CN112011497A - 分泌表达猪源性抗产肠毒素大肠杆菌k88菌毛单链抗体的重组乳酸乳球菌及其制备方法 - Google Patents

分泌表达猪源性抗产肠毒素大肠杆菌k88菌毛单链抗体的重组乳酸乳球菌及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分泌表达猪源性抗产肠毒素大肠杆菌K88菌毛单链抗体的重组乳酸乳球菌及其制备方法，属于基因工程技术领域。所述重组乳酸乳球菌携带分泌表达抗产肠毒素大肠杆菌K88菌毛单链抗体的融合序列，所述融合序列具有如SEQ ID No.1所示序列与如SEQ ID No.2所示的单链抗体序列，其中，如SEQ ID No.1所示序列为含有分泌信号肽USP45、分泌增强信号肽LEISSTCDA和硫氧还蛋白基因的序列。获得的分泌的抗产肠毒素大肠杆菌K88菌毛的单链抗体分子量约为45kDa，能特异性的识别产肠毒素大肠杆菌，阻断细菌的感染，以及对仔猪产肠毒素大肠杆菌病提供保护作用。

Description

分泌表达猪源性抗产肠毒素大肠杆菌K88菌毛单链抗体的重 组乳酸乳球菌及其制备方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种猪源性抗产肠毒素大肠杆菌K88菌毛的单链抗体、猪源性抗产肠毒素大肠杆菌K88菌毛的单链抗体的制备方法、分泌表达抗产肠毒素大肠杆菌K88菌毛单链抗体的重组乳酸乳球菌的制备方法、编码该分泌表达抗产肠毒素大肠杆菌K88菌毛单链抗体的基因、分泌表达抗产肠毒素大肠杆菌K88菌毛单链抗体的表达载体和宿主细胞。
背景技术
大肠杆菌最早由Theodore Escherich在1885年从粪便分离得到，人们为了纪念他的研究，以他的名字命名大肠杆菌为Escherichia coli。一些大肠杆菌是肠道正常菌群的组成成分，另一些大肠杆菌会引起腹泻，最常见的致病性大肠杆菌是产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)。产肠毒素大肠杆菌的毒力因子主要有黏附素和肠毒素。黏附素是引起肠道感染的先决因素。其中K88菌毛和K99菌毛是ETEC最重要的黏附性毒力因子。ETEC的防控依靠抗生素，然而抗生素的大量使用容易导致ETEC产生耐药性，并且抗性基因在细菌间的传播会对公共安全造成威胁。
单链抗体是一种基因工程抗体，以其分子量小、特异性高、穿透力强、易于改造等特点，显示了巨大的应用潜力，越来越受到人们的重视。
中国专利CN106008710B即公开了一种猪源性抗产肠毒素大肠杆菌K88 FaeG蛋白的单链抗体及其制备方法，该专利中的抗产毒素大肠杆菌K88FaeG蛋白的单链抗体由抗体的重链可变区VH和轻链可变区VL通过短的连接肽连接而成。轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示，重链可变区VH的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。获得的抗产肠毒素大肠杆菌K88FaeG蛋白的单链抗体分子量约为28kDa，能够特异性的识别产肠毒素大肠杆菌K88，可用于阻断产肠毒素大肠杆菌K88的感染和粘附。
然而单链抗体口服时可能会受到胃部酸性环境和蛋白酶的破坏，使其效果受到影响。
发明内容
本发明的目的就是为了克服单链抗体口服时容易受到破坏的技术问题而提供一种分泌表达猪源性抗产肠毒素大肠杆菌K88菌毛单链抗体的重组乳酸乳球菌及其制备方法。
本发明所述重组乳酸乳球菌分泌的猪源性抗产肠毒素大肠杆菌K88菌毛单链抗体能够与产肠毒素大肠杆菌特异性结合，可用于阻断产肠毒素大肠杆菌的感染，以及对仔猪感染病毒提供保护作用。
所述猪源性抗产肠毒素大肠杆菌K88菌毛单链抗体具有与抗产肠毒素大肠杆菌K88菌毛特异性结合活性。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明提供一种分泌表达猪源性抗产肠毒素大肠杆菌K88菌毛单链抗体的重组乳酸乳球菌，所述重组乳酸乳球菌携带分泌表达抗产肠毒素大肠杆菌K88菌毛单链抗体的融合序列，所述融合序列具有如SEQ ID No.1所示序列与如SEQ ID No.2所示的单链抗体序列，其中，如SEQ ID No.1所示序列为含有分泌信号肽USP45、分泌增强信号肽LEISSTCDA和硫氧还蛋白基因的序列。
其中，分泌表达抗产肠毒素大肠杆菌K88菌毛单链抗体的融合序列具有与产肠毒素大肠杆菌结合的活性。
进一步地，所述分泌表达抗产肠毒素大肠杆菌K88菌毛单链抗体的融合序列具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。
进一步地，为了构建分泌表达抗产肠毒素大肠杆菌K88菌毛单链抗体的重组乳酸乳球菌载体，在上述序列的基础上进一步设计酶切位点和识别序列，所述核苷酸序列中进一步包含内切酶位点Nco I、Hind III，其中Nco I为CCATGG，Hind III为AAGCTT。
进一步地，所述分泌表达抗产肠毒素大肠杆菌K88菌毛单链抗体的融合序列具有如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列。
本发明的乳酸乳球菌是一种益生菌，定殖在肠道，将单链抗体导入乳酸乳球菌中能使单链抗体在肠道持续表达，避免单链抗体直接口服受到胃酸和蛋白酶的影响。
本发明还提供一种乳酸乳球菌表达载体，含有分泌表达抗产肠毒素大肠杆菌K88菌毛单链抗体的融合序列，所述融合序列具有如SEQ ID No.1所示序列与如SEQ ID No.2所示的单链抗体序列，其中，如SEQ ID No.1所示序列为含有分泌信号肽USP45、分泌增强信号肽LEISSTCDA和硫氧还蛋白基因的序列。
进一步地，所述载体为原核表达载体。
进一步地，所述载体为pNZ8148-EZZ 3。
本发明还提供制备所述分泌表达猪源性抗产肠毒素大肠杆菌K88菌毛单链抗体的重组乳酸乳球菌的方法，包括以下步骤：
(1)合成密码子优化的抗产肠毒素大肠杆菌K88菌毛单链抗体EZZ 3序列，所述抗产肠毒素大肠杆菌K88菌毛单链抗体EZZ 3序列如SEQ ID No.2所示；
(2)合成分泌信号肽和硫氧还蛋白的序列；
(3)将步骤(1)的抗产肠毒素大肠杆菌K88菌毛单链抗体EZZ 3基因和步骤(2)的分泌表达信号肽和硫氧还蛋白的基因酶切克隆到乳酸乳球菌载体中，构建乳酸乳球菌表达载体；
(4)将步骤(3)的乳酸乳球菌表达载体电转化入乳酸乳球菌NZ9000感受态细胞，放入培养基中培养；
(5)分离纯化步骤(4)的培养基即获得分泌表达猪源性抗产肠毒素大肠杆菌K88菌毛单链抗体的重组乳酸乳球菌。
进一步地，步骤(2)中，设计带有分泌信号肽USP45、分泌增强信号肽LEISSTCDA和硫氧还蛋白A基因的序列如SEQ ID No.1所示；
步骤(3)中，乳酸乳球菌载体为pNZ8148。
本发明还提供提取所述重组乳酸乳球菌分泌的猪源性抗产肠毒素大肠杆菌K88菌毛单链抗体的方法，将过夜培养的所述重组乳酸乳球菌接种至培养基后，加入Nisin诱导培养5-8h，离心诱导培养后的菌液，收集培养基上清；上清中加入脱氧胆酸钠，静置；加入丙酮，离心分离，获得分泌的猪源性抗产肠毒素大肠杆菌K88菌毛单链抗体。获得的分泌的抗产肠毒素大肠杆菌K88菌毛的单链抗体分子量约为45kDa，能特异性的识别产肠毒素大肠杆菌，阻断细菌的感染，以及对仔猪产肠毒素大肠杆菌病提供保护作用。
需要说明的是，以上各步骤采用的实验材料均为正规公司获得的标准材料,所用方法均为标准试剂盒产品说明书所述方法(见相应的实施例),各步骤获得的中间产品及最后的终产品均经过多次试验证明可以重复获得,其生物学性质保持稳定一致。说明本发明各试验步骤所涉及的中间产品和终产品均可以按照本发明所陈述的发法准确获得。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：重组乳酸乳球菌分泌的抗产肠毒素大肠杆菌K88菌毛单链抗体能与产肠毒素大肠杆菌特异性结合，能够用于猪产肠毒素大肠杆菌病的预防和治疗。
附图说明
图1为pNZ8148-EZZ 3的质粒结构图。
图2为pNZ8148-EZZ 3双酶切产物电泳图；M为2000bp DNA ladder marker；1为pNZ8148-EZZ 3经Nco I和Hind III的酶切电泳图基因PCR产物。
图3为Nisin诱导时间与EZZ 3分泌量的关系。
图4为western-blot检测分泌表达的单链抗体EZZ 3。
图5为重组乳酸乳球菌分泌表达单链抗体EZZ 3的定量。
图6为分泌的单链抗体EZZ 3与产肠毒素大肠杆菌的结合能力。
图7为分泌的单链抗体EZZ 3对产肠毒素大肠杆菌的体外中和效果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1构建分泌表达抗产肠毒素大肠杆菌K88菌毛单链抗体的重组乳酸乳球菌
设计带有分泌信号肽USP45、分泌增强信号肽LEISSTCDA和硫氧还蛋白A基因(trxA)的序列，在5’端加上Nco I酶切位点，在3’端加上EcoR I，并且在trxA基因两端加上Kpn I；将抗产肠毒素大肠杆菌K88菌毛单链抗体EZZ 3序列用Codon OptimWiz软件优化密码子，在5’端加上EcoR I，在3’端加上6×His序列和Hind III。将设计的序列交由苏州金唯智生物科技有限公司合成。
分别将带有分泌信号肽USP45、分泌增强信号肽LEISSTCDA和硫氧还蛋白A基因(trxA)的序列、密码子优化的单链抗体EZZ 3序列依次连入pNZ8148，转化MC1061F-感受态细胞，得到重组质粒pNZ8148-USP45-LEISSTCDA-trxA-EZZ 3(简写为pNZ8148-EZZ 3)(见图1)。琼脂糖凝胶电泳结果发现分泌表达抗产肠毒素大肠杆菌K88菌毛的融合序列都插入了pNZ8148，大小约1200bp(见图2)。
从-80℃取出乳酸菌电转化感受态细胞NZ9000，加入10μL连接产物pNZ8148-EZZ3，冰上放置10min后转移至电极杯。设置电击参数：电压为2.5kv，电阻为200Ω，电容为25μF。电转后加入1mL预热的SGM17B复苏培养基，30℃静置培养1.5h后涂布至带氯霉素抗性的SGM17B平板，30℃培养2天。从平板上挑取单菌落，得到重组携带抗产肠毒素大肠杆菌K88菌毛单链抗体的重组乳酸乳球菌。
实施例2重组乳酸菌分泌抗产肠毒素大肠杆菌K88菌毛单链抗体的鉴定
将过夜培养的重组乳酸菌按1:25接种至2管10mL带氯霉素的SGM17B培养基，培养至OD600达到0.4。其中一管加入终浓度为10ng/mL的Nisin(乳酸链球菌素，亦称乳链菌肽)，继续培养5-8h。
提取重组乳酸菌分泌的单链抗体，方法为：离心诱导后的菌液，收集培养基上清；上清中加入1％(v/v)的2％脱氧胆酸钠，静置30min；加入丙酮，4℃静置2h；12,000×g离心30min，将沉淀用预冷的丙酮洗涤两次，离心取沉淀；将沉淀悬浮于蛋白上样缓冲液或PBS。通过western-blot和间接ELISA检测分泌至培养基上清的单链抗体EZZ 3。将未被Nisin诱导的重组乳酸菌的培养基上清提取物作为阴性对照。
western-blot结果显示，Nisin诱导5h后在培养基中能检测到分泌的单链抗体EZZ3，而未诱导的重组乳酸乳球菌培养基上清中未检测到单链抗体EZZ 3，说明单链抗体TZZ-19在重组乳酸乳球菌中经Nisin诱导成功表达并分泌，并且蛋白表达受到Nisin的严格调控(见图3)。为了得到更多分泌的单链抗体EZZ 3，检测了诱导持续时间对表达量的影响。ELISA结果显示，重组乳酸乳球菌在Nisin诱导后2-10h大量分泌单链抗体EZZ 3，单链抗体EZZ 3最大分泌量出现在诱导后的8-10h。10-20h单链抗体EZZ 3的分泌基本保持稳定，20h后分泌量开始下降(见图4)。将10μL诱导8h的培养基上清和已知浓度的从大肠杆菌纯化的EZZ 3通过western-blot转印至NC膜，通过光密度比较对分泌的单链抗体EZZ 3进行定量。结果发现重组乳酸乳球菌在诱导8h后EZZ 3分泌量约为2.2μg/mL(见图5)。
间接ELISA检测分泌的单链抗体EZZ 3与TGEV全病毒抗原的结合能力，将TGEV全病毒抗原稀释至20ug/mL，每孔加入100uL稀释液，4℃包被过夜。第二天每孔加入5％的脱脂乳，室温封闭2h。将提取的培养基上清浓缩20倍后连续4倍稀释，加入ELISA板。结果发现，从重组乳酸乳球菌纯化的单链抗体EZZ 3能与相应抗原结合，OD450值的高低与单链抗体的浓度有关，而导入pNZ8148质粒的重组乳酸菌上清提取物不会与抗原结合(见图6)。以上结果说明重组乳酸乳球菌能分泌猪源单链抗体EZZ 3，并且分泌的单链抗体EZZ 3正确折叠，保留了原有的生物学活性。
实施例3重组乳酸菌分泌的单链抗体对产肠毒素大肠杆菌的黏附抑制作用
黏附抑制实验的方法为：将长满单层的IPEC-J2细胞用于黏附抑制实验，将细菌(MOI＝50:1)与50μg/mL或5μg/mL从重组乳酸乳球菌纯化的单链抗体EZZ 3预先作用30min，然后将ETEC-单链抗体EZZ 3混合物加入IPEC-J2细胞，37℃作用1h。将12孔板在37℃孵育1h，1h后PBS洗涤5次，洗去未黏附的ETEC。向12孔板加入0.5％Triton X-100，反复吹打使细胞裂解。将裂解物8,000×g离心10min，沉淀连续10倍稀释后涂布LB平板，计算菌落数。将小鼠抗K88ac菌毛多抗作为阳性对照，将未免疫小鼠血清作为阴性对照。将阴性血清处理后黏附至细胞的ETEC数量记为100％，得出其它处理组ETEC的黏附率(％)。结果表明，50μg/mLEZZ 3抑制53.3±3.2％的ETEC黏附细胞，与阴性血清差异显著(p<0.05)。多抗对ETEC的黏附抑制率为77.8±2.1％(见图7)。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 分泌表达猪源性抗产肠毒素大肠杆菌K88菌毛单链抗体的重组乳酸乳球菌及其制备方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 168
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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ggtactgtta ctcttacatg cgctttttca tctggttctg ttacaactga caactaccca 1020
tcttggttcc agcagacacc gggtcaacca ccacgtcaac ttatttattc tacaaacaac 1080
cgtccaactg gtgttccttc acgtttctct ggtgctattt ctggttcaaa ggctgctctt 1140
acaattactg gtgctcaagc tgaggacgag gcagattatt tctgtgctct ttataaaaca 1200
tctggtaata tttttggagg tggtactcat ttaacagttt tacaccatca tcatcatcat 1260
taa 1263
<210> 4
<211> 420
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Gly Met Lys Lys Lys Ile Ile Ser Ala Ile Leu Met Ser Thr Val
1 5 10 15
Ile Leu Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ser Gly Val Tyr Ala Leu Glu Ile
20 25 30
Ser Ser Thr Cys Asp Ala Gly Ser Gly Thr Asp Lys Ile Ile His Leu
35 40 45
Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile
50 55 60
Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala
65 70 75 80
Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val
85 90 95
Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly
100 105 110
Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala
115 120 125
Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu
130 135 140
Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly Ser Gly His Met Ser Ser Gly Asp
145 150 155 160
Asp Asp Asp Lys Gly Thr Glu Phe Met Ala Glu Glu Lys Leu Val Glu
165 170 175
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
180 185 190
Val Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Asp Phe Thr Trp Val Arg
195 200 205
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala Ile Ile Tyr Met Asp
210 215 220
Ser Ser Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
225 230 235 240
Ser Arg Asp Asn Ser Gln Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
245 250 255
Arg Thr Glu Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Val Arg Glu Leu Pro Tyr
260 265 270
Gly Gly Trp Gly Asp Leu Asp Leu Trp Gly Pro Gly Val Glu Val Val
275 280 285
Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
290 295 300
Asp Ser Gln Thr Val Ile Gln Glu Pro Ala Met Ser Val Ser Pro Gly
305 310 315 320
Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Ala Phe Ser Ser Gly Ser Val Thr Thr
325 330 335
Asp Asn Tyr Pro Ser Trp Phe Gln Gln Thr Pro Gly Gln Pro Pro Arg
340 345 350
Gln Leu Ile Tyr Ser Thr Asn Asn Arg Pro Thr Gly Val Pro Ser Arg
355 360 365
Phe Ser Gly Ala Ile Ser Gly Ser Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly
370 375 380
Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Ala Leu Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Ser Gly Asn Ile Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu His His
405 410 415
His His His His
420

Claims (10)

1.一种分泌表达猪源性抗产肠毒素大肠杆菌K88菌毛单链抗体的重组乳酸乳球菌，其特征在于，所述重组乳酸乳球菌携带分泌表达抗产肠毒素大肠杆菌K88菌毛单链抗体的融合序列，所述融合序列具有如SEQ ID No.1所示序列与如SEQ ID No.2所示的单链抗体序列，其中，如SEQ ID No.1所示序列为含有分泌信号肽USP45、分泌增强信号肽LEISSTCDA和硫氧还蛋白基因的序列。
2.根据权利要求1所述分泌表达猪源性抗产肠毒素大肠杆菌K88菌毛单链抗体的重组乳酸乳球菌，其特征在于，所述分泌表达抗产肠毒素大肠杆菌K88菌毛单链抗体的融合序列具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述分泌表达猪源性抗产肠毒素大肠杆菌K88菌毛单链抗体的重组乳酸乳球菌，其特征在于，所述核苷酸序列中进一步包含内切酶位点Nco I、Hind III，其中Nco I为CCATGG，Hind III为AAGCTT。
4.根据权利要求1所述分泌表达猪源性抗产肠毒素大肠杆菌K88菌毛单链抗体的重组乳酸乳球菌，其特征在于，所述分泌表达抗产肠毒素大肠杆菌K88菌毛单链抗体的融合序列具有如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列。
5.一种乳酸乳球菌表达载体，其特征在于，含有分泌表达抗产肠毒素大肠杆菌K88菌毛单链抗体的融合序列，所述融合序列具有如SEQ ID No.1所示序列与如SEQ ID No.2所示的单链抗体序列，其中，如SEQ ID No.1所示序列为含有分泌信号肽USP45、分泌增强信号肽LEISSTCDA和硫氧还蛋白基因的序列。
6.根据权利要求5所述的一种乳酸乳球菌表达载体，其特征在于，所述载体为原核表达载体。
7.根据权利要求6所述的一种乳酸乳球菌表达载体，其特征在于，所述载体为pNZ8148-EZZ 3。
8.一种制备如权利要求1所述分泌表达猪源性抗产肠毒素大肠杆菌K88菌毛单链抗体的重组乳酸乳球菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)合成密码子优化的抗产肠毒素大肠杆菌K88菌毛单链抗体EZZ 3序列，所述抗产肠毒素大肠杆菌K88菌毛单链抗体EZZ 3序列如SEQ ID No.2所示；
(2)合成分泌信号肽和硫氧还蛋白的序列；
(3)将步骤(1)的抗产肠毒素大肠杆菌K88菌毛单链抗体EZZ 3基因和步骤(2)的分泌表达信号肽和硫氧还蛋白的基因酶切克隆到乳酸乳球菌载体中，构建乳酸乳球菌表达载体；
(4)将步骤(3)的乳酸乳球菌表达载体电转化入乳酸乳球菌NZ9000感受态细胞，放入培养基中培养；
(5)分离纯化步骤(4)的培养基即获得分泌表达猪源性抗产肠毒素大肠杆菌K88菌毛单链抗体的重组乳酸乳球菌。
9.根据权利要求8所述制备分泌表达猪源性抗产肠毒素大肠杆菌K88菌毛单链抗体的重组乳酸乳球菌的方法，其特征在于，步骤(2)中，设计带有分泌信号肽USP45、分泌增强信号肽LEISSTCDA和硫氧还蛋白A基因的序列如SEQ ID No.1所示；
步骤(3)中，乳酸乳球菌载体为pNZ8148。
10.提取权利要求1所述重组乳酸乳球菌分泌的猪源性抗产肠毒素大肠杆菌K88菌毛单链抗体的方法，其特征在于，将过夜培养的权利要求1所述重组乳酸乳球菌接种至培养基后，加入Nisin诱导培养5-8h，离心诱导培养后的菌液，收集培养基上清；上清中加入脱氧胆酸钠，静置；加入丙酮，离心分离，获得分泌的猪源性抗产肠毒素大肠杆菌K88菌毛单链抗体。
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