统例如噬菌体展示也有助于构建更大的文库，并促进从这些文库中选择、筛选和鉴定结合成员。相比之下，在真核系统中鉴定的结合成员可能不适合在原核系统内进一步工程化。
优选地，核酸在原核细胞例如大肠杆菌中表达。例如，核酸可以在原核细胞中表达以产生展示在噬菌体表面上的结合成员的文库。合适的原核噬菌体展示系统在本领域中是公知的，并且描述于例如Kontermann，R&Dubel，S，Antibody Engineering，Springer-Verlag New York，LLC；ISBN：3540413545，WO92/01047，US5969108，US5565332，US5733743，US5858657，US5871907，US5872215，US5885793，US5962255，US6140471，US6172197，US6225447，US6291650，US6492160和US6521404。噬菌体展示系统允许生产大型文库，例如具有108或更多、109或更多、或1010或更多成员的文库。
在其它实施方式中，细胞可以是真核细胞，例如酵母、昆虫、植物或哺乳动物细胞。
结合成员文库(例如由上述方法生成的文库)可以包括：
包含插入受体多样性支架结构域的供体多样性支架结构域的融合蛋白质的多样化群体，任选地其中供体多样化支架结构域的N和C末端各自连接至具有至多4个氨基酸的连接子的受体多样性支架结构域，
其中供体多样性支架结构域包含供体支架和供体相互作用序列，并且受体多样性支架结构域包含受体支架和受体相互作用序列，并且
供体相互作用序列、受体相互作用序列和连接子中的一者、两者或全部三者在所述群体中是不同的，
任选地其中群体中的每种融合蛋白与配偶体结构域相关联。
供体相互作用序列、受体相互作用序列和连接子中的一者、两者或全部三者的序列可以是不同的。例如，文库中的结合成员可能具有不同的供体相互作用序列和相同的受体相互作用序列；不同的受体相互作用序列和相同的供体相互作用序列；不同的连接子序列和相同的受体和供体相互作用序列；或不同的受体和供体相互作用序列
如本文所述的不同序列是在群体成员之间变化的序列，即序列在群体的不同成员中是不同的。不同的序列可以是随机的，即不同序列中每个位置的氨基酸或核苷酸的同一性可以从天然存在的氨基酸或核苷酸或其子集的完整组中随机选择。
使用本领域技术人员已知的方法，例如寡核苷酸定向诱变22,23(MolecularCloning：a Laboratory Manual：3rd edition，Russell等，2001，Cold Spring HarborLaboratory Press和其中的参考文献)，多样性可以针对供体相互作用序列、受体相互作用序列、配偶体结构域内的连接子或序列。例如，在受体多样性支架结构域是抗体可变结构域并且供体多样性支架结构域已经取代一个CDR区的情况下，可以将氨基酸改变(如不同序列)引入受体结构域或配偶体链的其它CDR中。在供体结构域是结蛋白的情况下，可以将不同序列引入连接核心支架元件的区域，例如半胱氨酸连结。已经显示了结蛋白结构能够容纳超过50％的非天然结构24。为了产生文库而将多样性引入到诸如EETI-II24，短肤蝎毒素25，ProTx-126和TRPA126的结蛋白支架中是本领域已知的。
不同的序列可以是连续的或可以分布在结构域内。本领域充分描述了将不同序列引入结构域的合适方法。例如，可以使用由核苷酸的部分或完全随机化产生的或由密码子混合物产生的寡核苷酸混合物(例如使用三核苷酸)产生多样化。或者，可以使用高通量基因合成方法合成不同的寡核苷酸群体，并将其组合以产生精确定义和控制的变体结构域群体。可选地可以使用“掺杂”技术，其中原始核苷酸占主导地位，而可选的核苷酸以较低频率存在。作为可选方案，下面的实施例2描述了使用来自天然来源(该实施例中的抗体集)的多样性以将多样性引入结构域的方法。
供体或受体结构域可以是多聚体蛋白质的一部分，并且由配偶体链引入潜在的额外多样性。整个配偶体链可以被替换，例如通过链改组27。或者，可以将多样性引入受体或供体的现有配偶体链的区域，例如，供体的VL受体的VH配偶体。一般而言，抗体的异源二聚体特性和选择配偶体链变体的能力独立于支持供体的受体链，这增加了该方法的力量。
优选地，文库是展示文库。文库中的结合成员可以展示在颗粒，或分子复合物如珠，核糖体，细胞或病毒，包括可复制遗传包装，如酵母，细菌或噬菌体(例如Fd、M13或T7)颗粒，病毒，细胞，包括哺乳动物细胞，或共价，核糖体或其它体外展示系统的表面上。每个颗粒或分子复合物可以包含编码由颗粒展示的结合成员的核酸，并且任选还包含展示的配偶体结构域(如果存在的话)。
在一些优选的实施方式中，文库中的结合成员展示在噬菌体的表面上。用于产生和筛选噬菌体展示文库的合适方法是本领域公知的。例如在WO92/01047和美国专利US5969108，US5565332，US5733743，US5858657，US5871907，US5872215，US5885793，US5962255，US6140471，US6172197，US6225447，US6291650，US6492160和US6521404中描述了噬菌体展示。
如本文所述的文库可以筛选展示结合活性的结合成员，例如与靶分子的结合。
结合可以直接测量或者可以通过结合所产生的激动或拮抗作用间接测量。
与靶分子的结合可以由一个或多个供体多样性支架结构域、受体多样性支架结构域和结合成员的配偶体结构域介导。
融合蛋白的供体和受体多样性支架结构域的相互作用序列可以与靶分子结合，更优选与靶分子的相同表位结合。结合成员的融合蛋白和配偶体结构域可以结合相同的靶分子或不同的靶分子。例如，融合蛋白可以结合第一靶分子，并且配偶体结构域可以结合第二靶分子。
结合成员可以以与亲本供体或受体多样性支架结构域相同的亲和力或者以更低或更高的亲和力结合靶分子。在一些实施方式中，结合成员可以中和靶分子的生物学活性。在其它实施方式中，结合成员可以激活靶分子的生物学活性。
合适的靶分子包括生物大分子，如蛋白质。靶分子可以是受体、酶、抗原或寡糖。在一些优选的实施方式中，靶标可以是完整的膜蛋白。在一些实施方式中，靶标可以是G蛋白缀合受体(GPCR)。难以用抗体靶向的靶分子如离子转运体可能是特别合适的。
在一些优选的实施方式中，靶分子可以是离子转运体，例如离子泵或离子通道。
合适的离子通道在本领域中是公知的，包括Kir1.1，Kir2.1，Kir6.2，SUR2，Kv1.1，KCNQ1，KCNQ，KCNQ4，TRPP2，TRPA1，TRPC6，CNGA1，BK，Nav1.1，Nav1Nav1.6，Nav2.1，Cav1.2，Cav2.1，甘氨酸受体，GABA-A，CHRNA482。其它合适的离子通道包括电压门控钾通道，如Kv1.3，L型电压门控钙通道，Cav2.2，hERG，ASIC和Eag1。
本文所述的结合成员可以结合两个或更多个不同的靶表位(即结合成员可以是多特异性的)。被结合成员结合的靶表位可以在相同或不同的靶分子上。例如，多特异性结合成员的一个或多个供体多样性支架结构域、受体多样性支架结构域和/或配偶体结构域可以与其它结构域的不同靶表位结合。
在一些实施方式中，结合成员可以是双特异性的，即它可以结合两个不同的表位。
双特异性结合成员可同时结合两个不同的靶表位。这可能有助于使第一和第二表位紧密接近例如交联分子或细胞。当靶表位位于不同的靶分子上时，靶分子可以通过与结合成员同时结合而紧密接近。当靶分子位于不同的细胞上时，靶分子与结合成员的同时结合可以使细胞紧密接近，例如以促进或增强细胞的相互作用。例如，结合到肿瘤特异性抗原和T细胞抗原例如CD3的结合成员可以用于使T细胞接近肿瘤细胞。
通过本文所述的结合成员的不同靶表位的同时结合还可以用于稳定靶分子或靶分子复合物的特定构象。
结合成员可以依次结合两个不同的靶表位，即结合成员可以结合一个靶表位，然后结合另一个靶表位。这可能是有用的，例如在穿越血液：脑屏障(BBB120)或血液：神经屏障(BNB121)时。例如，结合成员可以结合BBB或BNB受体上的表位。合适的受体在本领域中是公知的，包括转铁蛋白(TFR)，胰岛素(IR)，瘦蛋白(LEP-R)，葡萄糖(GLUT1)，CD98(LAT1)和脂蛋白(LRP-1)受体。一旦与BBB或BNB受体结合，结合成员就可以穿过BBB或BNB进行胞吞作用，之后其然后可以独立地结合至脑或外周神经系统中的第二靶分子上的表位，例如离子通道或蛋白酶。
在一些优选的实施方式中，结合成员可以结合TFR。例如，结合成员可以包含结合TFR的配偶体结构域和结合脑或外周神经系统中的第二靶分子的融合蛋白。融合蛋白中的受体支架可以是VL结构域，并且配偶体结构域可以是VH结构域。用于靶向TFR的合适的VH配偶体结构域可以包含表20中所示的序列(SEQ ID NO：237-245)或其变体。
用于筛选能够穿过BBB或BNB的双特异性结合成员的文库的合适体外系统在本领域中是公知的(Nakagawa,S.等人Neurochem.Int.54,253-263(2009)；Yosef，N.等人J.Neuropathol.Exp.Neurol.69,82-97(2010))并在下面更详细地描述。
在一些优选的实施方式中，结合成员上的第一结构域(例如，供体多样性支架结构域、受体多样性支架结构域和配偶体结构域中的一个)可以被导向第一细胞表面靶分子。与该第一靶分子的结合可以隔离细胞表面上的结合成员，从而通过增加细胞表面上的结合成员的局部浓度来促进第二结合域(例如供体多样性支架结构域、受体多样性支架结构域和配偶体结构域中的另一个)与第二靶分子的相互作用。例如，双特异性结合成员可以由VH配偶体结构域组成，其以高亲和力与T细胞上丰富的第一靶分子结合，所述T细胞与VL-结蛋白融合物结合并阻断第二靶分子，例如离子频道例如Kv1.3。可以例如通过选择代表候选靶分子的重组蛋白(如实施例6中所述)或通过选择靶细胞的细胞表面上的文库来产生细胞特异性结合结构域(该实施例中的VH)以寻找增强第二个域的结合的配偶体结构域(该实施例中的VH)。第一结构域与第一靶分子的结合使细胞表面上的结合成员隔离，并且可以克服第二结合结构域对第二靶分子的低亲和力、低密度或相对难以接近性。这可以增加第二结合结构域对表达由第一结合结构域识别的靶标的细胞的效力。该方法还可以增加结合成员的特异性，因为最佳的结合/阻断需要两个靶分子在同一细胞上。已经显示第一结合分子的存在基于亲和力和抗原密度在几个数量级上实现第二结合分子的结合增强(Rhoden等人(2016)J Biol.Chem.291p11337-11347)。
用于选择和筛选的靶分子可以使用任何便利的技术来产生。例如，整合膜蛋白可以使用细菌、杆状病毒或哺乳动物表达系统86,87、蛋白脂质体88、“纳米盘”89或细胞裂解物90产生。
在本文描述的一些实施方式中，结合成员的初始“创始”文库可以用于鉴定允许同时折叠供体和受体多样性支架结构域的一个或多个创始结合成员。可以选择这些创始结合成员用于显示所需结合活性的保留供体和受体结构域，例如与靶分子的结合。在随后的步骤中，可以对创始结合成员进行进一步的修饰和筛选以优化结合活性和其它性质。或者，结合成员的初始“创始”文库可以包括组合本文所述的受体多样性支架结构域、供体多样性支架结构域和任选的连接子的任何文库，其中将多样性引入任何的所述受体多样性支架域、供体多样性支架结构域或连接子序列。
如本文所述的筛选方法可以包括：
(i)提供如本文所述的结合成员的创始文库；
其中，供体相互作用序列、受体相互作用序列和连接子中的一者、两者或全部三者在所述创始文库中是不同的，
(ii)筛选文库中显示结合活性的结合成员，以及
(iii)鉴定显示结合活性的创始文库中的一种或多种结合成员。
一种或多种鉴定的结合成员可以从创始文库中回收。
在一些优选的实施方式中，连接子序列在文库中可以是不同的。这可以有助于确定供体和受体多样性支架结构域的功能融合。本文呈现了不同连接子序列的实例。在一些实施方式中，可以在供体多样性支架结构域和受体多样性支架结构域之间的接合处引入1、2、3或4个氨基酸的不同连接子以允许从所得文库中选择最佳接合序列。
任选地，受体多样性支架结构域内的序列也可以多样化以促进支持与供体多样性支架结构域功能性融合的受体多样性支架结构域的鉴定。在一些实施方式中，在两个结构域之间的一个或两个结合处的供体多样性支架结构域和/或受体多样性支架结构域的一个或多个氨基酸残基可以多样化(即与其它结构域的一个或两个接合直接相邻的结构域的一个或多个残基可以是多样化的)。下面提供了供体和受体支架的框架残基多样化的实例。例如，供体多样化支架结构域的N和C端接合处的1、2、3或4个残基和/或与供体结构域的接合处的受体多样性支架结构域内的1、2、3或4个残基可以是多样化的。
结合活性可以与靶分子结合。筛选文库的方法可以包括：
提供如本文所述的结合成员的创始文库，
使创始文库与靶分子接触，以及
选择与靶分子结合的一个或多个创始文库成员。
一种或多种鉴定或选择的结合成员可以被回收并进行进一步选择和/或筛选。
可以进行多轮淘选以鉴定显示结合活性的结合成员。例如，可以从创始文库中回收或分离富集结合活性的结合成员群体，并进行一轮或多轮筛选结合活性以产生一个或多个进一步富集的群体。可以从一个或多个进一步富集的群体中鉴定显示结合活性的创始结合成员并回收、分离和/或进一步研究。
显示结合活性的创始结合成员可以进一步工程化以改善活性或性质或引入新的活性或性质，例如结合性质如亲和性和/或特异性、增加的靶分子中和和/或调节靶分子的特定活性。结合成员也可以工程化以改善稳定性、溶解性或表达水平。
例如，鉴定的创始结合成员的鉴定的连接子序列可以保留在修饰的文库中，取决于应用和期望的结果，将不同序列引入一个或多个受体、供体或配偶体结构域。在某些情况下，连接子的进一步多样化可能对优化结合成员的功能有用。
如本文所述的筛选方法可以进一步包括：
(iv)在本文所述的一种或多种结合成员的氨基酸序列的一个或多个位置处引入不同的氨基酸残基，例如从创始文库中鉴定的一种或多种结合成员，以产生修饰的结合成员文库，
(v)针对显示结合活性的修饰的结合成员筛选修饰的文库，以及
(vi)对显示结合活性的修饰的文库中的一种或多种修饰的结合成员进行鉴定。
结合活性可以与靶分子结合。筛选文库的方法可以包括：
提供如上所述的修饰的结合成员文库，
使修饰的文库与靶分子接触，以及
选择与靶分子结合的一种或多种修饰的文库成员。
一种或多种鉴定或选择的结合成员可以被回收并进行进一步的筛选。
可以通过本文其它地方所述的任何合适的技术引入各种氨基酸，包括随机诱变或定点诱变。
可以鉴定一种或多种修饰的结合成员，其相对于步骤(iii)中鉴定的一个或多个创始结合成员显示增加或改善的结合活性，例如增加的结合亲和力和/或特异性。
可以进行多轮淘选以鉴定显示改善结合活性的修饰的结合成员。例如，可以从文库中回收或分离富集改善结合活性的结合成员群体，并进行一轮或多轮筛选结合活性以产生一个或多个进一步富集的群体。可以从一个或多个进一步富集的群体中鉴定并分离显示改善结合活性的修饰的结合成员和/或进一步研究。
可以进一步对创始或修饰的结合成员进行进一步的诱变，例如产生进一步修饰的文库和选择具有改善或新的活性或性质的结合成员。氨基酸残基可以在来自文库和/或修饰的文库的一种或多种鉴定的结合成员的氨基酸序列中的一个或多个位置突变。例如，一种或多种鉴定的结合成员的供体支架、供体相互作用序列、受体支架、受体相互作用序列、连接子或配偶体结构域内的氨基酸残基可以突变。
该突变可以在一个或多个位置引入不同的氨基酸残基以产生进一步修饰的结合成员的文库。下面显示了受体和供体的相互作用和支架残基的删除或置换以及它们随机残基的置换的实例。
为了产生结合成员，其中诸如配偶体VH或VL结构域的配偶体结构域与靶分子产生另外的相互作用接触，可以生成一个文库，其中原始配偶体结构域被整个可选配偶体结构域集替换以创建“链改组”文库。具有改善活性的结合成员由于新选择的配偶体结构域的有益贡献而可以被鉴定、回收和隔离。
如本文所述的筛选方法可以进一步包括：
(vii)将来自如上所述的一种或多种鉴定的结合成员或修饰的结合成员的融合蛋白与配偶体结构域的不同群体相关联以产生改组的结合成员文库，
(viii)针对显示结合活性的改组的结合成员筛选改组的文库，
(ix)对显示结合活性的一种或多种改组的结合成员进行鉴定。
可以对相对于步骤(iii)中鉴定的一个或多个创始结合成员和/或步骤(vi)中鉴定的修饰的结合成员显示增加的结合活性的一种或多种改组的结合成员进行鉴定。
可以进行多轮淘选或功能筛选以鉴定显示增加或改善的结合活性的改组的结合成员。例如，可以从改组文库中分离出富含改善结合活性的改组的结合成员，并进行一轮或多轮筛选结合活性以产生一个或多个进一步富集的改组群体。可以从一个或多个进一步富集的群体中鉴定显示改善结合活性的改组的结合成员，并分离和/或进一步研究。
可以通过确定文库中的结合成员与靶分子的结合来筛选创始文库、修饰文库或改组文库。
结合可以通过任何合适的技术来确定。例如，创始文库、修饰文库或改组文库可以在结合条件下与靶分子接触足够的时间，以使靶分子与文库相互作用并与其至少一个成员形成结合反应复合物。
结合条件是那些与靶分子的已知天然结合功能相容的条件。那些相容的条件是缓冲液、pH和温度条件，其维持靶分子的生物活性，从而维持分子参与其预选结合相互作用的能力。通常，这些条件包括通常与感兴趣的靶分子相关的pH和离子强度的水性生理溶液。
创始文库、修饰文库或改组文库可以以非均质或均质混合物的形式与靶分子接触。因此，文库的成员可以处于固相，而靶分子存在于液相中。可选地，靶分子可以处于固相，而文库的成员存在于液相中。此外，文库成员和靶分子都可以处于液相。
确定结合成员与靶分子结合的合适方法是本领域熟知的，包括ELISA、珠基结合测定(例如使用链霉亲和素包被的珠与生物素化的靶分子结合)、表面等离子体共振、流式细胞术、Western印迹、免疫细胞化学、免疫沉淀和亲和层析。可选地，可以使用生物化学或基于细胞的测定，如HT-1080细胞迁移测定或基于荧光或基于发光的报道测定。
在一些实施方式中，可以通过检测由结合成员与靶分子如配体、受体或离子通道结合产生的激动或拮抗作用(包括在离子通道和酶的情况下的阻断活性)来确定结合。例如，可以通过在报道细胞中表达文库并鉴定具有改变的基因表达或表型的一种或多种报道细胞来筛选创始文库、修饰文库或改组文库。用于筛选结合成员的重组群体的合适的功能筛选技术在本领域是公知的16,78,79,91。
已经报道了通过将基因集克隆到报道细胞中来构建文库的系统16,78。这些系统在一个细胞内组合表达和报道，并且通常引入针对预定义靶标选择的抗体群体(例如，使用噬菌体或哺乳动物展示)。
可以使用标准技术将如本文所述的编码结合成员的核酸群体引入报道细胞以产生文库。可以鉴定具有结合成员引导的表型改变(例如改变的基因表达或存活)的群体内的克隆。为了使这种表型定向选择发挥作用，需要保持存在于表达细胞内的结合成员基因(基因型)与结合成员表达(表型)的结果之间的连接。这可以例如通过将结合成员系链到细胞表面来实现，如针对抗体展示所描述的或者通过使用半固体培养基将分泌的抗体保留在生产细胞附近105。可选地，可以将结合成员保留在细胞内。保留在细胞表面或周围介质中的结合成员可能与细胞表面上的内源性或外源性受体相互作用，引起受体的激活。这又可能引起报道基因表达的改变或细胞表型的改变。作为替代方案，结合成员可以阻断受体或配体以减少受体激活。编码引起修饰的细胞行为的结合成员的核酸然后可以回收用于生产或进一步工程化。
作为这种“靶向”方法的替代方案，可以向细胞中引入尚未针对特定靶分子预先选择的“天然”结合成员群体。细胞报道系统用于鉴定行为改变的群体。由于目前没有关于靶分子的知识，所以这种非靶向方法对于大集是特别需要的，因为不可能将结合成员群体预先富集到靶分子上。
“功能选择”方法可以用于涉及真核细胞文库的其它应用，特别是高等真核生物如哺乳动物细胞。例如，可以将结合成员与信号传导结构域融合，从而与靶分子的结合引起受体的激活。合适的信号传导结构域包括细胞因子受体结构域，例如血小板生成素(TPO)受体、促红细胞生成素(EPO)受体、gp130、IL-2受体和EGF受体。结合成员-受体嵌合体可以用于驱动初级或稳定报道细胞中的靶分子依赖性基因表达或表型变化。这种能力可用于鉴定文库中驱动信号传导响应的融合结合成员或抑制响应的结合物123-125。
使用本文所述的方法鉴定的受体和连接子序列的组合可以用于呈现相同类别的不同供体多样性支架结构域，例如具有相同数量的半胱氨酸残基或不同类别的富含半胱氨酸的蛋白质。
供体多样性支架结构域可以在来自文库、修饰文库和/或改组文库中的一种或多种鉴定的结合成员中用替代的供体多样性支架结构域置换。
供体多样性支架结构域和替代供体多样性支架结构域可以来自相同的支架类别。例如，供体多样性支架结构域和替代供体多样性支架结构域可以包含相同的支架和不同的相互作用序列。在一些实施方式中，供体多样性支架结构域可以是结合第一靶分子的结蛋白，并且替代供体多样性支架结构域可以是结合第二靶分子的结蛋白。已经针对如本文所述的一个结蛋白供体多样性支架结构域进行优化的受体多样性支架结构域可能对于所有结蛋白供体多样性支架结构域都是有用的。例如，创始结合成员的受体抗体可变结构域内的供体结蛋白结构域可以被不同的结蛋白供体结构域置换，如下所示。
供体多样性支架结构域和替代供体多样性支架结构域可以来自不同的支架类别。例如，供体多样性支架和替代供体多样性支架可以包含不同的供体支架和不同的供体相互作用序列。例如，创始结合成员的受体抗体可变结构域内的供体结蛋白结构域可以被粘蛋白供体多样性支架结构域置换，如下所示。
可以将另外的氨基酸序列引入来自文库和/或修饰文库的一种或多种鉴定的结合成员的融合蛋白或配偶体结构域中。例如，供体多样性支架结构域(例如结蛋白供体结构域)可以工程化以引入新的结合特异性，例如通过使用体外显示技术的合理设计、环形移植和基于组合库的方法。
另外的氨基酸序列可以是靶结合序列，如VEGF-A结合序列92或血小板生成素(TPO)结合序列54。
在一些实施方式中，可以将不同序列引入如本文所述的结合成员中以产生用于选择改善变体的另外文库。例如，可以将多样性引入供体或受体多样性支架结构域或配偶体结构域。合适的不同序列可以通过寡核苷酸定向诱变或随机诱变引入22。
在一些实施方式中，由选自结合成员内的供体多样性支架结构域、受体多样性支架结构域和配偶体结构域中的第一结构域介导的结合可以用作指导结构域，以使用本文所述的方法指导从文库选择以鉴定其中第二结构域也有助于结合的修饰或改组的结合成员。
第二结构域可以与第一引导结构域相同的靶分子相互作用或可以与与其紧密相关的第二靶分子相互作用。例如，通过来自配偶体VH结构域或受体VL结构域与相同α亚单位或与相关亚单位(例如离子通道的β亚单位)结合的额外接触可以增加或延长通过结蛋白供体多样性支架结构域与离子通道的α亚单位(例如电压门控钠或钾通道(例如Nav或Kv通道))的结合。
在第二轮中，原始指导结构域也可以被修改或置换。例如，结合成员的供体多样性支架结构域、受体多样性支架结构域或配偶体结构域中的一个可以充当结合靶分子的第一指导结构域。已经鉴定了有助于结合靶分子的第二结构域，方法可以包括修饰或置换所述第一指导结构域以产生包含第二结构域和不同的第一结构域的结合成员文库。这导致最终融合蛋白得益于如本文所述的在其发育期间原始引导结构域的可用性，但不包含原始引导结构域。这可能是有用的，例如如果期望最终的结合成员不包含供体多样性支架结构域在受体多样性支架结构域内的融合。
例如，如果在第一轮选择中使用结合成员内的结蛋白供体多样性支架结构域来分离配偶体抗体可变结构域(例如VH结构域)，那么该配偶体抗体可变结构域可以转而充当第二轮中的引导以选择替代互补可变域(例如VL域)。该互补结构域可以是具有融合供体多样性支架结构域的受体多样性支架结构域，或者可以是正常(即未融合)的抗体可变结构域。在一些实施方式中，通过使用离子通道结合供体多样性支架结构域从第一周期鉴定的抗体可变结构域(例如VH结构域)可以结合离子通道的相关亚单位，例如与不同α链相互作用的β链。然后这个抗体可变结构域可以指导互补抗体可变结构域或VL-供体多样性支架结构域融合蛋白选择朝向与同一β链相关联的不同α链。
在一些实施方式中，第一结构域可以以低至中等的亲和力与靶分子结合。例如，亲和力可能小于KD 100nM。这允许由于可能结合相同蛋白质或紧密相关的亚单位的第二结构域的贡献而改善结合。可选地，第二结构域可以与相同细胞上的非相互作用或弱相互作用分子结合，以隔离靶细胞上的第二结构域，从而促进其与靶标的相互作用。
在一些实施方式中，靶分子可以以标记或未标记的形式存在于细胞的表面上以确定结合93。例如，整合膜蛋白如离子转运体或GPCR可以用标签表达。可以对包含结合标签的配偶体结构域(例如抗体VH或VL结构域)和存在于VL或VH受体结构域上的不同群体的供体多样性支架结构域的结合成员文库进行选择以改善与标记且细胞表面表达的靶蛋白的结合。这可以允许鉴定在标签外结合靶蛋白的融合蛋白和供体多样性支架结构域。这些融合蛋白和供体多样性支架结构域可以用于进一步筛选，例如具有不同的配偶体结构域，以鉴定结合未标记的靶蛋白的结合成员。
本领域已知各种合适的标签，包括例如MRGS(H)6(SEQ ID NO：36)，DYKDDDDK(SEQID NO：37)(FLAGTM)，T7-，S-(KETAAAKFERQHMDS；SEQ ID NO：38)，poly-Arg(R5-6)，poly-His(H2-10)，poly-Cys(C4)poly-Phe(F11)poly-Asp(D5-16)，Strept-标签II(WSHPQFEK；SEQ IDNO：39)，c-myc(EQKLISEEDL；SEQ ID NO：40)，流感-HA标签(Murray，P.J.等(1995)AnalBiochem 229,170-9)，Glu-Glu-Phe标签(Stammers，D.K.等(1991)FEBS Lett 283,298-302)，标签.100(Qiagen；来自哺乳动物MAP激酶2的12个aa标签)，Cruz标签09TM(MKAEFRRQESDR；(SEQ ID NO：41)，Santa Cruz Biotechnology Inc.)和Cruz标签22TM(MRDALDRLDRLA；(SEQ ID NO：42)，Santa Cruz Biotechnology Inc.)。已知的标签序列在Terpe(2003)Appl.Microbiol.Biotechnol.60 523-533中审查。
在一些实施方式中，如本文所述的文库、修饰文库和/或改组文库可以对其中供体多样性支架结构域和/或受体多样性支架结构域采用其天然结构的结合成员进行选择，即它们被正确地折叠成活跃构象。
例如，当供体多样性支架结构域结合已知的靶分子时，如本文所述的创始文库、修饰文库和/或改组文库可以对与靶分子结合的结合成员进行选择。与靶分子结合的结合成员包含活跃并正确折叠成其天然结构的供体多样性支架结构域。例如，当供体多样性支架结构域的实际结构未知时，这可能是有用的。
除了基于亲和力的选择来正确折叠供体多样性支架，选择系统如噬菌体展示可以为受体的正确折叠提供额外的选择性，因为已经显示了噬菌体展示富集具有优异结构完整性的融合物94。当受体多样性支架结构域是免疫球蛋白或其片段或结构域时，如本文所述的文库、修饰文库和/或改组文库可以对结合免疫球蛋白结合分子的结合成员进行选择95。与免疫球蛋白结合分子结合的结合成员包含受体多样性支架结构域，其尽管融合有供体结构域，但也活跃并正确折叠成其天然结构。像以前所做的那样，通过使展示的元件群体(例如噬菌体展示群体)经受更多破坏性条件例如温度升高，可以进一步改善系统的严格性94,96。
合适的免疫球蛋白结合分子在本领域中是公知的，并且包括蛋白L、蛋白G和蛋白A，以及抗Ig抗体和抗体片段的野生型和工程化形式。在一些实施方式中，免疫球蛋白结合分子可以包含在亲和色谱介质中。合适的亲和层析介质在本领域中是公知的，包括κSelectTM，λSelectTM，IgSelectTM和γBindTM(GE Healthcare)。
可以进一步测试如上所述鉴定的一种或多种结合成员，例如以确定与靶分子结合的功能效应。方法可以包括确定从文库、修饰文库和/或改组文库鉴定的一种或多种结合成员对靶分子活性的影响。
在一些实施方式中，靶分子可以是离子通道，并且可以确定一种或多种鉴定的结合成员对通过通道的离子流的影响。
通过通道的离子通量可以使用常规电生理学技术如夹片钳来确定。例如，可以在离子通道的内源或异源表达之后使用双电极电压钳来测量离子通量。在一些实施方式中，离子通道功能可以使用基于荧光的屏幕来确定。例如，表达内源或异源离子通道的细胞例如电压门控钙通道(Cav)可以装载荧光团如Fura3或钙绿。通过K+诱导的去极化激活离子通道导致细胞内离子浓度的瞬时增加，其可以容易地测量。用于去极化细胞膜和记录响应的合适系统(例如FlexStationTM；Molecular Devices Inc USA)在本领域中是可用的。
通过通道的离子通量也可以使用荧光蛋白离子传感器来确定。合适的荧光蛋白离子传感器可以在本领域中是可用的97。
在一些实施方式中，可以确定一种或多种鉴定的结合成员对一组靶标分子的影响。例如，可以确定一种或多种鉴定的结合成员对通过一组离子通道的离子流的影响。例如，在确定或表征结合成员的特异性时，这可能是有用的。可选地，当靶标是蛋白酶时，可以确定一种或多种鉴定的结合成员对蛋白酶活性的影响。可选地，当靶标是受体时，可以确定一种或多种鉴定的结合成员对细胞信号传导的影响。
在如上所述鉴定之后，可以从文库、修饰文库和/或改组文库中回收、分离和/或纯化所述一种或多种鉴定的结合成员。
在优选的实施方式中，文库中的每个结合成员可以展示在包含编码结合成员的核酸的颗粒如珠、核糖体、细胞或病毒的表面上。
在选择显示结合活性(例如结合靶分子)并展示在噬菌体或其它文库颗粒或分子复合物上的结合成员后，可以从展示选择的结合成员的噬菌体或其它颗粒或分子复合物获得核酸。
展示一种或多种鉴定的结合成员的颗粒可以从文库、修饰文库和/或改组文库中分离和/或纯化。编码一种或多种鉴定的结合成员的核酸可以从颗粒分离和/或纯化。
编码一种或多种鉴定的结合成员的分离核酸可以被扩增、克隆和/或测序。
核酸扩增、克隆和/或测序的合适方法在本领域中是公知的(参见例如Protocolsin Molecular Biology,Second Edition,Ausubel等eds.John Wiley&Sons)。
分离核酸的序列可用于随后生产结合成员或融合蛋白。
可以合成一种或多种鉴定的结合成员或编码核酸。例如，一种或多种结合成员可以全部或部分地通过化学合成来产生。例如，结合成员或个体供体或受体多样性支架结构域或融合蛋白及其配偶体结构域可以使用液相或固相合成方法；在溶液中；或通过固相、液相和溶液化学的任何组合来合成，例如，通过首先完成相应的肽部分，然后如果需要和适当，在除去存在的任何保护基之后，通过相应的碳酸或磺酸或其反应性衍生物的反应引入残基X.
化学合成多肽是本领域众所周知的(J.M.Stewart和J.D.Young,Solid PhasePeptide Synthesis,2nd edition,Pierce Chemical Company,Rockford,Illinois(1984)；M.Bodanzsky和A.Bodanzsky,The Practice of Peptide Synthesis,SpringerVerlag,New York(1984)；J.H.Jones,The Chemical Synthesis of Peptides.OxfordUniversity Press,Oxford 1991；in Applied Biosystems 430A User’s Manual,ABIInc.,Foster City,California；G.A.Grant,(Ed.)Synthetic Peptides,A User’sGuide.W.H.Freeman&Co.,New York 1992,E.Atherton和R.C.Sheppard,Solid PhasePeptide Synthesis,A Practical Approach.IRL Press 1989和G.B.Fields中,(Ed.)Solid-Phase Peptide Synthesis(Methods in Enzymology Vol.289).Academic Press,New York and London 1997)。
一种或多种鉴定的结合成员可以从编码核酸重组表达。例如，可以在宿主细胞中表达编码结合成员的核酸，并从细胞培养物分离和/或纯化表达的多肽。
如上所述的核酸序列和构建体可以包含在表达载体内。合适的载体可以被选择或构建，包含合适的调节序列，包括启动子序列、终止子片段、聚腺苷酸化序列、增强子序列、标志物基因和其它适当的序列。优选地，载体含有适当的调节序列以驱动核酸在宿主细胞中的表达。驱动表达系统中异源核酸编码序列表达的合适调控序列是本领域熟知的，并且包括组成型启动子，例如病毒启动子如CMV或SV40，和诱导型启动子如Tet-on受控启动子。载体还可以包含序列，例如复制起点和选择性标记，这允许其在细菌宿主如大肠杆菌和/或真核细胞中选择和复制和表达。
用于在细胞培养物中表达重组多肽以及其随后的分离和纯化的许多已知技术和方案在本领域中是已知的(Protocols in Molecular Biology,第2版,Ausubel等eds.JohnWiley&Sons,1992；Recombinant Gene Expression Protocols Ed RS Tuan(Mar 1997)Humana Press Inc)。
合适的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、植物细胞、丝状真菌、酵母和杆状病毒系统以及转基因植物和动物。本领域已经确定了抗原和抗体片段在原核细胞中的表达。常见的细菌宿主是大肠杆菌。
在培养的真核细胞中的表达对于本领域技术人员而言也可用作生产结合成员的选项。本领域中可用于表达异源多肽的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、海拉细胞、幼仓鼠肾细胞、NS0小鼠黑素瘤细胞、YB2/0大鼠骨髓瘤细胞、人胚胎肾细胞(例如HEK293细胞)、人胚胎视网膜细胞(例如PerC6细胞)和许多其它细胞。
一种或多种鉴定的结合成员可以重新形成。例如，包含免疫球蛋白受体结合结构域或免疫球蛋白配偶体结构域的结合成员可以重新形成为scFv、Fab、scFv-Fc、Fc、IgA、IgD、IgM、IgG或半抗体。方法可以包括从克隆细胞中分离编码免疫球蛋白结构域的核酸(例如VH或VL结构域)，扩增编码所述结构域的核酸，并且将扩增的核酸插入载体以提供编码抗体分子的载体。下面举例说明了从scFv形式重新形成为Fab和IgG形式。
在一些实施方式中，可以分离来自一种或多种鉴定的结合成员的供体多样性支架结构域。本文所述的方法可以进一步包括从来自创始文库、修饰文库和/或改组文库的一种或多种鉴定的结合成员合成或重组表达分离的供体多样性支架结构域。
分离的供体多样性支架结构域可以重新形成。例如，供体多样性支架结构域可以插入本文所述的结合成员中的不同受体多样性支架结构域中，或可以插入不同的结合成员形式，例如N或C末端融合。
在一些实施方式中，分离的供体多样性支架结构域可以用作独立结合分子，不含任何受体结构域或融合配偶体。
可检测或功能性的标记或半衰期延长部分可以连接至一种或多种鉴定的结合成员。
标记可以是产生或可被诱导产生信号的任何分子，包括但不限于荧光剂、放射性标记、酶、化学发光剂或光敏剂。因此，可以通过检测荧光或发光、放射性、酶活性或光吸收来检测和/或测量结合。
合适的标记包括酶，如碱性磷酸酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(“G6PDH”)，α-D-半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，葡萄糖淀粉酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，溶菌酶，苹果酸脱氢酶和过氧化物酶辣根过氧化物酶；染料；荧光标记或荧光粉，如荧光素及其衍生物，荧光染料，罗丹明化合物和衍生物，GFP(用于“绿色荧光蛋白”的GFP)，丹磺酰，伞形酮，藻红蛋白，藻蓝蛋白，别藻蓝蛋白，邻苯二甲醛和荧光胺；荧光团，如镧系元素穴合物和螯合物，例如铕等(Perkin Elmer和Cis Biointernational)；化学发光标记或化学发光剂，如异鲁米诺，鲁米诺和二氧杂环丁烷；生物发光标记，如萤光素酶和萤光素；敏化剂；辅酶；酶底物；放射性标记，包括溴77，碳14，钴57，氟8，镓67，镓68，氢3(氚)，铟111，铟113m，碘123m，碘125，碘126，碘131，碘133，汞107，汞203，磷32，铼99m，铼101，铼105，钌95，钌97，钌103，铱107，钌105，钪47，硒75，硫35，锝99，锝99m，碲121m，碲122m，碲125m，铥165，铥167，铥168和钇199；颗粒，如胶乳或碳颗粒；金属溶胶；微晶；脂质体；细胞等，其可以进一步用染料、催化剂或其它可检测基团标记；和分子如生物素，地高辛或5-溴脱氧尿苷；毒素部分，例如选自假单胞菌外毒素(PE或其细胞毒性片段或突变体)，白喉毒素或其细胞毒性片段或突变体，肉毒毒素A，B，C，D，E或F，蓖麻毒蛋白或其细胞毒性片段，蓖麻毒蛋白A，相思豆毒蛋白或其细胞毒性片段，皂草素或其细胞毒性片段，美洲商陆抗病毒毒素或其细胞毒性片段以及苔藓素1或其细胞毒性片段的组的毒素部分。
合适的酶和辅酶公开于Litman等人的US4275149和Boguslaski等人的US4318980中。合适的荧光剂和化学发光剂公开于Litman等人的US4275149中。标记还包括化学部分，例如生物素，其可以通过结合特定的同源可检测部分(例如标记的亲和素或链霉亲和素)来检测。可以使用本领域已知的常规化学方法将可检测标记附着于本发明的抗体。
合适的半衰期延伸部分包括与Fc结构域或血清白蛋白的融合蛋白、非结构化肽例如XTEN98或PAS99聚乙二醇(PEG)，
本文描述的方法可以进一步包括将来自文库、修饰、文库和/或改组、文库或分离的供体多样性支架结构域的一种或多种鉴定的结合成员与药学上可接受的赋形剂一起配制。
本文所用的术语“药学上可接受的”涉及在合理的医学判断范围内适用于与受试者(例如人)的组织接触的化合物、材料、组合物和/或剂型，而没有过度的毒性、刺激性、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。每种载体、赋形剂等在与制剂的其它成分相容的意义上也必须是“可接受的”。合适的载体、赋形剂等可以在标准药学教科书中找到，例如Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack PublishingCompany，Easton，PA，1990.
本发明的另一方面提供了编码本文所述的融合蛋白或结合成员的核酸。
核酸可以包含DNA或RNA，并且可以全部或部分合成。除非上下文另有要求，否则本文提出的核苷酸序列包括具有特定序列的DNA分子，并且包括具有其中U取代T的特定序列的RNA分子。
本发明的另一个方面提供了包含本文所述的核酸的载体，以及包含该核酸的转录或表达盒。载体可以是合适的质粒，病毒例如噬菌体或噬菌粒。更多细节参见例如Molecular Cloning：a Laboratory Manual：第3版，Russell等，2001，Cold Spring HarborLaboratory Press。
本发明的另一个方面提供了编码本文所述的结合成员文库的核酸群体。
编码文库的核酸可以包含在表达载体如噬菌体或噬菌粒载体中。
本发明的另一方面提供了包含本文所述文库和/或编码本文所述文库的核酸群体的颗粒群体。
该文库可以展示在病毒颗粒的表面上。文库中的每个结合成员可以进一步包含噬菌体外壳蛋白以促进展示。每个病毒颗粒可以包含编码展示在颗粒上的结合成员的核酸。合适的病毒颗粒包括噬菌体，例如丝状噬菌体如M13和Fd。用于产生噬菌体展示文库的技术在本领域中是公知的。
本发明的其它方面提供了包含如本文所述的结合成员、核酸或载体的宿主细胞，以及包含本文所述的文库、核酸群体和/或病毒颗粒群体的宿主细胞群体。
本发明的另一方面提供了包含本文所述的融合蛋白或结合成员和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
药物组合物可以方便地以单位剂量形式存在，并且可以通过药学领域中公知的任何方法来制备。这些方法包括将结合成员与可构成一种或多种辅助成分的载体结合的步骤。一般而言，药物组合物通过将活性化合物与液体载体或细分的固体载体或两者均匀且紧密地结合在一起，然后如果需要则使产物成形来制备。
药物组合物可以是液体，溶液，悬浮液，乳剂，酏剂，糖浆剂，片剂，锭剂，颗粒剂，散剂，胶囊剂，扁囊剂，丸剂，安瓿剂，栓剂，阴道栓剂，软膏剂，凝胶剂，糊剂，薄雾，泡沫，乳液，油，大丸药，冲剂，或气溶胶。
结合成员或包含结合成员的药物组合物可以通过任何方便的施用途径施用于受试者，无论是全身/外周地或在期望的作用部位，包括但不限于口服(例如通过摄取)；局部(包括例如透皮，鼻内，眼部，颊部和舌下)；肺部(例如通过使用例如气雾剂的吸入或吹入疗法，例如通过口或鼻)；直肠；阴道；例如通过注射，包括皮下，皮内，肌内，静脉内，动脉内，心内，鞘内，脊髓内，囊内，囊下，眼眶内，腹膜内，气管内，表皮下，关节内，蛛网膜下和胸骨内；例如通过皮下或肌内植入长效制剂。
适于口服施用(例如通过摄取)的药物组合物可以作为离散单位存在，例如胶囊剂、扁囊剂或片剂，各自含有预定量的活性化合物；作为粉末或颗粒；作为在水性或非水性液体中的溶液或悬浮液；或作为水包油液体乳剂或油包水液体乳剂；作为丸药；作为冲剂；或作为贴剂。
适于肠胃外施用(例如通过注射，包括皮肤，皮下，肌肉内，静脉内和皮内)的药物组合物包括水性和非水性等渗、无热原、无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、防腐剂、稳定剂、抑菌剂以及使制剂与预期受体的血液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可包含悬浮剂和增稠剂，以及设计用于将化合物靶向血液成分或一种或多种器官的脂质体或其它微粒体系。适用于此类制剂的等渗媒介物的实例包括氯化钠注射液、林格溶液或乳酸林格氏注射液。典型地，溶液中的活性化合物的浓度为约1ng/ml至约10μg/ml，例如约10ng/ml至约1μg/ml。制剂可以存在于单位剂量或多剂量密封容器(例如安瓿和小瓶)中，并且可以以冷冻干燥(冻干)条件存储，仅需要在使用前立即添加无菌液体载体，例如注射用水。
应该理解的是，结合成员的合适剂量可以因患者而异。确定最佳剂量将通常涉及针对施用的任何风险或有害副作用来平衡诊断益处水平。所选择的剂量水平将取决于多种因素，包括但不限于施用途径，施用时间，显像剂排泄速率，所需造影剂量，其它药物，化合物和/或联合使用的材料，以及患者的年龄，性别，体重，状况，一般健康状况和以前的病史。显像剂的量和施用途径最终将由医生决定，但是通常剂量将是实现显像剂在诸如肿瘤、感兴趣组织或全身等部位处的显像剂浓度，其允许成像而不会造成实质性的不良或有害的副作用。
体内施用可以以一个剂量、连续或间歇方式(例如，以适当间隔分开的剂量)进行。确定最有效的施用方法和剂量的方法对于本领域技术人员是公知的，并且将随着用于治疗的制剂、治疗目的、被治疗的靶细胞和被治疗的受试者而变化。可以在医生选择剂量水平和模式的情况下进行单次或多次施用。
本文所述的结合成员可用于人或动物受试者(例如人)的诊断或治疗方法。靶分子的结合成员(例如离子通道)可用于治疗与靶分子相关的病症。
本发明的其它方面提供了本文所述的融合蛋白、结合成员或组合物用作药物；本文所述的融合蛋白、结合成员或组合物用于治疗疼痛或自身免疫性疾病；以及本文所述的融合蛋白、结合成员或组合物在制备用于治疗与离子通道活性或功能障碍相关的病症的药物中的用途。
本发明的另一个方面提供了治疗方法，其包括将本文所述的结合成员或组合物施用于有需要的个体，任选地用于治疗与离子通道活性或功能障碍相关的病症。
本文所述的有效量的结合成员或组合物单独或与本领域已知或本文所述的另一种适当药物的组合治疗方案可用于治疗或减轻与有需要的患者中的靶分子相关的任何疾病或病症的至少一种症状的严重程度，从而降低上述任何疾病的至少一种症状的严重程度。
本发明的其它方面和实施方式提供了上述的方面和实施方式，其中术语“包含”被术语“由……组成”替换，以及上述的方面和实施方式，其中术语“包含”被术语“基本上由……组成”替换。
应该理解的是，除非上下文另有要求，否则本申请公开了上述任何方面和上述实施方式的所有彼此组合。类似地，除非上下文另有要求，本申请公开了优选和/或可选的单独特征或与任何其它方面一起的所有组合。
对于本领域技术人员来说，上述实施方式、其它实施方式及其修改的变化在阅读本公开时是显而易见的，因此这些都在本发明的范围内。
出于所有目的，本说明书中提及的所有文献、网站、数据库和序列数据库条目的内容(包括其中公开的氨基酸和核苷酸序列)通过引用整体并入本文。
本文中使用的“和/或”被认为是两个特定特征或部件中具有或不具有另一个的每一个的具体公开。例如，“A和/或B”将被视为(i)A，(ii)B，以及(iii)A和B的每一个的具体公开，就像每个在本文中单独列出一样。
现在将通过实施例并参考上述附图来说明本发明的某些方面和实施方式。
实验
1.总结
本文首先例示供体多样性支架(例如结蛋白)融合到受体多样性支架结构域(例如抗体VL结构域)中，使用胰蛋白酶抑制剂；Ecballium elaterium胰蛋白酶抑制剂-II(EETI-II)。在该结蛋白支架中，与胰蛋白酶的高亲和力结合依赖于结蛋白的正确折叠。将该结蛋白基因克隆到抗体轻链受体的CDR1或CDR2中(表现为κ和λ轻链两者)。创建了受体变体库以允许选择可容纳进入的供体的那些受体变体。供体和受体结构域紧密相关。在下面的实施例中，进入的供体替换了CDR环，并且进入的供体结构域的末端与侧翼抗体框架残基(即核心结构的β链序列)融合。在下面的一些实施例中，框架残基被随机序列替换。结合成员因此以限制连接供体和受体支架的序列的长度的方式构建，使得添加很少或没有额外的残基。在一些情况下，框架残基和供体结构域之间的连接处的残基比通过供体和受体的二级结构元件的直接融合产生的残基更少。创建变体文库，其中在进入结构域的N和C末端边界处的氨基酸残基序列是变化的，同时保持短的连接子长度以限制构象柔性。该文库设计用于鉴定在结蛋白之前具有固定κ或λ序列的正确融合组合，其中在结蛋白插入之后的区域中从天然轻链集引入多样性。因此，为了将结蛋白插入CDR1，从框架2(FW2)至VL结构域的末端的序列来自天然集。同样，然后通过来自天然集的序列从框架3至VL结构域的末端插入CDR2。
将编码供体和受体多样性支架融合的基因群体克隆到噬菌体展示载体中，回收展示融合的噬菌体颗粒，并使用噬菌体展示技术在固定的胰蛋白酶上选择群体28,100。通过这种方式，进行选择以保留胰蛋白酶结合，并因此正确折叠结蛋白供体。除了基于亲和力选择供体的正确折叠之外，噬菌体展示为受体的正确折叠提供了额外的选择性，因为已经显示噬菌体展示富集具有优异结构完整性的融合物94。因此，如果供体正确折叠(因此能够结合胰蛋白酶)，但受体的折叠受损，则供体的展示仍将受到损害(可能通过降低错误折叠的融合)。因此，通过预先选择蛋白质L或蛋白质A，可以进一步增强抗体受体折叠的选择性，所述蛋白质L或蛋白质A已经显示分别结合特定的VL和VH结构域95，并且需要正确的折叠。通过使噬菌体群体受到更多破坏性条件，可以进一步改善系统的严格性94,96。
选择支持EETI-II折叠和胰蛋白酶结合的一组轻链变体。一旦选择了一个供体多样性支架家族成员的支架(在这种情况下为结蛋白)，鉴于供体家族内共享的结构限制，它可以用于同一个供体多样性支架家族的其它成员。使用两种选择的受体抗体轻链支架，将一系列阻断钠通道71,72,70、钾通道25,73,74和酸敏感性离子通道118,122的其它结蛋白在先前选择的受体抗体结构域内用作供体。在电压门控钾通道Kv1.3和酸敏感离子通道1a的情况下，其中一些显示为在靶离子通道上保持阻断活性。因此，选择的受体结构域显示为提供了一种通用支架，其可用于同一类多样性支架的多个不同的供体。
两个结合支架通过短的非柔性连接子连接以限制这些结构域之间的柔性和相对移动。鉴于融合结合支架的紧密接近，供体和受体多样性支架表面上的氨基酸有机会有助于参与与单一蛋白质上相同表位的相互作用的互补位。同样，供体或受体多样性支架的配偶体结构域的表面可能有助于靶标的绑定。可选地，两种支架都可能与靶蛋白复合物上的密集位点接触。构象柔性为结合相互作用带来热力学“熵惩罚”。出于同样的原因，固定两个融合结构域之间的构象关系是有利的，因此优选避免柔性连接子序列连接两个结构域。
将包含插入受体抗体可变结构域的供体结蛋白的结合成员结晶，并确定蛋白质结构。这证实了结蛋白的正确折叠，并且显示存在于受体抗体可变结构域内的结蛋白具有与之前针对游离结蛋白所示的相同结构。该结构还证实了抗体的正确折叠和两个结构域的紧密结合。两个结构域显示了预期的结构，并且结构域之间的相对刚性构象的期望由晶体结构支持。富含半胱氨酸的供体结构域与抗体受体结构域的融合在下文中称为结体TM
实施例1：结蛋白-VL CDR融合噬菌体展示文库的构建
噬菌体展示载体pSANG4 28是基于噬菌粒的噬菌体展示载体，其允许简单克隆单链Fv(scFv)形式的抗体。在scFv形式中，VH基因和VL基因通过编码柔性连接子肽的DNA连接。用pSANG4将scFv基因克隆到Nco1和Not1位点中，以产生与Nco1位点之前的M13前导序列和Not1位点之后的基因3编码的次要外壳蛋白的框内融合(图1A)。
合成了包含不与胰蛋白酶相互作用的固定VH基因(D12)的一对合成scFv基因(图2)(来自Genscript)。该D12VH基因101与“TNFα转化酶”(TACE)结合并源自经常用于抗体应答的IGHV3-23种系基因(也称为DP47)102。
VH基因与编码IGKV1D-39种系基因(Vκ1家族成员)或IGLV1-36种系基因(Vλ1家族成员)的N末端部分的合成基因缀合到至多FR2区段的末端，然后是Not 1限制性位点。
包含部分VL基因的该合成基因将允许在CDR1位置或CDR2位置插入结蛋白基因(图1B，C)。该基因在FR1的末端引入Pml1限制性位点，用于克隆在其5'和3'末端分别侧接Pml1和Mfe1位点的结蛋白集(图1B)。由于κ基因的沉默突变，Pml位点在FW1末端附近被引入。将Ser至Thr突变引入λ基因的FW1区以容纳该相同的限制酶位点。合成基因还在FW2末端引入Pst1位点，其用于使用结蛋白基因5'和3'末端的限制性位点Pst1和BspE1将结蛋白基因引入CDR2位置(图1C)。在组装功能性VL基因时，通过来自轻链集28的PCR产生VL结构域的其余部分(在CDR1结蛋白插入的情况下来自FR2，在CDR2插入的情况下来自FW3)以完成融合(参见实施例2)。
使用引物2561(GGTACCTCGCGAATGCATCTAG；SEQ ID NO：43)和2562(CATGCAGGCCTCTGCAGTCG；SEQ ID NO：44)扩增编码κ或λ轻链种系基因区段的这2个合成基因。纯化的PCR产物用NcoI和NotI消化，然后连接到用相同限制酶切割的pSANG4载体28中。根据制造商的说明将连接转化到大肠杆菌DH5-α细胞(Life technologies)中。使用MachereyNagel Midi制备试剂盒(根据制造商的说明书)从序列确认的转化体制备质粒DNA。这些载体被命名为“pIONTAS1_KB_κ”和“pIONTAS1_KB_λ”，并且从Nco1位点到Not1位点的序列分别显示在图2A和2B中。
为了证明将折叠的结蛋白供体与抗体接受体融合的可能性，使用了具有胰蛋白酶抑制活性的植物来源的结蛋白，Ecballium elaterium胰蛋白酶抑制剂-II(EETI-II)。EETI-II具有游离的N和C末端，并且胰蛋白酶结合由循环1(图3A)中存在的受限序列“PRIL”驱动103。对于正确折叠状态104的胰蛋白酶的高亲和力提供了鉴定供体结蛋白的潜力，其尽管被克隆到受体VL结构域中，仍保留胰蛋白酶结合。在供体和受体之间引入可变融合序列的噬菌体展示文库的构建将允许基于胰蛋白酶结合从文库中选择功能性结蛋白-CDR-VL组合。
该结蛋白供体多样性支架融合到κ或λVL结构域的CDR1或CDR2位置。这是通过用限制2个结构域之间添加的氨基酸数量或甚至减少它们的方式以用随机氨基酸置换进入的结蛋白供体和VL受体内的残基来完成的(图3B)。我们还在插入点后引入了包含VL基因区段的轻链片段集(实施例2)。
将结蛋白插入CDR1中
通过产生具有Pml1和Mfe位点(其通过PCR引入)的PCR片段并克隆到pIONTAS1_KB_κ和pIONTAS1_KB_λ中来制备合成的EETI-II结蛋白供体基因并用于置换轻链受体中的CDR1位置。框架和CDR指定如国际免疫遗传学信息系统(IMGT)29所述。PCR引物还在限制性位点和结蛋白基因之间引入可变的氨基酸序列。PCR引物Pml1-5EETa和Pml1-5EETb各自在Pml限制性位点后立即引入由序列VNS(V＝AC或G，N＝ACG或T，S＝C或G)编码的3个可变密码子。“VNS”简并密码子在来自24个密码子组合的每个随机化位置编码16个氨基酸(不包括半胱氨酸，酪氨酸，色氨酸，苯丙氨酸和终止密码子)。
Pml1-5EETa GTGT VNS VNS VNS TGC CCG CGT ATC CTG ATG CGT TGC(SEQ IDNO：45)
Pml1-5EETb GTGT gga VNS VNS VNS TGC CCG CGT ATC CTG ATG CGT TGC(SEQID NO：46)
这些序列的5'末端代表由Pml1产生的位点，Pml1是识别序列“CACGTG”(SEQ IDNO：47)以产生平端的限制性酶。为了促进合成具有5'磷酸化末端的PCR产物引物的平端克隆。
此时引入PCR产物具有用3个随机残基置换FW1的最后3个残基和EETI-II的第一个残基(其形成结蛋白内β片的一部分)的效果。净效果是框架和供体之间连接处的氨基酸丢失。引物Pml1-5EETb编码另外的Gly残基，其恢复它们之间的残基数量(图3B)。
在结蛋白基因的3'末端，使用反义引物1-5EETMfe(编码Mfe1位点)来扩增EETI-II。用于克隆的Mfe1位点编码FW2(Asn-Trp)的2和3个氨基酸。该引物还保留了EETI-II中发现的甘氨酸末端，并引入了由VNS或VNC密码子编码的随机氨基酸，随后是Mfe1位点。这种引入结蛋白供体基因的策略的结果是除去FW2的第一个氨基酸并使用2个随机氨基酸连接2个结构域(图3B)，即在供体和框架之间净添加1个氨基酸。
1-5EETMfe GTCAGTCCAATTGNBSNBCCCGCAGAAGCCGTTCGGACCG CA(SEQ ID NO：48)
编码Mfe1位点的序列加下划线。作为示例，用Pml1-5EETa和1-5EETMfe扩增产生然后克隆到pIONTAS1_KB_λ和pIONTAS1_KB_κ中的构建体分别显示在图3C和3D中。
将结蛋白插入CDR2
通过产生具有通过PCR引入的Pst1和BspE1位点的PCR片段，将结蛋白供体引入pIONTAS1_KB_λ和pIONTAS1_KB_κ的CDR2位置。有可能将Pst1位点引入IGKV1D-39Vκ基因的CDR2区的前两个残基(在Ala-Ala序列内)。为了便于克隆，在Vλ种系基因IGLV1-36的框架2的末端处引入相同的限制性位点和编码的残基。在λ种系中，也可以将BspE1位点引入编码Ser-Gly的FW3区的第4个和第5个残基(图3E)。再次，限制性位点和编码的氨基酸也被引入Vκ基因(图3F)。
PCR引物PST1-5EETa用于扩增EETI-II并引入2个Ala密码子，包含用于克隆的Pst1位点(下划线)，随后是由序列GNS(编码Val，Ala，Asp或Gly)和VNS(在24个密码子内编码16个氨基酸)编码的2个可变密码子，紧接在Pst1限制性位点之后并在结蛋白序列之前。VNS密码子置换EETI-II的第一个氨基酸，具有在供体和受体框架之间添加3个氨基酸(2个Ala残基和Val，Asp，Ala或Gly中的一个)的净效果(图3B)。
PST1-5EETa ATC TAT GCT GCA GNS VNS TGC CCG CGT ATC CTG ATG CGT TGC(SEQ ID NO：49)
在进入的结蛋白供体的3'末端，使用PCR引物-5EETBse来扩增EETI-II。这引入了用于克隆的BspE1位点。PCR产物引入了结蛋白供体，然后是天然跟随EETI-II最后一个半胱氨酸的甘氨酸(图3A)。然后是2个随机氨基酸，其在克隆后与FW3的第四和第五个氨基酸相连。这具有用两个随机氨基酸取代FW3的前三个残基并保留了结蛋白的末端甘氨酸的效果(图3B)。净效果是供体和框架3之间的氨基酸丢失。
1-5EETBse GTCAGAGACTCCGGASNBSNBCCCGCAGAAGCCGTTCGGA CCGCA(SEQ ID NO：50)
作为示例，用PST1-5EETa和1-5EETBse扩增产生然后克隆到pIONTAS1_KB_κ或pIONTAS1_KB_λ中的构建体分别显示在图3E和3F中。
实施例2.向受体VL结构域引入额外的多样性。
在人类中，存在两种不同类别的抗体轻链(κ或λ)，其分别由大约50和40个种系基因编码。基于与7种不同κ家族(Vκ1-Vκ7)和11种不同λ家族(Vλ1-Vλ11)的序列同源性，这些可以排列成家族。对种系序列29的检查允许设计对不同种系VL基因家族特异的有义链引物(“正向引物”)。
在抗体成熟过程中，单个VL种系基因在其3'末端与约5个不同的κ或λ特异性J区段重组。因此可以设计少量的正向和反向引物，使得能够扩增来自人供体的重新排列的VL基因以构建抗体噬菌体展示文库，例如在Schofield等(2007)28中所述。在这个示例中，我们表面了如何使用类似的方法来扩增从FW2或FW3开始到VL基因末端的VL基因片段。这允许将多样性引入在CDR1或CDR2中具有供体插入的受体VL结构域。因此，这种方法允许在插入的供体下游的受体结构域中引入额外的多样性。
从框架2开始扩增VL集。
将Vκ和Vλ种系基因家族的序列进行比对(来自IMGT29的数据)，并且PCR引物设计为允许从框架2开始扩增VL集。设计了能够从Vλ1、2和3的FW2区域扩增的λ特异性引物(“Mfelam”)。这些引物也设计为引入Mfe1位点(加下划线)，其与上述结蛋白基因末端引入的Mfe1位点相容并且符合读框。以类似的方式，设计了能够从Vκ1、2和3的FW2区域扩增的κ特异性引物(“Mfekap”)。
Mfelam 1GTGTGGAGGTGGC AAT TGG TAC CAG CAG CTC CCA GG(SEQ ID NO：51)
Mfelam 2GTGTGGAGGTGGC AAT TGG TAC CAA CAG CAC CCA GG(SEQ ID NO：52)
Mfelam 3GTGTGGAGGTGGC AAT TGG TAC CAG CAG AAG CCA GG(SEQ ID NO：53)
Mfekap1GTGTGGAGGTGGC AAT TGG TAT CAG CAG AAA CCA GG(SEQ ID NO：54)
Mfekap2GTGTGGAGGTGGC AAT TGG TAC CTG CAG AAG CCA GG(SEQ ID NO：55)
Mfekap3GTGTGGAGGTGGC AAT TGG TAC CAG CAG AAA CCT GG(SEQ ID NO：56)
使用这些有义链正向引物从先前已预克隆到噬菌体展示载体的Nhe1/Not1位点的文库扩增VL基因集(如图1所示)。引入的Mfe1位点加下划线，Mfelam1和Mfekap1的序列分别表示在图3E和3F的FW2起点。对于κ轻链，设计了单个反向引物(JKFOR_Thr2)，其横跨包含Not1的原始克隆连接，包括与噬菌粒载体的同源性以及克隆的Jκ区段的起点。对于λ轻链，设计了单个引物(JLFORQP2)，其在噬菌粒质粒序列内穿过Not1克隆位点并且进入Jλ区段的起点。
JLFORQP2
TGAGATGAGTTTTTGTTCTGCGGCCGCGGGCTGACCTAG(SEQ ID NO：57)
JKFOR_Thr2
TGAGATGAGTTTTTGTTCTGCGGCCGCGGTACGTTTGAT(SEQ ID NO：58)
用成对的κ或λ正向和反向引物扩增产生编码以下的PCR产物：
Mfe1-FW2，CDR2-FW3，CDR3，FW4-NOT1。(SEQ ID NO：59)
引物在5'末端引入Mfe1位点，在3'末端引入Not1位点，与上述的结蛋白PCR产物和图1中所示的噬菌粒展示载体相容并且符合读框。这将允许扩增VL基因文库，其可以通过使用限制性酶Mfe1和Not1而与编码结蛋白插入的构建体融合。这将额外的CDR2和CDR3多样性引入受体VL结构域。JLFORQP2和JKFOR_Thr2是反义反向引物，反义互补编码正义链在图3C、3D、3E和3F中分别表示为最终构建体中的FW4-Not1区。
从框架3开始扩增VL集
通过类似的方法，设计了与λVL基因(“Bsplam”引物)或κ(“BspKap”引物)的FW3起点杂交的有义链正向引物，同时将与引入到BspE1位点中的BspE1限制性位点相容的BspE1限制性位点引入如上所述的结蛋白构建体。引入的BspE1位点加下划线，Bsplam1a和BspKap1a的序列分别表示在图3E和3F的FW3起点处。
Bsplam1a ATCTATGCTGCAGGAGGTGGC TCC GGA GTC TCT GAC CGA TTC TCT GG(SEQID NO：60)
Bsplam1e ATCTATGCTGCAGGAGGTGGC TCC GGA GTC cCT GAC CGA TTC TCT GG(SEQID NO：61)
Bsplam2ATCTATGCTGCAGGAGGTGGC TCC GGA TCC AAG TCT GGC AAC ACG GG(SEQID NO：62)
Bsplam3ATCTATGCTGCAGGAGGTGGC TCC GGA ATC CCT GAG CGA TTC TCT GG(SEQID NO：63)
BspKap1a ATCTATGCTGCAGGAGGTGGC TCC GGA GTC CCA TCA AGG TTC AGT GG(SEQID NO：64)
BspKap1b ATCTATGCTGCAGGAGGTGGC TCC GGA GTC CCA TCA AGG TTC AGC GG(SEQID NO：65)
BspKap2ATCTATGCTGCAGGAGGTGGC TCC GGA GTC CCA GAC AGG TTC AGT GG(SEQID NO：66)
BspKap3ATCTATGCTGCAGGAGGTGGC TCC GGA ATC CCA GcC AGG TTC AGT GG(SEQID NO：67)
当λ特异性正向引物与λ特异性反向引物(JLFORQP2)一起使用时或者当κ特异性正向引物与κ特异性反向引物((JKFOR_Thr2))一起使用时，产生编码以下序列的PCR产物。
BspE1-FW3-CDR3-FW4-Not1
这允许通过使用限制性酶BspE1和Not1扩增VL基因文库，其可以与具有结蛋白基因插入的构建体融合。这将额外的CDR3多样性引入受体VL结构域。
使用标准分子生物学技术，构建体(如图3所示)使用如上所述产生的基因片段来创建。将它们克隆到“pIONTAS1_KB_κ”和“pIONTAS1_KB_λ”中并电穿孔到大肠杆菌TG1细胞中，并且使用标准分子生物学技术(例如Schofield等200728)构建3.5-6.6×108的结体文库大小。
实施例3：使用噬菌体展示技术从结体文库分离和表征功能性结蛋白-抗体融合克 隆体。
噬菌体展示技术有助于从基于蛋白质和肽的大型组合集中分离任何给定靶标的结合物，这些蛋白质和肽可以存在于丝状噬菌体表面上105。为了从结体文库中分离功能性结蛋白-抗体融合物，进行了胰蛋白酶的多轮噬菌体展示选择(针对EETI-II供体的同源抗原)。通过使用胰蛋白酶可切割的辅助噬菌体拯救结体文库来制备噬菌体颗粒102,106。对固定在链霉亲和素(对于第1轮)或中性亲和素(对于第2轮)包被的MaxisorpTM免疫管(ThermoScientific，目录号444202)上的10μg/ml生物素化胰蛋白酶进行两轮噬菌体展示选择。在两轮选择中，将噬菌体文库与链霉亲和素包被的顺磁珠(Thermo Fisher Scientific，目录号11205D)一起预温育。在将噬菌体加入抗原管之前除去这些珠以限制链霉亲和素结合物进入选择。使用时间分辨荧光(TRF)结合测定法分析来自第2轮选择输出的多克隆噬菌体制剂的胰蛋白酶结合。在该测定中，使用小鼠抗-M13抗体(GE Healthcare，纽约)，然后是铕缀合的抗小鼠抗体(Perkin Elmer，目录号AD0124)检测多克隆噬菌体与固定在中性亲和素(Thermo Fisher Scientific，目录号31000)包被的MaxisorpTM板(Thermo Scientific，目录号437111)上的生物素化胰蛋白酶的结合。
来自这两个EETI-II文库的多克隆噬菌体在该测定中显示了与胰蛋白酶的良好结合，证明了噬菌体展示选择在富集与胰蛋白酶结合的结体中的成功(图4)。为了研究通过标准噬菌体展示方法呈现EETI-II是否可行，将EETI-II基因克隆到噬菌粒展示载体28中，在此其直接与基因III的N端融合。令人惊讶的是，EETI-II呈现在噬菌体上，因为直接N端基因-III融合物显示对胰蛋白酶没有可检测的结合，而来自两个EETI-IICDR融合文库的选择的多克隆噬菌体显示胰蛋白酶结合。重要的是，这个结果表明了通过抗体CDR环(其与基因-III融合)在噬菌体上间接呈现结蛋白可能是直接结合基因III融合的更好选择。
为了鉴定具有所需结合特征的单克隆结体，将从使用EETI-II CDR1或CDR2文库的2轮选择中得到的94个单独克隆挑取到96孔培养板中，从每个克隆制备噬菌体。通过单克隆噬菌体ELISA筛选的方法在本领域中是已知的107。使用TRF测定法(如上所述)测试来自每个克隆的噬菌体上清液与固定在中性亲和素包被的MaxisorpTM板上的生物素化胰蛋白酶的结合。图5中显示了单克隆结合测定的代表性实例。挑选具有高于背景的3倍结合信号的克隆作为阳性克隆并测序以鉴定独特克隆。分别从EETI-II CDR1和EETI-II CDR2文库鉴定14个和42个独特的结合物(表1)。基于它们的VL和连接子序列多样性，选择来自EETI-II CDR2文库的18个结合物和来自EETI-II-CDR1文库的3个结合物用于进一步表征。这些结合物分配有新的克隆识别号码(表2)。
EETI-II的胰蛋白酶结合能力归因于存在于其环1(GCPRILMRC；SEQ ID NO：68)中的脯氨酸(Pro3)和精氨酸(Arg4)残基。为了显示选择的结体通过展示为VL CDR融合物(即不经由其它CDR环或C或N端融合序列)的完全折叠的EETI-II与胰蛋白酶结合，胰蛋白酶的结合残基(Pro3和Arg4)的EETI-II分别置换甘氨酸(Gly)和丙氨酸(Ala)。从21个选择的克隆及其突变体等价物制备单克隆噬菌体。使用TRF结合测定法(如上所述)测试来自每个克隆的噬菌体上清液与固定在链霉亲和素包被的MaxisorpTM板上的生物素化胰蛋白酶的结合。置换EETI-II的胰蛋白酶结合残基消除了所有结体克隆与胰蛋白酶结合的能力(表3)。为了确认胰蛋白酶结合的损失不是由于表达减少，或pIII融合噬菌体的展示是由11个(随机选择的)结体制备的，并且它们的GlyAla变体在蛋白质印迹上使用识别基因3(pIII)产物的抗体使用抗-pIII抗体(MoBiTec GmbH)进行分析(图6)。在任何结体克隆和其GlyAla取代的变体之间观察到的pIII融合展示量没有显著差异。这些数据证实了这些结体克隆的胰蛋白酶结合功能是正确展示结蛋白供体(EETI-II)作为VL CDR融合物的结果，并证实了胰蛋白酶结合是由EETI-II结蛋白供体引导的。
实施例4.选自EETI-II CDR2文库的结体的晶体结构
为了产生结体的晶体结构，将从EETI-II CDR2文库(表3)分离的18个克隆重新形成为Fab。在这种形式中，将VH(来自D1A12)基因与人IgG1重链恒定结构域1(CH1)融合，并将含有EETI-II的受体VL链与轻链恒定结构域(CL)融合。通过在哺乳动物细胞中瞬时表达来表达抗体的方法是本领域技术人员熟知的。为了使这些结体Fab能够在哺乳动物细胞中表达，使用引物LLINK2(CTCTGGCGGTGGCGCTAGC；SEQ ID NO：69)和NotMycSeq(GGCCCCATTCAGATCCTCTTCTGAGATGAG；SEQ ID NO：70)对编码结蛋白的VL链进行PCR扩增。扩增的VL基因用限制酶NheI和NotI消化并连接到用相同酶预消化的pINT12载体(编码D1A12重链)中。pINT12载体(图7)具有双重启动子表达盒，其中重链表达受巨细胞病毒(CMV)启动子控制，轻链表达由延伸因子-1α(EF1-α)启动子驱动。
为了在HEK-293F细胞中表达结体Fab，使用Plasmid Plus试剂盒(Qiagen，目录号12945)制备转染质量DNA。将24μg质粒DNA与2μg Freestyle 293表达培养基(ThermoFisher Scientific，目录号12338-018)中的48μg聚乙烯亚胺(PEI)温育15分钟。温育后，将DNA：PEI混合物加入到以1×106个细胞/ml的密度接种在125ml组织培养瓶中的20ml HEK-293F细胞(Thermo Fisher Scientific，目录号R790-07)。将培养瓶在37℃下温育5天(具有5％CO2，75％湿度并以800rpm摇动)。除KB_A03之外的所有转染均成功表达结体Fab。根据制造商的说明使用CaptureSelect IgG-CH1亲和基质(Life Technologies，目录号194320005)从细胞培养物上清液中纯化表达的蛋白质。将纯化的蛋白质针对2×PBS透析过夜，并使用Quick Coomassie染色(Generon，产品参考，GEN-QC-STAIN)在SDS-PAGE凝胶上使透析样品可视化。图8A中显示了代表性示例。使用Superde×200 2.4mL柱(GE HealthCare，17-1089-01)和Akta纯化系统(GE Healthcare)通过分析型尺寸排除色谱法确认纯化的结体Fab的单体状态。所有结体Fab显示了对应于单体Fab种类的色谱图(图8B)。
为了证实Fab形式的结体的胰蛋白酶结合能力，使用TRF结合测定法测试纯化的蛋白质与胰蛋白酶的结合。在该测定中，使用小鼠抗CH1抗体，然后是铕缀合的抗小鼠抗体检测结体Fab(10μg/ml，2.4μg/ml和0.5μg/ml)与固定在链霉亲和素包被的MaxisorpTM板上的生物素化胰蛋白酶的结合(表4)。
选择7个结体(KB_A04，KB_A01，KB_A05，KB_A07，KB_A08，KB_A10，KB_A12)用于结晶。如前所述，将为这些克隆制备的DNA转染到500mlHEK-293F细胞中。使用CaptureSelectIgG-CH1亲和基质纯化表达的蛋白质。纯化的蛋白质最初使用市售结晶筛(供应商)进行结晶试验。KB_A12和KB_A05容易获得清晰的晶体。进一步优化这两个克隆的结晶条件，并使用以下条件产生衍射质量晶体：0.1M MES pH＝6.5，25％w/v PEG MME 2000和0.1M Tris.Cl，50％PEG MME，10mM NiCl2。在100K在液氮流下，在这些晶体上收集完整的衍射数据。使用PROTEUM2软件(Bruker)处理收集的数据。使用Phenix软件v 1.8.1-1168110使用分子置换技术109解析了结蛋白融合的Fab抗体的晶体结构。使用Phenix.Refine111进一步精制所得结构。用于分子置换的模板从PDB网站(www.rcsb.org/pdb，PDB代码：3G04轻链和3QOS重链)下载。结体KB_A12和KB_A05序列如下给出。在克隆中使用的Nhe1位点的轻链N端引入另外的AlaSer序列。
KB_A12_重链
EVQLVESGGGLVRPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNTKNSLYLQMTSLRADDTAFYYCVDFGPGYGTGWFDYWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC(SEQ IDNO：71)
KB_A12_轻链
QSVLTQPPSVSEAPRQRVTITCSGSSSNIGNNAVNWYQQLPGKAPKLLIYAAGRCPRILMRCKQDSDCLAGCVCGPNGFCGANSGVSDRFSAAKSGTSASLAINGLRSEDEADYYCAAWDDSLNGYVFGTGTKLTVLGQPAAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS(SEQ ID NO：72)
KB_A05重链
Evqlvesggglvrpggslrlscaasgftfssyamswvrqapgkglewvsaisgsggstyyadsvkgrftisrdntknslylqmtslraddtafyycvdfgpgygtgwfdywgpgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepksc(SEQ IDNO：73)
KB_A05轻链
QSVLTQPPSVSEAPRQRVTITCSGSSSNIGNNAVNWYQQLPGKAPKLLIYAADKCPRILMRCKQDSDCLAGCVCGPNGFCGGGSGIPERFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCATWDDNLNGVVFGGGTKLTVLGQPAAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS(SEQ ID NO：74)
对于这两个数据集，分子置换溶液都是成功的，表明结蛋白融合Fab的整体折叠没有变化。细化后(图9)，很明显的是结蛋白融合的Fab抗体正确折叠并且抗体内的结蛋白部分的二硫化物模式与已早期报道的EETI-II(图10A)完全相同(PDB ID：1H9I)。另外，来自Fab的EETI-II部分的相对排列表明重链的CDR区可以与其它抗原潜在结合。缺乏VH CDR3残基的电子密度(图10B)进一步增强了这种可能性。PDB坐标
实施例5：表明结体形式的双特异性结合功能。
可以结合两种不同靶抗原的双特异性抗体的概念在药物开发中更加欢迎112。常规双特异性抗体通常由具有不同特异性的两个VH-VL对(即，各自识别不同抗原的两个不同VH-VL结构域对)组成。在这个示例中，我们描述了双特异性结体形式的开发。在这种形式中，将识别两种不同抗原所需的结合决定簇掺入单个VH-VL对内。这通过使用VH以介导一种结合特异性和结蛋白-VL融合以介导其它结合特异性来实现。
这里使用了两种特征明确的结体胰蛋白酶结合物(KB_A07和KB_A12，参见实施例3)作为用于设计双特异性功能的模型支架。这些结体含有来自D1A12抗体(抗TACE抗体)101的共同重链基因和展示EETI-II作为CDR2融合物的两种不同的轻链基因。这些结体的胰蛋白酶结合能力完全归因于展示EETI-II的VL结构域。因此，受体VL：供体结蛋白的这些融合物与大量天然VH基因集28重组以产生文库，从中可以分离具有额外VH介导的结合特异性的新分子。
在之前的工作中，Schofield及其同事描述了将VH和VL基因集克隆到中间抗体文库中28。该中间抗体文库用于产生功能性抗体噬菌体展示文库(“McCafferty文库”和“Iontas抗体文库”28)。在该实施例中使用相同的VH基因集来构建结体重链改组文库。这通过使用引物M13前导序列(AAATTATTATTCGCAATTCCTTTGGTTGTTCCT；SEQ ID NO：75)和HLINK3(CTGAACCGCCTCCACCACTCGA；SEQ ID NO：76)从Iontas抗体文库细菌原种PCR扩增VH基因来实现。扩增的VH基因用限制酶NcoI和XhoI消化并连接到用相同酶预消化的pIONTAS1_KB载体(编码KB_A017和KB_A12轻链)中。使用MiniElute PCR纯化试剂盒(Qiagen，目录号28004)纯化连接产物并电穿孔到大肠杆菌TG1细胞(Lucigen，目录号60502-2)中。如实施例3中所述，从该库中拯救噬菌体107。
为了鉴定具有由VH结构域介导的新型结合特异性的双特异性结体，针对5种不同抗原(人-cMET-Fc融合物，小鼠-FGFR4-CD4融合物，人-GAS6-CD4融合蛋白，人尿激酶型纤溶酶原激活物和β-半乳糖苷酶)进行两轮噬菌体展示选择。将cMET-Fc、FGFR4-CD4、GAS6-CD4和尿激酶型纤溶酶原激活物(UPA)直接固定在MaxisorpTM免疫管上。将生物素化的β-半乳糖苷酶(bio-B-gal)间接固定在用链霉亲和素(第1轮)或中性亲和素(第2轮)包被的MaxisorpTM免疫管上。如实施例3中所述进行噬菌体选择。在TRF结合测定(如实施例3中所述)中针对所有5种抗原、胰蛋白酶和固定配偶体(链霉亲和素和中性亲和素)测试由第2轮选择输出制备的多克隆噬菌体。所有多克隆噬菌体群体都显示了与胰蛋白酶和它们针对选择的抗原的特异性结合，但不与其它抗原结合(图11)。例如，从cMET-Fc选择制备的多克隆噬菌体获得的结合信号对胰蛋白酶和cMET是特异性的。该结果表明了噬菌体展示选择在富集双特异性结合物方面的成功。为了鉴定单克隆结合物，从每个选择输出中挑取48个单独的克隆，并从每个克隆制备单克隆噬菌体(如实施例3中所述)。测试每个克隆的单克隆噬菌体上清液与胰蛋白酶以及用于选择的抗原的结合(筛选的代表性实例示于图12)。任何在胰蛋白酶和选择抗原上都显示超过15000个荧光单位的结合信号的克隆被认为是双特异性结合物。从每个选择输出中鉴定出大量双特异性结合物(表5)。
实施例6：证明结体形式的双表位结合能力
在前面的示例中，我们表明了结蛋白支架通过不同的互补位与两种不同的抗原结合的能力，一种位于受体-供体融合物(即VL-结蛋白)上，另一种位于VH上。可以应用相同的原理来靶向单个靶抗原内的两个不同表位，其中VH定向结合可以用于增加原始相互作用(由结蛋白介导)的亲和力和/或特异性。通过这种方法，可以利用VH结构域的额外结合特性来改善基于结蛋白的药物的效力或特异性。可选地，对结合的这种额外贡献也可以使用实施例2中描述的方法由VL CDR3指导。在该实施例中，我们通过改善抗胰蛋白酶结体(KB_A07和KB_A12，参见实施例3)的亲和力，通过引入与胰蛋白酶独立结合的新型重链伙伴，表明了结蛋白支架的双表位结合能力。
KB_A07和KB_A12含有与肿瘤坏死因子-α转换酶101的dis-cys结构域结合的共同VH结构域(D12)和经由EETI-II(展示在CDR2位置)与胰蛋白酶结合的VL结构域。为了鉴定结合胰蛋白酶上独特表位的新型重链配偶体(并改善总体亲和力)，通过用天然重链的大集置换这两个结体的D1A12VH来产生噬菌体展示文库(参见实施例5)。通过在有利于优先富集高亲和力克隆的严格条件下对胰蛋白酶进行三轮噬菌体展示选择，从该“链改组”的文库中分离亲和力提高的克隆。选择的严格性通过在每轮选择中使用减少量的胰蛋白酶来控制(图13)。通过针对一系列抗原浓度选择结体并将噬菌体输出数量与无抗原对照进行比较，以凭经验确定每轮的最佳抗原浓度。如实施例5中所述，通过对固定在Maxisorb免疫管上的抗原进行淘选来进行第1轮选择。选取在20nM抗原浓度下进行第2轮选择的群体进行又一轮第3轮。
使用引物M13前导序列(参见实施例4)和NotMycSeq(GGCCCCATTCAGATCCTCTTCTGAGATGAG；SEQ ID NO：70)对来自第2轮(20nM选择)和第3轮(2nM和0.2nM选择)输出的结体基因进行PCR扩增。PCR产物用NcoI和NotI限制酶消化并通过NcoI和NotI克隆到pBIOCAM5-3F载体中。pBIOCAM5-3F允许在哺乳动物细胞中表达抗体作为可溶性scFv-Fc融合蛋白113，因此便于筛选亲和力提高的结体结合物。将352个克隆(由pBIOCAM5-3F克隆产生)挑取到4×96孔培养板中。使用Plasmid Plus 96试剂盒(Qiagen，目录号16181)为每个克隆制备转染质量质粒DNA。将600ng各质粒DNA与1.44μg聚乙烯亚胺(PEI)在Freestyle HEK-293F表达培养基(Thermo Fisher Scientific，目录号R790-07)中一起温育15分钟，然后加入到含有500μl/孔的密度为1×106细胞/ml的指数生长HEK-293F细胞的96孔深孔板中。用透气性密封件密封平板并在37℃下温育5天(具有5％CO2，75％湿度并在800rpm下摇动)。使用含有结体-Fc融合蛋白的细胞培养物上清液进行筛选以鉴定亲和力提高的克隆。
在初次结合筛选中观察到特定克隆的结合信号(例如使用单克隆噬菌体上清液的TRF结合分析)是亲和力和表达的组合功能。由于蛋白质表达可以从克隆到克隆显著变化，因此通过初级筛选中的结合信号对结体进行排序可能不一定与它们的亲和力相关。因此，使用两种不依赖于表达的筛选测定以通过亲和力对结体克隆进行排序，并与亲本克隆进行比较。存在(i)TRF捕获测定和(ii)Biacore解离速率筛选。在“TRF捕获测定”(图14)中，将结体-scFv-Fc捕获在用抗-Fc抗体包被的MaxisorpTM板上(Abcam，目录号ab113636)，并且使用链霉亲和素缀合的铕检测生物素化胰蛋白酶与结体的结合(Perkin Elmer，目录号1244-360)。为了使结体(scFv-Fc)表达的差异标准化，将限制量的抗-Fc抗体包被在每个孔上。例如，用50μl浓度为2.5μg/ml(32nM)的抗Fc抗体包被的孔具有1.6飞摩尔scFv-Fc的最大(理论)捕获能力。然而，使用pBIOCAM5-3F载体系统的HEK-293F细胞中的平均scFv-Fc表达为10-20mg/l(83-166nM)，并且用于测定的50μl原始上清液具有4.1-8.2飞摩尔的平均scFv-Fc，因此使包被在每孔上的固定化抗Fc抗体饱和。选自VH改组文库的大部分结体显示了比亲本克隆更高的抗胰蛋白酶结合信号(代表性实例见图15)。在捕获测定中给出最高结合信号的90个结体在“Biacore解离速率筛选”中进行樱桃挑选和测试。在“Biacore解离速率筛选”中，通过表面等离子体共振(使用来自GE healthcare的Biacore T100)分析结体克隆的解离常数(解离速率)。抗体-抗原相互作用的解离常数不依赖于浓度，因此不需要用于差异表达的归一化。在该测定中，将CM5传感器芯片(GE healthcare，目录号BR-1005-30)与大约3000个抗Fc抗体(人抗体捕获试剂盒，GE healthcare，目录号BR-1008-39)耦合。在抗FC抗体上捕获约1200-1600RU的结体-scfv-Fc。注入胰蛋白酶溶液(400nM)60秒。监测每个结体胰蛋白酶相互作用的解离阶段300秒。每次循环后，通过注入3M MgCl2再生芯片表面。使用1：1Langmuir结合模型(使用Biacore T100评估软件)确定每个结体的解离常数(kd)。认为解离常数比其亲本克隆慢1.5倍的克隆被认为具有改善的亲和力(表6)。总体而言，使用捕获测定和解离速率筛选鉴定了22个亲和力提高的克隆。图16显示了与亲本克隆相比显示出改善解离速率的克隆的代表性实例。通过重链改组对KB_A07和KB_A12克隆的亲和力的这种改善表明了结体形式的双表位结合能力。
实施例7：在抗体VL受体支架的CDR3内克隆、表达和纯化各种富含半胱氨酸的毒素 供体。
正常离子通道功能的偏差涉及多种疾病病症的发病机理，包括疼痛疾病和自身免疫。例如，电压门控钠通道1.7(Nav1.7)的功能缺陷在对疼痛的超敏感或不敏感中起主要作用。电压门控钾通道1.3(Kv1.3)涉及T细胞介导的自身免疫。酸敏感离子通道1a(ASIC1a)涉及疼痛信号的感测和处理。因此，特定的离子通道调节剂在治疗疼痛和各种自身免疫性疾病中提供了巨大的治疗潜力。自然发生的结蛋白起着离子通道阻断毒素的作用。如之前所讨论的，唯一批准用于治疗的基于结蛋白的药物(齐考诺肽)是源自芋螺蜗牛毒液的N型电压门控钙通道阻断剂。
该实施例描述了将可选的富含半胱氨酸的毒素供体融合到先前选择的受体VL支架中以产生针对离子通道的结体(表7)。这通过将三个Nav1.7阻断剂、三个Kv1.3阻断剂和三个酸敏感离子通道1a(ASIC1a)阻断剂克隆到两个结体KB_A07和KB_A12的CDR2位置中来实现(即在该位置置换EETI-II基因，如实例3中所述)。将编码所有毒素的基因(表8)合成为基因片段(来自Integrated DNA Technologies)。使用编码KB_A07和KB_A12特异性连接序列的引物组(表9)对每个毒素基因进行PCR扩增。也PCR扩增了引入连接子序列(N端GGS和C端SGG)的Ssm6a(Ssm6s_GGS)的另一种变体。在该实施例中，结体构建体形成为IgG分子，其中VH基因与IgG1重链恒定结构域(CH1-CH2-CH3)融合，含有新供体毒素的受体VL链融合至轻链恒定结构域(CL)。为了在哺乳动物细胞中表达这些结体构建体，将PCR片段克隆到KB_A12和KB_A07VL链(由pINT3-hg1载体编码，图17)的PstI和BspEI位点。pINT3-hg1载体具有双重启动子表达盒，其中重链表达受巨细胞病毒(CMV)启动子控制，轻链表达由延伸因子-1α(EF1-α)启动子驱动。
为了在哺乳动物细胞中表达结体，使用Plasmid Plus试剂盒(Qiagen，目录号12945)制备转染质量DNA。将60μg质粒DNA与120μg聚乙烯亚胺(PEI)在5ml Freestyle 293表达培养基(Thermo Fisher Scientific，目录号12338-018)中一起温育15分钟，然后加入到以1x106个细胞/ml的密度接种在250ml组织培养瓶中的50ml HEK-293F细胞(ThermoFisher Scientific，目录号R790-07)。将培养瓶在37℃下温育5天(具有5％CO2，75％湿度并以800rpm摇动)。使用蛋白质-A亲和层析(来自Generon的蛋白-A琼脂糖，目录号PC-A5)从细胞培养上清液中纯化表达的蛋白质。用2×PBS透析纯化的蛋白质，并使用QuickCoomassie染色(Generon，产品参考，GEN-QC-STAIN)在SDS-PAGE凝胶上使透析样品可视化。图18显示了代表性实例。在HEK293F细胞中获得的这些融合分子的平均表达水平(7.7mg/l)与使用相同载体系统(4mg/l)产生的常规抗体的平均表达水平相当。纯化后的蛋白质产量列于表10中。在曼巴利金融合物的情况下，如实施例11中所述将DNA转染入CHO-Expi细胞中，并给出这些产量。
总之，本实施例中描述的结果说明了(i)离子通道阻断毒素可以表达为与VL结构域受体(例如结体)的融合物内的供体；(ii)除了EETI-II以外的结蛋白支架可以形成为结体，或换句话说，结体形式能够多功能表达多个结蛋白(ii)这些融合分子可以作为IgG有效表达和纯化。
实施例8：表达为结体的Kv1.3和ASIC1a阻断剂的功能验证
测试以结体形式表达的结蛋白Kv 1.3和ASIC1a阻断剂(参见实施例6和7)抑制离子通道靶标功能的能力。使用QPatch自动化全细胞膜片钳电生理学(Sophion)评估这些结体对表达人Kv1.3(huKv1.3)或人ASIC1a通道的细胞的作用。
为了测试Kv1.3，在存在或不存在结体融合物或抗体同种型(阴性)对照的情况下，使用QPatch电生理学测定分析稳定表达huKv1.3的CHO细胞(Charles River Lab)。在测定之前新鲜制备内部和外部生理溶液。细胞外溶液含有145mM NaCl，4mM KCl，2mM CaCl2，1mMMgCl2，10mM HEPES和10mM葡萄糖；用NaOH将pH调节至7.4；渗透压为～305mOsm/L。细胞内溶液含有：KF(120mM)，KCl(20mM)，HEPES(10mM)和EGTA(10mM)；用KOH将pH调节至7.2；渗透压为～320mOsm/L。
使用一系列去极化电压(通道激活)脉冲来监测加入对照(细胞外溶液)时的通道电流以定义当前活性的对照基线。对于这些测量的对照电流，将上升浓度的结体或亲本抗体同种型(对照分子)施加到外部沐浴溶液(2.2μM-0.5nM，在细胞外溶液中稀释)。结体KB_A12和KB_A07(EETI-II融合物)用作测试的同种型对照。从-80mV的保持电压，施加+30或+80mV去极化的激活电压脉冲300ms，每5或10秒施加一次。对在每个溶液交换周期的激活步骤期间测得的最大外向电流值进行平均(每个浓度应用n＝3-8)并绘制为浓度-响应曲线。从这些浓度-响应曲线(参见图21中的示例图)计算IC50值(总结在表11A中)。KB_A07_Shk，KB_A12_Shk和KB_A07_短肤蝎毒素(KTX)融合蛋白均以浓度依赖性方式抑制huKv1.3电流，IC50分别约为20nM，40nM和900nM。相比之下，两种受体支架上的亲本结体、KB_A12、KB_A07、Moka-1和KB_12上的短肤蝎毒素均未显示测量电流的显著减少(～IC50外推至>10μM)，这与在相同时间段内对照外部添加溶液的电流记录的减少幅度相似(四次应用，每次持续四分钟，共16分钟)。
为了功能性评估ASIC1a结体，在存在或不存在结体融合物的情况下使用QPatch电生理学测定法分析稳定表达huASIC1a(Sophion)的HEK293细胞(使用KB_A12作为受体并置换最初的EETI-II供体，如表8所示)。将具有EETI-II供体的“亲本”KB_A12用作阴性对照。在测定之前新鲜制备内部和外部生理溶液。细胞外溶液含有145mM NaCl，4mM KCl，2mMCaCl2，1mM MgCl2，10mM HEPES和10mM葡萄糖；用NaOH(用于对照，静息状态的pH)将pH调节至7.4或用MES(用于酸性，活化状态的pH)将pH调节至pH 7.4；渗透压为～305mOsm/L。细胞内溶液含有：CsF(140mM)，HEPES(10mM)，NaCl(10mM)和EGTA/CsOH(1mM/5mM)；用CsOH将pH调节至7.3；渗透压为～320mOsm/L。
在整个ASIC1a记录中，记录细胞膜电压钳位在-60mV。ASIC1a基线对照电流通过施加活化pH 6.0下的外部溶液达3000ms而引发。将该活化pH施加再重复三次，得到四个基线对照ASIC1a电流。然后将记录细胞与在pH7.4的外部溶液中稀释的结体预温育15-20分钟。在该结体预温育之后，在活化pH 6.0的外部溶液中将相同浓度的结体施加至细胞记录。
在每次结体温育和随后的ASIC1a电流活化结束时，将ASIC1a结蛋白抑制剂PcTx1(阳性对照)的完全阻断浓度(300nM)灌注到细胞记录上，并施加最终活化的pH 6.0外部溶液。确定活化pH 6.0基线(即预结体)和后结体温育之间的剩余百分比信号。从这些图中(参见表11B)可以看出结体KB_A12_PcTx1和KB_A07_PcTx1是活性的，将ASIC1a电流降低至4.8％，这与PcTx1的阳性对照施加(1.9-3.8％)所观察到的水平相同。KB_A12_Mba-1和KB_A12_Mba-2显示出与KB_A12阴性对照或“仅缓冲液”对照相同的电流水平。
上面的数据说明了将具有治疗潜力的结蛋白(即离子通道阻断剂)融合到最初选择用于融合到不同结蛋白(即EETI-II)的受体抗体支架中的可能性。
实施例9：非结蛋白供体与抗体的受体VL结构域的功能性融合。
该实施例描述了非结蛋白供体多样性支架结构域与受体VL结构域的融合。缺乏二硫醚键的非结蛋白供体多样性支架结构域可以是对结蛋白有价值的替代品。正如之前讨论的，已有多种蛋白质支架被工程化用于新的结合特异性38,114。在此，我们使用称为粘蛋白的小蛋白质支架(约100个氨基酸)，其基于植物来源的植物抑制素的共有序列(半胱氨酸蛋白酶的蛋白质抑制剂)。粘蛋白在大肠杆菌中显示出高热稳定性并表达良好46。它们在结构上与结蛋白不同并且不含任何半胱氨酸残基。
作为供体，我们选择了两种工程化的粘蛋白，其结合凝集素样氧化低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)以置换KB_A07和KB_A12的VL链(接受者)的VL CDR2位置处的EETI-II(实施例3)。这些粘蛋白的序列(称为Ad-LOX1-A和Ad-LOX1-B，表12)从专利WO2014125290A1获得，并且作为基因片段合成以实现克隆(表13)。使用PCR使用特异于KB_A07和KB_A12的引物组(表14)来扩增每个粘蛋白基因。将PCR产物克隆到编码KB_A12和KB_A07基因的pIONTAS1_KB噬菌体展示载体(图1)的PstI和BspEI位点。
为了测试这些粘蛋白-抗体融合物的功能性，在TRF结合测定中评估由每个克隆制备的单克隆噬菌体与LOX-1的结合。在该测定中，使用小鼠抗M13抗体(GE Healthcare)，然后是铕缀合的抗小鼠抗体(Perkin Elmer)检测展示粘蛋白-抗体融合的噬菌体的LOX-1(直接固定在MaxisorpTM板上)结合。包含父结体KB_A07和KB_A12(EETI-II融合体)作为对照。使用蛋白质cMET-FC，GAS6-CD4，FGFR4-CD4，UPA和B-gal检查非特异性结合。该测定的结果(图19)显示了所有粘蛋白抗体融合蛋白特异性结合LOX-1。亲本克隆KB_A07和KB_A12显示与LOX-1没有可检测的结合，证实了粘蛋白-抗体融合分子显示的LOX-1结合是由粘蛋白(展示在这些抗体的VL CDR2环中)介导的。
在这个实施例中，我们已经证明了可以将结蛋白供体多样性支架插入受体VL支架中以创建可选的结体形式。
实施例10.鉴定用于插入供体序列或在供体、受体或配偶体序列中引入多样性的 环区域
实施例1中描述的将供体结蛋白序列插入受体Ig结构域的方法可以用于鉴定连接其它支架的次要结构元件作为供体插入的潜在位点的序列。
对于Ig结构域，框架和CDR指定如国际免疫遗传学信息系统(IMGT)数据库所述。根据IMGT v3.1.10，编号CDR1、CDR2和CDR3序列分别占据氨基酸位置27-38、56-65和105-117(对于所有VH和VL序列)。FW1、FW2和FW3残基占据1-26、39-55和66-104。在重新排列的V基因结束时，FW4由VH的6个J区段，Vκ区段的5个J区段和Vλ的7个J区段编码(在每种情况下分别编码每个FW4的11、10和10个氨基酸)。
在一种方法中，单个CDR可以整体去除并且被进入的供体序列置换，所述供体序列侧接有在N和C末端各自不超过4个氨基酸残基的连接子。在另一种方法中，可以保留一些CDR残基，但是将进入的供体多样性支架与受体Ig多样性支架的支架连接的残基(包括CDR残基)的总数在每个末端可能不超过4个氨基酸(以保持供体和受体之间的紧密接近)。在另一种方法中，可以从供体或受体支架上去除连接的边界处的变异框架残基，并用包含一些或全部氨基酸的随机化密码子置换。在N和C末端处的总体连接(不包括置换框架残基)不得超过4个氨基酸。
编码以这种方式设计的融合物的基因或基因群可以使用本领域技术人员已知的方法产生(也在本文的实施例中举例说明)。该基因可以完全作为合成基因制备或由限制性消化或PCR产生的基因片段产生，并通过PCR组装或连接将其整合入最终融合基因中。基因片段和/或PCR产物可以通过配合独立克隆，Gibson克隆，NEB Builder(NEB)或本领域技术人员已知的其它方法来连接。然后可以将所得基因克隆到如上所述的合适表达载体中。
上述方法利用IMGT数据库作为Ig结构域上序列信息的策划来源。上述相同的方法可以用于覆盖具有已知结构的所有结构域。描述各个蛋白质结构的pdb文件的参考可以在原始引文中(例如在本文引用的参考文献或其中的参考文献中)找到。RCSB蛋白质数据库(“pdb server”)代表生物大分子如蛋白质结构域的结构信息的入口。已经总结了其它访问结构数据的来源，包括PDBSUM115。与这些文件相关的数据还允许通过查看3D结构或通过使用软件(如DSSB)或运行此类软件的网站来鉴定二级结构元件116。使用这种方法，可以得到一级氨基酸序列上的二级结构表示。可选地，可以使用期望的受体结构域和具有已知结构的直系同源物或旁系同源物之间的结构模型或直接序列比对来鉴定二级结构元件。可选地，可以使用用于预测二级结构元件的算法
纤连蛋白的第十个III型细胞粘附结构域的结构117可以用于例示鉴定候选受体域内用于插入供体序列的潜在位点的方法。同样的方法可以用于确定供体、受体和配偶体链中都可能适合多样化的区域。
作为示例，描述纤连蛋白(FnIII-10)的第十种III型细胞粘附区的pdb文件是“1FNA”。使用pdb文件(例如通过在pdb服务器上查看)可以产生用二级结构元件注释的FnIII-10的线性氨基酸序列的表示(图20A)。形成β链的区域加下划线，并且在结构域的上表面上连接它们的残基用小写字母表示。在另一个示例中，gp251具有由pdb文件2WMN表示的结构。图20B中表示了二级结构元件的线性表示。连接β链或β链-α螺旋连接处的残基加下划线。
以小写字母表示的这些“连接序列”代表可以部分或整体置换的区域，同时在供体和受体之间保持短的连接子。如上所述，框架残基可以在受体支架的接合边界处被去除，并被包含一些或全部氨基酸的随机化密码子置换。如图20所示的这些相同的残基也代表了可以引入如上所述的多样性的可能位点。
Gp2是64个氨基酸的小蛋白质结构域，具有接近的N和C末端，因此该分子也代表供体结构域的理想候选物。此外，已经显示了Gp2的N和C末端可以被截短而不影响允许与受体结构域紧密融合的结构域的折叠。
实施例11.选择的连接子对于抗体受体结构域内的结蛋白供体结构域的功能性表 达是必需的。
与其它利用长的柔性连接子连接结构域所采用的肽融合方法相反，结体形式使用短的非柔性连接子序列来限制供体和受体结构域之间的相对运动。这是本发明的一个重要方面。为了鉴定允许2个融合结构域正确折叠的合适连接子，我们采用了制造连接子变异的文库的方法。在实施例3和实施例12中，我们描述了用连接EETI-II(供体域)与VL或VH域(受体)的框架残基的所选短的非柔性连接子序列分离几个功能性结体分子。
为了证明连接子选择的重要性，两个特征明确的结体KB_A07和KB_A12的所选短的连接子被置换为其它通常使用的长的柔性N端和C端连接子11,13,15(参见表15)。然后使用胰蛋白酶结合测定将这些连接子变体的性能与具有选自文库的短的非柔性连接子的原始结体的性能进行比较。
在本实施例中，结体变体形成为Fab，其中VH基因与重链恒定结构域-1(CH1)融合，并且含有结体连接子变体的VL链与轻链恒定结构域(CL)融合。将编码结蛋白的VL基因和连接子序列合成为基因片段(Integrated DNA Technologies，参见表16)。为了在哺乳动物细胞中表达结体连接子变体，使用NheI和NotI限制性位点将这些基因片段克隆到pINT12表达载体(编码D1A12重链)中。
pINT12载体(图7)具有双重启动子表达盒，其中重链表达受巨细胞病毒(CMV)启动子控制，轻链表达由延伸因子-1α(EF1-α)启动子驱动。
为了在哺乳动物细胞中表达结体，使用NucleoBond Xtra Midi plus试剂盒(Macherey Nagel，目录号740412.50)制备转染质量DNA。将25μg质粒DNA与80μlExpiFectamine CHO转染试剂(Thermo Fisher scientific，目录号A29129)在2ml OptiPRO无血清培养基(Thermo Fisher Scientific，目录号12309050)中一起温育5分钟，然后加入到以6x106个细胞/ml的密度接种在125ml组织培养瓶中的25ml Expi-CHO细胞(ThermoFisher Scientific，目录号A29133)。转染后18-22小时，将培养瓶在37℃下温育7天(5％CO2，75％湿度，800rpm振荡)。进料包括含有150μl增强剂溶液的6ml ExpiCHO进料。根据制造商的说明使用CaptureSelect IgG-CH1亲和基质(Thermo Fisher Scientific，目录号194320005)从细胞培养物上清液纯化表达的蛋白质。纯化的蛋白质针对2x PBS透析过夜。使用280nm处的吸光度和理论消光系数确定蛋白质浓度。
为了比较结体与短和长的连接子的性能，通过ELISA测试纯化的Fab与胰蛋白酶的结合。在该测定中，使用小鼠抗CH1抗体(杂交瘤试剂实验室)，随后是铕缀合的抗小鼠抗体(Perkin Elmer，目录号AD0124)检测结体Fab(0.5μg/ml)与生物素化胰蛋白酶(以5μg/ml固定在链霉亲和素包被的MaxisorpTM板上)的结合。当短的所选连接子被长的柔性连接子置换时，KB_A07和KB_A12结体的胰蛋白酶结合能力大大降低(图22)。这个实施例清楚地表明了短的非柔性连接子对于产生最佳的供体-受体融合体的重要性。
实施例12.通过随机化供体相互作用结构域以向供体域引入多样性
实施例5和6显示了使用VH改组在结体的结合配偶体结构域内产生序列多样性以选择具有额外特异性或改善的结合动力学的变体。在这两个实施例中，对配偶体结构域(VH结构域)进行多样化，并且供体结构域(结蛋白)的原始结合特异性未改变。在实施例2和3中，我们说明了向VL受体结构域引入多样性。在这个实施例中，我们表面了一种不同的方法以在结体的供体结构域中引入序列多样性：用随机氨基酸序列置换供体结蛋白中的现有环。该专利中描述的结体的胰蛋白酶结合能力由结蛋白-EETI-II的环1序列(PRILMR)赋予。在此，我们用不同长度(6、8、9和10个残基)的随机化序列置换KB_A12结体的环1序列以增加多样性以及潜在的结合表面。随后使用噬菌体展示技术将所得的环文库用于产生cMET和β-半乳糖苷酶结合特异性。
为了产生具有高比例环置换变体的大噬菌体展示文库，使用了使用Kunkel诱变(Kunkel，T.A.等，Meth.Enzymol.154,367-382(1987))和选择性滚环扩增(Huovinen,T.等，PLoS ONE 7,e31817(2012))的寡核苷酸定向诱变方法。用于编码VNS密码子的寡核苷酸(V＝A/C/G，N＝A/G/C/T和S＝G/C)在给定位置编码16个氨基酸(不包括胱氨酸，酪氨酸，色氨酸，苯丙氨酸和终止密码子)。在表18中给出了代表反义链(其中B＝TGC)的诱变寡核苷酸。
将编码KB_A12的模板DNA(在噬菌体展示载体pSANG428中)纯化为来自从大肠杆菌CJ236(dut-/ung-菌株)拯救的噬菌体的含有单链DNA的尿嘧啶(dU-ssDNA)。将上述反义寡核苷酸退火至dU-ssDNA模板并使用T7聚合酶延伸以产生互补链。使用随机六聚体(ThermoFisher Scientific，目录号S0142)和Phi29聚合酶(Thermo Fisher Scientific，目录号EP0091)对新合成的异源双链DNA进行滚环扩增以选择性扩增突变链。使用NotI限制性内切酶(New England Bio labs，目录号R3189S)将滚环扩增产物切割成质粒大小单位，并通过自我连接重新环化。使用MiniElute PCR纯化试剂盒(Qiagen，目录号28004)纯化连接产物并电穿孔到大肠杆菌TG1细胞(Lucigen，目录号60502-2)中。用于克隆诱变和选择性滚环扩增的方法是本领域技术人员已知的。如实施例3中所述的从噬菌体库中拯救噬菌体。
为了分离具有新的特异性的结体环结合物，针对两个直接固定在MaxisorpTM免疫管上的人cMET和β-半乳糖苷酶进行两轮噬菌体展示选择。如实施例3中所述的进行噬菌体选择。使用引物LLINK2(SEQ ID NO：69)和NotMycSeq(SEQ ID NO：70)对来自第2轮输出的结体VL基因进行PCR扩增。扩增的结体VL基因用NheI和NotI消化并连接到用相同酶预消化的pSANG4载体(编码D1A12重链)中。将连接产物转化到大肠杆菌TG1细胞中。为了鉴定单克隆结合物，从每个转化中挑取47个单独的克隆，并从每个克隆制备单克隆噬菌体(如实施例3中所述)。使用TRF结合测定来测试来自每个克隆的单克隆噬菌体上清液与用于选择的抗原的结合。30/47克隆测试结合c-Met和37/47克隆结合β-半乳糖苷酶(图23)。使用引物LMB3(CAGGAAACAGCTATGACC：SEQ ID NO：77)对来自该测定的结合物进行测序。鉴定了cMET的23个独特序列(表17A)和鉴定了β-半乳糖苷酶的11个独特序列(表17B)。尽管EETI-II的环1的自然长度是6个残基，但从环文库中分离的所有新型结合物都具有8或9个氨基酸的环大小。
这个实施例清楚地表明，通过用不同长度的随机序列置换现有的结蛋白环，可以将额外的多样性引入结体。这种环置换/随机化方法可用于获得新的特异性(如实施例5中所述)或微调由供体或受体结构域介导的现有特异性或亲和性。
实施例13：通过受体介导的转胞吞作用(RMT)可以穿过血脑屏障(BBB)的双特异性 结体的产生
穿越血脑屏障(BBB)构成了将肽和抗体递送到脑中用于治疗神经障碍(例如慢性疼痛，阿尔茨海默氏病，多发性硬化症，癫痫症)的主要挑战。例如，将约0.1％的循环抗体穿进脑中(Zuchero，YJY等，Neuron 89p70-82(2015)。可选地，使用侵入性且昂贵的鞘内注射程序施用诸如齐考诺肽(来自芋螺蜗牛毒液的结蛋白)的治疗剂。因此，将分子递送穿过BBB的有效策略的发展对于制药工业已经成为长期目标(Niewoehner，J.等，Neuron 81,49-60(2014))。近年来，本研究的主要重点是通过利用内源性营养转运系统(例如受体介导的胞吞作用(RMT))产生能够使药物部分穿梭过BBB的分子。这通常使用双特异性方式实现，包括“分子穿梭”和活性的药物部分。例如，Yu和同事已经报道了一种传统的双特异性抗体，其能够使用结合转铁蛋白受体(TFR)的“分子穿梭”以转运抗β分泌酶-1(BACE)抑制剂穿过BBB(Yu，Y.J.等Sci Transl Med 3,84ra44-84ra44(2011))。该双特异性抗体形式由2个不同的VH：VL对(即2个不同的Fab臂)组成，其分别识别TFR或BACE。在实施例5中，我们已经证明了双特异性结体的产生，其中将识别两种不同抗原所需的结合决定簇并入单个VH-VL对内。在这个实施例中，我们描述了以相同的形式产生双特异性结体，其中针对TFR选择的VH结构域经由RMT使它们的配偶体结蛋白-VL融合结构域穿梭过BBB。
实施例5描述了由与未免疫供体分离的VH基因集配合的胰蛋白酶结合结体轻链(KB_A07和KB_A12)组成的VH改组文库。使用直接固定在MaxisorpTM免疫管上的TFR抗原的2-3轮噬菌体展示选择，从这些文库中选择抗TFR双特异性结体。在小鼠TFR上进行第1轮选择，随后在大鼠TFR上进行第2轮选择。在另一种情况下，对小鼠TFR-小鼠TFR-大鼠TFR(代表分别用于第1、2和3轮的抗原)进行3轮选择。另外，对小鼠TFR-人TFR-小鼠TFR进行选择。然后从最后一轮选择中挑取736个个体克隆，并从每个克隆制备单克隆噬菌体(如实施例3中所述)。通过ELISA测试来自每个克隆的单克隆噬菌体上清液与大鼠TFR的结合(筛选的代表性实例显示在图24中)。挑出显示超过10000个荧光单位的结合信号的376个克隆并测序以鉴定独特克隆。基于对VH CDR序列的分析，鉴定了65种独特的结合物。
为了能够将这些TFR结合结体表达为Fab，使用引物M13前导序列(参见实施例4)和HLINK3(CTGAACCGCCTCCACCACTCGA：SEQ ID 76)对VH基因进行PCR扩增。扩增的VH基因用限制酶NcoI和XhoI消化并连接到用相同酶预消化的pINT12载体(编码KB_A07或KB_A12轻链)中。pINT12载体(图7)具有双重启动子表达盒，其中重链表达受巨细胞病毒(CMV)启动子控制，轻链表达由延伸因子-1α(EF1-α)启动子驱动。为了在哺乳动物细胞中表达这些结体，使用Plasmid Plus试剂盒(Qiagen，目录号12945)制备转染质量DNA。将15μg质粒DNA与48μlExpiFectamine CHO转染试剂(赛默飞世尔科技，产品目录号A29129)在1ml OptiPRO无血清培养基中一起温育5分钟，然后加入到以6x106个细胞/ml的密度接种在125ml组织培养瓶中的15ml Expi-CHO细胞(Thermo Fisher Scientific，目录号A29133)。转染后18-22小时，将培养瓶在37℃下温育7天(5％CO2，75％湿度，800rpm振荡)。进料包括补充有90μl增强剂溶液的3.6ml ExpiCHO进料。根据制造商的说明使用CaptureSelect IgG-CH1亲和树脂(Thermo Fisher Scientific，目录号194320005)从细胞培养物上清液中纯化表达的蛋白质。纯化的蛋白质针对2x PBS透析过夜。使用280nm处的吸光度和理论消光系数确定蛋白质浓度。
为了评估这些结体穿过BBB的能力，使用了立即可用的体外大鼠BBB模型系统(Pharmacocell，目录号RBT-24H)。在该模型系统中，将大鼠脑内皮细胞与周细胞和星形胶质细胞共培养以模拟体内BBB解剖(Nakagawa，S.等(2009)Neurochem.Int.54,253-263)。根据制造商的说明培养体外大鼠BBB试剂盒，并在测试结体之前测量跨内皮电阻(TEER)以验证屏障的完整性。所有孔的TEER测量值>200Ω/cm2。对21个结体Fab测试了它们穿过体外BBB模型系统的能力。已被证明穿过BBB体内模型的充分表征的抗大鼠TFR抗体(尽管处于低水平)OX-26用作阳性对照(Jefferies，WA，Brandon，MR，Williams，AF和Hunt，SVImmunology，54，333-341(1985)，Moos，T.&Morgan，EH Journal of Neurochemistry 79,119-129(2001))。将父结体KB_A12用作阴性对照。如上所述，以Fab形式表达和纯化阳性和阴性对照。对于该测定，将测试结体制备为7种寡克隆混合物，各含有3种不同的在测定缓冲液(含有15mM HEPES，0.5％BSA，500nM氢化可的松和10μgDMEM-F12/ml Na-F)中终浓度为2μM的Fab抗体。在相同的测定缓冲液中以1μM制备阳性和阴性对照。将这些Fab寡克隆混合物和对照添加到共培养试剂盒的上室(称为血液侧)，并在37℃下温育6小时(具有5％CO2和75％湿度)。使用夹心ELISA确定下腔室(称为脑侧)中转运Fab的浓度。在该ELISA中，使用抗CH1抗体(由Hybridoma Reagent Laboratories提供)捕获Fab，并使用兔抗人IgGκ轻链抗体(Abcam，目录号ab195576)或抗人IgGλ轻链抗体(Abcam，目录号ab124719)，然后是铕缀合的抗兔抗体(Perkin Elmer，目录号AD0105)检测。与阴性对照相比，C2、C3和C4孔中的寡克隆结体Fab混合物显示出显著水平的转胞吞作用(参见表19)。存在于这些孔中的结体的VH序列显示在表20中。该实施例证明了使用对参与大分子转运进入大脑的受体(即TFR)具有特异性的VH结构域以递送具有不同特异性的结蛋白-VL融合物(在该实施例中的胰蛋白酶结合)。可以使用相同的方法来产生功能性结蛋白-VL融合物，其可以调节在脑中表达的靶标(例如中枢神经系统内的离子通道，蛋白酶如BACE)的活性。通过使用本领域技术人员已知的方法优化VH结构域特异性和/或亲和力，可以进一步提高观察到的胞吞作用水平。
实施例14：将结体和牛抗体与呈现结蛋白插入的天然“超长VH CDR3(牛ULVC-Ab)” (EETI-II牛ULVC-Ab)进行比较
已经描述了牛抗体具有天然超长VH CDR3，其含有暴露于溶剂的长约20A°的双链反平行片(称为茎)，呈现由3个二硫醚键稳定的折叠结构域(称为Knob)10。Zhang及其同事证明了这些牛超长VH CDR3抗体(ULVC-Ab)的突起结构域可以被其它折叠蛋白如促红细胞生成素置换13。在这个实施例中，我们评估了与结体相比，牛ULVC-Ab在噬菌体上呈递功能性结蛋白融合物的能力。为了产生结蛋白-牛UCLA融合蛋白，将牛ULVC-Ab BLV1H12的突起区域的第一个和最后一个半胱氨酸之间的序列置换为胰蛋白酶结合结蛋白的序列；EETI-II(EETI-II牛ULVC-Ab)。将编码该构建体的基因片段合成(Integrated DNA technologies，表21)。使用限制性位点NcoI和NotI将该合成基因克隆到噬菌体展示载体pSANG4中并转化到大肠杆菌TG1细胞中。然后使用胰蛋白酶结合测定法将结蛋白-牛ULVC-Ab融合物的性能与结体KB_A12(其呈现结蛋白EETI-II作为VL CDR2融合物)进行比较。在该测定中，使用抗M13抗体，然后是铕缀合的抗小鼠抗体(如实施例3中所述)检测从EETI-II牛ULVC-Ab和KB_A12拯救的噬菌体与胰蛋白酶的结合。与EET-II-牛ULVC-Ab融合物相比，结体KB_A12展示出与胰蛋白酶的优异结合(图25)。
实施例15.结体在哺乳动物细胞表面上的功能展示
在实施例1、2、3、5、6、9、12和13中，采用噬菌体展示技术以能够展示结体或衍生文库及其选择。作为噬菌体展示的替代方案，结合物的展示已经在细菌、酵母和哺乳动物细胞上进行。在这些方法中，可以使用流式分选以测量结合分子的结合和表达以及与靶标的结合。因此，展示细胞(例如哺乳动物细胞)表面上的结体文库将能够通过荧光激活细胞分选(FACS)来筛选和选择数千万个克隆，以增加对靶标的亲和力和其最终scFv-Fc、Fab或IgG形式的表达水平。在其它系统中构建和使用显示文库的方法对于本领域技术人员是已知的。
如上所述，结体的文库(例如在受体、供体、连接子或配偶体结构域内)也可以用于哺乳动物细胞中改变的细胞表型的直接功能性筛选。因此，哺乳动物细胞中展示或分泌的结体文库可以提供发现候选药物或前导分子的有效途径。例如，在WO2015166272和其中引用的参考文献中提供了通过核酸酶定向整合在哺乳动物细胞中构建文库的方法，所有这些文献通过引用并入本文。在这个实施例中，我们证明了可以在哺乳动物细胞表面展示膜锚定的结体scFv-Fc。这通过将结体KB_A07和KB_A12scFv克隆到靶向载体pD6中(图26)，将核酸酶介导的基因整合到HEK293细胞中，然后进行流式细胞术分析来实现。流式细胞术结果显示了当用标记的抗-Fc染色时实现了表达，并且显示了结蛋白被正确折叠，因为用荧光团标记的胰蛋白酶也实现了染色。
制备结体基因KB_A07和KB_A12，用于以可以修饰的方式插入哺乳动物展示载体中以产生连接子文库。使用在边界处的重叠通过PCR产生和组装3个片段以驱动结合。在N端至C端方向，片段1由编码scFv基因的N端部分直至供体插入点(在此情况下编码Nco1位点，整个VH，scFv连接子，FW1，CDR1，FW2，重叠)的PCR产物组成。片段2由重叠、进入的结蛋白供体、重叠组成。片段3由重叠、FW3、CDR3、FW4非1位点组成)。下面给出了潜在的连接子大小和位点的描述。可以选择重叠的位置，但通常与抗体框架或供体编码区同源(允许将多样性引入重叠内部的一个或其它片段中)。在以下实例中，片段包括18至27个核苷酸的同源性重叠以使它们能够通过PCR进行组装和扩增，包含供体的最终scFv产物由三片段组装产生。使用亲本结体(没有多样化)详细描述了这种三片段组装方法。
所描述的引物列于表22中。KB_A07scFv片段1(569bp)通过PCR用正向引物2985和反向引物2999和携带KB_A07基因的DNA模板pIONTAS1产生。KB_A07scFv片段2通过PCR用引物2979和2980在不存在模板的情况下产生。在此，引物简单地退火并延伸以产生137bp的KB_A07片段2。KB_A07scFv片段3(170bp)通过PCR用正向引物3000和反向引物2995和携带KB_A07的DNA模板pIONTAS1产生。KB_A12scFv片段1(572bp)通过PCR用正向引物2985和反向引物3003以及携带结体A12的DNA模板pIONTAS1产生。KB_A12scFv片段2，通过PCR用引物2983和2984在不存在模板的情况下产生。在此，引物简单地退火并延伸以产生137bp的A12片段2。KB_A12scFv片段3(179bp)通过PCR用正向引物3004和反向引物3002)和携带KB_A12的DNA模板pIONTAS1产生。将片段2和3进行凝胶纯化，并且片段1通过离心柱纯化。然后将三种片段合并(各自100nM在10mM Tris-HCl(pH8)中)，总体积为10μl。向其中加入10μl KODHot Start Master Mix(Merck Millipore，目录号71842)。然后通过在95℃温育2分钟然后95℃(20s)，60℃(1min，40s)和70℃(30s)的20个循环来组装片段。然后将1μl该组装反应产物用作与外部引物2985和2995(A07)或2985和3002(A12)的PCR反应混合物中的模板。然后将编码KB_A07和KB_A12scFv基因的组装PCR产物用NcoI和NotI消化、凝胶纯化并克隆到用相同酶预消化的哺乳动物展示靶向载体pD6(图26)中。使用NucleoBond Xtra Midi plus试剂盒(Macherey Nagel，目录号740412.50)制备转染质量质粒DNA。
电穿孔是将DNA引入细胞的有效方式，Maxcyte开发的方案结合了哺乳动物细胞的高效转染和高细胞活力。在制造商的电穿孔缓冲液(Maxcyte电穿孔缓冲液，Thermo FisherScientific目录号NC0856428)中，将HEK293细胞离心并以108个细胞/ml的最终体积重新悬浮。将等份的4×107个细胞(0.4ml)加入到含有88μg DNA(即2.2μg/106细胞)的OC-400电穿孔杯(Maxcyte，目录号OC400R10)中。DNA混合物由80μg编码AAVS-SBITALEN(pZT-AAVS1L1和pZT-AAVS R1Systems Bioscience目录号GE601A-1)的质粒DNA作为等摩尔混合物和8μgDNA编码KB_A07或KB_A12的“供体”质粒pD6组成。还进行了对照电穿孔，其中TALEN或供体DNA被pcDNA3.0置换。根据制造商的说明(Maxcyte)进行电穿孔。转染后2天(2dpt)开始杀稻瘟菌素选择(5μg/ml)。13天后(15dpt)，使用抗Fc藻红蛋白(PE)标记的抗体通过流式细胞术分析细胞的scFv-Fc表达。通过用与别藻蓝蛋白(APC)标记的链霉亲和素预结合的生物素化胰蛋白酶染色细胞来检测正确折叠的结蛋白的存在。在FL3通道中使用前向散射和7AAD染色以针对活细胞进行分析。排除在FL3通道中染色阳性的细胞(代表吸收7-AAD的非活细胞)。
根据制造商的说明使用EZ-Link Sulfo-NHS-LC-生物素试剂盒(Pierce目录号21327)将纯化的胰蛋白酶生物素化。将生物素化胰蛋白酶(1.25μl，0.1mg/ml，4.3μM)和链霉亲和素-APC(Molecular Probes，目录号SA1005，1μl，0.2mg/ml，3.8μM)在PBS/1％BSA(100μl)中在室温下预温育30分钟。将用PBS预洗涤的每个样品的细胞(106)重新悬浮于上面制备的生物素化胰蛋白酶/链霉亲和素-APC混合物中，并向其中加入抗人Fc-PE(BioLegend，Cat#409304，200μg/ml，0.5μl)并在4℃下温育30分钟。将细胞在PBS/0.1％BSA中洗涤两次，再悬浮于含有7-AAD活力染色溶液(eBioscience，目录号00-6993-50)的PBS/0.1％BSA中并使用流式细胞仪(Intellicyt iQUE筛选仪)进行分析。
图27显示了在杀稻瘟菌素选择13天后(15dpt)，34％和11％的KB_A07和KB_A12转染的HEK293细胞对Fc和胰蛋白酶进行双重染色。未观察到未转染的HEK293细胞的染色。这表明了有可能在哺乳动物细胞的表面上展示膜束缚的结体，其中结蛋白供体被正确折叠。
实施例16.将结蛋白插入抗体VH CDR1，VH CDR2，VH CDR3，VLCDR1，VL CDR2和VL CDR3中，具有可变的连接子序列，它们在噬菌体上的展示和功能性结体的选择
实施例1、2和3证明了将结蛋白插入到抗体VL CDR1和VL CDR2中，所得结体在噬菌体表面上的展示和功能性结体的选择。在实施例1、2和3中创建了在供体和受体之间引入可变融合序列的文库，然后通过噬菌体展示选择并筛选以鉴定用于展示功能性结蛋白的最佳融合序列。如实施例11所述，该鉴定的短的连接子序列在用于展示功能性结蛋白中优于长的柔性连接子。将结蛋白插入VL CDR1或VL CDR2使得从VL和VH CDR进一步结合贡献。对于一些应用，在其中将结蛋白插入VH或VL上的可选CDR的替代构型中可以具有优势。如实施例3中所述，可能仅有一小部分将供体结蛋白连接至每个CDR的可变融合序列能够功能性地展示结蛋白。为了证明能够在所有的抗体CDR中展示功能性结蛋白，形成为scFv D1A12的变体(Tape，CJ等人.(2011)PNAS USA 108，p5578-5583)设计为在VH CDR1，VH CDR2，VH CDR3，VLCDR1，VL CDR2和VL CDR3中具有结蛋白插入，其中侧接结蛋白的两个密码子被随机分配，使得能够创建“连接子文库”结蛋白构建体，如图28所示。亲本抗TACE scFv101的序列显示于表23中。另外，为KB_A07创建了连接子文库，其中EETI-II供体结蛋白被插入到VL CDR2中，如图28所示。被插入到D1A12的六个CDR的每一个中的编码具有随机化连接子序列的结蛋白的插入片段，和其中具有随机化侧翼氨基酸的结蛋白被插入到VL CDR2中的KB_A07的连接子文库，使用本领域技术人员已知的标准分子生物学技术例如Schofield等人200728，通过如实施例15中所述的三片段组装来创建。噬菌体展示文库通过克隆到噬菌体展示载体pSANG4(Schofield等人，2007)，如实施例3中描述的噬菌体拯救，选择用于用单个克隆进行结合胰蛋白酶和单克隆噬菌体ELISA来创建。获得阳性克隆，表明了结蛋白的功能展示在抗体可变重链和轻链两者的所有CDR环内都是可能的。
通过三片段PCR组装制备scFv结蛋白连接子文库插入片段的策略和方法详述于实施例15中，并且产生插入片段的引物列于表22和24中。产生三个片段所需的引物对于每个文库，DNA模板(如果需要)和产物大小列于表25中，制备和纯化单个插入片段的方法在实施例15中描述。然后将表25中所列的每个文库A至G的三个片段以等摩尔比结合(例如将片段A1、A2和A3组合以产生文库A)并如实施例15中所述进行组装。可能使用两片段组装产生片段E(其中多样化接近scFv的末端基因)。通过PCR用正向引物2985和反向引物D1A12NotIRev(文库A至F)或2995(文库G)扩增产物。然后将编码文库A至G的组装PCR产物用NcoI和NotI消化、凝胶纯化并连接到噬菌体展示载体pSANG4(用相同酶预先消化)，并将连接产物电穿孔到大肠杆菌TG1细胞(Lucigen，目录号60502-2)中，如实施例2所述。实现了0.7-1.6×108的文库大小。如实施例3中所述从文库中拯救噬菌体以产生7个文库：文库A(插入D1A12VH CDR1中的结蛋白连接基文库)；文库B(插入D1A12VH CDR2中的结蛋白连接基文库)；文库C(插入D1A12VH CDR3中的结蛋白连接子文库)；文库D(插入D1A12VL CDR1的结蛋白连接子文库)；文库E(插入D1A12VL CDR2的结蛋白连接子文库)；文库F(插入D1A12VLCDR3的结蛋白连接子文库)；和文库G(插入KB_A07VLCDR2的结蛋白连接子文库)。
为了分离功能性的连接子-抗体融合物，将如上所述的每个连接子-抗体连接子噬菌体展示文库A至G用实施例3所述的生物素化胰蛋白酶进行两轮噬菌体展示选择。将单个克隆(每个选择46个)挑取到96孔培养板中，产生噬菌体并测试来自每个克隆的噬菌体上清液与固定在链霉抗生物素蛋白包被的MaxisorpTM平板上的生物素化胰蛋白酶的结合，使用如实施例3中所述的TRF测定检测结合(使用包被浓度为2.5μg/ml的生物素化胰蛋白酶)。将每个96孔板上的ELISA信号用从相同平板上的两个阴性对照读数的平均值获得的信号减去背景，其中不添加噬菌体到孔中。胰蛋白酶的特异性通过在不存在添加的胰蛋白酶的情况下与链霉亲和素包被的MaxisorpTM缺乏结合来证实。筛选从未选择的结蛋白连接子抗体文库C、E和G挑选的克隆，分别得到0％、1％和32％的阳性克隆，表明了有限比例的文库成员能够展示功能性结蛋白供体。文库A、B、C、D、E、F和G的噬菌体展示选择和单克隆噬菌体ELISA后获得的克隆的命中率分别为11％、17％、28％、4％、74％、24％和93％，表明了富含展示功能性连接子的结体。
对阳性克隆进行测序以确定能够用VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3展示功能性结蛋白的侧翼连接子序列。鉴定的连接子序列的序列列于表26和27中。分离了具有独特连接子序列的功能性结体的实例(表26)，因此证明了功能性结蛋白插入抗体VH CDR1、VHCDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
实施例17.插入到抗体VL CDR1和VL CDR2结构域中的结蛋白的替代框架
在上述实施例中，将富含半胱氨酸的肽的天然N末端和C末端(以下称为结蛋白，不考虑结构和二硫醚键形式)以保留具有融合到抗体框架的天然N和C末端的结蛋白的天然线性序列的方式插入抗体CDR残基。受体抗体和供体结蛋白之间的替代“框架”策略是可能的，然而这里将其举例说明。在以下描述中，供体中连续半胱氨酸之间的序列被称为“环”，并且基于其自然顺序编号为1-5。例如，环1在第一个半胱氨酸和第二个半胱氨酸之间延伸。环5在第5和第6个半胱氨酸之间延伸。一些富含半胱氨酸的肽，例如环化合物以环状形式存在，其中N和C末端通过肽序列连接。例如，MoCoT可以以“线性”形式(即具有游离的N和C末端)或环状形式存在。连接环状形式的第1个(N末端)和第6个(C末端)半胱氨酸的另外的肽序列被称为“环6”(Jagadish等，(2010)Peptide Science 94p611-616)，并且用于下面的实施例以连接原始N和C末端。
从一个角度来看，结体中的供体结蛋白的N和C末端通过抗体连接，该抗体可被认为等同于环状结蛋白中的“环6”“连接”N和C末端半胱氨酸。从同样的角度来看，人们可以考虑其中抗体替代可选环路的替代“框架”。在此排列中，供体的天然N和C末端可以通过循环MoCoTI-II中发现的另外的“环6”肽连接。这些可选的框架化策略将允许不同环相对于抗体受体的并列变化，以及在产生最佳双特异性取向中的潜在益处以及工程策略例如通过使供体和受体与靶蛋白或复合物接触而改善亲和力或特异性。供体相对于受体的有效“旋转”可以增加某些关键环的可用性，例如EET 5-3中的胰蛋白酶结合环相对于EET 1-5被移动到供体内更中心的位置(见下文)。添加替代的“环6”进一步增加了与靶蛋白质额外接触的可能性。最后，在某些情况下，与天然结体构建体相比，这样的构建方案可以提供优越的表达或折叠。
当如之前实施例中所述将结蛋白以其天然构型插入时，抗体受体的N末端区段之后是供体结蛋白的第一个半胱氨酸和环1。供体在环5处终止，然后是半胱氨酸末端。在这里采用的命名法中，这被称为“1-5”构型，代表了结蛋白环1、2、3、4、5的顺序。在这种情况下，抗体可以被认为是与循环结蛋白的环6的等同。表28说明了改变结蛋白和抗体之间框架的不同潜在策略。在表28中，天然环1在每种情况下都加下划线。将EETI-II的原始N和C末端连接在一起以形成“环6”，并使用MoCOTI-II的环6的肽序列(以斜体表示)。图29A给出了EET_5-3配置中回路排列的更详细表示。这表明了在替代配置EET_5-3中，环的顺序是环5、6、1、2和3(其中抗体“替换”环4)。
为了举例说明选择插入替代框架中的结蛋白，将具有EET_5-3构型框架的结蛋白供体融合到κ或λVL结构域的CDR1或CDR2位置。这是以限制2个结构域之间添加的氨基酸数量的方式用随机氨基酸置换VL受体内的残基来完成的(图29B)。
将具有修饰框架的结蛋白插入CDR1中
通过产生具有Pml1和Mfe位点(通过PCR引入)的PCR片段并克隆到pIONTAS1_KB_κ和pIONTAS1_KB_λ中以制备具有5-3框架的合成EETI-II结蛋白供体基因并用于置换轻链受体中的CDR1位置。框架和CDR指定如国际免疫遗传学信息系统(IMGT)29所述。PCR引物还在限制性位点和结蛋白基因之间引入可变的氨基酸序列。PCR引物Pml5-3EETa和Pml5-3EETb各自在Pml限制位点后立即引入由序列VNS(V＝A、C或G，N＝A、C、G或T，S＝C或G)编码的3个可变密码子。“VNS”简并密码子在来自24个密码子组合的每个随机化位置编码16个氨基酸(不包括半胱氨酸，酪氨酸，色氨酸，苯丙氨酸和终止密码子)。与Pml5-3EETa相比，Pml5-3EETb还在供体和受体之间引入额外的甘氨酸残基。
Pml5-3EETa GTGT VNS VNS VNS TGC GGT CCG AAC GGC TTC TGC(SEQ ID NO：79)
Pml5-3EETb GTGT gga VNS VNS VNS TGC GGT CCG AAC GGC TTC TGC(SEQ IDNO：80)
这些序列的5'端代表由Pml1产生的位点，Pml1是识别序列“CACGTG”以产生平端的限制酶。为了促进合成具有5'磷酸化末端的PCR产物引物的平端克隆。
在结蛋白基因的3'末端，使用反义引物5-3EETMfe(编码Mfe1位点)来扩增EETI-II的5-3框架。用于克隆的Mfe1位点编码FW2(Asn-Trp)的2和3个氨基酸。该引物引入由VNS或VNC密码子编码的2个随机氨基酸，随后是Mfe1位点(加下划线)。
5-3EETMfe
GTCAGTCCAATTGNBSNBGCAGCCGGCCAGGCAGTCTGA(SEQ ID NO：81)
图29C描绘了使用引物Pml5-3EETa将5-3形式的EETI-II插入λ轻链IGKV1D-39的CDR1后的序列。如前面实施例2所述，还使用限制性位点Mfe1和Not1(加下划线)在结蛋白供体后克隆了包含框架2-框架4的轻链片段集。
将结蛋白插入CDR2
通过产生具有通过PCR引入的Pst1和BspE1位点的PCR片段，将结蛋白供体导入pIONTAS1_KB_λ和pIONTAS1_KB_κ的CDR2位置。有可能将一个Pst1位点引入IGKV1D-39Vκ基因的CDR2区的前两个残基(在Ala-Ala序列内)。为了便于克隆，在Vλ生殖系基因IGLV1-36的框架2的末端引入相同的限制性位点和编码的残基。在λ种系中，也可以将BspE1位点引入编码Ser-Gly的FW3区域的第4个和第5个残基(图3E)。再次，也将该限制性位点和编码的氨基酸引入Vκ基因(图3F)。
PCR引物PST5-3EETa用于扩增EETI-II并引入2个Ala密码子，包含用于克隆的Pst1位点(加下划线)，随后是由序列GNS编码的2个可变密码子(编码Val、Ala、Asp或Gly)和VNS(在24个密码子内编码16个氨基酸)紧接在Pst1限制性位点之后并在结蛋白序列之前。VNS密码子取代EETI-II的第一个氨基酸具有在供体和受体框架之间添加3个氨基酸(2个Ala残基和Val、Asp、Ala或Gly之一)的净效果(图29B，D)。
PST5-3EETa ATC TAT GCT GCA GNS VNS TGC GGT CCG AAC GGC TTC TGC(SEQ IDNO：82)
在进入的结蛋白供体的3'末端，使用PCR引物5-3EETBse来扩增5-3框架的EETI-II。这引入了用于克隆的BspE1站点。PCR产物引入了结蛋白供体，然后是天然位于EETI-II的最后一个半胱氨酸之后的甘氨酸(图3a)。随后是2个随机氨基酸，其在克隆后与FW3的第4和第5个氨基酸相邻。这具有用两个随机氨基酸取代FW3的前三个残基并保留结蛋白的末端甘氨酸的效果(图3B)。
5-3EETBse
GTCAGAGACTCCGGASNBSNBCCCGCAGCCGGCCAGGCAG TCTGA(SEQ ID NO：83)
包含框架3-框架4的轻链片段集也如先前实施例2中所述在结蛋白供体后克隆。
图29D描述了使用引物5-3EETBse将5-3形式的EETI-II插入λ轻链IGKV1D-39的CDR2后的序列。包含框架3-框架4的轻链片段集也使用限制性位点BspE1和Not1如先前实施例2中所述在结蛋白供体之后克隆。
使用本领域技术人员已知的标准分子生物学技术，例如Schofield等人200728，使用如上所述产生的基因片段产生构建体(如图29B中所示，C和D))。将它们克隆到“pIONTAS1_KB_κ”和“pIONTAS1_KB_λ”中，并电穿孔到大肠杆菌TG1细胞中，构建3.5-6.6×108个成员的结体文库大小
如实施例3中所述，在胰蛋白酶上进行选择后，通过单克隆噬菌体ELISA鉴定阳性克隆并确定它们的序列。表29中显示了κ和λ轻链的CDR1或CDR2中的阳性克隆的实例，其中连接子序列显示为小写字母，并且5-3框架中的结蛋白供体显示为斜体。还显示了从单克隆噬菌体ELISA获得的ELISA信号的值。通过突变涉及与胰蛋白酶相互作用的脯氨酸-精氨酸残基对减少结合的丙氨酸-丙氨酸来进一步证实相互作用的特异性(如实施例3中所述)。
实施例18评估抗Kv1.3结体的免疫调节功能。
Kv1.3在T细胞受体激活后维持钙信号传导中起关键作用，从而在效应记忆T(TEM)细胞中调节T细胞活化、增殖和细胞因子释放。TEM细胞在T淋巴细胞介导的自身免疫性疾病的发病机制中发挥重要作用，因此阻断Kv1.3活性代表了治疗干预的潜在点。
实施例7描述了通过用富含半胱氨酸的小蛋白Shk或短肤蝎毒素(分别来自海葵毒液和蝎子毒液的天然存在的Kv1.3阻断剂)取代结体KB_A07和KB_A12的CDR2位置处的胰蛋白酶结合结蛋白EETI-II来生成Kv1.3阻断剂。实施例8证明了由电生理学测定的这些结体对Kv1.3的阻断活性。在这个实施例中，我们评估了KB_A12Shk通过活化T细胞调节细胞因子分泌的能力。
用于测量来自T细胞的细胞因子释放的方法是本领域技术人员熟知的(例如Tarcha等人，(2012)J Pharmacology and Experimental Therapeutics，342p642-653)。从5名健康供体分离外周血单核细胞(PBMC)，并通过在预先用500ng/ml抗CD3抗体OKT3(ebioscience，目录号16-0037-85)包被的96孔板中培养来模拟。将PBMC以2x106个细胞/ml悬浮，并将与100ul测试样品(KB_A12_ShK)或阳性对照(游离Shk毒素，Alomone实验室，STS-400)或阴性对照(亲本结体KB_A12)混合的100ul细胞悬浮液的最终浓度为100nM。(样品一式三份用于KB_A12_Shk，或者重复用于KB_A12和游离Shk)。将细胞在37℃温育72小时，在室温下以1500rpm离心5分钟，然后除去150ul上清液。温育72小时后，根据制造商说明书(Thermo Fisher)，使用基于Luminex珠的试验测定细胞因子和颗粒酶B的浓度。
相比于与对照结体(KB_A12)(图30A至D)温育的对照，当与KB_A12_Shk温育时，来自所有5个不同供体的PBMC中的干扰素γ、颗粒酶B、白细胞介素-17A和TNF-α的分泌减少。这证明KB_A12_ShK不仅阻断了通过电生理学测量的Kv1.3功能(实施例8)，而且还直接干扰了T细胞功能测定中确定的T细胞活化。
表1：源自EETI-II CDR1和CDR2文库的独特EETI-II CDR1和CDR2结体结合物的序列
表2：选择用于详细表征的结体。
表3：结体GlyAla突变体的胰蛋白酶结合分析。
表4：结体Fab的胰蛋白酶结合。
表5：从噬菌体展示选择中鉴定的双特异性结体。
表6：具有改善结合胰蛋白酶的结体重链改组克隆(HCDR3-SEQ NO：143-165)
表7：用于抗体VL CDR2插入的离子通道阻断结蛋白。
表8A：离子通道阻断结蛋白的DNA和氨基酸序列。
表8B：离子通道阻断受体序列：供体融合物(加下划线的结蛋白序列)
表9A：用于将离子通道阻断剂(毒素)克隆到KB_A07的VL CDR2中的引物。引物名称标识用于融合的毒素(例如Huwen_A07Rev是用于将虎纹捕鸟蛛毒素-IV克隆到KB_A07中的反向引物)
表9B：用于将离子通道阻断剂(毒素)克隆到KB_A12的VL CDR2中的引物。引物名称标识用于融合的毒素(例如Huwen_A12Fwd是用于将虎纹捕鸟蛛毒素-IV克隆到KB_A07中的正向引物)。
表10：毒素-抗体融合物的蛋白-A纯化后的结体产量。
表11A：针对Kv1.3通道测试的八个样品的IC50总结数据。N/E*＝没有可检测的效果。
表11B：响应于基于KB_A12和KB_A07的结体应用的ASIC1a目前剩余百分比，随后是完全阻断浓度的PcTx1
表12：LOX-1结合粘蛋白的氨基酸序列
表13：用于这项工作的两种粘蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO：198,199)
表14：用于将抗体克隆到抗体KB_A07(SEQ ID NO：200和201)和KB_A12(SEQ IDNO：202和203)的CDR2位置的引物序列。
表15：“选定”结体及其变体的N和C末端连接子序列。
表16：结体连接子变体的序列
表17A：从结体环文库分离的独特cMET结合物的环1序列。环1残基侧翼的半胱氨酸以粗体突出显示。
KB_A12_B-gal_F02 CRTTSTIRRRC(SEQ ID NO:234) 476399
KB_A12_B-gal_G05 CLDTVNLRRRC(SEQ ID NO:235) 529017
KB_A12_B-gal_H03 CNQTMSIRRPC(SEQ ID NO:236) 517907
KB_A12_B-gal_E04 CLATTSIRRPC(SEQ ID NO:237) 523482
KB_A12_B-gal_E05 CRETSSLRRPC(SEQ ID NO:238) 311927
KB_A12_B-gal_F09 CIATSHIRRHC(SEQ ID NO:239) 257676
KB_A12_B-gal_F11 CHETAQIRRRC(SEQ ID NO:240) 531474
KB_A12_B-gal_H07 CTQTALIRRRC(SEQ ID NO:241) 62049
KB_A12_B-gal_H02 CEQTSVIRRHC(SEQ ID NO:242) 501461
KB_A12_B-gal_F03 CLATTSIRRHC(SEQ ID NO:243) 288901
KB_A12_B-gal_F07 CRTTANVRRHC(SEQ ID NO:244) 246274
表17B：从结体环文库分离的独特β-半乳糖苷酶结合物的环1序列。环1残基侧翼的半胱氨酸以粗体突出显示。
表18：用于构建结体环文库的诱变寡核苷酸的核苷酸序列。
表19：在体外模型系统中跨越BBB的21个测试结体和对照的转胞吞作用百分比。
表20：可能潜在跨越BBB的抗TFR VH的氨基酸序列。
表21.EETI-II-牛ULVC-Ab合成基因的核苷酸序列。
表22：用于产生克隆哺乳动物展示的结体和连接子文库的插入片段的引物。
表23：用于将结蛋白连接子文库插入VH和VL CDR 1至3中的亲本抗TACED1A12scFv的氨基酸序列101。
表24：用于产生克隆噬菌体展示选择的结体和连接子文库的插入片段的引物。
表25：产生三片段组装所需的DNA插入片段以产生结蛋白连接子文库所需的引物对。VL CDR3结蛋白连接子文库由具有插入片段F1和F2的两片段组装产生。
表26：能够在D1A12VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3中嵌入功能性结蛋白展示的连接子的序列。XX代表图28中所示的随机残基。
表27：能够在KB_A07VL CDR2中嵌入功能性结蛋白展示的连接子的序列。XX代表图28中所示的随机残基。
形式名称 序列 SEQ ID
EET 1-5 CPRILMRCKQDSDCLAGCVCGPNGFC 302
EET 2-6 CKQDSDCLAGCVCGPNGFCGSGSDGGVC 303
EET 3-1 CLAGCVCGPNGFCGSGSDGGVCPRILMRC 304
EET 4-2 CVCGPNGFCGSGSDGGVCPRILMRCKQDSDC 305
EET 5-3 CGPNGFCGSGSDGGVCPRILMRCKQDSDCLAGC 306
EET 6-4 CGSGSDGGVCPRILMRCKQDSDCLAGCVC 307
表28.EETI-II供体的替代框架
C09(9820)
QSVLTQPPSVSEAPRQRVTITC
ggkrCGPNGFCGSGSDGGVCPRILMRCKQDSDCLAGCtsNWYQQKPGQAPVLVVQDDSVRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDGADYYCQVWDISSDLGVFGGGTKLTVLGQP(SEQ ID NO:308)
E01(127988)
QSVLTQPPSVSEAPRQRVTITCSGSSSNIGNNAVNWYQQLPGKAPKLLIYaaggCGPNGFCGSGSDGGVCPRILMRCKQDSDCLAGCgihSGVSDRFSDSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGYVFGTGTKLTVLGQP(SEQ IDNO:309)
E08(121047)
QSVLTQPPSVSEAPRQRVTITCSGSSSNIGNNAVNWYQQLPGKAPKLLIYaaggCGPNGFCGSGSDGGVCPRILMRCKQDSDCLAGCgiqSGIPERFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDNLSGYVFGTGTKLTVLGQP(SEQ IDNO:310)
E05(118631)
QSVLTQPPSVSEAPRQRVTITCSGSSSNIGNNAVNWYQQLPGKAPKLLIYaaggCGPNGFCGSGSDGGVCPRILMRCKQDSDCLAGCgaqSGIPERFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEAHYYCAAWDDSLNGYVFGTGTKVTVLGQP(SEQ IDNO:311)
F01(101798)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIDaageCGPNGFCGSGSDGGVCPRINMRCKQDSDCLAGCgrdSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPWTFGQGTKVEIKRT(SEQ ID NO:312)
E03(82495)
QSVLTQPPSVSEAPRQRVTITCSGSSSNIGNNAVNWYQQLPGKAPKLLIYaaggCGPNGFCGSGSDGGVCPRILMRCKQDSDCLAGCgrnSGIPERFSGSKSGHTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHVLFGGGTKLTVLGQP(SEQ IDNO:313)
F07(72824)
QSVLTQPPSVSEAPRQRVTITCSGSSSNIGNNAVNWYQQLPGKAPKLLIYaaggCGPNGFCGSGSDGGVCPRILMRCKQDSDCLAGCggqSGVPDRFSGSKSGTSASLAISRLQSEDEADYYCAAWDDSLNAYVFGTGTKVTVLGQP(SEQ IDNO:314)
E09(70274)
QSVLTQPPSVSEAPRQRVTITCSGSSSNIGNNAVNWYQQLPGKAPKLLIYaaggCGPNGFCGSGSDGGVCPRILMRCKQDSDCLAGCgtqSGIPERFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLRAYVFGTGTQLTVLGQP(SEQ IDNO:315)
F03(67972)
QSVLTQPPSVSEAPRQRVTITCSGSSSNIGNNAVNWYQQLPGRAPKLLIYaaggCGPNGFCGSGGDGGVCPRILMRCKQDSDCLAGCgahSGIPERFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLNGWVFGGGTKVTVLGQP(SEQ IDNO:316)
G11(27650)
QSVLTQPPSVSEAPRQRVTITCSGSSSNIGNNAVNWYQQLPGKAPKLLIYaaggCGPNGFCGSGSDGGVCPRILMRCKQDSDCLAGCgqsSGVSDRFSGSKSGTSATLDITGLQTGDEADYYCGTWDNSLSVGVFGGGTKVTVLGQP(SEQ IDNO:317)
表29：具有EETI_II的替代框架的结体的序列
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Claims (127)

1.一种筛选方法，其包括：
(i)提供结合成员的创始文库，
所述文库中的每个结合成员包含融合蛋白且任选地包含与所述融合蛋白关联的配偶体结构域，
其中所述融合蛋白包含插入受体多样性支架结构域内的供体多样性支架结构域，任选地其中所述供体多样性支架结构域的N和C末端连接至具有至多4个氨基酸的连接子的所述受体多样性支架结构域，
其中所述供体多样性支架结构域包含供体支架和供体相互作用序列，且所述受体多样性支架结构域包含受体支架和受体相互作用序列，并且在所述创始文库中所述供体相互作用序列、受体相互作用序列和连接子中的一者、两者或全部三者不同，
(ii)针对显示结合活性的结合成员来筛选所述创始文库，以及
(iii)对显示所述结合活性的、所述创始文库中的一种或多种结合成员进行鉴定。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述创始文库中的所述结合成员具有不同的供体相互作用序列和相同的受体相互作用序列。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述创始文库中的所述结合成员具有不同的受体相互作用序列和相同的供体相互作用序列。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述创始文库中的所述结合成员具有不同的受体和供体相互作用序列。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述创始文库中的所述结合成员具有不同的连接子序列。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述创始文库中的所述结合成员具有相同的受体和供体相互作用序列。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其包括通过以下进一步富集所述一种或多种结合成员：
(a)回收所述一种或多种结合成员，
(b)对所述回收的结合成员针对所述结合活性进行选择，
(c)回收所述一个或多个选择的结合成员，
(d)任选地重复步骤(b)和(c)一次或多次。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括：
(iv)在一种或多种鉴定的创始结合成员的氨基酸序列中的一个或多个位置处引入不同的氨基酸残基以产生修饰的结合成员文库，
(v)针对显示结合活性的修饰的结合成员来筛选所述修饰的文库，以及(vi)对显示所述结合活性的、所述修饰的文库中的一种或多种修饰的结合成员进行鉴定。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，通过随机诱变或定点诱变引入所述不同的氨基酸。
10.根据权利要求8或权利要求9所述的方法，其中，所述一个或多个位置在所述一种或多种鉴定的结合成员的所述供体支架、供体相互作用序列、受体支架、受体相互作用序列、连接子或配偶体结构域的氨基酸序列内。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的方法，其中，相对于步骤(iii)中鉴定的所述一种或多种结合成员，一种或多种所述修饰的结合成员的所述结合活性改善。
12.根据权利要求8至11中任一项所述的方法，其包括通过以下进一步富集所述一种或多种结合成员：
(e)回收所述一种或多种修饰的结合成员，
(f)对所述回收的修饰的结合成员针对所述结合活性进行选择，
(g)回收所述一个或多个选择的结合修饰的成员，以及
(h)任选地重复步骤(f)和(g)一次或多次。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其包括用替代的供体多样性支架结构域置换所述一种或多种鉴定的结合成员或修饰的结合成员中的所述供体多样性骨架结构域。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述供体多样性支架结构域和所述替代的供体多样性支架结构域包含相同的支架类别。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述供体多样性支架结构域和所述替代的供体多样性支架结构域包含相同的供体支架和不同的供体相互作用序列。
16.根据权利要求14或权利要求15所述的方法，其中，所述供体多样性支架结构域和所述替代的供体多样性支架结构域均为结蛋白。
17.根据权利要求14所述的方法，其中，所述供体多样性支架和所述替代的供体多样性支架包含不同的供体支架和不同的供体相互作用序列。
18.根据权利要求13-17中任一项所述的方法，其中，所述替代的供体多样性支架包含不同的供体相互作用序列。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其包括：
(vii)将来自所述一种或多种鉴定的结合成员或修饰的结合成员的融合蛋白与不同群体的结合配偶体相关联以产生改组的结合成员文库，
(viii)针对显示结合活性的改组的结合成员筛选所述改组的文库，
(ix)对显示所述结合活性的一种或多种改组的结合成员进行鉴定。
20.根据权利要求19所述的方法，其包括通过以下进一步富集所述一种或多种改组的结合成员：
(i)回收所述一种或多种改组的结合成员，
(j)对所述回收的改组的结合成员针对所述结合活性进行选择，
(k)回收所述一个或多个选择的结合修饰的成员，以及
(l)任选地重复步骤(j)和(k)一次或多次。
21.根据权利要求19或权利要求20所述的方法，其中，相对于步骤(iii)和/或步骤(vi)中鉴定的所述一种或多种结合成员，所述改组的结合成员的所述结合活性改善。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其包括将另外的氨基酸序列引入来自所述创始文库、修饰文库和/或改组文库的所述一种或多种鉴定的结合成员的所述融合蛋白或配偶体结构域中。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述另外的氨基酸序列是靶结合序列。
24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述融合蛋白的供体和受体多样性支架都有助于所述融合蛋白的结合活性。
25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述结合活性是与靶分子的结合。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述结合成员是所述靶分子的拮抗剂或抑制剂。
27.根据权利要求25所述的方法，其中，所述结合成员是所述靶分子的激动剂、增强剂或激活剂。
28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述供体多样性支架结构域、受体多样性支架结构域和配偶体结构域中的一个与所述靶分子结合，并且所述方法包括修饰或置换所述一种或多种鉴定的结合成员中的所述供体多样性支架结构域、受体多样性支架结构域或配偶体结构域。
29.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，通过确定所述文库中的所述结合成员与靶分子的结合来筛选所述创始文库、修饰文库或改组文库，其中所述靶分子和所述创始文库、修饰文库或改组文库中的一个被固定。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的方法，其中，所述创始文库、修饰文库或改组文库通过在报道细胞中表达所述文库并鉴定具有改变的表型的一种或多种报道细胞来筛选。
31.根据权利要求29或30所述的方法，其中，与所述靶分子或改变的表型的结合通过流式细胞术、免疫组织化学或ELISA检测。
32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括对所述一种或多种鉴定的结合成员针对稳定性进行选择。
33.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法包括对所述创始文库、修饰文库和/或改组文库针对其中所述供体多样性支架和/或所述受体多样性支架采用活性构象的结合成员进行选择。
34.根据权利要求33所述的方法，其中，所述受体多样性支架结构域是免疫球蛋白序列，并且所述方法还包括使用免疫球蛋白结合分子筛选所述文库。
35.根据权利要求34所述的方法，其中，所述免疫球蛋白结合分子是蛋白质L、蛋白质A或抗Ig抗体或抗体片段。
36.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法包括从所述文库、修饰文库和/或改组文库中分离和/或纯化所述一种或多种鉴定的结合成员。
37.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述文库中的结合成员展示在包含编码所述结合成员的核酸的核糖体、细胞或病毒的表面上。
38.根据权利要求37所述的方法，其中，所述方法包括从所述文库、修饰文库和/或改组文库中分离和/或纯化展示所述一种或多种鉴定的结合成员的所述核糖体、细胞或病毒。
39.根据权利要求37或38所述的方法，其中，所述方法包括从所述文库、修饰文库和/或改组文库中分离和/或纯化编码所述一种或多种鉴定的结合成员的核酸。
40.根据权利要求37至39中任一项所述的方法，其中，所述方法包括从所述文库、修饰文库和/或改组文库中扩增和/或克隆编码所述一种或多种鉴定的结合成员的核酸。
41.根据权利要求37至40中任一项所述的方法，其中，所述方法包括从所述文库、修饰文库和/或改组文库中测序编码所述一种或多种鉴定的结合成员的核酸。
42.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其包括从所述文库、修饰文库和/或改组文库中合成或重组表达一种或多种鉴定的结合成员。
43.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其包括确定从所述文库、修饰文库和/或改组文库中鉴定的所述一种或多种结合成员对所述靶分子的活性的影响。
44.根据权利要求43所述的方法，其中，所述靶分子是离子通道，并且确定所述一种或多种鉴定的结合成员对穿过所述通道的离子流的影响。
45.根据权利要求1至44中任一项所述的方法，其包括从所述创始文库、修饰文库和/或改组文库中合成或重组表达来自一种或多种所述鉴定的结合成员的分离的供体多样性支架结构域。
46.根据权利要求1至45中任一项所述的方法，其包括将一种或多种所述鉴定的结合成员重新形成为scFv、Fab、scFv-Fc、Fc、IgA、IgD、IgM或IgG。
47.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其包括将治疗性部分、半衰期延长部分或可检测标记附接于所述一种或多种鉴定的结合成员。
48.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其包括将来自所述创始文库、修饰文库和/或改组文库或所述分离的供体多样性支架结构域的所述一种或多种鉴定的结合成员与药学上可接受的赋形剂一起配制。
49.一种产生结合成员文库的方法，其包括：
提供核酸群体，其编码不同种群的包含插入受体多样性支架结构域中的供体多样性支架结构域的融合蛋白，
其中所述供体多样性支架结构域包含供体支架和供体相互作用序列，并且所述受体多样性支架结构域包含受体支架和受体相互作用序列，任选地其中所述供体多样性支架结构域的N和C末端连接至具有至多4个氨基酸的连接子的所述受体多样性支架结构域，并且所述群体中所述供体相互作用序列、受体相互作用序列和连接子中的一者、两者或全部三者不同，
表达所述核酸群体以产生所述不同的群体，以及
任选地将所述融合蛋白与配偶体结构域群体相关联，
从而产生结合成员文库。
50.根据权利要求49所述的方法，其中，所述核酸在细胞或无细胞核糖体中表达。
51.根据权利要求50所述的方法，其中，所述细胞是原核细胞。
52.根据权利要求50所述的方法，其中，所述细胞是真核细胞。
53.根据权利要求52所述的方法，其中，所述真核细胞是植物、酵母、昆虫或哺乳动物细胞。
54.一种结合成员文库，其包含：
包含插入受体多样性支架结构域中的供体多样性支架结构域的不同群体的融合蛋白，
其中所述供体多样性支架结构域包含供体支架和供体相互作用序列，并且所述受体多样性支架结构域包含受体支架和受体相互作用序列，任选地其中所述供体多样性支架结构域的N和C末端连接至具有至多4个氨基酸的连接子的所述受体多样性支架结构域，并且
所述群体中所述供体相互作用序列、受体相互作用序列和连接子中的一者、两者或全部三者不同，以及
任选地其中所述融合蛋白与结合配偶体相关联以形成异二聚体。
55.根据权利要求54所述的文库，其中，所述文库中的结合成员包含：
(i)不同的供体相互作用序列和相同的受体相互作用序列，
(ii)不同的受体相互作用序列和相同的供体相互作用序列，或
(iii)不同的受体和供体相互作用序列。
56.根据权利要求55所述的文库，其中，所述文库中的结合成员具有不同的连接子序列。
57.根据权利要求56所述的文库，其中，所述文库中的结合成员具有相同的受体和供体相互作用序列和不同的连接子序列。
58.根据权利要求54至57中任一项所述的文库，其中，所述文库中的结合成员具有不同的配偶体结构域。
59.根据权利要求54至58中任一项所述的文库，其通过根据权利要求49至53中任一项所述的方法产生。
60.根据权利要求49至59中任一项所述的方法或文库，其中，所述文库中的各个结合成员展示在包含编码所述结合成员的核酸的核糖体、细胞或病毒的表面上。
61.根据权利要求60所述的方法或文库，其中，所述结合成员展示在噬菌体或真核细胞的表面上。
62.根据权利要求54至61中任一项所述的方法或文库，其中，所述结合成员的融合蛋白与丝状噬菌体的外壳蛋白融合。
63.一种包含插入受体多样性支架结构域中的供体多样性支架结构域的融合蛋白，其中，所述供体多样性支架结构域包含供体支架和供体相互作用序列，并且所述受体多样性支架结构域包含受体支架和受体相互作用序列。
64.一种结合成员，包含根据权利要求63所述的融合蛋白和配偶体结构域。
65.一种产生结合成员方法，其包括：
将编码供体多样性支架结构域的核酸插入到编码受体多样性支架结构域的核酸中以产生编码融合蛋白的嵌合核酸；
其中，所述供体多样性支架结构域包含供体支架和供体相互作用序列，并且所述受体多样性支架结构域包含受体支架和受体相互作用序列；
表达所述嵌合核酸以产生所述融合蛋白，以及
任选地，将所述融合蛋白与配偶体结构域相关联。
66.根据前述权利要求中任一项所述的方法、文库、融合蛋白或结合成员，其中，所述结合成员或融合蛋白相对于分离的供体多样性支架结构域具有增加的体内半衰期。
67.根据前述权利要求中任一项所述的方法、文库、融合蛋白或结合成员，其中，所述融合蛋白通过共价或非共价键与所述配偶体结构域相关联。
68.根据权利要求67所述的方法、文库、融合蛋白或结合成员，其中，所述融合蛋白的受体多样性支架结构域与配偶体结构域相关联。
69.根据权利要求67所述的方法、文库、融合蛋白或结合成员，其中，所述融合蛋白的供体多样性支架结构域与配偶体结构域相关联。
70.根据前述权利要求中任一项所述的方法、文库、融合蛋白或结合成员，其中，所述结合成员是异二聚体。
71.根据权利要求1至69中任一项所述的方法、文库、融合蛋白或结合成员，其中，所述结合成员包含多个配偶体结构域。
72.根据权利要求71所述的方法、文库、融合蛋白或结合成员，其中，所述结合成员是多聚体。
73.根据前述权利要求中任一项所述的方法、文库、融合蛋白或结合成员，其中，所述供体和受体多样性支架结构域的相互作用序列与所述靶分子上的相同表位相互作用。
74.根据前述权利要求中任一项所述的方法、文库、融合蛋白或结合成员，其中，所述融合蛋白和配偶体结构域与相同靶分子结合。
75.根据前述权利要求中任一项所述的方法、文库、融合蛋白或结合成员，其中，所述靶分子是整合膜蛋白。
76.根据权利要求75所述的方法、文库、融合蛋白或结合成员，其中，所述整合膜蛋白是离子通道、GPCR或I型受体。
77.根据权利要求1至76中任一项所述的方法、文库、融合蛋白或结合成员，其中，所述结合成员与第一靶分子和第二靶分子结合。
78.根据权利要求1至76中任一项所述的方法、文库、融合蛋白或结合成员，其中，所述融合蛋白和配偶体结构域中的一个结合第一靶分子，并且所述融合蛋白和配偶体结构域中的另一个结合第二靶分子。
79.根据权利要求77或权利要求78所述的方法、文库、融合蛋白或结合成员，其中，所述靶分子在相同细胞的表面上。
80.根据权利要求79所述的方法、文库、融合蛋白或结合成员，其中，所述结合成员与所述第一靶分子的结合增加所述结合成员与所述第二靶分子的结合。
81.根据权利要求77至80中任一项所述的方法、文库、融合蛋白或结合成员，其中，所述第一靶分子是血脑屏障受体或血液神经元屏障受体。
82.根据前述权利要求中任一项所述的方法、文库、融合蛋白或结合成员，其中，所述多样性支架结构域中的一者或两者包含多个二硫醚键。
83.根据前述权利要求中任一项所述的方法、文库、融合蛋白或结合成员，其中，所述受体多样性支架结构域选自由以下组成的组：免疫球蛋白、免疫球蛋白结构域、VH结构域、VL结构域、结蛋白、蛋白A、“设计的锚蛋白重复蛋白”(DARPin)、粘蛋白、纤连蛋白结构域、抗蛋白和T7噬菌体基因2蛋白(Gp2)。
84.根据权利要求83所述的方法、文库、融合蛋白或结合成员，其中，所述受体多样性支架结构域是全部或部分的免疫球蛋白。
85.根据权利要求84所述的方法、文库、融合蛋白或结合成员，其中，所述受体多样性支架结构域是全部或部分的抗体可变结构域。
86.根据权利要求85所述的方法、文库、融合蛋白或结合成员，其中，所述受体多样性支架结构域是抗体轻链可变(VL)结构域。
87.根据权利要求86所述的方法、文库、融合蛋白或结合成员，其中，所述抗体轻链可变(VL)结构域具有表23中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO：270)或其变体。
88.根据权利要求86或87所述的方法、文库、融合蛋白或结合成员，其中，所述配偶体结构域是抗体重链可变(VH)结构域。
89.根据权利要求88所述的方法、文库、融合蛋白或结合成员，其中，所述抗体重链可变(VH)结构域具有表20中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO：249-257)或其变体。
90.根据权利要求85所述的方法、文库、融合蛋白或结合成员，其中，所述受体多样性支架结构域是抗体重链可变(VH)结构域。
91.根据权利要求90所述的方法、文库、融合蛋白或结合成员，其中，所述配偶体结构域是抗体轻链可变(VL)结构域。
92.根据权利要求88或权利要求91所述的方法、文库、融合蛋白或结合成员，其中，所述VL结构域和所述VH结构域通过柔性连接子连接。
93.根据权利要求83至90中任一项所述的方法、文库、融合蛋白或结合成员，其中，所述供体多样性支架结构域置换所述抗体可变结构域的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2或VL CDR3的全部或部分。
94.根据权利要求91所述的方法、文库、融合蛋白或结合成员，其中，所述供体多样性支架结构域置换所述抗体VL结构域的CDR1或CDR2的全部或部分。
95.根据权利要求85至94中任一项所述的方法、文库、融合蛋白或结合成员，其中，所述供体多样性支架结构域和所述抗体可变结构域的一个或多个CDR的相互作用序列与所述靶分子上的相同表位相互作用。
96.根据权利要求95所述的方法、文库、融合蛋白或结合成员，其中，所述供体多样性支架结构域和所述抗体可变结构域的CDR3的相互作用序列与所述靶分子上的相同表位相互作用。
97.根据前述权利要求中任一项所述的方法、文库、融合蛋白或结合成员，其中，所述供体多样性支架结构域由至少15个氨基酸、优选至少20个氨基酸组成。
98.根据前述权利要求中任一项所述的方法、文库、融合蛋白或结合成员，其中，所述供体多样性支架结构域选自由以下组成的组：免疫球蛋白、免疫球蛋白结构域、VH结构域、VL结构域、蛋白A、富含半胱氨酸的肽如结蛋白或毒液肽、“设计的锚蛋白重复蛋白”(DARPin)、粘蛋白、纤连蛋白结构域、抗蛋白和T7噬菌体基因2蛋白(Gp2)。
99.根据权利要求98所述的方法、文库、融合蛋白或结合成员，其中，所述供体多样性支架结构域是富含半胱氨酸的肽。
100.根据权利要求99所述的方法、文库、融合蛋白或结合成员，其中，供体多样性支架结构域是毒液肽。
101.根据权利要求97至100中任一项所述的方法、文库、融合蛋白或结合成员，其中，所述供体多样性支架结构域是结蛋白。
102.根据权利要求101所述的方法、文库、融合蛋白或结合成员，其中，所述结蛋白是Ecballium elaterium胰蛋白酶抑制剂-II(EETI-II)、MCoTI-II、虎纹捕鸟蛛毒素-IV、ProTx-II、SSm6a、短肤蝎毒素、MoKa-1、Shk、PcTx1和芋螺毒素-ω，或其变体。
103.根据权利要求97至102中任一项所述的方法、文库、融合蛋白或结合成员，其中，所述供体多样性支架结构域的天然N和C末端连接至所述受体多样性支架结构域。
104.根据权利要求103所述的方法、文库、融合蛋白或结合成员，其中，所述结蛋白包含表17A(SEQ ID NO：211-233)、表17B(SEQ ID NO：234-244)或图29(SEQ ID NO：342)中所示的氨基酸序列或其变体。
105.根据权利要求97至104中任一项所述的方法、文库、融合蛋白或结合成员，其中，所述受体多样性支架结构域包含表1中所示的受体结合结构域的氨基酸序列，并且任选地所述连接子包含表1中所示的连接子的氨基酸序列。
106.根据权利要求103至105中任一项所述的方法、文库、融合蛋白或结合成员，其中，所述融合蛋白包含表1(SEQ ID NO：84-139)或表8B(SEQ ID NO：31至35)中所示的氨基酸序列或其变体。
107.根据权利要求97至102中任一项所述的方法、文库、融合蛋白或结合成员，其中，通过所述供体多样性支架结构域的环化和线性化产生的人工N和C末端与所述受体多样性支架结构域连接。
108.根据权利要求107所述的方法、文库、融合蛋白或结合成员，其中，所述供体多样性支架结构域是包含表28(SEQ ID NO：302-307)中所示的氨基酸序列或其变体的结蛋白。
109.根据权利要求107或108所述的方法、文库、融合蛋白或结合成员，其中，所述融合蛋白包含表29(SEQ ID NO：308-317)或图29(SEQ ID NO349和351)中所示的氨基酸序列或其变体。
110.根据权利要求106或权利要求109所述的方法、文库、融合蛋白或结合成员，其中，所述结合成员包含配偶体结构域，所述配偶体结构域是VH结构域。
111.根据权利要求97或86所述的方法、文库、融合蛋白或结合成员，其中，所述供体多样性支架结构域是粘蛋白。
112.一种核酸，其编码根据权利要求63和66至111中任一项所述的融合蛋白或根据权利要求64和66至111中任一项所述的结合成员。
113.一种编码根据权利要求112所述的核酸的载体。
114.一种产生融合蛋白或结合成员的方法，其包括：
表达根据权利要求112所述的核酸。
115.一种编码根据权利要求54至62和65至111中任一项所述的文库的核酸的群体。
116.根据权利要求115所述的群体，其中，编码所述文库的所述核酸包含在表达载体中。
117.一种包含根据权利要求54至62和65至111中任一项所述的文库和/或根据权利要求115或权利要求116所述的群体的病毒颗粒的群体。
118.一种包含根据权利要求54至62和65至111中任一项所述的文库或根据权利要求115或权利要求116所述的群体的宿主细胞的群体。
119.根据权利要求63和66至111中任一项所述的融合蛋白或根据权利要求64和66至111中任一项所述结合成员，其与毒素、治疗性部分、半衰期延长部分或可检测标记融合或缀合。
120.一种药物组合物，包含根据权利要求63、66至111和119中任一项所述的融合蛋白或根据权利要求64、66至111和119中任一项所述的结合成员和药学上可接受的赋形剂。
121.根据权利要求63、66至111和119中任一项所述的融合蛋白或根据权利要求64、66至111和119中任一项所述的结合成员或根据权利要求120所述的组合物作为药物的用途。
122.根据权利要求63、66至111和119中任一项所述的融合蛋白或根据权利要求64、66至111和119中任一项所述的结合成员或根据权利要求120所述的组合物在用于治疗与离子通道功能障碍相关联或以其为表征的疾病或病症中的用途。
123.根据权利要求122所述的融合蛋白、结合成员或组合物，其中，所述疾病或病症是疼痛、癌症、感染性疾病或自身免疫性疾病。
124.根据权利要求63、66至111和119中任一项所述的融合蛋白或根据权利要求64、66至111和119中任一项所述的结合成员或根据权利要求120所述的组合物在制备用于治疗与离子通道功能障碍相关联或以其为表征的疾病或病症的药物中的用途。
125.根据权利要求124所述的用途，其中，所述疾病或病症是疼痛、癌症、感染性疾病或自身免疫性疾病。
126.一种治疗与离子通道功能障碍相关联或以其为表征的疾病或病症的方法，其包括将根据权利要求63、66至111和119中任一项所述的融合蛋白或根据权利要求64、66至111和119中任一项所述的结合成员或根据权利要求120所述的组合物施用于有需要的个体。
127.根据权利要求126所述的治疗方法，其用于治疗疼痛或自身免疫性疾病。
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