JP4926054B2 - 抗−RhD組換えポリクローナル抗体及び製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、抗−RhD組換えポリクローナル抗体(抗−RhD rpAb)の一貫した製造のための方法を提供する。本発明は、新規クラスの予防用及び治療用抗−RhD抗体産物の大規模な製造及び産生のための可能性を開くことが熟慮される。
「抗生物質耐性遺伝子」は、細胞に対し抗生物質が有する阻害性又は毒性効果を克服し、抗生物質の存在下での細胞の生存及び持続的増殖を確保し得る蛋白質をコードする遺伝子である。
図1Aは、組換えポリクローナル製造細胞系統の作成及び組換えポリクローナル抗体の産生を示すフローチャートである。1)はバルクトランスフェクションストラテジーを示し;2)は半バルクトランスフェクションストラテジーを示し、及び3)は個々のトランスフェクションストラテジーを示す。A)は抗−RhD抗体発現ベクターのライブラリーを示し(横線)、矢じりはベクターのグループ化を示す。ストラテジー1では、ベクターはまとめてグループ化され、ストラテジー2では、それらはより小さなフラクション(半バルク)にグループ化され、一方でストラテジー3では、それらは互いに分離されている(個別)。B)はトランスフェクションを示し、ここで、チューブの数はライブラリーを構成するベクターのグループ化に依存する。C)は、宿主細胞ゲノム内に抗−RhD抗体コーディング核酸セグメントを部位特異的に組み込んだ細胞の選択を示し、D)は、ポリクローナル抗−RhD抗体ライブラリーストックの作成を示し、ここで、組込まれた抗−RhD抗体コーディング核酸セグメントを構成する選択された細胞はフリーザー内で貯蔵される。所望により、個々のクローンを貯蔵するか又は該クローンをプールする。E)は製造段階の開始を示し、ここで、ストックからのクローンは解凍される(より小さなフラクション又はプールのいずれかから個別に)。F)は産生段階を示し、ここで、ポリクローナル細胞系統はより大きなバイオリアクターでの播種のために増殖される(示されていないが、中間播種段階が選択される)。ストラテジー2及び3では、これは、ポリクローナル細胞クローンストックがもはや個々のクローン又は半バルクフラクションとして維持されないが、細胞群内にプールされ、組換えポリクローナル製造細胞系統(このポリクローナル製造細胞系統は凍結ストックとして貯蔵されてもよい)を形成する段階である。G)はバイオリアクター製造から得られた最終産物を示す。産生段階の後、該産物の精製及び特徴付けのためにポリクローナル蛋白質組成物を回収した。
組換えポリクローナル蛋白質発現系
本発明は、1又は数個の細胞系統からの抗−RhD組換えポリクローナル抗体(抗−RhD rpAb)の一貫した製造のための組換えポリクローナル抗体発現系を提供する。
適切な宿主細胞は、そのゲノムの1領域中に1つ以上の適切な組換え部位、すなわち、1つ以上のリコンビナーゼ酵素により認識可能であり、故に、リコンビナーゼ認識配列とも言われる核酸配列を含む。組込み体(すなわち、組込み部位内に抗−RhD抗体コーディング核酸セグメントの組込まれたコピーを有する細胞)についての選択を可能とするために、組換え部位は、組換え部位に対して3’側(下流側)に位置する第1の選択遺伝子(例えば、抗生物質耐性遺伝子)に作動可能に連結される。さらに、弱いプロモーター(例えば、切断型SV40初期プロモーター)及び転写開始コドンが、耐性マーカー−コーディング領域の不可欠な部分を構成する組換え部位に対して5’側(上流側)に位置してもよい。故に、転写開始コドンは、抗−RhD rpAbをコードする抗−RhD抗体発現ベクターのライブラリーを用いたトランスフェクションの前に、宿主細胞内の選択遺伝子の転写開始を先導する。好ましくは、該宿主細胞系統はただ1つの組換え部位を有し、及びそれが1以上のリコンビナーゼ認識配列を有するならば、「部位特異的組込み用ベクター」のセクションで記載したようにこれらは非相同であるはずであり、及びゲノム内への単一組込みのみが可能となる。
適切なベクターは、宿主細胞の構築に用いた選択遺伝子と異なる適切な選択遺伝子に連結された適切な組換え部位を含む。哺乳類細胞発現における使用に適する選択遺伝子は、栄養的選択性を付与する遺伝子、例えば、チミジンキナーゼ遺伝子(TK)、グルタミンシンテターゼ遺伝子(GS)、トリプトファンシンターゼ遺伝子(trpB)又はヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺伝子(hisD)を含むが、これらに限定されない。さらに、選択マーカーは、薬物耐性を付与する代謝拮抗物質耐性遺伝子、例えば、ヒポキサンチン及びチミジン欠乏培地を用いて選択され得る及びさらにはメトトレキサートを用いて選択され得るジヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(dhfr)、ミコフェノール酸を用いて選択され得るキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(gpt)、真核細胞ではG418を用いて及び原核細胞ではネオマイシン又はカナマイシンを用いて選択され得るネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子(neo)、ハイグロマイシンを用いて選択され得るハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ(hyg、hph、hpt)遺伝子、ピューロマイシンを用いて選択され得るピューロマイシンN−アセチル−トランスフェラーゼ遺伝子(pac)、又はブラストサイジンを用いて選択され得るブラストサイジンSデアミナーゼ遺伝子(Bsd)である。最終的に、例えばフローサイトメトリーにより選別を可能とする蛋白質、例えば、緑色蛍光蛋白質(GFP)、神経成長因子受容体(NGFR)又は他の膜蛋白質又はベータ−ガラクトシダーゼ(LacZ)をコードする遺伝子が選択マーカーとして用いられ得る。
核酸配列を細胞内へ導入するための方法は当該分野において知られている。典型的に、これらの方法は、目的の配列を細胞、ゲノム又は染色体外エレメント内へ導入するためのDNAベクターの使用を含む。細胞のトランスフェクションは、リン酸カルシウム沈降、電気穿孔法、マイクロインジェクション、リポソーム融合、RBCゴースト融合、原形質融合などを含む、当業者に知られている多数の方法により達成されてもよい。
ポリクローナル抗体の特性の1つは、それが多数の個々の抗体分子から構成されていることであり、ここで、各抗体分子はポリクローナル抗体の他の分子と相同であるが、ポリクローナル抗体の個々のメンバー間のアミノ酸配列における差異により特徴付けられた可変性も有する。通常、これらの差異は可変領域、特に、CDR領域、CDR1、CDR2及びCDR3に限定される。ポリクローナル抗体のこの可変性は、機能的レベルにおける多様性、例えば、1つ以上の標的上に位置する同一又は異なる抗原上の異なる抗原決定基に関する様々な特異性及び親和性としても説明され得る。組換えポリクローナル抗体において、該多様性は、ドナー由来の免疫グロブリン産物において観察される多様性のサブセットを構成する。かかるサブセットを慎重に選択し、次いで、所望の標的抗原、この特定事例においてはRhD抗原に結合するその能力に関して特徴付けた。
セクション「ポリクローナル蛋白質の高レベル発現のための発現系の確立」は、ポリクローナル製造細胞系統を確立する3つの代替法を記載する。該セクションは、バルク又は半バルクトランスフェクションにより得られた細胞群から構成される凍結ライブラリーストックの作成を記載し、ここで、ライブラリーストック中の各個々の細胞は、抗−RhD抗体発現ベクターのライブラリーに由来する個々のメンバーを発現し得る。好ましくは、細胞群は、既に記載したクローン多様性要件を満たしており、その結果、ポリクローナル製造細胞系統を確立するために解凍及び増殖される場合、本質的にライブラリーの全メンバーが凍結ライブラリーストックアンプルから発現され得る。バルクトランスフェクション及び半バルクトランスフェクションアプローチにおいて、凍結ライブラリーストックに由来する単一バイアルが解凍され及びポリクローナル製造細胞系統に増殖され得るという点で、凍結ライブラリーストックはポリクローナルワーキングセルバンク(pWCB)と見なされ得る。
培養物上清からの抗−RhD rpAbの単離は、蛋白質の物理化学特性における差異、例えば、分子量、正味電荷、疎水性又は特異的リガンド若しくは蛋白質に対する親和性における差異を利用する様々なクロマトグラフィー技法を用いて可能である。故に、蛋白質は、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いる分子量に従って或いはイオン交換(陽イオン/陰イオン)クロマトグラフィー又はクロマト分画を用いる正味電荷にに従って分離されてもよい。
ポリクローナル抗体の構造的特徴付けは、混合物の複雑性(クローン多様性、不均一性及びグリコシル化)に起因して高い分解能を必要とする。ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー又は電気泳動のごとき伝統的アプローチは、抗−RhD rpAb内の個々の抗体間を区別するのに十分な分解能を有していないかもしれない。複雑な蛋白質混合物のプロファイリングのために、2次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動(2D−PAGE)、次いで、質量分析(MS)又は液体クロマトグラフィー(LC)−MS(例えば、プロテオミクス)が用いられている。蛋白質の電荷及び質量に基づく分離を組み合わせる2D−PAGEは、血清試料中のポリクローナル、オリゴクローナル及びモノクローナル免疫グロブリン間の区別のために有用であることが証明された。しかし、この方法には幾つかの制限がある。クロマトグラフィー技法、特に、エレクトロスプレーイオン化MSにカップリングされたキャピラリー及びLCは、複雑なペプチド混合物の分析のためにますます適用されている。LC−MSはモノクローナル抗体の特徴付けのために用いられており、及び最近はポリクローナル抗体軽鎖のプロファイリングにも用いられている。非常に複雑な試料の分析はより高いクロマトグラフィー系の解像力を必要とし、これは2次元(又はそれ以上)での分離により達成され得る。かかるアプローチは、第一の次元ではイオン交換に基づき、及び第二の次元では所望によりMSにカップリングされた逆相クロマトグラフィー(又は疎水性相互作用)に基づく。
抗−RhD rpAb抗体は、例えば、抗−D免疫グロブリン産物又は抗−RhD mAbを用いた比較可能性研究により機能的に特徴付けられ得る。かかる研究はインビトロ及びインビボにて実施され得る。
ヒトPBMCをエフェクター細胞として用い、並びにRhD陰性及び陽性RBC(ABO式のO)を標的として用いる。初め、RBC(RhD(+)及びRhD(−))を51Cr標識し、洗浄し、次いで、様々な希釈の抗−RhD抗体(例えば、抗−RhD rpAb、抗−D又は抗−RhD mAb)を用いて感作した。エフェクター細胞(PMBC)を感作したRBCに加え(20:1の比)、次いで、インキュベーションを一晩行う。細胞をスパンカラムに付し(spun down)、次いで、ウェルの上清をLumaplate(PerkinElmer)に移す。自然放出に関する対照(51Crのみを有するRBC)及び全放出(トリトン−X−100ないし51Cr−標識RBCを加えた)に関する対照が含まれる。Lumaplateを乾燥し、次いで、Topcounter(PerkinElmer)でカウントする。
貪食性はADCCアッセイと組み合わせて測定され得る。ADCCアッセイにおいて上清を回収した後、残りの上清を除去し、次いで、低張緩衝液を加えることにより赤血球細胞を溶解する。細胞を洗浄し、次いで、上清を除去する。PBS+1%トリトン−X−100を全ウェルに加え、次いで、一定量をLumaplateに移し、乾燥し、次いで、前記のようにカウントする。
このアッセイは食細胞性細胞の粘着性に基づく。ヒト白血病性単芽球細胞系統U937がこのアッセイに用いられ得る。U937細胞は10nMのPMAを用いて分化させる。2日後に、培地の60%を除去し、次いで、PMAなしの培地と交換する。赤血球細胞(RhD(+)及びRhD(−))の細胞膜を製造元プロトコル(Sigma)に従ってPKH26(PE)で染色する。該RBCの細胞膜を様々な希釈の抗−RhD抗体で感作し、次いで、過剰な抗体を洗浄により除去する。3日目に、非付着細胞U937細胞を洗浄により除去し、次いで、感作したRBC(RhD(+)及びRhD(−))をウェルに加える。インキュベーター中でプレートを一晩インキュベーションする。貪食されなかったRBCを幾つかの段階により洗浄して除去する。低張緩衝液を加えることにより、結合したが貪食されなかったRBCを溶解し、次いで、さらに洗浄する。トリプシンとのインキュベーションによりU937細胞をウェルから剥離する。細胞をFACSにて分析する。
ロゼット形成アッセイは単なるFc受容体結合アッセイである。感作した赤血球細胞を上記のように調製した分化型U937細胞と共にインキュベーションする。RBC(RhD(−)及びRhD(+))を様々な希釈の抗−RhD抗体で感作し、次いで、U937細胞と混合する前に、過剰な抗体を洗浄により除去する。インキュベーションを1時間行い、次いで、非結合RBCを洗浄して除去する。表面に2つ以上のRBCが付着した細胞のパーセンテージを計数する。
本発明の一の実施態様において、活性成分として抗−RhD rpAb又は抗−RhD組換えポリクローナルFab又は別の抗−RhD組換えポリクローナルフラグメントを含有する医薬組成物が、新生児溶血性疾患の予防、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)の処置、又はRhD(−)の個人にRhD(+)の血液を誤って輸血した後のRhD抗原に対する感作の予防ために意図される。
本発明に記載の医薬組成物は、哺乳類における疾患の処置、改善又は予防のために用いられてもよい。本医薬組成物を用いて処置又は予防され得る状態は、新生児溶血性疾患の予防、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)の処置、又はRhD(−)の個人へRhD(+)の血液を誤って輸血した後のRhD抗原に対する感作の予防を含む。
本発明の別の実施態様は診断用キットに関する。本発明に記載のキットは、本発明に従って調製された抗−RhD rpAbを含み、該蛋白質は、検出可能標識で標識されていてもよく、又は非標識検出用に標識されていなくてもよい。該キットは、RhD(+)の個人又は特定のRhDカテゴリーを有する個人を特定するために用いられてもよい。後者の特定は、その特定のRhDカテゴリーのみと反応する抗−RhD rpAb組成物を得ることにより成し遂げられ得る。
抗−RhD組換えポリクローナル抗体の産生
ドナー
ドナーはAalborg Sygehus Nordに登録した。全8人のRhD(−)女性をRhD(+)個人に由来するRhD(+)赤血球で免疫した。ブースト数及び免疫化のためのRhD(+)赤血球の起源に関してドナーは様々な免疫歴を有した。異なるドナーの免疫歴を表1に示す。
表1
ライブラリー作製及びパニング手段を通じて各ドナーから得た材料を別々にしておいた。細胞溶解物を解凍し、次いで、キット使用説明書(NucleoSpin RNA L)に従ってRNAを調製した。RNAの完全性をアガロースゲル電気泳動により分析し、これにより、18S/28SリボソームRNAが分解していないことを確認した。
その表面にFabを提示するファージを以下のとおり産生した:50mLの2×YT/1%のグルコース/100μg/mLのカルベニシリンに、コンビナトリアルVH:VLライブラリーを含むTG1細胞を接種し、約0.08のOD600を得た。培養物を1.5時間振盪し、次いで、ヘルパーファージを加えた(VSCM13)。該培養物を、振盪せずに37℃で1/2時間、及び振盪しながら1/2時間インキュベーションした。細菌をペレット化し(3200×g,10分間,4℃)、次いで、50mLの2×YT/100μg/mLのカルベニシリン/70μg/mLのカナマイシン中に再懸濁し、次いで、培養物を30℃で一晩振盪した。1/5容量の20%のPEG/1.5MのNaClを加え、氷上で30分間インキュベーションし、次いで、8000×g、4℃で30分間遠心分離することにより、ファージを培養物上清から沈殿させた。沈殿したファージをPBS中に再懸濁し、次いで、パニングに直接用いた。
別の一連のパニングにおいて、選択を行い、RhDカテゴリーVI抗原に対して反応性を有するクローンを回収した。記載したようにネガティブセレクションをRhD(−)血液にて行い、及びポジティブセレクションをRhDVI陽性赤血球にて行った。他の手順は上記の通りだった。
各回のパニングの後、凝集アッセイにおいて赤血球細胞に対するその結合特性を分析するために、単一コロニーを採取した。すなわち、単一コロニーを2×YT/100μg/mLカルベニシリン/1%グルコースに接種し、次いで、37℃で一晩振盪した。翌日、900μl2×YT/100μg/mLカルベニシリン/0.1%グルコースを用いてDeepWellプレートを接種し、次いで、10μlを一晩培養した。そのプレートを37℃で2時間振盪し、その後、1ウェルあたり300μlの2×YT/100μg/mLカルベニシリン/0.25mMのIPTGを加えることでFab誘導を行った。そのプレートを30℃で一晩振盪した。翌日、遠心分離(3200×g,4℃,10分間)により細菌をペレット化し、次いで、100μlの0.8MのNaCl、0.2×PBS、8mMのEDTA中で再懸濁し、次いで、氷上で15分間インキュベーションし、Fabフラグメントのペリプラズム抽出(periplasmic extraction)を行った。そのプレートを−20℃とし、次いで、最終的に、懸濁液を解凍し、次いで、3200×g、4℃で10分間、遠心分離を行った。ELISAアッセイではFab含有量を分析するために、及び凝集アッセイでは個々のFabフラグメントの結合能を評価するために、ペリプラズム抽出物を用いた。
全部で1700個のRhD抗原結合クローンを同定した。全ての陽性クローンをDNAシークエンスに付した。これらの56個のクローンをそれらの特有の一連の重鎖CDR配列に基づいて選択した。同じ重鎖及び異なる軽鎖を用いた複数のクローンについては、FACSアッセイにおいて最も高い結合活性を示したクローンを選択した。これにより、高いRhD抗原特異性について広範な多様性を示す、可変重鎖(VH)及び軽鎖(LC)コーディング配列の対から構成されるサブ−ライブラリーを全ての陽性クローンから選択した。
表3
例えば、ファミリー間クロスプライミングに起因する突然変異のために、選択された多数の配列を修復する必要があった。これは、ファージディスプレイから哺乳類発現への発現系の交換に関連して行われた。この理由のために、各個々のクローンについて別々に移入を行った。
Flp−In CHO細胞系統(Invitrogen)を組換えポリクローナル製造細胞系統の構築のための開始細胞系統として用いた。しかし、より同質の細胞系統を得るために、親Flp−In CHO細胞系統をサブ−クローニングした。すなわち、親細胞系統を限界希釈によりサブ−クローニングし、次いで、幾つかのクローンを選択し、増殖させた。増殖挙動に基づき、1つのクローン、CHO−Flp−In(019)を産生細胞系統として選択した。
個々の付着抗−Rh−D抗体CHO−Flp−In(019)細胞培養物をトリプシン処理し、遠心分離し、次いで、適切な無血清培地(Excell302,JRH Biosciences)中、8×105細胞/mlにて、別の振盪フラスコに移した。
抗体産生及び増殖に関して全ての個々の細胞系統を特徴付けした。以下のアッセイによりこれを行った:
経時的に、カッパ又はラムダ特異的ELISAの後、個々の培養物中の組換え抗体の産生を行った。ELISAプレートを炭酸バッファー、pH9.6中のヤギ−抗−ヒトカッパ(Caltag)又はヤギ−抗−ヒトラムダ(Caltag)抗体でコーティングした。プレートを洗浄バッファー(1×PBS及び0.05%のTween20)で6回洗浄し、次いで、洗浄バッファー及び2%ミルクで1時間ブロックした。試料をウェルに加え、次いで、プレートを1時間インキュベーションした。プレートを6回洗浄し、次いで、2次抗体(ヤギ−抗−ヒトIgG(H+L)HRPO,Caltag)を1時間にわたって加え、次いで、6回洗浄した。TMB基質を用いてELISAを展開し、次いで、H2SO4を加えることにより反応を終了させた。450nmでプレートを読み取った。
細胞懸濁液のアリコートを週に3回取り出し、次いで、細胞数、細胞サイズ、クランピングの程度及び死細胞のパーセンテージをCASY(登録商標)(Schaerfe System GmbHからのCell Counter+Analyzer System)分析により測定した。細胞培養物についての倍加時間をCASY(登録商標)測定に由来する細胞数により算出した。
別個の組換え抗−Rh−D抗体(RhD157.119D11,RhD158.119B06,RhD159.119B09,RhD161.119E09,RhD163.119A02,RhD190.119F05,RhD191.119E08,RhD192.119G06,RhD197.127A08及びRhD204.128A03)を各々発現する10個の細胞系統を選択して、組換えポリクローナル製造細胞系統を構成した。Rhd197及びRhD204はラムダクローンであったが、他の全てはカッパクローンだった。
クローン多様性を蛋白質レベル及びmRNAレベルの両方についてアッセイした。抗体組成物を分析するために用いる上清試料を培養の9週間後に取り出し、一方で、mRNA組成物を分析するために用いる細胞試料は培養の11週間後に取り出した。
ポリクローナルCHO−Flp−In(019)細胞系統から発現された抗−RhD rpAbはIgG1アイソタイプ抗体である。蛋白質Aが固定されたカラムを用いて抗−RhD rpAbを両アリコート(3948及び3949)から精製した。個々の抗体はpH7.4で固定化蛋白質Aと相互作用し、一方で、夾雑蛋白質をカラムから洗浄した。次いで、結合抗体を低いpH値(pH2.7)でカラムから溶離した。280nmでの吸光度測定から決定される、抗体を含むフラクションをプールし、次いで、pH5で5mMの酢酸ナトリウムに対して透析した。
培養11週間後のポリクローナルCHO−Flp−In(019)細胞系統内のクローン多様性をRT−PCR−RFLP分析により評価した。すなわち、200個の細胞に対応する細胞懸濁液を凍結解凍手順に付し、次いで、これらの溶解物を、One−STEP RT−PCRキット(Qiagen)及び軽鎖増幅プライマーを用いるRT−PCRの鋳型として用いた。該プライマー配列は:
フォワードプライマー 5'-CGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTG(配列番号259)
リバースプライマー 5'-AAGACCGATGGGCCCTTGGTGGA(配列番号260)
だった。
RT−PCR産物をHinfIで消化し、次いで、アガロースゲル電気泳動により分析し、臭化エチジウム染色で制限産物を可視化した(図9)。
本実験は、56個の変異体抗−RhDコーディング核酸セグメントを含む抗−RhD抗体発現ベクターのライブラリーの産生に成功した(表3)。
より大規模な産生のためのワーキングセルバンクの産生
ポリクローナル細胞系統を構成するために、27個の細胞培養物を選択した(RhD157.119D11,RhD159.119B09,RhD160.119C07,RhD161.119E09,RhD162.119G12,RhD163.119A02,RhD189.181E07,RhD191.119E08,RhD192.119G06,RhD196.126H11,RhD197.127A08,RhD199.164E03,RhD201.164H12,RhD202.158E07,RhD203.179F07,RhD207.127A11,RhD240.125A09,RhD241.119B05,RhD244.158B10,RhD245.164E06,RhD293.109A09,RhD301.160A04,RhD305.181E06,RhD306.223E11,RhD307.230E11,RhD319.187A11及びRhD324.231F07)。
I.倍加時間;24〜32時間である必要あり;
II:細胞内染色;同質の細胞集団を示す必要あり;
III:生産性;1細胞1日あたり1.5pgを超える必要あり;
が含まれた。
本実施例は8つのメンバーを伴うポリクローナル細胞培養物の経時の特徴付けを示す。培養物のクローン多様性を、RFLP分析を用いて遺伝子レベルで、及び一次元クロマトグラフィー技法を用いて蛋白質レベルで評価した。
8つの異なる抗−RhD抗体を発現するポリクローナル細胞培養物における個々のクローンの分布をポリクローナル細胞系統に由来するRT−PCR産物のターミナルRFLP(T−RFLP)分析により評価した。T−RFLP法において1又は複数のフォワード及び/又はリバースプライマーは蛍光標識され、それ故に、単位複製配列から産生される制限フラグメント部分は標識を含み得る。次いで、標識されたフラグメントはキャピラリー電気泳動により分離され、次いで、蛍光により検出され得る。該分析は用いるプライマーに応じて軽鎖−及び重鎖可変領域−コーディング配列の両方において実行され得る。
VLフォワードプライマー:5'-TCTCTTCCGCATCGCTGTCT
CLリバースプライマー:5'-FAM-AGGAAAGGACAGTGGGAGTGGCAC
の通りであった。
VHフォワードプライマー:5'-FAM CGTAGCTCTTTTAAGAGGTG
VHリバースプライマー:5'-HEX-ACCGATGGGCCCTTGGTGGA
の通りであった。
上記したT−RFLP分析において用いられるような同一のポリクローナル細胞培養から産生されたポリクローナル抗体を、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて分析した。25mMの酢酸ナトリウム、150mMの塩化ナトリウム、pH5.0中の、組換えにより産生された蛋白質A精製ポリクローナル抗体を、室温、60ml/時間の流速でPolyCatAカラム(4.6×100mm)にアプライした。次いで、60ml/時間の流速で25mMの酢酸ナトリウム、pH5.0中の150〜350mM塩化ナトリウムからの直線勾配を用いて抗体成分を溶離した。抗体成分を280nmにおいて分光測定的に検出し、次いで、クロマトグラムを積分し、次いで、個々のピークの面積を用いて抗体成分を定量化した。経時の相対量を図13に示す。
RFLP分析により遺伝子レベルで得られた結果及び陽イオン交換クロマトグラフィーにより蛋白質レベルで得られた結果は類似している。図12及び13は、ポリクローナル細胞系統の個々のクローン及び細胞系統から発現されたポリクローナル抗体の個々の抗体大部分が5週間の培養の間に同一の傾向をたどることを明確に示す。故に、遺伝子及び蛋白質レベルでの分析は、遺伝子レベルでの細胞系統の、及び細胞系統から産生された組換えポリクローナル蛋白質の組成多様性を評価するための優れた等価物である。
本実施例は、25個のメンバーを伴うポリクローナル細胞培養物の経時の特徴付けを示す。培養物のクローン多様性は、T−RFLP分析を用いて遺伝子レベルで、及び一次元クロマトグラフィー技法を用いて蛋白質レベルで評価した。
本実施例は、一次転写産物及び抗体成分それぞれの分布を培養期間にわたって評価するためのT−RFLP分析及び陽イオン交換クロマトグラフィーの併用を記載している。T−RFLP分析は、ポリクローナル細胞系統において発現された25個のクローンのうち12個の個々のクローンの一意的同定を可能とし、及び本実施例では、これらの12個のクローンがT−RFLP分析を用いて4週間の培養の間に検出され得ることが記載されている。潜在的に、より多くのクローンが、1以上のクローンを示すフラグメントの配列分析により同定され得る。抗体成分の分布は陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて分析され、及び本実施例では、25個の分析した成分の分布は培養の間、相対的に安定であることが示されている。発現された抗体の固有の電荷不均一性に起因して全ての個々の抗体の一意的同定は困難であるが、本実施例では、RhD160、293及び196クローンを示す群13について得られた高いT−RFLP値に従って、RhD160抗体を示す抗体成分8が培養期間中に最も高い抗体レベルを示すことが実証された。さらに、T−RFLP及び陽イオン交換クロマトグラフィーにより一意的に同定され得るRhD207成分は、10〜11%のT−RFLPレベル、及び抗体レベルでは若干より低い5.5〜10%が得られた。概して、2つの技法は共に、mRNA及び抗体レベルでの培養中の相対的に安定な産生を示すが、2つの技法の間にある潜在的な相違も見られ、これは、抗体レベルで得られた結果と対照的に、培養5週間目において幾つかのクローンの転写が明らかに減少することにより説明され得る。故に、本実施例は、複雑なポリクローナル蛋白質の安定な産生が可能な培養期間を定めるための両技法の相補的な使用を証明する。
本実施例は、25個の個々のメンバーを伴う抗−RhD rpAbを含むpWCBの産生を示し、及びpWCBに由来する異なるバイアルから精製されたrpAb産物の最小のバッチ間差異を立証する。
25個の個々のメンバーを伴う抗−RhD rpAbを含むpWCBを産生するために、25個の保存されたモノクローナル抗−RhD抗体産生細胞系統(RhD157,159,160,162,189,191,192,196,197,199,201,202,203,207,240,241,245,293,301,305,306,317,319,321,324)各々の1つのバイアルを4mMグルタミン含有ExCell302培地中で解凍し、次いで、500μg/mlのG418及び1:250希釈した抗クランピング物質を加えた同一の培地中で3週間増殖させた。次いで、各培養物からの等数の細胞(2×106)を慎重に混合し、次いで、標準的な凍結法を用いて液体窒素で凍結した(5×107細胞/バイアル)。
pWCBに由来するバイアルをT75フラスコ(Nunc,Roskilde,Denmark)中で解凍し、次いで、スピナーフラスコ(Techne,Cambridge,UK)で増殖させた。5Lのバイオリアクター(Applikon,Schiedam,Netherlands)に1.5L中の0.6×106細胞/mlを接種した。リアクターのラン中、毎日、濃縮フィード溶液、グルタミン及びグルコースを加えたExCell302培地を細胞に与え、最終容量は4.5Lだった。バイオリアクターのランを16〜17日後に終了した。3つのバッチをSym04:21、Sym04:23及びSym04:24と名付けた。該バッチを異なる時間ポイントで培養した。
HiTrap(登録商標)rProtein Aカラム(GE Healthcare,UK)を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより、組換えポリクローナル抗体試料を精製した。
本実施例は、25個の個々のメンバー(実施例4のものと同一の組成物)を伴う抗−RhD rpAbの異なるバッチが同様の能力でRhD−陽性赤血球に結合し、及び関連するエフェクター機序に関して同等の生物学的活性:抗体−依存性細胞傷害活性(ADCC)及び貪食性を示すことを実証している。
1%のウシ血清アルブミン(BSA,Sigma−Aldrich,Germany)含有のPBS(Gibco,Invitrogen,United Kingdom)中で血液を3回洗浄することにより、Aalborg Hospital,DKの血液バンクにおいてインフォームド・コンセント後の健常ドナーから得られた全血液から赤血球細胞(RBC)を調製した。赤血球をID−Celltab(DiaMed,Switzerland)中の10%の溶液として再懸濁し、次いで、4℃で貯蔵した。
健常ドナーに由来する軟膜含有血液をNational Hospital,Copenhagen,Denmarkの血液バンクから得、次いで、末梢血単核細胞(PBMC)をLymphoprep(Axis−Shield,Norway)にて精製した。
能力アッセイをヨーロッパ薬局方4(セクション2.7.13方法C)から採用した。25個の個々のメンバーと抗−RhD rpAbの結合能を、PBS、1%BSA中、5×104細胞/μlでRhD−陽性赤血球を用いて測定した。抗−RhD rpAbバッチ、Sym04:21、Sym04:23及びSym04:24を個々の5Lのフェッドバッチバイオリアクターラン(fed batch bioreactor run)から得た。96ウェルプレート(Becton Dickinson Labware,NJ,USA)中、三つ組で、抗−RhD rpAbバッチの希釈(1.5倍)をPBS、1%のBSA中で行った。50μlの抗−RhD rpAb希釈を50μlの赤血球と混合し、次いで、37℃で40分間インキュベーションした。細胞をPBS、1%BSA中で2回(300×g,2分間)洗浄した。PBS、1%BSA中1:20希釈した80μlのフィコエリトリン−コンジュゲートヤギ抗−ヒトIgG(Beckman Coulter,CA,USA)を各試料に加え、次いで、4℃で30分間放置した。試料をPBS、1%BSA及びFacsFlow(Becton Dickinson,Belgium)(300×g,2分間)中で洗浄し、次いで、200μlのFACSFlow中に再懸濁した。試料をFACSCalibur(BectonDickinson,CA,USA)に付し、次いで、CellQuest Pro及びExcelを用いてデータ分析を行った。3つの個々の抗−RhD rpAbバッチはRhD−陽性赤血球と本質的に同一の結合能力を示した(図15A)。
このアッセイをBerkmanら.2002.Autoimmunity35,415−419から採用した。すなわち、RhD陽性(RhD+)及びRhD陰性(RhD−)赤血球細胞(RBC)を放射性クロムで標識した。Cr51標識のために、1×108のRhD+及びRhD−RBCをそれぞれ遠心分離し(600×gで10分間)、次いで、100μlのダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)及び200μlのクロム酸ナトリウム(0.2μCi)(GE Healthcare,UK)を各チューブに加え、その後、37℃で1.5時間インキュベーションした。懸濁液を50mlのPBS中で2回洗浄し、次いで、1mlの完全DMEM(2mMのグルタミン,1%のペニシリン−ストレプトマイシン及び10%のウシ胎児血清含有)(Invitrogen,CA,US)中で再懸濁した。細胞を4×106細胞/mlに調節し、次いで、50μl/ウェルを96−ウェル細胞培養プレート(Nunc)に加えた。次いで、バッチSym04:21又はSym04:24に由来する50μlの2倍希釈の抗−RhD rpAbを対照のウェルを除く各ウェルに加えた。対照のウェルに完全DMEMを加え、次いで、自然溶解/保持又は最大溶解のいずれかのために用いた。
=(平均試験放出Cr51−平均自然放出Cr51)/(標的赤血球中の全Cr51−マシンバックグラウンド)×100
貪食性:免疫貪食性(%)
=(平均試験保持Cr51−平均自然保持Cr51)/(標的赤血球中の全Cr51−マシンバックグラウンド)×100
本実施例は、25個の個々のメンバー(実施例4と同一の組成物)を伴う抗−RhD rpAbのクローン多様性が下流プロセッシング(DSP)の間維持されていることを実証している。陽イオン交換クロマトグラフィー分析を用いて、組換えポリクローナル抗体のDSPの間のクローン多様性を評価した。
発展的(developmental)バイオリアクターランに由来する、25個の個々のメンバーを含む抗−RhD rpAb試料を以下のDSP段階:
1.MAbSelectカラムを用いる抗体の捕獲;
2.pH3におけるウイルス不活性化;
3.SephadexG−25カラムを用いるバッファー交換;
4.DEAE−Sepharoseカラムを用いる陰イオン交換クロマトグラフィー;
5.Planova 15Nフィルターを用いるウイルス濾過;及び
6.MEP Hypercelカラムを用いる疎水性電荷誘導クロマトグラフィー;
7.Millipore biomaxフィルターを用いる限外濾過/ダイアフィルトレーション:
を用いて精製した。
陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて、DSPの間の組換えポリクローナル抗体組成物のクローン多様性を分析した。抗−RhD rpAbのDSPの間、段階1、3、4及び6の後に試料を採取し、25mMの酢酸ナトリウム、150mMの塩化ナトリウム、pH5.0中、室温、60ml/時間の流速でPolyCatAカラム(4.6×100mm)にアプライした。次いで、25mMの酢酸ナトリウム、pH5.0中、150〜500mMの塩化ナトリウムからの直線勾配を用いて60ml/時間の流速で抗体成分を溶離した。抗体成分を280nmにおいて分光測定的に検出し、次いで、クロマトグラムを比較し(図16)、DSPの間のクローン多様性の潜在的な減少を検出した。本実施例では、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて、組換えポリクローナル抗体のDSPの間にクローン多様性が本質的に変化しないことが実証された。
Claims (21)
- 個々のメンバーの少なくとも1つがepD3、epD4及びepD9(RhDカテゴリーVI抗原)に特異的に結合し、及びさらなるメンバーが単独又は組み合わせて残りのRhD抗原エピトープ、epD1、epD2、epD5、epD6/7及びepD8に結合する、請求項1記載の抗−RhD組換えポリクローナル抗体。
- VH:LC対に由来するCDR1、CDR2及びCDR3領域がクローン名RhD157.119D11、RhD158.119B06、RhD159.119B09、RhD161.119E09、RhD163.119A02、RhD190.119F05、RhD191.119E08、RhD192.119G06、RhD197.127A08及びRhD204.128A03により特定される、請求項1又は2記載の抗−RhD組換えポリクローナル抗体。
- VH:LC対に由来するCDR1、CDR2及びCDR3領域がクローン名RhD157.119D11、RhD159.119B09、RhD160.119C07、RhD161.119E09、RhD162.119G12、RhD163.119A02、RhD189.181E07、RhD191.119E08、RhD192.119G06、RhD196.126H11、RhD197.127A08、RhD199.164E03、RhD201.164H12、RhD202.158E07、RhD203.179F07、RhD207.127A11、RhD240.125A09、RhD241.119B05、RhD244.158B10、RhD245.164E06、RhD293.109A09、RhD301.160A04、RhD305.181E06、RhD306.223E11、RhD307.230E11、RhD319.187A11及びRhD324.231F07により特定される、請求項1又は2記載の抗−RhD組換えポリクローナル抗体フラグメント。
- 新生児溶血性疾患の予防、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)の処置、又はRhD(−)の個人にRhD(+)の血液を誤って輸血した後のRhD抗原に対する感作の予防のための組成物を調製するための、請求項1〜4のいずれか1項に記載の抗−RhD組換えポリクローナル抗体の使用。
- 活性成分として請求項1〜4のいずれか1項に記載の抗−RhD組換えポリクローナル抗体及び医薬上許容される賦形剤を含有する、医薬組成物。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の抗−RhD組換えポリクローナル抗体の発現のための製造細胞系統として適切な細胞群を産生するための方法であって、
a)抗−RhD抗体発現ベクターのライブラリーを提供する段階であって、ここで、前記ライブラリーの各個々のベクターが、1)抗−RhDポリクローナル抗体の異なるメンバーをコードする核酸セグメントの1つの単一コピー、及び2)1つ以上のリコンビナーゼ認識配列を含む、段階;
b)抗−RhD抗体発現ベクターの前記ライブラリーを宿主細胞系統に導入する段階であって、ここで、前記宿主細胞系統の各個々の細胞のゲノムは、そのゲノム内で前記ベクターのものと整合するリコンビナーゼ認識配列を含む、段階;
c)段階(a)の抗−RhD抗体コーディング核酸セグメントが宿主細胞系統の細胞内に部位特異的に組み込まれるように、1つ以上のリコンビナーゼの前記細胞内での存在を保証する段階であって、ここで、前記1つ以上のリコンビナーゼは、i)前記核酸セグメントが導入される前記細胞により発現されるか;ii)段階(a)のベクターにより操作可能な形でコードされるか;iii)第2のベクターからの発現を通して提供されるか;又はiv)1つの蛋白質として前記細胞に提供されるかのいずれかである、段階;及び
d)抗−RhD抗体発現ベクターの前記ライブラリーから、抗−RhD抗体コーディング核酸セグメントの組込まれたコピーを含む細胞を選択する段階:
を含む、方法。 - 抗−RhD抗体発現ベクターの前記ライブラリーが、前記ベクターライブラリーの個々のメンバーを用いて別々に前記宿主細胞をトランスフェクションすることによって前記宿主細胞系統内に導入され、及び前記細胞が、段階(d)の選択の後に、組換えポリクローナル抗体製造細胞系統として適切な細胞群を形成するべくプールされる、請求項7記載の方法。
- 抗−RhD抗体発現ベクターの前記ライブラリーが、前記ベクターライブラリーの5〜50個の個々のベクターを含むフラクションを用いた前記宿主細胞のアリコートの半バルクトランスフェクションにより前記宿主細胞系統内に導入され、及び前記細胞が、段階(d)の選択の後に、組換えポリクローナル抗体製造細胞系統として適切な細胞群を形成するべくプールされる、請求項7記載の方法。
- 抗−RhD抗体発現ベクターの前記ライブラリーが、前記ベクターライブラリーを用いた前記宿主細胞の一群のバルクトランスフェクションにより前記宿主細胞系統内に導入される、請求項7記載の方法。
- 抗−RhDポリクローナルの異なるメンバーをコードする核酸セグメントの前記単一コピーが、前記細胞群内の各個々の細胞の単一の所定の遺伝子座内に組み込まれており、前記遺伝子座が前記組換えポリクローナル抗体の各メンバーの高レベル発現を媒介し得る、前記請求項7〜10いずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞群が哺乳類細胞系統から誘導される、前記請求項7〜11いずれか1項に記載の方法。
- 前記哺乳類細胞系統が、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、COS細胞、BHK細胞、YB2/0、NIH3T3、骨髄腫細胞、繊維芽細胞、HeLa、HEK293、PER.C6及びそれらから誘導された細胞系統からなる群より選択される、請求項12記載の方法。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の抗−RhD組換えポリクローナル抗体の製造方法であって、
a)ポリクローナルワーキングセルバンクを提供するか、又は変異体抗−RhD抗体コーディング核酸セグメントのライブラリーを含む細胞群を提供する段階であって、ここで、前記群中の各個々の細胞は、前記抗−RhDポリクローナル抗体の異なるメンバーをコードする核酸セグメントの単一コピーを含み、前記コピーは、各個々の細胞のゲノムの同じ部位に組み込まれている、段階;
b)前記組換えポリクローナル抗体の発現を容易にする条件の下で、前記ポリクローナルワーキングセルバンク又は細胞群を培養する段階;及び
c)細胞培養物、細胞又は上清から前記発現された組換えポリクローナル抗体を回収する段階:
を含む、方法。 - 回収された組換えポリクローナル抗体をさらなる精製に付す、請求項14記載の方法。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の抗−RhD組換えポリクローナル抗体をコードする変異体抗−RhD抗体コーディング核酸セグメントの集団を含む、部位特異的組込み用の抗−RhD発現ベクターのライブラリーであって、ここで、前記ベクターの各々は、1)抗−RhDポリクローナル抗体の異なるメンバーをコードする核酸セグメントの1つのコピー、及び2)1つ以上のリコンビナーゼ認識配列を含むものである、ライブラリー。
- 請求項17記載の抗−RhD抗体コーディング核酸セグメントのライブラリーを用いてトランスフェクションした細胞群を含む組換えポリクローナル抗体製造細胞系統であって、ここで、前記群中の各細胞は、ライブラリーの1つのメンバーを発現し得るものであり、該メンバーは、抗−RhD組換えポリクローナル抗体の異なるメンバーをコードし、及び前記群中の個々の細胞のゲノム内の同じ部位に位置しており、前記核酸セグメントは群中の前記細胞に外来DNAとして導入されているものである、組換えポリクローナル抗体製造細胞系統。
- 抗−RhDポリクローナルの異なるメンバーをコードする前記核酸セグメントが、前記細胞群中の各個々の細胞の単一の所定の遺伝子座内に組み込まれ、前記遺伝子座は前記組換えポリクローナル抗体の各メンバーの高レベル発現を媒介し得るものである、請求項18記載の組換えポリクローナル抗体製造細胞系統。
- 前記細胞群が哺乳類細胞系統から誘導されている、請求項18又は19記載の組換えポリクローナル抗体製造細胞系統。
- 前記哺乳類細胞系統が、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、COS細胞、BHK細胞、YB2/0、NIH3T3、骨髄腫細胞、繊維芽細胞、HeLa、HEK293、PER.C6及びそれらから誘導された細胞系統からなる群より選択される、請求項20記載の組換えポリクローナル抗体製造細胞系統。
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