BRPI0707779A2 - antÍgenos de hpv, composiÇÕes de vacina, e mÉtodos relacionados - Google Patents

Abstract

ANTIGENOS DE HPV, COMPOSIÇÕES DE VACINA, E MÉTODOS RELACIONADOS. A presente invenção refere-se a intersecção dos campos de imunologia e produção de proteína, e, particularmente, a antígenos e vacinas úteis na prevenção de infecção por vírus papiloma humano. São providos antígenos de proteína recombinantes, composições e métodos para a produção e uso de tais antígenos e composições de vacina.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTÍGENOSDE HPV, COMPOSIÇÕES DE VACINA, E MÉTODOS RELACIONADOS".

Pedidos Relacionados

O presente pedido é relacionado a e reivindica prioridade sob 35USC 119(e) a U.S.S.N. 60/773.374, depositado em 13 de fevereiro de 2006(o pedido '374'); os conteúdos totais do pedido '374' sendo incorporados a-qui por referência.

Antecedentes da Invenção

O câncer cervical é o segundo câncer mais comum entre mulhe-res pelo mundo inteiro. Embora a triagem tenha reduzido dramaticamente aincidência desta doença no mundo desenvolvido, em áreas do mundo ondemuitas mulheres não têm acesso a triagem e cuidado ginecológico regula-res, câncer cervical é a segunda somente em relação ao câncer de seio co-mo uma causa de morte relacionada a câncer. Investigações clínicas, mole-culares e epidemiológicos têm vírus papiloma humano (HPV) identificadoscomo a maior causa de câncer cervical e displasia cervical. Virtualmente to-dos os cânceres cervicais (cerca de 99%) contêm os genes de HPVs de altorisco, tipos mais comumente 16, 18, 31 e 45 (Fearly et ai, 1999). Cerca dedoze por cento (12%) de cânceres de fêmea pelo mundo são devido a infec-ção de HPV do colo do útero. Todo ano, cerca de 470.000 casos de câncercervical são diagnosticados pelo mundo, e quase metade das mulheres afli-gidas morrerão. É estimado que HPV 16 é responsável por aproximadamen-te 60% de cânceres cervicais, com HPV-18 acrescentando outros 10%-20%.Outros tipos de alto risco incluem tipos 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59,68 e 73.

Contudo, o HPV pode desempenhar um papel em certos carci-nomas da região da cabeça e pescoço, bem como os melanomas mais mor-tíferos, e talvez outros cânceres (ver, por exemplo, Mellin et ai, 2000, Inter-nai J. Câncer, 89-300; Zumbach et ai, 2000, Internat. J. Câncer, 85:815;Dreau et ai, 2000, Annals Surgery, 231:664; e Soini et ai, 1996, Thorax,51:887).

O tratamento atual de displasia cervical é limitado a procedimen-tos de excisão e ablativos que removem ou destroem o tecido cervical. Estesprocedimentos têm taxas de eficiência de aproximadamente 90%, mas estãoassociados com morbidez e perda. Adicionalmente, os tratamentos cirúrgi-cos removem somente o tecido displástico, deixando o tecido infectado porHPV que parece normal não-tratado (Bell et ai, 2005). É, portanto, desejávelerradicar esta infecção usando uma vacina. A vacinação preventiva de ado-lescentes antes que eles primeiro entre em contato com o HPV é um objeti-vo. Algumas vacinas profiláticas estão atualmente em ensaios clínicos defase final, com resultados encorajadores. Devido ao período de latência Ion-go entre a infecção e o câncer, os benefícios de uma vacinação profilática,em termos de incidência de câncer, seriam visíveis após décadas. Contudo,indivíduos já infectados, bem como pacientes que sofrem de câncer avança-do, também podem se beneficiar de vacinações terapêuticas. A vacinaçãocontra HPV para prevenir infecção e/ou tratar doença maligna pode diminuirsubstancialmente a morbidez e mortalidade de cânceres associados a HPV.Desse modo, existe uma necessidade remanescente de se desenvolver va-cinas aperfeiçoadas adicionais contra HPV que sejam pouco custosas epossam ser prontamente disponíveis a grandes populações. Além disso, odesenvolvimento de vacinas terapêuticas contra HPV capaz de evitar a pro-gressão de lesões pré-existentes e tumores malignos, e, ainda para eliminá-los, será de benefício extraordinário para aqueles afligidos com infecção.

Sumário da Invenção

A presente invenção proporciona vacinas de vírus papiloma hu-mano (HPV) e componentes de vacina produzidos em plantas. Em algumasconcretizações, um ou mais antígenos de vírus de papiloma humano sãogerados como uma proteína de fusão com uma proteína termoestável. Apresente invenção compreende adicionalmente composições de vacina con-tendo antígenos de HPV. Em algumas concretizações, as vacinas de HPVda invenção compreendem pelo menos dois antígenos de HPV diferentes.

Além disso, a invenção proporciona vacinas de vírus papiloma humano(HPV) compreendendo pelo menos dois antígenos de vírus de papiloma hu-manos (HPV) diferentes. Alternativamente ou adicionalmente, as vacinas deHPV da invenção podem compreender um ou mais componentes de planta.

Ainda adicionalmente providos são métodos para a produção e uso dos an-tígenos e composições de vacina da invenção.

Breve Descrição dos Desenhos

Figura 1: Map do plasmídeo pET32. A esquerda superior indica aregião entre o promotor T7 o e terminador T7 necessitando de plasmídeomodificado usado para antígeno-alvo de clonagem.

Figura 2: Produção dos constructos de ρET-PRACS-Lic-KDEL epET-PRACS-Lic-VAC de um vetot pET32 modificado.

Figura 3: Esquemático da organização de vetor pBI121.

Figura 4: Organização esquemática da derivação de plasmídeopBID4 de um vetor pBI após excisão do gene β-glucuronidase (GUS) e aadição de um plasmídeo derivado de TMV.

Figura 5: Esquemático da fusão de E7 e E7GGG em seqüênciade lichenase entre locais Bglll e Hindlll e clonagem subseqüente no vetorpBID4.

Figuras 6A-D: Análise de Western de plantas infiltradas de Agro-bacterium que expressam constructos E7 usando um anticorpo anti-lichenase (6A,C) ou anticorpo anti-6HIS-E7 (6B,D).

Figuras 7A-D1: Análise de Western de plantas infiltradas de A-grobacterium que expressam constructos E7 usando um anticorpo anti-lichenase (7A,C) ou anticorpo anti-6HIS-E7 (7B.D).

Figura 8: Análise de atividade de Iichenase de plantas infiltradasde Agrobacterium que expressam constructos E7 (8A, 8B) ou E7GGG (8C,8D) usando um anticorpo anti-lichenase.

Figuras 9A-D\ (9A) Análise de Western de plantas infiltradas deAgrobacterium que expressam constructos E7GGG usando um anticorpoanti-lichenase. (9B-D) Análise de manchamento de Coomassie de frações deproteína de isolamento através de procedimentos de purificação.

Figura 10: Análise de Zimograma realizada em extratos de raízestransgênicas de Nicotiana benthamiana com Agrobacterium rhizogenes con-tendo pBID4-Lic-E7-KDEL (rotas 1-9) e constructos pBID4-Lic-E7GGG-KDEL (rotas 10,11); via 12 = 150 ng de Iichenase (controle positivo); via 13 =extrato bruto de folhas de Nicotiana benthamiana agro-infiltradas com Agro-bacterium rhizogenes contendo o constructo pBID4-Lic-E7-KDEL.

Figuras 11A-D\ Caracterização e eficiência de candidatos de va-cina produzidos por planta. (11 A) Respostas IgG de soro específico E7. Osdados são apresentados como valores de densidade ótica em 405 nm desoro diluído 1:500. Os dados de animais individuais são mostrados juntocom valores médios. (11B) Análise de ELISPOT de esplenócitos de camun-dongos vacinados. Os dados são apresentados como número médio de pon-tos ± SD por 2 χ 105 esplenócitos. As colunas cinza e negra se referem acélulas estimuladas com ou sem peptídeo CTL E7 específicos, respectiva-mente. (11C) Vacinação profilática contra tumores induzidos por TC-1. Osdados são representados como percentagem de camundongos livres de tu-mor. (11 D) Vacinação terapêutica contra tumores induzidos por TC-1. Osdados são representados como percentagem de camundongos livres de tumor.

Descrição Detalhada da Invenção

A invenção refere-se a antígenos de vírus papiloma humano(HPV) útil na preparação de vacinas contra infecção de HPV, e proteínas defusão compreendendo tais antígenos de HPV operavelmente ligados a prote-ína termoestável. A invenção se refere a métodos de produção de antígenosprovidos, incluindo, mas não limitados a, produção em sistemas de planta.

Adicionalmente, a invenção refere-se a vetores, proteínas de fusão, célulasde planta, plantas e composições de vacina compreendendo os antígenos eproteínas de fusão da invenção. Ainda adicionalmente providos são métodosde indução de resposta imune contra infecção de HPV em um indivíduocompreendendo administrar composições de vacina da invenção a um indivíduo.

Antígenos de HPV

Proteínas de antígeno de vírus de papiloma humano (HPV) dapresente invenção incluem qualquer proteína ou peptídeo de antígeno imu-nogênico capaz de induzir uma resposta imune contra vírus HPV. Geralmen-te, proteínas imunogênicas de interesse incluem antígenos de HPV (por e-xemplo, proteína E6, proteína E7, etc), uma porção imunogênica destas,e/ou uma variante imunogênica destas.

Antígenos de HPV para uso de acordo com a presente invençãopodem incluir proteínas de HPV de comprimento total (por exemplo, E6, E7,etc), ou fragmentos de tais proteínas, onde tais fragmentos retêm atividadeimunológica, e/ou proteínas de fusão compreendendo tais proteínas de HPVde comprimento total ou fragmentos.

Os genes de HPV envolvidos na transformação de células in vi-tro são aqueles que codificam E6 e/ou E7 (Bedell et ai, 1987, J. Virol.,61:3635). (Os mecanismos pelos quais proteínas E6 e E7 podem causartransformação celular foram propostos (Park et al., 1995, Câncer, 76:1902),e referências citadas neste). Baseado na sua capacidade de induzir respostaimunoprotetora contra infecção viral, E7 e E6 são os antígenos primários deinteresse na geração de vacinas. Adicionalmente, os antígenos de HPV po-dem ser úteis na produção de combinação de vacinas de modo a aperfeiçoareficiência de imunoproteção.

E6 é um polipeptídeo pequeno (aproximadamente 15.000 MW)compreendendo domínios de ligação de Zn. Um indício a sua função detransformação foi provido pela observação que a proteína se liga a p53. Aproteína p53 é uma proteína supressora de tumor bem-conhecida que regulanegativamente a profissão de ciclo de célula e, conseqüentemente, cresci-mento e divisão celular. A ligação de E8 a p53 resulta em ubiquitinação eeventual degradação da proteína ulterior, cujo processo envolve outra prote-ína celular denominada "proteína associada E6". Conseqüentemente, célu-las que expressam E6 terão um nível basal reduzido de p53. Os níveis dep53 são elevados em resposta a dano de DNA. Tais níveis aumentados re-sultam na expressão aumentada de p21, um inibidor de kinases dependen-tes de ciclin, cuja proteína media a limitação do ciclo de célula. Este meca-nismo proporciona células com uma janela de tempo dentro da qual elas po-dem reparar o DNA danificado antes de sua replicação, que resultaria norestabelecimento do dano/mutação. A rotação aumentada mediada por E6de p53 pode impedir o mecanismo de operação. Recentemente, foi verifica-do que E6 não afeta somente a regulação de ciclo de célula em virtude deacelerar a degradação de p53, mas também, mais diretamente, pelo blo-queio de p53 de interar com DNA (Thomas etal., 1995, Oncogene, 10:261).

A oncoproteína E7 de HPV é um antígeno específico de tumor, eé envolvida na progressão maligna. E7 é uma proteína de vida curta, que édegrada ambas in vitro e in vivo por trajetória de ubitiquin-protesoma (Reins-tein et ai, 2000). A proteína E7 é uma proteína de fosfoproteína de ligaçãode Zn pequena (aproximadamente 10.000 Mw) de ligação ao produto de ge-ne retinoblasto Rb. Rb é um supressor de tumor que se liga a e inativa o fa-tor de transcrição E2F. O fator ulterior controla a transcrição de um númerode genes relacionados ao crescimento incluindo aqueles que codificam timi-dina kinase, c-myc, dihidrofolato redutase e alfa polimerase de DNA. A for-mação de complexo Rb-E2F impede a expressão dos genes ulteriores nasfases GO e G1 do ciclo de célula, restringindo sua expressão à fase S ondeos complexos Rb-E2F são programados para dissociarem, liberando fator detranscrição ativo E2F. A formação de complexos de Rb-E7 impede a forma-ção dos complexos de Rb-E2F com o resultado de encurtar as pré-fases S,isto é, acelerando a progressão através do ciclo de célula. Tentativas paraproduzir grandes quantidades de proteína E7 recombinante não-fundida deseqüência autêntica em sistemas de expressão eucarióticos têm praticamen-te falhado, principalmente devido a sua rápida degradação (Fernando et ai,1999). Não obstante, algumas vacinas terapêuticas específicas de HPV ba-seadas em E7 são atualmente exploradas em ensaios clínicos de fase Il eIII. Resultados preliminares são promissores, mas ainda necessitam de aper-feiçoamento adicional pela associação com adjuvantes mais apropriadoscapazes de estimular a eficiência de imunidade mediada por célula (Frazer,2004).

Evidência correlativa para a importância destes mecanismos éprovida pelas observações que proteínas E6 de tipos HPV altamente onco-gênicas (por exemplo, HPV 16 e 18) têm afinidades mais altas para p53 doque proteínas correspondentes de tipos não-oncogênicas, e que proteínasΕ7 de tipos altamente oncogênicas têm afinidades mais altas para Rb doque proteínas correspondentes de tipos não-oncogênicas. Desse modo, E6e E7 representam alvos principais para o desenvolvimento de vacina seletivae terapia anticâncer.

Desse modo, a invenção proporciona células de planta e/ouplantas que expressam uma proteína heteróloga (por exemplo, antígeno deHPV). Uma proteína heteróloga da invenção pode ser qualquer antígeno deHPV de interesse, incluindo, mas não limitado a, E6, E7, uma porção de E6,e/ou uma porção de E7. Ácido nucléico de comprimento total e seqüênciasde proteína para E7 e uma E7 modificada de qualquer subtipo são providosem SEQ ID NO:1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, e SEQ ID N04.

Enquanto seqüências de antígenos de HPV exemplares são aquiprovidas, seqüências adicionais de E6 e E7 para várias cepas e subtipos deHPV são conhecidas na técnica, e podem ser identificadas, por exemplo,nas bases de dados tais como o Banco de Gene (GenBank). Ainda adicio-nalmente, as atividades e domínios para cada uma de E6 e E7 são conheci-dos na técnica. Desse modo, será apreciado que qualquer seqüência tendoas características imunogênicas de um domínio de E6 e/ou E7 pode alterna-tivamente ser empregada. Um versado na técnica será prontamente capazde gerar seqüências tendo pelo menos 75%, 80% ou 90% ou mais de identi-dade para os antígenos providos. Em certas concretizações, seqüências deantígeno de antígenos de HPV compreendendo proteínas incluem aquelastendo pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou mais de identidade para se-qüências, ou uma porção destas, em que a proteína de antígeno retém ativi-dade imunogênica. Por exemplo, seqüências tendo identidade suficiente pa-ra antígeno(s) de HPV que retém características imunogênicas são capazesde se ligarem com anticorpos que reagem com antígeno(s) de domínio pro-vido(s) nas mesmas. As características imunogênicas freqüentemente inclu-em três apresentações dimensionais de aminoácidos ou grupos laterais rele-vantes. Um versado na técnica pode identificar prontamente seqüências comdiferenças modestas na seqüência (por exemplo, com diferença nos limitese/ou algumas alternativas de seqüências que, não obstante, preservam ascaracterísticas imunogênicas). Por exemplo, seqüências cujos limites sãopertos de (por exemplo, dentro de cerca de 15 aminoácidos, 14 aminoáci-dos, 13 aminoácidos, 12 aminoácidos, 11 aminoácidos, 10 aminoácidos, 9aminoácidos, 8 aminoácidos, 7 aminoácidos, 6 aminoácidos, 4 aminoácidos,3 aminoácidos, 2 aminoácidos, ou 1 aminoácido) dos limites de domínio de-signados aqui em qualquer extremidade da seqüência de aminoácido desig-nada podem ser consideradas por compreenderem o domínio relevante deacordo com a presente invenção. Desse modo, a invenção contempla o usode uma seqüência de antígeno de HPV para compreender resíduos que seaproximam da designação de domínio. Por exemplo, um domínio de E7 foiprojetado e expresso como uma proteína de fusão de estrutura interna comoum antígeno da invenção (ver Exemplos aqui). Adicionalmente, será apreci-ado que quaisquer domínios, domínios parciais, ou regiões de seqüênciasde aminoácido de antígeno de HPV (por exemplo, E6, E7) que são imuno-gênicos podem ser gerados usando-se os constructos e métodos aqui provi-dos. Ainda adicionalmente, domínios ou subdomínios podem ser combina-dos, separadamente e/ou consecutivamente para produção de antígenos deHPV.

Fusões de Antíaeno com Proteínas Termoestáveis

Em certos aspectos da invenção, são providos polipeptídeos quecompreendem um antígeno de HPV (ou um fragmento ou variante deste)operavelmente ligado a proteína termoestável. Os polipeptídeos de fusão dainvenção podem ser produzidos em qualquer sistema de expressão conhe-cido na técnica. Em certas concretizações, as proteínas de fusão da inven-ção são produzidas em uma planta ou porção desta (por exemplo, planta,célula de planta, raiz, broto, etc).

Enzimas ou outras proteínas que não são encontradas natural-mente em células humanas ou animais são particularmente apropriadas parauso em polipeptídeos de fusão da presente invenção. As proteínas termoes-táveis que, quando fundidas, conferem termoestabilidade ao produto de fu-são, são úteis. A termoestabilidade permite que a proteína produzida mante-nha conformação, e mantenha proteína produzida à temperatura ambiente.Esta característica facilita recuperação fácil, de tempo eficiente e custo efeti-vo do polipeptídeo de fusão. Uma família representativa de enzimas termo-estáveis úteis de acordo com a invenção é a família de glucanohidrolase.

Estas enzimas clivam especialmente ligações 1,4-β glucosídicas que sãoadjacentes às ligações 1,3-β em polissacarídeos ligado misturados (Hahn etai, 1994, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 91:10417). As enzimas são encontra-das em cereais, tais como aveia e cevada, e são também encontradas emum número de fungos e espécies bacteriais, incluindo C. thermocellum (Gol-denkova et ai, 2002, Mol. Biol., 36:698). Desse modo, proteínas termoestá-veis exemplares para uso em polipeptídeos de fusão da presente invençãoincluem enzimas glicosidase; proteínas glicosidase termoestáveis exempla-res incluem aquelas representadas pelos números de acesso no Banco deGene (GeneBank) selecionados de: P29716, P37073, P45798, P40942,P14002, 033830, 043097, P54583, P14288, 052629, P29094, P49067,JC7532, Q60037, P33558, P05117, P04954, Q4J929, 033833, P49425,P06279, P45703, P45702, P40943, P09961, Q60042, AAN05438, A-AN05437, AAN05440, AAN05439 e AAD43138, cada um do qual sendo aquiincorporado por referência. Enzimas Iichenase de uso em proteínas de fusãoda invenção incluem Clostridium thermocellum P29716, Brevibacillus brevisP37073, e Rhodthermus marinus P45798, cada uma das quais sendo incor-poradas aqui por referência em seus números de acesso no banco de Ge-nes (GenBank). As proteínas de fusão representativas ilustradas nos Exem-plos utilizam Iichenase modificada isolada de Clostridium thermoceUus; con-tudo, qualquer proteína termoestável pode ser similarmente utilizada de a-cordo com a presente invenção.

Quando se designam proteínas de fusão e polipeptídeos de a-cordo com a invenção, é desejável, naturalmente, preservar a imunogenici-dade do antígeno. Ainda adicionalmente, é desejável em certos aspectos dainvenção proporcionar constructos que proporcionam termoestabilidade daproteína de fusão. Esta característica facilita a recuperação fácil, de tempoeficiente e de custo efetivo do antígeno-alvo. Em certos aspectos, modelosde fusão de antígeno podem ser selecionados que proporcionam vantagensadicionais, incluindo aumento de imunogenicidade potencial para incorporardeterminantes de vacina múltiplos, ainda carente antes desejável. Dois des-tes sistemas incluem produção de sistemas de raízes clonais e plantas clo-nais, e derivados destes, bem como produção de sistemas de brotos germi-nados.

Planta Clonal

As raízes clonais mantêm vetores de expressão viral de RNA, eproduzem estavelmente proteína alvo uniformemente na raiz total sobre pe-ríodos estendidos de tempo e subculturas múltiplas. Em contraste às plan-tas, onde o gene alvo é eliminado via recombinação durante movimento decélula a célula ou de longa distância, em culturas de raiz, a integridade dovetor viral é mantida e níveis de proteína alvo produzida sobre o tempo sãosimilares àqueles observados durante varredura inicial. As raízes clonaispermitem facilidade de produção de material para formulação oral de antíge-no e composições de vacina. Métodos e reagentes para geração de umavariedade de entidades clonais derivadas de plantas que são úteis para aprodução de antígeno (por exemplo, proteínas de antígeno da invenção) fo-ram descritos anteriormente, e são conhecidos na técnica (ver, por exemplo,Publicação PCT WO 05/81905, que é incorporada aqui por referência). Asentidades clonais incluem linhas de raiz clonal, linhas de célula de raiz clo-nal, linhas de célula de planta clonal, e plantas clonais capazes de produçãode antígeno (por exemplo, proteínas de antígeno da invenção). A invençãoproporciona adicionalmente métodos e reagentes para expressão de polinu-cleotídeo de antígeno e produtos de polipeptídeo em linhas de célula clonalderivadas de vários tecidos de planta (por exemplo, raízes, folhas), e emplantas totais derivadas de células simples (plantas clonais). Tais métodossão tipicamente baseados no uso de vetores de planta viral de vários tipos.

Por exemplo, em um aspecto, a invenção proporciona métodosde obtenção de uma linha de raiz clonal que expressa um polinucleotídeoque codifica antígeno da invenção compreendendo as etapas de: (i) introdu-ção de um vetor viral que compreende um polinucleotídeo que codifica o an-tígeno da invenção em uma planta ou porção desta; e (ii) geração de uma oumais linhas de raiz clonal a partir da planta. As linhas de raiz clonal podemser geradas, por exemplo, pela infecção de uma planta ou porção de planta(por exemplo, uma peça colhida de planta) com um Agrobacterium (por e-xemplo, A. Rhizogenes) que causa formação de raízes com pelos. As linhasde raiz clonal podem ser rastreadas em vários modos para identificar linhasque mantêm vírus, linhas que expressam polinucleotídeos que codificamantígeno da invenção em altos níveis, etc. A invenção proporciona adicio-nalmente linhas de raiz clonal, por exemplo, linhas de raiz clonal produzidasde acordo com os métodos da invenção, e envolve adicionalmente métodosde expressão de polinucleotídeos e produção de polipeptídeos que codificamantígeno da invenção usando as linhas de raiz clonal.

A invenção proporciona métodos de geração de uma linha decélula clonal que expressa um polinucleotídeo que codifica antígeno da in-venção compreendendo etapas de: (i) geração de uma linha de raiz clonal,células da qual contêm um vetor viral cujo genoma compreende um polinu-cleotídeo que codifica antígeno da invenção; (ii) liberação de células indivi-duais a partir da linha de raiz clonal; e (iii) manutenção das células sob con-dições adequadas para proliferação de célula de raiz. A invenção proporcio-na linhas de célula de raiz e métodos de expressão de polinucleotídeos eprodução de polipeptídeos usando linhas de célula de raiz clonal.

Em algumas concretizações, a invenção proporciona métodosde geração de uma linha de célula clonal que expressa um polinucleotídeoque codifica antígeno da invenção compreendendo etapas de: (i) geração deuma linha de raiz clonal, células da qual contêm um vetor viral cujo genomacompreende um polinucleotídeo que codifica antígeno da invenção; (ii) libe-ração de células individuais a partir da linha de raiz clonal; e (iii) manutençãodas células em cultura sob condições apropriadas para proliferação de célulade raiz. A invenção proporciona métodos de geração de uma linha de célulade planta clonal que expressa um polinucleotídeo que codifica antígeno dainvenção compreendendo etapas de: (i) introdução de um vetor viral quecompreende um polinucleotídeo que codifica antígeno da invenção em célu-las de uma linha de célula de planta mantida na cultura; e (ii) enriquecimentodas células que contêm o vetor viral. O enriquecimento pode ser realizado,por exemplo, por (i) remoção de uma porção das células a partir da cultura;

(ii) diluição das células removidas de modo a reduzir a concentração de célu-la; (iii) permitindo que as células diluídas proliferem; e (iv) varredura das cé-lulas que contêm o vetor viral. As linhas de célula de planta clonal podem serusadas para produção de um antígeno de HPV de acordo com a presenteinvenção.

A invenção inclui um número de métodos de geração de plantasclonais, células das quais contêm um vetor viral que compreende um polinu-cleotídeo que codifica antígeno da invenção. Por exemplo, a invenção pro-porciona métodos de geração de uma planta clonal que expressa um polinu-cleotídeo que codifica antígeno da invenção compreendendo as etapas de:(i) geração de uma linha de raiz clonal, células da qual contêm um vetor viralcujo genoma compreende um polinucleotídeo que codifica antígeno da in-venção; (ii) liberação de células individuais a partir da linha de raiz clonal; e

(iii) manutenção das células liberadas sob condições apropriadas para for-mação de uma planta. A invenção proporciona adicionalmente métodos dégeração de uma planta clonal que expressa um polinucleotídeo que codificaantígeno da invenção compreendendo etapas de: (i) geração de uma linhacélula de planta clonal, células da qual contêm um vetor viral cujo genomacompreende um polinucleotídeo que codifica antígeno da invenção; e (ii)manutenção das células sob condições apropriadas para formação de umaplanta. Em geral, as plantas clonais de acordo com a invenção podem ex-pressar qualquer polinucleotídeo que codifica antígeno da invenção. Taisplantas clonais podem ser usadas para produção de um antígeno-polipeptídeo.

Conforme notado acima, a presente invenção proporciona sis-temas para expressão de um polinucleotídeo ou polinucleotídeos que codifi-cam antígeno da invenção em linhas de raiz clonal, linhas de raiz clonal, Ii-nhas de planta clonal (por exemplo, as linhas de célula derivadas de folha,caule, etc), e/ou em plantas clonais. O polinucleotídeo de codificação de an-tígeno da invenção é introduzido em uma célula de planta ancestral usandoum vetor viral de planta cujo genoma inclui o polinucleotídeo de codificaçãode antígeno da invenção operavelmente ligado a (isto é, sob controle de) umpromotor. Uma linha de célula clonal ou linha de célula de planta clona! éestabelecida de uma célula contendo o vírus de acordo com qualquer devárias técnicas adicionalmente descritas abaixo. O vetor de vírus de plantaou porções deste pode ser introduzido em uma célula de planta por infecção,pela inoculação com uma transcrição viral ou clone de cDNA infeccioso, poreletroporação, por transferência de gene mediada por T-DNA, etc.

As seções que se seguem descrevem métodos para geração delinhas de raiz de clonal, linhas de célula de raiz clonal, linhas de célula deplanta clonal, e plantas clonais que expressam um polinucleotídeo que codi-fica antígeno da invenção são, em seguida, descritas. Uma "linha de raiz édistinguida de uma "linha de célula de raiz" em que uma linha de raiz produzestruturas atuais similares a raiz ou raízes, enquanto uma linha de célula deraiz consiste em células de raiz que não formam estruturas similares a raiz".O uso do termo "linha" é pretendido para indicar que células da linha podemproliferar e passar informação genética para as células de progenia. As célu-las de uma linha de célula tipicamente proliferam na cultura sem ser parte deuma estrutura organizada, tal como aquela encontrada em uma planta intac-ta. O uso do termo "linha de raiz" é pretendido para indicar que as células naestrutura de raiz podem proliferar sem ser parte de uma planta completa. Énotado que o termo "célula de planta" envolve raízes de célula. Contudo,para distinguir os métodos da invenção para gerar linhas de raiz e linhas decélula de raiz daqueles usados para gerar diretamente linhas de célula deplanta de tecido sem raiz (conforme oposto para gerar linhas de célula deplanta clonal de linhas de raiz clonal ou plantas clonais derivadas de linhasde raiz clonal), os termos "célula de planta" e "linha de célula de planta" con-forme usados aqui, geralmente se referem a células e linhas de célula queconsistem em tecido de planta sem raiz. As células de planta podem ser, porexemplo, folha, caule, broto, parte de flor, etc. É notado que sementes po-dem ser derivadas das plantas clonais geradas como derivadas aqui. Taissementes também conterão um vetor viral como plantas obtidas de tais se-mentes. Métodos para obtenção de estoques de semente são bem-conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Publicação de Patente dos Esta-dos Unidos 2004/0093643).

Linhas de Raiz Clonal

A presente invenção proporciona sistemas para geração de umalinha de raiz clonal em que um vetor de planta viral é usado para direcionarexpressão de um polinucleotídeo que codifica antígeno da invenção. Um oumais vetores de expressão incluindo um polinucleotídeo que codifica antíge-no da invenção operavelmente ligado a um promotor são introduzidos emuma planta ou uma porção desta de acordo com qualquer de uma variedadede métodos conhecidos. Por exemplo, folhas de planta podem ser inocula-das com transcrições virais. Os próprios vetores podem ser diretamente apli-cados a plantas (por exemplo, via inoculações abrasivas, inoculações despray mecanizadas, infiltração a vácuo, bombardeio de partícula, ou eletro-poração). Alternativamente ou adicionalmente, virions podem ser preparados(por exemplo, de plantas já infectadas), e aplicados a outras plantas de a-cordo com técnicas conhecidas.

Onde infecção é para ser acompanhada por aplicação direta deum genoma viral a uma planta, qualquer técnica disponível pode ser usadapara preparar o genoma. Por exemplo, muitos vírus que são utilmente em-pregados de acordo com a presente invenção têm genomas de ssRNA. ss-RNA podem ser preparados por transcrição de uma cópia de DNA do geno-ma, ou por replicação de uma cópia de RNA, ou in vivo ou in vitro. Dada apronta disponibilidade de facilidade de uso de sistemas de transcrição in W-tro (por exemplo, SP6, T7, Iisato reticulócito, etc), e também a conveniênciade manutenção de uma cópia de DNA de um vetor de RNA, é esperado queos vetores de ssRNA da invenção serão freqüentemente preparados portranscrição in vitro, particularmente com T7 ou SP6 polimerase. Clones decDNA infecciosos podem ser usados. Transferência de gene mediada agro-bacterialmente pode ser usada para transferir ácidos nucléicos virais, taiscomo vetores virais (ou genomas virais totais ou porções destes) em célulasde planta usando-se, por exemplo, agro infiltração, de acordo com métodosconhecidos na técnica.

A planta ou porção de planta podem, em seguida, serem manti-das (por exemplo, cultivadas ou crescidas) sob condições adequadas parareplicação de uma transcrição viral. Em certas concretizações da invenção, ovírus se espalha além de uma célula inicialmente inoculada, por exemplo,localmente de célula a célula e/ou sistemicamente de uma folha inicialmenteinoculada em folhas adicionais. Contudo, em algumas concretizações dainvenção, o vírus não se espalha. Desse modo, um vetor viral pode contergenes que codificam MP e/ou CP funcionais, mas podem estar carecendo deum ou ambos de tais genes. Em geral, um vetor viral é introduzido em célu-las múltiplas (infectadas) em uma planta ou porção desta.

Em seguida a introdução de um vetor viral na planta, folhas sãocolhidas. Em geral, as folhas podem ser colhidas a qualquer tempo em se-guida a introdução de um vetor viral. Contudo, pode ser desejável manter aplanta por um período de tempo em seguida a introdução de um vetor viralna planta, por exemplo, um período de tempo suficiente para replicação e,opcionalmente, difusão do vírus a partir das células nas quais foi inicialmenteintroduzido. Uma cultura de raiz clonal (ou culturas múltiplas) é preparada,por exemplo, por métodos conhecidos adicionalmente descritos abaixo.

Em geral, qualquer método disponível pode ser usado para pre-parar uma cultura de raiz clonal de uma planta ou tecido de planta em queum vetor viral foi introduzido. Tal método emprega genes que existem emcertos plasmídeos bacteriais. Estes plasmídeos são encontrados em váriasespécies de Agrobacterium que infectam e transferem DNA a uma amplavariedade de organismos. Como um gênero, Agrobacterium pode transferirDNA a um conjunto grande e diverso de tipos de planta, incluindo numero-sas espécies de angiosperma dicot e monocot e gimnosperma (ver Gelvin,2003, Microbial. Moi Biol. Rev., 67:16, e referências neste, todos dos quaissendo incorporados aqui por referência). A base molecular de transformaçãogenética de células de planta é transferência de uma bactéria e integraçãoem um genoma nuclear de planta de uma região de um grande plasmídeo(Ri) rizogênico ou (Ti) de indução de um tumor que reside dentro de váriasespécies de Agrobacterium. Esta região é referida como a "região T", quan-do presente no plasmídeo, e como "T-DNA" quando excizado a partir doplasmídeo. Geralmente, uma molécula de T-DNA de trançado simples étransferida para uma célula de planta na infecção Agrobacterial que ocorrenaturalmente, e é por último, incorporada (na forma de trançado duplo) nogenoma. Sistemas baseados nos plasmídeos Ti são amplamente usadospara introdução de material genético estranho em plantas, e para produçãode plantas transgênicas.

A infecção de plantas com várias espécies de Agrobacterium etransferência do T-DNA tem um número de efeitos. Por exemplo, A. tumefa-ciens causa doença de bile de coroa, enquanto A. rhizogenes causa desen-volvimento de raízes com pelos no local de infecção, uma condição conheci-da como "doença de raiz com pelo". Cada raiz ocorre de uma célula geneti-camente transformada simples. Desse modo, as células de raiz nas raízessão clonais, e cada raiz representa uma população clonal de células. Raízesproduzidas por infecção de A. rhizogenes são caracterizadas por uma altataxa de crescimento e estabilidade genética (Giri et ai, 2000., Biotech. Adv.,18:1, e referências neste, todas das quais sendo aqui incorporadas por refe-rência). Em adição, tais raízes são capazes de regenerar plantas genetica-mente estáveis (Giri et ai., 2000, supra).

Em geral, a presente invenção envolve o uso de qualquer cepade Agrobacteria (por exemplo, qualquer cepa de A. rhizogene) que é capazde induzir formação de raízes de células de planta. Conforme mencionadoacima, uma porção do plasmídeo Ri (Ri-T-DNA) é responsável por causardoença de raiz com pelo. Enquanto transferência desta porção do plasmídeoR1 para células de planta pode convenientemente ser acompanhada por in-fecção com Agronacteria que abriga o plasmídeo Ri, a invenção envolve ouso de vários outros métodos de introdução da região relevante em uma cé-lula de planta. Tais métodos incluem qualquer método disponível de introdu-ção de células de planta em material genético incluindo, mas não limitada a,biolísticos, eletroporação, entendimento de DNA mediado por PEG1 vetoresbaseados em Ti, etc. Porções relevantes do Ri T-DNA podem ser introduzi-das em células de planta pelo uso de um vetor viral. Os genes de Ri podemser incluídos no mesmo vetor que contém um polinucleotídeo que codificaantígeno da invenção, ou em um vetor viral diferente, que pode ser o mes-mo, ou um tipo diferente daquele vetor que compreende o polinucleotídeoque codifica antígeno da invenção. É notado que o Ri-T-DNA total não podeser requerido para produção de raízes com pelos, e a invenção envolve ouso de porções do Ri-T-DNA, provido que tais porções contêm material ge-nético suficiente para induzir formação de raiz, conforme conhecido na técni-ca. Material genético adicional, por exemplo, genes presentes dentro doplasmídeo Ri, mas não dentro do T-DNA, pode ser transferido para uma cé-lula de planta de acordo com a invenção, particularmente genes onde osprodutos de expressão facilitam integração do T-DNA no DNA de célula deplanta.

De modo a preparar uma linha de raiz clonal de acordo com cer-tas concretizações da invenção, porções de folha colhidas são contactadascom A. rhizogenes sob condições adequadas para infecção e transformação.Porções de folha são mantidas na cultura para permitir desenvolvimento deraízes com pelos. Cada raiz é clonal, isto é, células na raiz são derivadas deuma célula ancestral simples na qual o Ri T-DNA foi transferido. De acordocom a invenção, uma porção de tais células ancestrais conterá um vetor vi-ral. Desse modo, as células em uma raiz derivada de tais células ancestralconterão um vetor viral, visto que elas serão replicadas e serão transmitidasdurante divisão da célula. Desse modo, uma alta proporção (por exemplo,pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelomenos 95%), total (100%), ou substancialmente total (pelo menos 98%) dascélulas conterão o vetor viral. É notado que desde que um vetor viral é her-dado de células-filhas dentro de uma raiz clonal, o movimento de um vetorviral dentro da raiz não é necessário para manter o vetor viral através de to-da a raiz. As raízes com pelos clonais individuais podem ser removidas deuma porção de folha e adicionalmente cultivadas. Tais raízes também sãoreferidas aqui como linhas de raiz. Raízes clonais isoladas continuam acrescer em seguida ao isolamento.Uma variedade de linhas de raiz clonal diferentes foi gerada u-sando os métodos da invenção. As linhas de raiz foram geradas usando ve-tores virais contendo polinucleotídeos que codificam antígeno da invenção(por exemplo, codificando peptídeo imunogênico). As linhas de raiz foramtestadas por western blot. As linhas de raiz revelam uma variedade de níveisde expressão diferentes de vários polipeptídeos. As linhas de raiz que reve-lam alta expressão foram selecionadas e adicionalmente cultivadas. As li-nhas de raiz foram subseqüentemente testadas novamente e mostradas pa-ra manter altos níveis de expressão sobre períodos estendidos de tempo,incluindo estabilidade. Níveis de expressão foram comparáveis a ou maioresdo que expressão em plantas intactas infectadas com o mesmo vetor viralusado para gerar linhas de raiz clonal. Em adição, a estabilidade de expres-são das linhas de raiz foi obtida em plantas infectadas com o mesmo vetorviral. Até 80% de tais plantas infectadas com vírus revertidas em tipo selva-gem após 2-3 passagens. (Tais passagens envolvem inoculação de plantascom transcrições, permitindo que a infecção (local ou sistêmica) se tomeestabelecida, tomando uma amostra de folha, e inoculando plantas recentesque são subseqüentemente testadas para expressão).

As linhas de raiz podem ser cultivadas em uma grande escalapara produção de antígeno dos polipeptídeos da invenção conforme discuti-do adicionalmente abaixo. É notado que linhas de raiz clonal (e linhas decélula derivadas de linhas de raiz clonal) podem geralmente serem mantidasno meio que não inclui vários compostos, por exemplo, hormônios de cres-cimento de planta, tais como auxinas, citoquinas, etc, que são tipicamenteempregadas na cultura de raiz e células de planta. Esta característica reduzo dispêndio associado com cultura de tecido, e os inventores esperam quecontribuirá significantemente à praticabilidade econômica de produção deproteína usando plantas.

Qualquer de uma variedade de métodos podem ser usada paraselecionar raízes clonais que expressam um polinucleotídeo que codificaantígeno(s) de HPV da invenção. Western blot, ensaios ELISA, etc, podemser usados para detectar um polipeptídeo codificado. No caso de marcado-res detectáveis, tais como GFP, métodos alternativos, tais como varredurasvisuais, podem ser realizados. Se um vetor viral compreendendo um polinu-cleotídeo que codifica um marcador selecionável é usado, uma seleção a-propriada pode ser imposta (por exemplo, o material de folha e/ou raízesderivadas deste podem ser cultivados na presença de uma condição antibió-tica ou nutricional apropriadas e raízes sobreviventes identificadas e isola-das). Certos vetores virais contêm dois ou mais polinucleotídeos que codifi-cam antígeno da invenção, por exemplo, dois ou mais polinucleotídeos quecodificam polipeptídeos diferentes. Se um destes é um marcador selecioná-vel ou detectável, as raízes clonais que são selecionadas ou detectadas porseleção ou detecção de expressão do marcador terão uma alta probabilida-de de também expressar o segundo polinucleotídeo. A varredura ("screening")de linhas de raiz que contêm polinucleotídeos particulares pode ser realizadausando PCR e outros métodos de detecção de ácido nucléico.

Alternativamente ou adicionalmente, linhas de raiz clonal podemser classificadas pela presença do vírus pela inoculação de plantas hospe-deiras que formarão lesões locais como um resultado de infecção de vírus(por exemplo, plantas hospedeiras hipersensíveis). Por exemplo, 5 mg detecido de raiz pode ser homogeneizado em 50 μΙ de tampão de fosfato, eusado para inocular uma folha simples de uma planta de tabaco. Se o vírusestá presente em culturas de raiz, dentro de dois ou três dias lesões caracte-rísticas aparecerão nas folhas infectadas. Isto significa que a linha de raizcontém vírus recombinante que transporta o polinucleotídeo que codificaantígeno da invenção (gene alvo). Se nenhuma lesão local é formada, nãoexiste vírus, e a linha de raiz é rejeitada como negativa. Este método é alta-mente eficiente em tempo e custo. Após classificar inicialmente a presençade vírus, as raízes que contêm o vírus podem ser submetidas a varredurasecundária, por exemplo, por manchamentro de Western ou ELISA para se-lecionar altos expressores. Varreduras adicionais, por exemplo, varreduraspara crescimento rápido, crescimento em meio particular, ou sob condiçõesambientais particulares, etc, podem ser aplicados. Estes métodos de varre-dura podem, em geral, serem aplicados no desenvolvimento de qualquer daslinhas de raiz clonal, linhas de célula clonal, linhas de célula de planta clonal,e/ou plantas clonais aqui descritas.

Conforme será evidente a um versado na técnica, uma variedadede modificações pode ser feita à descrição dos métodos da invenção paragerar linhas de raiz clonal que contêm um vetor viral. Tais modificações es-tão dentro do escopo da invenção. Por exemplo, enquanto é geralmente de-sejável introduzir o vetor viral em uma planta intacta ou proteína desta antesda introdução dos genes de Ri-T-DNA, em certas concretizações da inven-ção o Ri-DNA é introduzido antes da introdução do vetor viral. Em adição, épossível contactar plantas intactas com A. rhizogenes preferivelmente doque colheita de porções de folha e, em seguida, expondo-as ao bacterium.

Outros métodos de gerar linhas de raiz clonais de células simplesda planta ou porção desta que abriga um vetor viral podem ser usados (istoé, métodos não usando A. rhizogenes ou material genético a partir de plas-mídeo Ri). Por exemplo, tratamento com certos hormônios de planta oucombinações de hormônios de planta é conhecido para resultar na geraçãode raízes de tecido de planta.

Linhas de Célula Clonal Derivadas de Linhas de Raiz Clonal

Conforme descrito acima, a invenção proporciona métodos paragerar linhas de raiz clonais, no qual as células nas linhas de raiz contêm umvetor viral. Conforme é bem-conhecido na técnica, uma variedade de linhasde célula diferentes pode ser gerada de raízes. Por exemplo, linhas de raizde célula podem ser geradas de células de raiz individuais obtidas a partir daraiz usando uma variedade de métodos conhecidos. Tais linhas de célula deraiz podem ser obtidas de vários tipos de célula de raiz diferentes dentro daraiz. Em geral, o material de raiz é colhido e dissociado (por exemplo, fisi-camente e/ou enzimaticamente digerido) para liberar células de raiz indivi-duais, que são, em seguida, adicionalmente cultivadas. A formação completade protoplasto não é geralmente necessária. Se desejado, células de raizpodem ser revestidas em concentrações de célula muito diluídas, de modo aobter linhas de célula de raiz de células de raiz simples. Linhas de célula deraiz derivadas dessa maneira são linhas de célula clonais contendo o vetorviral. Tais linhas de célula de raiz, portanto, exibem expressão estável dopolinucleotídeo que codifica antígeno da invenção. As linhas de célula deplanta clonais podem ser obtidas em uma maneira similar a partir de raízesclonais, por exemplo, por cultura de células de raiz dissociadas na presençados hormônios de planta apropriados. Varreduras e etapas sucessivas deenriquecimento podem ser usadas para identificar linhas de célula que ex-pressam o polinucleotídeo que codifica antígeno da invenção em níveis al-tos. Contudo, se a linha de raiz clonal da qual a linha de célula é derivada jáexpressa em altos níveis, tais varreduras adicionais podem ser desnecessá-rias.

Como no caso das linhas de célula clonais, as células de umalinha de célula de raiz clonal são derivadas de uma célula ancestral simplesque contém o vetor viral e, conterá, portanto, também o vetor viral, visto queele será replicado, e será transmitido durante divisão da célula. Desse modo,uma alta proporção (por exemplo, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelomenos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%), total (100%), ou substan-cialmente total (pelo menos 98%) das células conterá o vetor viral. É notadoque desde que o vetor viral foi herdado pelas células-filhas dentro da linhade célula de raiz clonal, o movimento do vetor viral entre as células não énecessário para manter o vetor viral. As linhas de célula de raiz clonais po-dem ser usadas de um polinucleotídeo que codifica antígeno da invençãoconforme descrito abaixo.

Linhas de Célula de Planta Clonal

A presente invenção proporciona métodos para gerar uma linhade célula de planta clonal na qual um vetor viral de planta é usado para dire-cionar expressão de um polipeptídeo que codifica antígeno da invenção. Deacordo com o método da invenção, um ou mais vetor(es) de expressão viralincluindo um polinucleotídeo que codifica um antígeno de HPV da invençãoligado operavelmente a um promotor é introduzido em células de uma linhade célula de planta que é mantida na cultura de célula. Um número de linhasde célula de plantas de vários tipos de planta é conhecido na técnica, qual-quer dos quais podendo ser usado. Linhas de célula recentemente derivadaspodem ser geradas de acordo com métodos conhecidos para uso na práticada invenção. Um vetor viral é introduzido nas células da linha de célula deplanta de acordo com qualquer de um número de métodos. Por exemplo,protoplastos podem ser produzidos e transcrições virais em seguida eletro-poradas nas células. Outros métodos de introdução de um vetor viral deplanta nas células de uma linha de célula de planta podem ser usados.

Um método de gerar linhas de célula de planta clonais, de acordocom a invenção, e um vetor viral para introdução em células de planta (porexemplo, protoplastos), podem ser usados conforme segue: em seguida aintrodução do vetor viral, a linha de célula de planta pode ser mantida nacultura de tecido. Durante este tempo, o vetor viral pode replicar, e os poli-peptídeos que codificam antígeno da invenção podem ser expressos. Aslinhas de célula de planta clonais são derivadas a partir da cultura, por e-xemplo, por um processo de enriquecimento sucessivo. Por exemplo, amos-tras podem ser removidas da cultura, opcionalmente com diluição de modoque a concentração de células é baixa, e revestidas em placas de Petri emgotículas individuais. As gotículas são, em seguida, mantidas para permitirdivisão de célula.

Será apreciado que as gotículas podem conter um número variá-vel de células, dependendo da densidade inicial da cultura e da quantidadede diluição. As células podem ser diluídas tal que muitas gotículas contêmou 0 ou 1 célula se é desejado obter-se linhas de célula clonais expressandoo polipeptídeo que codifica antígeno da invenção após somente uma etapasimples de enriquecimento. Contudo, pode ser mais eficiente selecionar umaconcentração tal que células múltiplas estejam presentes em cada gotículae, em seguida, classificar as gotículas para identificar aquelas que contêmexpressão de células. Em geral, qualquer procedimento de varredura apro-priado pode ser empregado. Por exemplo, seleção ou detecção de um mar-cador detectável, tal como GFP, pode ser usado. Western blot ou ensaiosELISA podem ser usados. Gotículas individuais (100 μΙ) contêm mais do quecélulas o bastante para realização destes ensaios. Etapas múltiplas de enri-quecimento são realizadas para isolar linhas de célula de expressão maisaltas. Linhas de célula de planta clonais simples (isto é, populações deriva-das de uma célula ancestral simples) podem ser geradas por limitação adi-cional de diluição usando-se métodos-padrão para clonagem de célula sim-ples. Contudo, é necessário isolar linhas clonais individuais. Uma populaçãocontendo linhas de célula clonais múltiplas pode ser usada de um polipeptí-deo que codifica antígeno da invenção.

Em geral, certas concretizações acima descritas para geração delinhas de raiz clonais se aplicam a geração de linhas de célula de planta clo-nais. Por exemplo, uma diversidade de vetores virais contendo um ou maispolipeptídeos que codificam antígeno da invenção pode ser usada como po-dem combinações de vetores diferentes múltiplos. Métodos de varredurasimilares podem ser usados. Como no caso das linhas de raiz clonais e li-nhas de célula de raiz clonais, células de uma linha de célula de planta clo-nal são derivadas de uma célula ancestral simples que contém o vetor viral econterão, portanto, também o vetor viral, visto que será replicado e serátransmitido durante divisão de célula. Desse modo, uma alta proporção (porexemplo, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos90%, pelo menos 95%), total (100%), ou substancialmente total (pelo menos98%) das células conterá o vetor viral. É notado que desde que o vetor viralé herdado por células-filhas dentro da linha de célula de planta clonal, o mo-vimento do vetor viral entre as células não é necessário para manter o vetorviral. A linha de célula de planta clonal pode ser usada para produção de umpolipeptídeo que codifica antígeno da invenção conforme descrito abaixo.

Plantas Clonais

Plantas clonais podem ser geradas a partir de raízes clonais, li-nhas de célula de raiz clonais, e/ou linhas de célula de planta clonais produ-zidas de acordo com os vários métodos acima descritos. Métodos para ge-ração de plantas a partir de raízes, linhas de célula de raízes, e linhas decélula de plantas, tais como as linhas de raiz clonais, linhas de célula de raizclonais, e linhas de célula de planta clonais aqui descritas são bem-conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Peres etal, 2001, Plant Cell Tissueand Organ Culture, 65:37; e referência modelo operam na biologia molecularde planta e biotecnologia citadas aqui). A invenção proporciona, portanto,um método de gerar uma planta clonal compreendendo etapas de (i) geraruma linha de raiz clonal, linha de célula de raiz clonal, ou linha de célula deplanta clonal de acordo com qualquer dos métodos da invenção descritosacima; e (ii) gerar uma planta total a partir da linha de raiz clonal, linha decélula de raiz clonal, ou planta clonal. As plantas clonais podem ser propa-gadas e descridas de acordo com métodos padrões.

Como no caso das linhas de raiz clonais, linhas de célula de raizclonais e linhas de célula de planta clonais, as células de uma planta clonalsão derivadas de uma célula ancestral simples que contém o vetor viral econterão, portanto, também o vetor viral, visto que será replicado e serátransmitido durante divisão de célula. Desse modo, uma alta proporção (porexemplo, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos90%, pelo menos 95%), total (100%), ou substancialmente total (pelo menos98%) das células conterá o vetor viral. É notado que desde que o vetor viralé herdado por células-filhas dentro da planta clonal, o movimento do vetorviral não é necessário para manter o vetor viral.

Sistemas de Expressão de Planta de Brotos e Brotos Germinados

Sistemas e reagentes para gerar uma variedade de brotos e bro-tos germinados que são úteis para a produção de antígeno(s) de HPV deacordo com a presente invenção foram descritos anteriormente e são co-nhecidos na técnica (ver, por exemplo, Publicação PCT WO 04/43886, que éaqui incorporada por referência). A presente invenção proporciona adicio-nalmente brotos germinados, que podem ser comíveis, como uma biomassacontendo um peptídeo ou proteína de antígeno de HPV. Em certos aspectos,a biomassa é provida diretamente para consumo de composições de antíge-no. Em alguns aspectos, a biomassa é processada antes do consumo, porexemplo, por homogeneização, trituração, secagem ou extração. Em certosaspectos, o antígeno de HPV é purificado a partir da biomassa e formuladoem uma composição farmacêutica.

Adicionalmente providos são métodos para produção de antíge-no de HPV em brotos germinados que podem ser consumidos ou colhidosvivos (por exemplo, brotos germinados do gênero Brassica). Em certos as-pectos, a presente invenção envolve crescimento de uma semente a um bro-to germinado comestível em um ambiente regulável contido (por exemplo,internos, em um recipiente, etc). A semente pode ser uma semente geneti-camente projetada que contém um cassete de expressão que codifica umantígeno de HPV, cuja expressão é acionada por um promotor exogenamen-te induzível. Uma variedade de promotores exogenamente induzíveis podeser usada que sejam induzíveis, por exemplo, por luz, calor, fitohormônios,nutrientes, etc.

Em concretizações relacionadas, a presente invenção proporcio-na métodos de produção de antígeno(s) de HPV em brotos germinados pri-meiro pela geração de um estoque de semente para o broto germinado pelatransformação de plantas com um cassete de expressão que codifica antí-geno de HPV usando sistema de transformação de Agrobacterium, no qual aexpressão do antígeno de HPV é acionada por um promotor induzível. Se-mentes transgênicas podem ser obtidas a partir da planta transformada,crescida em um ambiente regulável contido, e induzida para expressar o an-tígeno de HPV.

Em algumas concretizações, métodos são providos que envol-vem infecção de brotos germinados com um cassete de expressão viral quecodifica um antígeno de HPV, expressão da qual pode ser acionada porqualquer de um promotor viral ou um promotor induzível. Os brotos germina-dos são crescidos por dois a quatorze dias em um ambiente regulável conti-do, ou pelo menos até que níveis do antígeno de HPV tenham sido obtidospara consumo ou colheita.

A presente invenção proporciona adicionalmente sistemas paraprodução de antígeno(s) de HPV em brotos germinados que incluem umaunidade de alojamento com controle de clima e em broto germinado conten-do um cassete de expressão que codifica um ou mais antígenos de HPV, noqual expressão é acionada por um promotor constitutivo ou induzível. Ossistemas da invenção podem proporcionar vantagens únicas sobre o ambi-ente externo ou estufa, que não podem ser controlados. Desse modo, a pre-sente invenção capacita ao cultivador precisar o tempo de indução de ex-pressão do antígeno de HPV. Ele pode também reduzir grandemente o custode produção de antígeno(s) de HPV.

Em certos aspectos, brotos transientemente transfectados con-têm seqüências de vetor viral que codificam um antígeno de HPV da inven-ção. Os brotos são crescidos por um período de tempo de modo a permitirprodução de um ácido nucléico viral no broto, seguido por um período decrescimento no qual cópias múltiplas de vírus são produzidas, resultando,desse modo, na produção de antígeno.

Em certos aspectos, sementes geneticamente projetadas ou em-briões que contêm um transgene que codifica um antígeno de HPV sãocrescidos ao estágio de broto de semente em um ambiente regulável conti-do. O ambiente regulável contido pode ser uma unidade de alojamento ouambiente no qual as sementes podem ser crescidas interiormente. Todos osfatores ambientais do ambiente regulável contido podem ser controlados.Desde que os brotos não requerem luz e iluminação para crescerem, o quepode ser custoso, as sementes geneticamente projetadas ou embriões po-dem ser crescidas ao estágio de semente germinada em interiores na au-sência de luz.

Outros fatores ambientais que podem ser regulados em um am-biente regulável contido da presente invenção incluem temperatura, umida-de, água, nutrientes, gás (por exemplo, teor de O2 ou CO2, ou circulação dear), químicos (moléculas pequenas, tais como açúcares e derivados de açú-car, ou hormônios, tais como os fitohormônios giberélico ou ácido absísico,etc), e similares.

De acordo com certos métodos da presente invenção, expressãodo transgene que codifica um antígeno de HPV pode ser controlada por umpromotor exogenamente induzível. Promotores exogenamente induzíveissão propensos a aumentar ou diminuir a expressão de um transgene emresposta a um estímulo externo, preferivelmente do que interno. Um númerodestes fatores ambientais pode agir como indutores para expressão dostransgenes transportados pelos cassetes de expressão dos brotos geneti-camente projetados. Os promotores podem ser um promotor induzível decalor, tal como um promotor de choque de calor. Por exemplo, usando-secomo um promotor de choque de calor, a temperatura do ambiente contidopode simplesmente ser elevada para induzir expressão do transgene. Outrospromotores incluem promotores induzíveis de luz. Os promotores induzíveisde luz podem ser mantidos como promotores constitutivos se a luz no ambi-ente regulável contido está sempre ligada. Alternativamente ou adicional-mente, a expressão do transgene pode ser ligada em um tempo particulardurante desenvolvimento ligando-se simplesmente a luz. O promotor podeser um promotor quimicamente induzível que é usado para induzir expressãoda transgene. De acordo com estas concretizações, o químico· pode sim-plesmente ser enevoado ou pulverizado em uma semente, embrião, ou brotopara induzir expressão do transgene. A pulverização e enevoamento podemser precisamente controladas e direcionadas em uma semente particular,embrião, ou broto ao qual é pretendido. O ambiente contido é destituído devento ou correntes de ar, que podem dispersar o químico para fora a partirdo alvo pretendido, de modo que o químico fica no alvo para qual ele foi pre-tendido.

De acordo com a presente invenção, o tempo de expressão queé induzido pode ser selecionado para maximizar a expressão de um antíge-no de HPV no broto de semente pelo tempo de colheita. A indução de ex-pressão em um embrião em um estágio particular de crescimento (por e-xemplo, indução de expressão em um embrião em um número particular dedias após germinação, pode resultar em síntese máxima do antígeno deHPV no tempo de colheita). Por exemplo, a indução de expressão a partir dopromotor 4 dias após germinação pode resultar em mais síntese de proteínado que indução de expressão a partir do promotor após 3 dias ou após 5dias. Aqueles versados na técnica apreciarão que a maximização da expres-são pode ser alcançada por experimentação de rotina. Em algumas concre-tizações, os brotos germinados são colhidos em cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,8, 9 10, 11 ou 12 dias após germinação.

Em casos onde o vetor de expressão tem um promotor constituti-vo ao invés de um promotor induzível, o broto germinado pode ser colhidoem um certo tempo após transformação do broto de semente. Por exemplo,se um broto germinado fosse viralmente transformado em um estágio anteri-or de desenvolvimento, por exemplo, no estágio de embrião, os brotos ger-minados podem ser colhidos em um tempo quando expressão está em suapós-transformação máxima, por exemplo, em cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13 ou 14 dias pós-transformação. Pode também ser que brotosse desenvolvam um, dois, três ou mais meses pós-transformação, depen-dendo da germinação da semente.

Geralmente, uma vez que a expressão do antígeno de HPV seinicia, as sementes, embriões ou brotos germinados são permitidos cresce-rem até que níveis suficientes de antígeno de HPV sejam expressos. Emcertos aspectos, níveis suficientes são níveis que proporcionariam um bene-fício terapêutico a um paciente se a biomassa colhida fosse material em bru-to ingerido. Alternativamente ou adicionalmente, níveis suficientes são níveisdos quais o antígeno de HPV pode ser concentrado ou purificado a partir dabiomassa e formulado em uma composição farmacêutica que proporcionaum benefício terapêutico a um indivíduo após administração. Tipicamente, oantígeno não é uma proteína expressa no broto germinado na natureza. Emqualquer taxa, o antígeno de HPV é tipicamente expresso em concentraçõesacima daquela que estaria presente no broto germinado na natureza.

Uma vez que a expressão do antígeno de HPV é induzida, cres-cimento é permitido continuar até o estágio de broto germinado, em cujotempo os brotos germinados são colhidos. Os brotos germinados podem sercolhidos vivos. A colheita de brotos germinados vivos tem várias vantagens,incluindo esforço e quebra mínimos. Os brotos germinados da presente in-venção podem ser crescidos hidroponicamente, tornando a colheita umaação simples de se elevar o broto germinado de sua solução hidropônica.Nenhum solo é requerido para o crescimento dos brotos germinados da in-venção, mas pode ser provido se considerado necessário ou desejável peloversado na técnica. Devido aos brotos serem crescidos sem solo, nenhumalimpeza de material de broto germinado é requerida na hora da colheita.Sendo capaz de colher o broto germinado diretamente de seu ambiente hi-dropônico sem lavagem ou esfregamento, minimizando-se a quebra do ma-terial colhido. A quebra e definhamento de plantas induzem apoptose. Du-rante apoptose, certas enzimas proteolíticas tornam-se ativas, que podemdegradar a proteína farmacêutica expressa no broto germinado, resultandona atividade terapêutica diminuída da proteína. A proteólise induzida por a-poptose pode diminuir significantemente a produção de proteína de plantasmaduras. Usando-se os métodos da presente invenção, apoptose pode serevitada quando nenhuma colheita ocorre até o momento das proteínas se-rem extraídas da planta.

Por exemplo, brotos vivos podem ser moídos, triturados ou mistu-rados para produzir uma pasta fluida de biomassa de broto germinado, eminibidores de protease contendo tampão. O tampão pode ser mantido a cer-ca de 4°C. Em alguns aspectos, a biomassa de broto germinado é seca a ar,pulverizada seca, congelada, ou congelada seca. Como em plantas madu-ras, alguns destes métodos, tais como secagem a ar, podem resultar emuma perda de atividade da proteína farmacêutica. Contudo, devido aos bro-tos germinados serem muito pequenos e terem uma grande área superficialem razão de volume, isto é muito menos provável de ocorrer. Aqueles ver-sados na técnica apreciarão que muitas técnicas para colheita da biomassaque minimizam a proteólise da proteína expressa são disponíveis, e podemser aplicadas a presente invenção.

Em algumas concretizações, os brotos germinados são comestí-veis. Em certas concretizações, os brotos germinados que expressam níveissuficientes de antígenos de HPV são consumidos após colheita (por exem-plo, após colheita, dentro de um período mínimo em seguida a colheita), demodo que absolutamente nenhum processamento ocorre antes dos brotosde semente serem consumidos. Desse modo, qualquer quebra proteolíticainduzida pela colheita do antígeno de HPV antes da administração do antí-geno de HPV a um paciente em necessidade de tratamento é minimizada.Por exemplo, brotos germinados que estão prontos para serem consumidospodem ser distribuídos diretamente a um paciente. Alternativamente ou adi-cionalmente, sementes geneticamente projetadas ou embriões são distribuí-dos a um paciente em necessidade de tratamento e desenvolvidos ao está-gio de broto germinado pelo paciente. Em um aspecto, um suprimento debrotos germinados geneticamente projetados é provido a um paciente, ou aum médico que estará tratando os pacientes, de modo que um estoque con-tínuo de brotos germinados que expressam certos antígenos de HPV podeser cultivado. Isto pode ser particularmente valioso para populações em paí-ses em desenvolvimento, onde farmacêuticos custosos não são oferecidosou distribuídos. A facilidade com qual os brotos germinados da invenção po-dem ser crescidos torna os brotos germinados da presente invenção particu-larmente desejáveis para tal população em desenvolvimento.

A natureza regulável do ambiente contido concede vantagenspara a presente invenção sobre crescimento de plantas no ambiente exter-no. Em geral, o crescimento de brotos germinados geneticamente projetadosque expressa proteínas farmacêuticos em plantas proporciona um produtofarmacêutico mais rápido (porque as plantas são colhidas mais jovens) ecom menos esforço, risco, e considerações regulatórias do que o desenvol-vimento de plantas geneticamente projetadas. O ambiente regulável contidousado na presente invenção reduz ou elimina o risco de plantas de poliniza-ção cruzada na natureza.

Por exemplo, um promotor induzível de calor do mesmo modonão seria usado nos exteriores porque a temperatura no exterior não podeser controlada. O promotor seria ligado a qualquer hora que a temperaturaexterior se elevasse acima de um certo nível. Similarmente, o promotor seriadesligado toda hora que a temperatura externa caísse. Tais alterações detemperatura podem ocorrer em um único dia, por exemplo, ligando a expres-são no dia e desligando a noite. Um promotor induzível de calor, tal comoaquele aqui descrito, não seria mesmo prático para uso em uma estufa, queé susceptível a alterações climáticas para quase o mesmo grau conforme osexteriores. O crescimento de plantas geneticamente projetadas em uma es-tufa é muito custoso. Em contraste, no presente sistema, muita variável podeser controlada de modo que a quantidade máxima de expressão pode seralcançada com toda colheita.

Em certas concretizações, os brotos germinados da presenteinvenção são crescidos em bandejas que podem ser irrigadas, pulverizadas,ou enevoadas em qualquer tempo durante desenvolvimento do broto germi-nado. Por exemplo, a bandeja pode ser assentada com um ou mais apare-lhos de irrigação, pulverização, enevoamento e drenagem que podem distri-buir e/ou remover água, nutrientes, químicos, etc., no tempo específico, eem quantidades precisas durante desenvolvimento do broto germinado. Porexemplo, as sementes requerem umidade suficiente para mantê-las úmidas.A umidade em excesso drena através de furos nas bandejas nos drenos nosolo do ambiente. Tipicamente, a água de drenagem é tratada conforme a-propriado para remoção de químicos nocivos antes da descarga de volta noambiente.

Outra vantagem de bandejas é que elas podem estar contidasdentro de um espaço muito pequeno. Desde que nenhuma luz seja requeri-da para os brotos germinados crescerem, as bandejas contendo sementes,embriões ou brotos germinados podem ser apertadamente empilhadas verti-calmente uma sobre a outra, proporcionando uma grande quantidade de bi-omassa por unidade de espaço de solo em uma facilidade de alojamentoconstruída especificamente para esta proposta. Em adição, as pilhas debandejas podem ser dispostas em séries horizontais dentro de uma unidadede alojamento. Uma vez que os brotos tenham crescido a um estágio apro-priado para colheita (cerca de dois a quatorze dias), as bandejas de brotoindividuais são movidas em uma facilidade de processamento, ou manual-mente, ou por meios automáticos, tal como uma correia transportadora.

O sistema da presente invenção é único em que ele proporcionauma biomassa de broto germinado que é uma fonte de um antígeno de HPV.Se diretamente consumida ou processada na forma de uma composiçãofarmacêutica, porque os brotos germinados são crescidos em um ambienteregulável contido, a biomassa de broto germinado e/ou composição farma-cêutica derivada a partir da biomassa podem ser providas a um consumidorem baixo custo. Em adição, o fato que as condições para crescimento dosbrotos germinados podem ser controladas torna a qualidade e pureza doproduto consistentes. O ambiente regulável contido da invenção tambémtorna óbvio muitas regulações seguras da EPA que pode impedir cientistasde desenvolverem produtos agriculturais geneticamente projetados ao arlivre.

Brotos Transformados

Uma variedade de métodos pode ser usada para transformar cé-lulas de planta e produzir brotos germinados geneticamente projetados. Doismétodos disponíveis para a transformação de plantas que requerem quelinhas de células transgênicas sejam geradas in vitro, seguido por regenera-ção das linhas de célula nas plantas totais, incluem transferência de genemediada por Agrobacterium tumefaciens e bombardeio de microprojétil, oueletroporação. A transformação viral é um método mais rápido e menos cus-toso de transformação de embriões e brotos germinados que podem ser co-Ihidos sem um retardo experimental ou geracional antes da obtenção doproduto desejado. Para qualquer destas técnicas, o versado na técnica a-preciaria como ajustar e otimizar os protocolos de transformação que foramusados tradicionalmente para plantas, sementes, embriões, ou brotos germi-nados.

Cassetes de Expressão de Transformação de Aarobacterium

Agrobacterium é um gênero representativo da família gram-negativa Rhizobiaceae. Esta espécie é responsável por tumores de planta,tais como doença de bile de coroa e raiz com pelo. Em tecido de planta dedi-ferenciado, que é característico de tumores, derivados de aminoácido co-nhecidos como opines são produzidos pelo Agrobacterium e catabolizadospela planta. Os genes bacteriais responsáveis pela expressão de opines sãouma fonte conveniente de elementos de controle para cassetes de expres-são quiméricos. De acordo com a presente invenção, o sistema de transfor-mação de Agrobacterium pode ser usado para gerar brotos germinados co-mestíveis, que são meramente colhidos antes das plantas amadurecerem.Os métodos de transformação de Agrobacterium podem facilmente ser apli-cados para regenerar brotos germinados que expressam antígenos de HPV.Em geral, a transformação das plantas envolve a transformaçãode células de planta crescidas em cultura de tecido por co-cultivo com umAgrobacterium tumefaciens conduzindo uma planta/vetor bacterial. O vetorcontém um gene que codifica um antígeno de HPV. O Agrobacterium trans-fere o vetor para a célula hospedeira da planta e é, em seguida, eliminadousando tratamento antibiótico. As células de planta transformadas que ex-pressam o antígeno de HPV são selecionadas, diferenciadas, e, finalmente,regeneradas em plantinhas completas (Hellen et al., 2000, Plant Mol). Biol.,42:819; Pilon-Smits et al., Plant Physiolog. 119(1):123; Barfield et al., 1991,Plant Cell fíeports, 10:308; e Riva et al., J. Biotechnology 1(3); cada um doqual é incorporado aqui por referência.

Vetores de expressão para uso na presente invenção incluem umgene (ou cassete de expressão) que codifica um antígeno de HPV designa-do para operação em plantas, com seqüências companheiras a montante ea jusante do cassete de expressão. As seqüências companheiras são ge-ralmente de plasmídeo ou de origem viral, e proporcionam característicasnecessárias ao vetor para transferir DNA da bactéria ao hospedeiro de plan-ta desejado.

O constructo básico bacterial/vetor de planta pode desejavelmen-te proporcionar uma origem de replicação de procariote de hospedeiro defaixa ampla, um marcador selecionável de procariote. Marcadores selecio-náveis procarióticos adequados incluem resistência a antibióticos, tais comoampicilina ou tetraciclina. Outras seqüências de DNA que codificam funçõesadicionais que são bem-conhecidas podem também estar presentes no ve-tor.

Seqüências de Agrobacterium T-DNA são requeridas para trans-ferência mediada por Agrobaeterium de DNA para o cromossomo da planta.Os genes de indução de tumor do T-DNA são tipicamente removidos e subs-tituídos com seqüências que codificam o antígeno de HPV. As seqüênciasde limite de T-DNA são retidas porque elas iniciam a integração da região deT-DNA no genoma da planta. Se expressão do antígeno de HPV não é pron-tamente acessível para detecção, o constructo bacterial/de vetor de plantapode também incluir um gene marcador selecionável para determinação seuma célula de planta foi transformada, por exemplo, o gene de resistêncianptü karamicin. No mesmo ou diferente vetor bacterial/de planta (plasmídeoTi) são seqüências Ti. Seqüências Ti incluem os genes de virulência, quecodificam um conjunto de proteínas responsáveis pela excisão, transferênciae integração do T-DNA no genoma da planta (Caiu, 1987, Caiense,237:1176). Outras seqüências adequadas para permissão de integração daseqüência heteróloga no genoma da planta podem incluir seqüências detransposon, e similares, para recombinação homóloga.

Certos constructos incluirão o cassete de expressão que codificauma proteína de antígeno. Um, dois ou mais cassetes de expressão podemser usados em uma dada transformação. O cassete de expressão recombi-nante contém, em adição à seqüência que codifica antígeno de HPV, pelomenos os seguintes elementos: uma região de promotor, seqüências não-transladadas 5' de planta, códon de iniciação (dependendo se ou não o geneexpresso tem seu reconhecimento), e seqüências de terminação de transcri-ção e terminação. Em adição, terminadores de transcrição e translação po-dem ser incluídos nos cassetes de expressão ou genes quiméricos da pre-sente invenção. Seqüências de secreção de sinal que permitem processa-mento e translocação da proteína, conforme apropriado, podem também serincluídas no cassete de expressão. Uma variedade de promotores, seqüên-cias de sinal, e terminadores de transcrição e translação são descritos (ver,por exemplo, Lawton et ai., 1987, Plant Mol). Biol 9:315; e Patente dos Esta-dos Unidos N0 5.888.789, incorporados aqui por referência. Em adição, ge-nes estruturais para resistência a antibiótico são comumente utilizados comoum fator de seleção (Fraley et ai., 1983, Proc). Nati Acad. Sci., USA80:4803, aqui incorporado por referência. Locais de enzima de restrição úni-cos nas extremidades 5' e 3' do cassete permitem fácil inserção em um vetorpré-existente. Outros sistemas de vetor binário para transformação mediadapor Agrobacterium, conduzindo pelo menos uma seqüência limite de T-DNA,são descritos em PCT/EP99/07414, incorporado aqui por referência.

RegeneraçãoSementes de plantas transformadas podem ser colhidas, secas,limpas e testadas para viabilidade e para a presença e expressão de umproduto de gene desejado. Uma vez que este tenha sido determinado, esto-que de semente é tipicamente armazenado sob condições apropriadas detemperatura, umidade, saneamento e segurança a serem usadas quandonecessário. As plantas totais podem então ser regeneradas de protoplastoscultivados (ver, por exemplo, Evans et ai, Handbook of Plant Cell Cultures,Vol. 1, MacMiIIan Publishing Co). New York, 1983; e Vasil I. R. (ed.), CellCulture and Somatic Cell Genetics of Plants, Acad. Press, Orlando, Vol. I,1984, e Vol. III, 1986, incorporados aqui por referência. Em certos aspectos,as plantas são regeneradas somente ao estágio de broto germinado. Emalguns aspectos, as plantas totais são regeneradas para produzir estoquesde semente, e brotos germinados são geradas a partir das sementes do es-toque de semente.

Todas as plantas das quais protoplastos podem ser isolados ecultivados para dar plantas totais regeneradas podem ser transformadas pe-la presente invenção de modo que as plantas totais são recuperadas, quecontêm o gene transferido. É sabido que praticamente todas as plantas po-dem ser regeneradas a partir das células de cultura ou tecidos, incluindo,mas não limitadas a, todas as espécies maiores de plantas que produzembrotos comestíveis. Algumas plantas adequadas incluem alfafa, munguba,rabanete, trigo, mostarda, espinafre, cenoura, beterraba, cebola, alho, aipo,ruibarbo, uma planta folhosa, tais como repolho ou alface, agrião, ervas, taiscomo salsa, hortelã, ou trevos, couve-flor, brócolis, feijão-soja, lentilhas, flo-res comestíveis, tal como girassol, etc.

Os meios para regeneração variam de uma espécie de plantaspara a próxima. Contudo, aqueles versados na técnica apreciarão que ge-ralmente uma suspensão de protoplantas transformadas contendo cópias dogene heterólogo é primeiro provida. Tecido de calo é formado, e brotos po-dem ser induzidos de calo e, subseqüentemente, arraigados. Alternativa-mente ou adicionalmente, formação de embrião pode ser induzida a partir dasuspensão de protoplastos. Estes embriões germinam como embriões natu-rais para formar plantas. O afundamento da semente na água, ou a pulveri-zação da semente com água para aumentar o teor de umidade da sementepara entre 35-45%, inicia a germinação. Para a germinação proceder, assementes são tipicamente mantidas em ar saturado com água sob condi-ções de temperatura controlada e fluxo de ar. O meio de cultura geralmenteconterá vários aminoácidos e hormônios, tais como auxina e citoquinins. Etambém vantajoso adicionar ácido glutâmico e prolina ao meio, especialmen-te para espécies, tal como alfafa. Brotos e raízes normalmente se desenvol-vem simultaneamente. A regeneração eficiente dependerá do meio, do ge-nótipo, e da história da cultura. Se estas três variáveis são controladas, en-tão a regeneração é totalmente reproduzível e repetível.

As plantas maduras, crescidas a partir de células de planta trans-formadas, são plantas transgênicas homozigóticas de auto e não-segre-gação, são identificadas. Uma planta Uma planta congênita produz semen-tes contendo as seqüências que codificam o antígeno da invenção. Tais se-mentes podem ser germinadas e crescidas ao estágio de broto germinadopara produzir o(s) antígeno(s) de HPV de acordo com a presente invenção.

Em concretizações relacionadas, sementes da presente invençãopodem ser formadas em produtos de semente, e vendidas com instruçõesde como desenvolver brotos para o estágio de broto germinado apropriadopara administração ou colheita em uma composição farmacêutica. Em algu-mas concretizações relacionadas, híbridos ou novas variedades concreti-zando os traços desejados podem ser desenvolvidos de plantas congênitasda invenção.

Integração Direta

Integração direta de fragmentos de DNA no genoma de célulasde planta por bombardeio de microprojétil ou eletroporação pode tambémser usada na presente invenção (ver, por exemplo, Kikkert et ai, 1999, Plant:J. Tissue Cult. Assoc., 35:43; e Bates, 1994, Mol. Biotech., 2:135). Mais par-ticularmente, vetores que expressam antígenos de HPV da presente inven-ção podem ser introduzidos nas células de planta por uma variedade de téc-nicas. Conforme descrito acima, os vetores podem incluir marcadores sele-cionáveis para uso em células de planta. Os vetores podem incluir seqüên-cias que permitem sua seleção e propagação em um hospedeiro secundário,tais como seqüências contendo uma origem de replicação e marcador sele-cionável. Tipicamente, hospedeiros secundários incluem bactéria e levedura.

Em uma concretização, o hospedeiro secundário é bactéria (por exemplo,Escherichia coli, a origem de replicação é um origem tipo CoIEI de replica-ção), e o marcador selecionável é um gene que codifica resistência a ampici-lina. Tais seqüências são bem-conhecidas na técnica, e são comercialmentedisponíveis (por exemplo, Clontech, Palo Alto, CA ou Stratagene, La Jolla, CA).

Os vetores da presente invenção podem também ser modifica-dos em plasmídeos de transformação de planta intermediários que contêmuma região de homologia a um vetor de Agrobacterium tumefaciens, umaregião limite de T-DNA de Agrobacterium tumefaciens, e ácidos nucléicosque codificam antígeno ou cassetes de expressão descritos acima. Vetoresadicionais podem incluir um tumor de planta desarmado incluindo plasmídeode Agrobacterium tumefaciens.

De acordo com esta concretização, transformação direta dos ve-tores da invenção envolve microinjeção dos vetores diretamente nas célulasda planta pelo uso de micropipetas para transferir mecanicamente o DNArecombinante (ver, por exemplo, 1985, Moi. Gen. Genet., 202:179, incorpo-rado aqui por referência). O material genético pode também ser transferidona célula da planta pelo uso de polietileno glicóis (ver, por exemplo, Krens etal., 1982, Nature 296:72). Outro método de introdução de ácidos nucléicosem plantas via penetração balística de alta velocidade por partículas peque-nas com um ácido nucléico, ou dentro da matriz de gotas pequenas, ou par-tículas, ou na superfície (ver, por exemplo, Klein et ai., 1987, Nature 327:70;Knudsen et ai, 1991, Planta 185:330). Ainda outro método de introdução éfusão de protoplastos com outras entidades, ou minicélulas, células, Iisos-somos, ou outros corpos de superfície de lipídeo fusíveis (ver, por exemplo,Fraley et ai., 1982, Proc). Natl. Acad. Sei. USA (1859). Vetores da invençãopodem também serem introduzidos nas células da planta por eletroporação(ver, por exemplo, Fromm et ai, 1985, Proc. Nati Acad. Sei. USA, 82:5824).De acordo com esta técnica, protoplastos de planta são eletroporados napresença de plasmídeos contendo um constructo de gene. Impulsos elétri-cos de reversibilidade de resistência de campo alta permeabilizam biomem-branas permitindo a introdução dos plasmídeos. Os protoplastos de plantaeletroporados reformam a célula, dividem a parede, e formam calo da planta,que podem ser regenerados para formar brotos germinados da invenção.Aqueles versados na técnica apreciarão como utilizar estes métodos paratransformar células de planta que podem ser usadas para gerar brotos ger-minados comestíveis.

Transformação Viral

Similares a sistemas de expressão convencionais, vetores devírus de planta podem ser usados para produzir proteína de comprimentototal, incluindo antígeno de comprimento total. De acordo com a presenteinvenção, os vetores de vírus de planta podem ser usados para infectar eproduzir antígeno(s) em sementes, embriões, brotos germinados, etc, siste-mas virais que podem ser usados para expressar tudo de peptídeos curtos aproteínas complexas grandes. Especificamente, o uso de vetores tobamovi-ral é descrito (ver, por exemplo, McCormick et ai, 1999, Proc. Natl. Acad.Sei. USA 96:703; Kumagai et ai, 2000, Gene , 245:169; e Verch et ai, 1998,J. Immunol. Methods 220:69; cada um do qual incorporado aqui por referên-cia). Desse modo, vetores virais de planta têm uma capacidade demonstra-da de expressar peptídeos curtos, bem como proteínas complexas grandes.

Em certas concretizações, brotos germinados que expressamantígeno de HPV são gerados utilizando um sistema de hospedeiro/vírus. Osbrotos transgênicos produzidos por infecção viral proporcionam uma fonte deproteína transgênica que já foi demonstrado ser segura. Por exemplo, osbrotos são livres de contaminação com patogenias animais. Diferentemente,por exemplo, tabaco, proteínas de um broto comestível podiam pelo menosna teoria ser usadas em aplicações orais sem purificação, reduzindo, dessemodo, significantemente, os custos. Em adição, um sistema de vírus/brotooferece uma via muito mais simples, menos custosa para escala e fabrica-ção, visto que transgenes são introduzidos no vírus, que pode ser desenvol-vido a uma escala comercial dentro de uns poucos dias. Em contraste, plan-tas transgênicas podem requerer até 5-7 anos antes que sementes suficien-te ou material de planta estejam disponíveis para ensaios de grande escalaou comercialização.

De acordo com a presente invenção, os vírus de RNA de plantatêm certas vantagens, enquanto os tornam atrativos como vetores para ex-pressão de proteína estranha. A biologia e patologia molecular de um núme-ro de vírus de RNA de planta são bem caracterizadas, e existe conhecimen-to considerável de biologia, genéticas e seqüência regulatória de vírus. Mui-tos vírus de RNA de planta têm genomas pequenos, e clones de cDNA in-fecciosos são disponíveis para facilitar manipulação genética. Uma vez queo material de vírus infeccioso entra na célula hospedeira susceptível, ele re-plica a altos níveis e se espalha rapidamente através de um broto germinadototal (um a dez dias pós-inoculação). As partículas de vírus são facilmente eeconomicamente recuperadas de tecido de broto germinado infectado. Osvírus têm uma faixa ampla de hospedeiro, capacitando o uso de um cons-tructo simples para infecção de várias espécies susceptíveis. Estas caracte-rísticas são prontamente transferíveis para os brotos.

Seqüências estranhas podem ser expressas de vírus de RNA deplanta, tipicamente pela substituição de um dos genes virais com seqüênciadesejada, pela inserção de seqüências estranhas no genoma do vírus emuma posição apropriada, ou pela fusão de peptídeos estranhos às proteínasestruturais de um vírus. Além disso, quaisquer destas aproximações podemser combinadas para expressarem seqüências estranhas por transcomple-mentação de funções vitais de um vírus. Um número de estratégias diferen-tes existe como ferramentas para expressar seqüências estranhas nas plan-tas infectadas por vírus usando vírus de mosaico de tabaco (TMV), vírus demosaico de alfafa (AIMV), e quimeras destes.

O genoma de AIMV é um representante da família Bromoviridaede vírus, e consiste em três RNAs genômicos (RNAs1-3) e RNA sub-genômico (RNA4) Os RNAs genômicos 1 e 2 codificam proteínas replicasesde vírus P1 e P2, respectivamente. O RNA3 genômico codifica a proteína demovimento de célula a célula P3 e a proteína de revestimento (CP). A CP étransladada de RNA4 subgenômico, que é sintetizado de RNA3 genômico, eé requerido para iniciar a infecção. Estudos têm demonstrado o envolvimen-to da CP em funções múltiplas, incluindo ativação de genoma, replicação,estabilidade de RNA, formação de sintoma, e encapsidação de RNA (ver,por exemplo, Bol et al., 1971, Virology (1971) 46:73; Van Der Vossen et ai,1994, Virology 202:891; Yusibov et ai, Virology 208:405; Yusibov et ai,1998, Virology 242:1; Bol et ai, (Review, 100 refs.), 1999, J. Gen. Virol.,80:1089; De Graaff, 1995, Virology 208:583; Jaspars et ai, Adv. Vírus Res19:37; Loesch-Fries, 1985, Virology 146: 177; Neeleman et ai, 1991, Viro-logy 181:687; Neeleman et ai, 1993, Virology, 196:883; Van Der Kuyl et ai,1991, Virology 183:731; Van Der Kuyl et ai, 1991, Virology, 185:496).

A encapsidação de partículas virais é tipicamente requerida paramovimento de longa distância de vírus de partes inoculadas a não-inoculadas da semente, embrião, ou broto germinado, e para infecção sistê-mica. De acordo com a presente invenção, inoculação pode ocorrer emqualquer estágio de desenvolvimento de planta. Em embriões e brotos, adifusão do vírus inoculado deve ser muito rápida. Virions de AIMV são en-capsidatados por uma CP única (24 kD), formando mais do que um tipo departícula. O tamanho (30 a 60 mm de comprimento e 18 nm de diâmetro) eforma (esférica, elipsoidal, ou baciliforme) de uma partícula dependem dotamanho do RNA encapsidatado. Após montagem, o terminal N do AIMV CPé para estar localizado na superfície das partículas de vírus, e não pareceinterferir com a montagem do vírus (Boi et ai, 1971, Virology 6:73). Adicio-nalmente, o AIMV CP com um adicional de 38 peptídeo aminoácidos em seuterminal N forma partículas in vitro e retém atividade biológica (Yusibov etai, 1995, J. Gen. Viroi, 77:567).

O AIMV tem uma faixa de hospedeiro ampla, que inclui um nú-mero de plantas de colheita agriculturalmente valiosas, incluindo sementesde planta, embriões, e brotos. Juntas, estas características tornam o AIMVCP um excelente candidato como uma molécula transportadora e AIMV umvetor candidato atrativo para a expressão de seqüências estranhas para aexpressão de seqüências estranhas na planta no estágio de broto de desen-volvimento. Além disso, após expressão de um vetor heterólogo, tal comoTMV, o AIMV CP encapsidata o genoma de TMV sem interferir com a infecti-vidade do vírus (Yusibov et ai, 1997, Proc. Nati Acad. Sei. USA 94:5784,incorporado aqui por referência). Isto permite o uso de TMV como um vírusveículo para AIMV CP fundido às seqüências estranhas.

TMV, o protótipo do tobamovírus, tem um genoma consistindoem um RNA simples mais de sentido encapsidatado com uma CP de 17,0kD, que resulta em partículas em forma de haste (300 nm de comprimento).A CP é a única proteína estrutural de TMV, e é requerida para encapsidaçãoe movimento de longa distância do vírus em um hospedeiro infectado (Saitoet ai, 1990, Virology 176:329). As 183 e 128 kD de proteínas são translada-das de RNA genômico, e são requeridas para replicação de vírus (Ishikawaet ai, 1986, Nucleic Acids Res., 14:8291). A proteína de 30 kD é a proteínade movimento de célula a célula de vírus (Meshi et ai, 1987, EMBO J.6:2557). As proteínas de movimento e de revestimento são transladadas deRNAs sub-genômicos (Hunter et al., 1976, Nature 260:759; Bruening et ai,1976, Virology 71:498; e Beachy et ai, 1976, Virology 73:498; cada um doqual sendo incorporado aqui por referência).

Outros métodos de transformação de tecidos de planta incluemtransformação da flor de uma planta. A transformação de Arabidopsis thalia-na pode ser alcançada pela imersão das flores da planta em uma solução deAgrobaeterium tumefaeiens (Curtis et ai, 2001, Transgenie Res., 10:363; eQing et ai, Molecular Breeding: New Strategies in Plant Improvement, 1:67).Plantas transformadas são formadas na população de sementes geradaspelas "plantas imersas". Em um ponto específico durante desenvolvimentoda flor, um poro existe na parede do ovário através da qual Agrobaeteriumtumefaeiens ganha acesso ao interior do ovário. Uma vez no interior do ová-rio, o Agrobaeterium tumefaeiens prolifera e transforma os óvulos individuais(Desfeux et ai, 2000, Plant Physiology, 123:895). Os óvulos transformadosseguem a trajetória típica de formação de semente no interior do ovário.Produção e Isolamento de Antígeno

Em geral, métodos padrão-conhecidos na técnica podem ser u-sados para cultura ou crescimento de plantas, células de planta, e/ou tecidosde planta da invenção (por exemplo, plantas clonais, células de planta clo-nais, raízes clonais, linhas de raiz clonais, brotos, brotos germinados, plan-tas, etc.), para produção de antígeno(s). Uma ampla variedade de meio decultura e biorreatores foram empregados para cultura de células de raiz compelos, linhas de célula de raiz e células de planta (ver, por exemplo, Giri etai, 2000, Biotecnolol. Adv., 18:1; Rao et ai, 2002, Biotechnol. Adv., 20:101;e referências em ambos dos precedentes, todos dos quais sendo aqui incor-porados por referência). Plantas clonais podem ser crescidas em qualquermaneira adequada.

Em certas concretizações, os antígenos de HPV da invenção po-dem ser produzidos por qualquer método conhecido. Em algumas concreti-zações, um antígeno de HPV é expresso em uma planta ou porção desta. Asproteínas são isoladas e purificadas de acordo com condições e técnicasconvencionais conhecidas na técnica. Estas incluem métodos, tais comoextração, precipitação, cromatografia, cromatografia de afinidade, eletrofore-se, e similares. A presente invenção envolve a purificação e escala alcançá-vel de produção de antígeno(s) de HPV usando qualquer de uma variedadede sistemas de expressão de planta conhecido na técnica e providos aqui,incluindo sistemas de expressão de planta virais aqui descritos.

Em muitas concretizações da presente invenção, será desejávelisolar produtos de antígeno de vacina. Onde uma proteína da invenção éproduzida de tecido(s) de planta ou uma porção deste(s), por exemplo, raí-zes, células de raiz, plantas, células de planta que as expressam, métodosdescritos em detalhes adicionais aqui, ou quaisquer métodos aplicáveis co-nhecidos na técnica, podem ser usados para qualquer de um isolamentoparcial ou completo de material de planta. Onde é desejável isolar um produ-to de expressão de alguma ou toda de células de planta ou tecidos que aexpressam, quaisquer técnicas de purificação disponíveis podem ser empre-gadas. Aqueles versados na técnica são familiares com uma faixa ampla deprocedimentos de fracionamento e separação (ver), por exemplo, Scopes etal., Protein Purification: Principie and Practice, 35 Edição, Janson et ai,1993; Protein Purification: Principies, High Resolution Methods, and Applica-tions, Wiley-VCH, 1998; Springer-Verlag1 NY1 1993; e Roe1 Protein Purificati-on Techniques, Oxford University Press, 2001, cada um do qual sendo aquiincorporado por referência. Freqüentemente, será desejável produzir umproduto mais do que 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%,94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% puro. Ver, por exemplo, Patentes dosEstados Unidos 6.740.740 e 6.841.659 para discussão de certos métodosúteis para purificação de substâncias de tecidos ou fluidos de planta.

Aqueles versados na técnica também apreciarão que um métodode obtenção de produtos de vacina desejado é por extração. O material deplanta (por exemplo, raízes, folhas, etc) pode ser extraído para remover pro-dutos desejados de biomassa residual, aumentando, desse modo, a concen-tração e pureza de um produto. As plantas podem ser extraídas em uma so-lução tampão. Por exemplo, o material de planta pode ser transferido emuma quantidade de água gelada a uma razão de um para um por peso, quefoi tamponada com, por exemplo, tampão de fosfato. Inibidores de proteasepodem ser adicionados conforme requerido. O material de planta pode serrompido por mistura ou moagem vigorosas enquanto suspenso na soluçãotampão, e a biomassa extraída removida por filtração ou céntrifugação. Oproduto transportado na solução pode adicionalmente ser purificado por eta-pas adicionais, ou convertido a um pó seco por congelamento-secagem ouprecipitação. A extração pode ser efetuada por prensagem. As plantas ouraízes podem ser extraídas por prensagem em uma prensa, ou moídas amedida que elas passam através de rolos proximamente espaçados. Os flui-dos expressos a partir das plantas ou raízes moídas são coletados e proces-sados de acordo com métodos bem-conhecidos na técnica. A extração porprensagem permite a liberação de produtos em uma forma mais concentra-da. Contudo, o rendimento total do produto pode ser mais baixo do que seum produto fosse extraído em solução.

VacinaA presente invenção proporciona proteínas de antígeno farma-cêuticas para uso terapêutico, tal como proteína(s) de antígeno, ou por-ção(ões) imunogênica(s) desta(s) ativa(s) como uma vacina para tratamentoterapêutico e/ou profilático de infecção de HPV. Adicionalmente, a invençãoproporciona uso veterinário, visto que proteína de antígeno ou porção imu-nogênica desta é ativa em aplicações veterinárias. Em certas concretiza-ções, antígeno(s) pode(m) ser produzido(s) por planta(s) ou porção desta(s)(por exemplo, raiz, célula, broto, linha de célula, planta, etc.) da invenção.Em certas concretizações, os antígenos de HPV são expressos em plantas,células de planta, e/ou tecidos de planta (por exemplo, brotos, brotos germi-nados, raízes, cultura de célula, células clonais, linhas de célula clonais,plantas clonais, etc.), e podem ser usados diretamente de uma planta, ouparcialmente purificados ou purificados na preparação para administraçãofarmacêutica a um indivíduo.

A presente invenção proporciona plantas, células de planta, etecidos de planta que expressam antígeno(s) que mantêm atividade farma-cêutica quando administrados a um indivíduo em necessidade deste. Emcertas concretizações, os indivíduos incluem vertebrados, (por exemplo,mamíferos, tais como humanos). De acordo com a presente invenção, osindivíduos incluem indivíduos veterinários, tais como bovinos, ovinos, cani-nos, felinos, etc. Em certos aspectos, uma planta comestível ou porção des-ta (por exemplo, broto, raiz) é administrada oralmente a um indivíduo emuma quantidade terapeuticamente efetiva. Em alguns aspectos, um ou maisantígeno(s) de HPV é (são) provido(s) em uma preparação farmacêutica,conforme descrito aqui.

As composições de vacina da invenção compreendem um oumais antígenos de HPV. Em certas concretizações, pelo menos dois antíge-nos de HPV da invenção são incluídos em uma composição de vacina admi-nistrada.

De acordo com a presente invenção, o tratamento de um indiví-duo com um antígeno de vacina é pretendido para induzir um efeito fisiológi-co. Uma proteína de vacina pode ter propriedades curativas ou paliativascontra uma enfermidade ou doença, e pode ser administrada para aliviarmelhora, aliviar, retardar começo de reverso, ou diminuir sintomas ou severi-dade de uma doença ou enfermidade. Um antígeno de vacina pode ter pro-priedades profiláticas, e pode ser usado para impedir ou retardar começo deuma doença, ou diminuir a severidade de tal doença, enfermidade, ou condi-ção patológica quando ela aparece. Um efeito fisiológico induzido pelo tra-tamento de um indivíduo com antígeno de acordo com a presente invençãopode incluir uma resposta imune efetiva tal que infecção por um organismo éimpedida.

Em algumas concretizações, as vacinas da invenção são distri-buídas por vias orais e/ou mucosais. A administração oral e/ou mucosal temo potencial de impedir a infecção de tecidos mucosais, a abertura principalde infecção para muitas patogenias. A distribuição oral e/ou mucosal podeiniciar resposta imune sistêmica. Tem sido progresso considerável no de-senvolvimento de sistemas de expressão heterólogos para a administraçãooral de antígenos que estimulam o sistema imune mucosal, e pode iniciarimunidade sistêmica. Esforços prévios na distribuição de vacina oral, contu-do, têm demonstrado um requerimento de quantidades consideráveis de an-tígeno em alcançar eficiência. Desse modo, a produção econômica de gran-des quantidades de antígenos-alvos é um pré-requisito para a criação devacinas orais efetivas. O desenvolvimento de plantas que expressam antí-genos, incluindo antígenos termoestáveis, representa uma aproximaçãomais realísticas a tais dificuldades.

As preparações farmacêuticas da presente invenção podem seradministradas em uma ampla variedade de modos ao indivíduo, tais como,por exemplo, oralmente, enteralmente, nasalmente, parenteralmente, intra-muscularmente ou intravenosamente, retalmente, vaginalmente, topicamen-te, ocularmente, pulmonarmente, ou por aplicação de contato. Em certasconcretizações, um antígeno de HPV expresso em uma planta ou porçãodesta é administrado a um indivíduo oralmente por administração direta daplanta ao indivíduo. Em alguns aspectos, uma proteína de vacina expressaem uma planta ou porção desta é extraída e/ou purificada, e usada para apreparação de uma composição farmacêutica. Pode ser desejável formulartais produtos isolados para seu uso pretendido (por exemplo, como um a-gente farmacêutico, composição de vacina, etc.). Em algumas concretiza-ções, será desejável formular os produtos junto com alguns ou todos dostecidos de planta que os expressam.

Onde é desejável formular o produto junto com o material deplanta, será freqüentemente desejável ter uma planta que seja não tóxica aorecipiente relevante (por exemplo, um humano ou outro animal). Tecido deplanta relevante (por exemplo, células, raízes, folhas) pode simplesmenteser colhido e processado de acordo com técnicas conhecidas na técnica,com devida consideração para manter atividade do produto expresso. Emcertas concretizações da invenção, é desejável ter expressado o antígeno devacina em uma planta comestível (e, especificamente, em porções comestí-veis da planta), de modo que o material pode ser subseqüentemente comi-do. Por exemplo, onde o antígeno de vacina é ativo após distribuição oral(quando corretamente formulado), pode ser desejável produzir a proteína deantígeno em uma porção de planta comestível, e para formular o antígenode vacina expresso para distribuição oral junto com o algum ou todo do ma-terial de planta com o qual a proteína foi expressa.

Os antígenos de vacina providos podem ser formulados de acor-do com técnicas conhecidas. Por exemplo, uma quantidade efetiva de umproduto de vacina pode ser formulada junto com um ou mais materiaistransportadores farmaceuticamente adequados, orgânicos ou inorgânicos,líquido ou sólido. Um antígeno de vacina produzido de acordo com a presen-te invenção pode ser empregado em formas de dosagem tais como compri-midos, cápsulas, pastilhas, dispersões, suspensões, soluções, cápsulas,cremes, ungüentos, aerosóis, pacotes de pó, soluções líquidas, solventes,diluentes, agentes ativos de superfície, agentes isotônicos, agentes de es-pessamento ou emulsificante, preservativos, e ligações sólidas, consideran-do-se que a atividade biológica da proteína não seja destruída por tal formade dosagem.

Em geral, as composições podem compreender qualquer de umavariedade de transportador(es) farmaceuticamente aceitável(eis) diferen-te(s), adjuvante(s), ou veículo(s), ou uma combinação de um ou mais tal(is)transportador(es), adjuvante(s), ou veículo(s). Conforme aqui usado, a lin-guagem "veículo farmaceuticamente aceitável, adjuvante ou veículo" incluisolventes, meio de dispersão, revestimentos, agentes antibacterial ou anti-fungal, agentes de absorção e retardamento, e similares, compatíveis comadministração farmacêutica. Os materiais que podem servir como transpor-tadores farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a,açúcares, tais como lactose, glicose e sacarose, amidos, tais como amido demilho e amido de batata; celulose e seus derivados, tais como carboximetilcelulose de sódio, etil celulose e acetato de celulose; tragacanto em pó; mal-te, gelatina; talco; excipientes, tais como manteiga de cacau e ceras de su-positório; óleos, tais como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão;óleo de girassol; óleo de gergelim; óleo de oliva; óleo de milho e óleo de so-ja; glicóis, tal como propileno glicol; ésteres, tais como oleato de etila e Iaura-to de etila; ágar; agentes de tamponamento, tais como hidróxido de magné-sio e hidróxido de alumínio; ácido algínico; água livre de pirogênio; salinaisotônica; solução de Ringer; álcool etílico, e soluções tampão de fosfato,bem como outros lubrificantes não-tóxicos, tais como Iauril sulfato de sódio eestearato de magnésio, bem como agentes colorantes, agentes de liberação,agentes de revestimento, agentes de adoçamento, agentes aromatizantes, eagentes perfumantes, conservantes, e antioxidantes, podem estar presentesna composição, de acordo com o julgamento do formulador (ver tambémRemington's Pharmaceutical Sciences, Décima Quinta Edição, E. W. martin(Mack Publishing Co., Easton PA, 1975)). Por exemplo, o produto de antíge-no de vacina pode ser provido como uma composição farmacêutica por meiode processos convencionais de produção de granulação por mistura, disso-lução, liofilização, ou processos similares.

Componentes adicionais de vacina

As vacinas da invenção podem incluir adicionalmente qualqueradjuvante adequado para aumentar a imugenicidade da vacina quando ad-ministrada a um indivíduo. Por exemplo, tal(is) adjuvante(s) pode(m) incluir,sem limitação, extratos de Quillaja saponaria (QS)1 incluindo sub-fraçõespurificadas de grau de alimentação QS1 tais como Quil A e QS-21, alum, hi-dróxido de alumínio, fosfato de alumínio, MF59, Malp2, adjuvante de Freundincompleto; adjuvante de Freund completo; lipídeo A 3 De-O-monofosforilacilatado (3D-MPL). Adjuvantes adicionais podem incluir oligonucleotídeosimunomodulatórios, por exemplo, seqüência CpG não-metilatada conformedescrita em WO 96/02555. Combinações de adjuvantes diferentes, tais co-mo aquelas mencionadas aqui acima, são contempladas como proporcio-nando um adjuvante que é um estimulador preferencial de resposta de célulaTH1. Por exemplo, QS21 pode ser formulado junto com 3D-MPL. A razão deQS21:3D-MPL será tipicamente na ordem de 1:10 a 10:1; 1:5 a 5:1; e fre-qüentemente substancialmente 1:1. Em algumas concretizações, a faixa deenergia ótima é 2,5:1 a 1:1 3D-MPLQS21. Doses de extratos de QS purifi-cados para uso em uma formulação de vacina humana são de 0,01 mg a 10mg por quilograma de peso corpóreo.

Deve ser notado que certas proteínas termoestáveis (por exem-plo, lichenase) podem demonstrar atividade de potencialização de imunor-resposta, tal que o uso de tal proteína se em uma fusão com um antígeno deHPV ou separadamente pode ser uso considerado de um adjuvante. Dessemodo, as composições de vacina da invenção podem adicionalmente com-preender um ou mais adjuvantes. Certas composições de vacina podemcompreender dois ou mais adjuvantes. Além disso, dependendo da formula-ção e vias de administração, certos adjuvantes podem ser desejados emformulações e/ou combinações particulares.

Em certas situações, pode ser desejável prolongar o efeito deuma vacina da invenção pelo abaixamento da absorção de um ou maiscomponentes do produto de vacina (por exemplo, proteína) que é subcuta-neamente ou intramuscularmente injetada. Isto pode ser efetuado pelo usode uma suspensão líquida de material cristalino ou amorfo com solubilidadepobre em água. A taxa de absorção do produto então depende de sua taxade dissolução, que, por sua vez, pode depender do tamanho e forma. Alter-nativamente ou adicionalmente, absorção retardada de um produto parente-ralmente administrado por dissolução ou suspensão do produto em um veí-culo de óleo. Formas de depósito injetáveis são produzidas pela formaçãode matrizes de microcápsulas da proteína em polímeros biodegradáveis, taiscomo polilactide-poliglicolide. Dependendo da razão de produto para políme-ro e da natureza do polímero particular empregada, a taxa de liberação podeser controlada. Exemplos de polímeros biodegradáveis incluem po-li(ortoésteres) e poli(anidridos). Formulações injetáveis de depósito podemser preparadas por encerramento do produto em Iipossomas ou microemul-sões, que são compatíveis com os tecidos do corpo. Veículos de distribuiçãopoliméricos alternativos podem ser usados para formulações orais. Por e-xemplo, polímeros biocompatíveis biodegradáveis, tais como etileno vinilacetato, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácidopoliláctico, etc., podem ser formulados como micropartículas, por exemplo,em combinação com um veículo de distribuição polimérico.

Preparações enteralmente administradas de antígenos de vacinapodem ser introduzidas na forma sólida, semi-sólida, de suspensão e deemulsão, e podem ser compostas com quaisquer transportadores farmaceu-ticamente aceitáveis, tais como água, agentes de suspensão, e agentes e-mulsificantes. Os antígenos podem ser administrados por meio de bombasou formas de liberação sustentada, especialmente quando administradoscomo uma medida preventiva, de modo a prevenir o desenvolvimento dedoença em um indivíduo, ou para melhorar ou retardar doença estabelecida.Compostos ativos suplementares, por exemplo, compostos independente-mente ativos contra a doença ou condição clínica a ser tratada, ou compos-tos que aumentam a atividade de um composto da invenção, podem ser in-corporados em ou administrados com as composições. Agentes aromatizan-tes e colorantes podem ser usados.

Os produtos de vacina da invenção, opcionalmente juntos comtecido de planta, são particularmente bem adequados para administraçãooral como composições farmacêuticas. Formulações líquidas orais podemser usadas e podem ser de utilidade particular para populações pediátricas.O material de planta colhido pode ser processado em qualquer de uma vari-edade de modos (por exemplo, secagem a ar, secagem por congelamento,extração, etc.), dependendo das propriedades do produto terapêutico dese-jado e sua forma desejada. Tais composições conforme descritas acima po-dem ser ingeridas oralmente somente, ou ingeridas com alimento ou alimen-tação, ou com uma bebida. As composições para administração oral incluemplantas; extração das plantas, e proteínas purificadas de plantas infectadasprovidas como pós secos, produtos alimentícios, solventes aquosos ou não-aquosos, suspensões ou emulsões. Exemplos de solventes não-aquosossão propileno glicol, polietileno glicol, óleo vegetal, óleo de peixe, e ésteresorgânicos injetáveis. Transportadores aquosos incluem água, soluções deágua-álcool, emulsões ou suspensões, incluindo salina e veículos parente-rais mediais tamponados, incluindo solução de cloreto de sódio, solução dedextrose de Ringer, solução de dextrose mais cloreto de sódio, solução deRinger contendo lactose, ou óleos fixados. Exemplos de pós secos incluemqualquer biomassa de planta que foi secada, por exemplo, secada por con-gelamento, secada em ar, ou secada por pulverização. Por exemplo, asplantas podem ser secadas a ar por colocação das mesmas em um secadorde ar comercial a cerca de 120 graus Fahrenheit até que a biomassa conte-nha menos do que 5% de umidade por peso. As plantas secas são armaze-nadas para processamento adicional como sólidos de massa, ou adicional-mente processadas por moagem a um pó de tamanho de malha desejado.Alternativamente ou adicionalmente, secagem por congelamento pode serusada para produtos que são sensíveis a secagem por ar. Os produtos po-dem ser secados por congelamento pela colocação dos mesmos em um se-cador a vácuo, e secados congelados sob um vácuo até que a biomassacontenha menos do que 5% de umidade por peso. O material seco pode seradicionalmente processado conforme descrito aqui.

O material derivado de planta pode ser administrado como oujunto com uma ou mais preparações herbáceas. Alguns exemplos de prepa-rações herbáceas incluem tinturas, extratos (por exemplo, extratos aquosos,extratos de álcool), decocções, preparações secas (por exemplo, secadas aar, secadas por pulverização, ou secadas por congelamento), pós, (por e-xemplo, pó liofilizado), e líquido. Preparações herbáceas podem ser providasem qualquer veículo de distribuição padrão, tais como uma cápsula, com-primido, supositório, dosagem líquida, etc. Aqueles versados na técnica a-preciarão as várias formulações e modalidades de distribuição de prepara-ções herbáceas que podem ser aplicadas a presente invenção.

As linhas de raiz, linhas de células, plantas, extrações, pós, pre-parações secas e proteína purificada ou produtos de ácido nucléico, etc. dainvenção podem estar na forma encapsulada com ou sem um ou mais exci-pientes conforme notado acima. Formas de dosagem sólidas, tais comocomprimidos, drágeas, cápsulas, pílulas e grânulos podem ser preparadascom revestimentos e invólucros, tais como revestimentos entéricos, revesti-mentos de liberação controlada, e outros revestimentos bem-conhecidos natécnica de formulação farmacêutica. Em tais formas de dosagem sólida oagente ativo pode ser misturado com pelo menos um diluente inerte, tal co-mo sacarose, Iactose ou amido. Tais formas de dosagem podem compreen-der, conforme é prática normal, substâncias adicionais outras do que diluen-tes inertes, por exemplo, lubrificantes de comprimido e outros auxiliares decomprimido, tais como um estearato de magnésio e celulose microcristalina.

No caso de cápsulas, comprimidos e pílulas, as formas de dosagem podemcompreender agentes de tamponamento. Elas podem opcionalmente conteragentes de opacidade, e podem ser de uma composição que elas liberamo(s) ingrediente(s) ativo(s) somente, em uma certa parte do trato intestinal,e/ou em uma maneira retardada. Exemplos de composições de encrustaçãoque podem ser usadas incluem substâncias poliméricas e ceras.

Em alguns métodos, uma planta ou porção desta expressandoum antígeno de HPV de acordo com a presente invenção, ou biomassa des-tas, é administrada oralmente como alimento medicinal. Tais composiçõescomestíveis são tipicamente consumidas como produto em bruto de comer,se em uma forma sólida, ou por bebida, se na forma líquida. O material deplanta pode ser diretamente ingerido sem uma etapa de processamento an-terior, ou após preparação culinária mínima. Por exemplo, a proteína de va-cina pode ser expressa em um broto que pode ser comido diretamente. Porexemplo, antígenos de vacina podem ser expressos em um broto de alfaia,broto de munguba, ou broto de espinafre, ou broto de folha de alface, etc.

Em uma concretização, a biomassa planta pode ser processada, e o materialrecuperado após a etapa de processamento é ingerido.

Métodos de processamento úteis de acordo com a presente in-venção são métodos comumente usados na indústria de alimento e de ali-mentação. Os produtos finais de tais métodos incluem tipicamente umaquantidade substancial de um antígeno expresso, e podem ser convenien-temente comidos ou bebidos. O produto final pode ser misturado com outroalimento ou formas de alimentação, tais como sais, transportadores, intensi-ficadores de sabor, antibióticos, e similares, e consumidos na forma sólida,semi-sólida, de suspensão, de emulsão, ou líquida. Tais métodos podemincluir uma etapa de conservação, tal como, por exemplo, pasteurização,cozimento, ou adição de agentes de conservação e de preservação. Qual-quer planta pode ser usada e processada na presente invenção para produ-zir matéria de planta comível ou bebível. A quantidade de antígeno de HPVem uma preparação derivada de planta pode ser testada por métodos pa-drões na técnica, por exemplo, eletroforese de gel, ELISA, ou análise dewestern blot, usando-se uma sonda ou anticorpo específico para o produto.

Esta determinação pode ser usada para padronizar a quantidade de proteínade antígeno de vacina ingerida. Por exemplo, a quantidade de antígeno devacina pode ser determinada e regulada, por exemplo, por mistura de bate-Iadas de produto tendo níveis eficientes de produto de modo que a quanti-dade de material a ser bebida ou comida para ingerir uma dose simples po-de ser padronizada. O ambiente regulável contido da presente invenção,contudo, deve minimizar a necessidade de efetuar tais procedimentos depadronização.

Uma proteína de vacina produzida em uma célula ou tecido deplanta e comida por um indivíduo pode ser preferivelmente absorvida pelosistema digestivo. Uma vantagem da ingestão de tecido de planta que tenhasido apenas minimamente processado é proporcionar encapsulamento ouseqüestro da proteína em células da planta. Desse modo, o produto podereceber pelo menos alguma proteção de digestão no trato digestivo superiorantes de alcançar o intestino, e uma proporção mais alta de produto ativoseria disponível para percepção.

As composições farmacêuticas da presente invenção podem seradministradas terapeuticamente ou profilaticamente. As composições podemser usadas para tratar ou prevenir uma doença. Por exemplo, qualquer indi-víduo que sofre de uma doença, ou que está em risco de desenvolver infec-ção de HPV, pode ser tratado. Será apreciado que um indivíduo pode serconsiderado em risco de desenvolver uma doença sem ter sido diagnostica-do com quaisquer sintomas da doença. Por exemplo, se o indivíduo é co-nhecido como tendo sido, ou para ser pretendido para estar em situaçõescom risco relativamente alto de exposição a infecção de HPV, este indivíduoserá considerado em risco de desenvolver a doença. Similarmente, se mem-bros de uma família de indivíduos, amigos ou parentes foram diagnosticadoscom infecção de HPV, o indivíduo pode ser considerado estar em risco dedesenvolver a doença.

As formas de dosagem líquida para administração oral incluem,mas não estão limitadas a, emulsões farmaceuticamente aceitáveis, microemulsões, soluções, suspensões, xaropes e elixires. Em adição aos agentesativos, as formas de dosagem líquida podem conter diluentes inertes comu-mente usados na técnica, tais como, por exemplo, água ou outros solventes,agentes de solubilização e emulsificantes, tais como álcool etílico, álcool i-sopropílico, carbonato de etila, acetato de etila, álcool de benzílico, benzoatode benzílico, propileno glicol, 1,3-butileno glicol, dimetilformamida, óleos (emparticular, óleo de semente de algodão, óleo de amendoim, óleo de milho,óleo de germe, óleo de oliva, óleo de rícino, e óleo de gergelim), glicerol,álcool tetrahidrofurfurílico, polietileno glicóis e ésteres de ácido graxo de sor-bitan, e misturas destes. Além dos diluentes inertes, as composições oraispodem incluir adjuvantes, tais como agentes de umedecimento, agentesemulsificantes e agentes de suspensão, agentes adoçantes, flavorizantes ede perfume.

As composições para administração retal ou vaginal podem sersupositórios ou enemas de retenção, que podem ser preparados pela mistu-ra das composições desta invenção com excipientes ou transportadoresnão-irritantes adequados, tais como manteiga de cacau, polietileno glicol, ouuma cera de supositório que são sólidos à temperatura ambiente, mas líqui-dos na temperatura do corpo e, portanto, derretem no reto ou cavidade vagi-nal, e liberam a proteína ativa.

As formas de dosagem para administração tópica ou transdermalde uma composição de vacina desta invenção incluem ungüentos, pastas,cremes, loções, géis, pós, soluções, pulverizações, inalantes ou emplastros.

O agente ativo, ou preparação deste, é misturado sob condições estéreiscom um veículo farmaceuticamente aceitável e quaisquer conservantes outampões necessários conforme podem ser requeridos. Para administraçãotransmucosal ou transdermal, penetrantes apropriados à barreira a ser per-meada podem ser usados na formulação. Tais penetrantes são geralmenteconhecidos na técnica, por exemplo, para administração transdermal, deter-gentes, sais de bile, e derivados ácidos fusídicos. A administração transmu-cosal pode ser acompanhada através do uso de pulverizações nasais ousupositórios. Para administração transdermal, antígeno, ou uma porção imu-nogênica deste, podem ser formulados em ungüentos, pomadas, géis oucremes, conforme geralmente conhecidos na técnica. Formulação oftálmica,gotas no ouvido e gotas no olho são também contempladas como estandodentro do escopo desta invenção. Adicionalmente, a presente invenção con-templa o uso de emplastros transdermais, que têm a vantagem adicional deproporcionar distribuição controlada de uma proteína de vacina ao corpo.Tais formas de dosagem podem ser produzidas por suspensão ou dispensado produto de vacina no meio correto. Intensificadores de absorção podemser usados para aumentar o fluxo da proteína de vacina através da pele. Ataxa pode ser controlada, ou pela provisão de uma membrana de controle detaxa, ou pela dispersão da proteína de vacina em uma matriz de polímero ougel.

As composições da invenção são administradas em tais quanti-dades e por tal tempo conforme é necessário para alcançar o resultado de-sejado. Em certas concretizações da presente invenção, uma "quantidadeterapeuticamente efetiva" de uma composição farmacêutica é aquela quanti-dade efetiva para tratamento, atenuação, ou prevenção de uma doença emum indivíduo. Desse modo, a "quantidade efetiva para tratar, atenuar ou pre-venir doença", conforme usado aqui, se refere a uma quantidade não-tóxica,mas suficiente, da composição farmacêutica para tratar, atenuar ou prevenirdoença em qualquer indivíduo. Por exemplo, a "quantidade terapeuticamen-te efetiva" pode ser uma quantidade para tratar, atenuar ou prevenir infecção(por exemplo, infecção viral, infecção de HPV).

A quantidade exata requerida variará de indivíduo para indivíduo,dependendo da espécie, idade e condições gerais do indivíduo, do estágioda doença, a mistura farmacêutica particular, seu modo de administração, esimilares. Antígenos de anthrax da invenção, incluindo antígeno(s) que ex-pressa(m) plantas e/ou preparações destes, podem ser formulados em for-ma de unidade de dosagem para facilidade de administração e uniformidadede dosagem. A expressão "forma de unidade de dosagem", conforme aquiusada, se refere a uma unidade fisicamente distinta de composição de vaci-na apropriada para o paciente a ser tratado. Será compreendido, contudo,que o uso diário total das composições da presente invenção é tipicamentedecidido por um médico atendente dentro do escopo do julgamento médico.O nível de dose terapeuticamente efetivo específico para qualquer pacienteparticular ou organismo pode depender de uma variedade de fatores, inclu-indo a severidade ou risco de infecção; a atividade do composto específicoempregado; a composição específica empregada; a idade, peso corpóreo,saúde geral, sexo do paciente, dieta do paciente, condições farmacocinéti-cas do paciente, o tempo de administração, via de administração, e taxa deexcreção do composto específico empregado; a duração do tratamento; fár-macos usados em combinação ou coincidental com a composição de vacinaempregada; e fatores similares bem-conhecidos nas técnicas médicas.

Será também apreciado que as composições farmacêuticas dapresente invenção podem ser empregadas em terapias de combinação (porexemplo, combinação de terapias de combinação), isto é, as composiçõesfarmacêuticas podem ser administradas concorrentemente com, antes de,ou subseqüente a, um ou mais outros procedimentos de vacinação deseja-dos. A combinação particular de terapias (por exemplo, vacinas, tratamentoterapêutico de infecção de HPV) para empregar em um regime de combina-ção levará em conta compatibilidade dos terapêuticos e/ou procedimentosdesejados, e o efeito terapêutico desejado a ser alcançado. Será apreciadoque as terapias e/ou vacinas empregadas podem alcançar um efeito deseja-do para a mesma enfermidade (por exemplo, um composto da invenção po-de ser administrado concorrentemente com outra vacina de HPV), ou elespodem alcançar efeitos diferentes. Em certas concretizações, as composi-ções de vacina compreendem pelo menos dois antígenos de HPV. Por e-xempio, certas composições de vacina podem compreender pelo menos doisantígenos da invenção (por exemplo, uma E7 de domínio de HPV16 e umaE7 de domínio de HPV18 contendo antígeno da invenção). Em alguns as-pectos, tal combinação de vacinas pode incluir uma proteína de fusão ter-moestável compreendendo antígeno de HPV; em alguns aspectos, duas oumais proteínas de fusão termoestáveis compreendendo antígeno de HPVsão providas. Em certas concretizações, antígenos múltiplos serão derivadosde HPV da mesma cepa, e podem incluir antígenos derivados de proteínasdiferentes. Em algumas concretizações, antígenos múltiplos serão derivadosde HPV da mesma cepa, e podem incluir antígenos derivados da mesmaproteína (por exemplo, domínios diferentes da mesma proteína). Em certasconcretizações, antígenos múltiplos serão derivados de HPV de cepas ver-dadeiras, e incluem antígenos derivados de proteínas diferentes. Ainda ou-tras combinações contemplam uso de antígenos múltiplos derivados de ce-pas diferentes e da mesma proteína. Variações e/ou combinações das com-binações exemplares precedentes são contempladas. Por exemplo, em al-gumas concretizações, um domínio de E7, dois domínios de E7 ou três do-mínios de E7 de cepas diferentes são combinados para compreenderemuma composição de vacina da invenção. Onde combinação de vacinas éutilizada, será compreendido que qualquer combinação de antígenos deHPV pode ser usada para tais combinações.Kits

Em um aspecto, a presente invenção proporciona um envoltórioou kit farmacêutico incluindo brotos germinados vivos, entidade cional ouplanta que produz uma antígeno de HPV de acordo com a presente inven-ção, ou preparações, extratos, ou composições farmacêuticas contendo avacina em um ou mais recipientes preenchidos com um ou mais dos ingredi-entes das composições farmacêuticas da invenção. Em certas concretiza-ções, o envoltório ou kit farmacêutico inclui um agente terapêutico aprovadoadicional (por exemplo, antígeno de HPV, vacina de HPV) para uso comouma terapia de combinação. Opcionalmente associado com tal(is) recipien-te(s) pode estar um aviso na forma prescrita por uma agência governamentalque regula a fabricação, uso ou venda de produtos farmacêuticos, com avi-sos que refletem aprovação pela agência de fabricação, uso ou venda paraadministração humana.

Os kits são providos que incluem reagentes terapêuticos. Comoum exemplo, mas não limitativo, vacina de HPV pode ser provida como for-mulações orais e administradas como terapia. Alternativamente ou adicio-nalmente, a vacina de HPV pode ser provida em uma formulação injetávelpara administração. Doses farmacêuticas ou instruções, portanto, podem serprovidas no kit para administração a um indivíduo que sofre de, ou está emrisco de infecção de HPV.

Os exemplos representativos que se seguem são pretendidospara ajudar a ilustrar a invenção, e não são pretendidos para, nem devemser construídos para limitar o escopo da invenção. De fato, várias modifica-ções da invenção e muitas concretizações adicionais destas, em adição à-quelas mostradas e descritas aqui, tornar-se-ão aparentes àqueles versadosna técnica a partir dos conteúdos totais deste documento, incluindo os e-xemplos que se seguem e as referências à literatura científica e de patenteaqui citada. Os exemplos seguintes contêm informação, exemplificação eguia, que podem ser adaptadas à prática desta invenção em suas váriasconcretizações, e os equivalentes destas.

ExemplificaçãoExemplo 1. Geração de Constructos Candidatos de Vacina

Geração de seqüências de antíaeno de vírus paoiloma humano

Devido a interesses de segurança, o oncogene de HPV16 E7(K0278, Seedorf et ai, 1985, Virology, 145:181) já clonado em pQE30(pQE30-E7) entre locais de restrição BamHI/Pstl, sofreu mutação usando-seKit de Mutagênese de Local Dirigido Quikchange (Stratagene) para gerar oplasmídeo pQE30-E7GGG. Três mutações de ponto foram introduzidas nolocal de ligação pRB do gene E7 conforme indicado pelos oligonucleotídeosem negrito dos prímeres purificados de "cromatografia líquida de polinucleo-tídeo rápida" para frente e para trás designados para introduzir mutações,respectivamente:

E7GGG dir:

<image>image see original document page 59</image>

E7GGG rev:

<image>image see original document page 59</image>

As mutações introduzidas, resultadas na substituição dos trêsaminoácidos na seqüência de proteína E7: D21G (Asp21 > Gly), C24G(Cys24 > Gly), E26G (Glu26 > Gly) aboliram o potencial de transformação deproteína E7. A autenticidade do gene resultante, denotado E7GGG, foi con-firmada pelo seqüenciamento

HPV16 E7 (K02718, Seedorf et ai, supra) (SEQ ID N0:1)

ATGCATGGAGATACACCTACATTGCATGAATATATGTTAGATTTGCAACCAGA

GACAACTGATCTCTACTGTTATGAGCAATTAAATGACAGCTCAGAGGAGGAG

GATGAAATAGATGGTCCAGCTGGACAAGCAGAACCGGACAGAGCCCATTACA

ATATTTGTAACCriTITGTTGCAAGTGTGACTCTACGCTTCGGTTGTGCGTACAA

AGCACACACGTAGACATTCGTACTTTGGAAGACCTGTTAATGGGCACACTAG

GAATTGTGTGCCCCATCTGTTCTCAGAAACCATAAΕ7 (SEQ ID N0:2):MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP

HPV16 E7GGG (SEQ ID N0:3):ATGCATGGAGATACACCTACATTGCATGAATATATGTTAGATTTGCAACCAGAGACAACTGGTCTCTACGGTT ATGGGC AATT AAATGACAGCTCAGAGGAGGAGGATGAAATAGATGGTCCAGCTGGACAAGCAGAACCGGACAGAGCCCATTACAATATTGTAACCTTTTGTTGCAAGTGTGACTCTACGCTTCGGTTGTGCGTACAAAGCACACACGTAGACATTCGTACTTTGGAAGACCTGTTAATGGGCACACTAGGAATTGTGTGCCCCATCTGTTCTCAGAAACCATAA

E7GG (SEQ ID N0:4):MHGDTPTLHEYMLDLQPETTGLYGYGQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTTCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP

Geração de constructo de veículo termoestável

C. thermocellum lichenase, LicB1 nativa de comprimento total,consiste seqüencialmente em um peptídeo guia (Lp), uma porção N-terminal(A), um laço superficial (I), uma porção terminal-C (C), uma caixa Pro-Thr, eum domínio de ligação de celulossomo (C-BD). Nós removemos as seqüên-cias de codificação Lp, caixa Pro-Thr e C-BD a partir do gene que codificaLicB, circularmente permutou-se a molécula para inverter os terminais NeC(Musiychuk, et ai, 2007, Influenza and Other Respiratory Viruses, 1:1), eincorporamos locais de endonuclease de restrição únicos para clonagem deseqüências alvos nos novos terminais N e C, bem como no laço superficiais(I). A seqüência de molécula transportadora projetada resultante foi verifica-da, e é designada LicKM.

SEQ ID NO: 5:

GGATCCTTAATTAAAATGGGAGGTTCTTATCCATATAAGTCTGGTGAGTATAGAA CTAAGTCTTTCTTTGGATATGGTTATTATG AAGTTA GGATGAAGGCTGCAAAGAACGTTGGAATTGTTTCTTCTTTCITTACTTATACTGGACCATCTGATAACAACCCA TGGGATGAGATTGA TA TTGA GTTTCTTGGAAA GGATACTACT AA GGTTCAATTCAACTGGT AT AAG AATGGTGTT GGTGG AAACGAGTATCTTCAT AACCTTGGATTTGATGCTTCTCAAGATTTTCATACTTATGGTTTTGAGTGGAGACCAGATTATATTGATTTTTATGTTGATGGAAAGAAGGTTTATAGAGGTACTAOAAACATTCCAGTTACTCCTGGAAAGATTATGATGAATCTTTGGCCAGGAATTGGTGTTGATGAATGGCTTGGTAGATATGATGGAAGAACTCCACTTCAAGCTGAGTATGAG TA TGTTAAG TA TTATCCAAACGGTAG ATCTG AATTC AAGCTTGTTGTTAATACTCCATTTGTTGCTGTTTTCTCTAACTTTGATTCTTCTCAATGGGAAAAGGCTGATTGGGCT AACGGTTCTGTTTTr AACTGTGTTTGGAAGCCATCTCÀAGTTACTTTTTCTAACGGAAAGATGATTCTTACTTTGGATAGAGAGTATGTCGACCATCATCATCATCATCATTGACTCGAGCTC

SEQ ID NO: 6:

mggsyp yksgeyrtksffgygyyevrmkaaknvgivssfftytgpsdnnp wdeidieflgkdttkvqfnwykngvggneylhnlgfdasqdfhtygfewrpdyidfyvdgkkvyrgtrnipvttgkimmnlwpgigvdewlgrydgrtplqaeyeyvkyypngrsefklwntpfvavfsnfdssqwekadwangsvfncvwkpsqvtfsngkmiltldre yvd hhhhhh

Para certos constructos, foi projetado um peptídeo de sinal PR1ae seqüência KDEL nos terminais N e C de LicKM. O ácido nucléico e se-qüência de aminoácidos destes constructos são mostrados em SEQ ID NO:7e SEQ ID NO:8.SEQ ID NO 7:

GGATCCTTAATTAAAATGGGATTTGTTCTCTTITCACAATTGCCTTCATTTCTTcttgtctctacacttctcttattcctagtaatatcccactcttgccgtgcccaaaatggaggttcttatccatataagtctggtgagtatagaactaagtctttctttggatatggttattatgaagttaggatgaaggctgcaaagaacgttggaattgtttcrtctttctttacrrtatactggaccatctgataacaacccatgggatgagattgatattgagtttcttgg aaagg aia.ctactaaggttcaattcaactggtataagaatggtgttggtggaaacgagtatcttcataaccttggatttgatgcttctcaagattttcatacttatggttttgagtggagaccagatratattgacttttatgttgatggaaagaaggtttatagaggtactagaaacattccagttactcctggaaagattatgatgaatctttggccaggaattggtgttgatgaatggcttggta gatatgatggaagaactccacttcaagctgagtatgagtatgttaagtattatccaaacggtagatctgaattcaagcttgttgttaatactccatttgttgctgttitctctaactttgattcttctcaatgggaaaaggctgattgggctaacgGTTCTGTTTTTAA CTGTG TTTGG AA GC CATCTC AAGTTAC1' IIil CTAACGG AAAGATGATTCTTACTTTGGATAGAGAGTATGTCGACCATCATCATCATCATCATaaggatgaactttgactcgagctc

SEQ ID NO 8:

mgfvlfsqlpsfllvstlllflvishscraqnggsypyksgeyrtxsffgygyyevrmkaaknvgivssfftytgpsdnnp^wdeidieflgkdttkvqfnwykngvggneylh^gfdasqdfhttgrexj^^dyidfyvdgkkvyrgtrnip^vtpgkimmnlwpgigvdewlgrydgrtplqaeyeyvkyypngrsefklvvntpfvavfsnfdssqwekadwangsvfncvwkpsqvtfsngkmiltldreyvdhhhhhhkdel

Geração de constructos de antíaeno recombinanteForam usados vetores de expressão pET, derivados de plasmí-deo pBR322, projetados para levar vantagem das características do genebacteriófago T7 10 que promove transcrição e translação em alto nível. Obacteriófago que codifica polimerase de RNA é altamente específico para asseqüências de promotor T7, que são raramente encontradas em genomasoutros do que genoma de fagos T7 (Figura 1). pET-32 foi usado para fusãodos constructos E7 e E7GGG na região de laço de uma seqüência de Iiche-nase modificada que tinha sido clonada neste vetor. O domínio catalítico dogene de Iichenase com seqüência PR-1A a montante (Proteína 1A Relacio-nada a Patogenia), com um retículo endoplasmático (KDEL)1 ou uma se-qüência de retenção vacuolar (VAC) e uma etiqueta His6 a jusante, foramclonados entre os locais Pacl e Xholl em um vetor pET-32 modificado (emque a região entre o promotor E7 e o terminador T7 foi excizada).Desse mo-do, o pET-PRACS-LieKM-KDEL e pET-PRACS-LicKM-VAC foram obtidos(Figura 2). O fragmento de DNA E7 e E7GGG foi subclonado na porção delaço (I) de LicKM para dar uma fusão na estrutura de leitura correta paratranslação.

Exemplo 2. Geração de Vetores de Antíaeno Candidato de Vacina

Constructos de antígeno-alvos LicKM-E7 ou LicKM-E7GGG fo-ram individualmente subclonadas no vetor viral escolhido (pBI-D4). pBI-D4 éum vetor binário derivado de pBI121 no qual o gene relator que codifica paraE. coli β-D-glucoronidase (GUS) foi substituído por um "poliligante" onde,entre os locais Xbal e Saci, um vetor derivado de RMV foi clonado (Figura3). pBI-D4 é um constructo baseado em TMV na qual um gene estranho aser expresso (por exemplo, antígeno-alvo (por exemplo, LicKM-E7, LicKM-E7GGG) substitui o gene de proteína de revestimento (CP) de TMV). O vírusretém o gene TMV 126/183kDa, o gene de proteína de movimento (MP), e opromotor de mRNA subgenômico de CP (sgp), que se estende na estruturade leitura aberta de CP (ORF). O códon de partida para CP sofreu mutação.

O vírus carece de CP e, portanto, não pode se mover através de toda plantahospedeira via floema. Contudo, o movimento de célula a célula de infecçãoviral permanece funcional, e o vírus pode se mover vagarosamente para asfolhas superiores dessa maneira. Um local de clonagem múltiplo (Pacl-Pmel-Agel-Xhol) foi projetado na extremidade de sgp para expressão de genesestranhos, e é seguido pela região não-transladada TMV 3' (NTR). O promo-tor 35S é fundido na extremidade 5' da seqüência viral. A seqüência de vetoré posicionada entre os locais BamHI e Sacl de pBI121. A ribozima de cabe-ça de martelo é colocada 3' da seqüência viral (Chen et ai, 2003, Mol. Bre-ed., 11:287). Estes constructos incluem fusões de seqüências que codificamLicKM-E7 ou E7GGG, em seqüências que codificam o peptídeo de sinal deproteína PR-Ia de tabaco, uma etiqueta 6x His e a seqüência âncora de re-tenção de ER KDEL, ou seqüência de varredura vacuolar (Figura 4). Paraconstructos que contêm seqüência codificando PRACS-LicKM-E7-KDEL,PRACS-LicKM-E7VAC, PRACS-LicKM-E7GGG-KDEL e PRACS-LicKM-E7GGG-VAC, o DNA de codificação foi introduzido como fragmentos Pacl-Xhol em pBI-D4. A seqüência de nucleotídeo foi subseqüentemente verifica-da estendendo-se sobre as junções de subclonagem dos constructos de ex-pressão final (Figura 5).

Exemplo 3: Geração de Plantas e Produção de Antígeno

Infiltração de Agrobacterium de plantas

Sistema de expressão transiente mediado por Agrobacterium al-cançado por infiltração de Agrobacterium pode ser utilizado (Turpen et al.,1993, J. Viroi Methods, 42:227). Folhas saudáveis de N. benthamiana foraminfiltradas com A. rhizogenes contendo vetores virais projetados para ex-pressar LicKM-E7 ou LicKM-0E7GGG.

A cepa A. rhizogenes A4 (ATCC 43057) ou A. tumefaciens(GV3103) foi transformada com os constructos de pBI-D4-PRACS-LiKM-E7-KDEL, pBI-D4-PRACS-LicKM-E7VAC, PBI-D4-PRACS-LicKM-E7GGG-KDELe pBI-D4-PRACS-LicKM-E7GGG-VAC. Culturas de Agrobacterium foramcrescidas e induzidas conforme descrito (Kapila et al., 1997, Plant Sci.,122:101). Uma cultura iniciadora de 2 ml (escolhida de uma colônia fresca)foi crescida durante a noite em YEB (5 g/l de extrato de carne bovina, 1 g/lde extrato de levedura, 5 g/l de peptona, 5 g/l de sacarose, 2 mM de MgSO4com 25 μg/ml de kanamicin a 28°C. A cultura iniciadora foi diluída 1:500 em500 ml de YEB com 25 μς/πι! de kanamicin, 10 mM de 2-4(-morfolino)ácidoetanossulfônico (MES) pH 5,6, 2 mM de MgSO4 adicional e 20 μς/ιπΙ de ace-tosiringone. A cultura diluída foi, em seguida, crescida durante a noite a umO.Deoo de -1,7 a 28°C. As células foram centrifugadas a 3.000 χ g por 15minutos e re-suspensas em meio de MMA (sais de MS, 10 mM de MES pH5,6, 20 g/l de sacarose, 200 μΜ de acetosiringone) a um O.Deoo 2,4, manti-das por 1 hora à temperatura ambiente, e usadas para infiltração de Agro-bacterium. Folhas de N. benthamiana foram injetadas com a suspensão deAgrobacterium usando-se uma seringa disponível sem uma agulha. As fo-lhas infiltradas foram colhidas 6 dias pós-infiltração.

Geração de raiz clonal e linha de raiz clonal

Explantes de Petunia híbrida de cm χ 1 cm de largura foram obti-dos de folhas após esterilização em 0,1% de NH4CI e seis lavagens emdH20 estéril. Os explantes foram levemente danificados com uma faca nolado abacsial e co-cultivados com Agrobacterium rhizogenes, cepa A4, con-tendo ou a pBID4-LiKM-E7-KDEL ou o pBID4-LicKM-E7GGG-KDEL. Os ex-plantes foram incubados por 2 minutos com uma cultura de Agrobacteriumdurante a noite (O.D. 600 nm=0,8-1), centrifugados por 10 minutos a 3000rpm a 4°C, e ressuspensos em meio de MMA para um OD 600 final = 0,5 napresença de 20 mM de acetossiringone. No final da incubação, os explantesforam secados em papel estéril e transferidos em 0,8% de placas de MS á-gar na presença de T% de glicose, e 20 mM de acetossiringone. As placasforam paralaminadas à temperatura ambiente por dois dias. Os explantesforam então transferidos nas placas de MS na presença de 500 mg/l de Ce-fotaxin (Cif), 100 mg/l de Timentin (Tim) e 25 mg/l de karamicin. Após 5 se-manas, a geração de raízes transgênicas foi obtida de explantes de folha dePetunia híbrida transformados com Agrobaeterium rhizogenes contendo osconstructos de pBID4-LiKM-E7-KDEL e pBID4-LicKM-E7GGG-KDEL. Muitasraízes foram obtidas da transformação com pBID4-LicKM-E7-KDEL do quecom o constructo de pBID4-LicKM-E7GGG-KDEL. A análise de zimogramarevelou a expressão de ambas proteínas quiméricas E7 e E7GGG nas raí-zes transgênicas de Petunia híbrida testadas. A expressão é associada comatividade de lichenase. A faixa de atividade relacionada às proteínas de fu-são mostra um peso molecular mais alto do que o controle de lichenase, e omesmo peso molecular do produto expresso por plantas após agro-infecção,confirmando a presença de todo produto de fusão.

Após transformação, raízes com pelos foram cortadas e coloca-das em uma linha no meio K3 livre de hormônio sólido. Quatro a seis diasmais tarde as raízes que cresceram mais ativamente são isoladas e transfe-ridas para meio K3 semi-sólido (0,4% de ágar). As raízes selecionadas sãocultivadas a 22°C no escuro, e linhas clonais são isoladas e sub-cultivadasde seis em seis semanas. As raízes e/ou linhas clonais podem ser classifi-cadas para a presença de expressão de antígeno-alvo pela avaliação deensaio de atividade de lichenase e análise de imunomanchamento.

Exemplo 4: Produção de Candidato de vacina

Amostras de 100 mg de material de folha infiltrado de N. bentha-miana foram colhidas em 4, 5, 6 e 7 dias pós-infecção. O tecido fresco foianalisado para expressão de proteína após ser colhido ou coletado a -80°Cpara a preparação subseqüente de extratos de planta bruta, ou para purifi-cação de proteína de fusão.

As amostras frescas foram re-suspensas em PBS frio 1x + Inibi-dores de protease (Roche) em uma razão p/v 1/3 (1 ml/0,3 g de tecido), emoídas com um pilão. Os homogenados foram fervidos por 5 minutos emtampão de carregamento de gel SDS, e então clareados por centrifugaçãopor 5 minutos a 12.000 rpm a 4°C. Os sobrenadantes foram transferidos emum tubo fresco e 20 μΙ, 1 μΙ ou suas diluições foram separadas em 12% deSDS-PAGE e analisadas por análise de western blot usando-se anticorpospoliclonais de camundongo anti-His6-E7 ou anti-lichenase de coelho e/oupor análise de zimograma para avaliar atividade hidrolítica indicando ativida-de funcional de lichenase. A zimografia é um método eletroforético para me-dição de atividade de enzima. O método é baseado em um gel de sódio do-decil sulfato impregnado com um substrato que é degradado pela enzimadissolvida durante o período de incubação. O manchamento do gel revelaatividade enzimática como faixas brancas em um pano de fundo vermelhoescuro. Dentro de uma certa faixa, a intensidade de faixa pode estar relacio-nada a quantidade de enzima carregada.

A expressão de E7 em plantas Nicotiana benthamiana infiltradasou com Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes contendoo plasmídeo pBID4-LicKM-E7-KDEL conduz a uma faixa específica corres-pondente ao peso molecular da proteína quimérica LicKM-E7-KDEL (cercade 39 kD) se a mobilidade eletroforética de proteína E7 na proteína de fusãocorresponde ao PM teórico de 11 kD (o PM da enzima de Iichenase é cercade 28 kD) (Figuras 6A-D). Plantas Nieotiana benthamiana infiltradas com ouAgrobaeterium tumefaciens ou Agrobaeterium rhizogenes contendo os plas-mídeos pBID4-LicKM-E7-VAC expressam a proteína quimérica LicKM-E7-VAC. Não obstante, a faixa revelada é um par. A faixa dupla é provavelmen-te representativa da presença de ambas a seqüência de sinal vacuolar corre-tamente processado ou não-processádo dentro de proteínas quiméricas (Π-guras 6A-D). Em ambas cepas de Agrobaeterium, o melhor constructo deexpressão vira para fora para ser o constructo provido com a seqüênciaKDEL, que foi escolhida para a grande produção de tecido de planta expres-sando a fusão de E7 (ou a E7GGG) com a enzima lichenase. Os mesmosresultados de expressão foram obtidos para as proteínas quiméricas E7GGG(Figura 7A).

A análise de zimograma revelou que a expressão de ambas pro-teínas quiméricas E7 e E7GGG está associada com atividade de lichenase,indicando que a fusão da proteína acima mencionada no laço do domíniocataiítico da enzima lichenase não prejudica a atividade da enzima. A faixade atividade relacionada a proteína de fusão mostra um peso molecular maisalto do que o controle da lichenase, confirmando a presença do produto defusão total. O extrato obtido de plantas Nieotiana benthamiana infiltradascom Agrobaeterium tumefaciens ou Agrobaeterium rhizogenes contendopBID4-LicKM-E7-KDEL, pBID4-Lic-KM-E7GGG-KDEL mostra uma faixa deatividade, enquanto constructos-VAC resultam em uma extensão menor deatividade (Figuras 8A-D).

Ambas a expressão das fusões E7-LicKM-KDEL e E7-LicKM-VAC são constantemente altas e estáveis a partir do 4o ao T dia pós-infecção (embora pareça ser levemente mais alta no 5o dia), com a exceçãoda expressão de Agrobacterium rhizogenes que cai dramaticamente do 6oao T dia. Foi decidido colher no 5o dia pós-infecção de modo a evitar degra-dação de proteína. A qualificação das proteínas quiméricas LicKM-E7-KDELe Lic-KM-E7GGG-KDEL expressas no extrato bruto foi produzida por imu-noblotting ambos do tecido infiltrado manualmente e nos tecidos infiltrados àvácuo (Figuras 7B, C). O rendimento estimado de expressão no extrato brutoé pelo menos 400 μg de proteína quimérica LicKM-E7-KDEL e Lic-KM-E7GGG-KDEUg de tecido (correspondendo a 100 μg de proteínas E7 ouE7GGG/g de tecido).

Purificação de antíqenos

Folhas de plantas infiltradas com Agrobacterium tumefacienscontendo os constructos de pBID4-LicKM-E7-KDEL e pBID4-Lic-KM-E7GGG-KDEL foram homogeneizadas. Tampão de extração com inibidoresde protease "livres de EDTA" (Roche) e Triton-X-100 1% foi usado a umarazão de 3 volumes p/v, e oscilado por 30 minutos a 4°C. Os extratos foramclareados por centrifugação a 9000 χ g por 10 minutos a 4°C. O sobrenadan-te foi seqüencialmente filtrado através de tecido Mira, centrifugado a 20.000χ g por 30 minutos a 4°C, e filtrado através de um filtro de 0,45 μπι, antes depurificação cromatográfica.

Proteínas quiméricas LicKM-E7-KDEL e Lic-KM-E7GGG-KDELHis-etiquetadas foram purificadas pelo uso de IMAC (Immobilized Metal Affi-nity Chromatography", GE Health) à temperatura ambiente sob gravidade. Apurificação foi realizada sob condições de não-desnaturação. As proteínasforam coletadas como frações de 0,5 ml, que foram unificadas, adicionadascom 20 mM de EDTA, dializadas contra PBS 1X durante a noite a 4°C, eanalisadas por SDS-PAGE.

Alternativamente, frações foram coletadas juntas adicionadascom 20 mM de EDTA, dializada contra NaH2PH4 10 mM, durante a noite, a4°C, e purificada por Cromatografia de Troca de Ânion. Para purificação deLICKM-E7-KDEL E LIC-KM-E7GGG-KDEL, coluna de troca de ânion Q Se-pharose de Fluxo Rápido (Amersham Pharmacia Biosciences) foi usada.Amostras de afinidade de LICKM-E7-KDEL E LICKM-E7GGG-KDEL, ou pro-teínas quiméricas purificadas de troca de íon foram separadas em 12% degéis de poliacrilamida, seguido por manchamento de Coomassie. As proteí-nas separadas foram também eletroforeticamente transferidas nas membra-nas de PVDF, e analisadas por análise de western blot usando-se anticorpode anti-lichenase e sucessivamente com peroxidase de IgG anti-coelho-anticorpo conjugado.

As frações coletadas após diálise foram analisadas por imunob-lotting usando-se ambos pAb α-lichenase (Figuras 9A) e o pAb a-anti-His6(dados não mostrados). A His-etiqueta foi mantida pelas proteínas quiméri-cas expressas, e a concentração final da proteína purificada foi avaliada porsoftware (Figuras 9A, B). De 40 g de tecido infiltrado, 6,5 mg de cada proteí-na quimérica de pBID4-LicKM-E7-KDEL e pBID4-Lic-KM-E7GGG-KDEL fo-ram purificados com um rendimento final de 163 μg de proteínas quiméri-cas/g de tecido (cerca de 50 μg de proteína E7 ou E7GGG/ g de tecido, noqual o peso molecular de proteína E7 e E7GGG é cerca de 1/4 da fusão to-tal). Os resultados do protocolo de purificação são representados nas Figu-ras 9C, D.

Exemplo 5: Estudos de Imunoaenicidade

Produção e caracterização de antíaenos-alvos

Um estudo de imunogenicidade inicial foi conduzido para deter-minar se LicKM-E7-KDEL e Lic-KM-E7GGG-KDEL produzida de planta podeinduzir soro específico IgG em camundongos intraperitonealmente imuniza-dos, e se os anticorpos induzidos podem se ligar a células que expressamE7. O estudo usou LicKM-E7-KDEL e Lic-KM-E7GGG-KDEL enriquecida defolhas infiltradas de Agrobacterium de N. benthamiana para pureza, confor-me descrito acima.

Brevemente, o oncogene de HPV16 E7 (número de acesso aoBanco de Gene KP2718) sofreu mutação usando Kit de Mutagênese de Lo-cal Dirigido de Mudança Rápida (Stratagene; La Jolla, CA) para dar E7GGGcom as seguintes substituições de aminoácido no local de ligação pRB deE7:D21G, C24G e E26G (Smahel et ai, 2001, Virology, 281:231). Seqüên-cias que codificam HPV16 E7 e E7GGG foram clonadas como fusões inter-nas de estrutura interna de LicKM para obter LicKM-EY e Lic-KM-E7GGG.Estas fusões incluíam a seqüência de sinal de proteína PR1a de Nicotianatabacum, e a etiqueta 6xHis, seguido pelo sinal de retenção de retículo en-doplasmático KDEL em seu terminal C. As fusões foram clonadas no vetorde expressão de planta pBID4 (Musiychuk et ai., 2007, Influenza and OtherRespiratory Viruses, 1:1, em prensa) para dar pBID4-LicKM-E7 e pBID4-Lic-KM-E7GGG. Cada constructo foi introduzido na cepa de Agrobacterium rhi-zogenes A4, e as bactérias resultantes foram inoculadas em Nicotiana ben-thamiana. Cinco a sete dias pós-infiltração, antígenos-alvos foram purifica-dos por cromatografia de afinidade.

Os rendimentos estimados para LicKM-E7 e Lic-KM-E7 foramaproximadamente 400 mg por kg de tecido de folha fresca, e o rendimentoestimado para LicKM foi aproximadamente 1 g por kg. Antígeno-alvos purifi-cados foram caracterizados por análise de SDS-PAGE para revelar as prote-ínas dimensionadas prognosticadas de 28 kD (LicKM)1 39 kD (LicKM-E7), ekD (LicKM-E7GGG) (Figura 9B). Para proporcionar material de controle,LicKM foi similarmente produzida em N. benthamiana. A antigenicidade dasproteínas expressas por planta foi verificada por imunomanchamento usan-do-se anticorpos específicos a LicKM e E7. As amostras foram quantificadaspor densitometria usando-se GeneTooIs software (Syngene; canbridge, UK).

Estudos de Imunoaenicidade

Para avaliar a eficiência de antígenos-alvos produzidos por plan-ta, camundongos fêmeas de quatro a oito semanas de idade C57BL/6 (Char-les River; Como, Itália) foram imunizados com antígenos-alvos.

Para estudos profiláticos, 10 camundongos por grupo receberamμg de LicKM-R7 ou LicKM-E7GGG (equivalente a aproximadamente 10μg de E7 ou E7GGG, respectivamente) subcutaneamente, com ou sem ad-juvante Quil A (10 ^g/camundongo), nos dias 0, 14, 28, 42 e 76. Amostrasde soro de animais foram coletadas no dia de cada administração, e avalia-das para a presença de anticorpo específicos de E7 por ELISA. No dia 49,dois animais em cada grupo foram sacrificados para avaliar respostas imu-nes mediadas por célula. Todos os animais remanescentes foram então pro-vocados por injeção subcutânea com 5 χ 104 E7, expressando células detumor TC-1 (Lin et al., 1996, Câncer Research, 56:21). Para caracterizaçãode respostas imunes, ELISA, ELISPOT, e ensaios de hipersensibilidade detipo retardada espontânea (DHT) foram realizados conforme anteriormentedescrito (Franconi et ai, 2002, Câncer Research, 62:3654).

Para estudos profiláticos, 8 a 10 camundongos por grupo foraminoculados subcutaneamente com 5 χ 104 E7 expressando células de tumorTC-1 3 dias antes de imunização subcutânea com 40 μg de LicKM-E7 ouLicKM-E7GGG, com ou sem Quil A (10 μg/camundongo), nos dias 0, 15, 30,45 e 60.

Para ambos estudos profiláticos e terapêuticos, animais de con-trole foram administrados com 10 μg de E7 ou E7GGG produzido de E. coliou LicKM produzida de planta, com ou sem Quil A. O crescimento do tumorfoi monitorado por palpação duas vezes por semana. Através de todos estesestudos, os animais foram observados para sinais potenciais de estresse,diarréia, morte ou outros sinais clínicos que podem resultar da administraçãodo antígeno-alvo.

Para testar a imugenicidade e potencial profilático de LicKM-E7 eLicKM-D7GGG produzidos por planta, os animais foram imunizados comantígenos-alvos. Na presença de adjuvante, todos os animais imunizadoscom LicKM-E7 e LicKM-D7GGG, ou com E7 ou E7GGG produzidos de E.coli montaram uma resposta IgG específica (Figura 11 A), embora na ausên-cia de um adjuvante, fusões de LicKM não induziram respostas humoraissignificantes (Figura 11 A). Desde que células T citotóxicas CD8+ têm umpapel reconhecido como influenciadores em respostas anticâncer, a induçãode células T CD8+ específicas de E7 foi investigada por ELISPOT. Na au-sência de adjuvante, números altos de células de secreção de IFNy foramdetectados em camundongos vacinados com LicKM-E7 e LicKM-D7GGG,onde números inferiores de células CD8+ específicas de E7 foram encontra-dos em camundongos vacinados com R7 ou E7GGG produzidos de E. coli, enenhuma célula de secreção IFNy foi detectada em camundongos vacinadosde LicKM (Figura 11B). Ambos fusões de LicKM e antígenos produzidos deE. coli induzem números baixos, mas significantes, de pontos na ausênciade adjuvante, com as fusões de LicKM dando o número mais alto de conta-gens de ELISPOT (Figura 11B).

Foi estabelecido que células T CD8+ específicas de HPV são pro-tetoras contra provocação com um tumor de expressão de E7 (Frazer, 2004,Nature Reviews, 4:46). Portanto, a atividade anti-tumor das respostas imu-nes induzidas por vacinas candidatas de E7 produzidas por planta por pro-vocação de camundongos vacinados com células TC-1. Na presença de ad-juvante, LicKM-E7 e LicKM-D7GGG induziram proteção de tumor em 100%de animais, enquanto E7 ou E7GGG produzidas por E. coli induziram prote-ção em 80% e 60% de camundongos, respectivamente (Figura 11C). 80%de animais imunizados com LicKM-E7 na ausência de adjuvante foram pro-tegidos (Figura 11C). 20% de animais imunizados com LicKM-E7GGG ouqualquer antígeno produzido por E. coli na ausência de adjuvante foram pro-tegidos (Figura 11C). Nenhuma proteção foi observada em animais imuniza-dos com LicKM (Figura 11C).

Para testar atividade terapêutica de LicKM-E7 e LicKM-D7GGGcontra tumores de expressão de HPV16 D7, os animais que foram inocula-dos com células TC-1 de expressão de E7 foram subseqüentemente imuni-zadas com LicKM, LicKM-E7, ou LicKM-E7GGG, ou com E7 ou E7GGG pro-duzidas de E coli. Todos os animais imunizados com LicKM desenvolveramtumores dentro de 4 semanas, enquanto aqueles tratados com LicKM-E7 ouLicKM-E7GGG mais adjuvante permaneceram livres de tumor para a dura-ção do estudo (10 semanas). Imunização com E7 ou E7GGG produzidas deE. coli mais adjuvante inibiu crescimento de tumor em 40% e 60% de ani-mais, respectivamente (Figura 11 D). Na ausência do adjuvante, fusões deLicKM inibiram crescimento de tumor, com proteção maior observada emanimais que receberam LicKM-E7 (80%) versus LicKM-E7GGG (60%), e20% de animais tratados com E7 e E7GGG produzidos de E coli permane-ceram livres de tumor (Figura 11 D).A proteção contra o desenvolvimento de doença associada aHPV é, na maior parte, atribuída às respostas imunes mediadas por célula. Aresposta de DTH é pensada representar inflamação mediada por citoquinaespecífica de antígeno, particularmente envolvendo citoquinas tipo Th1.

Desde que LicKM-E7 mostrou maior atividade terapêutica do que Lic-KM-E7GGG contra tumores de expressão de E7, foi avaliada a resposta de DTHa E7 em camundongos vacinados com LicKM-E7 ou E7 produzida por E.coli. Uma resposta de DHT específica de antígeno foi observada em camun-dongos com a proteína LicKM-E7, mesmo na ausência de adjuvante (Tabela1). Esta resposta excede aquela observada em camundongos vacinadoscom E7 produzida por E. coli. Os camundongos imunizados com LicKM nãomostraram nenhuma inchação significante da orelha, demonstrando que amolécula transportadora de LicKM não induz uma resposta inflamatória.

Tabela 1. Hipersensibilidade Tipo Retardada

<table>table see original document page 72</column></row><table>

* inchação da orelha foi reportada com a média das diferenças (Δ) na espes-sura entre orelhas de controle provocadas ou não-provocadas de 5 camun-dongos por grupo (espessura de orelha em mm χ 10'2).LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Yusibov, et al.

<120> Antígenos de HPV, composições de vacina, e métodos relacionados

<130> 2002645-0115

<140> 11/706,568

<141> 2007-02-13

<160> 8

<170> PatentIn versão 3.5

<210> 1

<211> 297

<212> DNA

<213> HPVl6 E7

<400> 1 atgcatggag atacacctac attgcatgaa tatatgttag atttgcaacc agagacaact 60gatctctact gttatgagca attaaatgac agctcagagg aggaggatga aatagatggt 120ccagctggac aagcagaacc ggacagagcc cattacaata ttgtaacctt ttgttgcaag 180tgtgactcta cgcttcggtt gtgcgtacaa agcacacacg tagacattcg tactttggaa 240gacctgttaa tgggcacact aggaattgtg tgccccatct gttctcagaa accataa 297

<210> 2

<211> 98

<212> PRT

<213> E7

<400> 2

Met His Gly ASD Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln15 10 15

Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser20 25 30

Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp35 40 45

Arg Ala His Tyr Asn Ile vai Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr50 55 60Leu Arq Leu Cys vai Gln ser Thr His vai Asp Ile Arg Thr Leu Glu65 70 75 80

Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile vai Cys Pro Ile Cys Ser Gln85 90 95

Lys Pro

<210> 3

<211> 297

<212> DNA

<213> HPVl6 E7GGG

<400> 3 atgcatggag atacacctac attgcatgaa tatatgttag atttgcaacc agagacaact 60ggtctctacg gttatgggca attaaatgac agctcagagg aggaggatga aatagatggt 120ccagctggac aagcagaacc ggacagagcc cattacaata ttgtaacctt ttgttgcaag 180tgtgactcta cgcttcggtt gtgcgtacaa agcacacacg tagacattcg tactttggaa 240gacctgttaa tgggcacact aggaattgtg tgccccatct gttctcagaa accataa 297

<210> 4

<211> 98

<212> PRT

<213> E7GG

<400> 4

Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln1 5 10 15

Pro Glu Thr Thr Gly Leu Tyr Gly Tyr Gly Gln Leu Asn Asp Ser ser20 25 30

Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp35 40 45

Arg Ala His Tyr Asn Ile vai Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr50 55 60

Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu65 70 75 80

Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys ser Gln85 90 95

Lys Pro<210> 5

<211> 717

<212> DNA

<213> LickM

<400> 5

ggatccttaa ttaaaatggg aggttcttat ccatataagt ctggtgagta tagaactaag 60tctttctttg gatatggtta ttatgaagtt aggatgaagg ctgcaaagaa cgttggaatt 120gtttcttctt tctttactta tactggacca tctgataaca acccatggga tgagattgat 180attgagtttc ttggaaagga tactactaag gttcaattca actggtataa gaatggtgtt 240ggtggaaacg agtatcttca taaccttgga tttgatgctt ctcaagattt tcatacttat 300ggttttgagt ggagaccaga ttatattgat ttttatgttg atggaaagaa ggtttataga 360ggtactagaa acattccagt tactcctgga aagattatga tgaatctttg gccaggaatt 420ggtgttgatg aatggcttgg tagatatgat ggaagaactc cacttcaagc tgagtatgag 480tatgttaagt attatccaaa cggtagatct gaattcaagc ttgttgttaa tactccattt 540gttgctgttt tctctaactt tgattcttct caatgggaaa aggctgattg ggctaacggt 600tctgttttta actgtgtttg gaagccatct caagttactt tttctaacgg aaagatgatt 660cttactttgg atagagagta tgtcgaccat catcatcatc atcattgact cgagctc 717

<210> 6

<211> 230

<212> PRT

<213> LickM

<400> 6

Met Gly Gly Ser Tyr Pro Tyr Lys Ser Gly Glu Tyr Arg Thr Lys Ser1 5 10 15

Phe Phe Gly Tyr Gly Tyr Tyr Glu Val Arg Met Lys Ala Ala Lys Asn20 25 30

Val Gly Ile Val Ser Ser Phe Phe Thr Tyr Thr Gly Pro Ser Asp Asn35 40 45

Asn Pro Trp Asp Glu Ile Asp Ile Glu Phe Leu Gly Lys Asp Thr Thr50 55 60

Lys vai Gln Phe Asn Trp Tyr Lys Asn Gly Val Gly Gly Asn Glu Tyr65 70 75 80

Leu His Asn Leu Gly Phe Asp Ala Ser Gln Asp Phe His Thr Tyr Gly85 90 95Phe Glu Trp Arg Pro Asp Tyr Ile Asp Phe Tyr Val Asp Gly Lys Lys100 105 HO

Val Tyr Arq Gly Thr Arg Asn Ile Pro Val Thr Pro Gly Lys Ile Met115 120 125

Met Asn Leu Trp Pro Gly Ile Gly Val Asp Glu Trp Leu Gly Arg Tyr130 135 140

Asp Gly Arg Thr Pro Leu Gln Ala Glu Tyr Glu Tyr vai Lys Tyr Tyr145 150 155 160

Pro Asn Gly Arg ser Glu Phe Lys Leu Val vai Asn Thr Pro Phe vai165 170 175

Ala vai Phe Ser Asn Phe Asp Ser Ser Gln Trp Glu Lys Ala Asp Trp180 185 190

Ala Asn Gly Ser vai Phe Asn Cys vai Trp Lys Pro ser Gln vai Thr195 200 205

Phe Ser Asn Gly Lys Met Ile Leu Thr Leu Asp Arg Glu Tyr vai Asp210 215 220

HiS HiS HiS HiS HiS Hi S225 230

<210> 7

<211> 822

<212> DNA

<213> LicKM modificado

<400> 7

ggatccttaa ttaaaatggg atttgttctc ttttcacaat tgccttcatt tcttcttgtc 60tctacacttc tcttattcct agtaatatcc cactcttgcc gtgcccaaaa tggaggttct 120tatccatata agtctggtga gtatagaact aagtctttct ttggatatgg ttattatgaa 180gttaggatga aggctgcaaa gaacgttgga attgtttctt ctttctttac ttatactgga 240ccatctgata acaacccatg ggatgagatt gatattgagt ttcttggaaa ggatactact 300aaggttcaat tcaactggta taagaatggt gttggtggaa acgagtatct tcataacctt 360ggatttgatg cttctcaaga ttttcatact tatggttttg agtggagacc agattatatt 420gatttttatg ttgatggaaa gaaggtttat agaggtacta gaaacattcc agttactcct 480ggaaagatta tgatgaatct ttggccagga attggtgttg atgaatggct tggtagatat 540gatggaagaa ctccacttca agctgagtat gagtatgtta agtattatcc aaacggtaga 600tctgaattca agcttgttgt taatactcca tttgttgctg ttttctctaa ctttgattct 660tctcaatggg aaaaggctga ttgggctaac ggttctgttt ttaactgtgt ttggaagcca 720tctcaagtta ctttttctaa cggaaagatg attcttactt tggatagaga gtatgtcgac 780catcatcatc atcatcataa ggatgaactt tgactcgagc tc 822<210> 8<211> 265<212> PRT

<213> LicKM modificado<400> 7

Met Gly Phe Val Leu Phe Ser Gln Leu Pro Ser Phe Leu Leu Val Ser15 10 15

Thr Leu Leu Leu Phe Leu Val Ile Ser His Ser Cys Arg Ala Gln Asn20 25 30

Gly Gly Ser Tyr Pro Tyr Lys Ser Gly Glu Tyr Arg Thr Lys Ser Phe35 40 45

Phe Gly Tyr Gly Tyr Tyr Glu Val Arg Met Lys Ala Ala Lys Asn Val50 55 60

Gly Ile vai Ser Ser Phe Phe Thr Tyr Thr Gly Pro Ser Asp Asn Asn65 70 75 80

Pro Trp Asp Glu Ile Asp Ile Glu Phe Leu Gly Lys Asp Thr Thr Lys85 90 95

vai Gln Phe Asn Trp Tyr Lys Asn Gly vai Gly Gly Asn Glu Tyr Leu100 105 HO

His Asn Leu Gly Phe Asp Ala Ser Gln Asp Phe His Thr Tyr Gly Phe115 120 125

Glu Trp Arg Pró Asp Tyr Ile Asp Phe Tyr vai Asp Gly Lys Lys Val130 135 140

Tyr Arg Gly Thr Arg Asn lie Pro Val Thr Pro Gly Lys Ile Met Met145 150 155 160

Asn Leu Trp Pro Gly lie Gly Val Asp Glu Trp Leu Gly Arg Tyr Asp165 170 175

Gly Arg Thr Pro Leu Gln Ala Glu Tyr Glu Tyr vai Lys Tyr Tyr Pro180 185 190

Asn Gly Arg Ser Glu Phe Lys Leu vai vai Asn Thr Pro Phe Val Ala195 200 205

vai Phe Ser Asn Phe Asp Ser Ser Gln Trp Glu Lys Ala Asp Trp Ala210 215 220

Asn Gly Ser Val Phe Asn Cys vai Trp Lys Pro Ser Gln Val Thr Phe225 230 235 240

ser Asn Gly Lys Met lie Leu Thr Leu Asp Arg Glu Tyr Val Asp His245 250 255

His His His His His Lys Asp Glu Leu260 265

Claims (72)

1. Antígeno isolado compreendendo um componente de víruspapiloma humano (HPV) fundido a uma proteína termoestável;em que o componente de HPV compreende pelo menos um do-mínio selecionado a partir do grupo consistindo em E7 de HPV16, E7 deHPV18, E6 de HPV16, e E6 de HPV18, um fragmento de E7 de HPV16, umfragmento de E7 de HPV18, um fragmento de E6 de HPV16, e um fragmentode E6 de HPV18.

2. Antígeno isolado, de acordo com a reivindicação 1, em que ocomponente de HPV consiste em E7 de HPV16.

3. Antígeno isolado, de acordo com a reivindicação 1, em que ocomponente de HPV consiste em E7 de HPV18.

4. Antígeno isolado, de acordo com a reivindicação 1, em que ocomponente de HPV consiste em SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:4.

5. Antígeno isolado, de acordo com a reivindicação 1, em que aproteína termoestável compreende uma seqüência de proteína Iichenasemodificada.

6. Antígeno isolado, de acordo com a reivindicação 5, em que aseqüência de codificação para Iichenase foi otimizada para expressão deproteína em plantas.

7. Antígeno isolado, de acordo com a reivindicação 5, em que aseqüência de proteína Iichenase compreende o domínio N-terminal, o domí-nio C-terminal, e o dorhínio de laço de superfície de lichenase.

8. Antígeno isolado, de acordo com a reivindicação 5, em que ocomponente de HPV fundido à lichenase é qualquer de um domínio N-terminal, um domínio C-terminal, e um domínio de laço de superfície de li-chenase.

9. Antígeno isolado, de acordo com a reivindicação 1, em que ocomponente de HPV compreende pelo menos dois domínios independente-mente selecionados a partir do grupo consistindo em E7 de HPV16, E7 deHPV18, E6 de HPV16, e E6 de HPV18, um fragmento de E7 de HPV16, umfragmento de E7 de HPV18, um fragmento de E6 de HPV16, e um fragmentode E6 de HPV18.

10. Antígeno isolado, de acordo com a reivindicação 9, em que oprimeiro componente de HPV compreende E7 de HPV16, e o segundo com-ponente de HPV compreende E7 de HPV18.

11. Composição de vacina compreendendo um antígeno com-preendendo um componente de vírus papiloma humano (HPV) fundido auma proteína termoestável, e um veículo farmaceuticamente aceitável;em que o componente de HPV compreende pelo menos um do-mínio selecionado a partir do grupo consistindo em E7 de HPV16, E7 deHPV18, E6 de HPV16, e E6 de HPV18, um fragmento de E7 de HPV16, umfragmento de E7 de HPV18, um fragmento de E6 de HPV16, e um fragmentode E6 de HPV18; e em que a composição é capaz de induzir uma respostaimune após administração a um indivíduo.

12. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 11, emque o componente de HPV consiste em E7 de HPV16.

13. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 11, emque o componente de HPV consiste em E7 de HPV18.

14. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 11, emque o componente de HPV consiste em SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:4.

15. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 11, emque a proteína termoestável compreende uma seqüência de proteína Iiche-nase modificada.

16. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 15, emque a seqüência de codificação para Iichenase foi otimizada para expressãode proteína em plantas.

17. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 15, emque a seqüência de proteína Iichenase compreende o domínio N-terminal, odomínio C-terminal, e o domínio de laço de superfície de lichenase.

18. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 15, emque o componente de HPV fundido à lichenase é qualquer de um domínio N-terminal, um domínio C-terminal, e um domínio de laço de superfície de li-chenase.

19. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 11, emque o componente de HPV compreende pelo menos dois domínios indepen-dentemente selecionados a partir do grupo consistindo em E7 de HPV16, E7de HPV18, E6 de HPV16, e E6 de HPV18, um fragmento de E7 de HPV16,um fragmento de E7 de HPV18, um fragmento de E6 de HPV16, e um frag-mento de E6 de HPV18.

20. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 19, emque o primeiro componente de HPV compreende E7 de HPV16, e o segundocomponente de HPV compreende E7 de HPV18.

21. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 11,compreendendo adicionalmente um segundo antígeno, em que a composi-ção é capaz de induzir uma reposta imune após administração a um animal.

22. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 11, emque o segundo antígeno compreende um componente de vírus papilomahumano (HPV) fundido a uma proteína termoestável, e um veículo farmaceu-ticamente aceitável;em que o componente de HPV do primeiro antígeno compreendepelo menos um domínio selecionado a partir do grupo consistindo em E7 deHPV16, E7 de HPV18, E6 de HPV16, e E6 de HPV18, um fragmento de E7de HPV16, um fragmento de E7 de HPVI8, um fragmento de E6 de HPV16,e um fragmento de E6 de HPV18; e o componente de HPV do segundo antí-geno compreende pelo menos um domínio distinto a partir do primeiro antí-geno selecionado a partir do grupo consistindo em E7 de HPV16, E7 deHPV18, E6 de HPV16, e E6 de HPV18, um fragmento de E7 de HPV16, umfragmento de E7 de HPV18, um fragmento de E6 de HPV16, e um fragmentode E6 de HPV18; eem que a composição é capaz de induzir uma resposta imuneapós administração a um indivíduo.

23. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 22, emque o componente de HPV do primeiro antígeno compreende pelo menosum domínio selecionado a partir do grupo consistindo em E7 de HPV16, eum fragmento de E7 de HPV16, e o componente de HPV do segundo antí-geno compreende pelo menos um domínio distinto do primeiro antígeno se-lecionado a partir do grupo consistindo em E7 de HPV16, e um fragmento deE7 de HPV18.

24. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 11, emque o antígeno é produzido em uma planta selecionada de uma plantatransgênica e uma planta transientemente expressando o antígeno.

25. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 11, emque a composição compreende antígeno que é purificado, parcialmente puri-ficado, ou não-purificado de células de planta, de uma planta, sementes, fru-to, ou um extrato destes.

26. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 11,compreendendo adicionalmente um adjuvante de vacina.

27. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 26, emque o adjuvante compreende alum, MF59, MALP2, e saponin.

28. Composição de vacina compreendendo pelo menos dois an-tígenos, cada um do qual compreendendo um componente de vírus papilo-ma humano (HPV), em que pelo menos um dos antígenos compreende umaproteína termoestável, em que a composição é capaz de induzir uma repostaimune após administração a um indivíduo.

29. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 28, emque pelo menos dois antígenos compreendem um componente de vírus pa-piloma humano (HPV), cada um do qual compreende independentementepelo menos um domínio selecionado a partir do grupo consistindo em E7 deHPV16, E7 de HPV18, E6 de HPV16, e E6 de HPV18, um fragmento de E7de HPV16, um fragmento de E7 de HPV18, um fragmento de E6 de HPV16,e um fragmento de E6 de HPV18; e no qual a composição é capaz de induziruma resposta imune após administração a um indivíduo.

30. Método para indução de uma resposta imune protetora contrainfecção de vírus papiloma humano (HPV) em um indivíduo compreendendoadministrar a um indivíduo uma quantidade efetiva de uma composição devacina anti-HPV, em que a administração é suficiente para estimular a pro-dução de anticorpos específico de antígeno, ou estimular uma resposta imu-ne celular pelo indivíduo; induzindo, desse modo, uma resposta imune prote-tora;a. em que a composição de vacina compreende antígenocompreendendo um componente de vírus papiloma huma-no (HPV) fundido a uma proteína termoestável; eb. em que o componente de HPV compreende pelo menosum domínio selecionado a partir do grupo consistindo emE7 de HPV16, E7 de HPV18, E6 de HPV16, e E6 deHPV18, um fragmento de E7 de HPV16, um fragmento deE7 de HPV18, um fragmento de E6 de HPV16, e um frag-mento de E6 de HPV18.

31. Método, de acordo com a reivindicação 30, em que a compo-sição é administrada oralmente, intranasalmente, subcutaneamente, intrave-nosamente, intraperitonealmente, ou intramuscularmente.

32. Método, de acordo com a reivindicação 30, em que a compo-sição é administrada oralmente via alimentação de células de planta ao indi-víduo.

33. Método, de acordo com a reivindicação 30, em que o indiví-duo é um ser humano.

34. Método para produção de uma proteína de antígeno compre-endendo um vírus papiloma humano (HPV) fundido a uma proteína termoes-tável, compreendendo:a. preparação de um constructo de ácido nucléico que codifi-ca um componente de antígeno de vírus papiloma humano(HPV) fundido a uma proteína termoestável;b. transformação de uma célula com o constructo de ácidonucléico da etapa a; ec. incubação da célula sob condições favoráveis para expres-são da proteína de antígeno;d. produzindo, desse modo, a proteína de antígeno;e. em que o componente de HPV do antígeno compreendepelo menos um domínio selecionado a partir do grupo con-sistindo em E7 de HPV16, E7 de HPV18, E6 de HPV16, eE6 de HPV18, um fragmento de E7 de HPV16, um frag-mento de E7 de HPV18, um fragmento de E6 de HPV16, eum fragmento de E6 de HPV18.

35. Método, de acordo com a reivindicação 34, em que o compo-nente de HPV consiste em E7 de HPV16.

36. Método, de acordo com a reivindicação 34, em que o compo-nente de HPV consiste em E7 de HPV18.

37. Método, de acordo com a reivindicação 34, em que o compo-nente de HPV é codificado por uma seqüência de nucleotídeo selecionada apartir do grupo consistindo em SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:3.

38. Método, de acordo com a reivindicação 34, em que o compo-nente de HPV consiste em SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:4.

39. Antígeno isolado, de acordo com a reivindicação 34, em quea proteína termoestável compreende uma seqüência de proteína Iichenasemodificada.

40. Método, de acordo com a reivindicação 39, em que a se-qüência de codificação para Iichenase foi otimizada para expressão de pro-teína em plantas.

41. Método, de acordo com a reivindicação 39, em que a se-qüência de proteína Iichenase compreende o domínio N-terminal, o domínioC-terminal, e o domínio de laço de superfície de lichenase.

42. Método, de acordo com a reivindicação 39, em que o compo-nente de HPV fundido à lichenase é qualquer de um domínio N-terminal, umdomínio C-terminal, e um domínio de laço de superfície de lichenase.

43. Método, de acordo com a reivindicação 34, em que o compo-nente de HPV compreende pelo menos dois domínios independentementeselecionados a partir do grupo consistindo em E7 de HPV16, E7 de HPV18,E6 de HPV16, e E6 de HPV18, um fragmento de E7 de HPV16, um fragmen-to de E7 de HPV18, um fragmento de E6 de HPV16, e um fragmento de E6de HPV18, e combinações destes.

44. Método, de acordo com a reivindicação 34, em que a expres-são da proteína de antígeno está sob controle de um promotor viral.

45. Método, de acordo com a reivindicação 34, em que o cons-tructo de ácido nucléico compreende adicionalmente seqüência de ácidonucléico de vetor.

46. Método, de acordo com a reivindicação 45, em que o vetor éum vetor binário.

47. Método, de acordo com a reivindicação 34, em que o cons-tructo de ácido nucléico compreende adicionalmente seqüências que codifi-cam proteínas virais.

48. Método, de acordo com a reivindicação 34, em que a célula éuma célula de planta.

49. Método, de acordo com a reivindicação 48, em que a célulade planta é selecionada a partir do grupo consistindo em alfafa, rabanete,mostarda, munguba, brócolis, agrião, feijão-soja, girassol de trigo, repolho,trevo, petúnia, tomate, batata, nicotina, espinafre e célula de lentilha.

50. Método, de acordo com a reivindicação 48, em que a proteínade antígeno é produzida em uma célula de raiz clonal.

51. Método, de acordo com a reivindicação 48, em que a proteínade antígeno é produzida em mudas germinadas.

52. Método, de acordo com a reivindicação 34, compreendendoadicionalmente recuperar proteína de antígeno parcialmente purificada oupurificada que é produzida.

53. Constructo de ácido nucléico isolado compreendendo se-qüência de ácido nucléico que codifica um componente de vírus papilomahumano (HPV) fundido a uma proteína termoestável; em que o componentede HPV compreende pelo menos um domínio selecionado a partir do grupoconsistindo em E7 de HPV16, E7 de HPV18, E6 de HPV16, e E6 de HPV18,um fragmento de E7 de HPV16, um fragmento de E7 de HPV18, um frag-mento de E6 de HPV16, e um fragmento de E6 de HPV18, combinaçõesdestes.

54. Constructo de ácido nucléico isolado, de acordo com a reivin-dicação 53, em que o componente de HPV consiste em E7 de HPV16, E6 deHPV16 ou um fragmento de E7 de HPV16 ou um fragmento de E6 deHPV16.

55. Constructo de ácido nucléico isolado, de acordo com a reivin-dicação 53, em que o componente de HPV consiste em E7 de HPV18, E6 deHPV18 ou um fragmento de E7 de HPV18 ou um fragmento de E6 deHPV18.

56. Constructo de ácido nucléico isolado, de acordo com a reivin-dicação 53, em que o componente de HPV consiste em SEQ ID N0:2 ouSEQ ID N0:4.

57. Constructo de ácido nucléico isolado, de acordo com a reivin-dicação 53, em que a proteína termoestável compreende uma seqüência deproteína Iichenase modificada.

58. Constructo de ácido nucléico isolado, de acordo com a reivin-dicação 57, em que a seqüência de codificação para Iichenase foi otimizadapara expressão de proteína em plantas.

59. Constructo de ácido nucléico isolado, de acordo com a reivin-dicação 57, em que a seqüência de proteína Iichenase compreende o domí-nio N-terminal, o domínio C-terminal, e o domínio de laço de superfície delichenase.

60. Constructo de ácido nucléico isolado, de acordo com a reivin-dicação 57, em que o componente de HPV fundido à lichenase é qualquerde um domínio N-terminal, um domínio C-terminal, e um domínio de laço desuperfície de lichenase.

61. Constructo de ácido nucléico isolado, de acordo com a reivin-dicação 53, em que o componente de HPV compreende pelo menos doiscada, os quais compreendem independentemente pelo menos um domínioselecionado a partir do grupo consistindo em El de HPV16, E7 de HPV18,E6 de HPV16, e E6 de HPV18, um fragmento de E7 de HPV16, um fragmen-to de E7 de HPV18, um fragmento de E6 de HPV16, e um fragmento de E6de HPV18, e combinações destes.

62. Constructo de ácido isolado, de acordo com a reivindicação-53, em que o componente de HPV compreende SEQ ID N0:1 ou SEQ IDΝ0:3.

63. Constructo de ácido nucléico isolado, de acordo com a reivin-dicação 53, compreendendo adicionalmente seqüências de ácido nucléicode vetor.

64. Constructo de ácido nucléico isolado, de acordo com a reivin-dicação 53, compreendendo adicionalmente seqüência de ácido nucléico depromotor viral.

65. Constructo de ácido nucléico isolado, de acordo com a reivin-dicação 63, em que o vetor é um vetor binário.

66. Constructo de ácido nucléico isolado, de acordo com a reivin-dicação 53, compreendendo adicionalmente seqüências de ácido nucléicoque codificam proteínas virais.

67. Célula compreendendo o constructo de ácido nucléico comodefinido na reivindicação 53.

68. Célula de acordo com a reivindicação 67 que é uma célula deplanta.

69. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 67, sele-cionada a partir do grupo consistindo em alfafa, rabanete, mostarda, mungu-ba, brócolis, agrião, feijão-soja, girassol de trigo, repolho, trevo, petúnia, to-mate, batata, nicotina, espinafre e célula de lentilha.

70. Planta compreendendo o constructo de ácido nucléico comodefinido na reivindicação 53, em que a planta é capaz de produzir a proteínade antígeno.

71. Planta, de acordo com a reivindicação 70, que é selecionadaa partir do grupo consistindo em alfafa, rabanete, mostarda, munguba, bró-colis, agrião, feijão-soja, girassol de trigo, repolho, trevo, petúnia, tomate,batata, nicotina, espinafre e lentilha.

72. Planta, de acordo com a reivindicação 70, que é de um gêne-ro selecionado a partir do gênero Brassica, o gênero Nicotiana, e o gêneroPetúnia.