CN106008710A - 一种猪源性抗产肠毒素大肠杆菌K88 FaeG蛋白的单链抗体及其制备方法 - Google Patents

一种猪源性抗产肠毒素大肠杆菌K88 FaeG蛋白的单链抗体及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种猪源性抗产肠毒素大肠杆菌K88FaeG蛋白的单链抗体及其制备方法。本发明的抗产毒素大肠杆菌K88FaeG蛋白的单链抗体由抗体的重链可变区VH和轻链可变区VL通过短的连接肽连接而成。轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示，重链可变区VH的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。获得的抗产肠毒素大肠杆菌K88FaeG蛋白的单链抗体分子量约为28kDa，能够特异性的识别产肠毒素大肠杆菌K88，可用于阻断产肠毒素大肠杆菌K88的感染和粘附。

Description

一种猪源性抗产肠毒素大肠杆菌K88 FaeG蛋白的单链抗体及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种猪源性抗产肠毒素大肠杆菌K88FaeG蛋白的单链抗体及其制备方法，属于基因工程技术领域。
背景技术
断奶仔猪腹泻(post-weaning diarrhea，PWD)发生在仔猪断奶时或断奶后的第1周，临床上主要症状表现为腹泻、脱水、生长缓慢或停止生长，从而引起仔猪的大量死亡，给全世界养猪业造成了巨大的经济损失。超过50％断奶仔猪腹泻病例中是由特定血清型的产肠毒素大肠杆菌(ETEC)造成的。目前细菌耐药性问题越来越严重，抗生素治疗细菌感染效果不理想。单链抗体是一种基因工程抗体，以其分子量小、特异性高、穿透力强、易于改造等特点，显示了巨大的应用潜力，越来越受到人们的重视。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种猪源性抗产肠毒素大肠杆菌K88FaeG蛋白的基因工程单链抗体及其制备方法。本发明的单链抗体能够与产肠毒素大肠杆菌K88FaeG蛋白特异性结合，可用于阻断产肠毒素大肠杆菌的感染和粘附。
本发明的技术方案具体介绍如下。
本发明提供一种猪源性抗产肠毒素大肠杆菌K88FaeG蛋白的单链抗体，所述单链抗体具有如SEQ ID No：1所示重链可变区VH的氨基酸序列、如SEQ ID No：2所示的轻链可变区VL氨基酸序列和位于重链可变区VH和轻链可变区VL之间的连接肽。
优选的，所述连接肽的序列为：GGCGGTGGTGGATCCGGTGGCGGCGGGTCT。
优选的，所述单链抗体具有如SEQ ID No：3所示的氨基酸序列。
本发明还提供一种编码上述单链抗体的基因，其具有SEQ ID No：4所示的核苷酸序列。优选的，所述核苷酸序列中包含内切酶位点SfiI、NotI，其中SfiI的序列为GGCCNNNNNGGCC，NotI的序列为GCGGCCGC。
本发明进一步提供一种上述单链抗体的表达载体。优选的，其为原核表达载体。更优选的，所述原核表达载体为pCANTAB-5e-ScFv载体。
更进一步的，本发明提供一种上述单链抗体的制备方法，具体步骤如下：
(1)采用RT-PCR直接从产肠毒素大肠杆菌K88感染的猪外周血RNA中扩增出抗体编码基因的重链可变区VH基因和轻链可变区VL基因；
(2)利用SOE-PCR法将连接序列linker与重链可变区VH基因和轻链可变区VL基因相连构建猪源性单链抗体基因；
(3)将步骤(2)的猪源性单链抗体基因克隆到噬菌体抗体展示载体pCANTAB5e中，构建重组噬菌粒pCANTAB5e-ScFv；
(4)将步骤(3)的重组噬菌粒载体pCANTAB5e-ScFv电转化入E.coli TG1感受态细胞，获得猪源性噬菌体单链抗体库；
(5)将步骤(4)获得的猪源性噬菌体单链抗体库用以原核表达的产肠毒素大肠杆菌K88FaeG蛋白作为包被抗原进行噬菌体ELISA，得到的阳性克隆即为含有抗产肠毒素大肠杆菌K88FaeG的单链抗体；
(6)分离纯化步骤(5)所得阳性克隆培养产物即获得猪源性抗产肠毒素大肠杆菌K88蛋白的单链抗体。
需要说明的是,以上各步骤采用的实验材料均为正规公司获得的标准材料，所用方法均为标准试剂盒产品说明书所述方法(见相应的实施例),各步骤获得的中间产品及最后的终产品均经过多次试验证明可以重复获得，其生物学性质保持稳定一致。说明本发明各试验步骤所涉及的中间产品和终产品均可以按照本发明所陈述的发法准确获得.
本发明的技术原理是采用RT-PCR直接从产肠毒素大肠杆菌K88感染的猪外周血RNA中扩增出抗体编码基因的重链可变区(VH)基因和轻链可变区(VL)基因。利用SOE-PCR(重组链延伸反应)法将连接序列linker与VH基因和VL基因相连构建猪源性单链抗体(ScFv)基因，并将其克隆到噬菌粒载体pCANTAB5e中，phage-ELISA筛选抗ETEC单链抗体的阳性克隆，测序后使用DNAstar的Megalin进行序列分析，证明该单链抗体属于猪源性抗产肠毒素大肠杆菌K88蛋白的单链抗体。
本发明的有益效果是：抗猪产肠毒素大肠杆菌K88的基因工程抗体能与猪产肠毒素大肠杆菌K88FaeG蛋白特异性结合，能够用于猪产肠毒素大肠杆菌病K88的粘附阻断及其功能验证。
附图说明
图1为RT-PCR电泳图；M为2000bp DNA ladder marker；1为VH基因RT-PCR产物。
图2为RT-PCR电泳图；M为2000bp DNA ladder marker；1为VL基因RT-PCR产物。
图3为VH-Linker-VL PCR电泳图；M为2000bp DNA ladder marker；1为VH-Linker-VL基因PCR产物。
图4为pCANTAB5e-ScFv双酶切鉴定；M为2000bp DNA ladder marker；1、2为重组 质粒经Sfi I和Not I双酶切。
图5为重组原核表达载体pCANTAB5e-ScFv质粒图谱。
图6为噬菌体抗体库的多样性分析。
图7为抗产肠毒素大肠杆菌K88FaeG单链抗体的纯化电泳图；M为预染蛋白Marker；1为纯化后的单链抗体。
具体实施方式
实施例1猪源性抗产肠毒素大肠杆菌K88FaeG蛋白的单链抗体的制备
1、对GenBank已公布的猪抗体编码基因重链可变区序列(AF064686.1；AF064687.1；AF064688.1；AF064689.1；AF064690.1)和轻链可变区序列(KF561242.1；GQ867594.1；GQ867595.1)设计扩增抗体轻、重链的引物(表1)，其中VH1F分别与VH1R、VH2R用于扩增VH区；VL1F、VL2F、VL3F和VL1R用于扩增VL区；VH3F、VH3R用于VH基因加入酶切位点和Linker序列；VL4F、VL5F、VL6F在VL1F、VL2F、VL3F扩增的VL基因基础上加入酶切位点，VL2R用于VL基因加入Linker序列。其中，VH3F含有Sfi I酶切位点，VL 2R含有Not I酶切位点；VH3R、VL4F、VL5F、VL6F含互补的Linker序列(酶切位点和Linker序列在表1中用下划线标示出)。Linker采用(GGGGS)3，其对应的编码核苷酸序列为：GGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGATCCGGTGGCGGCGGGTCT。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
表1扩增抗体可变区的引物及其扩增片段大小
注：下划线代表Sfi I或Not I酶切位点，方框代表连接肽序列。
2、VH和VL基因的扩增
以cDNA为模版，VH1F、VH1R为引物扩增VH基因(见图1)。引物VL1F、VL2F、VL3F分别与引物VL1R配对，扩增VL基因(见图2)。PCR反应体系为25μL：2×PCR mix 12.5μL，模版cDNA 2μL，上下游引物(25μM)各1μL，ddH2O 8.5μL。扩增程序如下：95℃预变性3min；94℃变性40s，50℃退火40s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min。1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定产物并回收目的基因(根据Thermo公司提供的胶回收说明书操作)。
3、ScFv基因的获得
分别以VH和VL基因为模板，VH2F、VH2R为引物PCR扩增带有Linker的重链可变区基因，VH4F、VL5F、VL 6F分别与VL2R配对，PCR扩增带有Linker的轻链可变区基因，PCR条件同上。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定后回收目的基因(含有Linker序列的VH和VL基因)。以VH2F、VL 2R为引物，通过重组链延伸反应(SOE-PCR)将含有Linker序列的VH和VL基因连接为ScFv基因，并加入Sfi I和Not I酶切位点，VH-Linker-VL扩增产物大小为762bp(见图3)。
4、猪源性ScFv噬菌体原始文库的构建
根据常规分子克隆方法(参照J.萨姆布鲁克等主编的《分子克隆实验指南》)，ScFv基因和pCANTAB-5e载体分别经Sfi I和Not I双酶切后，琼脂糖凝胶电泳并用凝胶回收试剂盒回收酶切产物(见图4)。将ScFv基因插入pCANTAB-5e载体(北京普如汀生物技术有限公司)，构建重组表达质粒(参见图5)，并将其电转化E.coliTG1感受态细胞(北京普如汀生物技术有限公司)，连续电转化50次，构建猪源性ScFv噬菌体原始文库。挑取单克隆 菌落PCR验证其阳性率，菌落PCR验证正确的克隆进行测序分析来确定文库的多样性(见图6)。
5、ScFv的富集筛选
取纯化的原核表达的ETEC K88FaeG蛋白(本实验室制备)，用抗原包被液(50mmol/L碳酸氢钠盐溶液，pH＝9.6)稀释至5μg/mL，加入96孔板，每孔100μL，4℃包被过夜；每孔加入5％脱脂奶粉溶液200μL，37℃封闭1h，PBS洗涤3次；每孔加入100μL噬菌体ScFv原始文库，37℃孵育2h，PBS洗涤10次；每孔加入洗脱缓冲液(Gly-HCl pH＝2.2)100μL洗脱，再加入50μL(Tris-HCl pH＝9.0)进行中和。将部分洗脱的噬菌体感染对数生长期的大肠杆菌TG1，测定第一轮的捕获的噬菌体滴度，其余洗脱的噬菌体进行第二轮富集筛选；捕获的噬菌体滴度需要达到106cfu/mL；挑取最后一轮淘选的单菌落，即为抗产肠毒素大肠杆菌K88FaeG蛋白的阳性ScFv菌落。
6、ScFv的诱导表达
挑取阳性ScFv菌落至含氨苄抗生素(终浓度为100μM)和葡萄糖(终浓度为(2M)的2YT液体培养基中，37℃振摇培养，菌液OD600至0.6时感染辅助噬菌体M13KO7(北京普如汀生物技术有限公司)。12h后离心，吸取上清，即为阳性ScFv的噬菌体。阳性ScFv的噬菌体感染对数生长期的HB2151菌液(北京普如汀生物技术有限公司)，培养至菌液OD600为0.6。将菌液分为两份，分别为诱导组、和非诱导组。诱导组在菌液中加入IPTG(终浓度100μM)，于30℃诱导过夜，离心收集菌液。用PBS悬浮菌液，超声波裂解，离心后收集上清。采用Ni-NTA his band rasin纯化ScFv，纯化过程参照默克公司的《pET System Manual》。纯化后的样品进行SDS-PAGE电泳(见图7)。
实施例2抗原特异性ScFv的间接ELISA筛选
取纯化的原核表达的ETEC K88FaeG蛋白(本实验室制备)，用抗原包被液(50mmol/L碳酸氢钠盐溶液，pH＝9.6)稀释至5μg/mL，加入96孔板，每孔100μL，4℃包被过夜；每孔加入5％脱脂奶粉溶液200μL，37℃封闭1h，PBS洗涤3次；将纯化蛋白的上清50μL与4％脱脂奶粉溶液50μL混匀后加入上述孔中，37℃孵育2h，PBST洗涤3次；加入E-Tag Mouse mAb(E-tag标签鼠单克隆抗体购自RayBiotech公司)100μL(1:2000)，37℃反应2h，PBST洗涤3次；加入过氧化氢标记的羊抗鼠IgG二抗(购自美国Invitrogen公司)1000μL(1:4000)，37℃反应1h，PBST洗涤3次；TMB显色15min，2mol/L硫酸终止反应，酶标仪(美国Thermo公司读取OD450处吸光值，将设未诱导菌液上清为表达阴性对照。以P/N(P为阳性孔的OD450值，N为阴性孔的OD450值)表示，P/N≥2.1为阳性；1.5≤P/N＜2.1为可疑；P/N＜1.5为阴性。 阳性克隆经3次重复性试验验证，同时设猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪沙门菌作为对照，验证ScFv的特异性。结果证明单链抗体A能够特异性的识别产肠毒素大肠杆菌病毒，但不与传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪沙门菌发生交叉免疫反应。
实施例3
对获得的单链抗体编码基因进行测序，证明其由762个核苷酸及据此推测的254个氨基酸组成，所述核苷酸序列如SEQ ID No：4所示，所述氨基酸序列如SEQ ID No：3所示。
实施例4
检测单链抗体对产肠毒大肠杆菌K88的黏附阻断效果。将IPEC-J2细胞(本实验室保存)铺到细胞培养六孔板中，于37℃5％CO2培养箱中培养过夜。细胞生长至60％-70％时，弃去细胞培养基，用无菌PBS缓冲液洗涤3次，加入2mL无抗无血的DMEM培养基，其中两孔胰酶消化，细胞计数。将产肠毒素大肠杆菌K88稀释后按50MOI感染细胞，一组加入针对产肠毒素大肠杆菌K88的单链抗体(pCANTAB5e-ScFv)100μL(10ng/μL)，另一组加入与产肠毒素大肠杆菌K88无结合活性的单链抗体(pCANTAB5e-ScFv-negative)100μL，共同孵育2h。每隔半小时轻轻震荡30sec。2h后弃去培养基，PBS洗去未结合的大肠杆菌。然后将细胞用LB细菌培养基处理，裂解细胞，释放细胞表面的细菌。将细菌计数，计算黏附的产肠毒素大肠杆菌的数量。黏附抑制率计算公式为：(无结合活性单链抗体处理组细菌数-特异性单链抗体处理组细菌数)/无结合活性单链抗体处理组细菌数)。试验组内重复两次，组间三次，证实单链抗体具有一定的抗产肠毒素大肠杆菌K88的活性，可以用于阻断产肠毒素大肠杆菌对机体的感染和粘附(见表1)。
表1 pCANTAB5e-ScFv抗体黏附阻断试验

Claims (9)

1.一种猪源性抗产肠毒素大肠杆菌K88FaeG蛋白的单链抗体，其特征在于，所述单链抗体具有如SEQ ID No：1所示的重链可变区VH氨基酸序列，如SEQ ID No：2所示的轻链可变区VL氨基酸序列和位于重链可变区VH和轻链可变区VL之间的连接肽。
2.如权利要求1所述的单链抗体，其特征在于，所述连接肽的序列为：
GGCGGTGGTGGATCCGGTGGCGGCGGGTCT。
3.如权利要求1所述的单链抗体，其特征在于，该单链抗体具有如SEQ ID No：3所示的氨基酸序列。
4.一种编码权利要求1-3之一所述的单链抗体的基因，其特征在于，其具有SEQ ID No：4所示的核苷酸序列。
5.如权利要求4所述的基因，其特征在于，所述核苷酸序列中包含内切酶位点SfiI、NotI，其中SfiI的序列为GGCCNNNNNGGCC，NotI的序列为GCGGCCGC。
6.一种权利要求1-3之一所述的单链抗体的表达载体。
7.如权利要求6所述的表达载体，其特征在于，其为原核表达载体。
8.如权利要求7所述的表达载体，其特征在于，所述原核表达载体为pCANTAB-5e-ScFv载体。
9.一种根据权利要求1-3之一所述的单链抗体的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)采用RT-PCR法直接从产肠毒素大肠杆菌K88感染的猪外周血RNA中扩增出抗体编码基因的重链可变区VH基因和轻链可变区VL基因；
(2)利用SOE-PCR法将连接序列linker与重链可变区VH基因和轻链可变区VL基因相连构建猪源性单链抗体基因；
(3)将步骤(2)的猪源性单链抗体基因克隆到噬菌体抗体展示载体pCANTAB5e中，构建重组噬菌粒pCANTAB5e-ScFv；
(4)将步骤(3)的重组噬菌粒载体pCANTAB5e-ScFv电转化入E.coli TG1感受态细胞，获得猪源性噬菌体单链抗体库；
(5)将步骤(4)获得的猪源性噬菌体单链抗体库用以原核表达的产肠毒素大肠杆菌K88FaeG蛋白作为包被抗原进行噬菌体ELISA，得到的阳性克隆即为含有抗产肠毒素大肠杆菌K88FaeG的单链抗体；
(6)分离纯化步骤(5)所得阳性克隆培养产物即获得猪源性抗产肠毒素大肠杆菌K88蛋白的单链抗体。
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