ES2541323T3

ES2541323T3 - Anticuerpo monoclonal anti-virus de la hepatitis C como un medicamento para el tratamiento terapéutico y prevención de infecciones por el virus de la hepatitis C

Info

Publication number: ES2541323T3
Application number: ES09805863.9T
Authority: ES
Inventors: Roberto Burioni; Massimo Clementi
Original assignee: Pomona Ricerca SRL
Current assignee: Pomona Ricerca SRL
Priority date: 2008-12-22
Filing date: 2009-12-21
Publication date: 2015-07-17
Anticipated expiration: 2029-12-21
Also published as: KR101450955B1; WO2010073204A1; ITTO20080964A1; US20110256140A1; RU2596409C2; CN102264393B; KR20110096591A; EP2376119B1; JP2012513457A; RU2011130522A; US8623363B2; MX2011006722A; CN102264393A; BRPI0923569B1; BRPI0923569A2; EP2376119A1

Abstract

Un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo capaz de enlazar la glicoproteína E2 VHC de los genotipos 1a, 1b, 2a, 2b, 3, 4, 5 y 6 de VHC, en donde el anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo comprende por lo menos una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:1 o una secuencia por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO:1 y por lo menos una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:2 o una secuencia por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO:2, para usar en el tratamiento terapéutico o prevención de infecciones por VHC.

Description

imagen1

DESCRIPCIÓN

Anticuerpo monoclonal anti-virus de la hepatitis C como un medicamento para el tratamiento terapéutico y prevención de infecciones por el virus de la hepatitis C

5 La presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal contra la glicoproteína E2 del virus de la hepatitis C (VHC) como un medicamento para el tratamiento terapéutico y la prevención de las infecciones por VHC.

El VHC es un virus que tiene una envoltura vírica y un ARN de una sola cadena, que pertenece a la familia

10 Flavivirus. Con base en las diferencias genéticas observadas entre los diferentes aislados de VHC, estas especies de virus se clasifican en 6 diferentes genotipos, cada uno de las cuales está marcado con un número. Cada genotipo, a su vez, comprende un número de subtipos, cada uno de ellos está marcado con una letra. La prevalencia y distribución de los diferentes genotipos de VHC es variable en todo el mundo. En Europa, el genotipo predominante es 1b, mientras que en Norteamérica, el genotipo 1a prevalece. Determinar las variedades de

15 genotipo es importante a partir de un punto de vista clínico, en tal, una característica contribuye al determinar de la respuesta potencial a la terapia basada en la combinación del interferón alfa con ribavirina, que es actualmente el tratamiento más utilizado. De hecho, los genotipos 1 y 4 responden menos que los genotipos 2, 3, 5 y 6 a la terapia de interferón.

20 A la fecha, no están disponibles vacunas ni inmunoterapias que prueben ser realmente efectivas contra el virus de la hepatitis C. La alta variabilidad de la estructura antigénica del VHC hasta ha dificultado el desarrollo de los anticuerpos capaces de neutralizar el virus, mientras que están dotados con la reactividad cruzada hacia los diferentes genotipos de virus. De este modo, existe la necesidad de anticuerpos anti-VHC que estén provistos contra las características y por consiguientes son realmente efectivos en la terapia y prevención de las infecciones por

25 VHC.

Los anticuerpos dirigidos contra el VHC se describen en la técnica antecedente. Por ejemplo, Burioni et al., Hepatology Vol. 28, n. 3, 1998, describe la clonación y la caracterización de secuencias que codifican cinco fragmentos de anticuerpo humano recombinante (Fab) específicos para la glicoproteína E2 de VHC (E2 VHC), capaz

30 de enlazar las glicoproteínas de diferentes genotipos de virus (reactividad cruzada). Entre los Fab descritos en este artículo está el fragmento de anticuerpo designado como e20. Burioni et al., 1998, cit. describe que e20 tiene una actividad alta mínima al neutralizar el enlace de E2 VHC (actividad NOB). Sin embargo, en vista de la alta actividad de NOB, en la solicitud de patente internacional WO 03/064473, el fragmento de anticuerpo e20 se describe como incapaz de neutralizar la infección viral incluso en concentraciones altas (80 µg/ml) (ver, en particular, página 16

35 líneas 8 a 10 en WO 03/064473).

Johansson D et al, Proceedings of the National Academy of Sciences of USA, National Academy of Sciences, Washington D.C., USA, vol. 104, No. 41,9,2007, páginas 16269-16274, describe la producción de Fab anti-VHC, de los que dos de ellos muestran un genotipo cruzado de unión y neutralización de la infección.

40 WO 02/055560 describe el Fab anti-VHC identificado como VHC#4 que desarrolla una reacción cruzada con todos los genotipos.

Los presentes inventores han encontrado ahora sorprendentemente que, contrario a lo que se mencionó en la

45 técnica antecedente y en particular en WO 03/064473, el fragmento e20 es capaz de neutralizar efectivamente la infección mediante genotipos diferentes de VHC in vitro. Esto hace a e20 particularmente adecuado para la neutralización de VHC y eliminación de las células infectadas por VHC y para el uso como un medicamento para la inmunoterapia y la inmunoprevención de infecciones por VHC.

50 El logro de tal un resultado requirió un trabajo experimental largo y complejo, el cual se ilustra detalladamente en la siguiente sección experimental.

En síntesis extrema, el trabajo experimental llevado a cabo por los presentes inventores permitió demostrar que el fragmento de anticuerpo e20 muestra las siguientes características no esperadas:

55 -se genera en el curso de una infección natural debido a una cepa de VHC que pertenece al genotipo 1b, pero es capaz de enlazar a las glicoproteínas de todos los genotipos de VHC conocidos (genotipos particularmente 1a,1b, 2a, 2b, 3, 4, 5 y 6) y como tal es reactivo cruzado en gran medida;

60 -posee una capacidad de neutralización particularmente alta hacia los genotipos de VHC 1a, 1b, 2a y 4, como se mide mediante una neutralización con base en las pseudopartículas de VHC (VHCpp);

-ciertos residuos de aminoácidos esenciales para el enlace de e20 a la glicoproteína E2 VHC también son esenciales en la infección por VHC, lo cual sugiere que los mutantes capaces de escapar del enlace e20 están al

65 mismo tiempo provistos con una capacidad de duplicación disminuida.

imagen2

Las características antes mencionadas aparentemente son ventajosas para la finalidad de uso del fragmento de anticuerpo e20 como un medicamento para inmunoterapia e inmunoprevención de las infecciones por VHC.

Un primer objetivo de la presente invención es así un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo, capaz de

5 enlazar la glicoproteína E2 VHC de los genotipos 1a, 1b, 2a, 2b, 3, 4, 5 y 6 de VHC como un medicamento para tratamiento terapéutico o prevención de las infecciones por VHC, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo comprende por lo menos una región variada de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 o una secuencia por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO: 1 y por lo menos una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2 o una secuencia por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO: 2.

Otros porcentajes de identidad de secuencia preferidos son por lo menos 95%, 96%, 97%, 98% ó 99%, en donde la expresión “por lo menos” se refiere a cada uno de los porcentajes mencionados.

15 En una modalidad de la invención, la región variable de cadena pesada está codificada mediante la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 3 y la región variable de cadena ligera está codificada por SEQ ID NO: 4.

El término “anticuerpo” está previsto para referirse a una clase de inmunoglobulina de longitud completa y cualquier fragmento del mismo que comprende una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada tal como por ejemplo un Fab, un F(ab’)2 o un anticuerpo de una sola cadena que comprende las regiones variables de cadena pesada y ligera o CDR, o soportes que comprenden una o más copias de fragmentos CDR de regiones variables de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina. Esto incluye los fragmentos de anticuerpo funcionales designados como ScFvs, diacuerpos, VHHs o cadenas ligeras o pesadas aisladas. La expresión “anticuerpo” además abarca los anticuerpos que pueden generarse al utilizar las secuencias de la región variable de fragmento

25 de anticuerpo e20 en un procedimiento de transportaciones para la región variable de cadena ligera para establecer las combinaciones VH/VL con las propiedades de afinidad, estabilidad y/o producción recombinante mejoradas. La expresión “anticuerpo” también incluye un tipo de inmunoglobulina de longitud completa o un fragmento de inmunoglobulina fusionado con las inmunoglobulinas de longitud completa específicas o fragmentos de inmunoglobulina que pueden dirigirse a fragmentos de anticuerpo e20 o a la inmunoglobulina a los tejidos, células o estructuras de proteína solubles específicos. El anticuerpo monoclonal de la invención es preferiblemente humano.

El anticuerpo utilizado en la invención puede estar en la forma libre o en una forma conjugada. Una forma conjugada es un anticuerpo, como se define anteriormente, conjugado con una molécula capaz de modular la persistencia in vitro, promover o limitar la distribución de cuerpos, disminuir la sensibilidad a agentes proteolíticos, disminuir la 35 antigenicidad, aumentar la habilidad citotóxica y/o facilitar la detección en fluidos y tejidos corporales. Los ejemplos no limitantes de moléculas adecuadas para la conjugación incluyen albúmina de suero humano, proteína de enlace de maltosa, glutatión-S-transferasa, proteínas p3 o p8 de revestimiento de fagos, péptidos, azúcares, PEG o moléculas similares a PEG, toxinas derivadas de animales, plantas o microbios, citocinas, enzimas, compuestos quimioluminiscentes, compuestos bioluminiscentes, átomos metálicos, radioisótopos, compuestos fluorescentes, grupos de etiquetado o sustratos para fosforilación, glicosilación, ubiquitinación, SUMOilación o escisión endoproteolítica. Para facilitar la conjugación, puede modificarse el término C-de anticuerpo o el término N-, por ejemplo al insertar residuos de aminoácidos adicionales por ejemplo uno o más residuos de cisteína que son capaces de formar puentes de disulfuro. El anticuerpo utilizado en la invención también puede enlazarse a eritrocitos humanos u otros portadores de células, a formulaciones específicas o a sistemas de liberación sostenida tales, pero

45 no con limitación, como liposomas, dendrímeros, microsomas, nanopartículas, microcápsulas, vectores virales y similares.

Otro objetivo de la invención es una composición farmacéutica para tratamiento terapéutico o prevención de infecciones por VHC, que comprenden una cantidad farmacéuticamente efectiva de un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo como se definió anteriormente.

La composición de la invención puede administrarse a un sujeto infectado o en riesgo de ser infectado con VHC. Cualquier ruta de administración adecuada puede emplearse, incluyendo la administración parenteral, oral, ocular, tópica, loco-regional, enema o aerosol. La administración parenteral incluye inyección intramuscular, inyección

55 intravenosa, inyección intralinfática, subcutánea o intradérmica e infusión.

La composición de la invención puede prepararse en cualquier forma farmacéutica que sea adecuada para la ruta de administración seleccionada, por ejemplo en la forma de una solución inyectable o suspensión, una infusión, un comprimido, una cápsula, una crema, un ungüento, una loción o un supositorio.

La composición de la invención comprende el anticuerpo o fragmento del mismo, como se definió anteriormente, como el principio activo así como los excipientes, los portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables conocidos por los expertos en la técnica.

65 La invención además se describe detalladamente en la siguiente sección experimental provista únicamente a manera de ilustración, al referirse a las figuras descritas, en donde:

imagen3

La figura 1 muestra el enlace de e20 a la glicoproteínas E2 VHC de diferentes genotipos. Los datos se muestran como el porcentaje de células fluorescentes positivas.

5 Las figuras 2A-2F muestran la actividad neutralizadora de Fab e20 al utilizar pseudopartículas virales que muestran glicoproteínas E1-E2 de genotipo 1a: UKN1A20.8 (Figura 2A); genotipo E1E2 1b: UKN1B5.23 (Figura 2B); genotipo E1E2 2a: UKN2A1.2 (Figura 2C); genotipo E1E2 2b: UKN2B1.1 (Figura 2D); genotipo E1E2 4: UKN4.21.16 (Figura 2E). (Figura 2F) actividad neutralizadora de Fab e20 en 15 µm/ml al utilizar pseudopartículas virales que muestran E1-E2 de diferentes genotipos (UKN1A20.8, UKN1B5.23, UKN1A1.2, UKN2B1.1; UKN3A13.6, UKN4.21.16,

10 UKN5.15.11, UKN6.5.8).

La figura 3 muestra la actividad neutralizadora de e20 y otros anticuerpos anti-VHC (e137, AP33) al utilizar el sistema VHCcc (genotipo 2a). La infectividad JFH-1 en la presencia de e20 y el Fab control negativo (c33-3) se muestra como la cantidad del ARN viral normalizado a ARN gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, como se

15 determina mediante la transcripción inversa cuantitativa PCR.

Sección experimental

Estrategia de clonación

20 La preparación de genotecas combinatorias aleatorias mostradas en superficies de fagos filamentosos representa una herramienta altamente potente para seleccionar anticuerpos monoclonales humanos de alta afinidad. De hecho, el procedimiento de selección con base en la demostración de fagos es extremadamente versátil y puede optimizarse para seleccionar los anticuerpos de reacción cruzada. En particular, e20 se clonó como un fragmento de

25 IgG1 Fab del repertorio de linfocitos B de una mujer de 58 años que se infectó persistentemente con una cepa de VHC que pertenece al genotipo 1b. Para seleccionar los clones de reacción cruzada, la genoteca derivada del paciente se sujetó a un paneo contra la glicoproteína E2 VHC recombinante derivada de un aislado viral que pertenece a un genotipo diferente, es decir 1a. En resumen, con este enfoque es posible obtener anticuerpos que se generan en el curso de una infección natural; sin embargo, son los mismos capaces de enlazar a diferentes

30 glicoproteínas que nunca se encuentran mediante el sistema inmunológico del paciente seleccionado para el estudio.

Estudio de la secuencias de cadena pesada y ligera

35 La secuenciación de los genes de cadena pesada y ligera de e20 y el estudio de su patrón de mutación (cuadro 1) mostró que este anticuerpo se deriva de un procedimiento de mutación somática que es un procedimiento estimulado en un clon de anticuerpo mediante el contacto continuo con el antígeno específico, para mejorar la afinidad del anticuerpo mismo para el antígeno.

40 Con respecto a la cadena pesada, e20 muestra una homología de secuencia de nucleótidos al gen de línea germinal debajo del 85%. El patrón de mutación muestra una distribución común para un clon mutado somáticamente, con una polarización específica en las regiones determinantes de complementariedad (CDR). La examinación de la región de unión de e20 (es decir, la región de unión que da lugar a CDR3) muestra que está formada de un gen V que pertenece a la subfamilia VIH-69 (un gen altamente representado en una respuesta humoral anti-VHC humana),

45 un gen D que pertenece a la subfamilia D2-21 y un gen JH que pertenece a la subfamilia JH4.

De una manera similar, la cadena ligera de e20 (isotipo κ) muestra un porcentaje de mutación consistente con un procedimiento de mutación somático, como se muestra mediante la polarización en las CDR. La examinación de la región de unión muestra que la cadena ligera de e20 CDR3 surge de la unión de un gen κV que pertenece a la

50 subfamilia κv3-15, y un gen κJ que pertenece a la subfamilia κJ5.

Los datos de secuencia permiten la conclusión de que e20 no es un anticuerpo artificial, sino por el contrario está presente realmente en el repertorio de anticuerpos del paciente seleccionado para el estudio.

55 CUADRO 1

a)

Gen V: Gen D Gen J Longitud de CDR 3 % de nucleótidos mutados % de aminoácidos mutados Mutaciones R:S

FR: CDR FR CDR FR CDR

V1-69: D 2-21 J4 18 9.4 16.9 19 38 13 : 2 5 : 1

b) El cuadro 1 muestra los patrones de mutación para las líneas germinales y el gen V en cadena pesada de e20 a) y cadena ligera b). Los porcentajes de mutación de aminoácidos y nucleótidos se calcularon de acuerdo con el método de alineación de Kabat y Wu, al tomar en cuenta FR1, FR2, y FR3 para las cadenas ligeras y pesadas, CDR1 y

imagen4

Gen V: Gen J Longitud de CDR 3 % de n(ucleótidos mutados % de aminoácidos mutados Mutaciones R:S

FR: CDR FR CDR FR CDR

KV 3-15: KJ 5 9 1.5 10.4 1.5 11.5 1 : 2 3 : 5

5 CDR2 para las cadenas pesadas y CDR1, CDR2, y CDR3 para las cadenas ligeras. También se reporta la relación de las mutaciones de reemplazo (R) con las mutaciones silenciosas (S).

Valoración de enlace de e20 a E2 derivado de los diferentes genotipos de VHC

10 El fragmento e20 en la forma de un Fab se analizó para la habilidad de reconocer la glicoproteína E2 a partir de los genotipos de VHC diferentes a 1b (es decir, el genotipo de la cepa que infectó al paciente del que se obtuvo e20) y 1a (es decir el genotipo empleado para clonar Fab). Las dificultades experimentadas al obtener las formas E2 solubles de diferentes genotipos de VHC requieren el uso de un enfoque alternativo con base en FACS.

15 Brevemente, las células de riñón epitelial humano 293T (HEK) se cultivaron en un medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), complementado con el 10% del suero fetal bovino, 5% de aminoácidos esenciales, 200 mM de glutamina, estreptomicina (100 µg/ml) y penicilina (100 U/ml). Una vez que la confluencia de 80% se alcanzó, las células 2x106 HEK se sembraron en placa de 10 cm y se transfectaron 24 horas después con 3 µg de phCMV-7, un vector de expresión que codifica para la glicoproteína E1E2 de diferentes genotipos de VHC, al utilizar un protocolo

20 de transfección de fosfato de calcio. El medio se reemplazó 16 horas después de la transfección y las células después se incubaron a 37°C durante 24 horas. El medio se desechó y la monocapa celular se lavó dos veces con PBS. Se agregaron 5 ml de regulador de pH de disociación y las células se incubaron a 37°C durante 5 minutos. Se lavaron dos veces las células con PBS y se centrifugaron a 1000 rpm durante 5 minutos; se agregó 1.2 ml de reactivo de fijación al gránulo obtenido de cada placa. Las células se incubaron durante 15 minutos a temperatura

25 ambiente. Las muestras se lavaron en 5 ml de PBS complementado con 2% de suero fetal bovino (FPBS), después se centrifugó a 1000 rpm durante 5 minutos.

Se agregaron 100 µl de reactivo permeabilizador al gránulo con 50 µl de Fab e20 a una concentración final de 10 µg/ml. Un protocolo similar también se siguió para las células no transfectadas utilizadas como un control. Después 30 de una incubación de 40 minutos a temperatura ambiente, las muestras se lavaron en 5 ml de FPBS y 50 µl de anticuerpo secundario conjugado con FITC se agregó al gránulo. Las células se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente y después se lavaron dos veces en 5 ml en FPBS. Finalmente, el sobrenadante se removió, el gránulo se volvió a suspender en 300 µl de FPBS, y las células se analizaron mediante FACS. La actividad de enlace se expresó como el porcentaje de células fluorescentes positivas obtenidas de porcentaje de células que

35 tienen un nivel de fluorescencia mayor que las células sin Fab e20. Un Fab (c33-3) humano recombinante específico para un antígeno VHC no estructural (NS3) se incluyó como un control negativo en cada experimento.

Este enfoque mostró que Fab e20 fue capaz de reconocer todos los genotipos de VHC E2 (1a; 1b; 2a; 2b; 3; 4; 5; 6), con un porcentaje mayor de células fluorescentes que aquél obtenido con el control Fab. Los resultados se muestran

40 en la figura 1.

Valoración de enlace de e20 a glicoproteína E2 a partir de VHC 1a mutadas con regiones de enlace CD81

Fab e20 también se valoró contra un panel de E1E2 derivado de H77 (genotipo 1a) mutado con regiones

45 conservadas, descrito como crucial para enlazar CD81 y para la infectividad de pseudopartículas de VHC (VHCpp). Cada ubicación conservada en esta región se mutó en alanina. Todas estas sustituciones resultaron en la pérdida de infectividad en el ensayo de VHCpp descrito a continuación. El enlace de la glicoproteína Fab e20 VHC E2 se detiene mediante algunas de estas mutaciones cruciales (cuadro 2).

50 Los datos descritos en el cuadro 2 sugieren que e20 se enlaza a una región E2 esencial para la infección viral. Estos

medicamento de vacuna y para el uso en inmunoterapia, considerando que la inmunoterapia con anticuerpos heterólogos no es factible y que la presencia de los anticuerpos similares en el repertorio humano son

55 extremadamente raros (Tarr et al. J Gen Virol. 88:2991. 2007). Incluso de manera más interesante, este análisis mostró claramente que todos los mutantes no reconocidos por e20 no permiten la infección de células objetivo en un modelo pseudoviral.

60

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imagen6

Q412A: 1413A T414A N415A T416A N417A G418A S419A W420A H421A I422A N423A R483A

actividad de enlace de e20: 100 100 95 98 96 97 100 100 97 100 100 100 100

Infectividad de VHCpp: 5 0 0 0 0 12 0 100 0 0 0 0 0

P484A: Y486A W487A H488A Y527A W529A G530S N532S D533A T534A D535A N540A R543A

actividad de enlace de e20: 100 95 100 100 92 0 3 100 100 100 10 70 68

Infectividad de VHCpp: 100 5 0 0 5 0 0 25 30 25 0 40 0

P544A: P545A G547A W549A F550A

Actividad de enlace de e20: 72 97 98 96 94

Infectividad de VHCpp: 35 80 0 0 5

El cuadro 2 anterior muestra el enlace de e20 a E1E2 derivado de los mutantes H77 (genotipo 1a). La actividad de 5 enlace se expresa como el porcentaje de aquel medido con la proteína H77 tipo silvestre.

Valoración de la actividad neutralizadora de e20 en pseudopartículas de VHC derivadas de diferentes genotipos

La actividad neutralizadora de Fab e20 se verificó en un ensayo de neutralización con base en las pseudopartículas 10 de VHC (VHCpp).

Brevemente, las células de riñón epiteliales humanas 293T (HEK) y las células de hepatoma humanas Huh-7 se cultivaron en DMEM complementado con 10% de suero fetal bovino, 5% de aminoácidos no esenciales, 200 mM de glutamina, estreptomicina (100µg/ml) y penicilina (100 U/ml). Una vez que alcanzó el 80% de confluencia, las células 15 2x106 HEK se sembraron en placas de 10 cm y se transfectaron 24 horas después con 8 µg del vector de virus de leucemia de ratón de (MLV) Gag-Pol, 8µg de luciferasa codificadora del vector de transferencias MLV y 3 µg del vector de expresión PhCMV-7a con longitud completa que codifica para la glicoproteínas E1E2 de diferentes genotipos de VHC. Un día después, el medio de transfección se reemplazó con 5ml de medio fresco que contiene 10 mM HEPES. Las células se incubaron durante 24 horas a 37°C. Las células objetivo (Huh-7) se sembraron en

20 placas de 24 pozos a 2.5x104 por pozo y se incubaron durante la noche a 37°C. Las pseudopartículas de VHC (VHCpp) se recolectaron 24 horas después del reemplazo del medio, se centrifugaron a 200 rpm durante 10 minutos y se filtraron a través de membranas de tamaño de poro de 0.45 µm y se utilizaron en un ensayo de neutralización.

En particular, 60µl del medio que contiene VHCpp se mezcló con 90µl de diferentes concentraciones de Fab e20 y

25 se incubó durante 1 hora a 37°C. Tal mezcla se agregó a las células objetivo Huh-7 y las células se incubaron durante 3 horas a 37°C. Finalmente, la inoculación se removió, se agregó un mililitro de medio fresco a cada pozo y las células se incubaron a 37°C durante 4 días. Las células se lavaron 2 veces con PBS y después se lisaron con 100 µl de regulador de pH de lisis (Promega), siguiendo las instrucciones del fabricante. El lisado celular se transfirió a placas de 96 pozos y 100µl de sustrato/regulador de pH (Promega) se agregó a cada pozo. La infección de las

30 células se analizó al medir la actividad de luminiscencia (lector de placas Chameleon, Hidex), dado en unidades de luz relativa (RLU). La actividad neutralizadora se determinó como el porcentaje de infección al comparar la luminiscencia obtenida de aquélla detectada en los pozos VHCpp en la ausencia de anticuerpos capaces de competir (neg). Un Fab (c33-3) humano recombinante específico para un antígeno de VHC no estructural (NS3) se incluyó como un control negativo en cada experimento.

35 Este enfoque mostró que e20 es capaz de neutralizar fuertemente genotipos de VHC 1a y 4. E20 muestra un 50% de actividad neutralizadora en el genotipo 1a en concentraciones de 7.5 µg/ml y un 75% de inhibición en el genotipo 4 a 15 µg/ml (figuras 2A, 2E, y 2F). No obstante, este cuerpo también es capaz de neutralizar de manera fuerte los genotipos de VHC 1b y 2a. Más detalladamente, a 15 µg/ml, e20 muestra un 40% de neutralización y 75% de

40 infectividad de genotipo 1b y 2a, respectivamente (figuras 2B, 2C y 2F). Finalmente, e20 es capaz de neutralizar en menor grado HVCpps que tiene glicoproteínas 2b E1E2 de genotipo, que muestra un 20% de inhibición a 15 µg/ml

Claims

imagen1

REIVINDICACIONES

5 1. Un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo capaz de enlazar la glicoproteína E2 VHC de los genotipos 1a, 1b, 2a, 2b, 3, 4, 5 y 6 de VHC, en donde el anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo comprende por lo menos una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:1 o una secuencia por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO:1 y por lo menos una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:2 o una secuencia por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO:2, para usar en

10 el tratamiento terapéutico o prevención de infecciones por VHC.
2. El anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo para usar de conformidad con la reivindicación 1, que es una inmunoglobulina de tamaño completo o un fragmento de inmunoglobulina que comprende por lo menos una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera.

15
3. El anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo para usar de conformidad con la reivindicación 2, en donde el fragmento se selecciona de un Fab, un F(ab’)2, o un anticuerpo de cadena simple que comprende regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera.

20 4. El anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo para usar de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 que se conjuga con una molécula capaz de modular la persistencia in vivo, promover o limitar la distribución del cuerpo, disminuir la sensibilidad a los agentes proteolíticos, disminuir la antigenicidad, aumentar la habilidad citotóxica y/o facilitar la detección en los fluidos y tejidos corporales.

25 5. El anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo para usar de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que se fusiona con una inmunoglobulina de longitud completa específica o un fragmento de inmunoglobulina capaz de dirigir el anticuerpo a tejidos, células o estructuras de proteínas solubles específicas.
6. Una composición farmacéutica para uso en el tratamiento terapéutico o prevención de infecciones por VHC que

30 comprende una cantidad farmacéuticamente efectiva de un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
7. La composición farmacéutica para usar de conformidad con la reivindicación 6 en una forma de dosis

farmacéutica adaptada para ser administrable por vía parenteral, oral, ocular, tópica, locorregional, como un enema o 35 aerosol.
8. La composición farmacéutica para usar de conformidad con la reivindicación 6 ó 7 en forma de una solución inyectable o suspensión, una infusión, un comprimido, una cápsula, una crema, un ungüento, una loción o un supositorio.

40
9. El uso de un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para preparar un medicamento para tratar o prevenir infecciones por VHC.

10