CN1768079A - 多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了不使用免疫佐剂、通过粘膜给药增强诱导抗体产生的多肽、含有该多肽的组合物及其应用。本发明通过提供：在氨基末端侧具有由多限制位型T细胞表位的氨基酸序列组成的肽的、隔着连接肽连接的在羧基末端侧具有B细胞表位的氨基酸序列的、并且又在上述多肽上结合了细胞粘附分子粘附基序的氨基酸序列的多肽、含有该多肽的组合物及其应用，实现了上述目的。

Description

多肽
技术领域
本发明涉及含有特定的抗原表位、即使不存在免疫佐剂也可以通过粘膜给药有效地诱导产生针对该抗原表位的特异抗体的多肽、含有该多肽的组合物及其应用。更具体而言，涉及用蛋白酶识别序列氨基酸所组成的连接肽将含有抗体产生对象的抗原的B细胞表位的多肽和T细胞表位连接在一起，再向该肽上连接由细胞结合基序氨基酸序列组成的肽，以此得到能够有效地诱导产生目的抗体的多肽、含有该多肽的组合物及其应用。
背景技术
当诱导机体产生只针对特定抗原的特异抗体时，通常单独采用纯化的抗原或连同具有使抗体产生活性增强的免疫佐剂(通过非特异性地刺激免疫体系，使针对抗原的特异性免疫反应增强的物质)一起给药到生物体的方法。作为针对各种感染症状最有效的防御手段，该方法得到广泛应用，特别是针对抗生素无效的病毒或微生物产生的毒素之类的没有其他有效的预防或治疗方法时，很多情况下诱导生物体产生针对上述病毒或毒素的抗体是唯一的对策。现在该方法的应用实例如下：用有机溶剂或紫外线照射等使病原微生物灭活，制备没有感染性的灭活疫苗、和使病原体减毒以此降低对生物体的病原性的减毒疫苗，除了骨髓灰质炎病毒疫苗外，全部通过注射从非口服途径给药。不过，当采用灭活疫苗时，为了获得防御所必需的抗体效价，需要多次重复注射，存在生物体负担大而且便利性差等问题。
此外，用活疫苗时，不仅保存稳定性差，而且在疫苗给药后，存在因为突发突变产生强毒性株造成生物体伤害的可能。而且，灭活疫苗、活疫苗有可能使生物体产生过敏性休克，安全性不足。为了能将病毒粒子本身或蛋白大分子用作免疫原，很多时候因为制成疫苗制剂时的稳定性差，为了保持稳定性需要用人血清白蛋白或明胶等作为制剂的稳定剂，因此不能否定用作稳定剂的物质中混入未知的感染性微生物，或生物体对稳定剂产生过敏性休克，所以上述疫苗存在缺乏安全性、稳定性的问题。此外，大部分疫苗都以注射剂形式制剂了，不过发生感染而夺去了很多人的生命的多数地区为发展中国家，所以为了使疫苗普及需要开发稳定性好的制剂，而且需要开发可以通过注射以外的更简便的方式给药的疫苗制剂。
为了解决上述课题，全世界都在努力开发研究利用具有比灭活疫苗或活疫苗更高安全性和有效性的、由灭活疫苗和活疫苗的的部分氨基酸序列组成的多肽的新型疫苗，以乙肝病毒疫苗为代表的重组型疫苗或非细胞疫苗(component vaccine)是新型疫苗的代表。不过，作为疫苗，期望其所用多肽的链长越短越好，但越短，涵盖的生物体个别存在的主要组织相容性抗原(以下，简称为“MHC”)的II类单元型限制性范围就越广，很难设计使其具有充分的免疫原性。此外，作为提高经粘膜给药时的抗原的免疫原性的方法，已知有用霍乱毒素(下面简称为“CT”)或来自大肠杆菌的热不稳定型的肠毒素、或取代了上述毒素的一部分氨基酸序列的减毒化物作为免疫佐剂和对象抗原一起给药的方法(Lavelle，E.C，Immunology、第99卷、30～37页(2000年))。但存在会针对目的抗原之外的、用作免疫佐剂的霍乱毒素、或来自大肠杆菌的热不稳定型的肠毒素产生抗体等问题，尚不能实际应用。
一方面，在牙科中，微生物造成的两大疾病包括龋齿和牙周病，上述疾病由于均为普通的疾病，并且不是致死性的，所以在预防或治疗该疾病时要求更高的安全性。作为预防龋齿的手段，例如：在特开平6-122633号公报中公布了利用来自变异链球菌的对牙齿表面有附着性的蛋白质的片段肽免疫动物而产生的抗体(被动免疫)的方法。在特表2002-511422号公报中记载了由来自变异链球菌的T细胞表位上同样的变异链球菌的B细胞表位(葡聚糖结合蛋白质)所构成的用于预防龋齿的疫苗。
与此不同，本发明人提出了下述方法，使用诱导产生已知具有龋齿预防效果的针对参与变异链球菌血清型C(Streptoccocu mutansserotype C)的向牙齿表面早期附着的表层蛋白质抗原(以下，简称为“PAc”)的抗体的体系作为实验模型，以开发通过经粘膜给药，在没有免疫佐剂存在的情况下，在多个MHC II类的单元型(基因型)的个体中，能有效地诱导产生针对PAc的抗体的短链多肽为目的，进行了研究。即，将具有从PAc氨基末端起的第365～第377号氨基酸序列的、序列表中序列1记载的氨基酸序列的肽用作B细胞表位，在该肽的氨基末端侧结合同时受到多个MHC II类单元型限制的T细胞表位，在其间用如：赖氨酸-赖氨酸序列构成的二肽连接链使二者线性地连接，以此增强能够抑制龋齿产生的抗体的产生(西泽俊树、今井奖、花田信弘、第4次日本疫苗学会学术论文集，抄录集，第77页(2000年)、Oishi，Y.等，Oral Microbiology and Imunology，第16卷，第40～44页(2001年))。不过，上述文献中公布的多肽也存在下述尚未解决的缺点，即，在没有免疫佐剂存在的情况下，经粘膜给药时，免疫原性弱，即使给药多肽也不能充分地诱导针对生物体的抗体。而且，在特表平8-504118号公报中虽然公开了在T细胞表位的羧基末端结合B细胞表位的、用于防止沙眼衣原体感染的合成肽疫苗，但经过粘膜给药，也不能诱导产生足够的抗体。
鉴于这种状况，本发明的课题是提供即使是经粘膜给药，也能在生物体内诱导产生足够量的目的抗体的、能够安全地给药的肽疫苗。
发明内容
本发明人为了解决上述问题，用由造成龋齿的微生物——变异链球菌的PAc(菌体表层蛋白质抗原)获得的片段肽作为模型，开展了可增强可有效防御造成龋齿的微生物的感染的抗体产生的多肽的研究。结果发现了下述多肽，在多肽的氨基末端侧具有含有同时受到多个MHC II类单元型限制(约束)的T细胞表位的氨基酸序列，二者用具有蛋白酶识别氨基酸序列的连接肽连接，在羧基末端侧具有含有用于诱导抗体的B细胞表位的氨基酸序列，而且，在该多肽上结合有具有与细胞结合基序相同的氨基酸序列，在没有免疫佐剂存在的情况下，通过经鼻等经粘膜给与方式给药该多肽时，在多个MHC II类单元型中，能有效地增强充分产生针对目的抗原的特异抗体，并且，诱导产生目的特异抗体以外的抗体的能力很低，此外，该多肽不引发过敏等副作用，是具有高安全性的多肽。即使没有免疫佐剂，通过粘膜给药时，该多肽也能诱导产生抗体，并且还发现该多肽具有免疫佐剂效果，由此完成了本发明。
即，本发明通过提供在氨基末端侧具有含有T细胞表位的氨基酸序列的、用连接肽连接、在羧基末端侧含有B细胞表位的氨基酸序列的多肽内具有与细胞粘附分子的细胞结合基序相同氨基酸序列的多肽，解决了上述课题。
具体实施方式
本发明中所说的抗体主要是IgG、IgM、IgA抗体，包括分泌到血液中或体液中的抗体，当然也包括分泌到鼻腔、口腔、眼、消化道等中的抗体。
本发明多肽的用于诱导抗体产生的部位是B细胞表位或含有该表位的氨基酸序列部分。作为B细胞表位，该肽的氨基酸序列可以采用来自微生物、细胞或肿瘤细胞的毒素、致敏原、酶、细胞膜抗原、肿瘤特异性抗原等抗原，这些可以是在文献中已经报道的上述各种的已知的抗原表位的氨基酸序列本身，也可以是实际上对生物体具有免疫原性的各种抗原本身，或也可以是根据常规方法，免疫抗原的部分肽，以此鉴定表位序列，具有该鉴定后的氨基酸序列的多肽。此外，该B细胞表位也可以和下述的T细胞表位在相同的抗原上，并且B细胞表位可以与其共有部分或全部的氨基酸序列。因此，相应于诱导抗体的使用目的，如：预防感染、预防或治疗癌、肿瘤、溃疡、肝炎等炎症性疾病、预防或治疗变态反应和遗传过敏性皮肤炎症等免疫性疾病等、中和酶、检测临床检查等中的各种抗原等，B细胞表位部分可以选择优选的抗原多肽。例如：为了诱导预防龋齿的抗体，可以使用西泽俊树、今井奖、花田信弘、第4次日本疫苗学会学术论文集，抄录集，第77页(2000年)中记载的上述PAc片段肽，具体而言，例如：具有序列表中序列1中记载的氨基酸序列的肽。可以直接使用这些含有B细胞表位的多肽，也可以串连连接成2倍体、3倍体或多倍体使用。此外，也可以串连连接同一抗原上存在的2种以上的B细胞表位，或将整个抗原作为B细胞表位。此外，治疗有多种抗原性蛋白质参与的疾病时，可以通过串连连接其B细胞表位，设计可用1条多肽产生针对多种抗原性蛋白质的抗体的多肽也可以。这种情况下，在各B细胞表位之间，通过插入下述的连接肽可更确实地进行各表位的加工。
此外，用于本发明多肽的含有T细胞表位的多肽的氨基酸序列，只要是受作为给药对象的包括人在内的哺乳动物、鸟类、爬行类、或鱼类的MHC II类单元型限制的、可以作为辅助T细胞抗原接受递呈的任何氨基酸序列或含有该氨基酸序列的序列均可。该多肽的氨基酸序列也可以采用根据文献已明确了的T细胞表位的氨基酸序列。或者对于实际的生物体，也可以根据常规方法，免疫抗原的部分肽，鉴定表位序列，将具有该鉴定后的氨基酸序列的多肽作为T细胞表位。该T细胞表位可以在含有上述B细胞表位的抗原上，也可以与B细胞表位共有一部分或全部其氨基酸序列。可以直接使用这些T细胞表位肽，或者使用串连连接的同种或多种T细胞表位。此外，即使是用其它氨基酸残基置换限制位(和MHC II类抗原结合所必须的氨基酸残基)氨基酸序列以外的氨基酸残基，只要能发挥T细胞表位功能也可以。所以，只要是保存了限制位的多肽就可以用作本发明所用的T细胞表位多肽。因此将本发明的多肽用于以预防或治疗为目的的预防感染或抗变态反应等时，为了能使之适用于较多患者，将针对多种MHC II类单元型的限制位串连或重叠(overlap)的多肽(所谓“多限制位型多肽”)，作为T细胞表位多肽部分是极为有用的。目前，在文献中报道了很多自MHC II类单元型的限制性肽的基本结构和限制位，参考上述文献，根据使用目的，可以设计含有T细胞表位的多肽也是可以的。此外，可以将串连或重叠异种动物的T细胞表位或限制位的多肽作为T细胞表位多肽使用，以此得到对多种动物有效的T细胞表位多肽。
此外，对于B细胞表位，设计成多个表位或重复、或串连连接的、能同时诱导多种抗体的多肽也是可以的。
当含T细胞表位的多肽和含B细胞表位的多肽互不连接，分别免疫时，不认为会有效地增强目的抗体的产生。另外，用连接了含B细胞表位多肽和含T细胞表位多肽的多肽免疫时，和目的抗体一起，同时诱导产生了识别连接部分的氨基酸序列的抗体的情况也是有的。为此，本发明的多肽设计成：在T细胞表位序列和B细胞表位序列之间插入成为蛋白酶识别序列的氨基酸序列形成的连接肽，通过抗原递呈中的加工过程(processing process)，使两条多肽经酶切割后分开，以此抑制诱导产生识别连接部分氨基酸序列的抗体。这样，其免疫原性优良、可以增强产生足够的生物体用以显示防御效果的抗体，可以使针对重组B细胞表位所来源的抗原性蛋白质的抗体的产生增强变为可能，而不是增强产生针对免疫肽的抗体。
本发明中的用于使含有B细胞表位肽和T细胞表位结合的连接肽只要是能被参与抗原加工过程的蛋白酶识别的序列，任何序列均可。具体而言，可以是赖氨酸-赖氨酸(KK)、赖氨酸-精氨酸(KR)、精氨酸-精氨酸(RR)等二肽，其中希望使用组织蛋白酶B可识别的序列赖氨酸-赖氨酸构成的二肽。应予说明，使用T细胞表位和B细胞表位重复存在的多肽时，通过用连接肽连接相同的多肽，可以使之各自发挥T细胞表位或B细胞表位功能。
作为本发明中使用的细胞粘附分子的细胞结合基序，只要是能够使本发明的肽长时间地保持在粘膜表面者就可以用于本发明。例如：可以使用包括以针对整合蛋白(integrin)家族的结合基序为代表的结合基序及其他细胞结合基序的氨基酸序列。例如：作为属于整合蛋白结合基序的氨基酸序列，有纤连蛋白、胶原、玻连蛋白、纤维蛋白原、层粘连蛋白、人免疫缺陷病毒(以下简称“HIV”)的Tat蛋白质等的细胞粘附分子上存在的结合基序而为人所知的，具有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD：序列表中序列2)、精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸(RED：序列表中序列3)、亮氨酸-天冬氨酸-缬氨酸(LDV：序列表中序列4)、脯氨酸-组氨酸-丝氨酸-精氨酸-天冬酰胺(PHSRN：序列表中序列5)、精氨酸-赖氨酸-赖氨酸(PKK：序列表中序列6)、天冬氨酸-甘氨酸-谷氨酸-丙氨酸(DGEA：序列表中序列7)等氨基酸序列的肽。此外，作为整合蛋白家族的以外的结合基序，可列举：酪氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸(YIGSR：序列表中序列8)、异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸(IKVAV：序列表中序列9)、精氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-缬氨酸-缬氨酸-甲硫氨酸-色氨酸-赖氨酸(RFYVVMWK：序列表中序列10)、异亮氨酸-精氨酸-缬氨酸-缬氨酸-甲硫氨酸(IRVVM：序列表中序列11)等氨基酸序列构成的肽。其中，RGD、RED、YIGSR的氨基酸序列构成的肽具有强的诱导产生特异抗体的能力，所以优选。此外，具有上述细胞结合基序的氨基酸序列的肽的连接部位可以从T细胞表位多肽的氨基末端侧或羧基末端侧、或B细胞表位的氨基末端侧或羧基末端侧共4个位置中选择，至少连接在其中的1个位置。特别是连接到T细胞表位肽的氨基末端侧或羧基末端侧的单侧或两侧的本发明的肽，因为能特别使针对B细胞表位多肽的特异性的抗体产生增强，所以优选。
本发明的多肽的制造方法没有限制，可以用常规的肽合成方法，或使根据常规的肽合成法预先部分地合成的肽彼此结合而制备(例如：参考社团法人日本生化学会编《新生化学实验讲座》，第1卷，《蛋白质VI》、第3～44页，1992年，东京化学同人发行)。或用各制造商销售的肽合成仪按照装置的操作手册合成该肽。或通过重组DNA技术制备本发明的多肽。例如：制备编码所设计的多肽的氨基酸序列的DNA，将该DNA插入到能自我增殖的载体中，将该载体导入到大肠杆菌、枯草杆菌、放线菌、酵母等微生物、动植物或它们的细胞或组织等宿主中，得到转化体，或制备转基因动植物，培养、繁育上述转化体后，采用适当的方法获取、纯化本发明的多肽。此外，本发明的多肽还可除连接T细胞表位和B细胞表位所用的参与加工酶切割部位的氨基酸序列以外的适当的构成蛋白质分解酶的切割部位的氨基酸序列连接，使之表达后，使用由该酶分解之后的肽也是可以的。进一步的，直接加工表达本发明的多肽的菌体、动物体或植物体，将其作为含有本发明多肽的用于口服摄取的组合物使用也是可以的。此外，本发明的多肽可以根据上述的任何方法直接制备具有全部氨基酸序列的多肽，或可以预先合成包含部分氨基酸序列的多肽，再使该其彼此化学性地结合。
本发明的多肽，可以就这样单独使用或组合多个含有相同B细胞表位的多肽而使用以诱导产生特异性的抗体。此外，为了使针对多种抗原的抗体同时产生时，使用组合2种以上的具有各抗原相对应的B细胞表位的多肽也是可以的。此外，只要不妨碍本发明的效果，可制备在本发明的多肽中组合药剂学上允许的1种或2种以上制剂添加剂的组合物。作为用于制剂的添加剂，可列举：葡萄糖、麦芽糖、海藻糖、蔗糖等还原性或非还原性的糖类，山梨醇、甘露糖醇、麦芽糖醇等糖醇、琼脂、支链淀粉、瓜尔豆胶、阿拉伯胶等水溶性高分子，明胶、蚕丝等蛋白质或其水解物、脂质、氨基酸、缓冲剂、稳定剂、抗菌剂、香料、营养功能食品、准药品或药品的有效成分，明矾、氢氧化铝等免疫佐剂等，可以适当组合使用1种或2种以上。此外，只要能长期稳定地保持制剂中的多肽，对含有本发明的多肽的制剂形式没有特别的限制，考虑到给药对象、给药方法、制剂的保存方法或输送方法，可以适当选择溶液、冻干制品、片剂、舌下剂、糖锭、粉末、颗粒、霜剂、软膏、糖浆等剂型。此外，根据需要可以将本发明的多肽或含有多肽的组合物封入脂质体中，通过并用皮肤、组织的浸透促进剂或离子导入法等，促进其向存在抗原递呈细胞的部位渗透。此外，可以使点心、糖果、清凉饮料等各种食品饮料中含有本发明的多肽，通过经口摄取上述食品饮料，经粘膜摄取多肽也是可以的。或直接将编码本发明的多肽的RNA给以生物体，通过向细胞导入DNA，即通过所谓的基因治疗等在生物体内表达本发明的多肽。
本发明的多肽可以使以人、狗、猫、小鼠为代表的哺乳类动物；以鸡、鸭为代表的鸟类；爬行类；鱼类特别是养殖鱼类等能产生抗体的动物针对病原性病毒、微生物、细菌等的结构蛋白质或其分泌的毒素产生抗体。所以能有效地预防或治疗肉毒素、大肠杆菌OH-157等细菌导致的食物中毒、破伤风、白喉、流感等感染性疾病。此外，通过产生针对淀粉样β肽的抗体治疗阿尔茨海默症，能够有效地产生针对螨、屋尘、花粉、食物等过敏原的特异的IgG抗体，可用作各种过敏或遗传过敏性皮炎等的经口降低致敏治疗方法。此外，本发明的多肽可以通过给药到口腔内、鼻腔、眼睛、咽喉、阴道、气管内、腹腔、胸腔、肺泡内、食道内和胃或肠等消化管内等的粘膜，在粘膜诱导产生IgA抗体和诱导向体液中产生IgG抗体，可按照常规的疫苗给药途径如：皮下、皮内、肌肉内等给药，并且，根据情况，也可以血管内给药。此外，本发明的多肽，不仅可以用来产生针对任意蛋白质或多肽的特异性抗体，而且可以用来产生针对单独的抗原性低的寡肽或多肽的抗体。所以，用合成寡肽免疫动物，以产生抗血清或单克隆抗体为目的，除了使用上述给药途径用于动物之外，可以用做在试管内致敏具有免疫功能细胞。
本发明的多肽通过与其他的抗原或源自其多肽上的B细胞表位的抗原性蛋白质同时给药到生物体中，可用做诱导产生针对同时给药的抗原的抗体免疫佐剂。此时的使用量只要能达到诱导产生针对同时给药的其他的抗原或源自其多肽上的B细胞表位的抗原的抗体即可，没有特殊的限制。当然，不期望诱导产生针对本发明的多肽的抗体时，本发明的多肽的给药量是其他抗原给药量的10质量％以下，优选1质量％以下，更优选0.1质量％以下。
对于包括人在内的动物给药本发明的多肽的方法没有特别的限制，可以是任何能让该多肽确切到达给药部位的方法。例如：可以使用点滴或注射器适量滴加到粘膜上，或经口摄取，或以霜或凝胶状涂布到粘膜上，也可以导管等在给药部位诱导。此外，也可以通过喷嘴、吸入器等以雾状吹入，使之吸入鼻、气管或肺中。向皮下、皮内、肌肉内、血管内、腹腔内或胸腔内等体腔内给药时，可以使用注射器、导管、点滴等给药方法。本发明的多肽的给药量可以考虑到诱导抗体的能力、疾病的种类、给药途径、给药方法、给药对象动物等而适当选择，通常为0.00001～100mg/kg体重，优选0.0001～25mg/kg体重，更优选0.001～10mg/kg体重。
下面根据实验例详细说明本发明的多肽。
实验例
考虑到希望开发可用作预防生物体感染的疫苗，将产生针对龋齿病原体，即变异链球菌血清型C(Streptococcus mutants serotypeC)的牙齿表面附着因子之一的PAc(菌体表层蛋白质抗原)的抗体体系作为模型，为制备能够经粘膜给药的、有效地诱导的、具有疫苗功能的多肽，进行了如下实验。此外，实验中的PAc中的氨基酸序列是从基因克隆、碱基序列、氨基酸序列、生物活性部位、B细胞表位、T细胞表位的分析中可知具有PAc分子交叉反应性的具有序列表中序列1记载的氨基酸序列的肽，已知该肽是能够诱导仅具有抑制龋齿活性的抗体的最小单位的肽抗原(以下称为“单位肽”)(参见H.SENPUKU等人，Infection and Immunity，63：4695-4703(1995))。并且，用下面的实验中使用的多肽全部是使用肽合成仪(Advanced Chemtech公司制造、Model 350 Multiple Peptide Synthesizer)以Fmoc法合成、使用TSK-GEL柱(柱尺寸：直径1cm，长30cm，东曹株式会社制造)用反相HPLC纯化的纯度为95％以上的标准品。
实验例1：针对单位肽的小鼠的MHC II类单元型的限制性分析
分别用上述单位肽(200μg/只小鼠)和弗氏不完全佐剂(FIA)共同腹腔免疫只有MHC II类的单元型不同的8种B10同类系小鼠(日本SLC株式会社销售，雌性，5周龄，每组5只)，2周后，用初次免疫相同的条件追加免疫。然后1周后采血，按照常规的ELISA方法，用单位肽或PAc作为包被抗原，测定血清中针对单位肽和PAc的抗体效价。结果如表1所示。并且，在下面的实验中，将从各小鼠中采血得到血液的血清分别连续2倍稀释，通过ELISA法，使用酶标记抗体测定针对各抗原的抗体效价，用微孔板读板仪(マルチスキヤンバイクロマテツク、ラボシステム公司销售)针对用于分析的微孔板的各孔，测定405nm处的吸光度，将该吸光度和未使用包被抗原的对照孔的吸光度比较，求得其差值为0.1以上的血清的最高稀释倍数，平均后，表示为抗体效价。此外，在同类系小鼠的种类的名称后，在括号内填写该小鼠的MHC II类单元型。
表1：
  同类系小鼠的种类   MHC II类单元型  针对PAc的抗体效价   针对单位肽的抗体效价
  B10.M   f   19112   35391
  B10.D2   d   1625   9314
  B10.BR   k   1135   4539
  B10.SM   v   138   75
  B10.S   s   138   75
  B10.Y   pa   75   75
  B10.G   q   75   45
  B10.RIII   r   40   25
Multisacn bioclomatic，
从表1可以发现和其他类型的MHC II类(H-2)单元型小鼠相比较，在小鼠MHC II类(H-2)的单元型为f、d或k型的B10.M、B10.D2、B10.BR的3种同类系小鼠中，很强地诱导产生出针对单位肽和PAc的特异性抗体(大约10倍以上)。所以可以明确在H-2的II类的d、f、k型的多个单元型的同类系小鼠中，该单位肽中共存有用于诱导抗PAc抗体的B细胞表位、和抗原递呈所必需的受到多个MHC II类单元型(H-2d，f，k型)限制的多个T细胞表位。此外，在13个残基的短链肽构成的单位肽中存在能同时应答MHC II类(H-2A)的多种单元型的、具有多限制位型T细胞表位的肽抗原，提示可以人为地设计出即使使用1条短的多肽，也能有效地在MHC II类单元型不同的多个个体中诱导抗体产生的T细胞表位的多肽。
实验例2：小鼠中的多限制位型T细胞表位的确认
为了确认实验例1中的单元肽上存在多限制位型的T细胞表位，同时为了确认在小鼠中具有多限制位型T细胞表位功能的氨基酸序列及其位置关系，进行了下述实验。合成将单位肽的氨基酸残基依次置换成缬氨酸的缬氨酸置换肽，用上述肽免疫上述单位肽应答小鼠，以此逐个推测对于抗体诱导不可缺少的氨基酸残基。然后，分别合成用缬氨酸同时置换与推测的限制位相关的全部氨基酸的位置限定的缬氨酸置换肽，用与实验例1相同的方法、日程安排，免疫各同类系小鼠。用与实验例1相同的方法，采用ELISA测定血清中的抗体效价，探讨该免疫的诱导抗体产生的能力，以此确定各MHC II类单元型相对应的单位肽抗体上的限制位。结果如表2所示。并且，表2中仅标记出用各MHC II类单元型所识别的单位肽上的氨基酸。
表2：
  1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13
  单位肽的氨基酸序列   Thr   Tyr   Glu   Ala   Ala   Leu   Lys   Gln   Tyr   Glu   Ala   Asp   Leu
  与B10.A(a)的小鼠的限制性相关的氨基酸   Ala   Lys   Gln   Ala
  与B10.D2(d)的小鼠的限制性相关的氨基酸   Glu   Leu   Lys   Asp   Leu
  与B10.M(f)的小鼠的限制性相关的氨基酸   Leu   Tyr   Glu   Leu
  与B10.BR(k)的小鼠的限制性相关的氨基酸   Thr   Tyr   Ala   Gln
从表2可以明确任何一个为了被各MHC II类单元型所识别的必需的4个或5个氨基酸残基(限制位)都以重复和移动(shift)的形式共存于13个氨基酸残基的单位肽分子内，确定了各MHC II类单元型所识别的氨基酸位置关系，作为在单位肽内的多限制位型T细胞表位。
实验例3：人为构建多限制位型肽抗原
从上述单位肽的氨基酸序列着手，探讨了是否能人为地使与MHCII类单元型所致限制相关的小鼠的免疫应答产生变化。有目的地将实验例2中确定的B10.D2(d)或B10.M(f)小鼠各自对应的限制位的一部分共存的单位肽分子上的部位(具有序列表中序列1的氨基酸序列的单位肽的氨基末端起第10～12个)的氨基酸残基置换成其他氨基酸残基，分别合成具有序列表中序列12(以下称为“YQTEL肽”)、序列13(以下称为“YETDL肽”)、序列14(以下称为“YETAL肽”)或序列1(以下称为“YEDADL肽”)中记载的氨基酸序列的肽、单位肽的羧基末端再结合了赖氨酸-谷胺酰胺-酪氨酸的、具有序列表中序列15(以下称为“YEADLKQY肽”)中记载的氨基酸序列的肽、以及在单位肽的氨基末端连接公知的PAc的氨基酸末端的305～318氨基酸序列的、在序列表中具有序列16记载的氨基酸序列的肽(以下称为“PAc(305～318)”)作为B10.S(s)小鼠识别T细胞表位的序列17(以下，称为“单位肽-PAc(305～318)”)或颠倒顺序连接上述两条多肽的序列表中序列18(以下，称为“PAc(305-318)-单位肽”)中记载的氨基酸序列的肽，将上述这些肽按照和实验例1相同的免疫方法、日程安排免疫一系列的同类系B10小鼠，追加免疫2周后，从各小鼠采血，从其中分离血清后，用生理盐水稀释512倍，用实验例1相同的ELISA方法进行测定，用405nm的吸光度比较各同类系小鼠中针对免疫所用各多肽的抗体产生的诱导程度。其结果如表3所示。此外，测定用单位肽-PAc(305～318)或PAc(305～318)-单位肽免疫的小鼠血清中的针对单位肽的特异性抗体的量，其结果如表4所示。并且，当吸光度为0.1以上时认为在稀释的血清中存在针对单位肽的抗体。
表3：
  同类系小鼠的种类   MHC II类单元型   针对单位肽的抗体效价(405nm吸光度)
  YQTEL肽   YETDL肽   YETAL肽   YEADL肽   YQADLKQY肽   PAc(305-318)-单位肽
  B10.A   a   0.01   0.01   0.01   0.28   0.29   0.29
  B10.D2   d   0.01   0.32   0.32   0.33   0.32   0.30
  B10.M   f   0.01   0.12   0.33   0.32   0.32   0.32
  B10.BR   k   0.22   0.31   0.30   0.30   0.30   0.30
  B10.S   s   0.01   0.01   0.01   0.01   0.01   0.31
  B10.SM   v   0.01   0.01   0.01   0.01   0.32   0.31
表4：
  同类系小鼠的种类   MHC II类单元型   针对单位肽的抗体效价
  用单位肽-PAc305-318)免疫   用PAc(305-318)-单位肽免疫
  B10.D2   d   7610   28695
  B10.S   s   106   108205
  B10.M   f   59986   108205
从表3可以明确，通过有目的地设计单位肽氨基酸，当用YQTEL肽免疫时，只有B10.BR(k)一种能被诱导产生抗体，而当用YEADL肽(单位肽)免疫时，除了B10.S(s)和B10.M(v)的3种小鼠都同时被诱导产生了抗体。所以可以明确，通过改变肽中的1～3个氨基酸的种类，能够在具有不同MHC II类单元型的个体中使其针对单位肽的免疫应答发生变化。如YEADLKQY肽这样的在单位肽的羧基末端添加赖氨酸-谷胺酰胺-酪氨酸的肽，能够诱导MHC II类单元型不同的、除了B10.S(s)以外的4种小鼠产生抗体。进一步的，如表3和表4所示，已知PAc(305～318)肽是能使对单位肽不应答的小鼠B10.S(s)产生应答的T细胞表位，在单位肽的氨基末端连接上述肽所得到的PAc(305～318)-单位肽这样的肽使包括s型在内的5种MHC II类个体同时诱导出针对该单位肽的抗体，成为多限制位型抗原。通过上述实验对抗原上的多个MHC II类单元型的限制性相关的氨基酸序列进行了分析，根据其结果，通过人为地设计具有受到各MHC II类单元型限制的氨基酸序列的重复了的氨基酸序列的肽，能够有效地诱导产生针对抗原的抗体，以此推测可以构建同时受到多个MHC II类单元型限制的重复型多限制位型T细胞表位。还发现通过使多个T细胞表位串联结合而制备的簇(cluster)型T细胞表位也和重复型表位一样，是能够针对多种受到MHC II类单元型限制的个体、有效地诱导抗体产生的T细胞表位。如表4所示，可以确定在用连接了PAc(305～318)和单位肽的多肽免疫的小鼠中，当免疫所用的多肽的羧基末端侧连接有单位肽时，比在氨基末端侧连接的情况下具有更强的增强其产生针对单位肽的抗体能力的倾向。
实验例4：人为构建人用多限制位型肽抗原
鉴于上述实验例3的结果，以公知的人MHC II类单元型(HLA-DR)限制的T细胞表位的限制基序(配置限制表位)为基础，构建了具有序列表中序列19中记载的氨基酸序列的、可以同时应答针对多种MHCII类单元型限制的重复-移动型的多限制位型肽(OverlappingMultiagretope Peptide：下面的实验中，简称该肽为“OMP”)，以此作为解决MHC II类单元型的限制性导致的人产生强弱不同免疫原性的对策。没有出示具体的数据，不过经确认该多肽即使在小鼠中也具有T细胞多限制位的功能。在表5中，只表示由人MHC II类的HLA-DR的各单元型所识别的OMP上的氨基酸。
表5
  1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14   15   16   17   18   19   20
  OMP的氨基酸序列   Leu   Ala   Val   Tyr   Trp   Glu   Leu   Leu   Ala   Lys   Tyr   Leu   Leu   Asp   Arg   Val   Gln   Lys   Val   Ala
  HLA-DR1限制相关的氨基酸   Tyr   Leu   Ala   Leu
  HLA-DR3限制相关的氨基酸   Val   Glu
  HLA-DR4限制相关的氨基酸   Tyr   Asp   Val   Gln
  HLA-DR5限制相关的氨基酸   Leu   Arg   Val   Lys
  HLA-DR6限制相关的氨基酸   Leu   Arg   Val   Lys   Ala
  HLA-DR7限制相关的氨基酸   Tyr   Leu   Leu
  HLA-DR8限制相关的氨基酸   Leu   Val   Lys
  HLA-DR11限制相关的氨基酸   Trp   Leu   Lys
实验例5：连接肽对多肽特异性抗体产生增强的影响
在实验例3中制备的短链的单位肽的免疫原性弱，为了增强其免疫原性，虽对串连连接的多肽进行了研究，但考虑到单独这样做会导致针对因连接而产生的新的表位的抗体的产生也增强，以正确递呈B细胞表位为目的，在含有T细胞表位的多肽和含有B细胞表位的多肽之间，插入在抗原递呈细胞中参与抗原的加工的内体内的蛋白酶(组织蛋白酶B)的识别序列KK作为连接肽，为了检测其对抗体产生增强的影响，进行了如下实验。从在实验例4制备的OMP中也含有小鼠T细胞表位的氨基酸序列出发，合成下述2种多肽：在该OMP和含有B细胞表位的肽所组成的单位肽之间插入了KK氨基酸的、在序列表中的序列20(以下，简称为“OMP-KK-单位肽”)的肽和序列21(以下，简称为“单位肽-KK-OMP”)的肽，用与实验例1相同的方法，腹腔内免疫BALB/c小鼠，和实验例1相同，采用ELISA测定血清中针对OMP、免疫的多肽以及PAc的抗体效价。结果如表6所示。
表6
  用作抗原的多肽   针对PAc的抗体效价   针对免疫的多肽的抗体效价   针对OMP的抗体效价
  OMP-KK-单位肽   836462   782685   1737
  单位肽-KK-OMP   961   29921   1211
从表6所示，可以发现隔着连接肽KK，将T细胞表位OMP置于多肽的氨基末端侧，将B细胞表位单位肽置于羧基末端侧，能够有效地诱导抗体。此外，即使在实验例3所示的小鼠的系统中也具有同样的结果，特别是在单位肽的氨基酸序列上没有T细胞表位，仅在PAc(305～318)氨基酸序列上存在T细胞表位的情况下，在B10.S(s)中的效果更加显著(参见表4)。综上所述，用连接肽连接，用氨基末端的肽作为T细胞表位，或者用羧基末端的肽作为B细胞表位会有效地被识别。
实验例6：通过附加到细胞粘附分子的细胞结合基序上，使肽抗原在鼻腔免疫中的免疫原性增强
具有序列表序列1的氨基酸序列的多肽能够诱导产生具有抗龋齿活性的抗体。用赖氨酸-赖氨酸组成的连接链连接两分子的上述多肽后形成的多肽(序列表中序列22：单位肽-KK-单位肽，下面称为“双单位肽”)，将其通过注射(皮下或腹腔)进行免疫，可以更有效地诱导产生抗体，并且不需要免疫佐剂。不过因为经鼻给药未显示出足够的诱导抗体的能力，所以需要同时给药免疫佐剂。因此以增强经鼻免疫的抗原性为目的，为使双单位肽在粘膜表面长时间停留，将通过整合蛋白家族等已经证明具有细胞粘附性的蛋白质(纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原等)的整合素蛋白结合基序或其他的细胞粘附基序的氨基酸序列附加到该肽上，为了检测其对免疫原性的影响进行了下述实验。即，在上述双单位肽的氨基末端连接上选自RGD、RED、LDV、PHSRN、RKK、DGEA和YIGSR、IKVAV、IRVVM和RFYVVMWK中选出的任意的1种或2种，合成多肽，另外仅以双单位肽和合成的在该多肽上连接单独不具有细胞粘附能力的钙粘蛋白相关的具有序列表中序列23(以下简称为“DRE”)、序列24(以下简称为“DED”)、序列25(以下简称“HAV”)中记载的氨基酸序列的肽作为对照，每组5只BALB/c小鼠(日本SLC株式会社，雌，5周龄)，将无菌地溶解在磷酸缓冲生理盐水(以下简称为“PBS”)或蒸馏水中的浓度为50μg/4μl的各种多肽溶液，按照各鼻孔2μl，共计4μl(50μg/知/次)，从鼻腔滴入使之吸入。并且，将经鼻仅给药双单位肽的组设为阴性对照，将双单位肽与1μg的CT共同给药的组设定为阳性对照组。另外还将单位肽-KK-单位肽和其上连接有RGD的多肽进行腹腔给药。在第一次免疫的2周后，分别按照和第一次免疫的相同条件，以相同种类、相同量的多肽经鼻给药，进行追加免疫。然后，再经过2周后，分别和上次按照同一种类、相同量的多肽的相同条件进行给药，1周后，按照和实验例1同样的ELISA方法分别测定针对小鼠血清中的PAc、双单位肽、CT、双单位肽上附加了细胞粘附氨基酸序列的多肽的各种抗体的效价。此外，针对附加了RGD或YIGSR的多肽，为了检测针对上述多肽的抗体产生的增强情况，还同时添加了过剩剂量的已知的上述肽的抑制剂RGDS(序列表中序列26)或YIGSR(序列表中序列8)，用同样的方法进行免疫。其结果如表7所示。在用添加了选自RGD、RED、LDV、PHSRN、RKK、DGEA和YIGSR、IKVAV、IRVVM和RFYVVMWK中的任意1种或2种以上序列的双单位肽免疫后的任意小鼠中，都发生了针对单位肽的抗体产生的增强，用附加了DRE、DED或HAV后的双单位肽免疫的小鼠中的任意一个都没有发生针对单位肽的抗体产生的增强。表7所示仅为以双单位肽、具有序列表中序列27(以下称为“RGD-双单位肽”)、序列28(以下称为“RED-双单位肽”)、序列29(以下称为“YIGSR-双单位肽”)、序列30(以下称为“DED-双单位肽”)、序列31(以下称为“HAV-双单位肽”)中记载的氨基酸序列的多肽进行免疫的结果。
表7：
  用作抗原的多肽   给药途径   针对PAc的抗体效价
  双单位肽   经鼻给药   640
  CT+双单位肽   32768
  RGD-双单位肽   5069
  RGDS-RGD-双单位肽   256
  RED-双单位肽   1395
  YIGSR-双单位肽   1195
  YIGSR+YIGSR-双单位肽   235
  DED-双单位肽   544
  HAV-双单位肽   320
  双单位肽   腹腔内给药   312
  RGD-双单位肽   2352
从表7可以发现单独用双单位肽经鼻给药后，几乎没有发现诱导产生针对双单位肽的抗体，与此相对，当用附加了整合蛋白结合基序RGD、RED、或附加了相对于层粘连蛋白结合蛋白质的层粘连蛋白分子上的结合基序YIGSR的RGD-双单位肽、RED-双单位肽或YIGSR-双单位肽经鼻给药时，表现出抗体产生增强效果。此时使对整合蛋白的结合抑制剂RGDS或YIGSR的短链肽过量共存时，能抑制针对PAc特异性抗体的产生。其结果表明附加RGD或YIGSR等细胞粘附分子基序能够进一步增强多肽具有的抗体产生诱导能力，该结果提示双单位肽通过结合存在于粘膜细胞膜的整合蛋白导致产生了这种效果。
实验例7：细胞粘附分子对经粘膜给药肽疫苗抗体产生增强的影响
为了对用实验例6的双单位肽所证明的附加整合蛋白结合基序所带来的对其他肽抗原的抗体产生增强的影响、以及因整合蛋白结合基序的附加部位的不同造成的对抗体产生增强的影响进行调查，开展了如下实验。在实验例5中已确认OMP-KK-单位肽具有增强针对PAc的特异抗体产生能力，向该肽的OMP或单位肽的氨基末端侧或羧基末端侧插入在实验例6中已显出增强诱导多肽抗体产生作用的细胞粘附分子的整合蛋白结合基序RGD，合成具有下述序列的共计4种多肽：“RGD-OMP-KK-单位肽”(序列表中序列32)、“OMP-RGD-KK-单位肽”(序列表中序列33)、“OMP-KK-RGD-单位肽”(序列表中序列34)、“OMP-KK-单位肽-RGD”(序列表中序列35)。用已知在经粘膜给药中具有佐剂活性的CT作为阳性对照。用上述多肽或多肽与CT的混合液，按照实验例6相同的方法，免疫B10小鼠，判断是否具有诱导抗体产生增强的效果。其结果如表8所示。
表8：
  用作抗原的多肽   针对PAc的抗体效价   针对免疫的多肽的抗体效价   针对OMP的抗体效价
  OMP-KK-单位肽   32   128   32
  CT+OMP-KK-单位肽   1454   1063   14
  RGD-OMP-KK-单位肽   11544   11514   32
  OMP-RGD-KK-单位肽   26241   24370   16
  OMP-KK-RGD-单位肽   169   723   16
  OMP-KK-单位肽-RGD   1981   9483   16
如表8所示可见，向OMP-KK-单位肽中插入了RGD，结果使针对PAc的抗体产生增强。特别是确认了将RGD插入到OMP的氨基末端侧或羧基末端侧时，换而言之，隔着连接链插入到其N末端侧时，能比用CT作为佐剂更显著地增强目的抗体的产生量，并且所诱导的抗体几乎都是能和PAc反应的抗体。另一方面，隔着连接链，插入到其C末端侧时，经确认所诱导的多数抗体是能和含RDG序列的肽部分反应的抗体。
由此可以确定，在无佐剂存在的条件下，隔着连接链以氨基末端侧的肽作为T细胞表位，或羧基末端侧的肽作为B细胞表位，即使经鼻免疫仍能有效，能有效地增强针对目的B细胞表位的特异性抗体的产生，而且，通过隔着连接链在氨基末端侧附加RGD序列，能够使所产生的抗体几乎都是只和PAc反应的抗体。
实验例8：经粘膜给药的肽疫苗的基本设计的普遍性
用OMP或单位肽以外的多肽置换以实验例7中制备的RGD-T细胞表位-KK-B细胞表位所组成的多肽的T细胞表位和B细胞表位中的任何一方时，为了研究上述置换对针对B细胞表位的抗体产生增强的影响，进行了如下实验。用已报道具有不分种属的广泛MHC II类单元型限制性的、序列表中序列36记载的、来自HIV IIIB gp120的多限制位型T细胞表位的T1肽(参见Ahlers J.D.，Proceedings of theNational Academy of Sciences USA，第94卷，第20期，10856～10861页(1997))作为T细胞表位(以下简称为“T1”)。用已知能在BALB/c小鼠中诱导针对卵白蛋白(以下简称为“OVA”)的抗体的、由序列表中序列37中记载的氨基酸序列所组成的、来自OVA的14个氨基酸残基的肽(以下简称为“OVAp”)(参见Hunt D.F.，Science，第256卷，1817～1820页(1992年))作为B细胞表位。合成“RGD-OMP-KK-OVAp”(序列表中序列38)或“T1-RGD-KK-单位肽”(序列表中序列39)所组成的多肽。此外，准备“OMP-KK-OVAp”(序列表中序列40)或“T1-KK-单位肽”(序列表中序列41)作为对照。将上述多肽分别按照和实验例6同样的方法，免疫BALB/c小鼠的鼻腔，其结果如表9所示。
表9：
  用作抗原的多肽   针对OMP的抗体效价   针对免疫的肽的抗体效价   针对OVA的抗体效价   针对CT的抗体效价
  OMP-KK-OVAp   108   1589   1656   未测定
  RGD-OMP-KK-OVAp   235   5080   11692
  CT+OMP-KK-OVAp   7319   21310   25654   3656835
  用作抗原的多肽   针对T1的抗体效价   针对免疫的肽的抗体效价   针对PAc的抗体效价   针对CT的抗体效价
  T1-KK-单位肽   103   160   320   未测定
  T1-RGD-KK-单位肽   107   1707   1579
  CT+T1-KK-单位肽   69   1152   176   139264
如表9所示可见，在用RGD-OMP-KK-OVAp或T1-RGD-KK-单位肽组成的多肽经鼻免疫的小鼠中，增强了OVA或PAc特异性的抗体产生。即，用附加了RGD的多肽免疫时，比用未附加RGD免疫时能更加增强抗体的产生。
实验例9：本发明的多肽使其他抗原的抗体产生增强的效果
通常，用作佐剂的CT的抗原性很强，已知当经鼻给药时，不仅能诱导产生针对CT的抗体，而且能够增强和CT同时经粘膜给药的、针对CT以外的抗原的抗体产生。另一方面，RGD-OMP-KK-单位肽、OMP-RGD-KK-单位肽、RGD-OMP-KK-OVAp或T1-RGD-KK-单位肽所组成的本发明的多肽在实验例7和实验例8中已经证明即使不用CT作为免疫佐剂，单独经鼻给药上述多肽也能诱导产生针对各多肽的特异性的抗体。为了进一步检测本发明的多肽是否具有增强产生针对其他抗原的抗体的作用，进行了以下实验。
<经鼻给药牛血清白蛋白所带来的对各种多肽的影响>
将4μg牛血清白蛋白(以下，简称为“BSA”)与下述1μg双单位肽、1μg RGD-单位肽-KK-单位肽、1μg OMP-KK-单位肽、1μgOMP-RGD-KK-单位肽、1μg OMP-KK-OVAp、1μg RGD-OMP-KK-OVAp或2μg CT中的任何一种混合，得到生理盐水溶液，分别按照和实验例6相同的方法，经鼻腔免疫BALB/c小鼠，测定血中的抗体效价。其结果如表10所示。并且测定针对BSA、针对与BSA一起给药的肽以及针对CT的抗体。
<经鼻给药卵白蛋白所带来的对各种多肽的影响>
将4μgOVA和1μg OMP-RGD-KK-单位肽、1μg OMP-RGD-KK-OVAp或2μg CT中的任何一种混合，制备得到生理盐水溶液，分别按照和实验例6相同的方法，经鼻腔免疫B10.D2小鼠或BALB/c小鼠，测定血中的抗体效价。其结果如表10所示。并且测定针对OVA、OMP-RGD-KK-OVAp以及CT的抗体。
表10：
  用作抗原的多肽   针对CT的抗体效价   针对BSA的抗体效价   针对免疫的肽的抗体效价
  BSA   未测定   32   未测定
  CT+BSA   1887437   838861
  双单位肽+BSA   未测定   179   83
  RGD-双单位肽+BSA   6912   154
  RGDS+RGD-双单位肽+BSA   55776   128
  OMP-KK-单位肽+BSA   20480   1152
  OMP-RGD-KK-单位肽+BSA   109227   213
  OMP-KK-OVAp+BSA   1441792   224
  RGD-OMP-KK-OVAp+BSA   1527887   256
  用作抗原的多肽   针对CT的抗体效价   针对OVA的抗体效价   针对免疫的肽的抗体效价
  B10.D2小鼠   OVA   未测定   203   未测定
  CT+OVA   681574   24576
  OMP-RGD-KK-单位肽+OVA   未测定   10242   24
  BALB/c小鼠   OVA   16   未测定
  CT+OVA   524288   4096
  OMP-RGD-KK-单位肽+OVA   未测定   2176   26
从表10可以明确，用BSA或OVA单独经鼻给药，几乎不能诱导在血液中产生针对上述多肽的抗体。与此相对，在BSA或OVA与OMP-RGD-KK-单位肽、OMP-KK-OVAp或RGD-OMP-KK-OVAp中的任何一种同时给药的小鼠中能够诱导产生针对BSA或OVA强的抗体。此外，在BSA和RGD-单位肽-KK-单位肽或OMP-KK-单位肽同时给药时，虽然能够诱导产生针对BSA或OVA的抗体，不过其增强的程度，比OMP-RGD-KK-单位肽、OMP-KK-OVAp或RGD-OMP-KK-OVAp同时给药的时候低。当BSA或OVA与CT同时给药时，可检测到产生了和用BSA或OVA与OMP-RGD-KK-单位肽、OMP-KK-OVAp或RGD-OMP-KK-OVAp中的任何一种同时给药时同等程度的抗体。不过，当在实验中同时给药1μg的OMP-RGD-KK-单位肽、OMP-KK-OVAp或RGD-OMP-KK-OVAp中的任何一种时，产生了很少量的针对上述肽的抗体，与此相对应，同时给药2μg的霍乱毒素时，能够很强地诱导产生针对CT的抗体。由此可以确定OMP-RGD-KK-单位肽、OMP-KK-OVAp或RGD-OMP-KK-OVAp和其他抗原同时经鼻给药时，能够产生自身诱导的抗体的量以下的量的、或诱导少量的针对自身的抗体，可用作免疫佐剂，诱导产生同时给药的自身以外的抗原的抗体。
从上述实验结果可以发现，组合多种T细胞表位和多种B细胞表位、在其间插入KK等蛋白酶识别序列的连接肽、然后再向该肽上附加细胞粘附分子的基序的多肽能够增强针对B细胞表位或含有该表位的抗原的抗体产生。此外发现，即使不并用免疫佐剂，经鼻之类的经粘膜给药上述多肽也能有效地诱导针对给药的多肽中的B细胞表位的抗体，并且，因为几乎不产生针对该表位以外部位的非目的抗体，可以用作特异性抗体产生的诱导剂、或抗体产生增强剂。此外表明，给药了上述多肽的生物体中，能有效地产生识别来自免疫所用的B细胞表位的抗原性蛋白质的抗体，不需要免疫佐剂，本发明的多肽能够以经鼻免疫为代表的经粘膜免疫中，诱导用于预防感染的防御抗体、或针对毒素、酶类的活性的中和抗体、或针对过敏原的抗体等的针对多种抗原的抗体。并且，在受到广泛MHC II类单元型限制的个体中也能有效的诱导抗体的产生，可以用作以预防感染等目的的、用于经鼻粘膜免疫的肽疫苗。此外，上述多肽和其他抗原同时粘膜免疫时，具有免疫佐剂功能。
下面通过实施例具体说明本发明的多肽，不过，本发明不受下述
实施例的局限。
实施例1：用于使针对PAc的抗体产生增强的组合物
将按照实验例7的方法制备的RGD-OMP-KK-单位肽、RGD-OMP-KK-单位肽、RGD-OMP-KK-单位肽以及OMP-KK-单位肽-RGD中的任何一种和α，α-海藻糖(试剂级股份公司林原生物化学研究所销售)溶解到蒸馏水中，制备为上述肽为100μg/ml、α，α-海藻糖为40％的溶液，根据常规方法灭菌，得到糖浆剂。将其按照每个灭菌管形瓶(vial)2ml分别分装，密封，制备含有多肽的糖浆剂。本品稳定性优异、由于受到广泛的MHC II类单元型的限制，可以在大多数人或动物中通过经鼻或经口给药，发挥有效地增强产生具有预防龋齿活性的抗体的疫苗效果。此外，通过经粘膜或经皮等给药本品，还可以作为增强与之同时给药的针对其他抗原的抗体产生的免疫佐剂。
实施例2：用于使针对PAc的抗体产生增强的组合物
将以实验例7的方法制备的RGD-T1-KK-单位肽溶解在含有1％(w/v)蔗糖作为稳定剂的生理盐水中，使之分别为10μg/ml、100μg/ml或1000μg/ml，过滤灭菌。将其按照每个灭菌管形瓶1ml分别分装，根据常规方法冻干、密封，制备含有多肽的制剂。本品为稳定性优异、预防龋齿的效果优异的可以经粘膜摄取或用于注射的制剂。可以将任何一种本品完全溶解在1ml注射用蒸馏水中使用。此外，因为任何一种本品的稳定性都优异、并且受到广泛的MHC II类单元型的限制，所以可以在多数人或动物中经过经鼻、或经口给药，能够有效地发挥增强产生具有预防龋齿活性的抗体的疫苗的效果。此外，本品通过经粘膜或经皮等给药，可用作增强与之同时给药的其他抗原的抗体产生的免疫佐剂。
实施例3：含有多肽的组合物的毒性试验
用含有0.5％蔗糖的生理盐水稀释实施例1或实施例2制备的多肽，使之达到12.5mg/ml，按照常规方法，将其经口、腹腔内或肌肉内给药到出生后5周龄的DDY系雄性小鼠中，检测LD50。将LD50换算成上述任何一种多肽的标准品的多肽的质量，均为100mg/kg小鼠体重以上，由此可见本发明的多肽即使给以人或者动物也没有毒性，是安全的制剂。
实施例4：用于使针对HIV的抗体产生增强的组合物
T细胞表位使用选自OMP、T1、据报道能与HLA-DR1、2、3、4、5、6、7、8、9、51、52、53结合的、具有序列表中序列42记载的与来自HIV-1的gag298-312肽相同氨基酸序列的肽、或序列表中序列43记载的具有和来自HIV-1的pol 596-610(参见Wilson，C.C.，Journalof Virology.75，4195-4207(2001))相同的氨基酸序列的肽的任何一种，将RGD配置在其氨基或羧基末端，隔着KK形成的连接肽，在羧基末端侧连接与序列表中序列44记载的氨基酸构成的HIV的gp120蛋白的V3的环肽相同的肽(Haynes，B.F，The Journal of Immunology，第151卷，1646～1653页，(1993年))作为用于能诱导HIV中和抗体的B细胞表位，制备上述多肽。从上述肽中选出1种或2种溶解到含有100mg/ml甘露糖醇的生理盐水溶液中，使之含量为150μg/ml。在5ml容量的管形瓶中将其按照每管形瓶1ml进行分装，根据常规方法冻干。本品因为受到广泛的MHC II类单元型的限制，可以对人通过经粘膜或经皮等进行给药，因为能有效地增强多数人中产生针对HIV特异性的抗体，可将其用作推迟HIV感染的蔓延或HIV感染者症状的发展的疫苗而加以使用。此外，本品通过经粘膜给药等，能用作免疫佐剂，使针对同时给药的其他抗原的抗体产生增强。
实施例5：用于使针对流感病毒的抗体产生增强的组合物
该肽如下：用选自OMP、T1、具有序列表中序列42和序列43记载的氨基酸序列的肽中的任一种作为T细胞表位，将RGD或YIGSR配置在其氨基或羧基的末端，隔着KK连接肽连接选自具有与来自序列表中的序列45记载的流感病毒的血凝素(HA)蛋白氨基末端的第91～第108号氨基酸相同的氨基酸序列的肽(Ben-Yedidia，T.，MolecularImmunolgoy，第39卷，323～331页，(2002年))作为在羧基末端的诱导流感病毒中和抗体的B细胞表位，按照常规方法合成该疫苗。将从上述多肽中选取的1种或2种溶解在含有0.5％人白蛋白的生理盐水溶液中，使之分别为75μg/ml。在5ml容量的管形瓶中将其按照每管形瓶1ml进行分装，按照常规方法冻干。本品因为受到广泛的MHCII类单元型的限制，可以在多数人或动物上，通过经粘膜或经皮等进行给药，因为能有效地增强产生针对流感病毒特异性的抗体，可以预防流感感染。此外，本品通过经粘膜给药等，可以用作免疫佐剂，使针对同时给药的其他抗原的抗体产生增强。
实验例6：乳突瘤病毒疫苗
用选自OMP、T1、具有序列表中序列42以及序列43中记载的氨基酸序列的肽中的任何一种作为T细胞表位，将RGD配置在该肽的氨基末端或羧基末端，隔着KK连接肽，在羧基末端侧连接用于诱导人乳突瘤病毒的中和抗体的、序列表中序列46中记载的具有与来自L2：蛋白的部分氨基酸序列相同的氨基酸序列的肽(Kawana，K.，Vaccine、第19卷，1496～1502页(2001年))作为B细胞表位，制备上述多肽。从上述多肽中选出任意1种或2种溶解在含0.25mg/ml的明胶的磷酸缓冲生理盐水溶液中，使之分别为200μg/ml。在5ml容量的管形瓶中将其按照每管形瓶0.5ml进行分装，根据常规方法冻干。本品因为受到广泛的MHC II类单元型的限制，可以对人通过经粘膜或经皮等进行给药，因为能有效地增强多数人产生针对乳突瘤病毒特异性的抗体，可以预防乳突瘤病毒感染。此外，本品通过经鼻给药等经粘膜给药，可用作免疫佐剂，使针对同时给药的其他抗原的抗体产生增强。
实施例7：用于产生OVA抗体的组合物
将以实施例8的方法制备的具有RGD-OMP-KK-OVAp氨基酸序列的多肽和α，α-海藻糖(试剂级株式会社林原生物化学研究所销售)溶解到蒸馏水中，制备为上述肽为100μg/ml、α，α-海藻糖为40％的溶液，根据常规方法灭菌，得到糖浆剂。将其按照每个灭菌管形瓶2ml分别分装，密封，制备含有多肽的糖浆剂。本品稳定性优异、可以在动物中通过经鼻或经口、经皮等进行给药，可以有效地增强针对OVA的抗体产生。此外，本品还可以用作免疫佐剂，通过经鼻给药等使针对与之同时给药的其他抗原的抗体产生增强。
实施例8：用于增强产生流感疫苗的抗体的组合物
制备每1ml生理盐水中含4μg市售的流感HA疫苗(藤泽药品工业株式会社销售)或HA或M蛋白质等病毒表面抗原性蛋白质以及1μg RGD-OMP-KK-OVAp或RGD-OMP-KK-单位肽的标准品，在灭菌的管形瓶中，将其按照每瓶0.5ml分别分装，密封。本品通过病毒表面抗原性蛋白质和RGD-OMP-KK-OVAp或RGD-OMP-KK-单位肽所具有的免疫佐剂的作用，直接能够增强原来经粘膜给药不能诱导产生抗体的流感疫苗通过经鼻等经粘膜给药产生抗体。本品每隔2周给药一次，通过鼻腔给药3～4次，能够用作增强防御流感感染的抗体产生的疫苗。
实施例9：用于松花粉症经口减致敏治疗的组合物
用具有选自OMP、T1、序列表中序列42以及序列43记载的氨基酸序列的肽中的任何一种，将RGD配置在该肽的氨基末端或羧基末端，隔着KK连接肽，在羧基末端侧连接用于诱导松花粉致敏原抗体的、Cryj1的B细胞表位的VHPQDGDA(Tamura，Y.，International Archivesof Allergy and Immunology，第123卷，第3期，228～235页(2001))和Cryj2的B细胞表位的KWVNGREI(Tamura，Y.，Clinical andExperimental Allergy，第33卷，第2期，211～217页，(2003年))作为B细胞表位，用KK连接，配置成具有序列表中序列47记载的氨基酸序列的多肽，将选自上述多肽的任意一种溶解在含用0.25mg/ml明胶的磷酸缓冲生理盐水溶液中，使之分别为200μg/ml。得到了松花粉症减致敏治疗的组合物。本品因为受到广泛的MHC II类单元型的限制，对人通过经粘膜或经皮等给药、在多数人中经过粘膜给药能够优异地产生针对松花粉致敏原Cryj1和Cryj2特异性的IgG抗体，可以用作经口给药的松花粉症经口减致敏治疗药物。
工业实用性
如上所述，本发明涉及含有特定抗原的肽，其目的是产生针对抗原表位的特异性抗体，即使在没有免疫佐剂存在的情况下，也能特异性地使抗体产生增强的多肽和含有该多肽的组合物。并且，本发明的多肽不必须使用免疫佐剂，此外，可以通过经鼻给药或经口给药等经粘膜给药加以使用，和由注射进行经皮给药相比，简单并且安全、又因为受到广泛的MHC II类单元型的限制，可以用作使包括人在内的多种哺乳动物或鸟类、爬行类、鱼类等产生抗体的动物用疫苗或用作用于增强产生特异性抗体的抗原。此外，本发明的多肽可以用作免疫佐剂，使与之同时给药的其他的抗原的抗体产生增强。
                     序列表
<110>株式会社林原生物化学研究所
<120>多肽
<130>101006
<160>47
<210>1
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<400>1
Thr Tyr Glu Ala Ala Leu Lys Gln Tyr Glu Ala Asp Leu
  1               5                  10
<210>2
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<400>2
Arg Gly Asp
  1
<210>3
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<400>3
Arg Glu Asp
  1
<210>4
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<400>4
Leu Asp Val
  1
<210>5
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<400>5
Pro His Ser Arg Asn
  1               5
<210>6
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<400>6
Arg Lys Lys
  1
<210>7
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<400>7
Asp Gly Glu Ala
  1
<210>8
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<400>8
Tyr Ile Gly Ser Arg
  1               5
<210>9
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<400>9
Ile Lys Val Ala Val
  1               5
<210>10
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<400>10
Arg Phe Tyr Val Val Met Trp Lys
  1            5
<210>11
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<400>11
Ile Arg Val Val Met
  1               5
<210>12
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<400>12
Thr Tyr Glu Ala Ala Leu Lys Gln Tyr Gln Thr Glu Leu
  1               5                  10
<210>13
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<400>13
Thr Tyr Glu Ala Ala Leu Lys Gln Tyr Glu Thr Asp Leu
  1               5                  10
<210>14
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<400>14
Thr Tyr Glu Ala Ala Leu Lys Gln Tyr Glu Thr Ala Leu
  1               5                  10
<210>15
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<400>15
Thr Tyr Glu Ala Ala Leu Lys Gln Tyr Glu Ala Asp Leu Lys Gln Tyr
  1               5                  10                  15
<210>16
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<400>16
Asn Glu Ala Asp Tyr Gln Ala Lys Leu Thr Ala Tyr Gln Thr
  1               5                  10
<210>17
<211>27
<212>PRT
<213>人工序列
<400>17
Thr Tyr Glu Ala Ala Leu Lys Gln Tyr Glu Ala Asp Leu Asn Glu Ala
  1               5                  10                  15
Asp Tyr Gln Ala Lys Leu Thr Ala Tyr Gln Thr
             20                  25
<210>18
<211>27
<212>PRT
<213>人工序列
<400>18
Asn Glu Ala Asp Tyr Gln Ala Lys Leu Thr Ala Tyr Gln Thr Thr Tyr
  1               5                  10                  15
Glu Ala Ala Leu Lys Gln Tyr Glu Ala Asp Leu
             20                  25
<210>19
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<400>19
Leu Ala Val Tyr Trp Glu Leu Leu Ala Lys Tyr Leu Leu Asp Arg Val
  1               5                  10                  15
Gln Lys Val Ala
             20
<210>20
<211>35
<212>PRT
<213>人工序列
<400>20
Leu Ala Val Tyr Trp Glu Leu Leu Ala Lys Tyr Leu Leu Asp Arg Val
  1               5                   10                 15
Gln Lys Val Ala Lys Lys Thr Tyr Glu Ala Ala Leu Lys Gln Tyr Glu
             20              25               30
Ala Asp Leu
         35
<210>21
<211>35
<212>PRT
<213>人工序列
<400>21
Thr Tyr Glu Ala Ala Leu Lys Gln Tyr Glu Ala Asp Leu Lys Lys Leu
  1               5                  10                  15
Ala Val Tyr Trp Glu Leu Leu Ala Lys Tyr Leu Leu Asp Arg Val Gln
             20                  25                  30
Lys Val Ala
         35
<210>22
<211>28
<212>PRT
<213>人工序列
<400>22
Thr Tyr Glu Ala Ala Leu Lys Gln Tyr Glu Ala Asp Leu Lys Lys Thr
  1               5                  10                  15
Tyr Glu Ala Ala Leu Lys Gln Tyr Glu Ala Asp Leu
             20                  25
<210>23
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<400>23
Asp Arg Glu
  1
<210>24
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<400>24
Asp Glu Asp
  1
<210>25
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<400>25
His Ala Val
  1
<210>26
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<400>26
Arg Gly Asp Ser
  1
<210>27
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<400>27
Arg Gly Asp Thr Tyr Glu Ala Ala Leu Lys Gln Tyr Glu Ala Asp Leu
  1               5                  10                  15
Lys Lys Thr Tyr Glu Ala Ala Leu Lys Gln Tyr Glu Ala Asp Leu
             20                  25                  30
<210>28
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<400>28
Arg Glu Asp Thr Tyr Glu Ala Ala Leu Lys Gln Tyr Glu Ala Asp Leu
  1               5                  10                  15
Lys Lys Thr Tyr Glu Ala Ala Leu Lys Gln Tyr Glu Ala Asp Leu
             20                  25                  30
<210>29
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
<400>29
Tyr Ile Gly Ser Arg Thr Tyr Glu Ala Ala Leu Lys Gln Tyr Glu Ala
  1               5                  10                  15
Asp Leu Lys Lys Thr Tyr Glu Ala Ala Leu Lys Gln Tyr Glu Ala Asp
             20                  25                  30
Leu
<210>30
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<400>30
Asp Glu Asp Thr Tyr Glu Ala Ala Leu Lys Gln Tyr Glu Ala Asp Leu
  1               5                  10                  15
Lys Lys Thr Tyr Glu Ala Ala Leu Lys Gln Tyr Glu Ala Asp Leu
             20                  25                  30
<210>31
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<400>31
His Ala Val Thr Tyr Glu Ala Ala Leu Lys Gln Tyr Glu Ala Asp Leu
  1               5                  10                  15
Lys Lys Thr Tyr Glu Ala Ala Leu Lys Gln Tyr Glu Ala Asp Leu
             20                  25                  30
<210>32
<211>38
<212>PRT
<213>人工序列
<400>32
Arg Gly Asp Leu Ala Val Tyr Trp Glu Leu Leu Ala Lys Tyr Leu Leu
  1               5                  10                  15
Asp Arg Val Gln Lys Val Ala Lys Lys Thr Tyr Glu Ala Ala Leu Lys
             20                  25                  30
Gln Tyr Glu Ala Asp Leu
         35
<210>33
<211>38
<212>PRT
<213>人工序列
<400>33
Leu Ala Val Tyr Trp Glu Leu Leu Ala Lys Tyr Leu Leu Asp Arg Val
  1               5                  10                  15
Gln Lys Val Ala Arg Gly Asp Lys Lys Thr Tyr Glu Ala Ala Leu Lys
             20                  25                  30
Gln Tyr Glu Ala Asp Leu
         35
<210>34
<211>38
<212>PRT
<213>人工序列
<400>34
Leu Ala Val Tyr Trp Glu Leu Leu Ala Lys Tyr Leu Leu Asp Arg Val
  1               5                  10                  15
Gln Lys Val Ala Lys Lys Arg Gly Asp Thr Tyr Glu Ala Ala Leu Lys
             20                  25                  30
Gln Tyr Glu Ala Asp Leu
         35
<210>35
<211>38
<212>PRT
<213>人工序列
<400>35
Leu Ala Val Tyr Trp Glu Leu Leu Ala Lys Tyr Leu Leu Asp Arg Val
  1               5                  10                  15
Gln Lys Val Ala Lys Lys Thr Tyr Glu Ala Ala Leu Lys Gln Tyr Glu
             20                  25                  30
Ala Asp Leu Arg Gly Asp
         35
<210>36
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<400>36
Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Ala Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala
  1               5                  10                  15
<210>37
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<400>37
Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu
  1               5                  10
<210>38
<211>39
<212>PRT
<213>人工序列
<400>38
Arg Gly Asp Leu Ala Val Tyr Trp Glu Leu Leu Ala Lys Tyr Leu Leu
  1               5                  10                  15
Asp Arg Val Gln Lys Val Ala Lys Lys Ile Ser Gln Ala Val His Ala
             20                  25                  30
Ala His Ala Glu Ile Asn Glu
         35
<210>39
<211>34
<212>PRT
<213>人工序列
<400>39
Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Ala Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala
  1               5                  10                  15
Arg Gly Asp Lys Lys Thr Tyr Glu Ala Ala Leu Lys Gln Tyr Glu Ala
             20                  25                  30
Asp Leu
<210>40
<211>36
<212>PRT
<213>人工序列
<400>40
Leu Ala Val Tyr Trp Glu Leu Leu Ala Lys Tyr Leu Leu Asp Arg Val
  1               5                  10                  15
Gln Lys Val Ala Lys Lys Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala
             20                  25                  30
Glu Ile Asn Glu
         35
<210>41
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<400>41
Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Ala Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala
  1               5                  10                  15
Lys Lys Thr Tyr Glu Ala Ala Leu Lys Gln Tyr Glu Ala Asp Leu
             20                  25                  30
<210>42
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<400>42
Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys Ile Val Arg Met Tyr
  1               5                  10                  15
<210>43
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<400>43
Trp Glu Phe Val Asn Thr Pro Pro Leu Val Lys Leu Trp Tyr Gln
  1               5                  10                  15
<210>44
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<400>44
Lys Arg Lys Arg Ile His Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys
  1               5                  10                  15
<210>45
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<400>45
 Ser Lys Ala Phe Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
   1               5                  10                  15
Ser Leu
<210>46
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<400>46
 Leu Val Glu Glu Thr Ser Phe Ile Asp Ala Gly Ala Pro
   1               5                  10
<210>47
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<400>47
Val His Pro Gln Asp Gly Asp Ala Lys Lys Trp Val Asn Gly Arg Glu
  1               5                  10                  15

Claims (15)

1.一种多肽，其特征是，在氨基末端侧具有含有T细胞表位的氨基酸序列，隔着连接肽，在其羧基末端侧具有含有B细胞表位的氨基酸序列，在具有上述氨基酸序列的肽的内部具有1种或2种以上具有1种或2种以上的细胞粘附分子的细胞结合基序的氨基酸序列。
2.权利要求1记载的多肽，其特征是，其中的连接肽是由1种或2种以上选自赖氨酸-赖氨酸、赖氨酸-精氨酸和精氨酸-精氨酸的二肽所构成的。
3.权利要求1或2记载的多肽，其特征是，其中的细胞粘附分子的细胞结合基序选自具有序列表中序列2、序列3、序列4、序列5、序列6、序列7、序列8、序列9、序列10以及序列11所记载的氨基酸序列的肽中的1种或2种以上。
4.权利要求1或2记载的多肽，其特征是，其中的细胞粘附分子的细胞结合基序选自整合蛋白家族的结合基序中的1种或2种以上。
5.权利要求1、2、3或4记载的多肽，其特征是，其中的T细胞表位为多限制位型。
6.权利要求1、2、3、4或5记载的多肽，其特征是，其中的B细胞表位来自致病性抗原性蛋白质。
7.权利要求6记载的多肽，其特征是，致病性抗原性蛋白质选自变异链球菌血清型C菌的表层蛋白质抗原、HIV蛋白质、流感病毒蛋白质、乳突瘤病毒蛋白质、卵白蛋白以及松花粉抗原中的1种或2种以上。
8.编码权利要求1、2、3、4、5、6或7记载的多肽的DNA或RNA。
9.导入了权利要求8记载的DNA的微生物或动植物。
10.一种组合物，其特征是，其中含有权利要求1、2、3、4、5、6或7记载的多肽和1种或2种以上制剂学上允许的制剂添加剂。
11.权利要求10记载的组合物，其特征在于还含有抗原性蛋白质。
12.一种产生抗体的方法，包括给药到生物体或使之摄取权利要求1、2、3、4、5、6、或7中记载的多肽、权利要求8中记载的DNA或RNA、权利要求9中记载的动植物或微生物、或权利要求10或11记载的组合物。
13.权利要求12记载的方法，该方法是通过经粘膜给药或摄取。
14.权利要求12或13记载的方法，该方法是用于预防或治疗疾病。
15.一种使针对抗原性蛋白质的抗体产生增强的方法，其特征是将权利要求1、2、3、4、5、6或第7项记载的多肽用作免疫佐剂。
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