CN114591995A - 一种重组牛流行热病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体及其构建方法和应用 - Google Patents

一种重组牛流行热病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种重组牛流行热病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体及其构建方法和应用，本发明首先将pgsA基因连接至NICE表达系统中构建得到pgsA重组质粒，然后将牛流行热病毒的G基因连接至上述的pgsA重组质粒中，最后转化至乳酸乳球菌感受态细胞中构建得到重组牛流行热病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体。本发明构建的重组牛流行热病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体利用pgsA锚定蛋白的特性，将牛流行热病毒糖蛋白融合表达，使牛流行热病毒糖蛋白表达在乳酸乳球菌的外表面，不仅可以用于制备牛流行热病毒的重组G蛋白，而且可以为跨膜表达体系的建立和新型口服基因工程疫苗的研制奠定基础。

Description

一种重组牛流行热病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体及其构建方法 和应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种重组牛流行热病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体及其构建方法和应用。
背景技术
牛流行热(Bovine Ephemeral Fever，BEF)是牛流行热病毒(Bovine EphemeralFever Virus，BEFV)引起的一种高传染性发热疾病。BEF是由虫媒传播的疾病，其中蚊子和库蠓是目前已经证实的BEFV传播媒介。由于蚊子和库蠓等虫媒在夏末秋初较活跃，BEF在该时间段也较为流行。因此，BEF是一种季节性流行病，BEF的发生和传播非常快，并有一定的周期性，一般在3～4年可能会发生一次较大规模的流行。
牛流行热病毒的G蛋白有4个主要抗原位点，G蛋白含有特异的中和抗原位点，诱导牛的保护性免疫，是主要的抗原蛋白，其还与细胞的嗜性、致病性、融合以及与宿主细胞受体的相互作用密切相关。G蛋白是Ⅰ类跨膜糖蛋白，分子大小为81kD，存在于病毒粒子囊膜的表面。
乳酸乳球菌(Lactococcus lactis，L.Lactis)为革兰氏阳性菌、无芽孢，被美国食品和药物管理局认定为安全级(generally recognized as safe，GRAS)微生物。实践表明，乳酸乳球菌在基因工程方面已经得到了广泛的应用。其中，乳酸菌可以激活淋巴细胞、并且可刺激机体产生抗体，还能在肠道内定植，相当于天然的自动免疫。目前，表达异源蛋白使用最多的为NICE表达系统(nisin-controlled gene expression system，NICE)，NICE表达系统主要包括组氨酸蛋白激酶NisK、反应蛋白NisR和表达启动子PnisA，当诱导剂Nisin进入该系统时，可以激活位于膜上的NisK，NisK通过自我磷酸化激活NisR；NisR则通过激活启动子PnisA来引起其下游目的基因的表达，从而使目的基因在乳酸乳球菌中得以表达。但乳酸乳球菌是一种高度富含AT碱基的原核生物，目前尚未有牛流行热G蛋白在该菌中表达的报道。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明的首要目的是提供一种重组牛流行热病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体的构建方法。
本发明的第二个目的是提供采用上述构建方法构建得到的重组牛流行热病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体。
本发明的第三个目的是提供上述重组牛流行热病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体的应用。
本发明的上述第一个目的是通过以下技术方案来实现的：
一种重组牛流行热病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：
S1、pgsA重组质粒的构建：以pUC19-pgsA质粒为模板扩增枯草芽孢杆菌的pgsA基因，将其连接至NICE表达系统中，得到pgsA重组质粒；
S2、pgsA-G重组质粒的构建：以pUC19-G重组质粒为模板扩增牛流行热病毒的G基因，将其连接至步骤S1的pgsA重组质粒中，然后转化至乳酸乳球菌感受态细胞中，制备得到重组牛流行热病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体；所述pUC19-G重组质粒中的G基因为优化后的G基因，其序列如SEQ ID NO.5所示。
枯草芽孢杆菌的染色体上有聚-γ-谷氨酸合成酶复合体A(poly-γ-glutamicacid synthetase A,pgsA)基因，该基因由1143个核苷酸组成，编码381个氨基酸。pgsA基因能使聚-γ-谷氨酸(poly-γ-glutamicacid,γ-PGA)稳定地锚定在细胞膜上。本发明利用枯草芽孢杆菌pgsA基因锚定蛋白的特性，将枯草芽孢杆菌pgsA基因与BEFV的G基因连接到NICE表达系统上进行融合性表达，使BEFV的G蛋白表达在乳酸乳球菌的外表面，为跨膜表达体系的建立和新型口服基因工程疫苗的研制奠定基础。
优选地，所述NICE表达系统为携带Nisin多克隆位点的pNZ8149质粒。
优选地，所述乳酸乳球菌感受态细胞为乳酸乳球菌NZ3900感受态细胞。
优选地，步骤S1采用同源重组法将pgsA基因连接至NICE表达系统中，pgsA基因的扩增引物的5’端连接有载体序列和酶切位点NcoI和SphI。
进一步地，pgsA基因的扩增引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，采用NcoⅠ和SphⅠ双酶切NICE表达系统制备用于同源重组的线性化NICE表达系统。
优选地，步骤S1采用同源重组法将G基因连接至pgsA重组质粒中，G基因的扩增引物的5’端连接有载体序列和酶切位点KpnI和SphI。
进一步地，G基因的扩增引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，采用KpnI和SphI双酶切pgsA重组质粒制备用于同源重组的线性化pgsA重组质粒。
本发明的上述第二个目的是通过以下技术方案来实现的：
采用所述的构建方法构建得到的重组牛流行热病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体。
本发明的上述第三个目的是通过以下技术方案来实现的：
所述的重组牛流行热病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体在以下任一方面中的应用：
(1)制备牛流行热病毒的重组G蛋白；
(2)建立牛流行热病毒重组G蛋白的跨膜表达体系；
(3)研制用于防治牛流行热的口服基因工程疫苗。
本发明构建的重组牛流行热病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体，利用pgsA锚定蛋白的特性将牛流行热病毒糖蛋白融合表达，使牛流行热病毒糖蛋白表达在乳酸乳球菌的外表面，为跨膜表达体系的建立和新型口服基因工程疫苗的研制奠定基础。
还提供了一种牛流行热病毒重组G蛋白的制备方法，即对所述的重组牛流行热病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体进行扩大培养后，加入Nisin诱导剂进行诱导即可制备得到牛流行热病毒重组G蛋白。
优选地，扩大培养至OD值处于0.6至0.8之间。
优选地，所述Nisin诱导剂的加入浓度为106ng/mL。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明公开了一种重组牛流行热病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体的构建方法，首先将pgsA基因连接至NICE表达系统中构建得到pgsA重组质粒，然后将牛流行热病毒的G基因连接至上述的pgsA重组质粒中，最后转化至乳酸乳球菌感受态细胞中构建得到重组牛流行热病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体。本发明构建的重组牛流行热病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体利用pgsA锚定蛋白的特性，将牛流行热病毒糖蛋白融合表达，使牛流行热病毒糖蛋白表达在乳酸乳球菌的外表面，不仅可以用于制备牛流行热病毒的重组G蛋白，而且可以为跨膜表达体系的建立和新型口服基因工程疫苗的研制奠定基础。
附图说明
图1为pgsA基因的扩增图；
图2为pNZ8149-pgsA基因重组表达载体图谱；
图3为BEFV的G蛋白基因扩增图；
图4为pNZ8149-pgsA-G基因重组表达载体图谱；
图5为质粒pNZ8149-pgsA-G表达的pgsA-G融合蛋白WB检测结果(M为Marker，1为空白对照，2为pNZ8149-pgsA-G未诱导组，3为pNZ8149-pgsA-G融合蛋白)。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
实施例1构建pNZ8149-pgsA重组质粒
以pUC19-pgsA质粒为模板(广州擎科生物技术有限公司)，PCR扩增pgsA基因，然后使用
Figure BDA0003526551680000042
II One Step Cloning Kit同源重组试剂盒(购自诺唯赞生物，货号：C112)将pgsA基因连接到pNZ8149质粒中，得到质粒pNZ8149-pgsA。具体实施步骤如下：
(1)PCR扩增
在NCBI数据库上下载pgsA(GenBank：AB016245)的核苷酸序列，将核苷酸序列交由广州擎科生物技术有限公司合成pUC19-pgsA重组质粒，然后以pUC19-pgsA重组质粒为模板进行PCR扩增，并分别在上下游引物的5’端连接载体序列和酶切位点NcoI和SphI(下划线部分)，得到pgsA目的序列。
引物的核苷酸序列如下：
上游引物pgsA-F(SEQ ID NO.1)：
5’-ATTATAAGGAGGCACTCACCATGAAAAAAGAACTGAGCTT-3’；
下游引物pgsA-R(SEQ ID NO.2)：
5’-GAACTAGTGGTACCGCATGCTTTAGATTTTAGTTTGTCACTATG-3’；
其中，PCR扩增的反应体系为：
Figure BDA0003526551680000041
PCR扩增的反应程序为：
98℃预处理30s；98℃变性10s，52℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；72℃终延伸10min。
PCR产物使用1％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，确认正确后用DNA纯化试剂盒进行切胶回收目的基因，琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示。
(2)双酶切
用NcoⅠ和SphⅠ(购自北京NEB公司)酶切pNZ8149载体，酶切体系如下：
Figure BDA0003526551680000051
将酶切体系置于37℃下酶切2h，酶切结束后使用琼脂糖凝胶电泳进行验证，并使用DNA凝胶回收试剂盒(货号：K0692，Thermo)进行切胶回收线性化pNZ8149载体。
(3)同源重组反应
将双酶切回收后的线性化pNZ8149载体和PCR产物按照
Figure BDA0003526551680000053
II One StepCloning Kit同源重组试剂盒进行同源重组反应，具体反应体系如下：
Figure BDA0003526551680000052
将反应体系置于37℃下反应30min；反应后降至4℃或立即置于冰上冷却。
(4)电击转化
取20μL同源重组连接产物，加入50μL乳酸乳球菌NZ3900(本实验室保藏)电转感受态细胞，然后将其转入到电击杯中，使用电转仪(购自Bio Rad)进行电击转化，电转仪参数为：1600V，4ms。转化结束后转入M17恢复培养基中，在金属水浴锅中30℃培养3h，之后使用离心机5000rpm离心5min，收集上清涂布于Elliker培养基上，30℃培养24，随后挑取黄色单菌落进行菌落PCR鉴定，选取阳性单克隆菌液培养后提取质粒并送到广州擎科生物进行测序验证，命名为pNZ8149-pgsA，其图谱如图2所示。
实施例2构建pNZ8149-pgsA-G重组质粒
将BEFV的G基因序列(GenBank：JX564638)进行序列优化(由广州擎科生物科技有限公司完成)，将优化好的G基因序列(SEQ ID NO.5)送到广州擎科生物科技有限公司合成，命名为pUC19-G。
(1)PCR扩增
以pUC19-G重组质粒为模板，进行PCR扩增，得到G基因目的序列。分别在上下游引物的5’端连接载体序列和酶切位点KpnI和SphI(下划线部分)，得到G基因目的序列。
引物如下：
上游引物BEFV-G-F(SEQ ID NO.3)：
5’-AACTAAAATCTAAAGCATGCATGTTCAAAGTTCTGATCATTACAC-3’；
下游引物BEFV-G-R(SEQ ID NO.4)：
5’-AGAACTAGTGGTACCGTGATCGAAGAATCTGTCATCTC-3’；
优化后的G基因序列如下(SEQ ID NO.5)：
GGATCCAACATGTTCAAAGTTCTGATCATTACACTGTTGGTCAACGGAATACACTTCGAAAAAATCTACAACGTCCCGGTGAATTGCGGCGAATTGCACCCCGTGAAAGCTCACGAAATCAAGTGTCCTCAAAGATTGAATGAACTGTCACTGCAAGCTCACCACAACCTCGCCAAAGACGAACACTACAATAAGATTTGCAGACCACAACTCAAAGACGATGACCACCTGGAAGGATTCATTTGCAGAAAACAGAAGTGGATAACAAAGTGTTCAGAAACTTGGTACTTCTCGACCAGTATAGAATACCAAATATTGGAAGTTATCCCGGAATACTCTGGATGCACAGACGCTGTCAAAAAGTTGGATCAGGGCGCCCTCATCCCTCCATACTACCCGCCCGCTGGTTGTTTCTGGAACACTGAAATGAATCAAGAAATAGAGTTCTACGTGCTGATCCAGCACAAACCGTTCTTGAACCCCTACGACAATCTCATCTACGATTCGAGATTCTTGACCCCCTGCACAATTAACGACAGTAAAACTAAGGGATGTCCTCTCAAAGACATTACCGGCACATGGATACCAGATGTTAGAGTCAAGGAAATAAGCGAACACTGCAACTCCAAACACTGGGAATGTATCACCGTTAAGAGCTTCAATCCGAACTGAATGAAACAGAAAGATTGTGGGAAGCTCCTGATATTGGCCTCGTGCACGTTAACAAAGGTTGCCTGTCGACTTTCTGTGGCAGAAATGGTATAATCTTCGAAGACGGTGAATGGTGGTCAATTGAAAACCAAACCGAATCTGATTTCCAGAACTTCAAGATCGAAAGATGCAAGGGAAAAAAGCCAGGCTTCAGAATGCACACTGACAGAACCGAGTTCGAAGAACTCGATATAAAGGCCGAACTGGAACACGAAAGATGTTTGAACACTATCTCAAAAATTCTCAACAAGGAAAACATCAATACTCTGGACATGTCTTACTTGGCTCCTACCAGACCAGGCAGAGATTACGCCTACCTGTTCGAACAAACCTCATGGCAGGAAAAATTGTGCCTCTCGCTGCCGGACAGTGGTAGAGTGTCAAAGGATTGTTCTATCGACTGGAGAACTAGCACCAGAGGTGGAATGGTTAAAAAGAACCACTACGGTATCGGTTCATACAAAAGAGCTTGGTGCGAATACAGACCCTTCATTGATAAGAACGAAGACGGTTACATTGATATACAAGAACTGAACGGACACAATATGAGCAGAAATCACGCCATTTTGGAAACCGCTCCTGCTGGTGGTTCATCTGGCACAAAACTCAACGTGACTCTGAATGGTATGATATTCGTTGAACCCACCAAATTGTACCTCCACACAAAGTCCATTTACGAAGGAATAGAAGAATACCAGAAACTGATCAAGTTCGAAGTCATGGAATACGACAACATCGAAGAAAACCTCATCAAGTACGAAGAAGATGAAAAATTCAAGCCTGTGAACCTGTCGCCACACGAAAAGAGTCAAATTAATAGAACCGACATCGTCAGAGAAATTCAGAGAGGAGGCAAAAAGGTGTTGAGCGCTGTGGTTGGTTGGTTCACATCCACTGCTAAAGCCGTTAGATGGACAATTTGGGCTGTCGGAGCCATAGTGACAACTTACGCCATCTACAAACTCTACAAGATGGTCAAATCGAACAGCTCCCACAACAAACACAATGAAACAGACCTGGAAGGATTGCAAAGTATCACTAAGGAAAACATGAAGATGGAAAAGAACGACAAGAATTACCACGATCTGGAATTGGGCCTCTACGAAGAAATCAGATCAATCAAGTCAGGTTCTAAGCCTATTGGAGATGACAGATTCTTCGATCACTAAGAATTC。
其中，PCR扩增的反应体系为：
Figure BDA0003526551680000071
PCR扩增的反应程序为：
98℃预处理30s；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；72℃终延伸10min。
PCR产物使用1％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，确认正确后用DNA纯化试剂盒进行切胶回收目的基因，琼脂糖凝胶电泳结果如图3所示。
(2)双酶切
用KpnⅠ和SphⅠ(购自北京NEB公司)酶切pNZ8149-pgsA载体，酶切体系如下：
Figure BDA0003526551680000072
37℃酶切2h，酶切结束后使用琼脂糖凝胶电泳进行验证，使用DNA凝胶回收试剂盒(货号：K0692，Thermo)进行切胶回收线性化的pNZ8149-pgsA载体。
(3)同源重组反应
将双酶切回收后的线性化pNZ8149-pgsA载体和PCR产物按照
Figure BDA0003526551680000081
II OneStep Cloning Kit同源重组试剂盒进行同源重组反应，具体反应体系如下：
Figure BDA0003526551680000082
37℃反应30min；降至4℃或立即置于冰上冷却。
(4)电击转化
取20μL同源重组连接产物，加入50μL乳酸乳球菌NZ3900电转感受态细胞，然后将其转入到电击杯中，使用电转仪(购自Bio Rad)，电转仪参数：1600V，4ms，进行电击转化。转化结束后转入恢复培养基中，在金属水浴锅中30℃培养3h，之后使用离心机5000rpm离心5min，涂布Elliker培养基，30℃培养24后，挑取黄色单菌落进行菌落PCR鉴定，选取阳性单克隆菌液培养后提取质粒并送到广州擎科生物测序验证，命名为pNZ8149-pgsA-G，其图谱如图4所示。
实施例3重组乳酸乳球菌pNZ8149-pgsA-G/NZ3900的诱导表达
(1)乳酸菌样品的处理
将阳性菌液按1：100的比例用LM17培养基扩大培养，经过5.5小时的30℃培养后使用紫外可见光分光光度计测得两组的OD600在0.6至0.8之间。将阳性菌液分为两组，体积均为60mL，1为诱导组，2为非诱导组。在诱导组加入106ng/mLNisin诱导剂6μL，两组继续在30℃的条件下进行培养，经过3个小时的诱导后，4℃保存用作下步实验。
(2)SDS-PAGE电泳
离心机8000g/min离心10min，弃置上清，每组用10mL1％PBS分别进行重悬。将重悬后的样品分别转移到50mL的离心管内，置于超声波细胞粉碎机内以200W率各自裂解20钟。将样品与上清液每组各加入40μL的SDS Loading Buffer进行混匀，并将两组样品煮沸10min，待加样。配制10％的SDS-PAGE分离胶，并在分离胶溶液上覆盖一层正丁醇封胶，待分离胶完全聚合后倾出覆盖层液体，用去离子水洗涤数次以除去正丁醇，之后用滤纸将残留液体吸净。随后，灌注5％的积层胶并立即插入干净的梳子，待积层胶聚合后小心拔出梳子等待上样。
将诱导组样品、非诱导组样品和低分子量标准蛋白Marker上样，先以100V电压进行电泳，待染料前沿进入分离胶时将电压提高到120V直至染料到达分离胶底部。
(3)转膜
将滤纸和硝酸纤维素膜浸泡于转移缓冲液中，在塑料支架上依次叠放湿润的海绵、3层滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜、3层滤纸和海绵，使其相互对齐，且各层之间无气泡存在，将支架夹紧插入电泳槽中，其中硝酸纤维素膜一侧接阳极，凝胶一侧接阴极，80V电压转膜2h。
(4)封闭
转膜结束后，加入WB封闭液(货号：P0252，购自碧云天生物技术有限公司)浸泡硝酸纤维素膜，室温封闭2小时。
(5)检测
用洗涤液(货号：P0023C，购自碧云天生物技术有限公司)漂洗封闭后的硝酸纤维素膜3次，每次5min。分别将硝酸纤维素膜置于牛BEFV高免血清糖蛋白多克隆抗体(1∶500)稀释液中，4℃平缓摇动反应16h，回收抗体；再分别将纤维素膜浸泡于大量Western洗涤缓冲液中，平缓摇动洗涤3次，每次10min。以HRP标记的兔抗牛IgG(1∶2000)稀释液为第二抗体，分别与相应的纤维素膜条反应，将膜浸泡在二抗反应液中，室温平缓摇动反应1-2小时，回收二抗，洗膜，然后用TMB显色液显色1-2min，进行显影。
Western Blot电泳条带如图5所示，经诱导后，pNZ8149-pgsA-G/NZ3900重组质粒在116KDa附近出现明显单一条带，表明牛流行热病毒G蛋白成功表达。
综上所述，本发明构建的口服乳酸菌表面展示系统，利用pgsA锚定蛋白的特性将牛流行热病毒糖蛋白融合表达，使牛流行热病毒糖蛋白表达在乳酸乳球菌的外表面，为跨膜表达体系的建立和新型口服基因工程疫苗的研制奠定基础。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。
序列表
<110> 广东省农业科学院动物卫生研究所
<120> 一种重组牛流行热病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体及其构建方法和应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 40
<212> DNA/RNA
<213> pgsA-F(人工序列)
<400> 1
attataagga ggcactcacc atgaaaaaag aactgagctt 40
<210> 2
<211> 44
<212> DNA/RNA
<213> pgsA-R(人工序列)
<400> 2
gaactagtgg taccgcatgc tttagatttt agtttgtcac tatg 44
<210> 3
<211> 45
<212> DNA/RNA
<213> BEFV-G-F(人工序列)
<400> 3
aactaaaatc taaagcatgc atgttcaaag ttctgatcat tacac 45
<210> 4
<211> 38
<212> DNA/RNA
<213> BEFV-G-R(人工序列)
<400> 4
agaactagtg gtaccgtgat cgaagaatct gtcatctc 38
<210> 5
<211> 1886
<212> DNA/RNA
<213> 优化后的G基因(人工序列)
<400> 5
ggatccaaca tgttcaaagt tctgatcatt acactgttgg tcaacggaat acacttcgaa 60
aaaatctaca acgtcccggt gaattgcggc gaattgcacc ccgtgaaagc tcacgaaatc 120
aagtgtcctc aaagattgaa tgaactgtca ctgcaagctc accacaacct cgccaaagac 180
gaacactaca ataagatttg cagaccacaa ctcaaagacg atgaccacct ggaaggattc 240
atttgcagaa aacagaagtg gataacaaag tgttcagaaa cttggtactt ctcgaccagt 300
atagaatacc aaatattgga agttatcccg gaatactctg gatgcacaga cgctgtcaaa 360
aagttggatc agggcgccct catccctcca tactacccgc ccgctggttg tttctggaac 420
actgaaatga atcaagaaat agagttctac gtgctgatcc agcacaaacc gttcttgaac 480
ccctacgaca atctcatcta cgattcgaga ttcttgaccc cctgcacaat taacgacagt 540
aaaactaagg gatgtcctct caaagacatt accggcacat ggataccaga tgttagagtc 600
aaggaaataa gcgaacactg caactccaaa cactgggaat gtatcaccgt taagagcttc 660
aatccgaact gaatgaaaca gaaagattgt gggaagctcc tgatattggc ctcgtgcacg 720
ttaacaaagg ttgcctgtcg actttctgtg gcagaaatgg tataatcttc gaagacggtg 780
aatggtggtc aattgaaaac caaaccgaat ctgatttcca gaacttcaag atcgaaagat 840
gcaagggaaa aaagccaggc ttcagaatgc acactgacag aaccgagttc gaagaactcg 900
atataaaggc cgaactggaa cacgaaagat gtttgaacac tatctcaaaa attctcaaca 960
aggaaaacat caatactctg gacatgtctt acttggctcc taccagacca ggcagagatt 1020
acgcctacct gttcgaacaa acctcatggc aggaaaaatt gtgcctctcg ctgccggaca 1080
gtggtagagt gtcaaaggat tgttctatcg actggagaac tagcaccaga ggtggaatgg 1140
ttaaaaagaa ccactacggt atcggttcat acaaaagagc ttggtgcgaa tacagaccct 1200
tcattgataa gaacgaagac ggttacattg atatacaaga actgaacgga cacaatatga 1260
gcagaaatca cgccattttg gaaaccgctc ctgctggtgg ttcatctggc acaaaactca 1320
acgtgactct gaatggtatg atattcgttg aacccaccaa attgtacctc cacacaaagt 1380
ccatttacga aggaatagaa gaataccaga aactgatcaa gttcgaagtc atggaatacg 1440
acaacatcga agaaaacctc atcaagtacg aagaagatga aaaattcaag cctgtgaacc 1500
tgtcgccaca cgaaaagagt caaattaata gaaccgacat cgtcagagaa attcagagag 1560
gaggcaaaaa ggtgttgagc gctgtggttg gttggttcac atccactgct aaagccgtta 1620
gatggacaat ttgggctgtc ggagccatag tgacaactta cgccatctac aaactctaca 1680
agatggtcaa atcgaacagc tcccacaaca aacacaatga aacagacctg gaaggattgc 1740
aaagtatcac taaggaaaac atgaagatgg aaaagaacga caagaattac cacgatctgg 1800
aattgggcct ctacgaagaa atcagatcaa tcaagtcagg ttctaagcct attggagatg 1860
acagattctt cgatcactaa gaattc 1886

Claims (10)

1.一种重组牛流行热病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：
S1、pgsA重组质粒的构建：以pUC19-pgsA质粒为模板扩增枯草芽孢杆菌的pgsA基因，将其连接至NICE表达系统中，得到pgsA重组质粒；
S2、pgsA-G重组质粒的构建：以pUC19-G重组质粒为模板扩增牛流行热病毒的G基因，将其连接至步骤S1的pgsA重组质粒中，然后转化至乳酸乳球菌感受态细胞中，制备得到重组牛流行热病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体；所述pUC19-G重组质粒中的G基因为优化后的G基因，其序列如SEQ ID NO.5所示。
2.根据权利要求1所述的一种重组牛流行热病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体的构建方法，其特征在于，所述NICE表达系统为携带Nisin多克隆位点的pNZ8149质粒。
3.根据权利要求1所述的一种重组牛流行热病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体的构建方法，其特征在于，所述乳酸乳球菌感受态细胞为乳酸乳球菌NZ3900感受态细胞。
4.根据权利要求1所述的一种重组牛流行热病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体的构建方法，其特征在于，步骤S1采用同源重组法将pgsA基因连接至NICE表达系统中，pgsA基因的扩增引物的5’端连接有载体序列和酶切位点NcoI和SphI。
5.根据权利要求4所述的一种重组牛流行热病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体的构建方法，其特征在于，pgsA基因的扩增引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，采用NcoⅠ和SphⅠ双酶切NICE表达系统制备用于同源重组的线性化NICE表达系统。
6.根据权利要求1所述的一种重组牛流行热病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体的构建方法，其特征在于，步骤S1采用同源重组法将G基因连接至pgsA重组质粒中，G基因的扩增引物的5’端连接有载体序列和酶切位点KpnI和SphI。
7.根据权利要求6所述的一种重组牛流行热病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体的构建方法，其特征在于，G基因的扩增引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，采用KpnI和SphI双酶切pgsA重组质粒制备用于同源重组的线性化pgsA重组质粒。
8.采用权利要求1-7任一项所述的构建方法构建得到的重组牛流行热病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体。
9.权利要求8所述的重组牛流行热病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体在以下任一方面中的应用：
(1)制备牛流行热病毒的重组G蛋白；
(2)建立牛流行热病毒重组G蛋白的跨膜表达体系；
(3)研制用于防治牛流行热的口服基因工程疫苗。
10.一种牛流行热病毒重组G蛋白的制备方法，其特征在于，对权利要求8所述的重组牛流行热病毒糖蛋白乳酸乳球菌载体进行扩大培养后，加入Nisin诱导剂进行诱导即可制备得到牛流行热病毒重组G蛋白。
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