CN101395174A - 人类乳头瘤病毒(hpv)抗原、疫苗组合物和相关方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及免疫学和蛋白质工程的交叉领域,并且尤其涉及适用于预防人类乳头瘤病毒(HPV)感染的抗原和疫苗。本发明提供重组蛋白质抗原、组合物和产生以及使用所述抗原和疫苗组合物的方法。
Description
相关申请案
本申请案涉及并且根据35USC119(e)主张2006年2月13日申请的U.S.S.N.60/773,374(′374申请案)的优先权;′374申请案的全部内容以引用的方式并入本文。
技术领域
无
背景技术
子宫颈癌是全世界妇女中第二位最常见的癌症。在发达国家通过筛查已经显著地降低了这种疾病的发病率,但是在大多数妇女还不能接受正规妇科护理和筛查的国家地区,子宫颈癌是仅次于乳腺癌的癌症相关死亡病因。临床、分子学和流行病学研究已将人类乳头瘤病毒(HPV)识别为子宫颈癌和子宫颈非典型增生(cervical dysplasia)的主要原因。几乎所有子宫颈癌(约99%)都含有高风险HPV的基因,最常见的有16、18、31和45型(福雷(Ferlay)等人,1999)。全世界约12百分比(12%)的女性癌症归因于子宫颈的HPV感染。每年,在世界范围内诊断出约470,000例子宫颈癌,并且几乎一半遭受疾病折磨的妇女将死亡。据估计,HPV16是近60%的子宫颈癌的病因,而HPV-18导致另外10%-20%。其他高风险类型包括31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68和73型。
此外,HPV也可能在某些头颈部的癌瘤以及更致命的黑素瘤和(或许)其他癌症中起作用(参见例如,梅林(Mellin)等人,2000,国际癌症杂志(Internat.J.Cancer),89:300;仲巴赫(Zumbach)等人,2000,国际癌症杂志(Internat.J.Cancer),85:815;德雷奥(Dreau)等人,2000,外科年报(Annals Surgery),231:664;和索伊尼(Soini)等人,1996,胸腔(Thorax),51:887)。
子宫颈非典型增生的当前治疗限于去除或破坏子宫颈组织的切除或摘除程序。这些程序具有近90%的有效率,但与发病率和费用相关。另外,外科治疗仅去除非典型增生的组织,而留下未治疗的表现正常的HPV感染组织(贝尔(Bell)等人,2005)。因此希望使用疫苗根除所述感染。青少年在其第一次遭遇HPV之前的预防性疫苗接种就是针对此目标。一些预防性疫苗目前在晚期临床试验中正在取得进展,得到了令人鼓舞的结果。由于在感染与癌症之间有较长的潜伏期,因此就癌症发病率而言,预防性疫苗接种的益处将在数十年后可见。但是,已经感染的个体以及正遭受晚期癌症的患者也可受益于治疗性疫苗接种。针对HPV来防止感染和/或治疗恶性疾病的疫苗接种可大大降低HPV相关癌症的发病率和死亡率。因此,仍对开发便宜的、较大人群可以容易使用的针对HPV的另外的改进疫苗存在需要。另外,开发能够阻碍预先存在的病变和恶性肿瘤的进程并且甚至将其消除的针对HPV的治疗性疫苗对受感染折磨的那些患者来说将具有非凡益处。
发明内容
本发明提供人类乳头瘤病毒(HPV)疫苗和植物中产生的疫苗组分。在一些实施例中,用热稳定蛋白质产生作为融合蛋白质形式的一种或一种以上人类乳头瘤病毒抗原。本发明另外包含含有HPV抗原的疫苗组合物。在一些实施例中,本发明HPV疫苗包含至少2种不同HPV抗原。另外,本发明提供包含至少2种不同人类乳头瘤病毒(HPV)抗原的人类乳头瘤病毒(HPV)疫苗。或者或另外,本发明HPV疫苗可包含一种或一种以上植物组分。另外提供用于产生和使用本发明的抗原和疫苗组合物的方法。
附图说明
图1是pET32质粒的图。顶部左边指示在用于克隆目标抗原的经修饰质粒中缺乏的T7启动子与T7终止子之间的区域。
图2显示pET-PRACS-Lic-KDEL和pET-PRACS-Lic-VAC构筑体从修饰后的pET32载体的产生。
图3是pBI121载体组织的示意图。
图4是切除β-葡糖苷酸酶(GUS)基因并且添加TMV衍生质粒后,pBID4质粒从pBI载体衍生的组织示意图。
图5是E7和E7GGG在地衣多糖酶序列中BglII与HindIII位点之间的的融合和在pBID4载体中的后续克隆的示意图。
图6A-D显示使用抗地衣多糖酶抗体(6A,C)或抗6HIS-E7抗体(6B,D)的表达E7构筑体的农杆菌渗透植物的免疫印迹分析。
图7A-D显示使用抗地衣多糖酶抗体(7A,C)或抗6HIS-E7抗体(7B,D)的表达E7构筑体的农杆菌渗透植物的免疫印迹分析。
图8显示使用抗地衣多糖酶抗体的表达E7(8A、8B)或E7GGG(8C、8D)构筑体的农杆菌渗透植物的地衣多糖酶活性分析。
图9A-D的(9A)显示使用抗地衣多糖酶抗体的表达E7GGG构筑体的农杆菌渗透植物的免疫印迹分析。(9B-D)显示来自通过纯化程序分离的蛋白质部分的库马斯染色分析。
图10显示在来自转基因根的提取物上执行的酶谱分析,所述转基因根是从用含有pBID4-Lic-E7-KDEL(泳道1-9)和pBID4-Lic-E7GGG-KDEL构筑体(泳道10、11)的发根农杆菌转化的侵染烟草叶外植体获得;泳道12=150ng地衣多糖酶(正对照);泳道13=来自用含有pBID4-Lic-E7-KDEL构筑体的发根农杆菌来农杆菌渗透(agro-infiltrated)的侵染烟草叶的粗提取物。
图11A-D显示植物产生的候选疫苗的特性和功效。(11A)显示E7特异性血清IgG反应。数据以1:500稀释血清的405nm下的光学密度值来呈现。来自个别动物的数据连同平均值一起显示。(11B)显示来自疫苗接种小鼠的脾细胞的ELISPOT分析。数据以每2×105个脾细胞的斑点平均数量±标准偏差(SD)来呈现。灰色和黑色条分别指经或未经特定CTL E7肽刺激的细胞。(11C)显示针对TC-1诱导肿瘤的预防性疫苗接种。数据以无肿瘤小鼠的百分比表示。(11D)显示针对TC-1诱导肿瘤的治疗性疫苗接种。数据以无肿瘤小鼠的百分比表示。
具体实施方式
本发明涉及适用于制备针对HPV感染的疫苗的人类乳头瘤病毒(HPV)抗原,和包含可操作连接到热稳定蛋白质的所述HPV抗原的融合蛋白质。本发明涉及产生所提供抗原的方法,包括(但不限于)在植物系统中产生。另外,本发明涉及载体、融合蛋白质、植物细胞、植物和包含本发明的抗原和融合蛋白质的疫苗组合物。另外还提供在个体中诱导针对HPV感染的免疫反应的方法,其包含向个体投与本发明的疫苗组合物。
HPV抗原
本发明的人类乳头瘤病毒(HPV)抗原蛋白质包括能够引发针对HPV病毒的免疫反应的任何免疫原性抗原蛋白质或肽。通常,所关注的免疫原性蛋白质包括HPV抗原(例如E6蛋白质、E7蛋白质等)、其免疫原性部分和/或其免疫原性变异体。
根据本发明适用的HPV抗原可包括全长HPV蛋白质(例如E6、E7等),或所述蛋白质的片段(其中所述片段保留免疫活性),和/或包含所述全长HPV蛋白质或片段的融合蛋白质。
涉及活体外细胞转化的HPV基因为编码E6和/或E7的那些基因(比德尔(Bedell)等人,1987,病毒学杂志(J.Virol),61:3635)。已提出E6和E7蛋白质可能引起细胞转化的机制(帕克(Park)等人,1995,癌症(Cancer),76:1902,和其中引用的参考文献)。基于其诱导针对病毒感染的免疫保护反应的能力,E7和E6成为产生疫苗的所关注的主要抗原。另外的HPV抗原也可能适用于产生组合疫苗来改善免疫保护的功效。
E6是包含Zn结合域的小的(约15,000MW)多肽。其转化功能的提示是通过观察到蛋白质结合p53而提供。p53蛋白质是一种熟知的肿瘤抑制基因蛋白质,其负调节细胞周期进程并因此负调节细胞生长和分裂。E6与p53的结合产生泛素化(ubiquitination)和后一种蛋白质的最终降解,所述过程涉及称为“E6相关蛋白质”的另一种细胞蛋白质。因此,表达E6的细胞将具有基础含量降低的p53。p53含量回应DNA破坏而升高。所述增加的含量产生p21(一种细胞周期素依赖性激酶抑制剂)的增强表达,所述蛋白质介导细胞周期停滞。所述机制提供具有时间窗的细胞,在所述时间窗内,它们可以在DNA复制之前修复破坏的DNA,从而将建立破坏/突变。由E6介导的p53的增强周转可防止所述机制的运转。近期,也发现,E6不仅通过加速降解p53,而且更直接通过阻断p53与DNA的相互作用来影响细胞周期调控(托马斯(Thomas)等人,1995,致癌基因(Oncogene),10:261)。
HPV E7癌蛋白(oncoprotein)是一种肿瘤特异抗原并且其涉及恶性进程。E7是一种短寿命蛋白质,其通过泛素-蛋白酶体路径活体外和活体内降解(莱因斯坦(Reinstein)等人,2000)。E7蛋白质是能够结合成视网膜细胞瘤基因产物Rb的小的(约10,000Mw)锌结合磷蛋白。Rb是与转录因子E2F结合并使转录因子E2F失活的肿瘤抑制基因。后一因子控制许多生长相关基因的转录,所述生长相关基因包括那些编码胸苷激酶、c-myc、二氢叶酸还原酶和DNA聚合酶α的基因。Rb-E2F复合物的形成防止后一基因在细胞周期的G0和G1期中表达,而将其表达限制于S期,在S期中Rb-E2F复合物经受解离,释放活性转录因子E2F。Rb-E7复合物的形成防止Rb-E2F复合物的形成,造成前S期缩短,即,加速通过细胞周期的进程。在真核表达系统中产生大量序列真正性(sequence-authentic)、非融合重组E7蛋白质的尝试实际上失败了,主要是由于其快速降解(费尔南多(Fernando)等人,1999)。然而,一些以E7为基础的HPV特异性治疗性疫苗目前正处于II期和III期临床试验研究之中。初步结果是有希望的,但仍需要通过结合能够刺激有效的细胞介导免疫性的更合适佐剂来进一步改进(弗雷泽(Frazer),2004)。
通过观察到来自高致癌性HPV类型(例如HPV 16和18)的E6蛋白质对p53具有比来自非致癌类型的相应蛋白质更高的亲和力和来自高致癌类型的E7蛋白质对Rb具有比来自非致癌类型的相应蛋白质更高的亲和力,为所述机制的重要性提供了相关证据。因此,E6和E7代表选择性疫苗和抗癌疗法的开发的主要目标。
因此,本发明提供表达异源蛋白质(例如HPV抗原)的植物细胞和/或植物。本发明的异源蛋白质可为所关注的任何HPV抗原,包括(但不限于)E6、E7、E6的部分和/或E7的部分。E7和具有一种亚型的经修饰E7的全长核酸和蛋白质序列提供于SEQ IDNO.:1、SEQ ID NO.:2、SEQ ID NO.:3和SEQ ID NO.:4中。
虽然本文中提供示范性HPV抗原的序列,但是各种HPV菌株和亚型的另外的E6和E7序列在所属领域已知并且可例如在GenBank等数据库中识别。另外,E6和E7各自的活性和域也在所属领域已知。因此,应了解,可替代地使用具有E6和/或E7的域的免疫原性特征的任何序列。所属领域的技术人员将很容易能够产生与所提供抗原具有至少75%、80%、85%或90%或更高的同一性的序列。在某些实施例中,HPV抗原的抗原序列构成包括在序列上具有至少95%、96%、97%、98%或更高的同一性的那些蛋白质的蛋白质或其部分,其中抗原蛋白质保留免疫原活性。举例而言,与HPV抗原具有足够同一性并保留免疫原性特征的序列,能够结合与本文中提供的域(抗原)反应的抗体。免疫原性特征常常包括相应氨基酸或侧基的三维呈现。所属领域的技术人员可容易识别具有适度序列差异的序列(例如,具有边界差异和/或一些序列替代差异,但仍保留免疫原性特征)。举例而言,其边界接近在所指定氨基酸序列的任一端处本文所指定的域边界(例如,约15个氨基酸、14个氨基酸、13个氨基酸、12个氨基酸、11个氨基酸、10个氨基酸、9个氨基酸、8个氨基酸、7个氨基酸、6个氨基酸、5个氨基酸、4个氨基酸、3个氨基酸、2个氨基酸或1个氨基酸以内)的序列可被视为包含根据本发明的相应域。因此,本发明涵盖使用包含近似于指定域的残基的HPV抗原的序列。举例而言,E7的域已经被工程改造并且被表达为作为本发明的抗原的顺框(in-frame)融合蛋白质(参见本文中的实例)。另外,所属领域的技术人员应了解,具有免疫原性的HPV抗原(例如E6、E7)氨基酸序列的任何域、部分域或区域均可使用本文中提供的构筑体和方法来产生。另外,域或亚域可组合地,分离地和/或连续地用于产生HPV抗原。
具有热稳定蛋白质的融合抗原
在本发明的某些方面中,提供融合多肽,其包含可操作连接到热稳定蛋白质的HPV抗原(或其片段或变异体)。本发明的融合多肽可以在所属领域已知的任何可用表达系统中产生。在某些实施例中,本发明的融合蛋白质在植物或其部分(例如,植物、植物细胞、根、芽等)中产生。
在人类或动物细胞中天然不可见的酶或其他蛋白质尤其适用于本发明的融合多肽。当融合时对融合产物赋予热稳定性的热稳定蛋白质是适用的。热稳定性允许所产生的蛋白质维持构象,并且在室温下维持所产生的蛋白质。这一特征有利于融合多肽容易、时间有效和成本有效的回收。根据本发明适用的热稳定酶的代表性家族为葡萄糖苷水解酶(glucanohydrolase)家族。这些酶特异地分裂混合链接多糖中邻近于1,3-β键合的1,4-P糖苷键(哈恩(Hahn)等人,1994,美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA),91:10417)。所述酶可见于燕麦和大麦等谷类中,并且也可见于许多真菌和细菌物种中,包括热纤梭菌(C.thermocellum)(戈登科娃(Goldenkova)等人,2002,分子生物学(Mol.Biol.),36:698)。因此,适用于本发明的融合多肽的示范性热稳定蛋白质包括糖苷酶;示范性热稳定糖苷酶蛋白质包括那些由选自以下各项的GenBank登录号表示的蛋白质:P29716、P37073、P45798、P38645;P40942;P14002;O33830、O43097、P54583、P14288、O52629、P29094、P49067、JC7532、Q60037、P33558、P05117、P04954、Q4J929、O33833、P49425、P06279、P45703、P45702、P40943、P09961、Q60042、AAN05438、AAN05437、AAN05440、AAN05439和AAD43138,其各自以引用的方式并入本文。用于本发明的融合蛋白质中的地衣多糖酶(lichenase)包括热纤梭菌(Clostridium thermocellum)P29716、短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)P37073和海洋红嗜热盐菌(Rhodothermusmarinus)P45798,其各自以引用其GenBank登录号的方式并入本文。实例中说明的代表性融合蛋白质利用从热纤梭菌分离的经修饰地衣多糖酶,但可根据本发明类似地利用任何热稳定蛋白质。
当设计根据本发明的融合蛋白质和多肽时,理想情况当然是保存抗原的免疫原性。另外,在本发明的某些方面中理想情况是提供赋予融合蛋白质热稳定性的构筑体。这一特征有利于目标抗原容易、时间有效和成本有效的回收。在某些方面中,所选择的抗原融合搭配物可提供另外的优点,包括对免疫原性的增强、引入多个疫苗抗原决定簇的潜力,但缺乏先前的理想性。2种所述系统包括产生克隆根(clonal root)和克隆植物系统和其衍生物,以及产生萌芽秧苗系统。
克隆植物
克隆根维持RNA病毒表达载体并且经过长时期和多次传代培养(subculture)在整个根中均匀稳定地产生目标蛋白质。与植物中(其中目标基因在细胞间移动或长距离移动期间通过重组而消除)对比,在根培养物中,维持了病毒载体的完整性并且所产生目标蛋白质随时间的含量与在初始筛选期间所观察到的相似。克隆根允许容易地产生用于抗原和疫苗组合物的口服调配物的物质。适用于产生抗原(例如本发明的抗原蛋白质)的得自植物的各种克隆实体的产生方法和试剂已在先前描述并且在所属领域中已知(参见例如,PCT公开案WO 05/81905,其以引用的方式并入本文)。克隆实体包括能够产生抗原(例如本发明的抗原蛋白质)的克隆根系、克隆根细胞系、克隆植物细胞系和克隆植物。本发明另外提供用于在得自各种植物组织(例如根、叶)的克隆细胞系中和得自单细胞(克隆植物)的完整植物中表达抗原多核苷酸和多肽产物的方法和试剂。所述方法通常基于使用各种类型的植物病毒载体。
举例而言,本发明的一个方面提供获得表达编码本发明抗原的多核苷酸的克隆根系的方法,其包含的步骤为:(i)将包含编码本发明的抗原的多核苷酸的病毒载体引入植物或其部分中;和(ii)从植物产生一种或一种以上的克隆根系。例如,克隆根系可通过用引起发根形成的农杆菌(Agrobacterium)(例如发根农杆菌(A.rhizogenes))感染植物或植物部分(例如收获的叶片)来产生。克隆根系可以各种方式来筛选以识别维持病毒的克隆根系、以高水平表达编码本发明的抗原的多核苷酸的克隆根系等。本发明另外提供克隆根系,例如根据本发明方法产生的克隆根系,并且另外涵盖使用所述克隆根系表达多核苷酸并产生编码本发明的抗原的多肽的方法。
本发明提供产生表达编码本发明的抗原的多核苷酸的克隆根细胞系的方法,其包含的步骤为:(i)产生克隆根系,其细胞含有基因组包含编码本发明的抗原的多核苷酸的病毒载体;(ii)从克隆根系释放个别细胞;和(iii)在适于根细胞增殖的条件下维持细胞。本发明提供克隆根细胞系和使用克隆根细胞系表达多核苷酸并产生多肽的方法。
在一些实施例中,本发明提供产生表达编码本发明的抗原的多核苷酸的克隆植物细胞系的方法,其包含的步骤为:(i)产生克隆根系,其细胞含有基因组包含编码本发明的抗原的多核苷酸的病毒载体;(ii)从克隆根系释放个别细胞;和(iii)在适于植物细胞增殖的条件下在培养物中维持细胞。本发明提供产生表达编码本发明的抗原的多核苷酸的克隆植物细胞系的方法,其包含的步骤为:(i)将包含编码本发明的抗原的多核苷酸的病毒载体引入维持在培养物中的植物细胞系的细胞中;和(ii)富集含有病毒载体的细胞。例如,富集可通过以下步骤来执行:(i)从培养物移出一部分细胞;(ii)稀释所移出的细胞以便降低细胞浓度;(iii)使所稀释的细胞增殖;和(iv)筛选含有病毒载体的细胞。克隆植物细胞系可用于产生根据本发明的HPV抗原。
本发明包括用于产生克隆植物的许多方法,所述克隆植物的细胞含有包含编码本发明的抗原的多核苷酸的病毒载体。举例而言,本发明提供产生表达编码本发明的抗原的多核苷酸的克隆植物的方法,其包含的步骤为:(i)产生克隆根系,其细胞含有基因组包含编码本发明的抗原的多核苷酸的病毒载体;(ii)从克隆根系释放个别细胞;和(iii)在适于植物形成的条件下维持所释放的细胞。本发明另外提供产生表达编码本发明的抗原的多核苷酸的克隆植物的方法,其包含的步骤为:(i)产生克隆植物细胞系,其细胞含有基因组包含编码本发明的抗原的多核苷酸的病毒载体;和(ii)在适于植物形成的条件下维持细胞。一般而言,根据本发明的克隆植物可表达编码本发明的抗原的任何多核苷酸。所述克隆植物可用于产生抗原多肽。
如上所述,本发明提供用于在克隆根系、克隆根细胞系、克隆植物细胞系(例如得自叶、茎等的细胞系)中和/或在克隆植物中表达编码本发明的抗原的一种或多种多核苷酸的系统。使用植物病毒载体,将编码本发明的抗原的多核苷酸引入植物祖细胞中,所述植物病毒载体的基因组包括编码可操作连接到启动子(即,在启动子控制下)的本发明的抗原的多核苷酸。根据下文进一步描述的数种技术中的任何技术,从含有病毒的细胞建立克隆根系或克隆植物细胞系。植物病毒载体或其部分可通过感染、通过用病毒转录物或感染性cDNA克隆的接种、通过电穿孔、通过T-DNA介导的基因转移等而引入植物细胞中。
以下部分描述用于产生表达编码本发明的抗原的多核苷酸的克隆根系、克隆根细胞系、克隆植物细胞系和克隆植物的方法。“根系”与“根细胞系”的区别在于,根系产生实际根状结构或根,而根细胞系是由不形成根状结构的根细胞组成。术语“系”的使用旨在说明所述系的细胞可增殖并且将遗传信息传递给后代细胞。细胞系的细胞通常在培养物中增殖,而不是那些例如在完整植物中所见的结构的组织化结构的部分。术语“根系”的使用旨在说明根结构中的细胞可增殖,而不是完整植物的部分。应注意,术语“植物细胞”涵盖根细胞。但是,为将用于产生根系和根细胞系的本发明方法与用于直接从非根组织产生植物细胞系的那些方法(与从克隆根系或得自克隆根系的克隆植物产生克隆植物细胞系对比)区别开来,如本文中所使用的术语“植物细胞”和“植物细胞系”通常指的是由非根植物组织组成的细胞和细胞系。植物细胞可为例如叶、茎、枝、花部分等。应注意,种子可得自如本文中获得的所产生的克隆植物。所述种子也将含有病毒载体,从所述种子获得的植物也如此。在所属领域熟知获得种子原料的方法(参见例如,美国专利公开案2004/0093643)。
克隆根系
本发明提供用于产生克隆根系的系统,在所述克隆根系中植物病毒载体用以直接表达编码本发明的抗原的多核苷酸。根据各种已知方法中的任何一种方法,将一种或一种以上的包括编码可操作连接到启动子的本发明的抗原的多核苷酸的病毒表达载体引入植物或其部分中。举例而言,植物叶可用病毒转录物来接种。载体自身可直接应用于植物(例如,通过研磨接种、机械化喷雾接种、真空渗透、粒子轰击或电穿孔)。或者或另外,可制备病毒粒子(virion)(例如从已感染的植物制备),并且可根据已知技术应用于其他植物。
在打算通过将病毒基因组直接应用于植物来完成感染的情况下,可使用任何可用技术来制备所述基因组。举例而言,根据本发明适用的许多病毒都具有ssRNA基因组。ssRNA可在活体内或活体外,通过转录基因组的DNA拷贝或通过复制RNA拷贝来制备。考虑到易于使用的活体外转录系统(例如SP6、T7、网织红细胞裂解液(reticulocyte lysate)等)的方便可得性以及维持RNA载体的DNA拷贝的便利性,希望本发明的ssRNA载体将常常通过活体外转录,尤其用T7或SP6聚合酶活体外转录来制备。可使用感染性cDNA克隆。根据所属领域已知的方法,通过使用例如农杆菌渗透法(agroinfiltration),由农杆菌介导的基因转移可用以将例如病毒载体(整个病毒基因组或其部分)的病毒核酸转移到植物细胞。
可随后在适于复制病毒转录物的条件下维持(例如培养或生长)植物或植物部分。在本发明的某些实施例中,病毒传播超出最初接种的细胞,例如从细胞局部传播到细胞和/或从最初接种的叶系统性传播进另外的叶中。但是,在本发明的一些实施例中,病毒不传播。因此,病毒载体可能含有编码功能性MP和/或CP的基因,但也可能缺乏所述基因之一或全部。一般而言,将病毒载体引入(感染)植物或其部分的多个细胞中。
将病毒载体引入植物中后,收获叶子。一般而言,可以在引入病毒载体后的任何时间收获叶子。但是,可能希望在病毒载体被引入植物中后,将植物维持一段时间,例如维持一段足以进行病毒复制和(视情况)足以使病毒从最初所引入的细胞传播的时期。例如通过下文进一步所述的已知方法制备克隆根培养物(或多种培养物)。
一般而言,任何可用方法都可用以从已引入病毒载体的植物或植物组织制备克隆根培养物。一种所述方法使用存在于某些细菌质粒中的基因。这些质粒可见于感染多种生物体并将DNA转移到多种生物体的各种农杆菌物种中。作为一个属,农杆菌可将DNA转移到多种多样的植物类型,包括许多双子叶植物和单子叶植物的被子植物物种和裸子植物(参见吉尔文(Gelvin),2003,微生物学与分子生物学评论(Microbiol.Mol.Biol.Rev.),67:16,和其中的参考文献,其全部以引用的方式并入本文)。将植物细胞的遗传转化的分子基础从细菌转移并且整合到大的诱导肿瘤的(tumor-inducing,Ti)或发根(rhizogenic,Ri)的质粒驻留在各种农杆菌物种内部的区域的植物核基因组中。这一区域在存在于质粒中时被称为“T区”,而从质粒切除时被称为“T-DNA”。通常,在天然存在的农杆菌感染中,将单股T-DNA分子转移到植物细胞并且最终并入(以双股形式)基因组中。基于Ti质粒的系统被广泛用于将外来遗传物质引入植物中并用于产生转基因植物。
用各种农杆菌物种感染植物并且转移T-DNA具有许多作用。例如,根癌农杆菌(A.tumefaciens)引起冠瘿病(crown gall disease),而发根农杆菌引起发根在感染部位处的发育,即一种称为“发根病(hairy root disease)”的病状。各根从单一遗传转化细胞产生。因此,根中的根细胞是克隆的,并且各根代表细胞的一个克隆群体。通过发根农杆菌感染产生的根具有高生长速度和遗传稳定性的特征(吉利(Giri)等人,2000,生物技术进展(Biotech.Adv.),18:1,和其中的参考文献,其全部以引用的方式并入本文)。另外,所述根能够再生遗传稳定的植物(吉利(Giri)等人,2000,同上)。
一般而言,本发明涵盖能够从植物细胞诱导根形成的农杆菌的任何菌株(例如,任何发根农杆菌菌株)的使用。如上所述,Ri质粒的一部分(Ri T-DNA)是引起发根病的原因。虽然将Ri质粒的所述部分转移到植物细胞可方便地通过用拥有Ri质粒的农杆菌感染来完成,但是本发明涵盖使用将相应区域引入植物细胞中的数种其他方法。这样的方法包括将遗传物质引入植物细胞中的任何可用方法,包括(但不限于)基因枪、电穿孔、PEG介导的DNA吸收、以Ti为基础的载体等。Ri T-DNA的相应部分可通过使用病毒载体引入植物细胞中。Ri基因可包括在含有编码本发明的抗原的多核苷酸的相同载体中,或包括在不同病毒载体中,所述不同病毒载体可以与包含编码本发明的抗原的多核苷酸的载体的类型相同或不同。应注意,可能并不需要整个Ri T-DNA来用于产生发根,并且本发明涵盖使用Ri T-DNA的部分,其限制条件为所述部分含有足以诱导根形成的遗传物质,如所属领域中已知。另外的遗传物质,例如存在于Ri质粒内而不存在于T-DNA内的基因,可被转移到根据本发明的植物细胞,尤其是对于表达产物促进T-DNA整合到植物细胞DNA中的基因而言。
为了制备根据本发明的某些实施例的克隆根系,在适于感染和转化的条件下,使所收获的叶部分与发根农杆菌接触。将叶部分维持在培养物中以允许发根发育。各根是克隆的,也就是说,根中的细胞是从被转移了Ri T-DNA的单一祖细胞得到。根据本发明,所述祖细胞的一部分将含有病毒载体。因此,得自所述祖细胞的根中细胞将含有病毒载体,因为病毒载体将在细胞分裂期间被复制并传递。因此,高比例(例如至少50%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%)、所有(100%)或大体上所有(至少98%)的细胞将含有病毒载体。应注意,因为病毒载体被克隆根内的子细胞(daughter cell)继承,所以病毒载体的根内移动并不是维持病毒载体遍及整个根所必需的。个别克隆发根可从叶部分移出并进一步培养。这样的根在本文中也称为根系。所分离的克隆根在分离后持续生长。
已使用本发明的方法产生各种不同的克隆根系。使用含有编码本发明的抗原(例如编码免疫原性肽)的多核苷酸的病毒载体产生了根系。通过免疫印迹法(Western blot)测试了根系。根系显示各种不同表达水平的各种多肽。选择显示高表达的根系并且进一步培养。随后再次测试根系并且证明经过长时期维持高表达水平,说明了稳定性。表达水平可相当于或超过以用来产生克隆根系的相同病毒载体感染的完整植物中的表达。另外,根系的表达稳定性优于经相同病毒载体感染的植物中所获得的表达稳定性。2-3次传代后,高达80%的所述病毒感染植物回复到野生型。(所述传代涉及用转录物接种植物,使感染(局部或系统性)建立,采集叶样本和接种随后测试表达的新鲜植物。)
如下文进一步所讨论,根系可被大规模培养用于产生本发明的抗原多肽。应注意,克隆根系(和得自克隆根系的细胞系)通常可维持在培养基中,所述培养基不包括通常用于培养根和植物细胞的各种化合物,例如植物生长激素,比如生长素(auxin)、细胞分裂素(cytokinin)等。这一特征降低了与组织培养相关的费用,并且发明者希望其显著有利于使用植物生产蛋白质的经济可行性。
各种方法中的任何一种方法都可用以选择表达编码本发明的HPV抗原的多核苷酸的克隆根。免疫印迹法、ELISA分析等都可用以检测所编码的多肽。在如GFP的可检测标记状况下,可执行如目视法筛选(visual screen)的替代方法。如果使用包含编码可选择标记的多核苷酸的病毒载体,那么可实行适当的选择(例如,叶物质和/或从其得到的根可以在适当抗生素或营养条件存在下培养并识别和分离存活的根)。某些病毒载体含有两种或两种以上编码本发明的抗原的多核苷酸,例如两种或两种以上编码不同多肽的多核苷酸。如果这些多肽之一是可选择或可检测的标记,那么通过选择标记或检测标记的表达来选择或检测的克隆根将具有同时也表达第二种多核苷酸的高概率。对于含有特定多核苷酸的根系的筛选可使用PCR和其他核酸检测方法来执行。
或者或另外,通过接种将由于病毒感染而形成局部病变的宿主植物(例如过敏性的宿主植物),就病毒的存在筛选克隆根系。例如,可将5mg根组织在50μl的磷酸盐缓冲液中匀化并用以接种烟草植物的单个叶。如果根培养物中存在病毒,那么2到3天内,特征病变将在受感染叶上出现。这意味着根系含有携带编码本发明的抗原的多核苷酸(目标基因)的重组病毒。如果没有局部病变形成,那么就不存在病毒,并且根系呈阴性被排斥。所述方法具有高的时间和成本有效性。就病毒存在与否进行的最初筛选后,可使含有病毒的根经受二次筛选,例如通过免疫印迹法或ELISA来选择高表达者。可应用另外的筛选,例如就快速生长、特定培养基中或特定环境条件下的生长等的筛选。一般而言,这些筛选方法可应用于开发本文中所述的任何克隆根系、克隆根细胞系、克隆植物细胞系和/或克隆植物。
如将对所属领域的技术人员而言明显的,可对用于产生含有病毒载体的克隆根系的本发明方法的描述进行各种修改。所述修改在本发明的范围之内。举例而言,虽然通常理想的是在引入Ri T-DNA基因之前先将病毒载体引入完整植物或其部分中,但是在本发明的某些实施例中,Ri-DNA是在引入病毒载体之前引入。另外,也可能是将完整植物与发根农杆菌接触而不是收获叶子部分并随后将其暴露给细菌。
可以使用从拥有病毒载体的植物或其部分的单细胞产生克隆根系的其他方法(即,不使用发根农杆菌或来自Ri质粒的遗传物质的方法)。举例而言,已知用某些植物激素或植物激素的组合处理而从植物组织产生根。
得自克隆根系的克隆细胞系
如上所述,本发明提供用于产生克隆根系的方法,其中根系中的细胞含有病毒载体。如所属领域中所熟知,可从根产生各种不同的细胞系。举例而言,根细胞系可从使用各种已知方法从根获得的个别根细胞产生。所述根细胞系可从根内的各种不同根细胞类型获得。一般而言,收获根物质并使其解离(例如,物理和/或酶促消化)来释放个别根细胞,然后进一步培养。完整的原生质体形成通常是不必要的。需要时,根细胞可以极稀的细胞浓度涂布,以便从单一根细胞获得根细胞系。以此方式得到的根细胞系是含有病毒载体的克隆根细胞系。所述根细胞系因此显示编码本发明的抗原的多核苷酸的稳定表达。克隆植物细胞系可以相似方式从克隆根获得,例如通过在适当植物激素存在下培养所解离的根细胞。可利用筛选和连续几轮富集来识别以高水平表达编码本发明的抗原的多核苷酸的细胞系。但是,如果产生细胞系的克隆根系已经以高水平表达,那么所述另外的筛选可能就是不必要的。
如在克隆根系的状况下,克隆根细胞系的细胞是得自含有病毒载体的单一祖细胞,并且因此也将含有病毒载体,因为病毒载体将在细胞分裂期间被复制并传递。因此,高比例(例如至少50%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%)、所有(100%)或大体上所有(至少98%)的细胞将含有病毒载体。应注意,因为病毒载体被克隆根细胞系内的子细胞继承,所以病毒载体在细胞间的移动并不是维持病毒载体所必需的。克隆根细胞系可如下文所述,用于产生编码本发明的抗原的多核苷酸。
克隆植物细胞系
本发明提供用于产生克隆植物细胞系的方法,在所述克隆植物细胞系中植物病毒载体用以直接表达编码本发明的抗原的多核苷酸。根据本发明的方法,将一种或一种以上包括编码可操作连接到启动子的本发明的HPV抗原的多核苷酸的病毒表达载体引入维持在细胞培养物中的植物细胞系的细胞中。来自各种植物类型的许多植物细胞系在所属领域中已知,可使用其中的任何植物细胞系。新得到的细胞系可根据适用于实施本发明的已知方法来产生。病毒载体根据许多方法中的任何方法引入植物细胞系的细胞中。举例而言,可制造原生质体并随后将病毒转录物电穿孔到细胞中。可使用将植物病毒载体引入植物细胞系的细胞中的其他方法。
用于产生根据本发明的克隆植物细胞系的方法和适于引入植物细胞(例如原生质体)中的病毒载体可如下使用:引入病毒载体后,植物细胞系可在组织培养物中维持。在此时间期间,病毒载体可复制,并且编码本发明的抗原的多核苷酸可被表达。克隆植物细胞系是例如通过连续富集方法从培养物得到。举例而言,可从培养物获取样本,视情况稀释以使细胞浓度较低,并以个别小液滴(droplet)涂于皮氏培养皿中(Petri dish)。随后维持小液滴以允许细胞分裂。
应了解,小液滴可含有不同数量的细胞,这取决于培养物的初始密度和稀释的量。如果希望仅在一轮富集后就获得表达编码本发明的抗原的多核苷酸的克隆细胞系,那么可稀释细胞以使大多数小液滴含有0或1个细胞。但是,更有效的方法是选择浓度以使多个细胞存在于各个小液滴中而随后筛选小液滴来识别那些含有表达细胞的小液滴。一般而言,可使用任何适当的筛选程序。例如,可使用如GFP的可检测标记的选择或检测。可使用免疫印迹法或ELISA分析。个别小液滴(100μl)含有对于执行所述分析来说绰绰有余的细胞。执行多轮富集来依次分离高表达细胞系。单一克隆植物细胞系(即,得自单一祖细胞的群体)可使用用于单细胞克隆的标准方法,通过进一步限制稀释来产生。然而,并非必需分离个别克隆系。可以使用含有多个克隆细胞系的群体来表达编码本发明的抗原的多核苷酸。
一般而言,上文对产生克隆根系所述的某些考虑也适用于产生克隆植物细胞系。例如,可使用含有一种或一种以上编码本发明的抗原的多核苷酸的多种病毒载体,以作为多种不同载体的组合。可使用相似的筛选方法。如在克隆根系和克隆根细胞系的状况下,克隆植物细胞系的细胞是得自含有病毒载体的单一祖细胞,并且因此也将含有病毒载体,因为病毒载体将在细胞分裂期间被复制并传递。因此,高比例(例如至少50%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%)、所有(100%)或大体上所有(至少98%)的细胞将含有病毒载体。应注意,因为病毒载体被克隆植物细胞系内的子细胞继承,所以病毒载体在细胞间的移动并不是维持病毒载体所必需的。克隆植物细胞系可如下文所述,用于产生编码本发明的抗原的多肽。
克隆植物
克隆植物可从根据上文所述的各种方法产生的克隆根、克隆根细胞系和/或克隆植物细胞系来产生。用于从根、根细胞系和植物细胞系,例如本文中所述的克隆根系、克隆根细胞系和克隆植物细胞系产生植物的方法在所属领域中熟知(参见例如,派瑞斯(Peres)等人,2001,植物细胞、组织和器官培养(Plant Cell,Tissue,and Organ Culture),65:37;和本文中其它地方引用的关于植物分子生物学和生物技术的标准参考著作)。本发明因此提供产生克隆植物的方法,其包含的步骤为(i)根据上文所述的本发明方法中的任何方法产生克隆根系、克隆根细胞系或克隆植物细胞系;和(ii)从克隆根系、克隆根细胞系或克隆植物细胞系产生完整植物。克隆植物可根据标准方法繁殖和生长。
如在克隆根系、克隆根细胞系和克隆植物细胞系的状况下,克隆植物的细胞是得自含有病毒载体的单一祖细胞,并且因此也将含有病毒载体,因为病毒载体将在细胞分裂期间被复制并传递。因此,高比例(例如至少50%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%)、所有(100%)或大体上所有(至少98%)的细胞将含有病毒载体。应注意,因为病毒载体被克隆植物内的子细胞继承,所以病毒载体的移动并不是维持病毒载体所必需的。
芽和萌芽秧苗植物表达系统
适用于产生根据本发明的HPV抗原的各种芽和萌芽秧苗的产生系统和试剂已在先前描述并且在所属领域中已知(参见例如,PCT公开案WO 04/43886,其以引用的方式并入本文)。本发明另外提供萌芽秧苗(可以是可食用的),呈含有HPV抗原肽或蛋白质的生物质(biomass)。在某些方面中,提供直接用于消耗抗原组合物的生物质。在一些方面中,在消耗之前,例如通过匀化、粉碎、干燥或提取来加工生物质。在某些方面中,从生物质纯化HPV抗原并将其调配到医药组合物中。
另外提供用于在萌芽秧苗中产生HPV抗原的方法,所述萌芽秧苗可以被消耗或者在活的时候(live)被收获(例如,芸苔属(Brassica genus)的芽、萌芽秧苗)。在某些方面中,本发明涉及使种子在封闭的(contained)、可调控环境(例如在室内、在容器内等)中生长成可食用萌芽秧苗。种子可为含有编码HPV抗原的表达盒(expressioncassette)的遗传工程改造种子,所述表达通过外源可诱导启动子来驱动。可使用各种外源可诱导启动子,例如可通过光、热、植物激素、养分等来诱导。
在相关实施例中,本发明提供在萌芽秧苗中产生HPV抗原的方法,其包含首先使用农杆菌转化系统,用编码HPV抗原的表达盒将植物转化来产生用于萌芽秧苗的种子原料,其中HPV抗原的表达通过可诱导启动子来驱动。转基因种子可从转化植物获得,在封闭的、可调控环境中生长,并且经诱导来表达HPV抗原。
在一些实施例中,提供涉及用编码HPV抗原的病毒表达盒感染萌芽秧苗的方法,其中所述表达可通过病毒启动子或可诱导启动子的任何启动子来驱动。使萌芽秧苗在封闭的、可调控环境中生长2到14天,或至少到已获得用于消耗或收获的足够含量的HPV抗原为止。
本发明另外提供用于在萌芽秧苗中产生HPV抗原的系统,其包括气候控制下的框架单元和含有编码一种或一种以上HPV抗原的表达盒的萌芽秧苗,其中表达是通过构成性或可诱导启动子来驱动。本发明的系统可提供超过不能被控制的户外环境或温室的独特优点。因此,本发明使生长物能达到诱导HPV抗原的表达的精确时间。它也可大大降低产生HPV抗原的成本。
在某些方面中,瞬时转染的芽含有编码本发明的HPV抗原的病毒载体序列。使苗生长一段时间以允许芽中产生病毒核酸,接着经过一个产生病毒的多个拷贝的生长时期,从而产生抗原。
在某些方面中,使含有编码HPV抗原的转基因的遗传工程改造种子或胚芽在封闭的、可调控环境中生长到萌芽秧苗阶段。封闭的、可调控环境可以是其中种子可在室内生长的框架单元或房间。封闭的、可调控环境的所有环境因素都可被控制。因为芽的生长不需要光,并且照明昂贵,所以可使遗传工程改造种子或胚芽在缺少光时,在室内生长到萌芽秧苗阶段。
在本发明的封闭的、可调控环境中可调控的其他环境因素包括温度、湿度、水、养分、气体(例如O2或CO2含量或空气循环)、化学物质(如糖和糖衍生物的小分子,或者如植物激素赤霉酸(gibberellic acid)或脱落酸(absisic acid)的激素等)等。
根据本发明的某些方法,编码HPV抗原的转基因的表达可通过外源可诱导启动子来控制。外源可诱导启动子回应外部而不是内部刺激来引起转基因表达的增加或降低。许多所述环境因素可担当由遗传工程改造芽的表达盒所携带的转基因的诱导物。启动子可以是热可诱导的启动子,例如热休克(heat-shock)启动子。举例而言,当使用热休克启动子时,可简单地通过升高封闭的环境的温度来诱导转基因的表达。其他启动子包括光可诱导启动子。如果在封闭的可调控环境中的灯光始终开启,那么光可诱导启动子可以作为构成性启动子来维持。或者或另外,转基因的表达可在发育期间的特定时间,简单地通过开启灯光而启动。启动子可以是用以诱导转基因表达的化学可诱导启动子。根据所述实施例,化学物质可简单地通过被雾化或喷雾到种子、胚芽或苗来诱导转基因的表达。喷雾和雾化可被精确控制并且被引导到所希望的目标种子、胚芽或苗上。封闭的环境中没有可能将化学物质分散而远离预期目标的风流或气流,以便化学物质停留在所希望的目标上。
根据本发明,可选择诱导表达的时间,以使到收获时为止萌芽秧苗中的HPV抗原表达最大化。在特定生长阶段诱导胚芽中的表达,例如,在发芽特定天数后诱导胚芽中的表达,可在收获时产生HPV抗原的最大合成。举例而言,在发芽4天后由启动子诱导表达可比3天后或5天后由启动子诱导表达产生更多的蛋白质合成。所属领域的技术人员应了解,最大化表达可通过常规实验达到。在一些实施例中,在发芽约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12天后收获萌芽秧苗。
在表达载体具有构成性启动子以代替可诱导启动子的状况下,萌芽秧苗可在其转化后的某个时间被收获。举例而言,如果萌芽秧苗在发育早期,例如在胚芽阶段经历病毒转化,那么萌芽秧苗可在表达处于转化后其最大值之时,例如在转化后约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天时被收获。也可能视种子的发芽而定,使芽在转化后发育1、2、3个月或更久。
通常,一旦HPV抗原的表达开始,就使种子、胚芽或萌芽秧苗生长直到足够含量的HPV抗原被表达。在某些方面中,如果所收获生物质被生食(raw),那么足够含量是指将对患者提供治疗益处的含量。或者或另外,足够含量为HPV抗原可从生物质浓缩或纯化并且调配成在投药后对患者提供治疗益处的医药组合物的含量。通常,所述抗原不是天然中在萌芽秧苗中表达的蛋白质。至少,HPV抗原通常是以高于天然中存在于萌芽秧苗中的浓度来表达。
一旦HPV抗原的表达被诱导,就使生长持续直到萌芽秧苗阶段,此时收获萌芽秧苗。萌芽秧苗可在活的时候被收获。收获活的萌芽秧苗有几个优点,包括最少的工作量(effort)和最少的破坏(breakage)。本发明的萌芽秧苗可以使用溶液培养法生长,从而使收获成为将萌芽秧苗从其培养溶液提起的简单事件。本发明的萌芽秧苗的生长不需要土壤,但如果所属领域的技术人员认为必需或是理想的,那么可提供土壤。因为芽可以在无土壤下生长,所以在收获时不需要清洗萌芽秧苗物质。能够直接从溶液培养环境收获萌芽秧苗并且不用洗涤或擦洗将对所收获物质的破坏最小化。植物的破坏和萎蔫(wilting)诱导细胞凋亡。在细胞凋亡期间,某些蛋白水解酶变成活性的,其可降解萌芽秧苗中表达的医药蛋白质,产生降低的蛋白质治疗活性。细胞凋亡诱导的蛋白水解会显著降低来自成熟植物的蛋白质产量。使用本发明的方法,直到从植物提取蛋白质的时刻才进行收获,细胞凋亡可得以避免。
举例而言,可在含有蛋白酶抑制剂的缓冲液中将活芽研磨、粉碎或掺合而产生萌芽秧苗生物质的浆液。缓冲液可维持在约4℃。在一些方面中,将萌芽秧苗生物质风干、喷雾干燥、冷冻或冷冻干燥。当在成熟植物中时,一些所述方法,例如风干可能造成医药蛋白质的活性损失。但是,因为萌芽秧苗非常小而且具有大的表面积与体积比,所以这种情况不太可能发生。所属领域的技术人员应了解,使所表达蛋白质的蛋白水解最小化的许多生物质收获技术是可用的并且可应用于本发明。
在一些实施例中,萌芽秧苗可食用。在某些实施例中,表达足够含量的HPV抗原的萌芽秧苗在收获后(例如,收获后立即,收获后最短时期内)被消耗,以便在消耗萌芽秧苗之前绝对没有加工发生。由此,在HPV抗原投与需要治疗的患者之前,HPV抗原的任何由收获诱导的蛋白水解性分解就被最小化。举例而言,准备被消耗的萌芽秧苗可以直接传递给患者。或者或另外,将遗传工程改造种子或胚芽传递给需要治疗的患者并通过患者生长到萌芽秧苗阶段。在一个方面中,向患者或向治疗患者的医生提供遗传工程改造萌芽秧苗的供应,以便可培育表达某些理想HPV抗原的萌芽秧苗的持续不断的原料。这种做法对发展中国家人群颇有价值,在所述发展中国家中,无力支付或者无力交付昂贵的医药品。可使本发明的萌芽秧苗生长的容易性使本发明的萌芽秧苗对所述的发展中国家人群尤为理想。
封闭的环境的可调控性质赋予本发明超过使植物在户外环境中生长的优点。一般而言,使表达医药蛋白质的遗传工程改造萌芽秧苗在植物中生长比使遗传工程改造植物生长更快地(因为更幼小时收获植物)提供医药产物,并且具有较少工作量、风险和调控考虑因素。用于本发明中的封闭的、可调控环境降低或消除了自然界中将植物交叉授粉的风险。
举例而言,热可诱导启动子可能不会用于户外,因为室外温度不可控制。所述启动子将在室外温度上升到高于某个水平的任何时间时启动。相似地,每当室外温度降低时,启动子将停止。这样的温度变动可能在一天内发生,例如在白天启动表达而在夜间停止。热可诱导启动子(例如本文中描述的那些)甚至实际上不适用于温室,所述温室对气候变动敏感,几乎达到与户外相同的程度。遗传工程改造植物在温室中的生长十分昂贵。相比之下,在本发明的系统中,每个变量都可受控制以便每次收获时都可达到最大表达量。
在某些实施例中,本发明的萌芽秧苗是在托盘(tray)中生长,所述托盘可在萌芽秧苗发育期间的任何时间加水、喷雾或雾化。举例而言,托盘可配备一个或一个以上的加水、喷雾、雾化和排水装置,从而可以在萌芽秧苗发育期间的特定时间并且以精确量传递和/或去除水、养分、化学物质等。例如,种子需要足够水分来保持其潮湿。过量水分通过托盘中的孔排出到房间地板中的排水沟中。通常适当时,排出水在排放回环境中之前加以处理以去除有害化学物质。
托盘的另一个优点是其可容纳在极小空间中。因为萌芽秧苗的生长不需要光,所以含有种子、胚芽或萌芽秧苗的托盘可彼此上下垂直紧密堆叠,从而在特别为所述目的而建构的框架设施中提供每单位占地面积较大量的生物质。另外,托盘堆叠可以在框架单元内排列成水平的行。一旦苗已生长到适于收获的阶段(约2到14天),就手动地或通过自动装置(例如传送带)将个别苗托盘移入加工设施中。
本发明的系统独特之处在于,其提供作为HPV抗原来源的萌芽秧苗生物质。无论是直接消耗还是加工成医药组合物形式,都因为萌芽秧苗是在封闭的、可调控环境中生长,所以萌芽秧苗生物质和/或源自生物质的医药组合物均可以低成本提供给消费者。另外,由于萌芽秧苗生长的条件可被控制,因此产物的品质和纯度具有一致性。本发明的封闭的、可调控环境也回避了EPA的许多安全规范,可使科学家不用在户外生长遗传工程改造农产品。
转化芽
各种方法可用以转化植物细胞并产生遗传工程改造萌芽秧苗。用于转化植物的2种可用方法包括根癌农杆菌介导的基因转移和微弹轰击法(microprojectile bombardment)或电穿孔,所述方法需要在活体外产生转基因植物细胞系,接着将细胞系再生到完整植物中。病毒转化是胚芽和萌芽秧苗转化的一种快速更快且成本更低的方法,所述胚芽和萌芽秧苗可以在获得期望的产物之前无实验或世代延迟(experimental or generationallag)而被收获。对所述技术中的任何技术而言,所属领域的技术人员应了解如何调整和优化传统上用于植物、种子、胚芽或萌芽秧苗的转化方案。
农杆菌转化表达盒
农杆菌是革兰氏阴性家族根瘤菌科(Rhizobiaceae)的代表属。这一物种是冠瘿病和发根病等植物肿瘤的病因。在以肿瘤为特征的去分化植物组织中,被称作冠瘿碱(opine)的氨基酸衍生物通过农杆菌产生并且被植物分解代谢。负责冠瘿碱表达的细菌基因是嵌合表达盒的控制元件的方便来源。根据本发明,农杆菌转化系统可用以产生仅仅比成熟植物更早收获的可食用萌芽秧苗。可容易地应用农杆菌转化方法来再生表达HPV抗原的萌芽秧苗。
一般而言,植物的转化涉及通过用携带植物/细菌载体的根癌农杆菌共同培育来转化在组织培养物中生长的植物细胞。载体含有编码HPV抗原的基因。农杆菌将载体转移到植物宿主细胞并且随后使用抗生素处理来消除。选择表达HPV抗原的转化植物细胞、分化并最终再生到完整小植物(plantlet)中(海伦斯(Hellens)等人,2000,植物分子生物学(Plant Mol Biol),42:819;皮隆斯密茨(Pilon-Smits)等人,1999,植物生理学(Plant Physiolog),119:123;巴非尔德(Barfield)等人,1991,植物细胞报告(Plant CellReports),10:308;和里瓦(Riva)等人,1998,生物技术杂志(J.Biotech),1(3);每一篇参考文献以引用的方式并入本文)。
适用于本发明的表达载体包括经设计在植物中操作的编码HPV抗原的基因(或表达盒),而伴生序列(companion sequence)位于表达盒的上游和下游。伴生序列通常具有质粒或病毒起源并且向载体提供将DNA从细菌转移到期望植物宿主的必需特征。
基本的细菌/植物载体构筑体可理想地提供广泛宿主范围的原核生物复制起点、原核生物可选择标记。合适的原核生物可选择标记包括针对氨苄青霉素(ampicillin)或四环素(tetracycline)等抗生素的抗性。载体中可存在所属领域中熟知的编码另外的功能的其他DNA序列。
农杆菌T-DNA序列是农杆菌介导的DNA转移到植物染色体所必需的。通常去除T-DNA的诱导肿瘤的基因并代之以编码HPV抗原的序列。保留T-DNA边界序列,因为它们引发T-DNA区域到植物基因组中的整合。如果HPV抗原的表达不易检测,那么细菌/植物载体构筑体可以包括适于确定植物细胞是否已被转化的可选择标记基因,例如nptII卡那霉素(kanamycin)抗性基因。在相同或不同细菌/植物载体(Ti质粒)上的是Ti序列。Ti序列包括毒力基因(virulence gene),其编码一组负责T-DNA的切除、转移和到植物基因组中的整合的蛋白质(谢尔(Schell),1987,科学(Science),237:1176)。允许异源序列整合到植物基因组中的其他适用序列可包括用于同源重组的转位子序列(transposon sequence)等。
某些构筑体包括编码抗原蛋白质的表达盒。在指定转化中可以使用1种、2种或更多种的表达盒。除HPV抗原编码序列之外,重组表达盒还至少含有以下元件:启动子区域、植物5′端非翻译序列、起始密码子(取决于所表达基因自身是否具有)和转录与翻译终止序列。另外,转录与翻译终止子可包括在本发明的表达盒或嵌合基因中。适当时,表达盒中可包括允许蛋白质加工和易位的信号分泌序列。已描述了各种启动子、信号序列和转录与翻译终止子(参见例如,劳顿(Lawton)等人,1987,植物分子生物学(Plant Mol.Biol),9:315;和美国专利5,888,789,以引用的方式并入本文)。另外,抗生素抗性的结构基因通常用作选择因子(弗雷利(Fraley)等人1983,美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA),80:4803,以引用的方式并入本文)。在表达盒5′端和3′端处独特的限制酶位点允许容易插入预先存在的载体中。用于农杆菌介导的转化、携带至少一个T-DNA边界序列的其他二元载体系统描述在PCT/EP99/07414中,以引用的方式并入本文。
再生
可收获转化植物的种子、干燥、清洁并且测试其生活力(viability)和期望基因产物的存在和表达。通常在必要时,一旦得以测定,就将种子原料储存在适当的温度、湿度、卫生和安全条件下以备用。完整植物可随后从所培养的原生质体再生(参见例如,埃文斯(Evans)等人,植物细胞培养手册(Handbook of Plant Cell Cultures),第1卷,麦克米兰出版公司(MacMillan Publishing Co.),纽约,1983;和瓦希尔(Vasil I.R.)(编),植物细胞培养和体细胞遗传(Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants),学术出版社(Acad.Press),奥来多(Orlando),第I卷,1984和第III卷,1986,以引用的方式并入本文)。在某些方面中,仅将植物再生到萌芽秧苗阶段。在一些方面中,将完整植物再生来产生种子原料,再从种子原料的种子产生萌芽秧苗。
可分离得到原生质体并加以培养以得到完整再生植物的所有植物都可通过本发明来转化以便回收含有所转移基因的完整植物。已知的是,实际上所有植物都可从培养的细胞或组织来再生,包括(但不限于)产生可食用芽的所有主要植物物种。一些适合的植物包括苜蓿(alfalfa)、绿豆(mung bean)、萝卜(radish)、小麦(wheat)、芥菜(mustard)、菠菜(spinach)、胡萝卜(carrot)、甜菜(beet)、洋葱(onion)、大蒜(garlic)、芹菜(celery)、大黄(rhubarb)、多叶植物如卷心菜(cabbage)或莴苣(lettuce)、水田芥(watercress)或水芹(cress)、草本类如欧芹(parsley)、薄荷(mint)或三叶草(clovers)、花椰菜(cauliflower)、西兰花(broccoli)、大豆(soybean)、小扁豆(lentils)、可食用的花如向日葵(sunflower)等。
再生的方式在不同植物物种之间有所不同。但是,所属领域的技术人员应了解,通常是先提供含有异源基因拷贝的转化原生质体的悬浮液。形成愈伤组织(callus tissue)并且可从愈伤组织诱导形成枝,随后生根。或者或另外,可从原生质体悬浮液诱导胚芽形成。所述胚芽作为天然胚芽发芽而形成植物。将种子浸渍在水中或用水喷雾种子以使种子的水分含量增加到35-45%之间,引发发芽。为了使发芽进行下去,通常在受控的温度和气流条件下,将种子维持在水饱和的空气中。培养基通常含有各种氨基酸和激素,例如生长素和细胞分裂素。有利的是将谷氨酸和脯氨酸添加到培养基中,尤其对苜蓿等物种而言。枝和根通常同时发育。有效的再生取决于培养基、基因型和培养史。如果对这3个变量加以控制,那么再生是完全可再现和可重复的。
使从转化植物细胞生长的成熟植物自花授粉并且识别不分离的、纯合转基因植物。自交植物产生含有本发明的抗原编码序列的种子。可以使所述种子发芽并生长到萌芽秧苗阶段来产生根据本发明的HPV抗原。
在相关实施例中,本发明的种子可形成为种子产品并附上说明书出售,所述说明书是关于如何使苗生长到适当萌芽秧苗阶段以用于投药或收获到医药组合物中。在一些相关实施例中,可以从本发明的自交植物开发体现期望性状的杂种或新颖变种。
直接整合
在本发明中可以通过微弹轰击法或电穿孔,将DNA片段直接整合到植物细胞的基因组中(参见例如,奇科特(Kikkert)等人,1999,植物:组织培养协会杂志(Plant:J.Tissue Cult.Assoc),35:43;和贝茨(Bates),1994,分子生物技术(Mol.Biotech),2:135)。具体地说,表达本发明的HPV抗原的载体可通过各种技术引入植物细胞中。如上所述,载体可包括适用于植物细胞的可选择标记。载体可包括允许其在第二宿主中选择和繁殖的序列,例如含有复制起点和可选择标记的序列。通常,第二宿主包括细菌和酵母。在一实施例中,第二宿主为细菌(例如,大肠杆菌(Escherichia coli),复制起点是colE1型复制起点)而可选择标记为编码氨苄青霉素抗性的基因。所述序列在所属领域中熟知并且是市售的(例如,加利福尼亚州帕罗奥多的科隆泰克公司(Clontech,Palo Alto,CA)或加利福尼亚州拉贺亚的斯曲塔基因公司(Stratagene,La Jolla,CA))。
本发明的载体可被修饰成中间植物转化质粒,所述转化质粒含有与根癌农杆菌载体同源的区域、来自根癌农杆菌的T-DNA边界区和上文所述的编码抗原的核酸或表达盒。其他载体可包括根癌农杆菌的无致癌能力的(disarmed)植物肿瘤诱导质粒。
根据此实施例,本发明载体的直接转化可涉及通过使用微量移液管机械转移重组DNA来将载体直接微注射到植物细胞中(参见例如,科洛斯维(Crossway),1985,分子基因遗传学(Mol.Gen.Genet),202:179,以引用的方式并入本文)。遗传物质可使用聚乙二醇转移到植物细胞中(参见例如,科雷恩斯(Krens)等人,1982,自然(Nature),296:72)。将核酸引入植物中的另一种方法是利用具有核酸(在小珠粒或粒子的基质内或在表面上)的小粒子的高速冲击穿透(high velocity ballistic penetration)(参见例如,克莱因(Klein)等人,1987,自然(Nature),327:70;努森(Knudsen)等人,1991,植物(Planta),185:330)。另一种引入方法是原生质体与其他实体,即微细胞、细胞、溶酶体或其他可融合脂质表面体的融合(参见例如,弗雷利(Fraley)等人,1982,美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA),79:1859)。本发明的载体可通过电穿孔引入植物细胞中(参见例如,弗罗姆(Fromm)等人1985,美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA),82:5824)。根据此项技术,将植物原生质体在含有基因构筑体的质粒存在下电穿孔。具有高场强度的电脉冲可逆地穿透生物膜,从而允许引入质粒。经过电穿孔的植物原生质体重整细胞壁,分裂并形成植物愈伤组织,愈伤组织可再生而形成本发明的萌芽秧苗。所属领域的技术人员应了解,如何利用所述方法来转化植物细胞而后用于产生可食用萌芽秧苗。
病毒转化
与常规表达系统类似,可使用植物病毒载体产生全长蛋白质,包括全长抗原。根据本发明,植物病毒载体可用以在种子、胚芽、萌芽秧苗等中感染并产生抗原,病毒系统可用以表达从短肽到大的复合蛋白质的所有物质。具体而言,已描述使用烟草花叶病毒载体(tobamoviral vector)(参见例如,麦考密克(McCormick)等人1999,美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Scl,USA),96:703;熊谷(Kumagai)等人,2000,基因(Gene)245:169;及维切(Verch)等人,1998,免疫学方法杂志(J.Immunol Methods),220:69;每篇参考文献以引用的方式并入本文)。因此,植物病毒载体具有表达短肽以及大的复合蛋白质的已被证明的能力。
在某些实施例中,表达HPV抗原的转基因芽是利用宿主/病毒系统而产生。通过病毒感染产生的转基因芽提供已被证明是安全的转基因蛋白质来源。举例而言,芽不含具有动物病原体的污染物。例如不同于烟草,来自可食用芽的蛋白质至少在理论上可不经纯化即用于口服应用,因此显著降低成本。另外,病毒/芽系统提供了一种进行扩大规模和商业生产的更简单、不太昂贵的途径,因为将转基因引入病毒后,可在几天内生长到商业规模。相比之下,在足够种子或植物物质可用于大规模试验或商业化之前,转基因植物可能需要长达5-7年时间。
根据本发明,植物RNA病毒具有某些优点,使其成为有吸引力的用于外来蛋白质表达的载体。许多植物RNA病毒的分子生物学和病理学已经得到充分表征,并且对病毒生物学、遗传学和调控序列已经有相当多的了解。大多数植物RNA病毒具有小的基因组,并且许多感染性cDNA克隆可用以促进遗传操作。感染性病毒物质一旦进入敏感宿主细胞中,就复制达到高含量并且快速传播遍及整个萌芽秧苗(接种后1到10天)。病毒粒子可以容易地并且经济地从受感染的萌芽秧苗组织回收。病毒具有广泛的宿主范围,因此可以使用单个构筑体来感染数个敏感物种。所述特征可容易转移到芽。
外来序列可以由植物RNA病毒表达,通常是通过以期望序列替换病毒基因之一,通过在病毒基因组中的适当位置插入外来序列,或通过将外来肽与病毒的结构蛋白质融合。此外,可将所述方法中的任何方法组合以通过病毒生命机能的反式互补作用(trans-complementation)来表达外来序列。许多不同策略可以作为使用烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)、苜蓿花叶病毒(alfalfa mosaic virus,AlMV)和其嵌合体在病毒感染的植物中表达外来序列的工具。
AlMV的基因组是雀麦花叶病毒科(Bromoviridae family)病毒的代表并且由3个基因组RNA(RNA 1-3)和亚基因组RNA(RNA4)组成。基因组RNA1和2分别编码病毒复制酶蛋白质P1和2。基因组RNA3编码细胞间移动蛋白质P3和外壳蛋白质(coatprotein,CP)。CP是从亚基因组RNA4(从基因组RNA3合成)翻译,并且是开始感染所需要的。研究证明在多种功能中涉及CP,包括基因组活化、复制、RNA稳定性、症状形成和RNA衣壳化(RNA encapsidation)(参见例如,波尔(Bol)等人,1971,病毒学(Virology),46:73;范德沃森(Van Der Vossen)等人,1994,病毒学(Virology)202:891;尤斯波夫(Yusibov)等人,病毒学(Virology),208:405;尤斯波夫(Yusibov)等人,1998,病毒学(Virology),242:1;波尔(Bol)等人,(评论,100篇参考文献(Review,100refs.)),1999,普通病毒学杂志(J.Gen.Virol),80:1089;德格拉夫(De Graaff),1995,病毒学(Virology),208:583;贾斯巴(Jaspars)等人,1974,病毒研究进展(Adv.VirusRes.),19:37;路赫费尔斯(Loesch-Fries),1985,病毒学(Virology),146:177;尼尔曼(Neeleman)等人,1991,病毒学(Virology),181:687;尼尔曼(Neeleman)等人,1993,病毒学(Virology),196:883;范德科利(Van Der Kuyl)等人,1991,病毒学(Virology),183:731;和范德科利(Van Der Kuyl)等人,1991,病毒学(Virology),185:496)。
病毒粒子的衣壳化通常是病毒从种子、胚芽或萌芽秧苗的接种部分到未接种部分长距离移动和系统性感染所需的。根据本发明,接种可在植物发育的任何阶段发生。在胚芽和芽中,所接种病毒的传播应当很迅速。A1MV的病毒粒子是通过独特CP(24kD)来衣壳化,形成不止1种类型的粒子。粒子的尺寸(长度30到60nm和直径18nm)和形状(球形、椭圆形或杆状)取决于衣壳化RNA的尺寸。装配后,认为AlMV CP的N末端位于病毒粒子的表面上并且似乎不干扰病毒装配(波尔(Bol)等人,1971,病毒学(Virology),6:73)。另外,在N末端有另外的38氨基酸肽的AlMV CP在活体外形成粒子并且保留生物活性(尤斯波夫(Yusibov)等人,1995,普通病毒学杂志(J.Gen.Virol),77:567)。
AlMV具有广泛的宿主范围,包括许多农业上有价值的作物植物,包括植物种子、胚芽和芽。总的来说,这些特征使AlMV CP成为优良的候选载体分子并且使AlMV成为用于在芽发育阶段,在植物中表达外来序列的有吸引力的候选载体。此外,在从异源载体如TMV表达后,AlMV CP将TMV基因组衣壳化而不干扰病毒感染性(尤斯波夫(Yusibov)等人,1997,美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA),94:5784,以引用的方式并入本文)。这允许将TMV用作与外来序列融合的AlMV CP的载体病毒。
TMV(烟草花叶病毒的原型)的基因组由以17.0kD CP衣壳化的单正链RNA组成,形成杆状粒子(长度300nm)。CP是TMV的唯一结构蛋白质并且是病毒在受感染宿主中的衣壳化和长距离移动所需的(塞托(Saito)等人,1990,病毒学(Virology),176:329)。183和126kD蛋白质是从基因组RNA翻译并且为病毒复制所需(伊斯卡娃(Ishikawa)等人,19S6,核酸研究(Nuc.Acids Res.),14:8291)。30kD蛋白质是病毒的细胞间移动蛋白质(梅西(Meshi)等人,1987,欧洲分子生物学杂志(EMBO J.),6:2557)。移动蛋白质和外壳蛋白质是从亚基因组mRNA翻译(亨特(Hunter)等人,1976,自然(Nature),260:759;布鲁宁(Bruening)等人,1976,病毒学(Virology),71:498;和毕奇(Beachy)等人,1976,病毒学(Virology),73:498;每篇参考文献以引用的方式并入本文)。
转化植物组织的其他方法包括转化植物的花。拟南芥(Arabidopsis thaliana)的转化可通过将植物花浸入根癌农杆菌的溶液中来达到(柯蒂斯(Curtis)等人,2001,转基因研究(Transgenic Res.),10:363;和秦(Qing)等人,2000,分子育种:植物改良的新策略(Molecular Breeding:New Strategies in Plant Improvement),1:67)。经转化植物是在“经浸渍”植物所产生的种子群体中形成。在花发育期间的特定时间点,子房壁中存在孔,根癌农杆菌通过所述孔进入子房内部。一旦处于子房内部,根癌农杆菌就增殖并转化个别胚珠(德费克斯(Desfeux)等人,2000,植物生理学(Plant Physiology),123:895)。转化后的胚珠沿子房内种子形成的典型路径而行。
抗原的产生和分离
一般而言,所属领域中已知的标准方法可用于培养或生长本发明的植物、植物细胞和/或植物组织(例如克隆植物、克隆植物细胞、克隆根、克隆根系、芽、萌芽秧苗、植物等),以用于产生抗原。多种培养基和生物反应器已被用于培养发根细胞、根细胞系和植物细胞(参见例如,吉利(Giri)等人,2000,生物技术进展(BiotechnolAdv.),18:1;劳(Rao)等人,2002,生物技术进展(Biotechnol Adv.),20:101;和上述两者中的参考文献,全部以引用的方式并入本文)。克隆植物可以任何适合方式生长。
在某些实施例中,本发明的HPV抗原可通过任何已知方法产生。在一些实施例中,HPV抗原是在植物或其部分中表达。可根据所属领域中已知的常规条件和技术将蛋白质分离和纯化。所述技术包括提取、沉淀、色谱法、亲和色谱法、电泳等方法。本发明涉及使用所属领域中已知和本文中提供的各种植物表达系统中的任何系统(包括本文中所述的病毒植物表达系统)的HPV抗原纯化和HPV抗原产生可承受的规模扩大。
在本发明的许多实施例中,希望分离疫苗抗原产物。在本发明的蛋白质是从植物组织或其部分产生,例如从表达它们的根、根细胞、植物、植物细胞产生的情况下,可使用本文中进一步详述的方法或所属领域中已知的任何可适用方法来进行从植物物质的部分或完整分离的任何分离。在希望从表达它的部分或全部植物细胞或组织分离表达产物的情况下,可使用任何可用的纯化技术。所属领域的技术人员熟悉广泛范围的分馏和分离程序(参见例如,斯科普斯(Scopes)等人,蛋白质纯化:原理和实施(ProteinPurification:Principles and Practice),第3版,杰森(Janson)等人,1993;蛋白质纯化:原理,高分辨方法和应用(Protein Purification:Principles,High Resolution Methods,andApplications),Wiley-VCH,1998;斯普林-维拉(Springer-Verlag),纽约,1993;和洛(Roe),蛋白质纯化技术(Protein Purification Techniques),牛津大学出版社(OxfordUniversity Press),2001;每篇参考文献以引用的方式并入本文)。常常希望产物的纯度超过约50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。关于适用于从植物组织或植物液纯化物质的某些方法的讨论,参见例如美国专利6,740,740和6,841,659。
所属领域的技术人员也应了解,获得期望疫苗产物的方法是通过提取。可对植物物质(例如根、叶等)进行提取以从残余生物质移出所希望的产物,从而增加产物的浓度和纯度。植物可在缓冲溶液中提取。举例而言,可以一比一的重量比率将植物物质转移到一定量的已用例如磷酸盐缓冲液缓冲的冰冷水中。可按需要添加蛋白酶抑制剂。植物物质可通过剧烈掺合或研磨同时悬浮于缓冲溶液中来破坏,并且通过过滤或离心去除所提取的生物质。溶液中带有的产物可通过另外的步骤纯化或通过冷冻干燥或沉淀转换成干燥粉末。提取可通过加压(pressing)进行。植物或根可通过在压力机中加压或当其通过间隔很近的辊子时碾碎来提取。从碾碎的植物或根榨出的液体根据所属领域中熟知的方法收集和加工。通过加压进行的提取可释放更浓的产物。但是,产物的总产量可能低于在溶液中提取时的产物。
疫苗
本发明提供用于治疗用途的药用抗原蛋白质,例如作为用于HPV感染的治疗性和/或预防性治疗的疫苗呈活性的抗原蛋白质或其免疫原性部分。另外,本发明提供兽医学用途,因为所述抗原蛋白质或其免疫原性部分在兽医学应用中为活性的。在某些实施例中,抗原可通过本发明的植物或其部分(例如根、细胞、芽、细胞系、植物等)来产生。在某些实施例中,所提供的HPV抗原在植物、植物细胞和/或植物组织(例如,芽、萌芽秧苗、根、根培养物、克隆细胞、克隆细胞系、克隆植物等)中表达,并且可直接从植物使用或在用于投与个体的制备中被部分地纯化或纯化。
本发明提供表达抗原的植物、植物细胞和植物组织,当投药到有需要的个体时,所述抗原维持医药活性。在某些实施例中,个体包括脊椎动物(例如哺乳动物,比如人类)。根据本发明,个体包括兽医学个体,例如牛、绵羊、犬、猫等。在某些方面中,可食用植物或其部分(例如芽、根)以治疗有效量经口投与个体。在一些方面中,如本文中所述,在医药制剂中提供一种或一种以上HPV抗原。
本发明的疫苗组合物包含一种或一种以上HPV抗原。在某些实施例中,本发明的至少2种HPV抗原包括在所投与的疫苗组合物中。
根据本发明,用疫苗抗原治疗个体旨在引发生理效应。疫苗蛋白质可具有针对病症或疾病的治愈治疗或减轻性质,并且可通过投与来改善、减轻、缓解、延迟疾病或病症的发作,逆转或减轻疾病或病症的症状或严重性。疫苗抗原可具有预防性质并且可用以预防或延迟疾病的发作或当所述疾病、病症或病理性病状出现时,减轻其严重性。通过用根据本发明的抗原治疗个体而引发的生理效应可包括有效的免疫反应以便阻碍被生物体感染。
在一些实施例中,本发明的疫苗通过口服和/或粘膜途径来传递。口服和/或粘膜传递具有预防粘膜组织感染的潜力,而粘膜组织是许多病原体感染的主要入口。口服和/或粘膜传递可预先起动(prime)全身性免疫反应。在用于抗原口服投药的异源表达系统的开发方面已取得重大进展,所述抗原刺激粘膜免疫系统并且可预先起动全身性免疫性。但是,先前对传递口服疫苗所作的工作已证明为达到功效需要相当大量的抗原。因此,大量目标抗原的经济性生产是产生有效口服疫苗的先决条件。表达包括热稳定抗原在内的抗原的植物开发代表一种针对所述困难而言更现实的方法。
本发明的医药制剂可用多种方式投与个体,例如,经口、经鼻、经肠、不经肠、肌肉内或静脉内、经直肠、经阴道、局部、经眼、经肺或通过接触施用。在某些实施例中,在植物或其部分中表达的HPV抗原,通过将植物直接投与个体而经口投与个体。在一些方面中,提取和/或纯化在植物或其部分中表达的疫苗蛋白质,并且用于制备医药组合物。可能希望调配所述分离产物用于其预期用途(例如,调配为医药剂、疫苗组合物等)。在一些实施例中,希望将产物与表达它们的部分或全部植物组织一起调配。
在想要将产物连同植物物质一起调配的情况下,常常希望利用对相应受体(例如人类或其他动物)无毒性的植物。可根据所属领域中已知的技术简单地收获并加工相应植物组织(例如细胞、根、叶),同时应考虑维持所表达产物的活性。在本发明的某些实施例中,希望在可食用植物中(以及具体而言,在植物的可食用部分中)表达疫苗抗原以便物质可随后被食用。举例而言,在疫苗抗原被口服传递后(当经适当调配时)为活性的情况下,可能希望在可食用植物部分中产生抗原蛋白质,并且将所表达的疫苗抗原连同表达蛋白质的部分或全部植物物质一起调配来用于口服传递。
所提供的疫苗抗原可根据已知技术来调配。例如,可将有效量的疫苗产物连同一种或一种以上有机或无机、液体或固体、医药学上适合的载剂物质一起调配。根据本发明产生的疫苗抗原可以采用多种剂型,例如片剂、胶囊、药片(troch)、分散液、悬浮液、溶液、胶囊锭(gelcap)、丸剂、囊片、乳膏、软膏、气雾剂、药粉包、液体溶液、溶剂、稀释剂、表面活性剂、等渗剂、稠化剂或乳化剂、防腐剂和固体结合剂,只要蛋白质的生物活性不被所述剂型破坏即可。
一般而言,组合物可包含各种不同的医药学上可接受的载剂、佐剂或媒剂的任何物质或一种或一种以上的所述载剂、佐剂或媒剂的组合。如本文中所使用,术语“医药学上可接受的载剂、佐剂或媒剂”包括与医药投药相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和延迟吸收的试剂,等。可用作医药学上可接受的载剂的物质包括(但不限于)糖,如乳糖、葡萄糖和蔗糖;淀粉,如玉米淀粉和马铃薯淀粉;纤维素和其衍生物,如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素;粉末黄芪胶;麦芽;明胶;滑石;赋形剂,如可可脂和栓剂蜡;油剂,如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和黄豆油;二醇,如丙二醇;酯,如油酸乙酯和月桂酸乙酯;琼脂;缓冲剂,如氢氧化镁和氢氧化铝;海藻酸;无热原质水;等渗盐水;林格氏溶液(Ringer′s solution);乙醇和磷酸盐缓冲液,以及其他无毒可相容润滑剂,如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁,以及根据调配物师的判断可存在于组合物中的着色剂、释放剂、涂布剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂(参见雷氏药学大全(Remington’s Pharmaceutical Sciences),第15版,E.W.马丁(E.W.Martin),麦克出版公司(Mack Publishing Co.),宾夕法尼亚州伊斯顿(Easton,PA),1975)。举例而言,可借助于常规混合粒化糖衣丸制造、溶解、冷冻干燥或相似方法,将疫苗抗原产物提供为医药组合物。
附加的疫苗组分
本发明的疫苗可另外包括当投与个体时增强疫苗的免疫原性的任何适合佐剂。举例而言,所述佐剂可包括(而不限于)皂树皮(Quillaja saponaria,QS)的提取物,包括食物级QS的纯化分馏物(purified subfraction),如Quil A和QS-21,明矾、氢氧化铝、磷酸铝、MF59、Malp2、弗氏不完全佐剂(incomplete Freund′s adjuvant);弗氏完全佐剂;3-O-脱酰单磷酸类脂A(3De-O-acylated monophosphoryl lipid A,3D-MPL)。其他的佐剂可包括免疫调节寡核苷酸,例如,WO 96/02555中揭示的未甲基化的CpG序列。在提供为TH1细胞反应的优先刺激物的佐剂时,涵盖如上文所提及的那些佐剂的不同佐剂的组合。举例而言,QS21可连同3D-MPL一起调配。QS21:3D-MPL的比率通常大约为1:10到10:1;1:5到5:1;并且常常大体上是1:1。在一些实施例中,达到最佳协同作用的范围是2.5:1到1:1的3D-MPL:QS21。适用于人类疫苗调配物的纯化QS提取物的剂量为每公斤体重0.01mg到10mg。
应注意,某些热稳定蛋白质(例如地衣多糖酶)自身可以显示免疫反应强化活性,以致所述蛋白质无论是与HPV抗原形成融合物还是单独使用都可视为使用了佐剂。因此,本发明的疫苗组合物可另外包含一种或一种以上的佐剂。某些疫苗组合物可包含两种或两种以上的佐剂。另外,取决于调配物和投药途径,可能在特定调配物和/或组合中需要某些佐剂。
在一些情况下,可能希望通过减慢经皮下或肌肉内注射的疫苗产物(例如蛋白质)的一种或一种以上组分的吸收来延长本发明疫苗的作用。这可通过使用水溶性不好的结晶或非晶形物质的液体悬浮液来达成。产物的吸收速率则取决于其溶解速率,而溶解速率又会取决于尺寸和形式。或者或另外,不经肠投与的产物的延迟吸收通过将产物溶解或悬浮在油媒剂中来完成。储积注射形式是通过在如聚丙交酯-聚乙交酯等生物可降解聚合物中形成蛋白质的微胶囊基质来制得。可根据产物与聚合物的比率和所使用特定聚合物的性质来控制释放速率。生物可降解聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。储积注射调配物可通过将产物包埋在与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备。替代性聚合物传递媒剂可用于口服调配物。举例而言,可使用可生物降解、可生物相容的聚合物,如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸等。抗原或其免疫原性部分可例如与聚合物传递媒剂组合调配为微粒。
疫苗抗原的经肠投与制剂可以固体、半固体、悬浮液或乳液形式引入,并且可与任何医药学上可接受的载剂如水、悬浮剂和乳化剂混配。抗原可借助于泵或持续释放形式投与—尤其当作为预防措施投与时,以便预防疾病在个体中发展或改善或延迟已形成的疾病。补充性活性化合物,例如针对待治疗的疾病或临床病状具有独立活性的化合物,或增强本发明化合物的活性的化合物,可被并入组合物中或与组合物一起投与。可使用调味剂和着色剂。
本发明的疫苗产物(视情况连同植物组织)特别适合作为医药组合物口服投药。可使用口服液体调配物,且其可特别适用于小儿科群体。所收获的植物物质可以各种方式(例如风干、冷冻干燥、提取等)中的任何一种加工,这取决于期望治疗产物的性质和其期望形式。如上所述的这些组合物可单独经口摄取或连同食物或饲料或饮料一起摄取。用于口服投药的组合物包括植物;植物提取物;和从受感染植物纯化的蛋白质,其是以干燥粉末、食料、水性或非水性溶剂、悬浮液或乳液的形式提供。非水性溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油、鱼油和可注射有机酯。水性载剂包括水、水-醇溶液、乳液或悬浮液,包括盐水和缓冲介质的不经肠媒剂(buffered medial parenteral vehicle),包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖溶液、右旋糖加氯化钠溶液、含有乳糖或不挥发油的林格氏溶液。干燥粉末的实例包括已经被干燥(例如冷冻干燥、风干或喷雾干燥)的任何植物生物质。举例而言,植物可通过放入约120华氏度的市售空气干燥器中直到生物质含有小于5重量%水分来风干。干燥后的植物可进一步加工为块体固体,或进一步通过研磨加工成期望筛目尺寸的粉末。或者或另外,冷冻干燥可用于易受风干破坏的产物。产物可通过放入真空干燥器中并在真空下干燥冷冻直到生物质含有小于约5重量%水分来冷冻干燥。干燥物质可如本文所述进行进一步加工。
植物衍生物质可作为草本制剂投与或者与一种或一种以上的草本制剂一起投与。适用草本制剂包括液体和固体草本制剂。草本制剂的一些实例包括酊剂,提取物(例如,水性提取物、醇提取物),煎剂,干燥制剂(例如风干、喷雾干燥、冷冻或冷冻干燥),散剂(例如冷冻干燥粉末)和液体。草本制剂可提供于任何标准传递媒剂中,例如胶囊、片剂、栓剂、液体剂型等。所属领域的技术人员应了解,各种调配物和传递草本制剂的模态可应用于本发明。
本发明的根系、细胞系、植物、提取物、粉末、干燥制剂和纯化蛋白质或核酸产物等可呈含或不含一种或一种以上如上所述的赋形剂的封装形式。如片剂、糖衣丸、胶囊、丸剂和颗粒剂等固体剂型可用包衣和壳层(如肠溶衣)、释放控制包衣和医药调配领域中熟知的其他包衣来制备。在所述固体剂型中,活性剂可与至少一种蔗糖、乳糖或淀粉等惰性稀释剂混合。所述剂型可与正常实施中一样,包含除惰性稀释剂以外的附加物质,例如压片润滑剂和其他压片助剂,如硬脂酸镁和微晶纤维素。在胶囊、片剂和丸剂的状况下,剂型可包含缓冲剂。剂型可视情况含有遮光剂,并且可具有仅在肠道的某一部分中和/或以延迟方式释放活性成分的组合物。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。
在一些方法中,表达根据本发明的HPV抗原的植物或其部分或其生物质是作为医疗食物经口投与。这样的可食用组合物一般通过生食(raw)来消耗(固体形式)或通过饮用来消耗(液体形式)。植物物质可不经先前的加工步骤直接摄取或在最小程度的烹调制备后摄取。举例而言,疫苗蛋白质可在可直接食用的芽中表达。例如,疫苗抗原在苜蓿芽、绿豆芽或菠菜或莴苣叶芽等中表达。在一实施例中,植物生物质可经过加工并且摄取加工步骤后所回收的物质。
根据本发明适用的加工方法是食品或饲料工业中普遍使用的方法。所述方法的最终产物通常包括相当大量的经表达抗原并且可被方便地食用或饮用。最终产物可与其他食物或饲料形式,如盐、载剂、增香剂、抗生素等一起混合,并且以固体、半固体、悬浮液、乳液或液体形式来消耗。所述方法可包括保鲜步骤,例如巴氏灭菌法、烹煮或添加保鲜剂和防腐剂。任何植物都可在本发明中使用并经过加工来产生可食用或可饮用的植物物质。HPV抗原在植物衍生制剂中的量可通过所属领域中标准的方法来测试,例如,凝胶电泳、ELISA或免疫印迹分析,使用对产物特异的探针或抗体。所述测定可用以标准化被摄取的疫苗抗原蛋白质的量。举例而言,可测定并调节疫苗抗原的量,例如,通过将具有不同含量的产物的产物批次混合以使打算通过饮用或食用来摄取一剂的物质的量可被标准化。但是,本发明的封闭的、可调控环境应当使对进行所述标准化程序的需要最小化。
在植物细胞或组织中产生并且被个体食用的疫苗蛋白质可优选通过消化系统吸收。摄取仅被最低程度加工的植物组织的一个优点是提供蛋白质在植物细胞中的封装或螯合。因此,产物可在达到内脏或肠之前受到至少一些保护以避免在上消化道中消化,并且较高比例的活性产物将可用于吸收。
本发明的医药组合物可治疗性或预防性投与。组合物可用以治疗或预防疾病。举例而言,可治疗遭受疾病或有发展HPV感染风险的任何个体。应了解,在尚未被诊断出具有疾病的任何症状的情况下,个体可被视为有发展疾病的风险。举例而言,如果已知个体已暴露于HPV感染,或将要暴露于HPV感染,处于具有暴露于HPV感染的相对高风险的情况之下,那么个体将被视为有发展疾病的风险。类似地,如果个体的家庭成员、朋友或配偶已被诊断具有HPV感染,那么所述个体可视为有发展疾病的风险。
用于口服投药的液体剂型包括(但不限于)医药学上可接受的乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除活性剂外,液体剂型还可含有通常用于所属领域中的惰性稀释剂,如水或其他溶剂,增溶剂和乳化剂,如乙醇,异丙醇,碳酸乙酯,乙酸乙酯,苄醇,苯甲酸苄酯,丙二醇,1,3-丁二醇,二甲基甲酰胺,油剂(尤其是棉籽油、落花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油),甘油,四氢糠醇,聚乙二醇和山梨聚糖的脂肪酸酯,和其混合物。除惰性稀释剂外,口服组合物还可包括佐剂,如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂和芳香剂。
用于直肠或阴道投药的组合物可为栓剂或保留灌肠剂,其可通过将本发明的组合物与适用无刺激性赋形剂或载剂,如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡混合来制备,所述赋形剂或载剂在环境温度下是固体但在体温下是液体并且因此在直肠或阴道腔中熔融并释放活性蛋白质。
用于本发明疫苗组合物的局部、透粘膜或透皮投药的剂型包括软膏、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、粉末、溶液、喷雾、吸入剂或贴片。将活性剂或其制剂在无菌条件下与医药学上可接受的载剂和任何所需防腐剂或可能需要的缓冲剂一起混合。对透粘膜或透皮投药来说,可将适于打算穿透的屏障的穿透剂用于调配物中。所述穿透剂通常在所属领域中已知,并且对透粘膜投药来说,包括例如,清洁剂、胆汁盐和夫西地酸(fusidic acid)衍生物。透粘膜投药可通过使用鼻喷雾或栓剂来完成。对透皮投药来说,可将抗原或其免疫原性部分调配成通常在所属领域中已知的软膏、油膏剂、凝胶或乳膏。眼用调配物、滴耳剂和滴眼剂涵盖在本发明的范围之内。另外,本发明涵盖使用透皮贴片,其具有向身体提供疫苗蛋白质受控传递的附加优点。所述剂型可通过将疫苗产物悬浮或分配在适当介质中来制得。吸收增强剂可用以增加疫苗蛋白质穿过皮肤的通量。速率可通过提供速率控制膜或通过将疫苗蛋白质分散在聚合物基质或凝胶中来控制。
本发明的组合物以达到期望结果所必需的量和时间来投与。在本发明的某些实施例中,医药组合物的“治疗有效量”是对治疗、减弱或预防个体的疾病有效的量。因此,如本文中所使用的“对治疗、减弱或预防疾病有效的量”指的是医药组合物治疗、减弱或预防任何个体的疾病的无毒但足够的量。举例而言,“治疗有效量”可以是治疗、减弱或预防感染(例如病毒感染、HPV感染)等的量。
所需要的精确量可根据不同个体而变化,其取决于个体的物种、年龄和一般健康状态,疾病的阶段,特定医药混合物,其投药模式,等。本发明的炭疽(anthrax)抗原,包括表达抗原的植物和/或其制剂,可以便于投药和提供剂量均一性的剂量单元形式来调配。如本文中所使用的表达“剂量单元形式”指的是适于待治疗患者的疫苗组合物的物理上离散的单元。然而应了解,本发明组合物总的每日用法由主治医师在合理的医学判断范围内决定。用于任何特定患者或生物体的具体治疗有效剂量取决于各种因素,包括感染的严重性或感染的风险;所使用特定化合物的活性;所使用的特定组合物;患者的年龄、体重、一般健康状态、性别,患者的饮食,患者的药物动力学状况,投药时间,投药途径和所使用特定化合物的排出速率;治疗持续时间;与所使用疫苗组合物组合或同时使用的药物;和医学领域中熟知的类似因素。
应了解,本发明的医药组合物可用于组合疗法(例如组合疫苗疗法),也就是说,医药组合物可与一种或一种以上其他期望疫苗接种程序同时,在其之前或在其之后投与。采用组合方案的疗法(例如,疫苗、HPV感染的治疗性治疗)的特定组合应当考虑期望治疗剂和/或程序与打算达到的期望治疗效果的相容性。应了解,所使用的疗法和/或疫苗可对相同病症达到期望效果(例如,本发明的化合物可与另一HPV疫苗同时投与),或者它们可达到不同效果。在某些实施例中,疫苗组合物包含至少2种HPV抗原。举例而言,某些疫苗组合物可包含至少2种本发明的HPV抗原(例如,本发明的含有HPV16的E7域和HPV18的E7域的抗原)。在一些方面中,所述组合疫苗可包括一种包含HPV抗原的热稳定融合蛋白质;在一些方面中,提供两种或两种以上包含HPV抗原的热稳定融合蛋白质。在某些实施例中,多种抗原将得自相同菌株的HPV,并且可包括得自不同蛋白质的抗原。在一些实施例中,多种抗原将得自相同菌株的HPV并且可包括得自相同蛋白质(例如,相同蛋白质的不同域)的抗原。在某些实施例中,多种抗原将得自不同菌株的HPV,并且可包括得自不同蛋白质的抗原。其他组合涵盖使用得自不同菌株和相同蛋白质的多种抗原。涵盖上述示范性组合的变化和/或组合。举例而言,在一些实施例中,将来自不同菌株的1个E7域、2个E7域或3个E7域组合来构成本发明的疫苗组合物。在利用组合疫苗的情况下,应了解,HPV抗原的任何组合可用于所述组合。
试剂盒
在一态样中,本发明提供医药包装或试剂盒,其在一个或一个以上容器中包括产生根据本发明的HPV抗原的活萌芽秧苗、克隆实体或植物,或含有疫苗的制剂、提取物或医药组合物,并且填充了一种或一种以上所述的本发明医药组合物成分。在某些实施例中,医药包装或试剂盒包括另外的被批准的治疗剂(例如HPV抗原、HPV疫苗)以用作组合疗法。所述容器视情况附有关于管理医药产品的制造、使用或销售的政府机构指定形式的公告,所述公告反映政府机构关于用于人类投药的制造、使用或销售的批准情况。
提供包括治疗试剂的试剂盒。作为一个非限制性实例,HPV疫苗可提供为口服调配物并作为疗法投与。或者或另外,HPV疫苗可提供在可注射调配物中用于投药。医药剂量或说明书因此可提供在试剂盒中用于投与遭受HPV感染或有HPV感染风险的个体。
随后的代表性实例旨在帮助说明本发明,而不打算,也不应被解释为限制本发明的范围。实际上,对所属领域的技术人员而言,本发明的各种修改和除本文中显示和描述的那些实施例以外的许多其他实施例,将从本文的全部内容,包括随后的实例和对本文中引用的科学和专利文献的参考而变得明显。以下实例含有适于在各种实施例和其等效物中实施本发明的信息、范例和指导。
范例
实例1.候选疫苗构筑体的产生
从人类乳头瘤病毒产生抗原序列
出于安全性考虑,使用Quikchange定位突变试剂盒(斯曲塔基因公司(Stratagene)),使被克隆到pQE30(pQE30-E7)中BamHI/PstI限制位点之间的HPV16E7致癌基因(KO2718,西多夫(Seedorf)等人,1985,病毒学(Virology),145:181)突变,以产生质粒pQE30-E7GGG。如为引入突变所设计的正向和反向“快速多核苷酸液相色谱法”纯化引物的粗体寡核苷酸所指示,分别将3个点突变引入E7基因的pRB结合位点中:
所引入的突变产生E7蛋白质序列中3个氨基酸的取代:D21G(Asp21>Gly)、C24G(Cys24>Gly)、E26G(Glu26>Gly),消除了E7蛋白质转化潜力。表示为E7GGG的所得基因的真实性通过测序确认。
HPV16E7(K02718,西多夫(Seedorf)等人,同上)(SEQIDNO.:1)
ATGCATGGAGATACACCTACATTGCATGAATATATGTTAGATTTGCAACCAGA
GACAACTGATCTCTACTGTTATGAGCAATTAAATGACAGCTCAGAGGAGGAG
GATGAAATAGATGGTCCAGCTGGACAAGCAGAACCGGACAGAGCCCATTACA
ATATTGTAACCTTTTGTTGCAAGTGTGACTCTACGCTTCGGTTGTGCGTACAA
AGCACACACGTAGACATTCGTACTTTGGAAGACCTGTTAATGGGCACACTAG
GAATTGTGTGCCCCATCTGTTCTCAGAAACCATAA
E7(SEQ ID NO.:2):
MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNI
VTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP
HPV16E7GGG(SEQ ID NO.:3):
ATGCATGGAGATACACCTACATTGCATGAATATATGTTAGATTTGCAACCAGA
GACAACTGGTCTCTACGGTTATGGGCAATTAAATGACAGCTCAGAGGAGGAG
GATGAAATAGATGGTCCAGCTGGACAAGCAGAACCGGACAGAGCCCATTACA
ATATTGTAACCTTTTGTTGCAAGTGTGACTCTACGCTTCGGTTGTGCGTACAA
AGCACACACGTAGACATTCGTACTTTGGAAGACCTGTTAATGGGCACACTAG
GAATTGTGTGCCCCATCTGTTCTCAGAAACCATAA
E7GG(SEQ ID NO.:4):
MHGDTPTLHEYMLDLQPETTGLYGYGQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNI
VTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP
热稳定载体构筑体的产生
全长天然热纤梭菌地衣多糖酶LicB依次由前导肽(Lp)、N末端部分(A)、表面环(1)、C末端部分(C)、Pro-Thr盒和纤维小体结合域(C-BD)组成。我们将Lp、Pro-Thr盒和C-BD编码序列从LicB编码基因去除,循环排列(circularly permutated)分子以颠倒N末端和C末端(穆斯曲克(Musiychuk)等人,2007,流感和其他呼吸道病毒(Influenzaand Other Respiratory Viruses),1:1),并且在新的N末端和C末端以及在表面环(1)中并入用于克隆目标序列的独特限制性核酸内切酶位点。验证了所得工程改造载体分子序列并且指定为LicKM。
SEQ ID NO.:5:
GGATCCTTAATTAAAATGGGAGGTTCTTATCCATATAAGTCTGGTGAGTATAG
AACTAAGTCTTTCTTTGGATATGGTTATTATGAAGTTAGGATGAAGGCTGCAA
AGAACGTTGGAATTGTTTCTTCTTTCTTTACTTATACTGGACCATCTGATAACA
ACCCATGGGATGAGATTGATATTGAGTTTCTTGGAAAGGATACTACTAAGGTT
CAATTCAACTGGTATAAGAATGGTGTTGGTGGAAACGAGTATCTTCATAACCT
TGGATTTGATGCTTCTCAAGATTTTCATACTTATGGTTTTGAGTGGAGACCAG
ATTATATTGATTTTTATGTTGATGGAAAGAAGGTTTATAGAGGTACTAGAAAC
ATTCCAGTTACTCCTGGAAAGATTATGATGAATCTTTGGCCAGGAATTGGTGT
TGATGAATGGCTTGGTAGATATGATGGAAGAACTCCACTTCAAGCTGAGTAT
GAGTATGTTAAGTATTATCCAAACGGTAGATCTGAATTCAAGCTTGTTGTTAA
TACTCCATTTGTTGCTGTTTTCTCTAACTTTGATTCTTCTCAATGGGAAAAGGC
TGATTGGGCTAACGGTTCTGTTTTTAACTGTGTTTGGAAGCCATCTCAAGTTA
CTTTTTCTAACGGAAAGATGATTCTTACTTTGGATAGAGAGTATGTCGACCAT
CATCATCATCATCATTGACTCGAGCTC
SEQ ID NO.:6:
MGGSYPYKSGEYRTKSFFGYGYYEVRMKAAKNVGIVSSFFTYTGPSDNNPWDEI
DIEFLGKDTTKVQFNWYKNGVGGNEYLHNLGFDASQDFHTYGFEWRPDYIDFY
VDGKKVYRGTRNIPVTPGKIMMNLWPGIGVDEWLGRYDGRTPLQAEYEYVKYY
PNGRSEFKLVVNTPFVAVFSNFDSSQWEKADWANGSVFNCVWKPSQVTFSNGK
MILTLDREYVDHHHHHH
对于某些构筑体,我们将LicKM的N末端和C末端的PRla信号肽和KDEL序列工程改造。这些构筑体的核酸和氨基酸序列如SEQ ED NO.:7和SEQ ID NO.:8所示。
SEQ ID NO.:7:
GGATCCTTAATTAAAATGGGATTTGTTCTCTTTTCACAATTGCCTTCATTTCTT
CTTGTCTCTACACTTCTCTTATTCCTAGTAATATCCCACTCTTGCCGTGCCCAA
AATGGAGGTTCTTATCCATATAAGTCTGGTGAGTATAGAACTAAGTCTTTCTT
TGGATATGGTTATTATGAAGTTAGGATGAAGGCTGCAAAGAACGTTGGAATT
GTTTCTTCTTTCTTTACTTATACTGGACCATCTGATAACAACCCATGGGATGAG
ATTGATATTGAGTTTCTTGGAAAGGATACTACTAAGGTTCAATTCAACTGGTA
TAAGAATGGTGTTGGTGGAAACGAGTATCTTCATAACCTTGGATTTGATGCTT
CTCAAGATTTTCATACTTATGGTTTTGAGTGGAGACCAGATTATATTGATTTTT
ATGTTGATGGAAAGAAGGTTTATAGAGGTACTAGAAACATTCCAGTTACTCCT
GGAAAGATTATGATGAATCTTTGGCCAGGAATTGGTGTTGATGAATGGCTTG
GTAGATATGATGGAAGAACTCCACTTCAAGCTGAGTATGAGTATGTTAAGTA
TTATCCAAACGGTAGATCTGAATTCAAGCTTGTTGTTAATACTCCATTTGTTGC
TGTTTTCTCTAACTTTGATTCTTCTCAATGGGAAAAGGCTGATTGGGCTAACG
GTTCTGTTTTTAACTGTGTTTGGAAGCCATCTCAAGTTACTTTTTCTAACGGAA
AGATGATTCTTACTTTGGATAGAGAGTATGTCGACCATCATCATCATCATCAT
AAGGATGAACTTTGACTCGAGCTC
SEQ ID NO.:8:
MGFVLFSQLPSFLLVSTLLLFLVISHSCRAQNGGSYPYKSGEYRTKSFFGYGYYEV
RMKAAKNVGIVSSFFTYTGPSDNNPWDEIDIEFLGKDTTKVQFNWYKNGVGGNE
YLHNLGFDASQDFHTYGFEWRPDYIDFYVDGKKVYRGTRNIPVTPGKIMMNLW
PGIGVDEWLGRYDGRTPLQAEYEYVKYYPNGRSEFKLVVNTPFVAVFSNFDSSQ
WEKADWANGSVFNCVWKPSQVTFSNGKMILTLDREYVDHHHHHHKDEL
重组抗原构筑体的产生
我们使用得自pBR322质粒的pET表达载体,通过工程改造来利用T7噬菌体基因10促进高水平转录和翻译的特征。经噬菌体编码的RNA聚合酶对T7启动子序列高度特异,而这些T7启动子序列很少在T7噬菌体基因组以外的基因组中遇到(图1)。已使用pET-32将E7和E7GGG构筑体融合到修饰后的地衣多糖酶序列的已被克隆到所述载体中的环区域中。将具有上游序列PR-1A(病原体相关蛋白质1A)、具有内质网(KDEL)或空泡保留序列(VAC)和下游His6标记的地衣多糖酶基因的催化结果域克隆到修饰后pET-32载体(其中已切除T7启动子与T7终止子之间的区域)中PacI与XhoI位点之间。如此获得pET-PRACS-LicKM-KDEL和pET-PRACS-LicKM-VAC(图2)。将DNA片段E7或E7GGG亚克隆到LicKM的环(1)部分中以在正确的阅读框中得到融合物用于翻译。
实例2.候选疫苗抗原载体的产生
将目标抗原构筑体LicKM-E7或LicKM-E7GGG个别地亚克隆到所选的病毒载体(pBI-D4)中。pBI-D4是一种pBI1-21衍生的二元载体,其中编码大肠杆菌β-D-葡糖苷酸酶(GUS)的报告基因已被“多位点接头(polylinker)”替换,在XbaI与SacI位点之间,已克隆TMV衍生的载体(图3)。pBI-D4是一种以TMV为基础的构筑体,其中待表达的外来基因(例如,目标抗原(例如LicKM-E7、LicKM-E7GG))替换TMV的外壳蛋白质(CP)基因。病毒保留TMV126/183kDa基因、移动蛋白质(MP)基因和CP亚基因组mRNA启动子(sgp),所述启动子延伸到CP开放阅读框(ORF)中。用于CP的起始密码子已突变。病毒缺乏CP并且因此不能通过韧皮部移动遍及宿主植物。然而,病毒感染的细胞间移动保留功能性,并且病毒可以此方式缓慢移动到上部叶。多克隆位点(PacI-PmeI-AgeI-XhoI)已在sgp的末端被工程改造用于表达外来基因,并且后面接着TMV3′非翻译区(NTR)。35S启动子融合在病毒序列的5′端。载体序列位于pBI121的BamHI与SacI位点之间。将锤头状核糖核酸酶置于病毒序列的3′端(陈(Chen)等人,2003,分子育种(Mol.Breed.),11:287)。所述构筑体包括编码LicKM-E7或E7GGG的序列与编码来自烟草PR-1a蛋白质的信号肽(一种6x His标记)的序列和ER保留锚定序列KDEL或空泡分选序列的融合(图4)。对于含有编码PRACS-LicKM-E7-KDEL、PRACS-LicKM-E7VAC、PRACS-LicKM-E7GGG-KDEL和PRACS-LicKM-E7GGG-VAC的序列的构筑体,将编码DNA作为PacI-XhoI片段引入pBI-D4中。随后验证核苷酸序列,跨越最终表达构筑体的亚克隆接点(图5)。
实例3:植物产生和抗原生产
植物的农杆菌渗透
可利用通过农杆菌渗透达到的农杆菌介导瞬时表达系统(特蓬(Turpen)等人,1993,病毒学方法杂志(J.Virol.Methods),42:227)。用含有为表达LicKM-E7或LicKM-E7GGG而工程改造的病毒载体的发根农杆菌渗透侵染烟草(N.benthamiana)的健康叶。
用构筑体pBI-D4-PRACS-LicKM-E7-KDEL、pBI-D4-PRACS-LicKM-E7VAC、pBI-D4-PRACS-LicKM-E7GGG-KDEL和pBI-D4-PRACS-LicKM-E7GGG-VAC转化发根农杆菌菌株A4(ATCC 43057)或根癌农杆菌(GV3103)。使农杆菌培养物生长并且按所述来诱导(卡皮拉(Kapila)等人,1997,植物科学(Plant Sci)122:1-01)。在28℃下,在具有25μg/ml卡那霉素(kanamycin)的YEB(5g/l牛肉膏、1g/l酵母膏、5g/l蛋白胨、5g/l蔗糖、2mM MgSO4)中,使2ml起子培养物(starter-culture)(从新鲜菌落拾取)生长过夜。将起子培养物1:500稀释到500ml具有25μg/ml卡那霉素、10mM2-(4-吗啉基)乙烷磺酸(MES)pH 5.6、2mM另外的MgSO4和20μM乙酰丁香酮(acetosyringone)的YEB中。随后在28℃下,使稀释后的培养物生长过夜,达到约1.7的O.D.600。在3,000×g下将细胞离心15分钟并且重新悬浮于MMA培养基(MS盐、10mM MES pH 5.6、20g/l蔗糖、200uM乙酰丁香酮)中达到2.4的O.D.600,在室温下保持1小时,并用于农杆菌渗透。使用不带针的一次性注射器,用农杆菌悬浮液注射侵染烟草叶。渗透后6天,收获所渗透的叶。
克隆根和克隆根系产生
将矮牵牛(Petunia hybrida)叶在0.1% NH4Cl中灭菌并在无菌dH2O中洗涤6次,获得1cm×1cm大的叶外植体。用刀轻微损坏外植体的abacsial侧,并且与含有pBID4-LicKM-E7-KDEL或pBID4-LicKM-E7GGG-KDEL的发根农杆菌菌株A4共同培养。用农杆菌过夜培养物(O.D.600nm=0.8-1)将外植体培养2分钟,所述农杆菌过夜培养物在4℃下以3000rpm离心10′,并在20mM乙酰丁香酮的存在下重新悬浮于MMA培养基中,达到最终O.D.600nm=0.5。培养结束时,在无菌纸上干燥外植体并且在1%葡萄糖和20mM乙酰丁香酮的存在下转移到0.8%琼脂MS培养板上。将培养板用Parafilm封口并在室温下保持2天。随后在500mg/l头孢噻肟(Cefotaxim,Cif)、100mg/l特美汀(Timentin,Tim)和25mg/l卡那霉素存在下,将外植体转移到MS培养板上。5周后,从以含有pBID4-LicKM-E7-KDEL和pBID4-LicKM-E7GGG-KDEL构筑体的发根农杆菌转化的矮牵牛叶外植体获得转基因根产生。从用pBID4-LicKM-E7-KDEL构筑体转化获得比用pBID4-LicKM-E7GGG-KDEL构筑体转化更多的根。酶谱分析揭示,E7和E7GGG嵌合蛋白质在所测试的矮牵牛转基因根中表达。所述表达与地衣多糖酶活性相关。与融合蛋白质有关的活性带显示比地衣多糖酶对照更高的分子量和在农杆菌感染后由植物表达的产物的相同分子量,确认完整融合产物的存在。
转化后,可切下发根并在固体、不含激素的K3培养基上放成一行。4到6天后,将生长最活跃的根分离并且转移到半固体(0.4%琼脂)K3培养基。在22℃下,在黑暗中培养所选的根,并且每6周对克隆系进行分离和传代培养。可通过评估地衣多糖酶活性分析和免疫印迹分析来筛选根和/或克隆系是否存在目标抗原表达。
实例4:候选疫苗的产生
在感染后4、5、6和7天收获100mg侵染烟草经渗透叶片物质样品。收获后立即分析新鲜组织的蛋白质表达,或者在-80℃下收集新鲜组织用于制备后续粗植物提取物或用于融合蛋白质纯化。
将新鲜样品以1/3w/v比率(1ml/0.3g的组织)重新悬浮在冷PBS1x+蛋白酶抑制剂(Roche)中并且用pestel研磨。在SDS凝胶加载缓冲液中将匀浆物煮5分钟,并且随后通过在4℃下以12.000rpm离心5分钟来净化。将上清液转移到新试管中,并且在12% SDS-PAGE上分离20μl、1μl或其稀释液并且通过免疫印迹分析(使用抗His6-E7小鼠或兔抗地衣多糖酶多克隆抗体)和/或通过酶谱分析进行分析,以评估指示功能性地衣多糖酶活性的水解活性。酶谱分析是一种用于测量酶活性的电泳法。这一方法基于浸渍有一种可在培养时期期间由溶解的酶所降解的底物的十二烷基硫酸钠凝胶。凝胶的染色将酶活性展现为暗红色背景上的白色带。在特定范围内,所述带强度可与所加载酶的量线性相关。
如果融合蛋白质中的E7蛋白质电泳迁移率对应于11kD的理论MW(地衣多糖酶MW为约28kD),那么用含有质粒pBID4-LicKM-E7-KDEL的根癌农杆菌或发根农杆菌渗透的侵染烟草植物中的E7表达会产生对应于嵌合蛋白质LicKM-E7-KDEL的分子量(约39kD)的特定带(图6A-D)。用含有pBID4-LicKM-E7-VAC质粒的根癌农杆菌或发根农杆菌渗透的侵染烟草植物表达嵌合蛋白质LicKM-E7-VAC。不过所展现的带是双重的。这一双重带可能代表嵌合蛋白质内存在适当加工的和未加工的空泡信号序列(图6A-D)。在两种农杆菌菌株中,经证明最好的表达构筑体是拥有KDEL序列的构筑体,其已被选用于大规模产生表达E7(或E7GGG)与地衣多糖酶的融合物的植物组织。对E7GGG嵌合蛋白质可获得相同表达结果(图7A)。
酶谱分析揭示,E7和E7GGG嵌合蛋白质的表达与地衣多糖酶活性相关,说明上述蛋白质在地衣多糖酶催化域的环中的融合不削弱酶活性。与融合蛋白质有关的活性带显示比地衣多糖酶对照更高的分子量,确认完整融合产物的存在。从用含有pBID4-LicKM-E7-KDEL、pBID4-LicKM-E7GGG-KDEL的根癌农杆菌或发根农杆菌渗透的侵染烟草植物获得的提取物显示活性带,而-VAC构筑体产生较小程度的活性(图8A-D)。
E7-LicKM-KDEL和E7-LicKM-VAC融合物的表达从感染后第4天到第7天恒定在高水平并且稳定(只是在第5天似乎稍微更高),但是发根农杆菌介导的表达从第6天到第7天急剧下降。我们决定在感染后第5天来收获以避免蛋白质降解。粗提取物中表达的嵌合蛋白质LicKM-E7-KDEL和LicKM-E7GGG-KDEL的定量通过免疫印迹法,在手动渗透的组织上和在真空渗透的组织上进行(图7B、C)。粗提取物中的表达的估算产率是至少400μg嵌合蛋白质LicKM-E7-KDEL和LicKM-E7GGG-KDEL/g组织(相应于100μg的E7或E7GGG蛋白质/g组织)。
抗原的纯化
将来自用含有pBID4-LicKM-E7-KDEL和pBID4-LicKM-E7GGG-KDEL构筑体的重组根癌农杆菌渗透的植物的叶匀化。具有“不含EDTA”蛋白酶抑制剂(Roche)和TritonX-1001%的提取缓冲液以3体积w/v的比率来使用,并且在4℃下摇动30分钟。通过在4℃下,以每10分钟9000×g离心来净化提取物。使上清液依次通过Mira布过滤,在4℃下,以20.000×g离心30′,并且通过0.45μm过滤器来过滤,之后色谱纯化。
通过使用IMAC(“固定金属亲和色谱法”,通用医疗集团(GE Health)),在室温下,在重力下将经His标记的LicKM-E7-KDEL和LicKM-E7GGG-KDEL嵌合蛋白质纯化。在非变性条件下执行纯化。将蛋白质收集为0.5ml馏分,将其统一,添加20mMEDTA,在4℃下针对PBS1X透析过夜并且通过SDS-PAGE分析。
或者,将馏分随后收集在一起,添加20mM EDTA,在4℃下针对NaH2PO4 10mM透析过夜并且通过阴离子交换色谱法纯化。对于LICKM-E7-KDEL ELICKM-E7GGG-KDEL纯化,使用阴离子交换Q琼脂糖速流柱(anion exchange column QSepharose Fast Flow)(安发玛西亚生物技术公司(Amersham Pharmacia Biosciences))。在12%聚丙烯酰胺凝胶上分离LICKM-E7-KDEL E LICKM-E7GGG-KDEL亲和或离子交换纯化的嵌合蛋白质的样品,接着库马斯染色。所分离的蛋白质也通过电泳转移到PVDF膜上,并且通过免疫印迹分析(使用多克隆抗地衣多糖酶抗体和接着用抗兔IgG辣根过氧化酶结合抗体)来分析。
通过免疫印迹法,使用pAb α-地衣多糖酶(图9A)和pAb α-抗His6(数据未图示)来分析在透析后收集的馏分。通过所表达的嵌合蛋白质维持His-tag并且所纯化蛋白质的最终浓度已通过软件评估(图9A、B)。从40g所渗透的组织,将各6.5mg的LicKM-E7-KDEL和LicKM-E7GGG-KDEL嵌合蛋白质纯化,最终产率为163μg嵌合蛋白质/g组织(约50μg的E7或E7GGG蛋白质/g组织,其中E7和E7GGG蛋白质的分子量是完整融合物的约1/4)。由纯化方案得到的结果如图9C、D中所示。
实例5:免疫原性研究
目标抗原的产生和表征
进行初始免疫原性研究来测定植物产生的LicKM-E7-KDEL和LicKM-E7GGG-KDEL是否可在腹膜内免疫的小鼠中诱导特异性血清IgG,和所诱导的抗体是否可结合表达E7的细胞。研究如上所述使用从侵染烟草的经农杆菌渗透的叶富集的LicKM-E7-KDEL和LicKM-E7GGG-KDEL来纯化。
简单地说,使用Quikchange定位突变试剂盒(加利福尼亚州拉贺亚的斯曲塔基因公司(Stratagene,La Jolla,CA))使HPV16 E7致癌基因(GenBank登录号K02718)突变,以得到在E7的pRB结合位点中具有以下氨基酸取代的E7GGG:D21G、C24G和E26G(赛穆尔(Smahel)等人,2001,病毒学(Virology),281:231)。将编码HPV16 E7和E7GGG的序列克隆为LicKM的顺框内部融合物以获得LicKM-E7和LicKM-E7GGG。所述融合物包括在其N末端的烟草(Nicotiana tabacum)PR1a蛋白质的信号序列,和6xHis标记,接着是在其C末端的内质网保留信号KDEL。在植物表达载体pBID4中克隆融合物(穆斯曲克(Musiychuk)等人,2007,流感和其他呼吸道病毒(Influenza and OtherRespiratory Viruses),1:1,待出版(in press))以得到pBID4-LicKM-E7和pBID4-LicKM-E7GGG。将各构筑体引入发根农杆菌菌株A4中并且将所得细菌接种到侵染烟草中。渗透后5到7天,通过亲和色谱法纯化目标抗原。
LicKM-E7和LicKM-E7GGG的估算产率是每公斤新鲜叶组织大致400mg并且LicKM的估算产率是每公斤大致1g。通过SDS-PAGE分析表征所纯化的目标抗原,显示所预测的尺寸化蛋白质为28kD(LicKM)、39kD(LicKM-E7)和39kD(LicKM-E7GGG)(图9B)。为了提供对照物质,相似地在侵染烟草中产生LicKM。通过免疫印迹法,使用对LicKM和E7特异的抗体验证植物表达的蛋白质的抗原性。通过密度测定法,使用GeneTools软件(英国剑桥的合成基因公司(Syngene))将样品定量。
免疫原性研究
为评估植物产生的目标抗原的功效,用目标抗原将4到8周大的雌性C57BL/6小鼠(意大利科摩的查士睿华(Charles River;Como,Italy))免疫。
对于预防性研究,在第0、14、28、42和76天,在有或无Quil A佐剂(10μg/小鼠)下,每组10只小鼠皮下接受40μg的LicKM-E7或LicKM-E7GGG(分别相等于大致10μg的E7或E7GGG)。在各次投药当天从动物收集血清样品并且通过ELISA评估E7特异抗体的存在。在第49天,各组中牺牲2只动物以评估细胞介导的免疫反应。随后通过用5×104个表达E7的TC-1肿瘤细胞的皮下注射向所有剩余的动物攻毒(林(Lin)等人,1996,癌症研究(Cancer Research),56:21)。为了表征免疫反应,如先前所述(弗兰哥尼(Franconi)等人,2002,癌症研究(Cancer Research),62:3654),执行ELISA、ELISPOT和自发延迟型过敏性(spontaneous delayed-type hypersensitivity,DTH)分析。
对治疗性研究而言,在第0、15、30、45和60天,在有或无Quil A(10μg/小鼠)时,用5×104个表达E7的TC-1肿瘤细胞将每组8到10只小鼠皮下接种,3天后用40μgLicKM-E7或LicKM-E7GGG皮下免疫。
对预防性和治疗性研究而言,在有或无Quil A时,向对照动物投与10μg大肠杆菌产生的E7或E7GGG或植物产生的LicKM。肿瘤生长通过每周两次触诊来监视。在所述研究期间,观察动物痛苦、腹泻、死亡的潜在病征或可从目标抗原的投药得到的其他临床病征。
为了测试植物产生的LicKM-E7和LicKM-E7GGG的免疫原性和预防潜力,用目标抗原将动物免疫。在佐剂存在下,用LicKM-E7或LicKM-E7GGG或用大肠杆菌产生的E7或E7GGG将所有动物免疫,建立特异IgG反应(图11A),但是在缺少佐剂时,LicKM融合物不诱导显著的体液反应(图11A)。因为CD8+细胞毒性T细胞具有在抗癌反应中作为效应物的公认作用,所以通过ELISPOT来研究E7特异CD8+ T细胞的诱导。在佐剂存在下,在用LicKM-E7或LicKM-E7GGG疫苗接种的小鼠中检测到高数量的分泌IFNγ的细胞,而在用大肠杆菌产生的E7或E7GGG疫苗接种的小鼠中发现较低数量的E7特异CD8+细胞,而在LicKM疫苗接种的小鼠中没有检测到分泌IFNγ的细胞(图11B)。LicKM融合物和大肠杆菌产生的抗原在缺少佐剂时诱导低的,但明显量的斑点,而LicKM融合物得到更高数量的ELISPOT计数(图11B)。
已确立,HPV特异CD8+ T细胞针对用表达E7的肿瘤攻毒具有保护性(弗雷泽(Frazer),2004,自然评论(Nature Reviews),4:46)。因此,通过用TC-1细胞攻毒疫苗接种的小鼠来评估通过植物产生的E7候选疫苗诱导的免疫反应的抗肿瘤活性。在佐剂存在下,LicKM-E7和LicKM-E7GGG各自在100%的动物中引发肿瘤保护,而大肠杆菌产生的E7或E7GGG分别在80%和60%的小鼠中诱导保护(图11C)。在缺少佐剂时用LicKM-E7免疫的动物的80%被保护(图11C)。在缺少佐剂时用LicKM-E7GGG或大肠杆菌产生的抗原免疫的动物的20%被保护(图11C)。在用LicKM免疫的动物中没有观察到保护(图11C)。
为测试LicKM-E7和LicKM-E7GGG针对表达HPV16E7的肿瘤的治疗活性,将已用表达E7的TC-1细胞接种的动物随后用LicKM、LicKM-E7或LicKM-E7GGG,或用大肠杆菌产生的E7或E7GGG来免疫。用LicKM免疫的所有动物在4周内发展肿瘤,而用LicKM-E7或LicKM-E7GGG加佐剂来治疗的那些动物在研究持续时间保留为无肿瘤的(10周)。用大肠杆菌产生的E7或E7GGG加佐剂的免疫分别在40%和60%的动物中抑制肿瘤生长(图11D)。在缺少佐剂时,LicKM融合物抑制肿瘤生长,在接受LicKM-E7(80%)的动物中观察到相对LicKM-E7GGG(60%)的更大保护,并且用大肠杆菌产生的E7或E7GGG治疗的动物的20%保留为无肿瘤的(图11D)。
针对与HPV相关的疾病的发展的保护大部分归因于细胞介导的免疫反应。DTH反应被认为是表示抗原特异性细胞激素介导的发炎,尤其涉及Thl型细胞激素。因为LicKM-E7显示比LicKM-E7GGG针对表达E7的肿瘤更大的治疗活性,所以我们在用LicKM-E7或大肠杆菌产生的E7疫苗接种的小鼠中评估对E7的DTH反应。在用LicKM-E7蛋白质(甚至在缺少佐剂时)疫苗接种的小鼠中观察到抗原特异性DTH反应(表1)。所述反应超过在用大肠杆菌产生的E7疫苗接种的小鼠中观察到的反应。用LicKM免疫小鼠不显示显著的耳朵肿胀,证明LicKM载体分子不诱导发炎反应。
表1.延迟型过敏性
*将耳朵肿胀报告为来自每组5只小鼠的经攻毒与未经攻毒对照耳朵之间的厚度差异(Δ)的平均值(耳朵增厚mm值×10-2)。
Claims (72)
1.一种分离抗原,其包含与热稳定蛋白质融合的人类乳头瘤病毒(HPV)的组分;
其中所述HPV组分包含至少一个选自由以下组成的群组的域:来自HPV16的E7、来自HPV18的E7、来自HPV16的E6和来自HPV18的E6、来自HPV16的E7的片段、来自HPV18的E7的片段、来自HPV16的E6的片段和来自HPV18的E6的片段。
2.根据权利要求1所述的分离抗原,其中所述HPV组分由来自HPV16的E7组成。
3.根据权利要求1所述的分离抗原,其中所述HPV组分由来自HPV18的E7组成。
4.根据权利要求1所述的分离抗原,其中所述HPV组分由SEQ ID NO.:2或SEQ IDNO.:4组成。
5.根据权利要求1所述的分离抗原,其中所述热稳定蛋白质包含修饰后的地衣多糖酶(lichenase)蛋白质序列。
6.根据权利要求1所述的分离抗原,其中所述地衣多糖酶的编码序列已被优化来用于植物中的蛋白质表达。
7.根据权利要求1所述的分离抗原,其中所述地衣多糖酶蛋白质序列包含地衣多糖酶的N末端域、C末端域和表面环域。
8.根据权利要求1所述的分离抗原,其中与地衣多糖酶融合的所述HPV组分是N末端融合蛋白质、C末端融合蛋白质或表面环插入融合蛋白质中的任何一种蛋白质。
9.根据权利要求1所述的分离抗原,其中所述HPV组分包含至少2个独立地选自由以下组成的群组的域:来自HPV16的E7、来自HPV18的E7、来自HPV16的E6和来自HPV18的E6、来自HPV16的E7的片段、来自HPV18的E7的片段、来自HPV16的E6的片段和来自HPV18的E6的片段。
10.根据权利要求9所述的分离抗原,其中所述第一HPV组分包含来自HPV16的E7并且所述第二HPV组分包含来自HPV18的E7。
11.一种疫苗组合物,其包含抗原和医药学上可接受的载剂,所述抗原包含与热稳定蛋白质融合的人类乳头瘤病毒(HPV)的组分;
其中所述HPV组分包含至少一个选自由以下组成的群组的域:来自HPV16的E7、来自HPV18的E7、来自HPV16的E6和来自HPV18的E6、来自HPV16的E7的片段、来自HPV18的E7的片段、来自HPV16的E6的片段和来自HPV18的E6的片段;并且
其中所述组合物能够在投与个体后引发免疫反应。
12.根据权利要求11所述的疫苗组合物,其中所述HPV组分由来自HPV16的E7组成。
13.根据权利要求11所述的疫苗组合物,其中所述HPV组分由来自HPV18的E7组成。
14.根据权利要求11所述的疫苗组合物,其中所述HPV组分由SEQ ID NO.:2或SEQID NO.:4组成。
15.根据权利要求11所述的疫苗组合物,其中所述热稳定蛋白质包含修饰后的地衣多糖酶蛋白质序列。
16.根据权利要求11所述的疫苗组合物,其中所述地衣多糖酶的编码序列已被优化用于植物中的蛋白质表达。
17.根据权利要求11所述的疫苗组合物,其中所述地衣多糖酶蛋白质序列包含地衣多糖酶的N末端域、C末端域和表面环域。
18.根据权利要求11所述的疫苗组合物,其中与地衣多糖酶融合的所述HPV组分是N末端融合蛋白质、C末端融合蛋白质或表面环插入融合蛋白质中的任何一种蛋白质。
19.根据权利要求11所述的疫苗组合物,其中所述HPV组分包含至少2个独立地选自由以下组成的群组的域:来自HPV16的E7、来自HPV18的E7、来自HPV16的E6和来自HPV18的E6、来自HPV16的E7的片段、来自HPV18的E7的片段、来自HPV16的E6的片段和来自HPV18的E6的片段。
20.根据权利要求19所述的疫苗组合物,其中所述第一HPV组分包含来自HPV16的E7并且所述第二HPV组分包含来自HPV18的E7。
21.根据权利要求11所述的疫苗组合物,其另外包含第二抗原,其中所述组合物能够在投与动物后引发免疫反应。
22.根据权利要求11所述的疫苗组合物,其中所述第二抗原包含与热稳定蛋白质融合的人类乳头瘤病毒(HPV)的组分和医药学上可接受的载剂;
其中所述第一抗原的所述HPV组分包含至少一个选自由以下组成的群组的域:来自HPV16的E7、来自HPV18的E7、来自HPV16的E6和来自HPV18的E6、来自HPV16的E7的片段、来自HPV18的E7的片段、来自HPV16的E6的片段和来自HPV18的E6的片段,并且所述第二抗原的所述HPV组分包含至少一个不同于所述第一抗原的选自由以下组成的群组的域:来自HPV16的E7、来自HPV18的E7、来自HPV16的E6和来自HPV18的E6、来自HPV16的E7的片段、来自HPV18的E7的片段、来自HPV16的E6的片段和来自HPV18的E6的片段;并且其中所述组合物能够在投与个体后引发免疫反应。
23.根据权利要求22所述的疫苗组合物,其中所述第一抗原的所述HPV组分包含至少一个选自由来自HPV16的E7和来自HPV16的E7的片段组成的群组的域,并且所述第二抗原的所述HPV组分包含至少一个不同于所述第一抗原的选自由来自HPV18的E7和来自HPV18的E7的片段组成的群组的域。
24.根据权利要求11所述的疫苗组合物,其中所述抗原是在选自转基因植物和瞬时表达所述抗原的植物的植物中产生。
25.根据权利要求11所述的疫苗组合物,其中所述组合物包含来自植物细胞、植物、种子、果实或其提取物的纯化、部分纯化或未纯化的抗原。
26.根据权利要求11所述的疫苗组合物,其另外包含疫苗佐剂。
27.根据权利要求11所述的疫苗组合物,其中所述佐剂包含明矾、MF59、MALP2和皂苷。
28.一种包含至少2种抗原的疫苗组合物,每种抗原都包含人类乳头瘤病毒(HPV)的组分,其中所述抗原中的至少一种抗原另外包含热稳定蛋白质,其中所述组合物能够在投与个体后引发免疫反应。
29.根据权利要求28所述的疫苗组合物,其中至少2种抗原包含HPV的组分,每一者独立地包含至少一个选自由以下组成的群组的域:来自HPV16的E7、来自HPV18的E7、来自HPV16的E6和来自HPV18的E6、来自HPV16的E7的片段、来自HPV18的E7的片段、来自HPV16的E6的片段和来自HPV18的E6的片段和其组合;并且其中所述组合物能够在投与个体后引发免疫反应。
30.一种在个体中诱导针对人类乳头瘤病毒(HPV)感染的保护性免疫反应的方法,其包含向个体投与有效量的抗HPV疫苗组合物,其中所述投药足以刺激所述个体产生抗原特异性抗体或刺激所述个体的细胞免疫反应;从而诱导保护性免疫反应;
a.其中所述疫苗组合物包含抗原,所述抗原包含与热稳定蛋白质融合的人类乳头瘤病毒(HPV)的组分;并且
b.其中所述HPV组分包含至少一个选自由以下组成的群组的域:来自HPV16的E7、来自HPV18的E7、来自HPV16的E6和来自HPV18的E6、来自HPV16的E7的片段、来自HPV18的E7的片段、来自HPV16的E6的片段和来自HPV18的E6的片段。
31.根据权利要求30所述的方法,其中所述组合物是经口、鼻内、皮下、静脉内、腹膜内或肌肉内投与。
32.根据权利要求30所述的方法,其中通过供给植物细胞而向所述个体经口投与所述组合物。
33.根据权利要求30所述的方法,其中所述个体是人类。
34.一种产生抗原蛋白质的方法,所述抗原蛋白质包含与热稳定蛋白质融合的人类乳头瘤病毒(HPV)的组分,所述方法包含:
a.制备核酸构筑体,其编码与热稳定蛋白质融合的人类乳头瘤病毒(HPV)的抗原组分;
b.用步骤a的所述核酸构筑体来转化细胞;和
c.在有利于表达所述抗原蛋白质的条件下培养所述细胞;
d.从而产生所述抗原蛋白质;
e.其中所述抗原的所述HPV组分包含至少一个选自由以下组成的群组的域:来自HPV16的E7、来自HPV18的E7、来自HPV16的E6和来自HPV18的E6、来自HPV16的E7的片段、来自HPV18的E7的片段、来自HPV16的E6的片段和来自HPV18的E6的片段。
35.根据权利要求34所述的方法,其中所述HPV组分由来自HPV16的E7组成。
36.根据权利要求34所述的方法,其中所述HPV组分由来自HPV18的E7组成。
37.根据权利要求34所述的方法,其中所述HPV组分由选自由SEQ ID NO.:1和SEQNO.:3组成的群组的核苷酸序列编码。
38.根据权利要求34所述的方法,其中所述HPV组分由SEQ ID NO.:2或SEQ ID NO.:4组成。
39.根据权利要求34所述的方法,其中所述热稳定蛋白质包含修饰后的地衣多糖酶蛋白质序列。
40.根据权利要求34所述的方法,其中所述地衣多糖酶的编码序列已被优化用于植物中的蛋白质表达。
41.根据权利要求34所述的方法,其中所述地衣多糖酶蛋白质序列包含地衣多糖酶的N末端域、C末端域和表面环域。
42.根据权利要求34所述的方法,其中与地衣多糖酶融合的所述HPV组分是N末端融合蛋白质、C末端融合蛋白质或表面环插入融合蛋白质中的任何一种蛋白质。
43.根据权利要求34所述的方法,其中所述HPV组分包含至少2个域,每个域独立地包含至少一个选自由以下组成的群组的域:来自HPV16的E7、来自HPV18的E7、来自HPV16的E6和来自HPV18的E6、来自HPV16的E7的片段、来自HPV18的E7的片段、来自HPV16的E6的片段和来自HPV18的E6的片段和其组合。
44.根据权利要求34所述的方法,其中所述抗原蛋白质的表达处于病毒启动子的控制之下。
45.根据权利要求34所述的方法,其中所述核酸构筑体另外包含载体核酸序列。
45.根据权利要求45所述的方法,其中所述载体是二元载体。
46.根据权利要求34所述的方法,其中所述核酸构筑体另外包含编码病毒蛋白质的序列。
47.根据权利要求34所述的方法,其中所述细胞是植物细胞。
48.根据权利要求47所述的方法,其中所述植物细胞选自由苜蓿(alfalfa)细胞、萝卜(radish)细胞、芥菜(mustard)细胞、绿豆(mung bean)细胞、西兰花(broccoli)细胞、水田芥(watercress)细胞、大豆(soybean)细胞、小麦(wheat)细胞、向日葵(sunflower)细胞、卷心菜(cabbage)细胞、三叶草(clover)细胞、矮牵牛(petunia)细胞、番茄(tomato)细胞、马铃薯(potato)细胞、烟碱(nicotine)细胞、菠菜(spinach)细胞和小扁豆(lentil)细胞组成的群组。
49.根据权利要求47所述的方法,其中所述抗原蛋白质是在克隆根细胞中产生。
50.根据权利要求47所述的方法,其中所述抗原蛋白质是在萌芽秧苗中产生。
51.根据权利要求34所述的方法,其另外包含回收所产生的部分纯化或纯化抗原蛋白质。
52.一种分离核酸构筑体,其包含编码与热稳定蛋白质融合的人类乳头瘤病毒(HPV)的组分的核酸序列;
其中所述HPV组分包含至少一个选自由以下组成的群组的域:来自HPV16的E7、来自HPV18的E7、来自HPV16的E6和来自HPV18的E6、来自HPV16的E7的片段、来自HPV18的E7的片段、来自HPV16的E6的片段和来自HPV18的E6的片段和其组合。
53.根据权利要求52所述的分离核酸构筑体,其中所述HPV组分由来自HPV16的E7、来自HPV16的E6或来自HPV16的E7的片段或来自HPV16的E6的片段组成。
54.根据权利要求52所述的分离核酸构筑体,其中所述HPV组分由来自HPV18的E7、来自HPV18的E6或来自HPV18的E7的片段或来自HPV18的E6的片段组成。
55.根据权利要求52所述的分离核酸构筑体,其中所述HPV组分由SEQ ID NO.:2或SEQ ID NO.:4组成。
56.根据权利要求52所述的分离核酸构筑体,其中所述热稳定蛋白质包含修饰后的地衣多糖酶蛋白质序列。
57.根据权利要求52所述的分离核酸构筑体,其中所述地衣多糖酶的编码序列已被优化用于植物中的蛋白质表达。
58.根据权利要求52所述的分离核酸构筑体,其中所述地衣多糖酶蛋白质序列包含地衣多糖酶的N末端域、C末端域和表面环域。
59.根据权利要求52所述的分离核酸构筑体,其中与地衣多糖酶融合的所述HPV组分是N末端融合蛋白质、C末端融合蛋白质或表面环插入融合蛋白质中的任何一种蛋白质。
60.根据权利要求52所述的分离核酸构筑体,其中所述HPV组分包含至少2个域,每个域独立地包含至少一个选自由以下组成的群组的域:来自HPV16的E7、来自HPV18的E7、来自HPV16的E6和来自HPV18的E6、来自HPV16的E7的片段、来自HPV18的E7的片段、来自HPV16的E6的片段和来自HPV18的E6的片段和其组合。
61.根据权利要求52所述的分离核酸构筑体,其中所述HPV组分包含SEQ ID NO.:1或SEQ ID NO.:3。
62.根据权利要求52所述的分离核酸构筑体,其另外包含载体核酸序列。
63.根据权利要求52所述的分离核酸构筑体,其另外包含病毒启动子核酸序列。
64.根据权利要求52所述的方法,其中所述载体是二元载体。
65.根据权利要求52所述的方法,其另外包含编码病毒蛋白质的核酸序列。
66.一种细胞,其包含根据权利要求52所述的核酸构筑体。
67.根据权利要求66所述的宿主细胞,其为植物细胞。
68.根据权利要求66所述的宿主细胞,其选自由苜蓿细胞、萝卜细胞、芥菜细胞、绿豆细胞、西兰花细胞、水田芥细胞、大豆细胞、小麦细胞、向日葵细胞、卷心菜细胞、三叶草细胞、矮牵牛细胞、番茄细胞、马铃薯细胞、烟碱细胞、菠菜细胞和小扁豆细胞组成的群组。
69.一种植物,其包含根据权利要求52所述的核酸构筑体,其中所述植物能够产生所述抗原蛋白质。
70.根据权利要求69所述的植物,其选自由苜蓿、萝卜、芥菜、绿豆、西兰花、水田芥、大豆、小麦、向日葵、卷心菜、三叶草、矮牵牛、番茄、马铃薯、烟碱、菠菜和小扁豆组成的群组。
71.根据权利要求69所述的植物,其为选自芸苔属(Brassica genus)、烟草属(Nicotianagenus)和矮牵牛属(Petunia genus)的属。
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