CZ296807B6

CZ296807B6 - Polypeptidy schopné tvorby vazebných struktur proantigen se specificitou pro Rhesus D antigeny, DNA kódující takové polypeptidy a zpusob jejich prípravy a pouzití

Info

Publication number: CZ296807B6
Application number: CZ0395998A
Authority: CZ
Inventors: Miescher@Sylvia; Vogel@Minique; Stadler@Beda; Morell@Andreas; Imboden@Martin; Amstutz@Hanspeter
Original assignee: Zlb Behring Ag
Priority date: 1996-06-24
Filing date: 1997-06-20
Publication date: 2006-06-14
Also published as: CA2258494C; AU3342397A; PL186019B1; EP0920509B1; DK0920509T3; HUP9902605A2; SK284879B6; TR199802692T2; US20060165694A1; IL127595A; IS2220B; AU722127B2; KR100361449B1; WO1997049809A1; BR9709958A; BG64534B1; JP2000515732A; HUP9902605A3; NO327947B1; IL127595A0

Abstract

Polypeptidy schopné tvorby vazebných struktur proantigen specifických pro Rhesus D antigeny obsahují sekvence ukázané na obr. 1a az 16b. Získané polypeptidy, které jsou Fab fragmenty, mohou být pouzity prímo jako aktivní slozka ve farmaceutických adiagnostických prostredcích. Fab a jejich DNA sekvence mohou také být pouzity pro prípravu kompletních rekombinantních anti-Rhesus D protilátek pouzitelných ve farmaceutických a diagnostických prostredcích.

Description

Polypeptidy schopné tvorby vazebných struktur pro antigen se specificitou pro Rhesus D antigeny, DNA kódující takové polypeptidy a způsob jejich přípravy a použití

CD CD h* o co CD

O) Ol (57) Anotace:

Polypeptidy schopné tvorby vazebných struktur pro antigen specifických pro Rhesus D antigeny obsahují sekvence ukázané na obr. la až 16b. Získané polypeptidy, které jsou Fab fragmenty, mohou být použity přímo jako aktivní složka ve farmaceutických a diagnostických prostředcích. Fab a jejich DNA sekvence mohou také být použity pro přípravu kompletních rekombinantních anti-Rhesus D protilátek použitelných ve farmaceutických a diagnostických prostředcích.

Polypeptidy schopné tvorby vazebných struktur pro antigen se specificitou pro Rhesus

D antigeny, DNA kódující takové polypeptidy a způsob jejich přípravy a použití

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká polypeptidů tvořících vazebné struktury pro antigen se specificitou pro Rhesus D antigen a zejména Fab molekul se specificitou pro Rhesus D antigen. Vynález se také týká jejich použití pro farmakologické a diagnostické přípravy. Výše uvedené Fab fragmenty, pokud jsou geneticky zpracovány tak, aby byly částí kompletních protilátek, jsou použitelné pro profylaxi hemolytické nemoci novorozenců (HDN). Předkládaný vynález poskytuje nové DNA a aminokyselinové sekvence výše uvedených polypeptidů.

Tak mohou být protilátky použity pro ochranu Rh negativní ženy před nebo ihned po porodu Rh pozitivního dítěte pro zabránění HDN v následujících těhotenstvích.

Vynález také obsahuje použití uvedených Fab molekul buď samostatně, nebo v kombinaci s Fc konstantními regiony, jako kompletních protilátek pro léčbu jiných onemocnění, u kterých může být přínosem použití anti-Rhesus D imunoglobulinu, například pro léčbu idiopatické trombocytopenické purpury.

Kromě toho může být Rhesus D imunoglobulin použit po chybné transfuzi Rh pozitivní krve Rh negativnímu příjemci, pro zabránění senzibilizace Rh D antigen. Dále se vynález týká použití těchto Fab fragmentů a protilátek jako diagnostických činidel.

Dosavadní stav techniky

HDN je obecný název pro hemolytickou anemii plodů a novorozenců způsobenou protilátkami matky. Tyto protilátky jsou zaměřeny proti antigenům na povrchu fetálních eiytrocytů. Tyto antigeny mohou náležet k Rhesus, ABO nebo jinému systému krevních skupin.

Rhesus systém krevních skupin obsahuje 5 hlavních antigenů: D, C, c, E a e (Issit, P.D. Med. Lab. Sci. 45: 395, 1988). D. antigen je nej důležitější z těchto antigenů, protože je vysoce imunogenní a vyvolává tvorbu Rhesus D protilátek v průběhu Rhesus inkopatibilního těhotenství a po transfusi Rhesus inkopatibilní krve. D. antigen je nacházen přibližně u 85 % Kavkazské populace v Evropě a o těchto jedincích se říká, že jsou Rh pozitivní. Jedinci, kteří nemají D antigen, se nazývají Rh negativní. Exprese D antigenu může být různá z důvodů nízké hustoty antigenu, dále známé jako slabé D nebo D¹¹, nebo z důvodu částečné antigenicity, známé jako částečné D antigeny.

Rhesus D antigen, membránový protein erytrocytu, byl nedávno klonován a byla popsána jeho primární struktura (Le Van Kim, C. et al., PNAS 89: 10925, 1992). Modelové studie ukázaly, že Rhesus D antigen má 12 transmembránových domén s pouze velmi krátkým spojovacím regionem přesahujícím vně buněčné membrány nebo přesahujícím do cytoplazmy.

Parciální D fenotypy byly plně identifikovány u lidí majících D antigen na erytrocytech, ale nemají aloanti-D-v séru (Rose, R.R. a Sanger, R., Blood groups in man, Blackwell Scientific, Oxford, UK, 1975; Tippett, P. et al., Vox Sanguanis, 70: 123, 1996). Toto může být vysvětleno tak, že D antigen je mozaiková struktura s nejméně 9 odlišnými epitopy (epDl až epD9). Proto u některých lidí s D variantou nemají erytrocyty část této mozaiky a protilátky jsou namířeny proti chybějících D epitopům. Rh pozitivní jedinci, kteří vytvářejí protilátky proti částečným D antigenům byly klasifikovány do šesti hlavních odlišných kategorií (Dⁿ až D^vn), kde každá má jinou abnormalitu D antigenu. Nověji bylo ukázáno, že tyto D kategorie dávají různý charakter reakce při testování proti panelu lidských monoklonálních anti-D protilátek (Tippett, P. et al.,

-1 CZ 296807 B6

Vox Sanguinis, 70: 123, 1996). Podle různých charakterů reakce bylo identifikováno 9 epitop a tak byly definovány různé parciální D kategorie. Počet epitopů přítomných na D antigenů se liší mezi jednotlivými parciálními D kategoriemi, kdy D^VI kategorie exprivuje nejméně, epD3, 4 a 9.

D^VI kategorie je klinicky významná, protože D^VI ženy mohou být imunizovány dostatečně silně pro způsobení hemolytické nemoci novorozenců.

Profylaktická účinnost anti-RhD IgG pro prevenci hemolytické nemoci novorozenců je dobře prokázána a je rutinním postupem po mnoho let. V důsledku toho se závažné onemocnění stalo raritou. Nicméně, základní příčina onemocnění, tj. RhD inkompatibilita mezi RhD negativní matkou a RhD pozitivním dítětem, stále zůstává a tak vyžaduje kontinuální dodávání terapeutického anti-RhD IgG.

V posledních letech se zajištění kontinuálního dodávání anti-RhD IgG stává narůstajícím problémem. Zásoba dostupného hyperimunního séra od aloimunizovaných Rh negativních vícerodiček se drasticky snížila díku úspěchu profylaktického podávání anti-RhD. Proto současné metody produkce vyžadují opakovanou imunizaci stále více neochotnějších dárců pro produkci vysokého titru antiséra (Selinger, M. Br. J. Obstet. Gynaecol. 98: 509, 1991). Jsou zde také asociované rizikové faktory a technické problémy, jako je použití Rh pozitivních erytrocytů pro opakovanou imunizaci, což má riziko přenosu virových onemocnění jako je hepatitida B, AIDS a jiné doposud neznámí viry (Hugnes-Jones, N.C., Br. J. Haematol., 70: 263, 1988). Proto je žádoucí alternativní způsob pro produkci anti-RhD protilátek.

V posledních několika letech byly zkoušeny různé alternativní zdroje hyperimunního séra, ale všechny jsou spojeny s nevýhodami. Transformace lymfocytů virem Epstein-Barrové (EBV) za vzniku B lymfoblastoidních buněčných linií, které secemují specifickou protilátku včetně protilátky proti Rhesus D antigenů (Crawford et al., Lancet, 386: Feb. 19* 1983) jsou nestabilní a vyžadují extensivní klonování. Také z důvodů nízké účinnosti transformace (1 až 3 % B buněk) může být z potenciálního repertoáru získat pouze omezený rozsah protilátkových specificit. Dále se zdá, že myši neodpovídají na Rhesus D antigen a proto nejsou dostupné žádné myší monoklonální protilátky, které by mohly být použity pro výrobu chimérických nebo humanizovaných protilátek. Doposud byla jedinou alternativou produkce lidských protilátek hybridomní technikou, která je také omezena chyběním vhodného partnery pro fúzi s lidskými myelomovými buňkami (Kozbor, D. a Roder, J.C. Immunol Today, 4: 72, 1983).

Podstata vynálezu

Předmětem předkládaného vynálezu proto jsou Fab fragmenty mající reaktivitu proti Rhesus D antigenů, stejně jako kompletní protilátky obsahující Fab fragmenty, které nemají výše uvedené nedostatky.

V posledních několika letech technika repertoárového klonování a konstrukce fágových zobrazovacích knihoven otevřela nové možnosti pro produkci lidských protilátek definované specificity (Williamson, R.A. et al., Pnas 90: 4141, 1993). Tyto metody byly proto použity pro přípravu polypeptidů schopných tvorby vazebných struktur pro antigen se specifickou pro Rhesus D antigeny, zejména pro přípravu Fab fragmentů majících aktivitu proti Rhesus D a částečným D antigenům.

Tvorba lidských protilátek repertoárovým klonováním jak byla popsána v posledních letech (Barbas III, C.F. a Lerner, R.A. Companion Methods Enzymol. 2: 119, 1991) je založena na izolaci mRNA z periferních B buněk. Tato metoda nabízí nástroje pro izolaci přirozených protilátek, autoprotilátek nebo protilátek tvořených v průběhu imunitní odpovědi (Zebedee, S. L. et al., PNAS 89: 3175, 1992; Vogel, M. et al., Eur. J. Immunol. 24: 1200, 1994). Tato metoda spočívá v konstrukci knihovny rekombinantních protilátek od jednotlivých dárců z mRNA kódující imunoglobulinové (Ig) molekuly. Protože pouze lymfocyty periferní krve (PBL) mohou být izo

-2CZ 296807 B6 lovány od dárce, jsou šance na nalezení B buněk produkujících specifickou protilátku v periferii zvýšeny, pokud je jedinci podána dávka požadovaného antigenů těsně před odběrem PBL (Persson, M.A.A. et al., PNAS 88: 2432, 1991). Celková RNA je potom izolována a mRNA Ig repertoáru může být klonována za použití Ig specifických primerů v polymerázové řetězové reakci (PCR), po které následuje současná exprese těžkých a lehkých řetězců Ig molekuly na povrchu filamentózního fágu, což vytvoří „organismus“, který analogicky s B buňkami může vázat antigen. V literatuře je také metoda také známá jako kombinatoriální přístup, jelikož umožňuje nezávislé kombinování těžkých a lehkých řetězců za vzniku funkčního Fab fragmentu protilátky připojeného na jeden z koncových proteinů, nazývaných plil, filamentózního fágu. Fágy nesoucí Fab molekuly (zde dále Phab částice) jsou podrobeny selekce na požadovanou antigenní specificitu procesem známým jako biopanorámování. Antigen může být navázán na pevný nosič, kdy specifická Phab se váže na antigen, zatímco nespecifické Phab jsou vypláchnuty a nakonec jsou specifické Phab eluovány z pevného nosiče. Specifické Phab jsou potom amplifikovány v bakteriích, je provedena opakovaná vazba na antigen na pevném nosiči a celý postup biopanorámování je opakován.

Postupné opakování panorámování a amplifikace vybrané Phab v bakterii vede k obohacení specifických Phab, což je pozorováno z vzestupu titru kolonie tvořících jednotek (cfu) očkovaných na plotny po každém kle panorámování. Naše dřívější zkušenosti a publikovaná data naznačují, že specifický fág může být detekován obvykle po 4 až 6 kolech panorámování (Vogel, M. et al., Eur. J. Immunol. 24: 1200, 1994). Ve výše uvedené citaci nicméně není žádná zmínka, že naznačené kroky mohou být použity pro přípravu Fab fragmentů anti-RhD protilátek.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázky 1 a až 16b ukazují DNA sekvence kódující variabilní regiony (V regiony) anti-RhD Fab fragmentů a odpovídající polypeptidové sekvence.

Obrázek 17 ukazuje pComb3 expresní vektor použitý podle předkládaného vynálezu.

Obrázky 18 a 19 ukazují oddělenou přípravu genů pro těžký a lehký řetězec kompletní protilátky podle popisu v příkladu 6.

Předmětem předkládaného vynálezu jsou polypeptidy schopné tvorby vazebných struktur pro antigen se specificitou pro Rhesus D antigeny podle definice v nároku 1. Tabulka 1 v nároku 1 se vztahuje k připojeným obrázkům. Je uvedeno identifikační číslo pro každou sekvenci. Lokalizace Rhesus D specifických CDR1 (komplementaritu určující region 1), CDR2 a CDR3 regionů jsou uvedeny na obrázkách a podle číslování párů bází v tabulce nároku 1. Výhodnými polypeptidy podle předkládaného vynálezu jsou anti-Rhesus D protilátky, které obsahují variabilní regiony těžkých a lehkých řetězců sekvencí uvedených na obrázkách la - 16b. Obrázky 1 a, 2a ... 16a se týkají variabilních regionů těžkých řetězců a obrázky lb, 2b ... 16b se týkají variabilních regionů lehkých řetězců.

Dalšími předměty předkládaného vynálezu jsou DNA sekvence kódující antigen vazebné polypeptidy podle nároku 6. Výhodné DNA sekvence jsou ty, které kódují variabilní regiony Fab fragmentů anti-RhD protilátek podle nároků la - 16b. Obrázky 1 a, 2a ... 16a se týkají těžkých řetězců a obrázky lb, 2b .... 16b se týkají lehkých řetězců.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je způsob pro přípravu rekombinantních Fab polypeptidů podle nároku 11.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je způsob pro selekci rekombinantních polypeptidů podle nároku 12.

-3CZ 296807 B6

Dalším předmětem předkládaného vynálezu jsou anti-RhD protilátky podle nároku 14, výhodně anti-RhD imunoglobulinové molekuly obsahující variabilní regiony těžkého a lehkého řetězce podle obrázků la až 16b v kombinaci se známými konstantními regiony těžkého a lehkého řetězce.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu jsou farmaceutické a diagnostické prostředky obsahující polypeptidy, anti-RhD protilátky nebo Fab fragmenty podle předkládaného vynálezu.

Celková reamplifíkovaná Phab populace získaná po každém panorámování může být testována na specifícitu za použití různých metod jako je ELISA a imunologické bodové testy. Toto je také určeno charakterem antigenů, například anti-Rhesus D Phab jsou detekovány nepřímou hemaglutinací za použití králičí anti-fágové protilátky nebo ekvivalentního Coomsova činidla jako zkřížené vazebné protilátky. Po identifikaci celkové Phab populace jako pozitivní pro požadovaný antigen jsou jednotlivé Phab klony izolovány a je sekvencována DNA kódující požadované Fab molekuly. Jednotlivé Fab mohou být potom vyrobeny za použití pComb 3 expresního systému, který je zobrazen na obr. 16. V tomto systému je glll gen, kódující koncový protein plil, vystřižen z fagemidového vektoru pComb3. Toto umožňuje produkci solubilního Fab v periplazmě bakterie. Takové jednotlivé Fab fragmenty mohou být potom testovány na antigenní specifícitu.

Fágový zobrazovací přístup byl také použit jako prostředek pro získání monoklonálních protilátek z nestabilních hybridomních buněčných linií. Toto bylo popsáno proti anti-Rhesus D protilátky (Siegel, D.L. a Silberstein, L.E. Blood, 83. 2334, 1994; Dziegiel, M. et al., J. Immunol. Methods, 182: 7, 1995). Fágová zobrazovací knihovna konstruovaná od neimunizovaných dárců byla také použita pro selekci Fv fragmentů (tj. variabilních regionů těžkého a lehkého řetězce, V_H a V_L) specifických pro antigen lidských krevních skupin, které obsahují jeden Fv fragment reaktivní s Rhesus D antigenem Marks, J. D. et al., Biotechnology, 11:1145,1993).

Důležitými podmínkami při konstrukci kombinatoriálních knihoven jsou zdroje buněk použitých pro extrakci RNA a charakter antigenů použitého pro panorámování. Proto předkládaný vynález používá hyperimunního dárce, kterému byla podána i.v. dávka Rhesus D⁺ erytrocytů. PBL dárce jsou odebrány +5 a +18 dní i.v. dávce a jsou použity pro konstrukci 2 kombinatoriálních knihoven zde dále označovaných jako knihovna Dl (LD1) a knihovna D2 (LD2), v příslušném pořadí. Dvojitá imunofluorescenční analýza získaných PBL, za použití markérů DC20 a CD38 pro spektrum B buněk a lymfoblastoidních buněk, v příslušném pořadí, ukázala vyšší než normální procento lymfoblastoidních B buněk, morfologie plazmatických buněk. Vyšší počet plazmatických buněk nalezených v periferní krvi je neobvyklý, protože v periferii je normálně méně než 1 % a pravděpodobně ukazuje na to, že dárce měl vyšší procento cirkulujících b buněk se specificitou pro Rhesus D antigen.

Po konstrukci knihovny byla selekce Phab specifických pro Rhesus D antigen provedena biopanorámováním čerstvých celých erytrocytů fenotypu R1R1 (CDe/CDe), tj. referenčních buněk pro Rhesus D typizaci. Toto bylo nezbytné, protože Rhesus D antigen, integrální membránový protein o 417 aminokyselinách (Le Van Kim C. et al., PNAS 89: 10925, 1992), ztrácí svou imunogenicitu v průběhu přečištění (Paradis, G. et al., J. Immunol. 137: 240, 1986) a proto nemůže být chemicky přečištěný D antigen navázán na pevnou fázi pro selekci imunoreaktivních Phab jak je to provedeno pro jiné antigenní specificity dříve selektované v tomto systému (Vogel, M. et al., Eur. J. Immunol. 24: 1200, 1994). Modelové studie ukázaly, že pouze velmi krátký spojovací region Rhesus D antigenů přesahuje vně buněčné membrány nebo přesahuje do cytoplazmy Chérif-Zahar, B. et al., PNAS 87: 6T243, 1990). Proto jsou části RhD antigenů rozpoznatelné protilátkami relativně omezené a mohou být konformačně omezené. Tento aspekt Rhesus D antigenů se stává ještě důležitějším při selekci Phab s reaktivitou proti částečným D fenotypům, které postrádají některé definované epitopy D membránového proteinu (Mouro, I. et al., Blood, 83: 1129, 1994).

-4CZ 296807 B6

Kromě toho, protože celé erytrocyty neesprivují pouze D antigen, musí být provedena série negativních absorpcí na Rhesus D negativních erytrocytech z toho důvodu, aby se odabsorbovaly ty Phab, které reagují s jinými antigenními proteiny na erytrocytech.

Tento panorámovací postup provedený na Phab zobou LD1 a LD2 knihoven vedl kizolaci 6 různých klonů produkujících Fab z knihovny LD1, 8 různých klonů produkujících Fab z knihovny 2 a 2 klonů produkujících Fab ze souboru knihoven LD1 a LD2.

Nomenklatura a obrázky, kde jsou sekvence popsány, jsou uvedeny v tabulce 1.

Tabulka 1

Knihovna	V -	V - I.»	Knihovna	V - H	V -
LD1	sekvence	sekvence	LD2	sekvence	sekvence
klon č.	obrázek	obrázek	klon č.	obrázek	obrázek
LD1-40	la	lb	LD2-1	6a	6b
LD1-52	2a	2b	LD2-4	7a	7b
LD1-84	3a	3b	LD2-5	8a	8b
LD1-110	4a	4b	LD2-10	9a	9b
LD1-117	5a	5b	LD2-11	10 a	10b
			LD2-14	11a	11b
			LD2-17	12a	12b
			LD2-20	13a	13b

Výše uvedené Fab klony vykazují výlučnou reaktivitu s Rhesus D antigenem, 3 a 5 D“ testovali ných erytrocytů a aglutinační reaktivitu proti částečným D fenotypům: Rh33, DIII, DIVa, DIVb,

DVa, DVII.

Nicméně, za použití výše uvedených R1R1 erytrocytů pro panorámování Phab nebyly izolovány žádné klony reaktivní s částečným DVI fenotypem. Protože bylo známo, že sérum původního 20 hyperimunního dárce testované v době tvorby rekombinantní knihovny je reaktivní s DVI fenotypem, měla by rekombinantní knihovna také obsahovat anti-DVI specifícitu.

Pro selekci DVI reaktivity byly podmínky pro panorámování změněny v tom, že byly použity jiné buňky. Speciální dárce, jehož erytrocyty byly typizovány a bylo známo, že exprimují 25 částečný DVI fenotyp, byl použit jako zdroj buněk pro opakované panorámování LD1 a LD2 knihoven. Tato druhá série panorámování byla provedena v podstatě stejným způsobem jako první sorie s výjimkou substituce DVI erytrocytů za R1R1 erytrocyty a přidání ošetření DVI erytrocytů za R1R1 erytrocyty a přidání ošetřením VI erytrocytů bromelasou. DVI fenotyp exprivuje nejméně Rhesus D epitopů a je proto obtížné vyrobit proti němu protilátky. Bylo popsáno, 30 že pouze 15 % neselektováných polyklonálních anti-D a 35 % selektovaných anti-D tvořených

Rhesus D negativními subjektu reaguje sDVI+ buňkami (Mouro, I. et al., Blood, 83: 1129, 1994). Ošetření bromelasou, která odstraňuje N-acetylneuraminovou kyseliny (sialovou kyselinu) z membrány erytrocytů bylo provedeno proti, aby byly epitopy Rhesus DVI lépe dosažitelné v průběhu panorámování s pre-absorbovanými Phab.

-5CZ 296807 B6

Tato druhá série panorámování na LD1 knihovně vedla k zisku 1 klonu produkujícího Fab, LD16-17. Nomenklatura je uvedena v tabulce 2.

Tabulka 2

Knihovna LD1	V -sekvence Xi obrázek	V -sekvence Li obrázek
Klon č. LD1-6-17	14a	14b

Nicméně, tento klon reagoval s Rhesus alelami C a E a vykazoval falešně pozitivní reakci s DVI pozitivními erytrocyty. Toto bylo způsobeno také fenotypem DVI dárce (Cc DVI ee), který exprivoval C alelu, která nebyla odabsorbována Rhesus negativními erytrocyty (ccddee).

Proto byla provedena třetí série panorámování na souboru LD1 a LD2 knihoven za použití jiných erytrocytů pro absorpční fázi. Po 6 kolech panorámování za použití jako bromelasou ošetřených, tak bromelasou neošetřených erytrocytů pro oba absorpční kroky a eluci z DVI pozitivních erytrocytů byla získána celková populace Phab, které reagovaly výlučně s erytrocyty fenotypu R1R1 (CCDDee) a 2 různí dárci exprivující DVI variantu.

Tato třetí série panorámování na LD1 knihovně vedla k zisku 2 klonů produkujících Fab reagujících s DVI+ erytrocyty. Nomenklatura je uvedena v tabulce 3.

Tabulka 3

Knihovna LD1/LD2	V -sekvence - obr. H	V^ - sekvence - obr.
Klon Č. LD1/2-6-3	15a	15b
Klon č. LD1/2-6-33	16a	16b

Tak bylo izolováno 16 různých anti-Rhesus D Fab klonů. DNA z těchto klonů byla izolována a sekvenována za použití fluorescenčního cyklického sekvencování na ABI 373A Sequencing Systém. Nukleotidové a odpovídající aminokyselinové sekvence uvedených Fab klonů tvoří základ předkládaného vynálezu.

Analýza sekvence ukázala, že bylo izolováno několik klonů majících stejný V_H genový segment, ale jiné V_L genové segmenty. Tak je tomu v případě dvou klonů LD2-1 a LD2-10, dvou klonů LD2-4 a LD2-11 a tří klonů LD2-14, LD1/2-6-3 a LD1/2-6-33, v příslušném pořadí.

Získané DNA sekvence a Fab fragmenty jsou použitelné pro přípravu kompletních protilátek majících aktivitu proti Rhesus D antigenu. Vhodnými expresními systémy pro takové protilátky jsou myší myelomové buňky nebo ovariální buňky čínského křečka.

Následující příklady podrobně popisují vynález, bez jakéhokoliv omezení rozsahu vynálezu.

-6CZ 296807 B6

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1 popisuje konstrukci 2 kombinatoriálních knihoven; zejména výše uvedených LD1 a LD knihoven.

Příklad 2 popisuje podrobně sérii panorámování na LD1 a LD2 knihovnách za použití R1R1 erytrocytů.

Příklad 3 popisuje sérii panorámování za použití jak bromelasou ošetřených, tak bromelasou neošetřených erytrocytů za použití souboru uvedených LD1 a LD2 knihoval.

Příklad 4 popisuje nepřímý hemaglutinační test využívající králičí anti-fágovou protilátku, jako ekvivalentní Coombsovo činidlo, pro sledování obohacení a specifícity Rhesus D specifických Phabs po panorámování.

Příklad 5 popisuje přípravu a přečištění Fab fragmentů protilátky pro použití jako diagnostické činidlo.

Příklad 6 popisuje přípravu kompletní anti-Rhesus D imunoglobulinů za použití sekvencí podle předkládaného vynálezu.

Příklad 1 - Konstrukce rekombinantních LD1 a LD knihoven

a) Zdroj lymfocytů

Dospělému muži, který byl členem dobrovolné základny hyperimunních Rhesus D dárců, byla podána i.v. dávka 2 ml připravených erytrocytů od známého mužského dárce krevní skupiny O RhD⁺. PBL byly odebírány v den +5 a +18 po dárce a mononukleámí buňky byly izolovány centrifugací sFicollovým grafientem (Lymphoprep, Pharmacia, Milwaukee, WI). Výsledky analýzy dárcovských lymfocytů v den +5 jsou uvedeny v tabulce 4. MNC z den +5 byly použity přímo pro přípravu RNA za použití postupu fenol-chloroform-guanidiniumisothiokyanat (Chomzynski, P. a Sacchi, N. Anal. Biochem. 162: 156, 1987). MNC ze dne +18 byly nejprve kultivovány po dobu 3 dnů v RPMI-1640 médiu (Seromed, Basel) obsahujícím 10³ U/ml IL-2 (Sandoz Research Center, Vienna, Austria) a 10 pg/ml mitogenu z líčidla amerického (PWM; Sigma L9379, Busch, Switzerland) před extrakcí RNA.

Tabulka 4 - Imunofluorescenční analýza dárcovských lymfocytů v den +5 po i.v. dávce erytrocytů

Buněčný povrchový antigen	% pozitivních buněk	Buněčný povrchový antigen	% pozitivních buněk
CD20	15	CD8	12
CD38	20	CD25	7,6
CD20/CD38	15	CD57	12,5
CD3	47	CD14	6
CD4	34	HLA-DR	18

b) Konstrukce knihovny

Byly konstruovány jednotlivé knihovny nazvané LD1 a LD2 (jak je podrobněji uvedeno výše) odpovídající buňkám odebraným v den +5 a +18 (dohromady +21 dní včetně +3 dní PWM stimulace) po i.v. dávce, v příslušném pořadí. Celková RNA byla potom připravena z těchto buněk za použití postupu fenol-chloroform-guanidiniumisothiokyanat. Z této RNA bylo 10 pg použito pro výrobu cDNA za použití oligo(dT) primerů (400 ng) a bylo reverzně transkribováno za použití M-MuLV reverzní transkriptasy podle návodu dodavatele (Boehringer Mannheim Germany). PCR amplifikace byla provedena podle postupu popsaného v Vogel, M. et al., E.J. of Immunol. 24: 1200, 1994. Stručně, 100 μΐ PCR reakce obsahovala Perkin-Elmer pufr s 10 mM MgCl₂, 5 μΐ cDNA, 150 ng, každého vhodného 5' a 3' primerů, všechny čtyři dNTP - 200 μΜ každý a 2 U/ml Taq polymerázy (Perkin Elmer, NJ). PCR amplifikace těžkého a lehkého řetězce Fab molekuly byla provedena jednotlivě se sadou primerů od Stratacyte (podrobnosti jsou uvedeny dále). Pro těžký řetězec bylo použito šest „upstream“ primerů, které hybridizovaly s každou ze šesti rodin V_H genů, zatímco primer pro jeden kappa a jeden lambda řetězec byl použit pro lehký řetězec. „Downstream“ primery byly navrženy tak, aby odpovídaly pantovému regionu konstantních domén τΐ a τ3 pro těžký řetězec. Pro lehký řetězec odpovídaly „downstream“ primery 3' konci kappa a lambda konstantních domén. PCR produkty těžkého a lehkého řetězce byly shromážděny odděleně, byly přečištěny na gelu a tráveny Xhol/Spel a Sacl/Xbal restirkčními enzymy (Boehringer Mannheim), v příslušném pořadí. Po trávení byly produkty PCR extrahovány jednou fenol: chloroform: isoamylalkoholem a přečištěny gelovou excisí. Inserce Xhol/Spel tráveného Fd fragmentu a následná ligace Sacl/Xbal tráveného řetězce do pComb3 vektoru, transformace do XLl-Blue buněk a produkce fágů byly provedeny podle postupu popsaného vBarbas ΠΙ, C.F. a Lemer, R.A. Companion Methods Enzymol. 2: 119, 1991).

Po transformaci XLl-Blue E. coli buněk byly odebrány vzorky a byly titrovány na plotnách pro určení velikosti knihovny. Tyto výsledky ukazují expresní knihovny o 5 χ 10⁶ a 7,7 χ 10⁶ cfu (kolonie tvořící jednotky) pro LD1 a LD2, v příslušném pořadí.

c) PCR primery

VHI 5'~CAC TCC CAG G I G CAG CTG CTC GAG TCT GG-3’

VHII 5-GTG CTG TCC CAG GTC AAC TTA CTC GAG TCT GG-3’

VH11I 5’-GTC CAG GTG GAG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GG-3’

VH1V 5'-GTC CTG TCC CAG GTG CAG CTG CTC GAG TCG GG-3'

VHV 5’-GTC TGT GCC GAG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GG-3’

VHVI 5’-GTC CTG TCA CAG GTA CAG CTG CTC GAG TCA GG-3’ CHI(gl) ϋ'-AGC ATC ACT AGT ACA AGA TTT GGG CTC3’

VL(k) 5’-GT GCG AGA TGT GAG CTC GTG ATG ACC CAG TCT CCA-3’

CL(k) ΰ’-T CCT TCT AGA TTA CTA ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT

CTT TGT GAC GGG CGA ACT C-3‘

VL(I) 5’C TGC ACA GGG TCC TGG GCC GAG CTC GTG GTG ACT CA-3’ CL(l) 5’G CAT TCT AGA CTA TTA TGA ACA TTC TGT AGG GGC-3’

d) Vektory a bakteriální kmeny pComb3 vektory použitý pro klonování Fd a lehkého řetězce byl získán od Scripps Research Institute La Jolla, CA; Bambas ΠΙ, C.F. a Lemer, R.A. Companion Methods Enzymol. 2: 119,

-8CZ 296807 B6

1991). Escherichia coli kmen XLl-Blue použitý pro transformaci pComb3 vektoru a VCSM13 pomocný fág byly zakoupeny od Stratacyte (L Jolla, CA).

Příklad 2 - Selekce Rhesus D Phab z LD1 a LD2 knihoven na R1R1 erytrocytech.

a) Absorpce a biopanorámování

Série tří negativních absorpcí na erytrocytech skupiny 0 Rh negativní byly provedeny před každým kolem panorámování před pozitivní selekcí na erytrocytech skupiny 0 Rh pozitivní (R1R1). Čerstvé erytrocyty byly odebrány v ACD (kyselá citratová dextrosa) antikoagulačním činidlu a byly promyty 3 krát v 0,9% NaCl. Erytrocyty byly počítány vHayemsově roztoku a jejich počet byl upraven na 40 x 10⁶/ml. Absorpce: 1 ml fágového přípravku v PBS/3% BSA byl přidán k peletě erytrocytů skupiny 0 Rh negativní (16 x 10⁶ erytrocytů) ve 12 ml tubách (Greiner 187261, Reinach, Switzerland) a byla provedena inkubace při pokojové teplotě po dobu 30 minut s jemným třepáním. Všechny tuby byly předem blokovány v PBS/3% BSA po dobu minimálně 1 hodiny při pokojové teplotě. Erytrocyty byly peletovány centrifugací po dobu 5 minut při 300 x g při 4 °C. Vzniklý fágový supematant byl opatrně odebrán a proces byl opakován ještě dvakrát. Po konečné absorpci byl fágový supematant přidán k peletě erytrocytů skupiny 0 Rh pozitivní (16 x 10⁶ erytrocytů) a znovu byla provedena inkubace při pokojové teplotě po dobu 30 minut s mírným třepáním. Potom byly erytrocyty promyty alespoň 5-krát v 10 ml ledově chladného PBS, byla provedena centrifugací při 300 x g po dobu 5 minut při 4 °C a potom následovala eluce s 200 pg 76 mM kyseliny citrónové pH 2,8 po dobu 6 minut při pokojové teplotě a neutralizace 200 μΐ 1 M Tris. Erytrocyty byly centrifugo vány při 300 x g po dobu 5 minut při 4 °C a vzniklý supematant obsahující eluované fágy byl pečlivě odebrán a skladován s proteinovým nosičem (0,3% BSA) při 4 °C připravený pro re-amplifikaci. Počet Rhesus D specifických Phab každého kola panorámování je uveden v tabulce 5.

Tabulka 5 - Selekce Rhesus D Phab z LD1 a LD2 knihoven na R1R1 erytrocytech

Počet eluovaných Rhesus D specifických fágů
Panorámování kolo č.~	Knihovna Dl cfu	Knihovna D2 cfu
1	8 x 10^s	4,6 x 10’
2	6 x 10’	1,4 x 10’
3	1 x 10⁸	7,9 X 10’
4	3 x 10⁸	1,3 X 10^a
5	3 x 10⁸	1 X 10⁸
6	nd	2,8 X 10⁸

^a) Pro každé kolo bylo 10¹² Phab inkubováno v tubách s erytrocyty skupiny 0 Rh negativní (absorpční fáze) a potom následovala eluce z erytrocytů skupiny 0 Rh pozitivní (R1R1).

nd = neprovedeno cfu = kolonie tvořící jednotky

Příklad 3 - selekce Rhesus D Phab ze souboru knihoven LD1 a LD2 na DVI+ erytrocytech

a) Absorpce na erytrocytech skupiny 0 Rh negativní, fenotypu 1 (r'r, Ccddee) a 2 (ryry, CCddEE)

Série čtyř negativních absorpcí na erytrocytech skupiny 0 Rh negativní byly provedeny pro každé kolo panorámování před pozitivní selekcí na erytrocytech skupiny 0 Rh DVI pozitivní. Negativní absorpce byly provedeny v následujícím pořadí: krok 1) fenotyp 1 ošetřený bromelasou; krok 2) fenotyp 1 neošetřený bromelasou; krok 3) fenotyp 2 ošetřený bromelasou; krok 4) fenotyp 2 neošetřený bromelasou. Zmražené erytrocyty se nechaly roztát ve směsi sorbitu a fosfátem pufrovaného salinického roztoku, nechaly se stát v tomto roztoku po dobu minimálně 10 minut a potom se promyly 5 až 6-krát ve fosfátem pufrovaném salinickém roztoku a nakonec se uskladnily ve stabilizačním roztok (DiaMed EC-roztok) připravené pro použití. Před panorámováním byly erytrocyty promyty 3-krát v 0,9% NaCl a potom následovalo počítání v Hayemově roztoku. Absorpce: 1 ml fágového přípravku v PBS/3%BSA byl přidán k peletě erytrocytů (2 x 10⁸) stejně jako v kroku 1 ve 12 ml tubách (Greiner 187261, Reinech, Switzerland) a byla provedena inkubace při pokojové teplotě po dobu 30 minut s jemným třepáním. Všechny tuby byl předem blokovány v PBS/3%BSA po dobu minimálně 1 hodiny při pokojové teplotě. Erytrocyty byly peletovány centrifugací po dobu 5 minut při 300 x g při 4 °C. Vzniklý fágový supematant byl pečlivě odebrán a proces byl opakován za použití erytrocytů jak je podrobněji popsáno výše v krocích 2, 3 a 4.

b) Ošetření erytrocytů Rhesus D negativní ťr a ryry a Rhesus DVI+ bromelasou

Bromelasa 30 (Baxter, Dubingen, Switzerland) byla použita pro ošetření erytrocytů Rhesus DVI ve stejných poměrech, jako je používána v rutinním hemaglutinačním testu, tj. 10 μΐ bromelasy na 2 x 10⁶ erytrocytů. Bromelasa byla přidána do požadovaného množství erytrocytů a byla inkubována při 37 °C po dobu 30 minut a potom následoval promytí 3-krát v 0,9% NaCl, opětovné počítání v Hayemově roztoku a upravení na požadovanou koncentraci v PBS/3% BSA a byly připraveny pro Phab panorámování.

c) Biopanorámování na bromelasou ošetřených Rhesus DVI+ erytrocytech

Po konečné absorpci na erytrocytech ryry neošetřených bromelasou byl fágový supematant rozdělen na dvě stejné části a byl přidán buď k enzymem ošetřené, nebo enzymem neošetřené peletě erytrocytů skupiny 0 Rh DVI+ (40 x 10⁶), v příslušném pořadí, a byla znovu provedena inkubace při pokojové teplotě po dobu 30 minut s jemným třepáním. Potom byly dvě populace erytrocytů promyty alespoň 5-krát v 10 ml ledově chladného PBS, byla provedena centrifugace při 300 x g po dobu 5 minut při 4 °C a potom následovala eluce s 200 μΐ 76 mM kyseliny citrónové pH 2,8 po dobu 6 minut při pokojové teplotě a neutralizace 200 μΐ 1 M Tris. Erytrocyty byly centrifugovány při 300 x g po dobu 5 minut při 4 °C a vzniklý supematant obsahující eluované fágy z bromelasou ošetřených a bromelasou neošetřených DVI+ erytrocytů byl pečlivě odebrán a skladován s proteinovým nosičem (0,3% BSA) při 4 °C připravený pro re-amplifikaci. V dalších kolech panorámování byly eluované fágy z bromelasou ošetřených a neošetřených DVI+ erytrocytů uchovávány odděleně a po každém následovaly kroky 1 až 4 absorpčního protokolu. Krok eluce byl mírně odlišný ve srovnání s kolem 1 panorámování, protože fágové populace nebyla znovu rozděleny na dvě části. Pouze ty fágy, které byly eluovány z bromelasou ošetřených DVI+ erytrocytů byly také znova eluovány z bromelasou ošetřených DVI+ erytrocytů a pouze ty fágy, které byly eluovány z bromelasou neošetřených DVI+ erytrocytů byly také znova eluovány z bromelasou neošetřených DVI+ erytrocytů. Počet Rhesus D specifických Phab každého kola panorámování je uveden v tabulce 6.

-10CZ 296807 B6

Tabulka 6 - Selekce Rhesus D Phab ze souboru LD1 a LD2 knihoven na Rhesus DVI+ erytrocytech

	Počet eluovaných DVI+	specifickýcl	i fágů
Panorámování	- bromelasa	+ bromelasa
kolo č.~	cfu	cfu
1	1,9 x 10^s	4,4 x	10^e
2	1,6 x 10^e	4 x	10^s
3	2,4 x 10⁷	4,1 x	10⁷
4	3 x 10^e	5 X	10’
5	1 x 10^a	1 X	10®
6	nd	3 x	10⁸

^a) Pro každé kolo bylo 10¹² Phab inkubováno v tubách se 2 různými fenotypy erytrocytů skupiny 0 Rh negativní (absorpční fáze) a potom následovala eluce z erytrocytů skupiny 0 Rh DVI+.

Příklad 4 - Monitorování kol panorámování a určení specifícity obohacený Phab za použití králičí anti-fágové protilátky

Nepřímý hemaglutinační test

Čerstvě odebrané erytrocyty různých ABO a Rhesus krevních skupin byly promyty 3-krát v 0,9% NaCl a byly upraveny na 3 až 5% roztok (45 až 50 x 10⁷/ml) buď v 0,9% NaCl, nebo vPBS/3%BSA. Pro každé testovací podmínky bylo 50 μΐ erytrocytů a 100 μΐ testované vzorky (vysrážený a amplifikovaný fág nebo kontrolní protilátky) inkubováno společně ve skleněných trubičkách pro určování krevních skupin (Baxter, Dudingen, Switzerland) po dobu 30 minut při 37 °C. Erytrocyty byly promyty 3-krát v 0,9% NaCl a potom byly inkubovány se dvěma kapkami Coomsova činidla (Baxter, Dudinten, Switzerland) pro pozitivní kontrolu nebo se 100 μΐ králičích anti-fágových protilátek (vyrobených imunizací králíků přípravkem fágu VCSM13 a potom přečištěním na Affí-Gel Blue koloně a absorpcí na E. coli specifických protilátek) ředěných 1/1000. Tuby byly inkubovány po dobu 20 minut při 37 °C, centrifugovány po dobu 1 minuty při 125 xg a erytrocyty byly vyšetřovány na aglutinaci pečlivým protřepáním a za použití lupy.

Při testování přečištěných Fab na aglutinaci byla afinitně přečištěna anti-Fab protilátka (The Binding Site, Birmingham, U.K.) použita místo králičí anti-fágové protilátky.

Tabulka 7 ukazuje výsledky hemaglutinačních testů Phab vzorků po různých kolech panorámování na R1R1 erytrocytech.

Tabulka 8 ukazuje výsledky hemaglutinačních testů Phab vzorků po různých kolech panorámování na Rhesus DVI1+ erytrocytech.

Tabulka 9 ukazuje charakter reaktivity jednotlivých Fab klonů z knihoven LD1 a LD s částečnými D variantami

-11 CZ 296807 B6

Tabulka 7 - Monitorování Phab zLDl a LD knihoven nepřímo hemaglutinací po panorámování na R1R1 erytrocytech

Phab vzorek kolo panorámování	Knihovna LD1 testováno na	Knihovna LD2 erytrocytech 0 Rh D+ ^<a>
č. 4
neředěný	+	+
1/4	+	±
1/20	-	-
Č. 5
neředěný		+
1/4	++	+
1/20		-
č. 6
neředěný	nd	+ + +
1/4	nd	+ +
1/20	nd	nd
Pomocný fág ’
neředěný, 1/4, 1/20	-	-

nepřímá hemaglutinace byla provedena ve skleněných trubičkách za použití 50 μΐ erytrocytů (40 x 10⁷/ml) a 100 μΐ Phab s počátkem při 4 x 10ⁿ/ml. Po 30 minutách při 37 °C byly erytrocyty promyty 3-krát a byly dále inkubovány po dobu 20 minut při 37 °C s králičí anti-fágovou protilátkou při ředění 1/1000.

^b) Aglutinace byla hodnocena vizuálně od +++ (silná aglutinace) do - (žádná aglutinace) . nd = neprovedeno

-12CZ 296807 B6

Tabulka 8- Monitorování Phab ze souboru LD1 a LD knihoven nepřímou hemaglutinací po panorámování na Rhesus DVI+ erytrocytech

Phab vzorek fenotypy erytrocytů

Kolo panorámování

	CCDDee ccddee	Ccddee	CCddEE	DVI (E. J.)	i DVI(K.S.)
Bromelasou	neošetřené
erytrocyty	DVI+
Kolo č. 3	^&)+++	±	( + )	±	+
Kolo č. 5	+ +	-	-	-	-
Bromelasou	ošetřené
erytrocyty	DVI +
Kolo č. 4	++ +	±	-	(+)	+
Kolo č. 5	+ + +	+	±	(+++)	+ +
Kolo č. 6	+ +++	-	-	+ + +	4-4- +
LD1-6-17
LD1/2-6-3	+ + + + —	-	-	±	nd
LD1/2-6-33	+ + + +	-	-	4-	nd

^a) Aglutinace byla hodnocena vizuálně od +++ (silná aglutinace) do - (žádná aglutinace) . nd = 5 neprovedeno.

Povšimněte si: Pouze ty Phab, které byly eluovány zbromelasou ošetřených DVI+ erytrocytů vykazovaly známky aglutinace proti 2 různých DVI+ dárcům.

-13 CZ 296807 B6

Tabulka 9 - Klonování analýzy reaktivita Fab anti-Rehesus D klonů z knihoven Dia LD2 pro částečným D variantám

^<a*⁵ Fab klon	č.	Částečné D varianty	DVII
Rh33	DIII	DIVa	DIVb	DVa	DVI
LD1 -	40		-	₊₊₊	4-	+	±	-	+ +
-	52		-	+ 4- +	-	-	++ +	-	+ + +
-	84		-	4-4-	-	-	-	-	+
-	110		( + )	4-4-4·	+ 4-	+	+	-	+ +
-	117		-	+ + +	-	-	-	-	++
LD2 -	1		+++	nd	4-4-4-	+ + +	+	-	+ + +
-	4		-	++ +	-	+	-	-	+
-	5		-	nd	+++	+++	-	-	+++
-	10		(-)	4-4-4-	4-4-4-	++ +	+	-	+ +
-	11		-	++ +	-	-	-	-	++
-	14		+++	4-4-4-	+ 4-4-	+ + +	++ +	-	+ + +
-	17		-	+++	+++	+	+	-	+++
-	20		-	+ + +	+ + +	-	±	-	+++
LD1/2	- 6 -	3	+ +	+++	+ 4 +	+ +	++ +	+	++
LD1/2	- 6 -	33	+	+ + +	+ + +	+ +	+ + +	+	++

^a) solubilní Fab přípravky byly vyrobeny z každého klonu a následovala nepřímá hemaglutinace ^b) Aglutinace byla hodnocena vizuálním hodnocením od +++ (všechny buňky aglutinovány ve shluku) do - (žádné buňky nejsou aglutinovány)

Příklad 5 - Příprava a přečištění Fab fragmentů protilátky pro použití jako diagnostická činidla

Po postupech biopanorámování podrobně popsaných v příkladech 2 a 3 byla fágová populace, která vykazovala specifickou aglutinaci na Rhesus D+ erytrocytech selektována a byla použita pro přípravu fagemidové DNA. Přesněji, Phab selektované na R1R1 erytrocytech byly použity po 5. a 6. kole biopanorámování pro LD1 a LD knihovny, v příslušném pořadí, a po 5. kole biopanorámování na DVI+ erytrocytech pro izolaci klonu LD 1-6-17. Pro produkci solubilního Fab musí být sekvence glll kódující plil koncový protein na fágové částici deletována.

Fagemidová DNA byla připravena za použití Nucleotrap kitu (Machery-Nagel) a glll sekvence byla odstraněna trávením takto izolované fagemidové DNA Nhel/Spel jak je popsáno (Burton, D.R. et al., PNAS, 1989). Po transformaci do XL-1 Blue byly jednotlivé klony selektovány (nomenklatura je uvedena v tabulce 1) a kultivovány v LB (Luna Broth) obsahujícím 50 pg/ml karbencilinu při 37 °C do OD 0,6 při 600 nm. Kultury byly inkubovány 2 mM isopropyl β-Dthiogalaktopyranosidu (IPTG) (Biofínex, Praroman, Switzerland) a byly kultivovány přes noc při 37 °C. Celá kultura byla centrifugována při 10 000 x g po dobu 30 minut při 4 °C pro peletování bakterií. Bakteriální peleta byla ošetřena roztokem lysozym/DNAsa pro uvolnění Fab fragmentů uvnitř buněk. Protože některé Fab fragmenty byly uvolněny do supernatantu kultury, byl super

-14CZ 296807 B6 natant odebrán zvlášť. Tyto Fab přípravky byly potom shromážděny a vysráženy 60% síranem amonným (Měrek, Darmstadt, Germany) pro koncentrování Fab a potom následovala extensivní dialýza ve fosfátem pufrovaném salinickém roztoku (PBS) a ultracentrifugace při 200 000 x g pro peletování jakýchkoliv nerozpustných komplexů. Fab přípravky byly potom přečištěny na keramické hydroxyapatitové koloně (HTP Econo cartridge, BioRad, Glattbrugg, Switzerland) za použití gradientově eluce PBS (pufr A) a PBS + 0,5 M NaCl (Pufr B). Lineární gradient byl programován na růst od 0 do 100 % pufru B ve 40 min. Fab byl eluován jako jediný pík mezi 40 až 60 % pufru B. Pozitivní frakce, jako byly identifikovány „imunodot“ testem za použití konjugátu anti-Fab peroxidasa (The Binding Site, Birmingham, U.K.) byly shromážděny, koncentrovány za použití polyethylenglykolu a extensivně dialyzovány proti PBS. Pozitivní frakce z hydroxyapatitové kolony pro každý klon byly použity v klasickém nepřímém hemaglutinačním testu ve skleněných trubičkách za použití buď standardního Coombsova činidla (Baxter Diagnostice AG Dade, anti-lidské sérum), nebo anti-Fab (The Binding Site, Birmingham, U.K.) jako činidla pro zkříženou vazbu. Tyto Fab definované specificity k částečným D variantám jak je ukázána na str. 25 mohou být použity pro typizaci erytrocytů neznámého částečného D fenotypu.

Příklad 6 - Konstrukce kompletních imunoglobulinových genů

V gen LD2-14 pro těžký řetězec (V_H gen) byl amplifikován z anti-Rhesus D-Fab-kódujícího plazmidu LD2-14 za použití polymerázové řetězové reakce (PCR) se specifickými primery.

5'-primer měl sekvenci:

5’-GGGTCGACGCACAGGTGAAACTGCTCGAGTCTGG-3’, zatímco 3' - primer měl sekvenci:

5’-GCCGATGTGTAAGGTGACCGTGGTCCCCTTG-3’.

PCR reakce byla proveden s Deep Vent DNA polymerázou a pufrovacím roztokem (2 mM Mg⁺⁺) od New England Biolabs za podmínek doporučených výrobcem včetně 100 pmol každého primeru a čtyřech deoxynukleotidů v koncentraci 250 μΜ každý. Reakce byla provedena při 30 cyklech s následujícími teplotními kroky: 60 s při 94 °C (prodlouženo o 2 minuty v průběhu prvního cyklu), 60 s při 57 °C a 60 s při 72 °C (prodlouženo o 10 minut v průběhu posledního cyklu). Postamplifikační adice 3' A-přesahujících konců byla provedena následnou inkubací po dobu 10 minut při 72 °C za přítomnosti 1 jednotky Taq DNA polymerázy (Boehringer Mannheim, Germany). PCR produkt byl přečištěn za použití QIAquick PCR purifikačního kitu (Qiagen, Switzerland) a byl klonován do vektoru pCRII za použití klonovacího kitu od Invitrogen (San Diego, USA). Po trávení vzniklého plazmidu TAVH14 Sall a BstEII byl izolován V_H gen za použití preparativní agarosové gelové elektroforesy za použití QIAquick gel extraction kitu od Qiagen.

Vektor č. 50 (Sandoz Pharma, Basel), který obsahoval irelevantní, ale intaktní lidský genomový imunoglobulinový V_H gen, byl tráven Sall a BstEII a vektorový fragment byl izolován preparativní agarosovou gelovou elektroforesou za použití QIAquick gel extraction kitu od Qiagen. Ligace vektoru a PCR produktu byla provedena při 25 °C po dobu 2 hodin v celkovém objemu 20 μΐ za použití rychlého DNA Ligation kitu (Boehringer Mannheim, Germany). Po ligaci byla reakční směs ředěna 20 μΐ H₂O a extrahována 10 objemy n-butanolu pro odstranění solí. DNA byla potom peletována centrifugací, sušena ve vakuu a resuspendována v 10 μΐ H₂O. 5 μΐ tohoto DNA roztoku bylo elektroporováno (0,1 cm kyvety, 1,9 kV, 200 Ω, 25 pFD) za použití GenePulser (BioRad, Gaithersburg) do 40 μΐ pro elektroporaci kompetentních E. coli XL-lblue MRF' (Stratagene, La Jolla), bylo provedeno ředění v SOC médiu, inkubace při 37 °C po dobu 1 hodiny a buňky byly umístěny na LB plotny obsahující ampicilin (50 pg/ml). Plazmidové mini

-15CZ 296807 B6 přípravky (Qiagen, Basel) vzniklých kolonií byly ověřeny restrikčními tráveními na přítomnosti požadovaného insertu.

Při tomto postupu byl irelevantní původní V_H gen ve vektoru č. 150 nahrazen amplifíkovanou anti-Rhesus D V_H sekvencí LD2-14 a byl získán plazmid cassVH14. Struktura vzniklého imunoglobulinového V_H genového konstruktu byla potvrzena sekvencováním, byl rozstřižen trávením EcoRI a BamHI a přečištěn na gelu jak je popsáno výše. Expresní vektor č. 10 (Sandoz Pharma, Basel) obsahující lidský genomový imunoglobulinový Cxl genový segment, byl také tráven EcoRI a BamHI, izolován preparativní agarosovou gelovou elektroforesou, ligován s EcoRI/BamHI-Vn genovým segmentem předem získaným z plazmidu cassVH14 a elektroporován do E. coli XLl-Blue MRF' jak bylo popsáno výše. Toto vedlo ke vzniku genu pro kompletní těžký řetězec anti-Rhesus D imunoglobulinu v expresním vektoru 14IgGl (obrázek a).

V gen LD2-14 pro lehký řetězec (V_L gen) byl amplifikován ze stejného anti-Rhesus D-Fab plazmidu LD2-14 PCR se specifickými primery. 5'-primer měl sekvenci:

5'-TACGCGTTGTGACATCGTGATGACCCAGTCTCCAT-3', zatímco 3' - primer měl sekvenci:

5'-AGTCGCTCAGTTCGTTTGATTTCAAGCTTGGTCC-3'.

PCR reakce, přečištění produktu a následující kroky klonování byly analogické s kroky popsanými pro V_H gen s tou výjimkou, že byly použity vhodné vektory pro lehlý řetězec. Stručně, V_LPCR produkt byl klonován do pCRH vektoru za vzniku plazmidu TAVL14, byl z něj excidován za použití Mlul a HindlII a byl izolován gelovou extrakcí. V_L gen byl potom klonován do Mlul a HindlII míst vektoru č. 151 (Sandoz Pharma, Basel) a tak nahradil irelevantní původní V_L gen amplifíkovanou anti-Rhesus D V_L sekvencí LD2-14. Po potvrzení sekvence vzniklého plazmidu cassVL-14 byl EcoRI/Xbal fragment obsahující V_L gen potom subklonován do restrikčních míst EcoRI a Xbal vektoru č. 98 (Sandoz Pharma, Basel), který obsahuje lidský genomový genový segment pro imunoglobulin C_K. Tento postup nahrazuje irelevantní původní V_L gen v plazmidu č. 98 a je získán expresní vektor 14 kappa, který obsahuje gen pro kompletní lehlý řetězec antiRhesus D imunoglobulinu.

Myší myelomová buněčná linie SP2/0-Ag 17 (ATCC CRL 1581) byla současně transfektována expresními vektory 14IgGl a 14 kappa předem linearizovaných v jedinečných EcoRI a Notl restrikčních místech, v příslušném pořadí. Elektroporace byla provedena následujícím způsobem: exponenciálně rostoucí buňky byly dvakrát promyty a suspendovány ve fosfátem pufrované sacharóze (272 mM sacharózy, 1 mM mgCl₂, 7 mM NaH₂PO₄, pH 7,4) v hustotě 2 x 10⁷ buněk na ml. 0,8 ml buněk bylo přidáno do 0,4 cm kyvet, smíseno s 15 pg linearizovaných plazmidů 14IgGl a 14 kappa, ponecháno na ledu po dobu 15 minut, elektroporováno za s 290 V, 200 Ω, 25 pFD, umístěno zpět na led na dobu 15 minut, přeneseno do buněčné kultivační nádoby T75 s20ml chladného RPMI 1640 média (10% teplem inaktivované fetální hovězí sérum, 50 pM beta-merkaptoethanolu), ponecháno po dobu 2 hodin při pokojové teplotě a potom inkubováno po dobu 60 hodin při 37 °C. Po této době byly buňky přeneseny do 50 ml media obsahujícího 1 mg/ml G418 pro selekci. Stabilní transfektanty byly potom selektovány za přítomnosti zvyšujících se koncentrací metotrexatu pro amplifíkaci integrované DNA a tak zvýšení exprese odpovídající protilátky rD2-14.

Exprese rD2-14 vsupematantu kultury (SrD2-14) byla sledována enzymově vázaným imunosorbentním testem (ELISA) specifickým pro lidské τΐ a kappa řetězce. Kvantifikace Rhesus D specifických imunoglobulinů v anti-D testu podle Ph. Eur. ukázala mezi 1,1 až 11,4 pg/ml aglutinační protilátky v takových supematentech. Byly testovány jako aglutinaci negativní pro Rhesus

-16CZ 296807 B6 negativní erytrocyty a vykazovaly stejný aglutinační potenciál proti částečným D variantám jako

Fab LD2-14 exprivované v E. coli. Data jsou ukázána v tabulce 10.

Tabulka 10- Srovnávací analýza reaktivity Fab anti-Rhesus D klonu LD2-14 a protilátky rD2-14 proti částečným D variantám

Částečné D varianty
	R1R1	rr	Rh33	DUI	DIVa	DIVb	DVa DVI	DVII
LD2-14	+ + +	-	+ + +	4 + +	4· + +	+ + +	+++	+++
SÍD2-14	++ +	-	+ 4 +	+ + +	+ + +	+++	+-Í +	++ +
TCB	-	-

Aglutinace byla hodnocena vizuálním hodnocením od +++ (všechny buňky aglutinovány ve shluku) do - (žádné buňky nejsou aglutinovány).

LD2-14: Fab fragment připravený jak je popsáno v příkladu 5;

SrD2-14: supematant buněčné kultury obsahující protilátku rD2-14;

TCB: supematant buněčné kultury netransfektovaných buněk.

-17CZ 296807 B6

1. Polypeptidy schopné tvorby vazebných struktur pro antigen se specificitou pro Rhesus

D antigeny, které obsahují Rhesus D-specifické CDR1, CDR2 a CDR3 regiony párů aminokyselinových sekvencí V_H a V_L se stejnými nebo odlišnými identifikačními čísly podle obrázků v tabulce uvedené dále:

PATENTOVÉ NÁROKY

	v_H	v_L
Identifikační číslo	Obr. CDR1 CDR2 CDR3 páry páry páry bází č. ba'zí č. bází č.	Obr. CDR1 CDR2 CDR3 páry páry páry bází č. bází č. bází č.
LD1-40	Obr.la 91-105 148-198 295-342	Obr.lb 64-96 142-162 259-288
LD1-52	Obr.2a 91-105 148-198 295-342	Obr.2b 64-96 142-162 259-288
LD1-84	Obr.3a 91-105 148-198 295-342	Obr.3b 64-96 142-162 259-285
LD1-110	Obr.4a 91-105 148-198 295-342	Obr.4b 64-96 142-162 259-285
LD1-117	Obr.Sa 91-105 148-198 295-345	Obr.5b 64-96 142-162 259-288
LD2-1	Obr.6a 91-105 148-198 295-342	Obr.6b 64-99 142-165 262-294
LD2-4	Obr.7a 91-105 148-198 295-342	Obr.7b 64-96 142-162 259-282
LD2-5	Obr.8a 91-105 148-198 295-342	Obr.8b 64-96 142-162 259-288
LD2-10	Obr.9a 91-105 148-198 298-345	Obr.9b 61-102 148-168 265-294
LD2-11	Obr.lOa 91-105 148-198 295-342	Obr. 10b 64-96 142-162 259-285
LD2-14	Obr.11a 91-105 148-198 295-342	Obr. 11b 64-96 142-162 259-285
LD2-17	Obr.12a 91-105 148-198 295-342	Obr.12b 64-96 142-162 259-285
LD2-20	Obr.13a 91-105 148-198 295-342	Obr. 13b 64-96 142-162 259-285
LD1-6-17	Obr.14a 91-105 148-198 295-351	Obr. 14b 64-96 142-162 259-285
LD1/2-6-3	Obr.15a 91-105 148-198 295-342	Obr. 15b 64-96 142-162 259-285
LD 1/2-6- 33	Obr.16a 91-105 148-198 295-342	Obr.16b 64-96 142-162 259-285

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

2. Polypeptidy podle nároku 1, které obsahují Rhesus D-specifické CDR1, CDR2 a CDR3

10 regiony párů aminokyselinových sekvencí V_H a V_L se stejnými identifikačními čísly podle obrázků uvedených v tabulce podle nároku 1.
3. Polypeptidy podle nároku 1, které obsahují regiony s aminokyselinovými sekvencemi V_Ha V_L a mají identifikační čísla podle obrázků uvedených v tabulce podle nároku 1.
4. Polypeptidy podle nároků 1, 2 nebo 3, které jsou Fab fragmenty vážící antigen.

-18 CZ 296807 B6
5. Polypeptidy podle nároků 1, 2 nebo 3 obsahující těžké a lehké imunoglobulinové řetězce schopné tvorby kompletních anti-Rhesus D protilátek.

5

6. DNA sekvence kódující polypeptidy schopné tvorby vazebných struktur pro antigen se specifícitou pro Rhesus D antigeny, které obsahují regiony s Rhesus D-specifickými CDR1, CDR2 a CDR3 segmenty párů DNA sekvencí V_H a V_L se stejnými nebo odlišnými identifikačními čísly podle obrázků uvedených v tabulce uvedené dále:

v_H v_L Identifikační číslo Obr. CDR1 CDR2 CDR3 páry páry páry baží č. bází č. bází č. Obr. CDR1 CDR2 CDR3 páry páry páry bází č. baží č. bází č. LD1-40 Obr.la 91-105 148-198 295-342 Obr.lb 64-96 142-162 259-288 LD1-52 Obr.2a 91-105 148-198 295-342 Obr.2b 64-96 142-162 259-288 LD1-84 Obr.3a 91-105 148-198 295-342 Obr.3b 64-96 142-162 259-285 LD1-110 Obr.4a 91-105 148-198 295-342 Obr.4b 64-96 142-162 259-285 LD1-117 Obr.5a 91 -105 148-198 295-345 Obr.5b 64-96 142-162 259-288 LD2-1 Obr.óa 91-105 148-198 295-342 Obr.6b 64-99 142-165 262-294 LD2-4 Obr.7a 91-105 148-198 295-342 Obr.7b 64-96 142-162 259-282 LD2-5 Obr.8a 91-105 148-198 295-342 Obr.8b 64-96 142-162 259-288 LD2-10 Obr.9a 91-105 148-198 298-345 Obr.9b 61-102 148-168 265-294 LD2-11 Obr.lOa 91-105 148-198 295-342 Obr. 10b 64-96 142-162 259-285 LD2-14 Obr.lla91-105 148-198 295-342 Obr.llb 64-96 142-162 259-285 LD2-17 Obr.l2a91-105 148-198 295-342 Obr.l2b 64-96 142-162 259-285 LD2-20 Obr.l3a91-105 148-198 295-342 Obr. 13b 64-96 142-162 259-285 LD1-6-17 Obr.l4a91-105 148-198 295-351 Obr.l4b 64-96 142-162 259-285 LD 1/2-6-3 Obr.l5a 91-105 148-198 295-342 Obr. 15b 64-96 142-162 259-285 LD1/2- -6-33 Obr. 16a 91-105 148-198 295-342 Obr. 16b 64-96 142-162 259-285

7. DNA sekvence podle nároku 6 kódující polypeptidy schopné tvorby vazebných struktur pro antigen se specificitou pro Rhesus D antigeny, které obsahují regiony s Rhesus D-specifickými CDR1, CDR2 a CDR3 segmenty párů DNA sekvencí V_H a V_L se stejnými identifikačními čísly podle obrázků uvedených v nároku 6.
8. DNA sekvence podle nároku 6 nebo 7, které obsahují regiony s DNA sekvencemi V_H a V_Ls identifikačními čísly podle obrázků uvedených v nároku 6.

-19CZ 296807 B6
9. DNA sekvence podle nároků 6, 7 nebo 8 kódující polypeptidy schopné tvorby Fab fragmentů vážících antigen.
10. DNA sekvence podle nároků 6, 7 nebo 8 kódující polypeptidy schopné tvorby kompletních anti-Rhesus D protilátek.
11. Způsob pro selekci rekombinantních polypeptidů schopných tvorby vazebných struktur pro antigen se specifitou pro Rhesus D antigeny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5 a zejména vykazujících reaktivitu s částečnými Rhesus DVI variantami a bez známek reaktivity s erytrocyty Rhesus negativního fenotypu, zejména bez reaktivity proti Rhesus alelám C, c, E, a e, vy znáčů j í c í se tím, že:

a) se provede několik negativních absorpcí na následujících erytrocytech: fenotyp 1 (r'r, Ccddee) ošetřený bromelasou, fenotyp 1 neošetřený bromelasou, fenotyp 2 (ryry, CCddEE) ošetřený bromelasou a fenotyp 2 neošetřený bromelasou,

b) se provede pozitivní absorpce na DVI+ erytrocytech s nebo bez ošetření bromelasou,

c) se určí titr fágu vážícího se na DVI+ erytrocyty,

d) se opakuje krok a), b) a c), dokud titr fágu vážícího se na DVI+ erytrocyty nedosáhne uspokojivé hladiny.
12. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že se jako rekombinantní polypeptidy schopné tvorby vazebných struktur pro antigen použijí Fab fragmenty.

-20CZ 296807 B6

13. Anti-Rhesus D protilátky mající variabilní regiony těžkého a lehkého řetězce obsahující

Rhesus D-specifické CDR1, CDR2 a CDR3 sekvence párů aminokyselinových sekvencí V_H a V_L mající stejná nebo odlišná identifikační čísla podle tabulky uvedené dále:

VH v_L Identifikační číslo Obr. CDR1 CDR2 CDR3 páry páry páry bází č. bází č. bází č. Obr. CDR1 CDR2 CDR3 páry páry páry bází č. bází č. bází č. LD1-40 Obr. 1a 91-105 148-198 295-342 Obr.lb 64-96 142-162 259-288 LD1-52 Obr.2a 91-105 148-198 295-342 Obr.2b 64-96 142-162 259-288 LD1-84 Obr.3a 91-105148-198 295-342 Obr.3b 64-96 142-162 259-285 LD1-110 Obr.4a 91-105 148-198 295-342 Obr.4b 64-96 142-162 259-285 LD1-117 Obr.5a 91-105 148-198 295-345 Obr.5b 64-96 142-162 259-288 LD2-1 Obr.6a 91-105 148-198 295-342 Obr.6b 64-99 142-165 262-294 LD2-4 Obr.7a 91-105 148-198 295-342 Obr.7b 64-96 142-162 259-282 LD2-5 Obr.8a 91-105 148-198 295-342 Obr.8b 64-96 142-162 259-288 LD2-10 Obr.9a 91-105 148-198 298-345 Obr.9b 61-102 148-168 265-294 LD2-11 Obr.lOa 91-105 148-198 295-342 Obr. 10b 64-96 142-162 259-285 LD2-14 Obr.11a 91-105 148-198 295-342 Obr.11b 64-96 142-162 259-285 LD2-17 Obr. 12a 91-105 148-198 295-342 Obr. 12b 64-96 142-162 259-285 LD2-20 Obr.13a 91-105 148-198 295-342 Obr. 13b 64-96 142-162 259-285 LD1-6-17 Obr.14a 91-105 148-198 295-351 Obr. 14b 64-96 142-162 259-285 LD1/2-6-3 Obr.15a 91-105 148-198 295-342 Obr. 15b 64-96 142-162 259-285 LD1/2- -6-33 Obr.16a 91-105 148-198 295-342 Obr.16b 64-96 142-162 259-285

5

14. Anti-Rhesus D protilátky mající variabilní regiony těžkého a lehkého řetězce obsahující

Rhesus D-specifícké CDR1, CDR2 a CDR3 sekvence párů aminokyselinových sekvencí V_H a V] mající stejná identifikační čísla podle tabulky uvedené v nároku 13.
15. Anti-Rhesus D protilátky podle nároku 13 nebo 14, které obsahují páry aminokyselinových ío sekvencí V_H a V_L mající identifikační čísla podle obrázků, jak jsou uvedeny v tabulce v nároku 13.
16. Anti-Rhesus D protilátky podle nároků 13, 14 nebo 15, kde jsou imunoglobulinové konstantní regiony alespoň jeden z definovaných izotypů IgGl, IgG2, IgG3 nebo IgG4.

-21 CZ 296807 B6
17. Způsob pro přípravu kompletních anti-Rhesus D protilátek podle jakéhokoliv z nároků 13 až 16, vy z n a č u j í c í se tím, že:

a) se odděleně amplifikují členy páru V genového segmentu těžkého řetězce a V genového segmentu lehkého řetězce obsahující Rhesus D-specifické CDR1, CDR2 a CDR3 regiony jak jsou znázorněny na obr. la - 16a a lb - 16b, v příslušném pořadí, z anti-Rhesus D-Fab-kódujícího plazmidů pomocí polymerázové řetězové reakce se specifickýmiprimery,

b) se odděleně připraví geny pro kompletní těžký řetězec anti-Rhesus D imunoglobulinu a pro kompletní lehký řetězec anti-Rhesus D imunoglobulinu ve vhodných plazmidech obsahujících genové segmenty pro konstantní region imunoglobulinu kódující jeden z lidských 1, 2, 3 a 4 těžkých řetězců a pro lidský kappa nebo lambda lehký řetězec a transformaci získaných plazmidů jednotlivě ve vhodných bakteriích E. coli, a

c) se současně transfekují získané plazmidy do vhodných eukaryotických hostitelských buněk, buňky se kultivují, separují se netransformované buňky, kultury se klonují, selektují se nejlépe produkující klon, použije se jako produkční kultury a izolují se kompletní protilátky ze supematantu buněčné kultury.
18. Farmaceutický prostředek pro profylaxi hemolytické choroby novorozenců, pro léčbu idiopatické trombocytopenické purpury a chybné transfuze Rhesus inkompatibilní krve, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden polypeptid podle nároků 1, 2 nebo 3 nebo alespoň jeden anti-Rhesus D protilátku podle jakéhokoliv z nároků 13 až 16.
19. Diagnostický prostředek pro Rhesus D typizaci, vyznačující se tím, že obsahuje Fab fragmenty podle nároku 4 nebo anti-Rhesus D protilátky podle jakéhokoliv z nároků 13 až 16.

70 sekvencí +

34 výkresů

-22CZ 296807 B6

Seznam sekvencí (1) Obecné informace:

(i) Přihlašovatel:

(A) Jméno: Rotkreuzstif tung Zentrallaboratorium

Blutspeňdedienst (B) Ulice: Wankdorfstrasse 10 (C) Město-. Bern 22 (E) Stát: Švýcarsko (F) Poštovní kod (ZIP): CB-3000 (ii) Název vynálezu: Polypeptidy schopné tvorby vazebných struktur pro antigen se specificitou pro Rhesus D antigeny, DNA kódující takové polypeptidy a způsob pro jejich přípravu a použití (iii) Počet sekvencí: 64 (iv) Počítačová čtecí forma:

(A) Typ media: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release #1.0, verse #1.30 (EPO) (v) Údaje o současné přihlášce:

(A) Číslo přihlášky: PCT/EP97/03253 (vi) Předchozí data přihlášky:

(A) Číslo přihlášky: EP 96810421.6 (B) Datum podání: 24.6.1996 (2) Informace pro SEQ ID NO: 1:

(i) Charakteristiky sekyence:

(A) Délka: 375 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetická: Ne (iv) Antisense: Ne