CN1198840C - 人类乳头瘤病毒11l1－e7重组蛋白及其应用 - Google Patents

人类乳头瘤病毒11l1－e7重组蛋白及其应用 Download PDF

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CN1198840C CNB001313436A CN00131343A CN1198840C CN 1198840 C CN1198840 C CN 1198840C CN B001313436 A CNB001313436 A CN B001313436A CN 00131343 A CN00131343 A CN 00131343A CN 1198840 C CN1198840 C CN 1198840C
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一种人类乳头瘤病毒11L1-E7重组蛋白及其应用，利用分子克隆技术构建HPV11型早期蛋白基因E7与HPV11晚期基因L1融合的重组体HPV11L1-E7，并使其在杆状病毒-昆虫表达系统进行表达。该重组蛋白经证实具有与野生型HPV相似的生物学特性。该重组蛋白可与药学上可接受的药物制成药物组合物，应用于临床预防和治疗HPV感染性疾病，并为今后研制用于临床预防和治疗尖锐湿疣的疫苗奠定基础。

Description

人类乳头瘤病毒11L1-E7重组蛋白及其应用
本发明涉及一种新的病毒重组蛋白和这种重组蛋白的用途，尤其是一种人类乳头瘤病毒11L1-E7重组蛋白及其在感染性疾病的预防与治疗中的应用。
近年来，我国性传播性疾病的发病率持续快速升高已严重危害我国人民的健康和家庭幸福。尖锐湿疣(condyloma acuminatum)是性传播性疾病之一，它在我国的发病率已占性传播性疾病的首位。由于缺乏理想的治疗方法，尖锐湿疣的复发率高达30％到70％。因此寻求理想的治疗和预防手段应成为我国迫在眉捷的大事。
尖锐湿疣由人类乳头瘤病毒(Human Papilloma Virus，HPV)引起。HPV是一群小DNA肿瘤病毒，属乳多空病毒科的多瘤病毒。目前已确定130个型别，其中78个型已被完全克隆。引起尖锐湿疣的HPV有11型、6型、16型、18型和33型等，其中最常见的是HPV11型。HPV不仅可以引起皮肤粘膜上皮的过度增殖，还与多种鳞状细胞癌的发生发展有关。乳头瘤病毒的感染具有严格的宿主特异性和嗜上皮性，人是HPV的唯一宿主，至今仍未能体外培养。
HPV研究的重大突破是发现HPV的晚期结构蛋白L1能在体外真核细胞表达系统表达并自动形成病毒样颗粒(Virus Like Particles，VLPs)。研究表明，VLPs的最大特点是其具有与野生型HPV病毒颗粒极为相似的空间结构和抗原决定簇，因此两者抗原性十分近似。其另一大特点是L1的羧基端可以象载体那样连接其它基因并随之在一定的表达系统进行表达，产生的重组蛋白可随着L1形成嵌合型病毒样颗粒VLPs。近年研究还表明，病毒样颗粒VLPs可作为外源性抗原通过非经典的组织相容复合体(MHC)class I抗原提呈通路得到呈递，并有效激活以细胞毒性T淋巴细胞反应(CTL)为特征的细胞免疫反应。细胞免疫对于机体清除病毒感染至关重要。
为了更好地防治HPV感染性疾病，国外许多学者正在研究乳头瘤病毒结构蛋白L1和早期蛋白E7引发机体特异性细胞免疫反应的机制等。体外试验、动物试验和人体试验均证实，乳头瘤病毒的晚期结构蛋白L1和早期蛋白E7能引发机体的特异性细胞免疫反应。但关于HPV11L1-E7重组蛋白及其应用尚无记载。
本发明的目的是提供一种人类乳头瘤病毒11L1-E7重组蛋白及其在感染性疾病的预防与治疗中的应用。
本发明的目的是这样实现的：将HPV11E7基因利用分子克隆技术克隆入连有HPVL1的载体PUC，再将这HPV11L1-E7基因片段插入杆状病毒转染载体pVL1393，然后转染杆状病毒线状DNA并用之感染SF-9昆虫细胞使HPV11L1-E7基因得到表达，其重组体pVL1393/HPV11L1-E7DNA的序列为：
(1)pVL1393/HPV11L1-E7a：
ATGTGGCGGCCTAGCGACAGCACAGTATATGTGCCTCCTCCCAACCCTGTATCCAAGGTTGTTGCCACG
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(3)pVL1393/HPV11L1-E7c：
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GCA CCA AAA CCA TAA
通过上述构建所得的重组蛋白可与药学上可接受的药物制成药物组合物，用于预防HPV感染和治疗HPV感染性疾病，也可研制用于临床预防和治疗尖锐湿疣的疫苗。
下面结合具体的实施例对本发明的技术措施作进一步的说明。
实施例1：重组杆状病毒转染载体的构建、转染和表达
将HPV11E7基因克隆入连有HPVL1的载体PUC，再将这HPV11L1-E7基因片段插入杆状病毒转染载体pVL1393，然后转染杆状病毒线状DNA并用之感染SF-9昆虫细胞使HPV11L1-E7基因得到表达。
具体构建过程如下：本发明利用分子克隆技术构建HPV11 E7于主要结构蛋白L1基因。引物设计成可以插入HPV11L1序列的C末端。将此重组体DNA克隆于杆状病毒转染载体pVL1393，然后转化大肠杆菌DHα5进行鉴定和扩增。将杆状病毒线状DNA和含目的DNA杆状病毒载体一起转染昆虫细胞Sf9。培养3-5天后，细胞经离心、匀浆化、超声粉碎、蔗糖超离和CsCl密度梯度离心可获浮密度1.34g/ml的重组蛋白条带。其重组体pVL1393/HPV11L1-E7DNA的序列为：
(1)pVL1393/HPV11L1-E7a：
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实施例2：重组蛋白HPV11L1-E7的鉴定
重组蛋白免疫印迹分析包括：
1.样本蛋白质定量分析：用穿孔酸蛋白分析药盒(PIERCE BICINCHONIC ACID，BCA)测定蛋白浓度：(1)在96孔微滴定板上加系列标准浓度的BCA样品10μl(同样浓度加样两次)和未知样品各5μl(同样浓度加样三次)；(2)每孔加200μl工作液，其中工作液A比工作液B为50∶1；(3)混匀30秒后37℃孵育30分钟；(4)测得562nm吸光值，绘制标准曲线并计算样本的蛋白质浓度。
2.样品的变性处理：取HPV11L1-E7重组蛋白样品各10μl，分别加5μl水和15μl加样缓冲液，100℃煮沸5-10分钟。
3.样本的SDS-PAGE凝胶(10％)电泳、转膜、凝胶考马斯亮篮染色、和免疫杂交和增强化学发光法(ECL)显色：具体步骤参照《分子克隆实验指南》(科技出版社第二版1998年)。
4.重组蛋白透射电镜分析
重组蛋白样本HPV11L1-E7经PBS透析(样本装入透析袋，然后用1×PBS在4℃透析过夜以去除氯化铯)后放在碳网上，用2％pH6.2钼酸胺(SIGMA USA)染色后用日立H-800电镜进行透射电镜观察和摄影。
实施例3：体外细胞毒性T淋巴细胞分析(CTL)
1.靶细胞的标记：
靶细胞的标记过程有：1)离心C2细胞和EL-4细胞(1000转，5分钟)，用无血清RPMI-1640培养基洗涤EL-4和C2细胞后再离心(1000转，5分钟)。2)重悬1×107细胞于200μl无血清RPMI-1640培养液；3)加100μl 51Cr到上述细胞中；4)置37℃、5％CO2孵育60分钟；5)先后用胎牛血清和RPMI-1640培养液洗涤靶细胞以去除游离51Cr：加8ml培养液重悬细胞，小心从试管底部加入2ml血清；离心(800转，8分钟)后吸去血清上部的培养液，并用培养液洗管壁两次；再离心(800转，8分钟)，去除全部上清(包括血清)；用约1ml培养液重悬细胞；6)数细胞数，调节细胞浓度至105/ml，将100μl的细胞加入96孔板，即每孔含104细胞。
2.细胞毒性实验：
1)用重组蛋白刺激靶细胞。重组蛋白HPV11L1-E7与上述51Cr标记的EL-4细胞共同孵育3小时(浓度为50μg VLPs/106细胞)。作为对照将靶细胞与HPV11L1-VLPs抗体(1∶1000)和无关抗体(抗兔多抗1∶1000，Anti-Ig)孵育一小时后再与重株蛋白孵育3小时。
2)CTL反应测定。分别加100μl效应细胞和靶细胞于圆底96孔板，效应细胞/靶细胞比例(effect cell：target cell ratio，E：T ratio)调至5∶1、2.5∶1、0.1∶1，每份样本重复三孔；作为对照，设三孔100μl靶细胞中加入100μl的10％SDS以及设三孔100μl靶细胞与100μl培养基；置37℃、5％CO2孵育5小时；500RPM离心5MIN并收集每孔100μl上清液于γ计数管内；γ计数仪测定样本中靶细胞特异性溶解引起的同位素释放量；靶细胞的特异性溶解百分率计算如下：
特异性溶解％＝(样本同位素释放量—自发同位素释放量)/
              (最大同位素释放量—自发同位素释放量)×100。
最大释放量：100μl靶细胞中加入100μl的10％SDS后的同位素释放量，
自发释放量：100μl靶细胞与100μl培养基孵育而得的同位素释放量。
实施例4：小鼠体内CTL分析
1.效应细胞的制备。重组蛋白HPV11L1-E7免疫小鼠并制备成效应细胞。具体步骤如下：在8-10周龄雌性C57 BL/6J(H-2b)小鼠的后足垫分别注射50μg HPV11L1-E7，每组注射三个小鼠。对照组注射50μl PBS；4天后杀死小鼠并取其双侧腘窝和腹主动脉旁淋巴结；用尼龙筛网小心碾磨淋巴结以分离出单个淋巴细胞；重悬淋巴细胞于含20U/ml IL-2和10％FCS的RPMI-1640培养基；淋巴细胞悬液于37℃、5％CO2孵箱培养四天即可用作效应细胞进行CTL测定。
2.靶细胞的标记
靶细胞的标记过程有：离心C-2细胞和EL-4细胞(1000转，5分钟)，用无血清RPMI-1640培养基洗涤EL-4和C-2细胞后再离心(1000转，5分钟)；2)重悬1×107细胞于200μl无血清RPMI-1640培养液；3)加100μl 51Cr到上述细胞中；4)置37℃、5％CO2孵育60分钟；先后用胎牛血清和RPMI-1640培养液洗涤靶细胞以去除游离51Cr：加8ml培养液重悬细胞，小心从试管底部加入2ml血清；离心(800转，8分钟)后吸去血清上部的培养液，并用培养液洗管壁两次；再离心(800转，8分钟)，去除全部上清(包括血清)；用约1ml培养液重悬细胞；进行细胞计数，调节细胞浓度至105/ml；将100μl的细胞加入96孔板，即每孔含104靶细胞。
3.细胞毒性实验：
分别加100μl效应细胞和靶细胞于圆底96孔板，效应细胞/靶细胞比例(effect cell：target cell ratio，E：T ratio)调至50∶1、25∶1、1∶1，每份样本重复三孔；作为对照，设三孔100μl靶细胞中加入100μl的10％SDS以及设三孔100μl靶细胞与100μl培养基；置37℃、5％CO2孵育5小时；500RPM离心5MIN；收集每孔100μl上清液于γ计数管内；γ计数仪测定样本中靶细胞特异性溶解引起的同位素释放量；靶细胞的特异性溶解百分率计算如前。
实施例5，小鼠感染模型的阻断
重组蛋白HPV11L1-E7免疫小鼠并制备成效应细胞。具体步骤如下：在8-10周龄雌性C57 BL/6J(H-2b)小鼠的后足垫分别注射50μg HPV11L1-E7；注射转染HPV11L1或E7细胞株；观察小鼠体内接种细胞的生长情况；观察体液免疫(抗体的测定)和细胞免疫的产生情况(CTL反应、DTH反应)；评价重组蛋白HPV11L1-E7对感染的阻断作用。
实施例6，制备重组蛋白HPV11L1-E7与其它药物的组合物
重组蛋白HPV11L1-E7可与某些细胞因子混合，如与一定浓度的TNFα、INF或IL-2等混合制成药物免疫动物C57BL/6J(H-2b)小鼠(方法同前)，观察体液免疫(抗体的测定)和细胞免疫的产生情况(CTL反应、DTH反应)；评价重组蛋白HPV11L1-E7对感染的阻断作用。
实施例7，应用重组蛋白HPV11L1-E7预防和治疗尖锐湿疣
用重组蛋白HPV11L1-E7给尖锐湿疣感染高危人群(主要指尖锐湿疣患者的性伴侣和家庭成员)和尖锐湿疣患者定期注射，观察体液免疫(抗体水平的测定)和细胞免疫的产生情况(CTL反应、DTH反应)和免疫维持的时间；评价重组蛋白HPV11L1-E7对感染的阻断作用和使尖锐湿疣患者疣体消退的作用。
本发明与已有技术相比较，采用本发明的技术措施所取得的有益效果是：
由于CTL反应被认为在清除病毒感染细胞中起着关键作用，因此任何针对病毒感染的疫苗必须能够诱导CTL反应。通常外源性抗原不足以通过MHC I类分子呈CD8+T细胞。我们不但能成功地构建和表达了重组蛋白HPV11L1-E7，还能证实其具有野生型病毒的空间的结构。具有深远意义的是能发现重组HPV11L1-E7VLP可以作为抗原通过MHC I类途径得到呈递并引发CTL反应。

Claims (2)

1.人类乳头瘤病毒11L1-E7重组蛋白，其特征在于：将HPV11E7基因利用分子克隆技术克隆入连有HPVL1的载体PUC，再将这HPV11L1-E7基因片段插入杆状病毒转染载体pVL1393，然后转染杆状病毒线状DNA并用之感染SF-9昆虫细胞使HPV11L1-E7基因得到表达，其重组体pVL1393/HPV11L1-E7DNA的序列为：
(1)pVL1393/HPV11L1-E7a
ATGTGGCGGCCTAGCGACAGCACAGTATATGTGCCTCCTCCCAACCCTGTATCCAAGGTTGTTGCCACG
GATGCGTATGTTAAACGCACCAACATATTTTATCATGCCAGCAGTTCTAGACTCCTTGCTGTGGGACAT
CCATATTACTCTATCAAAAAAGTTAACAAAACAGTTGTACCAAAGGTGTCTGGATATCAATATAGAGTG
TTTAAGGTAGTGTTGCCAGATCCTAACAAGTTTGCATTACCTGATTCATCCCTGTTTGACCCCACTACA
CAGCGTTTAGTATGGGCGTGCACAGGGTTGGAGGTAGGCAGGGGTCAACCTTTAGGCGTTGGTGTTAGT
GGGCATCCATTGCTAAACAAATATGATGATGTAGAAAATAGTGGTGGGTATGGTGGTAATCCTGGTCAG
GATAATAGGGTTAATGTAGGTATGGATTATAAACAAACCCAGCTATGTATGGTGGGCTGTGCTCCACCG
TTAGGTGAACATTGGGGTAAGGGTACACAATGTTCAAATACCTCTGTACAAAATGGTGACTGCCCCCCG
TTGGAACTTATTACCAGTGTTATACAGGATGGGGACATGGTTGATACAGGCTTTGGTGCTATGAATTTT
GCAGACTTACAAACCAATAAATCGGATGTTCCCCTTGATATTTGTGGAACTGTCTGCAAATATCCTGAT
TATTTGCAAATGGCTGCAGACCCTTATGGTGATAGGTTGTTTTTTTATTTGCGAAAGGAACAAATGTTT
GCTAGACACTT
TTTTAATAGGGCCGGTACTGTGGGGGAACCTGTGCCTGATGACCTGTTGGTAAAAGGGGGTAATAACAG
ATCATCTGTAGCTAGTAGTATTTATGTACATACACCTAGTGGCTCATTGGTGTCTTCAGAGGCTCAATT
ATTTAATAAACCATATTGGCTTCAAAAGGCTCAGGGACATAACAATGGTATTTGCTGGGGAAACCACTT
GTTTGTTACTGTGGTAGATACCACACGCAGTACAAATATGACACTATGTGCATCTGTGTCTAAATCTGC
TACATACACTAATTCAGATTATAAGGAATACATGCGCCATGTGGAGGAGTTTGATTTACAGTTTATTTT
TCAATTGTGTAGCATTACATTATCTGCAGAAGTCATGGCCTATATACACACAATGAATCCTTCTGTTTT
GGAGGACTGGAACTTTGGTTTATCGCCTCCACCAAATGGTACACTGGAGGATACTTATAGATATGTACA
GTCACAGGCCATTACCTGTCAGAAACCCACACCTGAAAAAGAAAAACAGGATCCCTATAAGGATATGAG
TTTTTGGGAGGTTAACTTAAAAGAAAAGTTTTCAAGTGAATTAGATCAGTTTCCCCTTGGACGTAAGTT
TTTATTGCAAAGTGGATATCGAGGACGGACGTCTGCTCGTACAGGTATAAAGCGCCCAGCTGTGTCTAA
GCCCTCTACAGCCCCCAAACGAAAACGTACCAAAACCAAAAAGTAA--- ATG CAT GGA AGA CTT
GTT ACC CTA AAG GAT ATA GTA CTA GAC CTG CAG CCT CCT GAC CCT GTA GGG TTA
CAT TGC TAT GAG CAA TTA GAA GAC AGC TCA
(2)pVL1393/HPV11L1-E7b
ATGTGGCGGCCTAGCGACAGCACAGTATATGTGCCTCCTCCCAACCCTGTATCCAAGGTTGTTGCCACG
GATGCGTATGTTAAACGCACCAACATATTTTATCATGCCAGCAGTTCTAGACTCCTTGCTGTGGGACAT
CCATATTACTCTATCAAAAAAGTTAACAAAACAGTTGTACCAAAGGTGTCTGGATATCAATATAGAGTG
TTTAAGGTAGTGTTGCCAGATCCTAACAAGTTTGCATTACCTGATTCATCCCTGTTTGACCCCACTACA
CAGCGTTTAGTATGGGCGTGCACAGGGTTGGAGGTAGGCAGGGGTCAACCTTTAGGCGTTGGTGTTAGT
GGGCATCCATTGCTAAACAAATATGATGATGTAGAAAATAGTGGTGGGTATGGTGGTAATCCTGGTCAG
GATAATAGGGTTAATGTAGGTATGGATTATAAACAAACCCAGCTATGTATGGTGGGCTGTGCTCCACCG
TTAGGTGAACATTGGGGTAAGGGTACACAATGTTCAAATACCTCTGTACAAAATGGTGACTGCCCCCCG
TTGGAACTTATTACCAGTGTTATACAGGATGGGGACATGGTTGATACAGGCTTTGGTGCTATGAATTTT
GCAGACTTACAAACCAATAAATCGGATGTTCCCCTTGATATTTGTGGAACTGTCTGCAAATATCCTGAT
TATTTGCAAATGGCTGCAGACCCTTATGGTGATAGGTTGTTTTTTTATTTGCGAAAGGAACAAATGTTT
GCTAGACACTT
TTTTAATAGGGCCGGTACTGTGGGGGAACCTGTGCCTGATGACCTGTTGGTAAAAGGGGGTAATAACAG
ATCATCTGTAGCTAGTAGTATTTATGTACATACACCTAGTGGCTCATTGGTGTCTTCAGAGGCTCAATT
ATTTAATAAACCATATTGGCTTCAAAAGGCTCAGGGACATAACAATGGTATTTGCTGGGGAAACCACTT
GTTTGTTACTGTGGTAGATACCACACGCAGTACAAATATGACACTATGTGCATCTGTGTCTAAATCTGC
TACATACACTAATTCAGATTATAAGGAATACATGCGCCATGTGGAGGAGTTTGATTTACAGTTTATTTT
TCAATTGTGTAGCATTACATTATCTGCAGAAGTCATGGCCTATATACACACAATGAATCCTTCTGTTTT
GGAGGACTGGAACTTTGGTTTATCGCCTCCACCAAATGGTACACTGGAGGATACTTATAGATATGTACA
GTCACAGGCCATTACCTGTCAGAAACCCACACCTGAAAAAGAAAAACAGGATCCCTATAAGGATATGAG
TTTTTGGGAGGTTAACTTAAAAGAAAAGTTTTCAAGTGAATTAGATCAGTTTCCCCTTGGACGTAAGTT
TTTATTGCAAAGTGGATATCGAGGACGGACGTCTGCTCGTACAGGTATAAAGCGCCCAGCTGTGTCTAA
GCCCTCTACAGCCCCCAAACGAAAACGTACCAAAACCAAAAAGTAA---GAA GAT GAG GTG GAC
AAG GTG GAC AAA CAA GAC GCA CAA CCT TTA ACA CAA CAT TAC CAA ATA CTG ACC
TGT TGC TGT GGA TGT GAC AGC
(3)pVL1393/HPV11L1-E7c
ATGTGGCGGCCTAGCGACAGCACAGTATATGTGCCTCCTCCCAACCCTGTATCCAAGGTTGTTGCCACG
GATGCGTATGTTAAACGCACCAACATATTTTATCATGCCAGCAGTTCTAGACTCCTTGCTGTGGGACAT
CCATATTACTCTATCAAAAAAGTTAACAAAACAGTTGTACCAAAGGTGTCTGGATATCAATATAGAGTG
TTTAAGGTAGTGTTGCCAGATCCTAACAAGTTTGCATTACCTGATTCATCCCTGTTTGACCCCACTACA
CAGCGTTTAGTATGGGCGTGCACAGGGTTGGAGGTAGGCAGGGGTCAACCTTTAGGCGTTGGTGTTAGT
GGGCATCCATTGCTAAACAAATATGATGATGTAGAAAATAGTGGTGGGTATGGTGGTAATCCTGGTCAG
GATAATAGGGTTAATGTAGGTATGGATTATAAACAAACCCAGCTATGTATGGTGGGCTGTGCTCCACCG
TTAGGTGAACATTGGGGTAAGGGTACACAATGTTCAAATACCTCTGTACAAAATGGTGACTGCCCCCCG
TTGGAACTTATTACCAGTGTTATACAGGATGGGGACATGGTTGATACAGGCTTTGGTGCTATGAATTTT
GCAGACTTACAAACCAATAAATCGGATGTTCCCCTTGATATTTGTGGAACTGTCTGCAAATATCCTGAT
TATTTGCAAATGGCTGCAGACCCTTATGGTGATAGGTTGTTTTTTTATTTGCGAAAGGAACAAATGTTT
GCTAGACACTT
TTTTAATAGGGCCGGTACTGTGGGGGAACCTGTGCCTGATGACCTGTTGGTAAAAGGGGGTAATAACAG
ATCATCTGTAGCTAGTAGTATTTATGTACATACACCTAGTGGCTCATTGGTGTCTTCAGAGGCTCAATT
ATTTAATAAACCATATTGGCTTCAAAAGGCTCAGGGACATAACAATGGTATTTGCTGGGGAAACCACTT
GTTTGTTACTGTGGTAGATACCACACGCAGTACAAATATGACACTATGTGCATCTGTGTCTAAATCTGC
TACATACACTAATTCAGATTATAAGGAATACATGCGCCATGTGGAGGAGTTTGATTTACAGTTTATTTT
TCAATTGTGTAGCATTACATTATCTGCAGAAGTCATGGCCTATATACACACAATGAATCCTTCTGTTTT
GGAGGACTGGAACTTTGGTTTATCGCCTCCACCAAATGGTACACTGGAGGATACTTATAGATATGTACA
GTCACAGGCCATTACCTGTCAGAAACCCACACCTGAAAAAGAAAAACAGGATCCCTATAAGGATATGAG
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TTTATTGCAAAGTGGATATCGAGGACGGACGTCTGCTCGTACAGGTATAAAGCGCCCAGCTGTGTCTAA
GCCCTCTACAGCCCCCAAACGAAAACGTACCAAAACCAAAAAGTAA----ACA GAC GGA GAC ATC
AGA CAA CTA CAA GAC CTT TTG CTG GGC ACA CTA AAT ATT GTG TGT CCC ATC TGC
GCA CCA AAA CCA TAA
2.如权利要求1所述的人类乳头瘤病毒11L1-E7重组蛋白的应用，其特征在于：通过上述构建所得的重组蛋白可与药学上可接受的药用敷料组成药物组合物，用于制备在预防HPV感染和治疗HPV感染性疾病的药物中的应用。
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