CN1557487A - 预防和治疗疾病的免疫原性组合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种预防和治疗疾病的免疫原性组合物及其制备方法，主要是由特异性抗原、抗体、抗独特型抗体、重组DNA和药用敷料组成。本发明具有疗效确切、特异性强、决定簇广并能进行集约化大规模生产的优点，尤其是能避免HAMA反应和异质性问题，且无毒副作用、安全性好。适用于作为人类恶性肿瘤、传染性疾病、自身免疫病、过敏性疾病和器官移植排斥的治疗性疫苗以及食品、保健品添加剂；还适用于作为畜禽传染病的治疗性疫苗以及畜禽饲料添加剂。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种预防和治疗疾病的免疫原性组合物及其制备方法，另外还涉及该预防和治疗疾病的免疫原性组合物的用途。
背景技术
目前针对于恶性肿瘤、传染性疾病、自身免疫病、过敏性疾病、器官移植排斥等疾病的治疗尚无特效药物，多应用抗癌药物、抗病毒药物、免疫抑制剂等对上述疾病进行对症治疗，在临床使用过程中，上述药物常产生严重的毒副作用以及过敏反应，并很容易产生耐药性，给临床有效治疗上述疾病带来了一定的困难。近年来，对上述疾病治疗药物的研究重点逐渐转移到生物技术药物领域。
特异性抗体的制备对相关疾病的诊断、治疗和预防具有重要意义，因而受到国内外生物医学界的广泛关注，已开展了大量的工作并取得了较大的进展。在现有技术中多采用单克隆抗体应用于疾病的诊断和生物治疗，其中单克隆抗体的制备方法一般包括获取疾病相关抗原、免疫小鼠和融合杂交瘤三个步骤，亦即a)首先利用生化和免疫化学的方法获取携带有疾病相关信息的抗原，b)然后将该疾病相关抗原多次重复注射入小鼠体内，待小鼠发生特异性免疫反应一定时间后，取出其脾脏并分离出带有疾病相关抗原信息的致敏淋巴细胞，再将该致敏淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞，再筛选出针对于疾病相关抗原的阳性杂交瘤细胞进行体外扩增或接种于小鼠腹腔内，即可从培养上清液或小鼠腹水中获得所需的单克隆抗体。
单克隆抗体作为治疗剂的研究也于近年获得重要进展。单抗药物(monoclonal antibody agents)可应用于治疗肿瘤、病毒性感染、心血管病以及其它疾患，尤其是用于传染性疾病的治疗，已显示出良好的应用前景。
抗体药物一般包括两类，一是抗病原体单克隆抗体(简称单抗)或多克隆抗体(简称多抗)；二是抗病原体单抗或多抗偶联物，或称免疫偶联物(immunoconjugate)。免疫偶联物分子由单抗或多抗与“弹头”药物两部分构成，故称为导向药物，又称为生物导弹或“魔弹”(magic bullets)，与之相对应的治疗方法称为导向治疗。单抗或多抗所针对的靶标通常为病原体表面的相关抗原或特定的受体。用作“弹头”的物质主要有三类，即放射性核素、药物和毒素，其与单抗或多抗连接分别构成放射免疫偶联物、化学免疫偶联物和免疫毒素。自80年代以来，对抗病原体尤其是抗肿瘤单抗药物进行了大量研究，特别是自1997年以来，Rituxan、Herceptin在美国相继获批准用于临床肿瘤治疗，单抗药物的研究与开发有了新的发展势头，成为生物技术药物的新热点(甄永苏，单克隆抗体药物治疗肿瘤的研究现状与展望，中国医学科学院学报，2000，22：9-12)。
尽管单抗药物的临床研究结果已为其应用于治疗肿瘤展示出良好的前景，但仍有许多问题需要进一步研究解决(Nguyen DT，Amess JA，Doughty H，et al.IDEC-C2B8 anti-CD20(rituxmab)immunotherapy in patients with low-grade non-Hodgkin′s lymphoma and lymphoproli ferative disorders：evaluation of response on 48 patients.Eur J Haematol，1999，62：76-82)。单抗药物存在的问题主要涉及免疫学和药理学两方面。免疫学方面的问题关键是人抗鼠Ig抗体(HAMA)反应，因为多年来用于临床研究的单抗药物多数使用小鼠单抗制备，往往导致HAMA反应。此外，病原体在抗原性方面的异质性，病原体的抗原性调变等也能影响单抗药物的疗效。药理学方面的问题主要是到达病原体的药量不足。单抗药物在体内运送过程中受多种因素影响。由于它是异体蛋白，会被网状内皮系统摄取，有相当数量将积聚于肝、脾和骨髓；再者就是机体对该异体蛋白产生抗体而降低其效力。单抗药物是大分子物质，通过毛细血管内皮层以及穿透病变部位均受到限制。(甄永苏，单克隆抗体药物治疗肿瘤的研究现状与展望，中国医学科学院学报，2000，22：9-12)。
疾病的免疫治疗是利用病原体免疫原进行主动免疫来激发、增强机体对病原体的主动特异性免疫反应。目前所研究的病原体疫苗主要是基因工程疫苗、肽疫苗、核酸疫苗、抗独特型抗体疫苗。其中a)病原体基因工程疫苗是通过基因重组技术，将目的基因导入受体细胞而制备的疫苗。b)肽疫苗是基于在免疫反应中抗原在胞浆内降解为短肽，最后形成肽-MHC-TCR复合体最终激发细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应。c)核酸疫苗是由编码能引起保护性免疫反应的抗原基因片段和载体构建而成的，包括DNA疫苗和RNA疫苗，目前研究较多的为DNA疫苗。核酸疫苗能够同时刺激机体产生体液免疫和细胞免疫反应，诱导许多亚单位疫苗不能诱导的CTL效应。d)抗独特型抗体疫苗(Ab2疫苗)是根据抗独特型抗体具有模拟抗原及免疫调节的双重作用，同时能克服机体免疫抑制，打破免疫耐受故能代替病原体抗原诱发特异性主动免疫反应(Bhattacharya CM，Mukerjee S，biddle W，et al.Murine monoclonalanti-idiotype antibldy as a potential netword antigen for human carcinoembryonic antigen.J Immumol，1990，145：2758.)。
在上述病原体疫苗免疫治疗方法中，由于病原体抗原的抗原性强弱不同，且病原体宿主经常处于免疫抑制状态，难以激发有效的抗病原体反应。尽管抗独特型抗体的研究已取得许多进展，但事物总是两方面的。Ab2疫苗应用存在许多困难，因为抗独特型抗体β(Ab2β)虽能模拟小分子多肽抗原，却难以精确反映大分子蛋白质抗原的决定簇，尤其是Ab2β单抗。再者由于病原体抗原极其复杂，常发生调变等，制备广谱的病原体特异性独特型疫苗难度很大。更重要的是目前使用的Ab2β主要来自鼠杂交瘤细胞，为异种蛋白，能激发人免疫系统产生人抗鼠Ig抗体(HAMA)，发生中和反应并产生毒性免疫复合物，而降低疗效，严重时可引起血清病反应。
禽类尤其是鸡在系统发育上与哺乳动物有很大差异，鸡的免疫球蛋白与哺乳动物免疫球蛋白在免疫学特性上也有很大不同。鸡的免疫系统能识别更多的免疫反应位点和更多的抗原决定簇，因此鸡免疫系统对哺乳动物的蛋白或生物分子能产生具有更高效价和亲和力的特异性抗体。鸡免疫系统针对于外源性蛋白所产生的IgY不仅具有更高的免疫特异性，更重要的是这种特异性IgY主要储存在鸡蛋黄中，因此可利用下蛋母鸡作为免疫反应器来大量生产具有重要临床应用价值的抗体药物。
众所周知鸡蛋作为人类的常用食品和化妆品原料，无论内服和外用均对人体无任何生物毒性和不良作用。因此，利用禽类作为免疫反应器来大量生产抗体药物，并应用于疾病的诊断和免疫治疗，将具有极广阔的应用前景。以疾病特异性蛋黄抗体IgY为原料制备的免疫药物和抗独特型抗体疫苗(Ab2疫苗)可以很好地解决上述单抗偶联物或上述病原体疫苗所存在的HAMA反应和异质性问题。
授权中国专利申请号93112409.3公开了“一种新型免疫原性复合物制剂及制备方法”，本发明由抗原与抗体组建，抗原量多于抗体量，利用抗原抗体复合物为载体，携带抗原，改变抗原提呈形式，增强机体免疫性。本发明采用血源纯化乙肝表面抗原，很难避免其潜在的感染性。况且该复合物是一种抗原抗体复合物，而不是抗原、抗体、抗独特性抗体和重组DNA复合物。
授权中国专利申请号97106291.9公开了“抗原-抗体-重组DNA复合型疫苗”，本发明由微生物抗原-抗体与带有编码微生物的一种或几种基因的重组质粒DNA制备成复合型疫苗，通过诱生对微生物感染处于免疫应答低下或免疫耐受者产生应答，可显著提高机体的特异性体液免疫与细胞免疫，具有抗原提呈形式多，诱生免疫应答速度快，而且用量少，稳定性高等特点。本发明采用基因重组乙肝表面抗原和抗体，再加入乙肝DNA重组质粒。该方法需要基因工程技术，技术工艺周期长，难度大，况且该复合物是一种抗原-抗体-重组DNA复合物，而不是抗原、抗体、抗独特性抗体和重组DNA复合物。
中国专利申请号02113744.7公开了“抗禽类病毒性疫病的复合卵黄抗体及其制备和应用”，是由蛋黄抗肠毒素免疫球蛋白、卵转铁蛋白、溶菌酶和余量的水分、灰分及微量元素组成的蛋白复合物，而不是抗原、抗体、抗独特性抗体和重组DNA复合物。
中国专利申请号00125941.5公开了“蛋黄免疫活性蛋白复合物”，是由具有抗体活性的抗禽流感、新城疫的鸡卵黄抗体(抗-ANIgY)组成的抗体复合物，也不是抗原、抗体、抗独特性抗体和重组DNA复合物。
在现有技术中，单克隆抗体药物和疫苗为两大类相互独立的免疫药物，其中单克隆抗体药物用于免疫治疗，疫苗用于免疫预防。临床通常是分别单独使用，其中疫苗用于未病先预防，而单克隆抗体药物则主要施用于已病患者，但是，在临床上很难及时判断出就诊者是未发病还是已发病，当就诊者处于观察期或疾病处于窗口期时，是施用疫苗还是施用抗体药物就变得非常难把握，假如对未病者施用抗体药物，不但会造成浪费而且又不能起到预防的目的；如果对已病者施用疫苗，不但达不到预防的目的而又失去了早期治疗的机会，因此临床急需一种能够真正实现有病治病未病预防的复合型抗体药物。另外，对于减毒或灭活病原体疫苗的使用，还会给患者带来潜在感染的隐患，再者就是基因重组亚单位疫苗所存在的的免疫作用不完全等问题。因此研制开发一种既能治病又能防病、安全高效的治疗性疫苗已成为生物技术领域的重大课题。
发明目的
本发明的目的在于克服上述现有技术的缺点与不足，提供一种预防和治疗疾病的免疫原性组合物，主要是由有效量的抗原、抗体、抗独特型抗体、重组DNA和药用敷料组成。以达到既能治病又能防病的目的。该预防和治疗疾病的免疫原性组合物用于作为疾病生物预防和治疗剂，能显著增强机体对疾病相关病原体的特异性体液和细胞免疫反应，且疗效确切、快速和全面，适用于作为人类肿瘤、传染性疾病、自身免疫病、过敏性疾病和器官移植排斥的治疗性疫苗以及食品、保健品添加剂；也适用于作为畜禽传染病的治疗性疫苗和畜禽饲料添加剂。
本发明的另一目的还在于预防和治疗疾病的免疫原性组合物的制备方法。
本发明的另一目的还在于预防和治疗疾病的免疫原性组合物的用途。
技术方案
本发明的技术方案是这样实现的：一种预防和治疗疾病的免疫原性组合物，主要是由抗原、抗体和重组DNA组成，其特征在于：由有效量的抗原、抗体、抗独特型抗体、重组DNA和药用敷料组成，其中抗原、抗体、抗独特型抗体是纯化或重组的特异性抗原、抗体、抗独特型抗体，重组DNA是能够表达所述特异性抗原、抗体和抗独特型抗体中的任一种或其多种的重组DNA质粒。
根据本发明，其特征还在于：在该免疫原性组合物中各组分重量比分别为：
抗原 0.001～99％
抗体 0.001～99％
抗独特型抗体 0.001～99％
重组DNA 0.01～99％
药用敷料 0.01～99％
其中以预防为目的者，抗原+抗独特型抗体+重组DNA的量(w/w)＞抗体的量；以治疗为目的者，抗体的量(w/w)＞抗原+抗独特型抗体+重组DNA的量；以预防性治疗或早期治疗为目的者，抗体的量(w/w)＝抗原+抗独特型抗体+重组DNA的量。
根据本发明，其特征还在于：在该免疫原性组合物中还含有特异性抗原(Ag)、抗体(Ab)和抗独特型抗体(Ab2)特异性结合后所形成的免疫复合物；所述抗独特型抗体包括抗独特型抗体α(Ab2α)、抗独特型抗体β(Ab2β)、抗独特型抗体γ(Ab2γ)、抗独特型抗体ε(Ab2ε)中的任一种或其组合；所述免疫复合物包括抗原-抗体复合物(Ag-Ab)、抗原-抗体-抗独特型抗体复合物(Ag-Ab-Ab2α、Ag-Ab-Ab2β、Ag-Ab-Ab2γ、Ag-Ab-Ab2ε)和抗体-抗独特型抗体复合物(Ab-Ab2α、Ab-Ab2β、Ab-Ab2γAb-Ab2ε)中的任一种或其组合。
根据本发明，其特征还在于：所述特异性抗原、抗体、抗独特型抗体和重组DNA是分别针对于同一种或同一类疾病相应免疫原的动物源性或人源性特异性抗原、抗体、抗独特型抗体和重组DNA。
根据本发明，其特征还在于：所述抗原、抗体、抗独特型抗体和重组DNA是分别针对于纯化或重组的肿瘤免疫原、传染性疾病病原体免疫原、自身免疫病免疫原、过敏性疾病免疫原、移植器官免疫原和畜禽传染病病原体免疫原的动物源性或人源性抗原、抗体、抗独特型抗体和重组DNA；
上述肿瘤免疫原包括纯化或灭活的肿瘤抗原或细胞、通过基因工程技术重组的肿瘤特异性抗原、多肽或疫苗瘤苗、肿瘤特异性DNA或mRNA及其与相应载体组成的重组体、针对于肿瘤特异性抗原的单克隆或多克隆抗体、针对于肿瘤特异性抗体的抗独特性抗体；以及上述肿瘤免疫原的纳米微粒或脂质体复合物；
上述传染性疾病病原体免疫原包括纯化或灭活的病原体、纯化或重组的病原体抗原、多肽或疫苗、病原体特异性DNA或mRNA及其与相应载体组成的重组体、针对于病原体特异性抗原的单克隆或多克隆抗体、针对于传染性疾病病原体特异性抗体的抗独特性抗体；以及上述传染性疾病病原体免疫原的纳米微粒或脂质体复合物；
上述过敏性疾病免疫原包括纯化或重组的变应原、多肽、变应原特异性DNA或mRNA及其与相应载体组成的重组体、针对于变应原的单克隆或多克隆抗体、针对于变应原特异性抗体的抗独特性抗体；以及上述过敏性疾病免疫原的纳米微粒或脂质体复合物；
上述自身免疫病免疫原包括纯化或重组抗原、多肽、自身抗原或疫苗、细胞因子靶向抗原、自身免疫病特异性DNA或mRNA及其与相应载体组成的重组体、针对于自身免疫病特异性抗原和细胞因子靶向抗原的单克隆或多克隆抗体、针对于自身抗原和细胞因子靶向抗原特异性抗体的抗独特性抗体；以及上述自身免疫病免疫原的纳米微粒或脂质体复合物；所述细胞因子靶向抗原包括人类白细胞分化抗原CD、粘附分子、补体、细胞因子及其受体、免疫球蛋白超家族；所述细胞因子及其受体包括白细胞介素(IL)及其受体、集落刺激因子(CSF)及其受体、肿瘤坏死因子(TNF)及其受体、趋化因子及其受体；
上述移植器官免疫原包括移植器官供体或移植器官受体的纯化或重组抗原、多肽、自身抗原或疫苗、细胞因子靶向抗原、自身免疫病特异性DNA或mRNA及其与相应载体组成的重组体、针对于自身免疫病特异性抗原和细胞因子靶向抗原的单克隆或多克隆抗体、针对于自身抗原和细胞因子靶向抗原特异性抗体的抗独特性抗体；以及上述自身免疫病免疫原的纳米微粒或脂质体复合物； 所述细胞因子靶向抗原包括人类白细胞分化抗原CD、粘附分子、补体、细胞因子及其受体、免疫球蛋白超家族；所述细胞因子及其受体包括白细胞介素(IL)及其受体、集落刺激因子(CSF)及其受体、肿瘤坏死因子(TNF)及其受体、趋化因子及其受体；
上述畜禽传染病病原体免疫原包括纯化或灭活的病原体、纯化或重组的病原体抗原、多肽或疫苗、病原体特异性DNA或mRNA及其与相应载体组成的重组体、针对于病原体特异性抗原的单克隆或多克隆抗体、针对于畜禽传染病病原特异性抗体的抗独特性抗体；以及上述畜禽传染病病原体免疫原的纳米微粒或脂质体复合物；
上述抗原、抗体、抗独特型抗体是通过分离、纯化和基因工程技术包括噬菌体展示多肽、细菌表面展示多肽和人工合成多肽中的任一种或其组合途径获得的；
根据本发明，其特征还在于：所述的疾病特异性抗独特型抗体(Ab2)是针对于上述疾病免疫原所对应的特异性抗体(Ab)包括蛋黄抗体IgY的抗独特型抗体(Ab2)；所述抗独特型抗体(Ab2)包括抗独特型抗体α(Ab2α)、抗独特型抗体β(Ab2β)、抗独特型抗体γ(Ab2γ)和抗独特型抗体ε(Ab2ε)中的任一种或其组合。
所述抗独特型抗体(Ab2)是针对于外来抗原的抗体分子(Ab1)可变区上独特型(Id)可刺激机体产生相应的抗Id抗体(Ab2)。其中Ab2α属半抗原非抑制性Ab2，具有调节作用，可促进或抑制Ab1克隆；Ab2β具有与外来抗原相似的氨基酸排列顺序或空间构型，它能够在体内模拟始动抗原的作用，故被认为是外部抗原在机体免疫系统中的“内影像”(internal image)，可抑制Ab1与相应抗原的结合反应；Ab2γ属半抗原非抑制性Ab2，能抑制抗原与Ab1的结合，具有调节作用，可促进或抑制带有相应Id克隆细胞增殖；Ab2ε是一种双特异性抗体，又称Epibody，能识别Ab1骨架区上的抗原决定簇，同时又能识别自身或外来抗原上的表位，更有利于上述疾病的免疫治疗。
具有内影像特点的抗独特型抗体能模拟病原体相关抗原诱导机体产生主动免疫应答，其应答过程极其复杂，但主要涉及体液免疫和细胞免疫两方面。Ab2β作为胸腺依赖抗原(TD)激活辅助T淋巴细胞亚群(Th1和Th2)，分泌一系列细胞因子，如Th1细胞产生干扰素-γ(INF-γ)、IL-10、TNF和白细胞介素-2(IL-2)；Th2细胞产生IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等。Th2细胞产生的细胞因子影响和促进B淋巴细胞分化和增殖，产生特异性抗体Ab3，Ab3一部分能与Ab1互相模拟，即具有与抗原结合性，称之为抗病原体抗体(Ab1′)。总Ab3的产生已被证实与微小病原体病灶消退和/或病人病情好转呈正相关。被激活的Th1细胞释放细胞因子，如INF-γ可通过影响NK细胞及T细胞功能而发挥抗病原体效应，IL-2可促进T细胞生长、克隆性扩增而增强机体的免疫功能，亦可诱导或促进多种细胞毒性细胞活性，如自然杀伤细胞(NK)、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)及肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)等，发挥免疫监视及抗病原体效应。同时IL-2还可协同刺激B细胞增殖及分泌抗体，与补体及效应细胞相作用，发挥抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)及补体依赖性细胞毒性(CDC)抗病原体作用(龚非力等，医学免疫学，第二版，武汉：科学出版社，2000)。
人体内免疫系统是一个处于自身动态平衡中的系统。在患者体内的免疫系统中，抗独特型抗体是一个较关键的系统要素，用人为的方法改变抗独特型抗体的质量和数量，必然会使系统发生变化，从而在更高的层次上达到新的平衡。使对病原体免疫的系统平衡按照理论上预测的有利于患者的方向发展变化，在某种意义上这正是抗独特型抗体应用的关键所在。
核酸疫苗主要是DNA疫苗可以引发全面的免疫应答反应。一方面，核酸疫苗导入宿主体内后，被抗原提呈细胞(APC)摄取，表达的蛋白质被细胞内蛋白酶体复合物降解为8～10个氨基酸多肽，多肽被内质网腔上的抗原转运蛋白(TAP)运送进入内质网，在那里与MHC-I类分子及β2-微球蛋白形成三聚体，三聚体移出细胞并定位在细胞膜上，从而诱导MHC-I限制的抗原特异性的CTL，产生细胞免疫；另一方面，胞内表达的蛋白质通过分泌或细胞裂解释放入血，并被专职APC内吞，在其中被降解为12～18个氨基酸的多肽，与此同时，胞浆内质网合成的MHC-II类分子(含α，β，γ三链)也被高尔基体运至内体，在体内，γ链被降解，剩余的MHC-II类分子的α，β链与抗原肽结合成抗原肽-II类分子复合物而提呈于APC表面，成为CD4 +Th细胞免疫监视的靶位，Th细胞分泌淋巴因子，刺激B细胞转化为浆细胞，产生抗体，诱导了抗原特异性的体液免疫应答。
根据本发明，其特征还在于：所述疾病相应免疫原包括肿瘤、传染性疾病、自身免疫病、过敏性疾病、移植器官特异性的纯化或重组抗原、抗体、抗独特型抗体、重组DNA、细胞因子及其受体和组织细胞中的任一种或其任一组合；所述免疫原是蛋白质、多肽、粘多糖、脂多糖、糖蛋白、细胞核、细胞质、细胞膜、细胞表面受体、核蛋白、DNA、RNA、线粒体、微粒体中的任一种或其组合。
根据本发明，其特征还在于：所述的疾病相应免疫原包括畜禽传染病病原体特异性纯化或重组抗原、抗体、抗独特型抗体、重组DNA、细胞因子及其受体和组织细胞中的任一种或其组合；所述免疫原是蛋白质、多肽、粘多糖、脂多糖、糖蛋白、细胞核、细胞质、细胞膜、细胞表面受体、核蛋白、DNA、RNA、线粒体、微粒体中的任一种或其组合。
根据本发明，其特征还在于：在该组合物中还含有药用辅料；所述药用辅料包括包衣材料、蛋白稳定剂、药用佐剂、免疫增强剂，其中包衣材料为丙烯酸树脂、羟丙基甲基纤维素及其衍生物中的任一种或其组合；蛋白稳定剂为聚乙二醇、蔗糖、海藻糖中的任一种或其组合；药用佐剂为氢氧化铝、表面活性剂、弗氏(Freund)佐剂中的任一种；免疫增强剂为多聚糖、糖肽、糖脂和磷脂中的任一种或其组合，其中脂类包括三棕榈酰丝氨酰甘油基半胱氨酸(P3CSS)、单棕榈脂酸、双棕榈脂酸、三棕榈脂酸、棕榈酰赖氨酸、α-氨基十六烷酸(Had、含线性饱和脂性侧链)、月桂酰肽脂中的任一种或其组合；上述脂类是以分子内佐剂的形式与所述本发明中的抗原、抗体、抗独特型抗体和重组DNA结合成复合物。
根据本发明，其特征还在于：所述预防和治疗疾病的免疫原性组合物包括肿瘤特异性免疫原性组合物、传染性疾病病原体特异性免疫原性组合物、自身免疫病特异性免疫原性组合物、过敏性疾病变应原特异性免疫原性组合物、移植器官特异性免疫原性组合物中的任一种或其组合。
上述肿瘤特异性免疫原包括甲胎蛋白AFP、癌胚抗原CEA、绒毛膜促性腺激素HCG、前列腺特异性抗原PSA、卵巢肿瘤相关癌抗原CA125、癌抗原CA15-3、糖链抗原CA19-9、鳞状细胞癌抗原SCC、组织多肽抗原TPA的纯化或重组抗原、抗体、抗独特型抗体及其重组DNA中的任一种；所述肿瘤特异性免疫原性组合物包括上述肿瘤抗原的特异性免疫原性组合物，其中癌胚抗原CEA特异性免疫原性组合物是由癌胚抗原CEA、癌胚抗原蛋黄抗体CEA-IgY、CEA-IgY特异性蛋黄抗独特型抗体、癌胚抗原CEA重组DNA质粒和药用辅料组成，其中各组分重量比分别为：
CEA抗原 0.01～99％
CEA-IgY抗体 0.01～99％
CEA-IgY特异性蛋黄抗独特型抗体 0.01～99％
CEA重组DNA质粒 0.1～99％
药用敷料 0.1～99％
上述传染性疾病特异性免疫原包括艾滋病、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、庚型肝炎、结核、幽门螺杆菌性胃炎、梅毒、淋病等性传播性疾病、病毒性肠炎、病毒性肺炎、病毒性脑炎、支原体、衣原体肺炎、斑疹伤寒、疱疹、风疹、流感及寄生虫感染性疾病病原体的纯化或重组抗原、抗体、抗独特型抗体及其重组DNA中的任一种；所述传染性疾病病原体特异性免疫原性组合物包括上述疾病的病原体特异性免疫原性组合物，其中乙型肝炎病毒特异性免疫原性组合物是由乙肝表面抗原HBsAg、乙肝表面抗原特异性蛋黄抗体IgY、乙肝表面抗体特异性蛋黄抗独特型抗体、乙肝表面抗原重组DNA质粒和药用辅料组成，其中各组分重量比分别为：
乙肝表面抗原HBsAg 0.01～99％
乙肝表面抗原特异性蛋黄抗体IgY 0.01～99％
乙肝表面抗体特异性蛋黄抗独特型抗体 0.01～99％
乙肝表面抗原重组DNA质粒 0.1～99％
药用敷料 0.1～99％
上述自身免疫病特异性免疫原包括多发性硬化症、类风湿关节炎、强直性脊柱炎、系统性红斑狼疮、混合结缔组织病、胰岛素依赖性糖尿病、自身免疫性溶血性贫血、甲状腺功能亢进症、桥本甲状腺炎、干燥综合征疾病相关因子的纯化或重组抗原、抗体、抗独特型抗体及其重组DNA中的任一种；所述自身免疫病特异性免疫原性组合物包括上述疾病的特异性免疫原性组合物，其中类风湿关节炎的免疫原性组合物是由B淋巴细胞表面抗原CD20、CD20-IgY、CD20-IgY特异性蛋黄抗独特型抗体、CD20重组DNA质粒和药用辅料组成，其中各组分重量比分别为：
CD20抗原 0.01～99％
CD20-IgY抗体 0.01～99％
CD20-IgY特异性蛋黄抗独特型抗体 0.01～99％
CD20重组DNA质粒 0.1～99％
药用敷料 0.1～99％
上述过敏性疾病变应原特异性免疫原性组合物包括变应性鼻炎、过敏性哮喘、特应性皮炎、过敏性结膜炎、过敏性胃肠炎的变应原纯化或重组抗原、抗体、抗独特型抗体及其重组DNA中的任一种；所述过敏性疾病变应原特异性免疫原性组合物包括上述疾病的变应原特异性免疫原性组合物，其中变应性鼻炎免疫原性组合物是由变应原尘螨抗原、螨抗体-IgY、螨抗体-IgY特异性蛋黄抗独特型抗体、螨抗原重组DNA质粒和药用辅料组成，其中各组分重量比分别为：
螨抗原 0.01～99％
螨抗体-IgY 0.01～99％
螨抗体-IgY特异性蛋黄抗独特型抗体 0.01～99％
螨抗原重组DNA质粒 0.1～99％
药用敷料 0.1～99％
上述移植器官特异性免疫原性组合物包括肾移植、肝移植、心脏移植、胰腺移植、骨髓移植、干细胞移植中排斥反应因子的纯化或重组抗原、抗体、抗独特型抗体及其重组DNA中的任一种；所述移植器官特异性免疫原性组合物包括上述器官移植排斥反应因子特异性免疫原性组合物，其中肾移植特异性免疫原性组合物是由CD154、CD154-IgY、CD154-IgY特异性蛋黄抗独特型抗体、CD154重组DNA质粒和药用辅料组成，其中各组分重量比分别为：
CD154抗原 0.01～99％
CD154-IgY抗体 0.01～99％
CD154-IgY特异性蛋黄抗独特型抗体 0.01～99％
CD154重组DNA质粒 0.1～99％
药用敷料 0.1～99％
根据本发明，其特征还在于：所述预防和治疗疾病的免疫原性组合物包括畜禽传染病病原体特异性免疫原性组合物。
上述畜禽传染病特异性免疫原包括口蹄疫、疯牛病、牛瘟、狂犬病、鸡新城疫、鸡传染性法氏囊病、禽流感、鸡减蛋综合征、鸡马立克氏病、鸡传染性鼻炎、鸡支原体病、鸡传染性喉气管炎、鸡霍乱、鸡伤寒、鸭瘟、小鹅瘟、猪瘟、猪红斑丹毒丝菌感染、猪传染性胃肠炎、猪囊虫病、猪肺疫、马传染性贫血病、兔瘟、羊脱毛综合征、鱼类暴发性出血病的病原体纯化或重组抗原、抗体、抗独特型抗体及其重组DNA中的任一种；所述畜禽传染病特异性免疫原性组合物包括上述疾病的病原体特异性免疫原性组合物，其中鸡新城疫病毒免疫原性组合物是由鸡新城疫病毒NDV抗原、NDV-IgY抗体、NDV-IgY特异性蛋黄抗独特型抗体、NDV抗原重组DNA质粒和药用辅料组成，其中各组分重量比分别为：
NDV抗原 0.01～99％
NDV-IgY抗体 0.01～99％
NDV-IgY特异性蛋黄抗独特型抗体 0.01～99％
NDV抗原重组DNA质粒 0.1～99％
药用敷料 0.1～99％
根据本发明，其特征还在于：在上述免疫原性组合物中还含有免疫偶联物；所述免疫偶联物包括上述疾病病原体特异性抗体与放射性核素、药物和毒素以及细胞因子的偶联物中的任一种或其组合：其中所述放射性核素包括碘131I、磷32P、锶89Sr、钇90Y、钐153Sm、铼188Re中的任一种或其组合；所述药物包括抗癌药物、抗病毒药物、抗菌素、免疫调节药物和免疫抑制剂中的任一种或其组合；所述毒素包括包括篦麻籽毒素(RT)、相思子毒素(abrin)、苦瓜毒素(MD)、氧化苦参碱(OXY)、去甲斑蝥素、白喉毒素(DT)、假单胞菌内毒素以及绿脓杆菌外毒素(PE)中的任一种或其组合：所述细胞因子包括白细胞介素、集落刺激因子(CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)、趋化因子中的任一种或其组合；从而使所述免疫原性组合物具有导向或靶向作用。
根据本发明，其特征还在于：所述的免疫原性组合物是其纳米微粒或脂质体复合物。
根据本发明，其特征还在于：所述免疫原性组合物是任一种药剂学上所述的剂型；所述剂型包括注射剂、胶囊、口服液、气雾剂、贴剂中的任一种剂型。
一种预防和治疗疾病的免疫原性组合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)采用蛋白质盐析、柱层析纯化疾病特异性抗原或通过基因重组的办法制备疾病病原体特异性抗原；所述疾病病原体特异性抗原包括人类肿瘤、传染性疾病、自身免疫病、过敏性疾病、器官移植排斥及畜禽传染病病原体的纯化或重组特异性抗原；即得到该免疫原性组合物组分之一抗原(Ag)；
2)通过免疫动物制备针对于上述抗原的单克隆或多克隆抗体；或通过基因重组的办法制备上述疾病相关病原体抗原的特异性抗体；即得到该免疫原性组合物组分之一抗体(Ab)；
3)以步骤1)制备的疾病相关病原体特异性抗原为免疫原，多次重复免疫注射给禽类优选是鸡，待5-20天后禽类尤其是鸡的产蛋中即含有针对于上述疾病相关病原体特异性免疫原的蛋黄抗体IgY；所述的免疫原注射量为1-2ml，免疫原量10-500μg/ml+等量不完全弗氏佐剂；
4)禽蛋尤其是鸡蛋去壳取黄，经灭菌处理后，依次进行a)用5倍体积的0.1mol/L PH7.2磷酸盐-海藻糖稀释液稀释蛋黄；b)自-20℃到室温反复冻融，每分钟500-1000转低速离心后合并上清液备用；c)向上清液中加入乙醇至终浓度为30-50％，静置沉淀后，取沉淀备用；d)取沉淀通过进一步浸提、萃取、浓缩、纯化、冷冻或喷雾干燥，即得到该免疫原性组合物组分之一蛋黄抗体IgY；
5)取步骤2)制备的针对于上述病原体抗原的抗体或步骤4)制备的蛋黄抗体IgY为免疫原，多次重复免疫注射给禽类优选是鸡，待5-20天后禽类尤其是鸡的产蛋中即含有针对于上述相应抗体包括蛋黄抗体IgY的蛋黄抗独特型抗体；所述的免疫原抗体Ab1的注射量为1-2ml，免疫原抗体Ab1的用量为10-2000μg/ml+等量不完全弗氏佐剂；
6)重复步骤4)的过程，即得到该免疫原性组合物组分之一蛋黄抗独特型抗体(Ab2)；
7)取特异性基因片段经过聚合酶链反应(PCR)后，提取和纯化表达上述疾病特异性抗原、抗体和抗独特型抗体的DNA片段，通过酶切后，与相应分子克隆载体重组，构建成上述疾病特异性抗原、抗体和抗独特型抗体的真核表达质粒，即得到该免疫原性组合物组分之一重组DNA；
8)根据实际需要按重量配比调制步骤1)所得的抗原、步骤2)所得的抗体或步骤4)所得的蛋黄抗体IgY、步骤6)所得的蛋黄抗独特型抗体和步骤7)所得的重组DNA，再辅以可接受量的药用辅料即得到所述的免疫原性组合物，其中各组分重量比分别为：
抗原 0.001～99％
抗体 0.001～99％
抗独特型抗体 0.001～99％
重组DNA 0.01～99％
药用敷料 0.01～99％
9)取步骤8)制备的免疫原性组合物经过无菌、安全及毒性试验合格后，再通过相应的制剂工艺制备成药剂学上相应的剂型；所述剂型包括注射剂、胶囊、口服液、气雾剂、贴剂中的任一种剂型。
根据本发明的制备方法，其特征还在于包括以下步骤：
1)提取纯化或重组疾病相关病原体特异性抗原；
2)提取纯化或重组疾病相关病原体特异性抗体；
3)分别取上述抗原和抗体包括蛋黄抗体IgY作为免疫原，分别连续或同时多次重复免疫注射给禽类优选是鸡；还可将上述抗原和抗体包括蛋黄抗体IgY按1∶1比例混合后作为免疫原进行免疫注射；待5-20天后禽类尤其是鸡的产蛋中即同时含有针对于上述抗原的蛋黄抗体IgY和针对于上述抗体包括蛋黄抗体IgY的特异性蛋黄抗独特型抗体；
4)取上一步骤所得的禽蛋或鸡蛋，经灭菌处理后，依次进行a)用5倍体积的0.1mol/L PH7.2磷酸盐-海藻糖稀释液稀释蛋黄；b)自-20℃到室温反复冻融，每分钟500-1000转低速离心后合并上清液备用；c)向上清液中加入乙醇至终浓度为30-50％，静置沉淀后，取沉淀备用；d)取沉淀通过进一步浸提、萃取、浓缩、纯化、冷冻或喷雾干燥；如此一次性提取纯化，可同时得到蛋黄抗体IgY和蛋黄抗独特型抗体组合物；
5)取特异性基因片段经过聚合酶链反应(PCR)后，提取和纯化表达上述疾病特异性抗原、抗体和抗独特型抗体的DNA片段，通过酶切后，与相应分子克隆载体重组，构建成上述疾病特异性抗原、抗体和抗独特型抗体的真核表达质粒，即得到该免疫原性组合物组分之一重组DNA；
6)根据实际需要按重量配比调制步骤1)所得的抗原、步骤2)所得的抗体、步骤4)所得的蛋黄抗体IgY和蛋黄抗独特型抗体组合物和步骤5)所得的重组DNA，再辅以可接受量的药用辅料即得到所述的免疫原性组合物，其中各组分重量比分别为：
抗原 0.001～99％
抗体 0.001～99％
抗独特型抗体 0.001～99％
重组DNA 0.01～99％
药用敷料 0.01～99％
7)取步骤6)制备的免疫原性组合物经过无菌、安全及毒性试验合格后，再根据实际需要，通过相应的制剂工艺制备成药剂学上相应的剂型；所述剂型包括注射剂、胶囊、口服液、气雾剂、贴剂中的任一种剂型。
根据本发明，预防和治疗疾病的免疫原性组合物的用途，其特征在于：应用于制备疾病生物预防和治疗剂以及食品、保健品添加剂，特别是应用于制备人类恶性肿瘤、传染性疾病、自身免疫病、过敏性疾病和器官移植排斥的治疗性疫苗以及食品、保健品添加剂。
根据本发明，预防和治疗疾病的免疫原性组合物的用途，其特征还在于：应用于制备畜禽传染病的治疗性疫苗和畜禽饲料添加剂。
技术效果
本发明将抗原、抗体、抗独特型抗体和重组DNA有机巧妙地结合在一起，既适用于治疗又适用于预防疾病，兼具治病和防病于一身，不但避免了单克隆抗体药物和减毒活疫苗及基因重组亚单位疫苗之功能单一的缺点，而且有效地解决了鼠源性单抗所产生的HAMA反应问题。
更重要的是在本发明中由于抗原-抗体、抗体-抗独特型抗体和抗原-抗体-抗独特型抗体免疫复合物的形成，能够通过上述免疫复合物所携带的抗原或抗独特型抗体，从而改变抗原提呈形式，更有利于抗原的提呈，并增强抗原的免疫原性，强化机体免疫应答，以达到降低或增加机体免疫耐受的目的，另外，上述免疫复合物所携带的抗体的中和或消除或耐受靶向抗原的功能同其所携带的抗独特型抗体的调节、抑制、模拟“内影像”及双特异性等功能相得益彰、相互促进、相互协调、相互增强或降低等多种功能协同作用，再加上重组DNA的强化和协同作用以共同达到防病和治病的双向目的。
本发明就是采用上述方法所制备的所述预防和治疗疾病的免疫原性组合物，即疾病特异性抗原、抗体、抗独特型抗体、重组DNA和药用辅料的免疫原性组合物，作为疾病的治疗性疫苗而应用于上述疾病的特异性免疫预防和治疗。该免疫原性组合物能够激活或抑制特定的淋巴细胞〔B细胞和T细胞〕，产生相应的对抗疾病病原体的整体免疫作用即体液和细胞免疫作用，并对将来的疾病病原体产生记忆反应，激活机体免疫系统甚至重新调节机体免疫系统平衡，调动或协调机体的体液免疫和细胞免疫作用，产生特异性对抗上述疾病病原体的抗体或反应性淋巴细胞，来共同消灭或耐受病原体、变应原、自身抗原和被移植器官，克服了灭活病原体疫苗的潜在感染问题、基因重组亚单位疫苗的不完全免疫反应问题以及免疫抑制剂的毒性问题，以达到全面、有效、快速预防和治疗上述疾病的目的。
本发明通过实验例和动物实验，取得了意想不到的效果，其实验结果(见实验例)表明，本发明具有下列优点；
1、本发明服用、携带、运输方便，适用于男女、老幼正常人和患者使用。
2、本发明疗效确切、无毒副作用和过敏反应，适用于作为人类肿瘤、传染性疾病、自身免疫病、器官移植排斥的治疗性疫苗以及食品、保健品添加剂；也适用于作为畜禽传染病的治疗性疫苗以及畜禽饲料添加剂。
3、本发明可替代和补充昂贵的抗肿瘤、抗病毒、抗细菌以及免疫抑制药物，能有效避免上述药物的耐药性及毒副作用。
4、本发明制备原料包括免疫原、禽类及其蛋黄、饲料、纯化设备及其所用化学原料来源广泛易得，经济实用。
5、本发明制备工艺成熟，纯度高且质量可靠，易于规模化实施。
6、本发明防治功能全面、快速，防病与治病集于一身，克服了抗体药物和亚单位疫苗的各自的弱点。
7、本发明有效避免了鼠源性单抗的HAMA反应问题。
8、本发明还具有较好的导向性或靶向性，在一定程度上具有生物导弹的功能。
9、本发明各组分间协同作用，相互促进、相互增强、相互协调，能有效防治上述疾病，且疗效全面，应用面广。
10、本发明中的抗原-抗体、抗体-抗独特型抗体、抗原-抗体-抗独特型抗体免疫复合物更有利于抗原和抗独特型抗体模拟“内影像”抗原性的提呈，并且上述免疫复合物比单独免疫原更能诱生高滴度的抗体产生和淋巴细胞增殖反应，从而更有效地诱生体液和细胞免疫反应，以达到防病和治病的双向目的。
具体实施方式
下面就结合实施例对本发明作进一步描述，但所述实施例并不限制本发明。
实施例1：传染性疾病的免疫原性组合物的制备(以乙型肝炎特异性免疫原性组合物为例)
一、抗原的来源和制备(以乙肝表面抗原HBsAg为例)
HBsAg：为自HBsAg阳性血浆分离、纯化，经胃蛋白酶消化及甲醛灭活的乙型肝炎病毒表面抗原。
重组HBsAg：重组乙肝表面抗原疫苗由上海生物制品研究所提供。
二、抗体的来源和制备(以乙肝表面抗体HBsAb为例)
鼠源性抗-HBs：以上述HBsAg加入2mg/ml氢氧化铝佐剂，经腹腔免疫BALB/c小鼠，加强2周后取血、分离制备成抗血清，其纯化抗-HBs效价为1∶256。
人Fab噬菌体抗-HBs：用RT-PCR技术扩增出人抗体轻链k基因和重链Fd基因，将二基因先后克隆入PComb3Hss载体中，转化大肠杆菌，再用辅助噬菌体感染，构建含抗-HBs的人源性噬菌体抗体库，进一步筛选出针对于HBsAg的人Fab噬菌体抗体。
蛋黄抗体IgY的制备(以乙肝表面抗原特异性蛋黄抗体IgY为例)
1)用具有免疫活性的血源纯化乙肝表面抗原或基因重组乙肝表面抗原或乙肝表面抗原疫苗作为免疫原，其中血源纯化乙肝表面抗原和基因重组乙肝表面抗原均由北京科卫临床诊断试剂厂提供，重组乙肝表面抗原疫苗由上海生物制品研究所提供；
2)取6月龄SPF纯系莱航产蛋母鸡于标准II级清洁级动物房饲养，每只鸡于胸腹部多点注射上述乙型肝炎免疫原1ml(免疫原量100μg/ml+等量完全福氏佐剂)，待3周后加强免疫注射2次，待15天后免疫母鸡所产的鸡蛋中即含有针对于上述乙型肝炎免疫原的蛋黄抗体IgY；
3)取步骤2)获得的鸡蛋10个去蛋清后的蛋黄液135ml，充分搅拌均匀后，加入蛋黄匀浆液5倍体积的0.1mol/L PH7.2磷酸盐-海藻糖稀释液，然后置于冰盒(-20℃)冰冻1小时，取出于室温复融并低速离心(1000r/min)后，收集上清液，再向沉淀物中加入2倍体积的0.1mol/L PH7.2磷酸盐-海藻糖稀释液，充分混匀溶解沉淀物，依上法再次冻融收集上清液，如此反复冻融3次，合并收集各次得到的上清液，加入乙醇至终浓度为50％，3000转/分离心后，取沉淀备用；
4)取步骤3)获得的沉淀物通过进一步浸提、萃取、浓缩、纯化、冷冻或喷雾干燥，即得到本发明免疫原性组合物组分之一蛋黄抗体IgY，共得到IgY1.12g，其收率为71％。该蛋黄抗体IgY是针对于上述乙型肝炎免疫原的。
三、蛋黄抗独特型抗体的制备(以乙肝表面抗体特异性蛋黄抗独特型抗体为例)
1)用具有免疫活性的血源纯化乙肝表面抗体或基因重组乙肝表面抗体或上述实施例1第二条中所制备的乙肝表面抗原特异性蛋黄抗体IgY为免疫原，其中血源纯化乙肝表面抗体和基因重组乙肝表面抗体均由北京科卫临床诊断试剂厂提供；
2)取6月龄SPF纯系莱航产蛋母鸡于标准II级清洁级动物房饲养，每只鸡于胸腹部多点注射上述乙型肝炎免疫原1ml(上述免疫原的用量为500μg+等量完全福氏佐剂)，待3周后加强免疫注射2次，待15天后免疫母鸡所产的鸡蛋中即含有针对于上述乙型肝炎免疫原的蛋黄抗独特性抗体；
3)取步骤2)获得的鸡蛋10个去蛋清后的蛋黄液155ml，充分搅拌均匀后，加入蛋黄匀浆液5倍体积的0.1mol/L PH7.2磷酸盐-海藻糖稀释液，然后置于冰盒(-20℃)冰冻1小时，取出于室温复融并低速离心(1000r/min)后，收集上清液，再向沉淀物中加入2倍体积的0.1mol/L PH7.2磷酸盐-海藻糖稀释液，充分混匀溶解沉淀物，依上法再次冻融收集上清液，如此反复冻融3次，合并收集各次得到的上清液，加入乙醇至终浓度为50％，3000转/分离心后，取沉淀备用；
4)取步骤3)获得的沉淀物通过进一步浸提、萃取、浓缩、纯化、冷冻或喷雾干燥，即得到本发明蛋黄抗体组合物组分之一蛋黄抗独特型抗体，共得到IgY1.37g，其收率为76％。该蛋黄抗独特型抗体是针对于上述乙型肝炎表面抗体或乙肝特异性蛋黄抗体IgY免疫原的。
四、蛋黄抗体IgY和蛋黄抗独特型抗体组合物的制备(以乙型肝炎蛋黄抗体IgY和蛋黄抗独特型抗体组合物为例)
1)分别取上述实施例1第一条中的乙肝表面抗原免疫原和上述实施例1第二条中的乙肝表面抗体包括乙肝蛋黄抗体IgY免疫原等量混合之，成为乙肝表面抗原和乙肝表面抗体包括乙肝蛋黄抗体IgY的混合免疫原；
2)取6月龄SPF纯系莱航产蛋母鸡于标准II级清洁级动物房饲养，每只鸡于胸腹部多点注射上述乙型肝炎混合免疫原1ml(上述免疫原的用量为1000μg+等量完全福氏佐剂)，待3周后加强免疫注射2次，待15天后免疫母鸡所产的鸡蛋中即含有针对于上述乙型肝炎混合免疫原的蛋黄抗体IgY和蛋黄抗独特性抗体；
3)取步骤2)获得的鸡蛋去蛋清后的蛋黄液160ml，充分搅拌均匀后，加入蛋黄匀浆液5倍体积的0.1mol/L PH7.2磷酸盐-海藻糖稀释液，然后置于冰盒(-20℃)冰冻1小时，取出于室温复融并低速离心(1000r/min)后，收集上清液，再向沉淀物中加入2倍体积的0.1mol/L PH7.2磷酸盐-海藻糖稀释液，充分混匀溶解沉淀物，依上法再次冻融收集上清液，如此反复冻融3次，合并收集各次得到的上清液，加入乙醇至终浓度为50％，3000转/分离心后，取沉淀备用；
4)取步骤3)获得的沉淀物通过进一步浸提、萃取、浓缩、纯化、冷冻或喷雾干燥，即得到本发明蛋黄抗体组合物的主要组分即蛋黄抗体IgY和蛋黄抗独特型抗体的混合物，共得到IgY1.32g，其收率为80％。该蛋黄抗体混合物是针对于上述乙型肝炎表面抗原和乙型肝炎表面抗体包括乙肝特异性蛋黄抗体IgY免疫原的。
五、重组DNA的制备(以乙肝表面抗原重组DNA质粒为例)
将编码HBV表面抗原preS2+S片段的基因片段插入到真核细胞表达载体pJW4303中，构建成真核表达质粒pJW4303/HBV-S2.S重组体，在此称为乙肝表面抗原重组DNA质粒。
六、免疫原性组合物的制备(以乙肝特异性免疫原性组合物I为例)
取实施例1第一条中制备的乙肝表面抗原100mg、实施例1第二条中制备的特异性蛋黄抗体IgY200mg、实施例1第三条中制备的乙肝表面抗体特异性蛋黄抗独特型抗体100mg和实施例1第五条中制备的乙肝表面抗原重组DNA质粒400mg，将四者充分混合，然后加入等量氢氧化铝佐剂900mg，充分混匀，再经过巴氏灭菌和除热源处理后即为本发明乙肝特异性免疫原性组合物I。
七、乙肝表面抗原特异性蛋黄抗体IgY与氧化苦参碱偶联物的制备
首先取葡聚糖10g，加入200mL蒸馏水后加高碘酸钠3g，室温下避光反应过夜，使葡聚糖充分氧化为多醛基葡聚糖，蒸馏水充分透析后冻干；注射治疗前2小时内取多醛基葡聚糖100mg加入0.15mol/L(pH7.2)的磷酸缓冲液20mL中，加氧化苦参碱100mg，室温下反应24小时后，再加入已纯化的乙肝表面抗原特异性蛋黄抗体IgY100mg，4℃搅拌反应24小时；然后在上述反应混合物中加硼氢化钠2mg，在4℃下还原2小时，离心后经Sephadex G-150层析柱过柱，收集第一峰即可应用。
八、乙肝特异性免疫原性组合物II的制备
取实施例1第七条中制备的乙肝表面抗原特异性蛋黄抗体IgY与氧化苦参碱的偶联物200mg和上述实施例1第一条中制备的乙肝表面抗原100mg、实施例1第三条中制备的乙肝表面抗体特异性蛋黄抗独特型抗体100mg、实施例1第五条中制备的乙肝表面抗原重组DNA质粒400mg，将四者充分混合，然后加入分子内佐剂棕榈酰赖氨酸200mg，充分混匀，待反应完全后再经过巴氏灭菌和除热源处理后即成为极易穿透细胞脂质膜且具有靶向抗乙肝病毒作用的乙肝特异性免疫原性组合物II。该免疫原性组合物II不仅具有上述实施例1第六条中所制备的免疫原性组合物I所具备的免疫协调和治疗作用，而且还具有针对于乙肝病毒的生物导弹功能，因此对于乙肝病毒具有更强的特异性杀伤能力。
九、乙肝特异性免疫原性组合物II注射剂的制备
按照实施例1第八条中乙肝特异性免疫原性组合物II的配方组成，取该组合物1.0g，再加入分子内佐剂棕榈酰赖氨酸200mg，再加入药用敷料海藻糖2.0g，充分混匀，待反应完全后再经过巴氏灭菌和除热源处理后，冷冻干燥或干燥处理后装安培、封口即成为注射剂。
十、乙肝特异性免疫原性组合物II胶囊的制备
按照实施例1第八条中乙肝特异性免疫原性组合物II的配方组成，取该组合物1.0g，再加入分子内佐剂棕榈酰赖氨酸200mg，再加入药用敷料蔗糖200g、大豆磷脂200g，充分混匀，待反应完全后再经过巴氏灭菌和除热源处理后，装入空心胶囊即成为用于口服的胶囊。
十一、乙肝特异性免疫原性组合物II口服液的制备
按照实施例1第八条中乙肝特异性免疫原性组合物II的配方组成，取该组合物1.0g，再加入分子内佐剂棕榈酰赖氨酸200mg，再加入药用敷料蔗糖200g，补足重蒸馏水至10ml，充分混匀，待反应完全后再经过巴氏灭菌和除热源处理后，装入口服液瓶并无菌封口即成为口服液。
十二、乙肝特异性免疫原性组合物II气雾剂的制备
按照实施例1第八条中乙肝特异性免疫原性组合物II的配方组成，取该组合物1.0g，再加入分子内佐剂棕榈酰赖氨酸200mg，再加入药用敷料气雾剂溶剂，待反应完全后再经过巴氏灭菌和除热源处理后，打压装带喷嘴耐压气雾剂瓶中即成为气雾剂。
十三、乙肝特异性免疫原性组合物II贴剂的制备
按照实施例1第八条中乙肝特异性免疫原性组合物II的配方组成，取该组合物1.0g，再加入分子内佐剂棕榈酰赖氨酸200mg，再加入适量的药用敷料羟丙基甲基纤维素，充分混匀，待反应完全后再经过巴氏灭菌和除热源处理后，涂布于贴剂基质载体表面即成为贴剂。
实施例2：恶性肿瘤的免疫原性组合物的制备(以肠癌特异性癌胚抗原CEA的免疫原性组合物为例)
一、抗原的来源和制备(以癌胚抗原CEA为例)
CEA：为自肠癌组织经分离、纯化的癌胚抗原。
二、抗体的来源和制备(以抗-CEA为例)
鼠源性抗-CEA：以上述CEA加入2mg/ml氢氧化铝佐剂，经腹腔免疫BALB/c小鼠，加强2周后取血、分离制备成抗血清，其纯化抗-CEA效价为1∶128。
癌胚抗原蛋黄抗体CEA-IgY的制备：用具有免疫活性的肠癌组织纯化CEA作为免疫原，按照实施例1第二条中的2)、3)、4)步骤即可获得癌胚抗原蛋黄抗体CEA-IgY，用157ml蛋黄液共得到CEA-IgY1.52g，其收率为73％。
三、癌胚抗原蛋黄抗体CEA-IgY特异性蛋黄抗独特型抗体的制备：用具有免疫活性的癌胚抗原蛋黄抗体CEA-IgY为免疫原，按照实施例1第三条中的2)、3)、4)步骤即可获得癌胚抗原蛋黄抗体CEA-IgY特异性蛋黄抗独特型抗体，用142ml蛋黄液共得到CEA-IgY特异性蛋黄抗独特型抗体1.52g，其收率为73％。
四、癌胚抗原特异性蛋黄抗体IgY和其特异性蛋黄抗独特型抗体组合物的制备：分别取实施例2第一条中制备的CEA和实施例2第二条中制备的癌胚抗原蛋黄抗体CEA-IgY等量混合之，成为混合免疫原，按照实施例1第四条中的2)、3)、4)步骤即可获得癌胚抗原蛋黄抗体CEA-IgY和其特异性蛋黄抗独特型抗体的组合物，用112ml蛋黄液共得到871mg，其收率为64％。
五、重组DNA的制备(以CEA重组DNA质粒为例)
将人特异表达的癌胚抗原CEA的cDNA克隆到逆转录病毒质粒载体pLXSN中，构建成真核表达重组质粒pLXSN-CEA，在此称为CEA重组DNA质粒。
六、癌胚抗原特异性免疫原性组合物I的制备：
取实施例2第一条中制备的CEA 100mg、实施例2第二条中制备的CEA-IgY200mg、实施例2第三条中制备的CEA-IgY特异性蛋黄抗独特型抗体100mg和实施例2第五条中制备的CEA重组DNA质粒500mg，将四者充分混合，然后加入氢氧化铝佐剂500mg，充分混匀，再经过巴氏灭菌和除热源处理后即为癌胚抗原特异性免疫原性组合物I。
七、CEA-IgY与丝裂霉素偶联物的制备
首先取葡聚糖10g，加入200mL蒸馏水后加高碘酸钠3g，室温下避光反应过夜，使葡聚糖充分氧化为多醛基葡聚糖，蒸馏水充分透析后冻干；注射治疗前2小时内取多醛基葡聚糖100mg加入0.15mol/L(pH7.2)的磷酸缓冲液20mL中，加丝裂霉素100mg，室温下反应24小时后，再加入已纯化的CEA-IgY100mg，4℃搅拌反应24小时；然后在上述反应混合物中加硼氢化钠2mg，在4℃下还原2小时，离心后经Sephadex G-150层析柱过柱，收集第一峰即可应用。
八、癌胚抗原特异性免疫原性组合物II的制备
取实施例2第一条中制备的CEA 100mg、实施例2第七条中制备的CEA-IgY与丝裂霉素的偶联物200mg、实施例2第三条中制备的CEA-IgY特异性蛋黄抗独特型抗体100mg和实施例2第五条中制备的CEA重组DNA质粒200mg，将四者充分混合，然后加入分子内佐剂棕榈酰赖氨酸400mg，充分混匀，待反应完全后再经过巴氏灭菌和除热源处理后即成为极易穿透细胞脂质膜且具有靶向抗癌作用的癌胚抗原特异性免疫原性组合物II。该免疫原性组合物II不仅具有上述实施例2第六条中所制备的免疫原性组合物I所具有的免疫协调和治疗作用，而且还具有针对于癌细胞的生物导弹功能，因此对于癌细胞具有更强的特异性杀伤能力。
九、癌胚抗原特异性免疫原性组合物II注射剂的制备
按照实施例2第八条中癌胚抗原特异性免疫原性组合物II的配方组成，取该组合物1.0g，再加入药用敷料海藻糖2.0g，充分混匀，待反应完全后再经过巴氏灭菌和除热源处理后，冷冻干燥或干燥处理后装安培、封口即成为注射剂。
十、癌胚抗原特异性免疫原性组合物II口服液的制备
按照实施例2第八条中癌胚抗原特异性免疫原性组合物II的配方组成，取该组合物1.0 g，再加入药用敷料蔗糖500g，补足重蒸馏水至10ml，充分混匀，待反应完全后再经过巴氏灭菌和除热源处理后，装入口服液瓶并无菌封口即成为口服液。
实施例3：自身免疫病的免疫原性组合物的制备(以类风湿性关节炎特异性CD20免疫原性组合物为例)
一、抗原的来源和制备(以CD20为例)
CD20：为自人白细胞经分离、纯化的CD20抗原。
二、抗体的来源和制备(以抗-CD20为例)
鼠源性抗-CD20：以上述CD20抗原加入2mg/ml氢氧化铝佐剂，经腹腔免疫BALB/c小鼠，加强2周后取血、分离制备成抗血清，其纯化抗-CD20效价为1∶128。
CD20蛋黄抗体CD20-IgY的制备：用具有免疫活性的纯化CD20抗原作为免疫原，按照实施例1第二条中的2)、3)、4)步骤即可获得蛋黄抗体CD20-IgY，用157ml蛋黄液共得到CD20-IgY1.52g，其收率为76％。
三、蛋黄抗体CD20-IgY特异性蛋黄抗独特型抗体的制备：用具有免疫活性的CD20-IgY为免疫原，按照实施例1第三条中的2)、3)、4)步骤即可获得蛋黄抗体CD20-IgY特异性蛋黄抗独特型抗体，用142ml蛋黄液共得到CD20-IgY特异性蛋黄抗独特型抗体1.52g，其收率为73％。
四、特异性蛋黄抗体CD20-IgY和其特异性蛋黄抗独特型抗体组合物的制备：分别取上述实施例3第一条中制备的CD20和上述实施例3第二条中制备的蛋黄抗体CD20-IgY等量混合之，成为混合免疫原，按照实施例1第四条中的2)、3)、4)步骤即可获得蛋黄抗体CD20-IgY和其特异性蛋黄抗独特型抗体的组合物，用112ml蛋黄液共得到895mg，其收率为67％。
五、重组DNA的制备(以CD20重组DNA质粒为例)
将人CD20分子胞外区基因片断插入到真核表达载体pExSecI的多克隆位点上，构建pExSecI/CD20重组质粒，在此称为CD20重组DNA质粒。
六、CD20免疫原性组合物I的制备：
取实施例3第一条中制备的CD20 100mg、实施例3第二条中制备的CD20-IgY200mg、实施例3第三条中制备的CD20-IgY特异性蛋黄抗独特型抗体100mg和实施例3第五条中制备的CD20重组DNA质粒500mg，将四者充分混合，然后加入氢氧化铝佐剂500mg，充分混匀，再经过巴氏灭菌和除热源处理后即为CD20特异性免疫原性组合物I。
七、CD20-IgY与氧化苦参碱偶联物的制备
首先取葡聚糖10g，加入200mL蒸馏水后加高碘酸钠3g，室温下避光反应过夜，使葡聚糖充分氧化为多醛基葡聚糖，蒸馏水充分透析后冻干；注射治疗前2小时内取多醛基葡聚糖100mg加入0.15mol/L(pH7.2)的磷酸缓冲液20mL中，加氧化苦参碱100mg，室温下反应24小时后，再加入已纯化的CD20-IgY100mg，4℃搅拌反应24小时；然后在上述反应混合物中加硼氢化钠2mg，在4℃下还原2小时，离心后经Sephadex G-150层析柱过柱，收集第一峰即可应用。
八、CD20免疫原性组合物II的制备
取上述实施例3第七条中制备的CD20特异性蛋黄抗体CD20-IgY与氧化苦参碱的偶联物100mg和上述实施例3第一条中制备的CD20抗原50mg、实施例3第三条中制备的CD20-IgY特异性蛋黄抗独特型抗体50mg、实施例3第五条中制备的CD20重组DNA质粒100mg，将四者充分混合，然后加入分子内佐剂棕榈酰赖氨酸100mg，充分混匀，待反应完全后再经过巴氏灭菌和除热源处理后即成为极易穿透细胞脂质膜且具有靶向治疗类风湿性关节炎的免疫原性组合物。该免疫原性组合物II不仅具有上述实施例3第六条中所制备的免疫原性组合物I所具备的免疫协调和治疗作用，而且还具有针对于CD20阳性淋巴细胞的生物导弹功能，因此对类风湿性关节炎具有更强的免疫治疗作用。
九、CD20免疫原性组合物II注射剂的制备
按照实施例3第八条中CD20免疫原性组合物II的配方组成，取该组合物II1.0g，再加入分子内佐剂棕榈酰赖氨酸200mg，再加入药用敷料海藻糖2.0g，充分混匀，待反应完全后再经过巴氏灭菌和除热源处理后，冷冻干燥或干燥处理后装安培、封口即成为注射剂。
十、CD20-IgY免疫原性组合物II贴剂的制备
按照实施例3第八条中CD20免疫原性组合物II的配方组成，取该组合物II1.0g，再加入药用敷料羟丙基甲基纤维素2.0g，充分混匀，待反应完全后再经过巴氏灭菌和除热源处理后，涂布于贴剂基质载体表面即成为贴剂。
实施例4：过敏性疾病的免疫原性组合物的制备(以变应性鼻炎尘螨抗原的免疫原性组合物为例)
一、抗原的来源和制备(以螨抗原为例)
螨抗原：为采用上海医大红旗药厂生产的螨逸口含免疫剂经分离、纯化的螨抗原。
二、抗体的来源和制备(以蛋黄抗体螨抗体-IgY为例)
螨抗体-IgY的制备：用具有免疫活性的纯化螨抗原作为免疫原，按照实施例1第二条中的2)、3)、4)步骤即可获得螨抗体-IgY，用132ml蛋黄液共得到螨抗体-IgY1.32g，其收率为75％。
三、螨抗体-IgY特异性蛋黄抗独特型抗体的制备：用具有免疫活性的螨抗体-IgY为免疫原，按照实施例1第三条中的2)、3)、4)步骤即可获得螨抗体-IgY特异性蛋黄抗独特型抗体，用112ml蛋黄液共得到螨抗体-IgY特异性蛋黄抗独特型抗体1.2g，其收率为67％。
四、特异性螨抗体-IgY和其特异性蛋黄抗独特型抗体组合物的制备：分别取上述实施例4第一条中制备的螨抗原和上述实施例4第二条中制备的螨抗体-IgY等量混合之，在加入等量完全佐剂而成为混合免疫原，按照实施例1第四条中的2)、3)、4)步骤即可获得螨抗体-IgY和其特异性蛋黄抗独特型抗体的组合物，用125ml蛋黄液共得到830mg，其收率为61％。
五、重组DNA的制备(以螨抗原重组DNA质粒为例)
采用基因重组的方法构建能够表达螨抗原的重组DNA质粒。
六、螨抗原特异性免疫原性组合物的制备：
取实施例4第一条中制备的螨抗原100mg、实施例4第二条中制备的螨抗体-IgY200mg、实施例4第三条中制备的螨抗体-IgY特异性蛋黄抗独特型抗体100mg和实施例4第五条中制备的螨抗原重组DNA质粒500mg，将四者充分混合，然后加入氢氧化铝佐剂500mg，充分混匀，再经过巴氏灭菌和除热源处理后即为螨抗原抗原特异性免疫原性组合物。
七、螨抗原特异性免疫原性组合物注射剂的制备
按照实施例4第六条中螨抗原特异性免疫原性组合物的配方组成，取该组合物1.0g，再加入分子内佐剂棕榈酰赖氨酸100mg，再加入药用敷料海藻糖2.0g，充分混匀，待反应完全后再经过巴氏灭菌和除热源处理后，冷冻干燥或干燥处理后装安培、封口即成为注射剂。
实施例5：用于器官移植的免疫原性组合物的制备(以肾移植用的免疫原性组合物为例)
一、抗原的来源和制备(以CD154抗原为例)
CD154抗原：为自人白细胞经分离、纯化的CD154抗原。
二、抗体的来源和制备(以蛋黄抗体CD154-IgY为例)
蛋黄抗体CD154-IgY的制备：用具有免疫活性的纯化CD154抗原作为免疫原，按照实施例1第二条中的2)、3)、4)步骤即可获得蛋黄抗体CD154-IgY，用125ml蛋黄液共得到CD154-IgY1.12g，其收率为74％。
三、CD154-IgY特异性蛋黄抗独特型抗体的制备：用具有免疫活性的CD154-IgY为免疫原，按照实施例1第三条中的2)、3)、4)步骤即可获得CD154-IgY特异性蛋黄抗独特型抗体，用112ml蛋黄液共得到CD154-IgY特异性蛋黄抗独特型抗体1.2g，其收率为67％。
四、特异性CD154-IgY和其特异性蛋黄抗独特型抗体组合物的制备：分别取上述实施例5第一条中制备的CD154抗原和上述实施例5第二条中制备的CD154-IgY等量混合之，在加入等量完全佐剂而成为混合免疫原，按照实施例1第四条中的2)、3)、4)步骤即可获得CD154-IgY和其特异性蛋黄抗独特型抗体的组合物，用120ml蛋黄液共得到840mg，其收率为62％。
五、重组DNA的制备(以CD154抗原重组DNA质粒为例)
采用基因重组的方法构建能够表达CD154抗原的重组DNA质粒。
六、CD154抗原特异性免疫原性组合物的制备：
取实施例5第一条中制备的CD154抗原100mg、实施例5第二条中制备的CD154-IgY200mg、实施例5第三条中制备的CD154-IgY特异性蛋黄抗独特型抗体100mg和实施例5第五条中制备的CD154抗原重组DNA质粒500mg，将四者充分混合，然后加入氢氧化铝佐剂500mg，充分混匀，再经过巴氏灭菌和除热源处理后即为CD154抗原特异性免疫原性组合物。
七、CD154抗原特异性免疫原性组合物注射剂的制备
按照实施例5第六条中CD154抗原特异性免疫原性组合物的配方组成，取该组合物1.0g，再加入分子内佐剂棕榈酰赖氨酸100mg，再加入药用敷料海藻糖2.0g，充分混匀，待反应完全后再经过巴氏灭菌和除热源处理后，冷冻干燥或干燥处理后装安培、封口即成为注射剂。
实施例6：畜禽传染病的免疫原性组合物的制备(以新城疫病毒抗原NDV的免疫原性组合物为例)
一、抗原的来源和制备(以NDV抗原为例)
NDV：为自新城疫病毒灭活疫苗经分离、纯化的NDV抗原，其中鸡新城疫病毒灭活疫苗来源于吉林省生物制品厂。
二、抗体的来源和制备(以蛋黄抗体NDV-IgY为例)
NDV蛋黄抗体NDV-IgY的制备：用具有免疫活性的纯化NDV抗原作为免疫原，按照实施例1第二条中的2)、3)、4)步骤即可获得蛋黄抗体NDV-IgY，用120ml蛋黄液共得到NDV-IgY1.2g，其收率为73％。
三、蛋黄抗体NDV-IgY特异性蛋黄抗独特型抗体的制备：用具有免疫活性的NDV-IgY为免疫原，按照实施例1第三条中的2)、3)、4)步骤即可获得蛋黄抗体NDV-IgY特异性蛋黄抗独特型抗体，用112ml蛋黄液共得到NDV-IgY特异性蛋黄抗独特型抗体1.2g，其收率为67％。
四、特异性蛋黄抗体NDV-IgY和其特异性蛋黄抗独特型抗体组合物的制备：分别取上述实施例6第一条中制备的NDV和上述实施例6第二条中制备的蛋黄抗体NDV-IgY等量混合之，在加入等量完全佐剂而成为混合免疫原，按照实施例1第四条中的2)、3)、4)步骤即可获得蛋黄抗体NDV-IgY和其特异性蛋黄抗独特型抗体的组合物，用130ml蛋黄液共得到890mg，其收率为66％。
五、重组DNA的制备(以NDV重组DNA质粒为例)
将鸡新城疫病毒NDV的HN基因片断插入到真核表达载体pIRES1的多克隆位点上，构建pIRHN重组表达载体，在此称为NDV重组DNA质粒。
六、NDV免疫原性组合物的制备：
取实施例6第一条中制备的NDV 100mg、实施例6第二条中制备的NDV-IgY200mg、实施例6第三条中制备的NDV-IgY特异性蛋黄抗独特型抗体100mg和实施例6第五条中制备的NDV重组DNA质粒500mg，将四者充分混合，然后加入氢氧化铝佐剂500mg，充分混匀，再经过巴氏灭菌和除热源处理后即为鸡新城疫病毒NDV抗原特异性免疫原性组合物。
七、NDV免疫原性组合物注射剂的制备
按照实施例6第六条中NDV免疫原性组合物的配方组成，取该组合物1.0g，再加入分子内佐剂棕榈酰赖氨酸100mg，再加入药用敷料海藻糖2.0g，充分混匀，待反应完全后再经过巴氏灭菌和除热源处理后，冷冻干燥或干燥处理后装安培、封口即成为注射剂。
下面就结合实验例对本发明作进一步描述，但所述实验例并不限制本发明。
实验例1：免疫原性组合物的性能检测
一、抗原、蛋黄抗体IgY和蛋黄抗独特型抗体的效价检测(以重组乙肝表面抗原及其特异性蛋黄抗体IgY和蛋黄抗独特型抗体组合物为例)
1)方法原理：重组乙肝表面抗原的检测采用ELISA双抗体夹心法；乙型肝炎表面抗原特异性蛋黄抗体IgY的检测采用ELISA间接法，即以乙型肝炎表面抗原液包被酶标板孔，采用辣根过氧化物酶标记的鼠抗鸡IgY抗体作为二抗；乙型肝炎表面抗体特异性蛋黄抗独特型抗体的检测采用ELISA双抗体夹心法，即以乙肝表面抗原特异性蛋黄抗体IgY包被酶标板孔，采用辣根过氧化物酶标记的乙肝表面抗原特异性蛋黄抗体IgY作为标记抗体。
2)试剂材料
a)包被缓冲液(PH9.6碳酸盐缓冲液)：取Na2CO30.16g和NaHCO30.29g，蒸馏水加至100ml；
b)稀释液(PH7.2磷酸盐缓冲液)：取Na2HPO4·12H2O2.9g、KH2PO40.2g、NaCL8.0g和KCL0.2g蒸馏水加至1000ml；
c)封闭液：取上述稀释液500ml加入牛血清白蛋白2.5g和Tween-20 0.25ml即可；
d)洗涤液：取上述稀释液200ml加入表面活性剂Tween-20 0.1ml即可；
e)底物缓冲液(0.1mol/L PH5.0磷酸盐-柠檬酸缓冲液)：取Na2HPO4·12H2O 1.8g和柠檬酸0.52g，蒸馏水加至100ml，4℃存放，用前加H2O2；
f)终止液(2.0mol/LH2SO4)：取浓硫酸55.5ml加蒸馏水444.5ml即可；
g)包被材料血源纯化乙肝表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎表面抗体(单克隆抗-HBs)均由北京科卫临床诊断试剂厂提供；鼠抗鸡IgY由北京成文免疫化学研究所提供，其中辣根过氧化物酶标记鼠抗鸡IgY和单克隆抗-HBs自行按照过碘酸钠法标记。
h)酶标反应底物用四甲基联苯胺(TMB)。
3)试验设备：酶联免疫检测仪(国产Biocell2010型)、37℃水浴箱、48孔或96孔聚苯乙烯酶标板、微量移液器(50μl、100μl)
4)间接法ELISA检测操作步骤
a)取包被材料血源纯化乙肝表面抗原(HBsAg)或乙型肝炎表面抗体(单克隆抗-HBs)，用包被液稀释成100μg/ml，取100μl/孔量分别加入聚苯乙烯酶标板孔中，于4℃吸附过夜；
b)取上述已包被过夜的酶标板，用洗涤液洗3次，每次3分钟；然后每孔加入200μl封闭液，于4℃封闭过夜；再用洗涤液洗3次，每次3分钟；待干后备用(如暂时不用置4℃存放)；
c)分别取上述实施例1第二、三、四条中所制备的乙肝特异性蛋黄抗体IgY、蛋黄抗独特型抗体、蛋黄抗体IgY和蛋黄抗独特型抗体的混合物，分别进行1∶1至1∶4096的比例稀释，取各种不同的稀释样品分别加入各自相应的检测酶标板孔中，每孔100μl，同时设立空白、阴性和阳性对照孔；
d)于37℃孵育反应1小时后用洗涤液洗4次，每次5分钟；
e)每孔加入100μl辣根过氧化物酶标记的鼠抗鸡IgY抗体(二抗)，37℃孵育反应1小时后用洗涤液洗5次，每次3分钟；
f)配制底物溶液：用前取0.1mol/L PH5.0磷酸盐-柠檬酸缓冲液7.0ml，加入3％H2O290μl和10mg/ml的四甲基联苯胺(TMB)溶液0.1ml，混匀避光备用；
g)加入新配制的底物溶液100μl/孔，保温15分钟，然后加入终止液(2.0mol/LH2SO4)50μl/孔以终止反应；
h)将酶标板放入酶联免疫检测仪中，波长450nm，以空白对照调零，读取各孔吸光度(OD)值；
i)结果计算：按照公式P/N≥2.1为阳性，否则P/N≤2.1为阴性，其中P为待测标本OD值，N为阴性对照OD值。
5)结果判断：以P/N≥2.1为阳性的最大稀释度作为其效价。
6)检测结果：按照上述间接法ELISA检测操作对实施例1中第六条所制备的乙肝特异性免疫原性组合物中各组成成分的效价进行测定，其检测结果见表1。
二、重组质粒拷贝值(copy/ml)的检测：用荧光定量PCR(试剂由上海复星公司提供)方法。用本法对实施例1第六条中所制备的乙肝特异性免疫原性组合物I中重组DNA质粒的效价进行测定，其检测结果见表1。
表1：乙肝特异性免疫原性组合物I中各组分效价检测结果
| 样品稀释度 | 1∶1-1∶l6 | 1∶32-1∶128 | 1∶256-1∶1024 | 1∶2048-1∶4096 |
| 乙肝表面抗原 | P/N≥2.1为阳性 | P/N≥2.1为阳性 | P/N≥2.1为阳性的最大稀释度为1∶512 | P/N≤2.1为阴性 |
| 乙肝蛋黄抗体IgY | P/N≥2.1为阳性 | P/N≥2.1为阳性 | P/N≥2.1为阳性的最大稀释度为1∶256 | P/N≤2.1为阴性 |
| 蛋黄抗独特型抗体 | P/N≥2.1为阳性 | P/N≥2.1为阳性的最大稀释度为1∶128 | P/N≤2.1为阴性 | P/N≤2.1为阴性 |
| 重组DNA质粒 | 1.2-6.4×107copy/ml | 3.2×104 | ＜103为阴性 | ＜103为阴性 |
实验结果表明：乙肝表面抗原的效价为1∶512，乙型肝炎表面抗原特异性蛋黄抗体IgY的效价为1∶256，乙肝特异性蛋黄抗独特型抗体的效价为1∶128；乙肝特异性重组DNA质粒3.8×107copy/ml。
二、免疫原性组合物中重组DNA的鉴定(以乙肝表面抗原重组DNA质粒为例)
重组质粒体外表达产物的鉴定：重组质粒转染293T细胞将生长期293T细胞铺于100mm培养皿，分别取提纯的pJW4303/HBV-S2.S及pJW4303(空载对照质粒)约20μg，用磷酸钙沉淀法转染293T细胞(一种用于瞬间转染的人胚肾细胞系)，培养72h(37℃，5％CO2)。
表达产物的回收：将培养皿中的细胞培养液以800r/min，离心5min后收集上清待测。同时收集细胞，用裂解剂裂解，4℃条件下12000r/min，离心1h后取上清待测。
表达产物的检测：用ELISA法检测细胞培养液上清和细胞裂解产物上清中的HBsAg和preS2，测定值以450nm的吸光度A值表示。
实验结果表明：细胞培养液上清中HBsAg的效价为1∶32、preS2的效价为1∶16；细胞裂解产物上清中的HBsAg的效价为1∶2048、preS2的效价为1∶512。
三、蛋黄抗体IgY和蛋黄抗独特型抗体的鉴定(以乙肝蛋黄抗体IgY和蛋黄抗独特型抗体为例)
用聚丙烯酰胺凝胶(PADE)电泳(浓缩胶浓度为5％)对乙型肝炎表面抗原特异性蛋黄抗体IgY和乙型肝炎表面抗体特异性蛋黄抗独特型抗体进行纯度鉴定，电泳中均出现一条电泳带，其纯度≥95％。
用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PADE)电泳，分离胶长度为8％，浓缩胶浓度为5％，稳流10mA电泳5小时；测得乙型肝炎表面抗原特异性蛋黄抗体IgY和乙型肝炎表面抗体特异性蛋黄抗独特型抗体的分子量均为180KD。
四、免疫原性组合物的稳定性试验(以乙肝特异性免疫原性组合物I为例)
取上述实施例1第六条中所制备的乙肝特异性免疫原性组合物I，以10mg/管分装小试管中，分别于-20℃冰冻、4℃、室温和37℃保存，其中37℃保存属于热破坏性试验。再定期进行其效价检测。实验结果表明：乙肝特异性免疫原性组合物于4℃保存，其稳定性至少可保持12个月以上；于-20℃冰冻保存，其稳定性至少可保持6个月以上；于室温(20℃)保存，其稳定性至少可保持2个月以上。该免疫原性组合物I以4℃保存稳定性最好。
五、免疫原性组合物中特异性复合物的检测(以乙肝特异性免疫原性组合物I为例)
用4％的聚乙二醇6000(PEG6000)检测上述实施例1中第六条所制备的乙肝特异性免疫原性组合物I中特异性复合物的含量：将4％PEG6000溶液与1∶100稀释的待检免疫原性组合物溶液混合，置4℃冰箱过夜后离心，将沉淀物用4％PEG6000溶液充分洗涤，重新溶解于0.01mol/L的NaOH中，在波长280nm下测量溶液的吸光度；也可利用散射比浊法直接测定PEG沉淀的免疫复合物；以不同浓度的热聚合IgG作为参考标准来计算免疫复合物的含量。结果表明：乙肝特异性免疫原性组合物I中的免疫复合物占45％另取上述乙肝特异性免疫原性组合物I经琼脂扩散和免疫印迹鉴定含有乙型肝炎表面抗原-蛋黄抗体IgY-蛋黄抗独特型抗体的特异性免疫结合复合物和乙型肝炎表面抗原特异性蛋黄抗体IgY-蛋黄抗独特型抗体的特异性免疫结合复合物。
六、免疫原性组合物生物安全性试验(以乙肝特异性免疫原性组合物I为例)
毒性实验用体重18-20g小白鼠10只，每腹腔注射上述实施例1中第六条所制备的乙肝特异性免疫原性组合物I0.5ml(6.0mg/ml)，连续观察7天，小白鼠的体重无一例减轻，无一例死亡，亦未发现任何不良反应。乙肝特异性免疫原性组合物的毒性实验表明：该免疫原性组合物具有较高的生物安全性。
实验例2：鸭乙型肝炎病毒感染模型的制备
用乙型肝炎病毒DNA阳性血清150μl对15日龄雏鸭进行腹腔注射，每隔15天对鸭血清进行乙型肝炎病毒表面抗原(用双抗体夹心ELISA法)和乙型肝炎病毒DNA(用聚合酶链反应法)检测，以持续3个月鸭乙型肝炎病毒表面抗原和乙型肝炎病毒DNA均为阳性作为鸭乙型肝炎病毒感染模型成功建立的标志。
实验例3：乙肝特异性免疫原性组合物I的动物试验
用上述实施例1中第六条所制备的乙肝特异性免疫原性组合物I对鸭乙型肝炎病毒感染模型进行动物实验，其中鸭血清乙肝表面抗原滴度(IU/ml)和鸭血清乙肝表面抗体滴度(IU/ml)的检测用双夹心ELISA法(试剂均由上海荣盛生物技术试剂有限公司提供)，鸭血清乙肝DNA拷贝值(copy/ml)的检测用荧光定量PCR(试剂由上海复星公司提供)方法；其实验结果见表2。
表2：实施例1制备的乙肝特异性免疫原性组合物的动物试验结果
| 组别 | 雏鸭感染模型只数 | 鸭血清乙肝抗原滴度(IU/ml) | 鸭血清乙肝抗体滴度(IU/ml) | 鸭血清乙肝DNA拷贝值(copy/ml) |
| 实验组：注射乙肝特异性免疫原性组合物 | 10 | 5例转阴＜0.015例阳性2.3-6.7 | 4例阳性3.6-9.56例阴性＜0.01 | 5例阴性＜1.0×1035例阳性4.1-6.5×103 |
| 对照组：注射人用重组乙肝疫苗 | 10 | 1例转阴＜0.019例阳性3.2-10.6 | 1例阳性3.6-9.59例阴性＜0.01 | 2例阴性＜1.0×1038例阳性5.2-9.1×104 |
| 鸭血清正常参考值 | 20只正常雏鸭 | ＜0.01 | ＜0.01 | ＜1.0×103 |
实验结果表明：实验组用皮下注射乙肝特异性免疫原性组合物I的乙型肝炎病毒感染鸭，在经过三周的免疫注射后，用ELISA检测感染鸭血清中的乙型肝炎表面抗原，其转阴率为50％；用聚合酶链反应(PCR)检测感染鸭血清中的乙型肝炎病毒DNA，其转阴率为50％；用ELISA检测感染鸭血清中的乙型肝炎表面抗体，其转阳率为40％。而对照组(对感染鸭皮下注射人用重组乙肝疫苗)感染鸭血清中乙型肝炎表面抗原的转阴率仅为10％、乙型肝炎病毒DNA的转阴率仅为20％、乙型肝炎表面抗体的转阳率仅为10％。
上述实验结果证明：本乙肝特异性免疫原性组合物I的治疗作用具有特异性强、毒副作用小等优点；该乙肝特异性免疫原性组合物I中的乙肝表面抗原、蛋黄抗体IgY和蛋黄抗独特型抗体及其免疫复合物更有利于抗独特型抗体模拟“内影像”抗原性的提呈，并且上述乙肝特异性免疫原性组合物I及其免疫复合物比单纯采用乙肝疫苗可诱生更高滴度的抗体产生和淋巴细胞增殖反应，从而更有效地诱生体液和细胞免疫反应，以达到对抗乙肝病毒保护肝脏组织细胞的目的。
实验例4：乙肝特异性免疫原性组合物的临床初步应用结果
通过对31例乙肝患者(其中慢性乙肝23例，活动性乙肝10例，乙肝病毒携带者8例)分别给予单独药物(干扰素300万单位)、实施例1中第六条所制备乙肝特异性免疫原性组合物I(称组合物I)和实施例1中第八条所制备乙肝特异性免疫原性组合物II(称组合物II)，并进行疗效观察和比较。实验结果表明：乙肝病毒表面抗原HBsAg转阴率组合物8(58.1％)明显高于组合物6)(38.7％)和单独药物组(9.7％)；乙肝病毒HBeAg转阴率后两组(54.8％)明显优于单独药物组(12.9％)；乙肝病毒HBVDNA转阴率后两组(51.6％)明显优于单独药物组(6.5％)；后两组患者血清ALT、DBIL及TNF-α水平明显低于单独药物组。表明乙肝表面抗原特异性蛋黄抗体IgY-氧化苦参碱导向治疗具有特异性强、毒副作用小等优点；本乙肝特异性免疫原性组合物II不仅具有免疫原性组合物I所具备的免疫协调和治疗作用，能够产生激活机体细胞及体液免疫的双重作用，而且该免疫原性组合物II还具有针对于乙肝病毒的生物导弹功能，因此对于乙肝病毒具有更强的特异性靶向杀伤能力，从而达到对抗乙肝病毒保护肝脏组织细胞的目的。
Claims (10)
1、一种预防和治疗疾病的免疫原性组合物，主要是由抗原、抗体和重组DNA组成，其特征在于：由有效量的抗原、抗体、抗独特型抗体、重组DNA和药用敷料组成，其中抗原、抗体、抗独特型抗体是纯化或重组的特异性抗原、抗体、抗独特型抗体；重组DNA是能够表达所述特异性抗原、抗体和抗独特型抗体中的任一种或其多种的重组DNA质粒；其中各组分重量比分别为：
抗原 0.001～99％
抗体 0.001～99％
抗独特型抗体 0.001～99％
重组DNA 0.01～99％
药用敷料 0.01～99％
2、根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其特征在于；在该免疫原性组合物中还含有特异性抗原Ag、抗体Ab和抗独特型抗体Ab2特异性结合后所形成的免疫复合物；所述抗独特型抗体包括Ab2α、Ab2β、Ab2γ、Ab2ε中的任一种或其组合；所述免疫复合物包括抗原-抗体复合物Ag-Ab、抗原-抗体-抗独特型抗体复合物Ag-Ab-Ab2α、Ag-Ab-Ab2β、Ag-Ab-Ab2γ、Ag-Ab-Ab2ε和抗体-抗独特型抗体复合物Ab-Ab2α、Ab-Ab2β、Ab-Ab2γAb-Ab2ε中的任一种或其组合。
3、根据权利要求1或2所述的免疫原性组合物，其特征在于：
所述抗原、抗体、抗独特型抗体和重组DNA是分别针对于同一种或同一类疾病相应免疫原的动物源性或人源性特异性抗原、抗体、抗独特型抗体和重组DNA；
所述抗原、抗体、抗独特型抗体是通过分离、纯化和基因工程技术包括噬菌体展示多肽、细菌表面展示多肽和人工合成多肽中的任一种或其组合途径获得的；
所述抗原、抗体、抗独特型抗体和重组DNA是针对于肿瘤免疫原、传染性疾病病原体免疫原、自身免疫病免疫原、过敏性疾病变应原、移植器官免疫原和畜禽传染病病原体免疫原的动物源性或人源性抗原、抗体、抗独特型抗体和重组DNA；
所述抗独特型抗体是针对于上述免疫原所对应的特异性抗体包括蛋黄抗体IgY的抗独特型抗体Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε中的任一种或其组合物；
所述重组DNA是能够表达上述疾病特异性抗原、抗体、抗独特型抗体的重组DNA；
所述免疫原包括恶性肿瘤、传染性疾病、自身免疫病、过敏性疾病、器官移植排斥和畜禽传染病病原体特异性的纯化或重组抗原、抗体、抗独特型抗体、重组DNA、组织细胞和细胞因子及其受体；
所述免疫原是蛋白质、多肽、粘多糖、脂多糖、糖蛋白、细胞核、细胞质、细胞膜、细胞表面受体、核蛋白、DNA、RNA、线粒体、微粒体中的任一种或其组合。
4、根据权利要求1或2所述的免疫原性组合物，其特征在于：所述免疫原性组合物包括肿瘤特异性免疫原性组合物、传染性疾病病原体特异性免疫原性组合物、自身免疫病特异性免疫原性组合物、过敏性疾病变应原特异性免疫原性组合物、移植器官特异性免疫原性组合物中的任一种或其组合；
所述免疫原性组合物包括畜禽传染病病原体特异性免疫原性组合物；所述免疫原性组合物是其纳米微粒或脂质体复合物。
5、根据权利要求1或2所述的免疫原性组合物，其特征在于：在该免疫原性组合物中还含有药用辅料；
所述药用辅料包括包衣材料、蛋白稳定剂、药用佐剂、免疫增强剂，其中包衣材料为丙烯酸树脂、羟丙基甲基纤维素及其衍生物；蛋白稳定剂为聚乙二醇、蔗糖、海藻糖；药用佐剂为氢氧化铝、表面活性剂、福氏佐剂；免疫增强剂为多聚糖、糖肽、糖脂和磷脂，其中脂类包括三棕榈酰丝氨酰甘油基半胱氨酸、单棕榈脂酸、双棕榈脂酸、三棕榈脂酸、棕榈酰赖氨酸、α-氨基十六烷酸、月桂酰肽脂中的任一种；所述脂类是以分子内佐剂的形式与上述免疫原性组合物中的特异性抗原、抗体、抗独特型抗体和重组DNA结合成复合物。
6、根据权利要求1或2所述的免疫原性组合物，其特征在于：在该免疫原性组合物中还含有免疫偶联物；所述免疫偶联物包括上述疾病病原体特异性抗体与放射性核素、药物和毒素以及细胞因子的偶联物中的任一种或其组合；其中所述放射性核素包括碘131I、磷32P、锶89Sr、钇90Y、钐153Sm、铼188Re中的任一种或其组合；所述药物包括抗癌药物、抗病毒药物、抗菌素、免疫调节药物和免疫抑制剂中的任一种或其组合；所述毒素包括包括篦麻籽毒素、相思子毒素、苦瓜毒素、氧化苦参碱、去甲斑蝥素、白喉毒素、假单胞菌内毒素以及绿脓杆菌外毒素中的任一种或其组合；所述细胞因子包括白细胞介素、集落刺激因子、肿瘤坏死因子、趋化因子中的任一种或其组合。
7、根据权利要求1或2所述的免疫原性组合物，其特征在于：该免疫原性组合物是任一种药剂学上所述的剂型；所述剂型包括注射剂、胶囊、口服液、气雾剂、贴剂中的任一种剂型。
8、一种预防和治疗疾病的免疫原性组合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)采用蛋白质盐析、柱层析纯化疾病特异性抗原或通过基因重组的办法制备疾病病原体特异性抗原；所述疾病病原体特异性抗原包括人类肿瘤、传染性疾病、自身免疫病、器官移植排斥及畜禽传染病病原体的纯化或重组特异性抗原；即得到该免疫原性组合物组分之一抗原；
2)通过免疫动物制备针对于上述抗原的单克隆或多克隆抗体；或通过基因重组的办法制备上述疾病相关病原体抗原的特异性抗体；即得到该免疫原性组合物组分之一抗体；
3)以步骤1)制备的疾病相关病原体特异性抗原为免疫原，多次重复免疫注射给禽类优选是鸡，待5-20天后禽类尤其是鸡的产蛋中即含有针对于上述疾病相关病原体特异性免疫原的蛋黄抗体IgY；所述的免疫原注射量为1-2ml，免疫原量10-500μg/ml+等量完全弗氏佐剂；
4)禽蛋尤其是鸡蛋去壳取黄，经灭菌处理后，先用5倍体积的0.1mol/L PH7.2磷酸盐-海藻糖稀释液稀释蛋黄；然后自-20℃到室温反复冻融，每分钟500-1000转低速离心后合并上清液备用；再向上清液中加入乙醇至终浓度为30-50％，静置沉淀后，取沉淀备用；最后取沉淀通过进一步浸提、萃取、浓缩、纯化、冷冻或喷雾干燥，即得到该免疫原性组合物组分之一蛋黄抗体IgY；
5)取步骤2)制备的针对于上述病原体抗原的抗体或步骤4)制备的蛋黄抗体IgY为免疫原，多次重复免疫注射给禽类优选是鸡，待5-20天后禽类尤其是鸡的产蛋中即含有针对于上述相应抗体包括蛋黄抗体IgY的蛋黄抗独特型抗体；所述的免疫原抗体Ab1的注射量为1-2ml，免疫原抗体Ab1的用量为10-2000μg/ml+等量完全弗氏佐剂；
6)重复步骤4)的过程，即得到该免疫原性组合物组分之一蛋黄抗独特型抗体；
7)取特异性基因片段经过聚合酶链反应后，提取和纯化表达上述疾病特异性抗原、抗体和抗独特型抗体的DNA片段，通过酶切后，与相应分子克隆载体重组，构建成上述疾病特异性抗原、抗体和抗独特型抗体的真核表达质粒，即得到该免疫原性组合物组分之一重组DNA；
8)根据实际需要按重量配比调制步骤1)所得的抗原、步骤2)所得的抗体或步骤4)所得的蛋黄抗体IgY、步骤6)所得的蛋黄抗独特型抗体和步骤7)所得的重组DNA，再辅以可接受量的药用辅料即得到所述的免疫原性组合物，其中各组分重量比分别为：
抗原 0.001～99％
抗体 0.001 ～99％
抗独特型抗体 0.001～99％
重组DNA 0.01～99％
药用敷料 0.01～99％
9)取步骤8)制备的免疫原性组合物经过无菌、安全及毒性试验合格后，再通过相应的制剂工艺制备成药剂学上相应的剂型；所述剂型包括注射剂、胶囊、口服液、气雾剂、贴剂中的任一种剂型。
9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)提取纯化或重组疾病相关病原体特异性抗原；
2)提取纯化或重组疾病相关病原体特异性抗体；
3)分别取上述抗原和抗体包括蛋黄抗体IgY作为免疫原，分别连续或同时多次重复免疫注射给禽类优选是鸡；还可将上述抗原和抗体包括蛋黄抗体IgY按1∶1比例混合后作为免疫原进行免疫注射；待5-20天后禽类尤其是鸡的产蛋中即同时含有针对于上述抗原的蛋黄抗体IgY和针对于上述抗体包括蛋黄抗体IgY的特异性蛋黄抗独特型抗体；
4)取上一步骤所得的禽蛋或鸡蛋，经灭菌处理后，先用5倍体积的0.1mol/L PH7.2磷酸盐-海藻糖稀释液稀释蛋黄；然后自-20℃到室温反复冻融，每分钟500-1000转低速离心后合并上清液备用；再向上清液中加入乙醇至终浓度为30-50％，静置沉淀后，取沉淀备用；最后取沉淀通过进一步浸提、萃取、浓缩、纯化、冷冻或喷雾干燥；如此一次性提取纯化，可同时得到蛋黄抗体IgY和蛋黄抗独特型抗体组合物；
5)取特异性基因片段经过聚合酶链反应后，提取和纯化表达上述疾病特异性抗原、抗体和抗独特型抗体的DNA片段，通过酶切后，与相应分子克隆载体重组，构建成上述疾病特异性抗原、抗体和抗独特型抗体的真核表达质粒，即得到该免疫原性组合物组分之一重组DNA；
6)根据实际需要按重量配比调制步骤1)所得的抗原、步骤2)所得的抗体、步骤4)所得的蛋黄抗体IgY和蛋黄抗独特型抗体组合物和步骤5)所得的重组DNA，再辅以可接受量的药用辅料即得到所述的免疫原性组合物，其中各组分重量比分别为：
抗原 0.001～99％
抗体 0.001～99％
抗独特型抗体 0.001～99％
重组DNA 0.01～99％
药用敷料 0.01～99％
7)取步骤6)制备的免疫原性组合物经过无菌、安全及毒性试验合格后，再根据实际需要，通过相应的制剂工艺制备成药剂学上相应的剂型；所述剂型包括注射剂、胶囊、口服液、气雾剂、贴剂中的任一种剂型。
10、根据权利要求1-2或8-9所述的免疫原性组合物的用途，其特征在于：应用于制备疾病生物预防和治疗剂以及食品、保健品添加剂，特别是应用于制备人类恶性肿瘤、传染性疾病、自身免疫病、过敏性疾病和器官移植排斥的治疗性疫苗以及食品、保健品添加剂；应用于制备畜禽传染病的治疗性疫苗以及畜禽饲料添加剂。
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