ES2389930T5 - Producción de anticuerpos monoclonales mediante transformación con VEB de células B - Google Patents

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Description

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DESCRIPCION
Produccion de anticuerpos monoclonales mediante transformacion con VEB de celulas B Campo tecnico
La presente invencion se refiere a un procedimiento de preparacion de celulas B de memoria humanas inmortalizadas y a un procedimiento de preparacion de celulas B de memoria inmortalizadas capaces de producir un anticuerpo monoclonal con una especificidad de antigeno deseada. La invencion es particularmente util para preparar anticuerpos monoclonales humanos. En una realizacion, la invencion se refiere a un procedimiento de preparacion de celulas B de memoria humanas inmortalizadas capaces de producir anticuerpos espedficos para un agente infeccioso, mas particularmente donde el agente infeccioso es el virus del smdrome respiratorio agudo grave (SRAG). A continuacion se describen realizaciones adicionales.
Tecnica antecedente
El exito en generar anticuerpos monoclonales murinos depende de la fusion eficaz y selectiva de blastocitos B estimulados con antigeno con una lmea celular de mieloma murino seguida de la seleccion de hnbridos estables productores de anticuerpos (Kohler y Milstein 1975). El documento FR2817875 describe una version modificada de este protocolo donde antes de la inmortalizacion, se induce a los linfocitos B a diferenciarse mediante un sistema activador no espedfico y una citoquina. Los blastocitos B pueden obtenerse del bazo o ganglios linfaticos. Sin embargo, la dificultad en la obtencion de blastocitos B estimulados con antfgeno y la ausencia de companeros de fusion adecuados ha obstaculizado este enfoque en el sistema humano.
Como enfoque alternativo a crear anticuerpos humanos, se ha usado el virus de Epstein Barr (VEB) para inmortalizar celulas B humanas (y de primate) productoras de anticuerpos espedficos. El procedimiento de VEB se ha descrito en varias publicaciones desde 1977 (Rosen y col. 1977; Steinitz y col. 1977; Steinitz y col. 1980; Kozbor y Roder 1981; Lundgren y col. 1983; Rosen y col. 1983; Steinitz y col. 1984; Lanzavecchia 1985). Las celulas B se inmortalizan por infeccion con VEB y se seleccionan los clones en cultivo que secretan anticuerpos espedficos. El procedimiento no requiere refuerzo antigenico, ya que VEB inmortaliza tambien celulas B humanas en reposo. Sin embargo, el procedimiento basado en VEB tiene varias limitaciones, concretamente la baja eficacia de la inmortalizacion, la baja eficacia de clonacion de las celulas B inmortalizadas con VEB, la baja tasa de crecimiento y, en algunos casos, la baja produccion de anticuerpos. El documento US4997764 describe un procedimiento para mejorar la tasa de crecimiento de las celulas inmortalizadas con VEB que comprende transfectar celulas B infectadas con VEB con ADN c-myc activado. Esto confiere a las celulas la capacidad de crecer en medios semi- solidos y de crecer en huespedes tales como ratas y ratones. El documento WO95/13089 describe el uso de GM- CSF e IL-3 para estimular la liberacion de anticuerpos por celulas B. Bomkamm y col. (documento US5798230) han superado el problema de la baja produccion de anticuerpos inactivando EBNA2. Sin embargo, esto no resuelve el problema de la baja eficacia de inmortalizacion. Para sortear estos problemas algunos autores han realizado un enriquecimiento de las celulas B espedficas de antfgeno antes de la inmortalizacion con VEB usando, por ejemplo, antfgenos solubles biotinilados (Casali y col. 1986). Otros propusieron la fusion de las celulas inmortalizadas con VEB con mielomas de raton o heteromielomas humanos-de raton para explotar la mayor tasa de crecimiento y secrecion de Ig de los hnbridos (Kozbor y col. 1982; Bron y col. 1984; Thompson y col. 1986). Se han hecho reivindicaciones de que la eficacia de clonacion podna aumentarse por factores de crecimiento derivados de celulas tales como tiorredoxina en una publicacion (Ifversen y col. 1993), pero estos resultados ni se han confirmado ni se han utilizado, incluso por los mismos autores. En conclusion, aunque el procedimiento de VEB tiene, en principio, algunas ventajas, se ha abandonado a causa de la baja eficacia de inmortalizacion y clonacion.
Otra razon por la cual el procedimiento de VEB se ha quedado obsoleto es que han llegado a estar disponibles enfoques alternativos para crear anticuerpos monoclonales humanos o tipo humano a traves de ingeniena genetica. Estos incluyen la humanizacion de anticuerpos murinos, el aislamiento de anticuerpos a partir de bibliotecas de diferente complejidad y la produccion de hibridomas usando el procedimiento clasico en ratones transgenicos para loci de Ig humana (el "xeno-raton"). La bibliograffa sobre estos enfoques alternativos no se revisa aqrn ya que no es directamente relevante para la presente invencion. Sin embargo, merece la pena considerar algunas limitaciones de estos procedimientos. La humanizacion de anticuerpos monoclonales murinos es un procedimiento laborioso e incompleto. Las bibliotecas de anticuerpos aleatorios representan un repertorio no sesgado y por lo tanto pueden usarse para seleccionar especificidades de anticuerpos contra antfgenos altamente conservados, pero conducen a anticuerpos de baja afinidad. Las bibliotecas seleccionadas a partir de celulas B sensibilizadas con antfgeno se enriquecen para una especificidad particular, pero no conservan el par VH-VL original y generalmente conducen a anticuerpos que tienen menor afinidad por el antfgeno que aquellos presentes en el repertorio original de anticuerpos. El impacto de esta tecnologfa ha sido limitado. En contraste, el xeno-raton puede inmunizarse de forma eficaz contra un antfgeno de eleccion (especialmente si este es un antfgeno humano), pero este sistema comparte con la tecnologfa clasica del hibridoma murino la limitacion de que los anticuerpos se seleccionan en una especie diferente a la humana. Por lo tanto, estos procedimientos no son adecuados para producir anticuerpos con las caractensticas de los producidos en el transcurso de una respuesta inmune humana fisiologica. Esto es aplicable a la respuesta de anticuerpos contra patogenos humanos incluyendo VIH, las cuatro especies de Plasmodium que causan la malaria en seres humanos (P. falciparum, P. vivax, P. malariae y P. ovale), los virus de la hepatitis By C
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humana, el virus del sarampion, virus del Ebola, etc. (para una lista exhaustiva vease Fields y col. 1996). Tambien es aplicable a respuestas de anticuerpos contra alergenos ambientales generados en pacientes alergicos, contra antigenos tumorales generados en pacientes que albergan tumores y contra auto-antigenos en pacientes con enfermedades autoinmunes.
Por lo tanto, existe la necesidad de un procedimiento de produccion eficaz de anticuerpos monoclonales humanos que se hayan seleccionado en el transcurso de la respuesta inmune natural.
Divulgacion de la invencion
La invencion se basa en el descubrimiento de que un activador de celulas B policlonales (tal como secuencias CpG) potencia la eficacia de la inmortalizacion por VEB y de la clonacion de celulas inmortalizadas por VEB. Esta eficacia aumentada representa un gran salto que hace que la tecnica de VEB sea adecuada para el rapido aislamiento de grandes cantidades de anticuerpos monoclonales humanos a partir del repertorio de memoria sin necesidad de inmunizacion espedfica o iniciacion. Los anticuerpos se seleccionan del entorno inmunocompetente fisiologico estimulado por contacto natural con un patogeno o antigeno. El procedimiento, por lo tanto, es particularmente util para producir anticuerpos contra determinantes antigenicos que se reconocen espedficamente por el sistema inmune humano. Estos incluyen anticuerpos neutralizantes contra patogenos humanos y anticuerpos contra alergenos, anticuerpos tumorales, auto-antfgenos y alo-antfgenos que son parte del repertorio de memoria de un individuo dado. Por lo tanto, no hay necesidad de crear modelos de enfermedad o de inmunizacion con antfgenos purificados. Los anticuerpos producidos tambien son completamente humanos (incluyendo modificaciones nativas post-traduccionales cuando se expresan en celulas B) y aprovechan toda la diversidad generada en el transcurso de una respuesta inmune humana (maduracion de afinidad). Por tanto, la invencion proporciona, inter alia, un procedimiento para producir linfocitos B de memoria humanos inmortalizados, que comprende la etapa de transformar linfocitos B de memoria humanos usando el virus de Epstein Barr (VEB) en presencia de un activador de celulas B policlonales. El procedimiento permite una transformacion de eficacia extremadamente elevada por primera vez.
En un aspecto adicional, la invencion proporciona un procedimiento para producir un clon de un linfocito B de memoria humano inmortalizado capaz de producir un anticuerpo monoclonal humano con una especificidad de antfgeno deseada, que comprende las etapas de:
(i) transformar una poblacion de celulas que comprende o que consta de linfocitos B de memoria humanos con virus de Epstein Barr (VEB) en presencia de un activador de celulas B policlonales;
(ii) explorar el sobrenadante de cultivo para la especificidad de antfgeno; y
(iii) aislar un clon de linfocito B de memoria humano inmortalizado capaz de producir un anticuerpo monoclonal humano que tiene la especificidad de antfgeno deseada.
Los procedimientos de la invencion ya se han usado para clonar linfocitos B de memoria humanos con hasta un 100 % de eficacia. Se han producido clones de celulas B transformadas con VEB que producen anticuerpos IgG neutralizantes espedficos para el virus del sarampion, las especies de Plasmodium que causan la malaria en seres humanos, el toxoide tetanico, Toxoplasma gondii y aloantfgenos usando este procedimiento. Ademas, tambien se han producido clones de celulas B transformadas con VEB que producen anticuerpos IgG neutralizantes espedficos para el coronavirus (CoV) del SRAG. Se apreciara que el procedimiento puede transferirse y usarse para la produccion de anticuerpos contra cualquier especificidad que este presente en el repertorio de memoria humano.
La repentina aparicion del SRAG en 2002 en China causo cientos de muertes en varios pafses. El agente causante se desconoda y por tanto no habfa cura disponible. Desde entonces se ha descubierto que el smdrome esta causado por un nuevo tipo de coronavirus (Drosten y col. 2003; Ksiazek y col. 2003) y se requieren procedimientos para detectar este virus y combatir las infecciones causadas por el mismo.
Se describe un procedimiento de produccion de un clon de linfocitos B de memoria humanos inmortalizados capaz de producir un anticuerpo monoclonal humano espedfico para el virus del SRAG, que comprende las etapas de:
(i) transformar una poblacion de celulas que comprende o que consta de linfocitos B de memoria humanos con virus de Epstein Barr (VEB) en presencia de un activador de celulas B policlonales,
(ii) explorar el sobrenadante de cultivo para la especificidad por el virus del SRAG, y
(iii) aislar un clon de linfocito B de memoria humano inmortalizado capaz de producir un anticuerpo monoclonal humano que tiene especificidad por el virus de SRAG.
En la presente memoria descriptiva, el termino "anticuerpo que tiene especificidad por el virus del SRAG" significa que una molecula de anticuerpo se une al coronavirus que es el agente causante del SRAG con una mayor afinidad en comparacion con su afinidad de union por otros virus.
En lmeas generales, la invencion tambien proporciona un procedimiento de produccion de linfocitos B de memoria humanos inmortalizados, que comprende una etapa de transformar una poblacion de linfocitos B de memoria humanos, donde el procedimiento transforma >n% de los linfocitos B de memoria humanos en la poblacion. El valor de n se selecciona entre 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 y 100. Despues de producir las celulas
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inmortalizadas, entonces pueden explorarse para seleccionar celulas que produzcan anticuerpos con una especificidad deseada. Las celulas seleccionadas despues pueden usarse para la produccion de anticuerpos monoclonales. Este procedimiento preferiblemente no implica la fusion celular de linfocitos B de memoria con otras celulas.
Activadores policlonales
En la presente memoria descriptiva, la expresion "activador policlonal" significa una molecula o compuesto o una combinacion de los mismos que activa los linfocitos B independientemente de su especificidad antigenica.
Los receptores tipo Toll (TLR) son receptores de reconocimiento de patrones del sistema inmune innato expresados en una diversidad de celulas, incluyendo celulas dendnticas y celulas B (Medzhitov y Janeway 2000, 2002). Los agonistas de TLR incluyen productos microbianos y compuestos sinteticos. Los activadores policlonales preferidos son agonistas de los receptores tipo Toll que se expresan en celulas B de memoria humanas, tales como TLR-7, TLR-9 y TLR-10 (Bernasconi y col. 2003). Dichas moleculas pueden ser de origen microbiano o celular o sinteticas.
Oligonucleotidos de ADN no metilado (CpG) son agonistas de TLR-9. Estimulan la maduracion de celulas dendnticas y activan la proliferacion de celulas B y la diferenciacion de forma policlonal, es decir independientemente de la especificidad del anticuerpo (Krieg y col. 1995; Krieg 2002). El efecto biologico de CpG depende de las secuencias espedficas y las modificaciones qmmicas (Krieg 2002). Los oligonucleotidos CpG pueden usarse como activadores policlonales, y ejemplos de activadores adecuados son CpG tales como CpG 2006 (5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3'; Hartmann y col. 2000) y otras secuencias oligonucleotidicas que activan TLR-9. Por "CpG" se entiende secuencias de oligonucleotidos de ADN no metilado. Mas particularmente, el termino "CpG" incluye moleculas de ADN monocatenario de entre 5 y 100 nucleotidos de longitud (por ejemplo, 10-80, 20-70, 30-60 nucleotidos) que incluyen uno o mas casos (por ejemplo, 2, 4, 6, 8, 10 o mas) de la secuencia dinucleotfdica CG en que la C en el o los dinucleotidos esta sin metilar.
Los compuestos de imidazoquinolina, tales como R-848 (resiquimod), activan TLR-7 y TLR-8 y estimulan la maduracion de celulas dendnticas (Hemmi y col. 2002). Dichos compuestos pueden usarse como activadores policlonales con la invencion, por ejemplo, R-848 (y sus analogos) y otros compuestos sinteticos que activan TLR-7 y TLR-8, incluyendo, aunque sin limitacion: imiquimod, loxoribina, y analogos de guanosina (por ejemplo, 7-tia-8- oxoguanosina y 7-desazaguanosina).
Otros activadores policlonales incluyen otros agonistas de TLR y de otros receptores de reconocimiento de patrones (PRR) que se expresan en celulas B de memoria, incluyendo anticuerpos monoclonales espedficos para TLR.
Los activadores policlonales tambien pueden incluir PAMP (patrones moleculares asociados a patogenos), tales como lipopolisacarido (LPS), peptidoglucanos, flagelinas, zimosan y otros componentes de pared celular encontrados en patogenos. Otros activadores policlonales disponibles incluyen loxoribina, Acholeplasma ladilawii inactivada por calor, Listeria monocytogenes inactivada por calor, acidos lipoteicoicos, lipopeptidos tripalmitoilados (por ejemplo, Pam3CSK4), ARN monocatenario (Diebold y col. 2004; Heil y col. 2004), aRn bicatenario, poli(I:C), ADN bacterianos, etc. Puede encontrarse una lista detallada de agonistas de TLR en Takeda y col. (2003). Algunos activadores no son preferidos para su uso con celulas B humanas, por ejemplo, LPS.
En un aspecto particularmente preferido, se usa CpG 2006 como activador policlonal.
Los proveedores comerciales de activadores policlonales adecuados incluyen Invivogen.
Recientemente se ha demostrado que las celulas B de memoria humanas se estimulan selectivamente por CpG (Bernasconi y col. 2002), y que varios TLR se expresan selectivamente en celulas B de memoria humanas pero no en celulas B no tratadas previamente (Bernasconi y col. 2003).
Transformacion de celulas B
En procedimientos de la invencion, las celulas humanas pueden transformarse con VEB en presencia de un activador de celulas B policlonales. La transformacion con VEB es una tecnica convencional y puede adaptarse facilmente para incluir activadores de celulas B policlonales.
Pueden anadirse estimulantes adicionales del crecimiento celular y la diferenciacion durante la etapa de transformacion para potenciar adicionalmente la eficacia. Estos estimulantes pueden ser citoquinas tales como IL-2 e IL-15. En un aspecto particularmente preferido, se anade IL-2 durante la etapa de inmortalizacion para mejorar adicionalmente la eficacia de la inmortalizacion, pero su uso no es esencial.
Las celulas B de memoria humanas a transformar pueden provenir de diversas fuentes (por ejemplo, de sangre completa, de celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC), de cultivo de sangre, de medula osea, de organos, etc.), y los procedimientos adecuados para obtener celulas B humanas son bien conocidos en la tecnica. Las muestras pueden incluir celulas que no son celulas B de memoria, por ejemplo, otras celulas sangumeas. Puede seleccionarse una subpoblacion espedfica de linfocitos B de memoria humanos que muestre una especificidad de
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antigeno deseada antes de la etapa de transformacion usando procedimientos conocidos en la tecnica En una realizacion, la subpoblacion de linfocitos B de memoria humanos puede tener especificidad por el virus del SRAG, por ejemplo, las celulas B pueden obtenerse de un paciente que este padeciendo o se haya recuperado del SRAG. En otra realizacion, las celulas B pueden obtenerse de sujetos con enfermedad de Alzheimer e incluyen celulas B con especificidad por p-amiloide (por ejemplo, Hock y col. (2002) Nature Medicine 8:1270-75; Mattson y Chan (2003) Science 301:1847-9; etc.).
Exploracion y aislamiento de celulas B
Las celulas B humanas transformadas se exploran para aquellas que tengan la especificidad de antfgeno deseada, y despues pueden producirse clones de celulas B individuales a partir de las celulas positivas.
La etapa de exploracion puede realizarse por ELISA, por tincion de tejidos o celulas (incluyendo celulas transfectadas), un ensayo de neutralizacion o uno de varios procedimientos diferentes conocidos en la tecnica para identificar la especificidad de antigeno deseada. El ensayo puede seleccionar basandose en el simple reconocimiento de antigeno, o puede seleccionar adicionalmente basandose en una funcion deseada, por ejemplo, para seleccionar anticuerpos neutralizantes en lugar de solamente anticuerpos que se unan a antigeno, para seleccionar anticuerpos que puedan cambiar las caractensticas de las celulas marcadas como diana, tales como sus cascadas de senalizacion, su forma, su tasa de crecimiento, su capacidad de influir sobre otras celulas, su respuesta a la influencia por otras celulas o por otros reactivos o por un cambio en las condiciones, su estado de diferenciacion, etc.
La etapa de clonacion para separar clones individuales de la mezcla de celulas positivas puede realizarse usando dilucion limitante, micromanipulacion, deposicion de celulas individuales por clasificacion celular u otro procedimiento conocido en la tecnica. Preferiblemente la clonacion se realiza usando dilucion limitante.
Los procedimientos de la invencion producen celulas B inmortalizadas que producen anticuerpos que tienen una especificidad de antigeno deseada. La invencion, por tanto, proporciona un clon de celula B inmortalizada que se puede obtener o que se obtiene por los procedimientos de la invencion. Estas celulas B pueden usarse de diversos modos, por ejemplo, como fuente de anticuerpos monoclonales, como fuente de acido nucleico (ADN o ARNm) que codifica un anticuerpo monoclonal de interes, para su suministro a pacientes para terapia celular, para investigacion, etc.
Se describe una composicion que comprende linfocitos B de memoria humanos inmortalizados, en la que los linfocitos producen anticuerpos, y en la que los anticuerpos se producen a >10N ng por clon por dfa. Tambien se describe una composicion que comprende clones de un linfocito B de memoria inmortalizado, en la que los clones producen un anticuerpo monoclonal de interes, y en la que el anticuerpo se produce a >10N ng por clon por dfa. El valor de N se selecciona entre -3, -2, -1, 0, 1, 2, 3 o 4.
Anticuerpos
Se describe un anticuerpo monoclonal que se puede obtener o se obtiene de clones de celulas B usados en el procedimiento de la invencion, y fragmentos de estos anticuerpos monoclonales, particularmente fragmentos que conservan la actividad de union a antigeno de los anticuerpos.
En general, estos anticuerpos pertenecen a dos categonas: reconocen auto-antigenos o no auto-antfgenos. Los anticuerpos que reconocen auto-antfgenos pueden usarse para tratar enfermedades causadas por expresion genica aberrante, incluyendo canceres, y por procesamiento aberrante de protemas, incluyendo la enfermedad de Alzheimer. Los anticuerpos que reconocen no auto-antfgenos pueden usarse para tratar enfermedades infecciosas, incluyendo infecciones parasitarias, vmcas y bacterianas. La invencion puede proporcionar ventajosamente anticuerpos humanos que reconocen antfgenos de interes donde no ha sido previamente posible.
Los procedimientos de la invencion producen anticuerpos con las caractensticas de los producidos en el trascurso de una respuesta inmune humana fisiologica, es decir, especificidades de anticuerpo que pueden seleccionarse solamente por el sistema inmune humano. Esto es aplicable a la respuesta contra patogenos humanos incluyendo el VIH, las especies de Plasmodium que causan la malaria humana, los virus de la hepatitis By C humana, el virus del sarampion, el virus del Ebola, el virus del SRAG, poxvirus, Bunyaviridae, Arenaviridae, Bornaviridae, Reoviridae (incluyendo rotavirus y orbivirus), Retroviridae (incluyendo vLhT-I, VLHT-II, VIH-1, VIH-2), Polyomaviridae, Papillomaviridae, Adenoviridae, Parvoviridae, Herpesviridae (incluyendo los virus del herpes simple 1 y 2, citomegalovirus, virus de varicela-zoster, los herpesvirus 6A, 6B y 7), Poxviridae, Hepadnaviridae, etc. (para una lista exhaustiva vease Fields y col. 1996). Tambien es aplicable a respuestas de anticuerpos contra alergenos ambientales generados en pacientes alergicos, contra protemas priones, contra antfgenos tumorales generados en pacientes que albergan tumores y contra auto-antfgenos en pacientes con enfermedades autoinmunes, contra protemas amiloides, etc. Estos anticuerpos pueden usarse como agentes profilacticos o terapeuticos tras su formulacion apropiada o como herramienta de diagnostico.
En relacion a cualquier patogeno particular, un "anticuerpo neutralizante" es uno que puede neutralizar la capacidad de ese patogeno de iniciar y/o perpetuar una infeccion en un huesped. Se describe un anticuerpo humano
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monoclonal neutralizante, en el que el anticuerpo reconoce un antfgeno de un patogeno seleccionado entre: el virus de la inmunodeficiencia humana; el virus de la hepatitis A; el virus de la hepatitis B; el virus de la hepatitis C; el virus del herpes simple tipo I o tipo 2; el coronavirus del SRAG; el virus del sarampion; el virus de las paperas; el virus de la rubeola; el virus de la rabia; el virus del Ebola; el virus de la gripe; el virus del papiloma; el virus vaccinia; el virus de varicela-zoster; el virus de la viruela; el virus de la polio; el rinovirus; el virus sincitial respiratorio; P. falciparum; P. vivax; P. malariae; P. ovale; Corynebacterium diphtheriae; Clostridium tetani; Clostridium botulinum; Bordetella pertussis; Haemophilus influenzae; Neisseria meningitidis, serogrupo A, B, C, W135 y/o Y; Streptococcus pnewnoniae; Streptococcus agalactiae; Streptococcus pyogenes; Staphylococcus aureus; Bacillus anthracis; Moraxella catarrhalis; Chlaymdia trachomatis; Chlamydia pneumoniae; Yersinia pestis; Francisella tularensis; especies de Salmonella; Vibrio cholerae; E. coli toxica; un retrovirus endogeno humano; etc.
Tambien se describen anticuerpos monoclonales humanos que reconocen protemas expresadas espedficamente en tumores, en celulas cardiovasculares enfermas, durante respuestas inflamatorias, en trastornos neurologicos (incluyendo enfermedad de Alzheimer, por ejemplo, protemas p-amiloides), en encefalopatias, etc. Tambien se describen anticuerpos monoclonales humanos que reconocen sustancias narcoticas tales como cocama, heroma, benzoilecgonina, anfetaminas, etc.
Los antigenos espedficos que pueden reconocerse por dichos anticuerpos incluyen, aunque sin limitacion: TNF-a, protema p-amiloide, la protema espiga del coronavirus SRAG, la protema prion PrP, complemento C5, CBL, CD147, IL-8, glucoprotema gp120 de VIH, VLA-4, CD11a, CD18, VEGF, CD40L, moleculas de adhesion celular tales como ICAM y VCAM, CD80, integrinas, TPL2, Her2, etc.
Tambien se describe un anticuerpo que tiene dos cadenas polipeptfdicas, en el que una o ambas cadenas polipeptfdicas tienen una secuencia VDJ humana.
Los anticuerpos monoclonales producidos por los procedimientos de la invencion pueden purificarse adicionalmente, si se desea, usando filtracion, centrifugacion y diversos procedimientos cromatograficos tales como HPLC o cromatograffa de afinidad. Las tecnicas para la purificacion de anticuerpos monoclonales, incluyendo tecnicas para producir anticuerpos de calidad farmaceutica, son bien conocidas en la tecnica.
Pueden obtenerse fragmentos de los anticuerpos monoclonales a partir de los anticuerpos monoclonales producidos de este modo por procedimientos que incluyen digestion con enzimas, tales como pepsina o papama, y/o por escision de enlaces disulfuro por reduccion qmmica. Los "fragmentos" de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, F(ab')2 y Fv. Tambien se describen fragmentos Fv de cadena sencilla (scFv) obtenidos de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo monoclonal.
Tambien se describe un anticuerpo humano monoclonal con actividad neutralizante, en el que el anticuerpo puede
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neutralizar a una concentracion de 10' M o inferior (por ejemplo, 10' M, 10' M, 10' M o inferior).
Los anticuerpos monoclonales son particularmente utiles en la identificacion y purificacion de los polipeptidos individuales u otros antfgenos contra los que estan dirigidos. Los anticuerpos monoclonales descritos tienen utilidad adicional porque pueden emplearse como reactivos en inmunoensayos, radioinmunoensayos (RIA) o ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA). En estas aplicaciones, los anticuerpos pueden marcarse con un reactivo analfticamente detectable tal como un radioisotopo, una molecula fluorescente o una enzima. Los anticuerpos monoclonales producidos por el procedimiento anterior tambien puede usarse para la identificacion y caracterizacion molecular (mapeo de epttopos) de antfgenos reconocidos por individuos protegidos en patogenos complejos tales como plasmodios, el aislamiento de anticuerpos protectores de reactividad cruzada en el caso de patogenos altamente variables tales como los encontrados en el VIH y para la deteccion de patogenos y la determinacion de su variabilidad.
Los anticuerpos pueden acoplarse a un farmaco para su suministro a un sitio de tratamiento o acoplarse a un marcador detectable para facilitar la formacion de imagenes de un sitio que comprende celulas de interes, tales como celulas cancerosas. Los procedimientos para acoplar anticuerpos a farmacos y marcadores detectables son bien conocidos en la tecnica, como los procedimientos para la formacion de imagenes usando marcadores detectables.
Los anticuerpos pueden unirse a un soporte solido.
Los anticuerpos pueden proporcionarse en forma purificada. Tfpicamente, el anticuerpo estara presente en una composicion que esta sustancialmente libre de otros polipeptidos, por ejemplo, donde menos del 90 % (en peso), habitualmente menos del 60 % y mas habitualmente menos del 50 % de la composicion esta compuesta de otros polipeptidos.
Los anticuerpos pueden ser inmunogenicos en huespedes no humanos (o heterologos), por ejemplo, en ratones. En particular, los anticuerpos pueden tener un idiotipo que es inmunogenico en huespedes no humanos, pero no en un huesped humano. Los anticuerpos para su uso en seres humanos incluyen aquellos que no pueden obtenerse de huespedes tales como ratones, cabras, conejos, ratas, marnfferos no primates, etc. y no pueden obtenerse por humanizacion o a partir de xeno-ratones.
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Los anticuerpos pueden ser de cualquier isotipo (por ejemplo, IgA, IgG, IgM, es dedr, una cadena pesada a, y o |i), pero generalmente seran IgG. Dentro del isotipo IgG, los anticuerpos pueden ser de la subclase IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. Los anticuerpos pueden tener una cadena ligera k o X.
Tambien se describe una celula de linfocito B de memoria humano inmortalizado, en la que la celula se infecta con VEB y codifica un anticuerpo de la invencion.
Composiciones farmaceuticas
El uso de anticuerpos monoclonales como el principio activo de composiciones farmaceuticas ahora esta extendido, incluyendo los productos Herceptin™ (trastuzumab), Rituxan™, Campath™, Remicade™, ReoPro™, Mylotarg™, Zevalin™, Omalizumab, Synagis™ (Palivizumab), Zenapax™ (daclizumab), etc. Estas incluyen anticuerpos que reconocen auto-antigenos humanos (por ejemplo, Herceptin™ reconoce el marcador Her2) y anticuerpos que reconocen antigenos patogenicos (por ejemplo, Synagis™ reconoce un antigeno del virus sincitial respiratorio).
Por tanto, se describe una composicion farmaceutica que contiene los anticuerpos monoclonales y/o las celulas B transformadas. Una composicion farmaceutica tambien puede contener un vetnculo farmaceuticamente aceptable para la administracion del anticuerpo. El vetnculo no debe inducir por sf mismo la produccion de anticuerpos daninos para el individuo que recibe la composicion y no debe ser toxico. Los vehnculos adecuados pueden ser macromoleculas grandes, metabolizadas lentamente tales como protemas, polipeptidos, liposomas, polisacaridos, acidos polilacticos, acidos poliglicolicos, aminoacidos polimericos, copoKmeros de aminoacidos y partfculas vmcas inactivas.
Pueden usarse sales farmaceuticamente aceptables, por ejemplo, sales de acidos minerales, tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos y sulfatos, o sales de acidos organicos, tales como acetatos, propionatos, malonatos y benzoatos.
Los vehnculos farmaceuticamente aceptables en las composiciones terapeuticas pueden contener adicionalmente lfquidos tales como agua, solucion salina, glicerol y etanol. Ademas, pueden estar presentes sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes o sustancias tamponantes del pH, en dichas composiciones. Dichos vehnculos posibilitan que las composiciones farmaceuticas se formulen en forma de comprimidos, pfldoras, grageas, capsulas, lfquidos, geles, jarabes, pastas y suspensiones, para su ingestion por el paciente.
Las formas preferidas para la administracion incluyen formas adecuadas para administracion parenteral, por ejemplo por inyeccion o infusion, por ejemplo, por inyeccion en embolada o infusion continua. Cuando el producto es para inyeccion o infusion, puede adoptar la forma de una suspension, solucion o emulsion en un vetnculo oleoso o acuoso y puede contener agentes de formulacion, tales como agentes de suspension, conservantes, estabilizadores y/o dispersantes. Como alternativa, la molecula de anticuerpo puede estar en forma seca, para su reconstitucion antes de su uso con un lfquido esteril apropiado.
Una vez formuladas, las composiciones pueden administrarse directamente al sujeto. Se prefiere que las composiciones esten adaptadas para su administracion a sujetos humanos.
Las composiciones farmaceuticas pueden administrarse por cualquiera de varias vfas incluyendo, aunque sin limitacion, via oral, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intramedular, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, transdermica, transcutanea (por ejemplo, documento WO98/20734), topica, subcutanea, intranasal, enteral, sublingual, intravaginal o rectal. Tambien pueden usarse hipopulverizaciones para administrar las composiciones farmaceuticas. Tfpicamente, las composiciones terapeuticas pueden prepararse en forma de inyectables, como soluciones o suspensiones lfquidas. Tambien pueden prepararse formas solidas adecuadas para solucion en, o suspension en, vehnculos lfquidos antes de su inyeccion.
El suministro directo de las composiciones generalmente se conseguira por inyeccion, por via subcutanea, intraperitoneal, intravenosa o intramuscular, o suministrada al espacio intersticial de un tejido. Las composiciones tambien pueden administrarse en el interior de una lesion. El tratamiento posologico puede ser un programa de dosis unica o un programa de multiples dosis. Las composiciones farmaceuticas conocidas basadas en anticuerpos proporcionan directrices que se refieren a la frecuencia de administracion, por ejemplo, si una composicion farmaceutica debe suministrarse diariamente, semanalmente, mensualmente, etc. La frecuencia y dosificacion tambien pueden depender de la gravedad de los smtomas.
Se apreciara que el principio activo en la composicion sera una molecula de anticuerpo. Por tanto, sera susceptible a la degradacion en el tracto gastrointestinal. Por tanto, si la composicion tiene que administrarse por una via usando el tracto gastrointestinal, la composicion tendra que contener agentes que protejan al anticuerpo de la degradacion pero que liberen el anticuerpo una vez se haya absorbido desde el tracto gastrointestinal.
Esta disponible un analisis minucioso de los vehfculos farmaceuticamente aceptables en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991) y en Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a edicion, ISBN: 0683306472.
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Las composiciones farmaceuticas generalmente tienen un pH entre 5,5 y 8,5, preferiblemente entre 6 y 8, y mas preferiblemente de aproximadamente 7. El pH puede mantenerse mediante el uso de un tampon. La composicion puede ser esteril y/o libre de pirogenos. La composicion puede ser isotonica con respecto a los seres humanos. Las composiciones farmaceuticas se suministran preferiblemente en recipientes sellados hermeticamente.
Las composiciones farmaceuticas incluiran una cantidad eficaz de uno o mas anticuerpos y/o una o mas celulas B transformadas, es decir, una cantidad que es suficiente para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad o afeccion deseada, o para mostrar un efecto terapeutico detectable. Los efectos terapeuticos tambien incluyen reduccion en los smtomas ffsicos. La cantidad eficaz precisa para cualquier sujeto particular dependera de su tamano y salud, la naturaleza y grado de la afeccion, y los agentes terapeuticos o combinacion de agentes terapeuticos seleccionados para su administracion. La cantidad eficaz para una situacion dada se determina por experimentacion rutinaria y entra dentro del criterio del medico. Para propositos de la presente invencion, una dosis eficaz generalmente sera de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, o de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg de las composiciones en el individuo al que se administra. Las composiciones farmaceuticas conocidas basadas en anticuerpos proporcionan directrices a este respecto, por ejemplo, Herceptin™ se administra mediante infusion intravenosa de una solucion de 21 mg/ml, con una dosis de carga inicial de 4 mg/kg de peso corporal y una dosis de mantenimiento semanal de 2 mg/kg de peso corporal; Rituxan™ se administra semanalmente a 375 mg/m2; etc.
Las composiciones pueden incluir mas de un anticuerpo (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, etc.), particularmente cuando dichos anticuerpos se unen a diferentes antfgenos (o a diferentes epttopos en el mismo antfgeno) para proporcionar un efecto terapeutico sinergico.
Los anticuerpos pueden administrarse (combinados o por separado) con otros agentes terapeuticos, por ejemplo, con compuestos quimioterapeuticos, con radioterapia, etc.
En composiciones que incluyen anticuerpos, los anticuerpos preferiblemente componente al menos el 50 % en peso (por ejemplo, el 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o mas) de las protemas totales en la composicion. Los anticuerpos estan, por tanto, en forma purificada.
Se describe un procedimiento de preparacion de una composicion farmaceutica, que comprende las etapas de:
(i) preparar un anticuerpo monoclonal y (ii) mezclar el anticuerpo purificado con uno o mas vehmulos farmaceuticamente aceptables.
Tambien se describe un procedimiento de preparacion de una composicion farmaceutica, que comprende la etapa de mezclar un anticuerpo monoclonal con uno o mas vehmulos farmaceuticamente aceptables, en el que el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal que se obtuvo de una celula B transformada. Por tanto, los procedimientos para obtener primero el anticuerpo monoclonal y preparar despues la composicion farmaceutica, pueden realizarse en momentos muy diferentes por personas diferentes en lugares (por ejemplo, en diferentes pafses).
Como alternativa al suministro de anticuerpos monoclonales o celulas B para propositos terapeuticos, es posible suministrar a un sujeto acido nucleico (tfpicamente ADN) que codifique el anticuerpo monoclonal (o fragmento activo del mismo) de interes, de modo que el acido nucleico pueda expresarse en el sujeto in situ para proporcionar un efecto terapeutico deseado. La terapia genica y los vectores de suministro de acido nucleico adecuados son conocidos en la tecnica.
Tratamientos medicos y usos
Los anticuerpos monoclonales o fragmentos de los mismos pueden usarse para el tratamiento de enfermedades, para la prevencion de enfermedades o para el diagnostico de enfermedades. Preferiblemente, los anticuerpos monoclonales se usan para la prevencion o tratamiento del SRAG o para el diagnostico del SRAG. Los procedimientos de diagnostico pueden incluir poner en contacto un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo con una muestra. Los procedimientos de diagnostico tambien pueden incluir la deteccion de un complejo antfgeno/anticuerpo.
Se describe una composicion para su uso como medicamento, el uso de un anticuerpo en la preparacion de un medicamento para el tratamiento de un paciente y/o el diagnostico en un paciente, y un procedimiento para tratar a un sujeto y/o para realizar el diagnostico en un sujeto, que comprende la etapa de administrarle una composicion. El sujeto es preferiblemente un ser humano. Un modo de comprobar la eficacia del tratamiento terapeutico implica controlar los smtomas de la enfermedad despues de la administracion de la composicion. El tratamiento puede ser un programa de una unica dosis o un programa de multiples dosis, y puede ser para tratar enfermedades infecciosas, canceres, enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, etc.
Los anticuerpos pueden usarse en inmunizacion pasiva.
Las composiciones generalmente se administraran directamente a un paciente. El suministro directo puede
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conseguirse por inyeccion parenteral (por ejemplo, por via subcutanea, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, o al espacio intersticial de un tejido), o por administracion rectal, oral (por ejemplo, comprimido, pulverizacion), vaginal, topica, transdermica o transcutanea, intranasal, ocular, aural, pulmonar u otra administracion a la mucosa.
Las composiciones pueden prepararse en diversas formas. Por ejemplo, las composiciones pueden prepararse en forma de inyectables, como soluciones o suspensiones lfquidas. Tambien pueden prepararse formas solidas para solucion en, o suspension en, vetnculos Kquidos antes de su inyeccion (por ejemplo, una composicion liofilizada, como Synagis™ y Herceptin™, para su reconstitucion con agua esteril que contiene un conservante). La composicion puede prepararse para administracion topica, por ejemplo, en forma de una pomada, crema o polvo. La composicion puede prepararse para administracion oral, por ejemplo, en forma de un comprimido o capsula, en forma de una pulverizacion, o en forma de un jarabe (opcionalmente aromatizado). La composicion puede prepararse para administracion pulmonar, por ejemplo, en forma de un inhalador, usando un polvo fino o una pulverizacion. La composicion puede prepararse en forma de un supositorio o pesario. La composicion puede prepararse para administracion nasal, aural u ocular, por ejemplo, en forma de gotas. La composicion puede estar en forma de kit, disenado de tal modo que se reconstituya una composicion combinada justo antes de su administracion a un paciente. Por ejemplo, puede proporcionarse un anticuerpo liofilizado en forma de kit con agua esteril o un tampon esteril.
Tambien pueden usarse anticuerpos y fragmentos de los mismos, como se describe, en un kit para el diagnostico de una enfermedad tumoral, autoinmune o alergica.
Expresion recombinante
Los linfocitos B de memoria humanos inmortalizados producidos usando el procedimiento de la invencion tambien pueden usarse como fuente de acido nucleico para la clonacion de genes de anticuerpos para la posterior expresion recombinante. La expresion a partir de fuentes recombinantes es mas habitual para propositos farmaceuticos que la expresion a partir de celulas B o hibridomas, por ejemplo, por razones de estabilidad, reproducibilidad, facilidad de cultivo, etc.
Por tanto, la invencion proporciona un procedimiento de preparacion de una celula recombinante, que comprende las etapas de:
(i) preparar un clon de celula B inmortalizada como se ha descrito anteriormente; (ii) obtener uno o mas acidos nucleicos (por ejemplo, genes de cadena pesada y/o ligera) a partir del clon de celula B que codifica el anticuerpo de interes; y (iii) insertar el acido nucleico en un huesped de expresion para permitir la expresion del anticuerpo de interes en ese huesped.
Asimismo, la invencion proporciona un procedimiento de preparacion de una celula recombinante, que comprende las etapas de:
(i) preparar un clon de celula B inmortalizada como se ha descrito anteriormente; (ii) secuenciar uno o mas acidos nucleicos a partir del clon de celula B que codifica el anticuerpo de interes; y (iii) usar la informacion de secuencia de la etapa (ii) para preparar uno o mas acidos nucleicos para insertarlos en un huesped de expresion para permitir la expresion del anticuerpo de interes en ese huesped.
Se describe un procedimiento de preparacion de una celula recombinante, que comprende la etapa de transformar una celula huesped con uno o mas acidos nucleicos que codifican un anticuerpo monoclonal de interes, en el que los acidos nucleicos son acidos nucleicos que se obtuvieron de un clon de celula B inmortalizada de la invencion. Por tanto, los procedimientos para preparar primero el o los acidos nucleicos y despues usarlos para transformar una celula huesped, pueden realizarse en diferentes momentos por diferentes personas en diferentes lugares (por ejemplo, en diferentes pafses).
Estas celulas recombinantes de la invencion despues pueden usarse para propositos de expresion y cultivo. Son particularmente utiles para la expresion de anticuerpos para produccion farmaceutica a gran escala. Tambien pueden usarse como principio activo de una composicion farmaceutica. Puede usarse cualquier tecnica de cultivo adecuada, incluyendo, aunque sin limitacion, cultivo estatico, cultivo en frasco rotatorio, fluido asdtico, cartucho de biorreactor tipo fibra hueca, minifermentador modular, tanque agitado, cultivo en microportadores, perfusion con nucleo ceramico, etc.
Los procedimientos para obtener y secuenciar los genes de inmunoglobulina a partir de celulas B son bien conocidos en la tecnica, por ejemplo, vease el capftulo 4 de Kuby Immunology (4a edicion, 2000; ASIN: 0716733315).
El huesped de expresion es preferiblemente una celula eucariota, incluyendo celulas de levadura y animales, particularmente celulas de mairnfero (por ejemplo, celulas CHO, celulas humanas tales como PERC6 [Crucell; Jones y col. Biotechno/ Prog 2003,19(1):163-8] o celulas HKB-11 [Bayer; Cho y col. Cytotechnology 2001, 37:23-30; Cho y col. Biotechnol Prog 2003,19:229-32], celulas de mieloma [patentes de Estados Unidos 5.807.715 y 6.300.104], etc.), asf como celulas vegetales. Los huespedes de expresion preferidos pueden glucosilar el anticuerpo de la invencion,
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particularmente con estructuras de carbohidrato que no son en sf mismas inmunogenicas en seres humanos. Se prefieren huespedes de expresion que pueden crecer en medios sin suero. Se prefieren huespedes de expresion que pueden crecer en cultivo sin presencia de productos derivados de animales.
El huesped de expresion puede cultivarse para dar una lmea celular.
La invencion proporciona un procedimiento de preparacion de una o mas moleculas de acido nucleico (por ejemplo, genes de cadena pesada y ligera) que codifica un anticuerpo de interes, que comprende las etapas de: (i) preparar un clon de celula B inmortalizada de acuerdo con la invencion; (ii) obtener del clon de celula B el acido nucleico que codifica el anticuerpo de interes. La invencion tambien proporciona un procedimiento para obtener una secuencia de acido nucleico que codifica un anticuerpo de interes, que comprende las etapas de: (i) preparar un clon de celula B inmortalizada de acuerdo con la invencion; (ii) secuenciar el acido nucleico del clon de celula B que codifica el anticuerpo de interes.
La invencion tambien proporciona un procedimiento de preparacion de una o mas moleculas de acido nucleico que codifica un anticuerpo de interes, que comprende la etapa de obtener el acido nucleico de un clon de celula B que se obtuvo de una celula B transformada de la invencion. Por tanto, los procedimientos para obtener primero el clon de celula B y despues preparar el o los acidos nucleicos a partir del mismo, pueden realizarse en momentos muy diferentes por personas diferentes en diferentes lugares (por ejemplo, en diferentes pafses).
La invencion proporciona un procedimiento de preparacion de un anticuerpo (por ejemplo, para uso farmaceutico), que comprende las etapas de: (i) transformar una poblacion de linfocitos B de memoria humanos y seleccionar una celula B transformada que produce un anticuerpo con una especificidad deseada, como se ha descrito anteriormente; (ii) obtener y/o secuenciar uno o mas acidos nucleicos (por ejemplo, genes de cadena pesada y ligera) a partir de la celula B seleccionada del anticuerpo de interes; (iii) insertar el o los acidos nucleicos en o usar el o los acidos nucleicos para preparar un huesped de expresion que pueda expresar el anticuerpo de interes; (iv) cultivar o subcultivar el huesped de expresion en condiciones en que se expresa el anticuerpo de interes; y, opcionalmente, (v) purificar el anticuerpo de interes.
Tambien se describe un procedimiento de preparacion de un anticuerpo, que comprende las etapas de: cultivar o subcultivar una poblacion de celulas huesped de expresion en condiciones en que se expresa el anticuerpo de interes y, opcionalmente, purificar el anticuerpo de interes, en el que dicha poblacion de celulas huesped de expresion se ha preparado (i) proporcionando uno o mas acidos nucleicos que codifican en una celula B seleccionada el anticuerpo de interes que se produce por una poblacion de linfocitos B de memoria preparada como se ha descrito anteriormente, (ii) insertando el o los acidos nucleicos en un huesped de expresion que puede expresar el anticuerpo de interes, y (iii) cultivando o subcultivando los huespedes de expresion que comprenden dichos acidos nucleicos insertados para producir dicha poblacion de celulas huesped de expresion. Por tanto, los procedimientos para preparar primero el huesped de expresion recombinante y cultivarlo despues para expresar el anticuerpo, pueden realizarse en momentos muy diferentes por diferentes personas en diferentes lugares (por ejemplo, en diferentes pafses).
Tambien se describe un procedimiento de preparacion de una composicion farmaceutica, que comprende la etapa de mezclar un anticuerpo monoclonal con uno o mas vehfculos farmaceuticamente aceptables, en el que el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal que se obtuvo de un huesped de expresion de la invencion. Por tanto, los procedimientos para obtener primero el anticuerpo monoclonal (por ejemplo, expresarlo y/o purificarlo) y mezclarlo despues con el vehfculo o vehfculos farmaceuticos, pueden realizarse en momentos muy diferentes por diferentes personas en diferentes lugares (por ejemplo, en diferentes pafses).
Partiendo con una celula B transformada de la invencion, pueden realizarse diversas etapas de cultivo, subcultivo, clonacion, subclonacion, secuenciacion, preparacion de acido nucleico etc. para perpetuar el anticuerpo expresado por la celula B transformada, con optimizacion opcional en cada etapa. En una realizacion preferida, los procedimientos anteriores comprenden adicionalmente tecnicas de optimizacion (por ejemplo, maduracion u optimizacion de la afinidad) aplicadas a los acidos nucleicos que codifican el anticuerpo.
En todos estos procedimientos, el acido nucleico usado en el huesped de expresion puede manipularse entre las etapas (ii) y (iii) para insertar, delecionar o corregir ciertas secuencias de acido nucleico. Los cambios a partir de dicha manipulacion incluyen, aunque sin limitacion, cambios para introducir sitios de restriccion, para corregir el uso de codones, para anadir u optimizar las secuencias reguladoras de la transcripcion y/o la traduccion, etc. Tambien es posible cambiar el acido nucleico para alterar los aminoacidos codificados. Por ejemplo, puede ser util introducir una o mas (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) sustituciones de aminoacidos, una o mas (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) deleciones de aminoacidos y/o una o mas (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) inserciones de aminoacidos en la secuencia de aminoacidos del anticuerpo. Dichas mutaciones puntuales pueden modificar funciones efectoras, la afinidad de union al antfgeno, las modificaciones post-traduccionales, la inmunogenicidad, etc., pueden introducir aminoacidos para la union de grupos covalentes (por ejemplo, marcadores) o pueden introducir marcas (por ejemplo, para propositos de purificacion). Las mutaciones pueden introducirse en sitios espedficos o pueden introducirse aleatoriamente, seguidas de seleccion (por ejemplo, evolucion molecular).
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SRAG
Los anticuerpos espedficos para el virus del SRAG pueden ser particularmente utiles para la profilaxis y pueden administrate a profesionales sanitarios u otras personas que puedan entrar en contacto con pacientes infectados por el virus de SRAG. Dicha seroterapia pasiva puede ofrecer una cura inmediata de los individuos infectados as^ como una contencion a traves de la proteccion de los contactos y el personal medico. No hay sueros humanos que contengan anticuerpos contra el virus del SRAG disponibles en cantidades suficientes, por lo tanto, el procedimiento de la invencion proporciona un modo ideal para producir anticuerpos monoclonales humanos neutralizantes. Dichos anticuerpos pueden usarse para desarrollar una seroterapia pasiva contra este y otros patogenos.
Por lo tanto tambien se describe un procedimiento para prevenir la transmision del virus del SRAG que comprende administrar una cantidad eficaz de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo espedfico para el virus del SRAG. Por lo tanto deben mantener soluciones madre de anticuerpo espedfico para el virus del SRAG de modo que esten disponibles para su uso inmediato en cualquier brote posterior de SRAG.
General
La expresion "que comprende" abarca "que incluye" asf como "que consta de", por ejemplo, una composicion "que comprende" X puede constar exclusivamente de X o puede incluir algo adicional, por ejemplo, X + Y.
La palabra "sustancialmente" no excluye "completamente", por ejemplo, una composicion que esta "sustancialmente libre" de Y puede estar completamente libre de Y. Cuando sea necesario, la palabra "sustancialmente" puede omitirse de la definicion de la invencion.
El termino "aproximadamente" en relacion a un valor numerico x significa, por ejemplo, x ± 10 %.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 muestra los resultados del ELISA usando celulas Vero infectadas con el virus del SRAG lisadas en SDS al 3 % como antigeno. Se muestran los valores de DO del suero (dilucion 1/5000), sobrenadantes de cultivos policlonales y de clones de celulas B independientes (dilucion 1/2).
La Figura 2 muestra el tftulo neutralizante de anticuerpos espedficos para el virus del SRAG. De izquierda a derecha: tftulo de neutralizacion (ensayo de celulas Vero) de suero de convalecientes; sobrenadantes de cultivos policlonales; clones positivos aislados del cultivo con los tftulos neutralizantes mas elevados.
La Figura 3 muestra el analisis clonal de la respuesta de anticuerpos humanos contra la protema espiga del virus del SRAG. Los sobrenadantes de cultivo se ensayaron para su capacidad de tenir celulas BHK transfectadas con el ARNm de la protema espiga del virus del SRAG (aislado Frankfurt) y para su capacidad de neutralizar la misma cepa de virus del SRAG. La Figura 3A muestra la correlacion entre el tftulo neutralizante y la tincion de la protema espiga por el sobrenadante de cultivo sin diluir. La Figura 3B muestra la tincion de celulas BHK transfectadas con la protema espiga por diluciones en serie de los sobrenadantes de once cultivos neutralizantes, mostrando los sfmbolos rellenos la dilucion maxima en que se observo neutralizacion completa.
La Figura 4 muestra la caracterizacion del anticuerpo S3.1 neutralizante de SRAG. Tincion de celulas BHK transfectadas con la protema espiga por S3.1 purificado (drculos) y suero de convalecientes de 6 meses (cuadrados). Los sfmbolos rellenos indican la dilucion maxima en que se observo neutralizacion completa.
La Figura 5 muestra la inmunomicroscopfa electronica del coronavirus del SRAG en presencia de anticuerpo S3.1.
La Figura 6 es un resumen de un procedimiento de la invencion, desde el ser humano hasta el anticuerpo monoclonal.
Modos para realizar la invencion
La presente invencion permite la clonacion de linfocitos B de memoria humanos con una eficacia muy elevada y consigue esto por la combinacion de dos estfmulos, concretamente: VEB, que inmortaliza las celulas B humanas con baja eficacia y un activador de celulas B policlonales que potencia la eficacia de la inmortalizacion con VEB.
Ejemplo 1: Clonacion de celulas B
Se aislaron celulas B de memoria humanas (CD19+ CD27+ IgM- IgD-) de donantes sanos por clasificacion celular usando procedimientos bien conocidos en la tecnica. Se sembraron diferentes cantidades de celulas en cultivos duplicados en microplacas de 96 pocillos en presencia de celulas mononucleares irradiadas (5x105/ml) y VEB (sobrenadante de celulas B95-8) solo o VEB en combinacion con CpG 2006 (2,5 ug/ml) e IL-2 recombinante (1000 U/ml). Despues de 15 dfas, se valoro el porcentaje de cultivos que conternan celulas en crecimiento. Las frecuencias se determinaron por ensayos de dilucion limitante. Los cultivos se valoraron para las celulas en crecimiento. La eficacia de clonacion usando cuatro fuentes diferentes de celulas B fue la siguiente:
Fuente de celulas B
Eficacia de clonacion
VEB
VEB + CpG + IL-2
Exp 1 (CD19+ CD27+ IgM' IgD-)
1 en 200 1 en 1
Exp 2 (CD19+ CD27+ IgM' IgD-)
1 en 120 1 en 1,5
Exp 3 (CD19+ CD27+ IgM' IgD-)
1 en 60 1 en 1
Exp 4 (CD19+ CD27+)
1 en 90 1 en 1,6
No se observo crecimiento en ausencia de VEB.
Por tanto, los procedimientos de la invencion permiten clonar casi cualquier celula B de memoria humana (eficacia cercana al 100 %). El procedimiento tambien es adecuado para subclonacion.
5 Ejemplo 2: Produccion de anticuerpos con una especificidad deseada
En un experimento adicional, se demostro que la inmortalizacion puede usarse para aprovechar la memoria inmunologica para producir anticuerpos monoclonales humanos de la especificidad deseada.
Se aislaron celulas mononucleares de 20 ml de sangre periferica obtenida de un donante de sangre sano. Se aislaron celulas B de memoria humanas CD19+CD27+IgG+ por clasificacion celular y se sembraron a 10 10 celulas/pocillo en microplacas de 96 pocillos en presencia de VEB, CpG 2006 (2,5 |ig/ml), IL-2 recombinante (1000 U/ml) y celulas mononucleares irradiadas (5x105/ml). Sembrar solamente 10 celulas por pocillo ayuda a aumentar la eficacia de clonacion. Despues de 15 dfas todos los cultivos conteman celulas en crecimiento. Se recogio una muestra de sobrenadante y se ensayo en ELISA para los anticuerpos IgG totales y para IgG espedfica para Toxoplasma gondii, toxoide tetanico y virus del sarampion. Los sobrenadantes tambien se ensayaron en un ensayo 15 de neutralizacion del virus del sarampion usando celulas Vero como dianas.
Algunos de los cultivos positivos identificados se subclonaron por dilucion limitante para aislar clones espedficos que producen el anticuerpo monoclonal deseado. Los cultivos se subclonaron a 0,5 celulas/pocillo en presencia de CpG 2006 (2,5 |ig/ml), IL-2 (1000 U/ ml) y PBMC irradiadas (5x105/ml).
Anticuerpo (procedimiento de deteccion)
Cultivos positivos # Clones espedficos aislados/intentos realizados*
IgG (ELISA)
180/180
Anti-Toxoplasma gondii (ELISA)
23/180 5/6
Anti-toxoide tetanico (ELISA)
19/180 5/6
Anti-virus del sarampion (ELISA)
36/180 7/9
Anti-virus del sarampion (neutralizacion)
7/180 4/4
"Para ELISA, numero de cultivos con DO >0,8 en un ensayo con fondo <0,2; para ensayo de neutralizacion, numero con proteccion completa contra el efecto citolftico del virus del sarampion. *Numero de casos en que pudo aislarse al menos un clon espedfico de antfgeno, relativo al numero de cultivos originales que se clonaron. La eficacia de clonacion vario del 50 al 100 %. Por tanto pudieron aislarse clones de celulas B transformadas con VEB que producen anticuerpos IgG contra el virus del sarampion, toxoide tetanico y Toxoplasma gondii, demostrando que pueden prepararse anticuerpos monoclonales humanos con multiples especificidades de memoria a partir de una pequena muestra de sangre periferica humana.
20 Ejemplo 3: Celulas B de memoria inmortalizadas que expresan anticuerpos espedficos para el coronavirus del SRAG
Se obtuvieron muestras de sangre de dos pacientes con historia clmica de SRAG. Ambos pacientes teman anticuerpos sericos anti-SRAG que se detectaron en dos ensayos: (i) un ensayo de neutralizacion que detecta anticuerpos neutralizantes dirigidos contra protemas de superficie del virus del SRAG, probablemente la protema 25 espiga y (ii) un ensayo ELISA, que detecta anticuerpos que se unen a cualquier protema desnaturalizada del virus
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del SRAG.
Para el ensayo de neutralizacion, se anadieron diluciones en serie de suero obtenido de la sangre a pocillos de microplaca que conteman celulas Vero, seguido de cantidades tituladas de virus del SRAG. Despues de 2 d^as, se registro el efecto citopatico por inspeccion visual. Tambien se desarrollo un ELISA convencional usando celulas Vero infectadas con virus del SRAg lisadas en SDS al 3 % como antfgeno.
Para la produccion del clon de celulas B que produce anticuerpos monoclonales espedficos para el virus del SRAG, se selecciono la sangre del paciente que mostro el tftulo mas elevado de anticuerpos de union y neutralizantes.
Se aislaron celulas B de memoria que portan IgG superficial usando microperlas anti-IgG humana, se incubaron con VEB (50 % del sobrenadante de celulas B95-8) durante 6 horas y despues se sembraron a 10 celulas/pocillo en microplacas de 96 pocillos en presencia de 2,5 |ig/ml de CpG 2006 y PBMC irradiadas alogenicas (en estos experimentos se omitio IL-2). Despues de dos semanas, se exploraron los sobrenadantes de cultivo para la presencia de anticuerpos espedficos.
De los 1042 sobrenadantes de cultivo ensayados, 165 se valoraron positivos en el ensayo ELISA (Figura 1). De estos cultivos, 23 se clonaron como anteriormente y se aislaron clones espedficos de 16 de ellos. Algunos de los anticuerpos monoclonales humanos aislados reconocen la nucleoprotema del virus del SRAG en transferencias de western, mientras que otros no, lo que sugiere que pueden reconocer diferentes protemas virales (datos no mostrados). Ninguno de estos anticuerpos mostro actividad neutralizante.
De los 1042 sobrenadantes de cultivo ensayados en el ensayo de neutralizacion, siete mostraron un bajo nivel de actividad neutralizante mientras que dos (A11 y D8) mostraron un elevado tftulo neutralizante (1/512 y 1/256 respectivamente). El cultivo A11 se clono por dilucion limitante en presencia de CpG y PBMC irradiadas y se aislaron varios clones de celulas B con actividad neutralizante comparablemente elevada (Figura 2). Los anticuerpos A11 no se unieron en el ensayo ELISA, pero tineron las protemas espiga de superficie del virus del SRAG detectadas por microscopfa electronica (datos no mostrados).
Por lo tanto, usando este procedimiento es posible producir anticuerpos neutralizantes espedficos para un antfgeno usando solamente una pequena muestra de sangre (aproximadamente 10 ml) en un corto espacio de tiempo (30-40 dfas). El procedimiento tambien permite la seleccion del mejor anticuerpo a partir de una gran combinacion, y por lo tanto es un procedimiento de alto rendimiento.
Los anticuerpos anti-SRAG neutralizan el virus del SRAG a concentraciones de ~5 ng/ml. La neutralizacion del virus sincitial respiratorio (VSR, una causa comun de infecciones del tracto respiratorio, especialmente en ninos) por anticuerpos humanizados disponibles en el mercado producidos por tecnicas convencionales requiere una concentracion de anticuerpos aproximadamente 1000 veces mayor (Johanson y col. 1997). Por lo tanto, los anticuerpos completamente humanos producidos por el procedimiento de la invencion parecen ser aproximadamente 1000 veces mas eficaces. Esto sugiere que debenan ser suficientes cantidades muy pequenas del anticuerpo descrito en este documento para prevenir o curar una infeccion de SRAG.
Ejemplo 4: Exploracion de pacientes convalecientes con virus del SRAG para anticuerpos
Se obtuvo sangre periferica de un paciente en diferentes momentos despues de infeccion aguda con virus del SRAG (2, 4 y 6 meses despues de la infeccion). Se aislaron PBMC por centrifugacion en gradiente. Se aislaron celulas B de memoria IgG+ por un procedimiento mejorado que evita activar el receptor de celulas B. Se aislaron las celulas B totales de PBMC usando microperlas CD22 (Miltenyi), que se descubrio que era incluso mejor que usar microperlas CD19. Las celulas se tineron con anticuerpos contra IgM, IgD e IgA humanas y se aislaron celulas negativas que portan IgG de superficie por clasificacion celular. Se pulsaron celulas B con VEB (50 % del sobrenadante de celulas B-95-8) durante 8 horas y despues se sembraron a 10 celulas/pocillo en microplacas con fondo en U de 96 pocillos en medio RPMI completo suplementado con FCS al 10 %, 2,5 |ig/ml de CpG 2006 y PBMC irradiadas (2x105/ml). En este experimento no se uso IL-2. Despues de 2 semanas, se exploraron los sobrenadantes de cultivo para la presencia de anticuerpos espedficos usando los tres ensayos descritos a continuacion. Los cultivos positivos se clonaron por dilucion limitante en presencia de CpG 2006 y PBMC irradiadas como anteriormente. Los clones positivos se expandieron y se purifico el anticuerpo producido a partir de los sobrenadantes de cultivo por cromatograffa de afinidad en columnas de protema A (Amersham).
El aislado Frankfurt del virus del SRAG (numero de referencia de Genbank AY310120) se uso para tres ensayos in vitro:
ELISA Se infectaron celulas Vero a una multiplicidad de infeccion de 0,01 unidades formadoras de placas por celula. El sobrenadante de cultivo celular recogido despues de 2 dfas se aclaro por centrifugacion a 3000 rpm, 5 min. El sobrenadante se sometio a centrifugacion a 20.000 rpm durante 2 horas en un rotor Beckman SW28 a traves de un lecho de sacarosa al 20 %. El sedimento se purifico usando un gradiente de tartrato de potasio/glicerol y se resuspendio en 500 |il de tampon TNE (Tris-HCl 10 mM, pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 2 mM) a una concentracion de protemas de aproximadamente 0,5 mg/ml. La suspension de antfgeno usada para el ensayo ELISA se preparo anadiendo sDs al 1 % al sedimento viral seguido de ebullicion durante 10 min. Las
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placas ELISA se recubrieron con una dilucion 1:1000 de antigeno del virus del SRAG en tampon fosfato 0,1 M. Se anadieron diluciones de sueros o sobrenadante de cultivo y se detectaron anticuerpos IgG1 espedficos usando anticuerpo de cabra anti-IgG humana conjugado con fosfatasa alcalina. Los resultados se expresaron en unidades arbitrarias (UA) relativas a la muestra de 2 meses (=1000 UA). Los sueros de 20 donantes normales ensayados fueron negativos (<1 UA).
Tincion Se detectaron anticuerpos espedficos para la protema espiga nativa del virus del SRAG por citometna de flujo. En resumen, se clono el gen de la protema espiga del virus del SRAG en un vector apropiado y se transcribio el ARNm in vitro y se uso para transfectar celulas BHK por electroporacion. Los transfectantes se incubaron con sobrenadantes de cultivo o suero, se lavaron y se tineron con anticuerpo de cabra anti-IgG humana marcado con APC. Este ensayo detecta anticuerpos IgG1 dirigidos contra el antigeno espiga nativo, la mayor parte de los cuales tiene actividad neutralizante. Los resultados se expresaron en unidades arbitrarias (UA) relativas a la muestra de 2 meses (=1000 UA). Los sueros de 20 donantes normales ensayados fueron negativos (<1 UA).
Neutralizacion in vitro Se diluyeron sueros o sobrenadantes de cultivo en etapas log 2 y se mezclaron con 75 DICT50 del virus del SRAG en 25 |il (el tftulo del virus se determino de acuerdo con el procedimiento de Karber). La mezcla se incubo durante 45 min. a temperatura ambiente. Posteriormente, se anadieron 50 |il de celulas Vero tratadas con tripsina (1,5 x 105 por ml) y se incubaron durante 3 dfas a 37 °C y finalmente, se determino el tftulo de neutralizacion por inspeccion visual para dar la dilucion de suero que neutraliza 75 DICT50 del virus del SRAG. Los ensayos se realizaron en un laboratorio de nivel 4 de bioseguridad.
Los resultados fueron los siguientes:
Meses despues de la infeccion
Anticuerpo anti-SRAG detectado por
ELISA
Tincion de espiga Neutralizacion
2
1000 1000 1/128
4
650 700 1/128
6
300 400 1/128
Aunque los sueros normales fueron negativos, el suero del paciente recogido en diferentes momentos puntuales despues de la aparicion de la enfermedad aguda se valoro positivo en los tres ensayos. Los anticuerpos detectados por ELISA y los que tineron celulas transfectadas con la protema espiga fueron mas elevados 2 meses despues de la infeccion y disminuyeron a aproximadamente un tercio en seis meses. En contraste, los anticuerpos neutralizantes permanecieron constantes con un tftulo de 1/128. El isotipo de los anticuerpos detectados en los ensayos de union a la protema espiga y ELISA fue exclusivamente IgG1, no detectandose anticuerpos IgA o IgM (datos no mostrados). Por tanto, el suero posterior a la infeccion de esta persona tema tftulos moderados de anticuerpos neutralizantes contra el virus del SRAG y anticuerpos IgG que se unieron a las protemas espiga y detectaron antfgenos desnaturalizados en ELISA.
Ejemplo 5: Cinetica y frecuencias de celulas B de memoria especificas
Se inmortalizaron linfocitos B de memoria IgG+ de los sueros post-SRAG de 2 meses, 4 meses y 6 meses con VEB en condiciones en que la cantidad de celulas B por cultivo era limitante, como se ha descrito anteriormente (10 celulas B por pocillo). Esta estrategia permite el analisis del producto de solamente unas pocas celulas B de memoria por cultivo, asegurando de este modo que el anticuerpo espedfico detectado en cultivos positivos es monoclonal y, al mismo tiempo, aumentando la probabilidad de aislar un clon productor del anticuerpo deseado por dilucion limitante. Despues de dos semanas de cultivo en presencia de VEB, CpG 2006 y celulas de alimentacion irradiadas, se exploraron los sobrenadantes de cultivo para la presencia de anticuerpos IgG espedficos usando ELISA o tincion de transfectantes espiga. La frecuencia de cultivos positivos a la exploracion en el ensayo ELISA del virus del SRAG o en la tincion de transfectantes de la protema espiga del virus del SRAG fueron las siguientes:
Meses despues de la infeccion
Cultivos positivos/cultivos totales explorados (%)
ELISA
Tincion de espiga
2
275/480 (57,3 %) No determinado
4
123/480 (25,6 %) 12/576 (2,1 %)
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44/480 (9/2 %) 21/768 (2,7%)
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La frecuencia de cultivos productores de anticuerpos detectados por el ensayo ELISA fue muy elevada 2 meses despues de la infeccion y disminuyo en los 4 y 6 meses. La frecuencia de cultivos productores de anticuerpos contra la protema espiga nativa medida a los 4 y 6 meses fue inferior. De forma importante, los cultivos valorados positivos para anticuerpos ELISA fueron distintos de los que conteman anticuerpos contra la protema espiga, lo que indica que los dos ensayos detectan especificidades de anticuerpo distintas no solapantes. Ademas, una proporcion considerable de celulas B de memoria IgG+ es espedfica para la protema espiga.
Entonces se realizaron ensayos para ver si hay una correlacion entre la union a la protema espiga y la actividad neutralizante. Se ensayaron 56 sobrenadantes de cultivo que tineron celulas transfectadas con la protema espiga para su capacidad de neutralizar el mismo aislado de virus del SRAG a partir del cual se clono la protema espiga (Fig. 3A). Aunque los anticuerpos con la tincion mas elevada mostraron elevados tftulos neutralizantes, hubo algunos anticuerpos que neutralizaron de forma eficaz a pesar de la pobre tincion mientras que otros ternan transfectantes espiga, pero no lograban neutralizar. Ademas, cuando se analizaron 11 sobrenadantes con elevado tftulo neutralizante, no fue evidente una correlacion clara entre la tincion y la neutralizacion (Fig. 3B). Tomados en conjunto, estos resultados indican que a nivel clonal, la respuesta a la protema espiga es heterogenea y que no todos los anticuerpos anti-espiga producidos en el trascurso de la infeccion natural son capaces de neutralizar el virus.
Ejemplo 6: Aislamiento de anticuerpos monoclonales contra el virus del SRAG
Los resultados mostrados anteriormente demuestran que es posible interrogar el repertorio de memoria de celulas B humanas con una diversidad de ensayos para identificar cultivos que producen un anticuerpo de la especificidad deseada. En estos experimentos, 29 de 38 intentos (76 %) en cultivos positivos a clonacion condujeron al aislamiento de uno o mas clones productores de anticuerpos de la especificidad seleccionada. Los clones VEB eran estables y se recuperaron anticuerpos monoclonales en el sobrenadante de cultivo a concentraciones de 10-20 |ig/ml. De estos 29, 21 fueron positivos en el ensayo ELISA y 8 fueron positivos en el ensayo de tincion de la protema espiga y tambien fueron capaces de neutralizar el virus del SRAG.
De los 21 clones independientes que se valoraron positivos en el ensayo ELISA, 13 (62 %) produjeron anticuerpos espedficos para la nucleoprotema del virus del SRAg (NP) detectada por transferencia de Western, mientras que 5 no reconocieron NP, pero tineron celulas infectadas con el virus del SRAG, y las 3 restantes reaccionaron solamente en el ensayo ELISA. Como se esperaba, ninguno de estos anticuerpos mostro actividad neutralizante.
De los 8 clones independientes que ternan los transfectantes espiga y que neutralizaban el virus del SRAG, uno (S3.1, IgG1K) se selecciono para ensayos de neutralizacion in vivo. El anticuerpo monoclonal de este clon se purifico del sobrenadante de cultivo y se ensayo para su capacidad de tenir celulas transfectadas con la protema espiga y de neutralizar el virus del SRAG (Fig. 4). S3.1 neutralizo 75 DICT50 del virus del SRAG a concentraciones de ~300 ng/ml, y fue hasta 300 veces mas potente que el suero de convalecientes. Ademas, S3.1 neutralizo los aislados Frankfurt y Urbani con la misma eficacia (datos no mostrados), y tineron las espigas del CoV del SRAG detectadas por inmunomicroscopfa electronica (Fig. 5).
Ejemplo 7: S3.1 neutraliza la infeccion por SRAG en un modelo animal
Se ensayo la actividad neutralizante in vivo del anticuerpo monoclonal S3.1 en un modelo de raton de infeccion aguda de SRAG. El anticuerpo purificado se transfirio a ratones no tratados previamente por inyeccion intraperitoneal para determinar si el anticuerpo solo podfa evitar la replicacion del virus del SRAG en el tracto respiratorio.
Los doctores L.J. Anderson y T.G. Ksiazek del Centers for Disease Control and Prevention (CDC), Atlanta, GA, proporcionaron virus del SRAG (cepa Urbani) para su uso en un ensayo de neutralizacion in vivo. El virus se aislo y se paso dos veces en celulas Vero E6 en el CDC y se paso en celulas Vero para dos pases adicionales en el laboratorio de los inventores para generar una solucion madre de virus con un tftulo de 106,5 DICT50/ml. Las celulas Vero se mantuvieron en OptiPro SFM (Invitrogen). Todo el trabajo con virus infeccioso se realizo dentro de una cabina de bioseguridad, en una instalacion de contencion de nivel 3 de bioseguridad y el personal llevaba respiradores electricos purificadores del aire (3M HEPA AirMate, Saint Paul, MN). Los estudios con ratones se aprobaron por el NIH Animal Care and Use Committee y se realizaron en una instalacion aprobada de nivel 3 de bioseguridad animal. Todo el personal que entraba en la instalacion tema que llevar respiradores electricos purificadores del aire.
Se alojaron ratones BALB/c hembra de cuatro a seis semanas de edad adquiridos de Taconic (Germantown, NY), 4 ratones por jaula. En el dfa 0, los ratones, ligeramente anestesiados con isoflurano, se inyectaron por via intraperitoneal con 3 dosis diferentes (800, 200, 50 |ig) de anticuerpo S3.1 en 500 |il o con el mismo volumen de una Ig humana policlonal que carece de actividad neutralizante. Despues de 24 horas, los ratones se expusieron por via intranasal con 104 DICT50 del coronavirus del SRAG. Despues de dos dfas adicionales, se sacrifico a los ratones y se retiraron sus pulmones y cornetes nasales y se homogeneizaron en una suspension al 5 % p/v en medio Leibovitz 15 (Invitrogen). Las muestras tisulares se evaluaron para la infeccion, y los tftuios de virus se determinaron como se ha descrito anteriormente. Los tftulos de virus se expresaron como log-iQ DICT50 por gramo de tejido:
Anticuerpo
Replicacion de virus en ratones expuestos
Pulmones
Cornetes nasales
Cantidad de infectados
Tftulo medio de virus(± ET) Cantidad de infectados Tftulo medio de virus (± ET)
S3.1 800 |ig
0/4 <1,5±0* 2/4 2,5±0,47
S3.1 200 |ig
0/4 <1,5±0* 4/4 3,4±0,41
S3.1 50 |ig
2/4 3,2±1,36 4/4 4,8±0,75
Control 800 |ig
4/4 7,5±0,1 4/4 6,4±0,41
El Ifmite inferior de deteccion de virus infeccioso en una suspension al 10 % p/v de homogeneizado pulmonar fue 1,5 log-10 DICT50/g y en suspension al 5 % p/v de cornetes nasales fue de 1,8 log-10 DICT50/g. Estos valores indican, por tanto, ausencia de virus detectable.
Los ratones que recibieron mAb S3.1 estuvieron de este modo protegidos de la replicacion del virus de exposicion, particularmente en el tracto respiratorio inferior. Las diferencias en los tftulos de virus en comparacion con el control fueron estadfsticamente significativas (p<0,05) en un ensayo t de Student. Se observo una restriccion significativa de 5 replicacion del virus en el tracto respiratorio superior en los ratones que recibieron la dosis mas elevada de mAb S3.1.
Ejemplo 8: R-848
R-848 es un agonista de TLR7 y TLR8. Este compuesto se comparo con CpG 2006 en terminos de eficacia de inmortalizacion inducida por VEB de celulas B humanas. Se aislaron celulas B de memoria de donantes sanos 10 usando microperlas magneticas anti-CD19 o anti-CD22 seguido de reduccion negativa de celulas que portan IgM, IgD e IgA (o IgG). Se establecieron 48 cultivos duplicados en microplacas con fondo en U de 96 pocillos por dilucion limitante a 30, 10 y 3 celulas B por pocillo en medio completo en presencia de celulas mononucleares irradiadas, VEB (20 % del sobrenadante de celulas B95-8) y en presencia o ausencia de 2,5 |ig/ml de CpG 2006 o 2,5 |ig/ml de R-848. La frecuencia de cultivos positivos para el crecimiento celular y la produccion de Ig se midio despues de 14 15 dfas y se calculo la eficacia de transformacion. Los resultados son los siguientes:
Fuente de celulas B
VEB + CpG 2006 + R848
Donante AOS CD19+ IgM- IgD- IgA-
1 en 150 1 en 3,5 1 en 2,5
Donante AOS CD22+ IgM' IgD' IgA'
1 en 300 1 en 2 1 en 1,5
Donante ASC CD19+ IgM- IgD- IgA-
1 en 320 1 en 2 1 en 2,4
Donante ASC CD19+ IgM- IgD- IgG-
1 en 280 1 en 4 1 en 2,2
Donante ETR CD22+ IgM" IgD"
1 en 230 1 en 1,9 1 en 2
R-848 y CpG 2006 por tanto son comparables en su capacidad de aumentar la eficacia de la inmortalizacion inducida por VEB. Ademas, R-848 fue comparable con CpG 2006 en la capacidad de aumentar la eficacia de 20 clonacion de lmeas de celulas B policlonales inmortalizadas por VEB. En presencia de R-848, la eficacia de clonacion de las lmeas celulares VEB variaba del 25 al 100 % en 10 experimentos independientes.
Ejemplo 9: Aislamiento de anticuerpos de elevada afinidad neutralizantes del CoV del SRAG
Se produjo una nueva serie de anticuerpos monoclonales con capacidad neutralizante del CoV del SRAG como se ha descrito anteriormente a partir de celulas B de memoria inmortalizadas aisladas de un paciente convaleciente 25 seis meses despues de la infeccion. Se ensayaron diluciones en serie de los sobrenadantes de los clones de celulas B para su especificidad de antfgeno (NP, matriz (M) o protemas espigas), y su capacidad de neutralizar el efecto citopatico del CoV del SRAG (aislado Frankfurt) en celulas Vero. La concentracion de IgG monoclonal se midio por ELISA en los mismos sobrenadantes de cultivo. Los tftulos neutralizantes se expresaron como la concentracion final de IgG (ng de IgG por ml) en cultivo tisular capaz de neutralizar completamente el virus (valores medios de al menos
tres ensayos). Los resultados fueron los siguientes:
Clon de celula B
Isotipo Especificidad Tftulo neutralizante
S18.1
IgG, k NP -
S20.1
IgG, x NP -
S21.1
IgG, k NP -
S23.4
IgG, k NP -
S24.1
IgG, x NP -
S13.1
IgG, k No determinada -
S5.1
IgG, k M -
S3.1
IgG, k Espiga 300
S101.1
IgG, k Espiga 40
S102.1
IgG, k Espiga 850
S103.3
IgG, k Espiga 350
S104.1
IgG, k Espiga 150
S105.2
IgG, k Espiga 150
S106.1
IgG, k Espiga 45
S107.4
IgG, k Espiga 75
S108.1
IgG, k Espiga 40
S109.2
IgG, k Espiga 80
S132.9
IgG, k Espiga 200
S128.5
IgG, k Espiga 25
S127.6
IgG, k Espiga 40
S124.4
IgG, k Espiga 40
S159.1
IgG, x Espiga 25
S160.1
IgG, k Espiga 15
Por tanto, la invencion es capaz, de forma rutinaria, de proporcionar anticuerpos que pueden neutralizar el virus a concentraciones inferiores de 10-9 M e incluso hasta 10-10 M (el PM de IgG humana es ~150 kDa, y por tanto 150 5 ng/ml es ~10-9M).
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Claims (24)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento de produccion de linfocitos B de memoria humanos inmortalizados, que comprende la etapa de transformar linfocitos B de memoria humanos usando virus de Epstein Barr (VEB) en presencia de un activador de celulas B policlonales, en el que el activador de celulas B policlonales es un agonista de un receptor de reconocimiento de patrones que se expresa en celulas B de memoria humanas.
  2. 2. Un procedimiento de produccion de un clon de un linfocito B de memoria humano inmortalizado capaz de producir un anticuerpo monoclonal humano con una especificidad de antigeno deseada, que comprende las etapas de: (i) transformar una poblacion de celulas que comprende o que consiste en linfocitos B de memoria humanos con virus de Epstein Barr (VEB) en presencia de un activador de celulas B policlonales, en el que el activador de celulas B policlonales es un agonista de un receptor de reconocimiento de patrones que se expresa en celulas B de memoria humanas; (ii) explorar el sobrenadante de cultivo para la especificidad de antfgeno; y (iii) aislar un clon de linfocito B de memoria humano inmortalizado capaz de producir un anticuerpo monoclonal humano que tenga la especificidad de antigeno deseada.
  3. 3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que el activador de celulas B policlonales es un agonista de un receptor tipo Toll.
  4. 4. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente, en el que el activador de celulas B policlonales es un agonista del receptor tipo Toll-7 (TLR-7), receptor tipo Toll-9 (TLR-9) y/o receptor tipo Toll-10 (TLR-10).
  5. 5. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente, en el que el activador de celulas B policlonales se selecciona entre el grupo que consiste en: oligodesoxinucleotidos CpG; R-848 y otros compuestos de imidazoquinolina que estimulan los TLR; imiquimod; loxoribina; 7-tia-8-oxoguanosina; 7-desazaguanosina; y anticuerpos monoclonales que imitan los efectos de estos activadores.
  6. 6. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente, en el que el activador de celulas B policlonales es CpG 2006.
  7. 7. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente, en el que se anade un estimulante adicional del crecimiento y/o diferenciacion celular durante la etapa de transformacion.
  8. 8. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 7, en el que dicho estimulante adicional es una citoquina.
  9. 9. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 8, en el que dicha citoquina es IL-2 o IL-15.
  10. 10. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 2, en el que la clonacion se realiza usando dilucion limitante.
  11. 11. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que se selecciona una subpoblacion de linfocitos B de memoria humanos con una especificidad de antigeno espedfica antes de la etapa de transformacion.
  12. 12. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente, en el que dicho linfocito B de memoria produce un anticuerpo humano dirigido contra patogenos humanos tales como el virus del SRAG, el virus de la inmunodeficiencia humana; el virus de la hepatitis A; el virus de la hepatitis B; el virus de la hepatitis C; el virus del herpes simple tipo 1 o tipo 2; el virus del sarampion; el virus de las paperas; el virus de la rubeola; el virus de la rabia; el virus del Ebola; el virus de la gripe; el virus del papiloma; el virus vaccinia; el virus de varicela-zoster; el virus de la viruela; el virus de la polio; el rinovirus; el virus sincitial respiratorio; P. falciparum; P. vivax; P. malariae; P. ovale; Corynebacterium diphtheriae; Clostridium tetani; Clostridium botulinum; Bordetella pertussis; Haemophilus influenzae; Neisseria meningitidis, serogrupo A, B, C, W135 y/o Y; Streptococcus pneumoniae; Streptococcus agalactiae; Streptococcus pyogenes; Staphylococcus aureus; Bacillus anthracis; Moraxella catarrhalis; Chlamydia trachomatis; Chlamydia pneumoniae; Yersinia pestis; Francisella tularensis; especies de Salmonella; Vibrio cholerae; E. coli toxica; un retrovirus endogeno humano; otros patogenos microbianos; otras toxinas microbianas, alergenos, antfgenos tumorales, autoantfgenos y aloantfgenos, agentes qmmicos o toxinas.
  13. 13. Un procedimiento de produccion de un anticuerpo monoclonal humano que comprende preparar un linfocito B de memoria humano inmortalizado por un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2-12, cultivar dicho linfocito B de memoria humano inmortalizado y aislar el anticuerpo monoclonal humano.
  14. 14. Un procedimiento de produccion de un anticuerpo monoclonal humano que comprende las etapas de: (i) preparar un linfocito B de memoria humano inmortalizado por un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 12; (ii) obtener el acido nucleico del linfocito B de memoria inmortalizado; (iii) insertar el acido nucleico en un huesped de expresion para permitir la expresion del anticuerpo en ese huesped.
  15. 15. El procedimiento de la reivindicacion 13 o la reivindicacion 14, que comprende adicionalmente la etapa de mezclar el anticuerpo monoclonal aislado con un vehfculo farmaceuticamente aceptable.
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    30
  16. 16. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que los linfocitos B de memoria no se fusionan con otras celulas.
  17. 17. Un procedimiento de preparacion de una celula recombinante, que comprende las etapas de: (i) preparar un clon de celula B inmortalizada por el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12; (ii) obtener el acido nucleico del clon de celula B que codifica un anticuerpo de interes; y (iii) insertar el acido nucleico en un huesped de expresion para permitir la expresion del anticuerpo de interes en ese huesped.
  18. 18. Un procedimiento de preparacion de una celula recombinante, que comprende las etapas de: (i) preparar un clon de celula B inmortalizada por el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12; (ii) secuenciar el acido nucleico del clon de celula B que codifica un anticuerpo de interes; y (iii) usar la informacion se secuencia de la etapa (ii) para preparar el acido nucleico para insertarlo en un huesped de expresion para permitir la expresion del anticuerpo de interes en ese huesped.
  19. 19. El procedimiento de la reivindicacion 17 o reivindicacion 18, en el que el huesped de expresion es una celula de levadura, una celula vegetal o una celula animal.
  20. 20. Un procedimiento de preparacion de una molecula de acido nucleico que codifica un anticuerpo de interes, que comprende las etapas de: (i) preparar un clon de celula B inmortalizada por el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12; (ii) obtener del clon de celula B el acido nucleico que codifica el anticuerpo de interes.
  21. 21. Un procedimiento para obtener una secuencia de acido nucleico que codifica un anticuerpo de interes, que comprende las etapas de: (i) preparar un clon de celula B inmortalizada por el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12; (ii) secuenciar el acido nucleico del clon de celula B que codifica el anticuerpo de interes.
  22. 22. Un procedimiento de preparacion de un anticuerpo para uso farmaceutico, que comprende las etapas de: (i) preparar una celula B inmortalizada que produce un anticuerpo de interes por el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 12; (ii) obtener y/o secuenciar el acido nucleico que codifica el anticuerpo de interes a partir de la celula B seleccionada; (iii) insertar el acido nucleico en o usar el acido nucleico para preparar un huesped de expresion que pueda expresar el anticuerpo de interes; (iv) cultivar o subcultivar el huesped de expresion en condiciones en que se exprese el anticuerpo de interes; y, opcionalmente, (v) purificar el anticuerpo de interes.
  23. 23. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17, 18 o 22, en el que el acido nucleico se manipula entre las etapas (ii) y (iii) para introducir sitios de restriccion, para cambiar el uso de codones, y/o para anadir u optimizar secuencias reguladoras de la transcripcion y/o la traduccion.
  24. 24. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13, 14 o 22, en el que el anticuerpo esta dirigido contra el virus sincitial respiratorio (VSR).
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