CN101168741B

CN101168741B - 乳酸乳球菌食品级分泌表达载体及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN101168741B
Application number: CN2007101752693A
Authority: CN
Inventors: 孙强正; 徐建国
Original assignee: National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention
Current assignee: National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention
Priority date: 2007-09-28
Filing date: 2007-09-28
Publication date: 2010-09-08
Anticipated expiration: 2027-09-28
Also published as: CN101168741A

Abstract

本发明涉及一种乳酸乳球菌食品级分泌表达载体及其制备方法和应用，具体地说，本发明涉及乳酸乳球菌食品级分泌表达载体，其包括以下元件：thyA基因选择标记、质粒pWV01的复制子、多克隆位点、分泌表达用启动子、Usp45的核糖体结合位点、Usp45的信号肽序列及部分Usp45成熟肽编码序列。

Description

乳酸乳球菌食品级分泌表达载体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体的说，涉及可在乳酸乳球菌中分泌表达外源基因的分泌表达载体及其制备方法和应用。

背景技术

食品级表达系统因其安全、符合FDA要求而日益受到重视。食品级表达系统必须具有如下条件：(1)载体必须是食品级的，不得含有非食品级功能性DNA片段，如抗生素抗性基因等；(2)表达宿主必须是安全的、特性清楚而稳定的食品级微生物(generally regarded as safe，GRAS)，如乳酸乳球菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌及其它已在食品工业中得到长期而广泛应用的菌株。此外，食品级系统的宿主菌在生产状况下，在食品中和进入人体后必须是足够稳定的。

乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)是一种广泛应用于食品工业的微生物，用来生产和保存乳制品，被公认为安全的食品级微生物。以乳酸乳球菌作为异源蛋白的输送载体，逐渐成为食品工业、生物制药和疫苗研究的热点。一系列基于乳酸乳球菌的表达系统已经构建，某些异源蛋白、细胞因子和酶以各种形式得到表达。

申请人于2004年提交的中国专利申请(申请号：200410093875.7)中公开了一个食品级载体系统，它以染色体上thyA基因缺失的乳酸乳球菌MBP71作为宿主菌，以质粒pSH91作为克隆表达载体。质粒pSH91由来自乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.cremoris)Wg2隐性质粒pWV01的复制子(RepA、ORF C和ori+)、来自pUC18质粒的全部多克隆位点和来自乳酸乳球菌MG1363的thyA选择标记构成，质粒载体和宿主菌实现营养缺陷互补。在整个载体系统中，除了来源于pUC18质粒的多克隆位点外，其余成分均来源于GRAS级微生物(乳酸菌)，不含有抗生素抗性基因，符合食品级载体系统的要求。

但该载体系统为克隆载体系统，不能表达外源蛋白。为了实现外源蛋白的表达，需要表达载体。而表达载体需要表达调控元件，如启动子、核糖体结合位点、调控序列等等。对于食品级载体系统来说，要求所有的表达调控元件均来自食品级微生物，而且表达调控的诱导物也是食品级的。

乳酸乳球菌表达的外源蛋白在细胞的定位有非分泌形式(胞内、胞壁结合)和分泌等形式。非分泌形式有很多缺点，例如不能及时将合成的外源蛋白输送到胞外，容易被胞内蛋白酶降解；表达蛋白不能够正确折叠，从而不能保持良好的生物学活性；同时，非分泌性表达的蛋白(抗原或酶)不能直接与底物或肠道黏膜作用，需下游的蛋白纯化操作。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，一方面，本发明提供一种乳酸乳球菌食品级分泌表达载体。

另一方面，本发明提供一种乳酸乳球菌食品级分泌表达系统。

另一方面，本发明提供一种疫苗，其含有本发明所述的乳酸乳球菌食品级分泌表达系统。

另一方面，本发明提供一种本发明的乳酸乳球菌食品级分泌表达载体的构建方法。

另一方面，本发明提供一种本发明的乳酸乳球菌食品级分泌表达载体在分泌表达外源蛋白中的应用。

在本发明的一个方面，本发明提供一种乳酸乳球菌食品级分泌表达载体，其包括以下元件：

thyA基因选择标记、质粒pWV01的复制子、多克隆位点、分泌表达用启动子、Usp45的核糖体结合位点、Usp45的信号肽序列及部分Usp45成熟肽编码序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述部分Usp45成熟肽编码序列为Usp45成熟肽前9、10、11、12、13、14或15个氨基酸编码序列。在本发明的另一个具体实施方式中，所述分泌表达用启动子为P32启动子。在本发明的另一个具体实施方式中，所述的P32启动子与所述Usp45的核糖体结合位点、Usp45信号肽序列及部分Usp45成熟肽编码序列形成融合基因。在本发明的另一个具体实施方式中，所述融合基因位于HindIII和XbaI多克隆位点之间。在本发明的另一个具体实施方式中，所述的thyA基因选择标记为乳酸乳球菌MG1363的thyA基因；所述P32启动子为pMG36e的P32启动子；所述的Usp45信号肽序列为乳酸乳球菌MG1363的Usp45信号肽序列；优选所述载体包含如SEQ ID NO：1所示的序列。

另一方面，本发明提供一种乳酸乳球菌食品级分泌表达系统，该系统包含本发明的乳酸乳球菌食品级分泌表达载体以及乳酸乳球菌ΔthyA突变株；优选所述的乳酸乳球菌食品级分泌表达载体位于所述的乳酸乳球菌ΔthyA突变株中。

另一方面，本发明提供本发明的乳酸乳球菌食品级分泌表达载体的构建方法，该方法包括：

制备分泌表达用启动子、Usp45的核糖体结合位点、Usp45信号肽序列及部分Usp45成熟肽编码序列以及制备包含thyA基因选择标记、质粒pWV01的复制子和质粒pUC18的多克隆位点的载体骨架；将所述分泌表达用启动子、Usp45的核糖体结合位点、Usp45信号肽序列及部分Usp45成熟肽编码序列克隆入所述载体骨架的多克隆位点；优选所述的分泌表达用启动子为P32启动子。

另一方面，本发明提供本发明的乳酸乳球菌食品级分泌表达载体在分泌表达外源基因中的应用。

附图说明

图1显示P32-SPusp45基因结构示意图；

图2A显示P32-SPusp45片段核苷酸序列；图2B显示本发明的乳酸乳球菌食品级分泌表达载体的部分序列，其中包括质粒pWV01的复制子、多克隆位点、thyA基因选择标记、分泌表达用启动子P32、乳酸乳球菌Usp45信号肽序列及部分Usp45成熟肽编码序列；

图3显示质粒pSQ的构建示意图；

图4A显示重组分泌性表达质粒pSQ的鉴定结果，其中，1：分子量标准；2：pSQ质粒；3：P32扩增片段；4：SPusp45扩增片段；5：P32-SPusp45扩增片段；图4B显示重组分泌性表达质粒pSQZ的鉴定结果，其中，1：分子量标准；2：pSQZ质粒；3：usp45(以pSQZ质粒为模板)；4：usp45阳性对照(以MG1363染色体为模板)；

图5A显示重组质粒pSQ-nucA的鉴定结果，其中，1：分子量标准；2：P32-SPusp45扩增片段；3：nucA扩增片段；图5B显示重组质粒pSQZ-nucA的鉴定结果，其中，1：分子量标准；2：pSQZ-nucA质粒；3：usp45基因扩增产物；4：nucA基因扩增产物；5：usp45-nucA扩增产物；

图6A和图6B显示乳酸乳球菌MBP71表达核酸酶活性检测及不同工程菌表达量的比较，其中，图6A为37℃培养15min；图6B为37℃培养45min；在图6A和图6B中，A区：乳酸乳球菌MBP71/pSQ-nucA菌落；B区：乳酸乳球菌MBP71/pSQZ-nucA菌落；C区、D区：乳酸乳球菌MBP71/pSH91菌落；

图7显示上清和菌体样品核酸酶SDS-PAGE；其中，M：蛋白分子量标准；1：乳酸乳球菌MBP71/pSH91上清；2：乳酸乳球菌MBP71/pSQZ-nucA上清；3：乳酸乳球菌MBP71/pSQ-nucA上清；4：乳酸乳球菌MBP71/pSH91菌体；5：乳酸乳球菌MBP71/pSQZ-nucA菌体；6：乳酸乳球菌MBP71/pSQ-nucA菌体；

图8显示核酸酶酶谱检测结果，其中，M：分子量标准；1：乳酸乳球菌MBP71/pSH91上清；2：乳酸乳球菌MBP71/pSQZ-nucA上清；3：乳酸乳球菌MBP71/pSQ-nucA上清；4：乳酸乳球菌MBP71/pSH91菌体；5：乳酸乳球菌MBP71/pSQZ-nucA菌体；6：乳酸乳球菌MBP71/pSQ-nucA菌体。

具体实施方式

本发明创造性地将Usp45的核糖体结合位点、乳酸乳球菌Usp45信号肽序列及部分Usp45成熟肽编码序列与thyA基因选择标记、质粒pWV01的复制子、多克隆位点、分泌表达用启动子组合，获得了本发明的乳酸乳球菌食品级分泌表达载体。因此本发明的乳酸乳球菌食品级分泌表达载体包括以下元件：

thyA基因选择标记、质粒pWV01的复制子、多克隆位点、分泌表达用启动子、Usp45信号肽序列及部分Usp45成熟肽编码序列。

在本领域，为实现分泌性表达，通常在启动子后、目的蛋白前融合一分泌信号肽，以引导目的蛋白分泌到细胞膜外。Usp45是一种分子量为45kDa的未知功能的分泌蛋白，也是乳酸乳球菌中唯一能通过考马斯亮兰染色检测到的分泌蛋白(Liebl，W.，A.J.Sinskey，and K.H.Schleifer.Expression，secretion，and processing of staphylococcal nuclease byCorynebacterium glutamicum.J.Bacteriol.1992；174：1854-1861)，其蛋白质前体的N端有由27个氨基酸组成的信号肽序列，能被乳酸乳球菌的分泌系统识别，引导蛋白通过胞质膜，信号肽随后被切割和降解，成熟肽释放到上清中。

本发明不但选择来源于乳酸乳球菌的Usp45信号肽序列并且还同时选择位于其后的部分Usp45成熟肽编码序列，作为本发明的分泌表达载体的一个元件，从而有效地构建了一个分泌性表达载体。上述“部分Usp45成熟肽编码序列”为Usp45成熟肽编码序列的一部分序列，可以为成熟肽前9、10、11、12、13、14或15个氨基酸编码序列，例如成熟肽前9个氨基酸编码序列、成熟肽前11个氨基酸编码序列、成熟肽前13个氨基酸编码序列或成熟肽前15个氨基酸编码序列。所述“部分Usp45成熟肽编码序列”作为宿主菌的自身蛋白在外源目的蛋白的N端或C端融合后，增加了外源目的蛋白mRNA和表达产物的稳定性，防止了外源目的蛋白因被宿主菌自身表达的蛋白酶所识别和切割而影响产量和功能；另外，对于分子量较小的外源目的蛋白，还可以增强其免疫原性。在本发明中，利用该分泌表达载体转化入宿主菌乳酸乳球菌MBP71，实现了报告蛋白核酸酶(NucA)的有效分泌表达。TB-D试验中，分泌表达的核酸酶水解细菌周围的DNA，形成特殊的菌落周围光晕；SDS-PAGE中，在上清中可见区别于阴性对照的阳性条带；在酶谱检测中，在上清和菌体样品中均可见阳性条带，但上清条带的亮度和宽度明显大于菌体中，估计上清核酸酶含量是菌体的10倍，说明核酸酶大多以分泌的形式表达。

分泌性表达具有诸多优点，如能及时将合成的外源蛋白输送到胞外，避免了被胞内蛋白酶降解；表达蛋白能够正确折叠，保持良好的生物学活性；同时，分泌性表达的蛋白(抗原或酶)可以直接与底物或肠道黏膜作用，无需下游的蛋白纯化操作。为了实现分泌性表达，通常在表达目的蛋白的C端或N端融合一分泌信号肽，以引导目的蛋白释放到胞外。由于现有技术的质粒pSH91(中国专利申请200410093875.7)包括thyA选择标记、质粒pWV01的复制子、pUC18质粒的全部多克隆位点，所以为了使用方便，本发明直接使用质粒pSH91，至于该质粒中的其它元件，并不影响本发明的分泌表达，不是本发明的分泌表达载体的必要元件；其中质粒pWV01的复制子为质粒复制所必需，不用于分泌表达。

本发明的分泌表达载体中的thyA基因(胸苷酸合成酶基因，thymidylatesynthase gene)选择标记可来自任何包含其的食品级微生物或者载体，优选例如来自乳酸乳球菌MG1363或质粒pSH91(该选择标记thyA基因应为与宿主菌染色体中thyA基因同源性不高，防止发生同源重组)。thyA在生物体内DNA合成中起关键作用，它催化dUMP转变为dTMP的甲基化，同时使5，10-甲基四氢叶酸转变为7，8-二氢叶酸。

多克隆位点可以为任何食品级载体中的多克隆位点，优选例如pUC18质粒的多克隆位点，包括Hind III、SphI、PstI、SalI、XbaI、BamHI、SmaI、KpnI、SacI、EcoRI。

本发明的食品级分泌表达载体中的“分泌表达用启动子”为适于分泌表达的食品级启动子。在本发明的一个实施方式中，所述分泌表达用启动子为来自乳酸乳球菌MG1363染色体上Usp45蛋白的启动子，发明人利用该启动子以及乳酸乳球菌MG1363染色体上Usp45蛋白的核糖体结合位点(RBS)、信号肽和部分成熟肽的编码序列，成功构建了一个组成性分泌表达载体pSQZ，并且实现了报告蛋白NucA的分泌性表达。但是，该启动子的启动效率较低，表达的报告蛋白量较少。

在本发明的另一优选实施方式中，所述分泌表达用启动子为P32启动子，P32启动子是van der Vossen等从乳酸乳球菌乳脂亚种(L.lactis subsp.cremoris)Wg2染色体中分离的启动子(van der Vossen JM，van der LD，Venema G.Isolation and characterization of Streptococcus cremorisWg2-specific promoters.Appl.Environ.Microbiol.1987；53：2452-2457)。vander Maarten等以此启动子构建了乳酸菌表达载体pMG36和pMG36e，并成功表达了鸡蛋白溶菌酶。但是，pMG36及其系列衍生质粒携带卡那霉素或红霉素抗性基因，存在抗性基因横向转移的可能，限制了其作为食品级载体的应用。本发明创造性地利用P32启动子以及乳酸乳球菌MG1363染色体上Usp45蛋白的核糖体结合位点、信号肽和部分成熟肽的编码序列，成功构建了分泌表达载体pSQ，与以Usp45本身启动子构建的表达载体pSQZ比较，pSQ分泌表达报告蛋白NucA的能力显著提高。在TB-D平板试验中，培养相同时间时，乳酸乳球菌MBP71/pSQ-nucA菌落周围光晕直径大于乳酸乳球菌MBP71/pSQZ-nucA；而在SDS-PAGE中，乳酸乳球菌MBP71/pSQ-nucA上清样品在18KD位置可见特异的、区别于阴性对照的阳性条带，而乳酸乳球菌MBP71/pSQZ-nucA在相应位置却没有特异阳性条带出现；在酶谱检测中，乳酸乳球菌MBP71/pSQ-nucA和乳酸乳球菌MBP71/pSQZ-nucA的上清和菌体在18KD位置都有特异的阳性条带，但乳酸乳球菌MBP71/pSQ-nucA上清和菌体条带的亮度和宽度均大于乳酸乳球菌MBP71/pSQZ-nucA，估计乳酸乳球菌MBP71/pSQ-nucA表达的核酸酶总量是乳酸乳球菌MBP71/pSQZ-nucA的5倍，说明乳酸乳球菌MBP71/pSQ-nucA的表达效率高于乳酸乳球菌MBP71/pSQZ-nucA。分泌表达量的增加，可以增加目的蛋白的产量，减少后续的浓缩操作，节约了成本，简化了操作。

在本发明的另一个实施方式中，本发明提供一种乳酸乳球菌食品级分泌表达载体，其中，所述的P32启动子与所述Usp45信号肽序列及部分Usp45成熟肽编码序列形成融合基因。在本发明的一个优选实施方式中，本发明将SPusp45克隆于P32的-10区后，其-10区与RBS间的距离为22bp，接近usp45自身-10区与RBS间的距离(24bp)；而RBS与ATG间的距离及RBS后碱基A、T含量维持usp45自身组成不变，有效保持了重组启动子的启动效率。

在本发明的一个实施方式中，在本发明的乳酸乳球菌食品级分泌表达载体中，所述的P32启动子与所述乳酸乳球菌MG1363 Usp45信号肽序列形成的融合基因位于多克隆位点的HindIII和XbaI间；当然，融合基因也可以在其他克隆位点间，但是为了在目的基因克隆中有尽可能多的克隆位点，宜选择靠近HindIII的位点。

在本发明的一个实施方式中，在所述的乳酸乳球菌食品级分泌表达载体中，所述的thyA基因选择标记优选为乳酸乳球菌MG1363的thyA基因；所述P32启动子优选为pMG36e的P32启动子；所述的Usp45信号肽序列优选为乳酸乳球菌MG1363的Usp45信号肽。

在本发明的一个优选实施方式中，提供一种乳酸乳球菌食品级分泌表达载体，该载体包含如SEQ ID NO：1所示的序列。在SEQ ID NO：1中，包括质粒pWV01的复制子、多克隆位点、thyA基因选择标记、分泌表达用启动子P32、乳酸乳球菌Usp45信号肽序列及部分Usp45成熟肽编码序列。

另一方面，本发明提供一种乳酸乳球菌食品级分泌表达系统，该系统包含本发明的乳酸乳球菌食品级分泌表达载体以及乳酸乳球菌ΔthyA突变株(胸苷酸合成酶缺陷突变株)。胸苷酸合成酶缺陷突变株(ΔthyA突变株)依靠外源性胸腺嘧啶(thymine)或胸腺嘧啶核苷(thymidine)进行DNA的生物合成，如果突变株生存的环境不能提供足够浓度的胸腺嘧啶或胸腺嘧啶核苷，突变株将因DNA合成受阻而停止生长或死亡。可以通过将细菌涂于含胸腺嘧啶或胸腺嘧啶核苷和抗叶酸的药物如三甲氧苄氨嘧啶(trimethoprim)、氨基喋呤(aminopterin)或氨甲喋呤(amethopterin)的培养基上，来筛选thyA基因突变的菌株。此外，还可以通过同源重组的方法获得thyA基因缺失突变株。某些菌株的thyA基因可以对同种属或不同种属的thyA基因缺陷的菌株提供功能互补作用，使thyA基因缺陷株恢复野生型表型。如果在质粒中提供同源或异源的功能互补的thyA基因后，缺陷株在不含外源性胸腺嘧啶或胸腺嘧啶核苷的情况下也能恢复生长，此即细菌营养缺陷型互补的原理。在本发明的一个优选表达系统中，载体以来源于宿主菌乳酸乳球菌MG1363的thyA基因作为筛选标志，与宿主菌乳酸乳球菌MBP71ΔthyA构成营养缺陷互补。

本发明的食品级分泌表达载体中的P32启动子、SPusp45及其它各组分均来自食品级微生物，不含有任何抗生素抗性基因；而且宿主菌也为食品级微生物，因此此系统完全符合食品级表达系统的要求。此外，本发明的载体中包含乳酸乳球菌的Usp45信号肽序列和部分Usp45成熟肽编码序列，能够有效地进行分泌表达。而分泌形式表达外源蛋白有胞内形式不可比拟的优点：例如可以持续培养、蛋白直接分泌到上清中，减少了下游的纯化操作；分泌的蛋白在肠道或发酵物中直接与底物或免疫系统作用，作用直接；乳酸乳球菌分泌性表达蛋白避免如大肠杆菌那样形成包涵体，无须复性处理；乳酸乳球菌为肠道益生菌，其基因工程菌可以在肠道中持续表达外源蛋白。

在本发明的一个优选食品级分泌表达载体系统中，所述的乳酸乳球菌食品级分泌表达载体位于所述的乳酸乳球菌ΔthyA突变株中。通过在选择培养基上进行筛选，就可以筛选出导入了含有thyA基因的质粒的ΔthyA突变株。所述选择培养基，例如改良SA培养基，只有导入了含有thyA基因的质粒的ΔthyA突变株才能在改良SA培养基上恢复生长。

另一方面，本发明提供一种疫苗，其包含本发明的食品级分泌表达系统。优选地，在本发明的食品级分泌表达载体中包含保护性抗原基因，使保护性抗原在乳酸菌中进行分泌表达，让其在人体或动物体内产生相应的保护性抗体。这样就使乳酸菌如虎添翼，发挥更大的作用。本发明的食品级分泌表达系统的好处(或特色)在于：能通过口服或饲喂施用，简单方便；能在体内定植，可以在肠道中持续表达外源蛋白；能直接产生有益的保护性抗原，省去了常规的发酵过程和繁琐的提取工艺；分泌的保护性抗原在肠道或发酵物中直接与底物或免疫系统作用，作用直接。

另一方面，本发明提供一种本发明的乳酸乳球菌食品级分泌表达载体的构建方法，该方法包括：

制备分泌表达用启动子、Usp45信号肽序列及部分Usp45成熟肽编码序列以及制备包含thyA基因选择标记、质粒pWV01的复制子、和多克隆位点的载体骨架；将所述分泌表达用启动子、Usp45信号肽序列及部分Usp45成熟肽编码序列克隆入载体骨架的多克隆位点。在本发明的一个优选实施方式中，所述的分泌表达用启动子为P32启动子。

另一方面，本发明提供一种乳酸乳球菌食品级分泌表达载体在分泌表达外源基因中的应用。用包含本发明的食品级分泌表达载体的分泌表达系统，可以分泌表达有益于人和动物的外源基因，如某些营养物质(各种必需氨基酸、维生素等)、保健和治病的药物(如抗癌药物、防衰老药物、避孕药物、各种免疫源和有关的酶类)、生长发育的激素(如促乳素、生长素等)。还可以将包含本发明的乳酸乳球菌食品级分泌表达载体的分泌表达系统制成活菌制剂，需要时口服或饲喂，从而引入人体和动物体内(定植或短暂定植)，产生机体所需的外源基因的产物。本发明的食品级分泌表达系统，集菌体本身和有益基因于一体，既可加强营养，也可防病治病，促进生长发育或禽畜生长增重。

以下以实施例的方式进一步说明本发明，所述实施例并不用于限定本发明的范围。

实施例

本发明实验中使用的培养基

(-)CBT培养基：

5×M9盐溶液(5×M9盐溶液的配制：Na₂HPO₄·7H₂O，64.0g；KH₂PO₄，15.0g；NaCl，2.5g；NH₄Cl，5.0g)，200ml；葡萄糖，20.0g；酪蛋白胨，0.5g；

色氨酸(10mg/ml)，1.0ml；维生素B1(1mg/ml)，1.0ml。

加蒸馏水定容至1000ml，pH7.2；8lbf/in²高压蒸气灭菌15～20分钟。

(二)改良SA培养基：

A、20×氨基酸混合液：

缬氨酸，3.0g；谷氨酸，3.0g；蛋氨酸，2.5g；

组氨酸，0.5g；亮氨酸，2.0g；异亮氨酸，1.0g；

谷氨酰胺，1.0g；天冬酰胺，1.0g。

^*将上述氨基酸溶于蒸馏水中，加入10N的NaOH溶液直至完全溶解，定容至500ml，4℃保存。

B、20×SA盐溶液：

氯化钠，30.0g；乙酸钠，12.5g；氯化铵，5.0g；

磷酸氢钾，2.0g；氯化镁，1.0g；硫酸钾，0.5g；

硫酸铁，20.0mg；氯化钙，1.0mg。

^*将上述盐溶于500ml蒸馏水中，分装后置于-20℃保存。

C、200×混合维生素溶液：

维生素B1，20.0mg；维生素B6，50.0mg；生物素，20.0mg；

核黄素，20.0mg；泛酸钙，20.0mg；叶酸，20.0mg；

烟酸，20.0mg。

^*将上述维生素溶于100ml磷酸钾溶液(0.067mol/L)中，4℃避光保存。

将上述A、B、C溶液混合至终浓度为1×，然后加入20.0g葡萄糖、0.5g酪蛋白胨，15.0g MOPS[3-(N-吗啉代)丙磺酸]，加蒸馏水定容至1000ml，pH7.0。8lbf/in²高压蒸气灭菌15～20分钟。

(三)GM17液体培养基：

多价蛋白胨，5.0g；酪蛋白胨，5.0g；牛肉膏，5.0g；

葡萄糖，5.0g；酵母粉，2.5g；维生素C，0.5g；

MgSO₄·7H₂O，0.25g GP(β-磷酸甘油钠)，19.0g。

加蒸馏水定容至1000ml，pH7.0。8lbf/in²高压蒸气灭菌15～20分钟。

实施例1、分泌性表达质粒pSQ的构建

根据发表的启动子P32的序列设计引物(SEQ ID NO：2和3，试验中所用的引物请参见表1)，以质粒pMG36e(van de GM，van der Vossen JM，Kok J，et al.Construction of a lactococcal expression vector：expression of henegg white lysozyme in Lactococcus lactis subsp.lactis.Appl.Environ.Microbiol.1989；55：224-228)为模板扩增启动子片段P32，包括-35区、-10区；根据GenBank公布的乳酸乳球菌MG1363 usp45基因序列(van Asseldonk，M.，Rutten，G.，Oteman，M.，et al.Cloning of usp45，a gene encoding a secretedprotein from Lactococcus lactis subsp.lactis MG1363.Gene.1990；95：155-160)设计引物对(SEQ ID NO：4和5)，以乳酸乳球菌MG1363(NCDO712，plasmid free，Gasson MJ，J.Bacteriol.1983；154(1)：1-9)染色体为模板扩增SPusp45，包括usp45的核糖体结合位点、翻译起始密码子、信号肽序列及Usp45成熟肽前11个氨基酸编码序列(图1、图2A、图2B)。PCR扩增产物分别回收纯化，以Sal I酶切，T4连接酶连接，取连接产物为模板，以引物对(SEQ ID NO：2和5)扩增片段P32-SPusp45，扩增产物胶回收纯化，克隆到载体pMD18-T(购自大连TaKaRa公司)，CaCl₂法转化E.coli DH5 α感受态细胞(购自天象生物技术公司)，蓝白斑筛选阳性克隆子送上海生物工程公司测序。测序正确的克隆子以Hind III和Xba I双酶切，胶回收目的基因片段，与经同样双酶酶切的pSH91质粒(见中国专利申请：200410093875.7，保藏号为CGMCC NO：1253)连接。以CaCl₂法制备E.coli X51感受态细胞(Okada T，et al.Nature.1960；188：340-341)，连接产物转化感受态细胞，在CBT培养基上挑选阳性菌落，经质粒提取、PCR扩增鉴定，质粒命名为pSQ(构建流程图见图3)。

结果：

上述P32、SPusp45基因片段经PCR扩增及1％琼脂糖电泳检测，所得产物片段分别约为138bp和170bp，符合预期片段长度。PCR扩增产物经胶回收纯化后，酶切连接，以连接产物为模板扩增融合基因P32-SPusp45，所得产物大小约为308bp，符合预期片段长度。融合基因扩增产物经T-A克隆测序(TA克隆系统购自TAKARA公司)，证实与文献和GenBank上公布的P32和SPusp45序列完全一致。将测序正确的片段以Xba I、HindIII酶切后，与同样酶切的pSH91质粒连接，转化E.coli X51，获得多个克隆子。提取质粒，PCR扩增P32、SPusp45及P32-SPusp45基因片段，分别在138bp、170bp和308bp位置有相应的条带，表明重组分泌性表达质粒pSQ构建成功(图4A)。

实施例2、表达质粒pSQ-nucA的构建

1、报告基因nucA的克隆：

根据文献报道的nucA基因序列(Kuroda，M.，Ohta，T.，Uchiyama，I.，et al.Whole genome sequencing of meticillin-resistant Staphylococcus aureus.Lancet.2001；357：1225-1240)设计引物(SEQ ID NO：6和7)，以金黄色葡萄球菌25923(购自中国药品生物制品鉴定所)染色体为模板，PCR扩增nucA基因序列。扩增产物为核酸内切酶成熟肽的编码序列，不包括分泌信号肽编码序列，扩增产物预期长度约为510bp。扩增产物回收纯化后，T-A克隆测序，与发表的序列比对。

2、表达质粒pSQ-nucA的构建：

测序正确的nucA基因扩增片段经Xba I和Kpn I双酶切，与同样双酶切的pSQ质粒连接。连接产物转化感受态细胞E.coli X51，经提取质粒、PCR扩增鉴定，质粒命名为pSQ-nucA。

结果：

nucA基因PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，在约500bp位置有一片段，符合nucA基因预期片段长度(513bp)。扩增产物经T-A克隆测序，证实与GenBank上公布的NucA序列完全一致。将测序正确的片段以Xba I、Kpn I酶切后，与同样酶切的pSQ质粒连接，转化E.coli X51。提取质粒，PCR扩增nucA和P32-SPusp45序列片段鉴定，分别在500bp和300bp位置有相应的条带，表明重组分泌性表达质粒pSQ-nucA构建成功(图5A)。

实施例3、分泌性表达质粒pSQZ-nucA的构建

根据GenBank公布的L.lactis MG1363 usp45基因序列(GenBank NC009004)设计引物(SEQ ID NO：8和9)，以L.lactis MG1363染色体为模板，扩增usp45有关序列，包括usp45的启动子(-35、-10区)、核糖体结合位点(RBS)、信号肽序列(SPusp45)及usp45成熟肽前11个氨基酸编码序列。PCR扩增片段预期长度为230bp。

按照与实施例1～2类似的方法，对该目的基因进行T-A克隆测序，证实与GenBank上公布的usp45有关序列完全一致。将测序正确的克隆子以Xba I、HindIII酶切后，胶回收小片段，与同样酶切的pSH91质粒连接，转化E.coli X51，获得多个克隆子；提取质粒，以质粒为模板PCR扩增usp45基因片段，在约230bp位置有相应的条带，表明重组分泌性表达质粒pSQZ构建成功(图4B)。

将测序正确的nucA基因扩增片段以Xba I、Kpn I酶切后，与同样酶切的pSQZ质粒连接，转化E.coli X51。提取质粒，PCR扩增nucA、usp45和nucA-usp45片段鉴定，分别在约500bp、230bp和730bp位置有相应的条带，重组分泌性表达质粒pSQZ-nucA构建成功(图5B)。

实施例4、质粒pSQ-nucA、pSQZ-nucA转化乳酸乳球菌MBP71

乳酸乳球菌MBP71为乳酸乳球菌ΔthyA精确缺失株(Pedersen MP，etal，Appl.Environ.Microbiol.2002；68(6)：3010-3023)，MBP71感受态细胞的制备和电击转化见参考文献[Martin B.Pedersen，Peter R.Jensen，et al.Bacteriophage Resistance of a ΔthyA Mutant of Lactococcus lactis blocked inDNA replication.applied and environmental microbiology，2002；68：3010-3023]，于改良SA培养基上筛选阳性菌落。用质粒pSQ-nucA、pSQZ-nucA转化的阳性菌株分别称为MBP71/pSQ-nucA、MBP71/pSQZ-nucA。类似地，用质粒pSH91转化的阳性菌株称为MBP71/pSH91。

结果：

MBP71/pSQ-nucA、MBP71/pSQZ-nucA克隆子在改良SA培养基上回复了生长能力。转化克隆子经PCR扩增鉴定，分别含有质粒pSQ-nucA和pSQZ-nucA，乳酸乳球菌分泌表达系统乳酸乳球菌MBP71/pSQ-nucA和MBP71/pSQZ-nucA构建成功。

实施例5、乳酸乳球菌MBP71/pSQ-nucA表达核酸酶活性(平板法检测)

核酸酶活性检测采用TB-D平板法(Liebl，W.，A.J.Sinskey和K.H.Schleifer.1992.Expression，secretion，and processing of staphylococcalnuclease by Corynebacterium glutamicum.J.Bacteriol.174：1854-1861)，具体步骤如下：挑取乳酸乳球菌MBP71/pSH91、乳酸乳球菌MBP71/pSQ-nucA和乳酸乳球菌MBP71/pSQZ-nucA单菌落涂在改良的SA平板上，30℃培养24～36小时，至出现大小合适的单菌落。将融化的TB-D琼脂(Lachica RVF，Genigeorgis C，Hoeprich PD.Metachromatic agar-diffusion methods fordetecting staphylococcal nuclease activity.Appl Microbiol，1971，21：585-587)倒在SA平板上，完全覆盖单菌落(10ml/皿)，置37℃培养15～30min，观察单菌落周围颜色变化，比较不同菌株单菌落周围橙色光晕大小。

结果：

分别涂乳酸乳球菌MBP71/pSQ-nucA、乳酸乳球菌MBP71/pSH91和乳酸乳球菌MBP71/pSQZ-nucA到改良SA平板上，30℃培养24～36h后，菌落生长至针尖大小。将融化的TB-D培养基覆盖单菌落，37℃培养15min后，乳酸乳球菌MBP71/pSQ-nucA和乳酸乳球菌MBP71/pSQZ-nucA菌落周围出现橙色光晕，但乳酸乳球菌MBP71/pSQ-nucA菌落光晕半径较乳酸乳球菌MBP71/pSQZ-nucA菌落光晕半径大，乳酸乳球菌MBP71/pSH91菌落周围没有橙色光晕出现(图6A)；37℃培养45min后，乳酸乳球菌MBP71/pSQ-nucA和乳酸乳球菌MBP71/pSQZ-nucA菌落周围光晕半径较15min时增大；乳酸乳球菌MBP71/pSH91菌落周围没有橙色光晕出现(图6B)。结果提示乳酸乳球菌MBP71/pSQ-nucA和乳酸乳球菌MBP71/pSQZ-nucA能够分泌性表达核酸酶，而且乳酸乳球菌MBP71/pSQ-nucA表达核酸酶量较乳酸乳球菌MBP71/pSQZ-nucA多，表达效率高。

实施例6、乳酸乳球菌上清和菌体蛋白样品的制备

乳酸乳球菌上清和菌体蛋白样品的制备参照文献[Le Loir Y，Gruss A，Ehrlich SD，et al.A nine-residue synthetic propeptide enhances secretionefficiency of heterologous proteins in Lactococcus lactis.J.Bacteriol.1998；180：1895-1903]，具体步骤如下：分别接种乳酸乳球菌MBP71/pSQ-nucA、乳酸乳球菌MBP71/pSH91和乳酸乳球菌MBP71/pSQZ-nucA单菌落至GM17液体培养基中，30℃静止培养过夜，次日以1∶100稀释静止培养至OD＝1.0。取2ml培养液，4℃ 6000×g离心5min，分别收集上清和菌体。上清和菌体样品按照每10D培养液用100μl溶液定容(即20倍浓缩)。上清以0.2μm孔径滤器过滤，三氯乙酸(TCA，终浓度15％)沉淀1h，4℃ 6000×g离心5min，沉淀以1ml预冷丙酮洗一遍，冷冻干燥，以100μl 50mM NaOH溶解，-20℃保存备用。菌体以1ml预冷的TES(蔗糖，25％；EDTA，1mM；Tris-HCl，50mM[pH 8])洗过后，以TCA(终浓度10％)沉淀1h，4℃ 6000×g离心5min，沉淀用1ml丙酮洗过后，重悬于70μl TESL(蔗糖，25％；EDTA，1mM；Tris-HCl，50mM[pH 8]；溶菌酶，1mg/ml)，37℃孵育30min，加30μl 20％SDS(终浓度6％)溶解，-20℃保存备用。

实施例7、核酸酶SDS-PAGE和酶谱检测

分别取15μl上述上清和菌体样品与5μl蛋白上样缓冲液混合，95℃变性5min后，取15μl上样进行SDS-PAGE，考马斯亮兰染色后，观察核酸酶特异条带并扫描保存。酶谱检测参照文献[Liebl，W.，A.J.Sinskey，and K.H. Schleifer.Expression，secretion，and processing of staphylococcal nucleaseby Corynebacterium glutamicum.J.Bacteriol.1992；174：1854-1861]：样品进行SDS-PAGE后，进行蛋白复性处理，将复性处理后的胶平铺到TB-D琼脂上，保鲜膜包裹后置37℃孵育，观察橙色条带，比较其颜色深浅并拍照。

结果：

上清和菌体样品SDS-PAGE电泳后，经考马斯亮兰染色和脱色处理，与空白对照比较，乳酸乳球菌MBP71/pSQ-nucA上清样品在18KD位置有一条特异的条带，而乳酸乳球菌MBP71/pSQZ-nucA在相应位置没有明显的特异条带；MBP71/pSQ-nucA和MBP71/pSQZ-nucA的菌体样品与空白对照比较，没有观察到特异条带的存在(图7)。酶谱结果显示，TB-D琼脂胶与SDS-PAGE胶作用1小时后，乳酸乳球菌MBP71/pSQ-nucA与乳酸乳球菌MBP71/pSQZ-nucA上清和菌体样品在18KD位置出现橙色条带，而且上清样品中条带的亮度和宽度远远高于菌体样品条带，根据条带的宽度和亮度估计，上清样品中核酸酶含量是菌体的10倍；乳酸乳球菌MBP71/pSQ-nucA上清和菌体样品条带亮度和宽度高于乳酸乳球菌MBP71/pSQZ-nucA上清和菌体样品，估计乳酸乳球菌MBP71/pSQ-nucA核酸酶总量是乳酸乳球菌MBP71/pSQZ-nucA的5倍(图8)。结果提示在乳酸乳球菌MBP71/pSQ-nucA中，核酸酶大多以分泌形式表达，分泌到培养液上清中，而菌体中含有少量核酸酶；乳酸乳球菌MBP71/pSQ-nucA表达的核酸酶量高于乳酸乳球菌MBP71/pSQZ-nucA。

表1 试验中所用的引物

基因名称	引物序列(内切酶)	扩增片段长度(bp)
基因名称	引物序列(内切酶)	扩增片段长度(bp)	P32	5’-CGaagcttAGATTAATAGTTTTAGCTATTAATC-3’(HindII)SEQ IDNO：25’-GCgtcgacCCTAGTATAGCATTTTGTGAAG-3’(SalI)SEQ IDNO：3	138
SPusp45	5’-GCgtcgacAAC CGA ACTTAA TGG GAG GA-3’(SalI)SEQ IDNO：45’-CGtctagaCGCATCTTGTTTAGCAATATCTGAG-3’(XbaI)SEQ IDNO：5	170	P32		138
SPusp45		170	NucA	5’-GAtctagaTCAACTAAAAAATTACATAAAGAACC-3’(XbaI)SEQ IDNO：65’-GCggtaccGATCTAAAAATTATAAAAGT-3’(KpnI)SEQ ID NO：7	513
Usp45	5’-CGAAGCT7GTGTTTTGTAATCATAAAGA-3’(HindIII)SEQ IDNO：85’-CGTCTSGACGCATCTTGTTTAGCAATATCTGAG-3’(XbaI)SEQ ID NO：9	230	NucA		513

序列表

<110>中国疾病预防控制中心传染病预防控制所

<120>乳酸乳球菌食品级分泌表达载体及其制备方法和应用

<130>GBI07CN0490-C

<160>9

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>2601

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>本发明的乳酸乳球菌食品级分泌表达载体

<400>1

tgaaagccga tgactgaatg aaataataag cgcagcgccc ttctatttcg gttggaggag 60

gctcaaggga gtatgaggga atgaaattcc ctcatgggtt tgattttaaa aattgcttgc 120

aattttgccg agcggtagcg ctggaaaatt tttgaaaaaa atttggaatt tggaaaaaaa 180

tggggggaaa ggaagcgaat tttgcttccg tactacgacc ccccattaag tgccgagtgc 240

caatttttgt gccaaaaacg ctctatccca actggctcaa gggtttaagg ggtttttcaa 300

tcgccaacga atcgccaacg ttttcgccaa cgttttttat aaatctatat ttaagtagct 360

ttattgttgt ttttatgatt acaaagtgat acactaactt tataaaatta tttgattgga 420

gttttttaaa tggtgatttc agaatcgaaa aaaagagtta tgatttctct gacaaaagag 480

caagataaaa aattaacaga tatggcgaaa caaaaaggtt tttcaaaatc tgcggttgcg 540

gcgttagcta tagaagaata tgcaagaaag gaatcagaac aaaaaaaata agcgaaagct 600

cgcgttttta gaaggatacg agttttcgct acttgttttt gataaggtaa ttatatcatg 660

gctattaaaa atactaaagc tagaaatttt ggatttttat tatatcctga ctcaattcct 720

aatgattgga aagaaaaatt agagagtttg ggcgtatcta tggctgtcag tcctttacac 780

gatatggacg aaaaaaaaga taaagataca tggaatagta gtgatgttat acgaaatgga 840

aagcactata aaaaaccaca ctatcacgtt atatatattg cacgaaatcc tgtaacaata 900

gaaagcgtta ggaacaagat taagcgaaaa ttggggaata gttcagttgc tcatgttgag 960

atacttgatt atatcaaagg ttcatatgaa tatttgactc atgaatcaaa ggacgctatt 1020

gctaagaata aacatatata cgacaaaaaa gatattttga acattaatga ttttgatatt 1080

gaccgctata taacacttga tgaaagccaa aaaagagaat tgaagaattt acttttagat 1140

atagtggatg actataattt ggtaaataca aaagatttaa tggcttttat tcgccttagg 1200

ggagcggagt ttggaatttt aaatacgaat gatgtaaaag atattgtttc aacaaactct 1260

agcgccttta gattatggtt tgagggcaat tatcagtgtg gatatagagc aagttatgca 1320

aaggttcttg atgctgaaac gggggaaata aaatgacaaa caaagaaaaa gagttatttg 1380

ctgaataatg aggaattaaa aaagatagga aaatttcatg acttacgcag atcaagtttt 1440

taaacaaaat atccaaaata tcctagataa tggtgttttt tcagaaaatg caagaccaaa 1500

gtataaggat ggtcaaatgg cgaatagcaa atatgtcact ggttcattcg ttacttatga 1560

tttgcaaaag ggggagtttc caattaccac tttgcgtcca attccaatca aatctgctat 1620

taaagaattg atgtggatat accaagacca aacaagtgaa ctttctgttc tcgaagagaa 1680

gtatggagtc aaatactggg gagaatgggg aattggtgat ggtacgattg ggcaacgtta 1740

tggtgcaaca gtcaaaaaat ataatatcat tggtaaatta ttagaaggct tggccaaaaa 1800

tccatggaat cgtcgtaata tcatcaacct ttggcagtat gaagattttg aggaaacaga 1860

aggtctttta ccatgtgctt tccaaacgat gtttgatgtc cgtcgagaaa aagatggtca 1920

gatttatttg gatgccacac tgattcaacg ttcaaacgat atgcttgtag cccaccatat 1980

caatgcgatg caatatgttg ctttgcaaat gatgattgca aaacattttt cttggaaagt 2040

tgggaaattc ttttattttg taaataattt acatatttat gataatcagt ttgagcaggc 2100

aaatgaatta atgaagcgaa cagcttctga aaaagaacct cgtttggtcc ttaatgttcc 2160

tgatggtaca aactttttcg atattaaacc tgaagatttt gaacttgtgg actatgagcc 2220

agtaaaacct caattgaaat ttgatttagc aatttaaatt aatctaaagc ttagattaat 2280

agttttagct attaatcttt ttttattttt atttaagaat ggcttaataa agcggttact 2340

ttggattttt gtgagcttgg actagaaaaa aacttcacaa aatgctatac tagggtcgac 2400

aaccgaactt aatgggagga aaaattaaaa aagaacagtt atgaaaaaaa agattatctc 2460

agctatttta atgtctacag tgatactttc tgctgcagcc ccgttgtcag gtgtttacgc 2520

tgacacaaac tcagatattg ctaaacaaga tgcgtctaga ggatccccgg gtaccgagct 2580

cgaa ttcgtaatca tggtcat 2601

<210>2

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>2

cgaagcttag attaatagtt ttagctatta atc 33

<210>3

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>3

gcgtcgaccc tagtatagca ttttgtgaag 30

<210>4

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>4

gcgtcgacaa ccgaacttaa tgggagga 28

<210>5

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>5

cgtctagacg catcttgttt agcaatatct gag 33

<210>6

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>6

gatctagatc aactaaaaaa ttacataaag aacc 34

<210>7

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>7

gcggtaccga tctaaaaatt ataaaagt 28

<210>8

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>8

cgaagcttgt gttttgtaat cataaaga 28

<210>9

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>9

cgtctagacg catcttgttt agcaatatct gag 33

Claims

1.一种乳酸乳球菌食品级分泌表达载体，其包括以下元件：

thyA基因选择标记、质粒pWV01的复制子、多克隆位点、分泌表达用启动子、Usp45的核糖体结合位点、Usp45的信号肽序列及部分Usp45成熟肽编码序列，其中所述分泌表达用启动子为P32启动子。

2.如权利要求1所述的乳酸乳球菌食品级分泌表达载体，其中，所述部分Usp45成熟肽编码序列为Usp45成熟肽前9、10、11、12、13、14或15个氨基酸编码序列。

3.如权利要求1所述的乳酸乳球菌食品级分泌表达载体，其中，所述的P32启动子与所述Usp45的核糖体结合位点、Usp45信号肽序列及部分Usp45成熟肽编码序列形成融合基因。

4.如权利要求3所述的乳酸乳球菌食品级分泌表达载体，其中，所述融合基因位于HindIII和XbaI多克隆位点之间。

5.如权利要求1所述的乳酸乳球菌食品级分泌表达载体，其中，所述的thyA基因选择标记为乳酸乳球菌MG1363的thyA基因；所述P32启动子为pMG36e的P32启动子；所述的Usp45信号肽序列为乳酸乳球菌MG1363的Usp45信号肽序列。

6.如权利要求1或5所述的乳酸乳球菌食品级分泌表达载体，其中，所述载体包含如SEQ ID NO：1所示的序列。

7.一种乳酸乳球菌食品级分泌表达系统，该系统包含权利要求1～6任一项所述的乳酸乳球菌食品级分泌表达载体以及乳酸乳球菌ΔthyA突变株。

8.根据权利要求7所述的乳酸乳球菌食品级分泌表达系统，其中，所述的乳酸乳球菌食品级分泌表达载体位于所述的乳酸乳球菌ΔthyA突变株中。

9.一种疫苗，其含有权利要求7或8所述的乳酸乳球菌食品级分泌表达系统。

10.权利要求1～6任一项所述的乳酸乳球菌食品级分泌表达载体的构建方法，该方法包括：

制备分泌表达用启动子、Usp45的核糖体结合位点、Usp45信号肽序列及部分Usp45成熟肽编码序列以及制备包含thyA基因选择标记、质粒pWV01的复制子和质粒pUC18的多克隆位点的载体骨架；将所述分泌表达用启动子、Usp45的核糖体结合位点、Usp45信号肽序列及部分Usp45成熟肽编码序列克隆入所述载体骨架的多克隆位点；所述的分泌表达用启动子为P32启动子。

11.权利要求1～6任一项所述的乳酸乳球菌食品级分泌表达载体在分泌表达外源基因中的应用。