CN110408579A - 牛白细胞介素-2重组乳酸菌及其应用 - Google Patents

牛白细胞介素-2重组乳酸菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及牛白细胞介素‑2重组乳酸菌及其应用。BoIL‑2基因与载体pNZ8148连接，构建pNZ8148‑BoIL‑2表达载体，将pNZ8148‑BoIL‑2表达载体转化到大肠杆菌MC1061感受态细胞，进行质粒的克隆扩增，利用电转化的方法将质粒pNZ8148‑BoIL‑2转化到乳酸乳球菌NZ9000中，并诱导其表达。本申请所述的重组乳酸菌L.lactis NZ9000/pNZ8148‑BoIL‑2能够表达有生物活性的牛IL‑2，可以稳定传代20代，能够提高动物机体免疫功能，增强动物机体抵抗力，减少疾病的发生。

Description

牛白细胞介素-2重组乳酸菌及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及牛白细胞介素-2重组乳酸菌及其应用。
背景技术
目前在奶牛的养殖过程中许多疾病的预防与治疗仍旧依赖于抗生素，但由于抗生素的大量滥用，导致耐药菌株逐渐增多，细菌产生了高度的耐受能力，严重影响了奶牛养殖业和人类的健康安全。白细胞介素-2(IL-2)是由多种细胞产生的一类具有多种作用的细胞因子，具有提高动物机体免疫应答水平、增强动物机体抗病能力的作用。乳酸菌是一种食品级微生物，具有经济成本低、安全无害等优点，是一类良好的外源蛋白表达载体宿主，同时也是制成转基因微生态制剂的优秀宿主菌株，目前已有研究将两者结合，制成转基因微生态制剂，发挥二者的作用，但牛源细胞因子与乳酸菌二者结合制成转基因微生态制剂的报道甚少。因此，本研究的目的是利用基因工程方法将牛源IL-2基因转入到乳酸菌中，制成转基因微生态制剂，并对其效果进行初步探究，为开发提高奶牛固有免疫力、预防和治疗奶牛疾病的转基因微生态制剂提供基础，保障奶牛生产安全和动物性食品安全。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了牛白细胞介素-2重组乳酸菌及其应用。
具体技术方案为：牛白细胞介素-2重组乳酸菌，它是转化了质粒 pNZ8148-BoIL-2到乳酸乳球菌NZ9000的乳酸菌，其中BoIL-2为牛白细胞介素 -2基因的简称。
优选的，所述BoIL-2的碱基序列如序列表SEQ ID No.1所示。
优选的，密码子优化后BoIL-2的碱基序列如序列表SEQ ID No.2所示。
优选的，所述质粒pNZ8148-BoIL-2是载体pNZ8148中插入了如序列SEQ ID No.2所述的基因。
牛白细胞介素-2重组乳酸菌的制备方法，它包括：
1)、目的基因的合成
BoIL-2基因全长共468bp，利用HindⅢ和EcoRⅠ合成480bp BoIL-2基因；
2)、表达质粒pNZ8148-BoIL-2的构建
2.1目的基因BoIL-2与表达载体的酶切与纯化回收
将质粒pUC57-BoIL-2与载体pNZ8148分别用HindIII与KpnI进行双酶切，酶切时间为6h，完成后取3μL与少量l0×Loading Buffer混匀，跑0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定，将鉴定正确的酶切产物纯化回收；
2.2目的基因与表达载体的连接
将2.1得到的载体pNZ8148使用T4DNA ligase 16℃与目的基因BoIL-2连接过夜；
2.3连接产物转化到大肠杆菌MC1061F-感受态细胞中；
2.4大肠杆菌MC1061中重组质粒鉴定：
在平板中挑取单个菌落，37℃摇床过夜活化后提取质粒，进行PCR鉴定和双酶切鉴定；
PCR反应体系如下：
试剂：Premix Taq DNA聚合酶为50μL；引物P上为2μL；引物P下为2μL；模板为2μL；ddH2O为44μL；体系为100μL；
反应条件为：94℃30sec；60℃30sec；循环30次，72℃延展1min，反应完成后取3μL产物进行1％凝胶电泳鉴定，观察结果；
使用内切酶KpnI和HindIII对疑为阳性的重组质粒进行双酶切鉴定；于 37℃恒温水浴锅中酶切3h，取3μL进行1％凝胶电泳；
双酶切反应体系如下：
试剂：重组质粒为8μL；HindIII为2μL；KpnI为2μL；10×M缓冲液为2μL；ddH2O为6μL；体系为20μL；
2.5重组表达质粒的的序列测定
鉴定正确的质粒进行测序，对于测序比对结果正确的阳性质粒命名成 pNZ8148-BoIL-2；
3)重组乳酸菌L.lactis NZ9000/pNZ8148-BoIL-2的构建
3.1重组质粒pNZ8148-BoIL-2的提取
3.2质粒pNZ8148-BoIL-2电转化至L.lactis NZ9000。
优选的，所述2.3连接产物转化到大肠杆菌MC1061F-感受态细胞中具体为：
2.3.1将MC1061F-感受态细胞从-80℃冰箱中拿出，放入到冰水混合物中缓慢融化，待MC1061F-感受态细胞融化后将连接产物10μL加入到其中，用手轻轻拨动EP管底，待混匀后在冰水混合物中静置25min；
2.3.2将EP管迅速插入42℃水浴中，热激45秒，迅速取出放回冰水混合物中静置5min，动作尽量小心，不要晃动；
2.3.3向EP管中加入700μL无抗性无菌LB培养基，轻轻混匀，37℃，500 rpm水平摇床中复苏30min；
2.3.4低温离心机中5000rpm，1min离心，收集菌体沉淀，留取100μL 左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含有氯霉素的LB培养基上；
2.3.5将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。
优选的，所述3.1重组质粒pNZ8148-BoIL-2的提取是使用天根质粒提取试剂盒进行提取。
优选的，所述3.2质粒pNZ8148-BoIL-2电转化至L.lactisNZ9000具体为：
3.2.1将用75％乙醇粗粒过的电转杯放入到无菌操作台中，紫外照射30min 消毒，冰水混合物中冷却20min；
3.2.2将100μL L.lactis NZ9000感受态和5μL的pNZ8148-BoIL-2 质粒放在冰水混合物中，缓慢融化，至不再有冰块，将L.lactisNZ9000感受态与pNZ8148-BoIL-2质粒混合，不要震荡，冰水混合物中静置15min；
3.2.3将连接产物用移液枪移到电转杯中，设置电转仪电压为3,000V，将电转杯放在电转仪中进行电转；
3.2.4结束后，在电转杯底部加入895μL的电转缓冲液；
3.2.5将转化后的培养液移至1.5mL离心管中，30℃恒温培养箱中静置培养
6h，离心后留200μL涂布到有氯霉素抗性的GM17培养板上，继续培养3 天。
牛白细胞介素-2重组乳酸菌在制备奶牛免疫力增强剂方面的应用。
有益效果为：本申请牛IL-2基因与载体pNZ8148连接，构建pNZ8148-BoIL-2 表达载体。将pNZ8148-BoIL-2表达载体转化到大肠杆菌MC1061感受态细胞，进行质粒的克隆扩增，利用电转化的方法将质粒pNZ8148-BoIL-2转化到乳酸乳球菌NZ9000中，构建成功的重组菌可稳定传代20代。经Western blot方法检测，在17.5kDa处发现目的蛋白，证明乳酸菌诱导表达成功。小鼠体重增长量重组乳酸菌组显著高于其他三组(P<0.05)；肠道组织损伤程度实验组与三组对照组相比最轻微；重组乳酸菌组外周血中特异性抗体sIgA、IgG含量最高，与其他三组差异显著(P<0.05)；重组乳酸菌组外周血T淋巴细胞增殖活性极显著高于其他三组(P<0.01)；流式细胞仪检测淋巴结、脾脏中CD4+、CD8+、CD25+含量重组乳酸菌组均显著高于其他三组(P<0.05)；TNF-α、mRNA表达量重组乳酸菌组显著高于其他三组(P<0.05)。
本申请所述的重组乳酸菌L.lactisNZ9000/pNZ8148-BoIL-2能够表达有生物活性的牛IL-2，可以稳定传代20代，能够提高动物机体免疫功能，增强动物机体抵抗力，减少疾病的发生。
附图说明
图1为E.coil MC1061中质粒pNZ8148-BoIL-2PCR鉴定结果；
图2为E.coil MC1061中质粒pNZ8148-BoIL-2双酶切鉴定结果；
图3为L.lactis NZ9000中质粒pNZ8148-BoIL-2PCR鉴定结果；
图4为L.lactis NZ9000中质粒pNZ8148-BoIL-2双酶切鉴定结果；
图5为L.lactis NZ9000表达蛋白的Western blot分析；
图6为小鼠十二指肠病理切片；
图7为小鼠血清中IgG含量比较；
图8为小鼠血清中sIgA含量比较；
图9为淋巴结中CD25+含量；
图10为淋巴结中CD4+、CD8+含量；
图11为脾脏中CD25+含量；
图12为淋巴结中CD4+、CD8+含量；
图13为淋巴结中CD25+、CD8+、CD4+含量比较；
图14为脾脏中CD25+、CD8+、CD4+含量比较；
图15为外周血T淋巴细胞增殖功能变化；
图16为小鼠脾脏中IFN-γ表达量比较；
图17为小鼠脾脏中TNF-α表达量比较；
图18为重组菌传代10代后PCR鉴定；
图19为重组菌传代20代后PCR鉴定。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1、实验材料
1.1实验动物
60只6-8周龄BALA/c小鼠购自哈尔滨医科大学实验动物学部。小鼠饲喂鼠粮、饮水、饲养环境均相同。
1.2实验仪器
实验仪器：酶标仪(美国Bio-Tek公司)，低温离心机(德国Sigma公司)，PCR仪(美国Bio-Rad公司)，荧光定量PCR仪(瑞士Roche有限公司)，RNA浓度微量测定仪(赛默飞科技有限公司)，电泳转印仪(上海天能科技有限公司)， Tanon 5200曝光机(上海天能科技有限公司)，生化培养箱LRH-100(常州诺基仪器有限公司仪器有限公司)，电热恒温培养箱(上海森信实验仪器有限公司)， HZQ-C恒温摇床(金坛市开发区吉特实验仪器厂)，立式压力蒸汽灭菌器(江阴滨江医疗设备有限公司)。
1.3菌株与质粒
大肠杆菌MC1061F-感受态购买自上海唯地生物技术有限公司；乳酸菌 NZ9000由东北农业大学乳品科学教育部重点实验室赠送；载体pNZ8148购买自优宝生物公司；大肠杆菌EHEC O157:H7由东北农业大学动物医学院外科实验室刘云教授赠送。
1.4主要试剂
实验所用试剂：限制性内切酶HindIII、限制性内切酶EcoRI、限制性内切酶KpnI、Ex Taq DNA聚合酶、T4DNA连接酶，以上试剂生产商均为宝生物工程有限公司；质粒小提取试剂盒、DNA片段胶回收试剂盒，以上试剂生产商为北京天根公司；氯霉素广谱抗菌素和卡那霉素的生产商为索莱宝公司；乳酸链球菌素 (Nisin)和刀豆素(ConA)的生产商为美国Sigma公司；小鼠免疫球蛋白G(IgG) 酶连免疫分析和小鼠卵清蛋白特异性抗体IgA(sIgA)酶连免疫分析的生产商为江苏晶美科技生物有限公司；抗体CD4+、抗体CD8+和抗体CD25+的生产商为美国 Biolegend公司；牛IL-2抗体的生产商为美国Novus Biologicals公司。
1.5主要溶液配方
1.5.1培养基的配置
(1)LB液体培养基：酵母粉(YEAST EXTRACT)5g/L，胰蛋白胨(TRYPONE) 10g/L，NaCl 10g/L，调节pH为弱碱性，去离子水定容至1L，120℃高压灭菌30min，降至常温，加入100μL卡那霉素，4℃保存以备用。
(2)LB固体培养基：LB液体培养基中添加15g/L琼脂粉，调节pH为弱碱性，120℃高压灭菌30min，待温度降低至不烫手，加入100μL卡那霉素，在无菌操作台中倒入一次性平板中，完全凝固后取出，密封条密封，4℃保存备用。
(3)GM17液体培养基：M1742.25g/L，葡萄糖5g/L，调节pH为弱碱性，去离子水定容至1L，120℃高压灭菌30min，降至常温，加入100μL氯霉素， 4℃保存以备用。
(4)GM17固体培养基：GM17液体培养基中添加15g/L琼脂粉，调节pH 为弱碱性，120℃高压灭菌30min，待温度降低至不烫手加入100μL氯霉素，在无菌操作台中倒入一次性平板中，完全凝固后取出，封口膜密封，4℃保存备用。
1.5.2其他溶剂配制
(1)溶菌酶(5mg/mL)：溶菌酶粉末0.05g，添加去离子水溶解后定容至 10mL，-20℃冰箱保存以备用。
(2)卡那霉素储存液(50mg/mL)：卡那霉素0.5g，添加去离子水溶解后定容至10mL，采用0.22μm滤菌器过滤除菌，操作台内分装后于-20℃冰箱保存。
(3)氯霉素贮存液(20mg/mL)：氯霉素0.2g，添加少量无水乙醇中充分溶解后并用无水乙醇定容至10mL，采用0.22μm滤菌器过滤除菌，操作台内分装后于-20℃冰箱保存。
2、实验步骤
2.1目的基因的合成与鉴定
2.1.1目的基因的合成
BoIL-2基因全长共468bp，有由上海生工公司利用HindⅢ和EcoRⅠ合成 480bpBoIL-2基因，克隆载体为pUC57，交付样品为大肠杆菌Top10甘油菌(含 pUC57-IL-2质粒)及质粒pUC57-IL-2。
BoIL-2基因序列为：
ATGTACAAGATACAACTCTTGTCTTGCATTGCACTAACTCTTGCACTCGTTGCAAACGGTGCACC TACTTCAAGCTCTACGGGGAACACAATGAAAGAAGTGAAGTCATTGCTGCTGGATTTACAGTTGCTTTT GGAGAAAGTTAAAAATCCTGAGAACCTCAAGCTCTCCAGGATGCATACATTTGACTTTTACGGGCCCAA GGTTAACGCTACAGAATTGAAACATCTTAAGTGTTTACTAGAAGAACTCAAACTTCTAGAGGAAGTGCT AAATTTAGCTCCAAGCAAAAACCTGAACCCCAGAGAGATCAAGGATTCAATGGACAATATCAAGAGAAT CGTTTTGGAACTACAGGGATCTGAAACAAGATTCACATGTGAATATGATGATGCAACAGTAAACGCTGT AGAATTTCTGAACAAATGGATTACCTTTTGTCAAAGCATCTACTCAACAATGACTTGA
密码子优化后BoIL-2基因序列为：
GGTACCATGTACAAGATCCAGCTGCTGAGCTGCATCGCCCTGACCCTGGCCCTGGTGGCCAACGG CGCCCCTACCAGCAGCAGCACCGGCAACACCATGAAGGAGGTGAAGAGCCTGCTGCTGGACCTGCAGCT GCTGCTGGAGAAGGTGAAGAACCCCGAGAACCTGAAGCTGAGCAGGATGCACACCTTCGACTTCTACGG ACCCAAGGTGAACGCCACCGAGCTGAAGCACCTGAAGTGCCTGCTGGAGGAGCTGAAGCTGCTGGAGGA GGTGCTGAACCTGGCCCCCAGCAAGAACCTGAACCCCAGGGAGATTAAGGACAGCATGGACAACATCAA GCGGATCGTGCTGGAGCTGCAAGGCAGCGAGACCCGGTTCACCTGCGAGTATGACGACGCCACCGTGAA CGCCGTGGAGTTCCTGAACAAGTGGATCACCTTCTGCCAGAGCATCTACAGCACCATGACCTGAAAGCT T。
2.1.2 pUC57-IL-2质粒提取
天根质粒提取试剂盒提取质粒pUC57-IL-2，具体步骤见说明书。
2.1.3质粒pUC57-IL-2的验证
将pUC57-IL-2质粒进行双酶切和PCR验证，引物由金维智公司合成。
上游引物P上：CGGAATTCATGTACAAGATACAACTCTTGTCTTGCATTG
下游引物P下：CCCAAGCTTCAAGTCATTGTTGAGTAGATGCTTTGAC
质粒pUC57-IL-2酶切体系如下：试剂pUC57-IL-2为4μL；HindⅢ为1μL； EcoRⅠ为1μL；10×M缓冲液为1μL；ddH2O为3μL；体系为10μL。
酶切时间为3h，完成后取3μL与少量l0×Loading Buffer混匀。跑1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
PCR反应体系如下：
试剂：Premix Taq DNA聚合酶为25μL；引物P上为1μL；引物P下为1μL；质粒pUC57-IL-2为1μL；ddH2O为22μL；体系为50μL。
反应条件为：94℃30sec；60℃30sec，循环30次，72℃延展1min，反应完成后取3μL产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，观察结果。
2.2表达质粒pNZ8148-BoIL-2的构建
2.2.1目的基因BoIL-2与表达载体pNZ8148的酶切与纯化回收
分别将质粒pUC57-IL-2与载体pNZ8148分别用HindIII与KpnI进行双酶切，
质粒pUC57-IL-2酶切体系如下：试剂pUC57-IL-2为16μL；HindⅢ为4μL；KpnI为4μL；10×M缓冲液为4μL；ddH2O为12μL；体系为40μL。
载体pNZ8148酶切体系如下：
试剂：pNZ8148为16μL；HindⅢ为4μL；KpnI为4μL；10×M缓冲液为 4μL；ddH2O为12μL；体系为40μL。
酶切时间为6h，完成后取3μL与少量l0×Loading Buffer混匀，跑0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定。将鉴定正确的酶切产物纯化回收。
根据天根公司的DNA片段胶回收试剂盒进行纯化回收，其具体方法见说明书。
2.2.2目的基因与表达载体的连接
将2.2.1得到的载体pNZ8148使用T4DNA ligase 16℃与目的基因BoIL-2 连接过夜。连接体系如下：
试剂：载体pNZ8148为4.5μL；BoIL-2基因为15μL；T4DNA ligase 为1μL；T4DNAligase Buffer为2.5μL；ddH2O为2μL；体系为25μL。
2.2.3连接产物转化到大肠杆菌MC1061F-感受态细胞中，具体操作见说明书。
2.2.4大肠杆菌MC1061中重组质粒鉴定
在平板中挑取单个菌落，37℃摇床过夜活化后提取质粒，进行PCR鉴定和双酶切鉴定。
PCR反应体系如下：
试剂：Premix Taq DNA聚合酶为50μL；引物P上为2μL；引物P下为2μL；模板为2μL；ddH2O为44μL；体系为100μL。
反应条件为：94℃30sec；60℃30sec；循环30次，72℃延展1min，反应完成后取3μL产物进行1％凝胶电泳鉴定，观察结果。
使用内切酶KpnI和HindIII对疑为阳性的重组质粒进行双酶切鉴定。于 37℃恒温水浴锅中酶切3h，取3μL进行1％凝胶电泳并观察结果。
双酶切反应体系如下：
试剂：重组质粒为8μL；HindIII为2μL；KpnI为2μL；10×M缓冲液为2μL；ddH2O为6μL；体系为20μL。
2.2.5重组表达质粒的的序列测定
鉴定正确的质粒交给北京擎科生物科技有限公司测序，对于测序比对结果正确的阳性质粒命名成pNZ8148-BoIL-2。
2.3重组乳酸菌L.lactis NZ9000/pNZ8148-BoIL-2的构建
2.3.1重组质粒pNZ8148-BoIL-2的提取
使用天根质粒提取试剂盒进行提取，步骤见说明书。
2.3.2质粒pNZ8148-BoIL-2电转化至L.lactis NZ9000
(1)将用75％乙醇粗粒过的电转杯放入到无菌操作台中，紫外照射30min 消毒，冰水混合物中冷却20min；
(2)将100μL L.lactis NZ9000感受态和5μL的pNZ8148-BoIL-2质粒放在冰水混合物中，缓慢融化，至不再有冰块，将L.lactis NZ9000感受态与 pNZ8148-BoIL-2质粒混合，不要震荡，冰水混合物中静置15min；
(3)将连接产物用移液枪移到电转杯中，设置电转仪电压为3,000V，将电转杯放在电转仪中进行电转；
(4)结束后，在电转杯底部加入895μL的电转缓冲液；
(5)将转化后的培养液移至1.5mL离心管中，30℃恒温培养箱中静置培养 6h，离心后留200μL涂布到有氯霉素抗性的GM17培养板上，继续培养3天，观察结果。
2.3.3阳性乳酸菌表达质粒的鉴定
操作台中挑取疑似阳性的单个菌落，过夜培养活化后提取质粒。分别进行 PCR和双酶切鉴定，
2.3.4重组表达质粒的的序列测定
对PCR和酶切鉴定正确的质粒交给北京擎科生物科技有限公司进行测序。
2.4目的基因的诱导表达
2.4.1重组乳酸菌的诱导表达
在之前电转之后的平板上挑取单个阳性菌落，在GM17培养液(氯霉素25 μg/mL)中培养，30℃恒温培养箱过夜培养；再接种到新的培养液中培养至OD600nm为0.5～0.6，用Nisin诱导剂诱导，设置浓度梯度0.5mg/mL、1mg/mL、 2.5mg/mL、5mg/mL、7.5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL，于6h、8 h、12h、24h取菌液，低温12,000rpm离心10min，弃掉上清，用PBS悬起沉淀的菌体，12,000rpm低温离心清洗菌体3～5次，添加300μL溶菌酶37℃摇床处理1h，12,000rpm离心7min弃上清，加入适量PBS和5×SDS上样缓冲样，沸水煮10min，12000rpm离心5min取上清。吸取7μL做SDS-PAGE 电泳观察。
2.4.2Western blot方法检测目的蛋白
(1)根据凝胶快速配制试剂盒说明书配制15％的分离胶和6％的浓缩胶。
(2)在加样孔内依次加入6μL蛋白Marker和14μL菌体蛋白。
(3)放入电泳槽内，先以80V电泳溴酚蓝跑到上层胶和下层胶的分界线，再以120V电泳将溴酚蓝跑到底部。
(4)按照三明治法将膜放在厚滤纸和NC膜中间，组装后放入转膜仪中，300 mA跑大概30min。
(5)将转膜后的NC膜放于封闭液中，室温摇床封闭2h。
(6)以0.5μg/mL的浓度稀释一抗，4℃孵育过夜。。
(7)摇床上使用TBST洗膜，15min/次，3次。
(8)摇床室温孵育二抗(1μg/mL)2h。
(9)重复步骤(7)
(10)将ECL化学发光试剂盒中的A、B液等比例混合配制成发光液。
(11)将膜取出，放在Tanon 5200曝光机中，滴加1mL(A液B液等体积混合，现用现配)发光液进行曝光成像。
结果：用DNAstar软件预测目的蛋白大小约为17.5kDa。将诱导后的重组菌L.lactis NZ9000/pNZ8148-BoIL-2用Western blot方法进行鉴定，在17.5 kDa处出现特异性条带，与预期目的蛋白大小相符。说明重组菌L.lactis NZ9000/pNZ8148-BoIL-2表达了有生物活性的IL-2基因。见图7，图中M为预染蛋白分子质量标准；1为nisin诱导L.lactisNZ9000/pNZ8148-BoIL-2表达结果；2为nisin诱导L.lactis NZ9000/pNZ8148表达结果。
2.5重组乳酸菌效果观察
实验所需60只6-8周龄的雌性BALA/c小鼠，分成四组，每组15只小鼠， A组灌服200μL 4×108CFU诱导后的重组菌L.lactis NZ9000/pNZ8148-BoIL-2； B组灌服200μL 4×108CFU L.lactis NZ9000/pNZ8148；C组灌服200μL 4 ×108CFU L.lactis NZ9000；D组为对照组PBS组，连续21天灌服。在第15、 16、17天灌服大肠杆菌EHEC O157:H7(2×105cfu/mL),每天记录小鼠体重，无菌取肠道组织进行HE染色制成切片，采取小鼠外周血，一部分分离血清检测IgG、 sIgA，另一部分提取淋巴细胞进行T淋巴细胞增殖实验；无菌采集小鼠脾脏和淋巴结，提取淋巴细胞进行流式细胞检测。
2.5.1小鼠增重效果检测
每天记录小鼠体重，并计算每组平均增重量、相对增重率。其计算公式如下：
平均增长量(g)＝处死前体重－灌服前体重
相对增重率(％)＝(处死前体重－灌服前体重)/PBS组增加量。
2.5.2肠道病理组织学观察
(1)样本的采集：无菌打开小鼠腹腔，取适当1-2cm长度的十二指肠放在 4％多聚甲醛溶液中进行固定，送至医科大学制作成病理切片。
(2)当切片制作完成之后在光学显微镜下观察，观察十二指肠黏膜层、上皮结构是否完整、是否水肿、炎性组织等变化
2.5.3外周血中特异性抗体sIgA、IgG含量检测
(1)血清的采集：A、B、C、D四组小鼠眼球采血。小鼠倒置5s后，保定，用镊子摘取眼球，血液从眼眶中流入1.5mL EP管，避免剧烈摇晃，将取好的血液37℃水浴1h，4℃静置过夜，小心吸取上清，3,500rpm离心5min，分离出淡黄色血清，-20℃分装存放备用。
(2)将血清进行ELASA试剂盒检验，具体方法见说明书。
2.5.4淋巴结与脾脏中CD4+、CD8+、CD25+含量检测
(1)脾脏中淋巴细胞的采集：无菌打开小鼠腹腔，小心剥离脾脏周围的血管和结缔组织，避免划破血管，完整取出脾脏。将取出的脾脏放入盛有PBS的平皿中清洗。在一个培养皿中加入适量的PBS溶液，放一个细胞筛，将脾脏取出放于细胞筛中。取干净的注射器，用其按压处的末端对组织进行碾压。膜内细胞会慢慢游离出来，经过细胞筛之后，悬浮在培养皿溶液中；洗一洗细胞筛，收集细胞筛外PBS，400g，50mL离心管离心，15min；重复三次，去上清，加红细胞裂解液2mL，重悬。37℃2min；离心400g，15min，PBS 5mL洗一遍，离心400g，除去上清；一部分100μL PBS重悬，细胞计数并调整细胞浓度为1×107个/mL；
(2)淋巴结中淋巴细胞的采集：每只小鼠在皮下、腹股沟、肠系膜三处找到8～9个淋巴结，在一个培养皿中加入适量的PBS溶液，放一个细胞筛，将淋巴结取出放于细胞筛中。取干净的注射器，将淋巴结碾碎，淋巴细胞会游离在PBS 中，淋巴细胞提取方法同上；
(3)取制备的脾脏淋巴细胞和淋巴结淋巴细胞悬液(1×107/mL)100μL, 即最终细胞数为1×106；
(4)将细胞加入到400μL PBS中，分别加入0.5μL APC抗体(CD4+)、 0.5μL FITC抗体(CD8+)、1μL PE抗体(CD25+)，4℃避光孵育30min；
(5)4℃1200rpm离心15min，弃上清；
(5)用提前预冷的PBS清洗三次，加入500μL PBS重悬；
(6)细胞筛过滤，加入500μL PBS重悬，用流式细胞仪检测。
2.5.5外周血T淋巴细胞增殖实验
(1)外周血T淋巴细胞的分离
采用小鼠外周血淋巴细胞分离液试剂盒进行实验，步骤参见说明书；
(2)CCK8试剂盒检测外周血T淋巴细胞增殖
试剂盒为MCE公司的CCK8试剂盒，操作步骤见说明书：
2.5.6脾脏中TNF-αmRNA表达水平检测
(1)样本的采集
无菌剖开小鼠腹腔，小心剥离脾脏周围组织与血管，取出脾脏放入冻存管中， -80℃冰箱保存。
(2)脾脏RNA的提取
根据Trizol使用说明，取45-100mg冻存的组织放入经天净沙过夜浸泡处理的研钵中，加入少量液氮(使组织保持在凝固僵硬的状态)和1mL的Trizol 试剂充分研磨，研磨充分之后转移到Axygen离心管中，室温静置10min，加入 100-200μL氯仿震荡混匀，室温静置2-3min，使用低温离心机在4℃下于12,000 rcf离心15min，取上清加入400-500μL的异丙醇，混匀后静置10min，12,000 rcf离心10min，弃掉上清后加入1mL的75％酒精，7,500rcf离心5min，弃上清，室温晾7min左右，然后加入60μL的DEPC处理水，60℃干燥箱放置 8min后迅速放入冰盒内冷却。使用RNA浓度微量测定仪测定RNA浓度并调整RNA 浓度至1。
(3)荧光定量PCR反应
根据宝世德公司反转录说明书将总RNA反转录为cDNA，根据宝世德公司荧光定量PCR说明书进行实时荧光定量PCR反应，反应程序为：预变性95℃30s；扩增：95℃5s，55℃20s，75℃20s，共45个循环。
反转录反应如下：
反转录反应第一步的试剂及用量：
5×gDNA Eraser Buffer为2μL；gDNA Eraser为1μL；Total RNA为1/ 浓度；RNaseFree dH2O为补充到10μL；5×gDNA Eraser Buffer为2μL； gDNA Eraser为1μL。
42℃2min，进行下一步。
反转录反应第二步的试剂和用量：
上一步的产物为10μL；PrimeScript RT Enzyme Mix I为1μL；RT Primer Mix为4μL；5×PrimeScript Buffer 2(for Real Time)为4μL；RNase Free dH2O r为1μL；体系为20μL。
37℃15min；85℃5s。
实时荧光定量PCR反应体系的试剂和用量：
TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)为10μL；PCR Forward Primer(10μM)为0.8μL；PCR Reverse Primer(10μM)为0.8μL；DNA 模板为2μL；灭菌水为6.4μL；Total为20μL。
2.6重组乳酸菌的传代培养与鉴定
将已经验证测序成功的重组菌L.lactis NZ9000/pNZ8148-BoIL-2进行传代，传代培养10、20代后，进行PCR检测，测序鉴定。
挑取阳性质粒进行培养，得到的乳酸菌在冷冻干燥在低温做成干粉，-80℃冰箱冻存。
3、数据分析
使用GraphPad Prism5.0软件进行单因素方差分析，计算各组数值之间的差异性。P＜0.05表示两组之间差异显著，用“*”表示，P＜0.01则表示两组之间差异极显著用“**”。
4、结果
4.1E.coil MC1061中重组质粒的鉴定
对质粒pNZ8148-BoIL-2分别进行PCR及酶切鉴定，在480bp处发现目的蛋白，与预期结果相符。对鉴定正确的质粒送北京擎科生物科技有限公司测序，与 BoIL-2基因进行序列比对结果正确，如图1和2，其中图1中的M为DNA分子质量标准；1、2为质粒pNZ8148-BoIL-2PCR鉴定结果；图2中的M为DNA分子质量标准；1、2为质粒pNZ8148-BoIL-2双酶切鉴定结果。
4.3L.lactis NZ9000中重组表达质粒的鉴定
对质粒pNZ8148-BoIL-2分别进行PCR及双酶切鉴定，可见目的片段大小为 480bp左右，如图3和4，与预期结果相符。对鉴定正确的质粒送北京擎科生物科技有限公司测序，与BoIL-2基因进行序列比对结果正确。图3中的M为DNA 分子质量标准；1、2为质粒pNZ8148-BoIL-2PCR鉴定结果；图4中的M为DNA 分子质量标准；1、2为质粒pNZ8148-BoIL-2双酶切鉴定结果。
4.4目的蛋白的鉴定
用DNAstar软件预测目的蛋白大小约为17.5kDa。将诱导后的重组菌L. lactisNZ9000/pNZ8148-BoIL-2用Western blot方法进行鉴定，在17.5kDa 处出现特异性条带，与预期目的蛋白大小相符。说明重组菌L.lactis NZ9000/pNZ8148-BoIL-2表达了有生物活性的IL-2基因。见图5，图中M为预染蛋白分子质量标准；1为nisin诱导L.lactis NZ9000/pNZ8148-BoIL-2表达结果；2为nisin诱导L.lactis NZ9000/pNZ8148表达结果。
4.5重组乳酸菌初步效果评估
4.5.1连续21天记录了小鼠的体重，发现重组菌L.lactis NZ9000/pNZ8148-BoIL-2组、L.lactisNZ9000/pNZ8148组、L.lactisNZ9000、 PBS组平均增重分别为6.88g、4.25g、4.57g、3.24g。重组菌L.lactis NZ9000/pNZ8148-BoIL-2显著高于L.lactis NZ9000/pNZ8148组、L.lactis NZ9000、PBS组(p＜0.01)。证明重组菌可以促进小鼠的体重增长，增强小鼠免疫力。不同的大写字母上角标均表示差异极显著。见表1。
表1三组小鼠21天体重变化比较
4.5.2肠道病理组织学观察结果
在饲喂小鼠的第15、16、17天灌服大肠杆菌EHEC O157:H7(2×109CFU/mL)，在第21天剖杀小鼠，取小鼠十二指肠做HE染色切片。结果显示：A组L.lactis NZ9000/pNZ8148-BoIL-2绒毛完整，仅可见上皮小灶坏死及绒毛水肿；B组重组菌L.lactis NZ9000/pNZ8148组上皮相对完整可见，黏膜层高度水肿，偶见局部上皮坏死；C组L.lactis NZ9000组局部有一溃疡，固有层腺体消失，有炎性组织取代其余上皮可见坏死；D组PBS组可见一大面积溃疡，累及黏膜下层，腺体消失。三组对比结果可见A组病变最轻，D组病变最严重。见图6。图中A 组为L.lactis NZ9000/pNZ8148-BoIL-2组、B组为L.lactis NZ9000/pNZ8148 组、C组L.lactis NZ9000、D组为PBS组。
4.5.3外周血血清中特异性抗体IgG和sIgA的检测结果
ELISA试剂盒检测小鼠血清中的特异性抗体IgG和sIgA含量，结果显示重组菌L.lactisNZ9000/pNZ8148-BoIL-2组的特异性抗体IgG、sIgA含量极显著的高于PBS组(P<0.01)，显著高于L.lactis NZ9000/pNZ8148组与L.lactis NZ9000组(P<0.05)。见图7、8。其中P<0.01以**表示，P<0.05以*表示。
4.5.4淋巴细胞中CD4+、CD8+、CD25+相对百分比
分别检测四组小鼠免疫21天后脾脏和淋巴结淋巴细胞的CD4+、CD8+、CD25+相对百分比。结果显示：淋巴结的CD25+含量重组菌L.lactis NZ9000/pNZ8148-BoIL-2组极显著高于L.lactisNZ9000/pNZ8148组、L.lactis NZ9000组和PBS组(P<0.01)；淋巴结的CD4+含量重组菌L.lactis NZ9000/pNZ8148-BoIL-2组极显著高于PBS组(P<0.01)，显著高于L.lactis NZ9000/pNZ8148组和L.lactis NZ9000组(P<0.05)；淋巴结的CD8+含量重组菌L.lactis NZ9000/pNZ8148-BoIL-2组极显著高于PBS组(P<0.01)，显著高于L.lactisNZ9000/pNZ8148组和L.lactisNZ9000组(P<0.05)。脾脏中CD25+含量重组菌L.lactis NZ9000/pNZ8148-BoIL-2组极显著高于L.lactis NZ9000/pNZ8148组、L.lactisNZ9000组和PBS组(P<0.01)；CD4+含量极显著高于L.lactis NZ9000/pNZ8148组、L.lactisNZ9000组和PBS组(P<0.01)； CD8+含量重组菌L.lactis NZ9000/pNZ8148-BoIL-2组极显著高于PBS组 (P<0.01)，显著高于L.lactis NZ9000/pNZ8148组和L.lactis NZ9000组 (P<0.05)。说明重组菌L.lactis NZ9000/pNZ8148-BoIL-2可以促进T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+的表达量，促进CD25+的表达见图9、10、11、12、13、14。其中P<0.01以**表示，P<0.05以*表示。图9中A组为L.lactis NZ9000/pNZ8148-BoIL-2组、B组为L.lactisNZ9000/pNZ8148组、C组L.lactis NZ9000、D组为PBS组；图10中A组为L.lactis NZ9000/pNZ8148-BoIL-2组、 B组为L.lactis NZ9000/pNZ8148组、C组L.lactis NZ9000、D组为PBS组；图11中A组为L.lactisNZ9000/pNZ8148-BoIL-2组、B组为L.lactis NZ9000/pNZ8148组、C组L.lactis NZ9000、D组为PBS组；图12中A组为L. lactis NZ9000/pNZ8148-BoIL-2组、B组为L.lactis NZ9000/pNZ8148组、C 组L.lactis NZ9000、D组为PBS组。
4.5.5外周血T淋巴细胞增殖活性
分别三组小鼠的外周血提取淋巴细胞进行CCK8试剂盒检测三组小鼠T淋巴细胞增殖活性情况，目重组菌L.lactisNZ9000/pNZ8148-BoIL-2诱导组极显著高于L.lactisNZ9000/pNZ8148组、L.lactis NZ9000组和PBS组(P<0.01)，见图15。结果表明重组菌L.lactis NZ9000/pNZ8148-BoIL-2可以促进T淋巴细胞的增殖。其中P<0.01以**表示，P<0.05以*表示。
4.5.6脾脏中IFN-γ与TNF-α表达水平
取小鼠脾脏提取RNA进行实时荧光定量分析，结果显示重组菌L.lactis NZ9000/pNZ8148-BoIL-2组的TNF-α表达水平极显著高于PBS组(P<0.01)，显著高于L.lactisNZ9000/pNZ8148组和L.lactis NZ9000组(P<0.05)。重组菌L.lactis NZ9000/pNZ8148-BoIL-2组的IFN-γ表达水平极显著高于L. lactis NZ9000/pNZ8148组、L.lactis NZ9000组和PBS组(P<0.01)。结果表明重组菌L.lactis NZ9000/pNZ8148-BoIL-2可以促进IFN-γ与TNF-α的表达。见图16、17。其中P<0.01以**表示，P<0.05以*表示。
5、重组乳酸菌传代培养PCR鉴定
将重组菌连续传代在第10代、第20代进行PCR鉴定，在480bp左右出现目的条带，测序比对结果正确，证明重组菌可以稳定传代20代。见图18和19，图18中M为DNA分子质量标准；1、2为重组乳酸菌传代培养10代PCR扩增产物；图19中的M为DNA分子质量标准；1、2为重组乳酸菌传代培养20代PCR 扩增产物。
以上所述仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

Claims (9)

1.牛白细胞介素-2重组乳酸菌，其特征在于，它是转化了质粒pNZ8148-BoIL-2到乳酸乳球菌NZ9000的乳酸菌，其中BoIL-2为牛白细胞介素-2基因的简称。
2.根据权利要求1所述的牛白细胞介素-2重组乳酸菌，其特征在于，所述BoIL-2的碱基序列如序列表SEQ ID No.1所示。
3.根据权利要求2所述的牛白细胞介素-2重组乳酸菌，其特征在于，密码子优化后BoIL-2的碱基序列如序列表SEQ ID No.2所示。
4.根据权利要求1所述的牛白细胞介素-2重组乳酸菌，其特征在于，所述质粒pNZ8148-BoIL-2是载体pNZ8148中插入了如序列SEQ ID No.2所述的基因。
5.基于权利要求1-4任一所述牛白细胞介素-2重组乳酸菌的制备方法，其特征在于，它包括：
1)、目的基因的合成
BoIL-2基因全长共468bp，利用HindⅢ和EcoR Ⅰ合成480bp BoIL-2基因；
2)、表达质粒pNZ8148-BoIL-2的构建
2.1目的基因BoIL-2与表达载体的酶切与纯化回收
将质粒pUC57-BoIL-2与载体pNZ8148分别用HindIII与KpnI进行双酶切，酶切时间为6h，完成后取3μL与少量l0×Loading Buffer混匀，跑0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定，将鉴定正确的酶切产物纯化回收；
2.2目的基因与表达载体的连接
将2.1得到的载体pNZ8148使用T4 DNA ligase16℃与目的基因BoIL-2连接过夜；
2.3连接产物转化到大肠杆菌MC1061F-感受态细胞中；
2.4大肠杆菌MC1061中重组质粒鉴定：
在平板中挑取单个菌落，37℃摇床过夜活化后提取质粒，进行PCR鉴定和双酶切鉴定；
PCR反应体系如下：
试剂：Premix Taq DNA聚合酶为50μL；引物P上为2μL；引物P下为2μL；模板为2μL；ddH2O为44μL；体系为100μL；
反应条件为：94℃30sec；60℃30sec；循环30次，72℃延展1min，反应完成后取3μL产物进行1％凝胶电泳鉴定，观察结果；
使用内切酶KpnI和HindIII对疑为阳性的重组质粒进行双酶切鉴定；于37℃恒温水浴锅中酶切3h，取3μL进行1％凝胶电泳；
双酶切反应体系如下：
试剂：重组质粒为8μL；HindIII为2μL；KpnI为2μL；10×M缓冲液为2μL；ddH2O为6μL；体系为20μL；
2.5重组表达质粒的的序列测定
鉴定正确的质粒进行测序，对于测序比对结果正确的阳性质粒命名成pNZ8148-BoIL-2；
3)重组乳酸菌L.lactis NZ9000/pNZ8148-BoIL-2的构建
3.1重组质粒pNZ8148-BoIL-2的提取
3.2质粒pNZ8148-BoIL-2电转化至L.lactis NZ9000。
6.根据权利要求5所述的的牛白细胞介素-2重组乳酸菌的制备方法，其特征在于，所述2.3连接产物转化到大肠杆菌MC1061F-感受态细胞中具体为：
2.3.1将MC1061F-感受态细胞从-80℃冰箱中拿出，放入到冰水混合物中缓慢融化，待MC1061F-感受态细胞融化后将连接产物10μL加入到其中，用手轻轻拨动EP管底，待混匀后在冰水混合物中静置25min；
2.3.2将EP管迅速插入42℃水浴中，热激45秒，迅速取出放回冰水混合物中静置5min，动作尽量小心，不要晃动；
2.3.3向EP管中加入700μL无抗性无菌LB培养基，轻轻混匀，37℃，500rpm水平摇床中复苏30min；
2.3.4低温离心机中5000rpm，1min离心，收集菌体沉淀，留取100μL左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含有氯霉素的LB培养基上；
2.3.5将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。
7.根据权利要求5所述的牛白细胞介素-2重组乳酸菌的制备方法，其特征在于，所述3.1重组质粒pNZ8148-BoIL-2的提取是使用天根质粒提取试剂盒进行提取。
8.根据权利要求5所述的牛白细胞介素-2重组乳酸菌的制备方法，其特征在于，所述3.2质粒pNZ8148-BoIL-2电转化至L.lactis NZ9000具体为：
3.2.1将用75％乙醇粗粒过的电转杯放入到无菌操作台中，紫外照射30min消毒，冰水混合物中冷却20min；
3.2.2将100μL L.lactis NZ9000感受态和5μL的pNZ8148-BoIL-2质粒放在冰水混合物中，缓慢融化，至不再有冰块，将L.lactisNZ9000感受态与pNZ8148-BoIL-2质粒混合，不要震荡，冰水混合物中静置15min；
3.2.3将连接产物用移液枪移到电转杯中，设置电转仪电压为3,000V，将电转杯放在电转仪中进行电转；
3.2.4结束后，在电转杯底部加入895μL的电转缓冲液；
3.2.5将转化后的培养液移至1.5mL离心管中，30℃恒温培养箱中静置培养
6h，离心后留200μL涂布到有氯霉素抗性的GM17培养板上，继续培养3天。
9.牛白细胞介素-2重组乳酸菌在制备奶牛免疫力增强剂方面的应用。
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