具体实施方式
下面实验例将对本发明做更详细的说明,它们并不构成对本发明的限制。
除非特别说明,本发明实验例中的实验数据均为各组中每只小鼠得到的数值的平均值。
实验例1:重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子与基因工程乙型肝炎疫苗协同诱导小鼠细胞免疫应答材料与仪器:
实验动物:BALB/C小鼠,SPF级,雌性,体重16~18g,购于北京维通利华实验动物技术有限公司。
实验材料:基因工程(CHO细胞)乙型肝炎疫苗[Recombinant Hepatitis BVaccine(CHO)],10μg/1.0ml,注射用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子[Recombinant Human Granulocyte/Macrophage Colony-Stimulating Factor forInjection](以后简称rhGm-csf),300μg/支,CHO表达的基因工程乙型肝炎疫苗原液(HBsAg原液)均由华北制药集团金坦生物技术有限公司生产。
主要试剂和仪器:RPMI 1640培养液(Sigma公司);胎牛血清(杭州四季青生物公司);IL-2、IFN-γ、和IL-5的酶联免疫吸附试剂盒(上海雄森科技实业有限公司);抗-HBs用“乙型肝炎病毒表面抗体酶联免疫法诊断试剂盒”(北京万泰生物药业有限公司);MTT、SDS、HRP标记羊抗鼠IgG1、IgG2a均购自Sigma公司;其它试剂如果没有说明,均为市售。
酶联检测仪(Model450,BIO-RAD)、离心机(Labofuge 400R,Heraeus)、倒置显微镜(XDS-1B,重庆光学仪器厂);
检测方法:
1.脾细胞增殖实验检测方法:
①制备脾细胞:无菌方法取小鼠脾脏,在无血清的RPMI 1640培养液中制备细胞悬液,3000r/min离心5min,弃上清,加0.75%NH4Cl 2ml,充分混合4min,加无血清的RPMI 1640培养液至10ml,1500r/min离心7min,弃上清,加RPMI1640培养液5ml混悬后,3000r/min离心5分钟,用含20%胎牛血清的RPMI1640培养液2ml,记数并调整细胞密度为1×107/ml。
②取上述悬液加入96孔板中,每孔100μl,每份细胞悬液分装6个孔,其中3孔为对照组,加100μl无血清的RPMI 1640培养液;另3孔为实验组,每孔加入100μl CHO表达的HBsAg 10μg/ml,混匀后,置37℃,5%CO2孵箱中培养72小时后,每孔加入MTT 20μl,继续培养6小时,每孔再加入10%SDS100μl,置37℃,湿盒中过夜,用酶联检测仪在570nm/630nm波长下读取各孔OD值,以OD值高低判定淋巴细胞增殖程度。
2.细胞因子IFN-γ、IL-5含量测定方法:
①同上述检测方法1中“①制备脾细胞”,将细胞悬液加入24孔细胞培养板中,每孔500μl,每份细胞悬液分装4个孔,其中2孔为对照组,加500μl无血清的RPMI 1640培养液;另2孔为实验组,每孔加入500μl CHO表达的HBsAg10μg/ml,混匀后,置37℃,5%CO2孵箱中培养72小时后,收集细胞培养上清,-20℃保存备用。
②取细胞培养上清,按IFN-γ、IL-5检测试剂盒使用说明书操作。
3.细胞毒T细胞(CTL)功能测定方法——乳酸脱氢酶(LDH)释放实验(《核酸疫苗》孙树汉,第二军医大学出版社上海2000,第108页):
①靶细胞制备:取培养24~48小时的靶细胞YAC-1(GDC001购自中国典型培养物保藏中心),洗涤2次,用RPMI 1640完全培养液调整细胞浓度至3×106/ml。
②效应细胞制备:同检测方法1中“①制备脾细胞”,用RPMI 1640完全培养液调整细胞浓度至1×107/ml。
③效、靶细胞作用:按表1依次加样(如E/T=100∶1)于96孔板中,每份标本设3复孔,置37℃,5%CO2孵箱中培养4小时。
表1:乳酸脱氢酶LDH释放试验各组成份
|
空白组(ml) |
实验组(ml) |
自然释放组(ml) |
最大释放组(ml) |
靶细胞效应细胞1%NP-401640配养液 |
0.10.1 |
0.10.1 |
0.10.1 |
0.10.1 |
④酶促反应:取出培养板,吸取各孔上清0.1ml,加于另一培养板中,置37℃预温10分钟,每孔加入新鲜配制的底物溶液0.1ml,室温避光反应10~15分钟,每孔加入1mol/L柠檬酸终止液30μl,终止酶促反应。
⑤用酶联检测仪(Model 450,BIO-RAD)在570nm波长下读取各孔OD值。
⑥以OD值计算LDH释放率结果计算:
4.细胞毒T细胞(CTL)功能测定方法——MTT法:
将上述检测方法3中“④酶促反应”中取上清后的培养板中,每孔加入20μlMTT(5mg/ml),继续培养4小时后,每孔加入100μl 10%SDS,置37℃,湿盒中过夜,用酶联检测仪(Model 450,BIO-RAD)在570nm/630nm波长下读取各孔OD值(何春艳,刘庆良。包裹天然骨架CpG ODN和HBsAg的非磷脂脂质体疫苗的免疫效果[J]现代免疫学2004,1:第43-47页)、(贾茜,周兴军,等。MTT法测定三种基因工程细胞因子生物学活性方法研究[J]中国生化药物杂志2000,No.1:第8-11页),以OD值计算LDH释放率。计算公式:
5.抗体IgG1、IgG2a亚型滴度检测方法:
先将CHO表达的HBsAg原液2μg/ml,每孔100μl包被在酶标板上,4℃湿盒中过夜;次日,洗涤后加入按一定比例稀释的小鼠血清,37℃培养1小时,洗板,然后每孔分别加入1∶4000稀释的HRP标记羊抗鼠IgG1、IgG2a,37℃培养1小时,洗板,加显色剂,37℃静置10~15min,加入1mol/L的H2SO4终止,用酶标仪测各孔的OD值。以空白对照作为阴性对照,样品OD值/阴性对照OD值>2.1判为阳性,阴性对照OD值<0.05按0.05计算,高于0.05按实际OD值计算,以出现阳性最高稀释度作为该样品的滴度。
实验方法:
1.将BALB/C小鼠,随机分为5组,每组5只,分别为:原液组:给予基因工程乙型肝炎疫苗原液2μg/只;疫苗组:给予基因工程乙型肝炎疫苗2μg/只;混合疫苗组:给予基因工程乙型肝炎疫苗2μg/只,同时给予rhGm-csf20μg/只;GM+疫苗组:给予基因工程乙型肝炎疫苗(2μg/只)前三天,连续三天给予rhGm-csf,20μg/只/天。分别在第0、14天皮下注射(二次免疫),并在第21天放血处死,用CHO表达的HBsAg 10μg/ml,作抗原刺激物,检测脾细胞增殖情况,以及脾细胞培养上清液中细胞因子含量(见检测方法1、2)。
2.将BALB/C小鼠,随机分为5组,每组5只,分别为:原液组:给予基因工程乙型肝炎疫苗原液2μg/只;疫苗组:给予基因工程乙型肝炎疫苗2μg/只;混合疫苗组:给予基因工程乙型肝炎疫苗2μg/只,同时给予rhGm-csf20μg/只;GM+疫苗组:给予基因工程乙型肝炎疫苗(2μg/只)前三天,连续三天给予rhGm-csf,20μg/只。分别在第0、14天皮下注射(二次免疫),每只小鼠免疫的抗原量相当为2μg的HBsAg,并在第21天放血处死,测定细胞毒T细胞(CTL)功能(见检测方法3、4)。
3.将“实验方法1中:放血处死”的小鼠血清收集到离心管中,3000rpm离心15分钟,分离血清,抗体IgG1、IgG2a亚型滴度检测(见检测方法5)。
统计分析方法:
实验组与对照组比较用t检验判断有无显著性差异。
实验结果:
1.脾细胞增殖反应实验:
二次免疫后7天,GM+疫苗组小鼠脾细胞增殖速度最快,比疫苗组高出21.8%,见表2。
表2不同实验组小鼠脾细胞增殖情况
分组 |
OD值 |
原液组疫苗组混合疫苗组GM+疫苗组 |
0.151±0.0300.174±0.0300.183±0.0170.212±0.041 |
2.细胞毒T细胞(CTL)功能测定:
(1)乳酸脱氢酶(LDH)释放实验:
在四个效应细胞(E)与靶细胞(T)配比(5∶1、10∶1、50∶1、100∶1)中,GM+疫苗组小鼠脾细胞细胞毒T细胞(CTL)功能均高于其他组,其中E∶T=100∶1的GM+疫苗组有显著性差异,说明GM+疫苗组小鼠脾细胞细胞毒T细胞(CTL)功能明显高于其他组。见表3。
表3不同实验组乳酸脱氢酶(LDH)释放率(%)(X±S)
分 组 |
5∶1 |
10∶1 |
50∶1 |
100∶1 |
原液组疫苗组混合疫苗组GM+疫苗组 |
2.239±1.0422.971±1.6182.142±1.4953.192±0.257 |
3.486±1.8754.124±2.0154.689±0.9086.042±1.314 |
9.907±4.46310.740±4.88613.963±2.12516.857±4.330 |
17.605±3.57619.449±3.38720.617±5.65128.519±3.500** |
**与疫苗组相比P<0.01
(2)MTT法:
通过对活细胞的分析,在四个效应细胞(E)与靶细胞(T)配比(5∶1、10∶1、50∶1、100∶1)中,GM+疫苗组小鼠脾细胞细胞毒T细胞(CTL)功能均高于其他组,其中除E∶T=50∶1外,另外三个配比中GM+疫苗组均有显著性差异,说明GM+疫苗组小鼠脾细胞细胞毒T细胞(CTL)功能均明显高于其他组。见表4。
表4不同实验组小鼠脾细胞对靶细胞杀伤率(%)(X±S)
分 组 |
5∶1 |
10∶1 |
50∶1 |
100∶1 |
原液组疫苗组混合疫苗组GM+疫苗组 |
30.928±3.10432.239±10.48235.208±6.90146.927±5.764** |
20.521±5.90226.415±12.74326.850±16.62147.981±7.823** |
30.420±16.48045.663±22.60648.437±24.34765.124±18.453 |
30.406±13.23538.328±15.13239.232±21.13478.61 8±14.948** |
**与疫苗组相比P<0.01
3.细胞因子:
(1)IFN-γ:
GM+疫苗组脾细胞培养上清IFN-γ含量较多,GM+疫苗组明显高于疫苗组。说明GM+疫苗组可刺激Th1细胞主要分泌IFN-γ等细胞因子,参与激活细胞介导的免疫应答(《核酸疫苗》孙树汉,第二军医大学出版社上海2000,第105页),见表5。
表5不同实验组脾细胞培养上清液中IFN-γ含量(X±S)
分 组 |
IFN-γ含量(pg/ml) |
原液组疫苗组混合疫苗组GM+疫苗组 |
014.025±2.28816.462±9.50432.501±11.713* |
*与疫苗组相比P<0.05
(2)IL-5:
混合疫苗组脾细胞培养上清IL-5含量较多,故活化的Th2型T细胞,分泌IL-5细胞因子,参与激活B细胞介导的体液免疫应答(《核酸疫苗》孙树汉,第二军医大学出版社上海2000,第105页),见表6。
表6不同实验组脾细胞培养上清液中IL-5含量(X±S)
分 组 |
IL-5含量(pg/ml) |
原液组疫苗组混合疫苗组GM+疫苗组 |
9.067±0.14614.133±0.27816.133±0.23113.367±0.155 |
4.抗体IgG1、IgG2a亚型滴度:
GM+疫苗组小鼠血清抗体中IgG2a占优势,混合疫苗组小鼠血清抗体中以IgG1为主。提示GM+疫苗组可刺激Th1细胞,参与激活细胞介导的免疫应答,促进IgG2a类型抗体产生;混合疫苗组可刺激Th2细胞,参与激活B细胞介导的体液免疫应答,并促进IgG1类型抗体合成(《核酸疫苗》孙树汉,第二军医大学出版社上海2000,第105页),见表7。
表7抗体IgG1、IgG2a亚型滴度
分 组 |
IgG1 |
IgG2a |
原液组疫苗组混合疫苗组GM+疫苗组 |
2016340093505040 |
2200217060478000 |
实验例2:重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和基因工程乙型肝炎疫苗协同诱导小鼠体液免疫应答
材料与仪器:
实验动物、材料、主要试剂和仪器同实验例1。
检测方法:
1.血清抗体滴度测定方法:
用“乙型肝炎病毒表面抗体酶联免疫法诊断试剂盒”,样品的OD值/阴性对照的OD值≥2.1判为阳性(阴性对照的OD值不足0.05,以0.05计算),具体操作见说明书。
2.肝组织切片检查方法(HE染色法):
小鼠处死后,用剪刀剪开腹腔,观察肝组织,剪下肝组织中叶,立即投入生理盐水清洗,以除去外周血液;然后浸在10%甲醛溶液中固定(《实用组织学技术》杜卓民主编,人民卫生出版社,第8页);经较长时间流速适中的流水冲洗,去掉固定后组织所附的固定液,将组织从70%酒精中开始脱水,然后转入95%酒精及无水酒精,各换2~3次,进行脱水,再放入二甲苯中对组织最后脱水处理;用石蜡包埋(《实用组织学技术》杜卓民主编,人民卫生出版社,第22~28页);用石蜡切片常规化苏木精-伊红染色法染色,在染蓝色核后,经伊红复染,最后用95%酒精分色。(《实用组织学技术》杜卓民主编,人民卫生出版社,第49页)。
实验方法:
1.单次免疫:
将BALB/C小鼠,随机分为4组,每组10只,分别为:疫苗组:给予基因工程乙型肝炎疫苗1μg/只;GM+疫苗组:给予基因工程乙型肝炎疫苗(1μg/只)前三天,连续三天给予rhGm-csf,20μg/只;混合疫苗组:给予基因工程乙型肝炎疫苗(1μg/只)同时给予rhGm-csf,20μg/只;疫苗+GM组:给予基因工程乙型肝炎疫苗(1μg/只)后,连续三天给予rhGm-csf,20μg/只;分别于初次免疫后0天、7天、14天、21天、28天、35天,眼眶采血约200ul,3000rpm离心15分钟,分离血清,检测抗体滴度(见检测方法1)。
2.二次免疫:
将BALB/C小鼠,随机分为5组,每组8只,分别为:空白组:给予生理盐水0.1ml/只;疫苗组:给予基因工程乙型肝炎疫苗1μg/只;GM+疫苗组:给予基因工程乙型肝炎疫苗(1μg/只)前三天,连续三天给予rhGm-csf,20μg/只;混合疫苗组:给予基因工程乙型肝炎疫苗(1μg/只)同时给予rhGm-csf,20μg/只;疫苗+GM组:给予基因工程乙型肝炎疫苗(1μg/只)后,连续三天给予rhGm-csf,20μg/只;初次免疫后21天,同样免疫方法进行加强免疫一次;期间每周眼眶采血一次,每次采血约200ul,3000rpm离心15分钟,分离血清,检测抗体滴度(见检测方法1),结果见附图1。
3.挑战实验(免疫记忆):
初次病原体感染后,患者通过获得性免疫应答得到康复。当再次感染相同病原体,多数感染性疾病可避免,因有保护性免疫存在。再感染发生在初感痊愈后较长时间,数年甚至数十年,宿主体却仍然不发生感染。这种远期的保护性免疫主要依赖免疫记忆应答。[《免疫学原理》周光炎主编,上海科学技术文献出版社出版,P247]。故小鼠二次免疫后,待到抗体量极低时,用乙型肝炎疫苗原液进行挑战。挑战实验是将每只小鼠皮下注射乙型肝炎疫苗原液1μg/只,每周眼眶采血一次,每次采血约200ul,3000rpm离心15分钟,分离血清,检测抗体滴度(见检测方法1),见附图2。
4.肝组织切片检查:
挑战实验小鼠血清抗体达到峰值回落后,将小鼠处死,做肝组织切片检查(见检测方法2)。
统计分析方法:
实验组与对照组小鼠血清抗-HBsAg抗体的几何均数用t检验判断有无显著性差异。
实验结果:
1.抗体滴度:
(1)单次免疫后7天,疫苗组的10只小鼠,有4只血清中抗HBsAg抗体呈阳性,6只为阴性,阳性率为40%;GM+疫苗组有7只血清中抗HBsAg抗体呈阳性,3只为阴性,阳性率为70%;混合疫苗组有9只血清中抗HBsAg抗体呈阳性,1只为阴性,阳性率为90%;疫苗+GM组有7只血清中抗HBsAg抗体呈阳性,7只为阴性,阳性率为70%;经卡方检验,混合疫苗组与疫苗组相比有显著性差异(P<0.05),见表8。
表8单次免疫后7天小鼠血清抗体情况
分 组 |
阳性数(只) |
阴性数(只) |
阳性率(%) |
卡方检验 |
疫苗组GM+疫苗组混合疫苗组疫苗+GM组 |
4797 |
6313 |
40709070 | 卡方值:1.82 P=0.18卡方值:5.49 P=0.02卡方值:1.82 P=0.18 |
(2)单次免疫后14天,疫苗组的10只小鼠,有6只血清中抗HBsAg抗体呈阳性,4只为阴性,阳性率为60%;GM+疫苗组有9只血清中抗HBsAg抗体呈阳性,1只为阴性,阳性率为90%;混合疫苗组有10只血清中抗HBsAg抗体呈阳性,0只为阴性,阳性率为100%;疫苗+GM组有8只血清中抗HBsAg抗体呈阳性,2只为阴性,阳性率为80%;经卡方检验,混合疫苗组与疫苗组相比有显著性差异(P<0.05),见表9。
表9单次免疫后14天小鼠血清抗体情况
分 组 |
阳性数(只) |
阴性数(只) |
阳性率(%) |
卡方检验 |
疫苗组GM+疫苗组混合疫苗组疫苗+GM组 |
69108 |
4102 |
609010080 | 卡方值:2.40 P=0.12卡方值:5.00 P=0.03卡方值:0.95 P=0.33 |
(3)单次免疫后28天,4个实验组的小鼠血清抗体均为阳性,以混合疫苗组为最高,GM+疫苗组的血清抗体滴度比较高,紧随其次。可见混合疫苗组促进小鼠的体液免疫功能,见表10。
表10单次免疫后28天血清中抗体滴度(X±S)
分 组 |
抗体量(iu/ml) |
疫苗组GM+疫苗组混合疫苗组疫苗+GM组 |
0.733±0.3912.410±0.772*8.031±1.320**1.394±0.549 |
与疫苗组相比*P<0.05,**P<0.01
(4)二次免疫14天后血清中抗体的含量结果如下,其中混合疫苗组与疫苗组相比有显著性差异,见表11。
表11二次免疫后14天血清中抗体滴度(X±S)
分 组 |
抗体量(iu/ml) |
空白组疫苗组GM+疫苗组混合疫苗组疫苗+GM组 |
02.754±1.5724.438±1.4079.509±2.477**3.119±2.266 |
与疫苗组相比**P<0.01
(5)二次免疫后血清中抗体持续增加,GM+疫苗组、混合疫苗组和疫苗+GM组血清中抗体滴度都先后达到峰值,然后维持较高的水平:第10周疫苗+GM组血清中抗体滴度达到峰值,约为疫苗组8.0倍;第14周混合疫苗组血清中抗体滴度达到峰值,约为疫苗组9.7倍;第23周GM+疫苗组血清中抗体滴度达到峰值,约为疫苗组10.2倍,见附图1。
(6)免疫记忆:小鼠血清中抗体在33周以后,基本达到稳定状态。挑战3周后检测抗体滴度,抗体滴度达到较高水平,随后开始回落;挑战实验抗体最高值分别为挑战前的:8.9倍、5.3倍、12.9倍、4.8倍,见附图2。
2.肝组织切片(HE染色),证明肝细胞正常,肝组织未受到损伤,见附图3。
实验例3:重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子与三种来源的基因工程乙型肝炎疫苗协同诱导小鼠细胞免疫应答的比较
材料与仪器:
实验动物、主要试剂和仪器同实验例1。
实验材料:基因工程(CHO细胞)乙型肝炎疫苗[Recombinant Hepatitis BVaccine(CHO)],10μg/1.0ml,注射用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子[Recombinant Human Granulocyte/Macrophage Colony-Stimulating Factor forInjection](以后简称rhGm-csf),300μg/支,CHO表达的基因工程乙型肝炎疫苗原液(HBsAg原液)均由华北制药集团金坦生物技术有限公司生产;重组(汉逊酵母)乙型肝炎疫苗[Recombinant Hepatitis B Vaccine(Yeast)](2005030306),10μg/0.5ml,由大连汉信生物制药有限公司生产;重组(酵母)乙型肝炎疫苗[Recombinant Hepatitis B Vaccine(Yeast)](2005010104),10μg/1.0ml,由北京天坛生物制品股份有限公司生产。
检测方法:
1.脾细胞增殖实验检测方法同实验例1。
2.细胞毒T细胞(CTL)功能测定方法——乳酸脱氢酶(LDH)释放实验同实验例1。
3.细胞毒T细胞(CTL)功能测定方法——MTT法同实验例1。
4.抗体IgG1、IgG2a亚型滴度检测方法同实验例1。
实验方法:
1.将BALB/C小鼠,随机分为4组,每组6只,分别为:空白对照组:连续四天给予生理盐水0.2ml/只;CHO细胞疫苗组:连续三天给予rhGm-csf(10μg/只/天)后,给予华北制药集团金坦生物技术有限公司生产的CHO细胞表达乙型肝炎疫苗(2μg/只);汉逊酵母疫苗组:连续三天给予rhGm-csf(10μg/只/天)后,给予大连汉信生物制药有限公司生产的汉逊酵母表达乙型肝炎疫苗(2μg/只);啤酒酵母疫苗组:连续三天给予rhGm-csf(10μg/只/天)后,给予北京天坛生物制品股份公司生产的酵母表达乙型肝炎疫苗(2μg/只)。14天后同样方法加强免疫一次,并在二次免疫后7天放血处死,用CHO表达的HBsAg 10μg/ml,作抗原刺激物,检测脾细胞增殖情况(见检测方法1)。
2.将BALB/C小鼠,随机分为4组,每组6只,分别为:空白对照组:连续四天给予生理盐水0.2ml/只;CHO细胞疫苗组:连续三天给予rhGm-csf(10μg/只/天)后,给予华北制药集团金坦生物技术有限公司生产的CHO细胞表达乙型肝炎疫苗(2μg/只);汉逊酵母疫苗组:连续三天给予rhGm-csf(10μg/只/天)后,给予大连汉信生物制药有限公司生产的汉逊酵母表达乙型肝炎疫苗(2μg/只);啤酒酵母疫苗组:连续三天给予rhGm-csf(10μg/只/天)后,给予北京天坛生物制品股份公司生产的酵母表达乙型肝炎疫苗(2μg/只)。14天后同样方法加强免疫一次,并在二次免疫后7天放血处死,测定细胞毒T细胞(CTL)功能(见检测方法2、3)。
3.将“实验方法1中:放血处死”的小鼠血清收集到离心管中,3000rpm离心15分钟,分离血清,抗体IgG1、IgG2a亚型滴度检测(见检测方法4)。
统计分析方法:
实验组与对照组比较用t检验判断有无显著性差异。
实验结果:
1.脾细胞增殖反应实验:
二次免疫后7天,三个实验组小鼠的脾细胞增殖率均高于空白对照组,而CHO细胞疫苗组小鼠的脾细胞增殖率明显高于啤酒酵母疫苗组和汉逊酵母疫苗组,见表10。
表10不同实验组小鼠脾细胞增殖情况
分 组 |
特异性增殖率(%) |
空白对照组CHO细胞疫苗组啤酒酵母疫苗组汉逊酵母疫苗组 |
8.551.429.6**24.9** |
**与CHO细胞疫苗组P<0.01
2.细胞毒T细胞(CTL)功能测定
(1)乳酸脱氢酶(LDH)释放实验
在三个效应细胞(E)与靶细胞(T)配比(20∶1、50∶1、100∶1)中,三个实验组小鼠的脾细胞细胞毒T细胞(CTL)功能均高于空白对照组,而CHO细胞疫苗组和啤酒酵母疫苗组小鼠的脾细胞细胞毒T细胞(CTL)功能明显高于汉逊酵母疫苗组,说明CHO细胞疫苗组和啤酒酵母疫苗组小鼠的脾细胞细胞毒T细胞(CTL)功能均明显高于汉逊酵母疫苗组,见表11。
表11不同实验组小鼠脾细胞乳酸脱氢酶(LDH)释放率(%)(X±S)
分 组 |
20∶1 |
50∶1 |
100∶1 |
空白对照组CHO细胞疫苗组啤酒酵母疫苗组汉逊酵母疫苗组 |
4.383±0.8386.496±0.7976.965±2.6864.806±2.099 |
6.575±1.30712.054±2.60112.426±5.2129.354±3.455 |
8.384±1.76519.556±2.278**18.921±1.660**14.484±2.400 |
**与汉逊酵母疫苗组P<0.01
(2)MTT法
通过对活细胞的分析,在三个效应细胞(E)与靶细胞(T)配比(20∶1、50∶1、100∶1)中,三个实验组小鼠的脾细胞细胞毒T细胞(CTL)功能均高于空白对照组,见表12。
表12不同实验组小鼠脾细胞对靶细胞杀伤率(%)(X±S)
分 组 |
20∶1 |
50∶1 |
100∶1 |
空白对照组CHO细胞疫苗组啤酒酵母疫苗组汉逊酵母疫苗组 |
6.187±1.76115.853±1.79315.215±2.61014.345±0.912 |
7.436±1.23923.760±2.85921.941±4.46420.113±2.169 |
10.474±2.36731.363±4.20430.065±2.97228.215±2.207 |
3.抗体IgG1、IgG2a亚型滴度:
CHO细胞疫苗IgG1含量是啤酒酵母疫苗的1.4倍,是汉逊酵母疫苗的5.2倍;CHO疫苗IgG2a含量是啤酒酵母疫苗的9.7倍,是汉逊酵母疫苗的565.6倍;见表13。
表13抗体IgG1、IgG2a亚型滴度
分 组 |
IgG1 |
IgG2a |
空白对照组CHO细胞疫苗组啤酒酵母疫苗组汉逊酵母疫苗组 |
045434.1±52098.833344.0±41951.38686.1±23690.9 |
0452.5±482.946.6±514.20.8±0.9 |
实验例4:重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子与三种来源的基因工程乙型肝炎疫苗协同诱导小鼠体液免疫应答的比较
材料与仪器:
实验动物、主要试剂和仪器同实验例1。
实验材料同实验例3。
检测方法:
1.血清抗体滴度测定方法同实验例2。
实验方法:
将BALB/C小鼠,随机分为3组,每组10只,分别为:CHO细胞疫苗组:皮下给予华北制药集团金坦生物技术有限公司生产的CHO细胞表达乙型肝炎疫苗(1μg/只),同时给予10μg/只rhGm-csf;汉逊酵母疫苗组:皮下给予大连汉信生物制药有限公司生产的汉逊酵母表达的乙型肝炎疫苗(1μg/只),同时给予10μg/只rhGm-csf;啤酒酵母疫苗组:皮下给予北京天坛生物制品股份公司生产的啤酒酵母表达的乙型肝炎疫苗(1μg/只),同时给予10μg/只rhGm-csf。分别在第0、14天皮下注射乙型肝炎疫苗。分别于初次免疫后,每周眼眶采血约200ul,3000rpm离心15分钟,分离血清,检测抗体滴度(见检测方法1)。
统计分析方法
实验组与对照组小鼠血清抗-HBsAg抗体的几何均数用t检验判断有无显著性差异。
实验结果:
1.初次免疫后7天
CHO细胞疫苗组的10只小鼠,有9只血清中抗HBsAg抗体呈阳性,1只为阴性,阳性率为90%;汉逊酵母疫苗组的10只小鼠,仅有1只血清中抗HBsAg抗体呈阳性,9只为阴性,阳性率为10%;啤酒酵母疫苗组的10只小鼠,没有1只血清中抗HBsAg抗体呈阳性,10只均为阴性,阳性率为0;经卡方检验,CHO细胞疫苗组与汉逊酵母疫苗组和啤酒酵母疫苗组相比有显著性差异(P<0.01),见表14。
表14初次免疫后7天血清中抗体情况
分 组 |
阳性数(只) |
阴性数(只) |
阳性率(%) |
卡方检验 |
CHO细胞疫苗组汉逊酵母疫苗组啤酒酵母疫苗组 |
910 |
1910 |
90100 | 卡方值:12.80 P=3.47E-04卡方值:16.36 P=5.23E-05 |
2.初次免疫后14天
CHO细胞疫苗组的10只小鼠,有10只血清中抗HBsAg抗体呈阳性,阳性率为100%;汉逊酵母疫苗组的10只小鼠,有4只血清中抗HBsAg抗体呈阳性,6只为阴性,阳性率为40%;啤酒酵母疫苗组的10只小鼠,有4只血清中抗HBsAg抗体呈阳性,6只为阴性,阳性率为40%;经卡方检验,CHO细胞疫苗组与汉逊酵母疫苗组和啤酒酵母疫苗组相比有显著性差异(P<0.01),见表15。
表15初次免疫后14天血清中抗体情况
分 组 |
阳性数(只) |
阴性数(只) |
阳性率(%) |
卡方检验 |
CHO细胞疫苗组汉逊酵母疫苗组啤酒酵母疫苗组 |
1066 |
044 |
1006060 | 卡方值:6.76 P=9.30E-03卡方值:6.76 P=9.30E-03 |
3.二次免疫后7天
三个实验组小鼠血清中抗HBsAg抗体均呈阳性,阳性率为100%,见表16;三个实验组小鼠血清抗体滴度无显著性差异,见表17。
表16二次免疫后7天血清中抗体情况
分 组 |
阳性数(只) |
阴性数(只) |
阳性率(%) |
CHO细胞疫苗组汉逊酵母疫苗组啤酒酵母疫苗组 |
101010 |
000 |
100100100 |
表17二次免疫后7天血清中抗体滴度
分 组 |
miu/ml |
CHO细胞疫苗组汉逊酵母疫苗组啤酒酵母疫苗组 |
3719.131±8020.3043745.281±5857.6282713.725±4331.869 |
4.二次免疫后,三个实验组小鼠血清中抗体持续增加,第12周CHO细胞疫苗组的达到峰值,分别为汉逊酵母疫苗组和啤酒酵母疫苗组的2.5倍和2.2倍,见附图4。
实验例5:重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子不同注射次数与基因工程乙型肝炎疫苗协同诱导小鼠细胞免疫应答的比较
材料与仪器:
实验动物、实验材料、主要试剂和仪器同实验例1。
检测方法:
1.脾细胞增殖实验检测方法同实验例1。
2.细胞毒T细胞(CTL)功能测定方法——乳酸脱氢酶(LDH)释放实验同实验例1。
3.细胞毒T细胞(CTL)功能测定方法——MTT法同实验例1。
4.抗体IgG1、IgG2a亚型滴度检测方法同实验例1。
实验方法:
1.将BALB/C小鼠,随机分为4组,每组6只,分别为:疫苗组:给予基因工程乙型肝炎疫苗2μg/只;GM高剂量组:给予基因工程乙型肝炎疫苗(2μg/只)前七天,连续七天给予rhGm-csf,20μg/只/天;GM中剂量组:给予基因工程乙型肝炎疫苗(2μg/只)前三天,连续三天给予rhGm-csf,20μg/只/天;GM低剂量组:给予基因工程乙型肝炎疫苗(2μg/只)前一天,给予rhGm-csf,20μg/只/天;初次免疫14天后,加强免疫1次。并在二次免疫后14天放血处死,用CHO表达的HBsAg 10μg/ml,作抗原刺激物,检测脾细胞增殖情况(见检测方法1)。
2.将BALB/C小鼠,随机分为4组,每组6只,分别为:疫苗组:给予基因工程乙型肝炎疫苗2μg/只;GM高剂量组:给予基因工程乙型肝炎疫苗(2μg/只)前七天,连续七天给予rhGm-csf,20μg/只/天;GM中剂量组:给予基因工程乙型肝炎疫苗(2μg/只)前三天,连续三天给予rhGm-csf,20μg/只/天;GM低剂量组:给予基因工程乙型肝炎疫苗(2μg/只)前一天,给予rhGm-csf,20μg/只/天;初次免疫14天后,加强免疫1次。并在二次免疫后14天放血处死,测定细胞毒T细胞(CTL)功能(见检测方法2、3)。
3.将“实验方法1中:放血处死”的小鼠血清收集到离心管中,3000rpm离心15分钟,分离血清,抗体IgG1、IgG2a亚型滴度检测(见检测方法4)。
统计分析方法:
实验组与对照组比较用t检验判断有无显著性差异。
实验结果:
1.脾细胞增殖反应实验:
二次免疫后14天,三个不同剂量GM+疫苗组小鼠的脾细胞增殖率均高于疫苗组,且与剂量相关,见表18。
表18不同实验组小鼠脾细胞增殖情况
分 组 |
特异性增殖率(%) |
疫苗组GM高剂量组GM中剂量组GM低剂量组 |
70.4153.9**115.2**95.2 |
**与疫苗组相比P<0.01
2.细胞毒T细胞(CTL)功能测定
(1)乳酸脱氢酶(LDH)释放实验
在三个效应细胞(E)与靶细胞(T)配比(20∶1、50∶1、100∶1)中,三个不同剂量GM+疫苗组小鼠的脾细胞细胞毒T细胞(CTL)功能均高于疫苗组,且与剂量相关,见表19。
表19不同实验组小鼠脾细胞乳酸脱氢酶(LDH)释放率(%)(X±S)
分 组 |
20∶1 |
50∶1 |
100∶1 |
疫苗组GM高剂量组GM中剂量组GM低剂量组 |
2.639±0.7847.203±1.095**5.630±0.846**4.498±1.219* |
7.940±1.98320.423±5.135**16.835±3.001**8.138±2.456* |
9.278±1.61746.090±1.585**30.820±7.182**17.925±2.780* |
*与疫苗组相比P<0.05,**与疫苗组相比P<0.01
(2)MTT法
通过对活细胞的分析,在三个效应细胞(E)与靶细胞(T)配比(20∶1、50∶1、100∶1)中,三个不同剂量GM+疫苗组小鼠的脾细胞细胞毒T细胞(CTL)功能均高于疫苗组,见表20。
表20不同实验组小鼠脾细胞对靶细胞杀伤率(%)(X±S)
分 组 |
20∶1 |
50∶1 |
100∶1 |
疫苗组GM高剂量组GM中剂量组GM低剂量组 |
19.902±2.10135.078±3.379**31.283±9.273*28.328±11.184* |
26.845±12.02142.386±10.533*44.332±7.770**39.945±9.843 |
51.889±5.16760.105±8.020*61.645±9.072*54.716±14.473 |
*与疫苗组相比P<0.05,**与疫苗组相比P<0.01
3.抗体IgG1、IgG2a亚型滴度:
三个不同剂量GM+疫苗组小鼠的抗体IgG2a亚型滴度均高于疫苗组,其中GM高剂量组显著高于疫苗组,是疫苗组的4.3倍;见表21。
表21抗体IgG1、IgG2a亚型滴度
分 组 |
IgG1 |
IgG2a |
疫苗组GM高剂量组GM中剂量组GM低剂量组 |
160000.0±122202.054719.2±24440.4148530.8±126996.1117889.0±40265.8 |
1269.9±1385.65515.4±739.0**1871.4±3041.41485.3±3240.1 |
**与疫苗组相比P<0.01
实验例6:重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子与不同剂量的基因工程乙型肝炎疫苗协同诱导小鼠细胞免疫应答的比较
材料与仪器:
实验动物、实验材料、主要试剂和仪器同实验例1。
检测方法:
1.脾细胞增殖实验检测方法同实验例1。
2.细胞毒T细胞(CTL)功能测定方法——乳酸脱氢酶(LDH)释放实验同实验例1。
3.细胞毒T细胞(CTL)功能测定方法——MTT法同实验例1。
4.抗体IgG1、IgG2a亚型滴度检测方法同实验例1。
实验方法:
1.将BALB/C小鼠,随机分为4组,每组6只,分别为:疫苗组:给予基因工程乙型肝炎疫苗2μg/只;GM+疫苗高剂量组:给予基因工程乙型肝炎疫苗(4μg/只)前三天,连续三天给予rhGm-csf,20μg/只/天;GM+疫苗中剂量组:给予基因工程乙型肝炎疫苗(2μg/只)前三天,连续三天给予rhGm-csf,20μg/只/天;GM+疫苗低剂量组:给予基因工程乙型肝炎疫苗(1μg/只)前三天,连续三天给予rhGm-csf,20μg/只/天;初次免疫14天后,加强免疫1次。并在二次免疫后14天放血处死,用CHO表达的HBsAg 10μg/ml,作抗原刺激物,检测脾细胞增殖情况(见检测方法1)。
2.将BALB/C小鼠,随机分为4组,每组6只,分别为:疫苗组:给予基因工程乙型肝炎疫苗2μg/只;GM+疫苗高剂量组:给予基因工程乙型肝炎疫苗(4μg/只)前三天,连续三天给予rhGm-csf,20μg/只/天;GM+疫苗中剂量组:给予基因工程乙型肝炎疫苗(2μg/只)前三天,连续三天给予rhGm-csf,20μg/只/天;GM+疫苗低剂量组:给予基因工程乙型肝炎疫苗(1μg/只)前三天,连续三天给予rhGm-csf,20μg/只/天;初次免疫14天后,加强免疫1次。并在二次免疫后14天放血处死,测定细胞毒T细胞(CTL)功能(见检测方法2、3)。
3.将“实验方法1中:放血处死”的小鼠血清收集到离心管中,3000rpm离心15分钟,分离血清,抗体IgG1、IgG2a亚型滴度检测(见检测方法4)。
统计分析方法:
实验组与对照组比较用t检验判断有无显著性差异。
实验结果:
1.脾细胞增殖反应实验:
二次免疫后14天,GM+不同剂量疫苗的三个实验组小鼠的脾细胞增殖率均高于疫苗组,且与剂量相关,见表22。
表22不同实验组小鼠脾细胞增殖情况
分 组 |
特异性增殖率(%) |
疫苗组GM+疫苗高剂量组GM+疫苗中剂量组GM+疫苗低剂量组 |
45.786.8**74.6*68.7** |
*与疫苗组相比P<0.05,**与疫苗组相比P<0.01
2.细胞毒T细胞(CTL)功能测定
(1)乳酸脱氢酶(LDH)释放实验
在三个效应细胞(E)与靶细胞(T)配比(20∶1、50∶1、100∶1)中,GM+三个不同剂量疫苗的实验组小鼠的脾细胞细胞毒T细胞(CTL)功能均高于疫苗组,且与剂量相关,见表23。
表23不同实验组小鼠脾细胞乳酸脱氢酶(LDH)释放率(%)(X±S)
分 组 |
20∶1 |
50∶1 |
100∶1 |
疫苗组GM+疫苗高剂量组GM+疫苗中剂量组GM+疫苗低剂量组 |
3.386±2.1158.981±3.227**6.679±1.295**5.292±0.968 |
7.968±2.34112.274±3.327**10.461±2.1888.600±1.787 |
8.510±2.44618.248±4.759**13.579±2.801**11.892±2.960 |
**与疫苗组相比P<0.01
(2)MTT法
通过对活细胞的分析,在三个效应细胞(E)与靶细胞(T)配比(20∶1、50∶1、100∶1)中,GM+三个不同剂量疫苗的实验组小鼠的脾细胞细胞毒T细胞(CTL)功能均高于疫苗组,见表24。
表24不同实验组小鼠脾细胞对靶细胞杀伤率(%)(X±S)
分 组 |
20∶1 |
50∶1 |
100∶1 |
疫苗组GM+疫苗高剂量组GM+疫苗中剂量组GM+疫苗低剂量组 |
21.490±9.21935.183±12.88134.361±12.89229.779±6.580 |
23.651±5.38647.766±11.690**44.001±12.832**39.977±20.607 |
33.776±9.66057.679±7.045**53.004±14.382*46.933±12.388 |
*与疫苗组相比P<0.05,**与疫苗组相比P<0.01
3.抗体IgG1、IgG2a亚型滴度:
GM+三个不同剂量疫苗的实验组小鼠的血清抗体IgG2a亚型滴度均高于疫苗组,其中GM高剂量组显著高于疫苗组,是疫苗组的4.0倍;见表25。
表25抗体IgG1、IgG2a亚型滴度
分 组 |
IgG1 |
IgG2a |
疫苗组GM+疫苗高剂量组GM+疫苗中剂量组GM+疫苗低剂量组 |
812749.0±295603.31625499.0±591206.71024000.0±782092.9322540.0±147801.7 |
8063.5±5542.632253.9±14780.2*20318.7±7390.110159.0±11085.1 |
*与疫苗组相比P<0.05
实验结论:
综合上述实验结果,得到以下结论:GM+疫苗组,初次免疫后7天开始,血清抗体滴度比较高,血清抗体中IgG2a占优势,小鼠脾细胞增殖速度最快,比疫苗组高出21.8%;在四个效应细胞(脾细胞)与靶细胞配比中,细胞毒T细胞(CTL)功能均高于其他组,其中E∶T=100∶1的GM+疫苗组有显著性差异。结果表明,提前给予rhGm-csf,再给予基因工程乙型肝炎疫苗,可以刺激动物产生细胞免疫,同时可以提高体内血清中抗体滴度。
混合疫苗组,初次免疫后7天开始,小鼠血清抗体滴度为最高,直至免疫后35天混合疫苗组仍为最高;二次免疫14天后血清中抗体的含量与其他组相比有显著性提高。结果表明,同时给予rhGm-csf和基因工程乙型肝炎疫苗可以促进机体的体液免疫,增加抗体产生。