CN111448314A - 根据可开发性选择真核细胞展示系统中的多肽药物 - Google Patents

根据可开发性选择真核细胞展示系统中的多肽药物 Download PDF

Info

Publication number
CN111448314A
CN111448314A CN201880079095.7A CN201880079095A CN111448314A CN 111448314 A CN111448314 A CN 111448314A CN 201880079095 A CN201880079095 A CN 201880079095A CN 111448314 A CN111448314 A CN 111448314A
Authority
CN
China
Prior art keywords
binding agent
binding
clones
library
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201880079095.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111448314B (zh
Inventor
J·麦考夫迪
R·佩雷拉
M·R·戴森
K·帕特赫本
J·L·锡尔加宁
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Iontas Ltd
Original Assignee
Iontas Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Iontas Ltd filed Critical Iontas Ltd
Publication of CN111448314A publication Critical patent/CN111448314A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111448314B publication Critical patent/CN111448314B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1037—Screening libraries presented on the surface of microorganisms, e.g. phage display, E. coli display
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

一种结合剂(例如抗体、受体)在体外培养的高等真核细胞上的表面呈现水平作为所述结合剂的可开发性特征(例如溶解度)的预测指标的用途。高等真核细胞(例如哺乳动物细胞)的展示文库适用于根据可开发性和靶结合亲和力筛选表面展示的结合剂。根据可开发性(包括结合剂溶解度、在高浓度下配制的能力、非特异性结合倾向低和半衰期)进行的内置选择实现了展示文库的高通量筛选。利用可操作地连接到编码结合剂的DNA的诱导型启动子控制结合剂的细胞表面呈现，实现了具有可开发性特征和/或其它质量(例如靶结合和亲和力)的结合剂群体的富集。

Description

根据可开发性选择真核细胞展示系统中的多肽药物
技术领域
本发明涉及候选多肽药物的鉴定，所述候选多肽药物具有所期望的可开发性特征，例如溶解度、在高浓度下配制的能力、非特异性结合倾向低，和最优半衰期。本发明进一步涉及通过药物发现(包括抗体发现)来筛选结合剂。
背景技术
抗体已证实是一类极其成功的药物，迄今为止批准的治疗抗体逾70种，而处于开发流水线中的则更多。然而，在许多方面中，多肽药物(例如抗体)的生产和配制比小分子医药更复杂费劲。许多因素影响开发多肽药物(例如抗体)的可行性，影响着主要候选抗体是否将成功地开发成不仅有效、而且可制造、稳定且安全的药物。此类因素包括化学稳定性(抵抗例如断裂、脱酰胺、氧化和异构化)、物理稳定性(例如构象稳定性、蛋白质展开、聚集和/或沉淀的倾向、胶体稳定性)，以及溶液特性(例如溶解度、在溶液中可逆地自缔合的倾向，和高浓度下的粘度)。多肽在细胞培养时以高产量表达的能力也是一个相关考虑因素，因为宿主细胞所分泌的多肽的数量决定了能从培养基中回收的产物的产量。抗体或多肽药物的免疫原性也是一个考虑因素。所有这些因素可以统称为产物的“可开发性”特征。这些因素因为它们影响产品成本和制造可行性、安全特征、给药时程和施药方式而成为重要的考虑因素。在遇到可开发性问题的情况下，它们会影响抗体的效用或商业成功，并且可能导致主要分子在开发过程中失败。抗体药物可开发性和其测量方法的各方面已进行评审1-3。
希望生产出在高浓度下稳定、可溶的蛋白质以便施用于患者。举例来说，皮下施药寻求50mg/ml以及更大的抗体浓度，其中必须以低体积施以相对较大的剂量。用于治疗用途的理想多肽在缓冲水溶液中具有高溶解度并且因此能够高水平浓缩。成功地生产高浓度的可溶蛋白质至少部分地取决于多肽对自缔合的抗性，否则自缔合会引起粘度增加和/或沉淀。当达到分子的溶解度极限时，所溶浓度不能进一步增加，并且出现非期望的效应，例如分子从溶液中沉淀。当接近溶解度极限时，溶液可能变得粘稠且/或所溶多肽可能在溶液中自缔合(可逆地或以其它方式)，此类效应使溶液的操作和配制复杂化。更糟的是，当产品施用于患者时，难溶性和/或不稳定多肽形成聚集体会使免疫原性的风险加强4,5。抗药物免疫反应(例如抗药物抗体)可能中和治疗作用，并且超敏反应能导致发病或死亡。
多肽高水平表达的能力会影响生产的经济性。在抗体发现的早先步骤期间，通过在哺乳动物细胞培养时优化短暂表达所实现的产量能达到50μg/mL或更大。瞬时表达是一种短暂表达系统，其中将编码所关注产物的质体转染至细胞中并且表达一段时间，通常在2-7天之后因细胞中的质体损耗而下降。为了获得稳定表达型重组细胞用于药物制造，必须将编码DNA稳定地整合于细胞基因组中。建立稳定制造型细胞系之后，可以培养细胞一或两周以获得较高产量，其可能是约1mg/ml或更高。
瞬时表达的产量低可能表示候选药物存在潜在的可开发性问题。举例来说，倾向于聚集的抗血管生成素抗体(“Ang2”)据报道只有10μg/ml的产量，而优化的抗体变异体产量为260μg/ml6。然而，即使当瞬时表达(例如>50μg/ml)和/或稳定细胞系(例如>1mg/ml)获得良好产量时，可能出现生物物理学问题，此时多肽浓度大于1mg/ml。Dobson等人(20167)发现抗NGF抗体MEDI1912与其亲本抗体MEDI576相比，存在显著的生物物理学问题，但这在瞬时培养所产生的表达水平上得不到反映，其据报道为约200μg/ml。细胞培养表达的产量因此只是可开发性的一个方面并且可能预测不了其它重要方面。
在过去的几十年间，展示技术已经允许建立抗体和其它蛋白质和肽的多种多样的大型群体，从而能够自其中分离出具有所期望靶标结合特性的个别变异体。所期望的结合特性包括以适当特异性(例如针对直系同源物和旁系同源物)且以适当亲和力结合到靶标上的适当抗原决定基(例如抑制受体-配体相互作用)。展示技术通过允许一些此类方面在选择期间富集而能够有助于找到具有所期望特性的结合剂。举例来说，通过使用有限量的抗原驱动选择能够选出较高亲和力抗体。针对结合到非所需旁系同源物进行取消选择也已有描述。体外结合剂展示平台和其根据期望特性(包括可开发性的一些方面)进行选择的用途已进行评审8。还已知体内产生抗体的方法，包括实验动物(例如小鼠)的免疫。通过使用动物免疫系统建立一组抗体已发现多种已批准的抗体药物分子，然后在多孔板中或通过流式分选术、根据期望特性(例如结合肿瘤相关抗原；细胞因子中和)加以筛选。
不能保证从“天然”来源分离的抗体基因(不论从动物直接获得或内置于组合型展示系统，例如酵母展示或噬菌体展示)将编码展现良好可开发性特征的抗体。这适用于从初始来源获得的抗体基因以及免疫之后活体内产生的那些抗体基因，假定此类抗体将具有良好可开发性特性的先验理由不存在。免疫系统的目标是建立高亲和力抗体，而非建立委身于工业制造或配制成医药产品的抗体。体内或体外产生的抗体不一定能够浓缩到适于医药配制的水平。人类血清中的IgG平均总浓度是12mg/ml，其中任何个别抗体均以显著较低的浓度表示。个别抗体的比例也存在很大变化，在免疫反应期间，在个别B细胞之间观察到1000倍的表达差异6。因此，不论抗体起源(例如免疫的动物/人类供体、合成或半合成来源)，无法假定其在高浓度下的溶解度。
传统上，药物发现的早期聚焦于鉴定具有所期望的治疗作用方式(例如靶标结合特性)的分子，而对可开发性的评估则推迟到后续阶段，通常在主要分子或一组有限的分子已经选中用于临床前开发之后。由此带来的不幸结果是，可开发性问题可能只在药物开发的相对晚期阶段才显露出来，此时已经耗费了大量的时间和金钱。此类失败代价昂贵。虽然生物医药产业认识到候选药物的失败是药物发现的普遍特点(大部分潜在药物从未到达临床)，但是为了减少浪费和使资源能够向更稀有的成功分流，人们希望药物“尽早失败”。
已经证明，聚焦于改善亲和力的工程化抗体能够产生亲和力增强的变异体，而其突变不利地影响生物物理学特性，例如倾向于自缔合。抗NGF抗体MEDI1912是其实例。来自亲本抗体MEDI578的已亲和力成熟的MEDI1912据报道对NGF具有pM亲和力7。然而，与MEDI578相比，亲和力成熟的MEDI1912抗体展现不良溶解度、胶体不稳定性、低浓度下的聚集和短半衰期。
已努力将根据可开发性的一些方面进行的选择或筛选整合到体外选择平台，例如噬菌体展示。对于仅具有VH或VL域的单域抗体或dAb来说，在针对抗原进行选择之前，热量的挑战能够缩小解链温度(Tm)较低的抗体的比例。Tm的升高已与生物物理学特征的整体改善有关，例如可逆的展开、抗聚集、溶解度、表达和细菌的提纯产量。然而，Tm类似的分子能够展现生物物理学特性的差异-参见Dobson等人20167和实例3。scFv分子也已经工程改造而具有改善的稳定性，以便纳入双特异性平台9-11。另外，已经构建噬菌体展示文库(例如Tiller等人(2013)12，其试图将多样性引入文库，同时避免纳入任何潜在的翻译后修饰位点(例如脱酰胺位点、异构化位点、蛋白酶裂解位点和氧化位点)。
已经创建多种算法用于计算机模拟预测分子行为，此类算法有助于对相对较大数目个潜在候选药物分子的可开发性特征进行比较。这种类型的算法能够通过鉴定可能负责的氨基酸序列的特点而有助于指出可开发性问题背后的可能原因。举例来说，应认识到，序列中的疏水性补丁能够引起分子“粘性”，其展现为非特异性结合和/或自聚集，由于多肽紧密缔合，因此在高浓度下，这更可能发生。蛋白质展开可能使以原生构象内埋于分子内的疏水性残基暴露。
在可开发性问题产生的情况下(不论预测到的或只是在开发过程中遇到的)，可以尝试利用蛋白质工程解决困难。Dudgeon等人13在抗体VH和VL域中鉴定出特定的位置供引入天冬氨酸或谷氨酸残基来改善生物物理学特性。所得抗体据称无聚集、表达充分和能加热再折叠。据报道，所鉴定的突变通过独立于抗体序列的其余部分改变特定位置的局部电荷分布来增强抗聚集性，并且因此充当通用模板用于工程改造人类抗体可变域而具有优良的生物物理学特性。在其它情况下，已经检查出特定的抗体序列存在可能约束可开发性的个别特点。举例来说，从B细胞融合瘤活动中鉴定出的抗血管生成素抗体“Ang2”在瞬时培养时发现具有低水平的表达并且倾向于聚集6。其序列分析鉴定出在轻链可变域构架的位置49处存在不成对的半胱氨酸。制备20种个别变异体，评估聚集情况且鉴定溶解度改善的版本，其中半胱氨酸49变为苏氨酸(C49T)。在这种情况下，亲本克隆的基线表达极低，并且还观察到C49T变异体的产量改善而结合未受损。
另一实例是上述亲和力改善的MEDI912抗体的“修复”，其停滞于开发中7。通过将氢:氘交换与结构建模组合，鉴定出VH域中存在3个非互补位疏水性残基并且将这些残基恢复为亲本抗体中所发现的残基。使位置30处的色氨酸、位置31处的苯丙氨酸和位置56处的亮氨酸分别转化成丝氨酸、苏氨酸和苏氨酸(用W30S、F31T和L56T表示，其中编号表示抗体链内的氨基酸位置，第一个字母表示原始胺基酸且最后一个字母表示替换的氨基酸)。可开发性改善的版本(称为MEDI1912-STT)显示聚集减少并且在许多其它方面有改善，包括非特异性结合减少和半衰期延长。
Bethea等人(2012)14描述了抗IL-13抗体具有不良的生物物理学特性，包括在13mg/ml下自聚集，引起沉淀。重链CDR3中的芳族三联体(由苯丙氨酸、组氨酸和色氨酸组成)经鉴定是潜在的问题。作者描述了引入若干突变，包括改善溶解度和减少非特异性相互作用的单氨基酸变化(在位置100a处用丙胺酸取代色氨酸残基)。在这种情况下，所述变化也减少靶标结合。
MEDI912-STT和抗IL-13抗体的实例(其中序列优化能够同时减少非特异性结合和其它非期望的行为，例如自聚集)指出可以将多种可开发性参数互连且多种可开发性参数可以具有共同的潜在原因。然而，虽发现非特异性相互作用但自相互作用证据极少的其它情况已有报道2,15。
非特异性相互作用由于其能不利地影响药物分子的性能、特异性、体内分布或半衰期而成为药物开发时的重要考虑因素。已经证明，在具有相同Fc区的抗体之间，抗体的体内半衰期能显著不同16，表明抗体可变域影响半衰期。在许多情况下，这已归因于非特异性相互作用。如果施用的药物被吸入与非靶标组分发生的非特异性结合相互作用“漏槽”，则可供结合到其靶分子的利用度更小并且到达或渗透病变靶组织或部位的能力可能减小。甚至低亲和力非特异性相互作用可能是显著的，尤其在靶标丰裕度较高时。举例来说，循环中的抗体暴露于大面积的内皮细胞糖萼(估算面积为350m2)，据报道到达0.5mm或更大的深度。带负电的糖萼是由不同的葡糖胺聚醣构成，例如玻糖醛酸和蛋白多糖，例如肝素硫酸盐，其共同构成主要组分。其也呈现所吸收的血浆蛋白质17,18。此基质和所呈现的其它表面对循环中的抗体的低亲和力缔合可能对药物动力学具有显著影响。
存在根据非特异性相互作用进行筛选的方法，并且在所关注的个别结合剂已经鉴定之后，通常基于逐个克隆来执行这些方法。Hotzel等人(2012)描述了一种帮助鉴定展现非特异性相互作用的抗体的策略，所述策略是在ELISA中根据对杆状病毒颗粒的结合进行筛选16。此外，Xu等人描述了一种多特异性试剂结合分析(PSR MFI)，其利用标记的蛋白质混合物与酵母展示平台鉴定展现低特异性的抗体19。也已开发出许多色谱方法来帮助鉴定倾向于非特异性相互作用的抗体。这些方法典型地涉及使所关注的相互作用搭配物、化合物或表面固定于基质(例如琼脂糖)上以及然后使测试抗体分子越过基质以及通过固定或改变洗涤条件，比较测试抗体和对照抗体的滞留程度。已经使用例如交叉相互作用色谱(CIC)15、疏水性色谱和肝素等方法。
关于可开发性的另一个考虑因素是治疗蛋白的体内半衰期。为了使全身性施用的许多药物达成最优功效，必需使其血清浓度在特定水平(或在目标范围内)维持一定的时间段。上文所论述的非特异性结合相互作用对体内多肽半衰期和/或有效浓度能产生一定程度的影响。另外，对于抗体和含有Fc区域的其它分子来说，Fc区对FcRn(内皮细胞中表达的受体)的结合能够强烈地影响半衰期。人类IgG与其它循环分子相比具有相对较长的半衰期，且这归因于其与FcRn的pH依赖性相互作用。胞饮和核内体运输之后，抗体Fc与FcRn受体之间发生了相对较高的亲和力相互作用，从而保护抗体以免被溶酶体降解。在中性pH下，Fc与FcRn之间的亲和力较低且在再循环到细胞表面之后，遇到中性pH。在这些条件下，抗体被释放回到循环中。因此，对FcRn受体的pH依赖性结合是IgG分子的重要特性。FcRn与大鼠IgG2a的复合物的晶体结构20显示FcRn结合到CH2和CH3域(在CH 2残基252-254和309-311，和CH 3残基434-436)且有助于解释重要的pH依赖性结合。半衰期改善的Fc变异体已经通过Fc工程改造产生。
铃木(Suzuki)等人(2010)已证明中性pH下的低亲和力与体内长半衰期之间存在着正相关21，但显然，其它因素也可以促成。抗IL-12抗体布瑞金单抗(briakinumab)和优特金单抗(ustekinumab)尽管具有类似的Fc域，但分别具有8天和22天的半衰期。利用这些抗体和一系列杂交变异体，Schoch等人(2015)22证明中性pH下保持的结合与体内半衰期之间良好相关。他们指出布瑞金单抗VL上的带正电大补丁引起与FcRn的静电相互作用增强，从而限制了在胞外pH下发生的FcRn-IgG解离。Kelly等人(2016)描述了类似的pH依赖性相互作用，但他们主张与其它蛋白质的非特异性相互作用也可能导致短半衰期23。
通常，药物发现中利用展示文库的主要目的是使文库富集表达结合剂的克隆，所述结合剂对于结合到所关注的靶分子具有高亲和力。噬菌体展示文库能够用于相对于非结合剂富集结合剂以及相对于较低亲和力克隆富集较高亲和力克隆。基于亲和力的相对富集已允许利用噬菌体展示进行抗体的亲和力成熟。典型地，生物素化抗原连同相关展示封装(例如使用抗生蛋白链菌素涂布的磁珠)一起使用可容许回收抗体:抗原复合物。抗原浓度较低时，群体内的较高亲和力抗体比较低亲和力抗体形成复合物的可能性更大，导致这些抗体相对富集。
然而，为了结合剂在真核细胞上展示，使用限制抗原联合珠粒固相回收的方案的有效性比富集高亲和力结合剂的噬菌体展示更小。不同于单价噬菌体展示，真核细胞是多价展示封装，其表面上存在相同结合剂的许多拷贝。细胞群内所呈现的结合剂在选择期间的浓度潜在地相对高于设法求解的抗原浓度和/或亲和力。这可能会遮蔽亲和效应并且难以对混合群体中的不同克隆上所展示的结合剂的亲和力的差异进行求解，因此与例如噬菌体展示等方案相比，使得所达成的富集系数减小。
Boder和Wittrup24描述了一种声称可提高严格度且容许在真核细胞展示文库中根据亲和力进行选择的方法，所述方法使用有限浓度的荧光标记单价抗原联合流式细胞术来根据亲和力进行选择，测量每个细胞所结合的抗体的数量以控制表达的差异。在这个系统中，结合的严格度据报道是通过减小靶标的浓度(相对于结合剂)来提高，其中据称是基于从靶标检测到的信号水平来检测较高亲和力结合剂，原因是结合到较高亲和力结合剂的靶分子比结合到较低亲和力结合剂的靶分子多。
许多出版物已经描述了其中靶标结合和抗体表达同时予以检查的选择。以此方式能够基于所达成的展示水平将抗原结合程度归一化。US8,771,960(DKFZ)描述了使用荧光活化细胞分选(FACS)方法选择较高亲和力单克隆抗体，其中抗体文库或一组不同抗原特异性融合瘤细胞用PE标记的抗原进行染色且用FITC标记的蛋白质G进行对比染色。在FACS中选出PE染色:FITC染色比值最大的细胞，随后扩增各产生抗体的个别细胞，所述抗体对用于选择的靶抗原具有相对较高的亲和力。抗体结合的抗原与抗体未结合的抗原的比率因此用作抗体对其抗原的亲和力的直接度量。
Chao等人(2006)25描述了编码scFv谱系的的基因，所述scFv以基因方式与酵母凝集素Aga2p亚单元融合。在Aga2p酵母展示系统中，所关注的结合剂(在此为scFv)与Aga2p亚单元融合，所述亚单元经由二硫键连接至存在于酵母细胞壁中的Aga1p亚单元。表达靶标特异性结合分子的酵母细胞能够通过流式细胞术、使用直接或间接标记的靶分子鉴定。举例来说，可以将生物素化靶标添加至细胞中且可以利用抗生蛋白链菌素-藻红蛋白检测对细胞壁内所呈现的scFv的结合。靶分子的有限浓度使得富集表达较高亲和力结合剂的克隆成为可能，原因是那些克隆捕捉的靶分子更多并且因此展现更亮的荧光。为了控制不同细胞中的scFv表达变化，Chao等人(2006)25使用荧光标记的抗标签抗体测量每个细胞表面上的抗体表现量，从而允许针对表达水平的变化进行归一化。这种方案因此允许展示高亲和力结合分子的酵母细胞是由高水平表达较低亲和力抗体的那些细胞分化而成。在这种情况下，测量抗体展示的目的因此是针对表达差异进行归一化且借此促进亲和力选择。
其中使用展示水平作为分泌形式的相同蛋白质的潜在表达产量的指标的方法也已有描述。为了试图在建立稳定细胞系以便生产抗体期间鉴定出高度表达的细胞克隆，WO2015128509(Glenmark Pharmaceuticals)描述了一种方案，其中抗体以分泌形式表达，但对呈现于细胞表面上的比例进行“取样”。此取样是作为剪接事件绕过第一终止密码子的结果出现，并且在抗体的一部分中，mRNA使抗体基因剪接到编码跨膜域的外显子上。在此系统中，抗体的展示水平据报道与所表达的可溶性抗体的数量直接相关。
使用酵母进行的许多研究已经报道结合剂在酵母细胞上的表面呈现水平、结合剂的热稳定性和/或通过细胞培养产生的结合剂的产量之间有关。Shusta等人26将可溶性单链T细胞受体(scTCR)变异体与Aga2p融合且报道不同突变体的热稳定性与其可溶性分泌水平和以与Aga2p的融合体形式在酵母细胞壁上展示的scTCR的数量强烈相关。他们提出内质网(ER)的质量控制设备使热力学不稳定突变体发生的细胞内蛋白质水解决定了蛋白质表达效率。Kowalski等人27,28检查了可溶性多肽III型纤维结合蛋白(FnIII)域的变异体在酵母中的可溶性表达并且还报道了多肽的热力学稳定性与其分泌效率(因此与产量)之间相关。Hackel等人29使用酵母展示系统进一步研究了FnIII域的热力学稳定性的作用。Hackel等人培养了表达一系列与Aga2p融合的FnIII变异体的酵母，所述变异体经突变以减少其热稳定性，并且发现热稳定性与表面拷贝数之间正相关。因此，较多的热不稳定性突变体展现降低的表面展示水平。
WO2012/158739描述了一种用于从基于域的文库中选择多肽的两阶段方法，所述方法涉及从体外核糖体展示文库中进行基于抗原的选择，随后将所选结合剂转变为酵母展示文库用于进一步的基于抗原的选择。体外核糖体展示系统产生的多肽大部分聚集，而酵母展示选择的纳入使高度聚集的多肽在所选群体中的数目减少，但产生单体的克隆的分率仍较低。新出现的克隆的表达行为的适度改善归因于酵母系统不大容许误折叠(例如热不稳定)蛋白质的表达，使得可供酵母文库选择利用的此类蛋白质更少。此外，这项工作涉及Aga1p:Aga2p-FnIII展示系统。
另一方面，Julian等人30发现根据抗原结合和VH域在酵母上的的表面展示进行的协同选择产生亲和力较高、但稳定性较低的抗体。最高亲和力VH域是高度不稳定的。此研究发现在热稳定性的整个范围内，酵母上的展示水平只发生适度的变化(1.6倍)，并且作者报道了展示水平不能引导选出使亲和力和稳定性共同改善的突变集合。
抗体亲和力、特异性、稳定性和溶解度之间关系的最新评论描述了一种特性(例如亲和力)的改善如何能导致其它特性(例如稳定性)的不足以及如何能平衡这些得失以协同优化抗体的多种特性31。
因此，在多个前沿做出的广泛工作已寻求鉴定和理解影响可开发性的多肽的不同特征之间的潜在关系。尽管如此，但缺乏将可开发性筛选方便地整合到候选药物选择早期的多肽药物发现方法，尤其是例如药物溶解度和避免非特异性结合等方面。
发明内容
本发明提供在从展示文库发现阶段期间有助于检测多肽的可开发性问题的方法和产品，从而能够避免分子出现可开发性的可靠性问题并且能够从候选药物分子池中富集具有更佳可开发性特征的那些分子。
本发明人已惊人地发现，多肽呈现于真核宿主细胞表面上的水平与多肽的特定可开发性特征有关，包括其在溶液中的特性，例如其在溶液中的溶解度和其对自缔合的抗性。可以使用从重组基因表达多肽且将多肽展示于其表面上的宿主细胞、通过测定多肽在细胞表面上的呈现水平来根据此类可开发性特征评估或筛选多肽。这适用于高通量并行筛选多种宿主细胞克隆，从而允许对相对的表面呈现进行比较和选出展示具有更佳可开发性特征的多肽的克隆。因此，多肽的表面呈现水平代表着多肽结合剂筛选方法(例如抗体发现)的可开发性预测指标。另外，表面呈现水平与生物物理学特性(例如自缔合)之间的这种关联允许从结合剂文库中选出或在此类文库内富集具有此类最优生物物理学特性的结合剂。反之，可以根据结合剂文库选出或从结合剂文库中排除生物物理学特性较差(例如溶解度较低)的结合剂。
本发明人还已经设计出根据与多肽药物体内特性(例如在血清中或在靶标器官和组织中的非特异性结合、半衰期和有效浓度)有关的可开发性方面在体外筛选高等真核细胞所表达的多肽的方法。
根据本发明的方法和用途在早期阶段筛选期间具有特定的优势，包括筛选结合剂(例如抗体)的大型多样化文库。通过在药物发现的最早阶段整合候选多肽药物的可开发性筛选，本发明使代价高的晚期失败风险降低。根据本发明的可开发性筛选还可以用于对候选多肽药物的较晚期池(任选地，享有共同谱系的抗体“家族”)进行选择，以从所述池中富集具有更佳可开发性的多肽且/或告知关于选择主要分子用于药物开发的决定。另外，本发明的技术可以用于鉴定现有候选多肽药物(例如尚未满足一个或多个可开发性标准或期望改善一个或多个可开发性特征的候选药物)的改善变异体。因此，本文描述了产生和快速筛选衍生物序列的方法，所述衍生物序列展现改善的可开发性特征。
哺乳动物细胞中的多肽表达路径始于内质网上的翻译机器(核糖体等)，随后新生多肽经由高尔基体复合体行进且输送到质膜，在质膜中，他们可以被细胞分泌或滞留于细胞表面上(例如作为膜蛋白)。当重组产生的多肽被分泌时，其立即在大体积的培养基中稀释且在若干天/周积聚之后，以典型地在1-100μg/ml之间的浓度存在。相较于多肽药物在被配制成施用于患者的药剂中的期望浓度，这是较低的。与分泌的多肽相比，滞留于细胞表面上的所表达多肽能够在细胞表面上形成高局部浓度。所表达多肽在细胞表面上的滞留大量减少可供多肽使用的体积且因此提供实现高浓度的机会。当从强启动子(例如细胞巨大病毒(CMV)启动子)表达所展示的多肽时，浓度可能特别高。因此，多肽结合剂在重组细胞文库中的哺乳动物细胞和其它真核细胞表面上的滞留使得结合剂在质膜表面上以局部高密度浓缩，尤其当使用强烈表达重组基因的宿主细胞时，其中所编码的多肽代表总体多肽合成中的大部分。应用于表达多肽谱系的一组克隆时，不同多肽的表面呈现水平在克隆间的变化可以反映多肽特征，例如其对自缔合的抗性。自缔合倾向较低的多肽在细胞表面上能浓缩到较高水平，其当紧密接近时能够抵抗聚集有助于此。培养的真核细胞展示文库因此可以给展现良好可开发性特征的结合剂充当体外选择环境。这由本文提出的实例中的证据证明。
根据本发明的第一方面，多肽结合剂(例如抗体)在所培养真核细胞克隆表面上的表面呈现水平用作结合剂的可开发性特征的预测指标，例如其在溶液中的溶解度、对自缔合的抗性和/或在溶液中浓缩的能力。不希望受理论束缚，与结合剂溶解度有关的一种要素可以是其亲水性，其中较大亲水性(较低疏水性)与较高溶解度有关；在水溶液中对自缔合的较大抗性；和在溶液中达到较高浓度的能力。因此，本发明的方法可以用于基于在如本文所述的真核细胞展示系统中的表面呈现程度将较大亲水性结合剂(候选多肽药物)与较小亲水性结合剂区分开来。
本发明提供一种方法，其包括
提供各含有编码结合剂的DNA的高等真核(例如哺乳动物)细胞克隆的文库，
在用于表达所述结合剂的条件下体外培养所述克隆，其中所述结合剂呈现于细胞表面上，
测定所述结合剂在多种克隆上的表面呈现水平，
选出相较于其它克隆展现结合剂存在更高的表面呈现的一种或多种克隆，以及
鉴定出具有良好可开发性特征的由一种或多种所选克隆编码的结合剂。
本发明可以用于根据结合剂可开发性特征区分结合剂或将结合剂排序和/或选出具有良好可开发性特征的一种或多种结合剂。此类方法评估的可开发性特征可以是结合剂的溶液特性，例如溶解度、对自缔合的抗性，和/或在水溶液中浓缩的能力，如本文在别处详细论述。选出展现较高表面呈现的克隆得到所选细胞群，所选细胞群富集展现结合剂存在较高表面呈现的克隆，其然后能够任选地用于一种或多种其它方法中，例如额外多轮筛选。
测定表面呈现水平的方法在本文中别处详细地描述且任选地包括用并有可检测(例如荧光)标记的试剂标记结合剂。抗体和其它结合剂包括Fc区时，用结合Fc区的试剂标记是很方便的，例如检测剂可以是经标记的抗IgG抗体。方法可以包括测定表面呈现水平和观察所述文库中的细胞上的结合剂呈现水平范围。拷贝数范围的实例见于本文中别处。
本发明的另一个方面涉及在从展示文库中发现结合剂期间评估非特异性结合。在初始结合剂发现期间，鉴定与非靶分子的相互作用是有利的。本发明的方法可以用于筛选高等真核细胞上所展示的具有最优生物物理学特性且与非靶分子的体内非特异性相互作用倾向低的结合剂(例如抗体)群体。虽然常规做法是选择令人期望地结合到靶分子(例如多肽药物的分子靶标，多肽药物在体内结合其且对其发挥生物效应)的候选多肽药物，但是如果还注意对非期望结合到非靶分子(例如结合剂非特异性结合的组分或一类分子，例如结合到带负电的聚合物，如核酸)的候选多肽药物进行负向选择，则可以减少可开发性的问题。在选择结合剂的方法中，可以用非靶分子取代靶分子，其例外之处在于然后丢弃而非保留识别非靶分子的结合剂，借此富集不识别非靶分子的结合剂。
本发明提供了选择非特异性结合倾向较低的结合剂的方法，以从候选药物池中富集展现较小非特异性结合的那些药物，以及用于比较不同候选药物产品的预测药物动力学性能。此类方法可以在药物发现期间使用，任选地在筛选早期使用，或告知关于主要分子选择用于药物开发的决定。
本发明提供了一种体外筛选方法，其包括；
(i)提供各含有编码结合剂的DNA的真核细胞克隆文库，
(ii)在用于表达所述结合剂的条件下体外培养所述克隆，其中所述结合剂呈现于细胞表面上，
(iii)使所述结合剂暴露于非靶分子的基质，允许结合，
(iv)丢弃对所述基质展现较大结合水平的细胞，
(v)选择对所述基质展现较低结合水平的细胞，以提供所选细胞群，所选细胞群富集表达对结合非靶分子倾向低的结合剂的克隆。结合剂和由此展示其的细胞从而根据其对基质的相对结合加以分离。丢弃结合到基质的细胞，同时收集非结合细胞。
细胞表面上所展示的抗体价数高将有助于低亲和力交叉反应性的检测。当展示结合剂的细胞群越过基质时，可以根据延迟的通过来体现对基质的结合。与随后出现的展示展现非特异性相互作用的结合剂的克隆相比，展示相互作用潜力低的结合剂的细胞更容易前行通过基质且能够加以收集。使克隆文库越过基质从而实现克隆随时间的分离，原因是展示对结合基质的一种或多种组分的倾向较大的结合剂的那些克隆将花费更长的时间越过基质或甚至可能根本不从基质中出现。所述方法可以包括收集较快越过基质的细胞以及丢弃较慢通过和/或保持结合到基质的细胞。基质通常将包括其上固定一种或多种非靶标组分的固体或半固体底物(例如珠粒，任选地堆积于柱内)。能够测试多种非靶分子，例如肝素硫酸盐蛋白多糖和血流中遇到的其它丰裕组分。基质可以包括糖萼的一种或多种组分，例如玻糖醛酸、肝素硫酸盐。或者，可以对非靶分子使用流式分选或磁珠分选，其中收集参数是基于对所关注的相互作用搭配物、化合物或表面的结合程度。所述方法因此可以用于富集表达结合剂的细胞，在所述结合剂所施用的哺乳动物受试者体内，所述结合剂展现较低的与非靶分子结合的倾向。
可以在包括以下的方法中筛选出结合到一种或多种非靶分子的结合剂
(i)提供各含有编码结合剂的DNA的真核细胞克隆文库，
(ii)在用于表达所述结合剂的条件下体外培养所述克隆，其中所述结合剂呈现于细胞表面上，
(iii)使所述结合剂暴露于一种或多种非靶分子，允许结合，
(iv)丢弃对一种或多种非靶分子展现较大结合水平的细胞，以及
(v)选择展现较低结合水平的细胞，以提供所选细胞群，所选细胞群富集表达对结合非靶分子倾向低的结合剂的克隆。
此类方法可以应用于展示结合剂的高等真核细胞文库中的细胞(或细胞样品)，以富集表达结合剂的细胞，所述结合剂对结合一种或多种非靶分子展现低倾向。
为了有助于鉴定和/或分离出表达识别非靶分子的结合剂的细胞，可以可检测方式对非靶分子进行标记，例如用荧光标记进行标记。荧光的使用允许在FACS中通过流式分选来分离细胞，其中未染色(未标记)的细胞能与染色(荧光标记)的细胞区分开来且能相应地引入收集或丢弃部分中。这可以方便地与标记组合以检测FcRn结合和/或检测结合剂的存在和表面展示水平(例如使用抗Fc抗体结合含有Fc区的结合剂)和/或检测靶标结合(例如使用经标记的抗原)。可以使用多种不同标记(例如不同波长的荧光团)同时进行标记和根据组合特性的分选。
本发明的其它方面涉及筛选与FcRn受体发生pH依赖性相互作用的多肽。抗体(或其它含Fc药物)可以与延长或缩短其半衰期的FcRn发生相互作用。如已经指出，包含Fc域的结合剂可以与内皮细胞上的FcRn受体相互作用并且免于降解。FcRn再循环路径的运转具有pH依赖性，需要在低pH的核内体代谢区内发生较强的结合以保持多肽安全地对接于受体上，且需要在较高pH的胞外环境中发生较低亲和力结合以便使多肽释放回至血流中。在一些情况下，出于控制半衰期之外的原因，希望增加对FcRn的结合。举例来说，使用“扫描抗体”方法32是希望所施用的抗体与FcRn在中性pH下充分接合以确保优先相互作用(与血清中的其它天然抗体相比)。抗体继而能将所结合的靶分子递送到核内体代谢区，在代谢区中，降低的pH使所结合的靶标释放且随后降解，例如在溶酶体内降解。
人们可以希望将根据可开发性的多个方面(例如根据本文所述的本发明的任一此类方面)的选择加以组合或与根据对靶标的结合的选择组合。为此目的，可以通过将结合剂暴露于靶标、允许同源结合剂识别靶标来执行选择，其中展示同源结合剂的克隆结合到靶标。然后选择展示同源结合剂的一种或多种克隆。靶标可以携带可检测(例如荧光)标记以有助于选择展示同源结合剂的克隆。所述方法可以方便地包括同时测定结合剂的表面呈现水平和结合剂的靶标结合水平，以及协同选择展示展现较高表面呈现的同源结合剂的克隆。荧光活化细胞分选仪(FACS)的使用能够根据细胞发出的荧光分选细胞，并且表面呈现和靶标结合的并行选择可以通过使用检测表面呈现(相对于所结合的靶标)的不同荧光标记来进行。从而可以选择展现表面呈现高于所选阈值并且还展现靶标结合的克隆。
本发明的另一个方面涉及结合剂选择的改善，所述结合剂对所关注的靶标产生高亲和力结合。本发明人注意到虽然结合剂高水平呈现于细胞表面上能够在展示文库中具有优势，但其可能会非期望地限制基于亲和力的针对靶标结合的选择的灵敏度或严格度。本发明人意识到限制结合剂在展示文库中的呈现水平可能有助于选择较高亲和力结合剂。
根据这个方面，本发明提供一种方法，其包括
(a)提供各含有编码结合剂的DNA的高等真核(例如哺乳动物)细胞克隆的体外文库，其中所编码的结合剂从弱活性启动子表达且/或在细胞表面上以每个细胞100-60,000范围内的拷贝数表达，
(b)使所述文库暴露于靶标且允许同源结合剂识别所述靶标，其中展示同源结合剂的细胞结合到所述靶标，以及
(c)分离出结合到所述靶标的细胞以提供展示同源结合剂的所选细胞群。
从而获得克隆池，所述克隆池富集编码对靶标具有较高亲和力的结合剂的克隆。所述方法可以进一步包括
(d)使所选细胞群暴露于针对所述靶标的额外一轮或多轮选择，任选地其中逐渐地减小靶标浓度以提高选择严格度，和/或
(e)选出展示同源结合剂的一种或多种克隆，所述同源结合剂对所述靶标具有期望的结合水平。
所用靶标的浓度可以预先测定或可以基于使用靶标浓度范围和选择抗原浓度，凭经验判断，其中细胞结合程度高于对照细胞(例如不表达结合剂或表达不识别靶标的结合剂的细胞)上所发现的结合程度。
流式分选可以用于在靶标浓度和/或结合剂展示水平的不同条件下鉴定文库内具有所期望结合水平的克隆群体。所选克隆可以基于结合到细胞的荧光程度鉴定。当所结合靶分子的数目减少时(根据较低的靶标浓度和/或降低的结合剂展示水平)，将经标记的细胞与未标记的细胞区分开来的能力减小，特别是未标记的细胞展现显著的自体荧光基线时。在这种情况下，使用可回收的靶分子(例如生物素化靶标)和磁珠(例如抗生蛋白链菌素涂布的珠粒)分离经标记的细胞可以允许将标记程度显著减少的细胞与未标记的细胞分离，从而允许提高用于选择的严格度。
所述方法可以用于鉴定以所期望的亲和力识别靶分子的结合剂，以根据亲和力选择结合剂和/或从克隆池中富集表达针对靶标的较高亲和力结合剂的那些克隆。靶标可以是所关注的任何分子，例如人类受体、配体、酶或其它多肽。
本发明提供如上文在(a)下定义的文库，以及其用于选择对靶标具有期望亲和力的结合剂的用途。本文进一步描述此类文库和产生其的方法。
如上文所概述，可以利用细胞文库、根据结合剂在细胞表面上表达的水平、基于不同特征(可开发性和亲和力)区分结合剂。在药物发现期间，人们可能自然地希望根据良好亲和力和良好可开发性进行选择，在此情况下可以将本发明的多个方面进行组合。举例来说，人们可以使用以相对较低水平展示结合剂的细胞选择针对所关注靶标的结合剂且借此获得富集展示高亲和力结合剂的克隆的细胞群。然后可以在以较高水平表达结合剂的克隆中提供它们的编码DNA，以选择具有所期望的可开发性性状的结合剂。这些选择可以按照任一次序执行(根据亲和力进行选择，随后根据可开发性或类似的其它方式进行选择)且可以包括多轮选择(例如初始进行亲和力选择，然后进行可开发性选择，然后再进行多轮亲和力选择)。
通过将结合剂的表面表达置于外部控制的开关或可调节元件下能够构建适用于根据亲和力和可开发性进行选择的双用途展示文库。举例来说，编码结合剂的DNA可以可操作地连接到启动子，所述启动子的表达能够通过向细胞培养基中添加诱导剂或抑制剂来调节。然后从细胞的外部控制表达，从而让方法的操作人员能够按照意愿上调或下调表达水平。因此，在诱导型启动子的情况下，外部操作人员添加诱导剂使得启动子活化，因此这可以视为外部诱导型，但是诱导最终施加于细胞内。多种诱导型启动子系统已有描述，经典的实例是四环素诱导型启动子33。结合剂DNA表达处于外部控制(例如处于诱导型启动子控制)下的双用途文库具有快速直接改变结合剂基因表达水平而无需将编码DNA再克隆到新细胞群的优点。
涉及此类文库的结合剂展示方法形成本发明的一部分。一种鉴定识别靶标的结合剂的方法可以包括：
(i)提供各含有编码结合剂的DNA的真核(例如哺乳动物)细胞克隆的文库，其中结合剂在细胞表面上的表达在外部能调节(例如其中结合剂的表面表达处于外部能调节的启动子的控制下)，且其中结合剂呈现于细胞表面上，
(ii)在低呈现于细胞表面上的条件下(例如其中启动子活性弱)培养所述文库中的细胞，
(iii)使所述文库暴露于所述靶标，允许同源结合剂识别所述靶标，其中展示同源结合剂的细胞结合到所述靶标，
(iv)选择展示同源结合剂的细胞，借此提供所选细胞群，
(v)在使细胞表面上的呈现增强的条件下(例如其中启动子活性更强，任选地活性最大)，培养所选细胞群，
(vi)测定所述结合剂在所述多种克隆上的表面呈现水平，任选地通过用并有可检测(例如荧光)标记的试剂标记所述结合剂来测定，以及
(vii)选出相较于其它克隆展现结合剂存在更高的表面呈现的一种或多种克隆。
从而鉴定出具有良好可开发性特征的结合剂(和表达其的克隆)，通过选择/富集展现较高表面呈现的结合剂(和因此克隆)加以选择和/或富集。所述方法因此能够提供克隆池，所述克隆池富集表达具有良好可开发性特征的结合剂的克隆。
此类方法将在本文别处详细描述的本发明的多个方面有效地组合，即，靶标结合剂的选择与基于表面呈现结合剂的细胞的选择。如在本文别处所述的这些方面的特点可以用于组合方法中，包括选用于严格选择的靶标浓度、结合剂的表面呈现水平，和选择细胞的方法。
能调节的启动子可以是诱导型启动子。根据所用诱导型启动子系统的类型，可以在培养基缺乏诱导剂(例如四环素，例如四环素或多西环素(doxycycline))的情况下获得低水平表达或基础表达。或者，可以添加低浓度的诱导剂。启动子的表达可以通过添加诱导剂或通过增加诱导剂在培养基中的浓度来滴定，以优选获得最大启动子活性。诱导型启动子的替代形式是可抑制型启动子，其中启动子的默认状态是活性，其活性是通过添加抑制剂到培养基中来衰减或阻断。
通常方便的是，文库在其基础表达状态下开始，且在上调启动子活性以增强结合剂的细胞表面呈现且根据可开发性选择之前，对靶标执行初始多轮选择。然而，在一些情况下，可能期望根据可开发性选择，首先活化启动子，然后抑制启动子活性或使其活性衰减(例如通过从培养基中去除诱导剂)，随后根据亲和力进行选择。如果使用可抑制型启动子，则此可为较方便的。因此，参照上文阐述的编号的方法步骤，可以执行步骤(ii)-(iv)，随后执行步骤(v)-(vii)，或可以执行步骤(v)-(vii)，随后执行步骤(ii)-(iv)。
本发明进一步提供了用于上述方法中的文库，其实例是含有编码结合剂谱系的真核(例如哺乳动物)细胞克隆的体外展示文库，其中结合剂的表达(和因此其在细胞表面上的呈现)处于四环素诱导型启动子的控制下。优选地，将编码DNA整合于细胞DNA中的固定基因座。此类文库可以通过包括以下的方法产生：
提供编码所述结合剂的供体DNA分子，和真核(例如哺乳动物)细胞，
将所述供体DNA引入所述细胞中，借此建立含有整合于所述细胞DNA中的供体DNA的重组细胞，
其中所述供体DNA的表达置于四环素诱导型启动子的控制下以便呈现于细胞表面上，以及
培养所述重组细胞以产生克隆，
借此提供含有编码所述结合剂谱系的供体DNA的细胞克隆的文库。
任选地，供体DNA的整合是通过将位点特异性核酸酶提供于细胞内来实现，其中所述核酸酶使细胞DNA中的识别序列裂解以建立整合位点，所述供体DNA在所述整合位点整合于细胞DNA中，整合是通过细胞内源的DNA修复机制发生。
四环素诱导型启动子优选地位于编码结合剂的供体DNA分子上，但其在必要时可以分开整合。一般来说，重组细胞的供体DNA和/或细胞DNA将含有编码结合剂的DNA，所述DNA位于用于表达的启动子的下游。文库构建之后，供体DNA的表达能够从启动子诱导并且在使结合剂呈现于细胞表面的条件下培养细胞。
结合剂DNA的表达置于诱导型启动子控制下的细胞还给评估结合剂在表达型克隆上的细胞表面呈现达到特定水平的速率以及通过比较短期诱导之后的呈现水平来比较多种克隆的速率提供了机会。这可以预先测定(例如4小时或8小时或12小时)或可以凭经验通过观察诱导之后的结合剂呈现外观得到。能够将细胞表面呈现相对于时间作图，起始时间点为从诱导型启动子开始表达，以观察表达和表面呈现的增加速率。多肽表达典型地随时间增加，直至其在细胞表面上达到稳定或平衡的水平。通过在早期测定和在克隆之间比较细胞表面呈现，在最终表达水平已达到之前，可能已经发现可开发性方面的初始迹象。这些可开发性方面可以包括多肽在溶液中浓缩的能力、其在溶液中的溶解度、对自缔合的抗性，和/或本文所论述的其它可开发性特征，此外为可从表达回收的产量。
高等真核细胞上所展示的结合剂的转换、降解或内化的速率也可以用作此类可开发性特征的指标。这可以任选地在所展示的结合剂未经新表达的结合剂连续补充(因此表现为结合剂从细胞表面上耗竭，即，表面呈现水平降低)的条件下评估。可以标记结合剂，洗掉未结合的标记并且观察经标记的结合剂因降解和/或内化而随时间从细胞表面耗竭的速率。可以观察到结合剂在一些克隆上的耗竭水平高于其它克隆。选择表面呈现水平较高的克隆将选出可开发性特征更佳的那些克隆(例如在溶液中的溶解度较高、对自缔合的抗性更佳、非特异性结合较低)。
在细胞文库内，可以观察到一些克隆的表面呈现增加速率大于其它克隆。这可以用作多肽的可开发性潜力的早期指标，其允许从文库中选择具有最优特性的克隆。
根据本发明的方法，一般来说，一旦人们已经选中具有期望特性的克隆或选中富集具有期望特征的克隆的细胞群，则可以将所选克隆或群体用于一种或多种进一步筛选方法中，所述进一步筛选方法的实例提供于本文中。所选克隆可以一起或个别地培养。方法可以加以组合，以便针对多个特征筛选克隆，包括靶标结合和本文所述的多个可开发性特征。
本发明的方法可以用于在抗体发现的最早阶段评估抗体在高浓度下的行为。在优选实施例中，通过使用文库选择技术(例如流式分选、基于珠粒的选择或色谱)筛选克隆文库来检测抗体或其它多肽结合剂在高浓度下发生自身相互作用的倾向。
在本发明的任何方面中选择一种或多种含有编码所期望结合剂的DNA的克隆之后，可以回收编码所述结合剂的核酸且/或可以测定编码所述结合剂的核酸序列。编码结合剂的核酸(例如DNA)可以分离的形式提供，例如以重组载体提供。
编码所关注结合剂的DNA可以在体外的宿主细胞中表达，任选地在用于表达可溶形式的结合剂的条件下表达。因此，宿主细胞可以分泌结合剂，从而促进其从细胞培养基中的回收。结合剂(例如来自稳定转染的宿主细胞)的产量可以是例如至少0.5mg/ml、至少1mg/ml、至少2mg/ml或至少5mg/ml。可以提纯且/或浓缩结合剂以提供所述结合剂的水溶液。有利的是，结合剂可以浓度为至少1mg/ml、任选地至少10mg/ml、至少50mg/ml或至少100mg/ml的溶液提供。在一些实施例中，结合剂是以浓度在50mg/ml与200mg/ml之间(例如在50mg/ml与100mg/ml之间)的溶液提供。
使用本发明方法鉴定或选出的结合剂本身也作为本发明的方面提供于本文中，包括实例中所述的那些(包括(但不限于)包括所公开的序列的结合剂，例如本文阐述的抗体VH和/或VL域序列)以及作为执行本发明方法的结果而获得的其它结合剂。可以将所关注的结合剂配制成包括医药学上可接受的赋形剂的组合物。本发明扩展到此类组合物和其临床用途，包括用于通过疗法治疗人体或动物体的方法的结合剂。所述方法可以包括通过皮下施用来施用包含结合剂的组合物。包括结合剂于溶液中的组合物可以提供于注射用的预装药注射器中，任选地提供于试剂盒中，所述试剂盒包括一种或多种额外组件，例如针和/或产品信息说明书，包括通过注射(例如皮下注射)施用组合物的说明。
在本发明的情形下，真核细胞优选高等真核细胞，例如哺乳动物细胞。哺乳动物细胞通常用于旨在临床用途的多肽药物产品(例如抗体)的大规模表达。因此，当在药物发现中评估候选多肽的特征时，使用哺乳动物细胞是有利的。在发现的早期期间，多肽结合剂可以其预定的最终分子形式在哺乳动物细胞中表达。举例来说，在所期望临床产品是全长抗体(例如IgG)的情况下，本发明的方法中可以使用表达全长抗体(例如IgG)的哺乳动物细胞。
本发明用于细胞群可为最有利，其中每个基因组存在恒定数目个(优选一个)所整合的结合剂基因以避免拷贝数影响或不均一性，所述拷贝数影响或不均一性起因于群体中的不同克隆中所表达的结合剂基因的数目或一致性。另外，编码结合剂的DNA优选地整合于所有克隆的细胞DNA中的相同基因座，以避免对表达的外在影响复杂化使编码型DNA的整合位置发生变化，所述相同基因座可以另外来源于转录活性不同的基因组区域。这具有使结合剂表达的转录归一化的好处。因此，优选地，本发明使用各含有编码不同结合剂序列的DNA的多种(例如大型文库)哺乳动物细胞克隆，其中编码型DNA处于细胞DNA中的固定基因座且其中编码的结合剂呈现于细胞表面上。然而，仍可以使用其中编码型DNA随机整合于细胞DNA中或提供于用于瞬时表达的质体上的克隆获得本发明的好处(例如实例11)。编码结合剂的DNA整合于单个或有限数目个基因座在必要时还能够更好地控制表达，例如使用诱导型启动子，并且优选地，编码结合剂的DNA在每个细胞中存在一次或在二倍体基因组的每个染色体拷贝中存在一次。因此，文库的克隆各自优选地表达结合剂谱系中的仅一或两个成员。
本发明的各种特点进一步描述如下。整篇本说明书中所用的标题仅为了帮助导览，而不应解释为限定的。不同章节中所述的实施例在适当时可以组合。
具体实施方式
本文内的标题和子标题仅仅为了帮助导览而纳入，而不应解释为限制性的。本发明的多个方面和实施例可以组合，并且基于可开发性选择多肽药物的方法宜涵盖本文所述的个别特点和步骤的依序和/或并行组合。
可开发性
希望将根据多个可开发性特征进行的筛选整合到药物发现过程中，以在早期提供对可开发性的洞察和降低可开发性的风险。结合剂(和它们编码的细胞克隆)可以根据在此详述的一种或多种所期望的可开发性特征鉴定且选择。应理解，在本发明中，针对可开发性的筛选或选择通常是指预测的可开发性，其中所评估的内容是指示可开发性性状的替代标志，从而在早期发现中能够进行高通量选择和可开发性选择的整合。本发明允许通过富集具有较有利可开发性性状的结合剂鉴定和降低可开发性风险。然后可以通过例如下文所述的方法直接证实个别多肽的可开发性特征性。鉴定结合剂具有某种特征因此可以包括基于本发明方法获得的数据得出结论：所述结合剂经预测具有那种特征。
鉴定结合剂是用于开发的候选结合剂或鉴定结合剂具有良好可开发性特征可以包括生成鉴定所述结合剂具有良好可开发性特征的报告。鉴定结合剂池富集具有良好可开发性特征的结合剂可以包括生成鉴定所述池富集具有良好可开发性特征的结合剂的报告。类似地，鉴定所选细胞表达具有良好可开发性特征的结合剂(或富集表达具有良好可开发性特征的结合剂的克隆)可以包括生成报告，所述报告鉴定所述细胞(例如所选细胞群)表达具有良好可开发性特征的结合剂(或针对具有良好可开发性特征的结合剂的表达加以富集)。报告可以是书面报告，其可以电子形式和/或印刷形式提供。报告可以提供关于可开发性的定量和/或定性信息，包括例如来自本文所述的一种或多种方法的数据。
溶液中的溶解度、浓度和自缔合
重组表达的多肽通常需要从细胞培养基中提纯且以较高浓度配制，例如用作药剂。举例来说，蛋白质可以100μg/ml在瞬时细胞培养基中表达或以1mg/ml在稳定的细胞培养基中表达，对于皮下施药而言，蛋白质需要以较高浓度(例如50mg/ml或更大)提供给患者。
用于可溶性结合剂(例如抗体)表达、提纯和定量的许多直接技术已为所属领域的技术人员所知，例如Walker等人(2008)34，Janson等人(2012)35。提纯的多肽结合剂在溶液中的浓度能够用许多方式测定。举例来说，能够测量溶液对280nm波长的光的吸光度且利用数值、基于多肽的消光系数测定浓度。或者，可以将测试样品与已知浓度的标准蛋白质进行比较，用于其的多种比色分析和荧光分析已为所属领域的技术人员所知。
所期望的可开发性特征是水溶液中的高溶解度。多肽在10mg/ml、20mg/ml、50mg/ml、75mg/ml、100mg/ml、150mg/ml、200mg/ml或更大时宜为可溶的。溶液可以是水性缓冲溶液，例如PBS。多肽的溶解度极限可以大于10mg/ml、>20mg/ml、>50mg/ml、>75mg/ml、>100mg/ml、>150mg/ml或>200mg/ml。有利的是，含有多肽的溶液以大幅度低于其溶解度极限的浓度提供，以最小化分子的自身相互作用和当更紧密接近溶解度极限时可能发生的其它非期望影响。在产品质量和稳定性方面，多肽的自缔合能导致非期望的结果，包括增加的粘度或相分离。当达到分子的溶解度极限时，所溶浓度不能进一步增加，并且出现非期望的效应，例如分子将发生沉淀。在一些实施例中，所选多肽结合剂(例如改善的变异体)的溶解度极限是在10mg/ml与200mg/ml之间，例如在50mg/ml与100mg/ml之间。
可以将多肽溶液驱动到沉淀点且然后在过滤或离心之后，测定剩余可溶性材料的浓度，确定其溶解度极限。这也可以称为蛋白质的最大溶解度。然而，测量自缔合的开始存在更灵敏的方式，其可以在低于沉淀所需浓度的浓度下发生。举例来说，在临界浓度下，单体分子开始形成二聚体和高阶可溶性聚集体。此类聚集体能够以不同方式检测。“临界浓度”定义为自身相互作用明显(使用这些方法中的一种或多种)的浓度。结合剂的所期望可开发性特征在于其临界浓度高，以便结合剂溶液的医药配制舒适地在低于临界浓度的情况下进行。临界浓度优选地大于10mg/ml、>20mg/ml、>50mg/ml、>75mg/ml、>100mg/ml、>150mg/ml或>200mg/ml。在一些实施例中，所选多肽结合剂(例如改善的变异体)的临界浓度在10mg/ml与200mg/ml之间，例如在50mg/ml与100mg/ml之间。
自身相互作用的一些结果(例如沉淀)可以在延长的时间段内发生并且这与产品的存放期有关。缓冲液组成、pH和温度也可能有影响。例如浓度等参数因此可以在一组参考条件下测定，例如在4℃使用标准缓冲液，例如PBS pH 7.4。延长的时间段之后，可以证实多肽对自身相互作用的抗性，例如在这些条件下储存4周时间段之后(和任选地在所述时间段期间的其它时点)通过测试证实。多肽可以任选地在此类条件下抵抗自身相互作用至少六个月，证实溶液低于其临界浓度。
就此而言，具有不良可开发性特征的多肽是自聚集迹象明显的多肽，即使在溶液中的浓度较低的情况下，例如在标准缓冲液(例如PBS)中在1mg/ml或更小的情况下，例如在4℃。理想的多肽具有100mg/ml或更大的临界浓度，即，其将抵抗此类自身相互作用，从而允许其浓缩到100mg/ml。在这些极值之间，可能存在如下情况：使用本文概述的方法选出的改善的多肽展现比起始多肽改善1.5倍或更多的临界浓度。因此，“改善”能够结合起始多肽定义，例如在本文中别处所述的方法，其中将变异体与亲本结合剂比较。差异也可以是在来自不同克隆的结合剂之间比较，更通常例如在亲本结合剂的不同衍生物或变异体之间比较，或在文库中的整个克隆群体间比较，不论初始文库或从另一种方法得到的富集群体(任选地，从噬菌体展示选择的输出获得的克隆群体或从免疫获得的抗体群体)。可以将编码使用本发明以较高水平呈现于细胞表面上的结合剂的克隆与已经取消选择的同一群体内的编码具有较低表面呈现水平的多肽的克隆进行比较。能够将来自所选克隆的多肽的生物物理学行为与同一群体中的展现较低表面呈现水平的已取消选择的克隆所产生的多肽进行比较。受益于使用本发明发现的抗体或其它结合剂是如下抗体或结合剂：任何方法均能表明较高浓度水平能够在自身相互作用的开始之前达成，或在指定的分析内，自身相互作用的程度与比较多肽相比减少。举例来说，具有在10mg/ml自聚集证据的起始多肽可以是提高到15mg/ml或更大。或者，选自文库的最优多肽在10mg/ml可以抵抗自聚集，而由同一群体中的丢弃克隆所产生的其它多肽在10mg/ml或更小可以展现自身相互作用。在各种情况下，我们将亲本多肽或由丢弃克隆所产生的多肽称为“比较多肽”。
作为选用于本发明中的自缔合和其它生物物理学特性对照，可以使用期望特性已知的抗体且将亲本抗体和改善的其衍生物(或所选文库成员相对于取消选择的成员)的相对性能与此进行比较。美国国家标准与技术研究所(The National Institute ofStandards and Technology)已经使用抗体NIST RM 8671作为“黄金标准”参考抗体，其已被逾100位共同研究者广泛表征，所述比较作为美国化学学会(American ChemicalSociety)所出版的三册为一卷中的一册出版36。NIST RM 8671抗体显示具有最小的自身相互作用(Saro D等人，《对所提出的NIST单克隆抗体的可开发性评估(DevelopabilityAssessment of a proposed NIST monoclonal antibody)》37)。或者，抗体阿达木单抗(adalimumab)已表明展现最小的自身相互作用和交叉相互作用且已在一些研究中用作对照，例如Jain等人(2017)2和Sun等人(2013)38。出于定标目的，可以将如本文所述的结合剂(尤其是抗体)的临界浓度或溶解度与一种或多种此类参考抗体进行比较。
自身相互作用能够用多种方式测定，从而允许在选用于高水平表面呈现的抗体与基于较低展示水平而取消选择的抗体之间进行直接且可定量的比较。
尺寸排阻色谱(SEC)(例如高压液相色谱(HPLC))允许分离多肽的单体和多聚体形式(包括二聚体和高阶形式)。材料在二聚体和/或多聚体形式中的比例能够加以定量并且能够在结合剂之间(例如在亲本结合剂与改善的变异体之间)比较多聚体形成的程度，所述程度可以根据通过柱之后的延长的滞留时间和/或较宽的溶离峰检测。HPLC-SEC特征可以在单一浓度下测定且对多聚体比例和/或滞留时间进行比较。滞留时间或峰宽的任何可检测、可再现的缩短将视为改善。多聚体峰减小到亲本克隆的其数值的60％将视为改善。或者，多聚化阈值存在时的临界浓度对于每种克隆来说能够通过测试浓度范围并且测定这种多聚化阈值(例如5％)存在时的浓度来确定。或者，可以将多聚化的增加相对于时间作图且对多聚体积聚速率进行比较2。在各种情况下，临界浓度的增加代表改善。临界浓度的改善量级可以是例如至少1.5倍或至少2倍。
溶解度极限的改善或临界浓度的改善任选地在1.5倍与50倍之间，例如1.5倍与15倍之间、1.5倍与10倍之间或2倍与10倍之间。
测定多肽的自缔合的方法包括自身相互作用色谱(SIC)。在此技术中，使结合剂(例如抗体)固定在基质上且使相同结合剂的溶液越过基质。滞留时间相较于对照抗体延长显示自身相互作用38(或与基质的相互作用)。或者，可以使用高通量方案，其中使不同结合剂固定在生物层干涉测量芯片(BLI)上并且通过浸没其可溶形式的溶液来测试自身相互作用，从而产生与结合的可溶性结合剂的数量有关的信号。“使用生物层干涉测量抗体克隆自身相互作用”(CSI-BLI)方案显示与较费力的方案(例如SIC)良好相关并且需要的材料较少。在各种情况下，可以将测试结合剂的滞留时间(在SIC的情况下)和在(CSI-BLI)情况下所获得的信号与亲本结合剂和已知抵抗自聚集的对照结合剂(例如上述基准抗体)进行比较。
在亲和力捕捉式自身相互作用纳米颗粒光谱法(AC-SINS)中，测试抗体呈现于细胞表面上并且评估其与呈现于其它珠粒上的抗体发生亲合性自身相互作用的潜力39-41。相互作用引起的颗粒间距离的减少能够根据金胶体溶液的等离子体波长的增加检测到。AC-SINS是用于测定临界浓度的优选技术，因为这是灵敏且直接的分析。在优选实施例中，结合剂可开发性的改善能根据多肽在溶液中的临界浓度的增加检测到，其中临界浓度能通过在AC-SINS分析中测定等离子体波长的变化来测量。
自缔合还能够利用静态和动态光散射(DLS)测量42,43，其中能够计算出样品中的分子的流体动力学半径和多分散性百分比，从而提供关于分子在溶液中的尺寸和形状的信息。利用DLS，评估与抗体浓度有关的互扩散系数作为自缔合的度量。可以使用其它方法测量自身相互作用，例如分析型超离心44膜渗透压测定法45和中子散射46。
本发明的方法可以包括选择一种或多种克隆，所述克隆与其它克隆相比展现结合剂存在更高的表面呈现；以及鉴定由一种或多种所选克隆编码的结合剂在溶液中具有良好溶解度和/或对自缔合的抗性，其中所述一种或多种结合剂的临界浓度相较于由所述群体中的一种或多种其它克隆编码的结合剂或相较于亲本结合剂(其所选结合剂是变异体)增加至少10％、至少25％或至少50％，和/或其中所述一种或多种结合剂的临界浓度相较于由所述群体中的一种或多种其它克隆编码的结合剂或相较于亲本结合剂(其所选结合剂是变异体)增加至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍或至少100倍。
如所论述，本文中的方法能够用于排除可开发性特征不良的结合剂(或减少可开发性特征不良的结合剂的频率或发生率)，且有利于选择可开发性特征更佳的那些结合剂(增加具有更佳可开发性特征的结合剂的频率或发生率，富集具有更佳可开发性特征的结合剂)。此类方法不限于只鉴定和避免“问题”结合剂。本文所述技术的灵敏度允许其用于在展现良好溶解度的多种结合剂之间区分出最佳(例如最大可溶性)候选物。本发明还能够用于施加有利于在基于亲和力的选择期间维持或增强可开发性的选择性压力。
比较多肽可以是来自未选定的克隆群体(或展现结合剂呈现水平小于测定的阈值水平的克隆)的任何结合剂。比较多肽可以具有至少5mg/ml、至少10mg/ml、至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml或至少50mg/ml的溶解度极限，例如如本文所述的任何方法所测定。比较多肽可以任选地具有至少5mg/ml、至少10mg/ml、至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml或至少50mg/ml的临界浓度，例如如本文所述的任何方法所测定。与比较多肽(例如来自未选定的群体的克隆，或亲本结合剂)相比，来自所选克隆的结合剂可以展现可开发性特征(例如溶解度极限或临界浓度)的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％改善。与比较多肽相比，来自所选克隆的结合剂可以展现可开发性特征的至少1.5倍改善，例如增加的溶解度极限或增加的临界浓度比较多肽可以任选地具有至少10mg/ml、至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml或至少50mg/ml的临界浓度。应理解，当将多肽与比较多肽的特性进行比较时，所述比较是在与所属领域中使用对照的标准条件相同的条件下进行。
所述方法可以包括证实临界浓度的改善，例如通过在AC-SINS分析中测定等离子体波长的变化而在实验上测量临界浓度。用于测定参数(例如溶解度极限和临界浓度)的标准缓冲液条件包括PBS pH 7.4，4℃。在将新鲜合成的多肽配制成所述水性缓冲溶液之后可以立即测量参数。或者，可以在标准缓冲液条件下储存一段时间(例如1小时、1周、2周、28天或6个月的储存时间)之后测量参数。
人们可能希望在溶液恢复到4℃以便测量之前的储存期间暴露于较高温度(在此情况下，温度可以增加到例如25℃、37℃或50℃)之后测定参数。
非特异性结合
非特异性结合、“多反应性”、“多特异性”或“低特异性”可以指结合剂与除其同源靶标之外的非靶分子的相互作用，例如多肽可以非特异性结合到疏水性、带负电或带正电的表面。多反应性多肽可以被描述为显示“粘性”，这反映了除结合剂多肽与其靶标之间的特异性识别之外，其还通过这种类型的相互作用结合到非靶分子。在许多情况下，非特异性结合表现为低亲和力相互作用，但其仍存在问题，其中非靶分子是丰裕的。多反应性可归因于结合剂多肽表面上的簇聚的疏水性或带电荷氨基酸残基，在抗体的情况下，这可以位于重链和/或轻链可变域上，从而与其它(非靶标)分子产生一类非特异性相互作用。举例来说，多肽可能展现结合到疏水性表面，如果多肽在其表面上显示一个或多个疏水性补丁，或如果疏水性补丁通过多肽在溶液中的展开而暴露，则结合到疏水性表面可能会发生。或者，多肽可能展现结合到带负电的表面或携带净负电荷的分子(在中性pH下)，例如DNA的带负电主链，或其它带负电的聚合物，例如肝素或乙酰肝素硫酸盐。不论负责这些非特异性相互作用的潜在分子基序，多反应性通常是候选多肽药物的非期望特点。多肽药物的多反应性与不良的药物动力学有关，例如体内短半衰期和/或药物从循环到组织的不良吸收。
在本发明的各方面中，使表达结合剂的细胞(例如文库，或来自文库的细胞的样品)暴露于一种或多种非靶分子或“多反应性探针”。这能够用于区分呈现结合剂的群体内的细胞克隆，所述结合剂与来自那些细胞克隆的所述多反应性探针相互作用而不结合到此类探针或对此类探针的结合较低。多反应性探针可以包括以下中的任一种或多种：核酸(例如DNA)、抗生蛋白链菌素、肝素、乙酰肝素硫酸盐、软骨素硫酸盐、羧基聚葡萄糖、其它硫酸化蛋白多糖、胰岛素、脂多糖、杆状病毒、KLH、FcRn、层粘连蛋白、胶原蛋白、触发因子、Hsp70、Hsp90或其它热休克蛋白或伴随蛋白、玻糖醛酸或其它糖萼组分。非靶分子可以分离的形式呈现或以混合的制剂呈现，例如来自哺乳动物细胞(例如CHO细胞)的膜制剂可以用于测试多反应性。非靶分子可以是体内(例如哺乳动物中，例如人体中)发现的分子。其可以发现于细胞外基质或血流中，和/或细胞表面上。也可以制备非靶分子的合成替代物且用作多反应性探针。
选择多反应性探针是为了根据非特异性结合的特定方式进行筛选，例如检测对带负电表面的非特异性结合，人们可以选择在中性pH携带净负电荷的多反应性探针，例如肝素硫酸盐、DNA或抗生蛋白链菌素，和/或具有例如延伸的带负电表面区域的分子。FcRn.适合的多反应性探针可以基于计算出的其等电点(pI)鉴定。pI是蛋白质电荷的度量且定义为蛋白质不携带净电荷的pH。可以选择pI小于6的多反应性探针以便检测对带负电表面显示非特异性结合的结合剂。实例已为熟练的技术人员所知且包括抗生蛋白链菌素、核酸和硫酸化蛋白多糖，例如肝素硫酸盐或羧基聚葡萄糖。反之，为了检测到对带正电表面的非特异性结合，可以选择具有带正电表面区域和/或碱性pI(例如pI大于8)的多反应性探针。此类探针还可用以检测具有带负电表面补丁的结合剂，带负电的细胞表面可能在体内产生非期望的静电排斥力。为了通过疏水性吸引力探测多反应性，可以选择在其表面上具有一个或多个疏水性区域的多反应性探针，例如Hsp70或Hsp90。
有多种方法可用于筛选特异性低的个别克隆。交叉相互作用色谱(CIC)47是一种方法，其中使靶分子或混合物(通常为多株抗体制剂)固定于色谱基质上并且测量各种抗体的滞留时间。通过与固定的分子或树脂自身的相互作用发生的滞留延迟是低特异性的指示。这种方案已经在许多研究中用于表征例如重组抗体2,15,38。如上文所述的尺寸排阻色谱还可以用于测定结合剂与基质的相互作用。在本文中，应理解，在这些方法中，所关注的非靶分子占据“靶标”的位置，其为据以测试结合剂相互作用的分子组分。
与替代基质或靶分子分相互作用也已经用于抗体和其它多肽的表征。举例来说，可以根据对存在于糖萼中的丰裕分子(例如乙酰肝素硫酸盐蛋白多糖(HSPG)，其由核心蛋白与所连接的乙酰肝素硫酸盐(HS)葡糖胺聚糖(GAG)链构成)的结合来筛选细胞。鉴于此类分子在糖萼中的较大表面区域和数量，因此这是一类特别适于测试的分子。肝素亲和层析涉及使样品越过含有固定化肝素的基质48。预制备的树脂获自许多来源(肝素琼脂糖(Pharmacia)、生物凝胶肝素(Bio-Rad，奥地利维也纳)、Eupergit肝素(Riihm Pharma，德国威特塔得(Weiterstadt,Germany))和Toyopearl肝素650M(TosoHaas，德国斯图加特(Stuttgart))。结合物质将在其通过时被滞留或延迟。未结合物质将通过或在洗涤后去除。利用改变的缓冲液条件(例如增加盐浓度)去除所结合的材料。这种方法能够用于筛选可溶性抗体并且测定他们与肝素相互作用的程度。疏水相互作用色谱还能够用于根据抗体与疏水性基质发生相互作用的倾向表征抗体49,50。
在一种或多种非靶分子呈现于基质上的情况下，结合剂对基质的结合可以体现为细胞对基质的结合增加，例如细胞越过基质时被阻滞，或结合到经非靶分子涂布的珠粒(例如磁珠)。显示较大结合到一种或多种非靶分子的结合剂从而能够通过去除(丢弃或不选择)显示较大结合的细胞部分来分离，而显示较小结合的那些细胞可以回收且任选地选用于其它步骤。如上文所论述，比较多肽和对照多肽能够用于证实本发明引起的改善。改善可以通过鉴定非特异性相互作用明显发生时的浓度来确定，所述浓度任选地在标准条件下定义。或者，非特异性相互作用的程度可以在固定的浓度下测定。分析非特异性结合的方法可以向结合剂产生“粘性度量”，从而对可以与其它结合剂比较的非特异性结合提供定量度量。因此，任何指定分析的“粘性度量”将是测试多肽的数值与已知具有极低非特异性相互作用的对照多肽之间的差异。举例来说，已批准的抗体阿达木单抗2,38或抗体NIST RM 8671具有最小的自身相互作用或与其它多克隆IgG分子缔合，如通过自身相互作用色谱(SIC)和交叉相互作用色谱(CIC)方法所估算。(Saro D等人，《所提出的NIST单克隆抗体的可开发性评估(Developability Assessment of a proposed NIST monoclonal antibody)》37)。根据本发明的已批准的多肽是观察到“粘性度量”相较于比较克隆改善的多肽。比较克隆可以是正改善的起始克隆，或可以是通过使用本发明取消选择的克隆。
许多方法(包括这些色谱方法)典型地用于表征个别抗体和产生“粘性度量”。色谱基质能够用于基于其与所固定分子的相互作用来分离细胞。举例来说，固定于溴化氰活化琼脂糖上的凝集素已被用于分离T细胞群51。此类系统可加以修改以基于其与所固定靶标(例如多克隆抗体、肝素硫酸盐或其它测试分子)的相互作用分离表达抗体的细胞。在与所固定的靶标或载体基质存在相互作用的情况下，带有此类抗体的细胞相对于无相互作用的细胞将被滞留或延迟。当用于分离展示具有不同结合倾向的抗体的细胞时，可以修改上样缓冲液或洗涤缓冲液以实现所期望的严格度。
也可以使用非色谱方法鉴定和定量个别抗体内的低特异性。举例来说，Hotzel等人(2012)在ELISA中利用抗体对杆状病毒颗粒的结合来鉴定展现非特异性相互作用的抗体16。以类似方式可以使其它测试分子(例如肝素硫酸盐)固定于或呈现于珠粒上，以测试与个别抗体的相互作用。非色谱方法(例如这些方法)可以适于从高等真核细胞上所展示的文库中鉴定出展现低特异性的克隆。
已经制备洗涤剂溶解型膜蛋白的混合物，生物素化且用于鉴定展示具有低特异性的抗体的酵母文库内的克隆19。使用酵母文库可以耐受洗涤剂的存在，但不大可能适合于基于高等真核细胞(例如哺乳动物细胞)的展示系统。用于鉴定低特异性相互作用的测试分子或混合物可以用荧光团或分子(例如生物素)标记，所述荧光团或分子有助于标记或回收经抗生蛋白链菌素涂布的表面上的分子和其复合物。举例来说，例如荧光团标记的软骨素硫酸盐或肝素硫酸盐等分子(例如得自AMS目录号AMS.CSR.FACS-A1、C1或D1或E1或AMS.CSR.FAHS-P1)可以用于在流式分选中根据与经标记的测试分子相互作用的程度分离克隆。多肽在细胞表面上的高亲合力表达增加了方案的灵敏度，尤其当使用多价靶分子时。文库内的克隆可以基于荧光分子的结合、通过流式细胞术分离。这些测试分子可以联合其它经标记的分子使用，以预先、同时或随后根据其它期望特性进行选择，例如对靶标的结合，或所关注的其它分子(例如Fc受体)的其它结合/回避。其它方法包括如上文所提及的AC-SINS。在这种技术中，使测试结合剂呈现于细胞表面上并且评估其与其它细胞或珠粒上所呈现的一种或多种非靶标组分相互作用的潜力39。根据金胶体溶液的等离子体波长的增加能够检测到相互作用后发生的颗粒间距离的减少。
可以使表达结合剂的细胞暴露于一种或多种非靶分子，其中克隆混合物(例如文库，或来自其的样品)一同存在于一个容器中，对于例如FACS等方法或对于色谱技术来说，这是方便的。在其它情况下，可以在独立的容器中使表达结合剂的细胞暴露于一种或多种非靶分子，例如每个容器一种克隆，并且然后能够个别地测量且比较所产生的相互作用或结合水平，对于测量颗粒间距离的方法(例如AC-SINS)来说或当正比较的表达结合剂的克隆数目相对较小时，这可以是更方便的。
因此，能够将荧光标记的多反应性探针与细胞群混合并且使用检测或分离方法将表达多反应性结合剂(如根据对多反应性探针的结合所鉴定)的细胞克隆与不表达多反应性结合剂的结合剂表达克隆区分开来。未能结合经标记的探针的细胞克隆能够通过流式分选、磁珠分离和其它分离方法分离出来，以实现针对表达多反应性抗体的克隆的富集。实例6表明其不仅能在群体内的多反应性克隆与非多反应性克隆之间实现充分的区分，而且此能够使用允许其分离的直接实用步骤进行。
鉴定候选药物的可开发变异体
虽然本发明可以在药物发现的所有阶段使用(包括结合剂的早期选择(例如从初始文库或免疫或其它展示方案所产生的所选群体)，和稍后比较一组入围候选分子的质量)，其也适用于其中所关注的结合剂已经得到鉴定、但然后发现一种或多种可开发性特征需要改善的情形。可以发现来自任何来源的已鉴定结合剂展现不大理想的可开发性特征，并且在此类情况下，优选的是可以改进现有分子的序列，而非再次从头开始新的药物发现程序来找到替代分子。
本发明的方法可以用于鉴定结合剂的变异体，其中已鉴定所述结合剂的一种或多种可开发性特征(例如所论述的自缔合、溶解度、非特异性结合等)需要改善，且其中本发明用于预测一种或多种变异体是否展现改善的可开发性。因此，本发明的选择方法可以对展示“亲本”结合剂的变异体的细胞群执行。虽然这些可以称为文库，并且在一些情况下将展示变异体结合剂的大型多样化群体，但是用于比较的克隆数目在一些情况下可以是相对较小的，例如最多10种。本发明的方法因此可以包括提供克隆文库或多种克隆，其中结合剂呈现于细胞表面上，其中克隆是通过产生亲本结合剂序列的变异体序列且将编码变异体的DNA引入细胞中以便将DNA整合于细胞DNA中来产生。适合的方法和技术在本文的其它章节中详述。
产生变异体的“亲本”结合剂可以是已经在一种或多种可开发性分析中鉴定出因性能不良而需要改善的结合剂。或者，可能只是希望研究其可开发性是否能通过序列变异改善。本文论述了可开发性的各个方面并且可以鉴定亲本分子的这些可开发性中的任一种需要改善。可以发现亲本分子具有例如小于50mg/ml、小于20mg/ml、小于10mg/ml、小于5mg/ml或小于1mg/ml的溶解度极限(最大溶解度)。可以发现亲本分子具有例如小于50mg/ml、小于20mg/ml、小于10mg/ml、小于5mg/ml或小于1mg/ml的临界浓度。亲本分子可能会在溶液中展现非期望的聚集且/或可能在溶液中不能浓缩到大于1mg/ml而不聚集和/或沉淀。亲本分子可以对一种或多种非靶分子显示非特异性结合。可以鉴定亲本分子对FcRn的结合且/或与FcRn的解离需要改善。
任选地，对亲本多肽序列执行生物信息学评估以鉴定序列的潜在特点，其中预测突变会减少经鉴定的可开发性问题且从而改善性能。从而可以鉴定出一个或多个经预测与可开发性(例如溶解度、自缔合、非特异性结合)有关的氨基酸位置。
此类生物信息学评估能够用于告知突变策略。因此，能够产生亲本多肽序列的变异体，任选地包括在生物信息学评估中鉴定的一个或多个氨基酸位置的突变。从而可以使亲本结合剂的多肽序列的一个或多个氨基酸残基发生突变，所述突变经预测会促进自缔合、聚集及/或非特异性结合，且/或减小溶解度。突变产生编码亲本序列的一种或多种变异体的DNA，所述DNA可以引入高等真核细胞中以产生编码变异型结合剂的细胞群(其方法描述于本文中)。可以在用于表达结合剂的条件下培养细胞，其中结合剂呈现于细胞表面上。表达结合剂的多个细胞可以用作如本文所述的文库且可以执行选择以鉴定结合剂发生较高表面呈现的克隆，作为改善的可开发性特征的指标。
在如本文所述的不同实例中，利用序列分析鉴定潜在的问题残基。或者，可以使用随机序列变异。产生变异体和衍生物文库的方法描述于本文中别处。可以产生个别变异体并且评估改善的生物物理学特征。能够建立许多此类变异体的大型文库和直接根据改善的特征(例如对自聚集的抗性)进行选择将大大有助于发现溶解度特性最优的抗体和其它结合剂。由于有益于溶解度的变化能够同时减少靶标结合，尤其是涉及互补位残基时14，因此本发明的方法可以将针对可开发性进行的选择与根据所滞留的靶标结合进行的选择加以组合。此类选择任选地同时执行，并且根据亲和力和溶解度同时或依序筛选的方法已描述。
包括基于结合剂的表面呈现水平进行选择的本发明方法可以用于鉴定溶液特性改善的变异体，如所论述。举例来说，改善“亲本”结合剂(例如抗体)的可开发性特征的方法可以包括
将突变引入结合剂的氨基酸序列以产生变异体，
将编码变异体的DNA引入真核(例如哺乳动物)细胞以提供各含有编码衍生物抗体的DNA的多种细胞克隆，
将编码亲本结合剂的DNA引入真核(例如哺乳动物)细胞以提供含有编码亲本结合剂的DNA的细胞克隆，
在体外，在使所述结合剂呈现于细胞表面上的条件下培养所述克隆，
测定所述结合剂在多种克隆上的表面呈现水平，
选择衍生物抗体的表面呈现高于表达亲本结合剂的克隆的一种或多种克隆，以及
鉴定由一种或多种所选克隆编码的与亲本抗体相比具有改善的可开发性特征的一种或多种变异型结合剂。
自身相互作用倾向与非靶标相互作用倾向之间有关。已发现少数氨基酸变化(1-3)对两个方面均能产生有益的作用6,7,14。在其它情况下，低特异性的证据表明可能存在有限的自身相互作用。在任一情况下，也可以使用本发明的方法，包括选择展现较低非特异性结合的结合剂。因此，如本文中别处所论述，所述系统可以用于鉴定与其它分子的非期望非特异性相互作用，亦称为“低特异性”以及“多特异性”。本发明有益于在高等真核细胞(例如哺乳动物细胞)上的表达的背景下执行此类筛选，其中例如糖基化等修饰更密切地反映了在生产型细胞系中所发现的，所述细胞系典型地用于生产临床中所用的产品。多肽在细胞上的高呈现水平23将增加任何相互作用的亲合力，借此用于增加系统在检测低亲和力非期望相互作用时的灵敏度。另外，高等真核生物自身(或内质网和高尔基体的环境)的表面能够充当基质，其中结合剂可以在相对较高浓度下暴露于多种多肽，从而允许特异性低的结合剂与非靶分子在相同或相邻细胞上相互作用。这继而将降低呈现水平。这还可以引起呈现细胞与群体中的其它细胞聚集。所产生的细胞聚集体能够加以去除(例如通过过滤或沉积)，从而使群体中的此类克隆耗竭。所聚集细胞的去除还可以用于减少自身相互作用克隆的呈现。
在另一应用中，表达来自内源或外源基因的非所需靶标的宿主细胞可用于耗竭交叉反应性克隆。举例来说，表达糖萼组分的内皮细胞或哺乳动物细胞用所关注的基因转染。结合到靶标的克隆可以基于低表面表达或细胞聚集来耗竭。
可以在起始克隆与使用本发明产生的改善克隆之间比较在多肽的单一浓度下进行生物物理学测量的数值。或者，可以比较测量非所需生物物理学参数时的浓度。方法可以包括选择展现一种或多种所期望可开发性特征改善的变异体，例如较大溶解度、在溶液中较低的自缔合倾向、对非靶分子的非特异性结合较低、较高临界浓度等。差异倍数或差异％是可量测的且实例数值在本文中别处提供。比较通常针对亲本结合剂进行。然而，当本发明用于根据本文所述的其它生物物理学特性选择时，由本发明所选的克隆产生的变异型多肽与被本发明取消选择的比较多肽之间的比较还可以用于证实和定量改善。
产生变异体和衍生物文库的方法
依循本文所述的任何选择方法，能够从一个或多个所选细胞中回收编码所展示的结合剂的DNA，所述DNA任选地经突变而产生变异体，且/或对其进行亚克隆，例如允许在第二展示系统内进行额外多轮选择。这可以是另一种真核展示系统，其引起不同的表面呈现水平，或可以是完全不同的展示系统，例如噬菌体展示。第二系统可以使用分泌式表达且/或可以允许如此前所述的直接功能选择，参见参考文献52-54和WO2015/166272。或者，输入DNA编码型结合剂可以是来自未选定文库的结合剂群体或免疫或另一种展示技术(例如酵母或噬菌体展示)所产生的群体。
相应地，在利用本发明方法产生文库之后，可以选择且使用一种或多种文库克隆产生另一个第二代文库。当已通过将DNA引入如本文所述的真核细胞来产生文库时，可以培养文库以表达结合剂，并且可以回收表达所关注的结合剂的一种或多种克隆，例如通过选择针对如本文在别处所述的靶标的结合剂来回收。这些克隆随后可以用于产生含有编码第二谱系的结合剂的DNA的衍生物文库。
在其它情况下，希望产生亲本结合剂的变异体，以便提供多种变异体，从中选出展现改善的可开发性特征的变异体。
为了产生衍生物文库，使一种或多种所回收的克隆的供体DNA发生突变以提供第二谱系的结合剂。类似地，为了产生变异体，使编码亲本结合剂的DNA发生突变。突变可以是一个或多个核苷酸的添加、取代或缺失。通过一个或多个氨基酸的添加、取代或缺失，突变将改变所编码的结合剂的序列。突变可以聚焦于一个或多个区域，例如抗体分子的一个或多个CDR，提供结构类别共同的结合剂谱系，所述结合剂谱系在一个或多个多样性区域不同，如在本文别处所述。
一般来说，可以在DNA或RNA层面进行核酸序列的操纵和/或修饰。除非上下文另外要求，否则本文中提及DNA可以因此推广到包括其它等效核酸(例如RNA)。因此，提供、分离或使编码结合剂的RNA突变是提供、分离或使编码结合剂的DNA突变的替代方式。RNA任选地用于产生cDNA。
产生衍生物文库可以包括：从一种或多种回收的克隆中分离出编码结合剂的核酸(例如分离出供体DNA，或其编码的RNA)、将突变引入核酸(例如DNA)以提供编码结合剂的第二谱系的供体DNA分子衍生物群体，以及将供体DNA分子的衍生物群体引入细胞以建立含有编码结合剂的第二谱系的DNA的细胞衍生物文库。
分离编码结合剂的核酸(例如供体DNA)可以涉及从克隆中获得且/或鉴定DNA或RNA。此类方法可以涵盖扩增编码来自所回收克隆的结合剂的DNA(例如通过PCR来扩增)和引入突变。可以对DNA测序且合成所突变的DNA。
可以替代地通过诱导克隆内的DNA突变而将突变引入一种或多种所回收克隆的供体DNA中。从而可以从一种或多种克隆建立衍生物文库而不需要分离DNA，例如通过使禽鸟DT40细胞发生内源突变。或者，编码结合剂的基因可以存在于基因组内且通过引入寡核苷酸和短同源臂来执行诱变。已经证明，使用80bp的单链寡核苷酸修复有缺陷的GFP基因已经实现高达45％的转染效率(Igoucheva,O.,Alexeev,V.,Yoon,K.,2001.在哺乳动物细胞中利用小单链寡核苷酸进行靶基因校正(Targeted gene correction by small single-stranded oligonucleotides in mammalian cells).《基因疗法(Gene Ther.)》8(5),391-39955；Liang等人，(2017).通过改善gRNA、Cas9核酸酶和供体DNA的设计和递送来增强CRISPR/Cas9介导的精确基因组编辑(Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genomeediting by improved design and delivery of gRNA,Cas9 nuclease,and donor DNA).《生物技术杂志(J.Biotechnology)》241,136-14656)。
抗体展示本身特别适合于建立衍生物文库。一旦分离出抗体基因，则可以使用多种诱变方案(例如易出错PCR、寡核苷酸定向诱变、链改组)建立相关克隆的展示文库，从中能够选出改善的变异体。举例来说，利用链改组能够将编码所选VH克隆群体、寡克隆混合物或群体的DNA亚克隆到载体中，所述载体编码适合的抗体形式并且编码适当格式化的VL链谱系57。或者且再次使用VH的实例，可以将VH克隆、寡克隆混合物或群体引入真核细胞群体中，所述真核细胞群体编码且表达适当格式化轻链搭配物的群体(例如与IgG或Fab格式化重链缔合的VL-CL链)。VH群体可以源自上文所论述的任何来源，包括免疫动物的B细胞或来自所选噬菌体群体的scFv基因。在后一实例中，将所选VH克隆到轻链谱系中可以将链改组与重新格式化(例如格式化成IgG格式)组合成一个步骤。
结合剂的细胞表面呈现
结合剂滞留于细胞表面是展示文库的特点，原因是其提供结合剂与编码型DNA之间的物理性缔合，从而有助于在物理分离表达具有期望特性的结合剂的细胞之后获取DNA。结合剂的表面呈现(或简称“呈现”)也可以称为结合剂的展示或表面表达。结合剂的表面呈现水平反映了其表达水平和其在高浓度延长暴露于细胞表面上之后保持的呈现水平。在本文所述的方法中，在表达不同结合剂的克隆之间比较结合剂的表面呈现相对水平且用于鉴定结合剂，所述结合剂具有较低的自缔合倾向、较大溶解度且能够在适于医药用途的浓度下配制成水性缓冲溶液。因此，呈现水平可以用于选择具有期望特性的克隆。结合剂在展示文库上的表面呈现因此代表能够用于选择可开发性特征的内置特点。
能够使用不同方式固定于细胞表面上。结合剂可以包括或连接到膜锚，例如跨膜域，用于结合剂的胞外展示。这可以涉及使结合剂与膜定位信号(例如GPI识别序列)或与跨膜域(例如PDGF受体的跨膜域)直接融合。58
实现结合剂滞留于细胞表面上的其它方法包括结合剂与同一细胞内所表达的另一细胞表面滞留分子的间接缔合。这种缔合的分子自身可以是异源二聚体结合剂的一部分，例如系拴的抗体重链与未直接系拴的轻链搭配物的缔合。WO2015/166272(并入本文中供参考)描述了用于使所表达的结合剂保留于其宿主细胞上的多种技术，包括将分泌式表达与膜展示组合的方法。从而可以保持所表达结合剂在细胞表面上的比例，同时使相同结合剂的其它拷贝以可溶形式从同一细胞中分泌。细胞可以保持大部分结合剂(例如80％或更多，或90％或更多)呈现于细胞表面上，少数分泌到培养基中。任选地，结合剂仅保持于细胞表面上而不以可溶形式分泌。
如实例1中所说明，可以使抗体重链与PDGFR TM域融合并且连同其同源轻链一起表达以便表面呈现全长免疫球蛋白(例如IgG)。编码细胞内的结合剂或其多肽亚单元(例如抗体重链)的基因可以包括编码前导序列的DNA，以便经由内质网(ER)分泌到细胞表面。编码结合剂的基因可以包括编码膜锚(例如跨膜域，例如哺乳动物(例如人类)蛋白质的TM域)的DNA。或者，其可以包括编码翻译后膜锚(例如糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚)的附接信号的DNA。多肽结合剂的C端区域通常选用于TM域的膜锚附接或融合。
影响细胞表面表达水平的方法包括控制结合剂从其编码型DNA表达的水平，例如使用启动子控制，且此方法描述于本文中别处。表面表达水平能够可替代地通过影响编码表达结合剂的DNA剪接到编码跨膜域的外显子的程度来控制，例如如WO2015128509(Glenmark Pharmaceuticals)中所述。这种方案也在本文中举例说明，参见实例8a和实例8b，其描述了可以有效地用于本发明方法中的表达系统，其中希望结合剂存在不同的表面呈现水平。
在本发明的实施例中，结合剂在细胞中表达且输送到质膜，作为膜蛋白滞留于细胞表面，例如结合剂可以包括一种或多种具有至少一个跨膜域或膜锚的多肽。举例来说，在多肽结合剂包括抗体重链(或其一部分)和抗体轻链(或其一部分)并且包括连接到重链和/或轻链的跨膜域或膜锚的情况下，结合剂在ER内合成且萌芽到高尔基体中，通过细胞内小泡输送到细胞表面，与质膜融合，之后通过其跨膜域或膜锚滞留结合剂并且向细胞外呈现。结合剂整合到膜内因此在细胞内发生，随后输送到细胞表面。在适用的情况下，多亚单元结合剂(例如包括各别重链和轻链的抗体，或其一部分)的组装典型地也在细胞内发生。
细胞表面呈现水平可以按照拷贝数(每个细胞所展示的结合剂数目)测量。有多种方法可供利用，包括与校准珠粒进行比较以及配体浓度和受体占有率的史卡查图(Scatchard plots)59-61。通过了解细胞半径和关于可利用体积或表面面积的某些假设，这可以用于分别评估浓度或密度(实例3)。在涉及本发明的一般层面，拷贝数与在呈现水平增加时发现的较高浓度下实现的浓度有关。细胞表面上的拷贝数与浓度之间的关系也受到细胞尺寸的影响。由于抗体在较大细胞上将占据较大体积，因此相同数量的结合剂呈现于小细胞和大细胞上将产生不同浓度(比较细胞尺寸和所实现的浓度，参见实例3)。
大量重组表达系统可获得并且在不同系统之间，在细胞表面上展示的结合剂的绝对数量将不同。当使用不同细胞(例如不同尺寸的细胞)、不同启动子、不同诱导机制、不同剪接机制、输送效率等时，熟练的技术人员在适当时能够针对呈现水平的范围来校正本发明的方法。然而通过举例提供以下指导。
利用弱活性启动子，可以使结合剂以每个细胞100-100,000范围内的拷贝数呈现于细胞表面上。每个细胞的结合剂数目可以是至少100、至少1,000或至少10,000。每个细胞的结合剂数目可以是多达1,000、多达10,000或多达100,000。在优选实施例中，拷贝数是每个细胞约80,000或更少、每个细胞约60,000或更少、每个细胞约50,000或更少，或每个细胞约40,000或更少。为了促进检测，拷贝数可以是每个细胞至少100、至少1,000或至少10,000。因此，拷贝数可以在例如每个细胞1,000-60,000范围内。其可以是约10,000、约50,000或约60,000。
利用强活性启动子，可以使结合剂以每个细胞100,000-10,000,000范围内的拷贝数呈现于细胞表面上。每个细胞的结合剂数目可以是至少100,000或至少1,000,000。每个细胞的结合剂数目可以是多达1,000,000或多达10,000,000。其可以是约1,000,000。
当然，不同细胞上的确切的结合剂数目将是变化的，即使是单一克隆也如此，但一种克隆的细胞之间的此类拷贝数变化与本文所述的选择和富集方法所利用的克隆间拷贝数变化相比是微小的。实例数字和范围表示近似平均值(均值)。拷贝数可以是群体中的细胞的平均(均值)拷贝数。根据亲和力进行选择时，为了增强高亲和力克隆的结合和富集严格度，优选较低拷贝数；而根据可开发性(例如结合剂的溶液特性)进行选择时，优选较高拷贝数。
表达结合剂的细胞文库内的拷贝数可以在相对较低(例如每个细胞10,000、50,000、100,000或250,000个拷贝)到相对较高(例如每个细胞1,000,000个拷贝)的范围内。本文引用的拷贝数仅仅是引导，并且是基于悬浮培养的HEK细胞文库中所观察到的拷贝数，所述HEK细胞具有约10μm的半径95。以指定密度呈现于大细胞表面上的多肽的拷贝数高于以相同密度在小细胞上呈现时的拷贝数，因此在较大或更小细胞产生的文库中观察到的绝对拷贝数可以相应地改变。参见实例3b。
实施本发明的方法时，人们在各种克隆之间作比较时通常对相对呈现水平感兴趣，在此情况下，结合剂的绝对数(每个细胞的绝对拷贝数)不是关键，而是能够根据结合剂在细胞表面上展示的不同水平将克隆排序或区分开来。
来自文库的代表性克隆样品的表面呈现水平能够加以测定，并且用于评估存在于文库克隆中的表面呈现水平的平均值(方式、均值或中值)和展度(范围)。
能够利用任何适合方法测定多肽存在于细胞表面上的水平，以便比较其相对数量。在细胞之间测量结合剂呈现相对差异的优选方式是将细胞暴露于携带可检测(例如荧光)标记的试剂，允许所述试剂结合到结合剂，并且检测细胞上的标记的相对数量，其中来自可检测标记的信号较强(例如较多荧光单位)指示细胞上存在较高的结合剂呈现水平。当可检测标记是荧光时，可以使用荧光活化细胞分选仪(FACS)执行分选。或者或另外，在FACS的情况下，能够利用通过磁珠进行的选择。
人们通常将选择结合到结合剂恒定区的试剂，以便所有结合剂都能够独立于其序列而同等地被标记。使用抗体和包括Fc区的其它结合剂时，宜用结合Fc区的试剂进行标记。举例来说，在结合剂是IgG抗体的情况下，可以使细胞与可检测试剂接触，所述可检测试剂结合到IgG Fc区，例如经标记的抗IgG抗体。适当时，能够对所述方法进行调适，例如其中文库包括其Fc区的序列不同的结合剂(一种结合Fc的非多样化部分的试剂)，或能够利用结合剂分子的其它区域。可以将肽表达标签(例如血球凝集素(HA)、c-Myc)并入结合剂多肽(例如并入抗体支架中)，从而能够通过检测结合到标签的试剂来检测所展示的结合剂。这已经在选择正确组装的抗体的上下文中预先描述，以便基于抗体表达水平将抗原结合信号归一化24,62。用于检测结合剂的表面呈现水平的试剂可以单独使用，即，无需根据其它特点(例如抗原结合或靶标特异性)进行协同检测或协同选择。因此，在一些实施例中，使用结合结合剂恒定区的试剂检测结合剂呈现水平的步骤不包含使用经标记的靶标检测结合剂。在其它实施例中，可以执行多参数选择。文库中的表达结合剂的克隆可以展现多种多样的表面呈现水平，反映了高水平的克隆间变化。对于来自文库的代表性细胞样品来说，表面呈现水平能够相对于观察到呈现水平的频率作图，例如在FACS检测之后。关于此的一些实施例结合图31描述于实例10并且绘示于图31中。检测样品上中值表面呈现水平或峰值表面呈现水平，并且能够观察且/或计算呈现水平的展度和其相对于中值或峰值的偏差。在表面呈现水平相对于细胞计数的图中，峰值表面呈现能够作为最高峰方便地可视化。
在克隆群体中观察到的表面呈现水平的展度可以由相对于峰值(mode)的变异度表示。在克隆之间，克隆群体的表面呈现水平可以显示广泛的变异，特别是其中结合剂的结构(例如不同一级序列)展现较大变异度，使得一些克隆展示结合剂的密度比其它克隆高得多。在一些克隆群体中，表面呈现水平的克隆间变异可以是较低的，但本发明方法可以用于设定阈值呈现水平以及将较高呈现克隆与较低呈现克隆区分开来。展度的一种统计学度量是四分位数间距，即上四分位数(75％)与下四分位数(25％)之间的差异。处于75％(表示为上四分位数的下边界)的拷贝数与处于25％(表示为下四分位数的上边界)的拷贝数可以相差至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍或至少5倍。
在一些实施例中，当细胞群逐渐地富集结合剂存在高度表面呈现的克隆时，可以观察到表面呈现水平的范围和上述参考点之间的表面呈现差异倍数随着表面呈现水平的每一轮选择而减小。在一些实施例中，可以观察到峰值随着较高表面呈现的每一次富集而逐渐增加。选择之后，测定或观察结合剂群体的表面呈现水平增加的方法可以包括测定或观察平均(例如中值或峰值)拷贝数的增加，如通过例如FACS或本文所述的类似方法所测量。可以观察到所选群体(或其克隆)的平均表面呈现水平高于表达比较多肽的未选群体或克隆的平均表面呈现水平，例如高于表达群体所来源的亲本结合剂的克隆的平均表面呈现水平。举例来说，所选克隆或所选群体的峰值或中值拷贝数可以比比较克隆或亲本克隆高至少5％、至少10％、至少20％或至少25％，并且可以基于表面呈现水平的改善来选择所述克隆。
为了选择表达结合剂的较高表面呈现的克隆，或为了选择富集编码展现较高表面呈现的结合剂的克隆的克隆群体，根据结合剂在细胞上的表面呈现水平能够将细胞分选到收集部分和丢弃部分。表面呈现高于预定阈值的细胞分选到收集部分并且表面呈现低于预定阈值的细胞分选到丢弃部分。表面呈现任选地成为在这个步骤期间执行选择/富集的唯一基础。这能通过使用标记所有结合剂的可检测试剂、任选地在不检测结合剂识别靶标的情况下来促进。
通过丢弃展现结合剂的较低表面呈现的细胞部分，从群体中耗竭表达具有不良可开发性特征的结合剂的克隆。选择剩余细胞的全部或一部分提供了所选细胞群，所选细胞群富集的克隆与其它克隆相比表达结合剂具有较高表面呈现的结合剂。从而能够鉴定所选细胞、克隆或群体与起始群体或文库相比且与未选定的细胞、克隆或群体相比具有更佳的可开发性特征。
如上文所提及，结合剂在细胞表面上的绝对数将变化，并且熟练的技术人员将确定系统在使用时的适合阈值。举例来说，阈值可以预先确定以在表达最高表面呈现的结合剂的群体内选择特定百分比的克隆，例如基于文库中的初始测试样品。可以设定阈值以选择例如前50％的细胞、前30％、前25％、前20％、前15％、前10％或前5％的细胞。
来自文库的代表性细胞样品的表面呈现水平已测定时，并且样品的拷贝数的峰值、中值、展度和/或四分位数间距已观察或计算时，能够设定适当的阈值拷贝数。使用FACS时，这将对应于每个细胞的阈值荧光强度，例如如果用于收集细胞的FACS阈值设定成收集中值荧光强度对应于样品峰值的文库细胞，则将收集具有所述荧光水平或更高的细胞。对于表面呈现水平的甚至更大富集来说，用于收集细胞的FACS阈值可以设定成收集荧光强度对应于样品中的75％细胞的荧光强度的文库细胞。
阈值可以表示每个细胞所呈现的至少约100,000、至少约500,000或至少约1,000,000的结合剂数量。
选择和富集
选择克隆、选择细胞或选择群体可以包括在实体上将克隆、细胞或群体与其它克隆或细胞分离或从更宽的群体或文库中分离出来。所选克隆、细胞或群体可以分离形式提供。
在选择包括实体分离多种细胞或克隆的情况下，这将典型地包括产生收集部分和丢弃部分。收集部分将富集展示具有已通过所述方法选择的特征的结合剂的克隆。富集意谓着这些克隆在群体中的相对丰度增加。富集是相对于选择步骤之前的细胞池或克隆池(例如文库或起始群体)来说的。通过在选择期间丢弃一部分细胞(例如展现结合剂存在较低表面呈现的细胞、具有较低亲和力的细胞等)，排除表达具有较少期望特征(例如不良可开发性特征)的结合剂的克隆。因此，作为选择步骤的结果，群体中的具有较少期望特征的细胞/结合剂的相对丰度减小。所选细胞的全部或一部分(收集部分)在必要时可以前送到进一步选择方法，并且任选地选择一种或多种克隆用于独立的个别培养。任选地，一种或多种所选细胞或结合剂或所选群体可以用于建立衍生物文库，如在本文别处所述。
选择克隆的收集部分时，所述方法的操作人员可以采用设定百分比或分率的“最好”或“最佳”克隆。这种原理的实施例已参照根据高度表面呈现进行的选择详细论述。应理解，当针对其它特征(例如对靶分子或非靶分子的结合)进行选择时，相同原理也适用。因此，当选择表达识别靶标的结合剂的克隆(例如亲和力选择)时，操作人员可以选择对靶标展现最高结合的设定百分比或分率的克隆(例如在使用经标记的靶标的方法中根据结合到克隆的可检测标记的数量所测量)。当选择表达对非靶分子显示减少的(或缺少的)非特异性结合的结合剂的克隆时，操作人员可以选择设定百分比或分率的对非靶分子展现最低结合的克隆(例如在使用经标记的非靶分子(例如本文提及的各种多反应性探针中的任一种)的方法中根据结合到克隆的可检测标记的数量所测量)。一般来说，当根据“良好”特征(例如表面呈现水平、对靶标的亲和力)进行正向选择时，人们将选择所述特征的水平高于其它克隆的克隆；而当针对“不良”特征(例如非特异性结合)进行选择时，人们将选择展现所述特征的水平低于其它克隆的克隆。
如在本文别处所论述，选择阈值可以由操作人员根据现有情形确定，并且可以根据对群体中的样品(例如来自文库的克隆的代表性样品)的初始评估来引导。在所期望特征的情况下，阈值可以设定成富集具有最高信号水平的克隆，例如前50％、前30％、前25％、前20％、前15％、前10％或前5％的细胞(例如基于所结合的可检测标记的数量，其代表着表面呈现水平或靶标结合水平，或基于如通过AC-SINS所测定的颗粒间距离，或基于溶液中的单体比例)。所选前％的克隆变成收集部分，而其它丢弃。在针对非期望特征进行选择时(例如基于结合到多反应性探针的可检测标记的数量，或基质上的阻滞程度以检测非特异性结合)，阈值可以设定成富集具有最低信号水平的克隆，例如选择一定百分比(例如50％、30％、25％、20％、15％、10％或5％)的展现最低数量的所结合可检测标记或基质上的最低阻滞程度的克隆。收集的实例百分比当然只是指导原则，并且只要操作人员遵守所述方法的原理，则数值精确度并不重要。
量化和测量差异
本发明的各种方法涉及比较结合剂和/或其编码克隆的特性，例如如下特性：呈现水平、结合、浓度(例如临界浓度)、溶解度极限等等。方法可以包括鉴定与群体中的其它结合剂相比(例如与一种或多种其它结合剂相比，或与群体平均值(均值)相比)更佳的结合剂，和/或一种或多种特征相对于他们所来源的亲本分子改善的结合剂。也可以与基准结合剂进行比较，在抗体实例中，基准结合剂可以是NIST RM 8671抗体(Saro D等人，所提出的NIST单克隆抗体的可开发性评估(Developability Assessment of a proposed NISTmonoclonal antibody)37)。用于选择和改善的期望特性论述于本文中别处且包括较大溶解度、较大临界浓度、较低非特异性结合和/或较高的靶标亲和力。相对术语，例如“较大”或“较小”、“较高水平”或“较低水平”、“较佳”或“较差”、“较多”或“较少”，通常是指相关实验背景下所观察到的差异，其允许基于其特性区分结合剂或克隆。差异可以具有统计显著性。差异可以任选地用％术语量化，例如至少10％、至少25％或至少50％的差异。或者，差异倍数可以认为是例如至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍或至少100倍。
靶标结合
可以选择结合到所关注的靶分子的结合剂，所关注的靶分子任选地可以是另一种多肽，例如受体、酶和/或疾病相关的多肽，例如肿瘤相关抗原。其它靶分子类别包括核酸、碳水化合物、脂质和小分子。示例性的结合剂和靶标详述于本文中别处。经典实例是抗体分子文库，其可以根据对所关注的靶抗原的结合来筛选。其它实例包括针对靶标MHC:肽复合物来筛选TCR文库或针对靶标TCR筛选MHC:肽复合物文库。
选择编码识别靶标的结合剂(同源结合剂)的克隆可以包括使如本文所述的展示文库与靶标接触，借此使结合剂暴露于靶标，从而允许同源结合剂(如果存在)识别靶标，并且检测靶标是否被同源结合剂识别。然后可以选择展示同源结合剂的一种或多种克隆。
靶标可以可溶形式提供。靶标可加以标记以有助于检测，例如其可以携带荧光标记或其可以生物素化。表达靶标特异性结合剂的细胞可以使用直接或间接标记的靶分子鉴定，其中结合剂捕捉经标记的分子。举例来说，经由结合剂:靶标相互作用结合到荧光标记的靶标的细胞能够通过流式细胞术检测和分选，以分离出所期望的细胞。涉及细胞测量术的选择要求靶分子被荧光直接标记或被能够用二级试剂检测到的分子标记，例如生物素化靶标能够添加到细胞中并且对细胞表面的结合能够被荧光标记的抗生蛋白链菌素(例如抗生蛋白链菌素-藻红蛋白)检测到。另一种可能性是使靶分子或结合到靶标的二级试剂固定于固体表面，例如磁珠或琼脂糖珠粒，以允许结合靶标的细胞富集。举例来说，经由结合剂:靶标相互作用结合到生物素化靶标的细胞能够在抗生蛋白链菌素涂布的底物(例如抗生蛋白链菌素涂布的珠粒)上分离。磁珠通过磁力回收珠粒而便于捕捉已经结合到生物素化抗原的细胞。最优靶标浓度可以预先确定或可以通过使用一系列浓度且与背景对照进行比较而凭经验确定。
根据对靶标的结合进行选择的方法包括根据细胞上的靶标结合水平将细胞分选到收集部分和丢弃部分中，借此将呈现所结合靶标高于预定阈值的细胞分选到收集部分中并且将所结合靶标低于预定阈值的细胞分选到丢弃部分中。阈值可以相对于不展示同源结合剂的阴性对照细胞设定。在FACS中，当分选展示同源结合剂和非同源结合剂的细胞时，典型地将观察到阴性对照峰。可以设定阈值，以便将展示荧光的水平在统计上显著高于阴性对照的所有细胞分选到收集部分，或可以选择较高阈值以在选择同源结合剂和较大富集展示同源结合剂的克隆时实现较大置信度。如已经参照细胞表面呈现结合剂的测定所论述，可以使用确定适合阈值的细胞样品执行校准。能够实现从非结合剂中富集结合剂。富集较高亲和力结合剂的方法在本文中别处进一步描述。
针对靶标进行的选择可以作为另一步骤并入本发明的其它方法之前或之后，或纳入本发明的其它方法内。通过诱发起始域突变构建变异体文库以改善可开发性的各方面(例如溶解度或低特异性或最优FcRn结合)，可能会有损于一些文库成员对靶标的结合(例如如果诱发接触CDR突变)。举例来说，根据结合剂呈现水平选择的克隆随后可以针对靶标选择。通过对以高度表面呈现水平展示同源结合剂的克隆使用协同选择，也能够同时测定表面呈现水平和靶标结合。此类方法可以包括如在本文中别处所述使用并有可检测标记的试剂测定结合剂呈现水平，并且可以进一步包括使结合剂暴露于靶标，其中所述靶标用第二试剂标记，所述第二试剂并有能够检测靶标结合的第二可检测标记。在使用荧光标记的情况下，可以利用FACS以同时根据结合剂呈现和靶标识别来分选细胞。可以选择发出不同波长的荧光的标记，以便能够区分其不同信号。因此，本发明的方法可以包括使用针对每一者的不同可检测标记协同检测结合剂呈现水平和靶标结合水平。在其它实施例中，在不测定细胞上的结合剂呈现水平的情况下检测靶标结合，例如使用经标记的靶标检测结合剂的步骤不包含使用结合结合剂恒定区的试剂检测结合剂呈现水平。
检测同源结合剂识别靶标之后，可以回收含有编码同源结合剂的DNA的所选克隆的细胞。然后可以鉴定编码结合剂的DNA，扩增且/或以分离的形式提供，借此获得编码识别靶标的结合剂的DNA。
多重选择
并行执行多重选择的构思能够扩展到基于本文所述的任何两个或更多个特征对细胞进行协同分选。在以上论述中，通过同时测定结合剂的表面呈现水平和结合剂结合靶标的水平以及协同选择展示展现较高表面呈现的同源结合剂的克隆来对细胞同时进行协同选择。还能够并行使用本发明的其它方法。方法可以包括同时测定以下中的任何两种或多种：
(i)表面呈现水平
(ii)非特异性结合到非靶分子的水平
(iii)靶标结合水平，
(iv)FcRn结合水平，
和相应地协同选择克隆。FACS使用发射不同波长的荧光的多重标记能够执行并行选择。
可以通过连续或并行执行多种类型的选择来获得优势和协同作用，例如将针对溶解度进行的选择与针对非特异性结合进行的选择组合。对文库中的克隆群体应用的每次选择产生的进化压力有利于满足选择标准(例如表面呈现水平高)的变异体。根据单一参数进行的重复选择可以将进化驱向这个特征(例如高溶解度)，但以其它质量(例如用于结合靶标的亲和力)为代价，使其它质量处于耗竭或损耗的风险中31。例如当使溶解度增加的突变也使亲和力减小时，这会发生。选择方法的审慎组合可以将群体的进化导向表达具有多重期望特征的多肽的克隆，从而允许在多肽药物所需的需求的完整范围内鉴定出性能最优(或至少可接受)的多肽。
可以在根据增加的表面呈现水平进行选择之前或之后执行针对非特异性结合的选择。举例来说，人们可以执行根据结合剂在溶液中的溶解度和/或对自缔合的抗性将结合剂区分或排序且/或富集在溶液中展现较大溶解度和/或较大自缔合抗性的结合剂的方法，从而产生所选克隆群体，然后从所选群体中筛选表达结合剂的克隆，所述结合剂对结合一种或多种非靶分子展现低倾向，借此鉴定出表达也具有低非特异性结合的结合剂的一种或多种克隆。
在一些实施例中，针对非特异性结合的筛选能够与针对表面呈现水平的筛选同时整合。举例来说，能够执行细胞双重暴露于(i)用于结合所呈现的所有结合剂的试剂，其携带可检测标记(例如荧光标记的抗Fc)；和(ii)一种或多种非靶分子(例如避免非特异性结合的肝素或其它分子)，其携带不同的可检测标记(例如不同荧光波长的可检测标记)。克隆的双重染色允许基于表面呈现水平和非特异性或脱靶结合来区分克隆。可以设定分选阈值以收集展现较大表面呈现水平和对非靶分子的结合较低的细胞。这将消除或至少减少具有不良可开发性的抗体在所选克隆中的发生率。
类似地，根据对非靶分子(例如肝素或避免非特异性结合到的其它分子)的结合进行的选择能够与根据FcRn结合进行的选择在本文所述的方法中组合。
在一些情形中，作为可开发性的某些方面的互相关联的结果，针对一种特征进行的选择(例如针对表面呈现水平高进行的选择)将富集具有多种有益质量的结合剂。举例来说，一些克隆可以表达与非靶分子(例如蛋白多糖)在细胞表面上相互作用的多反应性结合剂，例如他们可以非特异性结合到肝素。在高等真核细胞展示系统中，表达结合剂的细胞克隆本身可以表达相同或相似的非靶分子(例如细胞内源的蛋白多糖)，所产生的效应是表面展示的结合剂与细胞上所展示的一种或多种分子在细胞上发生非特异性相互作用。这会引起结合剂在细胞内内化，从而展现较低的表面呈现水平，从而取消选择表达其的克隆。在这种情况下，选择展示结合剂的较高表面呈现水平的克隆将并行富集或选择表达在多个方面具有更佳可开发性质量(例如较大可溶性和较小倾向于非特异性结合)的结合剂的克隆。
其不同实例是，通过富集自聚集倾向较低的结合剂，方法可以通过从选择中排除倾向于形成免疫原性聚集体的那些结合剂来促进选择体内免疫原性程度较低的结合剂(如果用于医药配制物)。
除此之外，如所提及，通过包括其它经标记的检测试剂(例如经标记的FcRn、经标记的靶标、经标记的其它多反应性探针)能够合并其它尺度的并行选择。一系列不同标记(例如不同波长的荧光团)的随时可用性，和FACS机器执行多重检测和分选的能力能够有助于此类并行选择的设计。
亲和力选择
选择针对靶标的结合剂时，能够基于亲和力选择结合剂通常是适用的，其允许富集表达高亲和力结合靶标的结合剂的克隆。
亲和力通常用KD(平衡解离常数)表示。KD是结合剂与其靶标(例如抗体与其抗原之间)之间相互作用的k(解离)/k(结合)比率。KD数值涉及结合剂的浓度并且因此，KD数值越低(浓度越低)，则结合剂的亲和力越高。以抗体识别其抗原的方式特异性识别其靶标的结合剂可以称为同源结合剂。同源结合剂识别靶标宜是高亲和力相互作用。结合剂:靶标相互作用的KD可以小于1μM，优选小于10nM。
本发明的方法可以包括从细胞群中富集编码(和呈现)针对靶标的较高亲和力结合剂的那些细胞。通过使用其上结合剂以相对较低拷贝数呈现的真核细胞能够增强选择的严格度，以驱动亲和力选择。选择结合到所关注靶标的结合剂的方法可以利用各含有编码结合剂的DNA的高等真核细胞克隆的文库，其中结合剂呈现于细胞表面上，其中所编码的结合剂从弱活性启动子表达且/或在细胞表面上以相对较低的拷贝数表达。这可以来自由弱活性启动子驱动的表达或是转录物不稳定性或非最优剪接、翻译、输送到表面或滞留于细胞表面上的结果。
提供高等真核细胞的浓稠悬浮液(例如107/ml，其具有高水平的表面呈现(例如6×105个结合位点/细胞呈现相对较高浓度的抗体(在此实例中为10nM))。在所述情形中，即使当使用低浓度抗原试图驱动选择严格度(例如0.1nM)时，抗体的高浓度也将驱动缔合，此限制了高亲和力克隆与低亲和力克隆之间的相对富集(参见实例8a和实例8b)。优选1nM或更小的结合剂输入浓度。即使细胞密度较低，在高密度的已固定结合剂存在下仍存在靶标再结合的潜在问题。这个问题在基于表面的亲和力测量(例如表面等离子体共振(BIAcore手册))中已得到特别充分的认知和记录，并且具有使高亲和力克隆与低亲和力克隆之间的差异性结合减少的作用。因此，拷贝数可以在例如每个细胞100-100,000范围内。在优选实施例中，拷贝数是每个细胞约60,000或更少，任选地是每个细胞约50,000或更少，或每个细胞约40,000或更少。为了促进检测，拷贝数可以是每个细胞至少100、至少1,000或至少10,000。因此，拷贝数可以在例如每个细胞1,000-60,000范围内。拷贝数和在表面呈现结合剂的背景下测定拷贝数的方法在本文中别处论述。
文库暴露于靶标(例如通过将靶标添加到文库中的表达结合剂的细胞的悬浮液中)，使结合剂与靶标接触，从而允许同源结合剂(如果存在)识别靶标。展示同源结合剂的细胞结合到靶标。通过使用浓度有限的靶标，较高亲和力结合剂优先与靶标结合。与展示较高亲和力结合剂的细胞相比，展示不识别靶标或以较低亲和力识别靶标的结合剂的细胞将不结合靶标或每个细胞展示较少的靶分子。然后能够分离出结合到靶标的细胞，借此选择富集展示同源结合剂的细胞的细胞群。
使用浓度降低的靶标能够任选地重复选择程序，以逐渐地增加选择严格度以及增加较高亲和力克隆的富集度。在进一步富集高亲和力结合剂之前，可以将突变引入所选群体的结合剂中以产生变异体。衍生物文库的产生在本文中别处描述。
所用靶标浓度可以低于所述方法设法分离的结合剂的KD相互作用。
然后能够选择对靶标具有所期望亲和力的一种或多种克隆，并且任选地，然后能够回收编码DNA且由个别培养的重组细胞表达结合剂，如在本文中别处所述。
为了在细胞上实现低水平的表面呈现，结合剂基因可以在低水平表达，例如可操作地连接到弱活性启动子或是转录物不稳定性或非最优剪接、翻译、输送到表面或滞留于细胞表面上的结果。诱导型启动子和其它可控表达系统详细地描述本文中别处。参见例如实例8a或实例8b。
文库
各含有编码结合剂的重组DNA的细胞克隆集合一同形成文库。文库多样性是克隆所编码的不同结合剂的数目的函数。在药物发现中，有利的是提供大型多样化文库，以使鉴定出满足所有期望标准的结合剂的潜在性最大化。文库中的每种克隆可以通过将编码结合剂的DNA整合到细胞DNA中形成重组细胞来产生，如在本文中别处所述。可以将DNA并行引入许多细胞中以产生重组细胞群，其各自编码来自多样化谱系的至少一种结合剂。将供体DNA整合到细胞DNA中之后，培养所得重组细胞以允许其复制，从而由初始产生的各种重组细胞产生细胞克隆。因此，每个克隆来源于一种其中整合(例如在通过位点特异性核酸酶或通过如本文所述的其它方法建立的整合位点处)有供体DNA的原始细胞。根据本发明的文库可以含有至少100、103、104、105、106、107、108、109或1010个克隆。
根据本发明的文库可以具有以下特点中的任何一种或多种：
多样性.文库可以编码且/或表达至少100、103、104、105、106、107、108或109种不同结合剂。不同序列的结合剂构成谱系。
均一整合.文库可以由克隆组成，所述克隆含有在固定基因座整合的供体DNA或在细胞DNA中的有限数目个固定基因座整合的供体DNA。因此，文库中的每种克隆优选地含有位于固定基因座处或固定基因座中的至少一个处的供体DNA。优选地，克隆含有在细胞DNA中的一或两个固定基因座整合的供体DNA。如在本文中别处所解释，整合位点可以存在于位点特异性核酸酶的识别序列处。整合供体DNA以产生重组DNA详细地描述于本文中别处并且能够根据整合位点的数目产生不同结果。在用于产生文库的细胞存在单一潜在整合位点的情况下，文库将是克隆的文库，所述克隆含有在单一固定基因座整合的供体DNA。文库中的所有克隆因此在细胞DNA中的相同位置含有结合剂基因。或者，在存在多个潜在整合位点的情况下，文库可以是克隆文库，其含有在多个和/或不同固定基因座整合的供体DNA。优选地，文库中的每种克隆含有在第一和/或第二固定基因座整合的供体DNA。举例来说，文库可以包括其中供体DNA整合于第一固定基因座的克隆、其中供体DNA整合于第二固定基因座的克隆，和其中供体DNA整合于第一与第二固定基因座的克隆。在优选实施例中，文库的克隆中仅存在一个或两个固定基因座，但是在特定应用需要时可以将供体DNA整合于多个基因座。因此，在一些文库中，每种克隆可以含有在若干个固定基因座中的任何一个或多个处(例如三个、四个、五个或六个固定基因座)整合的供体DNA。
对于含有在各别位点整合的结合剂亚单元的文库来说，所述文库的克隆可以含有在第一固定基因座整合的编码第一粘合剂亚单元的DNA和在第二固定基因座整合的编码第二结合剂亚单元的DNA，其中所述克隆表达包括第一与第二亚单元的多聚体结合剂。
均一转录.在文库的不同克隆之间，结合剂转录的相对水平保持在可控的限值内，原因是供体DNA整合于可控数目个基因座以及不同克隆中的相同基因座(固定基因座)。结合剂基因的相对均一转录使得结合剂在文库中的克隆上产生相似水平的表达或文库中的克隆表达结合剂的水平相似。文库中的细胞表面上所展示的结合剂可以与相同细胞上所展示的其它结合剂一致(具有相同氨基酸序列)。文库可以由以下组成：各自展示结合剂谱系中的单个成员的细胞克隆，或每个细胞展示结合剂谱系中的多个成员的克隆。或者，文库可以包括：展示结合剂谱系中的单个成员的一些克隆，和展示结合剂谱系中的多个成员(例如两个)的一些克隆。优选地，文库的克隆表达结合剂谱系中的一或两个成员。
举例来说，根据本发明的真核细胞克隆的文库可以表达至少103、104、105、106、107、108或109种不同结合剂的谱系，例如IgG、Fab、scFv或scFv-Fc抗体片段，每个细胞含有在细胞DNA中整合的供体DNA。供体DNA编码结合剂且可以进一步包括用于选择其中整合有供体DNA的细胞的基因元件。文库中的细胞可以含有编码外源位点特异性核酸酶的DNA。
文库中的细胞表面上所展示的结合剂可以与相同细胞上所展示的其它结合剂一致(具有相同氨基酸序列)。文库可以由以下组成：各自展示结合剂谱系中的单个成员的细胞克隆，或每个细胞展示结合剂谱系中的多个成员的克隆。或者，文库可以包括：展示结合剂谱系中的单个成员的一些克隆，和展示结合剂谱系中的多个成员(例如两个)的一些克隆。相应地，根据本发明的文库可以包括编码结合剂谱系中的超过一个成员的克隆，其中供体DNA整合于双重复固定基因座或多个独立固定基因座。
如果相应克隆仅表达一种结合剂，则最容易鉴定结合剂的相应编码DNA。典型地，供体DNA分子将编码单一结合剂。结合剂可以是多聚体，因此供体DNA分子包括与多聚体结合剂的不同亚单元对应的多个基因或开放阅读框架。
如所提及，根据本发明的文库可以编码至少100、103、104、105或106、107、108、109或1010种不同结合剂。在结合剂是多聚体的情况下，多样性可以由结合剂的一个或多个亚单元提供。多聚体结合剂可以是一个或多个可变亚单元与一个或多个恒定亚单元的组合，其中恒定亚单元在文库的所有克隆中是相同的(或多样性较有限)。在产生多聚体结合剂文库时，组合多样性是可能的，其中可以将第一谱系的结合剂亚单元与第二谱系的结合剂亚单元中的任一种配对。
本文中别处进一步描述了根据本发明的文库的这些和其它特点，并且适用于其构建和用途的文库和方法的实例也阐述于WO2015/166272(Iontas Limited)中，所述文献的内容并入本文中供参考。可以鉴定出适用于将编码DNA靶向整合于细胞染色体中的基因座，并且若干个实例在所属领域中已知。AAVS基因座可以如本文中所说明来使用。其它适合的整合位点包括ROSA26、HPRT和FUT8基因座(例如在CHO细胞内)。虽然靶向整合可以具有优势，但是随机整合是一种适合的替代方案并且可以用于许多情形中。除核酸酶介导的靶向整合之外，用于产生表面表达的多肽文库的方法还包括用编码多肽的载体转染真核细胞，例如使用慢病毒、腺病毒、腺相关病毒或转座子，或使用基因组嵌入式重组酶位点，例如Flp、Bxb2重组酶，或内源性隐蔽重组酶位点，例如φ重组酶位点。通过这些或任何其它技术建立的文库可以在本文所述的方法中使用。本发明扩展到纯形式的文库，其为缺乏其它真核细胞的文库克隆群体；或与其它真核细胞混合的文库。其它细胞可以是相同类型(例如相同细胞系)的真核细胞，或不同细胞。其它优势可以通过将根据本发明的两个或更多个文库组合或将根据本发明的文库与细胞的第二文库或第二群体组合来获得，以促进或拓宽筛选，或用于其它用途，如本文中所述或熟练的技术人员显而易知。
根据本发明的文库、从所述文库获得的一种或多种克隆，或编码来自文库的结合剂的DNA已引入其中的宿主细胞可以在细胞培养基中提供。可以培养细胞并且然后浓缩以形成用于方便运输或储存的细胞集结粒。
文库通常在体外提供。文库可以存在于容器中，例如含有悬浮于培养基中的文库细胞的细胞培养瓶，或包含真核细胞(包括文库)的集结粒或浓缩悬浮液的容器。文库可以构成容器中的真核细胞的至少75％、80％、85％或90％。选择步骤可以针对混合培养物中的文库执行，从而促进高通量。
作为协同培养文库的克隆的混合物的一个替代方案，个别地培养克隆有时可能是方便的，所述克隆各自独立地存在于各别烧瓶或其它容器中。可以使用个别培养物，其中对数目相对较少的克隆进行比较，例如其中亲本结合剂已经发生突变而产生一种或多种变异体(例如多达10种变异体)，并且利用本发明比较变异体的质量与亲本结合剂的质量和/或比较彼此间的质量。
本文所述的选择方法可以应用于初始文库，即，尚未经历基于亲和力的选择的文库。因此，在执行任何基于亲和力的选择之前，可以利用方法使文库富集具有较高溶解度和/或较低非特异性结合的克隆(反之，使文库中的展现低溶解度和/或较高非特异性结合的克隆耗竭)。已经根据较大可开发性克隆“预选”的此类文库然后高度适于使用所关注的靶标执行基于亲和力的选择。与从尚未根据可开发性预筛选的文库选出的克隆相比，亲和力选择步骤获得的克隆更可能展现良好溶解度、高临界浓度、低非特异性结合和/或其它可开发性质量。
真核细胞
根据本发明的真核细胞优选高等真核细胞，其在此定义为基因组大于酿酒酵母基因组的细胞，酿酒酵母具有12×106个碱基对(bp)的基因组尺寸。高等真核细胞可以具有例如大于2×107个碱基对的基因组尺寸。这包括例如哺乳动物、禽鸟、昆虫或植物细胞。本发明的真核细胞优选地缺乏细胞壁。优选地，他们不是酵母细胞或其它真菌细胞。所述细胞优选哺乳动物细胞，例如小鼠或人类。所述细胞可以是原代细胞或可以是细胞系。中国仓鼠卵巢(CHO)细胞通常用于抗体和蛋白质表达，但本发明可以使用任何替代的稳定细胞系。本文中的若干实例使用HEK293细胞。
由于制造用于研究、诊断和治疗应用的抗体典型地在这些细胞中进行，因此使用高等真核细胞(例如哺乳动物细胞)呈现结合剂具有优势。对展现相同表达环境和相同翻译后修饰的哺乳动物细胞实施药物发现将更好地给下游制造指出潜在问题或好处，从而允许早期鉴定出具有最优表达特性的克隆。
相比之下，细菌和酵母细胞不能充分地再现高等真核细胞的糖基化、表达和分泌机制。因此，在哺乳动物细胞上展示能够有助于鉴定出具有更佳呈现水平或稳定性特性、影响未来研究使用或下游制造的克隆。能够在哺乳动物细胞表面上展示大型抗体文库将允许根据结合和呈现特性直接筛选数百万个克隆，所述克隆具有在抗体开发的发现阶段期间使用制造细胞系的潜能。
CHO细胞系最初在1957年分离63且这种细胞系的衍生物已经成为大部分治疗抗体的生产细胞系64。举例来说，通过CHO细胞表达生产的赫赛汀(Herceptin)(已批准用于治疗乳癌的抗HER-2抗体)每年超过一公吨。与人类细胞相比，CHO细胞因其不传播大部分人类病原性病毒而具有用于生产供施用于人类的产品的优势。另外，他们允许外来DNA整合到其基因组中且快速稳定地生长。抗体和其它多肽结合剂的特性，包括生物物理学特性、稳定性药物动力学和免疫原性，能够受到其翻译后修饰的影响，例如糖基化65，所述翻译后修饰是在细胞的分泌路径内获取，例如内质网(ER)和高尔基体。在此，单糖单元，例如甘露糖(Man)、半乳糖(Gal)、岩藻糖(Fuc)、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)和唾液酸，共价连接到特定氨基酸。“O连接型”或“N连接型”糖基化是指连接到丝氨酸或苏氨酸残基中的氧原子的聚糖或连接到天冬酰胺残基中的酰胺氮原子的聚糖。糖基化的复杂度能够通过线性或分支化的糖基化以及单糖单元内的不同位置处的糖苷键联的原子位置和构象α或β)引入。用于表达的宿主细胞系能够影响到抗体糖基化特征的确切本质65。因此，在抗体和治疗蛋白筛选期间，在尽可能接近最终生产细胞系的宿主细胞系中生产重组蛋白是一种优势。这确保了待筛选的多肽的翻译后修饰和因此其特性与在其大规模制造期间获得的那些相同或尽可能相似。由于大部分人类治疗抗体是在CHO细胞中产生，因此在CHO宿主细胞系中进行高等真核展示是一种优势。实例12展现了对CHO细胞文库中的候选多肽药物进行基于可开发性的选择。
在本发明的方法和用途中，一般来说，多种细胞克隆可以是至少1000种克隆的文库，其任选地在单个容器内、在相同培养基中一起培养。其可以是初始文库，即，编码结合剂谱系的文库，所述结合剂谱系尚未预先根据对靶标的结合而经历选择。在早期发现中，情况通常如此，但使用编码结合剂谱系的文库可为所期望的，所述结合剂谱系是预先根据对靶标的结合进行一轮或多轮选择的结果。举例来说，可以将噬菌体展示文库的选择结果引入真核细胞文库中。
本发明在本说明书中具体参照哺乳动物细胞描述，并且在实例中使用哺乳动物细胞说明本发明。然而，除非上下文另外要求，否则应理解，可以改用其它高等真核细胞。举例来说，可以使用昆虫或鸡细胞。
结合剂
根据本发明的“结合剂”是一种结合分子，其代表着另一种分子的特异性结合搭配物。特异性结合搭配物的典型实例是抗体-抗原和受体-配体。本发明的许多原理扩展到在传统上可以不视为“结合剂”的多肽，例如酶、辅因子、凝血因子和其抑制剂、补体因子和其抑制剂等。在许多情况下，此类多肽代表着希望以大规模生产和/或以高浓度提供的候选临床药物。其可开发性质量因此是重要的考虑因素。举例来说，因子VIII用于血友病，但具有相当大的可开发性问题。本发明的与可开发性有关的方面能够应用于所有此类多肽。因此，除非上下文另外要求，否则本发明不应解释为受限于经典的特异性结合分子，如抗体，并且应理解为通常扩展到设计成与一种或多种其它分子相互作用的多肽。
本发明涉及作为多肽的结合剂，即，氨基酸的聚合物，其由编码DNA在细胞中表达并且任选地经历翻译后修饰，例如裂解、糖基化等。结合剂可以包括例如大约10到30个氨基酸的短肽。结合剂还可以是较长多肽并且可以任选地包括多个亚单元。
结合剂优选地包括哺乳动物(例如人类)起源的多肽。结合剂可以包括人类抗体(任选地为包括人类抗体的嵌合抗原受体(CAR))、人类TCR或其它受体，或其它人类多肽。结合剂可以是可溶性肽或多肽(例如细胞因子、趋化因子、补体蛋白质或补体调控剂、酶(包括用于工业用途的酶)、凝血因子(例如因子VIII))。结合剂可以是哺乳动物(例如人类)膜蛋白，或可以是已经工程改造以包括一个或多个TM域或其它膜锚的哺乳动物(例如人类)可溶性蛋白质/肽。结合剂可以是原生的、天然存在的多肽，或(通常)是合成变异体。举例来说，人类因子VIII多肽的文库可以包括与人类因子VIII具有至少70％氨基酸序列一致性(例如至少80％或至少90％)的结合剂。
由文库编码的结合剂谱系通常享有共同结构且具有一个或多个多样性区域。所述文库因此允许选择具有所期望的分子结构类别的成员，例如肽或scFv抗体分子。在根据本发明的结合剂的文库或群体中，结合剂多肽可以因此享有共同结构(例如相关的二级和/或三级结构，任选地包括高度相似或一致氨基酸序列的区域-“恒定区”)并且可以具有一个或多个氨基酸序列多样性区域-“可变区”。
考虑抗体谱系能够对此进行说明。这些可以是具有共同结构类别的抗体，例如IgG、Fab、scFv-Fc或scFv，其序列的一个或多个区域不同。抗体的互补决定区(CDR)典型地具有序列可变性，互补决定区是主要涉及抗原识别的区域。本发明中的结合剂谱系可以是一个或多个CDR不同的抗体分子的谱系，例如所有六个CDR中或一个或多个特定CDR(例如重链CDR3和/或轻链CDR3)中可存在序列多样性。
本文中别处更详细地描述了抗体和其它结合剂。然而，本发明的潜力扩展超出抗体展示而包括肽或工程化蛋白质(包括受体、配体、个别蛋白质结构域和替代蛋白质支架)的文库展示66-68。实例是具有单体结合域的多肽，例如锚蛋白重复蛋白(DARPins)和脂笼蛋白(lipocalins)、亲和抗体(affibodies)和肽呈现支架蛋白(adhirons)。本发明还能够结合复杂的多聚体结合剂使用。举例来说，T细胞受体(TCR)在T细胞上表达并且已经进化而识别在抗原呈现细胞上与MHC分子复合呈现的肽。可以产生编码且表达TCR谱系的文库，并且可以筛选以鉴定对MHC肽复合物的结合。
对于多聚体结合剂来说，编码结合剂的供体DNA可以作为一个或多个DNA分子提供。举例来说，在个别抗体VH和VL域分开表达的情况下，这些域可以在供体DNA的单独分子上编码。供体DNA在多个整合位点整合到细胞DNA中，例如VH的结合基因在一个基因座整合，而VL的结合基因在第二基因座整合。引入编码单独结合剂亚单元的供体DNA的方法更详细地描述于本文中别处以及WO2015/166272(Iontas Limited)，所述文献并入本文中供参考。或者，多聚体结合剂的亚单元或一部分均可以在供体DNA的同一分子上编码，所述供体DNA在固定基因座整合。
结合剂可以是包含抗原结合位点的抗体或非抗体蛋白质。抗原结合位点可以通过将肽环布置于非抗体蛋白质支架(例如纤维结合蛋白或细胞色素B等)上或通过使蛋白质支架内的环氨基酸残基随机化或突变以赋予针对所期望靶标的结合来提供。(Haan及Maggos(2004)BioCentury,12(5):A1-A669,70,。用于抗体模拟物的蛋白质支架公开于WO/0034784中，其中发明人描述了包括具有至少一个随机化环的纤维结合蛋白III型域的蛋白质(抗体模拟物)。一个或多个肽环(例如一组抗体VH CDR环)所植入的适合支架可以由免疫球蛋白基因超家族的任何结构域成员提供。支架可以是人类或非人类蛋白质。
抗原结合位点在非抗体蛋白质支架中的使用先前已有评述(Wess,L.于：《生物世纪：伯恩斯坦关于生物商业的报告(BioCentury,The Bernstein Report onBioBusiness)》，12(42)，A1-A7，2004)。典型的是具有稳定主链和一个或多个可变环的蛋白质，其中所述一个或多个环的氨基酸序列发生特定或随机突变以建立用于结合靶抗原的抗原结合位点。此类蛋白质包括来自金黄色葡萄球菌的蛋白质A的IgG结合域、运铁蛋白、四连接素(tetranectin)、纤维结合蛋白(例如第10个纤维结合蛋白III型域)和脂笼蛋白。其它方案包括限制性小肽(例如基于“打结素(knottin)”)和环肽支架71。鉴于其小尺寸和复杂性(尤其关于二硫键的正确形成)，因此使用真核细胞选择基于这些支架的新颖结合剂可能存在优势。鉴于这些肽在自然界中的共同功能，因此基于这些支架的结合剂的文库可能有利于产生特别适用于阻断离子通道和蛋白酶的高亲和力小结合剂。WO2017/118761(IontasLimited)描述了各自包含融合蛋白的结合成员的文库，所述融合蛋白含有插入受体多样性支架域(例如抗体恒定或可变域)内的供体多样性支架域，例如富含半胱氨酸的蛋白质。如WO2017/118761中所述的此类结合剂和文库可以用于本发明并且所述文献并入本文供参考。因此，在一些实施例中，根据本发明的结合剂是“打结抗体”，其包括插入抗体可变域内的富半胱氨酸蛋白质。参见本文中的实例15。
除抗体序列和/或抗原结合位点之外，结合剂还可以包括其它氨基酸，例如形成肽或多肽，例如折叠域，或赋予分子除结合抗原能力之外的另一种功能特征。结合剂可以携带可检测标记，或可以与毒素或靶向部分或酶偶联(例如经由肽键或接头)。举例来说，结合剂可以包括催化位点(例如酶域中的催化位点)以及抗原结合位点，其中所述抗原结合位点结合到抗原并且从而使催化位点靶向抗原。催化位点可以抑制抗原的生物功能，例如通过裂解。
任选地，文库中的结合剂是多肽群体，其热稳定性(例如根据解链温度所测定)不能预测结合剂在溶液中的溶解度或自缔合抗性。当考虑文库中的具有至少10mg/ml的溶解度或临界浓度(测定方法在本文中别处描述)的所有结合剂时，可以应用热稳定性与溶液中的溶解度/自缔合抗性之间的这种无关。当考虑表面呈现为每个细胞至少103个、至少104个、每个细胞至少105个或每个细胞至少106个的所有结合剂(测定方法描述于本文中别处，例如FACS设门)时，其可为适用的。任选地，当考虑文库中的表面表达结合剂的总群体时，其可为适用的。
抗体
抗体是优选的结合剂。它们可能是完整的抗体或免疫球蛋白(Ig)，具有四个多肽链-两条相同的重链和两条相同的轻链。重链和轻链形成对，每个对具有包含抗原结合位点的VH-VL域对。重链和轻链还包含恒定区：轻链CL以及重链CH1、CH2、CH3和有时CH4。两条重链在柔性铰链区通过二硫键连接。抗体分子可以包含VH和/或VL域。
抗体分子的最常见原生形式是IgG，其为由两条相同重链和两条相同轻链组成的异四聚体。重链和轻链是由具有保守二级结构的模块化结构域构成，所述模块化结构域由以下组成：四链逆平行β片层和三链逆平行β片层，其通过单个二硫键稳定。抗体重链各自具有一个N端可变域(VH)和3个相对保守的“恒定”免疫球蛋白域(CH1、CH2、CH3)，而轻链具有一个N端可变域(VL)和一个恒定域(CL)。二硫键使个别结构域稳定且形成共价键以将四条链接合成稳定复合物。轻链的VL和CL与重链的VH和CH1缔合，并且这些元件能够单独表达以形成Fab片段。CH2和CH3域(也称为“Fc域”)与另一对CH2:CH3对缔合，得到四聚体Y形分子，其中来自重链和轻链的可变域位于“Y”的尖端。CH2和CH3域负责与免疫系统中的效应细胞以及补体组分发生相互作用。重组抗体先前已以IgG形式或Fab(由VH:CH1的二聚体和轻链组成)表达。此外，可以使用称为单链Fv(scFv)的人工构建体，其由编码VH和VL片段的DNA与编码柔性接头的DNA以基因方式融合而组成。
IgG是用于治疗用途的优选抗体类别之一。使用高等真核细胞(尤其是哺乳动物细胞)的一个优势是，它可以与IgG形式的抗体一起发挥作用。这使得药物发现和筛选能够直接在用于制造IgG的生产细胞类型中进行。
结合剂可以是人抗体分子。因此，在存在恒定域的情况下，这些优选人恒定域。
结合剂可以是抗体片段或较小的抗体分子形式，例如单链抗体分子。例如，抗体分子可以是scFv分子，其由通过接头肽连接的VH域和VL域组成。在scFv分子中，VH和VL域形成VH-VL对，其中VH和VL的互补决定区共同形成抗原结合位点。
包含抗体抗原结合位点分其它抗体片段包括(但不限于)(i)Fab片段，其由VL、VH、CL和CH1域组成；(ii)Fd片段，其由VH和CH1域组成；(iii)Fv片段，其由单一抗体的VL和VH域组成；(iv)dAb片段72-74，其由VH或VL域组成；(v)分离的CDR区；(vi)F(ab’)2片段，一种包含两个相连的Fab片段的二价片段；(vii)scFv，其中VH域与VL域通过肽接头连接，所述肽接头允许两个结构域缔合而形成抗原结合位点75,76；(viii)双特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09965)和(ix)“双功能抗体”，通过基因融合构建的多价或多特异性片段(WO94/1380477)。Fv、scFv或双功能抗体分子可以通过并入连接VH和VL域的二硫桥来稳定化78。
包括一个或多个抗体抗原结合位点的各种其它抗体分子已经工程改造，包括例如Fab2、Fab3、双链抗体、三链抗体、四链抗体和微型抗体(小免疫蛋白质)。抗体分子以及其构建和使用方法已有描述79。
结合片段的其它实例是Fab’，其与Fab片段不同之处是重链CH1域的羧基端添加了几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸；并且不同于Fab’-SH，其是恒定域的半胱氨酸残基具有游离硫醇基的Fab’片段。
dAb(域抗体)是抗体的小单体抗原结合片段，即，抗体重链或轻链的可变区。VHdAb天然地存在于骆驼科(例如骆驼、大羊驼)中并且可以通过用靶抗原使骆驼科免疫、分离抗原特异性B细胞且直接克隆来自个别B细胞的dAb基因来产生。dAb也能在细胞培养中产生。其小尺寸、良好溶解度和温度稳定性使得其在生理学上特别适用且适于选择和亲和力成熟。用于治疗用途的骆驼科VH dAb正以名称“纳米抗体TM”开发。
通过从借助于在适合的表达载体内合成和组装寡核苷酸而产生的基因表达可以建立合成抗体分子，例如Knappik等人或Krebs等人所述80,81。
双特异性或双功能抗体形成第二代单克隆抗体，其中两个不同可变区组合成同一分子63。其用途在诊断领域和治疗领域中已凭其募集新效应功能或使若干分子靶向肿瘤细胞表面的能力得到证明。在使用双特异性抗体的情况下，这些抗体可以是传统双特异性抗体，其能够以多种方式制造，例如以化学方式或由杂交融合瘤制备，或可以是上文所提及的双特异性抗体片段中的任一个82。这些抗体能够通过化学方法83,84或体细胞方法85,86获得，但类似地且优选地通过基因工程技术获得，所述基因工程技术迫使异二聚发生并且因此促进了所寻求抗体的提纯过程87。双特异性抗体实例包括BiTETM技术的那些抗体，其中能够使用具有不同特异性的两种抗体的结合域且其通过短柔性肽直接连接。这是两种抗体在单个短多肽链上的组合。双链抗体和scFv能够在没有Fc区的情况下仅使用可变域构建而成，潜在地减少了抗个体基因型反应的影响。
在本发明的一些实施例中，结合剂是双特异性抗体并且其编码克隆包含两条不同抗体重链和任选的两条不同抗体轻链或优选一条共同轻链。重链之间成功的异二聚对引起细胞表面呈现双特异性抗体，各抗体包含重链的异二聚对，并且任选地，每条重链与一条轻链成对，任选地与一条共同轻链成对(即，轻链与具有相同氨基酸序列的每条重链成对)。在包括Fc区的情况下，本发明可以用于评估可能会改善异二聚的Fc序列变异体。在此前的研究中，在Fc区已经工程改造以改善异二聚的情况下，可开发性特征已因变化而受损67。本发明提供了根据可开发性(例如溶解度和多特异性)以及其异二聚潜力筛选此类变异体的机会。
双特异性抗体能够作为完整IgG、作为双特异性Fab’2、作为Fab’PEG、作为双链抗体或作为双特异性scFv构建而成。另外，使用所属领域中已知的常规方法能将两种双特异性抗体连接以形成四价抗体。
与双特异性全抗体相反，双特异性双链抗体也可以是特别适用的。能够容易地选择具有适当结合特异性的双链抗体(和许多其它多肽，例如抗体片段)。如果双功能抗体的一个臂欲保持恒定(例如针对所关注抗原的特异性)，则能够制备其中另一臂改变的文库且选择具有适当特异性的抗体。双特异性全抗体可以通过如以下文献中所述的替代工程化方法制备：Ridgeway等人(《蛋白质工程(Protein Eng.)》，9，616-621，(1996))。
双特异性抗体的替代形式包括包含免疫球蛋白的mAb2(“mAb平方”)分子，所述免疫球蛋白的CH3环区已经工程改造以提供抗原结合位点(参见例如WO2006072620、WO2008003103、WO2008003116)。经修饰的CH3区域称为Fcab。Fv区的抗体抗原结合位点提供了一种结合特异性，而Fcab中的结合位点提供了不同结合特异性(或其它价数)。
根据本发明的文库可以用于选择结合所关注的一种或多种抗原的抗体。从文库中选择详细地描述于本文中别处。在选择之后，抗体可以经工程改造成不同形式和/或含有其它特点。举例来说，可以将所选抗体转化成不同形式，例如上述抗体形式之一。所选抗体和包含所选抗体分子的VH和/或VL CDR的抗体是本发明的一个方面。抗体和其编码核酸可以分离的形式提供。
以抗体分子为起始物，利用例如酶(例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)消化等方法和/或通过化学还原使二硫桥裂解能够获得抗体片段。通过所属领域的技术人员众所周知的基因重组技术或通过肽合成、借助于例如自动肽合成仪或通过核酸合成和表达能够以另一方式获得抗体片段。
可以采用单克隆抗体和其它抗体以及使用重组DNA技术中的技艺生产出结合靶抗原的其它抗体或嵌合分子。此类技术可能会涉及将编码抗体的免疫球蛋白可变区或CDR的核酸(例如DNA)引入不同免疫球蛋白的恒定区，或恒定区和构架区。参见例如EP-A-184187、GB 2188638A或EP-A-239400，和大量后续文献。
抗体分子可以选自文库并且然后加以修饰，例如通过化学修饰(例如聚乙二醇化)或通过并入脂质体能够延长抗体分子的体内半衰期。
结合剂可以包括展现序列多样性、任选地在一个或多个互补决定区中展现序列多样性的抗体可变域。结合剂还可以或替代地包含任选地展现序列多样性的抗体恒定区或Fc区。Fc区的特点进一步论述于下文。
Fc区
结合剂可以是包含Fc区的多肽。结合剂可以是包含Fc区的抗体、打结抗体或其它多肽，任选地为融合蛋白。Fc区可以是或可以包括结合剂的恒定区，即，具有高度相似或一致的氨基酸序列，如在文库的结合剂之间所比较。在一些情况下，抗体的恒定域(例如Fc区，或CL或CH1域)可以是或可以包括可变氨基酸序列，从而在文库中的结合剂谱系中展现序列多样性。序列多样性可以任选地存在于Fc的CH3域中。举例来说，结合剂可以包括Fcabs或mAb2，其中Fcabs的结合环在文库内具有多样性。mAb2可以包括多种多样的Fcab区域和Fv区域中的非变异或多种多样的抗原结合位点。结合剂的氨基酸序列多样性可以局限于Fc区，任选地局限于CH3域。
使用本发明的展示文库，可以根据改变的功能且根据可开发性标准(任选地同时根据改变的功能和可开发性标准)筛选Fc域文库。
已经采取多种工程化方案对Fc域与其相互作用搭配物的相互作用进行工程改造。举例来说，“臼包杵”方案修改了两个成对Fc序列，使得其在细胞中的共表达(或其在共培养的细胞中的表达)主要引起两个变异型Fc域之间形成异二聚体，从而有利于产生双特异性抗体。不幸的是，此类突变会影响可开发性88。本发明可以用于评估Fc变异体(包括含有候选“臼包杵”突变的Fc域)的可开发性潜力。
Fc工程化还已经用于改变Fcγ受体的亲和力或特异性，例如建立Fcγ受体相互作用减少的“剔除式变异体”。
抗体恒定域的突变和具有所期望结合质量的变异体的选择能够降低稳定性和可制造性。另外，本发明可以用于评估变异型Fc域的文库以富集具有改善的特性的那些变异型Fc域。
出于正向或负向调节半衰期的目的，也已经进行修饰以增加或减小Fc与FcRn的相互作用89。举例来说，M252Y/S254T/T256E的突变三联体(所谓的“YTE突变”)已经增加IgG半衰期，从而延长半衰期且减少给药频率和成本。
应认识到，突变引入Fc域也能对变异体的生物物理学特性产生有害的影响，引起聚集和不良可开发性。举例来说，Borrok等人(2017)90评述了影响与FcRn相互作用的突变和影响与其它Fc受体相互作用的突变。他们描述了一种抗体，所述抗体将增加半衰期的突变(M252Y、S254T、T256E，所谓的“YTE突变”)和减少CH2域与Fcγ受体相互作用的其它突变(L234F、L235E、P331S，所谓的TM突变体)组合90。与野生型相比，此TM-YTE突变体具有降低的热稳定性、较大的构象柔性、增加的自缔合、不良的溶解性和不良的聚集特征。通过选择候选突变，他们能够建立新的FQQ-YTE变异体(L234F/L235Q/K322Q/M252Y/S254T/T256E)，所述变异体具有显著改善的构象和胶体稳定性，同时保持延长的半衰期且不具有抗体依赖性细胞介导的细胞毒性和补体依赖性细胞毒性活性。
本发明提供了根据Fc域的改变的结合特性以及可开发性标准(例如自聚集或低特异性)同时筛选大量变异体的机会。因此，在本发明的各种实施例中，结合剂可以包括展现序列多样性(例如在CH3域的一个或多个氨基酸残基中展现序列多样性)的Fc区。Fc域外部的一个或多个可变区(例如抗体重链可变域和/或轻链可变域)中展现序列多样性且任选地具有未变异序列的恒定Fc域的的结合剂也可以加以筛选以鉴定可变区序列对FcRn相互作用的影响(参见实例9)。在可变区不直接结合到受体的情况下，此类影响可以是间接的，例如影响分子的构象或以其它方式较远地影响结合。
可以将根据多肽的FcRn结合特征进行的筛选整合于药物发现中。方法可以包括在序列变异体的文库内根据最优的pH依赖性FcRn相互作用进行选择。本文描述了鉴定或选择因与FcRn的相互作用的性质而使得体内半衰期延长或缩短的结合剂。
根据本发明的方法可以包括：
提供多种真核(例如哺乳动物)细胞克隆，其各自含有编码包含Fc域的结合剂的DNA，
在体外，在使所述结合剂呈现于细胞表面上的条件下培养所述克隆，
使所述克隆在低pH(例如约pH 6.0)或中性pH(例如约pH7.4)暴露于FcRn受体，以允许Fc域识别FcRn，
在较高pH(例如约pH 7.4)洗脱并且选择表达结合剂的一种或多种克隆，所述结合剂在约pH 6.0展现的亲和力结合高于在较高pH(例如约pH 7.4)展现的结合。
所选克隆能够从洗脱部分获得。来自所洗脱的克隆的结合剂可以鉴定为在体内具有延长的半衰期。
或者，如果期望在较高pH的结合得以保持，则可以收集在切换到较高pH之后滞留的结合剂，例如为了缩短半衰期或用于“扫描抗体”方案32。在此类情况下，所述方法可以包括：
提供多种真核(例如哺乳动物)细胞克隆，其各自含有编码包含Fc域的结合剂的DNA，
在体外，在使所述结合剂呈现于细胞表面上的条件下培养所述克隆，
使所述克隆在低pH(例如约pH 6.0)暴露于FcRn受体，以允许Fc域识别FcRn，
在较高pH(例如约pH 7.4)下洗涤并且选择表达结合剂的一种或多种克隆，所述结合剂在约pH 6.0展现的亲和力结合低于或类似于在较高pH(例如约pH 7.4)展现的结合。
所选克隆能够从在较高pH洗涤的情况下未洗脱的滞留部分中获得。此类克隆能够在更极端的pH(高于pH 7.4或低于pH 6)洗脱。可以选择在较低pH(例如约pH 6.0)下进行较高亲和力结合，以便在选择期间，通过减小在所述pH使用的FcRn的浓度来增加选择的严格度。
可以优先选择在两个pH之间展现较大亲和力差异的结合剂，原因是这些结合剂可以显示最大的半衰期延长。反之，如果寻求较短半衰期，则选择表达结合剂的克隆，所述结合剂在两个pH之间对FcRn的亲和力存在较小差异(或无显著差异)。所述方法因此可以适于根据较短或较长半衰期进行选择。从而在克隆群体中富集表达具有所期望的半衰期的结合剂的克隆。
对生物素化FcRn的结合可以在pH 6.0进行以确保结合发生，然后用pH增加的缓冲液洗涤之后，收集洗脱的样品。或者，可以使用流式分选、根据荧光标记的滞留或损失进行选择。基于FcRn的亲和色谱方法联合pH梯度洗脱已被描述91用于表征抗体。此类方法可以用于细胞上所展示的抗体变异体的文库，其中可以收集具有所期望的pH依赖性结合特性的克隆并且回收抗体基因。
本发明的一些实施例使用抗Fc检测试剂测定结合剂的表面呈现水平。此类试剂仍然可以联合具有Fc序列多样性的结合剂使用，条件是所述多样性不影响可检测试剂的结合，例如能够确保检测试剂结合Fc区时，其中结合剂享有共同序列。在替代实施例中，结合剂包含不展现序列多样性的Fc区。
细胞培养和结合剂表达
为了提供针对所关注的靶标和/或根据可开发性特征筛选用的结合剂谱系，可以培养从编码DNA表达结合剂的文库。如所论述，结合剂可以含有跨膜域、膜锚，或可以与膜结合的搭配物分子缔合用于细胞外展示。培养用于表达结合剂的细胞通常涉及在适合的培养基中、任选地在悬浮培养基中且在有助于细胞生长的温度(例如37摄氏度，对于哺乳动物细胞来说)下培育细胞。从编码DNA表达多肽结合剂是在启动子(和任选地，其它元件，例如增强子)的控制下起始，并且在一段时间之后开始观察到结合剂的表面呈现，并且在例如12小时内应该是可检测的，但结合剂呈现可能需要更长的持续时间(例如24小时或48小时)以在细胞表面上达到最终或平衡浓度。
启动子
在根据本发明的细胞中，编码结合剂的DNA可操作地连接到启动子以便表达。可以使用异源启动子，这意味着其不是自然界中与编码DNA有关的启动子，例如可以使编码抗体的DNA可操作地连接到除来自免疫球蛋白基因座的启动子之外的启动子。通常方便的是将启动子整合到细胞DNA中，任选地以顺式整合(与编码结合剂的序列位于同一供体DNA上)，但替代方式是从宿主细胞内源的启动子表达所整合的结合剂DNA。
在编码结合剂的DNA的表达处于强启动子(例如已经最大限度地诱导表达的组成型启动子或诱导型启动子)控制下的情况下，可以实现高水平的结合剂呈现。反之，在编码结合剂的DNA的表达处于弱活性启动子(例如已经最低限度地诱导表达或仅展现基本活性水平的弱启动子或诱导型启动子)控制下的情况下，可以实现低水平的结合剂呈现。启动子的强度能够使用报道基因量化并且测定报道体的表达水平(例如GFP的表达)能够作为可以量化的荧光检测。与CMV启动子相比，弱活性或弱启动子可以显示例如全部活性或组成型启动子的活性的约1-10％。
控制细胞表面呈现结合剂的方便方法是提供在细胞中可操作地连接到编码结合剂的DNA的诱导型启动子。四环素诱导型启动子是适合的，并且多种这些启动子是可获得的。Gossen等人描述了第一代rtTA蛋白质(EP0804565和Gossen等人，199592)。将VP16活化域与来自大肠杆菌的突变型Tet抑制因子融合以产生转录反式活化剂“rtTA”，其特异性DNA结合需要某些四环素(Tc)衍生物。多西环素(Doxycycline)是这种系统的诱导剂，并且其添加到其中基因表达处于rtTA控制下的所培养细胞中能够使诱导型启动子表达增强1000倍。第二代“TetO/CMV”启动子，命名为pTight或Ptet-14，其使用优化的7TetO间距和截短的最小CMV启动子设计，展现了降低的基础表达水平(克隆技术：pTRE-Tight载体(Clontech:pTRE-Tight Vectors)，《克隆技术(Clontechniques)》2003，18(3):13-14)。启动子序列是：
TTCGTCTTCACACGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGTCGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGATGTCGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGTCGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGTCGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGTCGAGTTTATCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGTCGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGTCGAGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCC
这种诱导型启动子或多种其它可调节启动子可以在本发明中用于控制结合剂呈现水平。可以使用任何诱导型系统，其中DNA结合域与能够结合诱导剂分子的蛋白域融合，引起蛋白质构象变化或DNA识别序列的亲和力变化。这将引起转录的去抑制或活化，促成蛋白质表达。举例来说，在T-Rex或二甲氨基二硫代甲酸铜(cumate)开关系统的情况下，诱导剂结合到抑制因子蛋白质引起DNA结合损失和转录的去抑制。或者，诱导剂结合到与转录活化域融合的DNA结合域(融合蛋白)将引起DNA结合和转录因子的募集，对于Tet-on92,114或GAL4 GeneSwitch系统121来说，情况如此。
上文提到的四环素诱导型启动子系统可以转化成更和谐、均一且可滴定的诱导，这是通过使TetO重复序列的数目减少到一与六之间118或通过修饰rTA蛋白质来达成。实例8b描述了第三代诱导型tet启动子系统，其实现了改善的表达范围。细节绘示于图37中。还可以使用替代的诱导型表达系统，包括二甲氨基二硫代甲酸铜开关119、T-Rex120或GAL4系统121。
结合剂和编码核酸的回收
从文库中选择所关注的结合剂或克隆之后，共同的下一个步骤将是分离、鉴定和/或扩增编码结合剂的核酸(例如DNA或RNA)。任选地，可能希望修饰编码结合剂的核酸，例如重构结合剂和/或将编码序列插入不同载体内。编码所展示结合剂的核酸(DNA或RNA)能够从所选细胞中回收，克隆到表达载体中并且所编码的多肽以分泌形式表达或用于展示。这能够对个别克隆进行。
当供体DNA分子群体用于建立含有相同序列的多个拷贝的文库时，可以获得含有编码相同结合剂的DNA的两种或更多种克隆。情况也可能是克隆可以含有编码超过一种不同结合剂的供体DNA，例如位点特异性核酸酶存在超过一种识别序列时，如在本文中别处所详述。因此，文库的多样性(按照所编码或表达的不同结合剂的数目)可以不同于所得克隆的数目。
文库中的克隆优选地含有编码结合剂谱系中的一种或两种成员的供体DNA且/或优选地表达结合剂谱系中的仅一种或两种成员。当要鉴定克隆和/或编码特定结合剂(针对指定靶标筛选文库时所鉴定)的DNA时，每个细胞有限数目个不同结合剂是一种优势。当克隆编码结合剂谱系中的单个成员时，这是最简单的。然而，如果选自文库的克隆编码少数不同结合剂(例如克隆可以编码结合剂谱系中的两个成员)，则也可以直接鉴定所期望结合剂的相关编码DNA。如本文中别处所论述，编码一种或两种结合剂的克隆特别方便地通过选择位点特异性核酸酶的识别序列来产生，由于二倍体细胞含有双重复固定基因座(每个染色体拷贝存在一个)，因此所述识别序列在二倍体基因组中的每个染色体拷贝中存在一次，并且供体DNA可以整合于一个或两个固定基因座。因此，文库的克隆可以各自表达结合剂谱系中的仅一个或两个成员。
在结合剂是抗体分子的情况下，方法可以包括从克隆的细胞中分离出编码抗体分子的DNA、扩增编码至少一个抗体可变区(优选VH和VL域)的DNA，以及将DNA插入载体中以提供编码抗体分子的载体。具有恒定域的多聚体抗体分子可以转化成单链抗体分子以便以分泌的可溶形式表达。抗体可以不同形式呈现，但无论哪一种形式均使抗体得到选择，一旦分离出抗体基因，则可以将其再配置成许多不同形式。一旦分离VH或VL域，则能够将其再克隆到包含所需搭配物结构域的表达载体中。
可以将编码所选结合剂的DNA整合于宿主细胞染色体中用于表达。重组蛋白的表达典型地涉及将编码所期望蛋白质的基因引入细胞中置于所述细胞表达的启动子控制下。举例来说，所述基因可以处于细胞巨大病毒增强子/启动子的控制下并且可以引入哺乳动物细胞，例如常用的人类胚肾293(HEK293)细胞或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。将表达构筑体引入宿主细胞中的标准方法是众所周知的。为了产生分泌型可溶性蛋白质，将前导序列置于所编码的基因之前，从而将所编码的蛋白质导向内质网。在缺乏跨膜域的情况下，所编码的基因分泌到培养基中，从培养基中提纯且浓缩。
所期望的结合剂可以遵循本发明的任何方法，以分离的形式在溶液中提供，例如在从稳定转染以便表达结合剂的宿主细胞中分泌之后。然后可以测试可溶性结合剂的特性以证实其性能，例如评估可开发性性状，例如溶解度、自缔合、非特异性结合、FcRn相互作用等，或评估亲和力。适用于测定这些特点中的每一个的分析提供于本文的相关章节中，并且可以实施以证实结合剂展现所期望的特性且/或显示相关特征改善，例如其与亲本分子相比改善。
结合剂的医药配制物
使用本发明方法获得的结合剂可以提纯且/或分离的形式提供，并且可以配制成包含一种或多种额外组分的组合物。组合物可以含有适合的载剂、赋形剂和并入配制物中以改善传递、递送、耐受性等的其它试剂。实例配制物描述于《雷氏药学大全(Remington’sPharmaceutical Sciences)》。旨在体内使用的结合剂可以根据所期望的施于患者的途径配制，例如注射液(任选地为水溶液)。各种递送系统是已知的，并且能够用于施用包含结合剂的医药组合物。施用方法包括皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。组合物可以通过任何方便的途径施用，通过输注或大剂量注射，通过上皮或粘膜皮肤内层(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收来施用，并且可以与其它生物活性剂一起施用。施药可以是全身的或局部的。
结合剂或包含结合剂的组合物可以装在医疗容器中，例如小瓶、注射器、IV容器或注射装置。在一个实例中，提供了一种试剂盒，其包括结合剂、包装和治疗方法的使用说明书。所述方法可以包括皮下施用于患者。
可以将结合剂配制成组合物，任选地配制成水性缓冲溶液，其包含浓度为至少(或高于)以下的结合剂：50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml或100mg/ml。结合剂的浓度可以是50-200mg/ml之间，例如50-150mg/ml之间，例如50与100mg/ml之间。
用于浓缩所表达的重组蛋白的许多方法已为所属领域的技术人员所知，而且可以包括柱色谱(例如亲和色谱、离子交换色谱)和超滤27。
条项
以下编号的各项代表着本发明的声明并且是说明书的一部分。
1.一种结合剂在体外培养的高等真核细胞上的表面呈现水平作为所述结合剂在溶液中的溶解度和/或其自缔合抗性的预测指标的用途。
2.根据第1项的用途，其中所培养的细胞是表达结合剂的多样化谱系的展示文库的克隆。
3.一种高等真核细胞的培养文库用于体外选择结合剂以实现在溶液中的较高溶解度和/或较低自缔合倾向的用途，
其中所述文库是各含有编码结合剂的DNA的高等真核细胞克隆的文库，其中已编码的所述结合剂呈现于细胞表面上。
4.一种结合剂发现方法，其中结合剂在展示文库的已培养高等真核细胞克隆表面上的表面呈现水平是用作所述结合剂在溶液中的溶解度和/或其自缔合抗性的预测指标。
5.一种根据结合剂在溶液中的溶解度和/或自缔合抗性将它们区分或排序和/或富集在溶液中展现较大溶解度和/或较大自缔合抗性的结合剂的方法，其包括(i)提供各含有编码结合剂的DNA的高等真核细胞克隆的文库，
(ii)在用于表达所述结合剂的条件下体外培养所述克隆，其中所述结合剂呈现于细胞表面上，
(iii)测定所述结合剂在所述克隆上的表面呈现水平，任选地通过用并有可检测(例如荧光)标记的试剂标记所述结合剂来测定，
(iv)选出相较于其它克隆展现结合剂存在更高的表面呈现的一种或多种克隆，以及
(v)鉴定出由所述一种或多种所选克隆编码的在溶液中具有良好溶解度和/或自缔合抗性的结合剂，且任选地提供所选克隆用于一个或多个进一步筛选步骤。
6.根据第1项到第3项中任一项的用途，或根据第4项或第5项的方法，其中所述结合剂是含有跨膜域的多肽。
7.根据第4项或第5项的方法，包括通过用并有可检测(例如荧光)标记的试剂标记所述结合剂来测定所述结合剂在所述克隆上的表面呈现水平，其中所述试剂结合到所述结合剂的恒定区，任选地其中所述结合剂包括Fc区且所述试剂结合到所述Fc区。
8.根据第4项到第7项中任一项的方法，包括根据结合剂在细胞上的表面呈现水平将细胞分选到收集部分和丢弃部分，其中将展示表面呈现大于预定阈值的细胞分选到所述收集部分并且将展示表面呈现低于所述预定阈值的细胞分选到所述丢弃部分。
9.根据第8项的方法，其中丢弃部分包括表达临界浓度为至少10mg/ml的比较多肽的细胞，且其中所述收集部分包括表达临界浓度为所述丢弃部分中的所述比较多肽的至少1.5倍高的结合剂的细胞。
10.根据第8项或第9项的方法，其中分选是利用荧光活化细胞分选仪(FACS)进行。
11.根据第4项到第10项中任一项的方法，其中步骤(ii)包括将所述文库中的所述克隆作为混合物在一个容器中培养。
12.根据第4项到第10项中任一项的方法，其中步骤(ii)包括在独立容器中培养所述文库中的每种克隆。
13.根据第4项到第12项中任一项的方法，其中所述结合剂是亲本结合剂的序列变异体。
14.根据第13项的方法，其中所述亲本结合剂已鉴定为需要改善其在溶液中的溶解度或自缔合抗性。
15.根据第13项或第14项的方法，其中所述方法包括产生所述亲本结合剂的序列变异体以及将编码所述序列变异体的DNA整合到高等真核细胞的细胞DNA中以提供含有编码所述结合剂的DNA的细胞克隆的文库，
任选地，其中所述方法包括分析所述亲本的多肽序列、鉴定出经预测会促进自缔合和/或减小溶解度的一个或多个氨基酸残基，以及使所述一个或更多个氨基酸残基产生突变。
16.根据第13项到第15项中任一项的方法，其中所述亲本结合剂在磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)中的临界浓度小于50mg/ml且/或在磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)中的溶解度极限小于50mg/ml，
且/或其中所述方法包括鉴定出临界浓度和/或溶解度极限为所述亲本结合剂的至少1.5倍高的由所述一种或多种所选克隆编码的结合剂。
17.根据第4项到第16项中任一项的方法，包括基于结合剂在所述细胞克隆上的表面呈现水平来预测所述结合剂的亲水性和/或鉴定出具有较强亲水性的一种或多种所选克隆的结合剂。
18.一种体外筛选展示结合剂的高等真核细胞文库以从所述文库中富集表达结合剂的细胞的方法，所述结合剂在哺乳动物体内结合一种或多种非靶分子的倾向低，所述方法包括
(i)提供各含有编码结合剂的DNA的高等真核细胞克隆的文库，
(ii)在用于表达所述结合剂的条件下体外培养所述克隆，其中所述结合剂呈现于细胞表面上，
(iii)使所述结合剂暴露于所述一种或多种非靶分子，允许所述结合剂与所述一种或多种非靶分子之间发生结合，
(iv)丢弃对所述一种或多种非靶分子展现较大结合的细胞，
(v)选择对所述一种或多种非靶分子展现较低结合的细胞，以提供所选细胞群，所选细胞群富集表达对所述非靶分子结合倾向低的结合剂的克隆；以及任选地
提供所选群体用于一个或多个进一步筛选步骤。
19.根据第18项的方法，其包括
(iii)使所述结合剂暴露于包括所述一种或多种非靶分子的基质，允许结合到所述基质，
(iv)丢弃对所述基质展现较大结合的细胞，
(v)选择对所述基质展现较低结合的细胞，以提供所选细胞群，所选细胞群富集表达对所述非靶分子结合倾向低的结合剂的克隆；以及任选地
提供所选群体用于一个或多个进一步筛选步骤。
20.根据第18项或第19项的方法，其中所述非靶分子包括DNA、肝素、乙酰肝素硫酸盐、软骨素硫酸盐、伴随蛋白、玻糖醛酸，或糖萼的一种或多种组分。
21.根据第18项到第20项中任一项的方法，其中对非靶分子的所述结合是低亲和力非特异性结合。
22.根据第18项到第21项中任一项的方法，其包括将所述文库中的所述克隆作为混合物在一个容器中培养以及使所述混合物暴露于所述基质。
23.根据第18项到第21项中任一项的方法，包括将所述文库中的每种克隆在独立容器中培养。
24.根据第18项到第23项中任一项的方法，其中所述结合剂是亲本结合剂的序列变异体。
25.根据第24项的方法，其中所述亲本结合剂已鉴定为需要减少对一种或多种非靶分子的结合。
26.根据第24项或第25项的方法，其中所述方法包括产生所述亲本结合剂的序列变异体以及将编码所述序列变异体的DNA整合到高等真核细胞的细胞DNA中以提供含有编码所述结合剂的DNA的细胞克隆的文库，
任选地其中所述方法包括分析所述亲本的多肽序列、鉴定经预测会促进非特异性结合的一个或多个氨基酸残基，以及使所述一个或多个氨基酸残基产生突变。
27.根据第24项到第26项中任一项的方法，其中所述亲本结合剂对一种或多种非靶分子展现显著的结合。
28.根据第18项到第27项中任一项的方法，其包括
(iii)使所述结合剂暴露于呈现所述一种或多种非靶分子的细胞或珠粒。
29.根据第28项的方法，其包括检测表达结合剂的细胞与呈现所述一种或多种非靶分子的所述细胞或珠粒的相互作用。
30.根据第29项的方法，其包括使用AC-SINS检测颗粒间距离以及选择由展现较高颗粒间距离的细胞所呈现的结合剂。
31.根据第18项的方法，其中所述一种或多种非靶分子被可检测地标记。
32.根据第31项的方法，其中所述一种或多种非靶分子被荧光标记。
33.根据第32项的方法，其包括根据对所述一种或多种非靶分子的结合水平、利用FACS将细胞流式分选到收集部分和丢弃部分，其中将显示所述被标记非靶分子的荧光高于预定阈值的细胞分选到所述收集部分并且将显示所述被标记非靶分子的荧光低于所述预定阈值的细胞分选到所述丢弃部分。
34.根据第4项到第33项中任一项的方法，其中编码所述结合剂的所述DNA是在强启动子的控制下表达。
35.根据第34项的方法，其中所述启动子是组成型启动子。
36.根据第35项的方法，其中所述启动子是CMV启动子。
37.根据第34项的方法，其中所述启动子是已最大限度地诱导表达的诱导型启动子。
38.根据第18项到第37项中任一项的方法，其进一步包括随后执行根据第5项到第17项中任一项的方法。
39.根据第18项到第37项中任一项的方法，其进一步包括初始执行根据第5项到第17项中任一项的方法。
40.一种选择针对靶标的一种或多种结合剂的方法，其包括
执行如第5项到第39项中任一项所定义的方法，其进一步包括
使所述结合剂暴露于所述靶标，允许同源结合剂识别所述靶标，其中展示同源结合剂的细胞结合到所述靶标，以及
选择一种或多种展示同源结合剂的克隆。
41.根据任一前述项的方法，其包括
(i)同时测定所述结合剂的表面呈现水平和所述结合剂结合靶标的水平，以及协同选择展示同源结合剂的克隆，所述同源结合剂展现的表面呈现高于其它克隆；或
(ii)同时测定所述结合剂的表面呈现水平和非特异性结合到非靶分子的水平，以及协同选择展示结合剂的克隆，与其它克隆相比，所述结合剂展现更高的表面呈现和更低的非特异性结合；或
(iii)同时测定所述结合剂的靶标结合水平和非特异性结合到非靶分子的水平，以及协同选择展示同源结合剂的克隆，所述同源结合剂展现的非特异性结合低于其它克隆。
42.一种鉴定以所期望亲和力识别靶标的结合剂的方法，所述方法包括
(a)提供各含有编码结合剂的DNA的高等真核细胞克隆的体外文库，其中所述结合剂呈现于所述细胞表面上，且其中被编码的所述结合剂从弱活性启动子表达且/或在细胞表面上以每个细胞100-60,000范围内的拷贝数表达，
(b)使所述文库暴露于所述靶标且允许同源结合剂识别所述靶标，其中展示同源结合剂的细胞结合到所述靶标，
(c)分离出结合到所述靶标的细胞以提供所选细胞群，所选细胞群富集展示同源结合剂的细胞，以及任选地
(d)使所选细胞群暴露于针对所述靶标的额外一轮或多轮选择，任选地其中逐渐地减小靶标浓度以提高选择严格度，以及任选地
(e)选出展示同源结合剂的一种或多种克隆，所述同源结合剂对所述靶标具有所期望的亲和力。
43.根据第42项的方法，包括提供富集展示同源结合剂的细胞的所选细胞群，以及随后：
提供处于强活性启动子控制下的编码结合剂的DNA，所述DNA来自高等真核细胞克隆的体外文库内的所选细胞群，以及
执行根据第5项到第17项中任一项的方法。
44.根据第42项的方法，其包括
执行根据第5项到第17项中任一项所定义的方法以提供展示结合剂存在较高表面呈现的所选克隆，以及随后：
在各含有编码结合剂的DNA的高等真核细胞克隆的体外文库中，从弱活性启动子表达所述结合剂，以及随后
执行第42项的方法。
45.一种鉴定识别靶标的结合剂的方法，其包括：
(i)提供各含有编码结合剂的DNA的高等真核细胞克隆的文库，其中所述结合剂是在诱导型启动子的控制下表达以便呈现于细胞表面上，
(ii)在所述诱导型启动子活性弱的条件下培养所述文库的细胞，
(iii)使所述文库暴露于所述靶标，允许同源结合剂识别所述靶标，其中展示同源结合剂的细胞结合到所述靶标，
(iv)选择展示同源结合剂的细胞，借此提供所选细胞群，
(v)在增强从所述诱导型启动子表达结合剂的条件下培养所选细胞群，
(vi)测定所述结合剂在所述多种克隆上的表面呈现水平，任选地通过用并有可检测(例如荧光)标记的试剂标记所述结合剂来测定，
(vii)选出相较于其它克隆展现结合剂存在更高的表面呈现的一种或多种克隆。
46.一种鉴定识别靶标的结合剂的方法，其包括：
(i)提供各含有编码结合剂的DNA的高等真核细胞克隆的文库，其中所述结合剂是在诱导型启动子的控制下表达以便呈现于细胞表面上，
(ii)在从所述诱导型启动子强烈表达结合剂的条件下培养所述文库，
(iii)测定所述结合剂在所述多种克隆上的表面呈现水平，任选地通过用并有可检测(例如荧光)标记的试剂标记所述结合剂来测定，
(iv)选出相较于其它克隆展现结合剂存在更高表面呈现的克隆群体，
(v)在从所述诱导型启动子弱表达结合剂的条件下培养所选群体，
(vii)使所述文库暴露于所述靶标，允许同源结合剂识别所述靶标，其中展示同源结合剂的细胞结合到所述靶标，
(iv)选择一种或多种展示同源结合剂的克隆。
47.根据第42项到第46项中任一项的方法，其中所述启动子是四环素诱导型启动子。
48.根据第42项到第47项中任一项的方法，其中所述靶标是用可检测试剂标记，例如荧光标记。
49.根据第48项的方法，其中所述方法包括根据所述细胞上的靶标结合水平将细胞分选到收集部分和丢弃部分中，其中将展示所结合靶标高于预定阈值的细胞分选到所述收集部分中并且将展示所结合靶标低于所述预定阈值的细胞分选到所述丢弃部分中。
50.根据第49项的方法，其中分选是利用荧光活化细胞分选仪(FACS)进行。
51.根据第5项到第50项中任一项的方法，其包括
测定编码所述结合剂的所述DNA的序列，所述结合剂来自所述一种或多种所选克隆，以及
提供编码所述结合剂的经分离的核酸。
52.根据第5项到第51项中任一项的方法，其进一步包括
测定编码所述结合剂的所述DNA的序列，所述结合剂来自所述一种或多种所选克隆，以及
在体外，在以可溶形式分泌所述结合剂的条件下，在宿主细胞中表达编码所述结合剂的DNA。
53.根据第52项的方法，其中分泌的所述结合剂是以至少1mg/ml的产量获得。
54.根据第52项或第53项的方法，其进一步包括提纯和/或浓缩所述结合剂以获得浓度为至少10mg/ml的所述结合剂的水溶液。
55.根据第54项的方法，其中所述浓度是至少50mg/ml。
56.根据第55项的方法，其中所述浓度是至少100mg/ml。
57.根据第52项到第56项中任一项的方法，包括将所述结合剂配制成包括医药学上可接受的赋形剂的组合物。
58.根据第57项的方法，包括将所述组合物提供于注射用的预装药注射器中，所述预装药注射器任选地存在于试剂盒内，所述试剂盒包括一种或多种额外的组件，例如针和/或产品信息说明书，包括通过注射施用所述组合物的说明。
59.一种鉴定与FcRn相互作用的结合剂的方法，所述方法包括
提供多种高等真核细胞克隆，其各自含有编码具有Fc域的不同结合剂的DNA，
在体外，在使所述结合剂呈现于细胞表面上的条件下培养所述克隆，
使所述克隆在约pH 6.0和约pH 7.4暴露于FcRn受体，允许所述Fc域识别FcRn，
选出表达结合剂的一种或多种克隆，所述结合剂在约pH 6.0展现的亲和力结合高于在约pH 7.4展现的亲和力、在约pH 6.0展现的亲和力结合低于在约pH 7.4展现的亲和力结合，或在约pH 6.0展现的亲和力结合与在约pH 7.4展现的亲和力结合大约相同，以及
任选地提供所选克隆用于一个或多个进一步筛选步骤。
60.根据第59项的方法，其包括：选出表达结合剂的一种或多种克隆，所述结合剂在约pH 6.0展现的亲和力结合高于在约pH 7.4展现的亲和力结合；以及鉴定体内半衰期延长的由一种或多种所选克隆编码的所述结合剂。
61.根据第59项或第60项的方法，其中所述结合剂包括展现序列多样性、任选地在一个或多个互补决定区中展现序列多样性的可变域。
62.根据第59项到第61项中任一项的方法，其中所述结合剂包括展现序列多样性、任选地在其CH3域中展现序列多样性的Fc区域。
63.根据第59项到第61项中任一项的方法，其中所述结合剂的所述Fc区域不展现序列多样性。
64.一种克隆、由克隆表达的结合剂，或编码所述结合剂的核酸，其大体上如本文所述且/或利用根据任一前述项的方法鉴定或选择。
65.一种各含有编码结合剂的DNA的高等真核细胞克隆的体外文库，其中所述编码DNA任选地处于细胞DNA中的固定基因座，且其中被编码的所述结合剂在细胞表面上以每个细胞100-1000范围内的拷贝数表达。
66.一种如第65项中所定义的文库用于对针对靶标的结合剂进行基于亲和力的选择的用途。
67.一种含有编码结合剂谱系的DNA的高等真核细胞克隆的体外展示文库，其中结合剂是在四环素诱导型启动子的控制下表达以便呈现于细胞表面上。
68.一种生产含有编码结合剂谱系的DNA的高等真核细胞克隆文库的方法，其包括
提供编码所述结合剂的供体DNA分子，和高等真核细胞，
将所述供体DNA引入所述细胞中，借此建立含有整合于所述细胞DNA中的供体DNA的重组细胞，
其中所述结合剂是在四环素诱导型启动子的控制下表达以便呈现于细胞表面上，以及
培养所述重组细胞以产生克隆，
借此提供含有编码所述结合剂谱系的供体DNA的高等真核细胞克隆文库。
69.根据第68项的方法，其中所述重组细胞是通过将所述供体DNA引入所述细胞中且在所述细胞内提供位点特异性核酸酶来建立，其中所述核酸酶使细胞DNA中的识别序列裂解以建立整合位点，在所述位点处，所述供体DNA整合于所述细胞DNA中，整合是通过所述细胞内源的DNA修复机制发生。
70.根据第68项或第69项的方法，其进一步包括诱导供体DNA从所述四环素诱导型启动子表达以及在表达所述结合剂的条件下培养所述细胞，从而获得结合剂在细胞表面上的呈现。
71.根据第69项或第70项的方法，其进一步包括在如任一前述项所定义的方法或用途中使用所述文库。
72.根据任一前述项的用途、方法或文库，其中所述高等真核细胞是哺乳动物细胞。
73.根据任一前述项的用途、方法或文库，其中所述哺乳动物细胞是人类细胞系或CHO细胞系。
74.根据任一前述项的用途、方法或文库，其中所述高等真核细胞处于悬浮培养中。
75.根据任一前述项的用途、方法或文库，其中编码所述结合剂的DNA整合于所述细胞DNA中的固定基因座处。
76.根据任一前述项的用途、方法或文库，其中所述结合剂是抗体。
77.根据第76项的用途、方法或文库，其中所述抗体是全长免疫球蛋白。
78.根据第77项的用途、方法或文库，其中所述抗体是IgG。
79.根据第76项到第78项中任一项的用途、方法或文库，其中所述抗体包含与跨膜域融合的重链，和轻链。
80.根据第1项到第79项中任一项的用途、方法或文库，其中所述结合剂是融合蛋白，所述融合蛋白包括插入受体多样性支架域内的供体多样性支架域，任选地包括与所述融合蛋白缔合的搭配域，
其中所述供体多样性支架域包括供体支架和供体相互作用序列并且所述受体多样性支架域包括受体支架和受体相互作用序列。
81.根据第80项的用途、方法或文库，其中所述融合蛋白是打结抗体，其包括插入抗体可变域内的富半胱氨酸肽。
82.根据第81项的用途、方法或文库，其中所述打结抗体包括与跨膜域融合的抗体重链，和抗体轻链。
83.根据任一前述项的用途、方法或文库，其中所述结合剂包括展现序列多样性、任选地在一个或多个互补决定区中展现序列多样性的抗体可变域。
84.根据任一前述项的用途、方法或文库，其中所述结合剂包括展现序列多样性、任选地在其CH3域中展现序列多样性的Fc区域。
85.根据任一前述项的用途、方法或文库，其中所述结合剂具多特异性，包括用于第一靶标的第一结合位点和用于第二靶标的第二结合位点。
86.根据任一前述项的用途、方法或文库，其中所述文库包括至少103种克隆。
87.根据任一前述项的用途、方法或文库，其中所述文库是初始文库。
88.根据第1项到第86项中任一项的用途、方法或文库，其中所述文库中的所述克隆已经根据对所选靶标的结合预选出来。
89.根据第88项的用途、方法或文库，其中所述靶标是人类多肽。
90.根据第88项或第89项的用途、方法或文库，其中所述文库中的所述克隆已经根据对两种不同靶标的双特异性结合预选出来。
所属领域的技术人员将认识到，或者使用不超出常规的实验就能够确定本文所述的发明的具体实施例的许多等效物。此类等效物希望被所附权利要求书涵盖。
本发明的其它方面和实施例是由上述方面和实施例通过用术语“由……组成”替换术语“包含”而得到以及由上述方面和实施例通过用术语“基本上由……组成”替换术语“包含”而得到。
应了解，除非上下文另有需求，否则本申请公开了上述方面和上述实施例中的任一个彼此间的所有组合。类似地，除非上下文另有需求，否则本申请公开了优选特征和/或任选特征单独或与其它方面中的任一个的所有组合。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然类似于或等效于本文所述的任何组合物和方法能够用于实施或测试本公开的方法，但本文中描述了示例性的组合物和方法。本文所述的本公开的任一方面和实施例还可以加以组合。举例来说，本文公开的的任何从属或独立权利要求的标的物可以多次组合(例如，来自每个从属权利要求的一个或多个叙述可以基于它们所从属的独立权利要求而组合成单个权利要求)。
如本文和权利要求书中所用，单数形式“一(a)”、“和(and)”和“所述(the)”包括复数个提及物，除非上下文另有明确规定。因此，举例来说，提及“肽链”是提及一个或多个肽链并且包括所属领域的技术人员已知的其等效物。
本说明书中提及的所有文献和序列数据库以全文引用的方式并入本文中用于所有目的。
“和/或”在本文中使用时被认为是具体公开了两种指定特征或组分中的每一种与或不与另一种指定特征或组分。举例来说，“A和/或B”将被认为是具体公开了(i)A、(ii)B和(iii)A和B中的每一个，就像各自在本文中单独列出一样。
附图的简要说明
本发明的实施例现将参考附图更详细地描述如下：
图1.pINT17-BSD，用于表面表达的双重启动子抗体IgG表达盒
pINT17-BSD，所示示意图描绘关键特征(1-7500bp)
pINT17-BSD-D1.3，用于表面表达抗溶菌酶抗体D1.3的双重启动子抗体表达盒。所示为充分标注的核酸序列。特征：
AAVS左同源臂9-812
杀稻瘟菌素抗性基因853-1254
pEF启动子1522-2705
BM40前导序列2745-2799
人源化D1.3 VL 2799-3130
人类Cκ3138-3443
BGH聚腺苷酸3468-3682
CMV启动子3701-4273
具有内含子4299-4426的小鼠VH前导序列
人源化D1.3 VH 4432-4779
优化的人类IgG1 CH1-CH3 4780-5775
Myc标签5776-5805
PDGFR锚5806-5961
BGH聚腺苷酸6011-6225
AAVS右同源臂6288-7124
f1复制起点7282-7695
pUC复制起点7916-8590
卡那霉素(Kanamycin)抗性基因9310-10104
图2.IgG在细胞表面上的表达。
通过在FL3通道中使用前向散射和染色，使分析聚焦于活细胞。FL3通道中染色呈阳性的细胞(代表吸收7-AAD的非活细胞)加以排除。在AAVS TALEN存在下，用pINT17抗体转染HEK293细胞。利用杀稻瘟菌素选择稳定群体。细胞在转染后第14天，用抗Fc PE(FL2)染色。描绘荧光强度(抗Fc-PE，x轴)的图相对于细胞计数(y轴)绘制并且包括CNTO607(a)、MEDI1912(b)和Ang2mAb(c)对。对于所有图来说，图包括染色的HEK293细胞(虚线)、亲本抗体(虚线)、改善的突变体(黑色实线)。
图3.MEDI-1912和MEDI-1912-STT的制备型尺寸排阻色谱。通过瞬时转染Expi293细胞来表达抗体，随后进行蛋白质A亲和提纯和透析。使用PBS(pH 7.4)操作缓冲液将提纯的MEDI-1912(0.5ml，1.1mg/ml)或MEDI-1912-STT(0.5ml，1.7mg/ml)装载于与AKTA Pure系统连接的Superdex 200 10/300柱上。洗脱体积(ml)在x轴上相对于280nm吸光度(mAU)在y轴上作图。MEDI-1912和MEDI-1912-STT的洗脱体积(Ve)分别是10.3ml和11.7ml。MEDI-1912显示的洗脱体积较早，表明自身相互作用。
图4.MED-1912可变重(VH)链的DNA和蛋白质序列。
建立文库所用的引物在核酸序列上方标识。
图5.基于抗体表达对展示抗体群体的混合细胞进行的FACS分离。
通过核酸酶定向整合到HEK293细胞的AAVS基因座中而靶向MEDI-1912与MEDI-1912_STT IgG基因的均等混合物。转染后第15天，通过使用BD Influx分选仪的FACS、基于抗体表达来分离这个混合细胞群。细胞用藻红蛋白(PE)标记的抗Fc和别藻蓝蛋白(APC)标记的NGF-生物素/抗生蛋白链菌素染色。通过使用前向散射和染色使分析聚焦于活细胞。λem＝450/40、λexc＝355通道中染色呈阳性的细胞(代表着吸收7-AAD的非活细胞)加以排除。
a.抗Fc-PE的荧光强度相对于混合型输入群体(虚线)以及展示MEDI-1912(灰线)和MEDI-1912_STT(黑线)的单克隆HEK293细胞系的细胞计数的直方图。
b.点阵图显示抗Fc-PE的荧光强度(x轴)，其代表抗体表达水平，相对于y轴上的抗原结合荧光强度(NGF-生物素/NGF-生物素/抗生蛋白链菌素-APC)所绘制。为了分离高表达和低表达抗体群体而选择的门标识为P5和P6并且在点阵图上以黑框显示。总事件计数为3.9×106个细胞并且在P5和P6门中分选的细胞数目分别是2.5×105和2.8×105个细胞。
图6.富集根据哺乳动物细胞展示水平所选的抗体。
将门5和6中分选的细胞(图5)扩增，制备基因组DNA且通过PCR分离抗体VH基因。通过Nextgen测序来分析两个抗体群体，以测定MEDI-1912和MEDI-1912_STT在两个门内群体中的比例。直方图显示MEDI-1912(阴影条柱)和MEDI-1912_STT(黑色实心条柱)在低表达抗体群体(门6)和高表达抗体群体(门5)中的频率百分比。
图7.基于抗体表达，对MEDI-1912文库抗体群体进行的FACS分离。
通过核酸酶定向整合到HEK293细胞的AAVS基因座中而靶向MEDI-1912IgG基因文库，其中利用NNS寡核苷酸定向诱变使编码W30、F31和L56的密码子随机突变。转染后15天，使用BD Influx分选仪、通过FACS、基于抗体表达和抗原结合来分离这个混合细胞群。细胞用藻红蛋白(PE)标记的抗Fc和别藻蓝蛋白(APC)标记的NGF-生物素/抗生蛋白链菌素染色。通过使用前向散射和染色使分析聚焦于活细胞。λem＝450/40、λexc＝355通道中染色呈阳性的细胞(代表着吸收7-AAD的非活细胞)加以排除。点阵图显示抗Fc-PE的荧光强度(x轴)，其代表抗体表达水平，相对于展示亲本MEDI-1912的单克隆细胞系(a)、展示MEDI-1912_STT的单克隆细胞系(b)和MEDI-1912氨基酸位置30、31和56随机文库(c)在y轴上的抗原结合荧光强度(NGF-生物素/NGF-生物素/抗生蛋白链菌素-APC)绘制。选用于分析的门标识为P5和P6并且在点阵图上以方框显示。
图8.所选MEDI-1912变异体的序列分布。
哺乳动物展示且FACS基于Fc表达和NGF结合设门(P5门，图7)之后，MEDI-1912VH文库在MEDI-1912VH位置30、31和56的氨基酸一致性频率的直方图。氨基酸(单字母码)在x轴上相对于邻近氨基酸30(阴影条柱)和31(黑色条柱(a))和氨基酸56(b)在y轴上的频率(出现率百分比)作图。位置56的亮氨酸从分析中排除。
图9.博可珠单抗(Bococizumab)小鼠亲本抗体5A10 VH(A)和VL(B)与人源化中间抗体5A10-i和博可珠单抗的比对。
CDR用序列上方的条柱指示并且待突变的残基用粗体加下划线突出显示。互补位残基(对直接结合到PCSK9有贡献的氨基酸)用斜体加下划线突出显示。点表示与亲本小鼠mAb 5A10一致。
图10.抗体哺乳动物展示博可珠单抗和亲本人源化中间体抗体5A10-i的表达
编码博可珠单抗或5A10-i IgG的靶向载体pINT17通过TALE核酸酶整合于Hek293细胞的AAVS基因座中。转染后(dpt)第1、8或21天，将细胞(106)用抗Fc-PE染色，并且使用iQue Intellicyte流式细胞仪、通过流式细胞术分析106个细胞。死细胞从分析中排除。直方图显示转染后(dpt)第1、8和21天，博可珠单抗和5A10-i细胞展示群体的荧光强度(抗Fc-PE)相对于细胞计数，其中野生型HEK293细胞的染色作为阴性对照纳入。
图11.博可珠单抗VH与人类生殖系序列(IMGT)的比对。
针对人类VDJ数据库，对博可珠单抗VH(查询_1)进行Ig基本局部比对检索(IgBLAST)。结果展示为与查询序列的比对，按照一致性百分比的次序(第二栏)，所述查询序列涵盖框架区1(FR1)、互补决定区1(CDR1)、FR2、CDR2和FR3。人类生殖系显示于第1栏中。与博可珠单抗VH序列一致的残基(.)和差异(单氨基酸码)显示于多序列比对中。
图12.编码博可珠单抗VH变异体和VL的DNA序列，和终止密码子模板。与原始“野生型”博可珠单抗(列f)相比，变异是以粗体加下划线突出显示。侧接的5’和3’VH限制位点(NcoI和XhoI)或VL限制位点(NheI和NotI)加下划线。VL终止密码子以粗体加下划线突出显示。
图13.博可珠单抗文库经MACS提纯后的分析型流式细胞术分析
经博可珠单抗文库转染的Hek293细胞在抗Fc或PCSK9i转染后第7天经MACS提纯。(a)流式细胞术点阵图显示了抗Fc表达(FL2，x轴)，其相对于MACS提纯后文库、HEK293细胞和未分选文库、博可珠单抗和5A10i转染物(9dpt)的PCSK9结合(FL4，y轴)绘制。(b)荧光强度(抗Fc，FL2，x轴)相对于细胞计数绘制的直方图。图(从上到下)是HEK293对照、博可珠单抗、5A10i、博可珠单抗文库、抗PCSK9MACS提纯的博可珠单抗文库，和抗Fc MACS提纯的博可珠单抗文库。
图14.预先经MACS提纯的博可珠单抗文库的BD Influx分选仪点阵图，其基于抗原结合或抗Fc。
通过核酸酶定向整合到HEK293细胞AAVS基因座中而靶向博可珠单抗IgG基因文库。这个混合细胞群首先基于PCSK9结合(a)或抗Fc(b)，经MACS提纯。转染后的第16天，基于抗体表达和抗原结合，使用BD Influx分选仪、通过FACS分离富集MACS的文库。细胞用藻红蛋白(PE)标记的抗Fc和别藻蓝蛋白(APC)标记的PCSK9-生物素/抗生蛋白链菌素染色。通过使用前向散射和染色使分析聚焦于活细胞。λem＝450/40、λexc＝355通道中染色呈阳性的细胞(代表着吸收7-AAD的非活细胞)加以排除。点阵图显示抗Fc-PE的荧光强度(x轴)，其代表抗体表达水平，相对于y轴上的抗原结合荧光强度(PCSK9-生物素/抗生蛋白链菌素-APC)所绘制。选用于分析的门标识为P5和P6并且在点阵图上以方框显示。
图15.哺乳动物展示选择之后的博可珠单抗VH分布。
对未选定的随机输入克隆(84)、所分选的抗原(75)和所选择的Fc(85)进行测序并且测定VH一致性。直方图显示相对于输入的出现率百分比(白色实心条柱)而在x轴上绘制的VH生殖系一致性，抗原MACS、随后用所选的抗原和抗Fc FACS(黑色实心条柱)和抗FcMACS、随后用所选的抗原和抗Fc FACS(灰色实心条柱)哺乳动物细胞展示所选群体。
图16.哺乳动物展示选择之后的博可珠单抗VL序列分析。
对未选定的随机输入克隆(84)、所分选的抗原(75)和所选择的Fc(85)进行测序并且测定VL一致性。计算3种突变密码子的平均pI和脂肪族指数。这显示哺乳动物展示所选的抗体的pI与脂肪族指数均减小。
图17.表格列举了哺乳动物展示的博可珠单抗克隆，其根据抗原结合、通过MACS富集，随后根据抗体展示水平(抗Fc)与抗原结合进行FACS富集。
对克隆进行测序并且VH CDR1和CDR2和VL CDR2和CDR3单字母氨基酸序列相对于博可珠单抗原始序列显示有变异，所述变异以粗体和红色突出显示。保持博可珠单抗序列的靶标氨基酸加有下划线。在捕捉ELISA中实施抗体(包括原始亲本抗体博可珠单抗和5A10-i)对抗原的结合并且结合信号(荧光单位)显示于第2栏中。如Liu等人，201430此前所述实施AC-SINS分析并且第3栏显示相较于非抗体PBS对照(nm)存在最大吸光度波长漂移。所选人类VH生殖系也在第6栏中用字母指出，如实例5中详述：
a：VH Y33A-IGHV1-3*01
b：VH Y33D-IGHV1-8*01
c：VH S52N、F54S、R57S-IGHV1-46*01
d：VH Y33A、S52N、F54S、R57S(a.和c.：组合的突变体)
e：VH Y33D、S52N、F54S、R57S(b.和c.：组合的突变体)
f：博可珠单抗“野生型”序列
图18..抗PCSK9 IgG1抗体的HPLC-SEC。
通过瞬时转染Expi-293细胞来表达抗体，通过蛋白质A色谱进行亲和力提纯且透析。使用Agilent 1100HPLC仪器，以0.35ml/min的流量将样品(2μl，1mg/ml)装载于AgilentAdvancedBio SEC 300A，2.7um，4.6x300 mm柱(安捷伦科技(Agilent Technologies)，目录号PL1580-5301)。显示所选抗体的滞留时间相对于吸光度的图。从黑色到逐渐变浅的灰色是：5A10-i、884_01_G01(根据哺乳动物细胞展示所鉴定)、博可珠单抗和阿利库单抗(Alirocumab)。
图19.凝胶过滤分析：尼沃单抗(Nivolumab)(a)和韦森单抗(Vesencumab)(b)。
通过瞬时转染Expi293细胞来表达抗体，随后进行蛋白质A亲和提纯且透析。使用PBS(pH 7.4)操作缓冲液将提纯的尼沃单抗(0.5ml，1.3mg/ml)或韦森单抗(0.5ml，1.2mg/ml)装载于与AKTA Pure系统连接的Superdex 200 10/300柱上。洗脱体积(ml)在x轴上相对于280nm吸光度(mAU)在y轴上作图。尼沃单抗和韦森单抗的洗脱体积(Ve)分别是12.0ml和13.7ml。
图20.尼沃单抗(a)和韦森单抗(b)在4℃储存2周之后的稳定性测定。
通过尺寸排阻色谱来提纯韦森单抗和尼沃单抗(参见图19)且用PBS将其浓度调节到0.5mg/ml(pH 7.4)。然后在4℃储存抗体2周。在20℃下，根据制造商说明书，使用Zetasizer APS(马尔文仪器公司(Malvern Instruments)，英国马尔文(Malvern,UK)进行动态光散射测量。利用爱因斯坦-斯托克斯方程式(Einstein-Stokes equation)评估流体动力学半径且相对于分散强度作图。相较于韦森单抗(b)的多个聚集体峰，观察到尼沃单抗(a)存在单个单分散峰。
图21.人类血清对细胞表面上的IgG的结合。
通过在FL3通道中使用前向散射和染色，使分析聚焦于活细胞。FL3通道中染色呈阳性的细胞(代表着吸收7-AAD的非活细胞)加以排除。细胞在AAVS TALEN存在下用pINT17-尼沃单抗或pINT17-韦森单抗转染。利用杀稻瘟菌素选择稳定群体。转染后的第20天，细胞用抗Fc PE(FL2)和经Dylight 633(325 0000，Innova)标记的人类血清(H4522，Sigma)染色。图为未转染的HEK293细胞(a)、经pINT17-尼沃单抗(b)或pINT17-韦森单抗(c)转染的HEK293细胞。
图22.亲和力、抗原浓度和抗体浓度之间的关系
在KD 10nM(虚线)或0.1nM(实线)的不同浓度的抗体存在下，使用0.1nM抗原的复合物的浓度。
较高亲和力抗体(KD 0.1nM)相对于较低亲和力(KD 10nM)在不同抗体浓度下结合到0.1nM抗原的双向相对选择率
即使抗原浓度低(“严格”)，但在抗体浓度高的情况下，选择率相对极小，但这随着抗原浓度降低而增加。
图23.控制抗体展示水平的剪接受体/供体变异体。
图示为pINT17-J9、J10、J29和J30变异体的从HindIII位点到5’内含子的核酸序列，包括剪接供体区域。人类原始“野生型”序列是J9并且J9在剪接点与J10、J29和J30不同的核苷酸加有下划线。
图24.pINT17-J30，双重启动子抗体IgG表达盒，用于减少展示表面的表达图示了XhoI(4804)与SbfI(8387)限制位点之间的经标注的核酸序列。特征：
IgG1 CH1-3 4805-5808
剪接接合点5801-5802
内含子5802-7104
M1外显子7105-7239
BGH pA 7264-7478
AAVS右同源臂7544-8381
3’β-球蛋白隔离子8421-8492
图25.使用替代跨膜域和剪接变异体使IgG在细胞表面上的表面表达减少。
通过在FL3通道中使用前向散射和染色，使分析聚焦于活细胞。FL3通道中染色呈阳性的细胞(代表着吸收7-AAD的非活细胞)加以排除。细胞在AAVS TALEN存在下用靶向pINT17的载体转染。利用杀稻瘟菌素选择稳定群体。细胞在转染后第27天，用抗Fc PE(FL2)染色。流式细胞术点阵图中的各图包括pINT17-J9-尼沃单抗(a)、pINT17-J10-尼沃单抗(b)、pINT17-J29-尼沃单抗(c)、pINT17-J30-尼沃单抗(d)和pINT17-BSD-尼沃单抗(e)。
图26.根据由pINT17-BSD或pINT17-J30靶向载体表达的抗体，量化细胞表面上的IgG展示水平
如经小鼠IgG-PE标记染色的Quantum Simply细胞抗小鼠IgG珠粒(目录号815，Bangs实验室有限公司)的制造商说明书中所述进行校准珠粒FL2染色。(a)标记的直方图显示校准珠粒组的染色，其中标识为1、2、3和4的峰分别代表12257、72745、283360、886417的珠粒拷贝数。空白峰代表不具有捕捉抗体的珠粒。(b)校准图显示相对于拷贝数(y轴)绘制的中值荧光强度(x轴)。来自pINT17-BSD或pINT17-J30表达盒的展示337_1_C08(c)和尼沃单抗(d)的细胞系用抗Fc-PE(5μl，0.1mg/ml；105个细胞)染色。通过在FL3通道中使用前向散射和染色，使分析聚焦于活细胞。FL3通道中染色呈阳性的细胞(代表着吸收7-AAD的非活细胞)加以排除。直方图显示pINT17-BSD和PDGFR TM(标有黑色实线)、pINT17-J30(标有虚线)和野生型HEK293细胞系(灰色实线)作为分别展示337_1_C08(c)和尼沃单抗(d)的细胞的荧光强度相对于细胞计数。
图27.通过减少细胞展示拷贝数能够分离哺乳动物展示的对其靶标具有不同亲和力的抗体。
展示尼沃单抗和337_1_C08抗体的Hek293细胞分别用50nM细胞追踪绿和50nM细胞追踪红标记。(a)展现使用J30剪接变异体的展示和(b)展现使用由pINT17-BSD载体编码的PDGFR跨膜域的展示。将经标记的细胞均等混合且基于抗原结合进行MACS分选。使用intellicyt流式细胞仪分析已分选的细胞。点阵图在x轴上展现尼沃单抗(FL1)且在y轴上展现337_1_C08(FL4)。图i、ii、iii和iv分别展现MACS提纯所用的10nM、1nM、0.1nM抗原和无抗原。
图28.pINT18-Tet1，用于减少展示表面表达的诱导型启动子抗体IgG表达载体。图示了AsiS1(5)和SbfI(7672)限制位点之间的经标注的核酸序列。包含复制起点和卡那霉素抗性基因的AsiSI和SbfI位点(7673-10922和1-4)外部的载体主链与pINT17-BSD一致(图1)。
主要特点：
AAVS左同源臂9-812
杀稻瘟菌素抗性基因853-1254
CMV启动子1540-2112
反向Tet活化因子(tTA)CDS 2164-3168
SV40 pA 3178-3395
tetO七聚体3679-3932
最小CMV启动子(PminCMV)3946-4005
BM40前导序列4016-4066
抗PD1 MK3475 VL 4068-4413
人类Cκ4421-4738
弗林蛋白酶(Furin)裂解位点4745-4756
P2A肽4757-4816
具有内含子4829-4960的小鼠VH前导序列
抗PD1 MK3475 VH 4962-5321
优化的人类IgG1 CH1-CH3 5322-6317
Myc标签6318-6347
PDGFR锚6348-6503
BGH聚腺苷酸6553-6767
AAVS右同源臂6829-7666
3’β-球蛋白隔离子7706-7777
f1复制起点7824-8237
pUC复制起点8458-9132
卡那霉素抗性基因9852-10646
图29.诱导型哺乳动物展示表达
直方图展现经pINT18-Tet1-377_1_C08和TALE核酸酶共转染的HEK293细胞系和在杀稻瘟菌素存在下历时20天所选择的稳定细胞群的染色结果。将样品分成20ml每毫升含有5×105个细胞，且用20ng/ml、2ng/ml和0ng/ml多西环素诱导。诱导后的第24小时，使用来自多西环素诱导的每个样品的1×106个细胞进行流式染色。细胞使用抗Fc-PE和TOPRO-3活力染色剂染色。直方图显示FL2通道(抗Fc-PE)上的荧光强度，其相对于细胞计数作图。HEK293WT对照(灰色实线)、经0ng/ml多西环素(黑色虚线)、2ng/ml多西环素(黑色虚线)和20ng/mL多西环素(黑色实线)诱导的HEK293-pINT18-Tet1-377_1_C08稳定细胞系。
图30.细胞展示的抗体对FcRn的结合。
表达布瑞金单抗(Briakinumab)和乌斯坦金单抗(Ustenkinumab)的HEK293细胞使用不同缓冲液用与抗生蛋白链菌素PE(11nM)预偶联的生物素化FcRn(50nM)染色：
a.Hek293 WT
b.抗生蛋白链菌素PE-对照
c.用缓冲液pH6.0染色的细胞
d.用缓冲液pH7.4染色的细胞
图31.FACS根据展示水平分离展示抗间皮素IgG的HEK293细胞。
通过核酸酶介导的基因转移，将一群抗间皮素抗体基因整合到HEK293细胞的人类AAVS基因座中。通过抗人类Fc-PE染色，根据抗体展示水平，利用FACS分离出展示抗体的HEK293细胞的多克隆群体。转染后的第16天，使用BD Influx分选仪，基于抗体表达，利用FACS分离出MACS富集的文库。细胞用藻红蛋白(PE)标记的抗Fc染色。通过使用前向散射和染色使分析聚焦于活细胞。λem＝450/40、λexc＝355通道中染色呈阳性的细胞(代表着吸收DAPI的非活细胞)加以排除。直方图显示抗Fc-PE的荧光强度(x轴)，其代表抗体表达水平，相对于y轴上的细胞计数作图。选用于分析的门标识为P4、P6和P5，分别代表低、中和高水平展示群体。
图32.分别来源于高水平展示组(实线)和低水平展示组(虚线)的两种抗间皮素IgG1抗体克隆的HPLC-SEC。
图33.DNA结合剂的DNA结合和耗竭(使用MACS)。(A)HEK293细胞(实心，灰色)或展示优特金单抗(虚线)、布瑞金单抗(长虚线)和阿玛西单抗(点线)的经生物素化DNA染色、经抗生蛋白链菌素PE检测的HEK293细胞的叠加图；(B)代表三种抗体细胞群的混合物的点阵图，所述细胞群展示优特金单抗(未标记，Q4)、阿玛西单抗(经CellTace远红标记，X轴)和布瑞金单抗(经CellTrace CFSE标记，Y轴)，在MACS分选之前经DNA染色；(C)显示DNA结合剂耗竭的流过物点阵图。
图34.用肝素-FITC(x轴)和抗人类Fc APC(y轴)双重染色。(a)显示优特金单抗(灰色)和布瑞金单抗(黑色)重叠图的点阵图。(b)显示优特金单抗(灰色)和加尼图单抗(黑色)重叠图的点阵图。重叠图内的门显示细胞是肝素的高表达者和非结合者。
图35.伴侣蛋白与DyLight 633的偶联物(x轴)和抗人类Fc PE(y轴)的双重染色。(a)显示优特金单抗(灰色)和布瑞金单抗(黑色)的重叠图的点阵图，其经Hsp70-DyLight633和抗人类Fc PE双重染色。(b)显示优特金单抗(灰色)和布瑞金单抗(黑色)的重叠图的点阵图，其经Hsp90-DyLight 633和抗人类Fc PE双重染色。重叠图内的门显示细胞是伴侣蛋白的高表达者和非结合者(Hsp70和Hsp90)。(c和d)重叠直方图显示冷自鲁单抗(lenzilumab)和贝伦妥单抗(brentuximab)分别结合Hsp70和Hsp90。
图36.经抗人类Fc PE和各种多反应性探针染色的抗体的直方图。通过核酸酶介导的基因整合来建立展示抗体选择的稳定单克隆HEK293细胞系。图示为在HEK293细胞表面上利用以下探针所展示的不同抗体的细胞计数(y轴)相对于荧光强度(x轴)的直方图：(a)抗人类Fc-PE、(b)使用抗生蛋白链菌素PE检测的生物素化DNA、(c)肝素-FITC、(d)抗生蛋白链菌素PE、(e)Hsp70-DyLight 633、(f)Hsp90-DyLight 633和(g)FcRn与抗生蛋白链菌素PE的预偶联物。
图37.pINT17-Tet-D1.3，一种诱导型抗体IgG哺乳动物展示表达载体。图示为AAVS同源臂与无启动子杀稻瘟菌素基因之间从BglII到BstZ171限制位点的充分标注核酸序列。编号始于BglII限制位点。下文列出了关键特征。
BGH聚腺苷酸223-9(反向链)
人类Cκ544-236(反向链)
D1.3 VL 877-549(反向链)
具有内含子1168-883的人类VL前导序列(反向链)
TRE3G启动子1230-1618
CMV启动子1237-1809
具有内含子1644-1782的VH前导序列
D1.3 VH 1783-2127
IgG1 CH1-3 2125-3120
Myc标签3121-3150
PDGFR锚3151-3306
BGH聚腺苷酸3356-3570
pEF启动子3621-4955
rtTA-3G 5063-5809
SV40聚腺苷酸5832-6274
图38.诱导型IgG哺乳动物展示细胞系。1549_02_D06(1)、1535_01_E03(2)和337_1_C08(3)、博可珠单抗(4)、884_01_G01(5)、5A10i(6)和阿利库单抗(7)。转染后第27天，通过添加0ng/ml(a)、2ng/ml(b)、4ng/ml(c)或100ng/ml(d)多西环素来诱导细胞系。诱导后第24小时，细胞用抗Fc-PE染色。荧光强度(抗Fc，FL2，x轴)相对于细胞计数绘制的直方图。
图39.诱导型IgG哺乳动物展示细胞系：细胞表面IgG代谢
通过AAVS TALE核酸酶介导的基因整合和杀稻瘟菌素选择，使用具有抗PD1抗体：1549_02_D06(1)、1535_01_E03(2)和337_1_C08(3)以及抗PCSK9抗体博可珠单抗(4)、884_01_G01(5)、5A10i(6)和阿利库单抗(7)的VH和VL的pINT17-Tet建立稳定HEK293细胞系。转染后的第27天，通过添加100ng/ml多西环素来诱导细胞系。诱导后第48小时，细胞用抗Fc-PE染色。荧光强度的直方图(抗Fc，FL2，x轴)相对于细胞计数绘示。
图40.展示抗PD1抗体1549_02_D06(对于PD-1，KD＝2.9nM)和337_1_C08(对于PD-1，KD＝74nM)的细胞系分别用(a)0ng/ml、(b)2ng/ml、(c)4ng/ml和(d)100ng/ml多西环素诱导。显示了FL1通道中的荧光(y轴)相对于前向散射(FSC，x轴)的点阵图。展示1549_02_D06的经标记的细胞显示于每个点阵图的上象限中并且展示337_1_C08的未标记细胞显示于下象限中。图i、ii、iii和iv展现了MACS提纯分别使用的0.1nM、1nM、10nM浓度的PD-1-生物素。图iv展现输入的MACS前群体。每个细胞群的百分比显示于每个象限内。
图41.优特金单抗(灰色)和布瑞金单抗(黑色)的双重染色群体的重叠点阵图。50nM FcRn-Avi标签与抗生蛋白链菌素PE(x轴)和抗人类Fc APC(y轴)的预偶联物的双重染色。图内的门代表作为FcRn非结合剂的优特金单抗，其能够通过FACS从FcRn结合剂分选出来。
图42.抗间皮素重链可变(VH)域抗体群体的生殖系分析。图绘制了每种VH生殖系的输入和哺乳动物低、中和高展示门控群体的出现频率。
图43.抗间皮素轻链可变κ(VLκ)域抗体群体的生殖系分析。图绘制了每种VLκ生殖系的输入和哺乳动物低、中和高展示门控群体的出现频率。
图44.抗间皮素轻链可变λ(VLλ)域抗体种群的生殖系分析。图绘制了每种VLλ生殖系的输入和哺乳动物低、中和高展示门控群体的出现频率。
图45.抗间皮素IgG1抗体的HPLC-SEC。通过瞬时转染Expi-293细胞来表达抗体，通过蛋白质A色谱进行亲和力提纯且透析。使用Agilent 1100HPLC仪器，以0.35ml/min的流量将样品(2μl，1mg/ml)装载于Agilent AdvancedBio SEC 300A，2.7um，4.6x300 mm柱(安捷伦科技，目录号PL1580-5301)。图示为以下所选抗间皮素抗体在215nm的吸光度相对于滞留时间的图：来源于高水平展示组的932_01_A03(黑线)；和来源于低水平展示组的930_01_A12(交替的点和虚线)、930_01_B02(长虚线)、930_01_C12(短虚线)。
图46.人类和CHO AAVS内含子1TALE-核酸酶(TALEN)靶标结合位点的比对。CHOAAVS内含子1DNA序列获自ENSEMBL标注的CHO-K1谷氨酸盐合成酶(GS)基因剔除细胞系寄存号：CHOK1GS_HDv1:scaffold_52:2374828:2406177:1。编号提及人类PPP1R12C内含子1起点。粗体指示人类TALEN靶点的左臂和右臂。星号指示人类与CHO序列之间的同源性并且虚线(-)指示缺失。下划线和斜体指示pINT17靶向载体内的AAVS左同源臂和右同源臂的末端。这种比对用于设计pINT17-CHO靶向载体内的CHO AAVS同源臂并且为了比较，可用于设计CRISPR/Cas9向导RNA。编号1到3的有义或反义CRISPR向导RNA识别位点分别显示于序列上方或下方。
图47.载体pINT17-BSD-CHO(双重启动子抗体IgG表达盒，用于CHO细胞上的表面表达)内的CHO AAVS同源臂。图示为载体内的左和右CHO AAVS同源臂的标注DNA序列。所有其余特征，包括此图中未示出的那些特征，包含双重启动子抗体表达盒，都如关于载体pINT17-BSD所述(图1)并且列举如下
特征：
CHO AAVS左同源臂9-899
杀稻瘟菌素抗性基因942-1343
pEF启动子1611-2794
BM40前导序列2834-2885
人源化D1.3 VL 2888-3219
人类Cκ3227-3532
BGH聚腺苷酸3468-3682
CMV启动子3790-4362
具有内含子4388-4515的小鼠VH前导序列
人源化D1.3 VH 4521-4868
优化的人类IgG1 CH1-CH3 4869-5864
Myc标签5865-5894
PDGFR锚5895-6050
BGH聚腺苷酸6100-6314
CHO AAVS左同源臂6376-7266
f1复制起点7424-7837
pUC复制起点8058-8732
卡那霉素抗性基因9452-10246
图48.通过TALEN或CRISPR/Cas9核酸酶介导的基因整合使抗体展示于CHO细胞表面上。荧光强度(抗Fc，FL2，x轴)相对于细胞计数绘制的直方图。图(从上到下)是CHO对照、pINT17-BSD-CHO V2-尼沃单抗减核酸酶、pINT17-BSD-CHO V1-尼沃单抗减核酸酶、pINT17-BSD-CHO V1-尼沃单抗加CHO TALEN、pINT17-BSD-CHO V1-尼沃单抗加CRISPR3、pINT17-BSD-CHO V1-尼沃单抗加CRISPR2、pINT17-BSD-CHO V1-尼沃单抗加CRISPR1。
图49.抗体在CHO表面上的展示水平。荧光强度(抗Fc，FL2，x轴)的直方图，其相对于CHO细胞的细胞计数绘制(实心图)：(a)博可珠单抗(实线)和884_01_G01(虚线)。(b)MEDI-1912(实线)和MEDI-1912-STT(虚线)。
图50.利用哺乳动物展示来建立“可开发性增强的”群体用于随后的结合选择
a.抗PD1 337_1_C08 VH(i)和VL(ii)链的序列。核苷酸序列图示在密码子上方有翻译单字母氨基酸码。对CDR进行标注(加有下划线)并且以粗体突出显示的CDR3氨基酸经历定点诱变。
b.基于抗体在细胞上的高、中和低展示水平，通过FACS分离抗PD1抗体VH和VLCDR3哺乳动物展示文库且通过用抗Fc-PE染色、通过分析型流式细胞术加以分析。图示(从上到下)为细胞计数(y轴)相对于Fc表达(x轴)的直方图：高(i)、中(ii)和低(iii)抗PD1群体。作为参考，图示为起始抗Fc MACS群体(iv)、“野生型”337_1_C08亲本克隆(v)和不展示抗体的HEK293细胞(vi)。
图51.pINT17-Bi-CMV-艾密次单抗(Emicizumab)，一种含有双向CMV和延伸因子(pEF)启动子的质体，用于细胞表面表达双特异性“臼包杵”共同轻链IgG艾密次单抗。这是一种三顺反子靶向载体，其具有驱动三种基因表达的三种启动子：抗FIXa重链、抗FX重链和共同轻链。图示为AAVS同源臂之间从BglII到BstZ171限制位点的充分标注的核酸序列。编号始于BglII限制位点。下文列出了关键特征。
BGH聚腺苷酸222-8(反向链)
人类Cκ546-232(反向链)
艾密次单抗VL 876-547(反向链)
具有内含子1143-884的人类VL前导序列(反向链)
最小CMV启动子1230-1167(反向链)
CMV启动子1237-1809
具有内含子1835-1973的小鼠VH前导序列
艾密次单抗抗FIXa VH 1974-2339
艾密次单抗抗FIXa CH1-3 2340-3317
Myc标签3318-3347
PDGFR锚3348-3503
BGH聚腺苷酸3553-3767
pEF启动子3818-5152
具有内含子5260-5401的人类VH前导序列
艾密次单抗抗FX VH 5402-5758
艾米珠单抗抗FX CH1-3 5759-6733
Myc标签6734-6763
PDGFR锚6764-6916
SV40聚腺苷酸6942-7384
图52.FIXa和FX对HEK293细胞表面上所展示的双特异性抗体艾密次单抗的结合
pINT17-Bi-CMV-艾密次单抗或pINT17-BSD-抗FIXa用于在编码AAVS TALEN的质体存在下转染HEK293细胞。转染后第24小时，分析细胞的抗体展示和结合抗原FIXa或FX的能力。直方图描绘了细胞计数相对于荧光强度，从左到右，其使用以下各物染色：抗Fc-APC、FX-生物素或FIXa-生物素，其与抗生蛋白链菌素-PE预偶联，或单独的抗生蛋白链菌素-PE，用于HEK293细胞展示(a)双特异性艾密次单抗(黑色虚线)、(b)抗FIXa IgG(实心黑线)、(c)HEK293细胞。
图53.艾密次单抗VL与亲本艾密次单抗VL的比对。
CDR由序列上方的条柱指示。点指示与最终艾密次单抗VL的一致性。促成正电荷补丁的残基用粗体突出显示。
图54.HEK293细胞表面上的打结抗体展示与其生物物理学特性之间的关系
(a)HEK293细胞在AAVS TALEN存在下用pINT17-打结抗体转染。利用杀稻瘟菌素选择稳定群体。转染后的第7天，细胞用抗Fc PE(FL2)染色且通过流式细胞术分析。直方图描绘了细胞计数(y轴)相对于荧光强度(抗Fc-PE，x轴)的图且包括KB_A12 EETI-II(黑色实线)、KB_A12 Hstx1(虚线)和KB_A12 ProTxIII(虚线)。KB_A12 Hstx1(虚线)和KB_A12ProTxIII(虚线)的迹线重叠并且似乎合并了。
打结抗体是通过瞬时转染Expi293细胞来表达并且通过蛋白质A亲和色谱来提纯。打结抗体如上文所述通过HPLC-SEC分析并且显示了(b)KB_A12 EETI-II、(c)曲妥珠单抗(Trastuzumab)和(d)KB_A12 ProTx-III的吸光度相对于洗脱体积的图。
图55.打结抗体的突变体文库含有展示水平与亲本打结抗体相比改善的克隆。展示打结抗体的HEK293细胞用抗Fc-PE染色并且通过流式细胞术分析。图示为三个文库(抗FcMACS提纯之后)的细胞计数相对于荧光强度与其相关亲本打结抗体对照展示细胞系相比的直方图。(从左到右)：(a)KB_A12 ProTxIII文库组A(虚线)与KB_A12 ProTxIII对照(实心线)、(b)KB_A12 ProTxIII文库组B(虚线)与KB_A12ProTxIII对照(实心线)、(c)KB_A12HsTx1文库(虚线)与KB_A12 HsTx1对照(实心线)。
实例
实例1.构建靶向载体用于IgG格式化抗体的可溶性表达和细胞表面展示
为了能够使结合剂分子(包括抗体)展示于高等真核细胞表面上和其后续的基因选择，可以利用载体将结合剂基因靶向宿主基因组中的特定位置。载体可以编码可选标记物以实现稳定细胞系的选择并且这种可选标记物可以编码赋予针对杀稻瘟菌素、G418/遗传霉素(Geneticin)、潮霉素(hygromycin)、嘌呤霉素(puromycin)或博莱霉素(zeocin)的抗性的基因。靶向载体可以含有驱动编码可选标记物的基因表达的外源启动子。或者，可以将转基因整合于细胞DNA中位于内源启动子下游的位置，以使正确整合的转基因能够被优先选择。靶向载体也将编码同源臂以允许相关染色体基因座和启动子发生同源重组，从而驱动结合剂分子和聚腺苷酸化(pA)位点的表达。使结合剂分子基因与编码前导序列的DNA融合，以允许经由内质网(ER)分泌到细胞表面和膜锚，例如跨膜域或糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚。
在此使用的靶向载体的示意图显示于图1a中并且充分标注的DNA序列显示于图1b中。质体包括侧接表达盒的AAVS同源臂，以允许转基因在人类AAVS位点同源重组。AAVS基因座最初鉴定为腺相关病毒的共同整合位点并且是异源基因在人类细胞中插入和表达的“安全港”基因座93。核酸酶介导在AAVS位点内裂解之后，靶向载体中的AAVS同源臂通过同源重组促进表达盒整合。杀稻瘟菌素基因在载体内缺乏启动子，但其前面存在剪接受体，所述剪接受体与AAVS基因座的上游外显子建立同框融合。抗体重链和轻链表达盒的细节描述于下文和图1中。
利用此前所述的载体(WO2015166272A2)、通过添加实现其后续组装的限制位点、通过聚合酶链反应(PCR)扩增所选片段来构建靶向载体pINT17-BSD(图1a和1b)。pINT17-BSD的各种元件的起点现已描述。编码AAVS-左同源臂、剪接受体、杀稻瘟菌素抗性基因、聚腺苷酸化位点和延伸因子1α启动子(pEF1α)的DNA来源于pD2质体(WO2015166272A2)，其通过添加5’AsiSI和3’BglII限制酶、通过PCR扩增(1511bp)而产生。利用pD2质体、通过添加5’IgG1 CH3同源序列和3’-HindIII位点对编码Myc标签和PDGFR跨膜域的DNA进行PCR扩增。利用此前描述的pINT3质体(WO2015166272A2)、通过添加5’BglII位点和3’的编码Myc标签的DNA对编码以下的DNA进行PCR扩增：轻链BM40前导序列、抗溶菌酶抗体D1.3的可变轻链(VL)94、人类恒定轻链(CL)、牛生长激素(BGH)pA、即刻早期细胞巨大病毒启动子(CMV启动子)、被内含子分离的小鼠重链前导序列、抗溶菌酶抗体D1.3的可变重链(VH)和IgG1抗体重链恒定域1到3(IgG1 CH1-3)。通过PCR组装将编码pINT17-BSD的4446bp区域(从BglII到HindIII)的两个片段组合，以将PDGR跨膜域直接添加到CH3末端。利用pD2质体(WO2015166272A2)、通过添加HindIII和SbfI限制位点、对编码AAVS右同源臂的区域(从HindIII到SbfI)进行PCR扩增(1168bp)。载体主链从来源于pSF-EF1α(Oxford Genetics OG43)的SbfI到AsiSI位点包含f1和pUC复制起点以及卡那霉素抗性基因。图1b中所示的实例编码人类抗溶菌酶抗体的VL和VH，但使用标准分子生物学技术(例如使用侧接限制酶置换VL和VH基因)能够方便地用其取代其它特异性。
实例2.比较3对抗体在亲本克隆和可开发性增强的克隆上的表面呈现水平
我们检查了三对抗体，其中原始亲本抗体具有不良的可开发性特征和其再经工程改造的子系分子，所述子系分子经改变可改善其自身相互作用和交叉相互作用特性。所述组包括CNTO607(针对介白素IL-13的单克隆抗体)和其经修饰的对应物CNTO607 W100A14。CNTO607在中性pH是难溶的，在高浓度下沉淀于PBS缓冲液中并且显示自身相互作用，如在亲和力捕捉自身相互作用纳米颗粒光谱法(AC-SINS)分析中所测量39。CNTO697的结构测定揭露了重链CDR3中的疏水性补丁。VH CDR3突变W100A使其抗体溶解度与交叉相互作用色谱(CIC)特征均得到改善47。CIC测量了对固定于柱基质上的人类血清多克隆抗体的结合。第二个实例是单克隆抗体，命名为Ang2mAb，其靶向血管生成素2(Tie2受体的可溶性配体和病理性血管生成的调节因子)。然而，Ang2mAb据报道展现不良的表达和聚集。对19种变异体进行结构建模和实验筛选的组合能够对更佳的表达Ang2mAb C49T6进行工程改造，其使不成对的半胱氨酸残基发生突变。最终，我们纳入MEDI-1912，一种抗神经生长因子(NGF)抗体，其通过TrkA和p75受体抑制信号传导7。MEDI-1912可以潜在地用于治疗慢性疼痛，但在溶液中显示沉淀和聚集以及不良的药物动力学特征。MEDI-1912以皮摩尔浓度亲和力结合到NGF并且由命名MEDI-578的“祖父级”抗体进行亲和力成熟，所述“祖父级”抗体在自聚集方面表现良好。通过氢/氘交换-质谱学(HDX-MS)和分子建模，鉴定出由VH CDR1和CDR2内的残基产生的VH域上存在疏水性补丁。由此允许预测负责自缔合和随之发生的聚集的氨基酸。这继而能够设计出具有突变W30S、F31T和L56T的三重突变体(MEDI-1912_STT)，所述突变使自身相互作用界面中断，同时保持针对NGF的效能和亲和力7。
将编码CNTO607、CNTO607-W100A、Ang2mAb、Ang2mAb-C49T、MEDI-1912和MEDI-1912_STT重链和轻链可变域的合成DNA(序列参见表1)克隆到哺乳动物展示载体pINT17-BSD中(载体图谱和序列参见实例1)，证实DNA序列并且制备转染质量的质体DNA。转染前一天，经悬浮液调适的HEK293细胞以5×105个细胞/毫升接种于HEK FreeStyle 293表达培养基中。当细胞在10ml中达到1×106个细胞/毫升的密度时，进行PEI转染。将具有pINT17的抗体基因(1ug)、左和右TALEN质体(各5ug)混合且在未补充的HEK FreeStyle 293表达培养基(1ml)中稀释。添加25000Da MW线性聚乙烯亚胺(PEI)(10ul，1mg/ml，Polysciences)，在室温下培育10分钟。然后将质体DNA/PEI混合物添加到HEK293悬浮细胞(1×106个细胞/毫升，存在于10ml HEK FreeStyle 293表达培养基中)中。以7μg/ml的浓度转染之后的第48小时开始杀稻瘟菌素选择。在实验期间，所述群体保持在选择下。转染后(dpt)的第15天之后，用抗人类Fc PE(Biolegend)将细胞染色。然后通过以下方案将展示抗体的单克隆细胞系染色。使展示抗体的HEK293细胞系或野生型HEK293细胞(一百万个细胞)集结(200g，3分钟，在微量离心管(Eppendorf tube)(1.5ml)中)。使集结粒再悬浮于PBS(1ml)中且离心(600g，2.5分钟)。使集结粒再悬浮于含有抗Fc PE(5μl，Biolegend)的1％BSA/PBS(100μl)中。混合物在4℃下避光培育30分钟。添加0.1％BSA/PBS(900μl)并且使细胞集结(600g，2.5分钟)。将细胞再悬浮于0.1％BSA/PBS(1ml)中，且重复此洗涤步骤一次。将细胞再悬浮于含有7-AAD(5μl/百万个细胞)的0.1％BSA/PBS(200μl)中。使用Intellicyte iQue筛选仪分析经标记的细胞(50μl)。流式细胞术分析(图2)显示所有三对抗体的经改善的子系分子的改善展示水平与存在问题的原始亲本分子相比存在增加的抗体展示水平。
Figure BDA0002526758730000891
表1.测试抗体的VH和VL基因的蛋白质序列.显示了可变抗体重链和轻链的氨基酸序列(单字母码)。可变域加有下划线。抗体对之间的变异残基以粗体突出显示。
实例3a.高浓度下的细胞表面呈现水平与自身相互作用之间的关系
为了检查实例2中描述的抗体的特性，进行了抗体表达和提纯。将编码CNTO607、CNTO607-W100A、Ang2mAb、Ang2mAb-C49T、MEDI-1912和MEDI-1912_STT重链和轻链可变域的合成DNA(序列参见表1)克隆到基于pINT3的双重启动子IgG可溶性表达载体(WO2015166272A2)中并且通过DNA测序来证实克隆正确。
制备质体DNA并且使用所述质体DNA、使用转染试剂ExpiFectamine、根据制造商说明书(A14525，赛默飞世尔科学(ThermoFisher Scientific))转染Expi293细胞(30ml最终培养体积规模)。转染之前的第24小时，以2×106个细胞/毫升的密度接种存在于25.5mlExpi293表达培养基中的细胞。使质体DNA(30μg)在Opti-MEM培养基(1.5ml)中稀释并且使ExpiFectamine 293试剂(80μl)在Opti-MEM培养基(1.5ml)中稀释并且在室温下培育5分钟。然后将稀释的质体DNA(30μg，存在于1.5ml Opti-MEM培养基中)添加到稀释的ExpiFectamine 293试剂(80μl ExpiFectamine存在于1.5ml Opti-MEM培养基中)中并且在室温下培育20分钟。将细胞在37℃、5％CO2、5％湿度下培育且以130rpm搅拌(25mm回转摆幅，ISF1-X，Climo-Shaker，Kuhner)。表达5天后，通过离心(2000g，20分钟)收获培养物上清液。
50ml离心管中的培养物上清液通过添加1/10体积的PBS(pH 7.4)进行pH调节并且添加蛋白质A琼脂糖FF树脂(300μl，Generon，PC-A100)并且在室温下搅拌培育1小时。50ml管以2000g离心5分钟以收集珠粒并且丢弃上清液，得到约1ml珠粒浆液。将此浆液再悬浮，装载于玻璃料柱上(Proteus“1步分批式”midi离心柱，Generon，GEN-1SB08)，离心(50g，1分钟，4℃)且丢弃流过物。柱用2×PBS(2×10ml)洗涤，随后在每个洗涤步骤之后离心(50g，1分钟，4℃)。使用洗脱缓冲液(900ul，0.2M甘氨酸，pH 2.6)洗脱抗体，添加到柱基质中且立即使用中和缓冲液(300ul，1M Tris-HCl，pH 8)中和洗脱液。然后通过离心(50g，1分钟，4℃)将抗体从蛋白质A琼脂糖柱直接洗脱到中和缓冲液中。抗体通过转移到GeBAflex最大管(8kDa分子量截止值，Generon，D045)中进行缓冲交换并且在4升PBS中透析并且在4℃下培育至少3-18小时。利用第二个4L PBS透析步骤重复这个透析步骤。通过测量280nm吸光度和使用1.4的估测消光系数估算浓度、利用比尔-兰伯特定律(Beer-Lambert Law)计算来测定抗体产量和浓度。
通过瞬时表达产生的多肽产量可以被视为可开发性潜力指标。虽然在实例2的3对抗体之间比较瞬时转染的表达产量显示亲本抗体的表达较低，但是通过比较瞬时转染的产量不能明显简单地看出可开发性潜力的显著差异(表2)举例来说，亲本CNTO607抗体的表达产量是34mg/L，而溶解度改善的CNTO607-W100A抗体表达产量是55mg/L。类似地，亲本抗体MEDI-1912的表达产量是33mg/l，相比之下，改善版本的表达产量是53mg/l。Ang2mAb产量是13mg/L，相比之下，工程化后代Ang C49T的产量是34mg/L。
多肽的解链温度有时被当作预测“可开发性”的替代指标并且在一些情况下，已经选择解链温度改善的抗体以期望产生较大可开发性抗体9-11。使用Prometheus NT.4B(Nanotemper)，根据制造商说明书测定解链温度(Tm)和聚集起始温度(Tagg)。使用小毛细管吸收约8-10μl的0.5mg/ml抗体溶液。然后将毛细管夹持就位，以便通过Prometheus仪器进行荧光扫描用于热解链分析。利用Prometheus拟合软件测定解链起始温度和散射起始温度。抗体的解链温度(Tm)与聚集温度(Tagg)相似(参见表2)，均在抗体对组之间并且与临床上批准的阳性对照抗PD1抗体尼沃单抗相比较。这个数据表明这个抗体组的解链温度和聚集温度不能预测自身相互作用和非特异性交叉相互作用的生物物理学特征。
在制备型尺寸排阻色谱期间，MEDI-1912显示的洗脱特征比MEDI-1912_STT更早(图3)，表明其作为较高分子量物质存在并且倾向于自身相互作用。其余抗体的洗脱特征与尼沃单抗相似。为了通过动态光散射(DLS)能够测量抗体自身相互作用，利用超过滤来浓缩尺寸提纯的抗体。每个抗体对所实现的抗体浓度显示于表2中。这揭露了在抗体沉淀发生而堵塞超滤膜之前，将亲本抗体MEDI-1912和CNTO607分别浓缩而超过1.4mg/ml和1.8mg/ml是不可能的。相比之下，将溶解度增强的子系分子MEDI-1912_STT和CNTO607_W100A分别浓缩到29mg/ml和30mg/ml而无沉淀证据是有可能的。对于浓缩的Ang2mAb对来说，未观察到沉淀。动态光散射(DLS)检测亲本抗体MEDI-1912和CNTO607的高阶聚集物质(表2)，而子系分子MEDI-1912_STT和CNTO607_W100A则检测不到，如根据计算的多分散指数(PDI)和累积量(或z-平均值)大小所判断。举例来说，亲本CNTO607和MEDI 1912的PDI分别是0.22和0.15，而子系分子的PDI分别是0.1和0.12，表明单分散状态较均匀(表2)。类似地，亲本MEDI-1912的平均粒度分别是22nm，而子系分子MEDI-1912-STT的平均粒度是13nm，表明低阶聚集状态(表2)。因此，出现显著的自身相互作用，从而在较低浓度下发生可检测的自身相互作用并且在较高浓度下发生沉淀。
Figure BDA0002526758730000921
表2.IgG生物物理学特性.使用Prometheus NT.4B(Nanotemper)，根据制造商说明书测定解链温度(Tm)和聚集起始温度(Tagg)。通过瞬时转染30ml规模的Expi293细胞(赛默飞世尔)来测定表达产量(按照每升培养体积所表达的抗体数量(mg))，随后进行亲和纯化(蛋白质A)并且利用280nm吸光度和1.4的估测抗体消光系数测定经提纯的抗体的产量。在Superdex 200 10/300上使用AKTA Pure系统、使用PBS(pH 7.4)操作缓冲液、通过尺寸排阻色谱进一步提纯抗体。使用Nano S DLS(马尔文仪器公司，英国马尔文)对样品进行动态光散射测量并且使用zetasizer软件(马尔文仪器公司，英国马尔文)计算多分散指数(PDI)和累积量(或z-平均值)大小(Zav)。
这个实例证明就三个不同抗体对来说，哺乳动物细胞展示抗体的水平和其生物物理学特性之间存在非常明显的关系。记录有与自身相互作用、交叉相互作用和不良药物动力学(MEDI-1912)有关的问题的特异性针对IL-13的亲本抗体(CNTO607)、Angiopoietin2(Ang2mAb)和神经生长因子(MEDI-1912)与其溶解度增强的子系分子相比，都产生了较低的细胞展示水平(图2)。
实例3b.支持细胞表面抗体浓度的理论
这个实例展示的潜在推理可以有助于了解当多肽滞留于细胞表面上时真核细胞中的强烈多肽表达能够潜在地实现高局部浓度的本发明方案。
在此所述的工作中，经悬浮液调适的HEK293细胞用于抗体展示。HEK293细胞系具有哺乳动物(人类)起源。细胞大致呈球形，半径为10微米95。如果我们将悬浮液HEK293细胞当作球体，则我们能够计算出抗体在其表面上所占据的体积。(我们为了这个实例假定细胞表面的所有区域同等可及以便抗体展示。如果不是这样，则实现抗体的较高局部浓度)。球体的半径(r)能够根据公式4/3πr3＝4.18r3计算。抗体高度取
Figure BDA0002526758730000932
时，其将以
Figure BDA0002526758730000933
的较大球体存在。因此，抗体体积是这种球体体积与细胞体积之间的差值。
10微米半径的细胞体积是：
4.18x10-15 m3(4180x10-15升)。
包括抗体的较大球体的体积是：
4.198x 10-15m3(4198x10-15升)。
因此，所展示的抗体占据的体积是
0.018x 10-15m3(18x10-15升)。
以类似方式，我们能够计算不同尺寸细胞的体积差。
知道抗体/细胞的数目、分子量和所占体积，我们于是能够计算在细胞表面上所达成的浓度。使用阿沃伽罗常数(Avogadro’s constant)，我们知道6×1023个抗体分子/升将具有150,000mg/ml的浓度。因此，6×1018个抗体分子/毫升将具有1.5mg/ml(10μM)的浓度。利用这种方案计算表3中所示的浓度。
Figure BDA0002526758730000931
表3.
在这些计算中，细胞表面上的抗体数目取为106个拷贝/细胞。实验测定拷贝数的方法详述本文中别处并且说明于实例7中。
我们从表3中发现，10微米半径的细胞(例如悬浮培养的HEK293细胞)上估测展示106个抗体/细胞，得到超过10mg/ml的浓度。在此类浓度下，可能潜在地出现蛋白质自身相互作用的问题。因此，具有聚集倾向的抗体因通过内质网减少96和降解增加而在细胞表面上的呈现减少。结果，与非自身相互作用抗体相比，观察到倾向于自聚集的抗体存在较低展示水平。
实例4.基于表面呈现水平富集“可开发性增强”的抗NGF抗体
实例3中描述了抗体的生物物理学特性(尤其自聚集)与其哺乳动物细胞展示水平之间的关系。这通过采用三个抗体对来说明，其中原始亲本抗体就自身相互作用和交叉相互作用而言具有不良的生物物理学特性并且这些特性是通过改变所选氨基酸以建立生物物理学特性改善的子系分子来改善。在所有三种情况下，生物物理学特性改善的子系分子展示于HEK293细胞表面上的水平与存在问题的亲本抗体相比增加。在此实例中，我们证明可以从哺乳动物展示的混合克隆群体中富集生物物理学特性优良的抗体。此研究中选择在小鼠模型7中具有自身相互作用特性和不良药物动力学的亲本抗NGF MEDI-1912以及改善的子系MEDI-1912_STT。进行模型实验，其中我们通过用编码亲本抗体和经修饰的抗体的等量哺乳动物展示质体(实例1)以及编码TALE核酸酶对(其将供体质体导向AAVS基因座)的质体转染HEK293细胞来建立展示MEDI-1912或MEDI-1912_STT的HEK293细胞的混合群体，如此前所述(WO2015166272A2)。药物选择之后，进行荧光活化细胞分选(FACS)并且基于高抗体呈现水平来选择细胞，通过所选抗体基因的分离和序列分析，我们证明从混合群体中选择性富集生物物理学特性改善的抗体。
pINT17-MEDI-1912与pINT17-MEDI-1912_STT(其描述参见实例2)以1:1比率混合并且使用核酸酶介导的基因靶向HEK293细胞而将此混合物整合于HEK293细胞基因组中。通过以200g离心10分钟来收获中对数期HEK293悬浮细胞(生长到1×106个细胞/毫升的细胞密度)并且以1x108个细胞/毫升的密度再悬浮于MaxCyte电穿孔缓冲液中。将由pINT17-MEDI-1912(1μg)、pINT17-MEDI-1912_STT(1μg)、AAVS定向TALEN载体对(各10μg)组成的质体DNA混合物添加到HEK293细胞(100μl，总计1×107个细胞，存在于MaxCyte电穿孔缓冲液中)并且转移到OC100电穿孔光析管中并且使用MaxCyte STX电穿孔系统进行电穿孔。电穿孔之后，在37℃下回收细胞20分钟，在HEK FreeStyle 293表达培养基中稀释并且在120rpm、37℃、5％CO2下维持。以7μg/ml的浓度转染之后的第48小时开始杀稻瘟菌素选择。在实验期间，所述群体保持在选择下。转染后的第15天，细胞如实例2中所述染色，其例外之处是用DAPI染色剂置换7-AAD染色剂，使用NGF-生物素/抗生蛋白链菌素-APC染色剂检测抗原结合并且数量按比例扩大到将1千万个细胞染色。利用流式细胞术分析MEDI-1912/MEDI-1912_STT混合型HEK293哺乳动物展示群体的抗体呈现水平(图5a)，并且这揭露了展示抗体水平不同的两个主要细胞群。这两个群体与单克隆MEDI-1912和MEDI-1912_STT抗体展示水平相关，如重叠图所示(图5a)。混合群体通过FACS分选成两个群体：抗体低水平呈现组和高水平呈现组(分别为门5和6，图5b)。
由FACS分选的细胞群(门5和6，图5b)制备基因组DNA。使用KOD热启动DNA聚合酶(默克密理博公司(Merck Millipore))，通过巢式PCR扩增编码IgG插入片段的DNA。使用以下基因组特异性引物进行外部PCR：正向：CCGGAACTCTGCCCTCTAAC；和反向：TCCTGGGATACCCCGAAGAG。使用KOD聚合酶(71086，默克)，根据制造商条件，使用外部PCR的PCR产物作为模板，以利用以下引物扩增所整合的IgG插入片段；正向：GAGGGCCTGGATCTTCTTTCTC；和反向：GAAGTAGTCCTTGACCAGGCA G。依循制造商说明书(20015964，Illumina)对PCR产物进行条形码编码并且使用Illumina MiSeq测序平台进行测序。分析约一百万个读段并且这揭露了根据抗体的高呈现水平(门5，图5b)分选的群体富集MEDI-1922_STT抗体(96％，图6)。根据抗体低呈现分选的群体富集亲本MEDI-1912抗体(85％，图6)。这个实例证明通过基于细胞表面抗体展示水平选择克隆而从混合群体中选择性富集生物物理学特性改善的由哺乳动物展示的抗体。对此说明的例子是从稳定细胞系的混合群体中富集生物物理学特性比其亲本抗体MEDI-1912优良的MEDI-1912_STT。
我们证明混合群体中能够富集生物物理学特性优良的抗体并且我们表明仅基于哺乳动物展示的呈现水平便能够从变异体的大型文库中鉴定出改善的抗体。如所论述，VHMEDI1912上的残基W30、F31和L56具有在这种抗体的表面上形成疏水性补丁的潜力7。这些残基选用于随机突变并且通过PCR组装诱变由合成DNA模板构建VH文库(引物的氨基酸和核酸序列和位置参见图4)。使用KOD聚合酶(71086-3，默克)，根据制造商说明书，由VH模板扩增三种PCR产物：
a.VH1(95bp)，其使用引物MEDI-1912-F3(CCATGGCCCAGGTTCAGCT G)和MEDI1912_W30NNS_F31NNS(CTGTCGGACCCATGTAAAGG CGCCSNNSNNAAAGGTGCCGCCGCTTGCTTTGCA)扩增。
b.VH2(102bp)，其使用引物MEDI-1912-F(GGCGCCTTTA CATGGGTCCGACAG)和MEDI-1912_L56NNS(CTGGAAGTTCTGGGCCAGA TTGGTSNNGCCGAAGATAGGGATGATGCCGCC)扩增。
c.VH3(213bp)，其使用引物MEDI-1912F2(ACCAATCTGG CCCAGAACTTCCAG)和MEDI-1912-R(ACTCGAGACGGTGACCATTGTG)扩增。
将上文所列的三种PCR产物(VH1、VH2和VH3)组合(各10ng)并且使用KOD聚合酶(71086-3，默克)，根据制造商说明书，使用外部引物MEDI-1912-F3和MEDI-1912-R，通过PCR反应组装。PCR产物用NcoI和XhoI消化并且与经Nco1/Not1消化的pINT17-MEDI-1912(pINT17哺乳动物展示载体(图1)，其编码MEDI1912的VL)(100ng)接合。然后使用mini-Elute PCR提纯试剂盒(Qiagen)提纯这种接合混合物并且使提纯的接合混合物在50μlE.cloni 10G elite电感受态细胞(60061-1，Lucigen)中转化。使用0.1cm光析管对细胞进行脉冲，使用2ml回收培养基回收并且在37℃、250rpm下生长1小时。为了计算文库大小，将细胞1:1000稀释并且以10μl和100μl接种于10cm直径的2TY-卡那霉素培养板中。将剩余细胞离心并且接种于2×10cm直径的2TY-卡那霉素培养板中并且在37℃下培育整夜。对10ul培养板中的群落进行计数并且计算1.1×106的文库大小。由于使用NNS密码子通过使三个残基随机突变而构建的文库编码32,768种变异体，因此实验文库大小超过理论文库大小34倍。刮擦转化体培养板，通过读取600nm吸光度(OD600)来测量细胞密度，使用2个OD单位(2xOD600)的培养等效物接种50ml Circlegrow培养基，在37℃下在250ml有挡板的烧瓶中培养生长3到4小时，收获约400x OD600单位并且制备midiprep质体DNA(pINT17-MEDI-1912-文库)。
核酸酶介导基因靶向HEK293细胞使用pINT17-MEDI-1912-文库。通过以200g离心10分钟来收获中对数期HEK293悬浮细胞(生长到1×106个细胞/毫升的细胞密度)并且以1x108个细胞/毫升的密度再悬浮于MaxCyte电穿孔缓冲液中。将由pINT17-MEDI-1912-文库(8μg)、AAVS定向TALEN载体对(各40μg)组成的质体DNA混合物添加到HEK293细胞(400μl，总计4×107个细胞，存在于MaxCyte电穿孔缓冲液中)并且转移到OC100电穿孔光析管中并且使用MaxCyte STX电穿孔系统进行电穿孔。电穿孔之后，在37℃下回收细胞20分钟，在HEKFreeStyle 293表达培养基中稀释并且在120rpm、37℃、5％CO2下维持。以7μg/ml的浓度转染之后的第48小时开始杀稻瘟菌素选择。在实验期间，所述群体保持在选择下。转染后的第15天，分析细胞，如实例3中所述染色。对HEK293展示的MEDI-1912-文库进行的流式细胞术分析(图7c)表明所述文库的混合群体内具有展示出抗体展示水平与MEDI-1912_STT单克隆细胞系等效(图7b)且展示水平高于亲本MEDI-1912单克隆细胞系(图7a)的细胞。这表明就展示水平而言，克隆存在于MEDI-1912群体中等效于MEDI-1912_STT。
根据抗体呈现水平，通过FACS分选文库群体(图7c)，从P5和P6门内群体中回收抗体基因且通过“下一代测序”(NextGen)对VH基因进行测序，如上文所述。图8显示哺乳动物展示所选群体中的残基30、31和56的氨基酸一致性直方图。其显示氨基酸S、T、P在位置31处富集、氨基酸S、P、N在位置32处富集和氨基酸R、S、T和P在位置56处富集。
为了能够对哺乳动物展示所选抗体进行生物物理学表征，从所选群体的基因组DNA对VH基因进行PCR扩增(门P5和P6，图7)，如实例3中所述。将VH插入片段克隆到具有MEDI-1912VL的pINT17-MEDI-1912、NcoI和XhoI切割载体中，如上文所述，并且使用接合混合物转化大肠杆菌DH10B细胞。挑选188个转型体，制备质体DNA并且对这些转型体进行DNA测序以鉴定密码子在位置30、31和56的身份。基于出现频率(根据NextGen测序)(图8)所选的克隆然后选用于通过瞬时转染进行表达和亲和纯化，如实例2中所述。通过动态光散射(DLS)分析之前，利用超滤来浓缩抗体。所有抗体都能够浓缩到亲本MEDI-1912抗体的8倍与29倍之间(表4)，而没有证据证明在这些浓度下沉淀，表明所选抗体的溶解度高于亲本抗体。DLS也表明所选抗体与亲本抗体MEDI-1912相比具有较低平均粒度(Z-Ave)和较小多分散性(PDI)(表4)。四种所选克隆(P5_C06、P5_F01、P6_C08和P6_F02)相较于此前报道的经改善的克隆MEDI-1912_STT显示优良或等效的单分散度。平均来看，通过子文库随机建立和哺乳动物展示选择所选的经改善的变异体是原始疏水性残基向亲水性残基的变化。
Figure BDA0002526758730000971
Figure BDA0002526758730000981
表4.所选MEDI-1912变异体生物物理学特性.通过以30ml规模瞬时转染Expi293细胞(赛默飞世尔)来表达抗体，随后进行亲和纯化(蛋白质A)。在Superdex 200 10/300上使用AKTA Pure系统、使用PBS(pH 7.4)操作缓冲液、通过尺寸排阻色谱进一步提纯抗体。通过离心过滤来浓缩抗体并且所得浓度以毫克/毫升(mg/ml)显示(C)。使用Nano S DLS(马尔文仪器公司，英国马尔文)对样品进行动态光散射测量并且使用zetasizer软件(马尔文仪器公司，英国马尔文)计算多分散指数(PDI)和累积量(或z-平均值)大小(Zav)。位置30、31和32以单字母码显示氨基酸一致性。
这个实例证明通过哺乳动物展示选择能够将生物物理学特性不良的抗体转化成特性改善(就溶解度和低自身相互作用而言)的抗体。这是通过将所选残基随机诱变并且建立HEK293细胞表面上所展示的大型随机抗体变异体文库来实现。所属领域中的评估抗体可开发性特征(例如溶解度)的技术现状需要按照多毫克规模进行大规模表达和提纯，从而实现全面的生物物理学和PK测量。在利用多肽呈现水平的差异的此实例中，如根据平均荧光强度(MFI)的差异所判断，我们证明能够建立数百万种变异体并且选择随后显示具有改善的生物物理学特性的抗体。可以应用这种方法，其中新颖抗体选自初始文库或在另一系统(例如噬菌体展示)中预选的文库。或者，本发明还可以在抗体的亲和力成熟或人源化期间应用，其中建立变异体文库并且在哺乳动物细胞表面上展示。
实例5.构建变异体文库以及选择可开发性增强的抗PSK9克隆
博可珠单抗是抗前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/枯草溶菌素9型(anti-proprotein convertase substilisin/kexin type 9，PCSK9)mAb，其正由辉瑞(Pfizer)开发以减少血清中的低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。博可珠单抗的作用机理是抑制PCSK9介导LDL受体(LDLR)降解且借此减少血清LDL-胆固醇(LDL-C)97。辉瑞在2016年11月退出研发这种抗体，并宣布“这种抗体不大可能给患者、医师或股东带来价值”。已经报道，博可珠单抗的生物物理学特性不是最优的2并且这可能是其临床失败的原因。举例来说，博可珠单抗在多种分析中展示自聚集与交叉相互作用2。相比之下，FDA批准的抗PCSK9阿利库单抗(Regeneron)抗体在相同分析中不展示相同水平的自聚集和交叉相互作用。
博可珠单抗最初是通过免疫接种PCSK9基因剔除小鼠且根据其抑制PCSK9活性的能力筛选产生单克隆抗体(mAb)的融合瘤克隆而发现的98。然后通过将编码来自重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)的互补决定区(CDR)的DNA克隆到人类构架99而使小鼠mAb 5A10(美国专利：US 8399646B2)发生人源化，其中VH CDR1和VH CDR2中进行氨基酸取代以得到人源化mAb 5A10-i。如此前所述100，对这种人源化抗体5A10-i进一步进行亲和力成熟，以得到博可珠单抗。亲本小鼠mAb 5A10、人源化中间抗体5A10-i与博可珠单抗的VH和VL域的序列比对显示于图9中。5A10、5A10-i和博可珠单抗对PCSK9的亲和力(平衡解离常数或KD)分别是1nM、1.5nM和7，如根据表面等离子体共振(SPR)或KinExA(美国专利：US 8399646B2)所测定。博可珠单抗Fab片段与PCSK9复合的晶体结构已经测定98且这已经显示抗体通过轻链和重链结合到PSK9的催化域，其中以VH CDR3的贡献为主。
核酸酶介导抗体基因整合到HEK293细胞并且在细胞表面上展示之后，我们已经观察到与衍生博可珠单抗的人源化中间版本5A10-i相比，博可珠单抗的细胞表面呈现减少(图10)。这个实例的目的是证明，通过哺乳动物展示能够从变异体文库中选择博可珠单抗变异体，其中良好的呈现水平表明生物物理学稳定性特性改善、自聚集减少和交叉相互作用特性减少或“粘住”所保持的靶抗原结合。重要的是首先鉴定抗体中可能会造成其不良生物物理学特性的区域或“补丁”。举例来说，已知多肽序列内的连续疏水性氨基酸残基能够引起所述蛋白质产生不良的表达水平101。抗体上的疏水性补丁还能够导致不良生物物理学特性6,7,14。类似地，抗体表面上来自簇聚的赖氨酸或精氨酸残基的正电荷补丁还能够通过非特异性结合到新生儿Fc受体(FcRn)22[6或表达带负电分子(例如肝素硫酸盐)的细胞23。
使用本发明产生改善的结合剂的方法始于鉴定序列内的残基作为用于在文库内改变的候选残基。这些位置能够充当使用超过一个替代氨基酸进行随机化的位点或可以是单个氨基酸取代的位点。诱变可以使用所属领域的技术人员已知的方案进行，例如寡核苷酸定向诱变(102《分子克隆：实验指南(Molecular Cloning:a Laboratory Manual)》第3版，Russell等人，2001，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，和其中的参考文献)。在博可珠单抗的这种情况下，可获得三维结构，对其加以分析并且鉴定用于诱变的候选氨基酸残基。结构建模可以用作有助于鉴定用于诱变的靶氨基酸的替代方案。
在本发明内熟练产生和筛选数百万种变异体意味着能够对序列变异体进行充分的检索，即使在缺乏任何3D结构信息或模型的情况下，例如通过检视线性序列。这能通过分析线性序列的特征(例如疏水性或电荷簇聚)来完成。作为一个替代方案，能够进行聚焦于个别氨基酸的突变扫描以便在亲和力成熟操作期间引导较大规模的组合型诱变操作103。利用相同方案，个别氨基酸可以被替代的氨基酸组取代以鉴定具有改善生物物理学特性的潜力的个别残基。这些残基随后可以形成用于组合型诱变的基础，其中多个位置同时改变。在抗体基因的情况下，与生殖系序列进行比对可以有助于鉴定用于改善表达的最优氨基酸变化。VH上的非互补位氨基酸残基采取这种方案。对疏水性或电荷补丁有贡献的残基是VHCDR1内的Y33、VH CDR2内的F54和R57(图9)。与人类VH生殖系序列的多序列比对显示于图11中。基于这种比对，使对疏水性或电荷补丁有贡献的非互补位博可珠单抗VH氨基酸回复为下文所列的生殖系序列：
a.VH Y33A(回复为生殖系IGHV1-3*01)
b.VH Y33D(回复为生殖系IGHV1-8*01)
c.VH S52N、F54S、R57S(三重突变体回复为生殖系IGHV1-46*01)
d.VH Y33A、S52N、F54S、R57S(a.和c.：组合的突变体)
e.VH Y33D、S52N、F54S、R57S(b.和c.：组合的突变体)
对于互补位残基来说，建立随机突变体文库以能够根据呈现和保持的抗原结合进行选择(图9)。VL内存在问题的候选残基是：Y53、L94和W95。根据博可珠单抗与PCSK9的共晶体结构，这些残基直接与靶抗原相互作用或间接通过异位相互作用促成结合，例如VL CDR3残基W95似乎抵着VH CDR3残基压紧并且可以维持VH CDR3构象以便最优结合到PCSK9。通过在这些位置中构建随机文库和选择，将能探究是否存在最优的氨基酸组合以便改善生物物理学特性、同时保持抗原结合。替代的文库设计可能涉及使VH CDR1和CDR2内的所选非互补位残基发生随机诱变。
设计合成性VH基因块并且加以合成，所述基因块编码上文(a)到(e)所列的以下构建体和原始野生型博可珠单抗(f)。编码这些合成基因的DNA序列显示于图12中。使用引物3054和3055对这些基因块进行PCR扩增(表5)，以产生375bp产物。这种产物通过离心柱提纯，用NcoI/XhoI消化并且通过离心柱提纯。然后使6个经消化的VH插入片段与pINT17-VHNcoI/XhoI切割载体接合，接合用于转化大肠杆菌DH5α，挑选个别群落，制备小型制备型质体DNA且证实DNA序列。
Figure BDA0002526758730001011
表5.引物序列.
使用VL基因模板、通过NNS PCR组装诱变而使VL Y53、L94、W95密码子发生随机突变，所述VL基因模板在经受诱变的位置含有终止密码子(VL基因模板序列参见图12)。进行以下PCR：
a)使用引物3071/3047(表5)对博可珠单抗VL加终止子基因块(序列参见图12)进行PCR扩增，得到353bp产物。
b)使用引物3071/3069(表5)，使用上述模板(a)进行PCR，得到191bp产物。
c)使用引物3073/3070，使用上述模板(a)进行PCR，得到146bp产物。
d)使用上述PCR反应产物b和c，使用外部引物3071/3075进行PCR组装反应，得到353bp插入片段。产物用NheI/NotI消化且通过离心柱提纯。
上述6种VH变异体a到f(参见图12)与编码恒定κ轻链(CL-κ)的“填充”片段、聚腺苷酸、CMV启动子和信号序列和VL NNS文库通过PCR组装在一起。使用引物κ填充子F4(GTACCGCGGCCGCACCTTCCG)和λ填充子R3(CAGCCATGGCGCCTGTGGAGAGAAAGG)，从pINT3质体扩增填充片段(WO2015166272A2)。组装的插入片段用NheI和XhoI消化，通过离心柱提纯并且与pINT17-BSD靶向载体(100ng)接合(每个接合反应50ng插入片段)，用NheI和XhoI预消化。使用mini-Elute PCR提纯试剂盒(Qiagen)提纯接合混合物(20μl)并且使提纯的接合混合物(4μl)在E.cloni 10G elite电感受态细胞(50μl，600512，Lucigen)中转化。使用0.1cm光析管对细胞进行脉冲，使用2ml回收培养基回收并且在37℃、250rpm下生长1小时。为了计算文库大小，将细胞1:1000稀释并且接种(10μl和100μl)于10cm直径的2TY-卡那霉素培养板中。将剩余细胞离心并且接种于2×10cm直径的2TY-卡那霉素培养板中并且在37℃下培育整夜。对10μl培养板中的群落进行并且文库大小经计算是2×106个转型体。为了代表每种变异体，所需文库大小是1.2×105个克隆。(323＝3.4×104/文库×6VH突变体)，因此所产生的文库代表所需文库多样性的16倍过度表达。刮擦转化体培养板，测量OD600，使用2OD600接种50ml circlegrow培养基，培养基在250ml有挡板的烧瓶中在37℃生长3到4小时，收获约400OD600单位并且制备6种midiprep质体DNA，其代表6种VH博可珠单抗变异体与三个NNS密码子VL文库的组合(图12)。通过读取260nm吸光度定量6种midiprep质体DNA并且以等摩尔比混合，得到博可珠单抗靶向载体文库pINT17-BSD-Boco1-文库。
转染前两天，经悬浮液调适的HEK293细胞以2.5×105个细胞/毫升接种于HEKFreeStyle 293表达培养基中。转染当天，将细胞离心并且以108个细胞/毫升的最终体积再悬浮于制造商的电穿孔缓冲液(1ml，Maxcyte电穿孔缓冲液，赛默飞世尔科技,目录NC0856428)中，所述电穿孔缓冲液含有pINT17-BSD-博可珠单抗-文库(20μg)以及编码AAVS左和右TALE核酸酶(TALEN，各100μg)的质体。将HEK293/质体DNA混合物(0.4ml)转移到单个OC-400光析管(MaxCyte，目录OC-400R10)并且使用MaxCyte STXG2在HEK293配置下进行脉冲。对照物(减TALEN和pINT17-BSD-博可珠单抗和pINT17-BSD-5A10-i)使用OC-100光析管(MaxCyte，目录号OC-100R10)在相同配置下转染。将电穿孔的细胞转移到锥形瓶(250ml)之后，允许细胞在添加FreeStyle 293表达培养基(40ml，LifeTech，目录号12338018)之前搁置30分钟。使细胞充分再悬浮并且置于设定为130RPM、37℃°和5％CO2的回转式振荡培育箱中。
在24小时后，1×106个细胞用抗人类Fc PE(剑桥生物科学(CambridgeBioscience)，目录号409304)染色以证实瞬时表达。简单来说，细胞以600xg离心2.5分钟。丢弃上清液并且将细胞再悬浮于0.1％BSA(从7.5％溶液稀释：LifeTech，目录号15260037)中。再次将这些细胞离心并且再悬浮于100μl的1％BSA/PBS(其中添加有1μl抗人类Fc PE)中。这些细胞在4℃下在暗处培育30分钟。细胞用1ml的0.1％BSA/PBS洗涤两次并且再悬浮于0.5ml的0.1％BSA/PBS中，所述PBS含有5μl的7-AAD(eBioscience，目录号00-6993-50)。去除50μl并且添加到96孔板的各孔中。使用IntelliCyt流式细胞仪分析呈现水平并且其显示用于转染的瞬时细胞表面抗体。当观察到瞬时表达时，培养物前行至进行选择，所述选择使用抗生素杀稻瘟菌素S HCl(LifeTech，目录号R21001)，浓度为7.5μg/ml。细胞以0.25x106个细胞/毫升接种于锥形烧瓶(Erlenmeyer flasks)中。细胞还接种于10cm培养皿(康宁(Corning)，目录号353003)中的DMEM(LifeTech，目录号41965039)中，所述DMEM含有10％FBS(西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich)，目录号F9665-500 ML)和1％青霉素/链霉素(西格玛奥德里奇公司，目录号P0781-100ML)，10ml中含有10,000个细胞或1000个细胞。允许这些细胞在添加7.5μg/ml的杀稻瘟菌素S HCl(LifeTech，目录号R21001)之前附接24小时。转染12天之后，培养板用2％亚甲基蓝染色。通过对根据总细胞的指定输入所达成的杀稻瘟菌素群落数目计数来计算转染效率百分比。整合效率经计算是2％并且4千万细胞转染所达成的文库大小是800,000，为所需理论文库大小(120,000)的7倍大。因此，构建编码变异体的所有可能组合的哺乳动物展示文库。
在杀稻瘟菌素S HCl(LifeTech，目录号R21001)选择5天之后，使用MACS珠粒和柱(美天旎(Miltenyi)，目录号130-048-801及目录号130-042-401)号富集细胞。文库已经扩增到逾2亿个细胞。1亿个细胞以200xg离心并且用0.1％BSA-PBS洗涤。将这些细胞再悬浮于9.9ml的1％BSA-PBS中并且添加100μl的抗人类Fc PE抗体(剑桥生物科学，目录号409304)。剩余1亿个细胞也进行离心，洗涤并且与生物素化PCSK9抗原(10nM，PC9-H82E7，AcroBiosystems，10ml，在1％BSA-PBS中稀释)一起培育。两者均在4℃下、在暗处培育30分钟。从这一点看，使用自动MACS漂洗溶液(美天旎，目录号130-091-221)。细胞用自动MACS漂洗溶液(10ml，1×PBS+2mM EDTA+0.5％BSA)洗涤，以200xg离心并且再悬浮于800μl自动MACS漂洗溶液中。添加200μl的抗PE(美天旎，目录号130-048-801)微珠或抗生蛋白链菌素(美天旎，目录号130-048-101)微珠。将这些物质在4℃下、在暗处培育10分钟，随后用10ml的自动MACS漂洗溶液洗涤并且再悬浮于5ml备用液中以施加到柱中。MACS LS柱(美天旎，目录号130-042-401)用3ml自动MACS漂洗溶液预洗涤，随后添加细胞。每组细胞使用4x柱。将1/4(约1.25ml)的细胞添加到每个柱中后，用3ml缓冲液洗柱3次。从磁力夹持器中移出LS柱并且添加5ml缓冲液。使用活塞将其通过柱推入15ml法尔康管(Falcon tube)中以洗脱所结合的细胞。为了进一步提纯群体，将此5ml添加到新制的柱(如前所述预洗涤)中并且如前所述处理。对细胞计数并且发现在5ml中是约1.5x106个细胞/毫升。将这些细胞离心并且再悬浮于30ml的含有7.5μg/ml杀稻瘟菌素的FreeStyle培养基FreeStyle 293表达培养基(LifeTech，目录号12338018)，并且在37℃、5％CO2下培育直至备好传代。
MACS后的第48小时，针对Fc呈现和抗原结合将细胞染色(图13)。因此，基于针对抗原或Fc表达的第一轮选择来建立2个群体(选择编号分别为884和885)。随后利用流式细胞术，针对抗原与Fc表达的组合来选择这些细胞。程序与此前所述的24小时染色相同，但有如下调整：将细胞与10nM生物素化人类PCSK9、Avi-标签(目录号PC9-H82E7-25ug，ACRObiosystems)一起在4℃下培育30分钟，随后洗涤并且与抗人类Fc PE(1μl/1x106个细胞)(剑桥生物科学，目录号409304)和抗strep APC(英杰公司(Invitrogen)，目录号SA1005)(0.5μl/1x106个细胞)的混合物一起培育。7-AAD(eBioscience，目录号00-6993-50)用于如前所述评估存活率。洗涤细胞并且使用IntelliCyt仪器进行分析，如此前所述(图10)。选择14天之后，使用BD Influx进行FACS。将针对抗原结合或Fc呈现分选出的MACS分选群体中的20x106个细胞与10nM生物素化人类PCSK9(PC9-H82E7-25ug，ACRObiosystems)一起培育(如此前)，随后洗涤并且与抗人类Fc PE(1μl/1x106个细胞)(剑桥生物科学，目录号409304)和抗strep APC(0.5μl/1x106，SA1005，英杰公司)的混合物一起培育。即将分选之前添加DAPI(1μl/百万个细胞)。将细胞分选到两个其它群体：较高抗原结合群体(门P5)和较低抗原结合群体(门P6)，如图14所示。使FACS提纯的这些群体在缺乏杀稻瘟菌素、但存在1％青霉素/链霉素的情况下生长以免被细胞分选过程污染。培养4天之后，每个群体取1x106个细胞用于提取基因组DNA。
使用KOD热启动DNA聚合酶(默克密理博公司)，通过巢式PCR扩增编码IgG的DNA，如实例4中所述。对PCR产物进行凝胶提纯并且用NheI和XhoI消化，克隆到哺乳动物pINT3表达载体中并且用于转化大肠杆菌DH10B细胞。
对未选定的随机输入克隆(84)、所分选的抗原(75)和所选Fc(85)进行测序并且测定VH一致性。从哺乳动物展示选择循环所得的经测序的克隆组中都不存在原始博可珠单抗VH基因，而是强烈偏向由IGHV1-46*01生殖系构成的变异体(参见图15)。测定同组克隆的VL序列。计算3种突变密码子的平均pI和脂肪族指数。其显示根据哺乳动物展示选择的抗体的pI与脂肪族指数均减小(图16)，表明大大偏离CDR2和3中的原始疏水性氨基酸。
为了表明根据哺乳动物展示选择的博可珠单抗变异体的生物物理学特性优于亲本抗体，接下来对所选抗体进行表达。根据选择将克隆挑选到96孔板中(91/群体)：针对PCSK9的MACS(命名为选择884)或针对抗Fc的MACS(命名为选择885)。这些群落用于两板DNA，以便使用Qiagen Plasmid Plus 96Miniprep试剂盒(Qiagen，目录号16181)、依循制造商说明书进行转染。使用这种DNA，使用Expi293转染系统(LifeTech，目录号A14525)、依循制造商说明书转染两个96孔板的Expi293细胞。5天之后，收获这些细胞并且使上清液保持在4℃。为了测定抗体聚集倾向，使用一种称为AC-SINS(亲和力捕捉自身相互作用纳米颗粒光谱法)的方法。所用方法基本上如Liu等人，201439所述，但有以下修改。用PEG阻断金纳米颗粒(AuNP，柠檬酸盐稳定化的20nm金纳米颗粒，15705，Ted Pella有限公司)之后，将AuNP在4℃下储存直到需要时为止(最长一周)。AuNP在4℃下以15,000RPM离心10分钟，去除95％上清液且进一步在相同条件下离心，而非使用针筒过滤器浓缩到10倍。将最终AuNP再悬浮于1/10的起始体积中。聚丙烯96孔板的每个孔(含有100μl存在于上清液中或在PBS中提纯的测试抗体)中添加10μl。培养板在室温下、在设定为700RPM的振荡平台上培育2小时。如Liu等人(2014)39所述，将内容物小心地转移到聚苯乙烯UV透明板中。使用BMG Pherastar仪器，以2nm增量收集450到650nm的吸光度数据。鉴定最大吸光度的波长并且任一侧的10个点与紧邻之前及之后的点一起平均化以减少杂讯误差。这些平均值的最高点取作最大吸光度。图17列出了AC-SINS分析的结果以及抗体CDR序列。所选变异型克隆中的大部分(86/91)显示12nm或更小的AC-SINS波长漂移，相当于人源化中间克隆5A10-i。这种波长表明在这些样品中，自缔合不会以任何大的程度发生。相比之下，博可珠单抗使AC-SINS产生26nm的波长漂移(图17)，并且所选组中仅5种克隆产生大于20nm的波长漂移。因此，已经根据哺乳动物细胞展示选出自聚集倾向低于原始亲本克隆的博可珠单抗变异型克隆，如通过AC-SINS分析所判断。
来自表达过的培养板的上清液也用于比较抗体保持结合到PCSK9的能力。这是在捕捉ELISA分析中使用单体抗原进行，已显示这是对抗体结合到其靶标进行亲和力排序的有效方式。简单来说，96孔Maxisorp培养板(Nunc，目录号437111)在4℃下用含有3μg/ml抗人类Fc抗体(Jackson ImmunoResearch，目录号209-005-098)的PBS涂布整夜。次日，培养板用1×PBS洗涤3次并且随后在室温下用300μl含有3％(w/v)奶粉(Marvel)的1×PBS(M-PBS)阻断1小时。这些培养板用1×PBS洗涤3次，并且向每个孔中添加30μl的6％(w/v)奶粉(Marvel)。添加30μl的各上清液并且在室温下培育1小时。培养板然后用1×PBS-Tween(0.1％)洗涤3次并且然后用1×PBS洗涤3次。向各孔中添加每孔60μl的0.1nM生物素化人类PCSK9、Avi-标签(ACRObiosystems，目录号PC9-H82E7)并且将培养板在室温下培育1小时。培养板如前所述用1×PBS-Tween洗涤，随后用1×PBS洗涤。每孔添加60μl含有抗生蛋白链菌素-铕(珀金埃尔默(Perkin Elmer)，目录号1244-360)的DELFIA分析缓冲液(珀金埃尔默，目录号1244-111)(1:500稀释度)并且在室温下培育1小时。培养板最后一次用1×PBS-Tween和1×PBS洗涤，随后每孔添加50μl的DELFIA增强溶液(珀金埃尔默，目录号4001-0010)。将培养板在板振荡器上、在300RPM下放置5分钟并且在BMG Labtech PHERAStar读盘器(激发340nm，发射615nm)上读取。这表明大部分抗体对PCSK9保持结合，其中若干抗体显示的捕捉ELISA信号等效于博可珠单抗(KD＝7pM)和5A10-i(KD＝1.5nM)中间克隆(图17)。这表明通过建立文库和哺乳动物展示选择，能够靶向抗体互补位残基并且选择同时具有改善的生物物理学特性和保持结合到靶抗原的能力的抗体。
然后基于低AC-SINS波长漂移和抗原结合保持的AC-SINS培养基上清液分数来选择克隆(图17)。这些克隆连同博可珠单抗、5A10-i和阿利库单抗(批准的抗PCSK9抗体)一起然后通过瞬时转染Expi-293细胞(50ml规模)表达并且通过蛋白质A亲和色谱来提纯，随后透析，如实例3中所述。然后通过HPLC-SEC分析抗体并且这表明所选的全部抗体显示的HPLC滞留时间和峰宽与对照阿利库单抗抗体和5A10-i相等(图18)。相比之下，博可珠单抗在柱上迟滞并且显示较长的滞留时间。博可珠单抗也显示了不对称的峰，也表明其具有交叉相互作用特性并且不会特异性结合到柱基质。经提纯的抗体也通过AC-SINS分析并且其显示波长漂移与阿利库单抗和5A10-i相等(Δλ＝8到12nm)，而博可珠单抗显示较长的AC-SINS波长漂移，表明其具有自身相互作用特性(Δλ＝39nm)。表达产量、AC-SINS波长漂移、HPLC-SEC滞留时间和HPLC-SEC峰宽概括于表6中。
因此，这个实例已举例说明能够利用高等真核细胞上的结合剂展示来选择可开发性特征改善(包括减少的自身相互作用和减少的非特异性相互作用、同时保持对靶标的结合)的变异体。在这个实例中，这是如下实现的：首先鉴定抗体表面上的疏水性和正电荷补丁，进行随机或靶向诱变以建立变异体文库并且利用核酸酶介导的结合剂基因打靶来实现每个细胞的单个基因拷贝。然后基于细胞展示水平和抗原结合来分选细胞展示文库，以鉴定生物物理学特性改善的亲本抗体的变异体。
Figure BDA0002526758730001071
表6.比较博可珠单抗和改善型变异体的生物物理学特性(包括AC-SINS分析中的波长漂移(nm)、HPLC-SEC滞留时间、峰宽和表达产量).
实例6a.通过选择增强非交叉相互作用克隆的可开发性
具有非特异性结合到除其靶标之外的分子的特性并且具有体内不良半衰期的抗体能够引起“脱靶”结合，导致药物动力学(PK)和药效学(PD)不良。另外，在抗体制造期间，交叉相互作用或“粘着”特性会带来问题，主要导致在提纯或配制期间被柱基质迟滞的问题。
这个实例证明能够利用哺乳动物抗体展示将存在已知“粘着”或交叉相互作用问题的抗体与表现良好且已批准用于临床用途的抗体区分开来。选择抗神经纤毛蛋白-1抗体韦森单抗(或MNRP1685A)作为“粘性”抗体的一个实例。已知这种抗体在尺寸排阻色谱期间被迟滞并且非特异性地结合到柱基质。这被认为造成其在动物模型中的半衰期不良104。另外，在观察到蛋白尿症副作用之后，停止了这种抗体的临床开发105。选择抗PD1抗体尼沃单抗作为表现良好的抗体实例，其已批准用于临床用途106。韦森单抗在亲和力捕捉自身相互作用纳米颗粒光谱(AC-SINS)分析中也显示一些自身相互作用39。
Figure BDA0002526758730001072
Figure BDA0002526758730001081
表7.韦森单抗和尼沃单抗重链和轻链的蛋白质序列以单字母码显示了完整抗体重链和轻链的氨基酸序列。可变域加有下划线。
将编码韦森单抗和尼沃单抗重链和轻链可变域的合成DNA(其序列参见表7)克隆到基于pINT3的双重启动子IgG可溶性表达载体(WO2015166272A2)中并且证实DNA序列。为了检查可溶性抗体的特性，由pINT3-韦森单抗和pINT3-尼沃单抗制备质体DNA并且使用其转染Expi293细胞(30ml最终培养体积规模)，此转染使用转染试剂ExpiFectamine、根据制造商说明书(A14525，赛默飞世尔科学)进行。转染之前的第24小时，以2×106个细胞/毫升的密度接种存在于25.5ml Expi293表达培养基中的细胞。使质体DNA(30μg)在Opti-MEM培养基(1.5ml)中稀释并且使ExpiFectamine 293试剂(80μl)在Opti-MEM培养基(1.5ml)中稀释并且在室温下培育5分钟。然后将稀释的质体DNA(30μg，存在于1.5ml Opti-MEM培养基中)添加到稀释的ExpiFectamine 293试剂(80μl ExpiFectamine存在于1.5ml Opti-MEM培养基中)中并且在室温下培育20分钟。将细胞在37℃、5％CO2、5％湿度下培育且以200rpm搅拌(50mm回转摆幅，ISF1-X，Climo-Shaker，Kuhner)。表达5天之后，通过离心(2000g，20分钟)收获培养基上清液并且如上文所述通过蛋白质A亲和色谱来提纯(实例3)。通过测量280nm吸光度和使用1.4的估测消光系数估算浓度、利用比尔-兰伯特定律计算来测定抗体产量和浓度。韦森单抗和尼沃单抗的表达产量相似(分别是95mg/L和103mg/L)。此外，增加抗体浓度时，以瞬时转染效率实现的表达产量不能解决即将发生的问题。
尼沃单抗和韦森单抗的生物物理学特性是通过若干技术测定。如上文(实例3)所述使用Prometheus NT.4B(Nanotemper)确定解链温度(Tm)和聚集起始温度(Tagg)。两种抗体的解链温度(Tm)和聚集温度(Tagg)相似(参见表8a)。这再次证明解链温度不能预测即将发生的问题。
Figure BDA0002526758730001091
表8a.韦森单抗和尼沃单抗IgG生物物理学特性.使用Prometheus NT.4B(Nanotemper)，根据制造商说明书测定解链温度(Tm)和聚集起始温度(Tagg)。通过瞬时转染30ml规模的Expi293细胞(赛默飞世尔)来测定表达产量(按照每升培养体积所表达的抗体数量(mg))，随后进行亲和纯化(蛋白质A)并且利用280nm吸光度和1.4的估测抗体消光系数测定经提纯的抗体的产量。在Superdex 200 10/300上使用AKTA Pure系统、使用PBS(pH7.4)操作缓冲液、通过尺寸排阻色谱进一步提纯抗体。使用Nano S DLS(马尔文仪器公司，英国马尔文)对样品进行动态光散射测量并且使用zetasizer软件(马尔文仪器公司，英国马尔文)计算多分散指数(PDI)和累积量(或z-平均值)大小(Zav)。
然而，在制备型尺寸排阻色谱期间，观察到显著的柱基质结合和迟滞(表8a和图19)，如此前所述。尼沃单抗和韦森单抗的洗脱体积(Ve)分别是12.0ml和13.7，表明韦森单抗被迟滞并且与柱基质发生非特异性相互作用。10.4ml的另一洗脱峰表明存在一些较高分子量的聚集抗体，而尼沃单抗未观察到。为了研究抗体在储存期间的稳定性，根据尺寸提纯的抗体在PBS pH7.4中、在4℃下培育2周。动态光散射(DLS)检测到韦森单抗出现较高阶聚集物质，而尼沃单抗则未检测到(方法参见图20和图例)使用Zetasizer APS(马尔文仪器公司，英国马尔文)对在4℃已储存2周的样品进行动态光散射测量。DLS得到的生物物理学参数-计算的多分散性百分比、多分散指数(PDI)、累积量(或z-平均值)大小和平均分子量显示于表8中并且显示与在4℃下储存2周后呈单分散性的尼沃单抗相比，韦森单抗在相同条件下显著聚集。
将编码韦森单抗和尼沃单抗重链和轻链可变域的合成DNA克隆到哺乳动物展示载体pINT17-BSD(载体图谱和序列参见实例1)中，证实DNA序列并且制备转染质量的质体DNA。HEK293细胞用TALE核酸酶转染并且如上文在实例2中所述建立稳定细胞系。转染后(dpt)14天之后，细胞在4℃下用抗人类Fc PE(409303，Biolegend)染色30分钟以测定抗体显示的展示水平(参见实例2)。展示尼沃单抗或韦森单抗的单克隆细胞系然后根据以下方案、用经标记的人类血清染色。
将热灭活的人类AB血清(5μl，40mg/ml H4522，西格玛(Sigma))在PBS(195μl)中稀释以得到1mg/ml的最终浓度。这种稀释的人类血清然后使用Lightning-
Figure BDA0002526758730001102
Rapid
Figure BDA0002526758730001101
633试剂盒(325-0000，Innova)、根据制造商说明书、用Dylight 633标记。使展示尼沃单抗或韦森单抗的HEK293细胞系或野生型HEK293细胞(一百万个细胞)集结(200g，3分钟，在微量离心管(1.5ml)中)。使集结粒再悬浮于PBS(1ml)中且集结(600g，2.5分钟)。使集结粒再悬浮于含有抗Fc PE(0.5μl，409303，Biolegend)的1％BSA/PBS(100μl)中并且用AB血清Dylight 633标记(5μl，0.5mg/ml)。混合物在4℃下避光培育30分钟。添加0.1％BSA/PBS(900μl)并且使细胞集结(600g，2.5分钟)。将细胞再悬浮于0.1％BSA/PBS(1ml)中，且重复此洗涤步骤一次。将细胞再悬浮于含有7-AAD(5μl/百万个细胞)的0.1％BSA/PBS(200μl)中。使用Intellicyte iQue筛选仪分析经标记的细胞(50μl)。流式细胞术分析(图21)显示，与分别就抗体和人类血清结合而言呈双重阳性的尼沃单抗(分别为12.3％和3.7％)相比，经标记的人类血清对HEK293细胞的结合增加。
韦森单抗是一种开发失败而未超越1期临床试验的抗体105并且是具有已知自聚集和交叉相互作用特性的抗体39,104。我们还已经表明，这种抗体显示与尺寸排阻柱基质存在非特异性相互作用(图19)并且在储存后聚集(图20和表8)，相比之下，临床上批准的抗PD1抗体尼沃单抗在尺寸排阻色谱期间未显示交叉相互作用并且在储存之后保持单分散性。我们在此表明，当韦森单抗和尼沃单抗在交叉相互作用流式细胞术分析中展示于HEK293细胞表面上时，我们能够将他们区分开来。可能的是，能够优化这种分析以允许在“粘性”抗体与表现良好的抗体之间作出甚至更大的区分。举例来说，人类血清可以生物素化并且与荧光团标记的抗生蛋白链菌素偶联，所述抗生蛋白链菌素与增强的亲合力偶联。或者，可以修改如此前所述的流式细胞术的任何数目个交叉相互作用分析2并且包括(但非排他地)经标记的杆状病毒16,19，或蛋白质、DNA和含肝素硫酸盐分子的经标记的混合物107。
实例6b.多反应性筛选的改善
使用具有已知多反应性特征的已知抗体，我们进一步举例说明在展示结合剂的细胞克隆群体内，基于对非靶分子的结合差异(多反应性探针)，将多反应性结合剂与非多反应性结合剂区分开来的可能性。我们证明未能结合多反应性探针的克隆富集。
使用核酸酶定向整合来制备表达优特金单抗、布瑞金单抗和阿玛西单抗(amatuximab)的HEK293细胞的个别群体。所述个别群体用生物素化DNA染色。检测到表达布瑞金单抗和阿玛西单抗的细胞结合到DNA，而表达优特金单抗的细胞未被染色。使DNA结合依模式归一化。图33A.抗Fc抗体染色揭露，布瑞金单抗群体是IgG表达细胞与非表达细胞的混合物，说明所述群体内存在DNA结合细胞与DNA非结合细胞的近似50:50混合物。不同细胞群用细胞追踪染料标记并且等比例混合。阿玛西单抗细胞用CellTrace Far红标记(在图33B和C的Q3中、在x轴上显示)，布瑞金单抗用CellTrace CFSE标记(在图33B和C的Q1中、在y轴上显示)，而优特金单抗仍不标记(图33B和C的Q4中，双重阴性群体)。混合群体用生物素化DNA(20μg DNA/1百万细胞，存在于200μl 1％BSA中)染色并且用抗生物素微珠标记。使用MiniMACS珠粒与MS柱的组合对所述群体进行分选。MACS分选得到的流过洗脱份使用Intellicyt流式细胞仪分析以对细胞计数。7-AAD用作活力染色剂并且将死细胞排除在分析之外。与布瑞金单抗和阿玛西单抗相比，观察到不结合DNA的优特金单抗富集(图33B、图33C、表8b)。
Figure BDA0002526758730001111
Figure BDA0002526758730001121
表8b.MACS之前及之后，针对各种抗体的相对细胞计数(相对于优特金单抗细胞数目归一化并且相对于10,000个计数归一化)。
与展示优特金单抗的细胞相比，展示布瑞金单抗的细胞的相对百分比减少到37％并且展示阿玛西单抗的细胞减少到10％。由可能的是，由于布瑞金单抗的输入群体包括比例相对较高的非抗体表达细胞并且这些细胞保留于在此选择的“未结合群体”中，因此富集系数甚至可以更高。这种背景可以通过预分选、后分选或协同分选用于IgG表达或抗原结合的细胞来进一步减少，如早先所描述。
在此我们成功地使用MACS，而且预期拆分和有效富集甚至大于FACS流式分选。
还测试了其它多反应性探针将表达多反应性抗体的细胞克隆与表达非多反应性抗体的细胞克隆区分开来的能力。
我们发现基于肝素硫酸盐结合程度可以将表达优特金单抗的细胞与表达布瑞金单抗或加尼图单抗(ganitumab)的细胞区分并分离。简单来说，使用如此前在实例5中所述的标准染色方案，用9μM肝素-FITC(Creative PEGWorks)将250,000个细胞染色。布瑞金单抗和加尼图单抗显示肝素结合。叠加图显示于图34中。这种非特异性结合可能通过布瑞金单抗和加尼图单抗的重链CDR中的带正电补丁发生。
伴随蛋白代表着其它多反应性探针，其可以作为非靶分子用于取消对多特异性结合剂的选择。伴侣蛋白在功能上与蛋白质折叠相关并且有助于蛋白质折叠。热休克蛋白(Hsp)在应激条件(例如高温)下过度表达。大部分伴侣蛋白在正常细胞中也受到丰富的表达，其中他们识别并且结合非原生蛋白质，从而防止聚集。
多种治疗抗体展示于HEK293细胞上并且测试对Hsp70和Hsp90的结合。
在我们的实验测试的抗体中，贝伦妥单抗(brentuximab)和冷自鲁单抗(lenzilumab)显示结合到Hsp70和Hsp90。贝伦妥单抗(维多汀(Vedotin))是一种抗CD30抗体-药物偶联物，其在治疗霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)的临床试验中失败。此前显示其展现自身相互作用和交叉相互作用2。冷自鲁单抗是一种抗GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞群落刺激因子)抗体，其在重度哮喘的II期试验中失败。
图35显示经抗人类Fc PE和与DyLight 633偶联的热休克蛋白(Hsp70和90)双重染色的优特金单抗和布瑞金单抗的叠加图。叠加图内的门指示未显示与伴侣蛋白(Hsp70和Hsp90)发生可检测相互作用并且能够利用FACS分选以提供所选克隆群体的细胞，在所选克隆群体中，识别伴侣蛋白的结合剂已经耗竭(并且优选排除)。
图36中描绘了使用多种不同抗体和不同多反应性探针的多项实验的混合数据。个别安瓿是在分开的独立实验中测试，但Intellicyt流式细胞仪具有固定的电压，因此预期所有样品的荧光强度一致。另外，Hek293用作各实验的内部对照。
下表8c概括了针对多反应性探针的结合测试的一组抗体的数据。
抗体 DNA 肝素 伴侣蛋白 FcRn
阿利库单抗 否 否 否 否
阿玛西单抗 是 是 是 是
贝伦妥单抗 ND ND 是 否
布瑞金单抗 是 是 是 是
加尼图单抗 是 是 否 是
冷组力单抗(Lenzulimab) ND 是 是 否
优特金单抗 否 否 否 否
韦森单抗 ND ND 否 是
表8c.抗体多反应性筛选的概述.是＝抗体显示与多反应性探针结合。否＝抗体未显示与多反应性探针结合。ND＝对多反应性探针的结合未测定。
阿玛西单抗、贝伦妥单抗、布瑞金单抗和冷自鲁单抗显示结合到伴随蛋白。这些抗体的多反应性可能起因于抗体可变域内的疏水性氨基酸簇，从而与也具有疏水区的蛋白质(例如伴随蛋白)产生范德华力相互作用(van der Waals interactions)。多反应性的其它原因可能是存在带正电荷的氨基酸补丁(例如由精氨酸或赖氨酸残基组成)，其与具有净负电荷的分子(例如DNA或乙酰肝素硫酸盐)或与表面上具有正电荷补丁的蛋白质(例如FcRn)发生相互作用22。阿玛西单抗、布瑞金单抗、加尼图单抗和冷组力单抗在我们的实验中都结合DNA和肝素。表面上具有疏水性和带正电荷补丁的抗体可能具有增强的多反应性。基于我们的数据，能够通过疏水性补丁结合伴随蛋白和在中性pH下结合DNA、乙酰肝素硫酸盐或FcRn的抗体实例包括布瑞金单抗、阿玛西单抗和冷组力单抗。这些数据与布瑞金单抗所显示的非特异性结合的早期报道一致2。
实例7.亲本克隆和改善型克隆的展示水平的量化
在实例2中，在核酸酶介导的转基因整合到HEK293细胞中和选择稳定细胞系之后，我们观察到高等真核细胞针对三对抗体的展示水平差异。通过用PE标记的抗Fc将细胞染色以及利用流式细胞术测量平均荧光强度所判断的展示水平与抗体自身相互作用和交叉相互作用特性相关(实例3)。在此实例7中，我们对细胞表面上的抗体展示拷贝数进行量化并且表明展示拷贝数与抗体生物物理学特性相关。使用珠粒、基于校准曲线进行定量测量，其中珠粒具有精确限定数目个Fc特异性捕捉抗体。
Quantum Simply Cellular(QSC)微球体试剂盒(815，Bangs实验室有限公司)具有5个珠粒群-一个空白珠粒群和四个具有数量递增的Fc特异性捕捉抗体(山羊抗小鼠IgG)的珠粒群。QSC珠粒用相同的荧光团偶联抗体染色，所述荧光团偶联抗体用于标记细胞并且在流式细胞仪上根据制造商说明书加以分析。简单来说，将一滴QSC微球体添加到微量离心管中并且添加50μL染色缓冲液(1％BSA)并且轻弹所述离心管。将5ul的PE抗人类IgG Fc抗体添加到QSC微球体中，轻缓地混合并且暗中培育30分钟。QSC微球体用1ml洗涤缓冲液(含有0.1％BSA的PBS)洗涤两次，以2500xG离心5分钟。将珠粒集结粒再悬浮于150ul洗涤缓冲液中。将被染色的珠粒群与空白群体合并(每个群体10ul)于单个孔中并且在Intellicyt中运作。如实例2中所述，对细胞表面上表达不同抗体的HEK293细胞进行并行细胞染色。
通过将每个珠粒群的中值荧光强度相对于其分配的抗体结合容量作图(图26)来产生校准曲线。将抗体表达群体的荧光强度与珠粒的抗体结合容量进行比较并且使用QuickCal(Bangs实验室有限公司)计算线性回归以能够计算抗体展示拷贝数
(表9)。
Figure BDA0002526758730001141
Figure BDA0002526758730001151
表9.使用Quantum Simply Cellular珠粒计算的展示于HEK293细胞上的抗体拷贝数
临床上批准的抗PD1抗体派立珠单抗(就低自身相互作用特性而言，已知具有良好的生物物理学特征2)在这个测试集合中具有最高拷贝数。最密集的校准珠粒具有886,000个拷贝/珠粒并且这超过所述拷贝数(约910,000个拷贝/细胞)。类似地，与治疗牛皮癣的III期人类临床试验中显示不良功效的抗IL-12抗体布瑞金单抗(273,000个拷贝)相比，批准用于临床治疗克罗恩氏疾病的抗IL12抗体优特金单抗在细胞上展示更高拷贝数(706,000)。与优特金单抗相比，布瑞金单抗被描述为具有增强的自身相互作用和交叉特性，如多种分析(包括自身相互作用分析AC-SINS和交叉相互作用分析)中使用多特异性试剂和杆状病毒颗粒所测量2,23。
对于所有三对抗体来说，拷贝数低于对照，经再次工程改造的具有改善的生物物理学特性的子系克隆具有较高的细胞展示拷贝数。举例来说，改善的子系抗体CNTO607-W100A、MED-1912_STT和Ang2mAb_C49的展示拷贝数分别为31.3万、43.3万和57.0万，拷贝数相较于具有已知自身相互作用和交叉相互作用问题的原始亲本分子增加2.8倍、9倍和4.6倍。
在这个实例中，我们表明在核酸酶介导转基因整合到宿主基因组中且选择稳定细胞系之后展示于细胞表面上的抗体拷贝数与所展示抗体的生物物理学特性之间明确相关。在为了测量自身相互作用和交叉相互作用而设计的分析中，具有自身相互作用和交叉相互作用特性的抗体展示的拷贝数低于得分不高的抗体。表现较好的抗体(具有低自身相互作用和低交叉相互作用特性的良好生物物理学特征)在高等真核细胞表面上展示高拷贝数。
实例8a.将针对可开发性的高水平表达与针对亲和性严格度的低水平表达组合
高水平多肽表达，例如其中抗体重链和轻链基因由强组成型启动子驱动的抗体，已经证明适用于从群体中富集具有优良生物物理学特性(例如低自身相互作用)的抗体(如上文在实例3、4和5中所述)。细胞上的高浓度多肽呈现能有助于检测自身相互作用并且增强的亲合力允许灵敏地检测到与其它分子发生的非期望的非特异性相互作用。然而，这种情况的一个不利结果是，高亲和力所达成的富集速率相对于低亲和力减小，即使当使用低浓度的抗原驱动严格度时。这种“低强力”富集的另一结果是，表面呈现实际上可以存在优先选择，即使当目标是富集较高亲和力结合剂时。然而通过使用细胞表面上较低密度的结合剂呈现能够增强富集速率。在以下论述中，我们将使用抗体和其抗原作为代表不同亲和力的结合剂的一般相互作用的实例。
如果我们考虑用100微升体积的106个细胞展示6×105个单价结合位点/细胞，则我们具有6×1011个分子/100毫升或6×1015个分子/升。这个体积中的这种数目个结合位点相当于10nM的浓度。在这种情况下使用低于10nM的抗原浓度意味着抗体相对于抗原是过量的并且相对较高的抗体浓度将有助于驱动缔合，即使是较低亲和力抗体。举例来说，如果试图将表达具有KD 0.1nM的抗体的稀少细胞与表达具有KD 10nM的较低亲和力的抗体的过量细胞分离，则在上文概述的条件(即，10nM抗体浓度的等效条件)下，将有显著比例的抗原与较低亲和力抗体复合。
质量作用定律涉及两种相互作用分子形成复合物。这些公式旨在涵盖自由溶液中的相互作用并且我们正在研究悬浮细胞上固定的抗体。下文的选择率计算考虑了单一抗体在溶液中在各种情况下所形成的复合物的浓度。然而，我们能够利用质量作用定律得到的溶液中的分子行为的这种知识更好地理解亲和力、抗体浓度、抗原浓度和复合物形成之间的关系，原因是其可能影响表面呈现的抗体。
如果混合两种相互作用分子(例如单价抗体(A)和抗原(B))，则他们能够形成复合物(A:B)且最终达到平衡。平衡位置依赖于抗体和抗原的浓度，但能够通过解离常数KD描述如下(其中[A].[B]和[AB]表示处于平衡时的浓度)：
Figure BDA0002526758730001161
这个方程式能够重新排列以计算在KD、A浓度和B浓度的不同条件下形成的复合物(AB)的浓度。
如果结合反应处于平衡状态，
(1)
Figure BDA0002526758730001162
则解离常数(KD)定义为：
(2)
Figure BDA0002526758730001163
其中[A]、[B]和[AB]是反应物处于平衡时的浓度。反应物的总浓度(AT和BT，其是添加到“试管”中的浓度)如下：
(3)[AT]＝[A]+[AB]，其能够重新排列为[A]＝[AT]-[AB]
(4)[BT]＝[B]+[AB]，其能够重新排列为[B]＝[BT]-[AB]
将方程式3和方程式4代入方程式2：
(9)
Figure BDA0002526758730001171
重新排列方程式：
(10)KD[AB]＝([AT]-[AB])([BT]-[AB])
将其相乘并且重新排列(为了清晰起见去除浓度括号)：
(11)AB2-(AT+BT+KD)(AB)+(ATBT)＝0
形成如下形式
(12)ax2+bx+c＝0
其中，
(14)a＝1
(15)b＝-(AT+BT+KD)
(16)c＝(ATBT)
从而允许通过二次项方程式求解：
(16)
Figure BDA0002526758730001172
(17)
Figure BDA0002526758730001173
假设使用0.1nM的抗原浓度，图22a显示抗体(A)的不同浓度对不同亲和力的2种抗体的影响(Ab1的KD等于10nM或Ab2的KD等于0.1nM)。图22b显示2种抗体之间的相对“选择率”，其为当抗体个别地与0.1nM抗原一起培育时所形成的复合物的浓度与不同抗体浓度的比率。
这表明尽管使用的抗原浓度远低于相互作用的KD，但当Ab1以10nM的浓度存在时，复合物浓度是50pM，代表着复合物中存在50％抗原。(10nM是在以上实例中根据6×105个拷贝/细胞的细胞表面展示所计算的浓度)。在使用高亲和力Ab2抗体的相同条件下，复合物浓度是99pM(代表99％的抗原)，因此选择率仅存在2倍差异(表10)。然而，如果抗体浓度减少到0.1nM(在这个实例中相当于展示水平减小100倍)，则复合物浓度就Ab1而言降低到1pM，而38.2pM的复合物浓度将通过Ab2实现(表10)，代表着38倍的选择率。减小的密度还具有使靶标再结合的潜力减小的优势。在基于表面的亲和力测量(例如表面等离子体共振(BIAcore手册))时，在高密度的固定结合剂存在下再结合的问题已得到充分的认知和记载。
在流式分选的情况下，通过检测荧光标记的抗原(直接或间接标记)在细胞表面上的存在来测量复合物的相对浓度。在流式细胞仪内检测的细胞上的荧光信号因此指示着在所用条件下在细胞上所形成的复合物的浓度。因此，在抗体呈现的更多限制性条件下，在呈现高亲和力抗体与低亲和力抗体的克隆之间实现较大的分离。
Figure BDA0002526758730001181
表10.使用0.1nM抗原和不同浓度的高亲和力(KD0.1nM)和低亲和力(KD 10nM)抗体在溶液中形成的复合物的浓度
在抗体发现操作期间，在选择最优抗体的过程中，可能希望选择对其靶标具有较高亲和力的抗体。在抗体噬菌体展示选择期间增加严格度和富集对其靶标具有改善的亲和力的克隆的方法是在选择期间减小靶抗原浓度57(Fellouse FA，Sidhu SS：通过细菌制备抗体(Making antibodies in bacteria).在：《制备和使用抗体：实用手册(Making andUsing Antibodies:A Practical Handbook)》Howard GC，Kaser MR编辑：CRC出版社；2007：157-180108)。在哺乳动物展示选择时，为了能够选择性富集亲和力改善的克隆，还能够在FACS或MACS期间减小经标记的抗原浓度。然而，在抗体表达由强组成型启动子驱动的情况下所实现的高展示水平可以等同于抗体浓度高于所期望的靶标亲和力。因此，可能希望将HEK293细胞上的抗体细胞展示水平降低到例如低于60,000/细胞，从而在以上实例中得到10nM与0.1nM之间的10倍选择率。这能够使亲和力改善的抗体富集优于较低亲和力克隆。
可以在抗体的转录、转录后、翻译或翻译后阶段通过若干不同方法降低抗体展示水平。举例来说，弱启动子可以用于减小初始mRNA转录物的产生速率，可以合并非最优的剪接/受体位点以减小成熟mRNA的生产效率和速率以及从细胞核输出到细胞质。可以减少mRNA的稳定性，从而减小转录物半衰期和有效浓度。表达的翻译控制可以通过改变Kozak共同序列以影响核糖体对mRNA的结合来达成。翻译后控制的一个实例可以是利用非最优前导序列降低输送到内质网的效率。
在这个实例中，我们表明利用剪接/受体位点工程改造来降低抗体展示水平。这种降低的展示系统显示能够对HEK293细胞系混合物进行更高效的分离，所述细胞系混合物展示对其靶标具有不同亲和力的抗体。
我们已设计了一种将表面展示与抗体分泌组合的方式，其基于B细胞中所用的天然系统。在B细胞成熟期间，抗体以膜结合形式表达并且随着浆细胞成熟将此切换到主要分泌形式。这符合真核细胞展示的要求，其中影响细胞表面展示的能力依赖于跨膜形式的表达。或者，克隆已选择后能够以分泌形式表达抗体将允许即刻产生游离的可溶性抗体用于进一步表征。
B细胞的表面展示与分泌之间的平衡大部分是由聚腺苷酸添加(引起IgG分泌)与剪接(引起膜系栓)之间的平衡驱动109,110。“近端”聚腺苷酸化位点发现于CH3域末端之后100-200bp处，并且这产生了mRNA，其在CH3域的末端终止翻译，从而产生分泌型产物。在CH3域末端附近，还存在潜在的剪接供体位点，其能够与下游外显子(M1)剪接以与“铰链”和跨膜域产生同框融合体。(M1外显子继而与编码胞内域的M2外显子剪接)。分泌型IgG呈现相对于膜结合型IgG呈现的平衡依赖于近端聚腺苷酸位点处的聚腺苷酸化与和M1外显子的剪接之间的平衡。这不同于最近公开的方法，其中使用2种替代外显子中的一种在分泌型与膜结合型之间切换111。
剪接通常通过U1小核RNA(snRNA)发生，是起始剪接体组装、从而去除内含子所必需的。相较于共同剪接供体位点，CH3末端的剪接供体位点是次优的。非最优剪接供体在整个进化期间是保守的并且预期会与U1 snRNA形成非最优的碱基成对。实际上，已经显示，非最优剪接供体位点突变为共同剪接供体序列使编码主要分泌形式的经处理RNA与编码主要膜结合形式的RNA的平衡发生变化作为剪接增强的结果86。这代表着修饰剪接供体的一个早期实例，其改变了剪接相对于聚腺苷酸化之间的平衡，从而使分泌与聚腺苷酸化之间的平衡实现显著变化。基于Peterson等人的著作109,110，预期剪接供体优化程度会影响剪接与聚腺苷酸化之间的平衡，因此影响所展示抗体的比例。为了在膜形式与分泌形式之间找到最优平衡，在CH3外显子的末端建立许多替代的剪接供体位点。
涉及剪接起始的U1 snRNA的序列在由IgG2 CH3域产生的mRNA序列上方显示。错配位置加有下划线：
U1 snRNA uc/cauuca
IgG2 CH3剪接供体 gg/guaaau
围绕剪接供体设计四种变异体，包括野生型(J9-GG/GTAAT)、部分优化(J10-AG/GTAAA)、部分优化(J29-GG/GTAAG)和全部优化(J30-AG GTAAG)，如图23所示。根据与U1snRNA的杂交，预期J30变异体会允许最有效的剪接，从而在细胞表面上产生更大比例的膜系拴抗体，相比之下，在“野生型”序列J9中，不太有效的剪接产生较低水平的膜系拴抗体和较大比例的分泌。J10和J29(部分优化的变异体)预期会使抗体展示水平在J9与J30之间的中间。
构建展示抗体的靶向载体pINT17-BSD的变异体，其中将嵌入式HindIII限制位点添加到编码IgG1 CH3域C端和人类IgG内含子和M1外显子的DNA中，从而编码置换PDGFR跨膜域的跨膜域，所述PDGFR跨膜域由pINT17-BSD编码(实例1)。通过将合成基因合成、PCR组装和限制酶克隆进行组合来构建剪接供体变异体J9、10、29和30。pINT17-J30载体的标注DNA序列从XhoI到SbfI限制酶位点显示于图24中。XhoI-SbfI插入片段外部并且在图24中未示出的载体主链与pINT17-BSD一致(图1)。
将编码抗PD1抗体尼沃单抗的VH和VL链的DNA克隆到四种剪接供体变异体靶向载体pINT17-J9、pINT17-J10、pINT17-J29和pINT17-J30中并且用于通过如实例2中所述的核酸酶介导的基因整合来建立稳定细胞系。为了比较，还将尼沃单抗克隆到图1所示的标准pINT17_BSD载体中。这种构建体使抗体CH3域与PDGFr跨膜域直接融合而无需剪接并且在这个实例中称为pINT17-PDGFR。杀稻瘟菌素选择27天之后，细胞用PE标记的抗Fc染色并且如上文所述通过流式细胞术分析(图25)。这表明，与具有原生IgG跨膜域的构建体相比(其中内含子置于CH3与跨膜域之间)(图25a到d)，pINT17-PDGFR(由IgG1 CH3域与PDGFR跨膜域之间的直接融合体表达的抗体)的抗体展示水平更大(图25e)。J30与U1 snRNA完全互补并且因此预期与编码跨膜域的M1外显子的剪接比J9、J10或J29变异体更高效。图25d表明显示最高水平的J30变异体实际上就是如此。然而其还表明，与整个早先实例中所用的pINT17-PDGFr构建体(图25d)上所发现的表达水平相比，J30变异体的表达水平甚至显著地更低。
为了证明抗体展示拷贝数的减少能够有助于区分和分离具有不同亲和力的抗体，选择对其靶标具有不同亲和力的一对测试抗PD1抗体。所选抗体是尼沃单抗和另一种PD1抗体(337_1_C08)，通过表面等离子体共振(SPR)所测定，其分别具有3nM112和74nM的平衡解离常数(KD)亲和力。将编码抗PD1抗体的VH和VL链的DNA克隆到靶向载体pINT17-J30和pINT17-PDGFr(也称为pINT17-BSD)中并且用于通过核酸酶介导的基因整合如实例2中所述建立稳定细胞系。通过定量流式细胞术分析对抗体展示水平的量化如此前113和制造商说明书(Quantum Simply Cellular抗小鼠IgG珠粒，目录号815，Bangs实验室有限公司)所述，在杀稻瘟菌素选择后的第21天针对细胞进行(图26)。细胞上的拷贝数是通过测量经抗Fc-PE染色的细胞的中值荧光强度、与参考珠粒集合(目录号815，Bangs实验室有限公司)比较来计算(图26)。如表11A所示，对于两种抗体而言，与pINT17-BSD表达盒(CH3与跨膜域之间无内含子)相比，pINT17-J30(加内含子)表达盒的细胞展示拷贝数减少。
Figure BDA0002526758730001211
表11A.拷贝数计算
随着抗体拷贝数和抗原浓度减小，通过流式细胞术观察到的信号强度也减小(图25)。可以使用磁珠分选富集低于流式细胞术的灵敏度极限的经标记的细胞并且本文中使用这种磁珠分选。为了测试细胞表面上的减少的拷贝数是否会有助于分离具有不同亲和力的抗体，表达尼沃单抗或337_1_C08的细胞系各自用不同荧光团染料染色。这样可以观察到一种细胞相对于另一种细胞的相对富集。将经标记的细胞混合，与不同浓度的生物素化PD1一起培育并且通过MACS分离。然后进行流式细胞术分析以确定表达对PD1具有较高亲和力的抗体的细胞是否富集。在这个实例中测试四种HEK293细胞系，其初始经以下转染：
a.pINT17-BSD-尼沃单抗
b.pINT17-J30-尼沃单抗
c.pINT17-BSD-337_1_C08
d.pINT17-J30-337_1_C08
上方显示的pINT17-BSD表达盒(抗体CH3与跨膜域之间的直接融合体)表达的抗体展示水平高于pINT17-J30表达盒。，根据制造商说明书，使用细胞追踪绿(50nM，C7025，赛默飞世尔)将表达尼沃单抗的细胞(5×106)染色，并且使用细胞追踪深红(50nM，C34565，赛默飞世尔)将表达337_1_C08的细胞染色。简单来说，细胞用PBS洗涤，与含有追踪染料(50nM)的PBS一起培育并且在37℃下培育10分钟。然后用PBS洗涤细胞。由表达尼沃单抗的预染色细胞或衍生自pINT17-J30表达盒的337_1_C08以1:1比率(5×106个细胞，各自体积为10ml)混合。使混合的细胞集结(100g，3分钟)并且将每个细胞集结粒再悬浮于含有0、0.1、1或10nM生物素化PD1(PD1-H82E4，AcroBiosystems)的PBS(1ml)中并且在4℃下培育30分钟。细胞用0.1％BSA、PBS和抗生蛋白链菌素珠粒(10μl)洗涤并且将90μl的1％BSA添加到每个样品中且混合。样品在冰箱(4℃)中培育15分钟。使用2ml的0.1％BSA洗涤细胞并且以200×G离心4分钟。将集结粒再悬浮于500μl分离缓冲液(MACS漂洗缓冲液，其由1×PBS+2mM EDTA+0.5％BSA组成)。LS柱用3ml分离缓冲液洗涤。将细胞悬浮液添加到柱中，每个柱一个样品。未捕获的细胞通过用3ml分离缓冲液洗柱三次来收集并且收集流过物。将柱置于一个新收集管中并且将5ml分离缓冲液添加到每个柱中并且使用所提供的柱活塞立即清空。使用细胞计数器和锥虫蓝对洗脱样品和流过样品进行计数，以测定细胞回收率。使每个样品1x106个细胞在500μl 0.1％BSA/PBS中稀释。通过流式细胞术分析50μl经稀释的细胞。
当使用低密度展示载体pINT17-J30时，可以选择性地将展示低亲和力抗PD1抗体337_1_C08的细胞系与表达较高亲和力抗PD1抗体尼沃单抗的细胞分离。这显示于图27a中，其中展现了MACS洗脱或流过群体的点阵图流式细胞术结果。每个图显示点阵图，其中与0、0.1、1或10nM生物素化PD1一起预培育的洗脱和流过洗脱份的绿色荧光强度在x轴上绘制(FL1，表达尼沃单抗的细胞)且红色荧光强度在y轴上绘制(FL4，表达337_C08的细胞)。举例来说，所述细胞系与1nM生物素化PD1混合培育、随后进行MACS分离之后，与红色染料染色的较低亲和力抗PD1 337_1_C08抗体相比，绿色染料染色的高亲和力抗PD1尼沃单抗展示细胞发生95％富集。相比之下，流过物中的未结合细胞主要含有较低亲和力的红色染色抗PD1337_1_C08抗体展示细胞。此外，与10nM PD1培育相比，观察到1nM PD1存在良好的分离。然而，当使用衍生自pINT17-BSD盒的较高拷贝数细胞系进行相同实验时，观察到尼沃单抗与337_1_C08表达细胞之间不存在优先富集(图27b)。
这个实例因此已经说明，降低细胞表面上的抗体展示水平能够增加高亲和力抗体相对于较低亲和力的富集，尤其是在所述群体内实现高亲和力时。高亲和力抗体与对其靶标亲和力较低的抗体的最优细胞展示分离是通过将抗体展示水平的降低与选择期间所用的经标记靶抗原的浓度的减小组合来实现。根据所期望抗体的所需候选靶标特征，在真核细胞展示选择期间根据亲和力分离抗体的能力在抗体发现操作期间是重要的。在亲和力成熟期间富集对其靶标的亲和力改善的抗体也是重要的。这个实例已经表明细胞展示拷贝数帮助区分对其靶标具有高亲和力的抗体的重要性。
实例8b.使用诱导型tet启动子的改善
建立能够使哺乳动物细胞展示的抗体得到诱导型表达的载体是有利的。这促进了选择步骤在不同表面呈现水平的组合，例如严格选择所需的低展示水平选择之后可以是选择具有改善的生物物理学特性的抗体所需的高展示水平诱导，如实例4和5中举例说明。
通过将合成基因合成、PCR组装和限制酶介导的克隆组合来构建展示诱导型抗体的靶向载体(pINT18-Tet1)(图28)。pINT18-Tet1含有与pINT17-BSD相同的载体主链、AAVS同源臂和无启动子杀稻瘟菌素抗性基因。图28显示AAVS同源臂之间的pINT18-Tet1的标注核酸序列。这种载体的关键特征包括驱动反向Tet活化因子(rtTA)蛋白质表达的CMV启动子114、Tet操纵子(TetO)四联体，随后为最小CMV启动子、BM40前导序列与轻链基因(VL和CL)的融合、能够实现核糖体“跳过”的P2A肽115，随后为抗体重链编码序列。将派立珠单抗、尼沃单抗和337_1_C03的重链和轻链可变基因(VH和VL)克隆到诱导型靶向载体中并且如上文所述通过核酸酶介导的基因整合来建立稳定的HEK293细胞系。图29显示当细胞用抗Fc-PE染色并且通过流式细胞术分析时，在缺乏多西环素的情况下的低基本抗体展示。然而，在添加20ng/ml多西环素之后的第24小时，观察到细胞表面上的抗体表达。当多西环素浓度滴定到2ng/ml时，能够控制这种展示水平，如根据Fc染色减少所示。因此，显示了诱导型细胞所展示的结合剂的范例和通过改变诱导剂浓度来控制展示水平的能力。
随后构建改善的(“第三代”)诱导型靶向载体以能够实现改善的抗体展示水平范围。通过将合成基因合成、PCR组装和限制酶介导的克隆组合来构建pINT17-Tet。pINT17-Tet含有与pINT17-BSD相同的载体主链、AAVS同源臂和无启动子杀稻瘟菌素抗性基因。图37显示AAVS同源臂之间的pINT17-Tet的标注核酸序列。这种质体包括驱动反向Tet活化因子(rtTA-3G)表达的延伸因子启动子。rtTA-3G是原始rtTA蛋白质的经修饰形式114，其进化而对诱导剂多西环素更敏感116。pINT17-Tet也含有驱动抗体重链和轻链表达的双向诱导型启动子(pTRE3G)。pTRE3G经优化而在诱导之后拓宽低基础表达与高最大表达之间的窗口117。其由以下组成：19bp tet操纵子(TetO)序列的7个重复，和两个侧接的最小CMV启动子。
将抗PD-1抗体：1549_02_D06、1535_01_E03和337_1_C08以及抗PCSK9抗体博可珠单抗、884_01_G01、5A10i和阿利库单抗的VH和VL基因克隆到pTet17-Tet中。实例8中描述了对PD1具有74nM亲和力的抗PD1抗体337_1_C08。抗体1549_02_D06和1535_01_E03是亲本抗体337_1_C08的亲和力成熟子系克隆，其对PD-1分别具有2.9nM和17nM的亲和力(KD)。还将抗PCSK9抗体博可珠单抗、884_01_G01、5A10i.和阿利库单抗(此前都在实例5中描述)的VH和VL基因克隆到pINT17-Tet中。
使用具有抗PD1和抗PCSK9抗体基因的pINT17-Tet靶向载体，使用编码AAVS TALE核酸酶的质体如上文所述转染HEK293细胞。杀稻瘟菌素药物选择25天后，用0、2、4或100ng/ml多西环素诱导稳定的细胞系。诱导后24小时，将诱导的细胞系用抗Fc-PE染色，并通过流式细胞术分析细胞。通过将细胞数目相对于荧光强度作图来产生细胞系直方图。
在缺乏多西环素的情况下，细胞系显示出非常低的基础表达(图38a)。诱导后的第24小时，通过添加浓度为100ng/ml的多西环素观察到充分的诱导(图38d)。通过添加浓度为2和4ng/ml的多西环素来实现中等诱导(图38b和38c)。这使得平均展示水平低于充分诱导，但诱导的展度类似于此前使用七个TetO重复所观察到的双峰基因表达118。
利用实例7中所述的方法定量抗体的平均展示拷贝数。在此，测定细胞系被不同量的多西环素诱导的平均荧光强度平均值(MFI)并且使用校准图将其换算为拷贝数，所述校准图使用经小鼠IgG-PE标记染色的Quantum Simply Cellular抗小鼠IgG珠粒(目录号815，Bangs实验室有限公司)产生。表11c和11d显示诱导后(hpi)第24或48小时的所计算展示拷贝数。在缺乏多西环素的情况下观察到抗体的极低基础表达，在一些情况下，当用抗Fc-PE染色时，所述极低基础表达下降而低于检测极限。所有抗体在诱导后48小时期间存在可检测的基础表达并且这可能是因为与诱导后24小时相比，细胞已达到平稳生长期。随着多西环素浓度从2ng/ml到4ng/ml增加到100ng/ml多西环素，所有抗体的平均展示水平增加。多西环素浓度增加而高于100ng/ml未引起展示水平增加并且因此以100ng/ml多西环素的浓度实现最大诱导。
在倾向于自身相互作用和多反应性的抗PCSK9 IgG博可珠单抗2与表现良好的亲本抗体5A10i之间观察到展示水平差异。当细胞用100ng/ml多西环素诱导并且在诱导后(hpi)24小时测定展示水平时，亲本抗体5A10i以235,000的拷贝数展示于HEK293细胞表面上，而博可珠单抗以36,000的拷贝数展示于HEK293细胞表面上。这表示博可珠单抗的展示水平相较于亲本抗体5A10i降低6.5倍。当抗体表达用组成型启动子驱动时，与5A10i相比，博可珠单抗的细胞展示拷贝数的这种所观察的减少在此前已观察到(实例5，图10)。因此，这种诱导型系统在充分诱导下能够区分具有不同可开发性特征(按照自身相互作用和多反应性)的抗体，如我们此前使用组成型启动子展示系统所证明。
我们还展示了通过哺乳动物展示文库筛选所鉴定的博可珠单抗变异体，其命名为884_01_G01(实例5)。AC-SINS分析和HPLC-SEC表明这种抗体在生物物理学方面表现良好(表6、实例5和图18、实例5)。诱导后24小时，这种抗体在HEK293细胞表面上高水平展示(100ng/ml多西环素)，展示拷贝数为768,000(表11B)。在充分诱导条件下诱导后24小时，表现良好的抗体阿利库单抗2在HEK293细胞表面上也高水平展示(表11B)。
多西环素已知在培养基上清液中降解，半衰期为约一天，此视培养条件而定。在不补充多西环素的情况下在诱导后的不同时间点检查抗体展示水平提供了关于抗体在细胞表面上动态代谢的一些证据。或者，诱导可以在多西环素存在下进行24小时时间段，随后更换整个培养基，从而使细胞不再暴露于多西环素。在此，我们简单地重新检查诱导后48小时的展示水平(表11C)。诱导后48小时，表现良好的若干抗体(例如阿利库单抗)维持或增加其细胞表面展示水平。与诱导后24小时相比，其它抗体(例如博可珠单抗)在诱导后48小时的细胞表面展示水平降低大于2倍(图39)。细胞上所展示的抗体的代谢、降解或内化速率(其中所展示的抗体未经新表达的抗体连续补充)是基于其可开发性特征(按照自身相互作用和稳定性)选择抗体的另一方式(还参见实例11)。
Figure BDA0002526758730001251
表11B.在0、2、4或100ng/ml多西环素(Dox)诱导的情况下诱导后24小时，使用Quantum Simply Cellular珠粒计算的HEK293细胞上所展示的抗体拷贝数。nd：不可检测。
Figure BDA0002526758730001252
Figure BDA0002526758730001261
表11C.在0、2、4或100ng/ml多西环素(Dox)诱导的情况下诱导后48小时，使用Quantum Simply Cellular珠粒计算的HEK293细胞上所展示的抗体拷贝数。
因此，pINT17-Tet代表着诱导型哺乳动物展示靶向载体的一个实例，其能够用于通过核酸酶介导的基因整合来建立单克隆细胞系，所述基因整合能够切换为高表达、充分诱导的模式以实现上文关于抗体自身相互作用和多反应性筛选所述的可开发性筛选。在缺乏诱导剂或添加有限浓度的多西环素的情况下，使用pINT17-Tet建立的细胞系还能够切换为基础展示水平的低拷贝展示模式。这种低拷贝数展示模式能够使具有不同亲和力的抗体克隆实现更高效的分离，如实例8a中所述。
为了证明诱导型哺乳动物展示细胞系用于分离细胞表面上所展示的对其靶标具有不同亲和力的抗体的效用，通过核酸酶介导的通过pINT17-Tet靶向载体发生的基因整合来建立展示高亲和力抗PD1抗体1549_02_D06(对于PD-1而言，KD＝2.9nM)或低亲和力抗PD-1抗体337_1_C08(对于PD-1而言，KD＝74nM)的HEK293细胞。展示1549_02_D06抗体的Hek293细胞用CellTrace CFSE细胞增殖试剂盒(Thermo目录号C34554-激发/发射波长-492nm/517nm)标记并且展示337_1_C08抗体的细胞未经标记。用0、2、4或100ng/ml多西环素诱导细胞。诱导后(hpi)48小时，展示1549_02_D06的细胞用CellTrace CFSE细胞增殖试剂盒(C34554，赛默飞世尔科学)染色并且与展示337_1_C08的未标记细胞混合。经标记的细胞与未标记的细胞等量混合并且然后使用0.1、1或10nM PD-1-生物素对混合的IgG展示细胞群进行MACS提纯，如实例8a中所详述。然后通过流式细胞术分析细胞(图40)以测定高亲和力抗PD1 IgG相较于低亲和力抗PD1 IgG的相对富集。
当细胞用2ng/ml有限浓度的多西环素诱导以降低抗体展示水平并且使用0.1nMPD-1-生物素进行MACS提纯时，展示高亲和力抗PD-1抗体的细胞与展示低亲和力抗PD-1抗体的细胞发生最有效的分离。在此，将群体中的高亲和力克隆富集到群体中的96％(图40bi)。当用2ng/ml多西环素诱导细胞时，诱导后48小时的细胞拷贝数就高亲和力和低亲和力抗PD-1克隆而言分别是11,000和20,000。相比之下，当细胞系被充分诱导时，仅使用0.1nM PD-1的MACS实现高亲和力克隆的77％富集(图40di)。当细胞用100ng/ml多西环素充分诱导时，诱导后48小时的细胞拷贝数就高亲和力和低亲和力抗PD-1克隆而言分别是317,000和294,000。除实例8中的数据之外，这进一步证明了细胞表面抗体展示水平(拷贝数)的降低将使对其靶标具有不同亲和力的展示抗体的分离效率增加。随着用于MACS的PD-1浓度增加，这使得高亲和力克隆的富集效率减小，如根据实例8中的理论分析所预期(图40bii和40iii)。
在这个实例中，我们已经证明诱导型启动子系统用于高等真核细胞展示的效用能够根据自身相互作用和聚集倾向筛选实现高拷贝数展示并且根据高亲和力抗体的严格选择实现低拷贝数展示。在此，我们使用有限浓度的诱导剂得到低展示水平，以便将对其靶标具有2.9nM亲和力的克隆与对相同靶标具有74nM亲和力的第二克隆有效分离。设想通过控制细胞表面上所展示的抗体拷贝数和用于MACS分离的靶抗原浓度，会使对其靶标的亲和力(KD)小于1nM的克隆与具有个位数nM亲和力的克隆的分离效率增加。
实例9.根据与Fc受体的最优相互作用、通过选择来增强可开发性
实例6证明能够将展示具有不同交叉相互作用特性的抗体的真核细胞区分开来。这是通过将细胞与经标记的人类血清一起培育并且利用流式细胞术检测结合来实现的。与临床上批准的抗体尼沃单抗(被视为表现良好的抗体)相比，韦森单抗(一种具有已知交叉相互作用特性39的抗体，其未进一步通过1期临床试验82)对人类血清的结合更大。韦森单抗的体内半衰期短105。抗体的“粘着”或交叉相互作用特性通常与不良药物动力学相关并且体内短半衰期被认为是因非特异性结合到弥散性组织而引起的全身性清除所致23,122,123。
体内抗体半衰期也关键地依赖于IgG(通过其CH2和CH3域)与新生儿Fc受体之间的相互作用124。循环中的抗体长半衰期是通过IgG的细胞内化、通过非特异性胞饮或Fc受体介导的吸收来实现。一旦内化，则IgG以高亲和力结合到核内体(pH5-6)内的FcRn，借此保护IgG以免溶酶体降解。由于IgG与FcRn之间的亲和力在生理pH 7.4下极弱，因此IgG最终被输送到细胞表面并且释放回至循环中。抗IL12布瑞金单抗20在治疗牛皮癣的III期临床试验中未显示功效并且已知在体内具有短半衰期。布瑞金单抗在其可变域内具有由精氨酸和赖氨酸残基组成的正电荷补丁，所述正电荷补丁能够结合到FcRn上的负电荷补丁，从而增加在pH7.4下结合到FcRn的亲和力。布瑞金单抗在pH7.4下对FcRn的结合已经显示与小鼠体内的不良半衰期相关。此外，临床上批准治疗克罗恩氏病的抗IL12抗体优特金单抗在其可变域内不具有正电荷补丁，已知在pH7.4下弱结合到FcRn并且体内半衰期优于布瑞金单抗。在这个实例中，我们表明能够区分在pH7.4对FcRn具有已知的不同亲和力的由高等真核细胞展示的抗体并且通过流式细胞术检测FcRn结合。
将编码布瑞金单抗和乌坦库单抗重链和轻链可变域(序列参见表12)克隆到pINT17-BSD靶向载体(载体图谱和序列参见实例1)中并且证实DNA序列。
Figure BDA0002526758730001281
表12.布瑞金单抗和优特金单抗VH和VL链的序列
转染前一天，以5×105个细胞/毫升接种经调适的HEK293细胞于HEK FreeStyle293表达培养基中的悬浮液。转染当天，将细胞离心并且以108个细胞/毫升的最终体积再悬浮于制造商的电穿孔缓冲液(Maxcyte电穿孔缓冲液，赛默飞世尔科技，目录号NC0856428)。使用OC-100光析管(Maxcyte)对100μl进行脉冲。转染之后的两天，以2.5x105个细胞/毫升接种细胞并且添加7.5ug/ml杀稻瘟菌素。转染之后的57天，细胞用与抗生蛋白链菌素PE(11nM)预偶联的生物素化FcRn(50nM)标记。在不同pH的染色缓冲液(含有1％BSA的PBS，pH7.4，或含有140mM NaCl和1％BSA的20mM MES，pH6.0)中进行预偶联。简单来说，将1x106个细胞离心，用PBS pH 7.4或20mM MES缓冲液pH 6.0洗涤一次。将细胞集结粒再悬浮于100ul染色缓冲液中并且用1.0ml洗涤缓冲液(含有0.1％BSA的PBS pH7.4，或含有140mMNaCl和0.1％BSA的20mM MES pH6.0)洗涤两次。将细胞集结粒再悬浮于含有活力染料7AAD的500ul洗涤缓冲液(5ul/百万个细胞)中。使用Intellicyt流式细胞仪分析细胞。分析期间排除死细胞。使用FlowJo软件(图30)产生直方图。
当抗体展示于HEK293细胞表面上时，布瑞金单抗与优特金单抗在pH6下均结合到FcRn(图30)。不同于FcRn结合未观察到的优特金单抗，只有布瑞金单抗展示在pH 7.4显著结合到FcRn。这个实例证明能够区分在pH7.4下对FcRn具有不同结合亲和力的由高等真核细胞展示的克隆以及通过流式细胞术分析FcRn结合。这将能够预测抗体药物动力学(PK)特征。此外，当从细胞展示的结合剂文库中选择时，这种技术可以用于排除在pH7.4下结合到FcRn的克隆且因此选择预期具有有利PK特征的克隆。举例来说，细胞展示的抗体对MACS珠粒的结合可以在pH6实现。在pH7.4洗涤珠粒应该洗脱在pH7.4具有低亲和力的克隆并且预期这些克隆展示出在体内的半衰期比在pH7.4保持结合的结合克隆长。
FcRn对IgG的结合已知部分地依赖于IgG的翻译后糖基化。因此，使用高等真核细胞执行所述选择的优势在于，不同于在未修饰的低等真核细胞展示系统(例如酵母)中展示，发生的可靠糖基化能够实现FcRn结合。
我们进一步证明能够从混合抗体群体中分离出对FcRn的结合减少的抗体。将分别表达不同抗IL-12抗体(布瑞金单抗和优特金单抗)的高等真核细胞克隆的两种群体共培养。表达布瑞金单抗的细胞显示在pH 7.4(图30)结合到FcRn。结合可能归因于其可变域内的其正电荷补丁结合到FcRn的带负电侧链(参见实例6，其中布瑞金单抗显示结合带负电的多反应性探针)。优特金单抗在pH 7.4下未显示对FcRn的结合(图30)。混合抗体表达群体经双重染色且通过FACS富集展示优特金单抗的细胞。图41.我们因此证明从也含有FcRn结合剂的混合群体中能够富集FcRn非结合剂。相同技术可以应用于更多样化的克隆混合物，例如含有数百万种不同抗体的文库。
抗体Fc区已知诱发多种效应功能，包括Fc受体139和补体结合140。通过建立Fc域文库，随后使用已知效应分子(例如Fcγ受体、NK受体、FcRn，或补体级联成员)进行选择，能够利用高等真核细胞展示来选择对效应功能分子的结合增强或减小的变异体。这会选出可以增强、减小或静默抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)或延长体内抗体半衰期的Fc变异体。还可以选择结合到Fc受体的Fc变异体以增加其对靶标受体的促效作用且因此增加其效能141,142。Fc变异体能够减小抗体稳定性并且对其生物物理学特性134,143产生不利影响。通过高等真核细胞展示选择Fc变异体的一个优势在于，能够选出高水平展示于细胞表面上的变异体并且预期这些变异体具有优良的生物物理学特性。
实例10.通过哺乳动物展示来选择所选群体内的最优可开发性克隆(间皮素选择)
在此，我们证明利用高等真核(哺乳动物)细胞展示能够从一组高度多样化的输入抗体中选择具有最优可开发性潜力的抗体。分离不同生殖系序列的抗体的复杂混合物，从而允许基于抗体的自身相互作用特性将抗体分组且选择。
对此我们如下证明：首先通过抗体噬菌体展示选择来产生一组富集的抗间皮素抗体，然后将抗体克隆到哺乳动物细胞展示文库中并且对来自分别展现高、中或低表面呈现的克隆的结合剂的特征进行比较。
间皮素是过度表达于若干人类肿瘤中的抗原并且因此作为治疗癌症的治疗抗体靶标而受到关注。为了产生抗人类间皮素的富集群体，进行两轮抗体噬菌体展示选择，其中抗原直接固定于聚苯乙烯表面上，如此前所述8。使用初始人类抗体文库(WO2015166272A2)，其如此前所述并且以与此前描述的人类初始抗体文库相似的方式构建8。分别使用VLλ和VLκ生殖系进行选择并且第1轮输出数目是2×105(平均值)。如此前所述(WO2015166272A2)，转化为IgG形式和克隆到pINT17-BSD靶向载体中都“一同”进行。如实例4和5中所述将λ和κ富集群体中的大肠杆菌转型体接种到琼脂板上，以建立2.4×106个克隆(12倍过量的输入抗体群体)的组合文库大小。制备转染质量的质体DNA，其编码pINT17-BSD载体中的抗间皮素抗体。使用如上文(实例2、4和5)所述的AAVS TALE核酸酶，使用单个OC-400光析管(总计108个细胞，MaxCyte，目录号OC-400R10)，在MaxCyte STXG2上的HEK293配置下转染文库。对照组是使用OC-100光析管(MaxCyte，目录OC-100R10)在相同配置下转染。将电穿孔的细胞转移到适当尺寸的锥形瓶之后，允许细胞在添加适量FreeStyle 293表达培养基(LifeTech，目录号12338018)之前搁置30分钟。使细胞再悬浮并且置于设定为130rpm、37℃°和5％CO2的回转式振荡培育箱中。稳定的转染效率如上文所述计算(实例4和5)为4.2％，得到4.2×106个稳定抗体展示HEK293细胞系的总文库大小。杀稻瘟菌素选择19天之后，如上文所述(实例4和5)使用BD Influx细胞分选仪相应地进行FACS。将100×106个细胞与抗人类Fc PE(1μl/1x106个细胞)(剑桥生物科学，目录号409304)一起培育并且即将分选之前添加DAPI(1μl/百万细胞)。绘制了三个门，从而获得展示水平低的群体(P4)、展示水平中等的群体(P6)和展示水平高的群体(P5)。Influx分选仪仅能一次分选两种群体，因此门P4和P5分选50x106个细胞，并且P6分选其它50x106个细胞(图31)。如上文所述(实例4和5)从三个群体中提取基因组DNA，将抗体基因克隆到pINT3载体中(WO2015166272A2)并且对VH和VL基因测序。
Figure BDA0002526758730001311
表13.抗间皮素哺乳动物展示所选克隆群体的序列分析。对FACS中根据低、中和高展示水平门控的群体(图30)进行DNA序列分析并且与用于产生起始抗间皮素展示文库的输入抗体产生进行比较。生殖系以及VL CDR1、2和3以及VH CDR1和2遵循命名法，而VH CDR3是根据Kabat编号系统定义。
序列分析揭露所有亚群内存在较大多样性(表13)。为了确保这不归因于取样问题，我们将分析聚焦于出现超过一次的克隆以确定不同克隆组是否“分组”成不同展示组。因此，对抗体进行重叠分析，其中在展示水平低、中和高的群体中已经鉴定出双重复克隆(基于VH和VL CDR3序列)(表14)。展示水平高的群体中存在13种此类克隆，并且28种克隆在展示水平低的群体中出现多次，其间无重叠。鉴定为“中等表达”的克隆组中有11种序列出现超过一次并且另外，这些序列在其它组中未发现。“中等”组中出现4种克隆，其在3种情况下与低表达组重叠并且在一种情况下与高表达组重叠。这种结果是基于哺乳动物细胞的展示水平进行的分选选择该组所独有的序列的特定亚群。
Figure BDA0002526758730001312
Figure BDA0002526758730001321
表14.根据HEK293细胞高、中等和低展示水平混合的抗间皮素抗体的抗体克隆重叠分析。根据细胞表面展示水平混合根据哺乳动物细胞展示所选的抗间皮素抗体(图31)。对来自展示水平高、中等和低的群体的克隆进行DNA测序并且根据高、中等或低展示组中的出现次数对出现超过一次的独特克隆(基于VH和VL CDR3序列)进行表征。表中的数字表示出现的次数。
使用下一代测序(NGS)，通过深入分析抗体群体来证实基于表面呈现所选的细胞群的独特性。简单来说，扩增来自展示水平高、中和低的群体和来自输入群体的抗体的成对可变域基因，测序并且使用不对称的条形码125,126进行多路解编并且然后将输出的BAM文件转化成FASTQ文件格式以能够用Geneious Biologics软件进行抗体序列分析。
总共19792个成对VL和VH基因读段由这个分析产生。对所述群体进行多路解编之后，输入群体和展示水平高、中和低的群体由此分别产生2998、1516、6180和9098个CCS读段。对抗体序列进行标注以定位其构架和互补决定区(CDR)并且根据IMGT数据库指定重链和轻链生殖系127。不具有终止密码子的VH和VL CDR3序列已标注的克隆的这种分析的结果概述于表15中。通过使用初始抗体噬菌体展示文库8针对间皮素执行两轮抗体噬菌体展示选择而预选的抗体输入群体具有高度多样性，其中51％克隆是VH CDR3序列独有的并且88％克隆是VH和VL CDR3序列独有的。这种输入群体也具有抗体生殖系多样性，其中测序的每1000种克隆分别鉴定19、18和10VH、VLκ和VLλ生殖系。当根据哺乳动物高、中和低展示门控群体进行分析时，就CDR3序列和生殖系而言的这种多样性减少。展示水平低的群体的多样性明显减少，其中VH CDR3独特抗体的数目下降到小于4％并且所测序的每1000种克隆的VH、VLκ和VLλ生殖系的数目分别下降到4、2和3。与输入群体相比，抗体多样性的这种减少指示某些克隆富集根据展示水平门控抗体群体，从而增加群体的冗余。
也检查VLκ和VLλ生殖系在不同群体中的比率。虽然起始输入群体的VLλ几乎2倍过量于VLκ抗体，但对于根据低展示水平门控群体而言，这种比率是反的，其VLκ抗体过量逾四倍。这些结果表明低展示组富集具有特定轻链生殖系序列的抗体的特定子集。
Figure BDA0002526758730001331
Figure BDA0002526758730001341
表15.通过PacBio测序对根据哺乳动物抗间皮素展示所选的所产生克隆群体进行的序列分析。对FACS中根据低、中和高展示水平门控群体(图30)进行DNA序列分析并且与用于产生起始抗间皮素展示文库的输入抗体产生进行比较。生殖系以及VL CDR1、2和3以及VHCDR1和2遵循命名法，而VH CDR3是根据Kabat编号系统定义。
为了对输入群体和基于低、中和高展示水平、利用用哺乳动物高等真核细胞展示所选的克隆进行较详细的生殖系分析，向抗体指定其最接近的匹配VH、VLκ和VLλ生殖系并且计算每组的生殖系出现频率。结果以表格式(表16、17和18)和直方图(图42、43和44)显示。这表明在测序的群体中，展示水平低或高的组富集或缺少若干生殖系，表明基于抗体展示水平的哺乳动物展示选择能够选择性富集抗体生殖系。举例来说，与低展示组相比，在高展示组中，IGHV3-23和IGHV1-2生殖系分别富集105倍和9倍。IGHV3-53、IGHV3-21和IGHV4-34生殖系分别以2.7％、1.1％和0.9％的频率出现于高展示组，但在低展示组中完全缺乏。IGHV3-23生殖系被认为是表现良好的生殖系并且体现于若干已批准用于临床用途的治疗抗体，包括阿利库单抗、贝伐单抗、赛妥珠单抗(certolizumab)、达土木单抗(daratumumab)、地诺单抗(denosumab)、杜匹鲁单抗(dupilumab)、艾密次单抗(emicizumab)、奥克雷珠单抗(ocrelizumab)、兰尼单抗(ranibizumab)和思图昔单抗(siltuximab)。被认为表现良好的IGHV3-21和IGHV3-53生殖系已纳入人类合成抗体文库设计12。发现低展示组中富集了五种VH生殖系：IGHV1-69D、IGH3-30、IGHV5-51、IGHV1-58和IGH3-64D。此前已经观察到，IGH3-30生殖系当与某些轻链成对时倾向于自身相互作用，如通过动态光散射测量所测定12。
对抗体轻链生殖系的出现频率的分析也表明与低展示组相比，某些生殖系在高展示组中富集。举例来说，IGKV1D-13和IGKV3-19分别以3.5％和6％频率出现于高展示组中，但在低展示组中完全不存在。与低展示组相比，IGKV1-12、IGKV1-17、IGKV2-28、IGKV2D-29和IGKV6-21生殖系在高展示组中分别富集11倍、22倍、6倍、11倍和132倍。IGKV2-28和相关生殖系IGKV2D-29被认为是表现良好的并且体现于若干已批准用于临床用途或正经历临床评估的抗体，包括坎妥珠单抗(cantuzumab)、杜匹鲁单抗(dupilumab)、鲁卡木单抗(lucatumumab)、莫加珠单抗(mogamulizumab)、奥比珠单抗(obinutuzumab)、司韦单抗(sevirumab)、替妥莫单抗(tenatumomab)和杂图昔单抗(zatuximab)。发现低展示组中富集四种VLκ生殖系：IGKV1-16、IGKV1-33、IGKV2-30和IGKV4-1。由于单一VHλ生殖系在输入群体中占主导(IGLV3-19)，因此VHλ生殖系分析不太明显。尽管如此，高展示组中富集以下VHλ生殖系：IGLV1-47、IGLV2-11、IGLV2-14、IGLV2-23、IGLV2-8、IGLV3-10和IGLV6-57。已知Vλ1-47和Vλ2-14轻链表现良好并且已经作为支架纳入合成文库设计12,128。IGLV2-14是临床上已批准的抗PCSK9抗体依伏库单抗(Evolocumab)中存在的轻链，所述抗体是表现良好的抗体2。
这种分析能够将人类抗体生殖系“分组”成哺乳动物高展示组或低展示组。先前已表明高水平展示与表现良好的生物物理学特性(就蛋白质自身相互作用倾向低而言)相关(实例3)。因此，观察到某些生殖系在哺乳动物展示高展示水平组中富集是归因于其固有的生物物理学特性。因此，哺乳动物展示能够实现具有表现良好的生物物理学特性(就自身相互作用倾向低而言)的抗体生殖系的富集和鉴定。
Figure BDA0002526758730001351
Figure BDA0002526758730001361
表16.对根据哺乳动物展示所选的抗间皮素克隆群体进行的可变重链(VH)生殖系分析。向抗体指定最接近的匹配人类VH生殖系序列并且显示了输入群体以及根据哺乳动物低、中和高展示门控群体中的出现频率。最后一栏显示根据高和低展示水平门控群体中的出现比率，其中两个群体中均发现生殖系。
Figure BDA0002526758730001362
Figure BDA0002526758730001371
表17.对根据哺乳动物展示所选的抗间皮素克隆群体进行的可变重链(VLκ)生殖系分析。向抗体指定最接近的匹配人类VLκ生殖系序列并且显示了输入群体以及根据哺乳动物低、中和高展示门控群体中的出现频率。最后一栏显示根据高和低展示水平门控群体中的出现比率，其中两个群体中均发现生殖系。
Figure BDA0002526758730001372
表18.对根据哺乳动物展示所选的抗间皮素克隆群体进行的可变重链(VLλ)生殖系分析。向抗体指定最接近的匹配人类VLλ生殖系序列并且显示了输入群体以及根据哺乳动物低、中和高展示门控群体中的出现频率。最后一栏显示根据高和低展示水平门控群体中的出现比率，其中两个群体中均发现生殖系。
Figure BDA0002526758730001381
表19.根据HEK293细胞高、中和低展示水平、针对抗间皮素抗体进行的抗体克隆聚类分析。根据细胞表面展示水平混合根据哺乳动物细胞展示所选的抗间皮素抗体(图31)。利用PacBio NGS对展示水平高(H)、中(M)和低(L)的群体进行DNA测序并且鉴定每组中的前10种最丰裕克隆并且这些最丰裕克隆描绘于这个表中，其中VH和VH CDR3序列以通过虚线分隔的单字母氨基酸码显示。向此前通过对个别克隆进行桑格测序(Sanger sequencing)鉴定的抗体指定克隆名称，显示于第二栏中。显示了每种克隆在高、中和低展示组中的丰度百分比。如果抗体存在于超过一个展示水平组中，则细胞加阴影。所选克隆在AC-SINS分析40中表达、提纯且测试并且显示了波长漂移(ΔAC-SINS)(nm)。HPLC-SEC滞留体积显示于最后一栏中(nd：未进行)。
进行聚类分析以产生四种抗间皮素抗体群体中的每一种的序列独特VH和VL CDR3克隆清单以及其出现频率。根据出现频率得到的前10种克隆显示于表19中，展示水平高、中和低的抗间皮素抗体如图31中所描绘进行FACS门控。为了比较，还显示了输入和替代群体中的克隆的出现频率。如此前以较有限的克隆集合所示，高水平展示组中的前7种最丰裕克隆与低展示组之间不存在重叠。高水平展示组中的7种最丰裕克隆在低水平展示组中完全不存在。低水平展示组中的9种最丰裕的克隆在高水平展示组中完全不存在。对于最丰裕的、中水平展示组来说，高水平展示组与低水平展示组存在一些重叠：中水平展示组中仅存在三种克隆，中和高水平展示组中仅存在两种克隆并且所有三个水平展示组中存在三种克隆。对于来源于与低水平展示组存在一些重叠的高水平展示组的克隆(例如克隆8、9和10)来说，这些克隆在高水平展示组中富集逾41倍。
抗体根据其序列分组成高、中和低水平展示组表明基于真核细胞抗体展示水平的分离归因于所述抗体的特性，如根据其多肽序列所测定。如通过PacBio NGS分析所测定的抗体的出现频率与通过桑格测序对一组更有限克隆测序的结果非常吻合。此前已经利用PacBio NGS、通过桑格测序鉴定出低、中和高水平展示组中的前10种最丰裕克隆中的9、8和6种。
然后表达从高和低水平展示组中选出的抗体并且提纯并且通过AC-SINS41或HPLC-SEC确定其生物物理学特性。AC-SINS结果显示于表19的倒数第二栏中。来源于高或低展示组的克隆的AC-SINS平均波长漂移分别是1.9和15.2。与高水平展示组相比，从来源于低水平展示组的克隆观察到的显著较高AC-SINS平均波长漂移表明低水平展示组抗体比高水平展示组抗体更倾向于自身相互作用和聚集。所选抗体也通过HPLC-SEC检查。图45显示被表达且通过HPLC-SEC提纯和分析的四种克隆的实例：一种来自高展示组(932_01_A03)且三种来自低展示组(930_01_A12、930_01_B02和930_01_C12)。这表明从高水平展示组中分离出的抗体932_01_A03是96％单体。相比之下，抗体930_01_C12是82％单体和18％二聚体并且在柱上还显示一些迟滞，随后的洗脱图表明与柱存在一些非特异性相互作用。这种克隆还包括小片段(16kDa分子量)，表明其在表达或提纯期间可能已片段化。来自低展示组的两种其它克隆(930_01_A12、930_01_B02)在柱上也展示延迟的滞留时间，表明抗体非特异性吸收到柱基质。HPLC-SEC滞留体积(表19最后一栏)是关于与柱基质发生相互作用的非特异性抗体的度量。在此，较大滞留体积能够引起较宽的HPLC-SEC峰且指示与HPLC-SEC柱基质发生非特异性相互作用。高展示组克隆的HPLC-SEC平均滞留体积是1.55ml，而低展示组克隆的HPLC-SEC平均滞留体积是1.6ml，从而证明低展示组克隆比高展示组克隆更倾向于与非特异性HPLC-SEC柱基质发生相互作用。在尝试通过超滤浓缩之后，低水平展示组中的一种克隆(930_01_C07)沉淀。低水平展示组中的第二克隆的表达和提纯失败。来源于高水平展示组的克隆无一者证明在其表达、提纯和后续分析期间存在任何问题。这包括在PBS(pH7.4)中通过超滤能够浓缩到大于12mg/ml。
因此，这个实例已举例说明能利用哺乳动物高等真核细胞展示来分离复杂混合物内存在的抗体，包括具有不同生殖系序列的抗体，此分离是基于其自身相互作用和交叉相互作用特性。
实例11.基于细胞表面上的快速积聚来选择可开发性克隆
在上述实例中，我们已经注意到稳定的高等真核细胞群的表面上的组成型抗体展示水平与所述抗体的生物物理学特性之间的关系。在此，我们还注意到在转染之后的24小时观察到展示水平的差异。在实例5、图10中，我们在转染后的第1天(1dpt)时间点观察到博可珠单抗与亲本抗体5A10i之间的展示水平差异(图10，左图)。所展示抗体的积聚差异的这种初始速率与稳定细胞系在平衡状态下的展示水平差异(图10，右图，21dpt)和抗体的生物物理学特性相关。实例5中显示与亲本抗体5A10-i相比，博可珠单抗具有高自身相互作用和交叉相互作用特性，如AC-SINS分析和HPLC-SEC中所测量。与亲本抗体5A10-i相比，在转染后24小时短暂阶段和稳定细胞系阶段、转染后21天(图10)，博可珠单抗以更低水平展示。因此，初始短暂抗体细胞展示水平预测在药物选择若干天之后建立的稳定细胞系的抗体细胞展示水平。
因此，我们已经表明高等真核细胞表面的表面上的抗体展示速率与抗体的生物物理学特性之间的关系。抗体的初始瞬时展示与其生物物理学特性之间的经证实的关系适用于在更早阶段(与产生稳定细胞系相比)从抗体群体或文库中富集生物物理学特征优良的抗体。其也适用于通过个别单克隆转染来筛选个别抗体集合。细胞表面展示抗体的初始速率的差异也可以是适用的，其中通过诱导型启动子调控抗体表达并且在诱导后开始基于细胞表面展示水平对群体进行选择。
实例12.基于CHO细胞文库中的表面呈现水平，根据IgG的可开发性进行选择
IgG抗体能够展示于CHO细胞表面上，其展示水平与个别抗体的生物物理学特性(包括其自身相互作用和聚集的倾向)相关。在这个实例中，我们表明在执行两种替代的核酸酶介导抗体基因整合方法之后，抗体展示于CHO细胞表面上，并且我们证明展示水平与所展示抗体的生物物理学特性相关。
基因靶向载体被设计成且用于将抗体基因表达盒整合到CHO AAVS基因的内含子1中，所述CHO AAVS基因与实例1中所述的人类AAVS基因组基因座直系同源93。TALEN核酸酶靶向CHO AAVS基因的基因座的内含子1，在这个位置建立双股断裂。为了比较，还用并行方法测试CRISPR/Cas9核酸酶。
使用TALEN定向和CRISPR/Cas9定向整合方法成功地实现CHO细胞上的抗体展示。使用TALEN核酸酶对或CRISPR 1设计来实现最佳展示水平。替代的CRISPR设计(CRISPR 2和CRISPR 3)也是成功的，但是观察到稍微较低的抗体展示水平。
图48.
我们进一步证明CHO细胞上所展示的抗体的细胞表面水平与所展示抗体的生物物理学特征相关，与HEK293细胞上所发现的结果一致。将所选抗体克隆到pINT17-BSD-CHO靶向载体：MEDI-1912、MEDI-1912-STT、博可珠单抗、884_01_G01。
MEDI-1912(抗NGF)就其自身聚集的倾向而言具有不良的生物物理学特性7。与溶解度增强的子系克隆MEDI1012-STT相比，观察到MEDI-1912在CHO细胞上的细胞表面展示水平降低。
884_01_G01是博可珠单抗衍生物并且通过诱变和哺乳动物展示选择、基于展示水平来鉴定并且保持结合到PCSK9(实例5)。就AC-SINS得到的低分数和HPLC-SEC得到的单体峰而言，884_01_G01在此前表明是“表现良好的”。与改善的子系克隆884_01_G01相比，还观察到博可珠单抗的CHO细胞表面展示水平降低。
图49.
所述实例因此证实CHO细胞用于展示抗体的效用和基于其细胞表面展示水平来区分具有不同生物物理学特性的抗体的效用。具有不同生物物理学特性的抗体能够通过流式细胞术很好地分离，从而能够根据CHO细胞展示从复杂混合物内分离出生物物理学特性较好的抗体。
材料与方法
从悬浮液调适的CHO细胞系基因组DNA，对编码CHO AAVS左和右同源臂的DNA进行PCR扩增，使用引物对3165/3166和3169/3170(表20)从CHO细胞中分离以分别产生大小为1.2kb和1.35kb的PCR产物。这些PCR产物然后用作模板以产生CHO AAVS左和右同源臂，同时敲除后续抗体基因克隆所需的多个限制位点。建立现有NcoI、NheI、NsiI和DraIII位点发生突变的CHO AAVS左同源臂，其通过使用上述CHO AAVS左臂模板、使用PCR引物对3195/3196、3197/3198、3199/3200进行PCR扩增以建立大小分别为241bp、576bp和142bp的三种PCR产物。然后使用引物3199和3196(表20)组装片段以产生大小为893bp的产物。进行额外的组装PCR反应，其例外之处在于使用引物3123替代3196以得到稍微较短的AAVS-左同源臂(880bp)。产生这种稍微较短的左同源臂的原因是为了避免靶向载体内的CRISPR 2和3设计识别位点(图46)。使用AsiSI和NsiI限制酶消化所组装的AAVS左同源臂并且克隆到用AsiSI和NsiI预切割的pINT17-BSD载体中。为了对CHO AAVS同源臂进行PCR扩增并且敲除BclI限制位点，使用引物对3201/3202和3203/3204进行两次单独的PCR反应以建立大小分别为707bp和208bp的PCR产物，然后使用引物3201和3204进行PCR组装以产生大小900bp的PCR产物。组装的AAVS右同源臂用BstZ171和SbfI限制酶消化并且克隆到用BstZ171和SbfI预切割的pINT17-BSD载体中并且然后克隆到BstZ171和SbfI切割的pINT17-BSD切割载体中，所述载体已经具有CHO AAVS左同源臂。然后建立CHO靶向载体pINT17-BSD-CHO，其与pINT17-BSD相同(图1)，例外之处在于人类AAVS同源臂已被CHO AAVS同源臂置换。
Figure BDA0002526758730001421
Figure BDA0002526758730001431
表20.能够扩增CHO AAVS左和右同源臂以及敲除限制位点的引物序列和CRISPR向导RNA引物。限制位点加有下划线并且敲除NheI、NcoI、BclI和DraIII限制位点的突变以粗体显示。
TALEN对设计成识别CHO AAVS基因座，从而识别TAL靶序列：TCCCCGTCATCCAAAAGC和TCTGCTGTGACTAATCTT，如图46所示。为了与TALEN引起的位点特异性DNA裂解进行比较，我们还测试了替代核酸酶(导向核酸的核酸酶CRISPR/Cas9)的性能。设计靶向CHO AAVS基因座的三种CRISPR/Cas9向导RNA，并且识别序列显示于图46中。
克隆到靶向载体中的CHO AAVS同源臂的核酸序列显示于图47中。设计编码U6 RNA聚合酶启动子向导RNA和tracrRNA的合成基因块并且用引物3222和3223进行PCR扩增(表21)。使用引物3220/3221对CRISPR/Cas9载体(A21177，Geneart)进行PCR扩增以产生9375bp产物。然后使用NEB Builder(新英格兰生物实验室(New England Biolabs))、使用三种CRISPR基因块(表20)组装这种产物，以产生编码图46中所描绘的三种向导RNA的三种CRISPR/Cas9载体。
Figure BDA0002526758730001432
Figure BDA0002526758730001441
表21.编码CHO CRISPR序列的基因块序列。CHO CRISPR向导和tracrRNA序列分别以粗体和斜体显示。U6 RNA聚合酶启动子加下划线显示。
在编码CHO AAVS TAL-1F和CHO AAVS TAL-1R TALEN对(M3770，赛默飞世尔科技)或CRISPR/Cas9和CHO AAVS特异性向导RNA的质体不存在或存在下，使用其中893bp或880bpAAVS左同源臂(分别命名为V1或V2)具有尼沃单抗抗体重链和轻链基因的靶向载体pINT17-BSD-CHO转染Freestyle CHO-S细胞(赛默飞世尔科技)并且经历杀稻瘟菌素药物选择(7.5μg/ml)。转染方法如实例2中针对TALEN转染所述。在CRISPR/Cas9转染中，使用10:1的CRISPR/Cas9、pINT17-BSD-CHO质体DNA比率。细胞在转染后(dpt)的第14天用抗Fc PE染色。荧光强度(抗Fc)相对于细胞计数作图。
将两对抗体的重链和轻链基因克隆到CHO靶向载体pINT17-BSD-CHO中，所述靶向载体具有893bp AAVS左同源臂(图47)：抗NGF抗体MEDI-1912或MED-1912-STT7或抗PCSK9博可珠单抗或博可珠单抗衍生物克隆884_01_G01(参见实例5)。所得靶向载体在编码CHOAAVS TAL-1F和CHO AAVS TAL-1R TALEN对(M3770，赛默飞世尔科技)的质体存在下用于转染Freestyle CHO-S细胞(赛默飞世尔科技)并且经历杀稻瘟菌素药物选择(7.5μg/ml)。转染后第15天的细胞用抗Fc-PE染色，如实例2中所述。转染后第15天的展示抗体的CHO细胞通过抗Fc-PE MACS提纯并且用抗Fc PE染色。荧光强度(抗Fc)相对于CHO细胞计数作图。
实例13.利用哺乳动物展示来建立“可开发性增强的”群体用于随后的结合选择
实例10证明针对抗原预选的克隆群体(在这个实例中，得自噬菌体展示选择)能够基于不同呈现水平进一步拆分，继而与生物物理学特性关联。如在别处所述，对多反应性探针的结合还可以用于鉴定和去除具有多反应性特性的克隆。从而能够排除存在问题的克隆，其可能以其它方式被选用于进一步表征或开发。
在实例10中，初始基于结合特性(在这个实例中使用噬菌体展示)选择抗体群体，随后基于生物物理学特性进行后续选择。也可以颠倒选择次序并且基于高等真核细胞的呈现水平或对多反应性探针的结合来产生已经根据最优生物物理学特性选择的克隆群体。举例来说，结合剂展示文库可以在哺乳动物细胞或其它高等真核细胞中制备并且使用结合到结合剂的恒定区的试剂、根据呈现水平选择，以便所有结合剂都能够独立于其序列而被同等标记。举例来说，在结合剂是IgG抗体的情况下，可以使细胞与可检测试剂接触，所述可检测试剂结合到IgG Fc区，例如经标记的抗IgG抗体。然后能够选择呈现水平高于峰值或中值的群体部分，例如通过流式细胞术来选择。举例来说，使用本文所述的方法，在一轮或多轮分选中能够基于呈现水平选择前5％、10％或25％的克隆。这将建立“可开发性增强”的结合剂群体，其能够用于随后基于对不同抗原的结合进行选择。
使用实例10的方案，选择4×1010个克隆的大型噬菌体展示文库以产生结合剂的亚群，然后并入哺乳动物展示文库中以便基于呈现水平进行选择。颠倒次序(即，根据高等真核细胞中的生物物理学特性预选，随后选择结合剂)的一个潜在缺点是，建立哺乳动物细胞的大型文库比建立用于体外系统(例如核糖体展示或细菌系统(例如噬菌体展示))的文库更费力且代价更高。因此，如果使用例如107种克隆的初始哺乳动物展示文库并且基于呈现水平而选择前10％，则用于随后根据抗原结合进行选择的文库潜在多样性将减少，例如减少到106种克隆，使得选择高亲和力结合剂的可能性减小。一种替代策略是预选哺乳动物展示文库中的组分，例如在抗体的情况下，分开选择最优VH和最优VL组分，然后将其重组以从组合多样性中受益。
因此，在一个分支中，可以建立哺乳动物展示文库，其中呈IgG或scFv形式的抗体含有单次或有限次选择的VL和较大多样性的VH链以选择最优VH基因。为了选择VH基因以拯救搭配物链的不良生物物理学特性，可以随机选择或基于不良生物物理学特性选择单一或有限搭配物VL基因。或者，可以选择生物物理学特性良好的VL基因以鉴定和去除损害呈现水平的那些VH基因。使用与上述实例相同的数目，可以建立具有VH多样性的107种克隆的文库并且基于呈现水平而选择的前10％VH基因潜在地产生106种经选择的VH克隆。在一个并行分支中，可以将单个或有限数目个VH基因与VL基因的多样性组合以选择最优VL基因。将所选不同VH和VL基因结合在一起的组合多样性显著高于个别选择的链的数目。因此，每个分支中选择前106个VH和前106个VL基因建立了1012种变异体的潜在组合多样性。所选VH和VL域可以在允许根据靶向结合进行选择的任何展示系统内呈现，包括噬菌体展示、核糖体展示、酵母展示和高等真核细胞上的展示。以此方式，使用本发明根据最优生物物理学特性进行的选择可以用于在其它展示系统内产生“可开发性增强”的文库。举例来说，预处置以产生具有最优生物物理学特性的克隆的噬菌体展示文库。
在上述方案的另一实例中，根据最优生物物理学特性进行的选择可以定向于个别结构域内的区域。举例来说，VH域包括3种不同的互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)，并且生物物理学可靠性可以由个别CDR或CDR组合内的序列促成。举例来说，可以回收非免疫抗体谱系中的VH基因的CDR1和2区域，与单个或有限数目个VH CDR3区域和VL搭配物链组合，且具有多样性的所得抗体群体聚焦于根据最优生物物理学特性所选的CDR1和2内。然后能够将所选CDR1和2区域与CDR3区段和VL区段的多样性组合，所述区段可以未选定或可能已根据最优生物物理学特性以类似方式选择。潜在的组合多样性因这种“改组”方案而增加。上述实例描述了根据最优生物物理学特性针对CDR 1和CDR2区段进行的选择，但所述相同方案如何能够结合单独或组合的不同CDR区域使用将是显而易见的。在一些情况下，根据最优生物物理学特性选择的输入文库可以是来自非免疫来源或来自多样化初始支架的初始文库。或者，为了潜在地改善生物物理学特性以及亲和力，输入文库可以是基于初始输入克隆或克隆选择的多样化文库。
在各种情况下，上述方案将利用所属领域的技术人员已知的标准分子生物学技术。另外，WO2015/166272(Iontas有限公司)还阐述了文库(包括链改组文库)的构建和使用方法，其内容并入本文中供参考。将VH或VL域内的不同区域组合将受益于使用最优PCR引物扩增VH和VL域内的个别区域。抗体VH和VL基因的生殖系序列容易获得，例如允许设计此类引物的IMGT数据库132。另外，WO2017/118761(Iontas有限公司)中的实例描述了引入多样性以及将不同CDR区域组合以重构完整VH:VL组合的方法。
下面的实例用于说明。将多样性引入初始PD1结合抗体克隆的VH CDR3和VL CDR3中并且所得群体根据哺乳动物细胞上的最优呈现进行选择。可以采用相同方案将多样性引入其它初始构架和其它CDR，包括生殖系编码基因的CDR 1和2。举例来说，表16鉴定了针对哺乳动物细胞上的高水平呈现所选的群体中频繁出现的生殖系基因，例如IGHV1-2、IGHV3-23和IGKV6-21，并且这些生殖系基因可以选作初始构架用于进一步的多样化和可开发性选择。类似地，可以鉴定出除抗体之外的结合域亚区域以便根据最优生物物理学特性进行单独选择。
举例来说，根据噬菌体展示来鉴定阻断PD-1与PD-L1相互作用的抗PD1抗体(337_1_C08)(图50a)。337_1_C08对PD-1的亲和力(KD)是74nM。这用于建立多样化聚焦于VH CDR3和VL CDR3的未诱变文库。所属领域的技术人员已知用于多样化的多种方法。举例来说，多样化可能涉及通过饱和诱变来建立诱变文库，其中使用随机化密码子，例如NNS(编码32个密码子内的所有20种氨基酸)。一种替代方案是保持序列信息，同时探究周围序列空间。为了实现这种方案，寡核苷酸设计为VH和VL的CDR3中的8个氨基酸的连续片段，以便包括每种可能2聚体和1聚体变异体(使用所有氨基酸(除了半胱氨酸之外))(图50a)。
因此，文库设计成每个CDR3区域中保持原始8个氨基酸中的至少6个。这可以通过合成靶向VH CDR3或VL CDR3中的每一个的9216种寡核苷酸来实现。通过TWISTBiosciences合成VH和VL的基因块，其中每种2聚体氨基酸变异都涵盖于8个氨基酸窗口内(9216种变异体)。通过高通量测序(Twist Bioscience)来证实每一组中存在所有9216种寡核苷酸。使用引物对扩增VH基因：正向引物：5’-CTTTCTCTCCACAGGCGCCCATGGCCGAAGTGCAGCC-3’和反向引物：5’-TTTTTTCTCGAGACGGTGACCAGGGTTC-3’。使用引物对扩增VL基因：正向引物：5’-TTTTTTGCTAGCTCCTATGAGCTGACTC-3’和反向引物：5’-GTCACGCTTGGTGCGGCCGCGGGCTGACCTAG-3’。使用以下引物对，利用pINT17-BSD载体对编码恒定轻链(CL)和CMV启动子的“填充”片段进行PCR扩增：正向引物：5’-GGCCGCACCAAGCGTGAC-3’和反向引物：5’-GGCGCCTGTGGAGAGAAAG-3’。首先通过“模拟”PCR而不使用扩增引物来组装三个基因片段，以确保部分组装和随后扩增不引入偏差。通过将上述三种PCR产物按照等摩尔比率(各90nM)混合且使用KOD热启动预混液(西格玛，71842)、根据制造商说明书、使用60℃的粘接温度和68℃的延长温度(45秒)执行PCR反应。随后使用引物对扩增组装产物：正向引物：5’-TTTTTTGCTAGCTCCTATGAGCTGACTC-3’和反向引物：5’-TTTTTTCTCGAGACGGTGACCAGGGTTC-3’。组装的抗PD-1VH和VL CDR3文库用NheI和XhoI限制酶消化并且克隆到pINT17-BSD靶向载体中，并且通过对E.cloni 10G SUPREME电感受态细胞(Lucigen目录号60081-1)进行电穿孔，建立1.1×108的文库大小，如通过对涂铺转化混合物的稀释液的琼脂板上的个别卡那霉素抗性群落进行计数所测定。制备转染质量的质体DNA且通过Maxcyte电穿孔用于与TALEAAVS左和右臂核酸酶共转染HEK293悬浮细胞(1.35×109个细胞)以实现单个拷贝抗体基因整合。如通过对转染后的稀释板中的杀稻瘟菌素抗性群落形成单位(CFU)进行计数所测定，基因靶向效率是0.8％，以产生10.8百万的哺乳动物展示文库大小。文库在杀稻瘟菌素选择下繁殖7天且然后通过抗Fc MACS选择以去除不表达IgG的克隆。
如实例10中所述，通过流式细胞术、利用荧光标记的抗Fc抗体、基于表达水平来分离Fc阳性细胞群(图50b)。将分离出的群体培养若干天并且针对Fc表达进行再分析。图50b显示用于表达的具有不同峰值的不同亚群已经产生。这包括呈现水平较差的群体以及呈现水平相当于亲本的群体。如实例10中所述，能够从这些细胞中回收抗体基因以产生生物物理学特性最优的亚群。在这个实例中，细胞仅基于生物物理学特性分选，但也可以基于与抗原结合一起或依序执行选择。
实例14.在哺乳动物细胞表面上展示双特异性抗体
双特异性抗体或替代形式(评述于Spiess等人，2015129)已能够达成此前的单一特异性抗体或蛋白质所不能达成的新治疗作用机理(MOA)。双特异性治疗剂的用途实例包括作为癌症治疗剂使T细胞的细胞毒性活性重定向、能够穿越血脑屏障、同时阻断两种信号传导路径以及抗体的组织特异性递送或活性130。双特异性形式就其倾向于自身或交叉相互作用特性而言，与传统的单特异性抗体一样都面临着相同的可开发性障碍。由于每一个结合区能具有补偿其自身相互作用或交叉相互作用特性或与之混配的不同特性，因此筛选双特异性部分的最终形式是一个优势。当筛选双特异性的个别结合“臂”时，这些特性可能不明显，原因是亲合力能够使针对脱靶分子(例如肝素硫酸盐)的亲和力增加若干数量级。由于总体表面特性(例如疏水性)可以改变，因此双特异性分子相较于其个别结合区而言，自身相互作用特性也可以不同。双特异性抗体(bsAb)形式不仅能以多种不同形式存在129，而且能够广泛分成：IgG样bsAb，例如κ/λ体131、共同轻链、臼包杵132、、电荷对和互换单抗形式130；基于片段的bsAb，例如BiTE形式；附接的IgG，例如DVD-IgG，或经工程改造以在其恒定域中具有额外结合区的抗体，例如Fcab或mAb2形式133。然而，发现Fcab的CH3域的结构构架的改变使其热稳定性减小134且需要对Fcab分子进行额外的工程改造来增强其可开发性134。在这个实例中，我们证明哺乳动物高等真核展示能够应用于双特异性抗体的展示，这通过双特异性抗体艾密次单抗展示于HEK293细胞表面上和表明这能够结合抗原FIXa和FX。
艾密次单抗是一种双特异性抗体，其利用重链“臼包杵”技术、使用此前所述的共同轻链132产生，其为了治疗血友病而开发且充当因子VIII模拟物135。艾密次单抗的一个臂特异性针对因子IXa(FIXa)且第二个臂特异性针对因子X(FX)。通过将艾密次单抗抗FIXa重链、抗FX重链和共同轻链基因(表22)克隆到诱导型靶向载体pINT17-Tet中来构建三顺反子靶向载体。将包括下游聚腺苷酸化(pA)位点的共同轻链基因克隆到pINT17-Tet的BglII和NheI限制位点。将包括PDGFR跨膜域的抗FIXa重链基因克隆于pINT17-Tet的NcoI与HindIII限制位点之间。将包括信号肽、PDGFR跨膜域和SV40 pA的抗FX重链基因克隆于pINT17-Tet的EcoRI与BstZ171限制位点之间。最终载体(pINT17-Bi-CMV-艾密次单抗)含有介于AAVS同源臂之间的编码序列。图51.还将艾密次单抗抗FIXa和VL基因克隆到pINT17-BSD靶向载体内以能够展示单特异性抗FIXa IgG抗体。
为了证明HEK293细胞表面展示双特异性抗体艾密次单抗，使用pINT17-Bi-CMV-艾密次单抗或pINT17-BSD-抗FIXa在如上文所述的编码AAVS TALEN的质体存在下转染HEK293细胞。转染后24小时，使用抗Fc-APC分析细胞上的抗体展示(图52)。这表明经单特异性抗FIXa臂的IgG形式转染或经双特异性抗体艾密次单抗转染的HEK293细胞在细胞表面上具有可检测到的抗体表达。然而，与标准单特异性抗体形式相比，具有“臼包杵”重链的双特异性艾密次单抗的表达减少。设想通过建立Fc变异体文库、随后根据哺乳动物展示的高水平表达进行选择，可以选择能够实现更高效异源重链配对和细胞展示水平增加的Fc变异体。以此方式能够选择新抗体CH2或CH3变异体或CH2与CH3变异体的组合，其不仅在异源重链配对以建立双特异性抗体方面更高效，而且具有优良的可开发特性，包括自身聚集的倾向低。还能够根据与其它分子的交叉相互作用倾向低来筛选Fc变异体文库。
还通过流式细胞术证明所展示的双特异性艾密次单抗结合其靶抗原的能力。FIXa和FX(Complement技术有限公司)以化学方式生物素化(EZ-连接磺基-NHS-生物素，赛默飞世尔科学)。原因是艾密次单抗对FIXa和FX的亲和力相对较低(KD在微摩尔浓度范围内136)。细胞染色之前，使抗原在100nM的抗原复合物浓度下与四聚体抗生蛋白链菌素-PE预偶联以增加结合亲合力。展示双特异性艾密次单抗的HEK293细胞显示结合FIXa和FX，而不结合到未偶联的抗生蛋白链菌素-PE(图52a)。这证明双特异性抗体在HEK293细胞表面上的功能展示。在HEK293细胞表面上展示的单特异性抗FIXa臂的IgG形式还结合到FIXa(图52b)。抗FIXa抗体对FX也显示一些结合，然而结合水平低于艾密次单抗，这可能归因于共同轻链或抗FIXa重链与FX交叉反应。
实例6b描述了肝素硫酸盐与HEK293细胞表面上所展示的抗IL12抗体布瑞金单抗和优特金单抗的差异结合。布瑞金单抗在其可变域内具有正电荷补丁，所述正电荷补丁可能促成其结合FcRn上的负电荷补丁22。布瑞金单抗上的正电荷补丁也可能是其与负电荷肝素硫酸盐发生交叉相互作用的原因。抗体结合到肝素硫酸盐能够增加体内非特异性清除，从而缩短半衰期137,138。因此，抗体或治疗蛋白质(包括双特异性分子)结合到肝素是非期望的特性。实例6b证明能够区分结合肝素硫酸盐的抗体并且因此能够通过哺乳动物高等真核展示选择来分离和排除肝素硫酸盐结合蛋白质。根据这个实例中呈现的数据，基于结合肝素硫酸盐的能力将一系列抗FIXa/抗FX双特异性抗体区分开来的证明是能够设想的。
在艾密次单抗开发过程中，发现了前体人源化抗体，命名为hBS106 136。发现这种分子在小鼠中具有不良药物动力学，与人类IgG4相比，其清除快且体内半衰期短。这种体内快速清除可归因于VH和VL抗FIXa臂上的正电荷补丁。对正电荷补丁有贡献的共同轻链上的氨基酸包括VL CDR1内的K24、R27和R31以及VL CDR2内的R53和R54以及FW3内的R61(图53)。对正电荷补丁有贡献的VH氨基酸包括R60和R95。对正电荷补丁有贡献的赖氨酸和精氨酸残基是FIXa结合必不可少的互补位残基。因此，引入带负电的氨基酸残基(谷氨酸或天冬氨酸)会破坏正电荷补丁并且还降低抗体等电点(pI)。带负电的氨基酸变化引入共同轻链中使得小鼠清除速率减小8倍且使最大体内血浆浓度(Cmax)增加近6倍。图53显示艾密次单抗的共同VL链与一系列前体VL的比对(US 2016/0222129)，与最终艾密次单抗VL相比，所述前体带负电荷的氨基酸少三个到一个。艾密次单抗亲本抗体相对于艾密次单抗命名。举例来说，相对于艾密次单抗，克隆：E30Y_E55Y_D93S在位置30、55和93分别具有酪氨酸、酪氨酸和丝氨酸残基以替代谷氨酸、谷氨酸和天冬氨酸。
可以将艾密次单抗前体VL抗FIXa基因(表23)克隆到pINT17-Bi-CMV-艾密次单抗靶向载体中，并且用于与如上文所述的人类AAVS TALEN对共转染HEK293细胞以能够实现核酸酶介导的抗体基因整合。转染后的第14天之后，HEK293细胞可以用肝素硫酸盐(FITC标记)和抗Fc-PE染色，如实例B中所述。流式细胞术分析将表明，与抗FIXa艾密次单抗和E30YVL克隆相比，哺乳动物细胞展示的抗FIXa艾密次单抗克隆E30Y_K54R_E55Y_D93S和E30Y_E55Y_D93S对肝素硫酸盐展示增强的结合。E30Y_K54R_E55Y_D93S和E30Y_E55Y_D93S克隆具有最完整的正电荷补丁并且这些克隆会引起可检测的肝素硫酸盐结合到展示这些抗体的细胞。这个实例已经表明如何能利用哺乳动物高等真核展示来区分结合到肝素硫酸盐的能力有差异的具有点突变的克隆。这将能够排除复杂文库内的结合肝素硫酸盐的双特异性克隆，且因此去除其可变域内具有正电荷补丁的克隆，所述正电荷补丁可能造成体内不良药物动力学。
这个实例已经说明通过哺乳动物展示来筛选双特异性抗体或替代双特异性形式的潜力。与单一靶抗体发现项目相比，将双特异性发现操作时需要筛选的变异体数目乘以若干个数量级。举例来说，在艾密次单抗发现操作中，为了鉴定主要的初始分子，使200种抗FIXa抗体与200种抗FX抗体互换以建立40,000个双特异性分子，然后通过费力的板基筛选进行筛选。主要的双特异性分子然后必须经历若干次迭代，包括人源化、亲和力和特异性优化以及可开发性增强，其关于通过破坏可变域正电荷补丁来减少与肝素硫酸盐发生的交叉相互作用136。通过哺乳动物展示对数百万个双特异性抗体克隆进行多维FACS的能力，包括对靶标的亲和力、特异性、展示水平(根据自聚集的倾向低来筛选)和交叉相互作用，能够以较大的筛选深度对较大数目个克隆执行更快、更高效的双特异性抗体筛选过程。
Figure BDA0002526758730001511
Figure BDA0002526758730001521
Figure BDA0002526758730001531
表22.艾密次单抗重链和轻链基因。可变和PDGFR跨膜域编码区分别以斜体和粗体突出显示。限制位点加有下划线。
Figure BDA0002526758730001532
Figure BDA0002526758730001541
表23.抗FIXa艾密次单抗和艾密次单抗亲本抗体的VL和VH合成基因块DNA序列。艾密次单抗亲本抗体是根据相对于艾密次单抗的单字母胺基酸取代进行命名。举例来说，亲本抗体艾密次单抗VL E30Y指示艾密次单抗谷氨酸在位置30处被酪氨酸置换。相对于最终艾密次单抗VL的变化以粗体突出显示。侧翼的限制位点加有下划线。
实例15.基于表面呈现水平、根据可开发性选择打结抗体
实例14证明HEK293细胞表面上能够展示“臼包杵”双特异性抗体艾密次单抗。还能够通过使多肽与抗体重链或轻链融合或对重链或轻链进行工程改造以赋予新颖结合特异性来建立双特异性分子133。哺乳动物细胞表面上展示双特异性分子的能力能够根据对两个靶标的结合进行筛选以及选择生物物理学特性良好的双特异性分子，如上文所述。打结抗体是新颖的抗体融合体形式，其中富半胱氨酸肽(打结素)并入抗体域的外周CDR环中(WO2017/118761)并且VH或VL域可用于结合相同抗原或不同抗原上的第二抗原决定基。这个实例的目的是证明哺乳动物展示技术能够区分和分离具有不同特性(关于其自身相互作用和多反应性特性)的打结抗体。
打结抗体专利WO2017/118761描述了通过将胰蛋白酶结合打结素EETI-II插入抗体的VL CDR2位置来产生两种胰蛋白酶结合打结抗体(KB_A07和KB_A12)。这个实例中测试的打结抗体是KB_A12 ProTx-III 2M(下文称为KB_A12 ProTx-III)和KB_A12 HsTx1。通过用离子通道阻断打结素或毒素肽ProTx-III 2M(PCT/EP2018/068855，2018年7月11日提交)和HsTxI(PCT/EP2018/068856，2018年7月11日提交)置换KB_A12打结抗体的VL CDR2位置的EETI-II打结素来建立这些打结抗体。KB_A12 EETI-II、KB_A12 ProTx-III和KB_A12 HsTx1的VL序列显示于表24中。
Figure BDA0002526758730001551
表24.打结抗体VL序列。VL CDR2中插有接头氨基酸的打结素以粗体突出显示。
将编码打结抗体KB_A12 EETI-II、ProTx-III和HsTxI的基因克隆到靶向载体pINT17-BSD中并且用于通过核酸酶介导的基因整合到HEK293细胞中来建立稳定细胞系，如上文所述。图54a表明KB_A12 EETI-II在HEK293细胞表面上的展示水平高于KB_A12 ProTx-III或KB_A12 HsTxI。HEK293细胞表面上以相对较低水平展示的KB_A12 ProTx-III或KB_A12 HsTxI与细胞计数相对于Fc表达的流式细胞术直方图(图54a)是等效的。打结抗体是通过Expi293细胞的瞬时转染来表达，通过蛋白质A亲和色谱法提纯且通过HPLC-SEC分析。图54b表明KB_A12 EETI-II显示了单体峰，其滞留时间和体积与表现良好的抗HER2抗体曲妥珠单抗相当(图54c)。相比之下，KB_A12 ProTx-III显示了二聚体和多聚体形成的证据，如根据较早的滞留时间所说明(图54d)。KB_A12 ProTx-III的洗脱体积大于曲妥珠单抗和KB_A12EETI-II是KB_A12 ProTx-III异源多聚体和聚集体形成的证据。在AC-SINS分析(表25)39中，与KB_A12 EETI-II相比，KB_A12 ProTx-III和KB_A12 HsTxI还显示了自身相互作用增加的倾向，其中KB_A12 ProTx-III和KB_A12 HsTxI显示的AC-SINS波长漂移比KB_A12EETI-II长。因此，如此前利用IgG展示所发现，高等真核细胞展示打结抗体的水平与其发生自身相互作用和聚集倾向的生物物理学特性之间有关。打结抗体是双特异性抗体的实例且因此，所展示分子的高等真核生物细胞展示水平与生物物理学特性之间的这种关系可能转移到替代的双特异性模式129。
打结抗体 AC-SINS分数
KB_A12 EETI-II 3
KB_A12ProTx III 10
KB_A12HsTx I 20
表25.经提纯的打结抗体的AC-分数39。
为了改善这些打结抗体的生物物理学特性，通过靶向诱发打结素序列中的疏水性或带正电残基突变来建立三种打结抗体哺乳动物文库。靶向诱发每种打结素突变的疏水性或带正电残基以粗体加下划线突出显示(参见下文)。使用编码VNS密码子(氨基酸序列中以X表示)或NSG密码子(氨基酸序列中以Z表示)的引物使这些残基突变。VNS密码子(V＝A/C/G，N＝A/G/C/T且S＝G/C)通过23种密码子组合来编码16种氨基酸(排除半胱氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和终止密码子)，而NSG密码子(N＝A/G/C/T且S＝G/C)通过8种密码子组合来编码7种氨基酸(精氨酸、色氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丝氨酸、丙氨酸和脯氨酸)。NSG密码子用于其中野生型色氨酸残基可能涉及对离子通道的结合接点的位置。
野生型ProTx-III打结素序列，其中靶向诱变的残基呈粗体加下划线：
Figure BDA0002526758730001561
KB_A12 ProTx-III A集合文库中的ProTx-III序列：
Figure BDA0002526758730001562
KB_A12 ProTx-III B集合文库中的ProTx-III序列：
Figure BDA0002526758730001563
野生型HsTx1打结素序列，其中靶向诱变的残基呈粗体加下划线：
Figure BDA0002526758730001564
KB_A12 HsTx-I文库中的HsTx1序列：
Figure BDA0002526758730001565
通过对打结抗体VL基因进行两片段组装PCR来产生文库。使用表26中所述的引物和模板扩增每个文库中的个别片段。使用引物pINT BM40前导序列正向引物和pINT CλNot反向引物组装与每一个文库对应的扩增片段。所有引物序列提供于表27中。使用NheI和NotI限制酶将组装的PCR片段消化并且接入编码D1A12或D12 VH(用于打结抗体构建体的重链，描述于WO2017/118761中)的pINT17-杀稻瘟菌素载体中。使用MinElute PCR提纯试剂盒(Qiagen，目录号28004)提纯接合产物。通过电穿孔将3x2.5μl的经提纯的接合混合物送入3x50μl的大肠杆菌细胞(E.cloni 10G Supreme，Lucigen，目录号60080-2)。简单来说，使用0.1cm光析管对50μl细胞进行脉冲，使用2ml回收培养基进行回收并且在37℃、250rpm下生长1小时，并且通过稀释接种来估测文库大小。KB_A12 ProTx-III A集合、KB_A12 ProTx-III B集合和KB_A12 HsTx1文库所得的文库大小分别是9x107、7x107和2x107。为了建立哺乳动物展示文库，使用Macherey Nagel Midi制备型试剂盒(Macherey Nagel，目录号740410.10)、依循制造商说明书，由这些文库储备液制备转染质量的DNA。
Figure BDA0002526758730001571
表26.用于扩增文库的片段1和片段2的引物。
Figure BDA0002526758730001572
Figure BDA0002526758730001581
表27.所用引物的序列。
使用MaxCyte STXG2、通过电穿孔将每一个文库的DNA送入经悬浮液调适的HEK293F细胞中(参见实例5)。类似地，克隆野生型KB_A12 ProTx-III和KB_A12HsTx1构建体且通过电穿孔送入HEK293F细胞中作为对照。每个文库使用1亿个细胞并且每个对照构建体使用1千万个细胞。转染后的第二天，以7.5μg/ml的浓度添加抗生素杀稻瘟菌素S HCl(LifeTech，目录号R21001)。细胞以0.25x106个细胞/毫升接种于锥形烧瓶(Erlenmeyerflasks)中。为了计算基因整合效率，还将细胞接种到10cm培养皿中，如实例5中所述。KB_A12 ProTx-III文库A集合、KB_A12 ProTx-III文库B集合和KB_A12 HsTx1文库的整合效率经计算分别是3％、2.5％和2％。因此，1亿细胞转染所达成的文库大小分别是3x106、2.5x106和2x106。5天的杀稻瘟菌素S HCl(LifeTech，目录号R21001)选择之后，使用抗Fc MACS珠粒富集细胞，如实例5中所述。14天的选择之后，通过流式细胞术分析文库中的打结抗体表达水平。如图55所示，与HEK293细胞上所展示亲本打结抗体相比，所有三种打结抗体文库展示改善的平均表达水平。这证明了已经产生打结抗体变异体，与亲本打结抗体分子相比，所述打结抗体变异体将具有改善的生物物理学特性。
接着，使用BioRad S3e细胞分选仪对打结抗体文库进行FACS。将MACS分选群体中的30x106个细胞与抗人类Fc PE(1μl/1x106个细胞)(剑桥生物科学，目录号409304)一起培育。在三种文库的针对高Fc表达的直方图上绘制门。对于KB_A12ProTxIII A集合文库而言，由此获取8.16％的门内细胞，而在所述区域中发现0.15％的对照KB_A12 ProTxIII。对于KB_A12 ProTxIII B集合文库而言，获取7.25％的门内细胞，而在这个区域中发现0.10％的对照。获取12.6％的KB_A12 HsTxI文库，而在这个区域中发现0.03％的KB_A12 HsTxI对照。每个群体取0.5x106个细胞用于提取基因组DNA。使用KOD热启动DNA聚合酶(默克密理博公司)，通过巢式PCR扩增编码IgG的DNA，如实例4中所述。对PCR产物进行凝胶提纯并且用NheI和XhoI消化，克隆到哺乳动物pINT3表达载体中并且用于转化大肠杆菌DH10B细胞。
通过利用如实例4和5中所述的相同方法(其中建立哺乳动物细胞展示突变体文库，然后基于表面展示水平进行选择)，鉴定出生物物理学特性与其亲本分子相比改善的个别打结抗体克隆。因此，这个实例已经描述了利用哺乳动物高等真核展示来改善打结抗体或任何替代双特异性形式的生物物理学特性。在此所述的方法还可以在打结抗体或双特异性发现项目期间进行，其中能够利用多参数FACS、基于高展示水平和对靶分子的特异性结合进行选择。
参考文献
1 Jarasch,A.等人,在新颖治疗抗体选择期间进行的可开发性评估(Developability assessment during the selection of novel therapeuticantibodies)，《药学杂志(J Pharm Sci)》104,1885-1898,doi:10.1002/jps.24430(2015).
2 Jain,T.等人,临床阶段抗体概貌的生物物理学特性(Biophysical propertiesof the clinical-stage antibody landscape)，《美国国家科学院院刊(Proceedings ofthe National Academy of Sciences of the United States of America)》114,944-949,doi:10.1073/pnas.1616408114(2017).
3 Yang,X.等人,工艺开发起始之前的可开发性研究：改善单克隆抗体的可制造性(Developability studies before initiation of process development:improvingmanufacturability of monoclonal antibodies),mAbs 5,787-794,doi:10.4161/mabs.25269(2013).
4 Ratanji,K.D.,Derrick,J.P.,Dearman,R.J.和Kimber,I.治疗蛋白的免疫原性：聚集的影响(Immunogenicity of therapeutic proteins:influence ofaggregation)，《免疫毒理学杂志(J Immunotoxicol)》11,99-109,doi:10.3109/1547691X.2013.821564(2014).
5 Moussa,E.M.等人,治疗蛋白聚集体的免疫原性(Immunogenicity ofTherapeutic Protein Aggregates)，《药学杂志(J Pharm Sci)》105,417-430,doi:10.1016/j.xphs.2015.11.002(2016).
6 Buchanan,A.等人,对治疗IgG分子进行工程改造以解决半胱氨酸化、聚集且增强热稳定性和表达(Engineering a therapeutic IgG molecule to addresscysteinylation,aggregation and enhance thermal stability and expression).mAbs5,255-262,doi:10.4161/mabs.23392(2013).
7 Dobson,C.L.等人,对人单克隆抗体的表面特性进行工程改造以阻止自缔合和体内快速清除(Engineering the surface properties of a human monoclonalantibody prevents self-association and rapid clearance in vivo)，《科学报道(Scientific Reports)》6,38644,doi:10.1038/srep38644https://www.nature.com/ articles/srep38644-supplementary-information(2016).
8 Schofield,D.J.等人,将噬菌体呈现应用于高通量抗体产生和表征(Application of phage display to high throughput antibody generation andcharacterization)，《基因组生物学(Genome biology)》8,R254,doi:10.1186/gb-2007-8-11-r254(2007).
9 Jespers,L.,Schon,O.,Famm,K.和Winter,G.在噬菌体上通过热变性来选择抗聚集结构域抗体(Aggregation-resistant domain antibodies selected on phage)，《自然·生物技术(Nat Biotechnol)》22,1161-1165,doi:10.1038/nbt1000(2004).
10 Fennell,B.J.等人,人类原生scFv的局限于CDR的工程改造建立了高度稳定的可溶性双功能抗体用于皮下递送(CDR-restricted engineering of native human scFvscreates highly stable and soluble bifunctional antibodies for subcutaneousdelivery),mAbs 5,882-895,doi:10.4161/mabs.26201(2013).
11 Christ,D.,Famm,K.和Winter,G.抗聚集人类抗体结构域谱系(Repertoiresof aggregation-resistant human antibody domains)，《蛋白质工程、设计和选择(Protein engineering,design&selection:PEDS)》20,413-416,doi:10.1093/protein/gzm037(2007).
12 Tiller,T.等人,基于固定VH/VL构架对、具有有利生物物理学特性的全合成人类Fab抗体文库(A fully synthetic human Fab antibody library based on fixed VH/VL framework pairings with favorable biophysical properties),mAbs 5,445-470,doi:10.4161/mabs.24218(2013).
13 Dudgeon,K.等人,用于产生抗聚集性增强的人类抗体可变域的通用策略(General strategy for the generation of human antibody variable domains withincreased aggregation resistance)，《美国国家科学院院刊(Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America)》109,10879-10884,doi:10.1073/pnas.1202866109(2012).
14 Bethea,D.等人,人类单克隆抗体CNTO607的自缔合机理(Mechanisms ofself-association of a human monoclonal antibody CNTO607)，《蛋白质工程设计和选择(Protein Engineering Design and Selection)》25,531-538(2012).
15 Kelly,R.L.等人,人类IgG1抗体在小鼠中的高通量交叉相互作用度量与清除率相关(High throughput cross-interaction measures for human IgG1antibodiescorrelate with clearance rates in mice).mAbs 7,770-777,doi:10.1080/19420862.2015.1043503(2015).
16
Figure BDA0002526758730001611
I.等人,快速清除的抗体的风险缓解策略(A strategy for riskmitigation of antibodies with fast clearance).mAbs 4,753-760,doi:10.4161/mabs.22189(2012).
17 Pries,A.R.,Secomb,T.W.和Gaehtgens,P.内皮细胞表面层(The endothelialsurface layer)，《欧洲生理学杂志(Pflugers Arch)》440,653-666,doi:10.1007/s004240000307(2000).
18 Nieuwdorp,M.等人,内皮细胞腊梅糖：健康与血管疾病之间的势垒(Theendothelial glycocalyx:a potential barrier between health and vasculardisease)，《脂质学新见(Curr Opin Lipidol)》16,507-511(2005).
19 Xu,Y.等人,解决选自试管内酵母呈现系统的抗体的多特异性：基于FACS的高通量选择和分析工具(Addressing polyspecificity of antibodies selected from anin vitro yeast presentation system:a FACS-based,high-throughput selection andanalytical tool)，《蛋白质工程、设计和选择：PEDS(Protein engineering,design&selection:PEDS)》26,663-670,doi:10.1093/protein/gzt047(2013).
20 Martin,W.L.,West,A.P.,Jr.,Gan,L.和Bjorkman,P.J.FcRn/异二聚体Fc复合物的2.8A晶体结构：pH依赖性结合的机理(Crystal structure at 2.8A of an FcRn/heterodimeric Fc complex:mechanism of pH-dependent binding)，《分子细胞(MolCell)》7,867-877(2001).
21 Suzuki,T.等人,新生儿FcR在调控含有人类IgG1的Fc域的治疗蛋白的血清半衰期方面的重要性：单克隆抗体和Fc融合蛋白对人类新生儿FcR的亲和力的比较研究(Importance of neonatal FcR in regulating the serum half-life of therapeuticproteins containing the Fc domain of human IgG1:a comparative study of theaffinity of monoclonal antibodies and Fc-fusion proteins to human neonatalFcR)，《免疫学杂志(Journal of immunology)》(Baltimore,Md.:1950)184,1968-1976,doi:10.4049/jimmunol.0903296(2010).
22 Schoch,A.等人,抗体可变域在电荷介导下对FcRn依赖性药物动力学的影响(Charge-mediated influence of the antibody variable domain on FcRn-dependentpharmacokinetics)，《美国国家科学院院刊》112,5997-6002,doi:10.1073/pnas.1408766112(2015).
23 Kelly,R.L.等人,靶标非依赖性可变区介导的对抗体清除的影响可以不依赖于FcRn(Target-independent variable region mediated effects on antibodyclearance can be FcRn independent),mAbs 8,1269-1275,doi:10.1080/19420862.2016.1208330(2016).
24 Boder,E.T.和Wittrup,K.D.用于筛选组合型多肽文库的酵母表面呈现(Yeastsurface display for screening combinatorial polypeptide libraries)，《自然·生物技术(Nat Biotechnol)》15,553-557,doi:10.1038/nbt0697-553(1997).
25 Chao,G.等人,利用酵母表面呈现来分离和工程改造人类抗体(Isolating andengineering human antibodies using yeast surface display.)，《自然·方案(Nat.Protocols)》1,755-768,doi:http://www.nature.com/nprot/journal/v1/n2/ suppinfo/nprot.2006.94_S1.html(2006).
26 Shusta,E.V.,Kieke,M.C.,Parke,E.,Kranz,D.M.和Wittrup,K.D.酵母多肽融合体表面呈现水平可预测热稳定性和可溶性分泌效率(Yeast polypeptide fusionsurface display levels predict thermal stability and soluble secretionefficiency)，《分子生物学杂志(Journal of molecular biology)》292,949-956,doi:https://doi.org/10.1006/jmbi.1999.3130(1999).
27 Kowalski,J.M.,Parekh,R.N.,Mao,J.和Wittrup,K.D.蛋白质折叠稳定性能够决定逃避内质网品质控制的效率(Protein Folding Stability Can Determine theEfficiency of Escape from Endoplasmic Reticulum Quality Control)，《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》273,19453-19458(1998).
28 Kowalski,J.M.,Parekh,R.N.和Wittrup,K.D.缺乏二硫键的牛胰脏胰蛋白酶抑制剂突变体在酿酒酵母中的分泌效率与热力学稳定性相关(Secretion Efficiency inSaccharomyces cerevisiae of Bovine Pancreatic Trypsin Inhibitor MutantsLacking Disulfide Bonds Is Correlated with Thermodynamic Stability)，《生物化学(Biochemistry)》37,1264-1273,doi:10.1021/bi9722397(1998).
29 Hackel,B.J.,Ackerman,M.E.,Howland,S.W.和Wittrup,K.D.稳定性和CDR组成偏向富集结合剂功能概貌(Stability and CDR Composition Biases Enrich BinderFunctionality Landscapes)，《分子生物学杂志(Journal of molecular biology)》401,84-96,doi:https://doi.org/10.1016/j.jmb.2010.06.004(2010).
30 Julian,M.C.等人,移植的淀粉样蛋白基序结构域抗体的亲和力和稳定性的协同进化(Co-evolution of affinity and stability of grafted amyloid-motif domainantibodies)，《蛋白质工程设计和选择(Protein Eng.Des.Sel.)》28,339-350,doi:10.1093/protein/gzv050(2015).
31 Rabia,L.A.,Desai,A.A.,Jhajj,H.S.和Tessier,P.M.了解和克服抗体亲和力、特异性、稳定性和溶解度之间的折衷(Understanding and overcoming trade-offsbetween antibody affinity,specificity,stability and solubility)，《生物化学工程杂志(Biochemical Engineering Journal)》137,365-374,doi:https://doi.org/ 10.1016/j.bej.2018.06.003(2018).
32 Igawa,T.,Haraya,K.和Hattori,K.将抗体作为新颖的治疗抗体模式扫描能够从循环中排除可溶性抗原(Sweeping antibody as a novel therapeutic antibodymodality capable of eliminating soluble antigens from circulation)，《免疫学评论(Immunol Rev)》270,132-151,doi:10.1111/imr.12392(2016).
33 Qin,J.Y.等人,组成型启动子与多西环素诱导型启动子的系统比较(Systematic comparison of constitutive promoters and the doxycycline-inducible promoter)，《公共科学图书馆·综合(PloS one)》5,e10611,doi:10.1371/journal.pone.0010611(2010).
34 Walker,J.M.蛋白质方案手册(The protein protocols handbook)第3版(Humana出版社,2009).
35 Janson,J.-C.《蛋白质提纯：原理、高分辨率方法和应用(Proteinpurification:principles,high resolution methods,and applications)》第3版(JohnWiley&Sons,2011).
36 Schiel,J.E.,Davis,D.L.和Borisov,O.《用于治疗单克隆抗体表征的工艺现状和新兴技术(State-of-the-art and emerging technologies for therapeuticmonoclonal antibody characterization)》(美国化学学会，2014)。
37 Saro,D.等人,在《用于治疗单克隆抗体表征的工艺现状和新兴技术(State-of-the-Art and Emerging Technologies for Therapeutic Monoclonal AntibodyCharacterization)》第2卷，《生物医药表征：NISTmAb案例分析(BiopharmaceuticalCharacterization:The NISTmAb Case Study)》第1201卷，ACS研讨会丛刊(ACS SymposiumSeries)第7章，329 355(美国化学学会，2015).
38 Sun,T.等人,通过生物层干涉量测术高通量检测抗体自身相互作用(Highthroughput detection of antibody self-interaction by bio-layerinterferometry)mAbs 5,838-841,doi:10.4161/mabs.26186(2013).
39 Liu,Y.等人,在利用自身相互作用纳米颗粒光谱法的早期抗体发现期间根据可开发性进行的高通量筛选(High-throughput screening for developability duringearly-stage antibody discovery using self-interaction nanoparticlespectroscopy).mAbs 6,483-492,doi:10.4161/mabs.27431(2014).
40 Geng,S.B.,Wittekind,M.,Vigil,A.和Tessier,P.M.单克隆抗体自缔合的测量结果与复杂的生物物理学特性相关(Measurements of Monoclonal Antibody Self-Association Are Correlated with Complex Biophysical Properties)，《分子制药学(Molecular Pharmaceutics)》13,1636-1645,doi:10.1021/acs.molpharmaceut.6b00071(2016).
41 Wu,J.等人,提纯之前利用亲和力捕捉自身相互作用纳米颗粒光谱法发现高度可溶性抗体(Discovery of highly soluble antibodies prior to purification usingaffinity-capture self-interaction nanoparticle spectroscopy)，《蛋白质工程、设计和选择:PEDS》28,403-414,doi:10.1093/protein/gzv045(2015).
42 Nobbmann,U.等人,动态光散射作为相对工具用于评估单克隆抗体的分子完整性和稳定性(Dynamic light scattering as a relative tool for assessing themolecular integrity and stability of monoclonal antibodies)，《生物技术和基因工程评论(Biotechnology and Genetic Engineering Reviews)》24,117-128(2007).
43 Geng,S.B.,Cheung,J.K.,Narasimhan,C.,Shameem,M.和Tessier,P.M.利用胶体蛋白质相互作用的测量结果来改善单克隆抗体选择和工程化(Improving monoclonalantibody selection and engineering using measurements of colloidal proteininteractions)，《药学杂志(J Pharm Sci)》103,3356-3363,doi:10.1002/jps.24130(2014).
44 Howlett,G.J.,Minton,A.P.和Rivas,G.用于研究蛋白质缔合和组装的分析型超离心法(Analytical ultracentrifugation for the study of protein associationand assembly)，《化学生物学新见(Curr Opin Chem Biol)》10,430-436,doi:10.1016/j.cbpa.2006.08.017(2006).
45 Salinas,B.A.等人,了解和调节单克隆抗体配制物的乳白化和粘度(Understanding and modulating opalescence and viscosity in a monoclonalantibody formulation)，《药学杂志》99,82-93,doi:10.1002/jps.21797(2010).
46 Gabel,F.等人,通过中子散射研究蛋白质动态(Protein dynamics studiedby neutron scattering)，《生物物理学季评(Q Rev Biophys)》35,327-367(2002).
47 Jacobs,S.A.,Wu,S.J.,Feng,Y.,Bethea,D.和O’Neil,K.T.交叉相互作用色谱：一种快速鉴定高度可溶性单克隆抗体候选物的方法(Cross-interactionchromatography:A rapid method to identify highly soluble monoclonal antibodycandidates)，《药物研究(Pharm.Res.)》27,65-71,doi:10.1007/s11095-009-0007-z(2010).
48 Josic,D.,Bal,F.和Schwinn,H.通过肝素亲和色谱法从凝血级联中分离血浆蛋白质(Isolation of plasma proteins from the clotting cascade by heparinaffinity chromatography)，《色谱学杂志(J Chromatogr)》632,1-10(1993).
49 Fekete,S.,Veuthey,J.L.,Beck,A.和Guillarme,D.用于表征单克隆抗体和相关产物的疏水相互作用色谱(Hydrophobic interaction chromatography for thecharacterization of monoclonal antibodies and related products)，《制药和生物医药分析杂志(J Pharm Biomed Anal)》130,3-18,doi:10.1016/j.jpba.2016.04.004(2016).
50 Eriksson,K.O.和Belew,M.疏水相互作用色谱(Hydrophobic interactionchromatography)，《生物化学分析方法(Methods Biochem Anal)》54,165-181(2011).
51 Bakalova,R.和Ohba,H.大豆凝集素与白血病T细胞的相互作用以及其用于通过凝集素亲和色谱法与正常淋巴细胞试管内分离的用途(Interaction of soybeanagglutinin with leukemic T-cells and its use for their in vitro separationfrom normal lymphocytes by lectin-affinity chromatography)，《生物医学色谱(Biomed Chromatogr)》17,239-249,doi:10.1002/bmc.218(2003).
52 Melidoni,A.N.,Dyson,M.R.,Wormald,S.和McCafferty,J.选择拮抗性抗体以通过胚胎干细胞的诱导型表达控制分化(Selecting antagonistic antibodies thatcontrol differentiation through inducible expression in embryonic stemcells)，《美国国家科学院院刊》110,17802-17807,doi:10.1073/pnas.1312062110(2013).
53 Xie,J.,Zhang,H.,Yea,K.和Lerner,R.A.自分泌信号传导是基于使人类干细胞转分化的组合型抗体的选择(Autocrine signaling based selection ofcombinatorial antibodies that transdifferentiate human stem cells)，《美国国家科学院院刊》110,8099-8104,doi:10.1073/pnas.1306263110(2013).
54 Zhang,H.等人,从组合型抗体文库感染的单一细胞中选择促效剂(SelectingAgonists from Single Cells Infected with Combinatorial Antibody Libraries)，《化学与生物学(Chemistry&Biology)》20,734-741,doi:10.1016/j.chembiol.2013.04.012(2013).
55 Igoucheva,O.,Alexeev,V.和Yoon,K.在哺乳动物细胞中利用小单链寡核苷酸进行靶基因校正(Targeted gene correction by small single-strandedoligonucleotides in mammalian cells).《基因疗法(Gene Therapy)》8,391,doi:10.1038/sj.gt.3301414(2001).
56 Liang,X.,Potter,J.,Kumar,S.,Ravinder,N.和Chesnut,J.D.通过改善gRNA、Cas9核酸酶和供体DNA的设计和递送来增强CRISPR/Cas9介导的精确基因组编辑(EnhancedCRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and deliveryof gRNA,Cas9 nuclease,and donor DNA).《生物技术杂志(J.Biotechnol.)》241,136-146,doi:https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2016.11.011(2017).
57 Dyson,M.R.等人,通过将抗体亲和力成熟与质谱学组合来定位蛋白质相互作用(Mapping protein interactions by combining antibody affinity maturation andmass spectrometry)，《分析生物化学(Analytical biochemistry)》417,25-35,doi:10.1016/j.ab.2011.05.005(2011).
58 Gronwald,R.G.等人,编码人类血小板源生长因子受体的cDNA的克隆和表达：超过一种受体类别的证据(Cloning and expression of a cDNA coding for the humanplatelet-derived growth factor receptor:evidence for more than one receptorclass)，《美国国家科学院院刊》85,3435-3439(1988).
59 Dux,R.,Kindler-Rohrborn,A.,Lennartz,K.和Rajewsky,M.F.校准荧光强度以通过流式细胞术定量细胞亚群的抗体结合表面决定子(Calibration of fluorescenceintensities to quantify antibody binding surface determinants of cellsubpopulations by flow cytometry)，《细胞测量术(Cytometry)》12,422-428,doi:10.1002/cyto.990120507(1991).
60 Brockhoff,G.,Hofstaedter,F.和Knuechel,R.流式细胞术对人类膀胱癌细胞系中的表皮生长因子受体的检测和量化与史卡查分析的比较(Flow cytometricdetection and quantitation of the epidermal growth factor receptor incomparison to Scatchard analysis in human bladder carcinoma cell lines)，《细胞测量术》17,75-83,doi:10.1002/cyto.990170110(1994).
61 Gordon,I.L.对荧光刀豆凝集素A结合到淋巴细胞的史卡查分析(Scatchardanalysis of fluorescent concanavalin A binding to lymphocytes)，《细胞测量术》20,238-244,doi:10.1002/cyto.990200307(1995).
62 Sheehan,J.和Marasco,W.A.噬菌体和酵母呈现(Phage and Yeast Display)，《微生物学波谱(Microbiol Spectr)》3,AID-0028-2014,doi:10.1128/microbiolspec.AID-0028-2014(2015).
63 Puck,T.T.体细胞哺乳动物细胞的遗传学(The genetics of somaticmammalian cells)，《实验医学与生物学进展(Adv Biol Med Phys)》5,75-101(1957).
64 Wurm,F.CHO准种—对制造过程的影响(Quasispecies-Implications forManufacturing Processes)，《过程(Processes)》1,296-311(2013).
65 Goh,J.B.和Ng,S.K.宿主细胞系选择对多糖特征的影响(Impact of hostcell line choice on glycan profile)，《生物技术重要评论(Critical Reviews inBiotechnology)》38,851-867,doi:10.1080/07388551.2017.1416577(2018).
66 Skerra,A.分子识别用的替代非抗体支架(Alternative non-antibodyscaffolds for molecular recognition)，《生物技术新见(Curr Opin Biotechnol)》18,295-304,doi:10.1016/j.copbio.2007.04.010(2007).
67 Gebauer,M.和Skerra,A.作为下一代抗体治疗剂的工程化蛋白质支架(Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeutics)，《化学生物学新见(Curr Opin Chem Biol)》13,245-255,doi:10.1016/j.cbpa.2009.04.627(2009).
68 Tiede,C.等人,得隆肽：一种用于分子识别应用的稳定和通用肽呈现支架(Adhiron:a stable and versatile peptide display scaffold for molecularrecognition applications)，《蛋白质工程、设计和选择:PEDS(Protein engineering,design&selection:PEDS)》27,145-155,doi:10.1093/protein/gzu007(2014).
69 Koide,A.,Bailey,C.W.,Huang,X.和Koide,S.纤维结合蛋白III型结构域作为新颖结合蛋白的支架(The fibronectin type III domain as a scaffold for novelbinding proteins)，《分子生物学杂志(Journal of molecular biology)》284,1141-1151,doi:10.1006/jmbi.1998.2238(1998).
70 Nygren,P.A.和Skerra,A.来自替代支架的结合蛋白(Binding proteins fromalternative scaffolds)，《免疫学方法杂志(J Immunol Methods)》290,3-28,doi:10.1016/j.jim.2004.04.006(2004).
71 Chang,H.J.等人,胱氨酸稳定化小蛋白质作为稳定蛋白质结合剂的分子进化(Molecular evolution of cystine-stabilized miniproteins as stableproteinaceous binders)，《结构(Structure)》17,620-631,doi:10.1016/j.str.2009.01.011(2009).
72 Ward,E.S.,Güssow,D.,Griffiths,A.D.,Jones,P.T.和Winter,G.从大肠杆菌分泌的单一免疫球蛋白可变域谱系的结合活性(Binding activities of a repertoireof single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli)，《自然(Nature)》341,544,doi:10.1038/341544a0(1989).
73 McCafferty,J.,Griffiths,A.D.,Winter,G.和Chiswell,D.J.噬菌体抗体：呈现抗体可变域的丝状噬菌体(Phage antibodies:filamentous phage displayingantibody variable domains)，《自然》348,552-554,doi:10.1038/348552a0(1990).
74 Holt,L.J.,Herring,C.,Jespers,L.S.,Woolven,B.P.和Tomlinson,I.M.结构域抗体：用于治疗的蛋白质(Domain antibodies:proteins for therapy)，《生物技术趋势(Trends in Biotechnology)》21,484-490,doi:10.1016/j.tibtech.2003.08.007(2003).
75 Huston,J.S.等人,抗体结合位点的蛋白质工程：恢复大肠杆菌所产生的抗地高辛单链Fv类似物的特异活性(Protein engineering of antibody binding sites:recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogueproduced in Escherichia coli)，《美国国家科学院院刊》85,5879(1988).
76 Bird,R.E.等人,单链抗原结合蛋白(Single-chain antigen-bindingproteins)，《科学(Science)》242,423-426(1988).
77 Holliger,P.,Prospero,T.和Winter,G.“双链抗体”：二价双特异性抗体小片段("Diabodies":Small bivalent and bispecific antibody fragments)，《美国国家科学院院刊》90,6444-6448(1993).
78 Reiter,Y.,Brinkmann,U.,Lee,B.和Pastan,I.用于癌症检测和治疗的工程化抗体Fv片段：二硫键稳定化Fv片段(Engineering antibody Fv fragments for cancerdetection and therapy:Bisulfide-stabilized Fv fragments)，《自然·生物技术》14,1239,doi:10.1038/nbt1096-1239(1996).
79 Holliger,P.和Hudson,P.J.工程化抗体片段和单一结构域的升高(Engineered antibody fragments and the rise of single domains)，《自然·生物技术》23,1126-1136,doi:10.1038/nbt1142(2005).
80 Knappik,A.等人,基于模块化共同构架和三核苷酸随机化CDR的全合成人类组合型抗体文库(HuCAL)(Fully synthetic human combinatorial antibody libraries(HuCAL)based on modular consensus frameworks and CDRs randomized withtrinucleotides)，《分子生物学杂志(Journal of molecular biology)》296,57-86,doi:10.1006/jmbi.1999.3444(2000).
81 Krebs,B.等人,重组人类抗体的高通量产生和工程化(High-throughputgeneration and engineering of recombinant human antibodies)，《免疫学方法杂志(JImmunol Methods)》254,67-84(2001).
82 Holliger,P.和Bohlen,H.用于临床的工程化抗体(Engineering antibodiesfor the clinic)，《癌症和转移评述(Cancer Metastasis Rev)》18,411-419(1999).
83 Glennie,M.J.,McBride,H.M.,Worth,A.T.和Stevenson,G.T.含有硫醚连接的Fab’γ片段的双特异性F(ab’γ)2抗体的制备和性能(Preparation and performance ofbispecific F(ab’gamma)2antibody containing thioether-linked Fab’gammafragments)，《免疫学杂志(Journal of immunology)》(Baltimore,Md.:1950)139,2367-2375(1987).
84 Repp,R.等人,使用针对FcγRI和HER-2/neu的双特异性抗体(MDX-210)免疫治疗乳癌的经G-CSF刺激的PMN(G-CSF-stimulated PMN in immunotherapy of breastcancer with a bispecific antibody to Fc gamma RI and to HER-2/neu(MDX-210))，《血液治疗杂志(J Hematother)》4,415-421,doi:10.1089/scd.1.1995.4.415(1995).
85 Suresh,M.R.,Cuello,A.C.和Milstein,C.得自杂合体融合瘤的双特异性单克隆抗体(Bispecific monoclonal antibodies from hybrid hybridomas)，《酶学方法(Methods in enzymology)》121,210-228(1986).
86 Staerz,U.D.和Bevan,M.J.产生能够集中效应T细胞活性的双特异性单克隆抗体的杂合体融合瘤(Hybrid hybridoma producing a bispecific monoclonal antibodythat can focus effector T-cell activity)，《美国国家科学院院刊》83,1453(1986).
87 Merchant,A.M.等人,人类双特异性IgG的有效途径(An efficient route tohuman bispecific IgG)，《自然·生物技术》16,677,doi:10.1038/nbt0798-677(1998).
88 Von Kreudenstein,T.S.等人,改善双特异性抗体支架的生物物理学特性以促进可开发性：分子设计的品质(Improving biophysical properties of a bispecificantibody scaffold to aid developability:quality by molecular design),mAbs 5,646-654,doi:10.4161/mabs.25632(2013).
89 Ghetie,V.等人,通过随机诱变来增加IgG片段的血清持久性(Increasing theserum persistence of an IgG fragment by random mutagenesis)，《自然·生物技术》15,637-640,doi:10.1038/nbt0797-637(1997).
90 Borrok,M.J.等人,为了改善稳定性而设计的具有延长的半衰期的“Fc静默”IgG1形式(An"Fc-Silenced"IgG1 Format With Extended Half-Life Designed forImproved Stability)，《药学杂志(J Pharm Sci)》106,1008-1017,doi:10.1016/j.xphs.2016.12.023(2017).
91 Schlothauer,T.等人,用于功能表征单克隆抗体的分析型FcRn亲和色谱法(Analytical FcRn affinity chromatography for functional characterization ofmonoclonal antibodies).mAbs 5,576-586,doi:10.4161/mabs.24981(2013).
92 Gossen,M.等人,四环素在哺乳动物细胞中引起的转录活化(Transcriptionalactivation by tetracyclines in mammalian cells)，《科学(Science)》268,doi:10.1126/science.7792603(1995).
93 Sadelain,M.,Papapetrou,E.P.和Bushman,F.D.用于将新DNA整合到人类基因组中的安全港(Safe harbours for the integration of new DNA in the humangenome)，《自然评论(Nature reviews)》,《癌症(Cancer)》12,51-58,doi:10.1038/nrc3179(2011).
94 Foote,J.和Winter,G.影响高变环构象的抗体构架残基(Antibody frameworkresidues affecting the conformation of the hypervariable loops)，《分子生物学杂志(Journal of molecular biology)》224,487-499(1992).
95 Haghparast,S.M.,Kihara,T.和Miyake,J.HEK293细胞在粘附和悬浮状态下的不同力学行为(Distinct mechanical behavior of HEK293 cells in adherent andsuspended states)，《PeerJ》3,e1131,doi:10.7717/peerj.1131(2015).
96 Rivera,V.M.等人,通过控制内质网中的聚集来调控蛋白质分泌(Regulationof protein secretion through controlled aggregation in the endoplasmicreticulum)，《科学(Science)》287,826-830(2000).
97 Ferri,N.,Corsini,A.,Sirtori,C.R.和Ruscica,M.用于治疗高胆固醇血症的博可珠单抗(Bococizumab for the treatment of hypercholesterolaemia)，《生物疗法专家意见(Expert Opin Biol Ther)》17,237-243,doi:10.1080/14712598.2017.1279602(2017).
98 Liang,H.等人,前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/枯草溶菌素9型拮抗作用减少了经抑制素治疗的高胆固醇脂血症非人类灵长类动物的低密度脂蛋白胆固醇(ProproteinConvertase Substilisin/Kexin Type 9Antagonism Reduces Low-Density LipoproteinCholesterol in Statin-Treated Hypercholesterolemic Nonhuman Primates)，《药理学和实验治疗学杂志(Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics)》340,228(2012).
99 Jones,T.D.,Crompton,L.J.,Carr,F.J.和Baker,M.P.在《治疗抗体：方法和方案(Therapeutic Antibodies:Methods and Protocols)》(Antony S.Dimitrov编)405-423(Humana出版社，2009).
100 Bostrom,J.,Lee,C.V.,Haber,L.和Fuh,G.在《治疗抗体：方法和方案》(Antony S.Dimitrov编)353-376(Humana出版社，2009).
101 Dyson,M.R.,Shadbolt,S.P.,Vincent,K.J.,Perera,R.L.和McCafferty,J.在大肠杆菌中产生可溶性哺乳动物蛋白质：与成功表达相关的蛋白质特征的鉴定(Production of soluble mammalian proteins in Escherichia coli:identificationof protein features that correlate with successful expression)，《BMC生物技术(BMC biotechnology)》4,32,doi:10.1186/1472-6750-4-32(2004).
102 Neylon,C.用于使蛋白质编码DNA序列随机突变的化学和生物化学策略：用于定向进化的文库构建方法(Chemical and biochemical strategies for therandomization of protein encoding DNA sequences:library construction methodsfor directed evolution)，《核酸研究(Nucleic acids research)》32,1448-1459,doi:10.1093/nar/gkh315(2004).
103 Fujino,Y.等人,基于界面聚焦高通量突变扫描的稳健性试管内亲和力成熟策略(Robust in vitro affinity maturation strategy based on interface-focusedhigh-throughput mutational scanning)，《生物化学和生物物理学研究通讯(Biochemical and biophysical research communications)》428,395-400,doi:10.1016/j.bbrc.2012.10.066(2012).
104 Xin,Y.等人,抗神经纤毛蛋白-1(MNRP1685A)：从临床前模型到人类跨越物种的出人意料的药物动力学差异(unexpected pharmacokinetic differences acrossspecies,from preclinical models to humans)，《药物研究(Pharm Res)》29,2512-2521,doi:10.1007/s11095-012-0781-x(2012).
105 Patnaik,A.等人,评估MNRP1685A、完整人类抗NRP1单克隆抗体与贝伐单抗和太平洋紫杉醇的组合对晚期实体肿瘤患者的Ib期研究(A Phase Ib study evaluatingMNRP1685A,a fully human anti-NRP1 monoclonal antibody,in combination withbevacizumab and paclitaxel in patients with advanced solid tumors)，《癌症化疗与药理学(Cancer Chemother Pharmacol)》73,951-960,doi:10.1007/s00280-014-2426-8(2014).
106 Shin,D.S.和Ribas,A.检查点阻断作为癌症疗法的演变：现状、将来(Theevolution of checkpoint blockade as a cancer therapy:What’s here,what’snext？)，《免疫学新见(Curr.Opin.Immunol.)》33,23-35,doi:10.1016/j.coi.2015.01.006(2015).
107 Mouquet,H.等人,多反应性通过异型接合来增强抗HIV抗体的表观亲和力(Polyreactivity increases the apparent affinity of anti-HIV antibodies byheteroligation)，《自然》467,591-595,doi:10.1038/nature09385(2010).
108 Fellouse,F.A.和Sidhu,S.S.在《制备和使用抗体：实用手册(Making andUsing Antibodies:A Practical Handbook)》(G.C.Howard和M.R.Kaser编)第8章，157-180(CRC出版社，2007).
109 Peterson,M.L.在B细胞发育期间控制膜和分泌的免疫球蛋白的产生的机理(Mechanisms controlling production of membrane and secreted immunoglobulinduring B cell development)，《免疫学研究(Immunol Res)》37,33-46(2007).
110 Peterson,M.L.和Perry,R.P.μm和μs mRNA的调控产生依赖于μs聚(腺苷酸)位点使用率和cμ4至M1剪接的相对效率(The regulated production of mu m and mu smRNA is dependent on the relative efficiencies of mu s poly(A)site usage andthe c mu 4-to-M1 splice)，《分子细胞生物学(Mol Cell Biol)》9,726-738(1989).
111 Yu,B.,Wages,J.M.和Larrick,J.W.用于促进细胞系发育的抗体-膜开关(AMS)技术(Antibody-membrane switch(AMS)technology for facile cell linedevelopment)，《蛋白质工程设计和选择(Protein Engineering Design and Selection)》27,309-315,doi:10.1093/protein/gzu039(2014).
112 Wang,C.等人,抗PD-1抗体尼沃单抗、BMS-936558的试管内表征和在非人类灵长类动物中的体内毒理学(In vitro characterization of the anti-PD-1 antibodynivolumab,BMS-936558,and in vivo toxicology in non-human primates)，《癌症免疫学研究(Cancer Immunol Res)》2,846-856,doi:10.1158/2326-6066.CIR-14-0040(2014).
113 D’Hautcourt,J.-L.在《流式细胞术实验指南(Current Protocols inCytometry)》(John Wiley&Sons,Inc.,2001).
114 Gossen,M.和Bujard,H.通过四环素响应性启动子紧密控制哺乳动物细胞中的基因表达(Tight control of gene expression in mammalian cells bytetracycline-responsive promoters)，《美国国家科学院院刊》89,doi:10.1073/pnas.89.12.5547(1992).
115 Ryan,M.D.和Drew,J.口蹄疫病毒2A寡肽介导人工多聚蛋白的裂解(Foot-and-mouth disease virus 2A oligopeptide mediated cleavage of an artificialpolyprotein)，《欧洲分子生物学学会杂志(The EMBO Journal)》13,928-933(1994).
116 Zhou,X.,Vink,M.,Klaver,B.,Berkhout,B.和Das,A.T.优化Tet-On系统以便通过病毒进化来调控基因表达(Optimization of the Tet-On system for regulatedgene expression through viral evolution)，《基因疗法(Gene Ther)》13,1382-1390,doi:10.1038/sj.gt.3302780(2006).
117 Loew,R.,Heinz,N.,Hampf,M.,Bujard,H.和Gossen,M.背景表达最小化的经改善的Tet响应性启动子(Improved Tet-responsive promoters with minimizedbackground expression)，《BMC生物技术(BMC biotechnology)》10,81,doi:10.1186/1472-6750-10-81(2010).
118 To,T.L.和Maheshri,N.杂讯能够诱导无双稳态的正向转录反馈回路产生双峰(Noise can induce bimodality in positive transcriptional feedback loopswithout bistability)，《科学》327,1142-1145,doi:10.1126/science.1178962(2010).
119 Mullick,A.等人,二甲氨基二硫代甲酸铜基因开关：一种用于调控哺乳动物细胞表达的系统(The cumate gene-switch:a system for regulated expression inmammalian cells)，《BMC生物技术》6,1-18,doi:10.1186/1472-6750-6-43(2006).
120 Yao,F.等人,四环素抑制因子tetR而非tetR-哺乳动物细胞转录因子融合体衍生物调控哺乳动物细胞中的诱导型基因表达(Tetracycline repressor,tetR,ratherthan the tetR-mammalian cell transcription factor fusion derivatives,regulates inducible gene expression in mammalan cells)，《人类基因疗法(Hum GeneTher)》9,doi:10.1089/hum.1998.9.13-1939(1998).
121 Wang,Y.,O’Malley,B.W.,Jr.,Tsai,S.Y.和O’Malley,B.W.用于基因转移的调控系统(A regulatory system for use in gene transfer)，《美国国家科学院院刊》91,8180-8184(1994).
122 Datta-Mannan,A.等人,非特异性结合、靶标介导式清除和FcRn相互作用对人源化抗体的药物动力学的相互影响(The interplay of non-specific binding,target-mediated clearance and FcRn interactions on the pharmacokinetics of humanizedantibodies)，mAbs 7,1084-1093,doi:10.1080/19420862.2015.1075109(2015).
123 Sigounas,G.,Harindranath,N.,Donadel,G.和Notkins,A.L.多反应性抗体的半衰期(Half-life of polyreactive antibodies)，《临床免疫学杂志(J ClinImmunol)》14,134-140(1994).
124 Roopenian,D.C.和Akilesh,S.FcRn：新生儿Fc受体成熟(FcRn:the neonatalFc receptor comes of age)，《自然·免疫学评述(Nat Rev Immunol)》7,715-725,doi:10.1038/nri2155(2007).
125 Eid,J.等人,单一聚合酶分子的实时DNA测序(Real-time DNA sequencingfrom single polymerase molecules)，《科学》323,133-138,doi:10.1126/science.1162986(2009).
126 Giordano,F.等人,来自MinION、PacBio和MiSeq平台的酵母基因组重新组装(De novo yeast genome assemblies from MinION,PacBio and MiSeq platforms)，《科学报道(Scientific Reports)》7,3935,doi:10.1038/s41598-017-03996-z(2017).
127 Ehrenmann,F.,Duroux,P.,Giudicelli,V.和Lefranc,M.-P.《使用
Figure BDA0002526758730001751
对抗体进行的标准化序列和结构分析(Standardized Sequence and Structure Analysis ofAntibody Using
Figure BDA0002526758730001752
)》11-31,doi:10.1007/978-3-642-01147-4_2(2010).
128 Van Blarcom,T.等人,生产性共同轻链文库产生了一组多样性高亲和力双特异性抗体(Productive common light chain libraries yield diverse panels of highaffinity bispecific antibodies).mAbs 10,256-268,doi:10.1080/19420862.2017.1406570(2018).
129 Spiess,C.,Zhai,Q.和Carter,P.J.双特异性抗体的替代分子形式和治疗应用(Alternative molecular formats and therapeutic applications for bispecificantibodies)，《分子免疫学(Molecular Immunology)》67,95-106,doi:http:// dx.doi.org/10.1016/j.molimm.2015.01.003(2015).
130 Husain,B.和Ellerman,D.通过双特异性抗体扩增生物治疗剂的边界(Expanding the Boundaries of Biotherapeutics with Bispecific Antibodies)，《生物药物(BioDrugs)》32,441-464,doi:10.1007/s40259-018-0299-9(2018).
131 Fischer,N.等人,利用轻链对原生人类双特异性IgG进行可放大的产生和平台提纯(Exploiting light chains for the scalable generation and platformpurification of native human bispecific IgG)，《自然通讯(Nat Commun)》6,6113,doi:10.1038/ncomms7113(2015).
132 Ridgway,J.B.B.,Presta,L.G.和Carter,P.用于重链异二聚的抗体CH3域的’臼包杵’工程化(‘Knobs-into-holes’engineering of antibody CH3 domains for heavychain heterodimerization)，《蛋白质工程、设计和选择(Protein Eng.Des.Sel.)》9,617-621,doi:10.1093/protein/9.7.617(1996).
133 Wozniak-Knopp,G.等人,将抗原结合位点引入免疫球蛋白恒定域的结构环中：具有工程化HER2/neu结合位点和抗体特性的Fc片段(Introducing antigen-bindingsites in structural loops of immunoglobulin constant domains:Fc fragmentswith engineered HER2/neu-binding sites and antibody properties)，《蛋白质工程、设计和选择:PEDS》23,289-297,doi:10.1093/protein/gzq005(2010).
134 Traxlmayr,M.W.等人,Her2/neu结合IgG1-Fc的定向进化以便利用酵母表面呈现改善稳定性和聚集抗性(Directed evolution of Her2/neu-binding IgG1-Fc forimproved stability and resistance to aggregation by using yeast surfacedisplay)，《蛋白质工程、设计和选择:PEDS》26,255-265,doi:10.1093/protein/gzs102(2013).
135 Mahlangu,J.等人,艾密次单抗防治无抑制因子的A型血友病患者(Emicizumab Prophylaxis in Patients Who Have Hemophilia A withoutInhibitors)，《新英格兰医学杂志(N Engl J Med)》379,811-822,doi:10.1056/NEJMoa1803550(2018).
136 Sampei,Z.等人,鉴定和多维度优化不对称双特异性IgG抗体、从而模拟因子VIII辅因子活性功能(Identification and Multidimensional Optimization of anAsymmetric Bispecific IgG Antibody Mimicking the Function of Factor VIIICofactor Activity)，《公共科学图书馆·综合(PloS one)》8,e57479,doi:10.1371/journal.pone.0057479(2013).
137 Tabrizi,M.A.,Tseng,C.M.和Roskos,L.K.治疗性单克隆抗体的排除机理(Elimination mechanisms of therapeutic monoclonal antibodies)，《今日药物发现(Drug Discov Today)》11,81-88,doi:10.1016/S1359-6446(05)03638-X(2006).
138 Dostalek,M.,Gardner,I.,Gurbaxani,B.M.,Rose,R.H.和Chetty,M.单克隆抗体基于药物动力学、药效学和生理学的药物动力学建模(Pharmacokinetics,pharmacodynamics and physiologically-based pharmacokinetic modelling ofmonoclonal antibodies)，《临床药物动力学(Clin Pharmacokinet)》52,83-124,doi:10.1007/s40262-012-0027-4(2013).
139.Sondermann,P.和Szymkowski,D.E.利用Fc受体生物学设计治疗抗体(Harnessing Fc receptor biology in the design of therapeutic antibodies)，《免疫学新见(Curr Opin Immunol)》40,78-87(2016).
140.Park,H.I.,Yoon,H.W.和Jung,S.T.高度可进化的抗体Fc域(The HighlyEvolvable Antibody Fc Domain)，《生物技术趋势(Trends in Biotechnology)》34,895-908(2016).
141.Hogarth,P.M.和Pietersz,G.A.用于治疗发炎、癌症和其它的Fc受体靶向疗法(Fc receptor-targeted therapies for the treatment of inflammation,cancerand beyond.Nature reviews)，《自然评论(Nature reviews)》，《药物发现(Drugdiscovery)》11,311-331(2012).
142.Mayes,P.A.,Hance,K.W.和Hoos,A.癌症的免疫促效抗体开发的前景和挑战(The promise and challenges of immune agonist antibody development incancer)，《自然评论》，《药物发现》17,509-527(2018).
143.Jacobsen,F.W.等人,工程改造缺乏效应功能、但具有优化的可开发性的IgG支架(Engineering an IgG scaffold lacking effector function with optimizeddevelopability)，《生物化学杂志》(2016).

Claims (90)

1.一种结合剂在体外培养的高等真核细胞上的表面呈现水平作为所述结合剂在溶液中的溶解度和/或其自缔合抗性的预测指标的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所培养的细胞是表达结合剂的多样化谱系的展示文库的克隆。
3.一种高等真核细胞的培养文库用于体外选择结合剂以实现在溶液中的较高溶解度和/或较低自缔合倾向的用途，
其中所述文库是各含有编码结合剂的DNA的高等真核细胞克隆的文库，其中已编码的所述结合剂呈现于细胞表面上。
4.一种结合剂发现方法，其中结合剂在展示文库的已培养高等真核细胞克隆表面上的表面呈现水平是用作所述结合剂在溶液中的溶解度和/或其自缔合抗性的预测指标。
5.一种根据结合剂在溶液中的溶解度和/或自缔合抗性将它们区分或排序和/或富集在溶液中展现较大溶解度和/或较大自缔合抗性的结合剂的方法，其包括
(i)提供各含有编码结合剂的DNA的高等真核细胞克隆的文库，
(ii)在用于表达所述结合剂的条件下体外培养所述克隆，其中所述结合剂呈现于细胞表面上，
(iii)测定所述结合剂在所述克隆上的表面呈现水平，任选地通过用并有可检测(例如荧光)标记的试剂标记所述结合剂来测定，
(iv)选出相较于其它克隆展现结合剂存在更高的表面呈现的一种或多种克隆，以及
(v)鉴定出由所述一种或多种所选克隆编码的在溶液中具有良好溶解度和/或自缔合抗性的结合剂，且任选地提供所选克隆用于一个或多个进一步筛选步骤。
6.根据权利要求1到3中任一项所述的用途，或根据权利要求4或权利要求5所述的方法，其中所述结合剂是含有跨膜域的多肽。
7.根据权利要求4或权利要求5所述的方法，包括通过用并有可检测(例如荧光)标记的试剂标记所述结合剂来测定所述结合剂在所述克隆上的表面呈现水平，其中所述试剂结合到所述结合剂的恒定区，任选地其中所述结合剂包括Fc区且所述试剂结合到所述Fc区。
8.根据权利要求4到7中任一项所述的方法，包括根据结合剂在细胞上的表面呈现水平将细胞分选到收集部分和丢弃部分中，其中将展示表面呈现大于预定阈值的细胞分选到所述收集部分中并且将展示表面呈现低于所述预定阈值的细胞分选到所述丢弃部分中。
9.根据权利要求8所述的方法，其中丢弃部分包括表达临界浓度为至少10mg/ml的比较多肽的细胞，且其中所述收集部分包括表达临界浓度为所述丢弃部分中的所述比较多肽的至少1.5倍高的结合剂的细胞。
10.根据权利要求8或权利要求9所述的方法，其中分选是利用荧光活化细胞分选仪(FACS)进行。
11.根据权利要求4到10中任一项所述的方法，其中步骤(ii)包括将所述文库中的所述克隆作为混合物在一个容器中培养。
12.根据权利要求4到10中任一项所述的方法，其中步骤(ii)包括在独立容器中培养所述文库中的每种克隆。
13.根据权利要求4到12中任一项所述的方法，其中所述结合剂是亲本结合剂的序列变异体。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述亲本结合剂已鉴定为需要改善其在溶液中的溶解度或自缔合抗性。
15.根据权利要求13或权利要求14所述的方法，其中所述方法包括产生所述亲本结合剂的序列变异体以及将编码所述序列变异体的DNA整合到高等真核细胞的细胞DNA中以提供含有编码所述结合剂的DNA的细胞克隆文库，
任选地，其中所述方法包括分析所述亲本的多肽序列、鉴定出经预测会促进自缔合和/或减小溶解度的一个或多个氨基酸残基，以及使所述一个或更多个氨基酸残基产生突变。
16.根据权利要求13到15中任一项所述的方法，其中所述亲本结合剂在磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)中的临界浓度小于50mg/ml且/或在磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)中的溶解度极限小于50mg/ml，
且/或其中所述方法包括鉴定出临界浓度和/或溶解度极限为所述亲本结合剂的至少1.5倍高的由所述一种或多种所选克隆编码的结合剂。
17.根据权利要求4到16中任一项所述的方法，包括基于结合剂在所述细胞克隆上的表面呈现水平来预测所述结合剂的亲水性和/或鉴定出具有较强亲水性的一种或多种所选克隆的结合剂。
18.一种体外筛选展示结合剂的高等真核细胞文库以从所述文库中富集表达结合剂的细胞的方法，所述结合剂在哺乳动物体内结合一种或多种非靶分子的倾向低，所述方法包括
(i)提供各含有编码结合剂的DNA的高等真核细胞克隆的文库，
(ii)在用于表达所述结合剂的条件下体外培养所述克隆，其中所述结合剂呈现于细胞表面上，
(iii)使所述结合剂暴露于所述一种或多种非靶分子，允许所述结合剂与所述一种或多种非靶分子之间发生结合，
(iv)丢弃对所述一种或多种非靶分子展现较大结合的细胞，
(v)选择对所述一种或多种非靶分子展现较低结合的细胞，以提供所选细胞群，所选细胞群富集表达对所述非靶分子结合倾向低的结合剂的克隆；以及任选地
提供所选群体用于一个或多个进一步筛选步骤。
19.根据权利要求18所述的方法，其包括
(iii)使所述结合剂暴露于包括所述一种或多种非靶分子的基质，允许结合到所述基质，
(iv)丢弃对所述基质展现较大结合的细胞，
(v)选择对所述基质展现较低结合的细胞，以提供所选细胞群，所选细胞群富集表达对所述非靶分子结合倾向低的结合剂的克隆；以及任选地
提供所选群体用于一个或多个进一步筛选步骤。
20.根据权利要求18或权利要求19所述的方法，其中所述非靶分子包括DNA、肝素、乙酰肝素硫酸盐、软骨素硫酸盐、伴随蛋白、玻糖醛酸，或糖萼的一种或多种组分。
21.根据权利要求18到20中任一项所述的方法，其中对非靶分子的所述结合是低亲和力非特异性结合。
22.根据权利要求18到21中任一项所述的方法，包括将所述文库中的所述克隆作为混合物在一个容器中培养以及使所述混合物暴露于所述基质。
23.根据权利要求18到21中任一项所述的方法，包括将所述文库中的每种克隆在独立容器中培养。
24.根据权利要求18到23中任一项所述的方法，其中所述结合剂是亲本结合剂的序列变异体。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述亲本结合剂已鉴定为需要减少对一种或多种非靶分子的结合。
26.根据权利要求24或权利要求25所述的方法，其中所述方法包括产生所述亲本结合剂的序列变异体以及将编码所述序列变异体的DNA整合到高等真核细胞的细胞DNA中以提供含有编码所述结合剂的DNA的细胞克隆文库，
任选地其中所述方法包括分析所述亲本的多肽序列、鉴定经预测会促进非特异性结合的一个或多个氨基酸残基，以及使所述一个或多个氨基酸残基产生突变。
27.根据权利要求24到26中任一项所述的方法，其中所述亲本结合剂对一种或多种非靶分子展现显著的结合。
28.根据权利要求18到27中任一项所述的方法，其包括
(iii)使所述结合剂暴露于呈现所述一种或多种非靶分子的细胞或珠粒。
29.根据权利要求28所述的方法，其包括检测表达结合剂的细胞与呈现所述一种或多种非靶分子的所述细胞或珠粒的相互作用。
30.根据权利要求29所述的方法，其包括使用AC-SINS检测颗粒间距离以及选择由展现较高颗粒间距离的细胞所呈现的结合剂。
31.根据权利要求18所述的方法，其中所述一种或多种非靶分子被可检测地标记。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述一种或多种非靶分子被荧光标记。
33.根据权利要求32所述的方法，其包括根据对所述一种或多种非靶分子的结合水平、利用FACS将细胞流式分选到收集部分和丢弃部分，其中将显示所述被标记非靶分子的荧光高于预定阈值的细胞分选到所述收集部分并且将显示所述被标记非靶分子的荧光低于所述预定阈值的细胞分选到所述丢弃部分。
34.根据权利要求4到33中任一项所述的方法，其中编码所述结合剂的所述DNA是在强启动子的控制下表达。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述启动子是组成型启动子。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述启动子是所述CMV启动子。
37.根据权利要求34所述的方法，其中所述启动子是已最大限度地诱导表达的诱导型启动子。
38.根据权利要求18到37中任一项所述的方法，其进一步包括随后执行根据权利要求5到17中任一项所述的方法。
39.根据权利要求18到37中任一项所述的方法，其进一步包括初始执行根据权利要求5到17中任一项所述的方法。
40.一种选择针对靶标的一种或多种结合剂的方法，其包括
执行根据权利要求5到39中任一项所述的方法，其进一步包括
使所述结合剂暴露于所述靶标，允许同源结合剂识别所述靶标，其中展示同源结合剂的细胞结合到所述靶标，以及
选择一种或多种展示同源结合剂的克隆。
41.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其包括
(i)同时测定所述结合剂的表面呈现水平和所述结合剂结合靶标的水平，以及协同选择展示同源结合剂的克隆，所述同源结合剂展现的表面呈现高于其它克隆；或
(ii)同时测定所述结合剂的表面呈现水平和非特异性结合到非靶分子的水平，以及协同选择展示结合剂的克隆，与其它克隆相比，所述结合剂展现更高的表面呈现和更低的非特异性结合；或
(iii)同时测定所述结合剂的靶标结合水平和非特异性结合到非靶分子的水平，以及协同选择展示同源结合剂的克隆，所述同源结合剂展现的非特异性结合低于其它克隆。
42.一种鉴定以所期望亲和力识别靶标的结合剂的方法，所述方法包括
(a)提供各含有编码结合剂的DNA的高等真核细胞克隆的体外文库，其中所述结合剂呈现于所述细胞表面上，且其中被编码的所述结合剂从弱活性启动子表达且/或在细胞表面上以每个细胞100-60,000范围内的拷贝数表达，
(b)使所述文库暴露于所述靶标且允许同源结合剂识别所述靶标，其中展示同源结合剂的细胞结合到所述靶标，
(c)分离出结合到所述靶标的细胞以提供所选细胞群，所选细胞群富集展示同源结合剂的细胞，以及任选地
(d)使所选细胞群暴露于针对所述靶标的额外一轮或多轮选择，任选地其中逐渐地减小靶标浓度以提高选择严格度，以及任选地
(e)选出展示同源结合剂的一种或多种克隆，所述同源结合剂对所述靶标具有所期望的亲和力。
43.根据权利要求42所述的方法，包括提供富集展示同源结合剂的细胞的所选细胞群，以及随后：
提供处于强活性启动子控制下的编码结合剂的DNA，所述DNA来自高等真核细胞克隆的体外文库内的所选细胞群，以及
执行根据权利要求5到17中任一项所述的方法。
44.根据权利要求42所述的方法，其包括
执行根据权利要求5到17中任一项所述的方法以提供展示结合剂的较高表面呈现的所选克隆，以及随后：
在各含有编码结合剂的DNA的高等真核细胞克隆的体外文库中，从弱活性启动子表达所述结合剂，以及随后
执行根据权利要求42所述的方法。
45.一种鉴定识别靶标的结合剂的方法，其包括：
(i)提供各含有编码结合剂的DNA的高等真核细胞克隆的文库，其中所述结合剂是在诱导型启动子的控制下表达以便呈现于细胞表面上，
(ii)在所述诱导型启动子活性弱的条件下培养所述文库的细胞，
(iii)使所述文库暴露于所述靶标，允许同源结合剂识别所述靶标，其中展示同源结合剂的细胞结合到所述靶标，
(iv)选择展示同源结合剂的细胞，借此提供所选细胞群，
(v)在增强从所述诱导型启动子表达结合剂的条件下培养所选细胞群，
(vi)测定所述结合剂在所述多种克隆上的表面呈现水平，任选地通过用并有可检测(例如荧光)标记的试剂标记所述结合剂来测定，
(vii)选出相较于其它克隆展现结合剂存在更高的表面呈现的一种或多种克隆。
46.一种鉴定识别靶标的结合剂的方法，其包括：
(i)提供各含有编码结合剂的DNA的高等真核细胞克隆的文库，其中所述结合剂是在诱导型启动子的控制下表达以便呈现于细胞表面上，
(ii)在从所述诱导型启动子强烈表达结合剂的条件下培养所述文库，
(iii)测定所述结合剂在所述多种克隆上的表面呈现水平，任选地通过用并有可检测(例如荧光)标记的试剂标记所述结合剂来测定，
(iv)选出相较于其它克隆展现结合剂存在更高表面呈现的克隆群体，
(v)在从所述诱导型启动子弱表达结合剂的条件下培养所选群体，
(vii)使所述文库暴露于所述靶标，允许同源结合剂识别所述靶标，其中展示同源结合剂的细胞结合到所述靶标，
(iv)选择一种或多种展示同源结合剂的克隆。
47.根据权利要求42到46中任一项所述的方法，其中所述启动子是四环素诱导型启动子。
48.根据权利要求42到47中任一项所述的方法，其中所述靶标是用可检测试剂标记，例如荧光标记。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述方法包括根据所述细胞上的靶标结合水平将细胞分选到收集部分和丢弃部分中，其中将展示所结合靶标高于预定阈值的细胞分选到所述收集部分中并且将展示所结合靶标低于所述预定阈值的细胞分选到所述丢弃部分中。
50.根据权利要求49所述的方法，其中分选是利用荧光活化细胞分选仪(FACS)进行。
51.根据权利要求5到50中任一项所述的方法，其包括
测定编码所述结合剂的所述DNA的序列，所述结合剂来自所述一种或多种所选克隆，以及
提供编码所述结合剂的经分离的核酸。
52.根据权利要求5到51中任一项所述的方法，其进一步包括
测定编码所述结合剂的所述DNA的序列，所述结合剂来自所述一种或多种所选克隆，以及
在体外，在以可溶形式分泌所述结合剂的条件下，在宿主细胞中表达编码所述结合剂的DNA。
53.根据权利要求52所述的方法，其中分泌的所述结合剂是以至少1mg/ml的产量获得。
54.根据权利要求52或权利要求53所述的方法，其进一步包括提纯和/或浓缩所述结合剂以获得浓度为至少10mg/ml的所述结合剂的水溶液。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述浓度是至少50mg/ml。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述浓度是至少100mg/ml。
57.根据权利要求52到56中任一项所述的方法，包括将所述结合剂配制成包括医药学上可接受的赋形剂的组合物。
58.根据权利要求57所述的方法，包括将所述组合物提供于注射用的预装药注射器中，所述预装药注射器任选地存在于试剂盒内，所述试剂盒包括一种或多种额外的组件，例如针和/或产品信息说明书，包括通过注射施用所述组合物的说明。
59.一种鉴定与FcRn相互作用的结合剂的方法，所述方法包括
提供多种高等真核细胞克隆，其各自含有编码具有Fc域的不同结合剂的DNA，
在体外，在使所述结合剂呈现于细胞表面上的条件下培养所述克隆，
使所述克隆在约pH 6.0和约pH 7.4暴露于FcRn受体，允许所述Fc域识别FcRn，
选出表达结合剂的一种或多种克隆，所述结合剂在约pH 6.0展现的亲和力结合高于在约pH 7.4展现的亲和力、在约pH 6.0展现的亲和力结合低于在约pH 7.4展现的亲和力结合，或在约pH 6.0展现的亲和力结合与在约pH 7.4展现的亲和力结合大约相同，以及
任选地提供所选克隆用于一个或多个进一步筛选步骤。
60.根据权利要求59所述的方法，包括：选出表达结合剂的一种或多种克隆，所述结合剂在约pH 6.0展现的亲和力结合高于在约pH 7.4展现的亲和力结合；以及鉴定体内半衰期延长的由所述一种或多种所选克隆编码的所述结合剂。
61.根据权利要求59或权利要求60所述的方法，其中所述结合剂包括展现序列多样性、任选地在一个或多个互补决定区中展现序列多样性的可变域。
62.根据权利要求59到61中任一项所述的方法，其中所述结合剂包括展现序列多样性、任选地在其CH3域中展现序列多样性的Fc区域。
63.根据权利要求59到61中任一项所述的方法，其中所述结合剂的所述Fc区域不展现序列多样性。
64.一种克隆、由克隆表达的结合剂，或编码所述结合剂的核酸，其大体上如本文所述且/或根据前述权利要求中任一项所述的方法鉴定或选择。
65.一种各含有编码结合剂的DNA的高等真核细胞克隆的体外文库，其中所述编码DNA任选地处于细胞DNA中的固定基因座，且其中被编码的所述结合剂在细胞表面上以每个细胞100-1000范围内的拷贝数表达。
66.一种根据权利要求65所述的文库用于对针对靶标的结合剂进行基于亲和力的选择的用途。
67.一种含有编码结合剂谱系的DNA的高等真核细胞克隆的体外展示文库，其中结合剂是在四环素诱导型启动子的控制下表达以便呈现于细胞表面上。
68.一种生产含有编码结合剂谱系的DNA的高等真核细胞克隆文库的方法，其包括
提供编码所述结合剂的供体DNA分子，和高等真核细胞，
将所述供体DNA引入所述细胞中，借此建立含有整合于所述细胞DNA中的供体DNA的重组细胞，
其中所述结合剂是在四环素诱导型启动子的控制下表达以便呈现于细胞表面上，以及
培养所述重组细胞以产生克隆，
借此提供含有编码所述结合剂谱系的供体DNA的高等真核细胞克隆文库。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述重组细胞是通过将所述供体DNA引入所述细胞中且在所述细胞内提供位点特异性核酸酶来建立，其中所述核酸酶使细胞DNA中的识别序列裂解以建立整合位点，在所述位点处，所述供体DNA整合于所述细胞DNA中，整合是通过所述细胞内源的DNA修复机制发生。
70.根据权利要求68或权利要求69所述的方法，其进一步包括诱导从所述四环素诱导型启动子表达供体DNA以及在表达所述结合剂的条件下培养所述细胞，从而实现结合剂在细胞表面上的呈现。
71.根据权利要求69或权利要求70所述的方法，其进一步包括在根据前述权利要求中任一项所述的方法或用途中使用所述文库。
72.根据前述权利要求中任一项所述的用途、方法或文库，其中所述高等真核细胞是哺乳动物细胞。
73.根据前述权利要求中任一项所述的用途、方法或文库，其中所述哺乳动物细胞是人类细胞系或CHO细胞系。
74.根据前述权利要求中任一项所述的用途、方法或文库，其中所述高等真核细胞处于悬浮培养中。
75.根据前述权利要求中任一项所述的用途、方法或文库，其中编码所述结合剂的DNA整合于所述细胞DNA中的固定基因座处。
76.根据前述权利要求中任一项所述的用途、方法或文库，其中所述结合剂是抗体。
77.根据权利要求76所述的用途、方法或文库，其中所述抗体是全长免疫球蛋白。
78.根据权利要求77所述的用途、方法或文库，其中所述抗体是IgG。
79.根据权利要求76到78中任一项所述的用途、方法或文库，其中所述抗体包括与跨膜域融合的重链，和轻链。
80.根据权利要求1到79中任一项所述的用途、方法或文库，其中所述结合剂是融合蛋白，所述融合蛋白包括插入受体多样性支架域内的供体多样性支架域，任选地包括与所述融合蛋白缔合的搭配域，
其中所述供体多样性支架域包括供体支架和供体相互作用序列并且所述受体多样性支架域包括受体支架和受体相互作用序列。
81.根据权利要求80所述的用途、方法或文库，其中所述融合蛋白是打结抗体，其包括插入抗体可变域内的富半胱氨酸肽。
82.根据权利要求81所述的用途、方法或文库，其中所述打结抗体包括与跨膜域融合的抗体重链，和抗体轻链。
83.根据前述权利要求中任一项所述的用途、方法或文库，其中所述结合剂包括展现序列多样性、任选地在一个或多个互补决定区中展现序列多样性的抗体可变域。
84.根据前述权利要求中任一项所述的用途、方法或文库，其中所述结合剂包括展现序列多样性、任选地在其CH3域中展现序列多样性的Fc区域。
85.根据前述权利要求中任一项所述的用途、方法或文库，其中所述结合剂具多特异性，包括用于第一靶标的第一结合位点和用于第二靶标的第二结合位点。
86.根据前述权利要求中任一项所述的用途、方法或文库，其中所述文库包括至少103种克隆。
87.根据前述权利要求中任一项所述的用途、方法或文库，其中所述文库是初始文库。
88.根据权利要求1到86中任一项所述的用途、方法或文库，其中所述文库中的所述克隆已经根据对所选靶标的结合预选出来。
89.根据权利要求88所述的用途、方法或文库，其中所述靶标是人类多肽。
90.根据权利要求88或权利要求89所述的用途、方法或文库，其中所述文库中的所述克隆已经根据对两种不同靶标的双特异性结合预选出来。
CN201880079095.7A 2017-12-06 2018-12-05 根据可开发性选择真核细胞展示系统中的多肽药物 Active CN111448314B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB1720351.4 2017-12-06
GBGB1720351.4A GB201720351D0 (en) 2017-12-06 2017-12-06 Selecting for developability in drug discovery
PCT/EP2018/083698 WO2019110691A1 (en) 2017-12-06 2018-12-05 Selecting for developability of polypeptide drugs in eukaryotic cell display systems

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111448314A true CN111448314A (zh) 2020-07-24
CN111448314B CN111448314B (zh) 2024-10-18

Family

ID=60950392

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880079095.7A Active CN111448314B (zh) 2017-12-06 2018-12-05 根据可开发性选择真核细胞展示系统中的多肽药物

Country Status (8)

Country Link
US (1) US11499150B2 (zh)
EP (1) EP3720959A1 (zh)
JP (2) JP2021509010A (zh)
CN (1) CN111448314B (zh)
AU (1) AU2018379426A1 (zh)
CA (1) CA3083571A1 (zh)
GB (1) GB201720351D0 (zh)
WO (1) WO2019110691A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108473987A (zh) * 2016-01-08 2018-08-31 艾恩塔斯有限公司 具有改变的多样性支架结构域的结合成员

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021018114A1 (zh) * 2019-07-30 2021-02-04 中山康方生物医药有限公司 抗人p40蛋白域抗体及其用途
GB202014851D0 (en) 2020-09-21 2020-11-04 Iontas Ltd SARS-COV-2 antibodies
AU2022334794A1 (en) 2021-08-25 2024-03-28 Iontas Limited Preparation of libraries of protein variants expressed in eukaryotic cells
WO2023039528A1 (en) * 2021-09-10 2023-03-16 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Nanobody-mediated control of gene expression and epigenetic memory
US12091694B2 (en) 2022-11-18 2024-09-17 Seismic Therapeutic, Inc. Fc fusion molecules and uses thereof

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6300065B1 (en) * 1996-05-31 2001-10-09 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Yeast cell surface display of proteins and uses thereof
US20050048578A1 (en) * 2003-06-26 2005-03-03 Epitomics, Inc. Methods of screening for monoclonal antibodies with desirable activity
JP2010213725A (ja) * 1998-01-20 2010-09-30 Univ Illinois タンパク質の酵母細胞表面ディスプレイおよびその使用
CN106574264A (zh) * 2014-05-02 2017-04-19 艾恩塔斯有限公司 在真核细胞中表达的蛋白质变体文库的制备及用于选择结合分子的用途

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6485943B2 (en) * 1995-01-17 2002-11-26 The University Of Chicago Method for altering antibody light chain interactions
WO2012149470A1 (en) 2011-04-27 2012-11-01 Amyris, Inc. Methods for genomic modification
JP2015503907A (ja) 2011-12-22 2015-02-05 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 真核細胞のための全長抗体提示システムおよびその使用
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6300065B1 (en) * 1996-05-31 2001-10-09 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Yeast cell surface display of proteins and uses thereof
JP2010213725A (ja) * 1998-01-20 2010-09-30 Univ Illinois タンパク質の酵母細胞表面ディスプレイおよびその使用
US20050048578A1 (en) * 2003-06-26 2005-03-03 Epitomics, Inc. Methods of screening for monoclonal antibodies with desirable activity
CN106574264A (zh) * 2014-05-02 2017-04-19 艾恩塔斯有限公司 在真核细胞中表达的蛋白质变体文库的制备及用于选择结合分子的用途

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CLAIRE L DOBSON等: "Engineering the surface properties of a human monoclonal antibody prevents self-association and rapid clearance in vivo", SCI REP, pages 1 - 14 *
JAMES C GEOGHEGAN等: "Mitigation of reversible self-association and viscosity in a human IgG1 monoclonal antibody by rational, structure-guided Fv engineering", MABS, vol. 8, no. 5, pages 941 - 950, XP055546388, DOI: 10.1080/19420862.2016.1171444 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108473987A (zh) * 2016-01-08 2018-08-31 艾恩塔斯有限公司 具有改变的多样性支架结构域的结合成员
CN108473987B (zh) * 2016-01-08 2024-01-02 马可讯治疗有限公司 具有改变的多样性支架结构域的结合成员

Also Published As

Publication number Publication date
US20210163923A1 (en) 2021-06-03
US11499150B2 (en) 2022-11-15
EP3720959A1 (en) 2020-10-14
CA3083571A1 (en) 2019-06-13
GB201720351D0 (en) 2018-01-17
WO2019110691A1 (en) 2019-06-13
JP2021509010A (ja) 2021-03-18
JP2024009895A (ja) 2024-01-23
AU2018379426A1 (en) 2020-06-18
CN111448314B (zh) 2024-10-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111448314B (zh) 根据可开发性选择真核细胞展示系统中的多肽药物
CN110177876B (zh) 抗gpc3抗体
CN108473987B (zh) 具有改变的多样性支架结构域的结合成员
TWI719894B (zh) 抗原結合分子類和使用彼等之方法
CA2683800C (en) Method for manufacturing a recombinant polyclonal protein
JP4926054B2 (ja) 抗−ＲｈＤ組換えポリクローナル抗体及び製造方法
Steven et al. In vitro maturation of a humanized shark VNAR domain to improve its biophysical properties to facilitate clinical development
IL293385A (en) New anti–pd–1 antibodies
TW201920275A (zh) 藉由細胞表現之調控生物活性的抗體
McCafferty et al. Identification of optimal protein binders through the use of large genetically encoded display libraries
CN111848800A (zh) Pd-l1单结构域抗体及其用途
JP6656243B2 (ja) 細胞表面での非共有結合Ｆｃドメイン含有タンパク質ディスプレイの方法及びそのスクリーニング方法
CN112745391B (zh) Pd-l1结合分子
US20210172932A1 (en) In vitro transcytosis assay
US20200072820A1 (en) Method of Selecting for Antibodies
AU2015364687A1 (en) Intercalated single-chain variable fragments
US20220411472A1 (en) Self-assembling circular tandem repeat proteins with increased stability
Su et al. Mimicking the germinal center reaction in hybridoma cells to isolate temperature-selective anti-PEG antibodies
WO2023232110A1 (zh) 抗人cd24抗体及其应用
CN114075284B (zh) Cd47结合分子及其用途
EP4059962A1 (en) Pd-l1 binding molecule
Sinha et al. A pipeline for facile cloning of antibody Fv domains and their expression, purification, and characterization as recombinant His-tagged IgGs
WO2023122574A1 (en) Chimeric antigen receptor (car) vectors and libraries and methods of high throughput car screening
CN114245804A (zh) 修饰的人可变域
Volk Cell line and protein engineering tools for production and characterization of biologics

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant