MX2011006722A - Anticuerpo monoclonal anti-virus de la hepatitis c como un medicamento para el tratamiento terapeutico y prevencion de infecciones por el virus de la hepatitis c. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere al anticuerpo monoclonal e20 o un fragmento funcional del mismo como un medicamento para el tratamiento terapéutico y prevención de las infecciones por VHC; el anticuerpo e20 es capaz de enlazar todos los genotipos de VHC y muestra una actividad neutralizadora fuerte contra el virus, en particular hacia los genotipos la, Ib, 2a, y 4; una composición farmacéutica también se describe para el tratamiento o prevención de las infección por VHC que comprende el anticuerpo monoclonal e20 o un fragmento funcional del mismo y excipientes, portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables.

Description

ANTICUERPO MONOCLONAL ANTI-VIRUS DE LA HEPATITIS C COMO UN MEDICAMENTO PARA EL TRATAMIENTO TERAPÉUTICO Y PREVENCIÓN DE INFECCIONES POR EL VIRUS DE LA HEPATITIS C MEMORIA DESCRIPTIVA La presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal contra la glicoproteína E2 del virus de la hepatitis C (VHC) como un medicamento para el tratamiento terapéutico y la prevención de las infecciones por VHC.

El VHC es un virus que tiene una envoltura vírica y un ARN de una sola cadena, que pertenece a la familia Flavivirus. Con base en las diferencias genéticas observadas entre los diferentes aislados de VHC, estas especies de virus se clasifican en 6 diferentes genotipos, cada uno de las cuales está marcado con un número. Cada genotipo, a su vez, comprende un número de subtipos, cada uno de ellos está marcado con una letra. La prevalencia y distribución de los diferentes genotipos de VHC es variable en todo el mundo. En Europa, el genotipo predominante es 1 b, mientras que en Norteamérica, el genotipo 1 a prevalece. Determinar las variedades de genotipo es importante a partir de un punto de vista clínico, en tal, una característica contribuye al determinar de la respuesta potencial a la terapia basada en la combinación del interferón alfa con ribavirina, que es actualmente el tratamiento más utilizado. De hecho, los genotipos 1 y 4 responden menos que los genotipos 2, 3, 5 y 6 a la terapia de interferón.

A la fecha, no están disponibles vacunas ni inmunoterapias que prueben ser realmente efectivas contra el virus de la hepatitis C. La alta variabilidad de la estructura antigénica del VHC hasta ha dificultado el desarrollo de los anticuerpos capaces de neutralizar el virus, mientras que están dotados con la reactividad cruzada hacia los diferentes genotipos de virus. De este modo, existe la necesidad de anticuerpos anti-VHC que estén provistos contra las características y por consiguientes son realmente efectivos en la terapia y prevención de las infecciones por VHC.

Los anticuerpos dirigidos contra el VHC se describen en la técnica antecedente. Por ejemplo, Burioni et al., Hepatology Vol. 28, n. 3, 1998, describe la clonación y la caracterización de secuencias que codifican cinco fragmentos de anticuerpo humano recombínante (Fab) específicos para la glicoproteína E2 de VHC (E2 VHC), capaz de enlazar las glicoproteínas de diferentes genotipos de virus (reactividad cruzada). Entre los Fab descritos en este artículo está el fragmento de anticuerpo designado como e20. Burioni et al., 1998, cit. describe que e20 tiene una actividad alta mínima al neutralizar el enlace de E2 VHC (actividad NOB). Sin embargo, en vista de la alta actividad de NOB, en la solicitud de patente internacional WO 03/064473, el fragmento de anticuerpo e20 se describe como incapaz de neutralizar la infección viral incluso en concentraciones altas (80 g/ml) (ver, en particular, página 16 líneas 8 a 10 en WO 03/064473).

Los presentes inventores han encontrado ahora sorprendentemente que, contrario a lo que se mencionó en la técnica antecedente y en particular en WO 03/064473, el fragmento e20 es capaz de neutralizar efectivamente la infección mediante genotipos diferentes de VHC in vitro. Esto hace a e20 particularmente adecuado para la neutralización de VHC y eliminación de las células infectadas por VHC y para el uso como un medicamento para la inmunoterapia y la inmunoprevención de infecciones por VHC.

El logro de tal un resultado requirió un trabajo experimental largo y complejo, el cual se ilustra detalladamente en la siguiente sección experimental.

En síntesis extrema, el trabajo experimental llevado a cabo por los presentes inventores permitió demostrar que el fragmento de anticuerpo e20 muestra las siguientes características no esperadas: - se genera en el curso de una infección natural debido a una cepa de VHC que pertenece al genotipo 1 b, pero es capaz de enlazar a las glicoproteínas de todos los genotipos de VHC conocidos (genotipos particularmente 1a, 1 b, 2a, 2b, 3, 4, 5 y 6) y como tal es reactivo cruzado en gran medida; - posee una capacidad de neutralización particularmente alta hacia los genotipos de VHC 1a, 1 b, 2a y 4, como se mide mediante una neutralización con base en las pseudopartículas de VHC (VHCpp); - ciertos residuos de aminoácidos esenciales para el enlace de e20 a la glicoproteína E2 VHC también son esenciales en la infección por VHC, lo cual sugiere que los mutantes capaces de escapar del enlace e20 están al mismo tiempo provistos con una capacidad de duplicación disminuida.

Las características antes mencionadas aparentemente son ventajosas para la finalidad de uso del fragmento de anticuerpo e20 como un medicamento para inmunoterapia e inmunoprevención de las infecciones por VHC.

Un primer objetivo de la presente invención es así un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo, capaz de enlazar la glicoproteína E2 VHC de una pluralidad de diferentes genotipos de VHC como un medicamento para tratamiento terapéutico o prevención de las infecciones por VHC, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo comprende por lo menos una región variada de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 o una secuencia por lo menos 90% idéntica a SEQ ID NO: 1 y por lo menos una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2 o una secuencia por lo menos 90% idéntica a SEQ ID NO: 2.

Otros porcentajes de identidad de secuencia preferidos son por lo menos 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99%, en donde la expresión "por lo menos" se refiere a cada uno de los porcentajes mencionados.

En una modalidad de la invención, la región variable de cadena pesada está codificada mediante la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 3 y la región variable de cadena ligera está codificada por SEQ ID NO: 4.

El término "anticuerpo" está previsto para referirse a una clase de inmunoglobulina de longitud completa y cualquier fragmento del mismo que comprende una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada tal como por ejemplo un Fab, un F(ab')2, una CDR (Región Determinante de Complementaridad) o un anticuerpo de una sola cadena que comprende las regiones variables de cadena pesada y ligera o CDR, o soportes que comprenden una o más copias de fragmentos CDR de regiones variables de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina. Esto incluye los fragmentos de anticuerpo funcionales designados como ScFvs, diacuerpos, VHHs o cadenas ligeras o pesadas aisladas. La expresión "anticuerpo" además abarca los anticuerpos que pueden generarse al utilizar las secuencias de la región variable de fragmento de anticuerpo e20 en un procedimiento de transportaciones para la región variable de cadena ligera para establecer las combinaciones VH/VL con las propiedades de afinidad, estabilidad y/o producción recombinante mejoradas. La expresión "anticuerpo" también incluye un tipo de inmunoglobulina de longitud completa o un fragmento de inmunoglobulina fusionado con las inmunoglobulinas de longitud completa específicas o fragmentos de inmunoglobulina que pueden dirigirse a fragmentos de anticuerpo e20 o a la inmunoglobulina a los tejidos, células o estructuras de proteína solubles específicos. El anticuerpo monoclonal de la invención es preferiblemente humano.

El anticuerpo utilizado en la invención puede estar en la forma libre o en una forma conjugada. Una forma conjugada es un anticuerpo, como se define anteriormente, conjugado con una molécula capaz de modular la persistencia in vitro, promover o limitar la distribución de cuerpos, disminuir la sensibilidad a agentes proteolíticos, disminuir la antigenicidad, aumentar la habilidad citotóxica y/o facilitar la detección en fluidos y tejidos corporales. Los ejemplos no limitantes de moléculas adecuadas para la conjugación incluyen albúmina de suero humano, proteína de enlace de maltosa, glutatión-S-transferasa, proteínas p3 o p8 de revestimiento de fagos, péptidos, azúcares, PEG o moléculas similares a PEG, toxinas derivadas de animales, plantas o microbios, citocinas, enzimas, compuestos quimioluminiscentes, compuestos bioluminiscentes, átomos metálicos, radioisótopos, compuestos fluorescentes, grupos de etiquetado o sustratos para fosforilación, glicosilación, ubiquitinación, SUMOilación o escisión endoproteolítica. Para facilitar la conjugación, puede modificarse el término C- de anticuerpo o el término N-, por ejemplo al insertar residuos de aminoácidos adicionales por ejemplo uno o más residuos de cisteína que son capaces de formar puentes de disulfuro. El anticuerpo utilizado en la invención también puede enlazarse a eritrocitos humanos u otros portadores de células, a formulaciones específicas o a sistemas de liberación sostenida tales, pero no con limitación.como liposomas, dendrímeros, microsomas, nanopartículas, microcápsulas, vectores virales y similares.

Otro objetivo de la invención es una composición farmacéutica para tratamiento terapéutico o prevención de infecciones por VHC, que comprenden una cantidad farmacéuticamente efectiva de un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo como se definió anteriormente.

La composición de la invención puede administrarse a un sujeto infectado o en riesgo de ser infectado con VHC. Cualquier ruta de administración adecuada puede emplearse, incluyendo la administración parenteral, oral, ocular, tópica, loco-regional, enema o aerosol. La administración parenteral incluye inyección intramuscular, inyección intravenosa, inyección intralinfática, subcutánea o intradérmica e infusión.

La composición de la invención puede prepararse en cualquier forma farmacéutica que sea adecuada para la ruta de administración seleccionada, por ejemplo en la forma de una solución inyectable o suspensión, una infusión, un comprimido, una cápsula, una crema, un ungüento, una loción o un supositorio.

La composición de la invención comprende el anticuerpo o fragmento del mismo, como se definió anteriormente, como el principio activo así como los excipientes, los portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables conocidos por los expertos en la técnica.

Otro objetivo de la invención es un anticuerpo anti-idiotipo capaz de enlazar específicamente al idiotipo del anticuerpo o fragmento del mismo como se definió anteriormente. El anticuerpo anti-idiotipo de la invención puede obtenerse mediante métodos convencionales para obtener anticuerpos anti-idiotipo que son por sí solos conocidos por el experto en la técnica.

La invención además se describe detalladamente en la siguiente sección experimental provista únicamente a manera de ilustración, al referirse a las figuras descritas, en donde: La figura 1 muestra el enlace de e20 a la glicoproteínas E2 VHC de diferentes genotipos. Los datos se muestran como el porcentaje de células fluorescentes positivas.

Las figuras 2A-2F muestran la actividad neutralizadora de Fab e20 al utilizar pseudopartículas virales que muestran glicoproteínas E1 -E2 de genotipo 1 a: UKN1A20.8 (Figura 2A)¡ genotipo E1 E2 1b: UKN1 B5.23 (Figura 2B); genotipo E1 E2 2a: UKN2A1.2 (Figura 2C); genotipo E1 E2 2b: UKN2B1.1 (Figura 2D); genotipo E1 E2 4: UKN4.21.16 (Figura 2E). (Figura 2F) actividad neutralizadora de Fab e20 en 15 µ??/ml al utilizar pseudopartículas virales que muestran E1-E2 de diferentes genotipos (UKN1A20.8, UKN1 B5.23, UKN1A1.2, UKN2B1.1 ; UKN3A13.6, UKN4.21.16, UKN5.15.11 , UKN6.5.8).

La figura 3 muestra la actividad neutralizadora de e20 y otros anticuerpos anti-VHC (e137, AP33) al utilizar el sistema VHCcc (genotipo 2a). La infectividad JFH-1 en la presencia de e20 y el Fab control negativo (c33-3) se muestra como la cantidad del ARN viral normalizado a ARN gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenase, como se determina mediante la transcripción inversa cuantitativa PCR.

Sección experimental Estrategia de clonación La preparación de genotecas combinatorias aleatorias mostradas en superficies de fagos filamentosos representa una herramienta altamente potente para seleccionar anticuerpos monoclonales humanos de alta afinidad. De hecho, el procedimiento de selección con base en la demostración de fagos es extremadamente versátil y puede optimizarse para seleccionar los anticuerpos de reacción cruzada. En particular, e20 se clonó como un fragmento de lgG1 Fab del repertorio de linfocitos B de una mujer de 58 años que se infectó persistentemente con una cepa de VHC que pertenece al genotipo 1 b. Para seleccionar los clones de reacción cruzada, la genoteca derivada del paciente se sujetó a un paneo contra la glicoproteina E2 VHC recombinante derivada de un aislado viral que pertenece a un genotipo diferente, es decir 1a. En resumen, con este enfoque es posible obtener anticuerpos que se generan en el curso de una infección natural; sin embargo, son los mismos capaces de enlazar a diferentes glicoproteínas que nunca se encuentran mediante el sistema inmunológico del paciente seleccionado para el estudio.

Estudio de la secuencias de cadena pesada y ligera La secuenciación de los genes de cadena pesada y ligera de e20 y el estudio de su patrón de mutación (cuadro 1 ) mostró que este anticuerpo se deriva de un procedimiento de mutación somática que es un procedimiento estimulado en un clon de anticuerpo mediante el contacto continuo con el antígeno específico, para mejorar la afinidad del anticuerpo mismo para el antígeno.

Con respecto a la cadena pesada, e20 muestra una homología de secuencia de nucleótidos al gen de línea germinal debajo del 85%. El patrón de mutación muestra una distribución común para un clon mutado somáticamente, con una polarización específica en las regiones determinantes de complementaridad (CDR). La examinación de la región de unión de e20 (es decir, la región de unión que da lugar a CDR3) muestra que está formada de un gen V que pertenece a la subfamilia VIH-69 (un gen altamente representado en una respuesta humoral anti-VHC humana), un gen D que pertenece a la subfamilia D2-21 y un gen JH que pertenece a la subfamilia JH4.

De una manera similar, la cadena ligera de e20 (isotipo ?) muestra un porcentaje de mutación consistente con un procedimiento de mutación somático, como se muestra mediante la polarización en las CDR. La examinación de la región de unión muestra que la cadena ligera de e20 CDR3 surge de la unión de un gen KV que pertenece a la subfamilia KV3-15, y un gen KJ que pertenece a la subfamilia KJ5.

Los datos de secuencia permiten la conclusión de que e20 no es un anticuerpo artificial, sino por el contrario está presente realmente en el repertorio de anticuerpos del paciente seleccionado para el estudio.

CUADRO 1 a) b) El cuadro 1 muestra los patrones de mutación para las líneas germinales y el gen V en cadena pesada de e20 a) y cadena ligera b). Los porcentajes de mutación de aminoácidos y nucleótidos se calcularon de acuerdo con el método de alineación de Kabat y Wu, al tomar en cuenta FR1 , FR2, y FR3 para las cadenas ligeras y pesadas, CDR1 y CDR2 para las cadenas pesadas y CDR1 , CDR2, y CDR3 para las cadenas ligeras. También se reporta la relación de las mutaciones de reemplazo (R) con las mutaciones silenciosas (S).

Valoración de enlace de e20 a E2 derivado de los diferentes genotipos de VHC El fragmento e20 en la forma de un Fab se analizó para la habilidad de reconocer la glicoproteína E2 a partir de los genotipos de VHC diferentes a 1 b (es decir, el genotipo de la cepa que infectó al paciente del que se obtuvo e20) y 1a (es decir el genotipo empleado para clonar Fab). Las dificultades experimentadas al obtener las formas E2 solubles de diferentes genotipos de VHC requieren el uso de un enfoque alternativo con base en FACS.

Brevemente, las células de riñon epitelial humano 293T (HEK) se cultivaron en un medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), complementado con el 10% del suero fetal bovino, 5% de aminoácidos esenciales, 200 mM de glutamina, estreptomicina (100 µg/ml) y penicilina (100 U/ml). Una vez que la confluencia de 80% se alcanzó, las células 2x106 HEK se sembraron en placa de 10 cm y se transfectaron 24 horas después con 3 µg de phCMV-7, un vector de expresión que codifica para la glicoproteína E1 E2 de diferentes genotipos de VHC, al utilizar un protocolo de transfección de fosfato de calcio. El medio se reemplazó 16 horas después de la transfección y las células después se incubaron a 37°C durante 24 horas. El medio se desechó y la monocapa celular se lavó dos veces con PBS. Se agregaron 5 mi de regulador de pH de disociación y las células se incubaron a 37°C durante 5 minutos. Se lavaron dos veces las células con PBS y se centrifugaron a 1000 rpm durante 5 minutos; se agregó 1.2 mi de reactivo de fijación al granulo obtenido de cada placa. Las células se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. Las muestras se lavaron en 5 mi de PBS complementado con 2% de suero fetal bovino (FPBS), después se centrifugó a 1000 rpm durante 5 minutos.

Se agregaron 100 µ? de reactivo permeabilizador al gránulo con 50 µ? de Fab e20 a una concentración final de 10 µg/ml. Un protocolo similar también se siguió para las células no transfectadas utilizadas como un control. Después de una incubación de 40 minutos a temperatura ambiente, las muestras se lavaron en 5 mi de FPBS y 50 µ? de anticuerpo secundario conjugado con FITC se agregó al gránulo. Las células se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente y después se lavaron dos veces en 5 mi en FPBS. Finalmente, el sobrenadante se removió, el gránulo se volvió a suspender en 300 µ? de FPBS, y las células se analizaron mediante FACS. La actividad de enlace se expresó como el porcentaje de células fluorescentes positivas obtenidas de porcentaje de células que tienen un nivel de fluorescencia mayor que las células sin Fab e20. Un Fab (c33-3) humano recombinante especifico para un antígeno VHC no estructural (NS3) se incluyó como un control negativo en cada experimento.

Este enfoque mostró que Fab e20 fue capaz de reconocer todos los genotipos de VHC E2 (1a; 1b; 2a; 2b; 3; 4; 5; 6), con un porcentaje mayor de células fluorescentes que aquél obtenido con el control Fab. Los resultados se muestran en la figura 1.

Valoración de enlace de e20 a glicoproteina E2 a partir de VHC 1a mutadas con regiones de enlace CD81 Fab e20 también se valoró contra un panel de E1 E2 derivado de H77 (genotipo 1a) mutado con regiones conservadas, descrito como crucial para enlazar CD81 y para la infectividad de pseudopartículas de VHC (VHCpp). Cada ubicación conservada en esta región se mutó en alanina. Todas estas sustituciones resultaron en la pérdida de infectividad en el ensayo de VHCpp descrito a continuación. El enlace de la glicoproteina Fab e20 VHC E2 se detiene mediante algunas de estas mutaciones cruciales (cuadro 2).

Los datos descritos en el cuadro 2 sugieren que e20 se enlaza a una región E2 esencial para la infección viral. Estos datos también confirman que e20 se enlaza a una región crítica para el enlace de AP33, el anticuerpo anti-VHC neutralizador con la reactividad cruzada más grande, pero menos adecuada como un templado para el diseño de un medicamento de vacuna y para el uso en inmunoterapia, considerando que la inmunoterapia con anticuerpos heterólogos no es factible y que la presencia de los anticuerpos similares en el repertorio humano son extremadamente raros (Tarr et al. J Gen Virol. 88:2991. 2007). Incluso de manera más interesante, este análisis mostró claramente que todos lo mutantes no reconocidos por e20 no permiten la infección de células objetivo en un modelo pseudoviral.

CUADRO 2 El cuadro 2 anterior muestra el enlace de e20 a E1 E2 derivado de los mutantes H77 (genotipo 1 a). La actividad de enlace se expresa como el porcentaje de aquel medido con la proteína H77 tipo silvestre.

Valoración de la actividad neutralizadora de e20 en pseudoparticulas de VHC derivadas de diferentes genotipos La actividad neutralizadora de Fab e20 se verificó en un ensayo de neutralización con base en las pseudoparticulas de VHC (VHCpp).

Brevemente, las células de riñon epiteliales humanas 293T (HEK) y las células de hepatoma humanas Huh-7 se cultivaron en DMEM complementado con 10% de suero fetal bovino, 5% de aminoácidos no esenciales, 200 mM de glutamina, estreptomicina (100µg/ml) y penicilina (100 U/ml). Una vez que alcanzó el 80% de confluencia, las células 2x106 HEK se sembraron en placas de 10 cm y se transfectaron 24 horas después con 8 µ9 del vector de virus de leucemia de ratón de (MLV) Gag-Pol, 8µg de luciferasa codificadora del vector de transferencias MLV y 3 µ9 del vector de expresión PhCMV-7a con longitud completa que codifica para la glicoproteinas E1 E2 de diferentes genotipos de VHC. Un día después, el medio de transfeccion se reemplazó con 5ml de medio fresco que contiene 10 mM HEPES. Las células se incubaron durante 24 horas a 37°C. Las células objetivo (Huh-7) se sembraron en placas de 24 pozos a 2.5x104 por pozo y se incubaron durante la noche a 37°C. Las pseudoparticulas de VHC (VHCpp) se recolectaron 24 horas después del reemplazo del medio, se centrifugaron a 200 rpm durante 10 minutos y se filtraron a través de membranas de tamaño de poro de 0.45 µ?? y se utilizaron en un ensayo de neutralización.

En particular, 60µ? del medio que contiene VHCpp se mezcló con 90µ? de diferentes concentraciones de Fab e20 y se incubó durante 1 hora a 37°C. Tal mezcla se agregó a las células objetivo Huh-7 y las células se incubaron durante 3 horas a 37°C. Finalmente, la inoculación se removió, se agregó un mililitro de medio fresco a cada pozo y las células se incubaron a 37°C durante 4 días. Las células se lavaron 2 veces con PBS y después se Usaron con 100 µ? de regulador de pH de lisis (Promega), siguiendo las instrucciones del fabricante. El lisado celular se transfirió a placas de 96 pozos y 10?µ? de sustrato/regulador de pH (Promega) se agregó a cada pozo. La infección de las células se analizó al medir la actividad de luminiscencia (lector de placas Chameleon, Hidex), dado en unidades de luz relativa (RLU). La actividad neutralizadora se determinó como el porcentaje de infección al comparar la luminiscencia obtenida de aquélla detectada en los pozos VHCpp en la ausencia de anticuerpos capaces de competir (neg). Un Fab (c33-3) humano recombinante específico para un antígeno de VHC no estructural (NS3) se incluyó como un control negativo en cada experimento.

Este enfoque mostró que e20 es capaz de neutralizar fuertemente genotipos de VHC 1 a y 4. E20 muestra un 50% de actividad neutralizadora en el genotipo 1a en concentraciones de 7.5 µg/ml y un 75% de inhibición en el genotipo 4 a 15 µg/ml (figuras 2A, 2E, y 2F). No obstante, este cuerpo también es capaz de neutralizar de manera fuerte los genotipos de VHC 1b y 2a. Más detalladamente, a 15 µg ml, e20 muestra un 40% de neutralización y 75% de infectividad de genotipo 1 b y 2a, respectivamente (figuras 2B, 2C y 2F). Finalmente, e20 es capaz de neutralizar en menor grado HVCpps que tiene glicoproteínas 2b E1 E2 de genotipo, que muestra un 20% de inhibición a 15 µg/ml (figuras 2D y 2F).

Actividad neutralizadora de e20 de un cultivo de cepas de VHC en cultivo celular (genotipo 2a, cepa JFH1) La actividad neutralizadora de e20 VHC también se analizó al utilizar un sistema de modelo VHCcc (cultivo celular VHC), mediante el uso de una línea celular de hepatoma humano estable que contiene un ADNc, integrado en un cromosoma, de genotipo de VHC 2a (JFH1) y virus infecciosos altamente productivos (figura 3). Cada sistema permite la evaluación de la actividad neutralizadora al utilizar un cepa de virus de hepatitis C infecciosa. En este juego de experimentos, las concentraciones diferentes de Fab e20 se incubaron con un medio que contiene el virus generado en el ensayo VHC. Después de 3 horas, la mezcla se agregó a células objetivo (Huh7.5). La infectividad se valoró al medir los niveles de ARN de cepa positiva de VHC. Fab e20 mostró una actividad neutralizadora fuerte, como en una concentración de g/ml, que es muy baja, que es capaz de tener completamente la infectividad de 2a de genotipos de VHC. La actividad neutralizadora de Fab e20 es comparable con el anticuerpo monoclonal AP33 IgG de ratón, uno de los anticuerpos neutralizadores cruzados más fuertes descritos a la fecha.

Claims (12)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo capaz de enlazar la glicoproteína E2 VHC de una pluralidad de diferentes genotipos de VHC, para uso como un medicamento para el tratamiento o prevención de las infecciones por VHC, en donde el anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo comprende por lo menos una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:1 o una secuencia por lo menos 90% idéntica a SEQ ID NO:1 y por lo menos una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:2 o una secuencia por lo menos 90% idéntica a SEQ ID NO:2.

2. - El anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque es capaz de enlazar la glicoproteína E2 VHC de los genotipos 1a, 1 b, 2a, 2b, 3, 4, 5 y 6.

3. - El anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado además porque es una inmunoglobulina de tamaño completo o un fragmento de inmunoglobulina que comprende por lo menos una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera.

4. - El anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque el fragmento se selecciona de un Fab, un F(ab')2, una CDR (región determinante complementaria), o un anticuerpo de cadena que comprende regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera o CDR, o mallas que comprenden una o más copias de fragmentos de CDR derivadas de las regiones variables de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina.

5. - El anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada además porque está en la forma libre.

6. - El anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado además porque se conjuga con una molécula capaz de modular la persistencia in vivo, promover o limitar la distribución del cuerpo, disminuir la sensibilidad a los agentes proteolíticos, disminuir la antigenicidad, aumentar la habilidad citotóxica y/o facilitar la detección en los fluidos y tejidos corporales.

7.- El anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado además porque se fusiona con una inmunoglobulina de longitud completa específica o un fragmento de inmunoglobulina capaz de dirigir el anticuerpo a tejidos, células o estructuras de proteínas solubles específicas.

8.- Una composición farmacéutica para uso en el tratamiento o prevención de infecciones por VHC, en donde la composición farmacéutica comprende una cantidad farmacéuticamente efectiva de un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque la composición farmacéutica es una forma de dosis farmacéutica adaptada para ser administrable parenteralmente, oralmente, ocularmente, tópicamente, locoregionalmente, como un enema o aerosol.

10. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 8 ó 9, caracterizada además porque la composición farmacéutica está en la forma de una solución inyectable o suspensión, una infusión, un comprimido, una cápsula, una crema, un ungüento, una loción o un supositorio.

11. - El uso de un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la preparación de un medicamento para tratar o prevenir infecciones por VHC.

12. - Un anticuerpo anti-idiotipo, capaz de enlazar específicamente al idiotipo del anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o el fragmento del mismo.