CN102796755B - 一种乳酸乳球菌表达载体及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种可在乳酸乳球菌中分泌表达外源蛋白的食品级表达载体及其构建方法与应用，该载体包含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。其构建方法为：用PCR方法扩增乳酸乳球菌Usp45蛋白的信号肽基因SPusp45，将其与食品级表达载体pNZ8149连接，连接产物用于转化大肠杆菌，筛选鉴定阳性转化菌，从中提取重组质粒，得到乳酸乳球菌分泌表达载体pNZ8149-SPusp45。本发明还公开了pNZ8149-SPusp45作为外源蛋白表达载体的应用，包括以pNZ8149-SPusp45为载体构建的分泌表达幽门螺杆菌UreB蛋白的重组乳酸乳球菌及其应用。

Description

一种乳酸乳球菌表达载体及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种可在乳酸乳球菌中分泌表达外源蛋白的表达载体，同时，还涉及一种该表达载体的构建方法与应用，尤其是应用该载体构建的表达幽门螺杆菌蛋白的重组乳酸乳球菌菌株及该菌株的应用。

背景技术

目前研究表明：对于一些人体消化道病原体感染，例如幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H.pylori）感染，由于频繁采用抗菌素治疗可致使细菌耐药性增加、而且对重复感染无预防作用，故对这类疾病更有效的防治只能寄希望于疫苗的研究成功。在疫苗研究中，口服疫苗以其免疫途径安全、方便、合理等优点而受到关注[Levine MM.″IDEAL″vaccines forresource poor settings.Vaccine,2011,29 Suppl 4:D116-25.]。然而，缺乏安全有效的疫苗载体阻碍了口服疫苗研究发展[Agarwal K,Agarwal S.Helicobacter pylori vaccine:from past tofuture.Mayo Clin Proc,2008,83(2):169-175；Zhang S,Moise L,Moss SF.H.pylori vaccines:whywe still don′thave any.Hum Vaccin,2011,7(11):1153-7.]。

现有研究多采用减毒伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium)作为口服疫苗载体[Xu C,Li ZS,Du YQ,et al.Construction of recombinant attenuated Salmonella typhimurium DNAvaccine expressing H pylori ureB and IL-2.World J Gastroenterol,2007,13(6):939-944]。由于沙门氏菌属于致病菌，减毒株不仅仍具有一定的毒性，而且还存在遗传稳定性问题，应用于人体时其安全性难以保证[Lee MH,Roussel Y，Wilks M,et al.Expression of Helicobacterpylori urease subunit B gene in Lactococcus lactis MG 1363 and its use as a vaccine deliverysystem against H.pylori infection in mice.Vaccine,2001,19(28-29):3927-3935]；而且动物实验显示，以该菌为载体构建的抗幽门螺杆菌疫苗株用于免疫小鼠时常引发严重的免疫后胃炎，造成组织损伤。因此，有必要探讨更安全有效的口服疫苗载体。

乳酸乳球菌（Lactococcus lactis，L.lactis）是乳酸菌类的一个菌种，在食品加工中的应用已有悠久的历史，属于食品级的益生菌，其安全性十分可靠[Morello E,Bermúdez-Humarán LG，Llull D,et al.Lactococcus lactis,an efficient cell factory forrecombinant protein production and secretion.J Mol Microbiol Biotechnol,2008,14(1-3):48-58]；而且其生长迅速，易于培养，遗传背景和调控机制相对清楚，具有作为口服疫苗载体的很大潜力[Stentz R,Bongaerts RJ,Gunning AP,Gasson M,Shearman C.Controlled release of protein from viable Lactococcus lactis cells.Appl EnvironMicrobiol,2010,76(9):3026-3031.]。目前，NICE系统是应用最为广泛的乳酸菌表达系统[Mierau I,Kleerebezem M.10 years of the nisin-controlled gene expression system(NICE)inLactococcus lactis.Appl Microbiol Biotechnol,2005,68(6):705-17.]。NICE系统的表达载体pNZ8149属于食品级安全载体，不含任何抗生素抗性基因，在安全性方面的优势十分突出。近年，有将pNZ8149用于表达幽门螺杆菌抗原基因的报道[Chen S,Zhang R,Duan G，Shi J.Food-grade expression of Helicobacter pylori ureB subunit in Lactococcus lactis and its immuno-reactivity.Curr Microbiol.2011,62(6):1726-31.]。但作为疫苗抗原表达载体，pNZ8149存在很大缺陷：pNZ8149只能将外源蛋白表达于细胞质中，而无分泌表达外源蛋白的功能。乳酸乳球菌具有较厚的细胞壁，将疫苗抗原表达于胞质中，不利于疫苗抗原对胃肠黏膜免疫系统产生作用，因此会影响疫苗免疫效果。

应用基因工程技术，改造pNZ8149载体，构建具有在乳酸乳球菌分泌表达外源蛋白功能的新型表达载体，并用于幽门螺杆菌尿素酶(UreB)等疫苗抗原的表达，建立更为安全有效的抗幽门螺杆菌疫苗菌株，这对幽门螺杆菌感染及相关疾病的免疫防治具有重要意义，有望产生可观的社会和经济效益，但目前尚无报道。

发明内容

针对上述问题，本发明目的在于提供一种可在乳酸乳球菌中分泌表达外源蛋白的食品级表达载体pNZ8149-SPusp45(SEQ ID NO.1)。

同时，本发明的目的还在于提供一种该载体的构建方法。

再者，本发明的目的还在于提供一种该载体的应用。

为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种乳酸乳球菌表达载体，该载体包含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

其含有乳酸乳球菌Usp45蛋白的信号肽基因SPusp45，SPusp45基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示，通过在所述表达载体中插入外源基因，并将载体转入乳酸乳球菌，可使SPusp45基因与外源基因在乳酸乳球菌中融合表达，进而实现外源蛋白在乳酸乳球菌中的分泌表达。

本发明的技术方案还采用了一种乳酸乳球菌表达载体pNZ8149-SPusp45(SEQ ID NO.1)的构建方法，其包括以下步骤：

1.提取L.lactis NZ3900菌株的基因组DNA，将其作为PCR模板，用于扩增Usp45蛋白分泌信号肽基因SPusp45。

2.分别双酶切SPusp45基因和表达载体pNZ8149，回收纯化酶切片段，并用T4DNA连接酶进行定向连接，连接产物用于电穿孔法转化L.lactis NZ3900菌株感受态细胞。

3.采用Elliker选择培养基筛选阳性转化菌，培养筛选出的转化菌，从菌体中提取质粒，进行PCR、酶切、测序鉴定，鉴定结果为核苷酸序列与预期相符的质粒即为所构建的L.lactis分泌表达载体，将其命名为：pNZ8149-SPusp45。

在食品级表达载体pNZ8149-SPusp45的构建方法中，扩增SPusp45基因的引物是根据GenBank数据库中L.lactis NZ3900菌株Usp45蛋白的信号肽基因序列(GenBank:EU382094.1)，应用生物软件Primer 5.0设计的，上游引物序列为5′-CATGCCATGG TGATGAAAAA AAAGATTAT-3′(SEQ ID NO.4)；下游引物序列为：5′-CATGCATGCAGCGTAAACACCTGACAAC-3′(SEQ ID NO.5)。在上游引物5’端引入限制性酶切位点NcoI，在下游引物5’端引入SphI限制性酶切位点。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

食品级表达载体pNZ8149-SPusp45包含：源自L.lactis NZ3900Usp45蛋白的分泌信号肽基因SPusp45、乳酸乳球菌表达载体pNZ8149的启动子Pnis、复制子repC和repA、lacF基因、多克隆酶切位点等元件。将外源基因从多克隆位点插入到表达载体pNZ8149-SPusp45中，用于转化L.lactis NZ3900，阳性转化菌经Nisin诱导后，可使分泌信号肽与外源蛋白基因融合表达，分泌信号肽引导外源蛋白分泌至胞外。

本发明的技术方案还采用了一种乳酸乳球菌表达载体作为外源蛋白表达载体的应用。

所述外源蛋白的编码基因是幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)基因。

所述外源蛋白是幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亚基(UreB)。所述幽门螺杆菌尿素酶B亚基的编码基因序列为SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列存在至少95%同源性。

同时，本发明的技术方案还采用了一种乳酸乳球菌表达载体在构建能够在乳酸乳球菌中分泌表达幽门螺杆菌尿素酶B亚基(UreB)的载体中的应用，所述能够在乳酸乳球菌中分泌表达幽门螺杆菌尿素酶B亚基(UreB)的载体的核苷酸序列是SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列，被命名为pNZ8149-SPusp45-ureB。

本发明的技术方案还采用了一种重组乳酸乳球菌菌株（Lactococcus lactis）NZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB，于2012年5月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,其保藏编号为CGMCC No.6117。

更进一步地，本发明的技术方案还采用了一种重组乳酸乳球菌菌株在制备抗幽门螺杆菌疫苗以及制备幽门螺杆菌感染诊断试剂的应用。

本发明的技术方案还采用了一种重组乳酸乳球菌菌株作为发酵菌株在食品加工方面的应用。

重组表达载体pNZ8149-SPusp45-ureB与菌株L.lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB的构建方法包括以下步骤：

1）提取H.pylori MEL-HP27菌株基因组DNA，作为PCR模板，用于扩增幽门螺杆菌ureB基因；

2）分别双酶切ureB基因和表达载体pNZ8149-SPusp45，纯化回收酶切片段，并用T4DNA连接酶进行定向连接，连接产物用于电穿孔法转化L.lactisNZ3900菌株；

3）通过Elliker选择培养基筛选和PCR、酶切、测序鉴定，得到阳性转化菌；

4）培养经鉴定的阳性转化菌，提取重组质粒，该重组质粒即为构建的分泌表达幽门螺杆菌UreB蛋白的乳酸乳球菌表达载体，将其命名为：pNZ8149-SPusp45-ureB，将含有pNZ8149-SPusp45-ureB的乳酸乳球菌命名为：L.lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB。

在表达载体pNZ8149-SPusp45-ureB的构建方法中，扩增ureB基因的引物是根据GenBank数据库中幽门螺杆菌ureB基因序列(GenBank:AY295085.1)，应用生物软件Primer 5.0设计的，上游引物序列为5’-CATGCATGCATGAAAAAGATTAGCAG-3’(SEQ IDNO.6)；下游引物序列为：5’-CGCTCTAGA CTGACTAGAAAATGCTAAAGAG-3(SEQ IDNO.7)。在上游引物5’端引入SphI酶切位点，在下游引物5’端引入XbaI酶切位点。

本发明的实验依据包括，体外培养重组菌株L.lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB，用乳酸链球菌素(Nisin)诱导外源蛋白表达，并用SDS-PAGE和Western blots方法分析蛋白的表达并鉴定蛋白的免疫活性。结果：SDS-PAGE可以检测到L.lactisNZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB分泌表达幽门螺杆菌UreB蛋白。在菌体培养液经离心分离出的上清中，分泌表达的UreB蛋白约占培养液上清蛋白的70%；通过Western blots分析检测到表达的UreB蛋白能够与幽门螺杆菌菌体裂解抗原免疫小鼠血清抗体发生免疫反应。本发明通过实验表明，L.lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB菌株在幽门螺杆菌疫苗和幽门螺杆菌感染诊断试剂制备中有应用价值。

本发明具有以下有益效果：

1)本发明提供了能够在L.lactis中分泌表达外源蛋白的表达载体pNZ8149-SPusp45，它是通过将具有食品级安全性的L.lactis SPusp45基因与食品级载体pNZ8149连接而成，因而pNZ8149-SPusp45保持了食品级安全性，但克服了pNZ8149表达载体不能分泌表达外源蛋白的缺陷，这是L.lactis表达载体研究的一次技术进步。

2)本发明应用表达载体pNZ8149-SPusp45构建的表达幽门螺杆菌尿素酶B亚基(UreB)的载体pNZ8149-SPusp45-ureB，具有在L.lactis中分泌表达幽门螺杆菌UreB的功能。而幽门螺杆菌UreB是免疫效果最好的幽门螺杆菌疫苗抗原之一。其意义在于pNZ8149-SPusp45-ureB是在具有食品级安全性的载体上构建的分泌表达幽门螺杆菌疫苗抗原的载体，pNZ8149-SPusp45不含抗生素抗性基因，既在安全性方面具有突出的优势，又具有分泌表达幽门螺杆菌疫苗抗原UreB的功能，对幽门螺杆菌疫苗的制备具有非常大的应用价值。

3)重组菌株L.lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB中除幽门螺杆菌疫苗抗原基因ureB外，其余成分均具有食品级安全性。实验证实，该菌株能够分泌表达UreB蛋白，而且表达的UreB蛋白可以与动物免疫血清反应。实验结果表明该重组菌株不仅能够分泌表达具有抗原活性的疫苗抗原，而且其安全性高于现有技术中以幽门螺杆菌UreB为疫苗抗原的同类疫苗株，因而该重组菌株具有独特优势，在幽门螺杆菌疫苗制备中具有应用价值。

4)本发明提供的菌株L.lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB在诱导培养后，分泌表达的ureB蛋白约占培养液上清总蛋白的70%(图6A)，在现有乳酸乳球菌食品级分泌表达系统中，表达的外源蛋白在培养液中能达到如此高纯度的，尚未见报道。

目前，用于幽门螺杆菌感染免疫检测的幽门螺杆菌UreB蛋白抗原一般是采用亲和层析法从大肠杆菌工程菌表达蛋白中纯化制备，其制备过程不仅繁琐，而且由于UreB蛋白分子量较大，在纯化过程存在蛋白降解和变性等突出问题，纯化得到的UreB蛋白的纯度常不理想。将图6A与文献报道的采用亲和层析法制备UreB蛋白实验结果(图6B)进行对比[图6B摘自文献：陈帅印，幽门螺杆菌ureB基因在乳球菌中食品级表达及免疫反应性，郑州大学硕士研究生毕业论文，2010,见于中国学术文献网络出版总库]，不难看出，L.lactisNZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB培养液上清样品中UreB蛋白的纯度更高。

而且，Western blots分析结果显示，菌株NZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB分泌表达的UreB蛋白可与动物免疫血清发生免疫反应，表明菌株NZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB的培养液上清可以不经过进一步纯化而作为诊断抗原，用于制备幽门螺杆菌感染免疫检测试剂，例如，将此培养液上清作为抗原用于包被酶联免疫吸附试验(ELISA)反应板(见实施例8)，这样比采用亲和层析技术从菌体蛋白中纯化UreB蛋白的方法简便很多。因此，L.lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB在幽门螺杆菌感染诊断试剂(包括诊断抗原)制备中具有很大应用价值。

5)L.lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB菌株中除疫苗抗原基因ureB外，其余成分均具有食品级安全性，最大限度地提高了疫苗抗原UreB表达系统的安全性。可以合理推断，L.lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB菌株可以作为发酵菌株，用于食品加工，尤其是乳制品发酵工艺中，生产具有防治幽门螺杆菌感染及相关胃肠疾病作用的保健食品，有望产生可观的社会和经济效益。

附图说明

图1为乳酸乳球菌表达载体pNZ8149-SPusp45的构建示意图；

图2为SPusp45基因PCR扩增产物电泳图；图中1为DNAMarker(bp)；2，3，4：为以NZ3900DNA为模板PCR扩增SPusp45基因的产物；5：阴性对照；

图3为乳酸乳球菌表达载体pNZ8149-SPusp45-ureB的构建示意图；

图4为幽门螺杆菌ureB基因PCR扩增产物电泳图；图中1为DNA Marker(bp)；2,3,4为ureB基因的PCR扩增产物；

图5为从乳酸乳球菌阳性转化菌中提取的质粒的PCR和酶切鉴定电泳图；图中1为幽门螺杆菌ureB基因PCR产物，2为用Xba Ⅰ酶切的pNZ8149，3为用Xba Ⅰ酶切的pNZ8149-SPusp45-ureB，4为用Xba Ⅰ+Sph Ⅰ双酶切的pNZ8149-SPusp45-ureB，5为DNAMarker(bp)；

图6A为乳酸乳球菌经诱导后培养液上清和菌体总蛋白的SDS-PAGE电泳图；图中1为Protein marker，4为L.lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB的培养液上清，5为L.lactisNZ3900/pNZ8149的培养液上清，6为L.lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB菌体总蛋白，7为L.lactis NZ3900/pNZ8149菌体总蛋白，2和3为其它研究的样品；

图6B摘自文献[陈帅印，幽门螺杆菌ureB基因在乳球菌中食品级表达及免疫反应性，郑州大学硕士研究生毕业论文，2010，见于中国学术文献网络出版总库]，该图为采用亲和层析法从大肠杆菌工程菌表达蛋白中纯化幽门螺杆菌UreB蛋白的电泳分析图；其在原文献的图题为：图3-2工程菌诱导表达产物SDS-PAGE电泳图；图中1～8为亲和层析过程中收集UreB蛋白样品，9为未经纯化的工程菌菌体蛋白，10为Protein Marker；

图7为乳酸乳球菌经诱导后培养液上清和菌体总蛋白的Western blots分析图；图中1为Protein marker；2为L.lactis NZ3900/pNZ8149菌体总蛋白；3，4为L.lactisNZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB菌体总蛋白；5为L.lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB的培养液上清；8为L.lactis NZ3900/pNZ8149培养液上清；6、7为其它研究样品。

具体实施方式

(一)本发明实验中使用的细菌菌株和质粒

Lactococcus lactis NZ3900菌株(lacF^-,pepN::nisRnisK)购自荷兰NIZO Food Research(Kernhemseweg,Netherlands)。该菌株也可从德国Mobitec公司(Germany)购得。采用含150ml/L甘油的GM₁₇培养基于-80℃保存该菌种。。

Lactococcus lactis表达载体pNZ8149购自荷兰NIZO Food Research (Kernhemseweg，Netherlands)，也可从德国Mobitec公司(Germany)购得。pNZ8149核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示，含启动子Pnis、lacF基因、多克隆酶切位点、复制子repC和repA及终止子等元件，为食品级安全性表达载体。

本发明提供的重组乳酸乳球菌菌株(Lactococcus lactis)NZ3900/pNZ8149-SPusp45于2012年5月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为：CGMCCNO.6118。采用含150ml/L甘油的GM₁₇培养基于-80℃保存该菌种。

本发明提供的重组乳酸乳球菌菌株Lactococcus lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB保藏号为：CGMCC NO.6117。采用含150ml/L甘油的GM₁₇培养基于-80℃保存该菌种。

幽门螺杆菌菌株Helicobacter pylori MEL-HP27于2005年3月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO.1338。采用100g/L的蔗糖溶液与等体积胎牛血清的混合液为菌株保存液，将菌株保存于-80℃冰箱。

(二)本发明涉及实验中培养基的配制

⑴LB培养基

LB液体培养基：称取1.0g胰蛋白胨，0.5g酵母浸粉，1.0g氯化钠,溶于100ml蒸馏水中，用10mol/L NaOH调pH值至7.2，121℃高压灭菌20min，置4℃保存备用。

LB固体培养基：称取1.0g胰蛋白胨，0.5g酵母浸粉，1.0g氯化钠,1.5g琼脂粉，溶于100ml蒸馏水中，用10mol/L NaOH调pH值至7.2，121℃高压灭菌20min，冷却至约50℃时倾注平板备用。

⑵乳酸菌培养基

GM₁₇培养基：称取4.25g M₁₇培养基，溶于80ml蒸馏水中，用10mol/L NaOH调pH值至7.2，定容至100ml，121℃高压灭菌20min，冷却后加入葡萄糖至终浓度为5.0g/L。

GM₁₇培养基平板：称取4.25g GM₁₇培养基，1.5g琼脂粉，溶于80ml蒸馏水中，用10mol/L NaOH调pH值至7.2，定容至100ml，121℃高压灭菌20min，冷却至约60℃时加入葡萄糖至终浓度为5.0g/L，混匀后将培养基倒入培养皿中，制成培养基平板。

GSGM₁₇培养基：称取85.50g蔗糖，12.50g甘氨酸，18.63g M₁₇培养基，溶于400ml蒸馏水中，用10mol/L NaOH调pH值至7.2，定容至500ml，高压灭菌。冷却后加入葡萄糖至终浓度为5.0g/L。

GM₁₇MC恢复培养基：称取3.73g M₁₇培养基，0.19g MgCl₂,0.02g CaCl₂，溶于80ml蒸馏水中，用10mol/L NaOH调pH至7.2，定容至100ml，高压灭菌。冷却后加入葡萄糖至终浓度为5.0g/L。

Elliker选择培养基配制方法如下：

(1)4.0g/L溴甲酚紫储藏液：称取0.4g溴甲酚紫，溶于5%的乙醇，用0.1M的NaOH调pH值至8.0，定容至100ml。用无菌0.22μm孔径过滤器过滤除菌，4℃保存备用。

(2)200g/L乳糖储藏液：称20g乳糖，用蒸馏水定容至100ml，用无菌的0.22μm孔径过滤器过滤除菌，分装，-20℃保存备用。

(3)取0.50g酵母浸粉(Yeast extract)，2.00g胰蛋白胨（Tryptone），0.15g无水醋酸钠，0.40g氯化钠(NaCl)，1.5g琼脂粉（Agar），0.05g抗坏血酸，溶于100ml蒸馏水中，高压灭菌20min。冷却至约60℃时，加入1ml 4.0g/L溴甲酚紫储藏液(终浓度为40mg/L)和2.5ml的200g/L乳糖储藏液(终浓度5.0g/L)，倾倒平板，4℃保存备用，三天内使用。

(3)幽门螺杆菌培养基

布氏血平板培养基：称取大豆蛋白胨1.00g，胰蛋白胨1.00g，酵母浸出粉0.10g，氯化钠0.50g，亚硫酸钠0.01g，琼脂粉1.50g，加入蒸馏水100ml，调pH至7.2，121℃高压灭菌20min，冷却至60℃左右时，加入羊血8ml，胎牛血清5ml，并加入下列4种抗生素：10mg/L万古霉素0.5ml，2mg/L两性霉素0.5ml，2500U/L多粘菌素0.1ml，5mg/L磺胺增效剂（TMP）0.2ml。混匀后倾倒入经高压灭菌的玻璃培养皿中。

(三)本发明涉及实验中使用的试剂

M₁₇培养基(青岛海博生物技术有限公司产品)、氯霉素(美国Amresco公司)、T₄DNA连接酶和限制性内切酶Nco I、Sph I和Xba I(美国Fermentas公司)、凝胶回收试剂盒(杭州爱思进(AxyGen)生物科技有限公司)、高纯度质粒提取试剂盒和DNA MarkerⅢ(北京康为世纪生物科技有限公司)、PCR反应试剂盒和RNA酶(RNase A)(北京天根生化科技有限公司)、其他常用试剂均为国产分析纯级试剂。

未作特别说明的实验材料和方法属于公知技术。在本发明所属技术领域，常用工具书包括《分子克隆实验指南》(J萨姆布鲁克和D.W拉塞尔著，第三版，科学出版社，2002)等。

实施例1 L.lactis表达载体pNZ8149-SPusp45的构建

L.lactis表达载体pNZ8149-SPusp45的构建参见图1。

1.用PCR方法扩增L.lactis基因SPusp45

1.1 L.lactis NZ3900基因组DNA的提取

⑴从-80℃冰箱取出L.lactis NZ3900菌种保存管，从中取100μl菌液接种至5ml GM₁₇液体培养基中，于30℃、5%CO₂静止培养12h，取1.5ml～3ml菌液，5000r/min离心5min，收集菌体。

⑵用500μl TE缓冲液(10mM Tris-Cl，1mM EDTA，pH8.0)洗涤菌体一次。

⑶用50μl TE缓冲液重悬菌体，加入溶菌酶至终浓度为10mg/ml，37℃水浴60min。

⑷加入蛋白酶K至终浓度为50μg/ml，混匀后加入100g/L的SDS至终浓度为10g/L，37℃水浴2h。

⑸补充300μl TE缓冲液，分别用等体积的酚氯仿(苯酚与氯仿等体积混合液)、氯仿异戊醇(氯仿与异戊醇体积比为24∶1)抽提蛋白，转速为10000r/min，离心15min。

⑹加入2倍体积的无水乙醇和1/10体积的3.0M乙酸钠，轻柔颠倒离心管数次至出现絮状沉淀。

⑺10000r/min离心5min收集DNA，将沉淀用70%乙醇洗涤。

⑻自然干燥后，用50μl TE缓冲液溶解DNA。

⑼加RNA酶(RNase A)至终浓度为50μg/ml，在37℃水浴30min。将基因组DNA置于-20℃贮存。

1.2 PCR引物设计与合成

根据GenBank数据库中乳酸菌SPusp45基因序列(GenBank:EU382094.1)，利用生物软件Primer 5.0设计PCR引物，上游引物序列为5’-CATGCCATGGTGATGAAAAAAAAGATTAT-3’(SEQ ID NO.4)；下游引物序列为：5’CATGCATGCAGCGTAAACACCTGACAAC-3’(SEQ ID NO.5)。在上游引物5’端引入Nco Ⅰ酶切位点，在下游引物5’端引入Sph I酶切位点。预期扩增产物长度为95bp。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.3 SPusp45基因的PCR扩增

⑴参照PCR反应试剂盒(北京天根生化科技有限公司)产品说明，配制50μl反应体系：8μmol/L的上游引物1μl，8μmol/L的下游引物1μl，2×Taq PCR Master Mix 25μl，NZ3900菌株基因组DNA模板2μl，加去离子水至50μl。

⑵PCR循环条件：预变性94℃ 5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30S，30个循环，最后72℃延伸5min。

⑶PCR产物分析：取3μl PCR反应产物，于20g/L琼脂糖凝胶中电泳，电压为5V/cm，用DNA Marker III做分子量标记，电压5V/cm，电泳20min后，用凝胶图像扫描仪进行分析。

2.SPusp45基因与表达载体pNZ8149的双酶切与回收

取PCR扩增得到SPusp45基因，用限制性内切酶Sph Ⅰ和Nco Ⅰ进行双酶切，并用SphⅠ和Nco Ⅰ双酶切质粒pNZ8149。酶切体系为：Sph Ⅰ 1.5μl、Nco Ⅰ 1.5μl、10×Buffer 5μl、质粒pNZ8149或SPusp45基因25μl、去离子水17μl。37℃酶切12h。

用凝胶回收试剂盒(杭州爱思进生物科技有限公司)对酶切片段进行纯化回收，操作步骤如下：

⑴取50μl双酶切产物在2%(W/V)的琼脂糖凝胶中电泳20min，依据DNA Marker条带的位置，在紫外灯下切下含有目的片段的琼脂糖凝胶，用滤纸将凝胶表面液体吸干，然后装入1.5ml的洁净的1.5ml EP管中，称凝胶重量，根据重量估算凝胶体积（100mg的凝胶按100μl体积估算）。

⑵加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后于75℃水浴，间断混合，直到凝胶完全溶化。

⑶加入0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀（在处理SPusp45基因双酶切产物时，需再加1个凝胶体积的异丙醇）。

⑷将步骤（3）的混合液转移至DNA制备管中，12000r/min离心1min，弃滤液。

⑸将制备管置回2ml离心管，加500μl Buffer W1,12000r/min离心30s，弃滤液。

⑹将制备管置回2ml离心管，加700μl Buffer W2,12000r/min离心30s，弃滤液。以同样的方法再用700μl Buffer W2洗涤一次，12000r/min离心1min。

⑺将制备管置回2ml离心管中，12000r/min离心1min。

⑻将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在制备膜中央加30μl去离子水，室温静置1min。12000r/min离心2min洗脱DNA，将得到的DNA置-20℃保存。

3.SPusp45基因与表达载体pNZ8149的定向连接

将回收的SPusp45基因与L.lactis表达载体pNZ8149用T₄DNA连接酶于16℃进行连接反应16h。连接反应体系：T4DNA连接酶1μl、pNZ8149 12μl、SPusp45 2μl、10×Buffer2μl、去离子水3μl。16℃连接反应16h。

4.L.lactis NZ3900菌株感受态细胞的制备

(1)从培养NZ3900的GM17培养基平板上挑取单菌落接种于5ml GSGM₁₇培养基中，放入CO₂培养箱，30℃、5%CO₂静止过夜培养(本说明书中“过夜”所指时长为12h～14h)；

(2)将过夜培养的5ml菌液加入50ml GSGM₁₇培养基中,30℃、5%CO₂静置培养12h～14h；

(3)将培养的50ml菌液加入400ml GSGM₁₇培养基中，30℃、5%CO₂静置培养至OD₆₀₀约为0.3；

(4)将菌液于4℃、4000r/min离心20min，收集菌体；

(5)用冰冷的400ml的洗液I（0.5M蔗糖，100ml/L甘油）洗涤一次，4000r/min、4℃离心20min，收集菌液；

(6)用冰冷的200ml洗液II（0.5M蔗糖，100ml/L甘油，50mM EDTA）重悬菌体，冰上静置15min；4000r/min、4℃离心20min，收集菌体；

(7)再用冰冷的洗液I（0.5M蔗糖，100ml/L甘油）100ml重悬菌体，4000r/min、4℃离心20min，收集菌体；

(8)用4ml冰冷的洗液I（0.5M蔗糖，100ml/L甘油）悬浮菌体，分装入事先冰浴的0.5ml EP管中，每管40μl，储存于-80℃。

5.L.lactis NZ3900菌株的电转化与筛选

（1）从-80℃取出保存的NZ3900菌株感受态细胞，立即放入冰上。

（2）制备好的连接产物中加入2.5倍体积的无水乙醇，1/10体积的2.5mol/L乙酸钠，混匀后于-20℃放置1h，12000r/min离心5min，弃上清；用1ml 75%乙醇沉淀一次，12000r/min离心5min，弃上清，室温干燥20min，用去离子水溶解沉淀；

（3）取纯化连接产物1μl加入感受态细菌，混匀，静止于冰上5min。

（4）将混合液加到冰冷的1mm电击转化杯中，用食指轻轻敲击电击杯保证混合液位于电击杯的底部；

（5）擦干电击杯外的水，放入电击仪；

（6）设置电击参数为25μF、200Ω、1500V，进行电击；

（7）电击完毕后，快速加入1ml冰冷的GM₁₇MC恢复培养基，混匀，将混合物转到1.5ml的EP管中冰浴5～10min；于30℃、5%CO₂培养箱静置恢复培养2h；

（8）取100μl恢复培养的菌液接种到Elliker选择培养基上，于30℃、5%CO₂培养箱静置培养12h，黄色菌落为阳性转化菌。

6.阳性转化菌的鉴定

培养筛选的阳性转化菌，采用高纯度质粒提取试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)，参照产品说明提取质粒，操作步骤如下：

⑴从上述Elliker选择培养基上挑取黄色单菌落接种于5ml液体GM₁₇培养基，放入CO₂培养箱，30℃、5%CO₂静止培养12h。

⑶取3ml过夜培养的菌液，加入离心管中，13000r/min离心1min，弃上清。

⑷向菌体沉淀中加入250μl Buffer P1和100μl浓度为100mg/ml的溶菌酶，使用涡旋振荡器悬浮细菌沉淀。

⑸向离心管中加入250μl Buffer P2，上下颠倒混匀4～6次，使菌体充分裂解，持续时间不应超过5min，以免质粒受损。

⑹向离心管中加入350μl BufferN3，上下颠倒混匀4～6次，此时出现白色絮状沉淀。

⑺13 000r/min离心10min，吸取上清，加入到已装入Collection Tube的Spin ColumnCM中。

⑻13 000r/min (r/min)离心30～60s，倒掉Collection Tube中的废液，将Spin Column CM放回Collection Tube中。

⑼向Spin Column CM加入500μl Buffer PB，13 000r/min离心30～60s，倒掉Collection Tube中的废液，将SpinColumn CM重新放回Collection Tube中。

⑽向Spin Column CM中加入700μl Buffer PW（含无水乙醇），13000r/min离心30～60s，倒掉Collection Tube中的废液，将Spin Column CM重新放回收Collection Tube中。

⑾向Spin Column CM中加入500μl Buffer PW，13 000r/min离心1min，倒掉Collection Tube中的废液，将Spin Column CM重新放回收Collection Tube中。

⑿13 000r/min离心1min，倒掉废液。将Spin Column CM置于室温数分钟，以彻底晾干吸附膜上残余的Buffer PW。

⒀将Spin Column CM置于一个新的离心管中，向吸附膜的中心位置滴加50μl BufferEB，室温放置1～2min，13 000r/min离心1min，将质粒收集到离心管中，-20℃贮存。

对质粒进行PCR和测序鉴定。PCR鉴定是采用提取的质粒为模板，PCR扩增SPusp45基因，反应体系和反应条件如前述。由北京华大基因公司对提取的质粒SPusp45基因进行测序。

结果如下：

1.分泌信号肽基因SPusp45的PCR扩增结果

PCR扩增SPusp45基因产物在20g/L琼脂糖凝胶中的电泳结果显示，PCR扩增产物的长度与预期的长度(95bp)符合，证实PCR扩增SPusp45基因成功(图2)。

2.阳性转化菌的筛选结果

用pNZ8149与SPusp45连接产物电转化NZ3900感受态细胞后，加入800μl冰预冷的GM₁₇MC恢复培养基，恢复培养3h，取100μl菌液接种于Elliker选择培养基上，培养两天后，可见Elliker培养基上有黄色的阳性转化菌落。

3.阳性转化菌的鉴定

挑取Elliker培养基上的黄色菌落接种到GM₁₇液体培养基，培养12h后，提取质粒，PCR鉴定结果为扩增产物长度与预期片段长度(95bp)相符；将质粒交由北京华大基因公司对质粒中SPusp45基因进行测序，结果得到SEQ ID NO.2所示核苷酸序列。将测序得到的基因序列与Genbank上公布的SPusp45基因序列(GenBank:EU382094.1)进行BLAST比对，结果显示二者相同。结果证明从该阳性转化菌中提取的重组质粒即为所要构建的表达载体，将该表达载体命名为pNZ8149-SPusp45，将含有该表达载体的重组L.lactis菌株命名为：Lactococcus lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45(其保藏号为：CGMCC NO.6118)。采用含150ml/L甘油的GM₁₇培养基于-80℃保存该菌株。

实施例2 L.lactis表达载体pNZ8149-SPusp45-ureB的构建

L.lactis表达载体pNZ8149-SPusp45-ureB的构建参见图3。

1.幽门螺杆菌的培养

从-80℃冰箱取出幽门螺杆菌H.pylori MEL-HP27菌种，取500μl菌液加入布氏血平板培养基上，用玻璃棒将菌液涂匀，待菌液被培养基吸收后，于37℃，微需氧条件下(5%O₂、10%CO₂、85%N₂)培养3～4天。

2.幽门螺杆菌基因组DNA的提取

（1）把培养3～4d的幽门螺杆菌菌体刮入装有500μl去离子水的1.5ml离心管中，加入100μl100g/L SDS溶液，煮沸5min。

（2）加入RNA酶至终浓度为50μg/ml，37℃1h，加蛋白酶K至终浓度为50μg/ml，42℃作用1h。

（3）分别用等体积酚、酚氯仿(苯酚与氯仿等体积混合物)、氯仿各抽提一次。

（4）加入2倍体积无水乙醇和1/10体积2.5mol/L乙酸钠后，于-80℃沉淀1h。15000r/min离心15min。

（5）用75%无水乙醇洗涤沉淀两次，加入100μl去离子水，-80℃贮存备用。

3.幽门螺杆菌ureB基因的PCR扩增。

3.1 PCR引物设计与合成：根据GenBank数据库中幽门螺杆菌ureB基因序列(GenBank:AY295085.1)，利用生物软件Primer 5.0设计PCR引物，上游引物序列为5’-CATGCATGCATGAAAAAGATTAGCAG-3’(SEQ ID NO.6)；下游引物序列为：5’-CGCTCTAGACTGACTAGAAAATGCTAAAGAG-3’(SEQ ID NO.7)。在上游引物5’端引入Sph Ⅰ酶切位点，在下游引物5’端引入Xba Ⅰ酶切位点。由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

3.2 PCR反应体系：8μmol/L的上游引物1μl，8μmol/L的下游引物1μl，2×Taq PCRMaster Mix 25μl，幽门螺杆菌基因组DNA模板2μl，加去离子水至50μl。

3.3 PCR循环条件如下：95℃预变性5min，94℃变性1min，退火55℃1min，72℃延伸3min，30个循环，最后72℃延伸10min。

3.4 PCR产物分析：直接取5ul PCR反应产物，用10g/L的琼脂糖凝胶进行电泳，电压5V/cm，20min，用凝胶图像分析仪分析凝胶图像。

3.幽门螺杆菌ureB基因和载体pNZ8149-SPusp45的酶切与回收

取PCR扩增得到的ureB基因，用限制性内切酶Sph Ⅰ和Xba Ⅰ进行双酶切，并用SphⅠ和Xba Ⅰ双酶切质粒pNZ8149。酶切体系为：Xba Ⅰ 1.5μl、SphI Ⅰ 1.5μl、10×Buffer 5μl、pNZ8149-SPusp45或ureB基因25μl、去离子水17μl。于37℃酶切反应12h。

用凝胶回收试剂盒(杭州爱思进生物科技有限公司)对酶切片段进行纯化回收，操作步骤参见实施例1。

5.幽门螺杆菌ureB基因与载体pNZ8149-SPusp45的连接

将回收的ureB基因与载体pNZ8149-SPusp45用T₄DNA连接酶于16℃连接反应16h。连接反应体系：T4DNA连接酶1μl、pNZ8149-SPusp45 12μl、ureB基因2μl、10×Buffer 2μl、去离子水3μl。于16℃连接反应16h。然后在连接反应管中加入50μl无水乙醇，2μl乙酸钠溶液(0.3mol/L,pH5.8)，混匀后于-20℃放置1h，12000r/min离心5min，弃上清；用1ml75%乙醇沉淀一次，12000r/min离心5min，弃上清，室温干燥20min，用去离子水溶解沉淀，用于转化乳酸乳球菌。

6.L.lactis NZ3900菌株的电转化与筛选

（1）从-80℃取出贮存的L.lactis NZ3900感受态细胞，放在冰上。

（2）取上述经纯化的连接产物1μl加入到40μl L.lactisNZ3900感受态细胞中，混匀，于冰上放置5min。

（3）将菌液加至用冰预冷的1mm电击转化杯中，用食指轻轻敲击电击杯保证菌液位于电击杯的底部；

（4）擦干电击杯外的水，放入电击仪；

（5）设置电击参数为25μF、200Ω、1500V，进行电击；

（6）电击完毕后，快速加入1ml冰冷的GM₁₇MC恢复培养基，混匀，将菌液转到1.5ml EP管中，冰浴5～10min；于30℃，5%CO₂培养箱中恢复培养2h；

（7）取100μl恢复培养的菌液，接种到Elliker选择培养基上，于30℃、5%CO₂培养箱中培养12～14h，黄色菌落为阳性转化菌。

7.阳性转化菌的鉴定

(1)从Elliker选择固体培养基上挑取黄色单菌落，接种于5ml GM17液体培养基中，于30℃、5%CO₂培养箱中培养12h。用质粒提取试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)提取重组质粒。

(2)阳性转化菌的PCR鉴定：PCR鉴定是以提取的质粒为模板，PCR扩增ureB基因，反应体系和反应条件参照前述。产物用10g/L琼脂糖凝胶进行电泳分析。

(3)阳性转化菌的酶切鉴定：取PCR鉴定为阳性的质粒10μl分别进行XbaI单酶切和XbaI+SphI双酶切，37℃酶切反应4h，65℃灭活10min。用10g/L琼脂糖凝胶进行电泳分析。

(4)阳性转化菌的测序鉴定：由北京华大基因公司对提取的质粒中SPusp45基因和ureB基因进行测序。

结果如下：

1.ureB的基因PCR扩增结果

用提取的幽门螺杆菌染色体DNA为模板，PCR扩增ureB基因，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析的结果显示，扩增基因片段长度与预期长度(1728bp)相符(图4)。

2.阳性转化菌的筛选

用ureB基因与pNZ8149-SPusp45连接产物转化L.lactis NZ3900感受态细胞后，在Elliker选择培养基上，于30℃、5%CO₂培养箱静置培养12～14h，可见黄色的阳性转化菌落。

3.阳性转化菌的鉴定

挑取黄色菌落接种至GM17液体培养基中，培养12h，用质粒提取试剂盒从菌液中提取质粒，以提取的质粒为模板，用前述ureB基因扩增引物进行PCR鉴定，结果显示，PCR扩增产物的长度与预期相符。将PCR鉴定为阳性的质粒分别用XbaI单酶切和XbaI+SphI双酶切，单酶切产生的片段长度为4.4kb，双酶切片段长度分别为2.7kb和1.7kb，均与预期长度一致(图5)。

4.阳性转化菌的测序鉴定

将酶切鉴定为阳性的质粒送交北京华大基因公司，对质粒中SPusp45和ureB基因进行测序，SPusp45的测序结果为SEQ ID NO.2所示核苷酸序列，ureB基因测序结果为SEQ IDNO.8所示核苷酸序列。将得到序列与Genbank上公布的SP_USP45基因序列(GenBank:EU382094.1)和幽门螺杆菌HP-MEL27ureB基因序列(GenBank:AY295085.1)进行BLAST比对，基因序列相同。结果表明，从阳性重组菌中提取的质粒即为所要构建的分泌表达幽门螺杆菌ureB基因的L.lactis表达载体，将该表达载体命名为：pNZ8149-SPusp45-ureB（SEQ ID NO.9），将含有该表达载体的重组L.lactis菌株命名为：L.lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB(其保藏号为：CGMCC NO.6117)。采用含150ml/L甘油的GM₁₇培养基于-80℃保存该菌株。

实施例3 重组菌株L.lactis NZ3900/pNZ8149的制备

重组菌株L.lactis NZ3900/pNZ8149的制备既可采用菌株L.lactis NZ3900销售商荷兰NIZO Food Research或德国Mobitec公司提供的技术方法，也可采用如下方法：

1.制备L.lactis NZ3900感受态细胞

方法同实施例1。

2.L.lactis NZ3900菌株感受态细胞的电转化

取1μl购置的表达载体pNZ8149与40μl L.lactis NZ3900感受态细胞混合，电转化L.lactis和阳性转化菌的筛选方法与实施例1相同。

3.L.lactis阳性转化菌的鉴定

3.1从筛选阳性转化菌的GM₁₇培养板上挑取黄色单菌落接种至5ml GM₁₇培养基中，放入CO₂培养箱，30℃、5%CO₂静置培养12h。取3ml菌液，参照实施例1的方法从乳酸乳球菌中提取质粒。

3.2分别用NcoI和Sph Ⅰ单酶切提取的质粒。NcoI酶切体系为：NcoI 1μl、10×Buffer2μl、质粒10μl、去离子水9μl。37℃酶切4h。Sph Ⅰ酶切体系为：SphI Ⅰ 1μl、10×Buffer 2μl、质粒10μl、去离子水9μl。37℃酶切12h。酶切产物用10g/L的琼脂糖凝胶进行电泳分析。

结果显示：从筛选的阳性转化菌中提取的质粒经酶切得到片段长度与预期片段长度2548bp符合，证明该阳性转化菌即为构建正确的重组L.lactis菌株，将其命名为：L.lactisNZ3900/pNZ8149。采用含150ml/L甘油的GM₁₇培养基，于-80℃保存该菌株。

实施例4 幽门螺杆菌菌体裂解抗原免疫小鼠血清的制备

本发明中检测乳酸乳球菌表达UreB蛋白免疫活性所采用的幽门螺杆菌菌体裂解抗原免疫小鼠血清，可参照文献方法制备[张小娟，幽门螺杆菌UreB和HspA蛋白在乳酸乳球菌中的表达及其免疫反应性研究，郑州大学博士研究生论文，2008,中国学术文献网络出版总库],也可按以下方法制备。

1.幽门螺杆菌菌体裂解抗原(lysate antigens)的制备

采用布氏血平板培养基，于37℃，微需氧条件下(5%O₂、10%CO₂、85%N₂)，培养H.pylori MEL-HP27菌株3～4d。将培养的幽门螺杆菌刮入生理盐水中，混匀后离心去上清。用6ml PBS（10mM Na₂HPO₄，2.7mM KCl，137mM NaCl，2mM KH₂PO₄，pH 7.4）重悬细菌，进行超声破碎，条件为：300w，超声10s，间歇10s，共30次。菌液于4℃，8000g离心30min，取上清测定总蛋白浓度，调整蛋白浓度为0.5μg/μl。为制备初次免疫抗原，取2ml幽门螺杆菌菌体裂解抗原与2ml弗氏完全佐剂混匀后，进行超声乳化，条件为：200w，10s，间歇1min，共4次。为制备加强免疫抗原，取2ml浓度为0.5μg/μl的幽门螺杆菌菌体裂解抗原与2ml弗氏不完全佐剂混合，进行超声乳化，条件为：200w，10s，间歇1min，共4次。

2.免疫小鼠

选择8周龄的Balb/c小鼠10只，第1周，每只小鼠股部和腹腔注射初次免疫抗原200μl（含蛋白约50μg），分别在第2周、第3周、第4周以同样的方式注射加强免疫抗原（200μl/次/只，含蛋白约50μg）各1次。

3.免疫血清采集

最后1次免疫后1周，摘眼球取血液，凝血后分离血清，-20℃保存备用。

应用常规Western blots分析，检测到制备的免疫血清与幽门螺杆菌菌体裂解抗原发生明显免疫反应，证明免疫血清制备成功。也可参照工具书《分子克隆实验指南》(J萨姆布鲁克和D.W拉塞尔著，第三版，科学出版社，2002)用ELISA方法对血清抗体滴度进行测定。

实施例5 菌株L.lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB的诱导表达

1.UreB蛋白的诱导表达

（1）在培养菌株L.lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB的GM17培养基平板上用接种环刮取单菌落接种于10ml GM17液体培养基，于30℃、5%CO₂培养箱，静置培养12h。

（2）取2ml菌液加入到50ml GM17液体培养基，于30℃、5%CO₂培养箱，静置培养至菌液OD₆₀₀为0.3～0.4时，加入诱导剂Nisin至终浓度为25ng/ml，诱导培养5h。

（3）同时用L.lactis NZ3900/pNZ8149作为诱导表达实验的阴性对照。

2.菌体总蛋白和菌液上清蛋白样品的收集

2.1菌体总蛋白样品的收集

（1）诱导5h后，取10ml菌液于4℃、8000r/min离心5min，弃上清，留取菌体沉淀；

（2）加columu buffer（200mM NaCl，20mM Tris-HCl，1mM EDTA，10mM β-巯基乙醇，pH 7.4）3ml悬浮菌体，8000r/min、4℃离心5min，弃上清；

（3）加columu buffer 200μl重悬菌体，加入22μl溶菌酶(终浓度为10mg/ml)，37℃水浴1h。

（4）8000r/min、4℃离心5min，取100μl上清，加入等体积的2×电泳上样缓冲液（100mM β-巯基乙醇、100mM pH 6.8Tris-HCl、4%SDS、20%甘油、0.2%溴酚蓝），煮沸3min，于-20℃贮存备用；另取100μl上清样品用于蛋白含量的测定。

2.2 培养液上清蛋白样品的收集

（1）取36ml过夜培养的菌液，10 000r/min，离心20min；

（2）取上清，用0.22μm的过滤膜过滤上清，过滤后加4ml分析纯三氯醋酸,混匀，放入4℃冰箱使蛋白沉淀12h；

（3）10 000r/min离心30min，弃上清，加入8ml丙酮重悬沉淀，10 000r/min离心20min，弃上清，通风橱内风干样品。

（4）用360μl PBS（10mM Na₂HPO₄，2.7mM KCl，137mM NaCl，2mM KH₂PO₄，pH 7.4）于4℃溶解沉淀3h。10 000r/min离心10min，取上清分装入离心管中，200μl加入等体积的2×上样缓冲液，煮沸3min，于-20℃贮存备用。

3.重组菌株诱导产物的SDS-PAGE分析

参照工具书[J.萨姆布鲁克和D.W拉塞尔著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002]，操作步骤如下：

采用12%的分离胶和5%的浓缩胶。每孔按20μg～50μg上样。电泳开始时电压为80V，待溴酚蓝泳至分离胶，将电压改为120V，电泳2h。电泳结束后，切除浓缩胶部分，将分离胶用考马斯亮蓝染色，室温下染色4h。染色后，先用蒸馏水将胶洗涤2次，并用脱色液脱色，待蛋白条带清晰后，用凝胶图像分析仪进行分析。

结果

SDS-PAGE电泳分析结果显示，L.lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB在诱导后，培养液上清样品中出现分子量约为61kD(千道尔顿)的蛋白条带，与ureB基因编码蛋白分子量一致，为ureB基因诱导表达产物，对照组菌株L.lactis NZ3900/pNZ8149培养液上清样品电泳图谱在61kD位置无蛋白条带(图6A)。结果表明，L.lactisNZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB菌株能有效分泌表达UreB蛋白，表达的蛋白约占培养液上清总蛋白的70%。

实施例6 L.lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB表达蛋白的免疫鉴定

参照工具书[J.萨姆布鲁克和D.W拉塞尔著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002]，操作步骤如下：

1.SDS-PAGE电泳：用实施例5所述方法制备L.lactis NZ3900/pNZ8149、L.lactisNZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB培养液上清和菌体蛋白，并进行SDS-PAGE分析。

2.转膜：SDS-PAGE电泳结束后，将凝胶切成所需大小，把硝酸纤维素膜(北京索莱宝科技有限公司)和厚滤纸剪成与凝胶相同大小，将硝酸纤维素膜在甲醇中浸润15s。在Bio-Rad电转仪中依次叠放厚滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜和厚滤纸。18V，冰浴转膜2h。

3.封闭：转膜后，用PBS（10mM Na₂HPO₄，2.7mM KCl，137mM NaCl，2mM KH₂PO₄，pH 7.4）漂洗硝酸纤维素膜一次，然后将硝酸纤维素膜置于封闭液(含20g/L脱脂奶粉的PBS)中，室温缓慢摇动封闭2h，封闭后，用PBS洗涤3次，每次漂洗10min；

4.一抗反应：免疫血清用封闭液1:100稀释，硝酸纤维素膜置于稀释后的免疫血清中，37℃孵育1h。用PBS洗3次，每次漂洗10min。再用TBS（0.15mM NaCl，0.1M Tris-HCl，pH 7.5）漂洗3次，每次持续10min；

5.二抗反应：在硝酸纤维素膜上加入用含20g/L脱脂奶粉的TBS稀释过的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，37℃1h，用TBS溶液漂洗3次，每次10min；

6.显色：将硝酸纤维素膜放入平皿中，用DBA显色试剂盒(北京康为世纪科技有限公司)进行显色，参照产品说明书，步骤为：取1ml试剂B入到1.5ml离心管中，再向离心管中加入50μl试剂A，混匀后，将混合液滴加在硝酸纤维素膜上，显色1～5min，显色后把膜放入到去离子水中浸泡，终止反应。

结果如下：

Western blots分析结果显示：在经诱导的L.lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB菌株培养液上清样品中，在预期位置出现了阳性反应带（UreB分子量为61.4KD），在L.lactisNZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB菌体蛋白样品电泳图谱的相应位置也出现了阳性反应带。对照菌株L.lactis NZ3900/pNZ8149菌体蛋白和培养液上清样品的电泳图谱中均无相应条带(图7)。结果表明，菌株L.lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB在诱导剂作用下能分泌表达幽门螺杆菌UreB蛋白，且表达的UreB蛋白具有免疫活性。

实施例7 L.lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB在制备口服疫苗中的应用

培养菌株L.lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB，用Nisin诱导疫苗抗原UreB分泌表达，将菌液或菌体培养液上清制成适合人类口服的剂型，用作口服疫苗。人类口服这种疫苗后，可产生抗幽门螺杆菌感染的免疫力和防治幽门螺杆菌相关疾病的有益效果。

实施例8 L.lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB在制备免疫诊断试剂的应用

培养菌株L.lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB；用诱导剂诱导UreB基因表达；离心分离出培养液上清，该上清含有重组表达的UreB抗原，而且该蛋白抗原约占培养液上清蛋白的70%，可直接用作幽门螺杆菌感染免疫检测的诊断抗原。其应用方法举例：用通过实施例5方法分离制备的L.lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB培养液上清包被普通96孔ELISA平板，每孔加入200μl培养液上清，室温放置2h，使培养液上清抗原包被反应孔；用PBS液洗涤反应孔3次；在ELISA反应孔中加入待检测人类血清，37℃温育2h；用PBS液洗涤反应孔3次；加入辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体，37℃温育2h；用TBS缓冲液（0.15mM NaCl，0.1M Tris-HCl，pH 7.5）洗涤反应孔3次；加辣根过氧化物酶的底物(如DAB)显色；用酶标仪测定各反应孔OD值，以菌株L.lactisNZ3900/pNZ8149-SPusp45培养液上清为对照，根据对照孔的OD值设立阳性反应判定标准，可对各实验孔免疫反应强度进行半定量或定性。应用菌株L.lactisNZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB培养液上清制备幽门螺杆菌感染诊断抗原比现有技术中通过亲和层析方法从菌体蛋白中纯化UreB抗原要简便很多，因此，该菌株在诊断抗原制备面很有应用前景。

实施例9 菌株L.lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB在食品加工中的应用

菌株L.lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB在食品(包括饮品)加工中的应用方法包括：取适量L.lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB菌株，加入到食品加工材料中，使混合物在适宜于该菌株生长的条件下，例如30℃，5%CO₂环境，发生发酵反应，并在适当时机加入Nisin，诱导菌株表达疫苗抗原UreB。制成的食品中可以含有存活的或灭活的该菌株。该菌株除表达的疫苗抗原外，其余菌体及产物成分均具有食品级安全性。

L.lactis NZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB作为发酵菌株，用于乳制品或其它食品加工工艺中，使产品含有幽门螺杆菌疫苗抗原UreB，产品被人类食用或饮用后，具有预防幽门螺杆菌感染及其相关疾病的有益作用。该重组菌在食品加工中的应用可为我国食品工业尤其是乳制品工业发展产生促进作用，有望产生巨大社会和经济效益。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110>郑州大学

<120>一种乳酸乳球菌表达载体及其制备方法与应用

<130>说明书

<160>9

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>2622

<212>DNA

<213>人工序列

<221>pNZ8149-SPusp45

<222>(1)..(2622)

<400>1

<210>2

<211>87

<212>DNA

<213>Lactococcus lactis

<220>

<221>SPusp45

<222>(1)..(87)

<400>2

atggtgatga aaaaaaagat  tatctcagct attttaatgt ctacagtgat actttctgct     60

gcagccccgt tgtcaggtgt ttacgct                                          87

<210>3

<211>2548

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

<210>4

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<221>引物

<222>(1)..(29)

<400>4

catgccatgg tgatgaaaaa aaagattat                                       29

<210>5

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<221>引物

<222>(1)..(28)

<400>5

catgcatgca gcgtaaacac ctgacaac                                        28

<210>6

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<221>引物

<222>(1)..(26)

<400>6

catgcatgca tgaaaaagat tagcag                                         26

<210>7

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<221>引物

<222>(1)..(31)

<400>7

cgctctagac tgactagaaa atgctaaaga g                                   31

<210>8

<211>1710

<212>DNA

<213>人工序列

<221>ureB

<222>(1)..(1710)

<400>8

<210>9

<211>4320

<212>DNA

<213>人工序列

<221>pNZ8149-SPusp45-ureB

<222>(1)..(4320)

<400>9

Claims (8)

1.一种乳酸乳球菌表达载体，其特征在于：包含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；其含有乳酸乳球菌Usp45蛋白的信号肽基因SPusp45，SPusp45基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示，通过在所述表达载体中插入外源基因，并将载体转入乳酸乳球菌，可使SPusp45基因与外源基因在乳酸乳球菌中融合表达，进而实现外源蛋白在乳酸乳球菌中的分泌表达；扩增SPusp45基因的上游引物序列为SEQ ID NO.4所示，下游引物序列为SEQ ID NO.5所示；扩增SPusp45基因的PCR循环条件：预变性94℃5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，最后72℃延伸5min。 

2.一种如权利要求1所述乳酸乳球菌表达载体的构建方法，其特征在于：其包括以下步骤： 

(1)以L.lactis NZ3900菌株基因组DNA为模板，PCR扩增得到SPusp45基因； 

(2)SPusp45基因与表达载体pNZ8149经双酶切和回收后，进行定向连接； 

(3)将连接产物用于电转化L.lactis NZ3900菌株感受态细胞； 

(4)采用Elliker选择培养基筛选阳性转化菌； 

(5)培养阳性转化菌，提取质粒，进行酶切和测序鉴定，得到乳酸乳球菌表达载体，并将其命名为pNZ8149-SPusp45。 

3.一种如权利要求1所述乳酸乳球菌表达载体作为外源蛋白表达载体的应用。 

4.根据权利要求3所述乳酸乳球菌表达载体作为外源蛋白表达载体的应用，其特征在于：所述外源蛋白的编码基因是幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亚基(UreB)的编码基因，基因序列为SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。 

5.一种如权利要求1所述的乳酸乳球菌表达载体在构建能够在乳酸乳球菌中分泌表达幽门螺杆菌尿素酶B亚基(UreB)的载体中的应用，所述能够在乳酸乳球菌中分泌表达幽门螺杆菌尿素酶B亚基(UreB)的载体的核苷酸序列是SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列，被命名为pNZ8149-SPusp45-ureB。 

6.一种重组乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureB，其保藏编号为CGMCC No.6117；其中，扩增SPusp45基因的上游引物序列为SEQ ID NO.4所示，下游引物序列为SEQ ID NO.5所示。 

7.一种如权利要求6所述的重组乳酸乳球菌在制备抗幽门螺杆菌疫苗以及制备幽门螺杆菌感染诊断试剂的应用。 

8.一种如权利要求6所述的重组乳酸乳球菌作为发酵菌株在食品加工方面的应用。