CN114438113A - 一种重组狂犬病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体及其构建方法和应用 - Google Patents
一种重组狂犬病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体及其构建方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种重组狂犬病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体及其构建方法和应用，为利用NICE表达系统和pgsA基因使狂犬病毒G蛋白表达在乳酸乳球菌中，本发明公开了一种重组狂犬病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体的构建方法，利用枯草芽孢杆菌pgsA锚定蛋白的特性，将枯草芽孢杆菌pgsA基因与RABV的G基因连接到pNZ8149表达载体上进行融合性表达，使RABV的G蛋白表达在乳酸乳球菌的外表面，为跨膜表达体系的建立和新型狂犬病毒口服基因工程疫苗的研制奠定基础。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种重组狂犬病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体及其构建方法和应用。
背景技术
狂犬病(rabies)是一种世界范围内流行的人兽共患传染病，而有效的动物狂犬病免疫是防止人狂犬病发生的根本。目前，用于动物狂犬病预防的疫苗多年来一直是以弱毒活疫苗为主，其次是灭活疫苗。但这两类疫苗在预防野生动物和城市流浪犬以及流浪猫狂犬病方面效果欠佳，而且在对其进行疫苗接种时，有可能会发生攻击或咬伤注射人员的恶性事件。此外，灭活疫苗的持久性较短，需每年加强免疫。因此，急需研发不依赖于注射接种，适用于大规模免疫的口服疫苗。
狂犬病毒(Rabies virus，RABV)为单链不分节段的负链RNA病毒，弹状，长180nm，直径75nm，基因组大约12kb，编码5种结构蛋白，包括核蛋白(N)、憐蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和多聚酶蛋白(L)。其中，G蛋白是一种同源三聚体跨膜糖蛋白，能在狂犬病毒外壳上形成刺突，且其含有可被宿主细胞识别的结构域，还与狂犬病毒的嗜神经性和致病性相关。
乳酸乳球菌(Lactococcus lactis，L.Lactis)为革兰氏阳性菌、无芽孢，被美国食品和药物管理局认定为安全级(generally recognized as safe，GRAS)微生物。目前，乳酸乳球菌在基因工程方面得到了广泛的应用。乳酸菌可以激活淋巴细胞、并且可刺激机体产生抗体，还能在肠道内定植，相当于天然的自动免疫。
目前，表达异源蛋白使用最多的为NICE表达系统(nisin-controlled geneexpression system，NICE)。NICE表达系统主要包括组氨酸蛋白激酶NisK、反应蛋白NisR和表达启动子PnisA，当诱导剂Nisin进入该系统时，可以激活位于膜上的NisK，NisK通过自我磷酸化激活NisR；NisR则通过激活启动子PnisA来引起其下游目的基因的表达，从而使目的基因在乳酸乳球菌中得以表达。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的染色体上有聚－γ－谷氨酸合成酶复合体A(poly-γ-glutamic acid synthetaseA,pgsA)基因，该基因由1143个核苷酸组成，编码381个氨基酸。pgsA基因能使聚－γ－谷氨酸(poly-γ-glutamicacid,γ-PGA)稳定地锚定在细胞膜上。然而，目前尚未有利用NICE表达系统和pgsA基因使狂犬病毒G蛋白表达在乳酸乳球菌中的报道。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明的首要目的是提供一种重组狂犬病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体的构建方法。
本发明的第二个目的是提供采用上述构建方法构建得到的重组狂犬病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体的应用。
本发明的上述第一个目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明提供了一种重组狂犬病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体的构建方法，该方法包括以下步骤：
S1、pgsA重组质粒的构建：以pUC19-pgsA质粒为模板，以5’端连接载体序列和酶切位点NcoI和SphI的引物扩增枯草芽孢杆菌的pgsA基因，并将其连接至NICE表达系统中，得到pgsA重组质粒；
S2、以灭火狂犬病毒的基因组为模板，以5’端连接载体序列和酶切位点KpnI和SphI的引物扩增得到G基因目的序列，并将其连接至步骤S1的pgsA重组质粒中，构建得到pgsA-G重组质粒，最后将pgsA-G重组质粒转化至乳酸乳球菌感受态细胞中，制备得到重组狂犬病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体。
优选地，所述NICE表达系统为携带Nisin多克隆位点的pNZ8149质粒。
优选地，所述乳酸乳球菌感受态细胞为乳酸乳球菌NZ3900感受态细胞。
本发明将枯草芽孢杆菌pgsA基因与RABV的G基因连接到pNZ8149表达载体上进行融合性表达，构建得到重组狂犬病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体pNZ8149-pgsA-G/NZ3900，使狂犬病毒糖蛋白表达在乳酸乳球菌的外表面，本发明构建的口服乳酸菌表面展示系统为跨膜表达体系的建立和新型口服基因工程疫苗的研制奠定了基础。
优选地，扩增枯草芽孢杆菌pgsA基因的引物序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示。
优选地，扩增G基因目的序列的引物序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。
优选地，采用同源重组的方法将pgsA基因连接至NICE表达系统中。
优选地，采用电击转化的方法将pgsA-G重组质粒转化至乳酸乳球菌感受态细胞中，电击转化所用电转仪的参数为1600V，4ms。
本发明还提供了采用所述的构建方法构建得到的重组狂犬病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体。
本发明的上述第二个目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明还提供了所述的重组狂犬病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体在制备重组狂犬病毒糖蛋白或狂犬病毒口服基因工程疫苗中的应用。
本发明还提供了一种重组狂犬病毒糖蛋白的制备方法，即将所述的重组狂犬病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体在30℃下扩大培养至OD值为0.6-0.8后，加入Nisin诱导剂继续培养一段时间，经分离后即得重组狂犬病毒糖蛋白。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
为利用NICE表达系统和pgsA基因使狂犬病毒G蛋白表达在乳酸乳球菌中，本发明公开了一种重组狂犬病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体的构建方法，利用枯草芽孢杆菌pgsA锚定蛋白的特性，将枯草芽孢杆菌pgsA基因与RABV的G基因连接到pNZ8149表达载体上进行融合性表达，使RABV的G蛋白表达在乳酸乳球菌的外表面，为跨膜表达体系的建立和新型狂犬病毒口服基因工程疫苗的研制奠定基础。
附图说明
图1为pgsA基因扩增图；
图2为pNZ8149-pgsA基因重组表达载体图谱；
图3为RABV的G蛋白基因扩增图；
图4为pNZ8149-pgsA-G基因重组表达载体图谱；
图5为质粒pNZ8149-pgsA-G表达的pgsA-G融合蛋白的WB检测结果(M为Marker，1为空白对照，2为pNZ8149-pgsA-G未诱导组，3为pNZ8149-pgsA-G融合蛋白)。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
实施例1构建pNZ8149-pgsA重组质粒
以pUC19-pgsA质粒(广州擎科生物技术有限公司)为模板，PCR扩增枯草芽孢杆菌的pgsA基因，使用
II One Step Cloning Kit同源重组试剂盒(购自诺唯赞生物，货号：C112)将pgsA基因连接到pNZ8149质粒中，得到质粒pNZ8149-pgsA。具体实施步骤如下：
(1)PCR扩增
在NCBI数据库上下载pgsA基因(GenBank：AB016245)的核苷酸序列，将核苷酸序列交由广州擎科生物技术有限公司合成pUC19-pgsA重组质粒，然后以pUC19-pgsA重组质粒为模板进行PCR扩增，分别在上下游引物的5’端连接载体序列和酶切位点NcoI和SphI(下划线部分)，得到pgsA目的序列。
pgsA扩增引物如下：
上游引物pgsA-F：5’-attataaggaggcactcaccatgaaaaaagaactgagctt-3’(SEQ IDNO.1)；
下游引物pgsA-R：5’-gaactagtggtaccgcatgctttagattttagtttgtcactatg-3’(SEQID NO.2)；
目的基因pgsA序列为：
atgaaaaaagaactgagctttcatgaaaagctgctaaagctgacaaaacagcaaaaaaagaaaaccaataagcacgtatttattgccattccgatcgtttttgtccttatgttcgctttcatgtgggcgggaaaagcggaaacgccgaaggtcaaaacgtattctgacgacgtactctcagcctcatttgtaggcgatattatgatgggacgctatgttgaaaaagtaacggagcaaaaaggggcagacagtatttttcaatatgttgaaccgatctttagagcctcggattatgtagcaggaaactttgaaaacccggtaacctatcaaaagaattataaacaagcagataaagagattcatctgcagacgaataaggaatcagtgaaagtcttgaaggatatgaatttcacggttctcaacagcgccaacaaccacgcaatggattacggcgttcagggcatgaaagatacgcttggagaatttgcgaagcaaaatcttgatatcgttggagcgggatacagcttaagtgatgcgaaaaagaaaatttcgtaccagaaagtcaacggggtaacgattgcgacgcttggctttaccgatgtgtccgggaaaggtttcgcggctaaaaagaatacgccgggcgtgctgcccgcagatcctgaaatcttcatccctatgatttcagaagcgaaaaaacatgctgacattgttgttgtgcagtcacactggggccaagagtatgacaatgatccaaacgaccgccagcgccagcttgcaagagccatgtctgatgcgggagctgacatcatcgtcggccatcatccgcacgtcttagaaccgattgaagtatataacggaaccgtcattttctacagcctcggcaactttgtctttgaccaaggctggacgagaacaagagacagtgcactggttcagtatcacctgaagaaaaatggaacaggccgctttgaagtgacaccgatcgatatccatgaagcgacacctgcacctgtgaaaaaagacagccttaaacagaaaaccattattcgcgaactgacgaaagactctaatttcgcttggaaagtagaagacggaaaactgacgtttgatattgatcatagtgacaaactaaaatctaaa(SEQ ID NO.3)。
其中，PCR扩增的反应体系为：
PCR扩增的反应程序为：
98℃预处理30s；98℃变性10s，52℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；72℃终延伸10min。
PCR产物使用1％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，确认正确后用DNA纯化试剂盒进行切胶回收目的基因，琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示。
(2)双酶切
用NcoⅠ和SphⅠ(购自北京NEB公司)酶切pNZ8149载体，酶切体系如下：
酶切体系置于37℃下酶切2h，酶切结束后使用琼脂糖凝胶电泳进行验证，并使用DNA凝胶回收试剂盒(货号：K0692，Thermo)进行切胶回收目的基因，得到线性化pNZ8149载体。
(3)同源重组反应
将双酶切回收后的线性化pNZ8149载体和PCR产物利用
II One StepCloning Kit同源重组试剂盒根据说明书操作进行同源重组反应，具体的同源重组反应体系如下：
同源重组反应体系置于37℃下反应30min；反应后降至4℃或立即置于冰上冷却，得到同源重组连接产物。
(4)电击转化
取20μL同源重组连接产物，加入50μL乳酸乳球菌NZ3900电转感受态细胞，然后将其转入到电击杯中，使用电转仪(购自Bio Rad)，进行电击转化，电转仪参数为1600V，4ms。转化结束后转入M17恢复培养基中，在金属水浴锅中30℃培养3h，之后使用离心机5000rpm离心5min，然后将其涂布于Elliker培养基上，30℃培养24后，挑取黄色单菌落进行菌落PCR鉴定，选取阳性单克隆菌液培养后提取质粒并送到广州擎科生物测序验证，并将验证成功的质粒命名为pNZ8149-pgsA，其图谱如图2所示。
实施例2构建pNZ8149-pgsA-G重组质粒
(1)PCR扩增
以本实验室保藏的灭火狂犬病毒核酸(DNA/cDNA)为模板进行PCR扩增，得到G基因目的序列。即分别在上下游引物的5’端连接载体序列和酶切位点KpnI和SphI(下划线部分)，得到G基因目的序列。
G基因扩增引物如下：
上游引物RABV-G-F：5’-aactaaaatctaaagcatgcatggttcctcaggttctt-3’(SEQ IDNO.4)；
下游引物RABV-G-R：5’-agaactagtggtacccagtctgatctcacctcc-3’(SEQ IDNO.5)；
G基因的序列如下：
atggttcctcaggttcttttgtttgtactccttctgggtttttcgttgtgtttcgggaagttccccatttacacgataccagacgaacttggtccctggagccctattgacatacaccatctcagctgtccaaataacctggttgtggaggatgaaggatgtaccaacctgtccgagttctcctacatggaactcaaagtgggatacatctcagccatcaaagtgaacgggttcacttgcacaggtgttgtgacagaggcagagacctacaccaactttgttggttatgtcacaaccacattcaagagaaagcatttccgccccaccccagacgcatgtagagccgcgtataactggaagatggccggtgaccccagatatgaagagtccctacacaatccataccccgactaccactggcttcgaactgtaagaaccaccaaagagtccctcattatcatatccccaagtgtgacagatttggacccatatgacaaatcccttcactcaagggtcttccctggcggaaagtgctcaggaataacggtgtcctctacctactgctcaactaaccatgattacaccatttggatgcccgagaatccgagaccaaggacaccttgtgacatttttaccaatagcagagggaagagagcatccaacgggaacaagacttgcggctttgtggatgaaagaggcctgtataagtctctaaaaggagcatgcaggctcaagttatgtggagttcttggacttagacttatggatggaacatgggtcgcgatgcaaacatcagatgagaccaaatggtgccctccagatcagttggtgaatttgcacgactttcgctcagacgagattgagcatctcgttgtggaggagttagtcaagaaaagagaggaatgtctggatgcattagagtccatcatgaccaccaagtcagtaagtttcagacgtctcagtcacctgagaaaacttgtcccagggtttggaaaagcatataccatattcaacaaaaccttgatggaggctgatgctcactacaagtcagtccggacctggaatgagatcatcccctcaaaagggtgtttgaaagttggaggaaggtgccatcctcatgtgaacggggtgtttttcaatggtataatattagggcctgacgaccatgtcctaatcccagagatgcaatcatccctcctccagcaacatatggagttgttgaaatcttcagttatccccctgatgcaccccctggcagacccttctacagttttcaaagaaggtgatgaggctgaggattttgttgaagttcacctccccgatgtgtacaaacagatctcaggggttgacctgggtctcccgaactggggaaagtatgtattgatgactgcaggggccatgattggcctggtgttgatattttccctaatgacatggtgcagaagagccaatcgaccagaatcgaaacaacgcagttttggagggacaggggggaatgtgtcagtcacttcccaaagcggaaaagtcataccttcatgggaatcatataggagtggaggtgagatcagactg(SEQ ID NO.6)。
其中，PCR扩增的反应体系为：
PCR扩增的反应程序为：
98℃预处理30s；98℃变性10s，53℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；72℃终延伸10min。
PCR产物使用1％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，确认正确后用DNA纯化试剂盒进行切胶回收目的基因，琼脂糖凝胶电泳结果如图3所示。
(2)双酶切
用KpnⅠ和SphⅠ(购自北京NEB公司)酶切pNZ8149-pgsA载体，酶切体系如下：
酶切体系置于37℃酶切2h，酶切结束后使用琼脂糖凝胶电泳进行验证，并使用DNA凝胶回收试剂盒(货号：K0692，Thermo)进行切胶回收目的基因，得到线性化pNZ8149-pgsA载体。
(3)同源重组反应
将双酶切回收后的线性化pNZ8149-pgsA载体和PCR产物利用
II OneStep Cloning Kit同源重组试剂盒按照说明书操作进行同源重组反应，具体的同源重组反应体系如下：
同源重组反应体系置于37℃反应30min；反应后降至4℃或立即置于冰上冷却，得到同源重组连接产物。
(4)电击转化
取20μL同源重组连接产物，加入50μL乳酸乳球菌NZ3900电转感受态细胞，然后将其转入到电击杯中，使用电转仪(购自Bio Rad)进行电击转化，电转仪参数为1600V，4ms。转化结束后转入恢复培养基中，在金属水浴锅中30℃培养3h，之后使用离心机5000rpm离心5min，然后将其涂布于Elliker培养基上，30℃培养24后，挑取黄色单菌落进行菌落PCR鉴定，选取阳性单克隆菌液培养后提取质粒并送到广州擎科生物测序验证，并将验证成功的质粒命名为pNZ8149-pgsA-G，其图谱如图4所示。
实施例3重组乳酸乳球菌pNZ8149-pgsA-G/NZ3900的诱导表达
(1)乳酸菌样品的处理
将阳性菌液pNZ8149-pgsA-G按1：100的比例用LM17培养基扩大培养，经过5.5小时的30℃培养后使用紫外可见光分光光度计测得其OD值处于0.6至0.8之间。将阳性菌液分为两组，体积均为60mL，1为诱导组，2为非诱导组，其中诱导组加入106ng/mLNisin诱导剂6μL，两组继续在30℃的条件下进行培养，经过3个小时的诱导后，4℃保存用作下步实验。
(2)SDS-PAGE电泳
将培养后的菌液置于离心机8000g/min离心10min，弃置上清，每组用10mL1％PBS分别进行重悬。将重悬后的样品分别转移到50mL的离心管内，置于超声波细胞粉碎机内以200W的功率各裂解20min。裂解后往每组的样品与上清液中各加入40μL的SDS LoadingBuffer进行混匀，并将两组样品煮沸10min，用于后续的加样。配制10％的SDS-PAGE分离胶，并在分离胶溶液上覆盖一层正丁醇封胶，待分离胶完全聚合后倒掉覆盖层液体，用去离子水洗涤数次以除去正丁醇，之后用滤纸将残留液体吸净。随后，灌注5％的积层胶并立即插入干净的梳子，待积层胶聚合后小心拔出梳子等待上样。
将诱导组样品、非诱导组样品和低分子量标准蛋白Marker上样，先以100V的电压进行电泳，待染料前沿进入分离胶时将电压提高到120V直至染料到达分离胶底部。
(3)转膜
将滤纸和硝酸纤维素膜浸泡于Western快速转膜液(货号：P0575，购自碧云天生物公司)，在塑料支架上依次叠放湿润的海绵、3层滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜、3层滤纸和海绵，使其相互对齐，且各层之间无气泡存在，然后将支架夹紧插入电泳槽中，其中硝酸纤维素膜一侧接阳极，凝胶一侧接阴极，80V电压转膜2h。
(4)封闭
转膜结束后，加入WB封闭液(货号：P0252，购自碧云天生物技术有限公司)浸泡硝酸纤维素膜，室温封闭2小时。
(5)检测
用洗涤液(货号：P0023C，购自碧云天生物技术有限公司)漂洗封闭后的硝酸纤维素膜3次，每次5min。然后分别将硝酸纤维素膜置于RABV鼠单克隆抗体(1∶500)稀释液中，4℃平缓摇动反应16h，回收抗体；再分别将纤维素膜浸泡于大量Western洗涤缓冲液中(货号：P0023C，购自碧云天生物技术有限公司)，平缓摇动洗涤3次，每次10min。以HRP标记的驴抗鼠IgG(1∶2000)稀释液为第二抗体，分别与相应的纤维素膜条反应，将膜浸泡在二抗反应液中，室温平缓摇动反应1-2小时，回收二抗，洗膜，然后用TMB显色液显色1-2min进行显影。
Western Blot电泳条带如图5所示，pNZ8149-pgsA-G/NZ3900重组质粒在101.8KDa附近出现明显的单一条带，表明狂犬病毒G蛋白成功表达。
综上所述，本发明将枯草芽孢杆菌pgsA基因与RABV的G基因连接到pNZ8149表达载体上进行融合性表达，构建得到重组狂犬病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体pNZ8149-pgsA-G/NZ3900，使狂犬病毒糖蛋白表达在乳酸乳球菌的外表面，本发明构建的口服乳酸菌表面展示系统为跨膜表达体系的建立和新型口服基因工程疫苗的研制奠定了基础。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。
序列表
<110> 广东省农业科学院动物卫生研究所
<120> 一种重组狂犬病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体及其构建方法和应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> pgsA-F(Artificial Sequence)
<400> 1
attataagga ggcactcacc atgaaaaaag aactgagctt 40
<210> 2
<211> 44
<212> DNA
<213> pgsA-R(Artificial Sequence)
<400> 2
gaactagtgg taccgcatgc tttagatttt agtttgtcac tatg 44
<210> 3
<211> 1140
<212> DNA
<213> pgsA(Bacillus subtilis)
<400> 3
atgaaaaaag aactgagctt tcatgaaaag ctgctaaagc tgacaaaaca gcaaaaaaag 60
aaaaccaata agcacgtatt tattgccatt ccgatcgttt ttgtccttat gttcgctttc 120
atgtgggcgg gaaaagcgga aacgccgaag gtcaaaacgt attctgacga cgtactctca 180
gcctcatttg taggcgatat tatgatggga cgctatgttg aaaaagtaac ggagcaaaaa 240
ggggcagaca gtatttttca atatgttgaa ccgatcttta gagcctcgga ttatgtagca 300
ggaaactttg aaaacccggt aacctatcaa aagaattata aacaagcaga taaagagatt 360
catctgcaga cgaataagga atcagtgaaa gtcttgaagg atatgaattt cacggttctc 420
aacagcgcca acaaccacgc aatggattac ggcgttcagg gcatgaaaga tacgcttgga 480
gaatttgcga agcaaaatct tgatatcgtt ggagcgggat acagcttaag tgatgcgaaa 540
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aaagtagaag acggaaaact gacgtttgat attgatcata gtgacaaact aaaatctaaa 1140
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> RABV-G-F(Artificial Sequence)
<400> 4
aactaaaatc taaagcatgc atggttcctc aggttctt 38
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> RABV-G-R(Artificial Sequence)
<400> 5
agaactagtg gtacccagtc tgatctcacc tcc 33
<210> 6
<211> 1572
<212> DNA
<213> G基因(Rabies virus)
<400> 6
atggttcctc aggttctttt gtttgtactc cttctgggtt tttcgttgtg tttcgggaag 60
ttccccattt acacgatacc agacgaactt ggtccctgga gccctattga catacaccat 120
ctcagctgtc caaataacct ggttgtggag gatgaaggat gtaccaacct gtccgagttc 180
tcctacatgg aactcaaagt gggatacatc tcagccatca aagtgaacgg gttcacttgc 240
acaggtgttg tgacagaggc agagacctac accaactttg ttggttatgt cacaaccaca 300
ttcaagagaa agcatttccg ccccacccca gacgcatgta gagccgcgta taactggaag 360
atggccggtg accccagata tgaagagtcc ctacacaatc cataccccga ctaccactgg 420
cttcgaactg taagaaccac caaagagtcc ctcattatca tatccccaag tgtgacagat 480
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gactttcgct cagacgagat tgagcatctc gttgtggagg agttagtcaa gaaaagagag 900
gaatgtctgg atgcattaga gtccatcatg accaccaagt cagtaagttt cagacgtctc 960
agtcacctga gaaaacttgt cccagggttt ggaaaagcat ataccatatt caacaaaacc 1020
ttgatggagg ctgatgctca ctacaagtca gtccggacct ggaatgagat catcccctca 1080
aaagggtgtt tgaaagttgg aggaaggtgc catcctcatg tgaacggggt gtttttcaat 1140
ggtataatat tagggcctga cgaccatgtc ctaatcccag agatgcaatc atccctcctc 1200
cagcaacata tggagttgtt gaaatcttca gttatccccc tgatgcaccc cctggcagac 1260
ccttctacag ttttcaaaga aggtgatgag gctgaggatt ttgttgaagt tcacctcccc 1320
gatgtgtaca aacagatctc aggggttgac ctgggtctcc cgaactgggg aaagtatgta 1380
ttgatgactg caggggccat gattggcctg gtgttgatat tttccctaat gacatggtgc 1440
agaagagcca atcgaccaga atcgaaacaa cgcagttttg gagggacagg ggggaatgtg 1500
tcagtcactt cccaaagcgg aaaagtcata ccttcatggg aatcatatag gagtggaggt 1560
gagatcagac tg 1572
Claims (10)
1.一种重组狂犬病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、pgsA重组质粒的构建：以pUC19-pgsA质粒为模板，以5’端连接载体序列和酶切位点NcoI和SphI的引物扩增枯草芽孢杆菌的pgsA基因，并将其连接至NICE表达系统中，得到pgsA重组质粒；
S2、以灭火狂犬病毒的基因组为模板，以5’端连接载体序列和酶切位点KpnI和SphI的引物扩增得到G基因目的序列，并将其连接至步骤S1的pgsA重组质粒中，构建得到pgsA-G重组质粒，最后将pgsA-G重组质粒转化至乳酸乳球菌感受态细胞中，制备得到重组狂犬病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体。
2.根据权利要求1所述的一种重组狂犬病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体的构建方法，其特征在于，所述NICE表达系统为携带Nisin多克隆位点的pNZ8149质粒。
3.根据权利要求1所述的一种重组狂犬病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体的构建方法，其特征在于，所述乳酸乳球菌感受态细胞为乳酸乳球菌NZ3900感受态细胞。
4.根据权利要求1所述的一种重组狂犬病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体的构建方法，其特征在于，扩增枯草芽孢杆菌pgsA基因的引物序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
5.根据权利要求1所述的一种重组狂犬病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体的构建方法，其特征在于，扩增G基因目的序列的引物序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。
6.根据权利要求1所述的一种重组狂犬病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体的构建方法，其特征在于，采用同源重组的方法将pgsA基因连接至NICE表达系统中。
7.根据权利要求1所述的一种重组狂犬病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体的构建方法，其特征在于，采用电击转化的方法将pgsA-G重组质粒转化至乳酸乳球菌感受态细胞中，电击转化所用电转仪的参数为1600V，4ms。
8.采用权利要求1-7任一项所述的构建方法构建得到的重组狂犬病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体。
9.权利要求8所述的重组狂犬病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体在制备重组狂犬病毒糖蛋白或狂犬病毒口服基因工程疫苗中的应用。
10.一种重组狂犬病毒糖蛋白的制备方法，其特征在于，将权利要求8所述的重组狂犬病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体在30℃下扩大培养至OD600值为0.6-0.8后，加入Nisin诱导剂继续培养一段时间，经分离后即得重组狂犬病毒糖蛋白。
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| CN105307673A (zh) * | 2012-04-06 | 2016-02-03 | 康奈尔大学 | 用于稳健的体液及细胞免疫应答的亚单位疫苗递送平台 |
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2022
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Patent Citations (3)
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| Title |
|---|
| 赵维静: "表达狂犬病毒糖蛋白乳酸菌工程菌株的构建及口服免疫的研究", CNKI优秀硕士学位论文全文库 * |
| 赵维静等: "表面展示狂犬病病毒糖蛋白的重组乳酸菌的构建及其免疫原性的研究", 中国兽医科学 * |
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