CN112048459B - 一种猪霍乱沙门氏菌、疫苗及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种猪霍乱沙门氏菌C500(pVAX‑S/GnRH‑2a/KISS1‑asd)，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 2020055。该菌种应用于制备控制动物发情表现的药品或疫苗。本发明还公开了两种质粒，即pVAX‑S/GnRH‑asd质粒和pVAX‑S/GnRH‑2a/KISS1‑asd质粒，也可应用于制备控制动物发情表现的药品或疫苗。本发明还公开了一种控制动物发情表现的基因疫苗及其制备方法。该疫苗对动物进行免疫后产生腺激素释放激素和吻素的抗体，中和动物内源性激素，降低动物的攻击性，缓解动物躁动不安，食欲减退，异常兴奋的发情期问题。

Description

一种猪霍乱沙门氏菌、疫苗及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种猪霍乱沙门氏菌、疫苗及其应用。猪霍乱沙门氏菌C500(pVAX-S/GnRH-2a/KISS1-asd)，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 2020055。分类命名是猪霍乱沙门氏菌C500(pVAX-S/GnRH-2a/KISS1-asd)或Salmonella choleraesuis C500(pVAX-S/GnRH-2a/KISS1-asd)。
背景技术
在自然情况下，动物的繁殖行为受激素水平及环境等因素的多重调控，但在生产和生活中往往需要人为的干扰和调控动物的行为及性状。在畜牧业生产上，尤其是大型家畜在发情期，由于激素水平的骤然改变，其性情往往也会发生巨大变化，这种由于发情带来的躁动、吼叫、撕咬、示威、打斗等现象，对于动物自身及其群体，或者直接接触发情动物的人员都是一种风险，甚至导致伤亡。每年由于宠物或饲养动物伤人的事件屡见不鲜，此外，群体养殖动物的打斗往往会给养殖场带来极大的经济损失。目前，就动物发情期难于饲养和管理的问题，国内已有一些相应的解决方法，借助去势控制动物的性行为，使其性情更加温顺，便于饲养管理。宠物行业的发展及动物福利的完善也推动了控制动物发情技术的创新和进步，同时也对相关技术的安全性提出了更高的要求。
去势的方法主要包括手术去势、化学去势、免疫去势，但目前运用最为普遍的依旧是传统的手术去势法。手术去势法通常是指借助外力直接摘除睾丸和附睾，或者不进行摘除，而使用其他方式使睾丸失血和组织坏死，进而脱落。手术去势法虽然可以控制动物的发情表现，但在注射麻药和手术等过程中，都会给动物造成的强烈的应激反应，短期内可能引起去势动物的生长性能降低，另外还可能存在术后感染的风险、大家畜和野生动物不便操作等缺点。
免疫去势通过对动物注射特定的外源生殖激素，诱导机体产生出能够中和该激素的特异性抗体，从而达到人为的改变生殖轴调节功能的目的，免疫去势法操作简单，且具有减小对动物体的损害、避免手术的疼痛和感染风险、以及不显著降低动物的生产性能的特点。因其独特的优势，在畜牧业和生活中也开始被广泛的研究和应用，免疫去势主要是选择下丘脑-垂体-性腺轴(Hypothalamic-pituitary-gonadal axis,HPG)上的一种或多种生殖激素作为靶标，常见的如卵泡刺激素(FSH)、促黄体激素(LH)、促性腺激素释放激素(GnRH)、吻素(KISS1)以及其他与生殖相关的激素或受体。
促性腺激素释放激素(GnRH)能够刺激促黄体素和卵泡刺激素释放到外周血液，进而调节性腺激素的合成，促进卵泡的发育和排卵，还能调节精子的发生以及第二性征的维持。但是研究表明GnRH的调节方式具有双重性，合适剂量的GnRH可以促进LH和FSH的分泌和释放，但当给予大剂量的外源GnRH或者GnRH的类似物时，反而抑制了机体的生殖系统功能。GnRH免疫疫苗的研究广泛，但也存在一些需要改进和解决的问题，比如GnRH疫苗免疫后的动物并未完全丧失繁殖能力、往往需要多次加强免疫、免疫时的剂量不易掌控等。
KISS1又称吻素基因，能够编码145个氨基酸的神经肽前体,经剪切生成54个氨基酸的活性多肽,称为kisspeptin-54，其能够进一步裂解形成kisspeptin-10、13、14。研究发现KISS1能够调控下丘脑GnRH神经元分泌GnRH的活动，KISS1基因合成的kisspeptin神经肽与受体结合后能够控制GnRH的合成与分泌，从而改变LH和FSH的释放，达到调节动物的生殖生理活动的目的。实验表明KISS1作为免疫去势的新靶标具有良好的免疫效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种工程菌——猪霍乱沙门氏菌C500(pVAX-S/GnRH-2a/KISS1-asd)以及其应用。猪霍乱沙门氏菌的拉丁名为Salmonella choleraesuis。
本发明的另一目的在于提供两种质粒pVAX-S/GnRH-asd质粒和pVAX-S/GnRH-2a/KISS1-asd质粒以及其应用。
本发明的又一目的在于提供一种控制动物发情表现的基因疫苗以及其制备方法。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
猪霍乱沙门氏菌C500(pVAX-S/GnRH-2a/KISS1-asd)，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为：武汉大学，保藏日期为：2020年03月19日，保藏号为CCTCC NO:M2020055。分类命名是猪霍乱沙门氏菌C500(pVAX-S/GnRH-2a/KISS1-asd)或Salmonellacholeraesuis C500(pVAX-S/GnRH-2a/KISS1-asd)。
上述猪霍乱沙门氏菌，用作动物药品或疫苗。
更进一步地，上述猪霍乱沙门氏菌，在制备控制动物发情表现的药品或疫苗中的应用。
更进一步地，上述猪霍乱沙门氏菌，用于降低雄性梅花鹿发情期攻击性。
上述工程菌可以制备GnRH-KISS1双表达DNA疫苗工程菌；通过SDS碱裂法进行质粒抽提，可以获取GnRH-KISS1的共表达质粒。
将含有GnRH-KISS1双表达DNA疫苗的工程菌C500(pVAX-S/GnRH-2a/KISS1-asd)直接免疫梅花鹿，能够达到有效抑制雄鹿的攻击性的目的，并缓解其躁动不安，食欲减退，异常兴奋等问题。减少了雄鹿群发情期因争“鹿王”和角斗引发的伤亡情况，也保障了饲养人员的安全，且不影响雄鹿第二年春季的正常生茸。
一种控制动物发情表现的基因疫苗，包括上述猪霍乱沙门氏菌。该基因疫苗为GnRH-KISS1双表达DNA疫苗，包括GnRH基因和KISS1基因。
pVAX-S/GnRH-asd质粒，其特征在于：包含S/GnRH基因，S/GnRH基因序列如SEQ IDNO.1所示。
pVAX-S/GnRH-2a/KISS1-asd质粒，其特征在于：包含S/GnRH基因和KISS1基因，S/GnRH基因序列如SEQ ID NO.1所示，KISS1基因序列如SEQ ID NO.2所示。
更进一步地，连接S/GnRH基因和KISS1基因的2A肽基因序列如SEQ ID NO.3所示。
上述两种质粒，在制备控制动物发情表现的药品或疫苗中的应用。
一种控制动物发情表现的基因疫苗的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、人工合成GnRH基因和KISS1基因，GnRH基因上游串联乙肝表面抗原S基因，KISS1基因上游串联2A肽基因；
S2、将含pVAX-asd质粒的沙门氏菌C500(pVAX-asd)和含pUC-S/GnRH-Amp的菌株活化培养，进行质粒提取；
S3、将质粒pVAX-asd和pUC-S/GnRH-Amp进行NheI和HindIII双酶切，连接目的片段获得质粒pVAX-S/GnRH-asd；
S4、将质粒pVAX-S/GnRH-asd和pUC-2a/KISS1-Amp进行HindIII和XhoI双酶切，连接目的片段获得质粒pVAX-S/GnRH-2a/KISS1-asd；
S5、将质粒pVAX-S/GnRH-2a/KISS1-asd导入猪霍乱沙门氏菌C500菌株中，构建猪霍乱沙门氏菌C500(pVAX-S/GnRH-2a/KISS1-asd)；
S6、猪霍乱沙门氏菌C500(pVAX-S/GnRH-2a/KISS1-asd)用于基因疫苗。
本发明的有益效果在于：
1、pVAX-S/GnRH-asd质粒能表达促性腺激素释放激素基因，调节促性腺激素释放激素的水平，其应用于疫苗或者药品可以调控动物的性激素水平及发情行为。
2、pVAX-S/GnRH-2a/KISS1-asd质粒能够同时表达促性腺激素释放激素基因和吻素基因，共同调节促性腺激素释放激素的水平，其应用于疫苗或者药品可以调控动物的性激素水平及发情行为。
3、猪霍乱沙门氏菌C500(pVAX-S/GnRH-2a/KISS1-asd)直接免疫梅花鹿后，产生的促性腺激素释放激素和吻素的抗体，中和雄性梅花鹿的内源性激素，在不影响雄鹿的身体状况的基础上，可以降低雄鹿的攻击性，并缓解雄鹿躁动不安，食欲减退，异常兴奋的发情期问题。
4、猪霍乱沙门氏菌C500(pVAX-S/GnRH-2a/KISS1-asd)可以直接进行免疫，省去中间处理环节，免疫方式多样，喷鼻、口服、拌料、注射都能够刺激机体产生免疫反应。
5、猪霍乱沙门氏菌C500(pVAX-S/GnRH-2a/KISS1-asd)不含抗性筛选基因，避免了外源抗生素的使用，没有抗生素残留的问题。其应用于基因疫苗，相对于合成肽疫苗，合成、获取等更加简便，此外，该疫苗的生产成本低，使用方便，效果显著。
附图说明
图1是质粒pUC-S/GnRH-Amp双酶切电泳图；
其中，M：DNA Marker；泳道1-3：质粒pUC-S/GnRH-Amp酶切；
图2是质粒pVAX-asd双酶切电泳图；
其中，M：DNA Marker；泳道4-6：质粒pVAX-asd酶切；
图3是质粒pVAX-S/GnRH-asd双酶切鉴定电泳图；
其中，M：DNA Marker；泳道1-2：质粒pVAX-S/GnRH-asd双酶切；
图4是质粒pUC-2a/KISS1-Amp双酶切电泳图；
其中，M：DNA Marker；泳道1-4：质粒pUC-2a/KISS1-Amp酶切；
图5是质粒pVAX-S/GnRH-asd双酶切电泳图；
其中，M：DNA Marker；泳道5-8：质粒pVAX-S/GnRH-asd酶切；
图6是质粒pVAX-S/GnRH-2a/KISS1-asd双酶切鉴定电泳图；
其中，M：DNA Marker；泳道1-2：质粒pVAX-S/GnRH-2a/KISS1-asd酶切；
图7是质粒pVAX-S/GnRH-2a/KISS1-asd双酶切鉴定电泳图；
其中，M：DNA Marker；泳道1-2：质粒HindIII和XhoI酶切，泳道3-4：质粒NheI和XhoI酶切；
图8是质粒pVAX-S/GnRH-2a/KISS1-asd双酶切电泳图；
其中，M：DNA Marker；泳道1-3：质粒pVAX-S/GnRH-2a/KISS1-asd经内切酶NheI和XhoI双酶切产物；
图9是免疫期间各组梅花鹿睾酮含量变化图；
其中，数据均以均值±标准误表示，同时期柱顶的字母不同表示统计学差异显著，显著水平P＝0.05；
图10是免疫期间各组梅花鹿雌二醇含量变化图；
其中，数据均以均值±标准误表示，同时期柱顶的字母不同表示统计学差异显著，显著水平P＝0.05；
图11是粪便中分离菌株的PCR扩增电泳图；
其中，M：DNA Marker；泳道A1-22、B1-22：粪便中分离菌株；泳道A0、B0：阳性对照；泳道A23、B23：阴性对照。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明此发明，但是不应理解为是对本发明的限制，在不违背本发明的实质和精神的前提下，任何对本发明所做的优化和替换，均属于本发明的范畴。
若未特别声明，下列实施例中涉及的技术手段均为本科学领域技术人员普遍使用的常规技术。
实施例1真核单表达促性腺激素释放激素质粒pVAX-S/GnRH-asd的构建。
1、合成：从NCBI中查询GnRH基因(Gene ID:101111690)，GnRH基因上游串联乙肝表面抗原S基因，再在两端添加NheI和HindIII酶切位点，送至武汉擎科生物进行合成，合成的S/GnRH长度为993bp，序列如SEQ ID NO.1所示，合成的片段插入在pUC 57质粒中保存，记为pUC-S/GnRH-Amp；
2、提质粒：取实验室保存的含有pVAX-asd质粒的沙门氏菌C500(pVAX-asd)和含有pUC-S/GnRH-Amp的甘油菌，划线活化后进行培养，培养的菌液使用质粒小量提取试剂盒(操作步骤参考天根生化科技有限公司质粒抽提试剂盒的说明)进行质粒提取；
3、酶切：将质粒pVAX-asd和pUC-S/GnRH-Amp使用限制性内切酶NheI和Hind III双酶切，获得片段pVAX-asd(3741bp)及片段S/GnRH(993bp)，反应体系共20μl：pVAX-asd质粒或pUC-S/GnRH-Amp质粒1μg，10×FastDigest Buffer 2μl，NheI和Hind III各1μl，最后加ddH2O补齐至20μl。反应条件为37℃水浴2h；
4、电泳：质粒pVAX-asd和pUC-S/GnRH-Amp的NheI和HindIII双酶切产物用1％的琼脂糖凝胶电泳，以Mark DL 5000作为分子量标准，电泳结果如图1、图2所示：图1泳道1-3为质粒pUC-S/GnRH-Amp酶切结果，显示在1000bp左右显示出一条清晰的特异性条带，大小与目的基因(S/GnRH，993bp)一致。图2泳道4-6为质粒pVAX-asd酶切，在4000bp左右显示出一条清晰的特异性条带，大小与目的基因(pVAX-asd，3741bp)一致；
5、连接：使用胶回收试剂盒回收电泳后的酶切产物，具体操作参照天根生化科技有限公司胶回收试剂盒使用说明，回收后的产物再利用T4连接酶进行连接，连接体系为10μl：pVAX-asd 2μl，S/GnRH 6μl，10×Fastligation Buffer 1μl，T4 Fast DNA ligation 1μl。25℃快速连接5min。连接产物pVAX-S/GnRH-asd直接用于转化或-20℃保存备用；
6、感受态细胞的制备(氯化钙法)：大肠杆菌x6097由华中农业大学遗传与育种实验室(繁殖课题组)保存。无菌化境下挑取冻存的x6097菌种，于含有50μg/ml的DAP(二氨基庚二酸)的LB平板上划线培养，同时以不加DAP的平板划线为对照，活化后挑取单菌落接种至含50μg/ml的DAP的液体LB中，37℃震荡培养6h，使菌液的OD600达到0.5左右时取200ml菌液倒入提前预冷的无菌大离心瓶中，冰浴30min后，4℃、5000rpm/min，离心10min收集沉淀。用30ml预冷的0.1M/L的CaCl2重悬，冰浴30min后，4℃、5000rpm/min，离心10min再次离心收集菌液。然后用30ml预冷的0.1M/L的CaCl2重悬，冰浴30min后，4℃、5000rpm/min，离心10min第三次离心收集菌液。最后添加1ml预冷的0.1M/L的CaCl2和1ml预冷的浓度为30％的灭菌甘油，重悬菌液并混匀，分装为100μl每管，制备完成的感受态细胞可直接用于转化，或-80℃保存备用；
7、转化：取100μl感受态细胞，冰上融化后加入10μl步骤4的连接产物，轻轻混匀后冰浴30min。然后42℃热激90s后冰浴2min，最后每管加入400μl无菌液体LB，混匀，37℃培养箱中放置10min，然后转移至37℃摇床中，220rpm/min复壮50min。在LB固体培养基中加入50μl转化产物，均匀涂开，37℃培养箱中过夜培养；
8、阳性克隆的筛选及鉴定：挑取过夜培养的阳性克隆接种于LB液体培养基中后，置于37℃摇床中220rpm/min培养6h，使用质粒小量提取试剂盒(操作步骤参考天根生化科技有限公司质粒抽提试剂盒的说明)进行质粒提取，提取的质粒使用限制性内切酶NheI和Hind III双酶切2h，反应体系参考步骤3，电泳酶切产物，鉴定片段S/GnRH，结果如图2所示，电泳条带与目的条带(993bp)大小相符合。将质粒送武汉擎科生物技术有限公司测序，测序对比结果显示，插入序列的方向、位点都正确。成功获得真核表达质粒pVAX-S/GnRH-asd。
实施例2真核双表达促性腺激素释放激素和吻素质粒pVAX-S/GnRH-2a/KISS1-asd的构建。
1、合成：从NCBI中查询KISS1基因(Gene ID:3814)，KISS1基因上游串联2A肽基因，再在两端添加HindIII和XhoI酶切位点，送至武汉擎科生物进行合成，合成的2a/KISS1长度为504bp，插入在pUC57质粒中保存，记为pUC-2a/KISS1-Amp。其中KISS1序列如SEQ ID NO.2所示，2A序列如SEQ ID NO.3所示；
2、提质粒：取实施例1构建的x6097(pVAX-S/GnRH-asd)和含pUC-2a/KISS1-Amp质粒的菌株，划线活化后进行培养，培养的菌液使用质粒小量提取试剂盒(操作步骤参考天根生化科技有限公司质粒抽提试剂盒的说明)进行质粒提取；
3、酶切：将质粒pVAX-S/GnRH-asd和pUC-2a/KISS1-Amp使用限制性内切酶HindIII和XhoI双酶切，获得片段pVAX-S/GnRH-asd(4728bp)及片段2a/KISS1(504bp)，反应体系共20μl：pVAX-S/GnRH-asd质粒或pUC-2a/KISS1-Amp质粒1μg,10×FastDigest Buffer 2μl，NheI和HindIII各1μl，最后加ddH2O补齐至20μl。反应条件为37℃水浴2h；
4、电泳：质粒pVAX-S/GnRH-asd和pUC-2a/KISS1-Amp酶切产物用1％的琼脂糖凝胶电泳，以Mark DL 5000作为分子量标准，电泳结果如图4、图5所示，其中，M:Mark DL 5000，图4泳道1-4为质粒pUC-2a/KISS1-Amp酶切，在500p左右显示出一条清晰的特异性条带，大小与目的基因(2a/KISS1，504bp)一致。图5泳道5-8为质粒pVAX-S/GnRH-asd酶切,显示在5000bp左右显示出一条清晰的特异性条带，大小与目的基因(pVAX-S/GnRH-asd，4728bp)一致；
5、连接：使用胶回收试剂盒回收电泳后的酶切产物，具体操作参照天根生化科技有限公司胶回收试剂盒使用说明，回收后的产物再利用T4连接酶进行连接，连接体系为10μl：pVAX-S/GnRH-asd 1μl，2a/KISS1 7μl，10×Fastligation Buffer 1μl，T4 Fast DNAligation 1μl。25℃快速连接5min。连接产物pVAX-S/GnRH-2a/KISS1-asd直接用于转化或-20℃保存备用；
6、转化：取实施例1中配置的100μl感受态细胞，冰上融化后加入6μl步骤4的连接产物，轻轻混匀后冰浴30min。然后42℃热激90s后再次冰浴2min，每管加入400μl无菌液体LB，混匀，37℃培养箱中放置10min，然后转移至37℃摇床中，220rpm/min复壮50min。取LB固体培养基加入50μl转化产物，均匀涂开，37℃培养箱中过夜培养；
7、阳性克隆的筛选及鉴定：挑取过夜培养的阳性克隆接种于LB液体培养基中后，置于37℃摇床中220rpm/min培养6h，使用质粒小量提取试剂盒(操作步骤参考天根生化科技有限公司质粒抽提试剂盒的说明)进行质粒提取，提取的质粒使用限制性内切酶NheI和XhoI双酶切2h，反应体系参考步骤3，电泳酶切产物，鉴定片段S/GnRH-2a/KISS1，结果如图6所示，电泳条带与目的条带(S/GnRH-2a/KISS1、1491bp)大小相符合。将酶切产物送武汉擎科生物技术有限公司测序，测序对比结果显示，插入序列的方向、位点都正确。成功获得真核表达质粒pVAX-S/GnRH-2a/KISS1-asd。
实施例3真核双表达抗促性腺激素释放激素和吻素的C500感受态工程菌的制备。
1、沙门氏菌C500感受态的制备：取冻存的C500菌种(由华中农业大学动物遗传育种与繁殖实验室保存)，用接种环挑取后加入含有50μg/ml DAP的LB琼脂平板上划线培养，以不加DAP的LB琼脂平板划线做对照，37℃过夜培养后挑取单个菌落于30ml含有50μg/mlDAP的LB液体培养基中，37℃振摇培养。以1：100的比例接种到300ml含有DAP的LB液体培养基中，37℃振摇培养4-6h，OD600值达到0.5左右时，将菌液倒入预冷的离心瓶中，冰浴30min后4℃5000rpm/min，离心10min，沉淀用10m1冰预冷的10％甘油溶液重悬，再冰浴10min，4℃5000rpm/min，离心10min，沉淀再次用10ml冰预冷的10％甘油溶液重悬，随后冰浴10min,同样离心10min后，用1.5m1预冷的10％甘油重悬，悬浮的感受态细胞按80μl每管进行分装，直接用于电转化或-80℃冰箱中保存备用；
2、电转化C500感受态细胞：取5μl提取的质粒pVAX-S/GnRH-2a/KISS1-asd，加入到冰上融化的感受态细胞C500中，混合后冰上预冷30min。将混合物转移至预冷的电转杯中，擦干表面的水分，设定电转仪参数为：1.8KV，4ms-6ms，将电转杯放入槽中电击，迅速加入400μl SOC培养基，轻混匀后37℃培养箱中放置10min，然后转移至37℃摇床中，220rpm/min复壮50min。取LB固体培养基加入50μl转化产物，均匀涂开，37℃培养箱中过夜培养；
3、阳性克隆的筛选及鉴定：挑取过夜培养的阳性克隆菌接种于LB液体培养基中后，置于37℃摇床中220rpm/min培养6h，使用质粒小量提取试剂盒(操作步骤参考天根生化科技有限公司质粒抽提试剂盒的说明)进行质粒提取，提取的质粒使用限制性内切酶HindIII和XhoI、NheI和XhoI各双酶切2h，反应体系参考实施例1步骤3，电泳酶切产物，鉴定片段S/GnRH-2a/KISS1，结果如图7所示，泳道1-2电泳条带与目的条带大小相符合(2a/KISS1、504bp)，泳道3-4电泳条带与目的条带大小相符合(S/GnRH-2a/KISS1、1497bp)。将酶切产物送武汉擎科生物技术有限公司测序，测序对比结果显示，插入序列的方向、位点都正确。成功获得真核双表达抗促性腺激素释放激素和吻素的C500感受态工程菌，即猪霍乱沙门氏菌C500(pVAX-S/GnRH-2a/KISS1-asd)。
实施例4一种抗促性腺激素释放激素和吻素的DNA疫苗在缓解动物发情期躁动亢奋，攻击力增加等问题的应用。
1、基因疫苗的活化：取-80℃冰箱中保存的工程菌C500(pVAX-S/GnRH-2a/KISS1-asd)，划线活化，37℃恒温培养后挑取形态正常的单菌落加入液体培养基中震荡培养，再以1：100的比例进行扩大培养。
2、质粒pVAX-S/GnRH-2a/KISS1-asd的提取：取50ml沙门氏菌C500(pVAX-S/GnRH-2a/KISS1-asd)培养液，提取质粒pVAX-S/GnRH-2a/KISS1-asd，检测提取质粒的纯度和浓度，-20℃保存备用。
3、质粒pVAX-S/GnRH-2a/KISS1-asd的鉴定：取质粒pVAX-S/GnRH-2a/KISS1-asd，利用内切酶NheI和XhoI进行双酶切。取少量酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳。
4、活菌疫苗的制备：取猪霍乱沙门氏菌C500(pVAX-S/GnRH-2a/KISS1-asd)菌液，以1：100的比例使用发酵罐进行过夜培养。然后取过夜培养后的菌液进行梯度稀释，稀释后的菌液进行涂板计数。根据计算的菌液浓度进行菌液离心收集，4℃、6000rpm/min、离心10min。使用PBS将离心收集的菌液浓度调整为1*109CFU/ml、1*1010CFU/ml、1*1011CFU/ml。
5、雄鹿的免疫：在雄鹿的发情期，选择年龄及身体状态相近的26头雄性梅花鹿，随机分为4组，空白组5头；实验1组、实验2组、实验3组，每组各7头，将26头雄鹿放在同一圈舍内饲养。免疫方法为：对实验鹿分组进行飞针麻醉，大腿肌肉注射疫苗。空白组：每头鹿注射5ml PBS；高剂量组：每头鹿注射5ml疫苗(浓度为1*1011CFU/ml)；中剂量组：每头鹿注射5ml疫苗(浓度为1*1010CFU/ml)；实验3组：低剂量组注射5ml疫苗(浓度为1*109CFU/ml)。首免后两周进行第一次加免，首免后四周进行第二次加免。
6、样品采集与处理：雄鹿麻醉后，在注射疫苗之前，用一次性注射器静脉采血5ml，再注入抗凝管中，轻轻摇晃，标记信息后低温保存，所有样品收集完后立即带回实验室进行离心分离血浆，4℃，3000rpm/min，离心10min，小心吸取上清分装保存。共采集免疫后0W、2W、4W、6W的血液样本，将所有血浆样品送至武汉华联科生物技术有限公司检测雄激素和雌激素水平；采集的雄鹿新鲜粪便，混匀后称取10g，用PBS进行梯度稀释，将梯度稀释液涂布在结晶紫中性红胆盐培养基中，培养箱中过夜培养，第二天观察生长菌落，并随机挑选不同形态的菌株培养后，扩增S/GnRH-2a/KISS1片段，进行菌液PCR鉴定。
7.结果与分析
7.1质粒pVAX-S/GnRH-2a/KISS1-asd鉴定结果
质粒pVAX-S/GnRH-2a/KISS1-asd利用内切酶Nhe I和Xho I进行双酶切后，琼脂糖凝胶电泳结果如图8所示，在1500bp左右显示出一条清晰的特异性条带，大小与目的基因(S/GnRH-2a/KISS1，1491bp)一致(图8，泳道1-3)。
7.2雄鹿的发情表现
雄鹿在发情期间，随着雄激素水平的骤然上升，发情行为逐渐显露出来，表现为躁动、吼叫、撕咬、打斗等。处于发情期的雄鹿通常使用脚链来限制运动，以防攻击饲养员，并控制群内争斗引发的伤亡。通过观察发现，经过免疫的高、中、低剂量组的雄性梅花鹿，性情温顺，在去掉脚链后，均未出现打斗和向人示威的情况，躁动的情况明显改善。对照组的雄鹿一直维持躁动不安，嘶吼，圈内奔跑，向人示威等明显的发情表现。可见使用该活菌疫苗免疫后，能够很好的改善雄性梅花鹿发情期的性情改变的问题，降低雄鹿在发情期饲养管理的难度，减少雄鹿打斗引起的不必要的经济损失，同时控制雄鹿伤人的恶性事件的发生。
7.3雄鹿的体况
雄鹿发情期亢奋躁动，活动量增加，休息减少，且食欲减退，致使雄鹿在发情期出现体质瘦弱的情况。通过观察发现，经过免疫的高、中、低剂量组的雄性梅花鹿，日采食量均明显高于对照组。对照组的雄鹿由于活动量大，采食量少，出现体重减轻的现象。此外，对照组雄鹿在打斗过程中出现严重的摔伤和抵伤，引发感染，严重影响雄鹿的健康。总的来说，高、中、低三种浓度的疫苗均能很好的改善雄性梅花鹿食欲减退和体质减弱的问题，增强雄鹿的体质，减少雄性发情期受伤和感染的情况。此外，在后续的观察中发现实验组的雄鹿均能在第二年春季正常生茸，不影响鹿茸的正常生长。
7.4雄鹿的性激素水平
通过对免疫0、2、4、6周的雄鹿进行睾酮水平的检测发现，如图9所示，使用疫苗免疫之前，对照组和免疫组血浆睾酮含量差异不显著(P＞0.05)，且睾酮含量维持在较高的水平，免疫后2、4、6周，高、中、低剂量组的血浆睾酮水平均显示出显著低于空白组的差异(P＜0.05)，除了首次免疫2周时高剂量组和中剂量组间差异不显著(P＞0.05)，其余均存在显著差异。说明这三种剂量的C500(pVAX-S/GnRH-2a/KISS1-asd)疫苗均能降低雄鹿的睾酮激素水平，与实验观察的雄鹿发情表现一致。此外免疫结果呈现出剂量依赖性，越高的剂量其免疫效果越佳，高剂量组(1*1011CFU/ml)在免疫6周后，睾酮水平降低为初始浓度的近一半，免疫效果最显著。
除了睾酮水平的降低，在雌二醇含量的检测中发现，使用疫苗免疫之前，对照组和免疫组血浆雌二醇含量差异不显著(P＞0.05)，免疫后，高、中、低剂量组的血浆雌二醇水平均显著低于空白组的差异(P＜0.05)(图10)，首次免疫2周时高、中、低剂量组的血浆雌二醇水平差异不显著(P＞0.05)，在二次加免后开始出现显著差异。说明这三种剂量的C500(pVAX-S/GnRH-2a/KISS1-asd)疫苗通过诱导宿主机体内潜在的免疫应答反应，降低雄激素的同时，也能降低雄鹿的雌二醇激素水平。
7.5粪便中工程菌残留检测
通过对免疫鹿群粪便的收集，分离粪便中的菌株，挑选进行菌液PCR反应扩展目的基因以检测是否有工程菌C500(pVAX-S/GnRH-2a/KISS1-asd)残留，结果如图10所示，阳性对照中工程菌在1500bp扩增出特异性条带，大小与目的基因(S/GnRH-2a/KISS1，1473bp)一致(图11，泳道A0、B0)。而粪便中挑选的44个菌株在1500bp均未出现异性条带(图11，泳道A1-22、B1-22)。证明该工程菌通过肌肉注射后，未通过粪便排放到体外，未污染周围的环境。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
序列表
<110> 华中农业大学
武汉金三鑫鹿业有限公司
<120> 一种猪霍乱沙门氏菌、疫苗及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 993
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctagctagcc ctgcgctgaa catggagaac atcacatcag gattcctagg accccttctc 60
gtgttacagg cggggttttt cttgttgaca agaatcctca caataccgca gagtctagac 120
tcgtggtgga cttctctcaa ttttctaggg ggaactaccg tgtgtcttgg ccaaaattcg 180
cagtccccaa cctccaatca ctcaccaacc tcttgtcctc caacttgtcc tggttatcgc 240
tggatgtgtc tgcggcgttt tatcatcttc ctcttcatcc tgctgctatg cctcatcttc 300
ttgttggttc ttctggacta tcaaggtatg ttgcccgttt gtcctctaat tccaggatcc 360
tcaacaacca gcacgggacc atgccggacc tgcatgacta ctgctcaagg aacctctatg 420
tatccctcct gttgctgtac caaaccttcg gacggaaatt gcacctgtat tcccatccca 480
tcatcctggg ctttcggaaa attcctatgg gagtgggcct cagcccgttt ctcctggctc 540
agtttactag tgccatttgt tcagtggttc gtagggcttt cccccactgt ttggctttca 600
gttatatgga tgatgtggta ttgggggcca agtctgtaca gcatcttgag tcccttttta 660
ccgctgttac caattttctt ttgtctttgg gtatacgttg gtaccatgga gctgactccc 720
aaacttctag ctggactaat cctgctgact ttctgtgtgg tgggttgctc tggtcaacac 780
tggtcctatg ggctgcgccc tggaggaaag agaaatgctg agaatgtgat tgattctttc 840
caagagatag ccaaagaggt cgatcagcca gtagaaccta agtgctgtgg gtgcattgtt 900
caccagtccc attctcctct gagggacctg aaagaagctc tggaaagtct gattgaagag 960
gaaactgggc agaggaaaat ataaaagctt ggg 993
<210> 2
<211> 417
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgaactcac tggtttcttg gcagctactg cttttcctct gtgccaccca ctttggggag 60
ccattagaaa aggtggcctc tgtggggaat tctagaccca caggccagca gctagaatcc 120
ctgggcctcc tggcccccgg ggagcagagc ctgccgtgca ccgagaggaa gccagctgct 180
actgccaggc tgagccgtcg ggggacctcg ctgtccccgc cccccgagag ctccgggagc 240
ccccagcagc cgggcctgtc cgccccccac agccgccaga tccccgcacc ccagggcgcg 300
gtgctggtgc agcgggagaa ggacctgccg aactacaact ggaactcctt cggcctgcgc 360
ttcggcaagc gggaggcggc accagggaac cacggcagaa gcgctgggcg gggctga 417
<210> 3
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggcagtggag agggcagagg aagtctgcta acatgcggtg acgtcgagga gaatcctggc 60
cca 63

Claims (5)

1.猪霍乱沙门氏菌，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2020055，所述猪霍乱沙门氏菌由pVAX-S/GnRH-2a/KISS1-asd质粒导入猪霍乱沙门氏菌C500菌株中构建而成，所述pVAX-S/GnRH-2a/KISS1-asd质粒包含S/GnRH基因和KISS1基因，S/GnRH基因序列如SEQ ID NO.1所示，KISS1基因序列如SEQ ID NO.2所示，连接S/GnRH基因和KISS1基因的2A肽基因序列如SEQ ID NO.3所示。
2.权利要求1所述猪霍乱沙门氏菌，用作动物疫苗。
3.权利要求1所述猪霍乱沙门氏菌，用于降低雄性梅花鹿发情期攻击性。
4.权利要求2所述猪霍乱沙门氏菌在制备控制动物发情表现的疫苗中的应用。
5.一种控制动物发情表现的基因疫苗，其特征在于：包括权利要求1所述猪霍乱沙门氏菌。
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