CN1642967A - 用于传递治疗性化合物的以正常微生物群为基础的临床级载体 - Google Patents

Abstract

本发明提供了由含有至少一个转化核酸序列(包含至少一个目的基因)的正常微生物群载体组成的临床应用级载体。编码治疗性多肽的转化核酸可通过局部给药、口服、经鼻和/或皮肤给药而被传送到所需宿主。临床应用级载体从乳酸菌、酵母菌和其它非致病性微生物中获得，并被赋予选择和/或报告基因而不依赖抗生素抗性。另外，临床应用级载体具有表型的和/或遗传型的特征，限制转化的核酸序列在体内外的传播。本发明还提供了治疗动物疾病的有效的方法与药物组合物。

Description

用于传递治疗性化合物的以正常微生物群为基础的临床级载体

相关的申请

【0001】本申请由要求于2002年8月5日申报的美国临时申请号为60/401465，于2002年1月31日申报的60/353885号，于2002年1月31日申报的60/353923号，于2002年1月31日申报的60/353964号的优先权。以上临时申请的内容在此一并参考。

发明领域

【0002】本发明通过临床应用级载体将治疗性成分直接传递到所需解剖位置，从而治疗、减轻或预防疾病。特别指出的是本发明所用的临床应用级别载体是以天然正常菌群为基础，而且不含抗生素抗性选择标记，专门设计以限制转化的核酸序列在体内播散。

发明背景

【0003】过去25年，分子生物学和遗传学领域均取得了巨大的科学进步。我们对许多疾病的基因功能、异源基因表达和分子基础的了解也随着这些科学的进展而相应地得到发展。然而，许多有前景的、更好的分子生物学在医药方面的应用尚未实现。对于医务工作者和病人来说，新的分子基础的治疗和预防方法在变成可行的选择之前，仍需克服许多技术上和伦理上的挑战。

【0004】总起来讲，目前研究的以基因为基础的临床申请包括疫苗、基因替代疗法和治疗成分传递。宿主细胞转化可通过基因传递载体来实现，其载体包括非复制性病毒(见美国专利号(USPN)5,824,544)，裸DNA(见USPN6,261,834)，包含重组表达单位的脂质体(见USPN6,271,207)，微生物载体(见美国临时专利申请序列号60/353,885和60/353,923)。可分泌和/或表面表达治疗成分的基因传递载体(见美国临时专利申请序列号60/353,885和60/353,923)。其他分子水平治疗成分传递方法包括表面表达异源蛋白的非复制性重组病毒(见USPN6,376,236)。

【0005】目前重组治疗药物已在体外制备。大规模生物反应器可以增加细胞分泌的治疗药物的产量，同时收集和浓缩重组治疗药物的上清液。使用传统的药理学技术将治疗成分提取、纯化及合成。这一过程非常的昂贵，产量低且经常得到变性的蛋白质。因此，药物研究者已经试图通过使用重组微生物载体、无生命的载体和裸露DNA来研制体内药物表达的方法。

【0006】重组微生物载体包括：重组细菌(见USPN5,547,664)和重组病毒如α病毒(见USPN6,391,632)，牛痘病毒(见USPN6,267,965)，腺病毒(见USPN5,698,202)和腺伴随病毒(AVA)(见USPN6,171,597)。无生命的载体包括脂质基因传递载体如DNA/阳离子脂质体复合物，包裹DNA的中性或阴离子脂质体，脂质体吸附且被聚阳离子致密的DNA(LPDI和LPDII)(见C.1999.脂质体作为基因传递系统.Braz J Med Biol Res；32(2)：163-9)。然而细菌与病毒载体用于体内基因传递尚有许多技术难题需要克服。而且尚未见到使用脂质载体的成功临床实验。

【0007】对基因传递载体的认识成为基因治疗领域的前驱工作。“基因治疗”是描述三种不同治疗模型的术语。基因治疗最常见的形式是基因替代治疗，将不能提供必要基因产物的宿主细胞(目标细胞)转变成为基因产物提供细胞。基因替代研究通常集中在一些遗传性疾病上，如囊性纤维化、严重联合免疫缺陷病(SCID)和鸟氨酸转氨基甲酰酶缺陷(OTCD)。其他的基因治疗方法包括基因产品的体内合成，其中转基因产品本身是治疗剂或减轻剂。例如，编码细胞毒素的载体已被用于癌症患者。此载体转化癌细胞(目标细胞)所得的转基因表达可杀死癌细胞。第三种模型与第二种类似，然而不是作为治疗剂，此转基因的序列可在目标细胞内刺激或增强存在的凋亡机制，转基因表达导致细胞死亡。

【0008】目标细胞的转化可在体外或体内完成，取决于细胞本身，转基因的性质和转基因产物。体外转化细胞被重输入宿主细胞，紧接着转化基因在体内表达(见USPN5,399,346)。体内转化要求包括载体的转基因本身即为治疗剂(见USPN6,015,694)。不管细胞如何转化，基因治疗均由一种目标细胞和与其相关的基因传递载体组成，该基因传递载体具有编码治疗基因的核酸结构。由此，对于上述的遗传性疾病，“治疗基因”代替了一个缺失或缺陷的宿主基因。因此，宿主细胞变为转化细胞，生产出基因产物，而此产物是受者本身细胞中不存在的。

【0009】体外与体内基因转导有很大的区别。体外宿主细胞进行转化时，载体不直接进入宿主体内。因此，相对于载体直接进入宿主身体，降低了与载体有关的恶性反应的危险。例如，基因治疗成功的例子之一，W French Anderson和他的同事在体外情况下用一个基因编码的腺苷脱氨酶(ADA)转化SCID患者的T淋巴细胞。结果非常成功，以至于ADA转化基因治疗法已作为SCID的治疗法(除美国之外)。(Anderson W F，Balese RM，Culver K.1990.ADA人体基因治疗临床方案：对临床草案反应考虑要点，1990年7月6日。Hum Gene Ther Fall；1(3)：331-62；见Balese RM，Culver KW，Chang L，Anderson WF，Mullen C，NienhuisA，Carter C，Dunbar C，Leitman S，Berger M等，1993。使用人ADA基因转化的CD34+的自身固有的外周血细胞治疗由于腺苷脱氨酶缺失所致的严重的免疫缺陷综合症(SCID)，改善的临床研究方案，方案90-C-195，1992年1月10日。HumGene TherAug；4(4)：521-7)。

【0010】令人遗憾的是，并非所有的遗传性疾病都可以通过体外转化而得到很好的治疗。另外，同体外重组治疗产品一样，体外细胞转化也是一个困难且费时间的工作，不宜大范围使用。因此，用于基因治疗的体内基因转导方法同疫苗一样也是一个较有活力的研究领域。

【0011】最初，体内基因转导集中在使用重组病毒载体，然而，当Pennsylvania大学研究者对局部OTCD患者进行体内基因替换治疗实验时，使用病毒载体作为基因治疗和疫苗的理论上的危险性变的很明确(见Batshaw ML，Wilson JM，RaperS，Yudkoff M，Robinson MB.1999。局部OTCD患者体内重组腺病毒基因转化。美国费城Pennsylvania大学临床研究中心医院19104。Hum Gene Ther Sep 20；10(14)：2419-37)。在一次实验中，一位18岁的OTCD患者被给药含有鸟氨酸转氨基甲酰酶转基因的重组腺病毒转化载体，此载体假定不能复制且对人安全，令人遗憾的是，静脉注射给药4天后，患者出现大范围的系统炎症免疫反应，最终死亡。

【0012】然而，严重的全身炎症反应仅是与以病毒为基础的、传染性载体有关的许多安全问题之一。其它的危险包括：继发性肿瘤，重组形成复制性病毒，载体引起的全身免疫反应使得以后使用该载体时功效降低或丧失。因此，研究者正致力于非病毒转基因载体的研究。虽然非病毒载体不及病毒载体有效，但非病毒载体具有许多潜在的优点，如低毒、非限制性的转基因位置、潜在的可定位性、较容易大量生产等。更重要的是，非病毒载体通常无免疫原性，可反复使用同一种载体进行转染。

【0013】近年研究开发了一种体内基因转导和治疗的新方法，它是利用重组天然正常菌群作为载体(见本发明人USPPASN60/353,885和60/353,923)。来源的微生物的载体包括(但不仅限于)：乳酸菌属、乳球菌属、链球菌属、酿酒酵母等。这些载体优点很多，因为正常微生物群具有很大的免疫惰性、无致病性、较好的特征且存在于食物中，由此被管理机构“一般认为安全”(GARS)。另外，当被用于转导产生免疫性的抗原时，不论是表面表达或是分泌表达，重组天然微生物载体将转导它们携带的抗原直接到达免疫活性的细胞，如肠壁的M细胞。

【0014】另外，研究者开发了由人体致病菌衍生而得的细菌载体(与天然菌群不同)，包括志贺氏菌属、沙门氏菌属、李斯特菌单胞质基因(见例USPNs6,287,556；6,210,663和6,004,815)。但是，有潜在致病性的细菌所衍生的载体，尽管它们的细胞侵入性质很吸引人，但其生产、运输和使用时会对健康有危害。因此，由病原体所得的载体不能在人体医学中广泛使用。

【0015】不管是GARS菌(如正常菌群)还是减毒病原体(如肠道细菌)用于治疗申请，载体本身必须安全且容易适应变化的生产环境。其中最困难的挑战是不使用以抗菌素抗性为基础的选择性标记来开发细菌载体。简而言之，当一个细菌群被含转基因的质粒转染时，只有一小部分可以被成功转化。因此，如何将转化细菌与未转化细菌区别开就显得很重要。这需要一个选择性标记或鉴定标记，或两者均需。对于临床应用级载体，宜使用一个更合适的选择性标记。而最常用于分子生物学的选择性标记是抗生素抗性基因。抗生素抗性基因与质体核酸相连接，通常在基因的下段，由同一启动子调控。但是此结构也可变更。转化之后，细菌群置于一个含杀菌或抑菌抗生素的培养基中，细菌成功的转化将表达抗生素抗性基因；未转化细菌无此功能。因此含治疗基因的转化细菌将很容易被鉴定出，进而被纯化。

【0016】这样选择的转基因载体也同样具有抗生素抗性基因(可存在于染色体外的质粒或整合到其基因中)。每一种情况均有危险—抗生素抗性标记会被传输给宿主细胞或环境中其他微生物。另外，如果根据上述所引用的美国专利中的建议，将减毒肠道病原体作为载体，病原回复变异和抗生素抗性同时存在一个难以接受的公共健康问题。因此，仍需要一种非病原的免疫惰性的转基因载体在体内高效表达，可以直接到达特殊的靶细胞，且不存在转导抗生素抗性标记到非目的宿主细胞的危险。

发明概要

【0017】本发明提供了将治疗成分直接转导到所需解剖位置的重组载体。本发明中的临床应用级载体来源于天然正常菌群，该天然微生物可分泌和/或表面表达治疗性成分。按本发明的技术制备的传递载体由可表达及分泌治疗蛋白的非致病性酵母或细菌组成。本发明的非致病性酵母或细菌载体与其它非致病性酵母或细菌载体相比具有明显的优越性。尤其是，本发明的非致病性酵母或细菌载体不使用抗生素作为重组细菌和/或酵母的选择标记。

【0018】按本发明技术制备的传递载体(delivery vector)的另一个优点是避免基因向环境或体内的酵母和细菌传播。本发明也提供了运送酵母和细菌载体到肠道及其他黏膜的方法及组成成分。

【0019】本发明的一个具体实施例中，载体的选择是将天然菌群的一个或多个看家基因从基因组删除或者使其不可操作。因此，缺少该基因功能的微生物不能生存和/或复制。

【0020】本发明另一具体实施例：有功能的基因与质粒上的目的基因相连，且由同一启动子驱动。本发明的微生物载体用带有目的基因和看家基因的质粒转化后可旺盛生长，但未转化者不能增殖。

【0021】本发明的一个具体实施例：微生物载体的一个关键的复制酶发生突变，例如但不局限于胸苷酸合成酶(thyA)。

【0022】本发明的另一具体实施例：临床应用级载体含有克隆到组成性启动子下游的报告基因作为检测工具。适用于本发明的报告基因包括但不限于：绿荧光蛋白(GFP)、β-半乳糖苷酶、淀粉酶和氯霉素乙酰转移酶(CAT)。

【0023】上述载体以及根据本发明的技术制备的载体被命名为“临床应用级载体”。此处所用的术语“临床应用级”是指载体没有抗生素抗性基因或使用抗生素抗性作为筛选方法。另外，“临床应用级载体”也包括被设计成在宿主体外存活能力有限或不能存活的突变体。此处所说的宿主是本发明中临床应用级载体的受者。在这一点上需要注意的是，许多微生物包括用来制备本发明中临床应用级载体的天然正常菌群常常自发对一种或多种抗生素有抗性。天然微生物表现出的抗生素抗性(先不管它的机制与遗传元件)并非是此处所用的“抗生素抗性基因”。本发明所指的“抗生素抗性基因”是指赋予天然微生物抗生素抗性，从而作为选择转化微生物的方法。很明显，本发明中作为临床应用级别载体的许多微生物也许天然存在抗生素抗性基因。

【0024】本发明另一具体实施例：临床应用级载体可用于转导外源目的基因到宿主细胞。目的基因可编码治疗分子和转基因，包括(但不局限于)激素(例如：α-促黑色素细胞激素、胰岛素、生长激素和副甲状腺激素)和细胞因子(干扰素、白细胞介素(IL)-2、白细胞介素-4、白细胞介素-10、白细胞介素-12、粒细胞集落刺激因子、粒-巨噬细胞集落刺激因子、促红细胞生成素)。

【0025】本发明另一具体实施例提供了治疗或减轻动物炎症疾病的方法。

【0026】本发明另一具体实施例，炎症疾病是眼葡萄膜炎，动物包括但不限于灵长类动物、马、牛、猪、羊、啮齿动物、鱼及鸟类等。

【0027】本发明另一具体实施例：通过给动物用表达α-促黑色素细胞激素的临床应用级载体治疗或减轻眼葡萄膜炎。

附图说明

【0028】图1和图2描述了根据本发明的教导而筛选的thyA^-突变种。

【0029】图3描述了革兰氏阳性表达载体pSYMX的构建。

【0030】图4描述了根据本发明的技术构建的啤酒酵母表达载体p426GPD。

【0031】图5描述了根据本发明的技术构建的分泌α-促黑色素细胞激素的表达载体的流程图。

【0032】图6描述了根据本发明的技术构建的酵母细胞显示载体(pGPD-dsply)。

【0033】图7A和7B描述了本发明中的表达载体整合到酵母基因组。

【0034】图8描述了根据本发明的技术构建的质粒pSYMB6。

【0035】图9描述了根据本发明的技术构建的质粒pSYMB3。

【0036】图10描述了根据本发明的技术构建的thyA删除菌株和报告基因结构。

专业术语的定义

【0037】在陈述本发明之前，为更好的理解本发明，对文中将用到的某些术语先进行定义。

【0038】此处定义的“抗生素抗性基因”包括提供给载体作为选择系统的异源核酸序列。术语“抗生素抗性基因”不包括赋予自然微生物抗生素抗性的其他机制或基因。

【0039】此处定义的“临床应用级载体”表示由天然微生物的非致病细菌或酵母构建成的用于传递治疗性成分和/或基因的载体。本发明的临床应用级载体不使用抗生素抗性作为选择标记并且/或已被修饰使其在宿主外不能复制。

【0040】“可检测的免疫反应”是指动物体内针对抗原的抗体反应(体液的)或细胞毒反应(细胞的)。该抗原可通过常规的实验方法检测，包括(但不局限于)：酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫荧光测定(IFA)、补体结合测定(CF)、Western Blot(WB)。

【0041】此处定义的“目的基因”指编码我们想要表达的多肽或蛋白质的核酸序列。“目的基因”可以包括或不包括启动子或其他的调节成分。

【0042】“基因治疗”是指通过重组载体将目的基因转导到动物体内的特定位置。目的基因可以是编码治疗或预防性多肽或蛋白质的基因。其中包括(但不局限于)：细胞因子、抗炎剂、抗增生剂、抗生素、新陈代谢抑制剂/增强剂、免疫活性抗原和片段。另外，“基因治疗”同样包括针对遗传或非遗传性疾病的基因置换技术。

【0043】“宿主”指本发明中治疗成分的目的受体。宿主包括所有的动物。具体地说，宿主包括(但不局限于)：灵长类动物、马、牛、犬、猫、猪、羊、兔、啮齿动物、鱼及鸟类等。

【0044】“看家基因”指在宿主基因组或染色体外DNA上的一个核酸序列，其表达只受启动子与RNA聚合酶之间的反应控制，不需其他调控因子(组成性表达)。本发明中的“看家基因”是细胞活性的基础物质。该基因发生突变或对基因完全删除后，细胞如缺少补充物质就不能生长，除非被有功能的基因转化。

【0045】“免疫惰性”是指任何物质，包括微生物(如正常菌群)不能引起宿主的明显的免疫反应。此处使用的免疫惰性材料包括不锈钢，生物相容聚合物(如聚-L-丙交酯)，药用级塑料和本发明中的微生物。“显著的免疫”反应是指可能会限制或约束根据本发明技术研制的微生物载体在体内应用的任何免疫反应。可检测的免疫反应不一定是“显著的免疫反应”。

【0046】“分离的核酸”是指与任何天然核酸分子或跨过三个基因片段的基因组具有不同结构的核酸。因此它包含：(a)一个具有天然基因组DNA分子部分序列的DNA分子，但其两端序列与天然基因组中该序列两端的序列不同；(b)核酸以某种方式整合到原核细胞或真核细胞的载体或基因组DNA中，所得的分子与任何天然的载体或基因组不同；(c)一个插入分子，如cDNA，基因组片段，多聚酶链反应(PCR)产生的片段，限制酶切片段；(d)一个重组核酸序列是杂合基因的一部分，如编码融合蛋白的基因。不包括在此定义的是在(i)DNA分子，(ii)转染细胞，(iii)细胞克隆的混合物中的核酸分子，例如cDNA文库或基因组DNA文库。

【0047】“正常菌群”指与人体有关的天然非致病性细菌和酵母。非限制性举例包括乳酸菌及酵母。这些细菌和酵母通常不刺激宿主及受体的免疫反应，且普遍存在于所有动物中。

【0048】两个氨基酸序列或两个核酸的“同一性百分率(同源)”使用Karlin和Altschul运算法则定义(Proc.Natl.Acad.Sci.US 87：2264-2268，1990)，以Karlin和Altschul运算法则进行修改(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877，1993)。此运算法则合并到NBLAST和XBLAST程序中(J.Mol.Biol.215：403-410，1990)。BLAST核苷研究应用NBLAST程序，score＝100，字长＝12，得到与发明中核酸分子相同的核苷序列。BLAST蛋白质研究应用XBLAST程序，score＝50，字长＝3，得到与参考多肽相同的氨基酸序列(e.g.，SEQ ID NO：2).。为获得有间隙的基线达到比较的目的，使用Altschul中描述的Gapped BLAST程序(Nucleic Acids Res.25：3389-3402，1997)。当利用BLAST和有缺口的BLAST程序时，使用每一程序的默认参数(e.g.，XBLAST and NBLAST)。见 http：//www.ncbi.nim.nih.gov。

【0049】“报告基因”(reporter gene)是在编码目的基因的核酸上整合一个核酸序列，提供转化载体一个易于选择的表型。报告基因的非限制性举例包括(但不局限于)：绿色荧光蛋白(GFP)、β-半乳糖苷酶、淀粉酶和氯霉素乙酰转移酶。

【0050】“筛选标记”指将一种可鉴定的特征(表型)提供给根据本发明构建的转化载体。本发明的具体实施例中，筛选标记是一个报告基因。

【0051】“选择性标记”，“选择性基因”，“报告基因”，“报告标记”(指下文所说的“选择性标记”)指编码表型特征的核酸序列，利用该表型特征可以快速鉴别和分离转化的细菌载体。一般来讲，根据本发明制备的“临床应用级”的细菌载体应用的选择性标记不编码抗生素抗性。

【0052】“转基因”指利用cDNA技术，将一个基因以某种方式插入到细胞中，确使其功能、复制和遗传均如正常基因。

【0053】“转化的核酸序列”指含编码目的基因的核酸序列的质粒或其他表达盒。在本发明的一些实施例中，此核酸序列可以编码与某一缺陷或缺失的看家基因有关的一个或多个基因产物。在本发明的另一实施例中，此转化的核酸序列可编码目的基因和看家基因。“转化的核酸序列”还可以被用于表示此发明的某一具体化的“转基因”。“转化的核酸序列”亦可包括启动子和其它调控元素的核酸序列。发明的详述

1.引言

【0054】将治疗成分和核酸转导到人体中特定的靶位是药物发展工业面临的挑战。本发明人开发了由非病原性微生物组建的临床应用级载体，该微生物能够在表面表达或分泌治疗性的肽和/或蛋白质。在本发明的另一实施例中，非病原微生物包括(但不局限于)：革兰氏阳性乳酸菌(LAB)例如：嗜酸乳杆菌、短乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、德氏乳杆菌、德氏乳杆菌属保加利亚菌、瑞士乳杆菌、Lactobacillus pentosus、发酵乳杆菌、Lactobacillus amylovorus、乳球菌、Lactococcuscremoris、链球菌、戈氏链球菌；革兰氏阴性菌，如大肠杆菌、新月茎菌和酵母。

【0055】本发明包含新的成分及其制备和使用方法。在本发明的实施例中，此临床应用级载体使用非致病性微生物构建。此非病原菌包括乳酸菌、大肠杆菌、新月茎菌和啤酒酵母。此临床应用级载体可被编码具有治疗功能的蛋白质或多肽基因转化。转化的临床应用级载体可被用于局部的或全身的治疗或减轻疾病。

【0056】在本发明的一个实施例中，治疗性蛋白如(但不局限于)：抗炎剂、神经肽、白细胞介素，都可提呈到所需位置。在列举的一个非限制性实例中，本发明用于转导重组α-促黑色素细胞激素到眼部，用于治疗眼葡萄膜炎。

【0057】按照本发明的技术使用时，乳酸杆菌(LAB)是转导治疗成分及其相应的核酸的理想候选载体。简言之，LAB是哺乳动物胃肠道中正常寄生的微生物，在宿主微生态学上扮演重要角色，且被认为具有明确的治疗作用。这些治疗性质包括(但不局限于)：内脏微生态学、生理、免疫调节和抗菌效应。其他LAB相关的特征包括：释放到肠腔的酶与LAB粘附物互相促进来减轻肠吸收障碍的症状。另外，LAB酶帮助调节肠道pH值，促进芳香族氨基酸的降解。[Fuller，R.益生菌食物—现在的使用与未来的发展，IFI NR 3：23-26(1993)；Mitsuoka，T.双歧杆菌的分类学和生态学。双歧杆菌微生物3：11(1984)；Gibson，G.R.et al.，益生菌和肠道感染，p.10-39.In R.Fuller(ed.)，Probiotics 2：Applications and practical aspects.Chapman and Hall，London，U.K.(1997)；Naidu AS，et al.，乳酸菌的益生菌谱(LAB).Crit Rev Food Sci Nutr 39：3-126(1999)；Naidu，A.S.，Clemens，R.A.Probiotics，p.431-462.In A.S.Naidu(ed.)，天然食品抗菌系统Natural Food AntimicrobialSystems.CRC Press，Boca Raton，FL(2000)].本发明所指的乳酸菌包括链球菌、肠球菌、乳球菌、乳酸杆菌、明串珠菌、小球菌和双歧菌。

【0058】一般来讲，正常微生物群作为体内使用的重组载体有许多优点。正常微生物群是非致病性的，具有免疫惰性，有很好的表型和遗传型特征。微生物通常不需要复杂的营养，且繁殖较快，因此它们适用于大规模的生产。而微生物普遍存在于食物和天然产品中，人类食用通常认为安全(GARS)。但目前的细菌载体，包括LAB，使用抗生素抗性基因作为选择标记，因而不适于体内使用。本发明提供了不需使用抗生素抗性基因作为鉴定转化株的方法。

【0059】选择标记为研究者和技术人员提供了一个区别混合群中的转化微生物和未转化微生物的便利的方法。最古老且最有效的鉴别转化微生物的方法是：将一个可选择标记的核酸序列整合到含有目的基因的质粒中。选择标记序列通常插入目的基因的下游且受同一启动子驱动。结果，目的基因成功转化的细胞将同样被选择标记核酸序列转化。如抗生素抗性被用作选择标记，仅有已转化细胞可以在含抗生素的培养基中存活和/或生长。

【0060】当开发转化株时，抗生素抗性是一个便利且有用的表型。然而，用抗生素抗性基因作为选择标记的载体，可能发生水平基因转导，赋予其他微生物抗生素-抗性表型。当用微生物如LAB作为治疗性载体时，危险性很大。因此，管理机构不允许在活的减毒疫苗种中使用抗生素-抗性标记。

【0061】为使用正常微生物群作为人体基因转导系统，本发明人发明临床应用级载体系统，它不使用抗生素选择标记。本发明中取代抗生素抗性作为选择标记的临床应用级载体在关键的看家基因中有染色体删除或致命突变。进而将一个有功能的看家基因插入到编码目的基因的质粒。因此，看家基因成为快速鉴别和分离转化株的选择性标记。基础的看家基因可以编码任何代谢调节剂和/或酶类，包括(但不局限于)：激酶、蛋白酶、合成酶、脱氢酶和其它酶类。本发明提供的取代抗生素抗性基因的另一种临床应用级别载体是将报告基因整合到含有目的基因的质粒中。本发明描述的报告基因包括但不限于绿色荧光蛋白(GFP)、β-半乳糖苷酶、淀粉酶和氯霉素乙酰转移酶。

【0062】本发明的另一具体实施例中，相似的看家基因与靶基因包含在一个整合表达盒中(integrated expression cassette)。该整合表达盒被结合到宿主基因组DNA中，而不是染色体外质粒中。

【0063】本发明的一个具体实施例中，临床应用级载体选择了胸苷酸合成酶(胸苷酸合成酶)的基因。DNA合成需要胸苷酸合成酶。它刺激dUMP和5，10-亚甲基四氢叶酸转化为dTMP和7，8-二氢叶酸。胸苷酸合成酶突变株在缺乏或含有少量的胸苷或胸腺嘧啶的培养基中不能生长。因此，本发明人选择乳杆菌的胸苷酸合成酶突变株开发本发明中的临床应用级选择系统。细菌学家和分子生物学家也广泛了解如何检测特异缺失突变株的细菌菌群.。简言之，胸苷酸合成酶突变株的鉴别是以三甲氧苄二氨嘧啶的抗性为基础，其阻碍了通过胸苷酸合成酶基因产品使5，10-亚甲基四氢叶酸到7，8-二氢叶酸的转化。(见Fu，X和JG Xu.2000。利用胸苷酸合成酶基因作为选择性标记，开发嗜酸乳杆菌的染色体-质粒平衡致死系统。Microbiol.Immunol.44(7)，551-556)为选择甲氧苄氨嘧啶抗性突变株(thyA突变株)，乳酸菌(LAB)在一个含20μg/ml甲氧苄氨嘧啶和50μg/ml胸腺嘧啶的MRS培养基中生长(图1)。然后甲氧苄氨嘧啶-抗性突变株用包含胸苷酸合成酶基因的质粒进行转化。转化株在改良的无腺嘧啶MRS培养基中被选择出来。

【0064】与本发明表述相一致的整合表达盒可被整合到酵母和细菌染色体中。例如，异源基因一般可以在游离基因质粒表达到酵母中，在细胞内表达稳定性需要持续不断的选择性压力，这种压力通过调节生长培养基中成分产生。虽然可以在体外控制生长培养基中的成分，但体外营养调节通常并不可能实现。因此，可能出现酵母细胞的表达质粒的缺失和酵母蛋白转导系统功能的降低。为了解决这一潜在的问题，本发明人已设计出利用同源重组将表达试剂盒整合到酵母染色体之中的新方法。染色体的整合使表达试剂盒稳定存在，且改变对特殊设计生长培养基的要求。染色体整合的一个尤为重要的优点是防止DNA分子水平转移到其它酵母菌株或种属。

【0065】为将表达试剂盒整合进入酵母染色体之中提供了两种方法。其中实施例之一是提供一个整合的载体，此载体缺乏在酵母中复制必需的序列，但包含一个特殊染色体位点的同源序列。一旦转入到酵母中，此整合的载体在同源染色体位点通过同源重组进入染色体(见图7B)。然而，目标染色体序列也有可能在表达盒染色体整合上被复制(见7A)。这些已复制序列之间的染色体内同源重组可以颠倒表达盒的染色体结合，得到表达盒。

【0066】因此，本发明人提供了可选择的方法，使表达盒缺失最小化。在本发明的实施例中，在缺失质粒的情况下，表达盒被作为一个PCR产物整合，见图7B。染色体结合由PCR产品末端序列促成，与染色体目标位置的侧位序列同源。因此，此方法提供了同源重组目标序列的基因转化，使得染色体结合不能取消。

【0067】前述的非限制性样例适用于其他的临床受体，其受体包括裸露质粒DNA或整合表达盒。但是，下述本发明中的非限制性示范实施例的四种不同生物体将被使用。这些是革兰氏阴性菌大肠杆菌和新月茎菌，革兰氏阳性乳酸乳球菌，以及酵母。酵母内表达应在游离基因载体上，同样在进入酵母染色体的整合载体上。每一个表达系统所用的载体可购买或由已知的技术制备。每一个表达系统的详细情况列于下表1。

表1 本发明的示范载体

质粒	目标微生物	表达方式	启动子	参考或来源
					pCX	新月茎菌	分泌	Plac/可诱导的	Invitrogen1
pFliTrx	大肠杆菌	表达于鞭毛表面	λ噬菌体PL/诱导型	Lu2 et al.，1995
					pSYMB	乳酸菌	分泌	P32/组成型	Symbigene
pYD1	酿酒酵母	表达于细胞壁	Gall fromcerevisiae/诱导型	Invitrogen1
					p426GPD	酿酒酵母	细胞内的	GPD from S.cerevisiae/组成型	Mumberg3 et al，1995
pGPD-DSPLY	酿酒酵母	表达于细胞壁	As p426GPD	Symbigene(See FIG.6)
					pSecY	酿酒酵母	分泌	As p426GPD	Symbigene(See FIG.6)
pFL34	酿酒酵母	无	无	ATCC
					pHY304	乳酸菌	无	无	Yim4 et al.，1998

¹Invitrogen Life Technologies 1600 Faraday Avenue，Carlsbad，CA 92008

²Lu，Z.et al.(1995)Bio/Technology 13：366-372

³Mumberg D.et al.(1995)Gene 156：119-122

⁴Yim et al.(1998)Methods Cell Sci.20：13-20.

【0068】表1中的非限制性示范表达载体和质粒用下述疾病模型来测试临床功效。测试分泌型和表面型表达模型。正如前面所讨论的，本发明的临床应用级别载体可用于转导编码治疗成分的目的基因，包括(但不局限于)激素和细胞因子的转基因，(包括但不限于干扰素、白细胞介素-2、白细胞介素-4、白细胞介素-12、粒细胞集落刺激因子、粒-巨噬细胞集落刺激因子、促红细胞生成素、胰岛素、成长激素和副甲状腺激素)。

【0069】本发明的临床应用级别载体的另一方面包括提供载体，该载体可以减少或消除转基因成分扩散到环境中或包括细菌和酵母菌的微生物中去。治疗蛋白表达的未控制传播可能导致不理想的副反应。因此，本发明人已经设计了有效阻止表达载体散布的方法与成分。

【0070】在本发明的实施例中，表达盒整合到细胞(载体)的生长基础位置。例如，胸苷酸合成酶位点可能通过整合而中断，由此使载体微生物的生长需要有胸苷的条件。如果胸苷缺失，载体在宿主中生命期将受到限制。

【0071】在另一个实施例中，在微生物中控制诱导细胞死亡。这也许可以通过操纵转导微生物携带可诱导毒素基因来完成。微生物一旦诱导进入宿主，且转导治疗蛋白到目标位置，细胞即可通过毒素基因的表达的而被清除。一种非常好的可诱导的启动子是Peter Quail(UC Berkeley)描述的光激活的启动子(Shimizu-Sato S.，Huq E.，Tepperman J.M.，and Quail P.H.(2002)，Nature Biotech.20：1041-1044)。该启动子系统的激活依赖无毒性载色体的存在。毒性基因的表达可在提供的载色体条件下诱导；在动物肠道排泄物中排出微生物载体，激活毒性基因并清除重组微生物。在本发明中的临床应用级别载体使用的另一个可诱导启动子包括(但不局限于)pH诱导启动子(见美国专利No.6,242,194 issued to Kullen等)；大肠杆菌质粒中使用的乳糖诱导启动子(例如pBluescript from Stratagene)或乳酸菌中的内源乳糖启动子；在厌氧生长条件下的启动子，如乙醇脱氢酶(adhE)启动子。见Aristarkhov，A.等等，″乙醇脱氢酶(adhE)转录产物的翻译产生乙醇脱氢酶需要的RNA酶在大肠杆菌中的修饰″J.Bacteriology，Vol.178，No.14，4327-4332。

【0072】毒性基因的非限制性样例包括可诱导启动子控制下的细菌自溶素。溶素基因可以通过使用一个或多个上述可诱导启动子在胃肠道中合适的时间与位置激活。溶血基因样例包括但不限于AcmA(Buist G.等，(1997)″通过诱导过剩生产自溶血素达到乳酸菌的自我分解″Appl.Environ.Microbiol，63：27222728)；holin和细胞溶解酶(Henrich，B.等，(1995)″格氏乳酸菌抗菌素～抗利尿激素裂解基因的一级结构和功能分析″J.Bacteriology，Vol.177，No.3，723732)。酵母毒性基因能够杀死SMK1毒性基因(Suzuki C等，酿酒酵母中杀伤基因SMK1表达的致命作用.Protein Eng 2000，13：73-6)。另外，过量表达哺乳动物pro-apoptotic Bcl-2家族蛋白Bax的可导致酵母细胞死亡(Zha等.，酵母和哺乳动物细胞中proapoptotic蛋白Bax的结构-功能比较。Mol Cell Biol 1996，16：6494-508)。

【0073】对氧敏感的微生物工程菌是能够限制临床应用级别载体扩散的另一个方法。人体内脏环境含氧量较低，适合于厌氧微生物的生长，包括本发明中的细菌微生物。因此，一旦从人体肠道排泄物中进入氧含量丰富的外部环境，消除微生物传递载体的有效方法就是将工程基因转入对氧敏感的载体微生物中。

【0074】另外，本发明的临床应用级载体可以通过感染噬菌体产生裂解。适当的噬菌体非限制性样例包括φadh，φLC3，mv4，M13，T4，φ29，Cp-1，Cp-7，and Cp-9。在工程细菌摄入数小时或数天后引入噬菌体。第一次摄入细菌培养基可以在肠道内定殖和扩增。被噬菌体感染的第二次细菌培养应在第一次培养之后数小时或数天后再进行。当噬菌体裂解肠内细胞时，噬菌体微粒可以进一步影响和裂解工程菌，因此防止遗传物质向周围环境的扩散。

【0075】本发明示范性实施例包括但不限于下列治疗蛋白质

1α-促黑色素细胞激素(α-MSH)

α-MSH是一个神经肽，作为神经系统、内分泌系统和免疫系统的信号分子。此分子对控制发热、急性反应、免疫和炎症的中枢和外周反应非常重要。

2白细胞介素(IL)-10

白细胞介素(IL)-10是最早认识的“细胞因子合成抑制因子”(CSIF)，它由Th2细胞产生，而且抑制Th1细胞生产干扰素γ(IFNγ)、白细胞介素(IL)-2和肿瘤坏死因子(TNFβ)。IL-10同样可以抑制引起炎症的细胞因子的产生，例如IL-1α，IL-1β，IL-6 and TNFα，还有趋化因子如IL-8。由于有这些抗炎活性，补充IL-10可以潜在地用于治疗炎症和自体免疫疾病的治疗。我们的转导系统可以用于将IL-10转导到体内。人体IL-10由160个氨基酸组成，分子量是18.5KD。人体IL-10在很大程度上与牛、鼠、羊的IL-10序列同源，但存在种属特异性，因为人体IL-10不能与鼠的IL-10受体结合。对于IL-10活性的动物实验，我们将克隆和表达鼠的IL-10cDNA。

表2 本发明的质粒结构

质粒名称	目的基因
		pCX-MSH	MSH
pCX-3MSH	MSH
		pSYMB3	MSH(Figure 3)
pSYMB4	MSH see
		pSYMX-MSH	MSH
pSYMX-IL-10	IL-10
		pGPDL-MSH，pInt-MSH	MSH
pLongα-MSH，pInt-Longα-MSH	MSH
		pLongα-sp-MSH，pInt-Longα-sp-MSH	MSH
pGPDL-IL10，pInt-IL10	IL-10
		pSYMB6	ThyA，(Figure 8)
pSYMB7	ThyA integration
		pSYMB8	ThyA integration

实施例

【0076】本发明用下列例子进行举例说明。这些例子是仅为了举例说明的目的，而不是有意限制本发明。

                              实施例1

                   细菌和酵母菌种及其生长培养基

【0077】细菌和酵母菌种及其生长培养基：大肠杆菌K12菌株Top10F’(Invitrogen)用于克隆。使用下列菌株作表达：大肠杆菌GI826(为pFliTrx-基础载体)，茎细菌JS4000，干酪乳杆菌，植物乳杆菌，短乳杆菌，嗜酸乳杆菌和乳球菌和其的亚种，酿酒酵母菌株W303-1a(为p426GPD-基础表达载体)和Eby100(Invitrogen，为pYD1-基础表达载体)。酵母可在YPD或选择培养基中生长，从Qbiogene购买。大肠杆菌在添加氨苄(50-100μg/ml)或氯霉素(2-15μg/ml)的LB或RM培养基中生长(for pFLiTrx系统)，；茎细菌在添加氯霉素的M11培养基中生长(Invitrogen)；乳杆菌在添加红霉素(2-50μg/ml)的MRS培养基中生长；乳球菌在添加0.1％葡萄糖和红霉素(2-50μg/ml)M17的培养基中生长。酵母菌的转化根据http：//www.umanitoba.ca/faculties/medicine/biochem/gietz/method.html.中的手册完成。细菌细胞的转化通过Raya等描述的方法(1992，J.Bact.174(17)：5584-5592)。

                             实施例2-14

                              质粒结构

【0078】所有的限制酶和DNA修改酶均购于New England Biolabs。Hotstart pfu和Hotstart Herculase聚合酶购于Stratagene。寡聚核苷酸购于Genset Oligos，测序由Qiagen测序服务完成。下面所列的所有结构均通过测序进行校验。所有的质粒DNA制备使用Qiagen公司的miniprep kit完成。

                              实施例2

                           质粒pCX-MSH的制备

【0079】为了在pCX表达载体中表达MSH，合成了两个包含下列成分的互补的寡核苷酸：

【0080】在5’-端的-Bgl II识别位点，在3’-端的Not I识别位点。

【0081】编码人α-MSH的基因序列，经修饰后包含优化的密码子，可在原核细胞和酵母菌中最优化表达。

【0082】连接序列由聚甘氨酸和丝氨酸或丙氨酸组成，可保证α-MSH在融合蛋白中的构像稳定性。

【0083】两个寡核苷酸之一的序列为：(SEQ ID NO：1)MSHUP SEQ ID NO 3(5’-AGA TCTGGT GGC GGT GGC TCT TAT TCT ATG GAA CAT TTT CGT TGGGGT AAA CCT GTT GGT GGC GGTGCG  GCC GCG-3’)。将等量的MSH-编码的寡核苷酸混合和退火。修饰的pCX用限制酶Bgl II和酶切线性化，同样的限制酶消化α-MSH基因，用退火后的α-MSH基因片段连接pCX，转入大肠杆菌。

                              实施例3

【0084】编码MSH序列的三个串联考贝的双链核苷酸通过5或6个氨基酸分开，由Retrogen Inc合成并克隆到PCRBlunt(Invitrogen)质粒中得到PCRBluntMSH。其中核苷酸链的有意义链见SEQ.ID NO：2

Arg Ser   Leu Asp  Gly Gly Gly Gly Ser Tyr Ser Met Glu His Phe Arg

AGA TCT  CTA GAT GGT GGC GGT GGC TCT TAT TCT ATG GAA CAT TTT CGT

Bgl II     XbaI

Trp Gly Lys Pro Val Gly Gly Gly Ala Ala Ala  Ser Tyr Ser Met Glu

TGG GGT AAA CCT GTT GGT GGC GGT GCG GCC GCG TCT TAT TCT ATG GAA

                              NotI

His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Val Gly Gly Gly Gly Gly Ser Tyr Ser

CAT TTT CGT TGG GGT AAA CCT GTT GGT GGT GGC GGT GGC TCT TAT TCT

Met Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Val Gly Glu Leu Glu

ATG GAA CAT TTT CGT TGG GGT AAA CCT GTT GGT  GAG  CTC GAG

                                             SacI  XhoI

TAA  GGA TCC

     BamHI

【0085】用BgIII/Xhol酶消化3MSH，分离片段并将其亚克隆到用同样酶消化的pCX载体(Invitrogen)上，构建pCX-3MSH

                              实施例4

                           质粒pSYMB3的制备

【0086】质粒pSYMB3包含一个MSH分泌盒，该分泌盒由干酪乳杆菌乳酸脱氢酶基因启动子(Pldh)、Lb.amylovorus淀粉酶A基因的分泌信号和编码MSH三个串联考贝的序列组成。此质粒构建如下所述：首先，通过两个互补的单链核苷酸杂交形成一个252bp的双链寡核苷酸，将其克隆到pCR-Blunt载体中。所得质粒是pCR-Blunt/P-ss。P-ss包含LDH启动子，分泌信号和淀粉酶A基因的前10个密码子。在Pss片段的5’和3’端引入EcoRI和KpnI酶切位点。Pss端的序列显示如下(SEQ ID NO：3.EcoRI和KpnI酶切位点被加下划线)。5’- GAATTCTGAAAAAGTCTGTCAATTTTGTTTCGGCGAATTGATAATGTGTTATACTCACAATGAAATGCAGTTTGCATGCACATAAGAAAGGATGATATCACCGTGAAAAAAAAGAAAAGTTTCTGGCTTGTTTCTTTTTTAGTTATAGTAGCTAGTGTTTTCTTTATATCTTTTGGATTTAGCAATCATTCTAAACAAGTTGCTCAAGCG GCTAGCGATACGACATCAACTGATCACTCAAGCAAT GGTACC-3’然后，Pss片段通过EcoRI/KpnI酶切位点亚克隆到质粒pUC19中。所得到的质粒命名为pSYMB1。为了得到MSH序列，以PCRBluntMSH做模板，用tri-MSH核苷酸来扩增三-MSH。(5’-GG GGTACCAGATCTCTAGATGGTGGC-3’，[SEQ IDNO：4下划线是KpnI识别位点)，Tri-MSHRev(5’-CCC AAGCTTGGATCCTTACTCGAGCTCACC-3’，[SEQ ID NO：5].下划线是HindIII识别位点)。得到的PCR产物用KpnI/HindIII酶消化，将其克隆到pSYMB1的相同位点，用amyA分泌序列得到pSYMB2。最后，为了得到pSYMB3，pSYMB2经EcoRI/HindIII酶切后的片段中分离出MSH表达盒，将其克隆到用同样的酶切的穿梭载体pSYMB中。

                              实施例5

                          质粒pSYMB4的制备

【0087】构建pSYMB4质粒，PCR扩增三倍的MSH序列(见上)并将其克隆到pSYMB的XbaI/HindIII位点。

                              实施例6

                         质粒 pXYMX的制备

【0088】质粒PSYMX是一个可在革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中复制的穿梭载体。此载体的不同成分组合在质粒pBC SK(+)(Stratagene)上；这些成分列如下：

【0089】金黄色葡萄球菌质粒pE194(ATCC)的抗性基因(Em)-从pWV01(ATCC)得到的复制革兰氏阳性菌复制源。

【0090】干酪乳杆菌的胸苷酸合成酶基因，在胸苷酸合成酶突变宿主中提供一个临床应用级选择系统。

【0091】splA基因的转录终止序列，来自于短乳杆菌(ATCC 8287)(tslp)

【0092】干酪乳杆菌乳酸脱氢酶基因启动子(Pldh)和分泌信号来自于Lb.amylovorus(-ss)淀粉酶A基因。

【0093】上述不同的成分被装配到pBC SK(+)上，如下(同样见图3)：从pE194的ClaI/HpaII酶切片段中分离Em基因，且将其克隆到也用ClaI酶剪切的pBC SK(+)中)，得到pBCE。这一结构的结果是pBCE仅有一个ClaI酶切位点，是因为ClaI和HpaII DNA ends的杂交和后来的连接破坏了两种酶的识别位点。

【0094】然后，pWV01复制起始在ClaI酶切片段上分离，将其克隆到同样酶切的pBCE。在此结构中为了包含thyA基因，利用引物thyAPstIFor SEQ ID NO 6)：(5’-AACTGCAGTGCAGGCACAGCTTGATGCG-3’)和thyAHindIIIRev SEQ IDNO 7：(5’-cccaagc ttCCTTTTGTGTCATTGGTAAACC-3’)，从干酪乳杆菌染色体中通过PCR扩增，经PstI和HindIII酶消化，将其克隆到相同酶切的pBCEW得到pBCEWT。tslp是通过重叠PCR方法构建(见下面质粒pgpdl-msh的制备及图五对此方法的一般描述)，使用引物tslpABamHI/PstIup SEQ ID NO 8：(5’- TGATAATTATTATTTAGGTGAGCTTTGTTGATAAAAAGGTCTTTTCAACGTTTATGTTGGGGAGACC-3’)tslpABamHI/PstIlow SEQ ID NO 9：(5’-GTTTTTCCTAACAAAGGCCTAATFTTTTCAATATAAAAAGGTCTCCCCAACATAAACGTTGAAAAGACC-3’)作为长引物，tslpABamHIFor SEQ ID NO 10：(5’-CG GGATCCTGATAATTATTATTTAGGTG-3’)tslpAPstIRev SEQ ID NO 11：(5’-AA CTGCAGGTTT TTCCTAACAAAGGCC-3’)作为外围PCR引物。最终的tslp PCR产物用BamH I和Pst I两种酶消化且克隆到相同的酶切的pBCEWT，得到pBCEWTt。

【0095】为了得到干酪乳杆菌乳酸脱氢酶(LDH)启动子(ATCC 393)及Lb.amylovorus(-ss)淀粉酶A的分泌信号，通过两个互补的单链核苷酸杂交形成一个252bps双链寡核苷酸(P-ss)( )并将其克隆到pCR-Blunt载体中。所得质粒是pCR-Blunt/P-ss。P-ss包含LDH启动子，连接着分泌信号和淀粉酶A基因的前10个密码子。Pss末端序列显示如下：SEQ ID NO 12：5’- GAATTCTGAAAAAGTCTGTCAATTTTGTTTCGGCGAATTGATAATGTGTTATACTCACAATGAAATGCAGTTTGCATGCACATAAGAAAGGATGATATCACCGTGAAAAAAAAGAAAAGTTTCTGGCTTGTTTCTTTTTTAGTTATAGTAGCTAGTGTTTTCTTTATATCTTTTGGATTTAGCAATCATTCTAAACAAGTTGCTCAAGC GGCTAGCGATACGACATCAACTGATCACTCAAGCAAT GGTACC-3’

【0096】最后，完成构建pSYMX，利用寡核苷酸P-ssSacIIFor SEQ ID NO 13：(5’-TC CCCGCGGTGAAAAAGTCTGTCAATTTTG-3’)和P-ssXbaIRev SEQ IDNO 14：(5’-GC TCTAGAA TTGCTTGAGTGATCAGTTG-3’)，从pCR-Blunt/P-ss PCR扩增P-ss分泌信号，SacII和XbaI酶消化并克隆到相同酶切的pBCEWTt载体中。

                              实施例7

                         质粒pSYMX-MSH的制备

【0097】两个寡核苷酸MSH/XBAI/BAMHIUP SEQ ID NO15：( CTAGATCTTATTCTATGGAACATTTTCGTTGGGGTAAACCTGTTTAATGA G’-3’)和MSH/XBAI/BAMHILOW SEQ ID NO 16：(5’-GATCCTCATTAAACAGGTTTACCCCAACGAAAATGTTCCAGAGAATAAGAT-3’)杂交形成一个编码MSH的双链DNA分子，且克隆到表达载体PSYMX相同的末端。将此双链DNA分子克隆到pSYMX的XBAI/BAMHI酶切位点得到pSYMX-MSH。

                               实施例8

                        质粒pSYMX-IL-10的制备

【0098】，利用引物IL-10XbaIFor SEQ ID NO 17：(5’-TCA TCTAGAAAAGCAGGGGCCAGTAC AGC-3’)和IL-10BamHIRev SEQ IDNO 18：(5’-CCC GGATCCTTAGCTTTTCATTTTGATC-3’)，从一个鼠淋巴细胞cDNA文库中PCR扩增鼠IL-10的cDNA。IL-10PCR产物用XbaI和BamHI酶消化并连接到相同酶切的pSYMX-MSH载体。所得质粒是pSYMX-IL-10，其中一个编码IL-10的融合基因融合到的N-末端淀粉酶一个序列上。除分泌信号和启动子用于本发明革兰氏阳性构建外，本发明人同样使用拥有短乳杆菌slpA-表层蛋白的分泌信号和启动子的载体建造，ATCC 8287(美国马纳萨斯洲梵地冈模式菌种收集)和/或编码一个分泌蛋白质usp45的分泌信号，该蛋白来自乳球菌亚种lactis mg1363)。

                              实施例9

                        酵母MSH表达载体的制备

【0099】构建三种不同MSH衍生质粒。pGPDL-MSH包含20个氨基酸，该氨基酸来自于分泌酵母α-偶连因子的前导序列融合到MSH编码序列。在质粒pLong MSH和pLongα-sp-MSH中，α-偶连因子的序列延伸到85氨基酸，包含Kex2蛋白酶识别位点，从MSH α-前导序列中除去。与此相比，pGPDL-MSH促进MSH的表达该MSH以α-偶连因子前20个氨基酸的融合形式分泌。MSH序列与pGPDL-MSH和pLong α-sp-MSH的α-前导序列以两个氨基酸间隔分离开；但在pLongα-MSH中，α-前导肽直接融合到MSH。

【0100】构建GPDL-MSH如下：通过重叠PCR方法构建α-leader-α-MSH的融合(图5)。两个长寡核苷酸，ALPHALEADER(SEQ ID NO：19)和MSHPEPTIDE(SEQ ID NO：20)通过3’-端互补结合。ALPHALEADER(SEQ ID NO：19)(ATGAGATTT CCT TCA ATT TTT ACT GCA GTT TTA TTC GCA GCA TCC TCC GCA TTAGCT GCT GGT GCT TCT TAC TCT ATG)编码α-前导肽，跟随着两个氨基酸间隔基和α-MSH的前四个氨基酸。MSHPEPTIDE(SEQ ID NO：20)(TTA AAC TGG CTT ACC CCA TCT GAA GTGTTC CAT AGA GTA AGA  AGC  ACC AGC AGC TAA TGC)包含MSH基因的非编码链，跟随ALPHALEADER寡核苷酸的3’-端的互补序列。在PCR反应中，上述提到的长核苷酸杂交并形成一个模板，利用pfu聚合酶构建一个编码α-leader-α-MSH融合蛋白双链分子。在同一个PCR管中，包含两个附加PCR扩增寡核苷酸，扩增融合结构，同时提供了用于克隆的限制性酶识别位点。PCR用的寡核苷酸是PCR fwd(SEQ ID NO：21)(GGGAATTCATGAGATTTCCTTCAATTTTTAC)，和PCR rev(SEQ ID NO：22)(GGAAGCTTTTAAACTGGCTTACCCC)。最终的PCR产品，用EcoRI和HindIII酶消化，并克隆到p426GPD中，得到pGPDL-MSH。

【0101】pLong sp-MSH和pLong MSH质粒构建如下：)，利用核苷酸LALPHAfwd(SEQ ID NO：23)(5’-ATGAGATTTCCTTCAATTTT TACTGC-3’)和其它LALPHArev(SEQ ID NO：24)(5’- ATAGAGTAAGAAGCACCTCTTTTATCCAAAGATACCC-3’)或LALPHAw/osprev(SEQ ID NO：25)( TGTTCCATAGAGTAAGA TCTTTTATCCAAAGATACCC)，从酵母染色体中PCR扩增-偶连因子的前85个氨基酸，分别生成PCR产物A和B。在核苷酸反向的序列中，有下划线的序列对应于MSH的3’-端反向链，黑体表示的核苷酸是指间隔-氨基酸密码子的反向链。PCR产物A和B作模板，分别用于以后的PCR反应来构建Longp-MSH和Long MSH的融合。后面的PCR反应用核苷酸EcoLALPHAfwd(SEQ ID NO：26)(5’-GCGAATTCATGAGATTTCCTTCAATTTTTAC-3’)预先准备，并结合另一个引物LALPHAMSHrev(SEQ ID NO：27)(5’-GGAAGCTTAAACTGGCTTACCCCATCTGAAGTGTTCCATAGAGTAAGAAGCACCTC-3’)或LALPHAMSHw/oSPrev(SEQ ID NO：28)(5’-GGAAGCTTAAACTGGCTTACCCCATCTGAAGTG TTCCATAGAGT)来分别构建Long -sp-MSH或Long MSH。将最终的PCR产物克隆到p426GPD的EcoRI/HindIII酶切位点，构建MSH表达质粒pLong -MSH和pLong -sp-MSH.

                              实施例10

                       GFP-细胞壁显示载体的构建

【0102】作为蛋白表达的目标载体，pGPD-DSPLY的功能显示在细胞壁上。PCR引物的名称和序列用于构建pGPD-DSPLY，它的衍生物列于表3。pGPD-DSPLY包含编码酵母-偶连因子前导序列的序列和酿酒酵母α-凝集素的细胞壁固定区((C-末端350氨基酸)。首先，编码α-前导肽序列跟随两个氨基酸间隔基(Gly andAla)的序列，从酵母染色体中利用引物BamLALPHAfwd和EcoLALPHArev进行PCR扩增)(S288C株)，将其克隆到p426GPD的BamHI和EcoRI酶切位点，构建pSecY。然后，利用寡核苷酸Agglfwd和AgglrevNext，在酵母染色体DNA(strainS288C)进行PCR扩增编码α-凝集素的细胞壁固定区的序列，并将其克隆到p426GPD的ClaI/XhoI酶切位点，构建pGPDAnch。通过亚克隆包含α-凝集素序列的EcoRI/XhoI酶切片段进入pSecY相同位点来进行构建pGPD-DSPLY。

【0103】GFP表面显示载体构建如下：GFP编码序列使用引物sgGFPfwd和sgGFPrev从质粒pQB125-fPA(Qbiogene)进行PCR扩增，并且克隆α-凝集素序列的上游序列进入pGPDAnch的EcoRI/HindIII酶切位点，获得pGFPAnch。然后，pGFPAnch的一个EcoRI/XhoI酶切片段被亚克隆到pSecY的相同位点，得到pGFPDSPLY.

表3  表达载体表面显示构建所用的SEQ ID NO

序列编码	寡聚核苷酸	序列
			SEQ IDNO：29	BamLALPHAfwd	5’-CCGGATCCATGAGATTTCCTTCAATTTTTAC-3’
SEQ IDNO：30	EcoLALPHArev	5’-GCGAATTCAGCACCTCTTTTATCCAAAGATACC-3’
			SEQ IDNO：31	Agglfwd	5’-CCATCGATGGTTC TGCTAGCGCCAAAAGCTC-3’
SEQ IDNO：32	Agglrev	5’-CAGCTCGAGTTAGAATAGCAGGTACGAC-3’
			SEQ IDNO：33	sgGFPfwd	5’-CGGAATTCATGGCTAGCAAAGGAGAAG-3’
SEQ IDNO：34	sgGFPrev	5’-GGAAGCTTTTAATCGATGTTGTACAGTTC-3’

                              实施例11

                        质粒pGPD-IL-10的制备

【0104】编码成熟小鼠IL-10蛋白的序列从小鼠cDNA库进行PCR扩增，并将其克隆到pSecY的SmaI/HindIII位点。下列的核苷酸被用于PCR反应：IL-10fwdSEQ ID NO：35(5’-GGGAGCAGGGGCCAGTACAG-3’)和IL-10rev SEQ ID NO 42：(5’-GGGAAGCTTTTAGCTTTTCATTTTGATCATC)。

                              实施例12

                    质粒pInt-MSH和其他pInt载体的制备

【0105】通过亚克隆一个SacI/KpnI片段上的表达盒(从GPD启动子的起始端到CYC1转录终止序列的末端)进入pFL34的相同位点构建pInt-MSH。所有其他pInt载体的构建是通过对相应的表达盒进行PCR扩增，并将其克隆到pFL34的HindIII/KpnI位点。用于PCR扩增寡核苷酸的是GPDFWD SEQ ID NO 36：(5’-CCCAAGCTTTTACCATCACCGTCACC-3’)和CYC1REV SEQ ID NO 37：(5’-CCCGGTACCGTCATGTAATT AGTTATGTC-3’).pInt-MSH和其他URA3基因内的pInt载体的消化将在线性DNA的两端提供序列，其DNA与染色体ura-3基因(突变ura-3株，见图7A)具有同源性。线性DNA末端的同源性调节同源重组进入ura-3位置并可提高Ura⁺原养型微生物的表型性状。

                           实施例13

                         PCR产物的整合

【0106】为了促进染色体整合(示意图见图7B)，对每个表达盒进行PCR扩增(从GPD启动子开端到URA3基因开端)，使用下列的寡核苷酸：UPINT(SEQ ID NO38)(5’-CGTGCTTCTGGTACATACTTGCAATTTATACAGTGATGACCGCTGGACCATGATTACGCCAAG-3’)和DWNINT(SEQ ID NO 39)(5’-TTTAGCATGGCCATTGAATGTAACAATTATATATATCGCAAGCACGATTCGGTAATCTCCGAG-3’)。UPINT由一个45bp序列组成，该序列与HO基因的+1587到+1542序列互补，跟随GPD启动子最初的18个碱基对。DWNINT包含对应HO基因(+1是ATG密码子)-2635到-2680序列的一个45bp序列，跟随的是与URA3基因起始端互补的18个碱基对。所得的PCR产物将与HO基因侧面序列同源，在双交联剂的作用下，它将会促进在HO位点表达盒的染色体整合。此HO基因编码核酸内切酶特殊位点，此核酸内切酶需用偶连型转化，而它的缺少对酵母生理学上的影响并未得知。染色体整合剂会给予酵母细胞一个Ura⁺原养型的表型性状，允许在不存在尿嘧啶的情况下进行重组选择。

                              实施例14

                 拥有ThyA选择系统的载体——pSYMB6的构建

【0107】为构建临床应用级别载体pSYMB6，首先，利用引物thyANsiIFor SEQ IDNO：40(5’-CCA ATGCATGGCACAGCTTGATGCGATC-3’)和thyANsiIRev SEQ IDNO：41(5’-CCA ATGCATGTG TCATTGGTAAACCTGAC-3’)，从干酪乳杆菌染色体DNA中PCR扩增ThyA基因。所得的PCR产物用NsiI酶消化，将其克隆到相同酶消化的pSYMB3，得到质粒pSYMB5。pSYMB5的建造是在去除thyA基因的大肠杆菌(MM21)中选择完成。为了得到pSYMB6，Erymthromycin-抗性基因(Em)通过长距离PCR方法从质粒中删除，其中氨苄基因被排除在最终的PCR产物之外。这个过程的完成是通过设计PCR引物与Em基因末端杂交，且指引聚合反应从氨苄基因上移开。通过DpnI酶消化(除去模板DNA)，PCR产物通过链接反应环化，并转化到缺失ThyA的大肠杆菌MM21中。在缺乏胸腺嘧啶的培养基中选择转化株。

                              实施例15

                  乳杆菌和乳球菌的ThyA突变株的分离

【0108】乳杆菌和乳球菌的菌株可通过两种方法构建：从thyA染色体突变株选择或删除thyA基因。ThyA染色体突变株可以通过在固体修饰的MRS或M17的培养基上接种细胞而进行分离，该培养基包含甲氧苄氨嘧啶(20-400ug/ml)和胸苷或胸腺激素(50-100ug/ml)的。虽然野型细胞对抗生素甲氧苄氨嘧啶很敏感，但是thyA突变株具有抵抗性且可在上述培养基中生长。

【0109】ThyA基因的染色体删除可通过用编码报告基因的序列替换ThyA ORF完成。报告基因的例子是GFP，荧光素酶和-半乳糖苷酶。因此，包含ThyA调控序列(启动子和3’未转化区域)且与报告基因两侧连接的融合结构将被克隆入一个整合载体中，例如(但不局限于)：pHY304(该结构的描述见下)。此载体具有温度敏感的复制源，以Em基因作为选择标记；一旦载体在合适温度下转化到细胞内，它通过在不许可温度下进行细胞培养，以染色体作为靶目标，选择红霉素抗性。靶染色体可通过同源重组来控制，此同源重组是在质粒上ThyA侧位序列和染色体上ThyA基因之间进行的(见图9)。氨苄抗性细胞通过荧光显微镜方法来检测，用于GFP表达(GFP作为报告基因的例子)，质粒的正确整合可通过对染色体DNA的诊断PCR扩增来证实。染色体整合的结果是，ThyA侧位序列在染色体上复制，它给染色体外重组提供了一个机会，导致质粒序列的删除，和50％的机会可用GFP-融合基因(GFP被ThyA调节序列驱动，见图9)替换染色体胸苷酸合成酶基因。由于thyA基因的删除，这种染色体外重组将对甲氧苄氨嘧啶的杀伤效果有抵抗作用。因此，为了获得染色体外重组和对thyA删除菌株的选择，Em-抗性GFP阳性细胞将在甲氧苄氨嘧啶和胸苷存在条件下，且对整合载体复制的合适温度下进行培养。然后，甲氧苄氨嘧啶抵抗细胞将会为GFP表达和氨苄灵敏性进行检测，其应该代表缺失质粒的细胞。最后，GFP-融合基因替换染色体胸苷酸合成酶基因的正确性可通过染色体DNA的诊断PCR扩增来检测。

                              实施例16

                乳酸乳球菌(pSYMB7)的ThyA整合载体的构建

【0110】从乳酸乳球菌基因组DNA中PCR扩增ThyA基因plus 200bp侧位序列并将其克隆到pUC19。然后，使用侧位相接且远离ThyA ORF的引物，通过长范围的PCR，将ThyAORF从pUC19结构中删除。上游和下游的引物将会把它们的5’-端序列分别补充到GFP ORF的起始端和末端。然后，所得的PCR产物将会同相应的GFP ORF的第二个PCR片段一同转化到一个RecA⁺细菌宿主，例如(但不局限于)：DH5。在GFP序列和产生的环形质粒中，两个PCR产物之间的相继同源重组基础上可形成转化群落。此同源重组的结果是，GFP将在ThyA调控序列控制下表达。最终，为了建构ThyA整合载体，GFP ORF同200bp ThyA侧位序列一起将被亚克隆到综合载体pHY304。

                              实施例17

                 乳酸菌(pSYMB8)的ThyA整合载体的构建

【0111】从乳酸菌染色体序列中PCR扩增ThyA ORF同70bp侧位序列，并将其亚克隆到pUC19。然后，通过限制性消化除去ThyA ORF的内部片段，用GFP PCR片段合适的末端替换。所得的结构中，GFP ORF读码框5’端具有ThyA ORF且在3’-端有终止密码，在读码框外保留ThyA ORF序列下游。所得的ThyA-GFP同ThyA侧位序列融合，被亚克隆到pHY304，得到一个LAB ThyA整合结构。

                              实施例18

                 乳酸菌和乳球菌表达结构整合入染色体

【0112】ThyA突变株构建的方法可用于LAB和L.lactis表达盒的整合进入染色体中。简单的说，从各自的表达结构中PCR扩增表达盒，(如pSYMB3，pSYMB4等等)，并将克隆在ThyA侧位序列的中部。所得的整合结构可被用于替换上述染色体的ThyA基因。

                    实施例19-23临床载体的蛋白表达

                              实施例19

                          在新月茎菌中的表达

【0113】质粒pCX-MSH或pCX-VP7通过电转化至新月茎菌中。将转化株的单菌落接种到含有2μg/ml氯霉素的5mlPYE培养基中，30℃培养16-18小时，第二天，将过夜培养物稀释25倍至含2μg/ml氯霉素的M11表达培养基中。稀释培养物在轻微的震荡中(80-100rpm)30℃培养2天，为了检测目标蛋白的表达，样品按规则的间隔收取。

                              实施例20

                     在埃希氏菌属大肠杆菌中的表达

【0114】将大肠杆菌菌株接种到含100μg/ml氨苄的IMC培养基中，25℃振摇培养过夜。加入1×10¹⁰过夜培养细胞至50ml含100μg/ml氨苄青霉素和100μg/ml色氨酸的IMC培养基中。25℃培养，每隔1小时取样，O.D.600nm下检查细胞浓度。离心收集细胞后，通过SDS-PAGE，ELISA，和Western Blot检查细胞的表达。

                              实施例21

                         在乳酸菌中的表达

【0115】将表达的乳酸菌菌株接种至MRS培养基中，37℃静置培养过夜，按1∶50将过夜培养物的稀释到50ml改良的MRS培养基中，37℃培养，每小时取样，离心后分离细胞和上清，通过ELISA检测其表达情况。另外，检测每部分的生物学活性。另外，测定并记录在OD600n.m.下的光密度，以及不同生长期的相关表达水平。

                              实施例22

                      蛋白在酵母细胞表面的表达

【0116】经pYD或基于pYD1的表达载体转化的EBY100酵母接种到含2％葡萄糖的YNB-CAA培养基中30℃培养过夜，离心收集细胞，在含2％半乳糖的YNB-CAA培养基中重悬至OD₆₀₀为0.5～1。细胞在20～25℃条件下培养，定时取样，通过免疫荧光检测法分析表达情况。

                              实施例23

                         蛋白在酵母中的表达

【0117】细胞表面表达GFP蛋白的酵母生长到对数中期，在不同的细胞密度收集细胞(细胞密度是通过600nm吸收测定的)。空载体(pGPDDSPLY，见下)转化的酵母同对照组一起收获。把等量的2×10⁷细胞沉淀，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)的上样缓冲液溶解，煮沸。蛋白在4-12％ Novex梯度凝胶分离，转移到硝酸纤维膜上，用单克隆的GFP抗体印迹(mAb11E5，Qbiogene)。通过用二级辣根过氧物酶(Hrp)-标记的抗鼠抗体处理膜以显示抗原蛋白，接着加入发色Hrp底物。如图10所示，只有以GFP表达结构转化的酵母才显示出由抗-GFP抗体识别的蛋白带。除主要的全长产物外，多条抗-GFP反应带的存在反映了基因产物蛋白的降解。

                            实施例24-27

                           表达产物的鉴定

                              实施例24

                          用SDS-PAGE进行鉴定

【0118】通过离心收集细胞(用于表面表达)或在培养基中聚集蛋白(for PCX)，用SDS-PAGE样品上样缓冲液重悬，95℃加热10min，通过SDS-聚酰铵电泳将样品分离，用考马斯亮兰染色检测蛋白。

                              实施例25

                        用W_ESTERN B_LOT进行鉴定

【0119】蛋白样品经过SDS-PAGE分离，然后用电印迹法转移到硝化纤维素膜上。含有蛋白的纤维素膜用抗原特异性抗体进行处理。抗原-抗体复合体的存在，可以通过将其置于二级抗体中进行鉴别，二级抗体可以识别特殊抗原抗体并且与酶连接。接下来，纤维素膜使用抗体连接酶的底物进行孵育，通过产生的颜色或轻微的能量就可以达到对目标蛋白的检测。

                              实施例26

                           用ELSIA进行鉴定

【0120】通过离心收集细胞(表面表达)或在培养基中聚集的蛋白(分泌表达)，在包被液中重悬，在ELISA板上包被细胞，再经过一级的抗原特异性抗体处理，冲洗之后，用二级酶连抗体处理。为了检测蛋白的表达，加入连接酶的底物，通过ELISA板读取器监测颜色的变化。

                              实施例27

                          表面表达蛋白的检测

【0121】收集经过表面表达结构或空白表达的载体转化的细胞，用PBS进行冲洗，在4℃用相应的抗体孵育30分钟。离心，用PBS冲洗，在暗处用硫氰酸荧光素连接的二级抗体在4℃下孵育30分钟。用PBS冲洗细胞2次，在荧光显微镜下观察结果。

【0122】当前的基因治疗技术主要依赖于载体，这些载体可以是病毒、裸质粒DNA等免疫活性物质，或者是象脂质体这样人工合成的载体。每一种基因载体都具有自己的优缺点。病毒载体可以引发免疫反应，这种免疫反应有可能是对受体的一种直接伤害，也可能会导致限制或阻止该种载体在受体中的进一步应用。裸的质粒DNA转化细胞的效率很低，易受体内核酸酶的攻击。脂质体因为其生产的复杂性从而应用十分有限，并且稳定整合率和转染率都非常低。下面的表4列出了包括本发明中微生物载体在内的不同基因治疗载体系统的优缺点。

【0123】本发明中所使用的微生物载体的几个最重要的优点如下：对受体具有极低的免疫活性，可以转运被插入的大的质粒，很容易规范FDA认可的生产制造环境，因为其没有致病性，所以对生产人员没有健康危害，特别的机体组织和细胞类型都可以应用于靶向定位。

【0124】本发明中的一个实施例中，临床应用级载体可以将治疗蛋白直接转导到治疗所需要的靶点。因为本载体不具备对健康的危险，所以整个载体系统和重组的治疗蛋白可以同时转导到机体。因为不需要昂贵的产品处理净化以除去重组蛋白表达系统和同时提供治疗蛋白产品，所以使操作非常简单。

【0125】此外，当用于转导免疫原性成分给动物时，口服给药系统通过将肠内的M细胞直接暴露到抗原表达/分泌载体而将免疫细胞作为靶细胞。另外，因为与许多在本发明中描述的微生物有关的益生作用，口服转导系统还对受体的健康具有许多间接的益处。(Fuller，R.1993.Probiotic foods-current use and futuredevelopments.IFI NR 3：23-26；Mitsuoka，T.1984.Taxonomy and ecology ofBifidobacteria.Bifidobacteria Microflora 3：11；Gibson，G.R.et al.，1997.Probiotics andintestinal infections，p.10-39.In R.Fuller(ed.)，Probiotics 2：Applications and practicalaspects.Chapman and Hall，London，U.K.)。

表4.基因治疗载体系统比较

载体系统	优点	缺点
			逆转录酶病毒	长期的持续基因表达	只能感染划分的细胞
Lentiviruses	长期的持续基因表达可感染非-划分细胞	很强的致死性
			腺病毒	可感染非-划分细胞高转移率	免疫原所致短暂基因表达
Adeno-associated病毒	比腺病毒更小的免疫原性可能更长期的表达	难于大量生产
			疱疹病毒	可以携带大量的DNA	免疫原性及潜在的毒性

脂质体	没有免疫原性可以转导大量的DNA	转导率低表达短暂
			裸DNA	非病毒性成分	短暂基因表达难于对特别的组织进行靶向定位
本发明中的微菌群载体	非免疫原性，可以携带大的DNA载荷，易于大量繁殖生产，非致病性对健康的间接益处(前生命期的)对疫苗的细胞靶向(M细胞)	目前未发现

【0126】本发明的一个具体实施例是使用临床应用级载体用于治疗或减轻外伤眼睛炎症或色素膜炎。色素膜炎是位于巩膜和视网膜之间的血管膜上的炎性反应。血管膜上含有众多的血管给眼球供氧。当其发炎时，会影响到角膜、视网膜、巩膜和眼睛的其它重要部分。色素膜炎分为急性和慢性两种，对男女患者的发病率相等。在任何年龄段的人群中均可发病，主要集中在20-50岁的人群中间，在20多岁的人群中最为常见。虽然并不知道其准确的致病原因，但是可以由象化学损伤那样的外伤引起，也可以通过病毒感染(如AIDS患者的巨细胞病毒)、真菌感染(网状内皮细胞真菌)或寄生虫感染(如果孕期妇女患有弓形虫病，则婴儿会患有色素膜炎)引发。色素膜炎也与相关免疫失调有潜在的关系，包括Reiter′s综合症，多发性硬化，少年风湿性关节炎、Crohn′s病和肉状瘤病。某些疾病象白血病，淋巴瘤和恶性黑色素瘤也会具有色素膜炎的类似症状。对一些药物的应用，象利福布丁，cidofovir，pamidronic acid和磺胺类药物也可以导致色素膜炎。在许多病例中，这种潜在的因素并没有被发现(AlexanderKLdeng，1997.Optometric临床实践方针：眼色素膜炎患者的治疗，2nd ed.American Optometric Association.)。

【0127】当前对色素膜炎的治疗包括皮质甾类，主要是针对减少水肿和减轻疼痛。睫状肌麻痹剂(如环戊通和后马托品)用于减轻疼痛，抗菌剂用于治疗感染，抗炎剂用于减轻水肿或者抑制免疫系统(Berkow R，Fletcher AJ，Beers MH，eds.TheMerck Manual.Rahway，NJ：Merck & Co.；1992：2380-2382)。本发明的例子证明内毒素在哺乳动物中导致色素膜炎可以使用αMSH表达载体进行抑制或治疗。

【0128】本发明证明，动物的色素膜炎可以使用本发明中的αMSH表达载体进行抑制或治疗。外伤性色素膜炎和内毒素所致色素膜炎均可以通过包括乳酸菌和酵母进行重组αMSH进行表达的临床应用级载体进行抑制和治疗。

                              实施例28

          使用临床应用级载体表达αMSH治疗外伤性色素膜炎

试验设计

【0129】对老鼠角膜进行外科非打孔型穿孔，对αMSH进行表达的重组微生物对老鼠进行局部给药和口服，通过观察充血，水肿，水溶性蛋白水平和房水中的炎性细胞数以及受损角膜的其他形态学参数评价色素膜炎的严重程度。受伤处理后24小时对以上参数进行分析，大鼠分为8组：第一组：正常对照，正常未处理组(10只)；治疗第二组：治疗对照组(色素膜炎老鼠用0.45％生理盐水治疗。10只)；第三组：酵母口服治疗组：色素膜炎老鼠经酵母表达rαMSH口服治疗(10¹⁰yeast/ml qd。5只)；第四组：酵母局部治疗组，色素膜炎老鼠经酵母表达rαMSH局部治疗(10¹⁰yeast/ml qd。5只)；第五组：乳酸菌口服治疗组，色素膜炎老鼠经乳酸菌表达rαMSH口服治疗；第六组：酵母局部治疗组，色素膜炎老鼠经乳酸菌表达rαMSH局部治疗(10¹⁰yeast/ml qd。5只)；乳酸菌对照组：正常大鼠经过乳酸菌表达rαMSH局部治疗(10¹⁰yeast/ml qd。4只)；酵母对照组：正常大鼠经过酵母表达rαMSH局部治疗(10¹⁰ yeast/ml qd。4只)。

B.材料和方法

1.动物：

Lewis大鼠性别随机，体重125-250g范围内。

2.临床级载体

a.酵母

酿酒酵母菌株W303-1A经p426GPD或pLong-sp-MSH转化。

b.乳酸菌

干酷乳杆菌经pSYMB4或pSYMB.转化

3.载体的制备

转化的和非转化的酵母和乳酸菌在增富固体培养基中培养，在对数生长期采集(在细菌达到最大数量的前一天)，用PBS洗涤并以10¹⁰cells/ml的浓度重悬，最终的悬浮液体用于给动物给药。

4.用于评价试验结果的参数

a.蛋白浓度和炎性细胞数：

蛋白及炎性细胞数：使用Lowry法测定蛋白，使用coulter细胞计数器测定炎性细胞数。通过观察αMSH治疗组和对照组的不同验证αMSH在治疗和控制LPS内毒素致炎症中的作用。

b.组织病理学

引发色素膜炎24小时后，抽出房水，取出眼球。实验的目标部分包括：角膜，虹膜睫状体，色素层血管和视网膜。将其在2％戊二醛溶液中固定。烘干之后，将组织切开并用H&E和PAS褪色处理。通过对αMSH治疗组和对照组的比较，可以评价αMSH的治疗作用。

c.临床评价

使用外科显微镜观察色素膜炎发生后的结膜充血，水肿，出血和渗出以及角膜的变化。使用1-4分级标准，1为轻微，4为严重。使用数码相机纪录充血状况。

                              实施例29

            临床应用级载体表达αMSH治疗内毒素所致色素膜炎

【0130】

A.试验设计：

大鼠色素膜炎可以通过注射Salmonella typhimurium LPS内毒素导致。αMSH的治疗可以通过局部给药或肌内注射。色素膜炎的严重性可以通过不同的指标检测，主要指标包括：充血，水肿，水溶性蛋白的水平和水液中炎性细胞的水平，以及受影响组织中组织形态学的其他指标。每一项指标均在治疗后1h，3h，6h，12h，及24h测得。本实验用老鼠至少分为8组。第一组：正常对照组(正常、未治疗大鼠10只)；治疗第二组：治疗对照组(外伤色素膜炎大鼠通过0.45％生理盐水局部给药，10rats)；第三组：酵母口服治疗组(外伤色素膜炎大鼠经酵母表达rαMSH口服给药(10¹⁰yeast/ml qd)治疗，5只)；第四组：酵母局部治疗组(外伤色素膜炎大鼠经酵母表达rαMSH局部给药治疗(10¹⁰yeast/ml qd)，5只)；第五组：乳酸菌口服治疗组(外伤色素膜炎大鼠经乳酸菌表达rαMSH口服给药治疗(10¹⁰bacterial/ml qd)，5只)；第六组：乳酸菌局部给药治疗组(外伤色素膜炎大鼠经乳酸菌表达rαMSH局部给药治疗(10¹⁰bacterial/ml qd)，5只)；乳酸菌对照组(正常大鼠经乳酸菌表达rαMSH局部给药治疗(10¹⁰bacterial/ml qd)，4只)。酵母对照组(正常大鼠经酵母表达rαMSH局部给药治疗(10¹⁰yseast/ml qd)，4只)。由于采用急性炎性反映模式，所组织损坏发生的太早或太严重，可能需要αMSH预处理。

B.材料和方法

1.动物：

Lewis大鼠性别随机，称重125-250g范围内。

2.临床级载体

a.酵母

酿酒酵母菌株W303-1A经p426GPD或pLong-sp-MSH转化。

b.乳酸菌

干酪乳杆菌经pSYMB4或pSYMB.转化

3.载体制备

转化的和非转化的酵母和乳酸菌在增富培养基中培养，在对数生长期采集(在细菌达到最大数量的前一天)，用PBS洗涤并以1010cells/ml的浓度重悬，最终的悬浮液用于给动物给药。

4.用于评价试验结果的参数

a.蛋白浓度和炎性细胞数

通过Lowry法测定蛋白，使用Coulter细胞计数器测定炎性细胞数。通过观察αMSH治疗组和对照组的不同验证αMSH在治疗和控制LPS内毒素致炎症中的作用。

b.组织病理学

引发色素膜炎24小时后，抽出房水，取出眼球。实验的目标部分包括：角膜，虹膜睫状体，色素层管和视网膜。将其在2％戊二醛溶液中固定。烘干之后，将组织切开并用H&E和PAS褪色处理。通过对αMSH治疗组和对照组的比较，可以评价αMSH的治疗作用。

c.临床评价

使用外科显微镜观察色素膜炎发生后的结膜充血，水肿，出血和渗出以及角膜的变化。使用1-4分级标准，1为轻微，4为严重。使用数码相机纪录充血状况。

d.房水中的细胞因子和分叶核白细胞(PMNs)

通过细胞毒性检测TNF-α的水平。IL-1，IL-2，IL-6和IFN-γ水平用放射性同位素进行测定。在显微镜下观察PMNs数目。使用改进了的Williams RN(curr EyeRes 2：465，1983)方法测定PMNs的活性。使用ELISA方法测定房水中αMSH水平。

                              实施例30-3

                        细胞靶向性临床应用级载体

【0131】M细胞是特异性的内脏上表皮细胞，调节从内脏到下面叫做peyer’s片的淋巴组织的大分子、病毒和类似物质的运输。除此之外，它还是防御外来生物和大分子的侵袭的第一道屏障，M细胞小泡的运输也为rapeutic化合物进入血液提供了方便。因此，通过设计细菌和酵母载体在其表面上携带M细胞靶分子。

【0132】在具体实施例中，乳酸菌中含有编码M细胞靶因子的结构。该因子可以包容在含有异源基因的质粒上或在单独的质粒上。在表达上，M细胞靶因子允许乳酸菌优先与上表皮细胞其他形式的M细胞结合。一般有三种类型的要素来说明提高药物与靶M细胞的结合能力。(Chen等美国专利号6,060,082)(Ginkel等CDC.6(2)，2000).第一种是外原凝集素，它能结合细胞的表面(例子见美国专利6,060,082).第二种是来源于呼肠孤病毒的sigma蛋白，它能使M细胞因子作用于靶点并可以以融合蛋白的形式表达。(Wu，Y.，等″M细胞靶点DNA接种疫苗″Proc.Natl Acad.Sci.USA 98(16)：9318-23(2001)).第三种包括单克隆抗体片段的发展和利用，它能对M细胞产生特殊靶向，或至少能支配M细胞。在本发明的具体实施例中，呼肠孤病毒的sigma蛋白是通过LAB细胞和治疗蛋白在细胞表面一同表达的。

【0133】本发明更多对M细胞靶向的具体实施例包括对LAB的扫描，从而在体内优先与上表皮细胞结合，同时利用这些菌株来生产本发明的临床应用级载体。在本发明其他的实施例中乳酸菌和/或酵母菌提供了粘着素蛋白，这种蛋白来源于能使M细胞产生靶向的细菌和病毒，例如：耶尔森氏菌和伤寒沙门氏菌。(Clark，M.A.等，″耶而森氏菌属假结核病M-细胞表面P1整联蛋白表达和侵袭素调节目标到大鼠Peyer的零碎M细胞″Infect Immun.66：1237-43(1998)；Baumler，A.等″TheIpf fimbrial operon mediates adhesion of Samonella typhirium to murine Peyer′spatches″ Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：279-83(1996).这种细菌和病毒的粘附素是蛋白类，能调节M细胞的结合。

【0134】上面描述M细胞靶向化合物能结合修饰的乳酸菌细胞壁，这可以通过加入M细胞靶向化合物到有再生细胞壁能力的修饰的乳酸菌原生质体中来实现。在优选的实施例中，M细胞靶向化合物将会被包在已设计好充当衍生的脂质体中。这种专职的脂质体能够从Avanti Polar Lipids，Inc.买到。(Alabaster，AL).在修饰的乳酸菌的质粒中能够选择地编码M细胞靶向多肽。在一个实施例中，含有抗原序列的质粒也含有M细胞靶向多肽序列。在这个实施例中，M细胞靶向多肽能被附加到抗原序列上。M细胞靶向多肽序列能被选择地附加到结合的促进者区域的表面上，并可行地能和促进区域连接起来，以致质粒的表达产生两种不同的蛋白。在可选的实施例中，第二个质粒将会含有M细胞靶向多肽序列，它是附加到结合的促进者区域表面上并可行地和促进者连接起来，以致载体能怀有两个不同的重组质粒。

【0135】在另外的实施例中，含有异源遗传物质的质粒也可以含有编码合成肽的多聚核苷酸序列，而合成肽含有oc整合素结合表位(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸，RGD)，该oc结合表位(RGD)是被融合到外源遗传物质编码序列上，目的是为了提高传输效率。目前已报道整合素可以结合位于已极化的人类支气管上皮细胞的表面上的RGD表位，(Scott，E.S.等″使用一个整合素-靶Lipoplex提高基因转导到上表皮细胞″The Journal Of Gene Medicine 3：125-134(2001).配基受体交互作用是在含有RGD表位(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)多聚核苷酸和几种已定性的细胞表面受体的整合素家族中进行。所以，常用这种受体调节内吞方法来进入靶向表皮细胞。Scott，E.S.等，″使用一个整联蛋白-靶Lipoplex提高基因转导到空中上皮细胞elial Cells″，The Journal Of Gene Medicine 3：125-134(2001)和Hart，S.等″通过一个整合素结合肽调节基因传导和表达″Gene Ther.2：552-554(1995)

【0136】对细菌和酵母载体定位到粘膜表面的另一种手段是使他们靶向于存在于粘膜表面细胞的单唾液酸糖苷GM1上，并与之结合。GM1通常被集中在称为筏(脂类和高胆固醇部位，起膜交换和表面区域发信号作用)的质膜区域里，(SimonsK.和Ikonen E.，1997，“细胞膜的功能筏”，Nature 387：569-572).实际上，GM1是霍乱毒素的首要靶点。(Ctx)of Vibrio Cholera，和大肠杆菌肠毒素(Etx)(Lencer WI，Hirst TR，and Holmes RK，1999，“霍乱毒素的膜传输和细胞吸收”，Biochim BiophysActa 1450：177-190).Ctx和Etx是由五个同样的B亚单位和单个A亚单位，还有同GM1受体起相同作用的B亚单位(CtxB and EtxB)低聚体共同组成。CtxB或EtxB结合引起交叉结合，这导致毒素-GM1联合体内吞，并最终导致A亚单位酶释放到胞液中。(Lencer WI，Hirst TR，和Holmes RK，1999，“霍乱毒素的膜传输和细胞吸收”，Biochim Biophys Acta 1450：177-190).

【0137】如A亚单位缺失，CtxB就是非毒性的，并且它能够形成一个可以结合GM1的独立的五聚体复合物。因此，纯化的CtxB已用作为将联结在CtxB上的抗原到粘膜表面的一种手段。(George-Chandy等，2001，“霍乱毒素B子组作为运输分子促进抗原表达且增强抗原呈现细胞的CD40和CD86表达”Infect.Immun.69：5716-25；Sadeghi等，2002，“人体胰岛素B-链的基因融合到霍乱毒素B亚单位提高体外抗原表达和体内旁观抑制的表达”Immunology 106：237-45)。CtxB在非病原大肠杆菌和葡萄球菌表面上的表达，通过粘膜给药，可发展活细菌疫苗释放系统(Liljeqvist等1997，“在葡萄状球菌xylosus和葡萄状球菌carnosus上的霍乱毒素B亚单位的表面显示”，Appl.Env.Microbiol.63：2481-2488；Klauser等，1990，“使用奈瑟菌属IgA蛋白酶-区对霍乱毒素B亚单位细胞外的传输：依赖构造的外部膜易位”EMBO J.9：1991-1999；Klauser等，1992，“通过大肠杆菌的霍乱毒素B亚单位的选择性细胞外释放：奈瑟菌属Iga-调节的外部膜传输的分解”EMBO J.11：2327-2335)。关于在葡萄球菌表面上表达，可以看出靶向于外膜的EtxB形成功能性的化合物，该化合物能在体内结合CM1。(Liljeqvist等，1997，“在葡萄状球菌xylosus和葡萄状球菌carnosus上的霍乱毒素B亚单位的表面显示”，Appl.Env.Microbiol.63：2481-2488).所以，为了利用这种高特异性和高效率的粘膜释放系统，我们的酵母和细菌释放载体将会被设计为表面展示EtxB。

【0138】一种为了靶向传递载体的可供选择的办法是在他们的表面上表达蛋白，该蛋白表现出介导上表皮细胞结合作用。这种蛋白已在致病酵母白色假丝酵母菌(Fu等，在酿酒酵母中的白色假丝酵母菌基因ALS1表达导致对内皮的和上皮的细胞的粘着。Infection and Immunity，66：1783-1786)和光滑假丝酵母菌中得到鉴定(致病酵母光滑假丝酵母菌的粘着素介导人上皮细胞的粘附Science，285：578-582).这些在酿酒酵母表面的上皮靶向蛋白的表达使上皮细胞结合到这种天然的非粘附性微生物。

【0139】除了这些方法之外，可用Van Der Vaart等描述的包括-凝集素基因(AG-1)，细胞壁蛋白2(CWp2p)，Sed1p和其他锚定域的载体细胞壁或酵母细胞壁蛋白的方法。(酿酒酵母的细胞壁蛋白比较作为异源蛋白细胞表面表达的锚，Appl.Env.Microbiol.63：615-620，1997)

                 含有本发明的正常微生物载体的药物组合物

【0140】本发明的临床应用级别载体可根据选择的给药方式(口服或全身)在很大的浓度范围内使用。然而，本发明的药物性成分加上可接受的赋形剂，通常每单位剂量含有大约10³到10¹¹活的微生物载体。口服成分的赋型剂可以含有合适的载体和辅料，例如：玉米淀粉、凝胶、乳糖、阿拉伯胶、蔗糖、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、磷酸二钙、碳酸钙、氯化钠或褐草酸。粉碎剂包括但不限于微晶纤维素、玉米淀粉、羟醋酸盐或褐草酸。可用的片剂粘合剂包括阿拉伯胶、甲基纤维素、缩甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮钠(Povidone^TM)、蔗糖、淀粉、和乙基纤维素。可用的润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸、硅树脂、滑石、蜡、油和硅胶。

【0141】口服成分的液体剂型可用水或其他溶液制备，可以含有多种的悬浊试剂如甲基纤维素、藻酸盐、黄蓍胶、胶质、角叉胶、阿拉伯胶、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇。液体剂型包括含有活性成分、湿剂、甜味剂、着色剂和矫味剂的溶液、乳浊液、糖浆和西尔剂。各种液体和粉末剂型可以根据被治疗的哺乳动物吸收入肺的这一特点的常规方法来制备。

【0142】局部应用的液体剂型和半固体膏剂通常含有浓度大约在10³到10¹¹活的微生物载体。各种局部药用剂型包括含有活性成分和各种支持物和载体的滴剂、酊剂、洗剂、油剂、溶液和油膏。本发明的最佳临床应用级别的载体的百分比在每种治疗制剂中都不同，这要根据剂型本身的特点和对特殊的病理和相关的治疗法则要求的治疗效果来确定。

【0143】众所周知的用于制备药物常规的技术方法可以用于做成给病人服用的剂型。显然，病人可以以液体、片剂和胶囊的形式口服药物制剂。对于局部给药，药物成分可以制成液体制剂、膏剂或透皮吸收制剂。透皮吸收制剂是贴在病人皮肤上(通常每片贴1到5小时)。通过常规的技术可用于其他透皮吸收给药途径(如：通过油剂、膏剂或其他剂型达到全身给药)。药物制剂也可通过其他的常用给药途径服用(如：口服、皮下给药、肺部给药、粘膜渗透、腹腔给药、子宫给药、舌下给药、膜给药和肌肉给药)。除此之外，病人服用药物制剂还可以通过长效注射给药，例如：通过1-，3-或6-月长效给药或用生物降解材料和方法给药。

【0144】本发明的一个实施例中，提供的动物的单剂量，每克治疗或预防成分大约含有10³到10¹¹个活的微生物。总量是根据动物的个体需要和动物的体重大小来确定。任一给药的合适剂量可以简单地通过滴定来确定。滴定可通过一系列标准剂量来测定，每个标准剂量的每单位剂量含有大约10³到10¹¹载体。开始以10³个载体服用，逐渐增加服用量，根据动物的大小和剂型的不同来计算系列的剂量。达到给药效果所需的最小的载体量，即为适宜的剂量。对有经验的技术人员来讲，适宜的剂量也可称为本发明的临床应用级别载体成分的有效剂量。

【0145】治疗方法的有效性可以通过监测病人的疾病症状或体征来评估。例如，缺乏鸟氨酸转氨甲酰酶和氨基甲酰磷酸盐合成酶I可以直接检测血浆中铵或oroticacid的水平来判断。血清瓜氨酸水平能同样地提供氨基甲酰磷酸盐合成酶的不足的指标，氨基甲酰裂合酶的不足可以根据血清氨基甲酰的水平来判断。治疗方法的评价参数对具有医疗经验的人来说是非常熟悉的(see，e.g.，Maestri et al.，1991，J.Pediatrics，119：923-928)。在用rαMSH治疗如眼色素膜炎炎症疾病的这个例子中，治疗时间和治疗剂量由治疗医生通过用上面所说的参数来监测疾病的康复。一般来讲，rαMSH治疗的有效数量在大约1μg/kg到100μg/kg之间，最好在5μg/kg和50μg/kg之间，尤其是在10μg/kg到25μg/kg之间(μg/kg＝活性成分μg/每kg宿主体重)。

【0146】除非是特别的指明，在本说明和权利要求中所有表示成分或特性的数据如分子量、反应条件等都要理解：已经用术语“关于”一词在所有情况下都作了修饰。因此，除非是指向反面，在下列规范中提出的或权利要求书中附加的数字参量都是近似值，这些数值可以根据本发明所寻求的预期特性而变化。在极少情况下，且并非试图限制本权利要求及其相应条款的应用，对每一数字参量都应该至少依据所报道的有意义数字的数值，并且运用普通的舍入技巧进行解析分析。尽管用以阐明本发明主要范围的数字范围和参数是近似值，但是在明确的实例中提出的数值，我们报道的尽可能精确。然而，任何数值都不可避免地含有某些错误，可能是由在它们各自的实验测定中造成的标准差所引起。

【0147】在说明本发明的上下文中(特别是在下列权利要求书中的上下文中)所使用的术语“a”、“an”、“the”以及相似的代词，必须理解为同时含盖单数和复数，除非在文中指明或明显与上下文相矛盾。这里所述的数值范围，仅仅是为在一定范围内的每一独立数值提供一个简略的方法。除非有明确标明，每一单独的数值都与说明书呈为一体，就象是在单独地复述它一样。本申请所有的方法都可以用任何合适的顺序进行，除非是有不同地指明或者是明显地与上下文相矛盾。使用本文所提供的任何与所有的例子，或者使用可示例性语言(例如，“such as”)仅仅是为了更好地阐明本发明，而不是对发明的适用范围加以限制，否则就予以声明。本说明中的任何语言都不应构成对实践本发明极为重要的成分没有提出要求。

【0148】本申请所公开的可替代的成分或者发明的具体实施例，都不应被理解为限制。每一组命题可能被单独地提出权利要求，或者同组内其它命题或所发现的其它要素一起提及。可以预见可能包括一个组内的一个或多个命题，或者是因为便利和/或许可问题而被删除。当发生这样的包含或删除时，在说明书中被视为会包含修正的组别，以满足权利要求中使用的所有马库什(Markush)组别的描述。

【0149】本发明的优选实施例包括发明人所知道的完成本发明的最好模式。当然，对那些只掌握该领域普通技术、仅靠阅读前述说明的人来说，这些优选实施例就会出现明显的变化。发明人希望有经验的技术人员正确利用这样的变化，并且可以其它不同的方式实施，而不仅仅使用本发明说明的方法。因此，本发明在符合法律要求的前提下权利要求中包括了对发明主题的所有改良和替代。而且，本发明涵盖了对所有可能的变化中采用上述因素的任何组合，除非是特殊说明或者明显地与上下文相矛盾。

【0150】而且，专大量的专利文献与公开发表的文献已经作为参考，并贯穿于本申请说明书中。对上述所引用的每一篇参考文献和公开发表的文献，都可以通过单独完整地参考其全文。

【0151】作为结束语，应该理解这里所公开的发明实施例是例证本发明的原理。在本发明的范围内可能会有其它的改良。因此，通过举例的方式，而不是通过限制的方式，本发明可能根据这里的原则采用了替换性的描述。因此，本发明并不仅仅限制在上述所显示与叙述的内容。

                                  序列表

<110>圣必健公司

<120>用于传递治疗性化合物的以正常微生物群为基础的临床应用级载体

<130>21823.17

<140>10/280769

<141>2002-10-25

<160>42

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>75

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>1

agatctggtg gcggtggctc ttattctatg gaacattttc gttggggtaa acctgttggt      60

ggcggtgcgg ccgcg                                                       75

<210>2

<211>195

<212>DNA

<213>人工序列

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<223>寡核苷酸

<400>2

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<210>3

<211>252

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<213>人工序列

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<223>寡核苷酸

<400>3

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<210>4

<211>26

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<223>寡核苷酸

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<220>

<223>寡核苷酸

<400>34

ggaagctttt aatcgatgtt gtacagttc                                        29

<210>35

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>35

gggagcaggg gccagtacag                                                  20

<210>36

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>36

cccaagcttt taccatcacc tgcacc                                           26

<210>37

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>37

cccggtaccg tcatgtaatt agttatgtc                                        29

<210>38

<211>63

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>38

cgtgcttctg gtacatactt gcaatttata cagtgatgac cgctggacca tgattacgcc      60

aag                                                                    63

<210>39

<211>63

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>39

tttagcatgg ccattgaatg taacaattat atatatcgca agcacgattc ggtaatctcc      60

gag                                                                    63

<210>40

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>40

ccaatgcatg gcacagcttg atgcgatc                                         28

<210>41

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>41

ccaatgcatg tgtcattggt aaacctgac                                        29

<210>42

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸

<400>42

gggaagcttt tagcttttca ttttgatcat c                                     31

Claims (20)

1.一种治疗性化合物传递载体，包括：

已分离的转化的正常微生物群载体，该载体具有至少一个被删除或被突变的看家基因，从而导致所述的看家基因失去操作功能；以及

至少一个转化核酸序列，该核酸序列含有至少一个编码所述的看家基因的可操作形式的核酸序列和目的基因。

2.根据权利要求1所述的治疗性化合物传递载体，其中所述的看家基因是胸苷酸合成酶。

3.根据权利要求1所述的治疗性化合物传递载体，其中所述的转化核酸是染色体外质粒。

4.根据权利要求1所述的治疗性化合物传递载体，其中所述的转化核酸是整合的表达盒。

5.根据权利要求1所述的治疗性化合物传递载体，其中所述的目的基因编码选自细胞因子、激素的蛋白或多肽。

6.根据权利要求5所述的治疗性化合物传递载体，其中所述的细胞因子选自干扰素、白细胞介素-2、白细胞介素-4、白细胞介素-10、白细胞介素-12、粒细胞集落刺激因子、粒-巨噬细胞集落刺激因子、促红细胞生成素。

7.根据权利要求5所述的治疗性化合物传递载体，其中所述的激素选自α-促黑色素细胞激素、胰岛素、成长激素、副甲状腺激素。

8.根据权利要求1所述的治疗性化合物传递载体，其中所述的载体是细菌或酵母菌。

9.根据权利要求8所述的治疗性化合物传递载体，其中所述的细菌包括短乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、德氏乳杆菌、德氏乳杆菌亚属保加利亚乳杆菌、瑞士乳杆菌、戊糖乳杆菌、发酵乳杆菌、Lactobacillus amylovorus、乳球菌、Lactococcus cremoris、链球菌属、戈登氏链球菌、大肠杆菌、新月柄细菌。

10.根据权利要求8所述的治疗性化合物传递载体，其中所述的酵母菌是酿酒酵母。

11.一种治疗或减轻动物体内炎症疾病的方法包括：

制备的转化的正常微生物载体，该载体含有至少一个被删除或被突变看家基因，从而导致看家基因不可操作，以及含有至少一个转化核酸序列，该序列包括至少一个编码抗炎化合物的目的基因和一个编码有操作的所述看家基因的核酸序列，其中通过所述的载体表达转化的核酸序列。

将所述转化的正常微生物群载体给与所需的动物。

12.根据权利要求11所述的治疗或减轻炎症疾病的方法，其中所述的抗炎分化合物是α-促黑色素细胞激素。

13.根据权利要求11所述的治疗或减轻炎症疾病的方法，其中所述的转化的微生物载体是乳酸菌或酵母菌。

14.根据权利要求11所述的治疗或减轻炎症疾病的方法，其中所述的炎症疾病是眼色素膜炎。

15.-根据权利要求11所述的治疗或减轻炎症疾病的方法，其中所述的转化的微生物生物载体为局部应用。

16.根据权利要求11所述的治疗或减轻炎症疾病的方法，其中所述的抗炎化合物是分泌的。

17.根据权利要求11所述的治疗或减轻炎症疾病的方法，其中所述的抗炎化合物是在所述的转化的正常微生物群载体的表面表达。

18.一个治疗性化合物传递载体包括：

含有至少一个报告基因的分离转化的正常微生物群载体，该基因选自绿色荧光蛋白、β-半乳糖苷酶、淀粉酶、氯霉素乙酰转移酶；以及

包含至少一个目的基因的至少一个转化核酸序列。

19.根据权利要求18所述的治疗性化合物传递载体，其中所述的载体是细菌或酵母菌。

20.根据权利要求19所述的治疗性化合物传递载体，其中所述的细菌选自短乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、德氏乳杆菌、德氏乳杆菌亚属保加利亚乳杆菌、瑞士乳杆菌、戊糖乳杆菌、发酵乳杆菌、Lactobacillus amylovorus、乳球菌、Lactococcus cremoris、链球菌属、戈登氏链球菌、大肠杆菌、新月茎菌。

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