BRPI0707728A2 - anticorpos de gripe, composiÇço compreendendo os mesmos e seus usos em diagnàsticos e anÁlises clÍnicas - Google Patents

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Abstract

ANTICORPOS DA GRIPE, COMPOSIÇçO COMPREENDENDO OS MESMOS E SEUS USOS EM DIAGNàSTICOS E ANÁLISES CLÍNICAS. A presente invenção refere-se a intersecção dos campos de imunologia e produção de proteína, e, particularmente, a antígenos e vacinas úteis na prevenção de infecção por vírus da gripe. São providos antígenos de proteína recombinantes, composições, e métodos para a produção e uso de tais antígenos e composições de vacina.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICOR-POS DE GRIPE, COMPOSIÇÕES, E MÉTODOS RELACIONADOS".Pedidos Relacionados
O presente pedido é relacionado a e reivindica prioridade sob 35USC 119(e) a U.S.S.N. 60/844.770, depositado em 15 de setembro de 2006(o pedido '770'); o conteúdo total do pedido '770' sendo incorporados aquipor referência.
Antecedentes da Invenção
A gripe tem uma longa história caracterizada por ondas dedoenças pandêmicas, doenças epidêmicas, ressurgências e deflagrações.A gripe é uma doença altamente contagiosa que pode estar devastando i-gualmente ambos os países em desenvolvimento e desenvolvidos. O vírusda gripe apresenta uma das maiores ameaças à população humana. Apesardos esforços da vacinação anual, as infecções de vírus resultam em morbi-dez e mortalidade substanciais. Embora doenças epidêmicas de gripe ocor-ram quase todo ano, felizmente as doenças pandêmicas não ocorrem muitofreqüentemente. Contudo, cepas recentes de gripe têm aparecido, visto quese está novamente diante do potencial de uma doença pandêmica de gripe.O vírus de gripe aviária do tipo H5N1, atualmente causando uma doençapandêmica em aves domésticas na Ásia, bem como regiões do leste daEuropa, tem persistentemente se difundido por todo o globo. A difusão rápi-do de infecção, bem como transmissão de espécies cruzadas de pássarospara indivíduos humanos, aumenta o potencial de deflagrações em popula-ções humanas e o risco de uma doença pandêmica. O vírus é altamente pa-togênico, resultando em uma taxa de mortalidade de mais de cinqüenta porcento em pássaros, bem como poucos casos seres humanos que foram i-dentificados. Se o vírus fosse alcançar transmissão de humano a humano,ele não teria o potencial para resultar em doença rápida, muito difundida, emortalidade.
A maior defesa contra a gripe é a vacinação. Os vírus da gripesão vírus de RNA de trançado negativo, segmentados, pertencentes à famí-lia Orthomyxoviridae. Os antígenos virais são imunógenos altamente efica-zes, capazes de induzir ambas as respostas sistêmicas e de anticorpo mu·cosal. A glicoproteína hemaglutinin de vírus da gripe (HA) é geralmente con-siderada o antígeno viral mais importante com relação ao estímulo de neu-tralização de anticorpos e desenho de vacina. A presença de neuraminidase5 viral (NA) foi mostrada ser importante para geração de respostas imunesprotetoras de braço múltiplo contra o vírus. Antivirais que inibem atividade deneuraminidase têm sido desenvolvidos, e podem ser um tratamento antiviraladicional sob infecção. Um terceiro componente considerado útil no desen-volvimento de antivirais e vacinas de gripe é proteína de canal de íon M2.Subtipos do vírus da gripe são designados por HA e NA diferen-tes, resultantes da alteração antigênica. Além disso, novas cepas do mesmosubtipo resultam de alteração de antígeno, ou mutações nas moléculas deHA ou NA que geram epítopos novos e diferentes. Embora 15 subtipos anti-gênicos de HA tenham sido documentados, somente três destes tipos H1,H2 e H3 circularam extensivamente em humanos. A vacinação tornou-sesuprema na questão de qualidade de vida aperfeiçoada em nações ambasindustrializadas e subdesenvolvidas. A maioria de vacinas disponíveis aindasegue os princípios básicos de aspectos que imitam infecção de modo a in-duzir uma resposta imune que pode proteger contra a infecção relevante.Contudo, a geração de vírus atenuados de vários subtipos e combinaçõespode consumir tempo e ser custosa. Novas tecnologias emergentes emcompreensão profunda de uma biologia molecular de patogenia, patogêne-se, e suas interações com um sistema imune individual, têm resultado emnovas aproximações para desenvolvimento de vacina e distribuição de vaci-na. Desse modo, enquanto os avanços tecnológicos têm aperfeiçoado a ca-pacidade de produzir composições de vacina de antígenos de gripe aperfei-çoadas, permanece uma necessidade de proporcionar fontes adicionais deproteção contra subtipos e cepas emergentes de gripe.
Sumário da Invenção
A presente invenção proporciona anticorpos contra antígenos deneuraminidase de gripe e componentes de anticorpo produzidos em plantas.A presente invenção proporciona anticorpos que inibem a atividade de neu-raminidase. A invenção proporciona adicionalmente composições de anti-corpo reativas contra antígeno de neuraminidase de gripe. Em algumas con-cretizações, as composições providas incluem um ou mais componentes deplanta. Ainda adicionalmente providos são métodos para produção e uso dosanticorpos e composições de vacina da invenção.
Breve Descrição dos Desenhos
Figura 1. Mapa do plasmídeo pET32. A esquerda superior indicaa região entre o promotor T7 e o terminador T7 necessitando de plasmídeomodificado usado para clonagem de antígeno alvo.
Figura 2: Esquemático dos constructos de pET-PR-LicKM-KDELe pET-PR-LicKM-VAC inseridas em um vetor pET32a modificado.
Figura 3: Esquemático da organização de vetor pBM 21.
Figura 4: Organização esquemática da derivação do plasmídeopBID4 de um vetor pBI após excisão do gene GUS e a adição de um plas-mídeo derivado de TMV.
Figura 5: Esquemático da fusão de HA, domínios de HA, e NAem seqüência de lichenase, com e sem seqüências alvos que foram postasem um vetor.
Figura 6: Ensaios de lichenase de extratos de plantas que ex-pressam proteínas de fusão de Lic-NA.
Figura 7. Análise de Western de extratos de plantas que expres-sam proteínas de fusão Lic-HA.
Figura 8. Ensaios de neuraminidase na presença de um anticor-po anti-NA e um anticorpo anti-RSV de controle.
Figura 9. Estrutura química do ácido 2'-(4-Metilumbeloferil)-a-D-N-acetilneuramínico.
Figura 10: Comparação de eficiência de A/Udorn/72 com osel-tamivir carboxilato (Tamiflu®) em ensaios de neuraminidase e demonstraçãode IC50·
Figura 11: Comparação de eficiência de A/New Caldonia/99 comoseltamivir carboxilato (Tamiflu®) em ensaios de neuraminidase e demons-tração de IC5O-Figura 12: Comparação de eficiência de A/Vietnam/1203/04 comoseltamivir carboxilato (Tamiflu®) em ensaios de neuraminidase e demons-tração de IC5O-
Figura 13: Comparação de eficiência de A/Hong Kong/156/97com oseltamivir carboxilato (Tamiflu®) em ensaios de neuraminidase e de-monstração de IC5O-
Figura 14: Comparação de eficiência de A/lndonesia/05 com o-seltamivir carboxilato (Tamiflu®) em ensaios de neuraminidase e demonstra-ção de IC50-
Descrição Detalhada da Invenção
A presente invenção refere-se a antígenos de gripe úteis na pre-paração de anticorpos vacinas contra infecção de gripe, e proteínas de fusãocompreendendo tais antígenos de gripe operavelmente ligados à proteínatermoestável. A invenção se refere a métodos de produção de composiçõesde anticorpo, incluindo, mas não limitados a, produção em sistemas de plan-ta. Adicionalmente, a invenção se refere a vetores, proteínas de fusão, célu-las de planta, plantas e composições compreendendo anticorpos ou frag-mentos de ligação de antígeno destes da invenção. Ainda adicionalmenteprovidos são kits, bem como uso terapêutico e de diagnóstico em associa-ção com infecção de gripe em um indivíduo.
Antígenos de gripe
Proteínas de antígeno de gripe da presente invenção incluemqualquer proteína imunogênica ou peptídeo capaz de induzir uma respostaimune contra vírus da gripe. Geralmente, proteínas imunogênicas de interes-se incluem antígenos de gripe (por exemplo, proteína de gripe, proteínas defusão, etc), porções imunogênicas destas, ou variantes imunogênicas des-tas, e combinações de quaisquer das precedentes.
Antígenos de gripe para uso de acordo com a presente invençãopodem incluir proteínas de gripe de comprimento total, ou fragmentos deproteínas de gripe, e/ou proteínas de fusão compreendendo proteínas degripe de comprimento total, ou fragmentos de proteínas de gripe. Ondefragmentos de proteínas de gripe são utilizados, se sozinhos ou em proteí-nas de fusão, tais fragmentos retêm atividade imunológica (por exemplo,reatividade cruzada com anticorpos anti-gripe). Baseado em sua capacidadede induzir resposta imunoprotetora contra infecção viral, hemaglutinin e neu-raminidase são antígenos primários de interesse na geração de vacinas.
Desse modo, a invenção proporciona células de planta e plantasque expressam uma proteína heteróloga (por exemplo, proteína de gripe, ouum fragmento desta, uma proteína de fusão compreendendo uma proteínade gripe, ou fragmento desta). Uma proteína heteróloga da invenção podecompreender qualquer antígeno de gripe de interesse, incluindo, mas nãolimitado a, hemaglutinin (HA), neuraminidase (NA), canal de íon de membra-na M2 (M2), uma porção de hemaglutinin (HA), uma porção de neuraminida-se (NA), e uma porção de canal de íon de membrana (M2), ou proteínas defusão, fragmentos.
Seqüências de aminoácido de uma variedade de proteínas degripe de HA, NA e M2 diferentes (por exemplo, de subtipos diferentes, oucepas ou isolados) são conhecidos na técnica, e são disponíveis em basesde dados públicas, tal como o Banco de Gene (GenBank). Seqüências deproteína de comprimento total exemplares para HA e NA de dois subtipos degripe de interesse particular hoje, bem como seqüência para M2, são provi-das abaixo:
V: Vietnam H5N1
HA (NAV) SEQ ID №: 2:
MNPNQKIITIGSICMVTGIVSLMLQIGNMISIWVSHSIHTGNQHQSEPISNTNLLTEKAVASVKLAGNSSLCPINGWAVYSKDNSERIGSKGDVFVIREPFISCSHLECRTFFLTQGALLNDKHSNGTVKJJRSPHRTLMSCPVGEAPSPYNSRFESVAWSASACHDGTSWLTIGISGPDNGAVAVLKYNGIITDTIKSWRNNILRTQESECACVNGSCFTVMTDGPSNGQASHKIFKMEKGKVVKSVELDAPNYHYEECSCYPDAGEITCVGRDNWHGSNRP WVSFNQNLEYQIGYICSGVFGDNPRPNDGTGSCGPVSSNGAGG VKGFSFKYGNGVWIGRTKSTNSRSGFEMIWDPNGWTETDSSFSVKQDIVAnDWSGYSGSFVQHPELTGLDCERPCFWVELIRGRPKESTIWTSGSSISFCGV^SDTVG-WSWPDGAELPFTIDK
W: Wvominq H3N2
NA (NAW) SEQ ID №:4:MWNQKUTIGSVSLTIS^CFFMQIAILITTVTLHFKQYEFNSPPNNQVMLCEPTIIE
RNITEIVYLTNTTIEK^ICPKXAEY31NWSKPQCNITGFAPFSKX)NSIRLSAGGDIWV
mEPYVSCDPDKCYQFALGQGTTLNNVHSNDWHDRTPYRTLLMNELGVPFHLG
TKQVCIA WSSSSCHDGKAWLHVCVTGDDENATASFIYNGRLVDSIVSWSKKJLR
TQESECVCtNGTCWVMTDGSASGKJ^DTKILHEEGKIVHTSTLSGSAQHVEECSC
YPRYPGWCVCRDNWKGSNI^rVDINIKDYSrVSSYVCSGLVGDTPRKNDSSSSSH
CLDPNNEEGGHGVKGWAFDDGNDVWMGRTISEKLRSGYETFKVIEGWSNPNSK
LQINRQVWDRGNRSGYSGIFSVEGKSCINRCFYSrELmGRKQETEVLWrSNSI^
CGTSGTYGTGSWPDGADINLMPI
Proteínas de GripeNeuraminidaseNa Vietnam:
Peptídeo de âncora H5N1 NA SEQ ID N9:15: MNPNQTIITIG-SICMVTGIVS
H5N1 N SEQ ID NQ:16:
LMLQ1GNM1SIWVSHSIHTGNQHQSEPISNTNLLTEKAVASVKLAGNSSLCPINGWAWSKDNSIRIGSKGDVFVIREPFISCSHLECRTFFLTQGALLNDKHSNGTVKDRSP
HRTLMSCPVGEAPSPYNSRFESVAWSASACHDGTSWLΉGISGPDNGAVAVLKY
NGIITDTIKSVm^NILRTQESECACVNGSCFTVMIXíGPSNGQASHKIFKMEKGKV
VKSVELDAPNYHYEECSCYPDAGE1TCVCRDNWHGSNRPWVSFNQ>ILEYQ1GYI
CSGVFGDNPRPNDGTGSCGPVSSNGAGGVKGFSFKYGNGVWIGRTKSTNSRSGF
EMIWDPNGWTETDSSFSVKQDrVAITDWSGYSGSFVQHPELTGLDCIRPCFWVEL
IRGRPKESTIWTSGSSISFCGWSDTVGWSWPDGAELPFTIDK
Peptídeo de âncora H3N2 NA SEQ ID Ne: 17:
MNPNQKIITIGSVSLTISTICFFMQIAILITTVTLHF
H3N2 NASEQ ID Ne:18:
KQYEFNSPPNNQVMLCEPTIIERNITEIV^YLWITffiKJEICPKLAEYRNWSKPQCM
TGFAPFSKDNSIRLSAGGDIWVTREPYVSCDPDKCYQFALGQGTTLNNVHSNDTV
HDRTP YRTLLMNELGVPFHLGTKQVCIAWSSSSCHDGKAWLHVCVTGDDENAT
ASFIYNGRLVDSIVSWSKKILRTQESECVCmGTCTVVMTDGSASGKADTKILFIEE
GKJVHTSTLSGSAQHVEECSCYPRYPGVRCVCRDNWKGSNRPIVDINIKDYSIVSS
YVCSGLVGDTPRKND SSS S SHCLDPNNEEGGHGVKGWAFDDGND V WMGRTISE
KLRSGYETTKVffiGWSNPNSKLQINRQVIVDRGNRSGYSGIFSVEGKSCINRCFYV
ELIRGRKQETEVLWTSNSIWFCGTSGTYGTGSWPDGADINLMPI
Conquanto seqüências de antígenos de gripe exemplares sejamprovidas aqui, e domínios representados para NA foram providos para cepasexemplares, será apreciado que qualquer seqüência tendo característicasimunogênicas de um domínio de NA podem alternativamente ser emprega-da. Um versado na técnica será prontamente capaz de gerar seqüênciastendo pelo menos 75%, 80%, 85% ou 90% ou mais de identidade para antí-genos providos. Em certas concretizações, os antígenos de gripe compreen-dem proteínas incluindo aquelas tendo pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% oumais identidades para um domínio de NA, ou uma porção de um domínio deNA, no qual a proteína de antígeno retém atividade imunogênica. Por exem-plo, seqüências tendo identidade suficiente para antígeno(s) de gripe queretém características imunogênicas são capazes de se ligarem com anticor-pos que reagem com antígeno(s) de domínio provido(s) nas mesmas. Ascaracterísticas imunogênicas freqüentemente incluem três apresentaçõesdimensionais de aminoácidos ou grupos laterais relevantes. Um versado natécnica pode identificar prontamente seqüências de identidade com diferen-ças modestas na seqüência (por exemplo, com diferença nos limites e/oualgumas alternativas de seqüências que, não obstante, preservam as carac-terísticas imunogênicas). Por exemplo, seqüências cujos limites são pertosde (por exemplo, dentro de cerca de 15 aminoácidos, 14 aminoácidos, 13aminoácidos, 12 aminoácidos, 11 aminoácidos, 10 aminoácidos, 9 aminoáci-dos, 8 aminoácidos, 7 aminoácidos, 6 aminoácidos, 5 aminoácidos, 4 ami-noácidos, 3 aminoácidos, 2 aminoácidos, ou 1 aminoácido) dos limites dedomínio designados aqui em qualquer extremidade da seqüência de amino-ácido designada podem ser consideradas por compreenderem o domíniorelevante de acordo com a presente invenção. Desse modo, a invenção con-templa o uso de uma seqüência de antígeno de gripe para compreender re-síduos que se aproximam da designação de domínio. Por exemplo, domí-nio(s) de NA foi(foram) projetado(s) e expresso(s) como uma proteína defusão de estrutura interna como um antígeno da invenção (ver Exemplifica-ção aqui). Adicionalmente, será apreciado que quaisquer domínios, domíniosparciais, ou regiões de seqüências de aminoácido de antígeno de gripe (porexemplo, NA) que são imunogênicos podem ser gerados usando-se os cons-tructos e métodos aqui providos. Ainda adicionalmente, domínios ou subdo-mínios podem ser combinados, separadamente e/ou consecutivamente paraprodução de antígenos de gripe.
Como antígenos exemplares, foram utilizadas seqüências deneuraminidase de subtipos particulares conforme descrito em detalhe aqui.Vários subtipos de vírus de gripe existem e continuam a serem identificadosà medida que novos subtipos aparecem. Será compreendido por um versadona técnica que os métodos e composições aqui proporcionados podem seradaptados para utilizar seqüências de subtipos adicionais. Tal variação écontemplada e envolvida dentro dos métodos e composições aqui providos.Fusões de Polipeptídeo de Gripe com Proteínas Termoestáveis
Em certos aspectos da invenção, são providos antígeno(s) degripe compreendendo polipeptídeos de fusão que compreendem uma prote-ína de gripe (ou um fragmento ou variante desta) operavelmente ligada auma proteína termoestável. Os polipeptídeos de fusão da invenção podemser produzidos em qualquer sistema de expressão disponível conhecido natécnica. Em certas concretizações, as proteínas de fusão da invenção sãoproduzidas em uma planta ou porção desta (por exemplo, planta, célula deplanta, raiz, broto, etc).
Enzimas ou outras proteínas que não são encontradas natural-mente em células de humanos ou animais são particularmente apropriadaspara uso em polipeptídeos de fusão da presente invenção. As proteínas ter-moestáveis que, quando fundidas, conferem termoestabilidade a um produtode fusão, são úteis. A termoestabilidade permite que a proteína produzidamantenha conformação, e mantenha proteína produzida à temperatura am-biente. Esta característica facilita recuperação fácil, de tempo eficiente e cus-to efetivo de um polipeptídeo de fusão. Uma família representativa de enzi-mas termoestáveis úteis de acordo com a invenção é a família de glucanohi-drolase. Estas enzimas clivam especialmente ligações 1,4-β glucosídicasque são adjacentes às ligações 1,3-β em polissacarídeos ligado misturados(Hahn et ai, 1994, Proc. Nati Acad. Sei. USA, 91:10417). Tais enzimas sãoencontradas em cereais, tais como aveia e cevada, e são também encontra-das em um número de fungos e espécies bactericidas, incluindo C. thermo-cellum (Goldenkova et ai, 2002, Mol. Biol., 36:698). Desse modo, proteínastermoestáveis exemplares para uso em polipeptídeos de fusão da presenteinvenção incluem enzimas glicosidase. Proteínas glicosidase termoestáveisexemplares incluem aquelas representadas pelos números de acesso noBanco de Gene (GeneBank) selecionados a partir daqueles colocados naTabela A, os conteúdos de cada um dos quais são incorporados aqui porreferência pela incorporação total da informação de acesso no Banco deGene (GenBank) para cada número referenciado. Enzimas termoestáveisexemplares de uso em proteínas de fusão da invenção incluem Clostridiumthermoceiium P29716, Brevibacillus brevis P37073, e Rhodthermus marinusP45798, cada uma das quais sendo incorporadas aqui por referência emseus números de acesso no banco de Genes (GenBank). As proteínas defusão representativas ilustradas nos Exemplos utilizam enzima termoestávelmodificada isolada de Clostridium thermocellus; contudo, qualquer proteínatermoestável pode ser similarmente utilizada de acordo com a presente in-venção.Tabela A: Proteínas glicosidase termoestáveis
<table>table see original document page 11</column></row><table>
Quando se designam proteínas de fusão e polipeptídeos de a-cordo com a invenção, é desejável, naturalmente, preservar a imunogenici-dade do antígeno. Ainda adicionalmente, é desejável em certos aspectos dainvenção proporcionar constructos que proporcionam termoestabilidade deuma proteína de fusão. Esta característica facilita a recuperação fácil, detempo eficiente e de custo efetivo do antígeno alvo. Em certos aspectos,modelos de fusão de antígeno podem ser selecionados, que proporcionamvantagens adicionais, incluindo aumento de imunogenicidade potencial paraincorporar determinantes de vacina múltiplos, ainda carente antes da expo-sição imunogênica a vacinação dos indivíduos. Qualidades benéficas adicio-nais de peptídeos de fusão de interesse incluem proteínas que proporcionamfacilidade de manipulação para incorporação de um ou mais antígenos, bemcomo proteínas que têm potencial para conferir facilidade de produção, puri-ficação e/ou formulação de preparações de vacina. Um técnico versado natécnica apreciará que apresentação tridimensional pode afetar cada umadestas características benéficas. A preservação de imunidade ou qualidadespreferenciais, portanto, podem afetar, por exemplo, a escolha de co-participantes de fusão, e/ou escolha de localização de fusão (por exemplo,terminal-N, terminal-C, combinações destes). Alternativamente ou adicio-nalmente, preferências podem afetar o comprimento de segmento selecio-nado para fusão, se ele for comprimento de antígeno, ou comprimento deco-participante de fusão selecionado.
A presente invenção demonstrou fusão bem-sucedida de umavariedade de antígenos com uma proteína termoestável. Por exemplo, tem-se usado a molécula transportadora termo-estável LicB, também referidacomo lichenase, para produção de proteínas de fusão. LicB é 1,3-1,4-β glu-canase (LicB) de Clostridium termocellum (Acesso no Banco de Genes:X63355 [gi:40697]). A MicB pertence a uma família de proteínas globulares.Baseado na estrutura tridimensional de LicB, seus terminais N e C estão si-tuados próximos um ao outro na superfície, em proximidade ao domínio ati-vo. A LicB também tem uma estrutura de laço exposta à superfície que estálocalizada distante do domínio ativo. Tem-se gerado constructos, tal que aestrutura de laço e os terminais N e C de proteína podem ser usados comolocais de inserção para polipeptídeos de antígeno de gripe. Os polipeptídeosde antígeno de gripe podem ser expressos como fusões de terminal N ou C,ou como insertos no laço da superfície. Importantemente, a LicB mantémsua atividade enzimática em pH baixo e a alta temperatura (até 75°C). Des-se modo, o uso de LicB como uma molécula transportadora contribui paravantagens, incluindo similarmente intensificação de imunogenicidade especí-fica de alvo, potencial para incorporar determinantes de vacina múltiplos, eformulação direta de vacinas que podem ser distribuídas nasalmente, oral-mente ou parenteralmente. Além disso, a produção de fusões de LicB emplantas deve reduzir o risco de contaminação com patogenias animais ouhumanas. Ver exemplos providos aqui.Proteínas de fusão da invenção compreendendo antígeno degripe podem ser produzidas em qualquer de uma variedade de sistemas deexpressão, incluindo ambos sistemas in vitro e in vivo. Um versado na técni-ca apreciará prontamente que otimização de seqüências de ácido nucléicopara um sistema de expressão particular é freqüentemente desejável. Porexemplo, na exemplificação aqui provida, seqüência otimizada para expres-são de antígeno de gripe-fusões de LicB em plantas providas. Ver Exemplo1. Desse modo, um antígeno(s) de gripe que codifica ácido nucléico relevan-te, proteína(s) de fusão, e fragmentos destes, de acordo com a invenção, épretendido para ser envolvido com constructos de ácido nucléico da inven-ção.
Para produção em sistemas de planta, plantas transgênicas ex-pressando antígeno(s) de gripe (por exemplo, proteína(s) de gripe, ou frag-mentos ou fusões destes), podem ser usadas. Alternativamente ou adicio-nalmente, plantas trangênicas podem ser produzidas usando-se métodosbem-conhecidos na técnica para gerar colheitas de produção estáveis. Adi-cionalmente, plantas utilizando sistemas de expressão transientes podemser utilizadas para produção de antígeno(s) de gripe. Quando se utiliza sis-temas de expressão de planta, se expressão transgênica ou transiente emplantas é utilizada, qualquer de expressão nuclear, expressão de cloroplasto,expressão mitocondrial, ou expressão viral, podem levar vantagem de acor-do com a aplicabilidade do sistema para antígeno desejado. Além disso, sis-temas de expressão adicionais para produção de antígenos e proteínas defusão de acordo com a presente invenção podem ser utilizados. Por exem-pio, sistemas de expressão de mamífero (por exemplo, linhas de célula demamíferos (por exemplo, CHO, etc)), sistemas de expressão bactericidas(por exemplo, E. colí), sistemas de expressão de inseto (por exemplo, bacu-lovírus), sistemas de expressão de levedura, e sistemas de expressão invitro (por exemplo, Iisatos reticulados) podem ser usados para expressão deantígenos e proteínas de fusão da invenção.
Produção de Antígenos da Gripe
De acordo com a presente invenção, antígenos da gripe (inclu-indo proteína(s) de gripe, fragmentos, variantes, e/ou fusões destes) podemser produzidos em qualquer sistema desejável; a produção não é limitada asistemas de planta. Constructos de vetor e sistemas de expressão são bem-conhecidos na técnica, e podem ser adaptados para incorporar uso de antí-genos da gripe aqui providos. Por exemplo, antígenos da gripe (incluindofragmentos, variantes, e/ou fusões) podem ser produzidos em sistemas deexpressão conhecidos, incluindo sistema de célula de mamíferos, animaistransgênicos, sistemas de expressão microbiais, sistemas de célula de inse-to, e sistemas de planta, incluindo sistemas de planta transgênicos e deplanta. Particularmente onde antígenos da gripe são produzidos como prote-ínas de fusão, pode ser desejável produzir tais proteínas de fusão em siste-mas sem planta.
Em algumas concretizações da invenção, os antígenos da gripesão desejavelmente produzidos em sistemas de planta. As plantas são rela-tivamente fáceis de manipular geneticamente, e têm várias vantagens sobrefontes alternativas, tais como fluidos humanos, linhas de célula de animal,microorganismos recombinantes e animais transgênicos. As plantas têmmaquinaria de modificação pós-translacional sofisticada para proteínas queé similar àquela de mamíferos (embora deva ser notado que existem algu-mas diferenças nos modelos de glicosilação entre plantas e mamíferos). Istocapacita à produção de reagentes bioativos em tecidos de planta. Também,as plantas podem ser economicamente produzir quantidades muito grandesde biomassa sem requerer facilidades sofisticadas. Além disso, as plantasnão são submetidas à contaminação com patogenias animais. Similar aoslipossomos e microcápsulas, as células de planta são esperadas proporcio-nar proteção para a passagem de antígeno ao trato gastrointestinal.
As plantas podem ser utilizadas para produção de proteínas he-terólogas, via uso de vários sistemas de produção. Tal sistema inclui uso deplantas transgênicas/geneticamente modificadas onde um gene que codificaproduto alvo é permanentemente incorporado no genoma da planta. Siste-mas transgênicos podem gerar sistemas de produção de colheita. Uma vari-edade de proteínas estranhas, incluindo muitas de origem de mamífero, emuitos antígenos candidatos de vacina, tem sido expressa em plantas trans-gênicas, e mostram ter atividade funcional. (Tacker et ai, 2000, J. Infect.Dis., 182:302; e Thanavala et ai, 2005, Proc. NatL Acad. Sci., USA,102:3378). Adicionalmente, a administração de plantas transgênicas não-processadas que expressam antígeno de superfície maior de hepatite B emvoluntários humanos não-imunizados resulta em produção de resposta imu-ne (Kapusta et ai, 1999, FASEBJ., 13:1796).
Outro sistema para expressão de polipeptídeos em plantas utili-za vetores virais projetados para expressar seqüências estranhas (por e-xemplo, expressão transiente). Esta aproximação permite o uso de plantassaudáveis não-transgênicas como sistemas de produção rápidos. Dessemodo, plantas geneticamente projetadas e plantas infectadas com vírus deplanta recombinantes que servem como "fábricas verdes" para gerar rapi-damente e produzir proteínas específicas de interesse. Vírus de planta têmcertas vantagens que os tornam atrativos como vetores de expressão paraprodução de proteína estranha. Vários membros de vírus de RNA de plantatêm sido bem caracterizados, e clones de cDNA infecciosos são disponíveispara facilitar manipulação genética. Uma vez que o material genético viralinfeccioso entre em uma célula hospedeira susceptível, ele replica a altosníveis e se espalha rapidamente através de toda a planta. Existem váriasaproximações para produção de polipeptídeos alvos usando vetores de ex-pressão viral de planta, incluindo incorporação de polipeptídeos alvos nosgenomas virais. Uma aproximação envolve projeto de proteínas de revesti-mento de vírus que infectam bactéria, animais ou plantas, para funcionaremcomo moléculas transportadoras para peptídeos antigênicos. Referidas pro-teínas transportadoras têm o potencial de agregar e formar partículas simila-res a vírus recombinante que descrevem epítopos antigênicos desejados.Esta aproximação permite produção eficiente de tempo de vacinas candida-tas, visto que a natureza da partícula de uma vacina candidata facilita recu-peração fácil e de custo efetivo do tecido de planta. Vantagens adicionaisincluem imunogenicidade específica de alvo aumentada, o potencial paraincorporar determinantes múltiplos de vacina, e facilidade de formulação emvacinas que pode ser distribuída nasalmente, oralmente ou parenteralmente.Como um exemplo, folhas de espinafre contendo partículas virais de plantarecombinantes transportando epítopos de vírus fundidos para proteína derevestimento têm resposta imune gerada após administração (Modelska eta/., 1998, Proc. Nati Acad. Sci., USA, 95:2481; e Yusibov et ai, 2002, Vac-cine, 19/20:3155).
Sistemas de Expressão de Planta
Qualquer planta susceptível a incorporação e/ou manutenção deácido nucléico heterólogo e capaz de produzir proteína heteróloga, pode serutilizada de acordo com a presente invenção. Em geral, será freqüentementedesejável utilizar plantas que são responsáveis pelo crescimento sob condi-ções definidas, por exemplo, em uma estufa e/ou em sistemas aquosos. Po-de ser desejável selecionar plantas que não são tipicamente consumidaspelos seres humanos ou animais domesticado, e/ou não são tipicamenteparte da cadeia de alimentação humana, de modo que elas podem ser cres-cidas do lado de fora sem interesse que polinucleotídeo expresso possa serindesejavelmente ingerido. Em algumas concretizações, contudo, será dese-jável empregar plantas comestíveis. Será desejável utilizar plantas que acu-mulam põlipeptídeos expressos em porções comestíveis de uma planta.
Freqüentemente, certas características de planta desejáveis se-rão determinadas pelo polinucleotídeo particular a ser expresso. Para dar,mas uns poucos exemplos, quando um polinucleotídeo codifica uma proteínaa ser produzida em alto rendimento (conforme será freqüentemente o caso,por exemplo, quando proteínas de antígeno são para serem expressas), se-rá freqüentemente desejável selecionar plantas com biomassa relativamentealta (por exemplo, tabaco, que tem vantagens adicionais que são altamentesusceptíveis a infecção viral, tem um período de crescimento curto, e nãoestá na cadeia de alimentação humana). Onde um polinucleotídeo codificaproteína de antígeno cuja atividade total requer (ou é inibida por) uma modi-ficação pós-translacional particular, a capacidade (ou inabilidade) de certasespécies de planta em efetuar modificação relevante (por exemplo, uma gli-cosilação particular) pode direcionar seleção. Por exemplo, as plantas sãocapazes de efetuar certas modificações pós-translacionais (por exemplo,glicosilação); contudo, as plantas não gerarão modelos de sialação que éencontrado em modificações pós-translacionais de mamífero. Desse modo,a produção de planta de antígeno pode resultar na produção de uma entida-de diferente do que a seqüência de proteína idêntica em sistemas alternati-vos.
Em certas concretizações da invenção, plantas de colheita, ouplantas relacionadas à colheita, são utilizadas. Em certas concretizaçõesespecíficas, plantas comestíveis são utilizadas.
Plantas para uso de acordo com a presente invenção incluemAngiospermas, Briófitos (por exemplo, Hepaticae, Musci, etc), Pterofitos (porexemplo, samambaias, rabo-de-cavalo, licopódio), Gimnospermas (por e-xemplo, coníferas, cicase, Ginko, Gnetales), e Algas (por exemplo, Clorofí-ceas, Faeofíceas, Rodofíceas, Mixofíceas, Xantofícea, e Euglenofícea).Plantas exemplares são membros da família Leguminosas (Febaceae; porexemplo, ervilha, alfafa, feijão-soja); Gramíneas (Poaceae; por exemplo, mi-lho, trigo, arroz); Solanaceae, particularmente do gênero Lycopersicon (porexemplo, tomate), Solanum (por exemplo, tomate, berinjela), Capsium (porexemplo, pimenta), ou Nicotiana (por exemplo, tabaco); Umbeliiferae, parti-cularmente do gênero Daueus (por exemplo, cenoura), Apium (por exemplo,aipo, ou Rutuceae (por exemplo, laranjas); Compositae, particularmente dogênero Laetuea (por exemplo, alface), Brassicaceae (Cruciferae), particular-mente do gênero Brassiea ou Sinapis). Em certas espécies, as plantas dainvenção podem ser plantas do gênero Brassiea ou Arabidopsis. Algunsmembros da família Brassicaceae exemplares incluem Brassiea eampestris,B. earinata, B. juneea, B. napus, B. nigra, B. oieracae, B. tournifortii, Sinapisaiba, e Rapharnus sativus. Algumas plantas adequadas que são melhoráveisa transformação e são comestíveis como brotos germinados incluem alfafa,munguba, rabanete, trigo, mostarda, espinafre, cenoura, beterraba, cebola,alho, aipo, ruibarbo, uma folha de planta folhosa tal como repolho ou alface,agrião, ervas tais como salsa, trevo, couve-flor, brócolis, feijão-soja, lenti-lhas, flores comestíveis, tal como girassol, etc.Introdução de Vetores e Plantas
Em geral, vetores podem ser distribuídos para plantas de acordocom técnicas conhecidas. Por exemplo, os vetores podem ser diretamenteaplicados a plantas (por exemplo, inoculações abrasivas virais, inoculaçõesde pulverização mecanizadas, infiltração a vácuo, bombardeio de partícula,ou eletroporação). Alternativamente ou adicionalmente, virions podem serpreparados (por exemplo, de plantas já infectadas), e podem ser aplicados aoutras plantas de acordo com técnicas conhecidas.
Uma ampla variedade de vírus é conhecida que infectam váriasespécies de planta, e podem ser empregada para expressão de polinucleotí-deo de acordo com a presente invenção (ver, por exemplo, em The Classifi-cation and Nomenclature of Viruses, "Sixth Report of the International Com-mittee on Taxonomy of Viruses" (Ed. Murphy et al), Springer Verlag; NewYork, 1995, os conteúdos totais dos quais sendo aqui incorporados por refe-rência; Grierson et al., Plant Molecular Biology, Blackie, London, pp. 126-146, 1984; Gluzman et al., Communictions in Molecular Biology; Viral Vec-tors, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, pp. 172-189; eMathew, Plant Viruses Online (http://imaae.fs.uidaho.edu/vide/). Em certasconcretizações da invenção preferivelmente do que distribuição de um vetorviral simples a uma célula de planta, vetores diferentes múltiplos são distri-buídos que, juntos, permitem replicação (e, opcionalmente, movimento decélula a célula e/ou de longa distância) de vetor(es) viral(is). Algumas ou to-das das proteínas podem ser codificadas pelo genoma de plantas transgêni-cas. Em certos aspectos, descritos em maiores detalhes aqui, estes siste-mas incluem um ou mais componentes de vetor viral.
Sistemas de vetores que incluem componentes de dois vírus deplanta heteróloga de modo a alcançar um sistema que infecta prontamenteuma faixa ampla de tipos de planta ainda impõem pouco ou nenhum risco dedifusão de infecção. Um sistema exemplar foi descrito anteriormente (ver,por exemplo, publicação PCT WO 00/25574 e Publicação de Patente dosEstados Unidos 2005/0026291, ambas das quais sendo incorporadas aquipor referência. Conforme notado aqui, em aspectos particulares da presenteinvenção, vetores virais são aplicados a plantas (por exemplo, planta, porçãode planta, broto, etc), por exemplo, através da infiltração ou inoculação me-cânica, pulverização, etc. Onde infecção é para ser acompanhada por apli-cação direta de um genoma viral a uma planta, qualquer técnica disponívelpode ser usada para preparar o genoma. Por exemplo, muitos vírus que sãoutilmente empregados de acordo com a presente invenção têm genomas dessRNA. ssRNA pode ser preparado por transcrição de uma cópia de DNA dogenoma, ou por replicação de uma cópia de RNA, ou in vitro ou in vivo. Dadaà pronta disponibilidade de sistemas de transcrição in vitro de facilidade deuso (por exemplo, SP6, T7, Iisato reticulócito, etc), e também a conveniênciade manutenção de uma cópia de DNA de um vetor de RNA, é esperado queos vetores de ssRNA da invenção freqüentemente serão preparados portranscrição in vitro, particularmente com T7 ou SP6 polimerase.
Em certas concretizações da invenção preferivelmente do queintrodução de um tipo de vetor viral simples em uma planta, vetores viraisdiferentes múltiplos são introduzidos. Tais vetores podem, por exemplo,trans-complementar um outro com relação às funções de tal replicação, mo-vimento de célula a célula, e/ou movimento de longa distância. Os vetorespodem conter polinucleotídeos diferentes que codificam antígeno de gripe dainvenção. A seleção para planta(s) ou porções desta(s) que expressam poli-peptídeos múltiplos que codificam um ou mais antígeno(s) de gripe pode serrealizada conforme descrito acima para polinucleotídeos ou polipeptídeossimples.
Sistemas de Expressão de Tecido de Planta
Conforme discutido acima, de acordo com a presente invenção,antígenos da gripe podem ser produzidos em qualquer sistema desejável.Constructos de vetores e sistemas de expressão são bem-conhecidos natécnica, e podem ser adaptados para incorporar uso de antígenos de gripeaqui providos. Por exemplo, produção de planta transgênica é conhecida, egeração de constructos e produção de planta podem ser adaptadas de acor-do com técnicas conhecidas na técnica. Em algumas concretizações, siste-mas de expressão transiente em plantas são desejáveis. Dois destes siste-mas incluem produção de raízes clonais e sistemas de planta clonal, e deri-vados destes, bem como produção de sistemas de brotos germinados.
Plantas Clonais
As raízes clonais mantêm vetores de expressão viral de RNA, eproduzem estavelmente proteína alvo uniformemente na raiz total sobre pe-ríodos estendidos de tempo e subculturas múltiplas. Em contraste às plan-tas, onde o gene alvo é eliminado via recombinação durante movimento decélula a célula ou de longa distância, em culturas de raiz, a integridade deum vetor viral é mantida e níveis de proteína alvo produzida sobre o temposão similares àqueles observados durante varredura inicial. As raízes clonaispermitem facilidade de produção de material de proteína heteróloga paraformulação oral de antígeno e composições de vacina. Métodos e reagentespara geração de uma variedade de entidades clonais derivadas de plantasque são úteis para a produção de antígeno (por exemplo, proteínas de antí-geno da invenção) foram descritos anteriormente, e são conhecidos na téc-nica (ver, por exemplo, Publicação PCT WO 05/81905, que é incorporadaaqui por referência). As entidades clonais incluem linhas de raiz clonal, li-nhas de célula de raiz clonal, linhas de célula de planta clonal, e plantas clo-nais capazes de produção de antígeno (por exemplo, proteínas de antígenoda invenção). A invenção proporciona adicionalmente métodos e reagentespara expressão de polinucleotídeo de antígeno e produtos de polipeptídeoem linhas de célula clonal derivadas de vários tecidos de planta (por exem-plo, raízes, folhas), e em plantas totais derivadas de células simples (plantasclonais). Tais métodos são tipicamente baseados no uso de vetores de plan-ta viral de vários tipos.
Por exemplo, em um aspecto, a invenção proporciona métodosde obtenção de uma linha de raiz clonal que expressa um polinucleotídeoque codifica antígeno da gripe compreendendo as etapas de: (i) introduçãode um vetor viral que compreende um polinucleotídeo que codifica um antí-geno da gripe da invenção em uma planta ou porção desta; e (ii) geração deuma ou mais linhas de raiz clonal a partir de uma planta. As linhas de raizclonal podem ser geradas, por exemplo, pela infecção de uma planta ou por-ção de planta (por exemplo, uma peça colhida de planta) com um Agrobacte-rium (por exemplo, A. Rhizogenes) que causa formação de raízes com pe-los. As linhas de raiz clonal podem ser classificadas em vários modos paraidentificar linhas que mantêm vírus, linhas que expressam um polinucleotí-deos que codificam um antígeno da gripe da invenção em altos níveis, etc. Ainvenção proporciona adicionalmente linhas de raiz clonal, por exemplo, li-nhas de raiz clonal produzidas de acordo com os métodos da invenção, eenvolve adicionalmente métodos de expressão de polinucleotídeos e produ-ção de polipeptídeo(s) que codifica(m) antígeno(s) da gripe da invenção u-sando as linhas de raiz clonal.
A invenção proporciona adicionalmente métodos de geração deuma linha de célula clonal que expressa um polinucleotídeo que codifica an-tígeno da gripe da invenção compreendendo etapas de: (i) geração de umalinha de raiz clonal, células da qual contêm um vetor viral cujo genoma com-preende um polinucleotídeo que codifica um antígeno da gripe da invenção;(ii) liberação de células individuais a partir da linha de raiz clonal; e (iii) ma-nutenção das células sob condições adequadas para proliferação de célulade raiz. A invenção proporciona linhas de célula de raiz e métodos de ex-pressão de polinucleotídeos e produção de polipeptídeos usando linhas decélula de raiz clonal.
Em um aspecto, a invenção proporciona métodos de geração deuma linha de célula clonal que expressa um polinucleotídeo que codifica an-tígeno da gripe da invenção compreendendo etapas de: (i) geração de umalinha de raiz clonal, células da qual contêm um vetor viral cujo genoma com-preende um polinucleotídeo que codifica antígeno da gripe da invenção; (ii)liberação de células individuais a partir da linha de raiz clonal; e (iii) manu-tenção das células em cultura sob condições apropriadas para proliferaçãode célula de raiz. A invenção proporciona adicionalmente métodos de gera-ção de uma linha de célula de planta clonal que expressa um polinucleotídeoque codifica antígeno da gripe da invenção compreendendo etapas de: (i)introdução de um vetor viral que compreende um polinucleotídeo que codifi-ca antígeno da gripe da invenção em células de uma linha de célula de plan-ta mantida na cultura; e (ii) enriquecimento das células que contêm o vetorviral. O enriquecimento pode ser realizado, por exemplo, por (i) remoção deuma porção das células a partir da cultura; (ii) diluição das células removidasde modo a reduzir a concentração de célula; (iii) permitindo que as célulasdiluídas proliferem; e (iv) varredura das células que contêm o vetor viral. Aslinhas de célula de planta clonal podem ser usadas para produção de umantígeno da gripe de acordo com a presente invenção.
A invenção inclui um número de métodos de geração de plantasclonais, células das quais contêm um vetor viral que compreende um polinu-cleotídeo que codifica antígeno da gripe da invenção. Por exemplo, a inven-ção proporciona métodos de geração de uma planta clonal que expressa umpolinucleotídeo que codifica antígeno da gripe da invenção compreendendoas etapas de: (i) geração de uma linha de raiz clonal, células da qual contêmum vetor viral cujo genoma compreende um polinucleotídeo que codifica an-tígeno da gripe da invenção; (ii) liberação de células individuais a partir dalinha de raiz clonal; e (iii) manutenção das células liberadas sob condiçõesapropriadas para formação de uma planta. A invenção proporciona adicio-nalmente métodos de geração de uma planta clonal que expressa um poli-nucleotídeo que codifica antígeno da gripe da invenção compreendendo eta-pas de: (i) geração de uma linha célula de planta clonal, células da qual con-têm um vetor viral cujo genoma compreende um polinucleotídeo que codificaantígeno da gripe da invenção; e (ii) manutenção das células sob condiçõesapropriadas para formação de uma planta. Em geral, as plantas clonais deacordo com a invenção podem expressar qualquer polinucleotídeo que codi-fica antígeno da gripe da invenção. Tais plantas clonais podem ser usadaspara produção de um polipeptídeo de antígeno.
Conforme notado acima, a presente invenção proporciona sis-temas para expressão de um polinucleotídeo ou polinucleotídeo(s) que codi-ficam antígeno(s) da gripe da invenção em linhas de raiz clonal, linhas deraiz clonal, linhas de planta clonal (por exemplo, as linhas de célula deriva-das de folha, caule, etc), e em plantas clonais. Um polinucleotídeo de codifi-cação de antígeno da gripe da invenção é introduzido em uma célula deplanta ancestral usando um vetor viral de planta cujo genoma inclui o polinu-cleotídeo de codificação de um antígeno da gripe da invenção operavelmen-te ligado a (isto é, sob controle de) um promotor. Uma linha de célula clonalou linha de célula de planta clonal é estabelecida de uma célula contendo ovírus de acordo com qualquer de várias técnicas adicionalmente descritasabaixo. O vetor de vírus de planta ou porções deste pode ser introduzido emuma célula de planta por infecção, pela inoculação com uma transcrição viralou clone de cDNA infeccioso, por eletroporação, por transferência de genemediada por T-DNA, etc.
As seções que se seguem descrevem métodos para geração delinhas de raiz de clonal, linhas de célula de raiz clonal, linhas de célula deplanta clonal, e plantas clonais que expressam um polinucleotídeo que codi-fica antígeno da gripe da invenção são, em seguida, descritas. Uma "linhade raiz é distinguida de uma "linha de célula de raiz" em que uma linha deraiz produz estruturas atuais similares à raiz ou raízes, enquanto uma linhade célula de raiz consiste em células de raiz que não formam estruturas simi-lares à raiz". O uso do termo "linha" é pretendido para indicar que células dalinha podem proliferar e passar informação genética para as células de pro-genia. As células de uma linha de célula tipicamente proliferam na culturasem ser parte de uma estrutura organizada, tal como aquela encontrada emuma planta intacta. O uso do termo "linha de raiz" é pretendido para indicarque as células na estrutura de raiz podem proliferar sem ser parte de umaplanta completa. É notado que o termo "célula de planta" envolve raízes decélula. Contudo, para distinguir os métodos da invenção para gerar linhas deraiz e linhas de célula de raiz daqueles usados para gerar diretamente linhasde célula de planta de tecido sem raiz (conforme oposto para gerar linhas decélula de planta clonal de linhas de raiz clonal ou plantas clonais derivadasde linhas de raiz clonal), os termos "célula de planta" e "linha de célula deplanta" conforme usados aqui, geralmente se referem a células e linhas decélula que consistem em tecido de planta sem raiz. As células de planta po-dem ser, por exemplo, folha, caule, broto, parte de flor, etc. É notado quesementes podem ser derivadas das plantas clonais geradas como derivadasaqui. Tais sementes também conterão um vetor viral como plantas obtidasde tais sementes. Métodos para obtenção de estoques de semente sãobem-conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Publicação de Patente dosEstados Unidos 2004/0093643).
Linhas de Raiz Clonal
A presente invenção proporciona sistemas para geração de umalinha de raiz clonal em que um vetor de planta viral é usado para direcionarexpressão de um polinucleotídeo que codifica antígeno da gripe da inven-ção. Um ou mais vetores de expressão incluindo um polinucleotídeo que co-difica antígeno da gripe da invenção operavelmente ligado a um promotorsão introduzidos em uma planta ou uma porção desta de acordo com qual-quer de uma variedade de métodos conhecidos. Por exemplo, folhas deplanta podem ser inoculadas com transcrições virais. Os próprios vetorespodem ser diretamente aplicados a plantas (por exemplo, via inoculaçõesabrasivas, inoculações de spray mecanizadas, infiltração á vácuo, bombar-deio de partícula, ou eletroporação). Alternativamente ou adicionalmente,virions podem ser preparados (por exemplo, de plantas já infectadas), e apli-cados a outras plantas de acordo com técnicas conhecidas.
Onde infecção é para ser acompanhada por aplicação direta deum genoma viral a uma planta, qualquer técnica disponível pode ser usadapara preparar o genoma. Por exemplo, muitos vírus que são utilmente em-pregados de acordo com a presente invenção têm genomas de ssRNA. ss-RNA podem ser preparados por transcrição de uma cópia de DNA do geno-ma, ou por replicação de uma cópia de RNA, ou in vivo ou in vitro. Dada apronta disponibilidade de facilidade de uso de sistemas de transcrição in vi-tro (por exemplo, SP6, T7, Iisato reticulócito, etc), e também a conveniênciade manutenção de uma cópia de DNA de um vetor de RNA, é esperado queos vetores de ssRNA da invenção serão freqüentemente preparados portranscrição in vitro, particularmente com T7 ou SP6 polimerase. Clones decDNA infecciosos podem ser usados. Transferência de gene mediada agro-bactericidamente pode ser usada para transferir ácidos nucléicos virais, taiscomo vetores virais (ou genomas virais totais ou porções destes) em célulasde planta usando-se, por exemplo, agro-infiltração, de acordo com métodosconhecidos na técnica.
Uma planta ou porção de planta podem, em seguida, seremmantidas (por exemplo, cultivadas ou crescidas) sob condições adequadaspara replicação de uma transcrição viral. Em certas concretizações da in-venção, o vírus se espalha além de uma célula inicialmente inoculada, porexemplo, localmente de célula a célula e/ou sistemicamente de uma folhainicialmente inoculada em folhas adicionais. Contudo, em algumas concreti-zações da invenção, o vírus não se espalha. Desse modo, um vetor viral po-de conter genes que codificam MP e/ou CP funcionais, mas podem estarcarecendo de um ou ambos de tais genes. Em geral, um vetor viral é intro-duzido em células múltiplas (infectadas) em uma planta ou porção desta.
Em seguida a introdução de um vetor viral na planta, folhas sãocolhidas. Em geral, as folhas podem ser colhidas a qualquer tempo em se-guida a introdução de um vetor viral. Contudo, pode ser desejável manter aplanta por um período de tempo em seguida à introdução de um vetor viralna planta, por exemplo, um período de tempo suficiente para replicação e,opcionalmente, difusão do vírus a partir das células nas quais foi inicialmenteintroduzido. Uma cultura de raiz clonal (ou culturas múltiplas) é preparada,por exemplo, por métodos conhecidos adicionalmente descritos abaixo.
Em geral, qualquer método disponível pode ser usado para pre-parar uma cultura de raiz clonal de uma planta ou tecido de planta em queum vetor viral foi introduzido. Tal método emprega genes que existem emcertos plasmídeos bactericidas. Estes plasmídeos são encontrados em vá-rias espécies de Agrobacterium que infectam e transferem DNA a uma am-pla variedade de organismos. Como um gênero, Agrobacterium pode trans-ferir DNA a um conjunto grande e diverso de tipos de planta, incluindo nume-rosas espécies de angiosperma dicot e monocot e gimnosperma (ver Gelvin,2003, Microbial. Mol. Biol. Rev., 67:16, e referências neste, todos dos quaissendo incorporados aqui por referência). A base molecular de transformaçãogenética de células de planta é transferência de uma bactéria e integraçãoem um genoma nuclear de planta de uma região de um grande plasmídeo(Ri) rizogênico ou (Ti) de indução de um tumor que reside dentro de váriasespécies de Agrobacterium. Esta região é referida como a "região T", quan-do presente no plasmídeo, e como "T-DNA" quando excizado a partir doplasmídeo. Geralmente, uma molécula de T-DNA de trançado simples étransferida para uma célula de planta na infecção Agrobactericida que ocorrenaturalmente, e é, por último, incorporada (na forma de trançado duplo) nogenoma. Sistemas baseados nos plasmídeos Ti são amplamente usadospara introdução de material genético estranho em plantas, e para produçãode plantas transgênicas.
A infecção de plantas com várias espécies de Agrobacterium etransferência do T-DNA tem um número de efeitos. Por exemplo, A. tumefa-ciens causa doença de bile de coroa, enquanto A. rhizogenes causa desen-volvimento de raízes com pelos no local de infecção, uma condição conheci-da como "doença de raiz com pelo". Cada raiz ocorre de uma célula geneti-camente transformada simples. Desse modo, as células de raiz nas raízessão clonais, e cada raiz representa uma população clonal de células. Raízesproduzidas por infecção de A. rhizogenes são caracterizadas por uma altataxa de crescimento e estabilidade genética (Giri et ai, 2000., Biotech. Adv.,1^:1, e referências neste, todas das quais sendo aqui incorporadas por refe-rência). Em adição, tais raízes são capazes de regenerar plantas genetica-mente estáveis (Giri et ai., 2000, supra).
Em geral, a presente invenção envolve o uso de qualquer cepade Agrobacteria (por exemplo, qualquer cepa de A. rhizogene) que é capazde induzir formação de raízes de células de planta. Conforme mencionadoacima, uma porção do plasmídeo Ri (Ri-T-DNA) é responsável por causardoença de raiz com pelo. Enquanto transferência desta porção do plasmídeoRi para células de planta pode convenientemente ser acompanhada por in-fecção com Agrobacteria que abriga o plasmídeo Ri, a invenção envolve ouso de vários outros métodos de introdução da região relevante em uma cé-lula de planta. Tais métodos incluem qualquer método disponível de introdu-ção de células de planta em material genético incluindo, mas não limitada a,biolísticos, eletroporação, entendimento de DNA mediado por PEG, vetoresbaseados em Ti, etc. Porções relevantes do Ri T-DNA podem ser introduzi-das em células de planta pelo uso de um vetor viral. Os genes de Ri podemser incluídos no mesmo vetor que contém um polinucleotídeo que codificaantígeno da invenção, ou em um vetor viral diferente, que pode ser o mesmo,ou um tipo diferente daquele vetor que compreende o polinucleotídeo que co-difica antígeno da invenção. É notado que o Ri-T-DNA total não pode ser re-querido para produção de raízes com pelos, e a invenção envolve o uso deporções do Ri-T-DNA, provido que tais porções contêm material genético sufi-ciente para induzir formação de raiz, conforme conhecido na técnica. Materialgenético adicional, por exemplo, genes presentes dentro do plasmídeo Ri,mas não dentro do T-DNA, pode ser transferido para uma célula de plantade acordo com a invenção, particularmente genes onde os produtos de ex-pressão facilitam integração do T-DNA no DNA de célula de planta.
De modo a preparar uma linha de raiz clonal de acordo com cer-tas concretizações da invenção, porções de folha colhidas são contactadascom A. rhizogenes sob condições adequadas para infecção e transformação.Porções de folha são mantidas na cultura para permitir desenvolvimento deraízes com pelos. Cada raiz é clonal, isto é, células na raiz são derivadas deuma célula ancestral simples na qual o Ri T-DNA foi transferido. De acordocom a invenção, uma porção de tais células ancestrais conterá um vetor vi-ral. Desse modo, as células em uma raiz derivada de tais células ancestralconterão um vetor viral, visto que elas serão replicadas e serão transmitidasdurante divisão da célula. Desse modo, uma alta proporção (por exemplo,pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelomenos 95%), total (100%), ou substancialmente total (pelo menos 98%) dascélulas conterão o vetor viral. É notado que desde que um vetor viral é her-dado de células filhas dentro de uma raiz clonal, o movimento de um vetorviral dentro da raiz não é necessário para manter o vetor viral através de to-da a raiz. As raízes com pelos clonais individuais podem ser removidas deuma porção de folha e adicionalmente cultivadas. Tais raízes também sãoreferidas aqui como linhas de raiz. Raízes clonais isoladas continuam acrescer em seguida ao isolamento.Uma variedade de linhas de raiz clonal diferentes foi gerada u-sando os métodos da invenção. As linhas de raiz foram geradas usando ve-tores virais contendo polinucleotídeos que codificam antígeno da invenção(por exemplo, codificando peptídeo imunogênico). As linhas de raiz foramtestadas por Western blot. As linhas de raiz descrevem uma variedade deníveis de expressão diferentes de vários polipeptídeos. As linhas de raiz quedescrevem alta expressão foram selecionadas e adicionalmente cultivadas.As linhas de raiz foram subseqüentemente testadas novamente e mostradaspara manter altos níveis de expressão sobre períodos estendidos de tempo,incluindo estabilidade. Níveis de expressão foram comparáveis a ou maioresdo que expressão em plantas intactas infectadas com o mesmo vetor viralusado para gerar linhas de raiz clonal. Em adição, a estabilidade de expres-são das linhas de raiz foi obtida em plantas infectadas com o mesmo vetorviral. Até 80% de tais plantas infectadas com vírus revertidas em tipo selva-gem após 2-3 passagens. (Tais passagens envolvem inoculação de plantascom transcrições, permitindo que a infecção (local ou sistêmica) se torneestabelecida, tomando uma amostra de folha, e inoculando plantas recentesque são subseqüentemente testadas para expressão).
As linhas de raiz podem ser cultivadas em uma grande escalapara produção de antígeno dos polipeptídeos da invenção conforme discuti-do adicionalmente abaixo. É notado que linhas de raiz clonal (e linhas decélula derivadas de linhas de raiz clonal) podem geralmente ser mantidas nomeio que não inclui vários compostos, por exemplo, hormônios de cresci-mento de planta, tais como auxinas, citoquinas, etc, que são tipicamenteempregadas na cultura de raiz e células de planta. Esta característica reduzo dispêndio associado com cultura de tecido, e os inventores esperam quecontribuirá significantemente à praticabilidade econômica de produção deproteína usando plantas.
Qualquer de uma variedade de métodos pode ser usada paraselecionar raízes clonais que expressam um polinucleotídeo que codificaantígeno(s) da gripe da invenção. Western blots ensaios ELISA, etc, podemser usados para detectar um polipeptídeo codificado. No caso de marcado-res detectáveis, tais como GFP1 métodos alternativos, tais como varredurasvisuais, podem ser realizados. Se um vetor viral compreendendo um polinu-cleotídeo que codifica um marcador selecionável é usado, uma seleção a-propriada pode ser imposta (por exemplo, o material de folha e/ou raízesderivadas deste podem ser cultivados na presença de uma condição antibió-tica ou nutricional apropriadas e raízes sobreviventes identificadas e isola-das). Certos vetores virais contêm dois ou mais polinucleotídeos que codifi-cam antígeno da gripe da invenção, por exemplo, dois ou mais polinucleotí-deos que codificam polipeptídeos diferentes. Se um destes é um marcadorselecionável ou detectável, as raízes clonais que são selecionadas ou detec-tadas por seleção ou detecção de expressão do marcador terão uma altaprobabilidade de também expressar o segundo polinucleotídeo. A varredurade linhas de raiz que contêm polinucleotídeos particulares pode ser realizadausando PCR e outros métodos dé detecção de ácido nucléico.
Alternativamente ou adicionalmente, linhas de raiz clonal podemser classificadas pela presença do vírus pela inoculação de plantas hospe-deiras que formarão lesões locais como um resultado de infecção de vírus(por exemplo, plantas hospedeiras hipersensíveis). Por exemplo, 5 mg detecido de raiz pode ser homogeneizado em 50 μΙ de tampão de fosfato, eusado para inocular uma folha simples de uma planta de tabaco. Se o vírusestá presente em culturas de raiz, dentro de dois ou três dias lesões caracte-rísticas aparecerão nas folhas infectadas. Isto significa que a linha de raizcontém vírus recombinante que transporta o polinucleotídeo que codificaantígeno da gripe da invenção (gene alvo). Se nenhuma lesão local é forma-da, não existe vírus, e a linha de raiz é rejeitada como negativa. Este métodoé altamente eficiente em tempo e custo. Após classificar inicialmente a pre-sença de vírus, as raízes que contêm o vírus podem ser submetidas à varre-dura secundária, por exemplo, por mancham entro de Western ou ELISApara selecionar altos expressores. Varreduras adicionais, por exemplo, var-reduras para crescimento rápido, crescimento em meio particular, ou sobcondições ambientais particulares, etc, podem ser aplicados. Estes métodosde varredura podem, em geral, serem aplicados no desenvolvimento dequalquer das linhas de raiz clonal, linhas de célula clonal, linhas de célula deplanta clonal, e/ou plantas clonais aqui descritas.
Conforme será evidente a um técnico versado na técnica, umavariedade de modificações pode ser feita à descrição dos métodos da inven-ção para gerar linhas de raiz clonal que contêm um vetor viral. Tais modifi-cações estão dentro do escopo da invenção. Por exemplo, enquanto é ge-ralmente desejável introduzir o vetor viral em uma planta intacta ou proteínadesta antes da introdução dos genes de Ri-T-DNA, em certas concretiza-ções da invenção o Ri-DNA é introduzido antes da introdução do vetor viral.Em adição, é possível contactar plantas intactas com A. rhizogenes preferi-velmente do que colheita de porções de folha e, em seguida, expondo-as aobacterium.
Outros métodos de gerar linhas de raiz clonais de células sim-ples da planta ou porção desta que abriga um vetor viral podem ser usados(isto é, métodos não usando A. rhizogenes ou material genético a partir deplasmídeo Ri). Por exemplo, tratamento com certos hormônios de planta oucombinações de hormônios de planta é conhecido para resultar na geraçãode raízes de tecido de planta.
Linhas de Célula Clonal Derivadas de Linhas de Raiz Clonal
Conforme descrito acima, a invenção proporciona métodos paragerar linhas de raiz clonais, no qual as células nas linhas de raiz contêm umvetor viral. Conforme é bem-conhecido na técnica, uma variedade de linhasde célula diferentes pode ser gerada de raízes. Por exemplo, linhas de raizde célula podem ser geradas de células de raiz individuais obtidas a partir daraiz usando uma variedade de métodos conhecidos. Tais linhas de célula deraiz podem ser obtidas de vários tipos de célula de raiz diferentes dentro daraiz. Em geral, o material de raiz é colhido e dissociado (por exemplo, fisi-camente e/ou enzimaticamente digerido) para liberar células de raiz indivi-duais, que são, em seguida, adicionalmente cultivadas. A formação completade protoplasto não é geralmente necessária. Se desejado, células de raizpodem ser revestidas em concentrações de célula muito diluídas, de modo aobter linhas de célula de raiz de células de raiz simples. Linhas de célula deraiz derivadas dessa maneira são linhas de célula clonais contendo o vetorviral. Tais linhas de célula de raiz, portanto, exibem expressão estável dopolinucleotídeo que codifica antígeno da gripe da invenção. As linhas de cé-lula de planta clonais podem ser obtidas em uma maneira similar a partir deraízes clonais, por exemplo, por cultura de células de raiz dissociadas napresença dos hormônios de planta apropriados. Varreduras e etapas suces-sivas de enriquecimento podem ser usadas para identificar linhas de célulaque expressam o polinucleotídeo que codifica antígeno da gripe da invençãoem níveis altos. Contudo, se a linha de raiz clonal da qual a linha de célula éderivada já expressa em altos níveis, tais varreduras adicionais podem serdesnecessárias.
Como no caso das linhas de célula clonais, as células de uma li-nha de célula de raiz clonal são derivadas de uma célula ancestral simplesque contém o vetor viral e, conterá, portanto, também o vetor viral, visto queele será replicado, e será transmitido durante divisão da célula. Desse modo,uma alta proporção (por exemplo, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelomenos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%), total (100%), ou substan-cialmente total (pelo menos 98%) das células conterão o vetor viral. É nota-do que desde que o vetor viral é herdado pelas células filhas dentro da linhade célula de raiz clonal, o movimento do vetor viral entre as células não énecessário para manter o vetor viral. As linhas de célula de raiz clonais po-dem ser usadas de um polinucleotídeo que codifica antígeno da gripe dainvenção conforme descrito abaixo.
Linhas de Célula de Planta Clonal
A presente invenção proporciona métodos para gerar uma linhade célula de planta clonal na qual um vetor viral de planta é usado para dire-cionar expressão de um polipeptídeo que codifica antígeno da gripe da in-venção. De acordo com o método da invenção, um ou mais vetor(es) de ex-pressão viral incluindo um polinucleotídeo que codifica um antígeno de gripeda invenção ligado operavelmente a um promotor é introduzido em células deuma linha de célula de planta que é mantida na cultura de célula. Um númerode linhas de célula de plantas de vários tipos de planta é conhecido na técni-ca, qualquer dos quais podendo ser usado. Linhas de célula recentementederivadas podem ser geradas de acordo com métodos conhecidos para usona prática da invenção. Um vetor viral é introduzido nas células da linha decélula de planta de acordo com qualquer de um número de métodos. Por e-xemplo, protoplastos podem ser produzidos e transcrições virais em seguidaeletroporadas nas células. Outros métodos de introdução de um vetor viral deplanta nas células de uma linha de célula de planta podem ser usados.
Um método de gerar linhas de célula de planta clonais, de acor-do com a invenção, e um vetor viral para introdução em células de planta(por exemplo, protoplastos), podem ser usados conforme segue: em seguidaa introdução do vetor viral, a linha de célula de planta pode ser mantida nacultura de tecido. Durante este tempo, o vetor viral pode replicar, e os poli-peptídeos que codificam antígeno da gripe da invenção podem ser expres-sos. As linhas de célula de planta clonais são derivadas a partir da cultura,por exemplo, por um processo de enriquecimento sucessivo. Por exemplo,amostras podem ser removidas da cultura, opcionalmente com diluição demodo que a concentração de células é baixa, e revestidas em placas de Pe-tri em gotículas individuais. As gotículas são, em seguida, mantidas parapermitir divisão de célula.
Será apreciado que as gotículas podem conter um número vari-ável de células, dependendo da densidade inicial da cultura e da quantidadede diluição. As células podem ser diluídas tal que muitas gotículas contêmou 0 ou 1 célula se é desejado obter-se linhas de célula clonais expressandoo polipeptídeo que codifica antígeno da gripe da invenção após somenteuma etapa simples de enriquecimento. Contudo, pode ser mais eficiente se-lecionar uma concentração tal que células múltiplas estejam presentes emcada gotícula e, em seguida, classificar as gotículas para identificar aquelasque contêm expressão de células. Em geral, qualquer procedimento de var-redura apropriado pode ser empregado. Por exemplo, seleção ou detecçãode um marcador detectável, tal como GFP, pode ser usado. Western blotsou ensaios ELISA podem ser usados. Gotículas individuais (100 μΙ) contêmmais do que células o bastante para realização destes ensaios. Etapas múl-tiplas de enriquecimento são realizadas para isolar linhas de célula de ex-pressão mais altas. Linhas de célula de planta clonais simples (isto é, popu-lações derivadas de uma célula ancestral simples) podem ser geradas porlimitação adicional de diluição usando-se métodos padrão para clonagem decélula simples. Contudo, é necessário isolar linhas clonais individuais. Umapopulação contendo linhas de célula clonais múltiplas pode ser usada de umpolipeptídeo que codifica antígeno(s) da gripe da invenção.
Em geral, certas concretizações acima descritas para geraçãode linhas de raiz clonais se aplicam a geração de linhas de célula de plantaclonais. Por exemplo, uma diversidade de vetores virais contendo um oumais polipeptídeos que codificam antígeno(s) da gripe da invenção pode serusada como podem combinações de vetores diferentes múltiplos. Métodosde varredura similares podem ser usados. Como no caso das linhas de raizclonais e linhas de célula de raiz clonais, células de uma linha de célula deplanta clonal são derivadas de uma célula ancestral simples que contém ovetor viral e conterão, portanto, também o vetor viral, visto que será replica-do e será transmitido durante divisão de célula. Desse modo, uma alta pro-porção (por exemplo, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 80%,pelo menos 90%, pelo menos 95%), total (100%), ou substancialmente total(pelo menos 98%) das células conterá o vetor viral. É notado que desde queo vetor viral é herdado por células filhas dentro da linha de célula de plantaclonal, o movimento do vetor viral entre as células não é necessário paramanter o vetor viral. A linha de célula de planta clonal pode ser usada paraprodução de um polipeptídeo que codifica antígeno da gripe da invençãoconforme descrito abaixo.
Plantas Clonais
Plantas clonais podem ser geradas a partir de raízes clonais, li-nhas de célula de raiz clonais, e/ou linhas de célula de planta clonais produ-zidas de acordo com os vários métodos acima descritos. Métodos para ge-ração de plantas a partir de raízes, linhas de célula de raízes, e linhas decélula de plantas, tais como as linhas de raiz clonais, linhas de célula de raizclonais, e linhas de célula de planta clonais aqui descritas são bem-conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Peres et al, 2001, Plant Cell Tissueand Organ Culture, 65:37; e referência modelo operam na biologia molecularde planta e biotecnologia citadas aqui). A invenção proporciona, portanto,um método de gerar uma planta clonal compreendendo etapas de (i) geraruma linha de raiz clonal, linha de célula de raiz clonal, ou linha de célula deplanta clonal de acordo com qualquer dos métodos da invenção descritosacima; e (ii) gerar uma planta total a partir da linha de raiz clonal, linha decélula de raiz clonal, ou planta clonal. As plantas clonais podem ser propa-gadas e descridas de acordo com métodos-padrão.
Como no caso das linhas de raiz clonais, linhas de célula de raizclonais e linhas de célula de planta clonais, as células de uma planta clonalsão derivadas de uma célula ancestral simples que contém o vetor viral econterão, portanto, também o vetor viral, visto que será replicado e serátransmitido durante divisão de célula. Desse modo, uma alta proporção (porexemplo, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos90%, pelo menos 95%), total (100%), ou substancialmente total (pelo menos98%) das células conterá o vetor viral. É notado que desde que o vetor viralé herdado por células filhas dentro da planta clonal, o movimento do vetorviral não é necessário para manter o vetor viral.
Sistemas de Expressão de Planta de Brotos e Brotos Germinados
Sistemas e reagentes para gerar uma variedade de brotos e bro-tos germinados que são úteis para a produção de antígeno(s) de gripe deacordo com a presente invenção foram descritos anteriormente e são co-nhecidos na técnica (ver, por exemplo, Publicação PCT WO 04/43886, que éaqui incorporada por referência). A presente invenção proporciona adicio-nalmente brotos germinados, que podem ser comíveis, como uma biomassacontendo um peptídeo ou proteína de antígeno de gripe. Em certos aspec-tos, a biomassa é provida diretamente para consumo de composições deantígeno. Em alguns aspectos, a biomassa é processada antes do consumo,por exemplo, por homogeneização, trituração, secagem ou extração. Emcertos aspectos, o antígeno de gripe é purificado a partir da biomassa e for-mulado em uma composição farmacêutica.Adicionalmente providos são métodos para produção de antíge-no(s) de gripe em brotos germinados que podem ser consumidos ou colhi-dos vivos (por exemplo, brotos germinados do gênero Brassica). Em certosaspectos, a presente invenção envolve crescimento de uma semente a umbroto germinado comestível em um ambiente regulável contido (por exem-plo, internos, em um recipiente, etc). A semente pode ser uma semente ge-neticamente projetada que contém um cassete de expressão que codificaum antígeno de gripe, cuja expressão é acionada por um promotor exoge-namente induzível. Uma variedade de promotores exogenamente induzíveispode ser usada que sejam induzíveis, por exemplo, por luz, calor, fitohormô-nios, nutrientes, etc.
Em concretizações relacionadas, a presente invenção propor-ciona métodos de produção de antígeno(s) de gripe em brotos germinadosprimeiro pela geração de um estoque de semente para o broto germinadopela transformação de plantas com um cassete de expressão que codificaantígeno de gripe usando sistema de transformação de Agrobacterium, noqual a expressão do antígeno de gripe é acionada por um promotor induzí-vel. Sementes transgênicas podem ser obtidas a partir da planta transforma-da, crescida em um ambiente regulável contido, e induzida para expressar oantígeno de gripe.
Em algumas concretizações, métodos são providos que envol-vem infecção de brotos germinados com um cassete de expressão viral quecodifica um antígeno de gripe, expressão da qual pode ser acionada porqualquer de um promotor viral ou um promotor induzível. Os brotos germina-dos são crescidos por dois a quatorze dias em um ambiente regulável conti-do, ou pelo menos até que níveis do antígeno de gripe tenham sido obtidospara consumo ou colheita.
A presente invenção proporciona adicionalmente sistemas paraprodução de antígeno(s) de gripe em brotos germinados que incluem umaunidade de alojamento com controle de clima e em broto germinado conten-do um cassete de expressão que codifica um ou mais antígenos de gripe, noqual expressão é acionada por um promotor constitutivo ou induzível. Ossistemas da invenção podem proporcionar vantagens únicas sobre o ambi-ente externo ou estufa, que não podem ser controlados. Desse modo, a pre-sente invenção capacita ao cultivador precisar o tempo de indução de ex-pressão do antígeno de gripe. Ele pode também reduzir grandemente o cus-to de produção de antígeno(s) de gripe.
Em certos aspectos, brotos transientemente transfectados con-têm seqüências de vetor viral que codificam um antígeno de gripe da inven-ção. Os brotos são crescidos por um período de tempo de modo a permitirprodução de um ácido nucléico viral no broto, seguido por um período decrescimento no qual cópias múltiplas de vírus são produzidas, resultando,desse modo, na produção de antígeno.
Em certos aspectos, sementes geneticamente projetadas ouembriões que contêm um ácido nucléico que codifica um antígeno de gripesão crescidos ao estágio de broto de semente em um ambiente regulávelcontido. O ambiente regulável contido pode ser uma unidade de alojamentoou ambiente no qual as sementes podem ser crescidas interiormente. Todosos fatores ambientais do ambiente regulável contido podem ser controlados.Desde que os brotos não requerem luz e iluminação para crescerem, o quepode ser custoso, as sementes geneticamente projetadas ou embriões po-dem ser crescidas ao estágio de semente germinada em interiores na au-sência de luz.
Outros fatores ambientais que podem ser regulados em um am-biente regulável contido da presente invenção incluem temperatura, umida-de, água, nutrientes, gás (por exemplo, teor de O2 ou CO2, ou circulação dear), químicos (moléculas pequenas, tais como açúcares e derivados de açú-car, ou hormônios, tais como os fitohormônios giberélico ou ácido absísico,etc), e similares.
De acordo com certos métodos da presente invenção, expres-são do ácido nucléico que codifica um antígeno de gripe pode ser controladapor um promotor exogenamente induzível. Promotores exogenamente indu-zíveis são propensos a aumentar ou diminuir a expressão de um ácido nu-cléico em resposta a um estímulo externo, preferivelmente do que interno.Um número destes fatores ambientais pode agir como indutores para ex-pressão dos ácidos nucléicos transportados pelos cassetes de expressãodos brotos geneticamente projetados. Um promotor pode ser um promotorinduzível de calor, tal como um promotor de choque de calor. Por exemplo,usando-se como um promotor de choque de calor, a temperatura do ambien-te contido pode simplesmente ser elevada para induzir expressão do ácidonucléico. Outros promotores incluem promotores induzíveis de luz. Os pro-motores induzíveis de luz podem ser mantidos como promotores constituti-vos se a luz no ambiente regulável contido está sempre ligada. Alternativa-mente ou adicionalmente, a expressão de um ácido nucléico pode ser ligadaem um tempo particular durante desenvolvimento ligando-se simplesmente aluz. Um promotor pode ser um promotor quimicamente induzível que é usa-do para induzir expressão da ácido nucléico. De acordo com estas concreti-zações, o químico pode simplesmente ser enevoado ou pulverizado em umasemente, embrião, ou broto para induzir expressão do ácido nucléico. A pul-verização e enevoamento podem ser precisamente controladas e direciona-das em uma semente particular, embrião, ou broto ao qual é pretendido. Oambiente contido é destituído de vento ou correntes de ar, que podem dis-persar o químico para fora a partir do alvo pretendido, de modo que o quími-co fica no alvo para qual ele foi pretendido.
De acordo com a presente invenção, o tempo de expressão queé induzido pode ser selecionado para maximizar a expressão de um antíge-no de gripe no broto de semente pelo tempo de colheita. A indução de ex-pressão em um embrião em um estágio particular de crescimento (por e-xemplo, indução de expressão em um embrião em um número particular dedias após germinação, pode resultar em síntese máxima do antígeno de gri-pe no tempo de colheita). Por exemplo, a indução de expressão a partir dopromotor 4 dias após germinação pode resultar em mais síntese de proteínado que indução de expressão a partir do promotor após 3 dias ou após 5dias. Aqueles técnicos versados na técnica apreciarão que a maximizaçãoda expressão pode ser alcançada por experimentação de rotina. Em algu-mas concretizações, os brotos germinados são colhidos em cerca de 1, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9 10, 11 ou 12 dias após germinação.
Em casos onde o vetor de expressão tem um promotor constitu-tivo ao invés de um promotor induzível, o broto germinado pode ser colhidoem um certo tempo após transformação do broto de semente. Por exemplo,se um broto germinado fosse viralmente transformado em um estágio anteri-or de desenvolvimento, por exemplo, no estágio de embrião, os brotos ger-minados podem ser colhidos em um tempo quando expressão está em suapós-transformação máxima, por exemplo, em cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13 ou 14 dias pós-transformação. Pode também ser que brotosse desenvolvam um, dois, três ou mais meses pós-transformação, depen-dendo da germinação da semente.
Geralmente, uma vez que a expressão do antígeno(s) de gripese inicia, as sementes, embriões ou brotos germinados são permitidos cres-cerem até que níveis suficientes de antígeno(s) de gripe sejam expressos.Em certos aspectos, níveis suficientes são níveis que proporcionariam umbenefício terapêutico a um paciente se a biomassa colhida fosse material embruto ingerido. Alternativamente ou adicionalmente, níveis suficientes sãoníveis dos quais o antígeno de gripe pode ser concentrado ou purificado apartir da biomassa e formulado em uma composição farmacêutica que pro-porciona um benefício terapêutico a um indivíduo após administração. Tipi-camente, o antígeno de gripe não é uma proteína expressa no broto germi-nado na natureza. Em qualquer taxa, o antígeno de gripe é tipicamente ex-presso em concentrações acima daquela que estaria presente no broto ger-minado na natureza.
Uma vez que a expressão do antígeno de gripe é induzida,crescimento é permitido continuar até o estágio de broto germinado, em cujotempo os brotos germinados são colhidos. Os brotos germinados podem sercolhidos vivos. A colheita de brotos germinados vivos tem várias vantagens,incluindo esforço e quebra mínimos. Os brotos germinados da presente in-venção podem ser crescidos hidroponicamente, tornando a colheita umaação simples de se elevar o broto germinado de sua solução hidropônica.Nenhum solo é requerido para o crescimento dos brotos germinados da in-venção, mas pode ser provido se considerado necessário ou desejável peloversado na técnica. Devido aos brotos serem crescidos sem solo, nenhumalimpeza de material de broto germinado é requerida na hora da colheita.Sendo capaz de colher o broto germinado diretamente de seu ambiente hi-dropônico sem lavagem ou esfregamento, minimizando-se a quebra do ma-terial colhido. A quebra e definhamento de plantas induzem apoptose. Du-rante apoptose, certas enzimas proteolíticas tornam-se ativas, que podemdegradar a proteína farmacêutica expressa no broto germinado, resultandona atividade terapêutica diminuída da proteína. A proteólise induzida por a-poptose pode diminuir significantemente a produção de proteína de plantasmaduras. Usando-se os métodos da presente invenção, apoptose pode serevitada quando nenhuma colheita ocorre até o momento das proteínas se-rem extraídas da planta.
Por exemplo, brotos vivos podem ser moídos, triturados ou mis-turados para produzir uma pasta fluida de biomassa de broto germinado, eminibidores de protease contendo tampão. O tampão pode ser mantido a cer-ca de 4°C. Em alguns aspectos, a biomassa de broto germinado é seca a ar,pulverizada seca, congelada, ou congelada seca. Como em plantas madu-ras, alguns destes métodos, tais como secagem a ar, podem resultar emuma perda de atividade da proteína farmacêutica. Contudo, devido aos bro-tos germinados serem muito pequenos e terem uma grande área superficialem razão de volume, isto é muito menos provável de ocorrer. Aqueles técni-cos versados na técnica apreciarão que muitas técnicas para colheita dabiomassa que minimizam a proteólise da proteína expressa são disponíveis,e podem ser aplicadas a presente invenção.
Em algumas concretizações, os brotos germinados são comes-tíveis. Em certas concretizações, os brotos germinados que expressam ní-veis suficientes de antígenos de gripe são consumidos após colheita (porexemplo, após colheita, dentro de um período mínimo em seguida a colhei-ta), de modo que absolutamente nenhum processamento ocorre antes dosbrotos de semente serem consumidos. Desse modo, qualquer quebra prote-olítica induzida pela colheita do antígeno da gripe antes da administração doantígeno de gripe a um paciente em necessidade de tratamento é minimiza-da. Por exemplo, brotos germinados que estão prontos para serem consu-midos podem ser distribuídos diretamente a um paciente. Alternativamenteou adicionalmente, sementes geneticamente projetadas ou embriões sãodistribuídos a um paciente em necessidade de tratamento e desenvolvidosao estágio de broto germinado pelo paciente. Em um aspecto, um suprimen-to de brotos germinados geneticamente projetados é provido a um paciente,ou a um médico que estará tratando os pacientes, de modo que um estoquecontínuo de brotos germinados que expressam certos antígenos de gripepode ser cultivado. Isto pode ser particularmente valioso para populaçõesem países em desenvolvimento, onde farmacêuticos custosos não são ofe-recidos ou distribuídos. A facilidade com qual os brotos germinados da in-venção podem ser crescidos torna os brotos germinados da presente inven-ção particularmente desejáveis para tal população em desenvolvimento.
A natureza regulável do ambiente contido concede vantagenspara a presente invenção sobre crescimento de plantas no ambiente exter-no. Em geral, o crescimento de brotos germinados geneticamente projetadosque expressam proteínas farmacêuticas em plantas proporciona um produtofarmacêutico mais rápido (porque as plantas são colhidas mais jovens) ecom menos esforço, risco, e considerações regulatórias do que o desenvol-vimento de plantas geneticamente projetadas. O ambiente regulável contidousado na presente invenção reduz ou elimina o risco de plantas de poliniza-ção cruzada na natureza.
Por exemplo, um promotor induzível de calor do mesmo modonão seria usado nos exteriores porque a temperatura no exterior não podeser controlada. O promotor seria ligado a qualquer hora que a temperaturaexterior se elevasse acima de um certo nível. Similarmente, o promotor seriadesligado toda hora que a temperatura externa caísse. Tais alterações detemperatura podem ocorrer em um único dia, por exemplo, ligando a expres-são no dia e desligando a noite. Um promotor induzível de calor, tal comoaquele aqui descrito, não seria mesmo prático para uso em uma estufa, queé susceptível a alterações climáticas para quase o mesmo grau conforme osexteriores. O crescimento de plantas geneticamente projetadas em uma es-tufa é muito custoso. Em contraste, no presente sistema, muita variável podeser controlada de modo que a quantidade máxima de expressão pode seralcançada com toda colheita.
Em certas concretizações, os brotos germinados da presente in-venção são crescidos em bandejas que podem ser irrigadas, pulverizadas,ou enevoadas em qualquer tempo durante desenvolvimento do broto germi-nado. Por exemplo, a bandeja pode ser assentada com um ou mais apare-lhos de irrigação, pulverização, enevoamento e drenagem que podem distri-buir e/ou remover água, nutrientes, químicos, etc., no tempo específico, eem quantidades precisas durante desenvolvimento do broto germinado. Porexemplo, as sementes requerem umidade suficiente para mantê-las úmidas.A umidade em excesso drena através de furos nas bandejas nos drenos nosolo do ambiente. Tipicamente, a água de drenagem é tratada conforme a-propriado para remoção de químicos nocivos antes da descarga de volta noambiente.
Outra vantagem de bandejas é que elas podem estar contidasdentro de um espaço muito pequeno. Desde que nenhuma luz seja requeri-da para os brotos germinados crescerem, as bandejas contendo sementes,embriões ou brotos germinados podem ser apertadamente empilhadas verti-calmente uma sobre a outra, proporcionando uma grande quantidade de bi-omassa por unidade de espaço de solo em uma facilidade de alojamentoconstruída especificamente para esta proposta. Em adição, as pilhas debandejas podem ser dispostas em séries horizontais dentro de uma unidadede alojamento. Uma vez que os brotos tenham crescido a um estágio apro-priado para colheita (cerca de dois a quatorze dias), as bandejas de brotoindividuais são movidas em uma facilidade de processamento, ou manual-mente, ou por meios automáticos, tal como uma correia transportadora.
O sistema da presente invenção é único em que ele proporcionauma biomassa de broto germinado que é uma fonte de um antígeno(s) degripe. Se diretamente consumida ou processada na forma de uma composi-ção farmacêutica, porque os brotos germinados são crescidos em um ambi-ente regulável contido, a biomassa de broto germinado e/ou composiçãofarmacêutica derivada a partir da biomassa podem ser providas a um con-sumidor em baixo custo. Em adição, o fato que as condições para cresci-mento dos brotos germinados podem ser controladas torna a qualidade epureza do produto consistentes. O ambiente regulável contido da invençãotambém torna óbvio muitas regulações seguras da EPA que pode impedircientistas de desenvolverem produtos agriculturais geneticamente projetadosao ar livre.
Brotos Transformados
Uma variedade de métodos pode ser usada para transformar cé-lulas de planta e produzir brotos germinados geneticamente projetados. Doismétodos disponíveis para a transformação de plantas que requerem que li-nhas de células transgênicas sejam geradas in vitro, seguido por regeneraçãodas linhas de célula nas plantas totais, incluem transferência de gene media-da por Agrobacterium tumefaciens e bombardeio de microprojétil, ou eletropo-ração. A transformação viral é um método mais rápido e menos custoso detransformação de embriões e brotos germinados que podem ser colhidos semum retardo experimental ou geracional antes da obtenção do produto deseja-do. Para qualquer destas técnicas, o versado na técnica apreciaria comoajustar e otimizar os protocolos de transformação que foram usados tradicio-nalmente para plantas, sementes, embriões, ou brotos germinados.Cassetes de Expressão de Transformação de Agrobacterium
Agrobacterium é um gênero representativo da família gram-negativa Rhizobiaceae. Esta espécie é responsável por tumores de planta,tais como doença de bile de coroa e raiz com pelo. Em tecido de planta de-diferenciado, que é característico de tumores, derivados de aminoácido co-nhecidos como opines são produzidos pelo Agrobacterium e catabolizadospela planta. Os genes bactericidas responsáveis pela expressão de opinessão uma fonte conveniente de elementos de controle para cassetes de ex-pressão quiméricos. De acordo com a presente invenção, o sistema detransformação de Agrobacterium pode ser usado para gerar brotos germina-dos comestíveis, que são meramente colhidos antes das plantas amadure-cerem. Os métodos de transformação de Agrobacterium podem facilmenteserem aplicados para regenerar brotos germinados que expressam antíge-nos de gripe.
Em geral, a transformação das plantas envolve a transformaçãode células de planta crescidas em cultura de tecido por co-cultivo com umAgrobacterium tumefaciens conduzindo uma planta/vetor bactericida. O vetorcontém um gene que codifica um antígeno de gripe. O Agrobacterium trans-fere o vetor para a célula hospedeira da planta e é, em seguida, eliminadousando tratamento antibiótico. As células de planta transformadas que ex-pressam o antígeno de gripe são selecionadas, diferenciadas, e, finalmente,regeneradas em plantinhas completas (Hellen et al., 2000, Piant Moi). Biol.,42:819; Pilon-Smits et al., Plant Physiolog. 119(1):123; Barfield et al., 1991,Plant Cell Reports, 10:308; e Riva et al., J. Biotechnology\{3)·, cada um doqual é incorporado aqui por referência.
Vetores de expressão para uso na presente invenção incluemum gene (ou cassete de expressão) que codifica um antígeno de gripe de-signado para operação em plantas, com seqüências companheiras a mon-tante e a jusante do cassete de expressão. As seqüências companheirassão geralmente de plasmídeo ou de origem viral, e proporcionam caracterís-ticas necessárias ao vetor para transferir DNA da bactéria ao hospedeiro deplanta desejado.
O constructo básico bactericida/vetor de planta pode desejavel-mente proporcionar uma origem de replicação de procariote de hospedeirode faixa ampla, um marcador selecionável de procariote. Marcadores sele-cionáveis procarióticos adequados incluem resistência a antibióticos, taiscomo ampicilina ou tetraciclina. Outras seqüências de DNA que codificamfunções adicionais que são bem-conhecidas podem também estarem pre-sentes no vetor.
Seqüências de Agrobaeterium T-DNA são requeridas para trans-ferência mediada por Agrobaeterium de DNA para o cromossomo da planta.Os genes de indução de tumor do T-DNA são tipicamente removidos e subs-tituídos com seqüências que codificam o antígeno de gripe. As seqüênciasde limite de T-DNA são retidas porque elas iniciam a integração da região deT-DNA no genoma da planta. Se expressão do antígeno de gripe não é pron-tamente acessível para detecção, a construção bactericida/de vetor de plan-ta pode também inclui um gene marcador selecionável para determinação seuma célula de planta foi transformada, por exemplo, o gene de resistêncianptll karamicin. No mesmo ou diferente vetor bactericida/de planta (plasmí-deo Ti) são seqüências Ti. Seqüências Ti incluem os genes de virulência,que codificam um conjunto de proteínas responsáveis pela excisão, transfe-rência e integração do T-DNA no genoma da planta (Caiu, 1987, Caiense,237:1176). Outras seqüências adequadas para permissão de integração daseqüência heteróloga no genoma da planta podem incluir seqüências detransposon, e similares, para recombinação homóloga.
Certos constructos incluirão um cassete de expressão que codi-fica uma proteína de antígeno. Um, dois ou mais cassetes de expressão po-dem ser usados em uma dada transformação. O cassete de expressão re-combinante contém, em adição à seqüência que codifica antígeno de gripe,pelo menos os seguintes elementos: uma região de promotor, seqüênciasnão-transladadas 5' de planta, códon de iniciação (dependendo se ou não ogene expresso tem seu reconhecimento), e seqüências de terminação detranscrição e terminação de translação. Em adição, terminadores de trans-crição e translação podem ser incluídos nos cassetes de expressão ou ge-nes quiméricos da presente invenção. Seqüências de secreção de sinal quepermitem processamento e translocação da proteína, conforme apropriado,podem também serem incluídas no cassete de expressão. Uma variedadede promotores, seqüências de sinal, e terminadores de transcrição e transla-ção são descritos (ver, por exemplo, Lawton et al., 1987, Plant Mol. Biol9:315; e Patente dos Estados Unidos N0 5.888.789, incorporados aqui porreferência). Em adição, genes estruturais para resistência a antibiótico sãocomumente utilizados como um fator de seleção (Fraley et al., 1983, Proc). Λ/aí/. Acad. Sci., USA 80:4803, aqui incorporado por referência. Locais deenzima de restrição únicos nas extremidades 5' e 3' do cassete permitemfácil inserção em um vetor pré-existente. Outros sistemas de vetor bináriopara transformação mediada por Agrobacterium, conduzindo pelo menosuma seqüência limite de T-DNA, são descritos em PCT/EP99/07414, incor-porado aqui por referência.
Regeneração
Sementes de plantas transformadas podem ser colhidas, secas,limpas e testadas para viabilidade e para a presença e expressão de umproduto de gene desejado. Uma vez que este tenha sido determinado, esto-que de semente é tipicamente armazenado sob condições apropriadas detemperatura, umidade, saneamento e segurança a serem usadas quandonecessário. As plantas totais podem então ser regeneradas de protoplastoscultivados (ver, por exemplo, Evans et al., Handbook of Plant Cell Cultures,Vol. 1, MacMiIIan Publishing Co. New York, 1983; e Vasil I. R. (ed.), Cell Cul-ture and Somatic Cell Genetics of Plants1 Acad. Press, Orlando, Vol. I, 1984,e Vol. III, 1986, incorporados aqui por referência). Em certos aspectos, asplantas são regeneradas somente ao estágio de broto germinado. Em algunsaspectos, as plantas totais são regeneradas para produzir estoques de se-mente, e brotos germinados são geradas a partir das sementes do estoquede semente.
Todas as plantas das quais protoplastos podem ser isolados ecultivados para dar plantas totais regeneradas podem ser transformadas pe-la presente invenção de modo que as plantas totais são recuperadas, quecontêm o gene transferido. É sabido que praticamente todas as plantas po-dem ser regeneradas a partir das células de cultura ou tecidos, incluindo,mas não limitadas a, todas as espécies maiores de plantas que produzembrotos comestíveis. Algumas plantas adequadas incluem alfafa, munguba,rabanete, trigo, mostarda, espinafre, cenoura, beterraba, cebola, alho, aipo,ruibarbo, uma planta folhosa, tais como repolho ou alface, agrião, ervas, taiscomo salsa, hortelã, ou trevos, couve-flor, brócolis, feijão-soja, lentilhas, flo-res comestíveis, tal como girassol, etc.
Os meios para regeneração variam de uma espécie de plantaspara a próxima. Contudo, aqueles versados na técnica apreciarão que ge-ralmente uma suspensão de protoplantas transformadas contendo cópias dogene heterólogo é primeiro provida. Tecido de calo é formado, e brotos po-dem ser induzidos de calo e, subseqüentemente, arraigados. Alternativa-mente ou adicionalmente, formação de embrião pode ser induzida a partir dasuspensão de protoplastos. Estes embriões germinam como embriões natu-rais para formar plantas. O afundamento da semente na água, ou a pulveri-zação da semente com água para aumentar o teor de umidade da sementepara entre 35-45%, inicia a germinação. Para a germinação proceder, assementes são tipicamente mantidas em ar saturado com água sob condi-ções de temperatura controlada e fluxo de ar. O meio de cultura geralmenteconterá vários aminoácidos e hormônios, tais como auxina e citoquininas. Étambém vantajoso adicionar ácido glutâmico e prolina ao meio, especialmen-te para espécies, tal como alfafa. Brotos e raízes normalmente se desenvol-vem simultaneamente. A regeneração eficiente dependerá do meio, do ge-nótipo, e da história da cultura. Se estas três variáveis são controladas, en-tão a regeneração é totalmente reproduzível e repetível.
As plantas maduras, crescidas a partir de células de plantatransformadas, são plantas transgênicas homozigóticas de auto e não-segregação, são identificadas. Uma planta congênita produz sementes con-tendo as seqüências que codificam o antígeno da invenção. Tais sementespodem ser germinadas e crescidas ao estágio de broto germinado para pro-duzir o(s) antígeno(s) de gripe de acordo com a presente invenção.
Em concretizações relacionadas, sementes da presente inven-ção podem ser formadas em produtos de semente, e vendidas com instru-ções de como desenvolver brotos para o estágio de broto germinado apro-priado para administração ou colheita em uma composição farmacêutica. Emalgumas concretizações relacionadas, híbridos ou novas variedades concre-tizando os traços desejados podem ser desenvolvidos de plantas congênitasda invenção.
Integração Direta
Integração direta de fragmentos de DNA no genoma de célulasde planta por bombardeio de microprojétil ou eletroporação pode tambémser usada na presente invenção (ver, por exemplo, Kikkert et al., 1999, Plant:J. Tissue Cult. Assoc., 35:43; e Bates, 1994, Mol. Biotech., 2:135). Mais par-ticularmente, vetores que expressam antígenos de HPV da presente inven-ção podem ser introduzidos nas células de planta por uma variedade de téc-nicas. Conforme descrito acima, os vetores podem incluir marcadores sele-cionáveis para uso em células de planta. Os vetores podem incluir seqüênciasque permitem sua seleção e propagação em um hospedeiro secundário, taiscomo seqüências contendo uma origem de replicação e marcador selecioná-vel. Tipicamente, hospedeiros secundários incluem bactéria e levedura. Emuma concretização, o hospedeiro secundário é bactéria (por exemplo, Esche-richia coli, a origem de replicação é uma origem tipo CoIEI de replicação), e omarcador selecionável é um gene que codifica resistência a ampicilina. Taisseqüências são bem-conhecidas na técnica, e são comercialmente disponí-veis (por exemplo, Clontech, Palo Alto, CA ou Stratagene, La Jolla, CA).
Os vetores da presente invenção podem também serem modifi-cados em plasm ídeos de transformação de planta intermediários que contêmuma região de homologia a um vetor de Agrobacterium tumefaciens, umaregião limite de T-DNA de Agrobacterium tumefaciens, e ácidos nucléicosque codificam antígeno ou cassetes de expressão descritos acima. Vetoresadicionais podem incluir um tumor de planta desarmado incluindo plasmídeode Agrobacterium tumefaciens.
De acordo com esta concretização, transformação direta dos ve-tores da invenção envolve microinjeção dos vetores diretamente nas célulasda planta pelo uso de micropipetas para transferir mecanicamente o DNArecombinante (ver, por exemplo, 1985, Mol. Gen. Genet., 202:179, incorpo-rado aqui por referência). O material genético pode também ser transferidona célula da planta pelo uso de polietileno glicóis (ver, por exemplo, Krens etai., 1982, Nature 296:72). Outro método de introdução de ácidos nucléicosem plantas via penetração balística de alta velocidade por partículas peque-nas com um ácido nucléico, ou dentro da matriz de gotas pequenas, ou par-tículas, ou na superfície (ver, por exemplo, Klein et ai., 1987, Nature 327:70;Knudsen et ai, 1991, Planta 185:330). Ainda outro método de introdução éfusão de protoplastos com outras entidades, ou minicélulas, células, lisos-somos, ou outros corpos de superfície de lipídeo fusíveis (ver, por exemplo,Fraley et ai, 1982, Proc). Natl. Acad. Sei. USA (1859). Vetores da invençãopodem também serem introduzidos nas células da planta por eletroporação(ver, por exemplo, Fromm et ai, 1985, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82:5824).De acordo com esta técnica, protoplastos de planta são eletroporados napresença de plasmídeos contendo um constructo de gene. Impulsos elétri-cos de reversibilidade de resistência de campo alta permeabilizam biomem-branas permitindo a introdução dos plasmídeos. Os protoplastos de plantaeletroporados reformam a célula, dividem a parede, e formam calo da planta,que podem ser regenerados para formar brotos germinados da invenção.Aqueles versados na técnica apreciarão como utilizar estes métodos paratransformar células de planta que podem ser usadas para gerar brotos ger-minados comestíveis.
Transformação Viral
Similares a sistemas de expressão convencionais, vetores de ví-rus de planta podem ser usados para produzir proteína de comprimento to-tal, incluindo antígeno de comprimento total. De acordo com a presente in-venção, os vetores de vírus de planta podem ser usados para infectar e pro-duzir antígeno(s) em sementes, embriões, brotos germinados, etc, sistemasvirais que podem ser usados para expressar tudo de peptídeos curtos a pro-teínas complexas grandes. Especificamente, o uso de vetores tobamoviral édescrito (ver, por exemplo, McCormick et ai, 1999, Proc. Natl. Acad. Sei.USA 96:703; Kumagai et ai, 2000, Gene , 245:169; e Verch et ai, 1998, J.Immunol. Methods 220:69; cada um do qual incorporado aqui por referên-cia). Desse modo, vetores virais de planta têm uma capacidade demonstra-da de expressar peptídeos curtos, bem como proteínas complexas grandes.
Em certas concretizações, brotos trangênicos que expressamantígeno de gripe são gerados utilizando um sistema de hospedeiro/vírus.Os brotos transgênicos produzidos por infecção viral proporcionam uma fon-te de proteína transgênica que já foi demonstrado ser segura. Por exemplo,os brotos são livres de contaminação com patogenias animais. Diferente-mente, por exemplo, tabaco, proteínas de um broto comestível podiam pelomenos na teoria serem usadas em aplicações orais sem purificação, redu-zindo, desse modo, significantemente, os custos. Em adição, um sistema devírus/broto oferece uma via muito mais simples, menos custosa para escalae fabricação, visto que ácidos nucléicos são introduzidos no vírus, que podeser desenvolvido a uma escala comercial dentro de uns poucos dias. Emcontraste, plantas transgênicas podem requerer até 5-7 anos antes que se-mentes suficiente ou material de planta estejam disponíveis para ensaios degrande escala ou comercialização.
De acordo com a presente invenção, os vírus de RNA de plantatêm certas vantagens, enquanto os tornam atrativos como vetores para ex-pressão de proteína estranha. A biologia e patologia molecular de um núme-ro de vírus de RNA de planta são bem caracterizadas, e existe conhecimen-to considerável de biologia, genéticas e seqüência regulatória de vírus. Mui-tos vírus de RNA de planta têm genomas pequenos, e clones de cDNA in-fecciosos são disponíveis para facilitar manipulação genética. Uma vez queo material de vírus infeccioso entra na célula hospedeira susceptível, ele re-plica a altos níveis e se espalha rapidamente através de um broto germinadototal (um a dez dias pós-inoculação). As partículas de vírus são facilmente eeconomicamente recuperadas de tecido de broto germinado infectado. Osvírus têm uma faixa ampla de hospedeiro, capacitando o uso de um cons-tructo simples para infecção de várias espécies susceptíveis. Estas caracte-rísticas são prontamente transferíveis para os brotos.
Seqüências estranhas podem ser expressas de vírus de RNA deplanta, tipicamente pela substituição de um dos genes virais com seqüênciadesejada, pela inserção de seqüências estranhas no genoma do vírus emuma posição apropriada, ou pela fusão de peptídeos estranhos às proteínasestruturais de um vírus. Além disso, quaisquer destas aproximações podemser combinadas para expressarem seqüências estranhas por trans-complementação de funções vitais de um vírus. Um número de estratégiasdiferentes existe como ferramentas para expressar seqüências estranhasnas plantas infectadas por vírus usando vírus de mosaico de tabaco (TMV),vírus de mosaico de alfafa (AIMV), e quimeras destes.O genoma de AIMV é um representante da família Bromoviridaede vírus, e consiste em três RNAs genômicos (RNAs1-3) e RNA sub-genômico (RNA4) Os RNAs genômicos 1 e 2 codificam proteínas replicasesde vírus P1 e P2, respectivamente. O RNA3 genômico codifica a proteína demovimento de célula a célula P3 e a proteína de revestimento (CP). A CP étransladada de RNA4 subgenômico, que é sintetizado de RNA3 genômico, eé requerido para iniciar a infecção. Estudos têm demonstrado o envolvimen-to da CP em funções múltiplas, incluindo ativação de genoma, replicação,estabilidade de RNA, formação de sintoma, e encapsidação de RNA (ver,por exemplo, Bol et al., 1971, Virology (1971) 46:73; Van Der Vossen et ai,1994, Virology 202:891; Yusibov et al., Virology 208:405; Yusibov et ai,1998, Virology 242:1; Bol et al., (Review, 100 refs.), 1999, J. Gen. Virol.,80:1089; De Graaff, 1995, Virology 208:583; Jaspars et al., Adv. Vírus Res19:37; Loesch-Fries, 1985, Virology 146: 177; Neeleman et al., 1991, Viro-logy 181:687; Neeleman et al., 1993, Virology, 196:883; Van Der Kuyl et al.,1991, Virology 183:731; Van Der Kuyl et al., 1991, Virology, 185:496).
A encapsidação de partículas virais é tipicamente requerida paramovimento de longa distância de vírus de partes inoculadas a não-inoculadas da semente, embrião, ou broto germinado, e para infecção sistê-mica. De acordo com a presente invenção, inoculação pode ocorrer emqualquer estágio de desenvolvimento de planta. Em embriões e brotos, adifusão do vírus inoculado deve ser muito rápida. Virions de AIMV são en-capsidatados por uma CP única (24 kD), formando mais do que um tipo departícula. O tamanho (30 a 60 mm de comprimento e 18 nm de diâmetro) eforma (esférica, elipsoidal, ou baciliforme) de uma partícula dependem dotamanho do RNA encapsidatado. Após montagem, o terminal N do AIMV CPé para estar localizado na superfície das partículas de vírus, e não pareceinterferir com a montagem do vírus (Boi et ai, 1971, Virology 6:73). Adicio-nalmente, o AIMV CP com um adicional de 38 peptídeo aminoácidos em seuterminal N forma partículas in vitro e retém atividade biológica (Yusibov etal., 1995, J. Gen. Virol., 77:567).
O AIMV tem uma faixa de hospedeiro ampla, que inclui um nú-mero de plantas de colheita agriculturalmente valiosas, incluindo sementesde planta, embriões, e brotos. Juntas, estas características tornam o AIMVCP um excelente candidato como uma molécula transportadora e AIMV umvetor candidato atrativo para a expressão de seqüências estranhas para aexpressão de seqüências estranhas na planta no estágio de broto de desen-volvimento. Além disso, após expressão de um vetor heterólogo, tal comoTMV, o AIMV CP encapsidata o genoma de TMV sem interferir com a infecti-vidade do vírus (Yusibov et ai, 1997, Proc. Nati Acad. Sei. USA 94:5784,incorporado aqui por referência). Isto permite o uso de TMV como um vírustransportador para AIMV CP fundido às seqüências estranhas.
TMV, o protótipo do tobamovírus, tem um genoma consistindoem um RNA simples mais de sentido encapsidatado com uma CP de 17,0kD, que resulta em partículas em forma de haste (300 nm de comprimento).A CP é a única proteína estrutural de TMV, e é requerida para encapsidaçãoe movimento de longa distância do vírus em um hospedeiro infectado (Saitoet ai, 1990, Virology 176:329). As 183 e 128 kD de proteínas são translada-das de RNA genômico, e são requeridas para replicação de vírus (Ishikawaet ai., 1986, Nucleic Acids Res., 14:8291). A proteína de 30 kD é a proteínade movimento de célula a célula de vírus (Meshi et ai, 1987, EMBO J.6:2557). As proteínas de movimento e de revestimento são transladadas deRNAs sub-genômicos (Hunter et ai, 1976, Nature 260:759; Bruening et ai,1976, Virology 71:498; e Beachy et ai, 1976, Virology 73:498; cada um doqual sendo incorporado aqui por referência).
Outros métodos de transformação de tecidos de planta incluemtransformação da flor de uma planta. A transformação de Arabidopsis thalia-na pode ser alcançada pela imersão das flores da planta em uma solução deAgrobaeterium tumefaeiens (Curtis et ai, 2001, Transgenie Res., 10:363; eQing et ai, Molecular Breeding: New Strategies in Plant Improvement, 1:67).Plantas transformadas são formadas na população de sementes geradaspelas "plantas imersas". Em um ponto específico durante desenvolvimentoda flor, um poro existe na parede do ovário através da qual Agrobaeteriumtumefaeiens ganha acesso ao interior do ovário. Uma vez no interior do ová-rio, o Agrobacterium tumefaciens prolifera e transforma os óvulos individuais(Desfeux et ai, 2000, Plant Physiology, 123:895). Os óvulos transformadosseguem a trajetória típica de formação de semente no interior do ovário.
Produção e Isolamento de Antígeno
Em geral, métodos padrão conhecido na técnica podem ser u-sados para cultura ou crescimento de plantas, células de planta, e/ou tecidosde planta da invenção (por exemplo, plantas clonais, células de planta clo-nais, raízes clonais, linhas de raiz clonais, brotos, brotos germinados, plan-tas, etc.), para produção de antígeno(s). Uma ampla variedade de meio decultura e biorreatores foram empregados para cultura de células de raiz compelos, linhas de célula de raiz e células de planta (ver, por exemplo, Giri eta/., 2000, Biotecnolol. Adv., 18:1; Rao et ai, 2002, Biotechnol. Adv., 20:101;e referências em ambos dos precedentes, todos dos quais sendo aqui incor-porados por referência). Plantas clonais podem ser crescidas em qualquermaneira adequada.
Em certas concretizações, os antígenos de gripe da invençãopodem ser produzidos por qualquer método conhecido. Em algumas concre-tizações, um antígeno de gripe é expresso em uma planta ou porção desta.As proteínas são isoladas e purificadas de acordo com condições e técnicasconvencionais conhecidas na técnica. Estas incluem métodos, tais comoextração, precipitação, cromatografia, cromatografia de afinidade, eletrofore-se, e similares. A presente invenção envolve a purificação e escala alcançá-vel de produção de antígeno(s) de gripe usando qualquer de uma variedadede sistemas de expressão de planta conhecido na técnica e providos aqui,incluindo sistemas de expressão de planta virais aqui descritos.
Em muitas concretizações da presente invenção, será desejávelisolar produtos de antígeno de vacina. Onde uma proteína da invenção éproduzida de tecido(s) de planta ou uma porção deste(s), por exemplo, raí-zes, células de raiz, plantas, células de planta que as expressam, métodosdescritos em detalhes adicionais aqui, ou quaisquer métodos aplicáveis co-nhecidos na técnica, podem ser usados para qualquer de um isolamentoparcial ou completo de material de planta. Onde é desejável isolar um produ-to de expressão de alguma ou toda de células de planta ou tecidos que aexpressam, quaisquer técnicas de purificação disponíveis podem ser empre-gadas. Aqueles versados na técnica são familiares com uma faixa ampla deprocedimentos de fracionamento e separação (ver), por exemplo, Scopes etai, Protein Purification: Principie and Practice, 3ã Edição, Janson et ai.,1993; Protein Purification: Principies, High Resolution Methods, and Applica-tions, Wiley-VCH, 1998; Springer-Verlag, NY, 1993; e Roe, Protein Purificati-on Techniques, Oxford University Press, 2001, cada um do qual sendo aquiincorporado por referência. Freqüentemente, será desejável produzir umproduto mais do que 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%,94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% puro. Ver, por exemplo, Patentes dosEstados Unidos 6.740.740 e 6.841.659 para discussão de certos métodosúteis para purificação de substâncias de tecidos ou fluidos de planta.
Aqueles versados na técnica também apreciarão que um méto-do de obtenção de produtos de vacina desejado é por extração. O materialde planta (por exemplo, raízes, folhas, etc) pode ser extraído para removerprodutos desejados de biomassa residual, aumentando, desse modo, a con-centração e pureza de um produto. As plantas podem ser extraídas em umasolução tampão. Por exemplo, o material de planta pode ser transferido emuma quantidade de água gelada a uma razão de um para um por peso, quefoi tamponada com, por exemplo, tampão de fosfato. Inibidores de proteasepodem ser adicionados conforme requerido. O material de planta pode serrompido por mistura ou moagem vigorosas enquanto suspenso na soluçãotampão, e a biomassa extraída removida por filtração ou centrifugação. Oproduto transportado na solução pode adicionalmente ser purificado por eta-pas adicionais, ou convertido a um pó seco por congelamento-secagem ouprecipitação. A extração pode ser efetuada por prensagem. As plantas ouraízes podem ser extraídas por prensagem em uma prensa, ou moídas àmedida que elas passam através de rolos proximamente espaçados. Os flui-dos expressos a partir das plantas ou raízes moídas são coletados e proces-sados de acordo com métodos bem-conhecidos na técnica. A extração porprensagem permite a liberação de produtos em uma forma mais concentra-da. Contudo, o rendimento total do produto pode ser mais baixo do que seum produto fosse extraído em solução.
Anticorpos
A presente invenção proporciona antígeno farmacêutico e prote-ínas de anticorpo para uso terapêutico, tais como antígeno(s) de gripe (porexemplo, proteína(s) de gripe ou porção(ões) imunogênica(s) desta(s), ouproteínas de fusão compreendendo proteína(s) de anticorpo de gripe, ouporção(ões) de ligação de antígeno desta(s) ativa(s) como anticorpo paratratamento terapêutico e/ou profilático de infecção de gripe. Adicionalmente,a invenção proporciona usos veterinários, tal como antígeno de gripe é ativoem aplicações veterinárias. Em certas concretizações, antígeno(s) de gripee/ou anticorpos pode(m) ser produzido(s) por planta(s) ou porção desta(s)(por exemplo, raiz, célula, broto, linha de célula, planta, etc.) da invenção.Em certas concretizações, os antígenos de gripe providos e/ou anticorpossão expressos em plantas, células de planta, e/ou tecidos de planta (por e-xemplo, brotos, brotos germinados, raízes, cultura de célula, células clonais,linhas de célula clonais, plantas clonais, etc.), e podem ser usados direta-mente de uma planta, ou parcialmente purificados ou purificados na prepa-ração para administração farmacêutica a um indivíduo.
Anticorpos Monoclonais
Vários métodos para geração de anticorpos monoclonais (MAbs)são agora muito bem-conhecidos. As técnicas mais padrão de geração deanticorpo monoclonal geralmente começam ao longo das mesmas linhasconforme aquelas para preparação de anticorpos monoclonais (Antibodies:A. Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, que é aqui in-corporado por referência). Uma resposta de anticorpo monoclonal é iniciadapor imunização de um animal com um fosfolipídeo aniônico imunogênicoe/ou composições aminofosfolipídeas e, quando um nível de titulação dese-jado é obtido, o animal imunizado pode ser usado para gerar MAbs. Tipica-mente, as técnicas de varredura e seleção particulares aqui descritas sãousadas para selecionar anticorpos com procura de propriedades.
MAbs podem ser prontamente preparados através do uso de téc-nicas bem-conhecidas, tais como aquelas exemplificados na Patente dos Esta-dos Unidos 4.196.265, incorporada aqui por referência. Tipicamente, a técnicaenvolve imunização de um animal de controle com uma composição de imuno-gênio selecionada para estimular células de produção de anticorpo. Roedorestais como camundongos e ratos são animais exemplares; contudo, o uso decélulas de coelho, ovelha e rã é possível. O uso de ratos pode proporcionarcertas vantagens (Goding, 1986, pp. 60-61; incorporado aqui por referência),mas camundongos são às vezes preferidos, com o camundongo BALB/c fre-qüentemente sendo mais preferido conforme este é mais rotineiramente usado,e geralmente dá uma percentagem mais alta de fusões estáveis.
Em seguida a imunização, células somáticas com o potencialpara produção dos anticorpos desejados, especificamente linfócitos B (célu-las B), são selecionadas na geração de MAb e fusão com células de umacélula de mieloma imortal, geralmente uma da mesma espécie como o ani-mal que foi imunizado. As linhas de célula de mieloma para uso nos proce-dimentos de fusão de produção de hibridoma são tipicamente de produçãosem anticorpo, têm alta eficiência de fusão, e deficiências de enzima quetornam então incapazes de crescerem em certo meio seletivo que suporta ocrescimento de somente as células de fusão desejadas (hibridomas). Qual-quer um de um número de células de mieloma pode ser usado, conformesão conhecidos àqueles versados na técnica (Goding, pp. 65-66, 1986;Campbell, pp. 75-83, 1984; cada incorporado aqui por referência). Por e-xemplo, onde o animal imunizado é um camundongo, o mesmo pode usarP3-X63/Ag8, X63-Ag8.653, NS1/1.Ag4. 1, Sp210-Ag14, FO, NOS/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 e S194/5XX0 Bul; para ratos, pode-se usarR210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F, 4B210, ou uma das linhas de célula decamundongo listadas acima; e U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 eUC729-6, são todos úteis em conjunto com fusões de célula humana.
Esta cultura proporciona uma população de hibridomas da qualhibridomas específicos são selecionados, seguido por diluição em série eclonagem em linhas de produção de anticorpo individuais, que podem serpropagadas indefinidamente para produção de anticorpo.Os MAbs produzidos são geralmente adicionalmente purifica-dos, por exemplo, usando-se filtração, centrifugação, e vários métodos cro-matográficos, tais como HPLC ou cromatografia de afinidade, todas dasquais técnicas de purificação são bem-conhecidas àqueles versados na téc-nica. Estas técnicas de purificação envolvem cada fracionamento para sepa-rar o anticorpo desejado de outros componentes de uma mistura. Métodosanalíticos particularmente adequados para a preparação de anticorpos inclu-em, por exemplo, cromatografia de proteína A-Sepharose e/ou proteína-G-Sepharose.
Fragmentos de Anticorpo e Derivados
Indiferente da fonte do anticorpo original contra uma neuramini-dase, ou do anticorpo intacto, multímeros de anticorpo, ou qualquer uma deuma variedade de regiões de ligação de antígeno funcionais do anticorpo,podem ser usados na presente invenção. Regiões funcionais exemplaresincluem fragmentos de scFv, Fv1 Fab', Fab e F(ab').sub.2 de anticorpos.Técnicas para preparação de tais constructos são bem-conhecidas àquelesversados na técnica, e são adicionalmente exemplificados aqui.
A escolha de constructo de anticorpo pode ser influenciada porvários fatores. Por exemplo, meia-vida prolongada pode resultar da readsor-ção ativa de anticorpos intactos dentro do rim, uma propriedade da peça Fcde imunoglobulina. Anticorpos baseados em IgG1 portanto, são esperadosexibir folga de sangue mais baixa do que contrapartes de Fab'. Contudo,composições baseadas em fragmento Fab' exibirão geralmente melhor ca-pacidade de penetração no tecido.
Fragmentos de anticorpo podem ser obtidos por proteólise daimunoglobulina total por papaína tiolprotease não-específica. A digestão depapaína produz dois fragmentos de ligação de antígeno idênticos, denomi-nados "fragmentos Fab", cada com um local de ligação de antígeno simples,e um "fragmento Fc" residual. As várias frações são separadas por proteínaA-Sepharose ou cromatografia de troca de íon.
O procedimento usual para preparação de fragmentos deF(ab').sub.2 de IgG de coelho e origem humana é proteólise limitada pelapepsina de enzima. O tratamento de pepsina de anticorpos intactos produzum fragmento de F(ab').sub.2 que tem dois locais de combinação de antíge-no e é ainda capaz de antígeno de ligação cruzada.
Um fragmento Fab contém o domínio constante da cadeia leve eo primeiro domínio constante (CHI) da cadeia pesada. Os fragmentos Fab'diferem dos fragmentos Fab pela adição de uns poucos resíduos no terminalcarbóxi do domínio de cadeia pesada CH1, incluindo uma ou mais cisteí-na(s) a partir da região de ligação de anticorpo. Os fragmentos de anticorpode F(ab').sub.2 foram originalmente produzidos como pares de fragmentosde Fab' que têm cisteínas de ligação entre eles. Outros acoplamentos quími-cos de fragmentos de anticorpo são conhecidos.
Um fragmento "Fv" é o fragmento de anticorpo mínimo que con-tém um reconhecimento completo de antígeno, e local de ligação. Esta regi-ão consiste em um dímero de uma cadeia pesada e um domínio variável decadeia leve em associação con-covalente apertada. É nesta configuraçãoque três regiões hipervariáveis de cada domínio variável interage para definirum local de ligação de antígeno na superfície do dímero Vh - VL. Coletiva-mente, seis regiões hipervariáveis conferem especificidade de ligação deantígeno ao anticorpo. Contudo, mesmo um domínio variável simples (oumetade de um Fv compreendendo somente três regiões hipervariáveis es-pecíficas para um antígeno) tem a capacidade de reconhecer e ligar antíge-no, embora em uma afinidade mais baixa do que o local de ligação total.
"Fv de cadeia simples" ou "fragmentos de anticorpo "scFv" (ago-ra conhecidos como "cadeias simples") compreendem o domínio Vh e Vl deum anticorpo, no qual estes domínios estão presentes em uma cadeia depolipeptídeo simples. Geralmente, o polipeptídeo de Fv compreende adicio-nalmente um Iigante de polipeptídeo entre domínios Vh e Vl que capacitamsFv a formar a estrutura desejada para ligação de antígeno.
As seguintes patentes são incorporadas aqui por referência paraa proposta de ainda adicionalmente suplementar os presentes ensinamentoscom relação à preparação e uso de regiões funcionais de ligação de antíge-no de anticorpos, incluindo fragmentos scFv, Fv, Fab', Fab e F(ab').sub.2 deanticorpos: Patentes dos Estados Unidos 5.855.866; 5.877.289; 5.965.132;6.093.399; 6.261.535 e 6.004.555. WO 98/45331 também é incorporado aquipor referência para proposta incluindo ainda adicionalmente descrever e en-sinar a preparação de regiões de determinação variável, hipervariável e decomplementaridade (CDR) de anticorpos.
"Diacorpos" são pequenos fragmentos de anticorpo com dois lo-cais de ligação de antígeno, cujos fragmentos compreendem um domíniovariável de cadeia pesada (Vh) ligado a um domínio variável de cadeia leve(Vl) na mesma cadeia de polipeptídeo (VH - VL). Pelo uso de um Iigante queé muito curto para permitir emparelhamento entre dois domínios na mesmacadeia, os domínios são forçados a emparelharem com os domínios decomplementaridade de outra cadeia, e criarem dois locais de ligação de an-tígeno. Diacorpos são descritos em EP 404.097 e WO 93/11161, cada espe-cificamente incorporado aqui por referência. "Anticorpos lineares" que po-dem ser biespecíficos ou mono-específicos, compreendem um par de seg-mentos Fd em tandem (V.sub.H-C.sub.H1-V.sub.H-C.sub.H1) que forma umpar de regiões de ligação de antígeno, conforme descrito (ver, por exemplo,Zapata et al., 1995, incorporado aqui por referência).
No uso de um fragmento Fab' e fragmento de ligação de antíge-no, com os benefícios auxiliares na penetração do tecido, pode-se derivarvantagens adicionais de modificação do fragmento para aumentar sua vida-útil. Uma variedade de técnicas pode ser empregada, tais como manipulaçãoou modificação da própria molécula de anticorpo, e conjugação a transporta-dores inertes. Qualquer conjugação para a proposta única de aumento demeia-vida, preferivelmente do que para distribuir um agente a um alvo, deveser efetuada cuidadosamente naquele Fab', e outros fragmentos são esco-lhidos para penetrar tecidos. Não obstante, conjugação a polímeros sem pro-teína, tal como PEG e similares, é contemplada.
Modificações outras do que conjugação são, portanto, baseadasna modificação da estrutura do fragmento de anticorpo para torná-lo maisestável, e/ou para reduzir a taxa de catabolismo no corpo. Um mecanismopara tais modificações é o uso de D-aminoácidos no lugar de L-aminoácidos.Aqueles versados na técnica compreenderão que a introdução de tais modi-ficações necessita ser seguida por teste rigoroso da molécula resultante pa-ra assegurar que ela ainda retenha as propriedades biológicas desejadas.Modificações de estabilização adicionais incluem o uso da adição de por-ções de estabilização a qualquer N-terminal ou C-terminal, ou ambos, que égeralmente usado para prolongar meia-vida de moléculas biológicas. Pormeio de exemplo somente, pode-se desejar modificar terminais por acetila-ção ou aminação.
Anticorpos Biespecíficos
Anticorpos biespecíficos em geral podem ser empregados, con-siderando-se que um braço se liga a um aminofosfolipídeo ou fosfolipídeoiônico, e o anticorpo biespecífico é fixado, em um local distinto a partir dolocal de ligação de antígeno, a um agente terapêutico.
Em geral, a preparação de anticorpos biespecíficos é bem-conhecida na técnica. Um método envolve a preparação separada de anti-corpos tendo especificidade para o aminofosfolipídeo ou fosfolipídeo iônico,por um lado, e um agente terapêutico, por outro lado. Fragmentos pépticosde F(ab')2 são preparados de dois anticorpos escolhidos, seguido por redu-ção de cada para proporcionar fragmentos de FabsH separados. Grupos SHem um de dois co-participantes a serem acoplados são em seguida alquila-tados com um reagente de ligação cruzada, tal como O-fenilenodimaleimidapara proporcionar grupos maleimida livre em um co-participante. Este co-participante pode então ser conjugado ao outro por meio de uma ligação detioéter, para dar o heteroconjugado de F(ab')2 desejado. Outras técnicas sãoconhecidas no qual ligação cruzada com SPDP ou proteína A é efetuada, ouum constructo tri-específico é preparado.
Um método para produção de anticorpos biespecíficos é pelafusão de dois hibridomas para formar um quadroma. Conforme aqui usado, otermo "quadroma" é usado para descrever a fusão produtiva de dois hibri-dornas de célula B. Usando-se agora técnicas-padrão, dois anticorpos pro-duzindo hibridomas são fundidos para dar células filhas, e aquelas célulasque tenham mantido a expressão de ambos conjuntos de genes de imuno-globulina clonotipos são, então, selecionadas.
Tecnologias de CDR
Os anticorpos são compreendidos de regiões variáveis e cons-tantes.Ό termo "variável", conforme aqui usado em referência a anticorpos,significa que certas porções dos domínios variáveis diferem extensivamenteem seqüência entre anticorpos, e são usadas na ligação e especificidade decada anticorpo particular para seu antígeno particular. Contudo, a variabili-dade é concentrada em três segmentos denominados "regiões hipervariá-veis", ambos nos domínios variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve.
As porções mais altamente conservadas de domínios variáveissão denominadas a região de estrutura (FR). Domínios variáveis de cadeiaspesada e leve nativas compreendem cada quatro FRs (FR1, FR2, FR3, eFR4, respectivamente), adotando grandemente uma configuração de folha-beta, ligada por três regiões hipervariáveis, que formam laços ligantes, e, emalguns casos, formando parte de estrutura de folha-beta.
As regiões hipervariáveis em cada cadeia são mantidas juntasem proximidade pelas FRs e, com regiões hipervariáveis a partir da outracadeia, contribuem para a formação do local de ligação de antígeno de anti-corpos (Kabat et al., 991, incorporado aqui por referência). Os domíniosconstantes não são envolvidos diretamente na ligação de um anticorpo a umantígeno, mas exibem várias funções executoras, tais como precipitação doanticorpo em toxicidade celular dependente de anticorpo.
O termo "região hipervariável", conforme aqui usado, se refere aresíduos de aminoácido de um anticorpo que são responsáveis por ligaçãode antígeno. A região hipervariável compreende resíduos de aminoácido deuma "região determinante de complementaridade" ou "CDR" (isto é, resíduos24-34 (L1), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no domínio variável de cadeia leve, e 31-35 (H1), 50-56 (H2) e 95-102(H3) no domínio variável de cadeia pesada;Kabat et al., 1991, incorporado aqui por referência), e/ou aqueles resíduosde um "laço hipervariável" (isto é, resíduos 26-32 (L1), 50-52 (L2) e 91-96(L3) no domínio variável de cadeia leve, e 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101(H3) no domínio variável de cadeia pesada). Os resíduos de "estrutura" ou"FR" são aqueles resíduos de domínio variável outros do que os resíduos deregião hipervariável conforme aqui definidos.
O DNA e seqüências de aminoácido deduzidas de cadeias kap-pa Vh e V do anticorpo 2B9 envolvem CDR1-3 de regiões variáveis de ca-deias pesada e leve do anticorpo. À luz da seqüência e outra informaçãoprovida aqui, e do conhecimento da técnica, uma faixa de 2B9 similar e anti-corpos aperfeiçoados e regiões de ligação de antígeno podem agora serpreparadas e são, desse modo, envolvidas pela presente invenção. Seqüên-cias das regiões variáveis de cadeia leve e pesada de anticorpo monoclonal2B9 anti-N1 são apresentadas no Apêndice A.
Em certas concretizações, a invenção proporciona pelo menosuma CDR do anticorpo produzido pelo hibridoma 2B9 a ser depositado. Emalgumas concretizações, a invenção proporciona uma CDR, um anticorpo,ou região de ligação de antígeno destes, que se ligam a pelo menos umaheuraminidase, e que compreendem pelo menos uma CDR do anticorpoproduzido pelo hibridoma 2B9 a ser depositado.
Em uma concretização particular, a invenção proporciona umanticorpo, ou região de ligação de antígeno deste, em que as regiões de es-trutura do anticorpo 2B9 foram mudadas de camundongo para um IgG hu-mano, tal como IgG humano ou subclasse de IgG para reduzir imugenicida-de em seres humanos. Em algumas concretizações, seqüências do anticor-po 2B9 são examinadas para a presença de epítopos de célula T, conformeé conhecido na técnica. A seqüência subjacente pode, em seguida, ser mu-dada para remover epítopos de célula T, isto é, "de-imuniza" o anticorpo.
A disponibilidade de DNA e seqüências de aminoácido de ca-deias kappa Vh e V do anticorpo 2B9 significa que uma faixa de anticorpospode agora ser preparada usando-se tecnologias de CDR. Em particular,mutações aleatórias são produzidas nas CDRs, e produtos classificados pa-ra identificar anticorpos com afinidades mais altas e/ou especificidades maisaltas. Tal mutagênese e seleção é rotineiramente praticada nas técnicas deanticorpo. Ela é particularmente adequada para uso na presente invenção,dada às técnicas de varredura vantajosas aqui descritas. Um modo conveni-ente para gerar tais variantes substitucionais é maturação de afinidade u-sando revelação de fago.
Mistura de CDR e tecnologias de implantação podem ser usa-das com anticorpos da presente invenção, especificamente anticorpos 2B9.
A mistura de CDR insere seqüências de CDR em uma região de estruturaespecífica (Jirholt et ai, 1998, incorporado aqui por referência) As técnicasde implantação de CDR permitem combinação aleatória de seqüências deCDR em uma estrutura principal simples (Soderlind et ai, 1999, 2000, cadaincorporado por referência). Usando-se tais técnicas, seqüências de CDR doanticorpo 2B9, por exemplo, são mutagenizadas para criar uma pluralidadede seqüências diferentes, que são incorporadas em uma seqüência de su-porte, e as variantes de anticorpo resultantes classificadas para característi-cas desejadas, por exemplo, afinidade mais alta.
Anticorpos de Bibliotecas de Phagemid
A tecnologia recombinante agora permite a preparação de anti-corpo tendo uma especificidade desejada de genes recombinantes que codi-ficam uma faixa de anticorpos (Van Dijk et al., 1989; incorporado aqui porreferência). Certas técnicas recombinantes envolvem isolamento de genesde anticorpo por varredura imunológica de bibliotecas de expressão de fagode imunoglobulina combinatoriais preparadas de RNA isolado de baço deum animal imunizado (Morrisson et al., 1986; Winter and Milstein, 1991; Bar-bas et al., 1992; cada um incorporado aqui por referência). Para tais méto-dos, bibliotecas de phagemid de imunoglobulina combinatoriais são prepara-das de RNA isolado de baço de um animal imunizado, e phagemids expres-sando anticorpos apropriados são selecionados por extração usando-se an-tígeno de expressão de células e células de controle. A vantagem desta a-proximação sobre técnicas de hibridoma convencionais incluem aproxima-damente 104 vezes mais anticorpos podem ser produzidos e classificadosem uma etapa simples, e que novas especificidades são geradas por combi-nação de cadeia HeL, que adicionalmente aumenta a percentagem de anti-corpos apropriados gerados.
Um método para geração de um grande repertório de moléculasde anticorpo diversas em bactérias utiliza o lâmbda bacteriófago como o ve-tor (Huse et ai, 1989; incorporado aqui por referência). A produção de anti-corpos usando o vetor lâmbda envolve a clonagem de populações de cadeiapesada e leve de seqüências de DNA em vetores de partida separados. Osvetores são subseqüentemente combinados aleatoriamente para formar umvetor simples que direciona co-expressão de cadeias leve e pesada paraformar fragmentos de anticorpo. A técnica geral de revelação de fago fila-mentoso é descrita (Patente dos Estados Unidos 5.658.727, incorporadaaqui por referência). Em um sentido mais geral, o método proporciona umsistema para a clonagem simultânea e varredura de especificidades de liga-ção de Iigante selecionadas de repertórios de gene de anticorpo usando umsistema de vetor simples. A varredura de membros isolados da bibliotecapara uma capacidade de ligação de Iigante pré-selecionada permite a corre-lação da capacidade de ligação de uma molécula de anticorpo expressa comum meio convencional para isolar um gene que codifica o membro a partir dabiblioteca. Métodos adicionais para varredura de bibliotecas de phagemidsão descritos (Patentes dos Estados Unidos 5.580.717; 5.427.908;5.403.484; e 5.223.409, cada uma incorporada aqui por referência).
Um método para geração e varredura de grandes bibliotecas delocais de combinação de anticorpo totalmente ou parcialmente sintéticos, ouparatopes, utilizam vetores de revelação derivados de fago filamentoso talcomo M13, fl ou fd (Patente dos Estados Unidos 5.698.426, incorporada aquipor referência). Vetores de revelação de fago filamentoso, referidos como"phagemids", produzem grandes bibliotecas de anticorpos monoclonais ten-do imunoespecificidade diversa e nova. A tecnologia usa um domínio de ân-cora de membrana de proteína de revestimento de fago filamentoso comoum meio para ligar produto de gene e gene durante o estágio de montagemde replicação de fago filamentoso, e tem sido usado para a clonagem e ex-pressão de anticorpos de bibliotecas combinatoriais (Kang et ai, 1991; Bar-bas et aí, 1991; cada um incorporado aqui por referência). A biblioteca deexpressão de superfície é classificada para fragmentos Fab específicos queligam moléculas de neuraminidase por procedimentos de isolamento de afi-nidade. Os fragmentos Fab selecionados podem ser caracterizados por se-qüenciamento dos ácidos nucléicos que codificam os polipeptídeos apósamplificação da população de fago.
Um método de produzir diversas bibliotecas de anticorpos eclassificar especificidades de ligação desejáveis é descrito (Patente dos Es-tados Unidos 5.667.988 e 5.759.817, cada uma incorporada aqui por refe-rência). O método envolve a preparação de bibliotecas de moléculas de i-munoglobulina heterodiméricas na forma de bibliotecas de phagemid usan-do-se oligonucleotídeos degenerados e reações de extensão de iniciadorpara incorporar degenerações nas regiões CDR de domínios variáveis decadeia pesada e leve variáveis de imunoglobulina, e revelação de polipeptí-deos mutagenizados na superfície do phagemid. Em seguida, a proteína derevelação é classificada para a capacidade de se ligar a um antígeno pré-selecionado. Uma variação adicional deste método para produção de diver-sas bibliotecas de anticorpos e varredura de especificidades de ligação de-sejáveis é descrito (Patente dos Estados Unidos 5.702.892, incorporada aquipor referência). Neste método, somente seqüências de cadeia pesada sãoempregadas, seqüências de cadeia pesada são randomizadas em todas asposições de nucleotídeo que codificam, ou a região CDRI, ou região hiperva-riável CDRIII, e a variabilidade genética nas CDRs é gerada independentede qualquer processo biológico.
Camundongos Transgênicos Contendo Bibliotecas de Anticorpo Hu-mano
Tecnologia recombinante é disponível para a preparação de an-ticorpos. Em adição às bibliotecas de expressão de fago de imunoglobulinacombinatoriais reveladas acima, uma aproximação de clonagem molecular épara preparar anticorpos de camundongos transgênicos contendo bibliotecasde anticorpo humano. Tais técnicas são descritas (Patente dos Estados Uni-dos 5.545.807, incorporada aqui por referência).
Em um sentido mais geral, estes métodos envolvem a produçãode um animal transgênico que tenha inserido em seu material genético delinha de germe que codifica para pelo menos parte de uma imunoglobulinade origem humana, ou que pode ser rearranjado para codificar uma respostade imunoglobulinas. O material genético inserido pode ser produzido de umafonte humana, ou pode ser produzido sinteticamente. O material pode codifi-car para pelo menos parte de uma imunoglobulina conhecida, ou pode sermodificado para pelo menos parte de uma imunoglobulina alterada.
O material genético inserido é expresso no animal transgênico,resultando na produção de uma imunoglobulina derivada pelo menos emparte do material genético de imunoglobulina humana inserido. O materialgenético inserido pode ser na forma de DNA clonado em vetores procarióti-cos, tais como plasmídeos e/ou cosmídeos. Fragmentos de DNA maioressão inseridos usando vetores de cromossomo artificial de levedura (Burke etai., 1987; incorporado aqui por referência), ou por introdução de fragmentosde cromossomo (Richer et ai, 1989; incorporado aqui por referência). O ma-terial genético inserido pode ser introduzido ao hospedeiro de maneira con-vencional, por exemplo, por injeção ou outros procedimentos em ovos fertili-zados, ou células de haste embriônicas.
Uma vez que um animal transgênico adequado tenha sido pre-parado, o animal é simplesmente imunizado com o imunógeno desejado.Dependendo da natureza do material inserido, o animal pode produzir umaimunoglobulina quimérica, por exemplo, de origem camundongo/humanomisturada, onde o material genético de origem estranha codifica somenteparte da imunoglobulina; ou o animal pode produzir uma imunoglobulina to-talmente estranha, por exemplo, de origem totalmente humana, onde o ma-terial genético de origem estranha codifica uma imunoglobulina total.
Anti-soro policlonal pode ser produzido a partir de animal trans-gênico em seguida a imunização. As células de produção de imunoglobulinapodem ser removidas a partir do animal para produzir a imunoglobulina deinteresse. Geralmente, anticorpos monoclonais são produzidos a partir doanimal transgênico, por exemplo, por fusão de células de baço a partir doanimal com células de mieloma e varredura dos hibridomas resultantes paraselecionar aqueles que produzem o anticorpo desejado. Técnicas adequa-das para tais processos são descritas aqui.Em uma aproximação, o material genético pode ser incorporadono animal de tal modo que o anticorpo desejado é produzido em fluidos cor-póreos, tais como soros ou secreções externas dos animais, tais como leite,colostro ou saliva. Por exemplo, pela inserção in vitro de material genéticoque codifica para pelo menos parte de um imunoglobulina humana em umgene de um mamífero que codifica para uma proteína de leite e, em seguida,introdução do gene em um ovo fertilizado do mamífero, por exemplo, porinjeção, o ovo pode se desenvolver em um mamífero adulto fêmea que pro-duz leite contendo imunoglobulina derivada pelo menos em parte do materialgenético de imunoglobulina humana inserido. O anticorpo desejado pode,então, ser colhido a partir do leite. Técnicas adequadas para efetuar taisprocessos são conhecidas àqueles versados na técnica.
Os animais transgênicos precedentes são usualmente empre-gados para produzir anticorpos humanos de um isotipo simples, mais especi-ficamente um isotipo que é essencial para maturação de célula B, tal comoIgM e, possivelmente, IgD. Outro método para produção de anticorpos hu-manos é descrito nas Patentes dos Estados Unidos 5.545.806; 5.569.825;5.625.126; 5.633.425; 5.661.016; e 5.770.429, cada uma incorporada aquipor referência, no qual animais trangênicos são capazes de se alterarem deum isotipo necessário para desenvolvimento de célula B para outros isotipos.
No método descrito nas Patentes dos Estados Unidos5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016; e 5.770.429, os áci-dos nucléicos de imunoglobulina humanos contidos dentro de um animaltransgênico funcionam corretamente através de toda a trajetória de desen-volvimento de célula B, conduzindo a alteração de isotipo. Conseqüentemen-te, neste método, estes ácidos nucléicos são construídos de modo a produzi-rem alterações de isotipo e um ou mais dos seguintes: (1) expressão especí-fica de alto nível e de tipo de célula, (2) rearranjo de gene funcional, (3) ati-vação de e resposta a exclusão alélica, (4) expressão de um repertório pri-mário suficiente, (5) transdução de sinal, (6) hipermutação somática, e (7)domínio do local de anticorpo ácido nucléico durante a resposta imune.Anticorpos Humanizados
Os anticorpos humanizados geralmente têm pelo menos trêsvantagens potenciais para uso na terapia humana. Primeiro, devido à porçãoexecutora ser humana, eles podem interagir melhor com outras partes dosistema humano, por exemplo, para destruir células-alvo mais eficientemen-te por citotoxicidade dependente de complemento (CDC), ou citotoxicidadecelular dependente de anticorpo (ADCC). Segundo, o sistema imune huma-no não deve reconhecer o anticorpo como estranho. Terceiro, a meia-vida nacirculação humana será similar aos anticorpos humanos que ocorrem natu-ralmente, permitindo que doses menores e menos freqüentes sejam dadas.
Vários métodos para preparação de anticorpos humanos sãoprovidos aqui. Em adição aos anticorpos humanos, anticorpos "humaniza-dos" têm muitas vantagens. Os anticorpos "humanizados" são geralmenteanticorpos quiméricos ou monóclonais mutantes de camundongo, rato,hamster, coelho ou outras espécies, suportando domínios de região constan-te e/ou variável humanos, ou mudanças específicas. Técnicas para geraçãode um assim denominado anticorpo "humanizado" são bem-conhecidas à-queles versados na téçnica.
Um número de métodos tem sido descrito para produzir anticor-pos humanizados. Rearranjo controlado de domínios de anticorpo unidosatravés de ligações de dissulfito de proteína para formar moléculas de prote-ína artificial novas ou anticorpos "quiméricos" pode ser utilizado (Koniecznyet aí., 1981; incorporado aqui por referência). Tecnologia de DNA recombi-nante pode ser usada para construir fusões de gene entre seqüências deDNA que codificam domínios de cadeia leve e pesada variáveis de anticorpode camundongo, e domínios constantes de cadeia pesada e leve de humano(Morrison etal., 1984; incorporado aqui por referência).
Seqüências de DNA que codificam porções de ligação de antí-geno ou regiões de determinação de complementaridade (CDR's) de anti-corpos monoclonais de murina podem ser enxertadas por meio molecularem seqüências de DNA que codificam estruturas de cadeias pesada e levede anticorpo humano (Jones etal., 1986; cada incorporado aqui por referên-cia). Produtos recombinantes expressos são denominados "anticorpos "re-moldados" ou humanizados, e compreendem a estrutura de um anticorpohumano de cadeia leve ou pesada, e porções de reconhecimento de antíge-no, CDR's de um anticorpo monoclonal de murina.
Um método para produção de anticorpos humanizados é descri-to na Patente dos Estados Unidos N0 5.639.641, incorporada aqui por refe-rência. Um método similar para a produção de anticorpos humanizados édescrito nas Patentes dos Estados Unidos 5.693.762; 5.693.761; 5.585.089;e 5.530.101, cada uma incorporada aqui por referência. Estes métodos en-volvem produção de imunoglobulinas humanizadas tendo uma ou mais regi-ões de determinação de complementaridade (CDR's), e possíveis aminoáci-dos adicionais de uma imunoglobulina doadora e uma região de estrutura deuma imunoglobulina humana aceitadora. Cada cadeia de imunoglobulinahumanizada compreende usualmente, em adição às CDR's, aminoácidos apartir da estrutura de imunoglobulina doadora que são capazes de interagi-rem com CDR's para efetuar afinidade de ligação, tal como um ou mais ami-noácidos que são imediatamente adjacentes a uma CDER na imunoglobuli-na doadora, ou aquelas dentro de cerca de 3A conforme prognosticado pelamodelagem molecular. Cadeias pesadas e leves podem cada uma ser de-signada pelo uso de qualquer um, qualquer combinação, ou todos de várioscritérios de posição descritos nas Patentes dos Estados Unidos 5.693.762;5.693.761; 5.585.089; e 5.530.101, cada uma incorporada aqui por referên-cia. Quando combinadas em um anticorpo intacto, as imunoglobulinas hu-manizadas são substancialmente não-imunogênicas em seres humanos, eretêm substancialmente a mesma afinidade como a imunoglobulina doadorapara o antígeno original.
Um método adicional para produção de anticorpos humanizadosé descrito nas Patentes dos Estados Unidos 5.565.332 e 5.733.743, cadauma incorporada aqui por referência. Este método combina o conceito dehumanização de anticorpos com as bibliotecas de phagemid descritas aqui.Em um sentido geral, o método utiliza seqüências a partir do local de ligaçãode antígeno de um anticorpo ou população de anticorpos direcionada contraum antígeno de interesse. Desse modo, para um anticorpo de roedor sim-ples, seqüências compreendendo parte do local de ligação de antígeno doanticorpo podem ser combinadas com repertórios diversos de seqüências deanticorpos humanos que podem, em combinação, criar um local de ligaçãode antígeno completo.
Os locais de ligação de antígeno criados por este processo dife-rem daqueles criados por enxerto de CDR, em que somente a porção deseqüência do anticorpo de roedor original é similarmente para produzir con-tatos com antígeno em uma maneira similar. Seqüências humanas selecio-nadas são similarmente para diferirem em seqüência, e produzirem contatosalternativos com o antígeno daqueles do local de ligação original. Contudo,restrições impostas pela ligação da porção de seqüência original para antí-geno e formas do antígeno e seus locais de ligação de antígeno, são simi-larmente para acionar novos contatos de seqüências humanas para a mes-ma região, ou epítopo do antígeno. Este processo tem sido, portanto, deno-minado "seleção impressa de epítopo", ou "EIS".
Partindo-se de um anticorpo de animal, um processo resulta naseleção de anticorpos que são anticorpos parcialmente humanos. Tais anti-corpos podem ser suficientemente similares em seqüência a anticorpos hu-manos a serem usados diretamente em terapia, ou após alteração de unspoucos resíduos chaves. Em EIS, os repertórios de fragmentos de anticorpopodem ser revelados na superfície de fase filamentosa e genes que codifi-cam fragmentos com atividades de ligação de antígeno selecionadas pelaligação do fago ao antígeno.
Ainda métodos adicionais para humanização de anticorpos con-templados para uso na presente invenção são descritos nas atentes dos Es-tados Unidos 5.750.078; 5.502.167; 5.705.154; 5.770.403; 5.698.417;5.693.493; 5.558.864; 4.935.496; e 4.816.567, cada uma incorporada aquipor referência.
Conforme discutido nas técnicas acima, o advento de métodosde biologia molecular e tecnologia recombinante, é agora possível produziranticorpos para uso na presente invenção por meios recombinantes e, dessemodo, gerar seqüências de gene que codificam para seqüências de aminoá-cido encontradas na estrutura de polipeptídeo de anticorpos. Isto tem permi-tido a pronta produção de anticorpos tendo seqüências características deanticorpos inibitórios de espécies e fonte diferentes, conforme discutido aci-ma. De acordo com o precedente, os anticorpos úteis nos métodos da pre-sente invenção são anticorpos antineuraminidase, especificamente anticor-pos cuja especificidade é em direção ao mesmo epítopo de neuraminidasecomo 2B9, e inclui todas as variantes terapeuticamente ativas e fragmentosde ligação de antígeno destas se produzidas por métodos recombinantes, oupor síntese direta dos polipeptídeos de anticorpo.
A presente invenção proporciona plantas, células de planta, etecidos de planta que expressam antígeno(s) de gripe que mantêm atividadefarmacêutica quando administrados a um indivíduo em necessidade deste.
Em certas concretizações, os indivíduos incluem vertebrados, (por exemplo,mamíferos, tais como humanos). De acordo com a presente invenção, osindivíduos incluem indivíduos veterinários, tais como bovinos, ovinos, cani-nos, felinos, etc. Em certos aspectos, uma planta comestível ou porção des-ta (por exemplo, broto, raiz) é administrada oralmente a um indivíduo emuma quantidade terapeuticamente efetiva. Em alguns aspectos, um ou maisantígeno(s) de gripe é (são) provido(s) em uma preparação farmacêutica,conforme descrito aqui.
Composições Terapêuticas e Usos
De acordo com a presente invenção, o tratamento de um indiví-duo com um anticorpo de gripe é pretendido para induzir um efeito fisiológi-co. Um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno deste pode ter propri-edades curativas ou paliativas contra uma enfermidade ou doença, e podeser administrada para aliviar melhora, aliviar, retardar começo de reverso, oudiminuir sintomas ou severidade de uma doença ou enfermidade. Uma com-posição de anticorpo compreendendo um antígeno de gripe pode ter propri-edades profiláticas, e pode ser usado para impedir ou retardar começo deuma doença, ou diminuir a severidade de tal doença, enfermidade, ou condi-ção patológica quando ela aparece. Um efeito fisiológico induzido pelo tra-tamento de um indivíduo com antígeno de acordo com a presente invençãopode incluir uma resposta imune efetiva tal que infecção por um organismo éimpedida.
Em algumas concretizações, composições de anticorpo são dis-tribuídas por vias orais e/ou mucosais. A administração oral e/ou mucosaltem o potencial de impedir a infecção de tecidos mucosais, a abertura princi-pal de infecção para muitas patogenias. A distribuição oral e/ou mucosal po-de iniciar resposta imune sistêmica. Tem sido progresso considerável nodesenvolvimento de sistemas de expressão heterólogos para a administra-cão oral de antígenos que estimulam o sistema imune mucosal, e pode inici-ar imunidade sistêmica. Esforços prévios na distribuição de vacina oral, con-tudo, têm demonstrado um requerimento de quantidades consideráveis deantígeno em alcançar eficiência. Desse modo, a produção econômica degrandes quantidades de anticorpo alvo ou fragmento(s) de ligação de antí-geno destes é um pré-requisito para a criação de vacinas orais efetivas. Odesenvolvimento de plantas que expressam anticorpo, incluindo antígenostermoestáveis, representa uma aproximação mais realísticas a tais dificulda-des.
As preparações farmacêuticas da presente invenção podem seradministradas em uma ampla variedade de modos ao indivíduo, tais como,por exemplo, oral, enteral, nasal, parenteral, intramuscularmente ou intrave-nosa, retal, vaginal, tópica, ocular, pulmonarmente, ou por aplicação de con-tato. Em certas concretizações, um antígeno de gripe expresso em umaplanta ou porção desta é administrado a um indivíduo oralmente por admi-nistração direta da planta ao indivíduo. Em alguns aspectos, um anticorpo oufragmento de ligação de antígeno deste, expressos em uma planta ou por-ção desta é extraído e/ou purificado, e usado para a preparação de umacomposição farmacêutica. Pode ser desejável formular tais produtos isola-dos para seu uso pretendido (por exemplo, como um agente farmacêutico,composição de anticorpo, etc.). Em algumas concretizações, será desejávelformular os produtos junto com alguns ou todos dos tecidos de planta que osexpressam.Onde é desejável formular o produto junto com o material deplanta, será freqüentemente desejável ter uma planta que seja não tóxica aorecipiente relevante (por exemplo, um humano ou outro animal). Tecido deplanta relevante (por exemplo, células, raízes, folhas) pode simplesmenteser colhido e processado de acordo com técnicas conhecidas na técnica,com devida consideração para manter atividade do produto expresso. Emcertas concretizações da invenção, é desejável ter expressado o antígeno degripe em uma planta comestível (e, especificamente, em porções comestí-veis da planta), de modo que o material pode ser subseqüentemente comi-do. Por exemplo, onde o um anticorpo ou fragmento de ligação de antígenodeste é ativo após distribuição oral (quando corretamente formulado), podeser desejável produzir a proteína de anticorpo em uma porção de planta co-mestível, e para formular o antígeno de anticorpo expresso para distribuiçãooral junto com o algum ou todo do material de planta com o qual a proteínafoi expressa.
O anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno deste (isto é,anticorpo de gripe ou fragmento de ligação de antígeno deste da invenção)provido pode ser formulado de acordo com técnicas conhecidas. Por exem-plo, uma quantidade efetiva de um produto de anticorpo pode ser formuladajunto com um ou mais materiais transportadores farmaceuticamente ade-quados, orgânicos ou inorgânicos, líquido ou sólido. Um anticorpo ou frag-mento de ligação de antígeno deste produzido de acordo com a presenteinvenção pode ser empregado em formas de dosagem tais como comprimi-dos, cápsulas, pastilhas, dispersões, suspensões, soluções, cápsulas, cre-mes, ungüentos, aerosóis, pacotes de pó, soluções líquidas, solventes, dilu-entes, agentes ativos de superfície, agentes isotônicos, agentes de espes-samento ou emulsificante, conservantes, e ligações sólidas, considerando-seque a atividade biológica da proteína não seja destruída por tal forma de do-sagem.
Em geral, as composições podem compreender qualquer deuma variedade de transportador(es) farmaceuticamente aceitável(eis) dife-rente^), adjuvante(s), ou veículo(s), ou uma combinação de um ou maistal(is) transportador(es), adjuvante(s), ou veículo(s). Conforme aqui usado, alinguagem "transportador farmaceuticamente aceitável, adjuvante ou veícu-lo" inclui solventes, meio de dispersão, revestimentos, agentes antibacterici-da ou antifungal, agentes de absorção e retardamento, e similares, compatí-veis com administração farmacêutica. Os materiais que podem servir comotransportadores farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limi-tados a, açúcares, tais como lactose, glicose e sacarose, amidos, tais comoamido de milho e amido de batata; celulose e seus derivados, tais como car-boximetil celulose de sódio, etil celulose e acetato de celulose; tragacantoem pó; malte, gelatina; talco; excipientes, tais como manteiga de cacau eceras de supositório; óleos, tais como óleo de amendoim, óleo de sementede algodão; óleo de girassol; óleo de gergelim; óleo de oliva; óleo de milho eóleo de soja; glicóis, tal como propileno glicol; ésteres, tais como oleato deetila e Iaurato de etila; ágar; agentes de tamponamento, tais como hidróxidode magnésio e hidróxido de alumínio; ácido algínico; água livre de pirogênio;salina isotônica; solução de Ringer; álcool etílico, e soluções tampão de fos-fato, bem como outros lubrificantes não-tóxicos, tais como Iauril sulfato desódio e estearato de magnésio, bem como agentes colorantes, agentes deliberação, agentes de revestimento, agentes de adoçamento, agentes aro-matizantes, e agentes perfumantes, conservantes, e antioxidantes, podemestar presentes na composição, de acordo com o julgamento do formulador(ver também Remington's Pharmaceutical Sciences, Décima Quinta Edição,E. W. martin (Mack Publishing Co., Easton PA, 1975)). Por exemplo, o pro-duto de antígeno de vacina pode ser provido como uma composição farma-cêutica por meio de processos convencionais de produção de granulaçãopor mistura, dissolução, liofilização, ou processos similares.
Componentes Adicionais
As composições podem incluir adicionalmente qualquer adjuvan-te adequado para aumentar a imugenicidade da composição quando admi-nistrada a um indivíduo. Por exemplo, tal(is) adjuvante(s) pode(m) incluir,sem limitação, extratos de Quillaja saponaria (QS), incluindo sub-fraçõespurificadas de grau de alimentação QS, tais como Quil A e QS-21, alum, hi-dróxido de alumínio, fosfato de alumínio, MF59, Malp2, adjuvante de Freundincompleto; adjuvante de Freund completo; lipídeo A 3 De-O-monofosforilacilatado (3D-MPL). Adjuvantes adicionais podem incluir oligonucleotídeosimunomodulatórios, por exemplo, seqüência CpG não-metilatada conformedescrita em WO 96/02555. Combinações de adjuvantes diferentes, tais co-mo aquelas mencionadas aqui acima, são contempladas como proporcio-nando um adjuvante que é um estimulador preferencial de resposta de célulaTH1. Por exemplo, QS21 pode ser formulado junto com 3D-MPL. A razão deQS21:3D-MPL será tipicamente na ordem de 1:10 a 10:1; 1:5 a 5:1; e fre-qüentemente substancialmente 1:1. Em algumas concretizações, a faixa deenergia ótima é 2,5:1 a 1:1 3D-MPL:QS21. Doses de extratos de QS purifi-cados para uso em uma formulação humana são de 0,01 mg a 10 mg porquilograma de peso corpóreo.
Deve ser notado que certas proteínas termoestáveis (por exem-pio, lichenase) podem demonstrar atividade de potencialização de imunor-resposta, tal que o uso de tal proteína se em uma fusão com um antígeno degripe ou separadamente pode ser uso considerado de um adjuvante. Dessemodo, as composições podem adicionalmente compreender um ou mais ad-juvantes. Certas composições podem compreender dois ou mais adjuvantes.Além disso, dependendo da formulação e vias de administração, certos ad-juvantes podem ser desejados em formulações e/ou combinações particula-res.
Em certas situações, pode ser desejável prolongar o efeito deum anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno deste pelo abaixamentoda absorção de um ou mais componentes do produto de anticorpo (por e-xemplo, proteína) que é subcutânea ou intramuscularmente injetada. Istopode ser efetuado pelo uso de uma suspensão líquida de material cristalinoou amorfo com solubilidade pobre em água. A taxa de absorção do produtoentão depende de sua taxa de dissolução, que, por sua vez, pode dependerdo tamanho e forma. Alternativa ou adicionalmente, absorção retardada deum produto parenteralmente administrado por dissolução ou suspensão doproduto em um veículo de óleo. Formas de depósito injetáveis são produzi-das pela formação de matrizes de microcápsulas da proteína em polímerosbiodegradáveis, tais como polilactídeo-poliglicolídeo. Dependendo da razãode produto para polímero e da natureza do polímero particular empregada, ataxa de liberação pode ser controlada. Exemplos de polímeros biodegradá-veis incluem poli(ortoésteres) e poli(anidridos). Formulações injetáveis dedepósito podem ser preparadas por encerramento do produto em Iiposso-mos ou microemulsões, que são compatíveis com os tecidos do corpo. Veí-culos de distribuição poliméricos alternativos podem ser usados para formu-lações orais. Por exemplo, polímeros biocompatíveis biodegradáveis, taiscomo etileno vinil acetato, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, polior-toésteres e ácido poliláctico, etc., podem ser formulados como micropartícu-las, por exemplo, em combinação com um veículo de distribuição polimérico.
Preparações enteralmente administradas de anticorpo podemser introduzidas na forma sólida, semi-sólida, de suspensão e de emulsão, epodem ser compostas com quaisquer transportadores farmaceuticamenteaceitáveis, tais como água, agentes de suspensão, e agentes emulsificantes.Os antígenos podem ser administrados por meio de bombas ou formas deliberação sustentada, especialmente quando administrados como uma me-dida preventiva, de modo a prevenir o desenvolvimento de doença em umindivíduo, ou para melhorar ou retardar doença estabelecida. Compostosativos suplementares, por exemplo, compostos independentemente ativoscontra a doença ou condição clínica a ser tratada, ou compostos que aumen-tam a atividade de um composto da invenção, podem ser incorporados emou administrados com as composições. Agentes aromatizantes e colorantespodem ser usados.
Os produtos de anticorpo, opcionalmente juntos com tecido deplanta, são particularmente bem adequados para administração oral comocomposições farmacêuticas. Formulações líquidas orais podem ser usadas epodem ser de utilidade particular para populações pediátricas. O material deplanta colhido pode ser processado em qualquer de uma variedade de mo-dos (por exemplo, secagem a ar, secagem por congelamento, extração,etc.), dependendo das propriedades do produto terapêutico desejado e suaforma desejada. Tais composições conforme descritas acima podem ser in-geridas oralmente somente, ou ingeridas com alimento ou alimentação, oucom uma bebida. As composições para administração oral incluem plantas;extração das plantas, e proteínas purificadas de plantas infectadas providascomo pós secos, produtos alimentícios, solventes aquosos ou não-aquosos,suspensões ou emulsões. Exemplos de solventes não-aquosos são propile-no glicol, polietileno glicol, óleo vegetal, óleo de peixe, e ésteres orgânicosinjetáveis. Transportadores aquosos incluem água, soluções de água-álcool,emulsões ou suspensões, incluindo solução salina e veículos parenteraismediais tamponados, incluindo solução de cloreto de sódio, solução de dex-trose de Ringer, solução de dextrose mais cloreto de sódio, solução de Rin-ger contendo lactose, ou óleos fixados. Exemplos de pós secos incluemqualquer biomassa de planta que foi secada, por exemplo, secada por con-gelamento, secada em ar, ou secada por atomização. Por exemplo, as plan-tas podem ser secadas a ar por colocação das mesmas em um secador dear comercial a cerca de 120 graus Fahrenheit até que a biomassa contenhamenos do que 5% de umidade por peso. As plantas secas são armazenadaspara processamento adicional como sólidos de massa, ou adicionalmenteprocessadas por moagem a um pó de tamanho de malha desejado. Alterna-tivamente ou adicionalmente, secagem por congelamento pode ser usadapara produtos que são sensíveis a secagem por ar. Os produtos podem sersecados por congelamento pela colocação dos mesmos em um secador avácuo, e secados congelados sob um vácuo até que a biomassa contenhamenos do que 5% de umidade por peso. O material seco pode ser adicio-nalmente processado conforme descrito aqui.
O material derivado de planta pode ser administrado como, umjunto com uma ou mais preparações herbáceas. Alguns exemplos de prepa-rações herbáceas incluem tinturas, extratos (por exemplo, extratos aquosos,extratos de álcool), decocções, preparações secas (por exemplo, secadas aar, secadas por pulverização, ou secadas por congelamento), pós, (por e-xemplo, pó liofilizado), e líquido. Preparações herbáceas podem ser providasem qualquer veículo de distribuição padrão, tais como uma cápsula, com-primido, supositório, dosagem líquida, etc. Aqueles versados na técnica a-preciarão as várias formulações e modalidades de distribuição de prepara-ções herbáceas que podem ser aplicadas a presente invenção.
As linhas de raiz, linhas de células, plantas, extrações, pós, pre-parações secas e proteína purificada ou produtos de ácido nucléico, etc. dainvenção podem estar na forma encapsulada com ou sem um ou mais exci-pientes conforme notado acima. Formas de dosagem sólidas, tais comocomprimidos, drágeas, cápsulas, pílulas e grânulos podem ser preparadascom revestimentos e invólucros, tais como revestimentos entéricos, revesti-mentos de liberação controlada, e outros revestimentos bem-conhecidos natécnica de formulação farmacêutica. Em tais formas de dosagem sólida oagente ativo pode ser misturado com pelo menos um diluente inerte, tal co-mo sacarose, Iactose ou amido. Tais formas de dosagem podem compreen-der, conforme é prática normal, substâncias adicionais outras do que diluen-tes inertes, por exemplo, lubrificantes de comprimido e outros auxiliares decomprimido, tais como um estearato de magnésio e celulose microcristalina.No caso de cápsulas, comprimidos e pílulas, as formas de dosagem podemcompreender agentes de tamponamento. Elas podem opcionalmente conteragentes de opacidade, e podem ser de uma composição que elas liberamo(s) ingrediente(s) ativo(s) somente, em uma certa parte do trato intestinal,e/ou em uma maneira retardada. Exemplos de composições de encrustaçãoque podem ser usadas incluem substâncias poliméricas e ceras.
Em alguns métodos, uma planta ou porção desta expressandoum antígeno de gripe de acordo com a presente invenção, ou biomassa des-tas, é administrada oralmente como alimento medicinal. Tais composiçõescomestíveis são tipicamente consumidas como produto em bruto de comer,se em uma forma sólida, ou por bebida, se na forma líquida. O material deplanta pode ser diretamente ingerido sem uma etapa de processamento an-terior, ou após preparação culinária mínima. Por exemplo, a proteína de va-cina pode ser expressa em um broto que pode ser comido diretamente. Porexemplo, antígenos de vacina podem ser expressos em um broto de alfafa,broto de munguba, ou broto de espinafre, ou broto de folha de alface, etc.Em uma concretização, a biomassa planta pode ser processada, e o materialrecuperado após a etapa de processamento é ingerido.
Métodos de processamento úteis de acordo com a presente in-venção são métodos comumente usados na indústria de alimento e de ali-mentação. Os produtos finais de tais métodos incluem tipicamente umaquantidade substancial de um antígeno expresso, e podem ser convenien-temente comidos ou bebidos. O produto final pode ser misturado com outroalimento ou formas de alimentação, tais como sais, transportadores, intensi-ficadores de sabor, antibióticos, e similares, e consumidos na forma sólida,semi-sólida, de suspensão, de emulsão, ou líquida. Tais métodos podemincluir uma etapa de conservação, tal como, por exemplo, pasteurização,cozimento, ou adição de agentes de conservação e de preservação. Qual-quer planta pode ser usada e processada na presente invenção para produ-zir matéria de planta comível ou bebível. A quantidade de antígeno de gripeem uma preparação derivada de planta pode ser testada por métodos-padrão na técnica, por exemplo, eletroforese de gel, ELISA, ou análise deWestern blot, usando-se uma sonda ou anticorpo específico para o produto.
Esta determinação pode ser usada para padronizar a quantidade de proteínade anticorpo ingerida. Por exemplo, a quantidade de antígeno de anticorpopode ser determinada e regulada, por exemplo, por mistura de bateladas deproduto tendo níveis eficientes de produto de modo que a quantidade de ma-terial a ser bebida ou comida para ingerir uma dose simples pode ser padro-nizada. O ambiente regulável contido da presente invenção, contudo, deveminimizar a necessidade de efetuar tais procedimentos de padronização.
Uma proteína de anticorpo produzida em uma célula planta outecido e comida por um indivíduo pode ser preferivelmente absorvida pelosistema digestivo. Uma vantagem da ingestão de tecido de planta que tenhasido apenas minimamente processado é proporcionar encapsulamento ouseqüestro da proteína em células da planta. Desse modo, o produto podereceber pelo menos alguma proteção de digestão no trato digestivo superiorantes de alcançar o intestino, e uma proporção mais alta de produto ativoseria disponível para percepção.As composições farmacêuticas da presente invenção podem seradministradas terapeuticamente ou profilaticamente. As composições podemser usadas para tratar ou prevenir uma doença. Por exemplo, qualquer indi-víduo que sofre de uma doença, ou que está em risco de desenvolver infec-ção de gripe, pode ser tratado. Será apreciado que um indivíduo pode serconsiderado em risco de desenvolver uma doença sem ter sido diagnostica-do com quaisquer sintomas da doença. Por exemplo, se o indivíduo é co-nhecido como tendo sido, ou para ser pretendido para estar em situaçõescom risco relativamente alto de exposição à infecção de gripe, este indivíduoserá considerado em risco de desenvolver a doença. Similarmente, se mem-bros de uma família de indivíduos, amigos ou parentes foram diagnosticadoscom infecção de gripe, o indivíduo pode ser considerado estar em risco dedesenvolver a doença.
As formas de dosagem líquida para administração oral incluem,mas não estão limitadas a, emulsões farmaceuticamente aceitáveis, micro-emulsões, soluções, suspensões, xaropes e elixires. Em adição aos agentesativos, as formas de dosagem líquida podem conter diluentes inertes comu-mente usados na técnica, tais como, por exemplo, água ou outros solventes,agentes de solubilização e emulsificantes, tais como álcool etílico, álcool i-sopropílico, carbonato de etila, acetato de etila, álcool benzílico, benzoato debenzila, propileno glicol, 1,3-butileno glicol, dimetilformamida, óleos (em par-ticular, óleo de semente de algodão, óleo de amendoim, óleo de milho, óleode germe, óleo de oliva, óleo de rícino, e óleo de gergelim), glicerol, álcooltetrahidrofurfurílico, polietileno glicóis e ésteres de ácido graxo de sorbitan, emisturas destes. Além dos diluentes inertes, as composições orais podemincluir adjuvantes, tais como agentes de umedecimento, agentes emulsifi-cantes e agentes de suspensão, agentes adoçantes, flavorizantes e de per-fume.
As composições para administração retal ou vaginal podem sersupositórios ou enemas de retenção, que podem ser preparados pela mistu-ra das composições desta invenção com excipientes ou transportadoresnão-irritantes adequados, tais como manteiga de cacau, polietileno glicol, ouuma cera de supositório que são sólidos à temperatura ambiente, mas líqui-dos na temperatura do corpo e, portanto, derretem no reto ou cavidade vagi-nal, e liberam a proteína ativa.
As formas de dosagem para administração tópica, transmucosalou transdérmica de uma composição desta invenção incluem ungüentos,pastas, cremes, loções, géis, pós, soluções, pulverizações, inalantes ou em-plastros. O agente ativo, ou preparação deste, é misturado sob condiçõesestéreis com um transportador farmaceuticamente aceitável e quaisquerconservantes ou tampões necessários conforme podem ser requeridos. Paraadministração transmucosal ou transdermal, penetrantes apropriados à bar-reira a ser permeada podem ser usados na formulação. Tais penetrantessão geralmente conhecidos na técnica, por exemplo, para administraçãotransdermal, detergentes, sais de bile, e derivados ácidos fusídicos. A admi-nistração transmucosal pode ser acompanhada através do uso de pulveriza-ções nasais ou supositórios. Para administração transdermal, antígeno, ouuma porção imunogênica deste, podem ser formulados em ungüentos, po-madas, géis ou cremes, conforme geralmente conhecidos na técnica. For-mulação oftálmica, gotas no ouvido e gotas no olho são também contempla-das como estando dentro do escopo desta invenção. Adicionalmente, a pre-sente invenção contempla o uso de emplastros transdermais, que têm a van-tagem adicional de proporcionar distribuição controlada de uma proteína aocorpo. Tais formas de dosagem podem ser produzidas por suspensão oudispensa do produto no meio correto. Intensificadores de absorção podemserem usados para aumentar o fluxo da proteína através da pele. A taxa po-de ser controlada, ou pela provisão de uma membrana de controle de taxa,ou pela dispersão da proteína em uma matriz de polímero ou gel.
As composições da invenção são administradas em tais quanti-dades e por tal tempo conforme é necessário para alcançar o resultado de-sejado. Em certas concretizações da presente invenção, uma "quantidadeterapeuticamente efetiva" de uma composição farmacêutica é aquela quanti-dade efetiva para tratamento, atenuação, ou prevenção de uma doença emum indivíduo. Desse modo, a "quantidade efetiva para tratar, atenuar ou pre-venir doença", conforme usado aqui, se refere a uma quantidade não-tóxica,mas suficiente, da composição farmacêutica para tratar, atenuar ou prevenirdoença em qualquer indivíduo. Por exemplo, a "quantidade terapeuticamen-te efetiva" pode ser uma quantidade para tratar, atenuar ou prevenir infecção(por exemplo, infecção viral, infecção de gripe), etc.
A quantidade exata requerida variará de indivíduo para indiví-duo, dependendo da espécie, idade e condições gerais do indivíduo, do es-tágio da doença, a mistura farmacêutica particular, seu modo de administra-ção, e similares. Antígenos da gripe da invenção, incluindo antígeno(s) queexpressa(m) plantas e/ou preparações destes, podem ser formulados emforma de unidade de dosagem para facilidade de administração e uniformi-dade de dosagem. A expressão "forma de unidade de dosagem", conformeaqui usada, se refere a uma unidade fisicamente distinta de composição devacina apropriada para o paciente a ser tratado. Será compreendido, contu-do, que o uso diário total das composições da presente invenção é tipica-mente decidido por um médico atendente dentro do escopo do julgamentomédico. O nível de dose terapeuticamente efetivo específico para qualquerpaciente particular ou organismo pode depender de uma variedade de fato-res, incluindo a severidade ou risco de infecção; a atividade do compostoespecífico empregado; a composição específica empregada; a idade, pesocorpóreo, saúde geral, sexo do paciente, dieta do paciente, condições far-macocinéticas do paciente, o tempo de administração, via de administração,e taxa de excreção do composto específico empregado; a duração do trata-mento; drogas usadas em combinação ou coincidental com a composição devacina empregada; e fatores similares bem-conhecidos nas técnicas médicas.
Será apreciado que as composições farmacêuticas da presenteinvenção podem ser empregadas em terapias de combinação (por exemplo,combinação de terapias de combinação), isto é, as composições farmacêuti-cas podem ser administradas concorrentemente com, antes de, ou subse-qüente a, um ou mais outros procedimentos de vacinação desejados. Acombinação particular de terapias (por exemplo, vacinas, tratamento tera-pêutico de infecção de gripe) para empregar em um regime de combinaçãolevará em conta compatibilidade dos terapêuticos e/ou procedimentos dese-jados, e o efeito terapêutico desejado a ser alcançado. Será apreciado queas terapias e/ou vacinas empregadas podem alcançar um efeito desejadopara a mesma enfermidade (por exemplo, um antígeno da invenção podeser administrado concorrentemente com outro anticorpo de gripe), ou elespodem alcançar efeitos diferentes.
Kits
Em um aspecto, a presente invenção proporciona um envoltórioou kit farmacêutico incluindo antígenos de gripe de acordo com a presenteinvenção. Em certas concretizações, os envoltórios ou kits farmacêutico in-cluem brotos germinados vivos, entidade clonal ou plantas que produzemum antígeno de gripe de acordo com a invenção, ou preparações, extratos,ou composições farmacêuticas contendo anticorpo em um ou mais recipien-tes preenchidos com opcionalmente um ou mais ingredientes adicionais decomposições farmacêuticas da invenção. Em algumas concretizações, en-voltórios farmacêuticos ou kits incluem composições farmacêuticas compre-endendo antígeno de gripe purificado de acordo com a presente invenção,em um ou mais recipientes opcionalmente preenchidos com um ou mais in-gredientes adicionais de composições farmacêuticas da invenção. Em certasconcretizações, o envoltório farmacêutico ou kit inclui um agente terapêuticoaprovado adicional (por exemplo, anticorpo de gripe, vacina de gripe) parauso como uma terapia de combinação. Opcionalmente associado com tal(is)recipiente(s) pode estar um aviso na forma prescrita por uma agência gover-namental que regula a fabricação, uso ou venda de produtos farmacêuticos,com avisos que refletem aprovação pela agência de fabricação, uso ou ven-da para administração humana.
Os kits são providos que incluem reagentes terapêuticos. Comoum exemplo, mas não limitativo, anticorpo de gripe pode ser provido comoformulações orais e administradas como terapia. Alternativamente ou adicio-nalmente, o anticorpo de gripe pode ser provido em uma formulação injetá-vel para administração. Em algumas concretizações, o anticorpo da gripepode ser provido em uma formulação inalável para administração. Dosesfarmacêuticas ou instruções, portanto, podem ser providas no kit para admi-nistração a um indivíduo que sofre de, ou está em risco de infecção de gripe.
Os exemplos representativos que se seguem são pretendidospara ajudar a ilustrar a invenção, e não são pretendidos para, nem devemser construídos para limitar o escopo da invenção. De fato, várias modifica-ções da invenção e muitas concretizações adicionais destas, em adição à-quelas mostradas e descritas aqui, tornar-se-ão aparentes àqueles versadosna técnica a partir dos conteúdos totais deste documento, incluindo os e-xemplos que se seguem e as referências à literatura científica e de patenteaqui citada. Os exemplos seguintes contêm informação, exemplificação eguia, que podem ser adaptadas à prática desta invenção em suas váriasconcretizações, e os equivalentes destas.
Exemplificação
Exemplo 1. Geração de Constructos de Antígeno
Geração de Seqüências de Antígeno de Neuraminidase de Vírus da Gripe
Seqüências de nucleotídeo que codificam neuraminidase de ca-da de vírus de gripe tipo Vietnam H5N1 (NAV) e Wyoming H3N2(NAW) fo-ram sintetizadas e confirmadas como sendo corretas. O ácido nucléico pro-duzido foi digerido com endonucleases de restrição Sall, locais para quaisforam projetados em qualquer extremidade de domínios de codificação deseqüência. Os fragmentos de DNA resultantes foram fundidos em estruturano terminal C em seqüência que codifica uma molécula transportadora ter-mo-estável projetada.
HAV(N1): SEQ ID N-:27):
GGATCCTTAATTAAAATGGGATTCGTGCTTTTCTCTCAGCITCCTTCTTTCCTT
CTTGTGTCTACTCTTCTTCTTTTCCTTGTGATTTCTCACTCTTGCCGTGCTCAAA
ATGTCGACCTTATGCTTCAGATTGGAAACATGATTTCTATTTGGGTGTCACAC
TCTATTCACACTGGAAACCAGCATCAGTCTGAGCCAATTTCTAACACTAACCT
TTTGACTGAGAAGGCTGTGGCTTCTGTTAAGTTGGCTGGAAACTCTTCTCTTT
GCCCTATTAACGGATGGGCTGTGTACTCTAAGGATAACTCTATTAGGATTGGATCTAAGGGAGATGTGTTCGTGATTAGGGAGCCATTCATTTCTTGCTCTCACCTTGAGTGeeGTACTTTCTTeeTTAeTGAGGGTGGrGTTGTTAACGATAAGCAGTGTAACGGAACTGTGAAGGATAGGTCTCCACACAGGACTCTTATGTCTTGTCCAGTTGGAGAAGCTCCATCTCCATACAACTCTAGATTCGAGTCTGTTGCTTGGAGTGCTTCTGCTTGCCATGATGGAACTTCATGGCTTACTATTGGAATTTCTGGACCAGATAACGGAGCTGTTGCTGTGCTTAAGTACAACGGAATTATTACTGATACCATCAAGTCTTGGAGGAACAACATTCTTAGGACTCAGGAGTCTGAGTGTGCTTGCGTTAACGGATCTTGCTTCACTGTGATGACTGATGGACCATCTAATGGACAGGCTTCTCACAAGATTTTCAAGATGGAGAAGGGAAAGGTTGTGAAGTCTGTGGAACTTGATGCTCCAAACTACCATTACGAGGAGTGTTCTTGCTATCCAGATGCTGGAGAGATTACTTGTGTGTGCCGTGATAATTGGCATGGATCTAACAGGCCATGGGTGTCATTCAATCAGAACCTTGAGTACCAGATTGGTTACATTTGCTCTGGAGTGTTCGGAGATAATCCAAGGCCAAACGATGGAACTGGATCTTGTGGACCAGTGTCATCTAATGGAGCTGGAGGAGTGAAGGGATTCTCTTTCAAGTACGG AAACGGAGTTTGGATTGGAAGGACTAAGTCTACTAACTCTAGGAGTGGATTCGAGATGATTTGGGACCCAAACGGATGGACTGAGACTGATTCTTCTTTCTCTGTGAAGCAGGATATTGTGGCTATTACTGATTGGAGTGGATACTCTGGATCTTTCGTTCAGCACCCAGAGCTTACTGGACTTGATTGCATTAGGCCATGCTTCTGGGTTGAACTTATTAGGGGAAGGCCAAAGGAGTCTACTATTTGGACTTCTGGATCTTCTATTTCTTTCTGCGGAGTGAATTCTGATACTGTGGGATGGTCTTGGCCAGATGGAGCTGAGCTTCCATTCACTATTGATAAGGTCGACCATCATCATCATCACCACAAGGATGAGCTTTGACTCGAG
NAV: (SEQID №: 16):
LMLQIGNMISIWVSHSfflTGNQHQSEPISNTOLLTEKAVASVKLAGNSSLCPrNGWAVYSKDNSIWGSKGDVFVIREPFISCSHLECRTFFLTQGALLNDKHSNGTVKDRSPHRTLMSCPVGEAPSPYNSRFESVAWSASACHDGTSWLTIGISGPDNGAVAVLKYNGHTOTIKSWRlvIMLRTQESECACVNGSCFTVMTDGPSNGQASHKIFK^VKSVELDAPNYHYEECSCYPDAGEITCVCRDNWHGSNRPWVSFNQNLEYQIGYICSGVFGDNPRPNDGTGSCGPVSSNGAGGVKGFSFKYGNGVWIGRTKSTNSRSGFEMIWDPNGWTETOSSFSVKQDIVAITOWSGYSGSFVQHPELTGLDCIRPCFWVELIRGRPKESTIWTSGSSISFCGVNSDTVGWSWPDGAELPFTIDK
NAW(N2): (SEQ ID NQ:28):
GGATCCTTAATTAAAATGGGATTCGTGCTTTTCTCTCAGCITCCTTCTrTCCTTcttgtgtctactcttcttcttttccttgtgatttctcactcttgccgtgctcaaa
atgtcgacaagcagtacgagttcaactctccaccaaacaagcaggttatggtt
tgcgagccaactattattgagaggaacattactgagattgtgtaccttactaa
cactactattgagaaggagatttgcccaaagttggctgagtaccgtaattggt
ctaagccacagtgcaacattactggattcgctccattctctaaggataactca
attaggctttctgctggaggagatatttgggttacaagggagccatacgtttc
ttgcgatccagataagtgctaccagttcgctcttggacaaggaactactctta
acaacgtgcactctaacgatactgtgcacgataggactccat agcgt actctt
ttgatgaacgagcttggagttccattccaccttggaactaagcaagtgtgcat
tgcttggtcatcttcatcttgccacgatggaaaggcttggcttcatgtttgcgt
gactggagatgatgagaacgctactgcttctttcatctacaacggaaggcttg
tggattctattgtttcttggtctaagaagattcttaggactcaggagtctgag
tgtgtgtgcattaacggaacttgcactgtggttatgactgatggatctgcttc
tggaaaggctgatacaaagattcttttcattgaggagggaaagattgtgcac
acttctactctttctggatctgctcagcatgttgaggagtgttcttgctaccca
aggtatccaggagttagatgtgtgtgccgtgataactggaagggatctaaca
ggccaattgtggatattaacattaaggattactctattgtgtcatcttatgtg
tggtctggacttgttggagatactccaaggaagaacgattcttcttcatcttc
acactgccttgatccaaataacgaggagggaggacatggagttaagggatgg
gctttcgatgatggaaacgatgtttggatgggaaggactatttctgagaagtt
gaggagcggatacgagactttcaaagtgattgagggatggtctaacccaaat
tctaagctgcagattaacaggcaagtgattgtggataggggaaacaggagtg
gatactctggaattttctctgtggagggaaagtcttgcattaacagatgcttc
tacgtggagcttattaggggaaggaagcaggagactgaggttttgtggactt
ctaactctattgtggtgttctgcggaacttctggaacttacggaactggatct
tggccagatggagctgatattaaccttatgccaattgtcgaccatcatcacca
tcaccacaaggatgagctttgactcgagNAW: (SEQ ID N9:18):
kqyefnspfnnqvmlceptmrnitc^
tgfapfskdnsirlsaggdrwvtrepyvscdpdkcyqfalgqgtrlnnvhsndtv
hdrtpyrtllmnelgvpfhlgtkqvciawsssschdgkawlhvcvtgddenat
asftyngrlvdswswskkilrtqesecvcingtctwmtdgsasgkadtkilfiee
gkivhtstlsgsaqhveecscyprypgvrcvciudnwkgsnrpivdin
yvcsglvgdtprkmdssssshcldpkneegghgvkgwafddgndvwmgrtise
klrsgyetfkviegwsnpnsklqinrqvivdrgnrsgysgifsvegkscinrcfyv
elirgrkqetevlwtsnsiwfcgtsgtygtgswpogadinlmpi
Geração de Constructos de Antígeno Recombinante
Foram usados vetores de expressão pET, derivados de plasmí-deo pBR322, projetados para levar vantagem das características do genebacteriófago T7 10 que promove transcrição e translação em alto nível.O bacteriófago que codifica polimerase de RNA é altamente específico paraas seqüências de promotor T7, que são raramente encontradas em geno-mas outros do que genoma de fagos T7 (Figura 1). pET-32 foi usado parafusão dos constructos HA e NA na região de laço de uma seqüência de Ii-chenase modificada que tinha sido clonada neste vetor. O domínio catalíticodo gene de lichenase com seqüência PR-1A a montante ("Proteína 1A Rela-cionada à Patogenia"), com um retículo endoplasmático (KDEL), ou uma se-qüência de retenção vacuolar (VAC) e uma etiqueta His6 a jusante, foramclonados entre os locais Pacl e Xholl em um vetor pET-32 modificado (emque a região entre o promotor E7 e o terminador T7 foi excizada). Dessemodo, o pET-PR-LicKM-KDEL e pET-PR-LicKM-VAC foram obtidos (Figura2). O domínio de HA de fragmento de DNA ou NA foi subclonado na porçãode laço (I) de LicKM para dar uma fusão na estrutura de leitura correta paratranslação. Fusões de LicKM-NA foram construídas. O fragmento de DNA deNAW ou NAV foi subclonado no terminal C de LicKM usando um local Sallpara dar uma fusão na estrutura de leitura correta para translação.Exemplo 2. Geração de Vetores de Antígeno
Constructos de antígeno alvos LicKM-NA foram subclonadas novetor viral escolhido (pBI-D4). pBI-D4 é um vetor binário derivado de pBI121no qual o gene relator que codifica para E. coli β-D-glucoronidase (GUS) foisubstituído por um "poliligante" onde, entre os locais Xbal e Saci, um vetorderivado de TMV foi clonado (Figura 3). pBI-D4 é um constructo baseado emTMV na qual um gene estranho a ser expresso (por exemplo, LicKM-HA,LicKM-NA) substitui o gene de proteína de revestimento (CP) de TMV). Ovírus retém o gene TMV 126/183kDa, o gene de proteína de movimento(MP)1 e o promotor de mRNA subgenômico de CP (sgp), que se estende naestrutura de leitura aberta de CP (ORF). O códon de partida para CP sofreumutação. O vírus carece de CP e, portanto, não pode se mover através detoda planta hospedeira via floema. Contudo, o movimento de célula a célulade infecção viral permanece funcional, e o vírus pode se mover vagarosa-mente para as folhas superiores dessa maneira. Um local de clonagem múl-tiplo (PacI-PmeI-AgeI-XhoI) foi projetado na extremidade de sgp para ex-pressão de genes estranhos, e é seguido pela região não-transladada TMV3' (NTR). O promotor 35S é fundido na extremidade 5' da seqüência viral. Aseqüência de vetor é posicionada entre os locais BamHI e Sacl de pBI121. Aribozima de cabeça de martelo é colocada 3' da seqüência viral (Chen et ai,2003, Mol. Breed., 11:287). Estes constructos incluem fusões de seqüênciasque codificam LicKM- HA ou NA, em seqüências que codificam o peptídeode sinal de proteína PR-Ia de tabaco, uma etiqueta 6x His e a seqüênciaâncora de retenção de KDEL, ou seqüência de varredura vacuolar (Figura4). Para constructos que contêm seqüência codificando PR-LicKM-HA(SD)-KDEL, PR-LieKM-HA(GD)-KDEL e PR-LicKM-NA-KDEL, o DNA de codifica-ção foi introduzido como fragmentos Pacl-Xhol em pBI-D4. Além disso, HAW(HA Wyoming), HAV (HA Vietnam), NAW (NA Wyoming), e NAV (NA Viet-nam) foram introduzidos diretamente como fragmentos Pacl-Xhol em pBI-D4. A seqüência de nucleotídeo foi subseqüentemente verificada estenden-do-se sobre as junções de subclonagem dos constructos de expressão final(Figura 5).
Exemplo 3: Geração de Plantas e Produção de AntígenoInfiltração de Agrobacterium de plantas
Sistema de expressão transiente mediado por Agrobacterium al-cançado por infiltração de Agrobacterium pode ser utilizado (Turpen et al.,1993, J. Viroi Methods, 42:227). Folhas saudáveis de N. benthamiana foraminfiltradas com A. rhizogenes contendo vetores virais projetados para ex-pressar LicKM-HA ou LicKM-NA.
A cepa A. rhizogenes A4 (ATCC 43057) foi transformada com osconstructos de pBI-D4-PR-LiKM-HA-(SD)-KDEL, PR-LicKM-HA(GD)-KDEL1e pBI-D4-PR-LicKM-NA-KDEL. Culturas de Agrobacterium foram crescidas einduzidas conforme descrito (Kapila et al., 1997, Plant Sci., 122:101). Umacultura iniciadora de 2 ml (escolhida de uma colônia fresca) foi crescida du-rante a noite em YEB (5 g/l de extrato de carne bovina, 1 g/l de extrato delevedura, 5 g/l de peptona, 5 g/l de sacarose, 2 mM de MgSO4 com 25 pg/mlde kanamicin a 28°C. A cultura iniciadora foi diluída 1:500 em 500 ml de YEBcom 25 pg/ml de kanamicin, 10 mM de 2-4(-morfolino)ácido etanossulfônico(MES) pH 5,6, 2 mM de MgSO4 adicional e 20 pg/ml de acetossiringone. Acultura diluída foi, em seguida, crescida durante a noite a um O.D600 de ~1,7 a28°C. As células foram centrifugadas a 3.000 χ g por 15 minutos e ressuspen-sas em meio de MMA (sais de MS, 10 mM de MES pH 5,6, 20 g/l de sacaro-se, 200 μΜ de acetosiringone) a um 0.D600 2,4, mantidas por 1 hora à tempe-ratura ambiente, e usadas para infiltração de Agrobacterium. Folhas de N.benthamiana foram injetadas com a suspensão de Agrobacterium usando-seuma seringa disponível sem uma agulha. As folhas infiltradas foram colhidas4-7 dias (por exemplo, 6 dias) pós-infiltração. As plantas foram classificadaspara a presença de expressão de antígeno alvo por avaliação de ensaio deatividade de lichenase e análise de imunomanchamento (Figuras 6 e 7). Aanálise de zimograma revelou que expressão de proteínas quiméricas de NAnas raízes de Nicotiana benthamiana transgênicas testadas. A expressão estáassociada com atividade de Iichenase (Figuras 6). A faixa de atividade rela-cionada às proteínas de fusão mostra um peso molecular mais alto do que ocontrole de lichenase, e o mesmo peso molecular do produto expresso apósagro-infiltração, confirmando a presença de todo produto de fusão.
Geração de Raiz Clonal e Linha de Raiz Clonal
Explantes de folha de Nicotiana benthamiana de cm χ 1 cm delargura são obtidos de folhas após esterilização em 0,1% de NH4CI e seis la-vagens em dH20 estéril. Os explantes são levemente danificados com umafaca no lado abacsial e co-cultivados com Agrobacterium rhizogenes, cepaA4, contendo ou a pBID4-Lic-HA-KDEL ou o pBID4-Lic-NA-KDEL. Os explan-tes são incubados por 2 minutos com uma cultura de Agrobacterium durante anoite (O.D. 600 nm=0,8-1), centrifugados por 10 minutos a 3000 rpm a 4°C, eressuspensos em meio de MMA para um OD 600 final = 0,5 na presença de20 mM de acetosiringone. No final da incubação, os explantes foram secadosem papel estéril e transferidos em 0,8% de placas de M S ágar na presençade 1% de glicose, e 20 mM de acetossiringone. As placas foram paralamina-das e mantidas à temperatura ambiente por dois dias. Os explantes são entãotransferidos nas placas de MS na presença de 500 mg/l de Cefotaxin (Cif),100 mg/l de Timentin (Tim) e 25 mg/l de karamicin. Após aproximadamente 5semanas, a geração de raízes transgênicas é obtida de explantes de folha deNicotiana benthamiana transformados com Agrobacterium rhizogenes conten-do os constructos de pBID4-Lic-HA-KDEL e pBID4-LicKM-NA.
Após transformação, raízes com pelos podem ser cortadas e co-locadas em uma linha no meio K3 livre de hormônio sólido. Quatro a seisdias mais tarde as raízes que cresceram mais ativamente são isoladas etransferidas para meio K3 semi-sólido. As raízes selecionadas são cultivadasem um oscilador rotativo a 24°C no escuro, e linhas clonais são isoladas esub-cultivadas semanalmente. As raízes e/ou linhas clonais podem ser clas-sificadas para a presença de expressão de antígeno alvo pela avaliação deensaio de atividade de Iichenase e análise de imunoblot.
Exemplo 4: Produção de Antígeno
Amostras de 100 mg de material de folha infiltrado de N. ben-thamiana foram colhidas em 4, 5, 5 e 7 dias pós-infecção. O tecido fresco foianalisado para expressão de proteína após ser colhido ou coletado a -80°Cpara a preparação de extratos de planta crua subseqüentes, ou para purifi-cação de proteína de fusão.
As amostras frescas foram ressuspensas em PBS frio 1x inibido-res de protease (Roche) em uma razão p/v 1/3 (1 ml/0,3 g de tecido), e moí-das com um pilão. Os homogenados foram fervidos por 5 minutos em tam-pão de carregamento de gel SDS, e então clareados por centrifugação por 5minutos a 12.000 rpm a 4°C. Os sobrenadantes foram transferidos em umtubo fresco e 20 μΙ, 1 μΙ ou suas diluições foram separadas em 12% de SDS-PAGE e analisadas por análise de Western blot usando-se anticorpos poli-clonais de camundongo anti-His6-HA ou anti-lichenase de coelho e/ou poranálise de zimograma para avaliar atividade hidrolítica indicando atividadefuncional de lichenase. A zimografia é um método eletroforético para medi-ção de atividade de enzima. O método é baseado em um gel de sódio dode-cil sulfato impregnado com um substrato que é degradado pela enzima dis-solvida durante o período de incubação. O manchamento do gel revela ativi-dade enzimática como faixas brancas em um pano de fundo vermelho escu-ro. Dentro de uma certa faixa, a intensidade de faixa pode estar relacionadaà quantidade de enzima carregada.
A expressão de HA em plantas Nicotiana benthamiana infiltra-das ou com Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes con-tendo o plasmídeo pBID4-Lic-HA-KDEL conduz a uma faixa específica cor-respondente ao peso molecular da proteína quimérica Lic-HA-KDEL se amobilidade eletroforética de proteína HA na proteína de fusão correspondeao PM teórico (o PM da enzima de Iichenase é cerca de 21-24 kD).
A quantificação da proteína quimérica Lic-HA-KDEL expressa noextrato cru pode ser feita por imunomanchamento ambos nos tecidos manu-almente infiltrados e nos tecidos infiltrados a vácuo.
Purificação de Antíqenos
Folhas de plantas infiltradas com Agrobacterium tumefacienscontendo os constructos de pBID4-Lic-HA-KDEL e pBID4-Lic-NA-KDEL fo-ram moídas por homogeneização. Tampão de extração com inibidores deprotease "livres de EDTA" (Roche) e Triton-X-100 1% foi usado a uma razãode 3 volumes p/v, e oscilado por 30 minutos a 4°C. Os extratos foram clare-ados por centrifugação a 9000 χ g por 10 minutos a 4°C. O sobrenadante foiseqüencialmente filtrado através de tecido Mira, centrifugado a 20.000 χ gpor 30 minutos a 4°C, e filtrado através de um filtro de 0,45 pm, antes depurificação cromatográfica.
O extrato resultante foi cortado usando-se precipitação de sulfa-to de amônia. Brevemente, (NH4)2SO4 foi adicionado ao extrato a 20% desaturação, incubado em gelo por uma hora, e centrifugado a 18.000 χ g por15 minutos. O pélete foi descartada e (NH4)2SO4 adicionado vagarosamenteaté 60% de saturação, incubado em gelo por uma hora, e centrifugado a18.000 χ g por 15 minutos. O sobrenadante foi descartado, e o pélete resul-tante foi ressuspenso em tampão, em seguida mantido em gelo por 20 minu-tos, seguido por centrifugação a 18.000 χ g por 30 minutos, e o sobrenadan-te dializado durante toda noite 10000 volumes de tampão de lavagem.
Proteínas quiméricas Lic-HA-KDEL e Lic-NA-KDEL de His-etiquetadas foram purificadas pelo uso de Ni-NTA sepharose ("ChelatingSepharose Fast Flow Column", Amersham) à temperatura ambiente sob gra-vidade. A purificação foi realizada sob condições de não-desnaturação. Asproteínas foram coletadas como frações de 0,5 ml, que foram unificadas,adicionadas com 20 mM de EDTA, dializadas contra PBS 1X durante a noitea 4°C, e analisadas por SDS-PAGE.
Alternativamente, frações foram coletadas juntas adicionadascom 20 mM de EDTA, dializada contra NaH2PH4 10 mM, durante a noite, a4°C, e purificada por Cromatografia de Troca de Ânion. Para purificação deLic-HA-KDEL e Lic-HA-KDEL, coluna de troca de ânion Q Sepharose de Flu-xo Rápido (Amersham Pharmacia Biosciences) foi usada. Amostras de afini-dade de Lic-HA-KDEL ou Lic-NA-KDEL1 ou proteínas quiméricas purificadasde troca de íon foram separadas em 12% de géis de poliacrilamida, seguidopor manchamento de Coomassie. As membranas foram também eletroforeti-camente transferidas em membranas de nitrocelulose para análise de Wes-tern blot usando-se anticorpo anti-lichenase policlonal e sucessivamentecom peroxidase de IgG anti-coelho-anticorpo conjugado.
As frações coletadas após diálise foram analisadas por imuno-manchamento usando-se ambos pAb α-lichenase e o pAb a-anti-His6. A His-etiqueta foi mantida pelas proteínas quiméricas expressas, e a concentraçãofinal da proteína purificada foi avaliada por software.
Exemplo 5: Derivação de um Anticorpo Monoclonal de Secreção de Hi-brodoma Murina
(Gripe A/Vietnam/03H5N1) (N1BRG-14) N1BRG-14 é um vírusH5N1 derivado por genéticas reversas e reagrupamento na prática de PR8,descrito no documento em anexo a partir do Instituto Nacional de Padrões eControles Biológicos.
Um camundongo fêmea A/J de 10 semanas de idade foi injetadointraperitonealmente com material de vacina expressa por planta compreen-dido de 50 pg de neuraminidase N1 de comprimento total. A proteína solúvelfoi distribuída em 300 μΙ com nenhum adjuvante. Doses idênticas foram da-das 14 dias e 24 dias mais tarde.72 horas em seguida ao segundo impulso, 45 milhões de célulasde baço foram fundidas com 5 milhões de células de mieloma de murinaP3XAg8.653 usando polietileno glicol. As 50 milhões de células fundidas re-sultantes foram revestidas em 5 X 105 células por cavidade em 10 X 96 pla-cas de cavidade. Seleção de HAT (hipoxantina, aminopterin e timidina), se-guida 24 horas mais tarde, e continuada até que ocorressem colônias. Todosos hibridomas de secreção de imunoglobulina foram subclonados por 3 eta-pas de limitação de diluição na presença de HAT.
Os hibridomas potenciais foram classificados em placas de ELI-SA para IgG específico para ou LicKM (500 ng/cavidade) ou GripeA/Vietnam/03 (300 ng de propiolactona-vírus inativado/cavidade). O hibrido-ma 2B9 tinha um sinal específico muito alto. A especificidade deste anticorpomonoclonal foi testada adicionalmente por ELISA contra antígenos expres-sos por planta. O sobrenadante de 106 células, cultivado por 48 horas em2,5 ml de Iscoves minimamente suplementado em meio essencial com 10%de soro bovino fetal, foi fortemente reativo contra NIBRG-14, e neuraminida-se N1, mas não contra neuraminidase N2. O isotipo deste monoclonal tinhaainda que ser definido. Estoques congelados são mantidos em um tanque denitrogênio líquido aqui em seguida etiquetado como "Fraunhofer 2B9". Asseqüências das regiões variáveis de cadeia leve e pesada de anticorpo mo-noclonal 2B9 anti-N1 são apresentadas no Apêndice A.
Exemplo 6: Caracterização de Atividade de Inibição de Anticorpo
Para caracterização de atividade de anticorpo, foi usado um en-saio baseado no protocolo de ensaio de neuraminidase WHO recomendado,com modificações menores. Para cada ensaio, reações foram conduzidasem triplicata e consistiam de:
a. 1 μl de extrato fresco preparado de tecido de planta que tinhasido infiltrado com um vetor de expressão que codifica neuraminidase (N1)carecendo do domínio de transmembrana de terminal N. Para a proposta depreparação de extrato de planta, 1 μΙ de tampão foi usado para cada mg detecido de planta.
b. Nenhum anticorpo (controle positivo), ou um volume de anti-corpo monoclonal (ou Ab αΝ1 [de hibridoma 2B9] ou Ab RSV [anticorpo con-tra proteína RSV viral ocorrida em camundongo] tal que a razão molar deneuraminidase para anticorpo foi 1:1,1:10. 1:20 ou 1:30.
Nota-se que o anticorpo de neuraminidase e anticorpo RSV Fsão do mesmo isotipo (murina IgG 2b). As reações foram incubadas à tem-peratura ambiente por 30 minutos para permitir que a oportunidade dos anti-corpos reconheçam a neuraminidase produzida da planta. As reações foramentão incubadas a 37°C, uma temperatura ótima para atividade de neurami-nidase. O acúmulo de produto (ácido siálico) foi avaliado colormetricamenteem 549 nm usando um espectrofotômetro, e qualificado contra padrões deácido siálico.
A percentagem de inibição de neuraminidase foi calculada u-sando-se a equação:
% de inibição = ([PC-Tr]/PC) χ 100
onde:
PC - atividade de neuraminidase do controle positivoTr - atividade de neuraminidase de combinação anticor-po/neuraminidase.
Uma comparação molar da capacidade do anticorpo em inibir aneuraminidase é representada na Figura 8. A percentagem de inibição deneuraminidase (calculada de acordo com a equação acima) é mostrada noeixo y, e a razão molar de neuraminidase para anticorpo (1:1, 1:10, 1:20 ou1:30) é mostrada no eixo χ como R1, R10, R20 ou R30, respectivamente(Figura 8). Os erros padrões são mostrados para p<0,05.
A inibição de atividade de neuraminidase expressa por planta foivista na presença do anticorpo monoclonal de murina que foi gerada contraesta mesma neuraminidase expressa por planta. Por comparação, a capaci-dade do anticorpo não-relacionado (RSV) inibir a mesma neuraminidaseproduzida pela planta é também mostrada (Figura 8).
De modo a determinar se anti-NA 2B9 é capaz de reconhecerantígenos N1 de cepas de gripe além da cepa da qual o antígeno 2B9 foioriginalmente derivado, foram realizados ensaios de neuraminidase em cin-co outras cepas: três cepas de H5N1 diferentes: A/Vietnam/1203/04, A/HongKong/156/97, e A/lndonesia/05; e uma cepa de H1N1: A/New Caldonia/99.Foi também realizado o ensaio Hl em um cepa de H3N2 (A/Udorn/72) paradeterminar se anti-NA 2B9 era capaz de reconhecer um subtipo diferente deN1.
Nestes experimentos, a inibição de NA foi medida usando-se á-cido 2'-(4-Metilumbeliferil)-a-D-N-acetilneuramínico (MDNA, Figura 9), quelibera uma etiqueta fluorescente quantificável em resposta a atividade desialidase. MDNA tem absorção e emissão de fluorescência máxima de apro-ximadamente 365 e 450, respectivamente, e sinal pode ser detectado fluo-rometricamente com uma sensibilidade tão baixa quanto "IO6 partículas devírus/ml (104 partículas totais) com uma faixa linear ampla de 0-30 vezes dediluições do estoque de vírus. O sistema usado amplifica vírus vivo que foidiluído para a concentração apropriada em tampão de reação (100 mM deacetato de sódio, pH 6,5, 10 mM de CaCI2), e adicionado diretamente à pla-cas contendo diluições 2 vezes em série do anticorpo testado. Devido ao NAativo estar localizado na superfície viral, nenhuma purificação de proteína deNA foi necessário para medir atividade enzimática. O anticorpo foi diluído 2vezes em série, e aliquotado em triplicata em 384 cavidades de microplaca(Tabela 1). O vírus titulado (também diluído em tampão de reação) foi adi-cionado às cavidades da placa, seguido por uma incubação de 30 minutos.Em seguida, MDNA foi diluído em 0,2 mM em tampão de reação, e adicio-nado às cavidades de placa, e a reação foi permitida proceder por 30 minu-tos adicionais. A reação foi cessada com a adição de 200 mM de carbonatode sódio, pH 9,5.Tabela 1. Layout de Planta para Triplicatas de Ensaios de NA
<table>table see original document page 95</column></row><table>
A titulação de cada cepa de vírus amplificada de cultura de célu-la foi realizada antes do ensaio para estabelecer a faixa linear de detecçãode atividade de NA e a concentração de vírus mínima necessária para umajanela de sinal de 10-15. Carboxilato de oseltamivir (Tamiflu®, 2 μΜ) foi usa-do como o fármaco de controle para este ensaio. Carboxilato de oseltamiviré um inibidor específico de atividade de NA de vírus de gripe, e é privada-mente disponível do responsório químico SRJ.
Diluições e controles do anticorpo foram efetuados em ensaiosde triplicata (Tabela 2). As concentrações de anticorpo 1 - 250 μς/ml (volu-me de cavidade final) foram testadas, e oseltamivir carboxilato (2 μΙ de con-centração de cavidade final) foi incluído como um controle de inibição positi-vo. Um resumo dos resultados de 50% para cada cepa de vírus é apresen-tado na Tabela 2. A coluna e gráficos lineares comparando eficiência comoseltamivir carboxilato e demonstrando IC5o são mostrados nas Figuras 10-14. Os números calculados são mostrados no Apêndice B. Os dados brutossão mostrados no apêndice C.
<table>table see original document page 96</column></row><table>
*IC50 = 50% de concentração inibitória
**N/D = não determinado
Listagem de Seqüência
<110> Yusibov, et ai.
<i20> Anticorpos de gripe, composições, e métodos relacionados
<130> 2002645-0117<140> US 11/707.257<141> 13.02.2007<160> 12
<170> Patentln version 3.2<210> 1<211> 449<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Proteínas da gripe<400> 1
Met Asn Pro Asn Gln Lys He Ile Thr lie Gly ser He Cys Met vai1 5 10 15
Thr Gly lie vai ser Leu Met Leu Gln lie Gly Asn Met lie ser lie20 25 30
Trp vai Ser His Ser Ile His Thr Gly Asn Gln His Gln Ser Glu Pro35 40 45He ser Asn Thr Asn Leu Leu Thr Glu Lys Ala vai Ala ser vai Lys
50 55 60
Leu Ala Gly Asn ser Ser Leu Cys Pro lie Asn Gly Trp Ala vai Tyr65 70 75 80
ser Lys Asp Asn ser lie Arg lie Gly ser Lys Gly Asp vai Phe vai
85 90 95
lie Arg Glu Pro Phe lie ser Cys Ser His Leu Glu Cys Arg Thr Phe
100 105 HO
Phe Leu Thr Gln Gly Ala Leu Leu Asn Asp Lys His Ser Asn Gly Thr115 120 125
vai Lys Asp Arg Ser Pro His Arg Thr Leu Met Ser Cys Pro Val Gly
IBO 135 140
Glu Ala Pro Ser Pro Tyr Asn Ser Arg Phe Glu Ser Val Ala Trp Ser145 150 155 160
Ala Ser Ala Cys His Asp Gly Thr Ser Trp Leu Thr Ile Gly Ile Ser
165 170 175
Gly Pro Asp Asn Gly Ala Val Ala vai Leu Lys Tyr Asn Gly Ile Ile
180 185 190
Thr Asp Thr Ile Lys Ser Trp Arg Asn Asn Ile Leu Arg Thr Gln Glu195 200 205
Ser Glu Cys Ala Cys vai Asn Gly ser Cys Phe Thr vai Met Thr Asp
210 215 220
Gly Pro ser Asn Gly Gln Ala Ser His Lys lie Phe Lys Met Glu Lys225 230 235 240
Gly Lys Val Val Lys Ser Val Glu Leu Asp Ala Pro Asn Tyr His Tyr
245 250 255
Glu Glu cys ser Cys Tyr Pro Asp Ala Gly Glu lie Thr Cys Val Cys
260 265 270
Arg Asp Asn Trp His Gly Ser Asn Arg Pro Trp Val Ser Phe Asn Gln275 280 285
Asn Leu Glu Tyr Gln Ile Gly Tyr Ile Cys Ser Gly Val Phe Gly Asp290 295 300Asη Pro Arg Pro Asn Asp Gly Thr Gly ser Cys Gly Pro vai ser Ser305 310 315 320
Asn Gly Ala Gly Gly vai Lys Gly Phe ser Phe Lys Tyr Gly Asn Gly325 330 335
vai Trp Ile Gly Arg Thr Lys Ser Thr Asn ser Arg ser Gly Phe Glu340 345 350
Met lie Trp Asp Pro Asn Gly Trp Thr Glu Thr Asp ser ser Phe Ser
355 360 365
vai Lys Gln Asp lie vai Ala lie Thr Asp Trp Ser Gly Tyr Ser Gly370 375 380
Ser Phe vai Gln His Pro Glu Leu Thr Gly Leu Asp Cys Ile Arg Pro385 390 395 400
Cys Phe Trp vai Glu Leu Ile Arg Gly Arg Pro Lys Glu Ser Thr lie405 410 415
Trp Thr ser Gly Ser ser Ile ser Phe Cys Gly vai Asn ser Asp Thr420 425 430
vai Gly Trp Ser Trp Pro Asp Gly Ala Glu Leu Pro Phe Thr Ile Asp435 440 445
Lys
<210> 2
<211> 469<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Proteínas da gripe<400> 2
Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Ile Thr lie Gly ser vai ser Leu Thr1 5 10 15
Ile Ser Thr Ile Cys Phe Phe Met Gln Ile Ala Ile Leu Ile Thr Thr20 25 30
Val Thr Leu His Phe Lys Gln Tyr Glu Phe Asn Ser Pro Pro Asn Asn35 40 45Gln vai Met Leu Cys Glu Pro Thr lie lie Glu Arg Asn lie Thr Glu
50 55 60
Ile vai Tyr Leu Thr Asn Thr Thr lie Glu Lys Glu lie Cys Pro Lys65 70 75 80
Leu Ala Glu Tyr Arg Asn Trp Ser Lys Pro Gln Cys Asn Ile Thr Gly
85 90 95
Phe Ala Pro Phe ser Lys Asp Asn Ser lie Arg Leu ser Ala Gly Gly
100 105 110
Asp lie Trp vai Thr Arg Glu Pro Tyr vai Ser Cys Asp Pro Asp Lys115 120 125
Cys Tyr Gln Phe Ala Leu Gly Gln Gly Thr Thr Leu Asn Asn Val His
130 135 140
Ser Asn Asp Thr Val His Asp Arg Thr Pro Tyr Arg Thr Leu Leu Met145 150 155 160
Asn Glu Leu Gly Val Pro Phe His Leu Gly Thr Lys Gln vai Cys Ile
165 170 175
Ala Trp Ser Ser Ser Ser Cys His Asp Gly Lys Ala Trp Leu His Val
180 185 190
Cys vai Thr Gly Asp Asp Glu Asn Ala Thr Ala ser Phe lie Tyr Asn195 200 205
Gly Arg Leu vai Asp ser lie vai Ser Trp Ser Lys Lys lie Leu Arg
210 215 220
Thr Gln Glu ser Glu Cys vai Cys lie Asn Gly Thr Cys Thr vai vai225 230 235 240
Met Thr Asp Gly ser Ala ser Gly Lys Ala Asp Thr Lys lie Leu Phe
245 250 255
Ile Glu Glu Gly Lys Ile Val His Thr Ser Thr Leu Ser Gly Ser Ala
260 265 270
Gln His vai Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Arg Tyr Pro Gly vai Arg275 280 285
Cys vai Cys Arg Asp Asn Trp Lys Gly Ser Asn Arg Pro Ile Val Asp290 295 300Ile Asn Ile Lys Asp Tyr ser lie vai Ser Ser Tyr vai Cys ser Gly305 310 315 320
Leu vai Gly Asp Thr Pro Arg Lys Asn Asp Ser Ser Ser ser ser His325 330 335
Cys Leu Asp Pro Asn Asn Glu Glu Gly Gly His Gly vai Lys Gly Trp340 345 350
Ala Phe Asp Asp Gly Asn Asp vai Trp Met Gly Arg Thr lie ser Glu
355 360 365
Lys Leu Arg ser Gly Tyr Glu Thr Phe Lys Val Ile Glu Gly Trp Ser370 375 380
Asn Pro Asn Ser Lys Leu Gln Ile Asn Arg Gln Val Ile Val Asp Arg385 390 395 400
Gly Asn Arg Ser Gly Tyr Ser Gly Ile Phe Ser vai Glu Gly Lys Ser405 410 415
Cys Ile Asn Arg Cys Phe Tyr vai Glu Leu Ile Arg Gly Arg Lys Gln420 425 430
Glu Thr Glu vai Leu Trp Thr ser Asn ser Ile vai Val Phe Cys Gly
435 440 445
Thr ser Gly Thr Tyr Gly Thr Gly ser Trp Pro Asp Gly Ala Asp lie450 455 460
Asn Leu Met Pro Ile465
<210> 3<211> 21<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Proteínas da gripe<400> 3
Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Ile Thr lie Gly Ser lie Cys Met vai1 5 10 15Thr Gly lie vai Ser20
<210> 4<211> 428<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Peptideos da gripe<400> 4
Leu Met Leu Gln Ile Gly Asn Met lie ser Ile Trp vai ser His ser1 5 10 15
lie His Thr Gly Asn Gln His Gln Ser Glu Pro lie Ser Asn Thr Asn
20 25 30
Leu Leu Thr Glu Lys Ala Val Ala Ser Val Lys Leu Ala Gly Asn Ser35 40 45
Ser Leu Cys Pro Ile Asn Gly Trp Ala Val Tyr Ser Lys Asp Asn Ser
50 55 60
lie Arg lie Gly ser Lys Gly Asp vai Phe vai lie Arg Glu Pro Phe65 70 75 80
Ile Ser Cys Ser His Leu Glu Cys Arg Thr Phe Phe Leu Thr Gln Gly
85 90 95
Ala Leu Leu Asn Asp Lys His ser Asn Gly Thr vai Lys Asp Arg Ser
100 105 110
Pro His Arg Thr Leu Met ser Cys Pro vai Gly Glu Ala Pro Ser Pro115 120 125
Tyr Asn Ser Arg Phe Glu ser vai Ala Trp ser Ala ser Ala Cys His
130 135 140
Asp Gly Thr ser Trp Leu Thr lie Gly Ile Ser Gly Pro Asp Asn Gly145 150 155 160
Ala vai Ala Val Leu Lys Tyr Asn Gly Ile Ile Thr Asp Thr Ile Lys
165 170 175Ser Trp Arg Asn Asn Ile Leu Arg Thr Gln Glu Ser Glu Cys Ala Cys
180 185 190
vai Asn Gly ser Cys Phe Thr vai Met Thr Asp Gly Pro Ser Asn Gly195 200 205
Gln Ala ser His Lys lie Phe Lys Met Glu Lys Gly Lys vai vai Lys210 215 220
Ser vai Glu Leu Asp Ala Pro Asn Tyr His Tyr Glu Glu Cys ser Cys225 230 235 240
Tyr Pro Asp Ala Gly Glu lie Thr Cys vai Cys Arg Asp Asn Trp His10 245 250 255
Gly Ser Asn Arg Pro Trp vai Ser Phe Asn Gln Asn Leu Glu Tyr Gln
260 265 270
lie Gly Tyr Ile Cys Ser Gly vai Phe Gly Asp Asn Pro Arg Pro Asn275 280 285
Asp Gly Thr Gly Ser Cys Gly Pro vai ser ser Asn Gly Ala Gly Gly290 295 300
vai Lys Gly Phe Ser Phe Lys Tyr Gly Asn Gly Val Trp Ile Gly Arg305 310 315 320
Thr Lys Ser Thr Asn Ser Arg Ser Gly Phe Glu Met Ile Trp Asp Pro 325 330 335
Asn Gly Trp Thr Glu Thr Asp Ser Ser Phe Ser vai Lys Gln Asp Ile
340 345 350
vai Ala Ile Thr Asp Trp Ser Gly Tyr Ser Gly Ser Phe Val Gln His355 360 365
Pro Glu Leu Thr Gly Leu Asp Cys lie Arg Pro Cys Phe Trp vai Glu370 375 380
Leu Ile Arg Gly Arg Pro Lys Glu Ser Thr Ile Trp Thr Ser Gly Ser385 390 395 400
Ser lie ser Phe Cys Gly vai Asn ser Asp Thr vai Gly Trp ser Trp 405 410 415
pro Asp Gly Ala Glu Leu Pro Phe Thr lie Asp Lys420 425<210> 5
<211> 37
<212> PRT
<213> seqüência Artificial
<220>
<223> peptideos da gripe<400> 5
Met Asn Pro Asn Gln Lys lie Ile Thr ile Gly Ser vai ser Leu Thr1 5 10 15
ile ser Thr Ile Cys Phe Phe Met Gln Ile Ala lie Leu Ile Thr Thr20 25 30
Val Thr Leu His Phe35
<210> 6<211> 432<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Peptideos da gripe<400> 6
Lys Gln Tyr Glu Phe Asn Ser Pro Pro Asn Asn Gln Val Met Leu Cys1 5 10 15
Glu Pro Thr Ile ile Glu Arg Asn ile Thr Glu lie vai Tyr Leu Thr20 25 30
Asn Thr Thr Ile Glu Lys Glu ile Cys Pro Lys Leu Ala Glu Tyr Arg35 40 45
Asn Trp ser Lys Pro Gln Cys Asn ile Thr Gly Phe Ala Pro Phe ser
50 55 60
Lys Asp Asn ser ile Arg Leu ser Ala Gly Gly Asp ile Trp vai Thr65 70 75 80
Arg Glu Pro Tyr vai Ser Cys Asp Pro Asp Lys Cys Tyr Gln Phe Ala85 90 95Leu Gly Gln Gly Thr Thr Leu Asn Asn vai His ser Asn Asp Thr vai
100 105 HO
His Asp Arg Thr Pro Tyr Arg Thr Leu Leu Met Asn Glu Leu Gly vai115 120 125
pro Phe His Leu Gly Thr Lys Gln vai Cys lie Ala Trp Ser Ser ser130 135 140
ser Cys His Asp Gly Lys Ala Trp Leu His vai Cys vai Thr Gly Asp145 150 155 160
Asp Glu Asn Ala Thr Ala ser Phe lie Tyr Asn Gly Arg Leu Val Asp165 170 175
ser lie vai ser Trp ser Lys Lys lie Leu Arg Thr Gln Glu ser Glu
180 185 190
Cys Val Cys Ile Asn Gly Thr Cys Thr Val Val Met Thr Asp Gly Ser195 200 205
Ala ser Gly Lys Ala Asp Thr Lys Ile Leu Phe Ile Glu Glu Gly Lys210 215 220
Ile Val His Thr Ser Thr Leu Ser Gly Ser Ala Gln His Val Glu Glu225 230 235 240
Cys Ser Cys Tyr Pro Arg Tyr Pro Gly Val Arg Cys vai Cys Arg Asp245 250 255
Asn Trp Lys Gly ser Asn Arg Pro lie Val Asp lie Asn lie Lys Asp
260 265 270
Tyr ser Ile vai ser ser Tyr vai Cys ser Gly Leu vai Gly Asp Thr275 280 285
Pro Arg Lys Asn Asp Ser ser ser Ser ser His Cys Leu Asp Pro Asn290 295 300
Asn Glu Glu Gly Gly His Gly vai Lys Gly Trp Ala Phe Asp Asp Gly305 310 315 320
Asn Asp Val Trp Met Gly Arg Thr Ile Ser Glu Lys Leu Arg Ser Gly325 330 335
Tyr Glu Thr Phe Lys vai Ile Glu Gly Trp Ser Asn Pro Asn Ser Lys340 345 350Leu Gln Ile Asn Arg Gln vai Ile vai Asp Arg Gly Asn Arg ser Gly
Tyr ser Gly lie Phe ser vai Glu Gly Lys Ser Cys lie Asn Arg Cys
Phe Tyr vai Glu Leu Ile Arg Gly Arg Lys Gln Glu Thr Glu vai Leu
Trp Thr Ser Asn Ser Ile Val Val Phe Cys Gly Thr Ser Gly Thr Tyr
Gly Thr Gly ser Trp Pro Asp Gly Ala Asp Ile Asn Leu Met Pro Ile
<210> 7<211> 1446<212> DNA
<213> seqüência Artificial
<220>
<223> Neuraminidase do virus da gripe<400> 7
ggatccttaa ttaaaatggg attcgtgctt ttctctcagc ttccttcttt ccttcttgtg 60
tctactcttc ttcttttcct tgtgatttct cactcttgcc gtgctcaaaa tgtcgacctt 120
atgcttcaga ttggaaacat gatttctatt tgggtgtcac actctattca cactggaaac 180
cagcatcagt ctgagccaat ttctaacact aaccttttga ctgagaaggc tgtggcttct 240
gttaagttgg ctggaaactc ttctctttgc cctattaacg gatgggctgt gtactctaag 300
gataactcta ttaggattgg atctaaggga gatgtgttcg tgattaggga gccattcatt 360
tcttgctctc accttgagtg ccgtactttc ttccttactc agggtgctct tcttaacgat 420
aagcactcta acggaactgt gaaggatagg tctccacaca ggactcttat gtcttgtcca 480
gttggagaag ctccatctcc atacaactct agattcgagt ctgttgcttg gagtgcttct 540
gcttgccatg atggaacttc atggcttact attggaattt ctggaccaga taacggagct 600
gttgctgtgc ttaagtacaa cggaattatt actgatacca tcaagtcttg gaggaacaac 660
attcttagga ctcaggagtc tgagtgtgct tgcgttaacg gatcttgctt cactgtgatg 720
actgatggac catctaatgg acaggcttct cacaagattt tcaagatgga gaagggaaag 780
gttgtgaagt ctgtggaact tgatgctcca aactaccatt acgaggagtg ttcttgctat 840
ccagatgctg gagagattac ttgtgtgtgc cgtgataatt ggcatggatc taacaggcca 900tgggtgtcat tcaatcagaa ccttgagtac cagattggtt acatttgctc tggagtgttc 960 ggagataatc caaggccaaa cgatggaact ggatcttgtg gaccagtgtc atctaatgga 1020 gctggaggag tgaagggatt ctctttcaag tacggaaacg gagtttggat tggaaggact 1080 aagtctacta actctaggag tggâttcgag atgatttggg acccaaacgg atggactgag 1140 actgattctt ctttctctgt gaagcaggat attgtggcta ttactgattg gagtggatac 1200 tctggatctt tcgttcagca cccagagctt actggacttg attgcattag gccatgcttc 1260 tgggttgaac ttattagggg aaggccaaag gagtctacta tttggacttc tggatcttct 1320 atttctttct gcggagtgaa ttctgatact gtgggatggt cttggccaga tggagctgag 1380 cttccattca ctattgataa ggtcgaccat catcatcatc accacaagga tgagctttga 1440 ctcgag <210> 8 1446 <211> 1458 <212> DNA <213> seqüência Artificial <220> <223> Neuraminidase do virus da gripe <400> 8 ggatccttaa ttaaaatggg attcgtgctt ttctctcagc ttccttcttt ccttcttgtg 60 tctactcttc ttcttttcct tgtgatttct cactcttgcc gtgctcaaaa tgtcgacaag 120 cagtacgagt tcaactctcc accaaacaac caggttatgc tttgcgagcc aactattatt 180 gagaggaaca ttactgagat tgtgtacctt actaacacta ctattgagaa ggagatttgc 240 ccaaagttgg ctgagtaccg taattggtct aagccacagt gcaacattac tggattcgct 300 ccattctcta aggataactc aattaggctt tctgctggag gagatatttg ggttacaagg 360 gagccatacg tttcttgcga tccagataag tgctaccagt tcgctcttgg acaaggaact 420 actcttaaca acgtgcactc taacgatact gtgcacgata ggactccata ccgtactctt 480 ttgatgaacg agcttggagt tccattccac cttggaacta agcaagtgtg cattgcttgg 540 tcatcttcat cttgccacga tggaaaggct tggcttcatg tttgcgtgac tggagatgat 600 gagaacgcta ctgcttcttt catctacaac ggaaggcttg tggattctat tgtttcttgg 660 tctaagaaga ttcttaggac tcaggagtct gagtgtgtgt gcattaacgg aacttgcact 720 gtggttatga ctgatggatc tgcttctgga aaggctgata caaagattct tttcattgag 780 gagggaaaga ttgtgcacac ttctactctt tctggatctg ctcagcatgt tgaggagtgt 840 tcttgctacc caaggtatcc aggagttaga tgtgtgtgcc gtgataactg gaagggatct 900aacaggccaa ttgtggatat taacattaag gattactcta ttgtgtcatc ttatgtgtgc 960tctggacttg ttggagatac tccaaggaag aacgattctt cttcatcttc acactgcctt 1020gatccaaata acgaggaggg aggacatgga gttaagggat gggctttcga tgatggaaac 1080gatgtttgga tgggaaggac tatttctgag aagttgagga gcggatacga gactttcaaa 1140gtgattgagg gatggtctaa cccaaattct aagctgcaga ttaacaggca agtgattgtg 1200gataggggaa acaggagtgg atactctgga attttctctg tggagggaaa gtcttgcatt 1260aacagatgct tctacgtgga gcttattagg ggaaggaagc aggagactga ggttttgtgg 1320acttctaact ctattgtggt gttctgcgga acttctggaa cttacggaac tggatcttgg 1380ccagatggag ctgatattaa ccttatgcca attgtcgacc atcatcacca tcaccacaag 1440gatgagcttt gactcgag 1458
<210> 9
<211> 452
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Cadeias leve e pesada do anticorpo Monoclonal
<400> 9
atggaatgga gctgggtctt tctctttctc ctgtcagtaa ctgcaggtgt ccactcccag 60 gtccagctgc agcagtctgg agctgagctg gtaaggcctg ggacttcagt gaagatgtcc 120 tgcaaggctg ctggatacac cttcactaac tactggatag gttgggtaaa acagaggcct 180 ggacatggcc ttgagtggat tggagatatt taccctgaaa atgatttttc taactacaat 240 gagaagttca aggacaaggc cacactgact gcagacacat cctccagaac agcctacatg 300 cagctcagca gcctgacatc tgaggactct gccatctatt actgtgtaag agcgaatgag 360 ggctggtact tagatgtctg gggcacaggg accacggtca gtgtctcctc agccaaaaca 420 acacccccac ccgtctatcc attggcccct gg 452
<210> 10
<211> 150
<212> PRT
<21B> Seqüência Artificial
<220>
<223> Cadeias leve e pesada do anticorpo Monoclonal
<400> 10Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly1 5 10 15
vai His ser Gln vai Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu vai Arg20 25 30
Pro Gly Thr Ser vai Lys Met Ser Cys Lys Ala Ala Gly Tyr Thr Phe35 40 45
Thr Asn Tyr Trp lie Gly Trp vai Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu
50 55 60
Glu Trp lie Gly Asp lie Tyr Pro Glu Asn Asp Phe ser Asn Tyr Asn65 70 75 80
Glu Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Arg
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr ser Glu Asp ser Ala lie100 105 HO
Tyr Tyr Cys Val Arg Ala Asn Glu Gly Trp Tyr Leu Asp Val Trp Gly115 120 125
Thr Gly Thr Thr Val Ser Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Pro
130 135 140
vai Tyr Pro Leu Ala Pro145 150
<210> 11<211> 426<212> DNA
<213> seqüência Artificial
<220>
<223> cadeias leve e pesada do anticorpo Monoclonal<400> 11
atgaggtacc cggctcagct tctgaggttg ctgctggtgt ggcttacagg tgccagatgt 60gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgaat ctgtgggaga aactgtcacc 120atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac agttatttag catggtatca gcagaaacag 180ggaaaatctc ctcagctcct ggtctatttt gcaaaaacct tagcagaagg tgtgccatca 240acgttcagtg gcagtggatc aggcacactg ttttctctga agatcaacag cctgcagcct 300gaagattttg ggaattatta ctgtcaacat cattatggca ctccgtacac gttcggaggg 360gggaccaagc tggaaataaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 420tccagt 426
<210> 12<211> 142<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> cadeias leve e pesada do anticorpo Monoclonal<400> 12
Met Arg Tyr Pro Ala Gln Leu Leu Arg Leu Leu Leu Val Trp Leu Thr1 5 10 15
Gly Ala Arg Cys Asp lie Gln Met Thr Gln ser Pro Ala Ser Leu Ser20 25 30
Glu Ser vai Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn35 40 45
Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro
50 55 60
Gln Leu Leu vai Tyr Phe Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly vai Pro Ser65 70 75 80
Thr Phe ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Leu Phe Ser Leu Lys Ile Asn
85 90 95
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Asn Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr100 105 HO
Gly Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg115 120 125
Ala Asp Ala Ala Pro Thr vai ser lie Phe Pro Pro Ser ser130 135 140

Claims (35)

1. Anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação de an-tígeno deste que liga neuraminidase, no qual o anticorpo é capaz de inibiratividade de enzima de neuraminidase.
2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, em que o anti-corpo é um anticorpo IgG.
3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, em que o anti-corpo é um anticorpo lgG2b.
4. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, em que o anti-corpo é um fragmento de ligação de antígeno de um anticorpo.
5. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 4, em que o anti-corpo é um scFv, Fv, Fab', Fab, diacorpo, anticorpo linear, ou fragmento deligação de antígeno F(ab').sub.2 de um anticorpo.
6. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 4, em que o anti-corpo é um CDR, fragmento univalente, anticorpo de domínio simples.
7. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, em que o anti-corpo é um anticorpo humano, humanizado ou parte-humano, ou fragmentode ligação de antígeno deste.
8. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 17, em que o anti-corpo compreende uma região de ligação de antígeno do anticorpo opera-cionalmente fixada a uma estrutura de anticorpo humano, ou região constante.
9. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, em que o anti-corpo é um anticorpo quimérico.
10. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, em que o anti-corpo é um anticorpo biespecífico.
11. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, em que o anti-corpo é um anticorpo recombinante.
12. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, em que o anti-corpo é um anticorpo produzido.
13. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, em que o anti-corpo é preparado por um processo compreendendo imunizar um animalcom neuraminidase purificada e seleção a partir do animal imunizado de umanticorpo que se liga a neuraminidase, e compete efetivamente com o anti-corpo monoclonal pelo hibridoma 2B9 para ligação à neuraminidase.
14. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, em que o anti-corpo tem a capacidade de inibir atividade de enzima neuraminidase.
15. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, em que o anti-corpo é o anticorpo monoclonal produzido pelo hibridoma 2B9.
16. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 15, em que o anticorpo é operacionalmente fixado a pelo menos um agen-te biológico ou agente diagnóstico.
17. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 16, em que o anti-corpo é operacionalmente fixado a pelo menos um primeiro agente que clivaum pró-fármaco substancialmente inativo para liberar um fármaco substanci-almente ativo.
18. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 17, em que o anti-corpo é operacionalmente fixado a fosfatase alcalina que cliva um pró-fármaco-fosfatase substancialmente inativo para liberar um fármaco anti-viralsubstancialmente ativo.
19. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 18, em que o fár-maco anti-viral é um agente anti-gripe.
20. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 16, em que o anti-corpo é operacionalmente fixado a pelo menos um primeiro agente anti-viral.
21. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 20, em que o anti-corpo é operacionalmente fixado a um agente anti-gripe.
22. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 16, em que o anti-corpo é operacionalmente fixado a um agente diagnóstico, de imagem, oudetectável.
23. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 22, em que o anti-corpo é operacionalmente fixado a um composto detectável por raios X, umíon radioativo, ou um isótopo de ressonância de rotação magnética nuclear.
24. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 23, em que o anti-corpo é operacionalmente fixado a: (a) o composto detectável por raios Xbismuto (III)1 ouro (III), lantânio (III) ou chumbo (II); (b) o íon radioativo detec-tável cobre67, gálio67, gálio68, índio111, índio113, iodo123, iodo125, iodo131, mer-cúrio197, mercúrio203, rênio186, rênio188, rubídio97, rubídio103, tecnécio99m ouítrio90; ou (c) o isótopo de ressonância de rotação magnética nuclear cobalto(II), cobre (II), cromo (III), disprósio (III), érbio (III), gadolínio (III), hólmio (III),ferro (II), ferro (III), manganês (II), neodímio (III), níquel (II), samário (III), tér-bio (III), vanádio (II), ou itérbio (III).
25. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 22, em que o anti-corpo é operacionalmente fixado a biotina, avidin ou a uma enzima que geraum produto colorido sob contato com um substrato cromogênico.
26. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 16, em que o anti-corpo é operacionalmente fixado ao agente biológico como uma proteína defusão preparada pela expressão de um vetor recombinante que compreen-de, na mesma estrutura de leitura, um segmento de DNA que codifica o anti-corpo operacionalmente ligado a um segmento de DNA que codifica o agen-te biológico.
27. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 16, em que o anti-corpo é operacionalmente fixado ao agente biológico, via uma ligação biolo-gicamente liberável, ou Iigante seletivamente clivável.
28. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, em que a com-posição é uma composição farmaceuticamente aceitável que compreendeadicionalmente um transportador farmaceuticamente aceitável.
29. Composição, de acordo com a reivindicação 28, em que acomposição farmaceuticamente aceitável é formulada para administraçãoparenteral.
30. Composição, de acordo com a reivindicação 28, em que acomposição farmaceuticamente aceitável é uma formulação de um anticorpoproduzido de planta.
31. Composição, de acordo com a reivindicação 28, em que acomposição farmaceuticamente aceitável é uma formulação encapsulada ouliposomal.
32. Composição, de acordo com a reivindicação 28, em que acomposição compreende adicionalmente um segundo agente terapêutico.
33. Método para tratamento de uma infecção de gripe, compre-endendo administrar a um animal em necessidade deste uma quantidadebiologicamente efetiva da composição como definida em qualquer uma dasreivindicações 1 a 27, tratando, desse modo, a infecção de gripe.
34. Uso de um anticorpo como definido em qualquer uma dasreivindicações 1 a 27, para a diagnose de uma condição devido a infecçãopor um vírus de gripe humana, ou tipificação de um vírus de gripe humana.
35. Ensaio para determinação da presença de vírus de gripehumana em uma amostra usando as substâncias como definidas em qual-quer uma das reivindicações 1 a 27.
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