CN103834678A - 使用食品级乳酸菌生产和递送的口服干扰素及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可以口服的，表达人或者动物来源的干扰素的食品级重组乳酸菌及其制备方法。其特征在于：干扰素的编码基因在诱导型或者组成型启动子的控制下，与信号肽、锚定子结合，组成完整的表达框(expression cassette)。该表达框被插入到thyA缺失的条件致死型乳酸菌突变株的染色体，或者质粒上，用于干扰素在乳酸菌细胞内、细胞外、或者细胞壁锚定表达。本发明所述的重组乳酸菌是食品级的，不含外源抗生素抗性基因，可以用于直接口服抗病毒治疗。

Description

使用食品级乳酸菌生产和递送的口服干扰素及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种表达和递送干扰素的食品级重组乳酸菌及其制备方法。更具体地说，本发明涉及一种可以大规模生产的，适用于人和动物干扰素表达的食品级重组乳酸菌，用于人和动物的抗病毒治疗。

背景技术

干扰素(interferon，IFN)是多功能细胞因子家族中的一员，是一种具有广泛的抗病毒抗肿瘤和免疫调节活性的糖蛋白，是人或者动物体防御系统的重要组成部分。干扰素通过与特定细胞表面受体结合发生的，随后激活细胞信号传导的通路，并且诱导一系列受干扰素调控基因的表达，刺激细胞内多种效应蛋白质的分子合成，从而干扰感染病毒的复制。

干扰素按国际标准分为三大类，每一类干扰素有不同型，每一型又可被分成不同的亚型。其中I类干扰素(IFN-I)包括IFN-α、IFN-β、IFN-ω、IFN-τ、IFN-δ、IFN-κ、人IFN-ε、IFN-ζ。II类干扰素(IFN-II)中只包括IFN-γ，它的主要作用是激活巨噬细胞的杀灭微生物的作用；III类干扰素(IFN-III)指IFN-λ，分IFN-λ-1，2和3三个亚型，也称为IL-28A，IL-28B和IL-29，与IFN-I相似，IFN-III主要在对病毒的自然免疫中在为数不多的几种细胞中起作用。

随着分子生物学的迅速发展，人们利用基因工程的方法已经成功的在体外大规模合成了干扰素，并生产了许多生物制品。目前用于干扰素生产的表达系统和生物发酵器主要是大肠杆菌和酵母菌。

在临床上，干扰素已经应用于人类流行感冒、带状疱疹、乙型肝炎和癌症治疗。动物干扰素的临床使用率要远远落后于人干扰素的应用，这主要是因为干扰素制剂的生产成本较高、干扰素药效持久性和稳定性差、动物种间差异大，需要的干扰素品种繁多，市场还不能满足其多样性的需求等。因此，开发生产成本低，使用方便，针对多物种的干扰素产品已经成为业内追求的发展方向。

专利CN1324951A公布了使用昆虫杆状病毒表达载体在昆虫细胞表达生产人乙型干扰素的方法；专利CN100999729A公布了使用昆虫杆状病毒表达载体在昆虫细胞表达生产牛γ-干扰素的方法；专利CN101054584A公布了在大肠杆菌表达鲫鱼干扰素的方法；专利CN101603033A公布了使用CHO细胞系表达牛β-干扰素的方法；专利CNI02154307公布了使用大肠杆菌制备鸡β-干扰素的方法；

通过基因工程手段表达和生产干扰素是一种经济、高效的方法，但由于上述专利所使用的表达宿主都不是食品级微生物，所生产的干扰素都必须经过纯化后注射使用，不能直接用于口服。

近年来，随着乳酸菌基因组学的不断发展和遗传操作工具的不断丰富，以活体乳酸菌为递送载体的药物递送逐渐成为乳酸菌应用研究的一个热点。乳酸菌是一个十分良好的蛋白质和多肽类药物的递送载体，因为它是人体的益生菌，适应肠道环境，并可以定殖到小肠内壁的上皮细胞。

专利CNI01538572A公布了含有重组人α-2b干扰素的重组乳酸菌及其应用方法。但在该发明专利中，人α-2b干扰素的编码基因位于Nisin诱导型表达质粒载体，而非染色体上，在人α-2b干扰素实际生产中仍受到很大限制，且不适宜直接口服。

本发明提供了一种使用乳酸菌作为生产和递送载体的，可以口服，适于大规模生产的干扰素及其制备方法。该方法可以将干扰素编码基因在非诱导型启动子的控制下，整合到表达宿主乳酸菌的染色体上，从而获得稳定遗传。由于干扰素编码基因都很小，本发明所提供的方法中，省略了依赖传统基因工程方法繁琐的表达载体构建程序，直接将设计好的完整表达框通过人工合成获得。在基因合成的同时，可以优化密码子使用偏好。另外，不同物种来源的干扰素具有良好的相似性，该方法广泛适用于人及动物干扰素的生产和递送，如人、猪、牛、鸡、犬、狐、鸭、羊、鱼等。

使用食品级乳酸菌生产和递送干扰素具有如下优势：

1)乳酸菌自身耐酸，可以顺利穿过胃液，到达肠道；

2)所生产的干扰素不需要纯化，可以直接随乳酸菌用于口服给药；

3)成本低廉、易于大量生产；

4)比其它制剂具有更长的储存期及更强的稳定性；

5)乳酸菌在肠道定殖期间还可以持续分泌干扰素，其分泌和释放是持续和缓和的，符合最天然的药物代谢动力学。

发明内容

本发明的目的是公布一种使用食品级乳酸菌作为生产和递送载体的，可以直接用于口服的干扰素及其制备方法。

本发明所述的用于口服的干扰素，其特征在于：干扰素的编码基因在诱导型或者组成型启动子的控制下，与信号肽、锚定子结合，组成完整的表达框(expression cassette)。该表达框被插入到乳酸菌的染色体，或者质粒上来表达和分泌。

本发明所述的用于口服的干扰素，其特征还在于，作为表达载体的乳酸菌菌株是thyA缺失的条件致死型突变株。该突变株在人体内可以存活，但在环境中会迅速死亡，从而避免了所插入的外源基因在环境中的扩散。本发明所涉及的携载了干扰素表达框的重组乳酸菌是食品级的，不含外源抗生素抗性基因，可以用于口服使用。

本发明所述的用于口服的干扰素，其特征还在于，通过不同的表达元件，如启动子、信号肽和锚定子的组合使用，干扰素是被表达在乳酸菌细胞内、或者分泌到乳酸菌细胞外，或者展示在细胞壁表面的。

本发明是通过下述技术方案予以实现的：

本发明的主要技术环节包括：

将编码成熟干扰素(人、猪、牛、鸡、犬、狐、鸭、羊、鱼的成熟干扰素蛋白)的核苷酸序列按照乳酸菌的密码子使用偏好进行优化，与不同的启动子(组成型或诱导型)序列、信号肽序列、锚定子序列，以及上述各序列之间的连接序列组成完整的表达框，并通过人工合成获得；使用Cre/lox位点特异性重组系统将表达框整合到表达宿主乳酸菌菌株染色体的thyA基因位置，与thyA基因发生置换，并去除抗生素抗性基因。或者直接插入到表达质粒上，转化乳酸菌感受态细胞，获得重组乳酸菌。

本发明所述的乳酸菌是指卫生部颁发的《可用于食品的菌种名单》(卫办监督发〔2010〕65号)所包含的所有乳酸菌属所有菌株，包括嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、德氏乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckii)、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentium)、格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)，以及乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)等。

本发明所述的干扰素编码序列，都根据乳酸菌的密码子使用偏好性对核苷酸序列进行了优化，以利于在乳酸菌细胞表达。

本发明所述的经过优化后的干扰素编码序列，是通过市场上的核酸合成服务商进行基因合成而获得的。

本发明所述的组成型启动子，是一种乳杆菌rRNA启动子的类似序列。

本发明所述的诱导型启动子，是被食品级的诱导物或者物理条件诱导的，如Nisin，温度、酸碱度，等。

本发明所述的将表达框整合到表达宿主乳酸菌菌株的染色体上，并去除抗生素抗性基因，是通过Cre／10x位点特异性重组实现的。表达框整合到染色体后，可以随着细胞分裂而稳定遗传，不会因外部选择压力的失去而丢失。

具体实施方式

下面结合具体实例，对本发明做进一步说明。本发明的保护范围并不限定于下列实例。

实施例1：干扰素编码基因密码子优化

由于人和动物来源的干扰素编码基因是真核基因，其密码子使用偏好与乳酸菌有别。为了使其能够顺利在乳酸菌细胞表达，需要对其核苷酸序列进行优化，去除稀有密码子。

本发明所述的干扰素，其成熟蛋白的编码基因按照乳酸菌的密码子使用偏好性优化后的基因序列，是如下1)或2)的核苷酸序列：

1)序列表中序列1-33所示的核苷酸序列

序列1-33所示的核苷酸序列依次为：人干扰素d、人干扰素β、人干扰素γ、猪干扰素α、猪干扰素β、牛干扰素α-1、牛干扰素α-3、牛干扰素α-7、牛干扰素α-8、牛干扰素β-1、牛干扰素β-3、牛干扰素γ、牛干扰素Ω-l、鸡干扰素α、鸡干扰素β、犬干扰素α-6、犬干扰素β、犬干扰素γ、狐狸干扰素α、狐狸干扰素β、狐狸干扰素γ、鸭干扰素α、鸭干扰素γ、羊干扰素α、羊干扰素β、羊干扰素γ、鲫鱼干扰素、鲈鱼干扰素、草鱼干扰素、大西洋鲑(三文鱼)干扰素α-1、大西洋鲑(三文鱼)干扰素α-2、斑马鱼干扰素、金鱼干扰素；

2)与序列表中序列1-33所示的核苷酸序列具有90％以上的同源性核苷酸序列

实施例2：干扰素表达框的构建

干扰素在乳酸菌的表达与定位是通过多个表达调控元件的组合使用来实现的。这些表达调控元件包括启动子、信号肽序列、干扰素编码基因、锚定子序列、以及各个表达调控元件之间的连接序列。

本发明所述的组成型启动子，是乳杆菌rRNA启动子的类似序列。

本发明所述的诱导型启动子，是被食品级的诱导物或者物理条件诱导的，如Nisin，温度、酸碱度，等。

本发明中，启动子序列与信号肽序列之间以CATATG，即核酸内切酶NdeI的特异性酶切位点序列连接，由此引入启始密码子ATG，方便基因操作。

本发明中的信号肽序列，其特征在于，是如下1)或2)的核苷酸序列

1)序列表中序列34-41所示的核苷酸序列

2)与序列表中序列34-41所示的核苷酸序列具有90％以上的同源性核苷酸序列

本发明中，信号肽序列与干扰素编码基因序列之间没有多余的连接序列。

本发明所述的用于细胞壁表面展示的锚定子序列，来自于以下蛋白质的LPXT-模序细胞壁锚定结构域(LPXTG-motif cell wall anchor domain)之一，这些蛋白质在GenBank的编码如下：

YP_005872271、YP_005873461、CCC77736、CCC77890、CCC78260、CCC78361、CCC78381、CCC78520、CCC78612、CCC78778、CCC79729、YP_005873877、YP_005873931、YP_005873973、YP_005874035、YP_005861438等。

以蛋白质YP_005861438为例，其锚定子的氨基酸序列为序列表中的序列42：

本发明中，干扰素编码基因序列与锚定子之间以GGT GGA，即两个甘氨酸的编码序列连接。

在本实施例中，根据不同的表达目的，表达框由不同的表达调控元件和干扰素编码序列组成。如果在细胞内表达，则表达框由启动子(组成型或诱导型)序列、干扰素编码序列组成；如果在细胞外分泌表达，则表达框由启动子(组成型或诱导型)序列、信号肽序列、干扰素编码序列组成；如果在细胞壁锚定表达，则表达框由启动子(组成型或诱导型)序列、信号肽序列、干扰素编码序列和锚定子序列组成。

在本实施例中，基因(整个表达框)合成由市场上的核酸合成服务商完成，为干粉状DNA。合成的基因存在于核酸合成服务商提供的克隆质粒上。将DNA溶于100微升超纯水备用。合成基因的N端连接一个BglII酶切位点，C端连接一个HindIII连接位点。可经BglII／HindIII双酶切后，连接到相应的表达载体。

实施例3：干扰素表达框插入发酵乳杆菌染色体，制备条件致死型突变株，并去除抗生素抗性基因

本实施例中所述乳杆菌特指发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentium)。

分两步完成，首先将一个含有干扰素表达框、上游lox位点、氯霉素抗性基因、下游lox位点的DNA片断通过位点特异性重组插入到发酵乳杆菌染色体的thyA基因位置，替换thyA基因；然后再使用Cre酶去除抗生素抗性基因。

其中，插入片断设计如下：来自发酵乳杆菌染色体thyA基因上游的1000bp的DNA片断-干扰素表达框-lox位点序列-氯霉素抗性基因-lox位点序列-来自发酵乳杆菌染色体thyA基因下游的1000bp的DNA片断。

其中，来自发酵乳杆菌染色体thyA基因上下游的DNA片断，是以发酵乳杆菌基因组DNA为模板，通过PCR获得的。以实施例2中所述的人工合成的干扰素表达框为模板，通过PCR在两端引入lox位点序列。3个PCR片断首尾相继重叠25bp，通过重叠延伸PCR连接为一个全长的DNA插入片断。将该DNA插入片断与pNZ质粒连接，并转化大肠杆菌Top 10感受态细胞，在含有5微克／毫升氯霉素的BHI固体培养基平板上筛选阳性重组子，并进一步在含有5微克／毫升氯霉素的BHI液体培养基中扩繁，大量提取质粒DNA并测序验证。将所提取的质粒通过电击转化至发酵乳杆菌，通过平行涂板筛选只在氯霉素平板而不在红霉素平板上生长的菌落，进一步通过菌落PCR验证，以获得双交换重组子。

将含有Cre重组酶编码基因的质粒转化上述通过验证了的双交换重组子(需提前制备为感受态细胞)，37℃培养子含10微克／毫升红霉素的MRS平板，菌落出现后平行涂平板于分别含有30微克／毫升红霉素和10微克／毫升氯霉素的培养基，筛选对氯霉素敏感但有红霉素抗性的重组子，使用菌落PCR方法验证氯霉素抗性基因的切除。

将该重组子37℃过夜培养于10ml不含如何抗生素的MRS培养基，以使含有Cre重组酶编码基因的质粒丢失。将培养液涂MRS平板，37℃过夜培养，取菌落平行涂板于含有30微克／毫升红霉素的MRS平板和不含任何抗生素的MRS平板，以筛选对红霉素敏感的重组子，通过菌落PCR验证含有Cre重组酶编码基因的质粒的丢失。

Claims (8)

1.一种使用食品级乳酸菌表达和递送的，用于直接口服的干扰素，其特征在于，干扰素编码基因序列在诱导型或者组成型启动子的控制下，与来源于乳酸菌的信号肽序列、锚定子序列连接，组成完整的表达框，分别被整合到乳酸菌的染色体，或者插入到表达质粒上。干扰素表达在乳酸菌细胞内、分泌到细胞外、或者锚定展示在乳酸菌细胞壁上。作为表达载体的乳酸菌菌株是缺失thyA基因的条件致死型突变株。携载了干扰素表达框的重组乳酸菌是食品级的，不含外源抗生素抗性基因，可以用于口服使用。

2.按照权利要求1所述的干扰素，包括人干扰素(α、β、γ)、猪干扰素(α、B、γ)、牛干扰素(α、β、γ、Ω)、鸡干扰素(α、β)、犬干扰素(α、β、γ)、狐干扰素(α、β、γ)、鸭α-干扰素(α、γ)、羊干扰素(α、β、γ)、鱼(鲫鱼、鲈鱼、草鱼、大西洋鲑、斑马鱼、金鱼)干扰素等。

3.按照权利要求2所述的干扰索，其成熟蛋白的编码基因按照乳酸菌的密码子使用偏好性优化后的基因序列(人工序列)，是如下1）或2)的核苷酸序列：

1)序列表中序列1-33所示的核苷酸序列：

序列1-33所示的核苷酸序列依次为：人干扰素α、人干扰素β、人干扰素γ、猪干扰素α、猪干扰素β、牛干扰素α-1、牛干扰素α-3、牛干扰素α-7、牛干扰素α-8、牛干扰素β-1、牛干扰素β-3、牛干扰素γ、牛干扰素Ω-1、鸡干扰素α、鸡干扰素β、犬干扰素α-6、犬干扰素β、犬干扰素γ、狐狸干扰素α、狐狸干扰素β、狐狸干扰素γ、鸭干扰素α、鸭干扰素γ、羊干扰素α、羊干扰素β、羊干扰素γ、鲫鱼干扰素、鲈鱼干扰素、草鱼干扰素、大西洋鲑(三文鱼)干扰素α-1、大西洋鲑(三文鱼)干扰素α-2、斑马鱼干扰素、金鱼干扰素；

2)与序列表中序列1-33所示的核苷酸序列具有90％以上的同源性核苷酸序列。

4.按照权利要求1所述的乳酸菌菌株，包括嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentium)、格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、约氏乳杆菌(Lactobacillusjohnsonii)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)，以及乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)等。

5.按照权利要求1所述的完整表达框，其特征在于包括组成型或诱导型启动子序列、来源于乳酸菌的信号肽序列、干扰素编码基因序列、锚定子序列，以及它们之间的连接片断组成。表达框位于表达载体乳酸菌的染色体或者质粒上。

6.按照权利要求1所述的乳酸菌thyA基因缺失突变株，其特征在于，是利用Cre／lox位点特异性重组系统，使干扰素表达框与thyA基因发生置换而获得的；或者是利用Cre／lox位点特异性重组系统将thyA基因敲除而获得的。

7.按照权利要求5所述的信号肽序列，其特征在于，是如下1)或2)的核苷酸序列：

1)序列表中序列34-41所示的核苷酸序列

2)与序列表中序列34-41所示的核苷酸序列具有90％以上的同源性核苷酸序列。

8.按照权利要求5所述的锚定子序列，其特征在于，是来自于以下蛋白质的LPXT-模序细胞壁锚定结构域(LPXTG-motifcell wall anchor domain)之一，这些蛋白质在GenBank的编码如下：

YP_005872271、YP_005873461、CCC77736、CCC77890、CCC78260、CCC78361、CCC78381、CCC78520、CCC78612、CCC78778、CCC79729、YP_005873877、YP_005873931、YP_005873973、YP_005874035、YP_005861438等。