PT1597280E

PT1597280E - Produção de anticorpo monoclonal através da transformação de células b pelo ebv

Info

Publication number: PT1597280E
Application number: PT04714866T
Authority: PT
Inventors: Antonio Lanzavecchia
Original assignee: Inst Research In Biomedicine
Priority date: 2003-02-26
Filing date: 2004-02-26
Publication date: 2012-08-03
Also published as: US9290786B2; GB0318431D0; US20120027768A1; SG181999A1; DK1597280T4; ATE556091T2; IL183370A; ES2389930T5; GB2398783A; US20100021470A1; US20180327800A1; US8071371B2; HUE015415T5; EP2298804A3; DK1597280T3; ES2389930T3; EP2298804A2; US20160160258A1; IL183370A0; US20140004123A1

Description

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DESCRIÇÃO

"PRODUÇÃO DE ANTICORPO MONOCLONAL ATRAVÉS DA TRANSFORMAÇÃO DE CÉLULAS B PELO EBV"

CAMPO TÉCNICO

Esta invenção refere-se a um método para preparar células B de memória imortalizadas e a um método para preparar células B de memória imortalizadas capazes de produzir um anticorpo monoclonal com uma especificidade do antigénio desejada. A invenção é particularmente útil para preparar anticorpos monoclonais humanos. Numa modalidade, a invenção refere-se a um método para preparar células B de memória humanas imortalizadas capazes de produzir anticorpos específicos para um agente infeccioso, mais particularmente onde o agente infeccioso é o vírus da síndrome respiratório agudo severo (SARS). São descritas a seguir modalidades adicionais.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 sucesso em gerar anticorpos monoclonais murinos reside na fusão eficiente e seletiva de blastos de célula B estimulados com antigénio com uma linha de células de mieloma de murino seguido da seleção de híbridos produtores de anticorpo estáveis (Kohler e Milstein 1975). 0 documento FR2817875 descreve uma versão modificada deste protocolo onde antes da imortalização, os linfócitos B são induzidos para se diferenciarem por um sistema de ativação não específico e uma citocina. Os blastos de célula B podem ser tomados do baço ou dos nódulos linfáticos. Contudo, a dificuldade em obter blastos de célula B estimulados com antigénio e a ausência de parceiros de fusão adequados tem dificultado esta abordagem no sistema humano.

Como uma abordagem alternativa para fabricar anticorpos humanos, o vírus de Epstein Barr (EBV) tem sido utilizado para imortalizar células B humanas (e de primata) 2 que produzem anticorpos específicos. 0 método do EBV tem sido descrito em várias publicações desde 1977 (Rosen et al. 1977; Steinitz et al. 1977; Steinitz et al. 1980;

Kozbor e Roder 1981; Lundgren et al. 1983; Rosen et al. 1983; Steinitz et al. 1984; Lanzavecchia 1985). As células B são imortalizadas por infeção com EBV e os clones em crescimento que secretam anticorpos específicos são selecionados. O método não requer estímulo antigénico, uma vez que o EBV imortaliza também células B humanas em repouso. Contudo, o método baseado no EBV tem várias limitações, nomeadamente a baixa eficiência de imortalização, a baixa eficiência de clonagem das células B imortalizadas pelo EBV, a baixa taxa de crescimento e, em alguns casos, a baixa produção de anticorpo. O documento US4997764 descreve um método de melhorar a taxa de crescimento das células imortalizadas pelo EBV compreendendo transfetar células B infetadas com EBV com c-myc ADN ativado. Isto confere às células a capacidade de crescer em meios semi-sólidos e de crescer em hospedeiros tais como ratazanas e ratinhos. O documento WO95/13089 descreve a utilização de GM-CSF e IL-3 para estimular a libertação de anticorpo pelas células B. Bornkamm et al. (documento US5798230) ultrapassaram o problema da baixa produção de anticorpos desativando EBNA2. Contudo, isto não resolve o problema da baixa eficiência de imortalização. Para contornar estes problemas alguns autores realizaram um enriquecimento para as células B específicas de antigénio antes da imortalização pelo EBV utilizando, por exemplo, antigénios solúveis biotinilados (Casali et al. 1986). Outros propuseram a fusão das células imortalizadas pelo EBV com mielomas de ratinho ou heteromielomas de humano-ratinho para explorar a taxa de crescimento mais elevada e a secreção de Ig pelos híbridos (Kozbor et al. 1982; Bron et al. 1984; Thompson et al. 1986) . As reivindicações de que a eficiência de clonagem poderia ser aumentada por 3 fatores de crescimento derivados da célula, tais como tioredoxina, foram feitas numa publicação (Ifversen et al. 1993) , mas estes resultados nunca foram nem confirmados nem utilizados, mesmo pelos próprios autores. Concluindo, apesar do método do EBV ter, em principio, algumas vantagens, foi abandonado devido à baixa eficiência de imortalização e clonagem.

Outra razão pela gual o método do EBV se tornou obsoleto é que abordagens alternativas para fabricar anticorpos monoclonais humanos ou parecidos com humanos foram disponibilizadas pela engenharia genética. Estas incluem a humanização de anticorpos murinos, o isolamento de anticorpos de bibliotecas de diferente complexidade e a produção de hibridomas utilizando o método clássico em ratinhos transgénicos para locais da Ig humana (os "xeno-mouse"). A literatura sobre estas abordagens alternativas não é revista aqui uma vez que não é diretamente relevante para a presente invenção. Contudo, vale a pena considerar algumas limitações destes métodos. A humanização de anticorpos monoclonais murinos é um procedimento laborioso e incompleto. Bibliotecas de anticorpo aleatórias representam um repertório imparcial e podem, por isso, ser utilizadas para selecionar especificidades de anticorpo contra antigénios altamente conservados, mas conduzir a anticorpos de baixa afinidade. As bibliotecas selecionadas das células B apetrechadas com antigénio são enriquecidas para uma especificidade particular, mas não preservam o emparelhamento VH-VL original e geralmente conduzem a anticorpos que têm uma afinidade inferior para o antigénio do que aqueles presentes no repertório do anticorpo original. 0 impacto desta tecnologia tem sido limitado. Por oposição, o ratinho transgénico xeno-mouse pode ser eficientemente imunizado contra um antigénio de eleição (especialmente se este é um antigénio humano) , mas este sistema partilha com a tecnologia clássica do hibridoma 4 murino a limitação de que os anticorpos são selecionados numa espécie que não a humana. Assim, estes métodos não são adequados para produzir anticorpos com as caracteristicas daqueles produzidos no decorrer de uma resposta imune humana fisiológica. Isto aplica-se à resposta do anticorpo aos patogénicos humanos incluindo o HIV, as quatro espécies de Plasmodium que causam a malária em humanos (P. falciparum, P. vivax, P. malariae e P. ovale), virus da hepatite B e C humana, virus do sarampo, virus do Ébola etc. (para uma lista exaustiva ver Fields et al. 1996). Também se aplica a respostas de anticorpo a alergénicos ambientais gerados em pacientes alérgicos, a antigénios tumorais gerados em pacientes com tumores e a auto-antigénios em pacientes com doenças auto-imunes.

Existe, portanto, uma necessidade de um método eficiente de produção de anticorpos monoclonais humanos que foram selecionados no decorrer da resposta imune natural. DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Enquanto a presente invenção é ilustrada por modalidades onde anticorpos monoclonais humanos são produzidos, as técnicas descritas aqui não são tão limitadas. A presente invenção pode ser utilizada para qualquer espécie para a qual é desejado produzir anticorpos monoclonais eficientemente. A invenção é baseada na descoberta que um ativador policlonal de célula B (tal como sequências CpG) aumenta a eficiência da imortalização pelo EBV e da clonagem de células imortalizadas pelo EBV. Esta eficiência aumentada representa um salto significativo que torna a técnica do EBV adequada para o isolamento rápido de grandes números de anticorpos monoclonais humanos do repertório de memória sem necessidade de imunização ou impulso especifico. Os anticorpos são selecionados a partir do ambiente fisiológico imunocompetente estimulado por contacto natural com um patogénico ou antigénio. 0 método é, portanto, 5 particularmente útil para produzir anticorpos contra determinantes antigénicos que são especificamente reconhecidos pelo sistema imune humano. Estes incluem neutralizar anticorpos a patogénicos humanos e anticorpos a alergénicos, antigénios tumorais, auto-antigénios e alo-antigénios que são parte do repertório de memória de um dado indivíduo. Não existe, portanto, nenhuma necessidade para criar modelos de doença ou para imunização com antigénios purificados. Os anticorpos produzidos também são inteiramente humanos (incluindo modificações pós-traducionais nativas quando expressas em células B) e exploram toda a diversidade gerada no decorrer de uma resposta imune humana (maturação da afinidade). Assim, a invenção providencia, entre outras coisas, um método para produzir linfócitos B de memória humana imortalizados, compreendendo a etapa de transformar linfócitos B de memória humanos utilizando o vírus de Epstein Barr (EBV) na presença de um ativador policlonal de célula B. 0 método permite pela primeira vez uma transformação com uma eficiência extremamente elevada.

Num aspeto adicional, a invenção providencia um método para produzir um clone de um linfócito B de memória humano imortalizado capaz de produzir um anticorpo monoclonal humano com uma especificidade do antigénio desejada, compreendendo as etapas de: (i) transformar uma população de células compreendendo ou consistindo em linfócitos B de memória humanos com vírus de Epstein Barr (EBV) na presença de um ativador policlonal de célula B; (ii) classificar o sobrenadante da cultura de acordo com a especificidade do antigénio; e (iii) isolar um clone de linfócito B de memória humano imortalizado capaz de produzir um anticorpo monoclonal humano com a especificidade do antigénio desejada. 6

Os métodos da invenção já foram utilizados para clonar linfócito B de memória humano com uma eficiência de até 100%. Os clones de célula B transformados pelo EBV que produzem anticorpos IgG neutralizadores específicos para o vírus do sarampo, as espécies de Plasmodium que causam a malária em humanos, toxóide tetânico, Toxoplasma gondii e alo-antigénios foram produzidos utilizando este procedimento. Além disso, os clones de célula B transformados pelo EBV que produzem anticorpos IgG neutralizadores específicos para o coronavírus da SARS (CoV) também foram produzidos. Será apreciado que o método pode ser transferido e utilizado para a produção de anticorpos contra qualquer especificidade que está presente no repertório de memória humano. A emergência súbita da SARS em 2002 na China causou centenas de mortes em vários de países. O agente causador foi desconhecido e como tal não existia cura disponível. Desde então foi descoberto que a síndrome é causada por um novo tipo de coronavírus (Drosten et al. 2003; Ksiazek et al. 2003) e métodos para detetar este vírus e combater infeções causadas por ele são necessários.

Existe um método descrito para produzir um clone do linfócito B de memória humano imortalizado capaz de produzir um anticorpo monoclonal humano específico para o vírus da SARS, compreendendo as etapas de: (i) transformar uma população de células compreendendo ou consistindo em linfócitos B de memória humanos com vírus de Epstein Barr (EBV) na presença de um ativador policlonal de célula B, (ii) classificar o sobrenadante da cultura de acordo com especificidade para o vírus da SARS, e (iii) isolar um clone de linfócito B de memória humano imortalizado capaz de produzir um anticorpo monoclonal humano com especificidade para o vírus da SARS. 7

Nesta especificação, o termo "anticorpo com especificidade para o vírus da SARS" significa que uma molécula de anticorpo se liga ao coronavírus que é o agente causador da SARS com uma afinidade superior comparada com a sua afinidade de ligação a outros vírus.

Em geral, a invenção também providencia um método para produzir linfócitos B de memória humanos imortalizados, compreendendo uma etapa de transformar uma população de linfócitos B de memória humanos, em que o método transforma ^n% dos linfócitos B de memória humanos na população. 0 valor de n é selecionado de 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 e 100. Depois das células imortalizadas serem produzidas estas podem ser classificadas para selecionar células que produzem anticorpos com uma especificidade desejada. As células selecionadas podem depois ser utilizadas para a produção de anticorpo monoclonal. Este método não envolve preferencialmente fusão celular dos linfóctios B de memória com outras células. Ativadores policlonais

Nesta especificação, o termo "ativador policlonal" significa uma molécula ou composto ou uma combinação dos mesmos que ativa linfócitos B independentemente da sua especificidade antigénica.

Receptores tipo Toll (TLR) são receptores de reconhecimento de padrão do sistema imune inato expressos numa variedade de células incluindo células dendríticas e células B (Medzhitov e Janeway 2000, 2002) . Os agonistas dos TLR incluem produtos microbianos e compostos sintéticos. Ativadores policlonais preferidos são agonistas dos Receptores tipo Toll que são expressos em células B de memória, tais como TLR-7, TLR-9 e TLR-10 (Bernasconi et al. 2003). Tais moléculas podem ser de origem microbiana ou celular ou sintéticas.

Os oligonucleot ídeos de ADN não metilados (CpG) são agonistas do TLR-9. Eles estimulam a maturação da célula dendrítica e ativam a proliferação e diferenciação da célula B de forma policlonal, isto é, independentemente da especificidade do anticorpo (Krieg et al. 1995; Krieg 2002). O efeito biológico do CpG é dependente de sequências especificas e modificações químicas (Krieg 2002). Os oligonucleotídeos CpG podem ser utilizados como ativadores policlonais, e exemplos de ativadores adquados são CpG, tais como CpG 2006 (5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3'; Hartmann et al. 2000) e outras sequências de oligonucleotídeo que despoletam TLR-9. Por "CpG" entende-se sequências de oligonucleotídeos de ADN não metiladas. Mais particularmente, o termo "CpG" inclui moléculas de ADN de cadeia simples de entre 5 e 100 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, 10-80, 20-70, 30-60 nucleotídeos) que incluem um ou mais exemplos (por exemplo, 2, 4, 6, 8, 10 ou mais) da sequência dinucleotídica CG, com o C no dinucleotídeo (s) a ser não metilado.

Os compostos imidazoquinolina, tais como R-848 (resiquimod), despoletam TLR-7 e TLR-8 e estimulam a maturação da célula dendrítica (Hemmi et al. 2002). Tais compostos podem ser utilizados como ativadores policlonais com a invenção, por exemplo R-848 (e os seus análogos) e outros compostos sintéticos que despoletam TLR-7 e TLR-8, incluindo, mas não limitado a: imiquimod, loxoribina, e análogos da guanosina (por exemplo, 7-tia-8-oxoguanosina e 7-desazaguanosina).

Outros ativadores policlonais incluem outros agonistas dos TLR e de outros receptores de reconhecimento de padrão (PRR) que são expressos em células B de memória, incluindo anticorpos monoclonais específicos para TLR.

Ativadores policlonais podem também incluir PAMP (padrões moleculares associados a patogénicos), tais como lipopolissacarídeo (LPS), peptidoglicanos, flagelinas, zimosanos e outros componentes da parede celular encontrados em patogénicos. Outros ativadores policlonais 9 disponíveis incluem loxoribina, Acholeplasma ladilawii morta por calor, Listeria monocytogenes morta por calor, ácidos lipoteicóicos, lipopeptídeos tripalmitoilados (por exemplo, Pam 3 CSK4), ARN de cadeia simples (Diebold et al. 2004; Heil et al. 2004), ARN de cadeia dupla, poli(I:C), ADN bacterianos, etc. Uma lista detalhada dos agonistas do TLR pode ser encontrada em Takeda et al. (2003) . Alguns ativadores não são preferidos para utilização com células B humanas, por exemplo, LPS.

Num aspeto particularmente preferido, CpG 2006 é utilizado como o activator policlonal.

Fornecedores comerciais de ativadores policlonais adequados incluem Invivogen.

Recentemente foi demonstrado que as células B de memória humanas são seletivamente estimuladas por CpG (Bernasconi et al. 2002), e que vários TLR são

seletivamente expressos em células B de memória humanas mas não em células B ingénuas (Bernasconi et al. 2003). Transformação das células B

Em métodos da invenção, as células podem ser transformadas com EBV na presença de um ativador policlonal da célula B. A transformação com EBV é uma técnica padrão e pode facilmente ser adaptada para incluir ativadores policlonais de célula B.

Estimulantes adicionais do crescimento e diferenciação celular podem ser adicionados durante a etapa de transformação para aumentar ainda mais a eficiência. Estes estimulantes podem ser citocinas tais como IL-2 e IL-15. Num aspeto particularmente preferido, IL-2 é adicionada durante a etapa de imortalização para melhorar mais a eficiência da imortalização, mas a sua utilização não é essencial.

As células B de memória a ser transformadas podem vir de várias fontes (por exemplo, do sangue inteiro, de células sanguíneas mononucleares periféricas (PBMC), de 10 cultura sanguínea, da medula óssea, de orgãos, etc.)λ e métodos adequados para obter células B humanas são bem conhecidos na arte. Amostras podem incluir células que não são células B de memória, por exemplo, outras células sanguíneas. Uma subpopulação específica de linfócito B de memória humano que exibe uma especificidade do antigénio desejada pode ser selecionada antes da etapa de transformação utilizando métodos conhecidos na arte. Numa modalidade a subpopulação de linfócito B de memória humana pode ter especificidade para o vírus da SARS por exemplo, as células B podem ser retiradas de um paciente que padece ou está a recuperar da SARS. Noutra modalidade, as células B podem ser retiradas de sujeitos com doença de Alzheimer e incluir células B com especificidade para β-amiloide (por exemplo, Hock et al. (2002) Nature Medicine 8:1270-75;

Mattson e Chan (2003) Science 301:1847-9; etc.). Classificação e isolamento das células B

As células B transformadas são classificadas para aquelas que têm a especificidade do antigénio desejada, e os clones de célula B individuais podem depois ser produzidos a partir das células positivas. A etapa de classificação pode ser realizada através de ELISA, corando os tecidos ou células (incluindo células transfetadas), um ensaio de neutralização ou um de um número de outros métodos conhecidos na arte para identificar a especificidade do antigénio desejada. O ensaio pode selecionar com base no simples reconhecimento do antigénio, ou pode selecionar com base ainda numa função desejada, por exemplo, selecionar anticorpos neutralizadores em vez de apenas anticorpos que se ligam a antigénio, selecionar anticorpos que podem alterar as características das células alvo, tais como a sua cascata sinalizadora, a sua forma, a sua taxa de crescimento, a sua capacidade de influenciar outras células, a sua resposta à influência por outras células ou por outros reagentes ou 11 por uma alteração nas condições, o seu estado de diferenciação, etc. A etapa de clonagem para separar clones individuais da mistura de células positivas pode ser realizada utilizando diluição limitante, micromanipulação, deposição celular única filtrando a célula ou outro método conhecido na arte. Preferencialmente a clonagem é realizada utilizando diluição limitante.

Os métodos da invenção produzem células B imortalizadas que produzem anticorpos com uma especificidade do antigénio desejada. A invenção providencia, assim, um clone de célula B imortalizada obtenível ou obtido pelos métodos da invenção. Estas células B podem ser utilizadas de várias maneiras, por exemplo, como uma fonte de anticorpos monoclonais, como uma fonte de ácido nucleico (ADN ou ARNm) que codifica um anticorpo monoclonal de interesse, para entrega a pacientes para terapêutica celular, para investigação, etc.

Existe uma composição descrita compreendendo linfócitos B de memória imortalizados, em que os linfócitos produzem anticorpos, e em que os anticorpos são produzidos a Ú10N ng por clone por dia. Existe também uma composição descrita compreendendo clones de um linfócito B de memória imortalizado, em que os clones produzem um anticorpo monoclonal de interesse, e em que o anticorpo é produzido a >10N ng por clone por dia. 0 valor de N é selecionado de -3, -2, -1, 0, 1, 2, 3 ou 4.

Anticorpos

Existe descrito um anticorpo monoclonal obtenível ou obtido de clones de célula B utilizados no método da invenção, e fragmentos destes anticorpos monoclonais, particularmente fragmentos que retêm a atividade de ligação ao antigénio dos anticorpos.

Em geral, estes anticorpos pertencem a duas categorias: reconhecem ou auto-antigénios ou não auto- 12 antigénios. Anticorpos que reconhecem auto-antigénios podem ser utilizados para tratar doenças causadas por expressão génica aberrante, incluindo cancros, e por processamento de proteína aberrante, incluindo doença de Alzheimer. Anticorpos que reconhecem não auto-antigénios podem ser utilizados para tratar doenças infeciosas, incluindo infeções parasíticas, virais e bacterianas. A invenção pode providenciar com vantagem anticorpos humanos que reconhecem antigénios de interesse onde não foi previamente possível.

Os métodos da invenção produzem anticorpos com as características daqueles produzidos no decorrer de uma resposta imune fisiológica humana, isto é, especificidades de anticorpo que apenas podem ser selecionadas pelo sistema imune humano. Isto aplica-se à resposta a patogénicos humanos incluindo HIV, as espécies de Plasmodium que causam a malária humana, vírus das hepatites B e C humanas, vírus do sarampo, vírus do Ébola, vírus da SARS, vírus vaccinia, Bunyaviridae, Arenaviridae, Bornaviridae, Reoviridae (incluindo rotavírus e orbivírus), Retroviridae (incluindo HTLV-I, HTLV-II, HIV-1, HIV-2), Polyomaviridae, Papillomaviridae, Adenoviridae, Parvoviridae, Herpesviridae (incluindo vírus do herpes simples 1 e 2, citomegalovírus, vírus da varicela-zóster, herpesvírus 6A, 6B e 7), Poxviridae, Hepadnaviridae, etc. (para uma lista exaustiva ver Fields et al. 1996) . Também se aplica a respostas de anticorpo a alergénios ambientais gerados em pacientes alérgicos, a proteínas prião, a antigénios tumorais gerados em pacientes com tumores e a auto-antigénios em pacientes com doenças auto-imunes, a proteínas amiloides, etc. Estes anticorpos podem ser utilizados como agentes profiláticos ou terapêuticos na formulação apropriada ou como uma ferramenta de diagnóstico.

Em relação a qualquer patogénico particular, um "anticorpo neutralizador" é um que pode neutralizar a capacidade daquele patogénico para iniciar e/ou perpetuar 13 uma infeção num hospedeiro. Existe descrito um anticorpo humano neutralizador monoclonal, em que o anticorpo reconhece um antigénio de um patogénico selecionado de: vírus da imunodeficiência humana; vírus da hepatite A; vírus da hepatite B; vírus da hepatite C; vírus herpes simples tipo I ou tipo 2; coronavírus da SARS; vírus do sarampo; vírus da papeira; vírus da rubéola; vírus da raiva; vírus do Ébola; vírus da influenza; vírus do papiloma; vírus vaccinia; vírus da varicela-zóster; vírus da varíola; vírus da poliomielite; rinovírus; vírus sincicial respiratório; P. falciparum; P. vivax; P. malariae·, P. ovale; Corynebacterium diphtheriae; Clostridium tetani; Clostridium botulinum; Bordetella pertussis; Haemophilus influenzae; Neisseria meningitidis, serogrupo A, B, C, W135 e/ou Y; Streptococcus pneumoniae; Streptococcus agalactiae; Streptococcus pyogenes·, Staphylococcus aureus; Bacillus anthracis; Moraxella catarrhalis; Chlamydia trachomatis; Chlamydia pneumoniae·, Yersinia pestis; Francisella tularensis; espécies de Salmonella; Vibrio cholerae; E. coli tóxica; um retrovírus endógeno humano; etc.

Estão também descritos anticorpos monoclonais humanos que reconhecem proteínas especificamente expressas em tumores, em células cardiovasculares doentes, durante respostas inflamatórias, em distúrbios neurológicos (incluindo doença de Alzheimer por exemplo, proteínas β-amiloides), em encefalopatias, etc. Existem também descritos anticorpos monoclonais humanos que reconhecem substâncias narcóticas tais como cocaína, heroína, benzoilecgonina, anfetaminas, etc.

Antigénios específicos que podem ser reconhecidos por tais anticorpos incluem, mas não se limitam a: TNF-a, proteína β-amiloide, proteína spike do coronavírus da SARS, proteína prião PrP, complemento C5, CBL, CD147, IL-8, glicoproteína gpl20 do HIV, VLA-4, CDlla, CD18, VEGF, 14 CD40L, moléculas de adesão celular tais como ICAM e VCAM, CD80, integrinas, TPL2, Her2, etc.

Existe também descrito um anticorpo com duas cadeias polipept idicas, em que uma ou ambas das cadeias polipeptidicas tem/têm uma sequência VDJ humana.

Os anticorpos monoclonais produzidos pelos métodos da invenção podem ainda ser purificados, se desejado, utilizando filtração, centrifugação e vários métodos cromatográficos tais como HPLC ou cromatografia por afinidade. Técnicas para purificação de anticorpos monoclonais, incluindo técnicas para produzir anticorpos de série farmacêutica, são bem conhecidas na arte.

Fragmentos dos anticorpos monoclonais podem ser obtidos dos anticorpos monoclonais produzidos por métodos que incluem digestão com enzimas, tais como pepsina ou papaína, e/ou por clivagem de ligações dissulfido por redução química. "Fragmentos" de anticorpo incluem fragmentos Fab, F(ab') 2 e Fv. Existem também descritos fragmentos Fv de cadeia simples (scFv) derivados das cadeias pesada e leve de um anticorpo monoclonal.

Também está descrito um anticorpo monoclonal humano com atividade neutralizadora, em que o anticorpo pode neutralizar a uma concentração de 1CT9 M ou inferior (por exemplo, ΙΟ-10 Μ, ΙΟ-11 Μ, 10“12 M ou inferior) .

Os anticorpos monoclonais são particularmente úteis na identificação e purificação dos polipeptídeos individuais ou outros antigénios contra os quais estão dirigidos. Os anticorpos monoclonais descritos têm utilidade adicional uma vez que podem ser empregues como reagentes em imunoensaios, radioimunoensaios (RIA) ou ensaios imunossorbentes ligados a enzimas (ELISA). Nestas aplicações, os anticorpos podem ser rotulados com um reagente detetável analiticamente tal como um radioisótopo, uma molécula fluorescente ou uma enzima. Os anticorpos monoclonais produzidos pelo método anterior também podem 15 ser utilizados para a identificação e caracterização molecular (mapeamento de epítopo) de antigénios reconhecidos por indivíduos protegidos em patogénicos complexos tais como plasmódios, o isolamento de anticorpos protetores que reagem de forma cruzada no caso de patogénicos altamente variáveis tais como aqueles encontrados no HIV e para detetar patogénicos e determinar a sua variabilidade.

Os anticorpos podem ser unidos a um fármaco para entrega a um local de tratamento ou unidos a um rótulo detetável para facilitar a tomografia de um local compreendendo células de interesse, tais como células cancerosas. Métodos para unir anticorpos a fármacos e rótulos detetáveis são bem conhecidos na arte, tal como o são métodos para tomografia utilizando rótulos detetáveis.

Os anticorpos podem ser anexos a um suporte sólido.

Os anticorpos podem ser providenciados na forma purificada. Tipicamente, o anticorpo estará presente numa composição que é substancialmente livre de outros polipeptideos, por exemplo, onde menos de 90% (por peso), normalmente menos de 60% e mais normalmente menos de 50% da composição é composta por outros polipeptideos.

Os anticorpos podem ser imunogénicos em hospedeiros não humanos (ou heterólogos) por exemplo, em ratinhos. Em particular, os anticorpos podem ter um idiotopo que é imunogénico em hospedeiros não humanos, mas não num hospedeiro humano. Os anticorpos para utilização humana incluem aqueles que não podem ser obtidos de hospedeiros tais como ratinhos, cabras, coelhos, ratazanas, mamíferos não primatas, etc. e não podem ser obtidos por humanização ou de ratinhos transgénicos xeno-mouse.

Os anticorpos podem ser de qualquer isotipo (por exemplo, IgA, IqG, IgM, isto é, uma cadeia pesada a, y ou μ) , mas será geralmente IgG. Dentro do isotipo IgG, os 16 anticorpos podem ser da subclasse IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4. Os anticorpos podem ter uma cadeia leve κ ou λ.

Existe também descrita uma célula de linfócito B de memória imortalizada (particularmente uma célula humana), em que a célula é infetada com EBV e codifica um anticorpo da invenção.

Composições farmacêuticas A utilização de anticorpos monoclonais como o ingrediente ativo dos produtos farmacêuticos está agora estendida, incluindo os produtos Herceptin™ (trastuzumab), Rituxan™, Campath™, Remicade™, ReoPro™, Mylotarg™, Zevalin™, Omalizumab, Synagis™ (Palivizumab), Zenapax™ (daclizumab), etc. Estes incluem anticorpos que reconhecem auto-antigénios humanos (por exemplo, Herceptin™ reconhece o marcador Her2) e anticorpos que reconhecem antigénios patogénicos (por exemplo, Synagis™ reconhece um antigénio do vírus sincicial respiratório).

Existe, assim, descrita uma composição farmacêutica que contém os anticorpos monoclonais e/ou as células B transformadas. Uma composição farmacêutica também pode conter um veículo farmaceuticamente aceitável para administração do anticorpo. 0 veículo não deveria induzir por si só a produção de anticorpos nocivos para o indivíduo que recebe a composição e não deveria ser tóxico. Veículos adequados podem ser macromoléculas grandes, metabolizáveis lentamente tais como proteínas, polipeptídeos, lipossomas, polissacarídeos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, ácidos amino poliméricos, copolímeros de aminoácido e partículas de vírus inativas.

Sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser utilizados, por exemplo sais de ácido mineral, tais como hidrocloretos, hidrobrometos, fosfatos e sulfatos, ou sais de ácidos orgânicos, tais como acetatos, propionatos, malonatos e benzoatos. 17

Veículos farmaceuticamente aceitáveis em composições terapêuticas podem adicionalmente conter líquidos tais como água, solução salina, glicerol e etanol. Além disso, substâncias auxiliares, tais como agents humidificadores ou emulsionantes ou substâncias tamponantes de pH, podem estar presentes em tais composições. Tais veículos permitem que as composições farmacêuticas possam ser formuladas como comprimidos solúveis, comprimidos, drageias, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas e suspensões, para ingestão pelo paciente.

Formas preferidas para administração incluem formas adequadas para administração parentérica, por exemplo, por injeção ou infusão, por exemplo por injeção em bolus ou infusão contínua. Onde o produto é para injeção ou infusão, pode tomar a forma de uma suspensão, solução ou emulsão num veículo oleoso ou aquoso e pode conter agentes formulatórios, tais como agentes suspensores, conservantes, estabilizadores e/ou dispersantes. Em alternativa, a molécula do anticorpo pode estar na forma seca, para reconstituição antes da utilização com um líquido estéril apropriado.

Uma vez formuladas, as composições podem ser administradas diretamente ao sujeito. É preferido que as composições sejam adaptadas para administração a sujeitos humanos. como

As composições farmacêuticas podem ser administradas por qualquer número de vias incluindo, mas não limitadas a, vias oral, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intramedular, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, transdérmica, transcutânea (por exemplo, documento WO98/20734), tópica, subcutânea, intranasal, entérica, sublingual, intravaginal ou retal. Os hipovaporizadores também podem ser utilizados para administrar as composições farmacêuticas. Tipicamente, as composições terapêuticas podem ser preparadas 18 injetáveis, quer como soluções liquidas ou suspensões. As formas sólidas adequadas para solução em, ou suspensão em, veiculos líquidos antes da injeção também podem ser preparadas. A entrega direta das composições será geralmente conseguida por injeção, por via subcutânea, intraperitoneal, intravenosa ou intramuscular, ou entregue no espaço intersticial de um tecido. As composições também podem ser administradas numa lesão. A dosagem do tratamento pode ser num regime de dose única ou num regime de dose múltipla. Produtos farmacêuticos baseados no anticorpo conhecidos providenciam um guia em relação à frequência de administração, por exemplo, se um produto farmacêutico deve ser entregue diariamente, semanalmente, mensalmente, etc. A frequência e dosagem também podem depender da severidade dos sintomas.

Será apreciado que o ingrediente ativo na composição será uma molécula de anticorpo. Como tal, será suscetível de degradação no trato gastrointestinal. Assim, se a composição é para ser administrada por uma via que utilize o trato gastrointestinal, a composição precisará de conter agentes que protejam o anticorpo da degradação mas que libertam o anticorpo assim que ele tenha sido absorvido a partir do trato gastrointestinal.

Uma discussão meticulosa sobre veículos farmaceuticamente aceitáveis está disponível em Pharmaceutical Sciences, do Remington (Mack Publishing Company, N.J. 1991) e em Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a edição, ISBN: 0683306472.

As composições farmacêuticas geralmente têm um pH entre 5,5 e 8,5, preferencialmente entre 6 e 8, e mais preferencialmente cerca de 7. 0 pH pode ser mantido através da utilização de um tampão. A composição pode ser estéril e/ou livre de pirogénio. A composição pode ser isotónica 19 com respeito aos humanos. As composições farmacêuticas são preferencialmente fornecidas em recipientes hermeticamente selados.

Composições farmacêuticas incluirão uma quantidade eficaz de um ou mais anticorpos e/ou uma ou mais células B transformdas, isto é, uma quantidade que é suficiente para tratar, melhorar, ou prevenir uma doença ou condição patológica desejada, ou para exibir um efeito terapêutico detetável. Os efeitos terapêuticos também incluem redução dos sintomas físicos. A quantidade eficaz precisa para qualquer sujeito particular dependerá do seu tamanho e saúde, da natureza e extensão da condição patológica, e dos terapêuticos ou combinação de terapêuticos selecionados para administração. A quantidade eficaz para uma dada situação é determinada por experimentação de rotina e está dentro do julgamento de um clínico. Para efeitos da presente invenção, uma dose eficaz estará geralmente entre cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 50 mg/kg, ou cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 10 mg/kg das composições no indivíduo ao qual é administrada. Produtos farmacêuticos baseados no anticorpo conhecidos providenciam um guia a este respeito, por exemplo, Herceptin™ é administrada por infusão intravenosa de uma solução de 21 mg/ml, com uma dose de carga inicial de 4 mg/kg de peso corporal e uma dose de manutenção semanal de 2 mg/kg do peso corporal; Rituxan™ é administrado semanalmente a 375 mg/m2; etc.

As composições podem incluir mais do que um (por exemplo, 2, 3, 4, 5, etc.) anticorpo particularmente onde tais anticorpos se ligam a antigénios diferentes (ou a epítopos diferentes no mesmo antigénio) para providenciar um efeito terapêutico sinérgico.

Os anticorpos podem ser administrados (quer combinados ou separadamente) com outros terapêuticos, por exemplo, com compostos quimioterapêuticos, com radioterapêutica, etc. 20

Em composições que incluem anticorpos, os anticorpos preferencialmente constituem pelo menos 50% por peso (por exemplo, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou mais) da proteína total na composição. Os anticorpos estão, assim, na forma purificada.

Existe descrito um método de preparar um produto farmacêutico, compreendendo as etapas de: (i) preparar um anticorpo monoclonal e (ii) misturar o anticorpo purificado com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis.

Existe também descrito um método de preparar um produto farmacêutico, compreendendo a etapa de misturar um anticorpo monoclonal com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis, em que o anticorpo monoclonal é um anticorpo monoclonal que foi obtido de uma célula B transformada. Assim, os procedimentos para obter primeiro o anticorpo monoclonal e depois preparar o produto farmacêutico podem ser realizados em tempos muito diferentes por pessoas diferentes em locais diferentes (por exemplo, em países diferentes).

Como uma alternativa a entregar anticorpos monoclonais ou células B para fins terapêuticos, é possível entregar ácido nucleico (tipicamente ADN) a um sujeito que codifica o anticorpo monoclonal (ou fragmento ativo do mesmo) de interesse, de tal maneira que o ácido nucleico pode ser expresso no sujeito in situ para providenciar um efeito terapêutico desejado. Terapêutica de genes adequada e vetores de entrega de ácido nucleico são conhecidos na arte.

Tratamentos médicos e utilizações

Os anticorpos monoclonais ou fragmentos dos mesmos podem ser utilizados para o tratamento de doença, para a prevenção de doença ou para o diagnóstico de doença. Preferencialmente, os anticorpos monoclonais são utilizados para a prevenção ou tratamento da SARS ou para o 21 diagnóstico da SARS. Métodos de diagnóstico podem incluir contactar um anticorpo ou um fragmento de anticorpo com uma amostra. Os métodos de diagnóstico também podem incluir a deteção de um complexo antigénio/anticorpo.

Existe descrita uma composição para utilização como um medicamento, a utilização de um anticorpo no fabrico de um medicamento para tratamento de um paciente e/ou diagnóstico num paciente, e um método para tratar um sujeito e/ou realizar diagnóstico num sujeito, compreendendo a etapa de administrar-lhes uma composição. 0 sujeito é preferencialmente um humano. Uma maneira de verificar a eficácia do tratamento terapêutico envolve monitorizar os sintomas da doença após administração da composição. 0 tratamento pode ser num regime de dose única ou num regime de dose múltipla, e pode ser para tratar doenças infeciosas, cancros, doenças inflamatórias, doenças auto-imunes, etc.

Os anticorpos podem ser utilizados na imunização passiva.

As composições serão geralmente administradas diretamente a um paciente. A entrega direta pode ser conseguida por injeção parentérica (por exemplo, por via subcutânea, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, ou para o espaço intersticial de um tecido), ou por via retal, oral (por exemplo, comprimidos solúveis, vaporizador), vaginal, tópica, transdérmica ou transcutânea, intranasal, ocular, aural, pulmonar ou outra administração mucosal.

As composições podem ser preparadas em várias formas. Por exemplo, as composições podem ser preparadas como injetáveis, quer como soluções liquidas ou suspensões. Formas sólidas adequadas para solução em, ou suspensão em, veiculos líquidos antes da injeção também podem ser preparadas (por exemplo, uma composição liofilizada, como Synagis™ e Herceptin™, para reconstituição com água estéril que contém um conservante). A composição pode ser preparada 22 para administração tópica, por exemplo, como uma pomada, creme ou pó. A composição pode ser preparada para administração oral, por exemplo, como um comprimido solúvel ou cápsula, como um vaporizador, ou como um xarope (opcionalmente aromatizado). A composição pode ser preparada para administração pulmonar, por exemplo, como um inalador, utilizando um pó fino ou um vaporizador. A composição pode ser preparada como um supositório ou óvulo. A composição pode ser preparada para administração nasal, aural ou ocular, por exemplo, como gotículas. A composição pode estar na forma de kit, desenhado de tal maneira que uma composição combinada é reconstituída imediatamente antes da administração a um paciente. Por exemplo, um anticorpo liofilizado pode ser providenciado sob a forma de kit com água estéril ou um tampão estéril.

Os anticorpos e fragmentos dos mesmos como descritos também podem ser utilizados num kit para o diagnóstico de tumor, doença auto-imune ou alérgica.

Expressão recombinante

Os linfócitos B de memória imortalizados produzidos utilizando o método da invenção também podem ser utilizados como uma fonte de ácido nucleico para a clonagem de genes do anticorpo para subsequente expressão recombinante. A expressão a partir de fontes recombinantes é mais comum para efeitos de produto farmacêutico do que a expressão a partir de células B ou hibridomas por exemplo, por razões de estabilidade, reproducibilidade, facilidade de cultura, etc.

Assim, a invenção providencia um método para preparar uma célula recombinante, compreendendo as etapas de: (i) preparar um clone de célula B imortalizada como descrito anteriormente; (ii) obter um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, genes da cadeia leve e/ou pesada) a partir do clone da célula B que codifica o anticorpo de interesse; e (iii) inserir o ácido nucleico num hospedeiro 23 de expressão de maneira a permitir a expressão do anticorpo de interesse naquele hospedeiro.

De forma análoga, a invenção providencia um método para preparar uma célula recombinante, compreendendo as etapas de: (i) preparar um clone de célula B imortalizada como descrito anteriormente; (ii) sequenciar ácido(s) nucleico(s) a partir do clone da célula B que codifica o anticorpo de interesse; e (iii) utilizar a informação da sequência da etapa (ii) para preparar ácido(s) nucleico(s) para inserir num hospedeiro de expressão de maneira a permitir a expressão do anticorpo de interesse naquele hospedeiro.

Existe um método descrito de preparar uma célula recombinante, compreendendo a etapa de transformar uma célula do hospedeiro com um ou mais ácidos nucleicos que codificam um anticorpo monoclonal de interesse, em que os ácidos nucleicos são ácidos nucleicos que eram derivados de um clone de célula B imortalizada da invenção. Assim, os procedimentos para preparar primeiro os ácido(s) nucleico(s) e depois utilizá-los para transformar uma célula do hospedeiro podem ser realizados em tempos diferentes por pessoas diferentes em locais diferentes (por exemplo, em países diferentes).

Estas células recombinantes da invenção podem depois ser utilizadas para efeitos de expressão e cultura. São particularmente úteis para expressão de anticorpos para produção em grande escala de produtos farmacêuticos. Também podem ser utilizadas como o ingrediente ativo de uma composição farmacêutica. Quaisquer técnicas de cultura adequadas podem ser utilizadas, incluindo, mas não limitadas a, cultura estática, cultura em frasco rolante, fluído ascite, cartucho de biorreator do tipo fibra oca, minifermentadora modular, tanque agitado, cultura de microveículo, perfusão de núcleo cerâmica, etc. 24 Métodos para obter e sequenciar genes de imunoglobulina de células B são bem conhecidos na arte, por exemplo, ver capítulo 4 do Kuby Immunology (4a edição, 2000; ASIN: 0716733315). O hospedeiro de expressão é preferencialmente uma célula eucarionte, incluindo células de levedura e animais, particularmente células de mamífero (por exemplo, células CHO, células humanas tais como PERC6 [Crucell; Jones et al. Biotechno/ Prog 2003,19(1):163-8] ou células HKB-11 [Bayer; Cho et al. Cytotechnology 2001,37:23-30; Cho et al. Biotechnol Prog 2003,19:229-32], células de mieloma [Patentes U.S. 5 807 715 e 6 300 104], etc.), bem como células de plantas. Hospedeiros de expressão preferidos podem glicosilar o anticorpo da invenção, particularmente com estruturas de carbohidrato que não são, elas próprias, imunogénicas em humanos. Hospedeiros de expressão que podem crescer em meios livres de soro são preferidos. Hospedeiros de expressão que podem crescer em cultura sem a presença de produtos derivados de animais são preferidos. 0 hospedeiro de expressão pode ser cultivado para proporcionar uma linha de células. A invenção providencia um método para preparar uma ou mais moléculas de ácido nucleico (por exemplo, genes da cadeia leve e pesada) que codificam um anticorpo de interesse, compreendendo as etapas de: (i) preparar um clone de célula B imortalizada de acordo com a invenção; (ii) obter do clone da célula B ácido nucleico que codifica o anticorpo de interesse. A invenção também providencia um método para obter uma sequência de ácido nucleico que codifica um anticorpo de interesse, compreendendo as etapas de: (i) preparar um clone de célula B imortalizada de acordo com a invenção; (ii) sequenciar ácido nucleico do clone da célula B que codifica o anticorpo de interesse. 25 A invenção também providencia um método de preparar molécula(s) de ácido nucleico que codifica(m) um anticorpo de interesse, compreendendo a etapa de obter o ácido nucleico de um clone de célula B que foi obtido de uma célula B transformada da invenção. Assim, os procedimentos para primeiro obter o clone da célula B e depois preparar o(s) ácido(s) nucleico(s) a partir dele podem ser realizados em tempos muito diferentes por pessoas diferentes em locais diferentes (por exemplo, em países diferentes) . A invenção providencia um método para preparar um anticorpo (por exemplo, para utilização farmacêutica), compreendendo as etapas de: (i) transformar uma população de linfócitos B de memória humanos e selecionar uma célula B transformada que produz um anticorpo com uma especificidade desejada, como descrito anteriormente; (ii) obter e/ou sequenciar um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, qenes de cadeia leve e pesada) da célula B selecionada o anticorpo de interesse; (iii) inserir os ácido (s) nucleico (s) em ou utilizar os ácido(s) nucleico(s) para preparar um hospedeiro de expressão que possa expressar o anticorpo de interesse; (iv) cultivar ou subcultivar o hospedeiro de expressão em condições onde o anticorpo de interesse é expresso; e, opcionalmente, (v) purificar o anticorpo de interesse.

Existe também descrito um método de preparar um anticorpo compreendendo as etapas de: cultivar ou subcultivar uma população de células do hospedeiro de expressão em condições onde o anticorpo de interesse é expresso e, opcionalmente, purificar o anticorpo de interesse, em que dita população de células do hospedeiro de expressão foi preparada por (i) providenciando ácido(s) nucleico(s) que codificam uma célula B selecionada o anticorpo de interesse que é produzido por uma população de linfócitos B de memória preparado como descrito 26 anteriormente, (ii) inserir os ácido(s) nucleico(s) num hospedeiro de expressão que pode expressar o anticorpo de interesse, e (iii) cultivar ou subcultivar hospedeiros de expressão compreendendo ditos ácidos nucleicos inseridos para produzir dita população de células do hospedeiro de expressão. Assim, os procedimentos para primeiro preparar o hospedeiro de expressão recombinante e depois cultivá-lo para expressar o anticorpo podem ser realizados em tempos muito diferentes por pessoas diferentes em locais diferentes (por exemplo, em países diferentes).

Existe também descrito um método de preparar um produto farmacêutico, compreendendo a etapa de misturar um anticorpo monoclonal com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis, em que o anticorpo monoclonal é um anticorpo monoclonal que foi obtido a partir de um hospedeiro de expressão da invenção. Assim, os procedimentos para primeiro obter o anticorpo monoclonal (por exemplo, expressá-lo e/ou purificá-lo) e depois misturá-lo com o(s) veículo(s) farmacêutico(s) podem ser realizados em tempos muito diferentes por pessoas diferentes em locais diferentes (por exemplo, em países diferentes) .

Começando com uma célula B transformada da invenção, várias etapas de cultivar, subcultivar, clonar, subclonar, sequenciar, preparar o ácido nucleico etc. podem ser realizadas de maneira a perpetuar o anticorpo expresso pela célula B transformada, com otimização opcional em cada etapa. Numa modalidade preferida, os métodos anteriores compreendem ainda técnicas de otimização (por exemplo, maturação por afinidade ou otimização) aplicadas aos ácidos nucleicos que codificam o anticorpo.

Em todos estes métodos, o ácido nucleico utilizado no hospedeiro de expressão pode ser manipulado entre as etapas (ii) e (iii) para inserir, eliminar ou emendar certas sequências de ácido nucleico. Alterações decorrentes de tal 27 manipulação incluem, mas não se limitam a, alterações na introdução de locais de restrição, para emendar o uso do codão, adicionar ou otimizar sequências reguladoras de transcrição e/ou tradução, etc. É também possível alterar o ácido nucleico para alterar os ácidos nucleicos codificados. Por exemplo, pode ser útil introduzir uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) substituições de aminoácido, uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) eliminações de aminoácido e/ou uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) inserções de aminoácido na sequência de aminoácido do anticorpo. Tais mutações pontuais podem modificar as funções efetoras, a afinidade de ligação ao antigénio, modificações pós-traducionais, imunogenicidade, etc., podem introduzir aminoácidos para a anexação de grupos covalentes (por exemplo, rótulos) ou podem introduzir etiquetas (por exemplo, para efeitos de purificação). As mutações podem ser introduzidas em locais específicos ou podem ser introduzidas aleatoriamente, seguido de seleção (por exemplo, evolução molecular).

SARS

Anticorpos específicos para o vírus da SARS podem ser particularmente úteis para profilaxia e podem ser administrados a profissionais de cuidados de saúde ou outras pessoas que podem entrar em contacto com pacientes infetados com o vírus da SARS. Tal seroterapêutica passiva pode oferecer uma cura imediata dos indivíduos infetados bem como contenção através da proteção dos contactos e pessoal médico. Os soros humanos contendo anticorpos contra o vírus da SARS não estão disponíveis em quantidades suficientes, por isso o método da invenção providencia uma maneira ideal de produzir anticorpos monoclonais neutralizadores humanos. Tais anticorpos podem ser utilizados para desenvolver uma seroterapêutica passiva contra este e outros patogénicos. 28

Existe, portanto, também descrito um método de prevenir a transmissão do vírus da SARS compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um anticorpo ou fragmento de anticorpo específico para o vírus da SARS. Estoques de anticorpo específico para o vírus da SARS deveriam, assim, ser mantidos de maneira a estarem disponíveis para utilização imediata em qualquer surto adicional da SARS.

Espécies não humanas A invenção foi descrita anteriormente em relação a anticorpos humanos preparados a partir de células B humanas. Será apreciado que a invenção não está tecnicamente restrita à utilização com células humanas, e pode ser utilizada com qualquer organismo de interesse, por exemplo, para providenciar anticorpos para uso veterinário terapêutico ou diagnóstico. Os organismos com células B que podem ser transformados pelos métodos da invenção incluem primatas (macacos, símios, gorilas, gibões, lémures, chimpanzés, babuínos, orangotangos, macacos, etc.) vacas, cavalos, cabras, ovelhas, porcos, cães, gatos, camelos, tubarões, peixes, etc.

Geral 0 termo "compreendendo" abrange "incluindo" bem como "consistindo" por exemplo, uma composição "compreendendo" X pode consistir exclusivamente de X ou pode incluir algo adicional, por exemplo, X + Y. A palavra "substancialmente" não exclui "completamente" por exemplo, uma composição que é "substancialmente livre" de Y pode estar completamente livre de Y. Onde necessário, a palavra "substancialmente" pode ser omissa da definição da invenção. 0 termo "cerca de" em relação a um valor numérico x significa, por exemplo, x±10%.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS 29 A Figura 1 mostra os resultados do ELISA utilizando células Vero infetadas com vírus da SARS lisadas em 3% de SDS como antigénio. São apresentados os valores OD de soro (diluição 1/5000), sobrenadantes de culturas policlonais e de clones de célula B independentes (diluição 1/2). A Figura 2 mostra o título neutralizador de anticorpos específicos para o vírus da SARS. Da esquerda para a direita: título de neutralização (ensaio de célula Vero) de soro convalescente; sobrenadantes de culturas policlonais; clones positivos isolados da cultura com título neutralizador mais elevado. A Figura 3 mostra a análise clonal da resposta do anticorpo humano à proteína spike do vírus da SARS. Os sobrenadantes da cultura foram testados pela sua capacidade em corar células BHK transfetadas com mARN da proteína spike do vírus da SARS (isolado Frankfurt) e pela sua capacidade em neutralizar a mesma estirpe de vírus da SARS. A Figura 3A mostra a correlação entre título neutralizador e coloração da proteína spike pelo sobrenadante da cultura não diluído. A Figura 3B mostra a coloração das células BHK transfetadas pela spike por diluições em série de sobrenadantes de onze culturas neutralizadoras, com os símbolos cheios representando a máxima diluição onde a neutralização completa foi observada. A Figura 4 mostra a caracterização do anticorpo neutralizador S3.1 da SARS. A coloração de células BHK transfetadas pela spike pelo S3.1 purificado (círculos) e soro convalescente aos 6 meses (quadrados). Os símbolos cheios indicam a máxima diluição onde a neutralização completa foi observada. A Figura 5 mostra a microscopia imunoeletrónica do coronavírus da SARS na presença do anticorpo S3.1. A Figura 6 é uma visão global de um método da invenção, de anticorpo humano a monoclonal.

MODOS PARA REALIZAR A INVENÇÃO 30 A presente invenção permite a clonagem de linfócitos B de memória humanos com eficiência muito elevada e alcança isto pela combinação de dois estímulos, nomeadamente: EBV, que imortaliza as células B humanas com baixa eficiência e um ativador policlonal de célula B que aumenta a eficiência da imortalização do EBV.

Exemplo 1: Clonagem de células B

As células B de memória humanas (CD19+ CD27+ IgM' IgD') foram isoladas a partir de dadores saudáveis por seleção de células utilizando métodos bem conhecidos na arte. Diferentes números de células foram semeados em culturas replicadas em microplacas com 96 poços na presença de células mononucleares irradiadas (5xl0s/ml) e quer o EBV (sobrenadante de células B95-8) sozinho como o EBV em combinação com CpG 2006 (2,5 ug/ml) e IL-2 recombinante (1000 U/ml). Após 15 dias a percentagem de culturas contendo células em crescimento foi classificada. As frequências foram determinadas por ensaios de diluição limitante. As culturas foram classificadas de acordo com células em crescimento. A eficiência de clonagem utilizando quatro fontes diferentes de células B foi como se segue:

Fonte de células B Eficiência de clonagem EBV EBV+ CpG+ IL-2 Exp 1 (CD19+ CD27+ IgM' IgD') 1 em 200 1 em 1 Exp 2 (CD19+ CD27+ IgM' IgD') 1 em 120 1 em 1,5 Exp 3 (CD19+ CD27+ IgM' IgD') 1 em 60 1 em 1 Exp 4 (CDl 9+ CD27 + ) 1 em 90 1 em 1,6 Não foi observado crescimento na ausência do EBV.

Assim, os métodos da invenção permitem que virtualmente todas as células B de memória humanas sejam clonadas (eficiência próxima a 100%). O método também é adequado para subclonagem. 31

Exemplo 2: Produção de anticorpos com uma especificidade desejada

Numa experiência adicional foi demonstrado que a imortalização pode ser utilizada para explorar a memória imunológica para produzir anticorpos monoclonais humanos da especificidade desejada.

As células mononucleares foram isoladas de 20 ml de sangue periférico obtido de um dador de sangue saudável. As células B de memória humanas CD19+ CD27+ IgG+ foram isoladas por seleção de células e semeadas a 10 células/poço em microplacas com 96 poços na presença de EBV, CpG 2006 (25 pg/ml), IL-2 recombinante (1000 U/ml) e células mononucleares irradiadas (5xl05/ml). Semear apenas 10 células por poço ajuda a aumentar a eficiência da clonagem. Após 15 dias todas as culturas continham células em crescimento. Uma amostra do sobrenadante foi recolhida e testada em ELISA para anticorpos IgG totais e para IgG específicos para Toxoplasma gondii, toxóide tetânico e vírus do sarampo. Os sobrenadantes foram também testados num ensaio de neutralização do vírus do sarampo utilizando células Vero como alvos.

Anticorpo (método de deteção) Culturas positivas# Clones específicos isolados/tentativas feitas * IgG (ELISA) 180/180 Ant i-Toxoplasma gondii (ELISA) 23/180 5/6 Anti-toxóide tetânico (ELISA) 19/180 5/6

Algumas das culturas positivas identificadas foram subclonadas por diluição limitante para isolar clones específicos que produzem o anticorpo monoclonal desejado. As culturas foram subclonadas a 0,5 células/poço na presença de CpG 2006 (2,5 pg/ml) , IL-2 (1000 U/ml) e PBMC irradiado (5xl05/ml) ._ 32 32 Anti-vírus do sarampo (ELISA) 36/180 7/9 Anticorpo (método de deteção) Culturas positivas# Clones específicos isolados/tentativas feitas * Anti-vírus do sarampo 7/180 4/4 (neutralização) # Para ELISA, o número de culturas com OD >0,8 num ensaio com antecedente <0,2; para ensaio de neutralização, número com proteção completa do efeito citolitico do vírus do sarampo * Número de casos onde pelo menos um clone específico de antigénio poderia ser isolado relativo ao número de culturas originais que foram clonadas. A eficiência de clonagem variou de 50 a 100%. Os clones de célula B transformados pelo EBV que produzem anticorpos IgG contra o vírus do sarampo, toxóide tetânico e Toxoplasma gondii poderiam, portanto, ser isolados, mostrando que os anticorpos monoclonais humanos com especificidades de memória múltiplas podem ser preparados a partir de uma pequena amostra de sangue periférico humano.

Exemplo 3: Células B de memória imortalizadas que expressam anticorpos específicos para coronavírus da SARS

As amostras de sangue foram obtidas de dois pacientes com um historial clínico de SARS. Ambos pacientes tinham anticorpos anti-SARS no soro como detetado por dois ensaios: (i) um ensaio de neutralização que deteta anticorpos neutralizadores dirigidos contra as proteínas de superfície do vírus da SARS, provavelmente a proteína spike e (ii) um ensaio ELISA, que deteta anticorpos que se ligam a qualquer proteína desnaturada do vírus da SARS.

Para o ensaio de neutralização, diluições em série do soro obtido do sangue foram adicionadas a poços de uma 33 microplaca que continham células Vero, seguidas de quantidades tituladas do vírus da SARS. Após 2 dias; o efeito citopático foi registado por inspeção visual. Um ELISA convencional também foi desenvolvido utilizando as células Vero infetadas com vírus da SARS lisadas em 3% de SDS como o antigénio.

Para a produção do clone de células B que produziam anticorpos monoclonais específicos para o vírus da SARS, foi selecionado sangue do paciente que mostrava o título mais alto de anticorpos neutralizadores e de ligação.

As células B de memória que transportavam IgG de superfície foram isoladas utilizando micropérolas de IgG anti-humana, incubadas com EBV (50% sobrenadante de células B95-8) durante 6 horas e foram depois colocadas em pratos a 10 células/poço em microplacas de 96 poços na presença de 2,5 pg/ml de CpG 2006 e PBMC irradiado alogénico (nestas experiências a IL-2 foi omitida) . Após duas semanas os sobrenadantes da cultura foram classificados para a presença de anticorpos específicos.

Dos 1042 sobrenadantes da cultura testados, 165 foram positivos no ensaio ELISA (Figura 1). 23 destas culturas foram clonadas como anteriormente e clones específicos foram isolados de 16 deles. Alguns dos anticorpos monoclonais humanos isolados reconhecem a nucleoproteína do vírus da SARS em western blots, enquanto alguns não, o que sugere que eles podem reconhecer proteínas virais diferentes (dados não apresentados) . Nenhum destes anticorpos exibiu atividade neutralizadora.

Dos 1042 sobrenadantes de cultura testados no ensaio de neutralização, sete mostraram baixo nível de atividade neutralizadora enquanto dois (All e D8) mostraram título neutralizador alto (1/512 e 1/256 respetivamente). A cultura de All foi clonada por diluição limitante na presença de CpG e PBMC irradiado e vários clones de célula B com atividade neutralizadora alta comparável foram 34 isolados (Figura 2) . Os anticorpos All não se ligaram no ensaio ELISA, mas coraram spikes de superfície do vírus da SARS como detetado pela microscopia eletrónica (dados não apresentados).

Assim, utilizar este método é possível para produzir anticorpos neutralizadores específicos para um antigénio utilizando apenas uma pequena amostra de sangue (cerca de 10 ml) dentro de um intervalo de tempo curto (30-40 dias). O método também permite a seleção do melhor anticorpo de um grande conjunto, e é, portanto, um método de alto rendimento.

Os anticorpos anti-SARS neutralizam o vírus da SARS a concentrações de ~5 ng/ml. A neutralização do vírus sincicial respiratório (RSV, uma causa comum de infeções do trato respiratório, especialmente em crianças) por anticorpos humanizados disponíveis comercialmente produzidos por técnicas convencionais requer uma concentração de anticorpo cerca de 1000 vezes superior (Johanson et al. 1997) . Por este motivo, os anticorpos inteiramente humanos produzidos pelo método da invenção parecem ser cerca de 1000 vezes mais eficazes. Isto sugere que quantidades muito pequenas do anticorpo descritas aqui deveriam ser suficientes para prevenir ou curar a infeção da SARS.

Exemplo 4: Classificar por anticorpos os pacientes convalescentes do vírus da SARS O sangue periférico foi obtido de um paciente em tempos diferentes após uma infeção aguda pelo vírus da SARS (2, 4 e 6 meses após infeção) . Os PBMC foram isolados por centrifugação em gradiente. As células B de memória IgG+ foram isoladas por um método melhorado que evita despoletar o receptor da célula B. As células B totais foram isoladas do PBMC utilizando micropérolas CD22 (Miltenyi) , que se considerou serem ainda melhores do que utilizar micropérolas CD19. As células foram coradas com anticorpos 35 para a IgM, IgD e IgA humana e as células negativas que transportavam na superfície IgG foram isoladas por seleção de células. As células B foram pulsadas com EBV (50% sobrenadante das células B-95-8) durante 8 horas e depois colocadas em pratos a 10 células/poço em microplacas de fundo em U com 96 poços em meio completo RPMI suplementado com 10% de FCS, 2,5 pg/ml de CpG 2006 e PBMC irradiado (2xl05/ml) . Nesta experiência a IL-2 não foi utilizada. Após 2 semanas os sobrenadantes da cultura foram classificados para a presença de anticorpos específicos utilizando os três ensaios descritos a seguir. As culturas positivas foram clonadas por diluição limitante na presença de CpG 2006 e PBMC irradiado como anteriormente. Os clones positivos foram expandidos e o anticorpo produzido foi purificado dos sobrenadantes da cultura através de cromatografia por afinidade em colunas de proteína A (Amersham). 0 isolado Frankfurt do vírus da SARS (número de acesso do Genbank AY310120) foi utilizado para três ensaios in vitro: ELISA Células Vero foram infetadas a uma multiplicidade de infeção de 0,01 unidades formadoras de placa por célula. O sobrenadante da cultura de células recolhido após 2 dias foi removido por centrifugação a 3000 rpm, durante 5 min. O sobrenadante foi sujeito a centrifugação a 20,000 rpm durante 2 horas num rotor Beckman SW28 através de uma almofada com 20% de sacarose. A bola foi purificada utilizando um gradiente de tartrato de potássio/glicerol e ressuspendido em 500 μΐ de tampão TNE (10 mM de Tris-HCl, pH 7,4, 0,15 M de NaCl, 2 mM de EDTA) para uma concentração da proteína de aproximadamente 0,5 mg/ml. A suspensão do antigénio utilizada para o ensaio ELISA foi preparada adicionando 1% de SDS à bola virai seguido de fervura durante 10 min. Os pratos de ELISA foram revestidos com uma diluição 1:1000 do antigénio do vírus da 36 SARS em 0,1 M de tampão fosfato. As diluições dos soros ou do sobrenadante da cultura foram adicionadas e os anticorpos IgGl específicos foram detetados utilizando fosfatase alcalina de cabra anti-IgG humana. Os resultados foram expressos em unidades arbitrárias (AU) relativas à amostra de 2 meses (=1000 AU) . Os soros de 20 dadores normais testados foram negativos (<1 AU).

Coloração Anticorpos específicos para proteína spike nativa do vírus da SARS foram detetados por citometria de fluxo. Resumidamente, o gene da spike do vírus da SARS foi clonado num vetor apropriado e o mARN foi transcrito in vitro e utilizado para transfetar células BHK por eletroporação. Os transfetantes foram incubados com sobrenadantes da cultura ou soro, lavados e corados com anticorpo anti-IgG humana de cabra rotulado com APC. Este ensaio deteta anticorpos IgGl dirigidos contra o antigénio spike nativo, a maioria dos quais têm atividade neutralizadora. Os resultados foram expressos em unidades arbitrárias (AU) relativas à amostra de 2 meses (=1000 AU). Os soros dos 20 dadores normais testados foram negativos (<1 AU).

Neutralização in vitro Os soros ou sobrenadantes da cultura foram diluídos em etapas log 2 e misturados com 75 TCID50 do vírus da SARS em 25 μΐ (o título do vírus foi determinado de acordo com o método de Karber). A mistura foi incubada durante 45 min à temperatura ambiente. Subsequentemente, 50 μΐ de células Vero tripsinizadas (1,5 x 105 por ml) foram adicionados e incubados durante 3 dias a 37°C e finalmente, o título de neutralização foi determinado por inspeção visual para proporcionar a diluição do soro que neutraliza 75 TCII)50 do vírus da SARS. Os ensaios foram realizados num laboratório de biossegurança de nível 4.

Os resultados foram como se seguem: 37

Meses após infeção Anticorpo anti-SARS detetado por ELISA Coloração Spike Neutralização 2 1000 1000 1/128 4 650 700 1/128 6 300 400 1/128

Enquanto soros normais foram negativos, o soro do paciente recolhido em diferentes momentos temporais após o despoletar da doença aguda foi positivo nos três ensaios. Anticorpos detetados por ELISA e aquelas células transfetadas coradas por spike foram as mais altas 2 meses após a infeção e diminuíram para cerca de um terço até aos seis meses. Por oposição, os anticorpos neutralizadores permaneceram constantes com um título de 1/128. 0 isotipo dos anticorpos detetados nos ensaios de coloração por ligação a spike e ELISA foi exclusivamente anticorpos IgGl, sem detetar os IgA ou IgM (dados não apresentados) . Assim, o soro pós-infeção desta pessoa tinha títulos moderados de anticorpos neutralizadores ao vírus da SARS e anticorpos IgG que ligam proteínas spike e detetam antigénios desnaturados em ELISA.

Exemplo 5: Cinética e frequências de células B de memória especificas

Os linfócitos B de memória IgG+ dos soros pós-SARS aos 2 meses, 4 meses e 6 meses foram imortalizados com EBV em condições onde o número de células B por cultura foi limitante, como descrito anteriormente (10 células B por poço). Esta estratégia permite a análise do produto de apenas algumas células B de memória por cultura, assegurando assim que o anticorpo específico detetado nas culturas positivas é monoclonal e, ao mesmo tempo, aumenta a probabilidade de isolar um clone que produz o anticorpo desejado por diluição limitante. Após duas semanas de cultura na presença de EBV, CpG 2006 e células 38 alimentadoras irradiadas os sobrenadantes da cultura foram classificados para a presença de anticorpos IgG esecificos utilizando ELISA ou coloração de transfetantes de spike. A frequência de culturas classificadas positivas no ensaio ELISA do virus da SARS ou corando transfetantes de spike do vírus da SARS foram como se segue:

Meses após infeção Culturas positivas/total de culturas classificadas (%) ELISA Coloração Spike 2 275/480 (57,3%) Não determinado 4 123/480 (25,6%) 12/576 (2,1%) 6 44/480 (9/2%) 21/768 (2,7%) A frequência de culturas que produzem anticorpos detetados pelo ensaio ELISA foi muito elevada 2 meses após a infeção e diminuiu até aos 4 e 6 meses. A frequência de culturas que produzem anticorpos contra a proteína spike nativa medidos aos 4 e 6 meses era mais baixa. De forma importante, a cultura que era positiva para ELISA os anticorpos eram distintos daqueles que continham anticorpos à spike indicando que os dois ensaios detetam diferentes especificidades de anticorpo não sobreponíveis. Além disso, uma proporção considerável de células B de memória IgG+ são específicas para a proteína spike.

Foram depois realizados testes para investigar se existia uma correlação entre a atividade de ligação e neutralizadora da spike. 56 sobrenadantes de cultura que coraram células transfetadas por spike foram testados para a sua capacidade para neutralizar o mesmo isolado do vírus da SARS do qual a proteína spike foi clonada (Figura 3A) . Apesar dos anticorpos com a coloração mais elevada mostrarem títulos neutralizadores elevados, houve alguns anticorpos que neutralizaram de forma eficiente, apesar da coloração fraca, enquanto outros coraram transfetantes da 39 spike, mas falharam em neutralizar. Além disso, quando 11 sobrenadantes com alto título neutralizador foram analisados, não existia uma correlação evidente entre coloração e neutralização (Fig 3B) . Em conjunto, estes resultados indicam que ao nível clonal a resposta à spike é heterogénea e que nem todos os anticorpos anti-spike produzidos no decorrer de uma infeção natural são capazes de neutralizar o vírus.

Exemplo 6: Isolamento de anticorpos monoclonais para o virus da SARS

Os resultados mostrados anteriormente provam que é possível interrogar o repertório das célula B de memória humanas com uma variedade de ensaios para identificar culturas que produzem um anticorpo da especificidade desejada. Nestas experiências, 29 das 38 tentativas (76%) em culturas positivas de clonagem conduziram ao isolamento de um ou mais clones que produzem anticorpos da especificidade selecionada. Os clones do EBV foram estáveis e os anticorpos monoclonais foram recuperados no sobrenadante da cultura a concentrações de 10-20 pg/ml. Destes 29, 21 foram positivos no ensaio ELISA e 8 foram positivos tanto no ensaio de coloração spike como foram capazes de neutralizar o vírus da SARS.

Dos 21 clones independentes que deram positivos no ensaio ELISA, 13 (62%) produziram anticorpos específicos para a nucleoproteína do vírus da SARS (NP) como detetado por Western blot, enquanto 5 não reconheceram NP, mas coraram as células infetadas pelo vírus da SARS, e os 3 remanescentes reagiram apenas no ensaio ELISA. Como esperado, nenhum destes anticorpos exibiu atividade neutralizadora.

Dos 8 clones independentes dos transfetantes de coloração spike e vírus da SARS neutralizadores, um (S3.1, IgGlK) foi selecionado para ensaios de neutralização in vivo. O anticorpo monoclonal deste clone foi purificado do 40 sobrenadante da cultura e testado para a sua capacidade de corar as células transfetadas por spike e para neutralizar o virus da SARS (Fig 4) . S3.1 neutralizou 75 TCID50 do vírus da SARS a concentrações de -300 ng/ml, e foi até 300 vezes mais potente do gue o soro convalescente. Além disso, S3.1 neutralizou os isolados Frankfurt e Urbani com a mesma eficiência (dados não apresentados), e decorou as spikes do SARS-CoV como detetado por microscopia imunoeletrónica (Figura 5).

Exemplo 7: S3.1 neutraliza a infeção por SARS num modelo animal A atividade neutralizadora in vivo do anticorpo monoclonal S3.1 foi testada num modelo de ratinho da infeção aguda da SARS. O anticorpo purificado foi transferido para ratinhos ingénuos por injeção intraperitoneal para determinar se o anticorpo sozinho poderia prevenir a replicação do vírus da SARS no trato respiratório.

Os doutores L.J. Anderson e T.G. Ksiazek dos Centros para o Controlo e Prevenção de Doenças (CDC), Atlanta, GA, providenciaram vírus da SARS (estirpe Urbani) para utilização num ensaio de neutralização in vivo. O vírus foi isolado e passado duas vezes em células Vero E6 pelo CDC e foi passado em células Vero para duas passagens adicionais no nosso laboratório para gerar um estoque de vírus com um título de 106'5 TCID50/ml. As células Vero foram mantidas em OptiPro SFM (Invitrogen) . Todo o trabalho com o vírus infeccioso foi realizado dentro de uma cabine de biossegurança, em instalações de contenção de biossegurança de nível 3 e o pessoal usou respiradores purificadores de ar mecânicos (3M HEPA AirMate, Saint Paul, MN) . Os estudos com ratinho foram aprovados pelo Comité de Uso e Cuidados Animais NIH e foram realizados numa instalação animal aprovada de biossegurança de nível 3. Todo o pessoal que 41 entrasse na instalação usava respiradores purificadores de ar mecânicos.

Ratinhos BALB/c fêmea com quatro a seis semanas de idade comprados da Taconic (Germantown, Nova Iorque) foram alojados, 4 ratinhos por jaula. No dia 0 os ratinhos, levemente anestesiados com isoflurano, foram injetados por via intraperitoneal com 3 doses diferentes (800, 200, 50 pg) do anticorpo S3.1 em 500 μΐ ou com o mesmo volume de uma Ig policlonal humana que carece de atividade neutralizadora. 24 horas depois os ratinhos foram desafiados por via intranasal com 104 TCID50 de coronavirus da SARS. Após dois dias adicionais os ratinhos foram sacrificados e os seus pulmões e turbinatos nasais foram removidos e homogenizados numa suspensão de 5% p/v em meio Leibovitz 15 (Invitrogen). As amostras de tecido foram avaliadas para infeção, e os títulos do vírus foram determinados como descrito anteriormente. Os títulos do vírus foram expressos como logio TCID50 por grama de tecido:

Replicação do vírus em ratinhos testados Pulmões Turbinatos nasais Anticorpo Número infetado Média (SE) do título do vírus Número infetado Média (SE) do título do vírus S3.1 800 pg 0/4 <1,5±0* 2/4 2,5±0,47 S3.1 200 pg 0/4 <1,5±0* 4/4 3,4±0,41 S3.1 50 pg 2/4 3,2±1,36 4/4 4,8±0,75 Controlo 800 pg 4/4 7,5±0,1 4/4 6,4±0,41 0 limite inferior de deteção do vírus infeccioso numa suspensão a 10% p/v do homogeneizado do pulmão foi 1,5 logio TCID50/gm e numa suspensão a 5% p/v dos turbinatos nasais foi 1,8 logio TCID50/gm. Estes valores indicam assim vírus não detetável. 42

Os ratinhos que receberam o mAc S3.1 estavam, assim, protegidos da replicação do vírus do desafio, particularmente no trato respiratório inferior. As diferenças nos títulos virais quando comparados com o controlo foram estatisticamente significativas (p<0,05) num teste t de Student. A restrição significativa da replicação do vírus no trato respiratório superior foi observada nos ratinhos que receberam a dose mais alta de mAc S3.1.

Exemplo 8:R-848 R-848 é um agonista de TLR7 e TLR8. Este composto foi comparado com CpG 2006 em termos de eficiência da imortalização induzida pelo EBV das células B humanas. As células B de memória foram isoladas de dadores saudáveis utilizando micropérolas magnéticas anti-CDl9 ou anti-CD22 seguido por eliminação negativa de células transportadoras de IgM, IgD e IgA (ou IgG) . 48 culturas de réplicas foram estabelecidas um microplacas com fundo em U com 96 poços por diluição limitante a 30, 10 e 3 células B por poço em meio completo na presença de células mononucleares irradiadas, EBV (20% sobrenadante de células B95-8) e na presença ou ausência de 2,5 pg/ml de CpG 2006 ou 2,5 pg/ml de R-848. A frequência de culturas positivas para o crescimento celular e produção de Ig foi medida após 14 dias e a eficiência de transformação foi calculada. Os resultados foram os seguintes:

Fonte de células B EBV + CpG 2006 + R848 Dador AOS CD19+ IgM” IgD” IgA 1 em 150 1 em 3,5 1 em 2,5 Dador AOS CD22+ IgM” IgD IgA” 1 em 300 1 em 2 1 em 1,5 Dador ASC CD19+ IgM- IgD- IgA- 1 em 320 1 em 2 1 em 2,4 43

Fonte de células B EBV + CpG 2006 + R848 Dador ASC CD19+ IgNT IgD' IgG 1 em 280 1 em 4 1 em 2,2 Dador ETR CD22+ IgNT IgD” 1 em 230 1 em 1, 9 1 em 2 R-848 e CpG 2006 são, assim, comparáveis na sua capacidade para aumentar a eficiência da imortalização induzida pelo EBV. Além disso, R-848 foi comparável ao CpG 2006 na capacidade de aumentar a eficiência de clonagem de linhas de células B imortalizadas pelo EBV policlonais. Na presença de R-848 a eficiência de clonagem das linhas de células EBV oscilou entre 25 a 100% em 10 experiências independentes.

Exemplo 9: Isolamento de anticorpos de elevada afinidade que neutralizam SARS-CoV

Uma nova série de anticorpos monoclonais com capacidade neutralizadora de SARS-CoV foi produzida como descrito anteriormente a partir de células B de memória imortalizadas isoladas de um paciente convalescente seis meses após infeção. Diluições em série de sobrenadantes de clones de célula B foram testadas pela sua especificidade de antigénio (NP, matriz (M) ou proteínas spike), e pela sua capacidade de neutralizar o efeito citopático do SARS CoV (isolado Frankfurt) em células Vero. A concentração de IgG monoclonal foi medida por ELISA nos mesmos sobrenadantes de cultura. Os títulos neutralizadores foram expressos como a concentração final de IgG (ng IgG por ml) na cultura de tecido capaz de completamente neutralizar o vírus (valores médios de pelo menos três testes). Os resultados foram os seguintes: 44

Clone de célula B Isotipo Especificidade Titulo neutralizador S18.1 IgG, K NP - S20.1 IgG, λ NP - S21.1 IgG, K NP - S23.4 IgG, K NP - S24.1 IgG, λ NP - S13.1 IgG, K Não determinado - S5.1 IgG, K M - S3.1 igG, K Spike 300 S101.1 IgG, K Spike 40 S102.1 IgG, K Spike 850 S103.3 igG, K Spike 350 S10 4.1 IgG, K Spike 150 S105.2 IgG, K Spike 150 S106.1 IgG, K Spike 45 S10 7.4 igG, K Spike 75 S108.1 igG, K Spike 40 S109.2 igG, K Spike 80 S132.9 igG, K Spike 200 S128.5 igG, K Spike 25 S127.6 igG, K Spike 40 S124.4 igG, K Spike 40 S15 9.1 igG, λ Spike 25 SI 60.1 igG, K Spike 15

Assim, a invenção é capaz de, de forma rotineira, providenciar anticorpos que podem neutralizar o virus a concentrações inferiores a 1CT9 M e mesmo inferiores a 1CT10 M (peso molecular de IgG humana é -150 kDa, e portanto 150 ng/ml é ~10~9 M) . 45

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LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

<110> INSTITUTO PARA INVESTIGAÇÃO EM BIOMEDICINA LANZAVECCHIA Antonio <12 0> PRODUÇÃO DE ANTICORPO MONOCLONAL ATRAVÉS DE TRANSFORMAÇÃO POR EBV DE CÉLULAS B <130> P033334WO <140> 48 <141> <150> GB 0304363.5 <151> 2003-02-26 <150> GB 0318431.4 <151> 2003-08-06 <150> GB 0325391.1 <151> 2003-10-30 <150> US 60/516665 <151> 2003-10-30 < 16 0 > 1

<170> SeqWin99, versão 1.02 <210> 1 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> CpG ODN-2006 <30 0> P, M, de o in <301> Hartmann G, Weeratna RD, Bailas ZK, Payette Blackwell S, suparto I, Rasmussen WL, Waldschmidt Sajuthi D, Purcell RH, Davis HL, Krieg AM <302> Delineação de um fosforotioato oligodesoxinucleoti CpG para ativar respostas imunes primatas in vitro e vivo <303> The Journal of Immunology <304> 164 <305> 3 <30 6> 1617-1624 <307> 2000-02-01 <400> 1 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 49

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • FR 2817875 [0002] • US 4997764 A [0003] • WO 9513089 A [0003] • US 5798230 A, Bornkamm [0003] • WO 9820734 A [0054] • US 5807715 A [0078] • US 6300104 A [0078] • GB 0304363 A [0125] • GB 0318431 A [0125] • GB 0325391 A [0125] • US 60516665 B [0125] Literatura não relacionada com patentes, citada na descrição • HOCK et al Nature Medicine, 2002, vol. 8, 1270-75 [0025] • MATTSON ; CHAN. Science, 2003, vol. 301, 1847-9 [0025] • Remington' s Pharmaceutical Sciences. Mack Publishing Company, 1991 [0057] • GENNARO. Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 2000 [0057] • Kuby Immunology. 2000 [0077] • JONES et al Biotechno/ Prog, 2003, vol. 19 (D , 163-8 [0078] • CHO et al. Cytotechnology, 2001 , vol. 37, 23 -30 [0078] • CHO et al. Biotechnol Prog, 2003, vol. 19, 229-32 [0078] 50 • BERNASCONI et al. A role for Toll-like receptors in acquired immunity: upregulation of TLR9 by BCR trig-gering in naive B cells and constitutive expression in memory B cells. Blood, 2003, vol. 101, 4500-04 [0124] • BERNASCONI et al. Maintenance of serological memory by polyclonal activation of human memory B cells. Science, 2002, vol. 298 (5601), 2199-202 [0124]

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Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um método para produzir linfócitos B de memória imortalizados, compreendendo a etapa de transformar linfócitos B de memória utilizando o virus de Epstein Barr (EBV) na presença de um ativador policlonal de célula B, caracterizado por o ativador policlonal de célula B ser um agonista de um Receptor de Reconhecimento de Padrão que é expresso em células B de memória.

2. Um método para produzir um clone de um linfócito B de memória humano imortalizado capaz de produzir um anticorpo monoclonal humano com uma especificidade do antigénio desejada, compreendendo as etapas de: (i) transformar uma população de células compreendendo ou consistindo em linfócitos B de memória humanos com vírus de Epstein Barr (EBV) na presença de um ativador policlonal de célula B caracterizado por o ativador policlonal de célula B ser um agonista de um Receptor de Reconhecimento de Padrão que é expresso em células B de memória; (ii) classificar o sobrenadante da cultura pela especificidade de antigénio; e (iii) isolar um clone de linfócito B de memória humano imortalizado capaz de produzir um anticorpo monoclonal humano que tem a especificidade do antigénio desejada.

3. Um método de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, caracterizado por o ativador policlonal de célula B ser um agonista de um Receptor Tipo Toll.

4. Um método de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizado por o ativador policlonal de célula B ser um agonista do Receptor Tipo Toll 7 (TLR-7), Receptor Tipo Toll 9 (TLR-9) e/ou Receptor Tipo Toll 10 (TLR-10). 2

5. Um método de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizado por o ativador policlonal de célula B ser selecionado a partir do grupo que consiste em: oligodesoxinucleotideos CpG; R-848 e outros compostos imidazoquinolina que estimulam TLR; imiquimod; loxoribina; 7-tia-8-oxoguanosina; 7-desazaguanosina; e anticorpos monoclonais que imitam os efeitos destes ativadores.

6. Um método de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizado por o ativador policlonal de célula B ser CpG 2006.

7. Um método de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizado por um estimulante adicional do crescimento e/ou diferenciação celular ser adicionado durante a etapa de transformação.

8. Um método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por dito estimulante adicional ser uma citocina.

9. Um método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por dita citocina ser IL-2 ou IL-15.

10. Um método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por a clonagem ser realizada utilizando diluição limitante.

11. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-9, caracterizado por a subpopulação de linfócitos B de memória humanos com uma especificidade de antigénio especifica serem selecionados antes da etapa de transformação. 3

12. Um método de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizado por o dito linfócito B de memória produzir um anticorpo dirigido contra patogénicos humanos tais como virus da SARS, vírus da imunodeficiência humana; vírus da hepatite A; vírus da hepatite B; vírus da hepatite C; vírus herpes simples tipo 1 ou tipo 2; vírus do sarampo; vírus da papeira; vírus da rubéola; vírus da raiva; vírus do Ébola; vírus da influenza; vírus do papiloma; vírus vaccinia; vírus da varicela-zóster; vírus da varíola; vírus da poliomielite; rinovírus; vírus sincicial respiratório; P. falciparum; P. vivax; P. malariae; P. ovale; Corynebacterium diphtheriae; Clostridium tetani; Clostridium botulinum; Bordetella pertussis; Haemophilus influenzae; Neisseria meningitidis, serogrupo A, B, C, W135 e/ou Y; Streptococcus pneumoniae; Streptococcus agalactiae; Streptococcus pyogenes; Staphylococcus aureus; Bacillus anthracis; Moraxella catarrhalis; Chlamydia trachomatis; Chlamydia pneumoniae; Yersinia pestis; Francisella tularensis; espécies de Salmonella; Vibrio cholerae; E. coli tóxica; um retrovírus endógeno humano; outros patogénicos microbianos; outras toxinas microbianas, alergénicos, antigénios tumorais, auto-antigénios e alo-antigénios, químicos ou toxinas.

13. Um método de produzir um anticorpo monoclonal humano, caracterizado por compreender a preparação de um linfócito B de memória humano imortalizado por um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 2-12, cultivar dito linfócito B de memória humano imortalizado e isolar o anticorpo monoclonal humano.

14. Um método para produzir um anticorpo monoclonal humano, caracterizado por compreender as etapas de: (i) preparar um linfócito B de memória humano imortalizado por um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4 12; (ii) obter o ácido nucleico do linfócito B de memória imortalizado; (iii) inserir o ácido nucleico num hospedeiro de expressão de maneira a permitir a expressão do anticorpo naquele hospedeiro.

15. 0 método da reivindicação 13 ou reivindicação 14, caracterizado por compreender ainda a etapa de misturar o anticorpo monoclonal isolado com um veiculo farmaceuticamente aceitável.

16. Um método de acordo com qualquer das reivindicações 1-12, caracterizado por os linfócitos B de memória não serem fundidos com outras células.

17. 0 método de qualquer das reivindicações 1-12, caracterizado por o linfócito B de memória ser um linfócito B de memória humano.

18. Um método para preparar uma célula recombinante, caracterizado por compreender as etapas de: (i) preparar um clone de célula B imortalizado pelo método de qualquer uma das reivindicações 1 a 12; (ii) obter o ácido nucleico do clone da célula B que codifica um anticorpo de interesse; e (iii) inserir o ácido nucleico num hospedeiro de expressão de maneira a permitir a expressão do anticorpo de interesse naquele hospedeiro.

19. Um método para preparar uma célula recombinante, caracterizado por compreender as etapas de: (i) preparar um clone de célula B imortalizado pelo método de qualquer uma das reivindicações 1 a 12; (ii) sequenciar o ácido nucleico do clone de célula B que codifica um anticorpo de interesse; e (iii) utilizar a informação da sequência da etapa (ii) para preparar o ácido nucleico para inserir num hospedeiro de expressão de maneira a permitir a expressão 5 do anticorpo de interesse naquele hospedeiro.

20. O método da reivindicação 18 ou da reivindicação 19, caracterizado por o hospedeiro de expressão ser uma célula de levedura, uma célula de planta ou uma célula animal.

21. Um método para preparar uma molécula de ácido nucleico que codifica um anticorpo de interesse, caracterizado por compreender as etapas de: (i) preparar um clone de célula B imortalizado pelo método de qualquer uma das reivindicações 1 a 12; (ii) obter do clone de célula B o ácido nucleico que codifica o anticorpo de interesse.

22. Um método para obter uma sequência de ácido nucleico que codifica um anticorpo de interesse, caracterizado por compreender as etapas de: (i) preparar um clone de célula B imortalizado pelo método de qualquer uma das reivindicações 1 a 12; (ii) sequenciar o ácido nucleico do clone de célula B que codifica o anticorpo de interesse.

23. Um método para preparar um anticorpo para uso farmacêutico, caracterizado por compreender as etapas de: (i) preparar uma célula B imortalizada que produz um anticorpo de interesse pelo método de qualquer uma das reivindicações 2 a 12; (ii) obter e/ou sequenciar o ácido nucleico que codifica o anticorpo de interesse a partir da célula B selecionada; (iii) inserir o ácido nucleico em ou utilizando o ácido nucleico para preparar um hospedeiro de expressão que pode expressar o anticorpo de interesse; (iv) cultivar ou subcultivar o hospedeiro de expressão em condições onde o anticorpo de interesse é expresso; e, opcionalmente, (v) purificar o anticorpo de interesse.

24. O método de acordo com qualquer uma das 6 reivindicações 18, 19 ou 23, caracterizado por o ácido nucleico ser manipulado entre as etapas (ii) e (iii) para introduzir locais de restrição, para alterar o uso do codão, e/ou para adicionar ou otimizar as sequências reguladoras da transcrição e/ou tradução.

25. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações 13, 14 ou 23, em que o anticorpo é dirigido contra o vírus sincicial respiratório (RSV).