JPS6214786A - グラム陽性菌の新規発現調節配列 - Google Patents

グラム陽性菌の新規発現調節配列

Info

Publication number
JPS6214786A
JPS6214786A JP61157771A JP15777186A JPS6214786A JP S6214786 A JPS6214786 A JP S6214786A JP 61157771 A JP61157771 A JP 61157771A JP 15777186 A JP15777186 A JP 15777186A JP S6214786 A JPS6214786 A JP S6214786A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
dna sequence
item
gram
coli
expression
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP61157771A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2632809B2 (ja
Inventor
ヘルマン　ブヤルド
スチュアート　レ　グリセ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by F Hoffmann La Roche AG filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Publication of JPS6214786A publication Critical patent/JPS6214786A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP2632809B2 publication Critical patent/JP2632809B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/832—Bacillus
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/848—Escherichia
    • Y10S435/849—Escherichia coli

Landscapes

  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はグラム陰性菌用の新規発現調節ＤＮＡ配列、そ
れらのＤＮＡ配列を含む発現ベクター、その発現ベクタ
ーにより形質転換した宿主、並びに新規発現コントロー
ルＤＮＡ配列、ベクターおよヒ形質転換株を用いて原核
細胞および真核細胞たん白質を生産する方法に関するも
のである。
従来の組換えＤＮＡの研究のほとんどはＫｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａｃｏｌｉ　（Ｆｊ、ｃｏｌｉ　）　ｙ＜用いて
行なわれてぎた。Ｅ。
Ｃ０１１は、ペリプラズマ空間を含んで二層の膜を百す
るグラム陰性細菌群に属する。Ｌ　ｃｏｌｉが生産する
たん白質の多くは、分泌するとしてもこのペリプラズマ
空間に分泌される。生細胞から外部の生育培地中に分泌
される物質はほとんどがい。
一方、　　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　　ｓｕ’ｂｔｉｌｉｓ
　　（Ｂ、　　５ｕｂｔｉｌｉｓ　　）は一層の細胞膜
全写するグラム陽性細菌群の一員である。従って、Ｂ、
θｕｂｔｉｌｉａは生育培地中に多量のたん白質を分泌
して生産する。さらに、飢５ｕｂｔｉｌｉｓ　　は非病
源性であり、内毒素で生産しないので、本細菌でたん白
質全生産させるのは有利である。その上、Ｂ、ａｕ’ｂ
ｔｉｌｉｓは今までに多く研究されており、グラム陰性
菌の中で遺伝研究の原型である。
Ｆｉ、　Ｃ０１ｉ　ｉ用いた遺伝子クローニングの一般
的手法はＢ、　５ｕｂｔｉｌｉ８にも応用できるが、Ｂ
。
５ｕｂｔｉｌｉｓにクローン化した異種遺伝子の胃用産
ｖＪヲ生産し、生育培地中に分泌させる試みは遅れてお
り、有用なりローニングおよび発現ベクターの一般的不
足により特に困難であった。この発現ベクターの不足は
、Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓにおける異種ＤＮＡの転写およ
び翻訳開始シグナルの理解の不足により、一部説明でき
る。従って、よく知られているｔｒｐ　（Ｒ，Ａ、　Ｈ
ａｌｌｅｗｅｌｌおよびｓ、　ｇｍｔａｇｅ、Ｇｅｎｅ
　　９巻２７〜４７頁［１９８０年］）、Ｉａｃ（Ｌ工
ｔａｋｕｒａら、５ｃｉｅｎｃｅ　１９３巻、１０５６
〜１０６６頁〔１９７７年］　：　Ｔ６Ｍ、　Ｒｏｂｅ
ｒｔｓら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、　Ａｃａａ−Ｓｃｉ、、
　　ＵＳＡ　７６巻、５５９６〜５６００頁［１９７９
年〕）、ＩＮ＋１）　（Ｎ、　Ｌｅｅら、Ｊ、Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ、　１４６巻、８６１〜８６６頁［１９８１
年）　：　’Ｌ、　Ｊ、　Ｚｗｉｅｂｅｌら、Ｊ　、Ｂ
ａｃｔ６ｒｉＯＩＬ１４５巻、６５４〜６５６頁（１９
８１年〕およびに、　ＮａｔａｍｕｒａおよびＭ、工ｎ
ｏｕｙｅ　、　（：ａｌｌ　１３巻、１１０９頁（１９
７９年〕）およびバクテリオファージ入ＰＩ、　（Ｅｌ
、　Ｂｅｒｎａｒａら、Ｇｅｎｅ　５巻、５９〜７６頁
［１９７９年］）の転写および翻訳システムはＢ、５ｕ
ｂｔｉｌｉｓでは作用しない。従って、３ｔａｐｈｙｌ
ｏｃｏｃｃｕｓおよび５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのよ
−うなグラム陽性菌からのいくつかの薬剤耐性遺伝子を
除いて、原核細胞および真俵細胞たん白質ｔコードする
外来遺伝子がＢａｃｉｌｌｕｓ　、特にＢ、ｓｕ’ｂｔ
ｉｌｉａ中で発現されていない（Ａ、Ｔ、　Ｇａｎｅｓ
ａｕおよび、Ｔ、Ａ、ＨＯＣｈ　ｉ集、′″Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”；　Ａ
ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　（１９３４年〕および後
述のＪ、Ｐａ１ｖａの学位論文の総説を参照）。その上
、発現量は一般的に少なハ、その結果、Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓｅｕｂｔｉｌｉｓのための有能なプロモーターを有す
るより良い発現ベクターの開発が望まｔてぎた。
現在、塩基配列が明かにされている既知のＢａｃｉｌｌ
ｕｓ　　５ｕｂｔｌｉｓプロモーターとしては、ｖｅｇ
プｏ　モー　ｐ−１ｔｍｓプロモーター、ｐｅｎ　Ｐプ
ロモーター（Ｃ，Ｐ、ｙｏｒａｎ　：ｒｒ、ら、Ｍｏ１
．　Ｇｅｎ。
Ｇｅｎｅｔｌｃｓ　１３６巻、３３９〜３４６頁［１９
８２年〕）、ｔ３ｐｏ　ＶＣプロモーター（Ｃ−Ｐ６Ｍ
ｏｒａｎ　Ｊｒ、ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１１ｓ　
　Ｒｅｅ、　９　巻、　　５９７９〜５９９０［１９８
１年〕）、ｓｐｏ　ＶＧ　７″ｏ　モー　ター　（Ｃ。
ＰｌＭｏｒａｎ　、Ｔｒ、ら、Ｃ８１１２５巻、７８３
〜７９１頁（１９８１年〕）、φ２９Ｇｌプ０モー、ｚ
−１φ２９Ｇ３１１）プロモーター、φ２９Ｇ２プロモ
ーター、φ２９Ａ１プロモーター（Ｃ，Ｔ、＋、Ｍｕｒ
ｒａｙおよびＪ、　Ｃ，Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ　、　Ｊ
、Ｂｉａｓ−、Ｃｈｅｍ−’ｌ　５７巻、１０５６〜１
０６２頁（１９８２年〕〕、ｐＭＧ　１０２プロモータ
ー、ｐＭＧ　２Ｑ　１プロモーター　ＣＭ、Ｚ、　Ｇ１
１ｍ１Ｌｎら、’Ｎｕｃ：Ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ
ｅ、９巻、５９９１〜６［］ＤＯ［：１９８１年］）、
５ｐｏ１−１５プロモーｐ　−（Ｇ、　Ｌｅｅら１．Ｔ
、　Ｍｏｌ、　Ｂ１１１゜１３９巻、４０７〜４２２頁
［：１９８０年〕〕、ｓｐａ　１−１６プロモーター（
Ｇ、　’Ｌｅｅら、Ｍｏ：Ｌｅｅ。
Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　、１８Ｑ巻、５７〜６５
頁（１９８０年〕）、およびＳＰＱ　２プロモーター（
Ｒ２Ｏ，５ｃｈｏｎｅｒら、Ｇｅｎｅ　２２巻、４７〜
５７頁Ｃ，１’９８３年〕）がある。これらの中ではＳ
ＰＯ２プロモーター（Ｒ，Ｇ、　５ｃｈｏｎｅｒら、前
述）およびｖｅｇプロモーター（ヨーロッパ特許出願公
開番号１１６４１１）のみが実際に遺伝子発現に利用さ
れている。
このような状況下で、例えはＢａｃｉｌｌｕｓ　Ｘ特に
Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓのようなグラム陽性細菌で使用で
ざるより良い遺伝子発現システムを開発することは■利
である。このような観点から、本発明の一般的に使用し
得る発現ベクターは原核細胞および真核細胞たん白質ｔ
コードする遺伝子ｆ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ、特にＢ−５ｕ
ｂｔｉｌｉｓおよび他のグラム陽性宿主中、グラム陰性
菌由来の転写開始および終了ＤＮＡ配列の調節下ではじ
めて発現できるようになるため特に重要である。
本発明は、具体的には、一方の末端付近にグラム陰性細
菌の転写開始ＤＮＡ配列を、他方の末端付近にグラム陰
性またはグラム陽性菌由来の転写終了ＤＮＡ配列を有し
、該転写開始ＤＮＡ配列と転写終了ＤＮＡ配列との中間
にグラム陽性またはグラム陰性菌由来のりざシーム結合
部位をコードするＤＮＡ配列が原核細胞または真核細胞
ポリペプチドでコードする外来遺伝子に機能的に結合し
て荷するグラム陽性細菌用発現調節ＤＮＡ配列、さらに
、５′から６′への下流方向にグラム陰性菌由来の転写
開始ＤＮＡ配列、グラム陽性またはグラム陰性菌由来の
リボゾーム結合部位をコードするＤＮＡ配列およびグラ
ム陰性またはグラム陰性細菌由来の転写終了配列を機能
単位に、公知のＤＮＡ組み換え技術により結合すること
より成る、発現調節ＤＮＡ配列の調製性全提供するもの
である。
さらに詳細には、本発明は以下の組み合わせより成るも
のである。
（ａｌ　　グラム陰性細菌由来の転写開始ＤＮＡ配列（
プロモーター）とグラム陰性細菌由来のリボゾーム結合
部位をコードするＤＮＡ配列およびグラム陰性細菌由来
の転写終了ＤＮＡ配列。
（ｂｌ　　グラム陰性細菌由来の転写開始ＤＮＡ配列（
プロモーター〕とグラム陰性細菌由来のリボゾーム結合
部位七コードするＤＮＡ配列およびグラム陰性細菌由来
の転写終了ＤＮＡ配列。
（Ｃ）グラム陰性細菌由来の転写開始ＤＮＡ配列（プロ
モーター）とグラム陰性細菌由来のりざシーム結合部位
をコードするＤＮＡ配列およびグラム陰性細菌由来の転
写終了ＤＮＡ配列、および＋（Ｌ）　　グラム陰性細菌
由来の転写開始ＤＮＡ配列（プロモーター）とグラム陰
性細菌由来のり、ボゾーム結合部位をコードするＤＮＡ
配列およびグラム　　　□陽性細菌由来の転写終了ＤＮ
Ａ配列。
転写開始ＤＮＡ配列に関連して用いている細菌由　　　
□来というのは（ａｌ自然界に存在する細菌の転写開始
配列および、そのような転写開始ＤＮＡ配列の一個また
は数個のヌクレオチドおよびリピートの！％或いは逆転
を含むその機能的変異種およびｔｂ＋ｂｌ的に合成した
（合成）転写ＤＮＡ配列で細菌で転写開始可能なものよ
り成る。
りざシーム結合部位をコードするＤＮＡ配列に関連して
用いている細菌由来という言葉は、（ａ）自然界に存在
する細菌のリボゾーム結合部位をコードするＤＮＡ配列
および一個又はいくつかのヌクレオチドの置換または逆
転を含むその機能的変異種、および＋１）ｌ細菌中で翻
訳開始可能な化学的に合成しｆｃ（合成）リボゾーム結
合部位をコードするＤＮＡ配列を含む。
転写終了ＤＮＡ配列に関連して用いられている細菌由来
という意味は、（ａ）自然界に存在する細菌転写終了Ｄ
ＮＡ配列および、その転写終了ＤＮＡ配列の一個または
いくつかのヌクレオチドのａ換あるいは逆転を含′０機
能的変異種、および（１）ｌ化学的に合成しｆｃ（合成
）転写終了ＤＮＡ配列で細菌中で転写を終了することの
出来るものを含Ｃ０ 好ましい適用においては、原核細胞または真核細胞のた
ん白質をコードする遺伝子がＢａｃｉｌｌｕｓ、特にＢ
、　５ｕｂｔ：Ｌｌｉｓ　、および他のグラム陽性菌中
で大腸菌ファージで５またはＴ７起源のプロモーターお
よび翫ｃｏｌｉ起源のターミネータ−の転写調節下で発
現できる。
本発明に於いてＴ５およびＴ７プロモーターは大腸菌フ
ァージで５および１７群のｒツムに存在するプロモータ
ー機能を仲介するＤＮＡ配列およびそのような配列由来
の機能的な組合せと定義される。
本発明に於いて有効なＴ５プロモーターはファージの１
前切期”、′初期”および”後期”発現のプロモーター
であり、物にＲ０Ｇθｎｔｚのハイデルベルグ大学学位
論文［１９８４年〕に記載される以下の配列である。
ＰＪ５ＸＮ２５＼　”Ｎ２５＼ＰＤ／Ｂ　２０　％　　
ＰＧ！５＼　ＰＧ２０＼ＰＧ２２　Ｘ（）２５　％　　
Ｐ（）２ａ　％　　ＰＫ２８ａＸＰＫ２８ｂ本発明に於
いて有効なで７プロモーターはファージの１初期”発現
プロモーター、特にＡ１およびＡ２プロモーター（Ｄ、
　Ｋ、　ＨａｗｌｅｙおよびＷ−Ｄ。
ＭｃＣｌｕｒｅ　、　Ｎｕｃｌａｉｃ　Ａａｉｄｓ　Ｒ
ｅ８．１１巻、２２３７〜２２５５頁［１９８３年〕）
である。
上述の好ましいＴ５またはＴ７ｆロモーターのいくつか
のＤＮＡ配列を下の第１我に示す。
第１表は本発明で用いられるプロモーターのヌクレオチ
ド配列を示す。−５０から＋１０までの配Ｚｌ示し、−
３５のヘキサマーおよびその上流ＯＡ：Ｔ−豊富な領域
を扉で囲んであり、−１０ヘキサマーは上線を印しであ
る。
第　　１　　表 宿主中での翻訳開始に必要なＩＪ　ｆシーム結合部位を
コードするＤＮＡ配列は、（１）アミノ酸メチオニンの
コドンであるＡＴＧ翻訳開始コドン、（２）シャイン　
ダルガーノ（ＳＤ　）　配列として知られる１（５８リ
ボゾームＲＮＡの３′−末端の塩基に相応する４〜１２
１基の配列、および（３）リンカ−領域として知られる
これら２つの間の１基配列とがら成る。
未発で使用され、また本発明の一部を成しているリボゾ
ーム結合部位をコードするＤＮＡ配列はグラム陽性菌ま
たはグラム陰性菌由来でＢａｃｉｌｌｕｓ。
特にＢ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ　、および他のグラム陽性
菌中で機能することの出来るリボゾーム結合部位をコー
ドするＤＮＡ配列より調製されるもので、既知のいくつ
かのものを含ｆ　（Ｊ、　Ｒ，ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら
、Ｊ。
Ｂｉｏｌ、ｃｈｅｍ、　２５６巻、１１２８３〜１１２
９１頁（１９３１年）　；　Ｃ−Ｐ、　Ｍｏｒａｎ　Ｊ
ｒ−ら、Ｍｏｌ。
Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１８．１５巻、３３９〜
３４＜５頁［１９８２年］）。
しかしながら、本発明で使用される好ましいリボゾーム
結合部位金コードする配列は下記の第２表に示す式で表
わされる可動性リボゾーム結合部位をコードする甘酸の
Ｉ）ＮＡ配列（８ＲＢＳ　）である。
第２表 コｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　５１３１　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　Ｓ＋コ＋　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５１これらの
Ｓ’ＲＢ８は原俵細胞または真核細胞ポリペプチドをコ
ードするいかなる遺伝子とも連動してＢａｃｉｌｌｕｓ
、特にＢ、　ａｕｂｔｉ：Ｌｉｅ　、および他のグラム
陽性菌中で機能できるように構築されている。
そのような機能を保持することで５ＲＢＳは“移動可能
”と言える。
転写終了ＤＮＡ配列はグラム陰性細菌由来のターミネー
タ−でＢａｃｉｌｌｕｓ、特にＢ−５ｕｂｔｉｌｉｓ、
および他のグラム陽性菌で機能できるものから調製され
る。本発明で使用される好ましいグラム陰性菌ターミネ
ータ−としては、１！ｉ、　ｃｏ１ｉ由来のターミネー
タ−ｔｏＣＭ、Ｈｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｐｒ０ｃ、　Ｎ
ａｔｌ。
Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　　７３巻、７１７〜７
２１頁［１９７６年］）、Ｔ１、Ｔ　２（Ｊ−Ｂｒｏａ
ｉｕｓ　ら、：ｒｏＭｏｌ、Ｂｉｏｌ、　１４８巻、１
０７〜１２７頁［１９８１年〕）およびＴ　７　（、Ｔ
、Ｊ、　ＤｕｎｎおよびＰ、　Ｗ、　５ｔｕｄｉｅｒ、
　　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　ｐｅｅ、　８巻、２
１１９〜２１６２頁（１９８０年〕）がある。
本発明の転写開始ＤＮＡ　ｒｉｒ：、列、移動可能なリ
ボゾーム結合部位をコードする配列、および転写終了配
列は１、例えばヌクレオチド合成器のように相当するＤ
ＮＡ配列の全化学合成を含むＤＮＡ化学でよく知られる
方法により得られる。
本発明はさらに原核細胞および真核細胞たん白質全コー
ドする遺伝子を形質転換したＢａｃｉｌｌｕａ、特にＢ
、θｕｂｔｉｌｉｓ　、或８偏のグラム陰性菌中で発現
するよう指示できる以下の配列を含七発現ベクターをも
包含する：（ａ）転写の下流方向に向って次の単位ｆｆ
ｉ！するグラム陽性細菌発現調節ＤＮＡ配列：少なくと
も一個のグラム陰性細菌由来の転写開始ＤＮＡ配列がグ
ラム陰性菌又はグラム陰性菌由来のリボゾーム結合部位
をコードするＤＮＡ配列と結合し、任意に原核細胞また
は真核細胞ポリペプチドをコードする外来遺伝子、およ
び転写終了ＤＮＡ配列、（ｂ）少なくとも一個のベクタ
ーの複製開始点、および（Ｃ）少なくとも一個の抗生物
質耐性遺伝子。
マタこのような発現ベクターの製造方法をも包含する。
転写開始ＤＮＡ配列はグラム陰性菌プロモーターから得
られる。使用される好ましいグラム陰性菌プロモーター
は第１衣ｌ￥む有する大腸菌ファージＴ５または大腸菌
ファージＴ７プロモーターである。りざシーム結合部位
をコードするＤＮＡ配列は、グラム陰性菌またはグラム
陰性菌由来でＢａｃｉ：Ｌｌｕｅ、特にＢ、　５ｕｂｔ
ｉｌｉｓ　、および他のグラム陽性菌中で機能すること
のできるＩＪ　ｆｆシーム結合部位をコードするＤＮＡ
配列より′ｖ！４シされるもので、既知のものを含ｆ　
（Ｊ、Ｒ−ＭＣＬ＆ｕｇｈｌｉｎら、前述；　Ｃ，Ｐ’
、　Ｍｏｒａｎ　Ｊｒ、ら、Ｍｏｌ、　Ｇｅｎ、　Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ、　　　□１８６巻、３６９〜６４６頁（
１９８２年〕）。
リボゾーム結合部位をコードする好ましいＤＮＡ配列は
第２表に示す式を頁する、リボゾーム結合部位をコード
する移動可能な合成りＮＡ配列である。
転写終了ＤＮＡ配列は、グラム陰性細菌由来でＢａｃｉ
ｌｌｕｓ、特にＢ、　ｅｕｂｔｉｌｉｆ３　、および他
のグラム陰性菌中で機能可能なターミネータ−より得ら
れる。本発明で使用される好ましい転写終了ＤＮＡ配列
としてはグラム陰性Ｅ、ｃｏｌｉターミネータ−ｔＯ（
Ｍ−Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｐｒ０Ｃ，Ｎａｔｌ、　Ａ
ｃａａ、　Ｓｃｉ。
［Ｔ８Ａ　７３巻、７１７〜７２１頁Ｃ１９７６年〕、
Ｔ　Ｉ　、Ｔ　２（Ｊ、　Ｂｒｏｄｉｕｓら、Ｊ、　Ｍ
ｏ１．　Ｂｉｏｌ。
１４８巻、１０７〜１２７負［１９８１年〕）、および
Ｔ　７　（Ｊ、　Ｌ　ＤｕｎｎおよびＦ、Ｗ−５ｔｕａ
ｉｌｒ　。
１（ｕｃｌθｉｃ　Ａｃ１５　Ｒｅ８．８巻、２１１９
１２１３２頁［１９８０年〕）。複製開始点はグラム陰
性菌および／またはグラム陰性菌由来のものであり、従
って本発明の発現ベクターはシャトルベクターとして使
用可能であり（Ｓ　、　Ｄ、　Ｅｈｒｌｉｃｌｒ　、　
Ｐｒｏｃ　。
Ｈａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　７５巻
、１４３３〜１４６６員（１９７８年］　；　Ｊ、　Ｋ
ｒｅｆｔら、Ｍｏｌ。
Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１６２巻、５９〜６７頁
〔１９７８年］　；　Ｂ、　Ｍｉｃｈｅｌら、Ｇｅｎｅ
１２巻、１４７〜１５４頁Ｃ１９８０年〕）、ｗ−ｃｏ
ｌｌ　オヨヒＢａｃｉ１１ｕｓ　Ｘ％にＢ、５ｕｂｔｉ
ｌｉｓの両者で複シ可能である。リボゾーム結合部位を
コードする合成りＮＡ配列を大腸菌ファージＴ５のプロ
モーターに結合して使用し、Ｆｉ、　ｃｏｌｉおよびＢ
、５ｕｂｔｉｌｉａの両方で複製可能（シャトルベクタ
ー）な好ましい発現ベクターは実施例４および５、並び
に実施例７〜１０に記載されている。
本発明の発現ベクターは文献で公知のＤＮＡ組換え技術
を用いて構築され（Ｍａｎｉａｔｉ、ｓらの実験マニュ
アル″Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　ＣＣｌ０ｎｉｎ”、Ｃｏ
１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　　ｂａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ、　　１９８２年、参照）、以下のステップより成
る。
（ａｌ　　既存のクローニングベクターに転写下流方向
に少なくとも一個のグラム陰性菌由来の転写開始ＤＮＡ
配列と、グラム陰性菌またはグラム陰性菌由来のリボゾ
ーム結合部位をコードするＤＮＡ配列とを挿入し、 （１）ｌ　　該クローニングベクターに少なくとも一個
の制限酵素切断部位を該リボゾーム結合部位をコードす
るＤＮＡ配列に隣接して組み入れ、（Ｃ１該リボゾーム
結合部全コードするＤＮＡ配列に隣接する該制限酵素部
位に、原核細胞ま友は真核細胞ポリペプチドをコードす
る少なくとも一個の外来遺伝子を挿入し、そして、 （（ｉｌ　　原核細胞または真核り砲ポリペプチドをコ
ードする該外来遺伝子の下流方向に少なくとも一個の転
写終了ＤＮＡ配列を挿入する。
本発明の発現ベクターを構築するために用いるベクター
は適当ないかなるベクター、コスミド、或いはファージ
で形質転換でき、宿主微生物中でそれ自体複製可能なも
のである。Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓおよび／またはＢ、
ｃｏｌｉでのクローニングに適したプラスミドは、例え
ばＭａｎｉａｔｉｅらの実験マニュアル″’　Ｍｏ１ｅ
ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　’　（前述）およびＪ。
Ｐａ１ｖａの学位論文（ヘルシンキ大学）、１９８６年
に記載されている。本発明の発現ベクター全構築するた
め使用されるプラスミド由来の好ましいベクターはｐＶ
Ｂ　１１　［］　（Ｔ−、Ｔ、　Ｇｒｙｃｚａｎら、Ｊ
。
Ｂａｃｔｅｒｌｏｌ、１６４巻、３１８〜３２９頁［１
９７８年〕）、ｐＤｓ　５およびｐＤｓ　６　ＣＤ、５
ｔｕｅ’ｂｅｒら、ｚ）ｌＢｏ　５％　　３巻、３１４
３〜３１４３員Ｃｌ９８４年〕）である。
ｐ６０２およびｐ２５のプラスミドは本発明のプラスミ
ド性シャトルベクターの具体例である。
それらの調製は笑施例１〜５および７〜１０により詳細
に記載されている。ｐ２５群の特に好ましいプラスミド
を含有するＢ−５ｕｂｔｉｌ−１ｓ菌株（ｐ２５ＲＢｓ
Ｉ　：１）２５ＲＢＳＩＩ　；１）２５　　ＲＢＳｎで
形質転換Ｌ　タＢ、　５ｕｂｔｉｌｉ日ＢＲ１５１）は
プツチ７　／ｒ’　５ｐｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕ
ｎｇＷｏｎｌ、（ｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ　（Ｄ
ＳＭ　）に１９８５年６月２０日、それぞれ寄託番号Ｄ
ＳＭ　３３５０、ＤＳＭ　３３５１およびＤＳＭ　３３
５２として寄託されている。
９６０２群の特に好ましいプラスミドを含■するＢ−５
ｕｂｔｉｌｉｓの菌株（ｐ６０２／１８　：ｐ６０２／
１９　；ｐ６０２／２０　：ｐ６０２／２１で形質転換
し７ＣＢ−５ｕｂｔｉｌｉ日ＢＲ１５１）はデツチンデ
ンの　Ｄｅｕｔ日ｃｈｅ　　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　　ｖｏ
ｎ　　ＭｉｋｒＯＯｒｇａｎｉＥｉｍｆ３ｎ（ＤＳＭ　
）に１９８６年５月１４日付けで、それぞれ寄託番号Ｄ
ＳＭ　３７２３、ＤＳＭ　３７２４、ＤＡＭ６７２５お
よびＤＳＭ　３７２６として寄託されている。
本発明の発現ベクターに挿入される外来遺伝子はｉｎ　
７１ｖＯおよびｉｎ　ｖｉｔｒｏで原核細胞または真核
細胞！リペプチドをコードする各Ｉ遺伝子（ＤＮＡ遺伝
子またはＲＮＡ遺伝子のＤＮＡコぎ−）から選ぶことが
できる。例えば、遺伝子は酵素、ホルモン、免疫副筒、
仇ウィルス性、または抗癌性を頁するポリペプチド、抗
体、抗原およびその仙の原核細胞または真核細胞由来の
ポリペプチドをコードする。本発明で使用する好ましい
外来遺伝子ハＬ　ｃｏｌｉのクロラムフェニコール・ア
セチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ　）およびマウスジ
ヒドロ葉酸レダクターゼ（ａｈｆｒ　）の遺伝子である
。
本発明による改良発現調節システムを用いて発現され得
るたん白質の例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、クロラ
ムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、マラリア
表面抗原、工Ｌ−２、インタフエロンアルファ、ベータ
、ガンマのようなリンフ才力イン類、インシュリンおよ
びインシュリン前駆体、成長ホルモン、ティシュ・ゾラ
スミノーデンアクチベーター、ヒトレニン或いはＨＴ’
ＩＪＶ−■たん白などがある。
本発明の発現ベクター、特にシャトルベクターを用いて
原核細胞または真核細胞たん白をコードする遺伝子を発
現する方法はよく知られている（　Ｍａｎｉａｔｉｓら
、前述）。それは、目的のＤＮＡ配列が本発明の発現調
節ＤＮＡ配列に機能的に挿入されている発現ベクターで
適当な宿主を形質転換し、生育の適当な条件下で宿主を
培養し、培養物から目的の、にリペプチドを単離するこ
とより成る。本技術に熟練している者は本発明の範囲か
ら出ることなく、個々の遺伝子の発現に最も効率のよい
公知の方法を選ぶことができる。
本発明で用いる特別の宿主の選択はこの分野で認められ
ている多くの要因に依存している。例えば、選んだ発現
ベクターとの適合性、雑種プラスミドによりコードされ
るたん白質の毒性、目的たん白質の回収の容易さ、発現
の特徴、生物安全性およびコストなどである。これらの
一般的指針の範囲内で有用な宿主細菌はグラム陰性およ
びグラム陽性細菌、特にに、ｃｏｌｉおよび１３．ｓｕ
’ｂｔｊ−’ｌｉｓ菌株である。本発明における最も好
ましい宿主細組は　Ｂ、　　５ｕｂｔｉｌｉｓ　　ＢＲ
１５１（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ＧｅｎｅｔｉｃＳｔｏｃ
ｋ　ＣｅｎｔｅｒにおいてＢＧＳＣＮｏ、　１　Ａ　４
０として保存されている）である。しかしながら、他の
Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ菌株、例えばＢ、　５ｕｂｔｉ
ｌｉｓ　ＢＤ　ｌ　７　Ｑ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｇｅｎ
ｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　（：ｅｎｔｅｒにてＢＧＳＣＮ
ｏ。
１Ａ４２として保存）およびＢ−ｅｕ’ｂｔｉｌｉｓ　
：ＪＨ６４６（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５
ｔｏｃｋ　（：ｅｎｔｅｒにてＢＧＳＣＮＯ０１Ｓ９と
して保存）なども使用できる。
以下に続く笑施例は以下の図面を参照してより詳細に本
発明を説明するものである。
制限エンドヌクレアーゼは以下のように略称した。
”　：”ＣＯＲＩ　：　Ｓｍ：　Ｓｍａ　Ｉ　；　Ｂ：
Ｂ＆ｍＨＩ：　Ｓ　：８ａｌ　Ｉ　’、　Ｐ　：Ｐｅｚ
　Ｉ　；Ｈ”、　Ｈｌｎｄ　ｌ　”、　Ｘｈ　：”ｈｏ
　ｌ：　ｘ：　Ｘｂａ　１　：　Ｋ：　Ｋｐｎ　Ｉ　＋
　ＰＶ　：　ＰＶｌｌ　ｎ　；　Ａ　”。
Ａｃｅ　Ｉ　；　Ｓｐ　：　Ｓｐｈ　Ｉ　；　Ｂｇ　：
　ＢｇＩＩＩ　：　Ｄ：Ｄｒａｌその他の略称は以下の
通りである。
Ｋａｎ　：カナマイシンヌクレオチジルトランスフエラ
ーゼの構造遺伝子； ｃａｔ　：　クロラムフェニコールアセチルトランスフ
ェラーゼの構造遺伝子： ｄｈｆｒ　：マウス　ジヒドロ葉酸レダクターゼの構造
遺伝子： ｂｌａ　：ベータ・ラクタマーゼ構造遺伝子；ＣＡＴ：
クロラムフェニコールアセテルトランスフエラーゼたん
白： ＤＨＦＲ：　ジヒドロ葉酸レダクターゼたん白；ｏｒｉ
＋ニゲラム陽性菌複製開始点； ０ｒｉ−ニゲラム陰性園複製開始点； ５ＲＢＳ　：りざシーム結合部位をコードする可動合成
りＮＡ配列； ＲＢＳ　：　ＩＪボゾーム結合部をコードするＤＮＡ配
列；ＳＤ：シャインダルガノ配列； ３０％　　ＴＩ、Ｔ２、Ｔ７：転写ターミネータ−ｔｏ
、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ７；および （Ｈ）　：　）＋ｉｎｄ　ｌｌの接着末端ｆ　ｇｉｎｄ
　１１末端に結合して１ｉｎａ　ｍ部位をつぶしたもの
。
１土１ニゲラム陽性菌の（０ｒｉｔ）およヒグラム陰性
菌の（ｏｒｉ−）複製開始点と共にカナマイシン（ｋａ
ｎ　）およびクロラムフェニコール薬剤耐性マーカーを
含む基本的なＥ、ｃｏ］Ｊ／Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓシ
ヤトルベクターｐ　６０２１５の構築を示す。この結果
、本プラスミドはＲ，ｃｏｌｉおよびＢ。
５ｕｂｔｉｌｉｓの両者でカナマイシン耐性を示す。ク
ロラムフェニコール耐性はＥｃｏ　Ｒ１（Ｒ）とＨｉｎ
ｄｌ（Ｈ）部位の間にプロモーターを含むフラグメント
　。
を挿入することで出現する。こ＼で示すＥ、　ｃｏｌｉ
ｃａｔ遺伝子は天然のりポゾーム結合部位全コードする
ＤＮＡ配列を有する。
第２図ニ一般の発現ベクターｐ６０２／７およ　　。
びｐ６０２／２５、並びにリボゾーム結合部位を　　（
コードすルＤＮＡ配列５ＲＢＳＩおよび５ＲＢＳＩＩ　
’ｔそれぞれ有するベクターｐ　６０２／　７　ＲＢＳ
Ｉおよび　　　”ｐ　６０２／７　ＲＢＳＩＩの構築を
示す。リボゾーム結合部位ヲコートするＤＮＡ配列５Ｒ
Ｂｓ１オヨび５ＲＢＳＩＩ　　　’を挿入することにょ
シ、野生型のＣａｔリボゾーム　　。
結合部−ＤＮＡ配列からの天然のＣＡＴたん白とそれ　
。
ぞれ５ＲＢＳＩ又は５ＲＢＳＩＩに由来する融合ＣＡＴ
たん白７）２ａのＣＡＴたん白質をＥ、　ｃｏｌｉ中で
合成するようになる。Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ中ではり
ポゾーム結合部立−ＤＮＡ配列、５ＲＢＳｌおよび５Ｒ
ＢｓＩｌに起因する融きＣＡＴたん白のみ生産される。
ｐ６０２／７、ｐ６０２／２５、ｐ　６０２／７　ＲＥ
ＳＩおよびｐ　６０２／７ＲＢＳｌの全てのプラスミド
共Ｅ、　ｃｏｌｉおよびＢ。
５ｕｂｔｉｌｉｓの両方でクロラムフェニコール耐性を
云す。
３シしり、：大腸菌ファーゾＴ５プロモーターＰＧ２５
をリボゾーム結合部位−合成りＮＡ配列５ＲＥＳＩ。
３ＲＢＳ■のそれぞれと結合して含有しているベクター
ｐ　２５　ＲＢＳＩ、　ｐ　２５　ＲＢＳ［ｌおよびｐ
　２５＊ＲＢＳＩ１９構築を示す。ベクターｐ　２５　
ＲＢＳＩを官有するＢ、　５ｕｔ）ｔｉｌｉ１９の細胞
は５ＲＢＳＩのすぐ下流付近に出処するたん白とＰＧ２
５のすぐ近くのリボゾーム結１部位に由来するものと二
つの融合ＣＡＴたん白質を合成する。後者のリボゾーム
結合部位に由来す５たん白金酸はＳＲＢ■の上流に転写
終了コドンをｋれることによシ除去され、その結合ｐ　
２５＊ＲＢＳＩＩベクターが得られる。ｐ２５＊ａＢｓ
ｍを含有する細胞は５ＲＢＳＩＩＫ由来する一つのＣＡ
Ｔたん白を合成する。
第４図二発現ベクターｐ　２５　ＲＢＳＩ　、　ｐ２５
ＲＢｓＩｌおよびｐ　２５＊ＲＢＳＩＩ　＠含有するＢ
　、　　５ｕｂｔｉｌｉｓ　ＢＲ１５１で生産される全
たん白質を示す。５ＲＢＳｌまたは５ＲＢＳＩＩに基づ
いて合成されるＣＡＴたん白質の位ｉを′″ＣＡＴ”で
示し、ｐ２５ＲＢＳＩＩを有する細胞のもう一つの融合
ＣＡＴたん白を“ｆＣＡＴ”で示した。ＬＹ３は細胞融
解を補助するため添加したりゾチームの位置七示す。
第５図：ベクターｐ　２５　ＲＢＳＩ、　ｐ２５　ＲＢ
ＳＩＩおよびｐ　２５＊ＲＥＳ１１２含有するＢ、　５
ｕｂｔｉｌｉｓ中でのＣＡＴ　７’ｃん白質合成を模式
図により示する。挿入した翻訳停止コドン（４）によｌ
）　ＰＧ２５ＲＢＳからｃａｔ遺伝子までの翻訳継続を
阻止できる。ｐ２５　ＲＢＳＩＩではそのようなフンー
ムの合った停止コドンが存在しないためＣａ／ｌたん白
はＲＢＳおよび５ＲＢＳＩＩの両方から生成する。ｐ２
５＊ＲＢＳＩＩにおけるＨ１ｎｄ１部位の修飾の結果、
５ＲＢＳ［のみから単一のＣＡＴ７’（ん白を生成する
。
第６図：第１表に示したプロモーターのインビトロ系転
写解析を示す。”ＥＣ″および”Ｂｓ　”はそれぞれＥ
、　ｃｏｌｉおよびＢ、　５ｕｂｔ、１ｌｉｓ　ＲＮＡ
ポリメラーゼによる解析を表わし、数字は転写全行なわ
せた塩濃度を示す。プロモーターをクローン化したベク
ターで’　ｏｖｉ　’およびｌ　ｂ　ｌａ　１転写物が
生じている。Ｉ　ｖ　ｅ　ｇ　Ｉと示した列はＢ、　５
ｕｂｔ、１ｌｉｓ　ｖｅｇプロモーター（Ｓ、Ｆ、Ｊ、
　Ｌｅ　ＧｒｉｃｅおよびＡ、Ｉ、。
５ｏｎｅｎｓｈｅｉｎ、　　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ
、、　　１６２巻、５５１〜５６４頁、１９８２年）の
みの転写物を示す。
横にｌ　ｖｅ　ｇ　ｌと示しであるのは円部標準のｖｅ
ｇプロモーターＤＮＡである。ＭはＨｐａｌｌで切断し
たｐＢＲ３２２の分子量マーカーである。本研究で対応
する大きさのバンドのみ示した。Ｔ５プロモーターＰＫ
ｆｓａ　／　ＰＫｚｓｂは両プロモーターが同一の制限
断片上に存在するため、これらのプロモーターからの転
写物には新しい２つのものが認められる。
第７図：大腸菌ファージプロモーターＰＮ２５が合成リ
ボゾーム結合部位−ＤＮＡ配列ＲＢＳｆｌ、９Ａ（ｐ６
０２／１８）またはＲＢＳＩＩ、３人＋５Ａ（ｐ６０２
／１９）に機能的に結合して有しているシャトルベクタ
ーｐ６０２／１８およびｐ　６０２／１９の構築を示す
。いずれの場合も合成リボゾーム結合部位−ＤＮＡ配列
を挿入することによシ合成リボゾーム結合部位のすぐ近
くよシ融合ＣＡＴ７ｊん白の合成を開丸し、ｃａｔ遺伝
子の天然の翻訳停止コドンで停止するようになる。ｐ６
０２／１８およびｐ６０２／１９の両プラスミド共Ｂ、
　５ｕｂｔｉｌｉ、ｓでクロラムフェニコール耐４＆に
示ｆ。
第８図：大Ｐ！に回７アージプロモーターＰＮ２５が合
成リボゾーム結合部位のＤＮＡ配列ＲＢＳＩＩ　（ｐ６
０２／２０）またはＲＢＳＩＩ、　　３　Ａ＋　５　Ａ
　（ｐ６０２／２１）に機能的に結合して有しているシ
ャトルベクターｐ６０２／２０およびｐ６０２／２１の
構築を示す。いずれのプラスミドの場合も、合成リボゾ
ーム結合部位−ＤＮＡ配列を挿入することによシ、合す
るようになる。ｐ６０２／２０またはｐ　６０２／２１
を含有するＢ、　５ｕｂｔｉｌｉｓの細胞は１０μ９／
７４６のトリメトプリムに耐性である。
第９図ニブラスミドル６０２／１８．ｐ６０２／１９、
ｐ６０２／２０およびｐ６０２／２１を含有するＢ、　
５ｕｂｔ、１ｌｉｓ　ＢＲ１５１株によシ合成される全
たん白質を示す。’Ｃｅ１ｌ’と示しであるのはプラス
ミドを含有しない細胞での几ん白金酸を表わす。対照と
してｐ　２５＊ＲＢＳＩＩからのＣＡＴ合成も示シテア
ル。融合ＣＡＴ　ｆｃン白ＣＡＴ＊（ｐ　６０２／１８
およびｐ６０２／１９由来）の位置および融合ＤＨＦＲ
ｆｃん白（ｐ　６０２／２０およびｐ６０２／２１から
）の位置は図示しである。
一般的な方法 別に記載していない限カ、以下の方法は前述のＭａｎｉ
ａｔ＋ｉＳらにより記載されている通り行なった；６７
℃に於ける制限エンドヌクレアーゼ消化（１００〜１０
１頁）；６７℃に於ける細菌アルカリフォスファターゼ
（ＢＡＰ　）による脱りん酸化（１３３〜１３４頁）　
；　ＣａＣｊ２処理Ｅ、　ｃｏｌｉａＢｉｏｉ細胞への
ＤＮＡの形質転換および１００μｇ／ｍｌのアンピシリ
ン含有ＬＢ培地を含む寒天平板上での形質転換株の選択
（２５ｏ〜２５１頁）；ＤＮＡプラスミドの調製（８６
〜９４頁）ニ一本鎖ＤＮＡ末端の１４℃に於けるＤＮＡ
ポリメラーゼＩの大断片（フレナラ断片）による光填（
１１３〜１１４頁）；アガロスプルによるＤＮＡの分離
および断片の精製（１６４〜１６７頁）；サブクローニ
ングへの合成りＮＡ　Ｉ）ンヵーの使用（６９２〜６９
７頁）；およびＳＤＳ　／ポリアクリルアミドデル電気
泳動（６４８〜６４９頁）。
Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ細鷹へのＤＮＡの形質転換はＳ
。
Ｃｏｎｔｅｎｔｅおよびり、　Ｄｏｂｎａｕ　Ｋよジ記
載されている通り（Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　ｏｅｎｅｔｔ
ｃｓ＋　１６７巻、２５１〜２５８貞〔１９７９年〕）
行なった。
Ｆｉ、　ｃｏｌｉおよびＢ、　５ｕｂｔｉｌｉｓのＲＮ
Ａポリメラーゼによる試験管同転写は欠の組成を有する
５０μｊの反応液中で行なった＝４ｏｍＭトリス／塩酸
、ｐＨ７，９；　１０　ｍＭＭｇｃｔ２；　０．１　ｍ
Ｍ　ＤＴＴ　；　０．１　ｍＭＥＤＴＡ　；　５０〜２
００　ｍＭＮａＣＪ　；　１Ｑ％（ｖ／ｖ）クリ−ｉ！
：ｌ：Ｉ−／ｌ’；　１５０　ＡＭｆｉ−ＴＰ、　　Ｇ
ＴＰ、　　ＣＴＰ　；　５０μＭＵＴＰ　　；　　５μ
Ｃｉ　３２Ｐ　−ＵＴＰ　（〜３０００　Ｃｉ　／凰ｍ
ｏｌｅ、アマ−ジャム・プフラー、ブラウンシュバイク
）；００口５ｐｍｏｌｅエンドヌクレアーゼ消化ＤＮＡ
　：　０．２５　ｐｍｏｌｅ　ＲＮＡポリメラーゼ。反
応はＲＮＡポリメラーゼの添加により開始し、３７℃１
〜５分間行なった。合成され７ｔ　ＲＮＡはエタノール
沈でんヲ＜シ返え丁ことによシ単離し、８Ｍ尿素含有の
５または８チポリアクリルアミド製０．４３冨厚さの高
圧デル電気泳動で分析した。電気泳動後、ゲルを乾燥し
、コダック社製Ｘ　−ＯＭＡＴ　ＸＡＲ５のフィルムを
用いて室温でオートラジオグラフィーに供した。
実施例　１ シャトルベクターｐ６０２１５の構築 （１）２μｇのプラスミドｐＵＢ１１０　ｋ制限酵素Ｐ
ｖｕＩＩで完全消化する。８塩基Ｋｐｎｌ　リンカ−ｔ
　Ｐｖｕ■末端に結合する。結合後、ＤＮＡ　’ｊＨＫ
ｐｎｌお：びＥｃｏＲＩで完全消化する。得られたＤＮ
Ａ消化物″ｆｃ１μ９７ｍ１のエチジウムプロミド含有
の低融解１％アガロースデルで電気泳動にかげる。７０
Ｖで２時間電気泳動後、ＤＮＡバンドを螢光で確認し、
３．５に１）のバンマヲゲルから切シ出す。この３．５
　Ｋｌｌ、のＥＣＯＲ１／　Ｋｐｎｌ断片を低温融解ア
ガロースでさらに精製する。
（ｎｌ　　プラスミドｐＩ）３５５μ、！ｉ’　ｋ　Ｄ
ｒａｌで完全消化し、Ｄｒａｌ末端に放射活性のＫｐｎ
ｌオクタマーリンカ−全結合する。結合生成物をさらて
制限酵素ＫｐｎｌおよびＸｂａｌで完全消化し、６％ポ
リアクリルアミドデル電気泳動で分離する。およそ１．
２に１：＋のＫｐｎｌ　／　Ｘｂａｌ断片をオートラジ
オグラフィーで位置の確認し、デルよシ切シ出す。Ｋｐ
ｎｌ　／　Ｘｂａｌ断片をさらにアクリルアミドデルで
精製する。
（■）５μＩのプラスミドｐＤｓ５を制限エンドヌクレ
アーゼｇｃｏＲ１およびＸｂａｌで完全消化し、１μｇ
　（／ゴのエチジウムクロリド含有の１％低温融解アガ
ロースデル電気泳動で分離する。電気泳動後、ＤＮＡバ
ンドを螢光で確認し、およそ９００　ｂｐのＥｃｏ　Ｒ
１／　Ｘ’ｂａｌ断片を切シ出す。ＥｃｏＲｌ　／　Ｘ
ｂａｌ断片をさらに低温融解アガロースで精製する。
（［Ｖ）　　ステップ（１）およびステップ（１）の精
製したＤＮＡ断片の等量を結合し、結合生成物ｆ　Ｅ、
　ｃｏｌｉ　ＡＢ７１５７株（Ｍａｎｉａｔｉｓら、前
述）のコンキーテント細胞に形質転換する。形質転換株
を１０μｇ／ゴカナマイシン含有のＬＢ寒天上にプレー
トデル。
カナマイシン耐性コロニーからプラスミドＤＮＡを単離
し、制限酵素切断にょシそれぞれの断片の挿入を確認す
る。このようにして得られるプラスミドをｐ６０２１５
と命名する。ｐ６０２１５の構築全第１図に図示する。
実施例　２ １３　２μＩのプラスミドル６０２１５’ｒ制限エンド
ヌクレアーゼＥｃｏ　Ｒ１およびＨｉｎｄ　ｌで完全消
化し、およそ５．６　Ｋｌ）のベクター由来ＤＮＡ断片
を得る。この断片を以下のＤＮＡ配列を有するＢ。
５ｕｂｔｉｌｉｓプロモーターＰｖｌｌ　ｆ含む１２５
　ｂｐのＥｃｏ　Ｒ１／　Ｈｉｎｄｌ断片と結合する：
５　’　ＡＡＴＴＣＴ口ＬＴＧ　ＴＴＴＧＡＣＡαゴτ
Ａ７スＴＣＧ靜−ＡＴＡＧＧ品Ｔ　ＡＧＡＧＣＪμＭス
３’　　　　　ＧＡＧＴＡＣＡＡＡＣＴＧＴＣＧＡ　Ａ
ＴＡＧＴＡＧＣＴＴ　　ＡＡＴＡＴＣＣＴＴＡ　　ＴＣ
ＴＣＧＴＴＴＧＴＴＴＧＡＴＡＴＡＡＴ　ＴＴＧＣＡ　
　　　　　　３’ＡＡＣＴＡＴＡＴ’ｒＡ　ＡＡＣにＴ
’ＴＣＧＡ　　　　　５’結合生成物七Ｅ、　ｃｏｌｉ
　ＡＢ　１１５７株に形質転換し、形質転換株全５０μ
ｇ／ｍｌのクロラムフェニコール含有ＬＢ寒天上で選択
する。クロラムフェニコール耐性コロニーについてプロ
モーターＰｖ　ｎ　２＞Ｋｐ６０２１５シラスミドに挿
入していることを確認の友め分析する。
（■）２μＪのプラスミドｐ６０２／７’を制限酵素Ｈ
ｉｎｄｕで完全消化する。次の配列を有するリボゾール
結合部位全コードする可動性合成りＮＡ配列５ＲＢＳ　
ｌ　ｋ　Ｈｉｎｄ　Ｉの部位に結合する。結合生成物を
Ｅ−ｃｏｌｉ　ＡＢ　１１５７株に形質転換し、形質転
換株ｔ−５０μ、！ｉ’／ｒ１１１！の ５Ｉ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　ゴークロラムフェニコール含有ＬＢ寒天上で選
択する。
クロラムフェニコール耐性コロニーについて以下の方法
によりリボゾーム結合部位金コードする可動合成りＮＡ
配列５ＲＢＳ　ｔ’を含有するプラスミドの有無全分析
する。
ａ）　　５ＲＢＳＩからのＣＡＴ＠合ｔん白の合性能力
ｂ）新友に獲得しｉ　ｓｐｈ　１部位を有する組換えプ
ラスミドの制限酵素分析 このような解析のできたプラスミドＤＮＡ　’１ｐ６０
２／７ＲＢｓｌと命名しｔ。この後ｐ６０２／７　ＲＢ
Ｓ　１．ＤＮＡ　ｆ　Ｂ、　５ｕｂｉｉｌｉｓ　ＢＲ１
５１株に形質転換シ、クロラムフェニコール耐性コロニ
ー（この場合、１０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール
耐性コロニー）につき上記（■）のａ）およびｂ）によ
り分析してＢ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ中での５ＲＥＳ　ｌ
の有効性全確認する。
（１１プラスミドｐ６０２／７　ＲＢＳＩ　ｔ−Ｈｉｎ
ｄｕおよびＳｐｈ　Ｉで完全消化し、１μｇ／ｍｌのエ
チジウムプロミド含有の１％低温融解性アガロースデル
による電気泳動によ、９５ＲＢＳ　１と分離する。電気
泳動後、ＤＮＡｔ−螢光で確認し、ゲルより切り出す。
続いてＤＮＡ　ｉアガロースより精製する。以下の配列
を有する５ＲＢＳ■と命名しｔリボゾーム結合部位全コ
ードする可動合成りＮＡ配列をｐ６０２／７ＲＢＳｌの
Ｈｉｎｄ　ｉ　／　Ｓｐｈ　ｌ切断ＤＮＡと結合する。
Ｅ、　ｃｏｌｉＡＢ１１５７株全本 結合混合物により形質転換し、形質転換株を５０μ９７
ｍ１のクロラムフェニコール含有ＬＢ寒天上で選択する
。クロラムフェニコール耐性コロニーを以下の点によ、
９５ＲＢＳ■存在の有無を分析する。
ａ）融合ＣＡＴたん白の合成能力 ｂ）新たにＤｒａ　１部位全獲得した組換えプラスミド
の制限酵素解析 このような性状を確認したプラスミドＤＮＡ′Ｉｒ：ｐ
　６０２／７　ＲＢＳ■と命名した。プラスミド１）　
６０２／７　ＲＢＳ　Ｉｆ　ｋ　Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉ
ｓ　ＢＲｌ　５１株のコンーーテント細胞に導入し、形
質転換株全１０μｆｌ／ｍｌのクロラムフェニコール含
有ＬＢ寒天上で選択する。クロラムフェニコール耐性コ
ロニーについて上記ステップ（ｌｌｌａ）およびｂ）に
記載されるように５ＲＢＳＩＩの有効性全分析する。ベ
クターｐ　６０２．／７　ＲＢＳ　ｌおよびｐ　６０２
／７　ＲＢ８１の構築を第２図に図示しである。
実施例　６ （１）２μｇのプラスミドル６０２１５ｅ制限エンドヌ
クレアーゼＥｃｏ　Ｒｌで完全消化する。その後、本Ｄ
Ｎへを大腸菌ファージＴ５プロモーターＰＣ）２５（Ｒ
，ＧｅｎｔｚＸ前述）を含む２５０　ｂｐのＥｃｏ　Ｒ
ｌ断片の等モル量と結合する。結合生成物ｆ　Ｅ、　ｃ
ｏｌｉＡＢ１１５７株に導入し、形質転換株ｔ−１００
μｇ／ゴのクロラムフェニコール含有のＬＢ寒天上で選
択する。クロラムフェニコール耐性コロニーよりシラス
ミドＤＮＡを分離し、ＥｃｏＲ１消化またはＤＮＡ配列
決定によジブロモ−ターＰＧ２５　ｔｌ”含む２５０ｂ
ｐ断片の存在を分析する。確認され几プラスミドＤＮＡ
をｐ６０５／２５と命名した。ｐ６０２／２５の構築全
第２図に図しである。
実施例　４ ！ （ＩＪ　　２ｐｉのプラスミドｐ　６０２／７　ＲＢＳ
　ｌ　２制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄ　ｌおよびＢ
ｇｌ　１１で完全消化し、１μ＆／Ｉｌｌのエチジウム
プロミドを含有す、る１％低温融解アガロースデルで電
気泳動して分画を行なう。電気泳動の後ＤＮＡバンドを
螢光で確認し、およそ３．２　Ｋｂの上のバンドを切り
出す。
この断片をアガロースより精製する。
（ＩＩ）　　２　ｔｔ９　Ｏプラスミドル　６０２／２
５　ｆ、同じように制限酵素Ｈ１ｎｄ　ＩおよびＢｇｌ
　ｍで完全消化し、エチジウムプロミド含有の１％アガ
ロースデル電気泳動で分画する。ＤＮＡバンド全螢光で
確認し、およそ２．６　Ｋｌ）の下のバンド全切り出し
、アガロースから精製する。
（１）　　上記実施例４の（１）および（ＩＩ）で調製
しｙｃ　ＤＮＡ　Ｆ！ｆｒ片を各等モル量を結合し、結
合生成物ｆｃＥ、　ｃｏｌｉＡＢ１１５７株に導入する
。１００μｇ／ゴのクロラムフェニコールにｉｔ＆Ｚコ
ロニーよりシラスミドＤＮＡ　’ｉ分離し、２５０　？
）ｐのｇｃｏ　Ｒｌバンドの存在を確認する。このよう
に確認されたプラスミドＤＮＡ　ｋ　ｐ　２５　ＲＢｓ
　Ｉと命名した。プラスミドｐ　２５　ＲＢＳ　ｌの構
築を第６図に図示した。
（ＩＶ）ｐ２．５　ＲＢＳ　ｌ　ｋ保有するＥ、　ｃｏ
ｌｉよりプラスミドＤＮＡ　ｔ″単離、Ｂ、　５ｕｂｔ
、１ｌｉｓ　ＢＲ１５１のコンビ−テント細胞に導入し
、形質転換株全１０μｇ／−のクロラムフェニコール含
有ＬＢ寒天上で選択する。クロラムフェニコール耐性コ
ロニーよジブラスミドＤＮＡを分離し、プラスミドｐ２
５　ＲＢＳ　ｌのＢ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ中での構造を
制限酵素解析で確認する。
（Ｖ）　　プラスミドｐ２５　ＲＢＳ　ｌ　ｔ−含有す
るＢ。
５ｕｂｔｉｌｉｓのコロニーを１０μｇ／成りロラムフ
ェニコールを含むし一ブロス中で培養し、合成した全た
ん白ｔ−８ＤＳ　／ポリアクリルアミドゲル電気泳動で
分析しｔ、。大腸薗ファージＴ５プロモーターＰＧ２ｓ
　ｋ　！Ｊポゾーム結合部位の合成りＮＡ配列５ＲＢ８
１と共に用いると、５ＲＢＳＩの近接で開姑し、Ｅ。
ｃｏｌｉ　ｃａｔ遺伝子の天然の翻訳停止コドンで停止
する融合ＣＡＴたん白の合成が確認された。分析結果は
第４図に示す。
実施例　５ （１）２μｇのプラスミドｐ　６０２／７　ＲＢＳＩＩ
を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄｌおよびＢｇｌ　［
で完全に消化し、生成物を１μＥ／ＨＬＩのエチジウム
プロミド含有の１％低温融解アガロースデルによる電気
泳動で分画する。電気泳動後、ＤＮＡバンドを螢光で確
認し、およそ３．２ｘｂの上のバンド全切り出してアガ
ロースより精製する。
（■）２μｇのプラスミドｐ　６０２／２５を同様に制
限酵素Ｈ１ｎｄ　！ｉおよびＢｇｌ　［で完全消化し、
１μＶゴのエチジウムプロミド含有の１％低温融解アガ
ロースデルで電気泳動して分画する。電気泳動後、ＤＮ
Ａバンドを螢光で確認し、およそ２．６　ｘｂの下のバ
ンド全切り出してゲルから精製する。実施例５の（１）
および（ＩＩ）で得られたＤＮＡ　ｌｌｒ片の等モル量
を結合し、結合生成物ｆ　Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＡＢ　１１
５７株に導入する。形＊転換株を１００μ９／ｍｌのク
ロラムフェニコール含有ＬＢ寒天上で選択する。クロラ
ムフェニコール耐性コロニーかラフラスミドＤＮＡを分
離し、大腸ファージＴ５プロモーターＰＧ２　ｓおよび
合成リボゾーム結合部位−ＤＮＡ配列５ＲＢＳＩＩの両
方の存在を制限エンドヌクレアーゼ解析で確認する。確
認されたプラスミドＤＮＡをｐ２５／ＲＢＳＩＩと命名
した。シラスミドｐ　２５　ＲＢＳ　Ｉｔの構築を第３
図に図示する。
ベクター１）　２５　ＲＢＳ　ｎを保有するＢ、　５ｕ
ｂｔｉｌｉｓ中での友ん白金酸を第４図に示す。こ＼で
明かなように１プロモーターＰＧ２　ｓを含むＫｃｏ　
Ｒｌ断片は余分のりポゾーム結合部位を含有し、その結
果ｃａｔ遺伝子の端まで伸びた融合たん白を生成する。
この直接の影響としてＲＢＳＨの効率を極端に低下させ
る。従ってＰＧ２５の近接リポゾーム結合部位の翻訳フ
レーム’（ｆ−Ｒの様に改修して５ＲＢＳＩＩからのた
ん白金酸を最大となるようにした。
（ＩＶ）　　２．ｐ９（Ｄプラスミドル２５／ＲＢＳＩ
ｌヲ制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄ　ｌで完全消化す
る。４つのｄ　ＮＴＰ存在下ＤＮＡポリメラーゼクレナ
ウ断片と反応させてＨｉｎｄ　Ｉ末端を平滑末端とする
。これらの平滑末端に１２塩基対Ｈｉｎｄ　Ｍ　！ｊン
カー全結合し、結合生成物ｋ　Ｈｉｎｄ　ｌで完全消化
する。このＤＮＡ　ｅ　１μ＆／ＩＩＬＩのエチジウム
プロミド含有の１％低温融解アガロースデルの電気泳動
にて分画する。泳動後ＤＮＡ　’ｉ螢光で確認し、デル
エリ切り出してアガロースから精製する。得られるＤＮ
Ａヲ再び結合し、結合生成物ｔ−Ｅ、　ｃｏｌｉ八Ｂ１
へ５７株に導入する。形質転換株を１００μｇ／ｍｌの
クロラムフェニコール含有ＬＢ寒天上で選択する。クロ
ラムフェニコール耐性コロニーよシブラスミドＤＮＡ　
ｅ単離し、新たに出来たＨｉｎｄ　ｉ部位を制限酵素解
析で確認する。このように確認されたプラスミドＤＮ入
全ｐ　２５＊ＲＢＳ　ｎと命名した。プラスミドり　２
５＊ＲＢＳ　ｉｌの構築を第３図に示す。
（■　プラスミドｐ　２５＊ＲＢＳ　ｎ　ｋ　Ｂ、　　
５ｕｂｔｉｌｉｓＢＲ１５１味のコンビ−テント細肥に
導入し、形質転換株を１０μ９／ゴクロラムフエニコー
ル含有ＬＢ寒天上で選択する。クロラムフェニコール耐
性コロニーからプラスミドＤＮＡ　’ｔ−単離し、その
構造がＥ、　ｃｏｌｉから単離したＩ）２５＊ＲＢ８１
１と同一であることを制限酵素解析によジ決定する。
（Ｖｌ）Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓのクロラムフェニコー
ル耐性コロニーノ夫々ｔ−１０μ９／ｍｌクロラムフェ
ニコール含有Ｌ−ブロス中で培養し、これらのコロニー
によυ合成される全几ん白ｔ−８ＤＳ　／ポリアクリル
アミドデル電気泳動で分析する。大腸菌ファージＴ５プ
ロモーターＰＯ２５ｋ合成リボゾーム結合部位−ＤＮＡ
配列５ＲＢ８１１と合わせて使用すると、５ＲＢＳＩｌ
の近接の部位で翻訳が開始し、Ｅ、　ｃｏｌｉｃａｔ遺
伝子の天然の停止コドンで停止する融合ＣＡＴたん白の
合成が確認できる。そのような分析結果は第５図に示す
。
実施例　６ 第１表に使用し友プロモーターを示した。これらのプロ
モーターの性能全インビトロの１ラン−オフ”転写によ
シ測定し、その結果全第６図に示す。それぞれのケース
でプロモーターのＢ。
５ｕｂｔｉｌｉｓδ５５ＲＮＡポリメラーゼによる利用
を異なるイオン強度で測定して２００　ｍＭ　ＮａＣｌ
　Ｉｃ　Ｐ−けるＨ、　ｃｏｌｉ　ＲＮＡポリメラーゼ
による転写効率と比較した。転写測定の反応液はプロモ
ーターの他に既にＢ、　５ｕｂｔｉｌｉｓδ”　ＲＮＡ
ポリメラーゼにより効率よく利用されるとわかっている
Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓのｖｅｇプｏモーターを含有す
る（ＭａｒａｎＪｒ、ら、Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎ
ｅｔ、ｉｃｓ　１８６巻、３３９〜３４６頁（：１９８
２年〕）。第６図のデータから明かなように、試験した
プロモーターは全てその程度は異なるがＢ、　５ｕｂｔ
ｉＬｉｓ　ＲＮＡポリメラーゼにより認識される。大腸
ファージＴ５プロモーターＰＮ２１５およびＰＫｚｓａ
　／　ＰＫ２ａｂの場合、転写は７０ｇプロモーターか
らの場合よシ強いかも仰れない。さらに、塩濃度のプロ
モーター効率に対する影響も明かである。５０　ｍＭ　
ＮａＣｊではＢ、　５ｕｂｔ、１ｌｉｓ　ＲＮ入ポリメ
ラーゼは試験したプロモーターから転写を開頗するばか
りか、ｐＢＲ３２２ベクターＤＮＡの一＝　ｂ　ｌａ　
ＩＩおよび′″ｏｒ１″ｏｒ１″プロモーターする（予
備試験ではプロモーターは全てｐＢＲ３２２由来のベク
ターに挿入している：それらのプラスミドは切断して常
に６５０ヌクレオチドの”ｂｌａ”　ｆ、厚物と大腸菌
７アージＴ５プロモーターからの稙々の長さの転写物全
生成する。）。塩讃度が上がるに伴ない、プロモーター
の効率はｖｅｇと大腸菌７アージＴ５プロモーターの間
ではっきりと分かれる。第６図の結果が生菌中でも成り
立つかどうか調べる友め大腸菌ファージＴ５プロモータ
ー、或いは大腸菌ファージＴ５Ａ１プロモーターがベク
ターｐ　２５＊ＲＢＳ　Ｉｌ（第６図）のＰＧ２５プロ
モーターの代わシとなり、Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ中で
ＣＡＴ合成を確認できる。
実施例　７ （１）２μｇのプラスミドｐ　Ｄ　Ｓ　５　／　ＲＢＳ
　ＩＩ、９Ａを制限エンドヌクレアーゼＸｈｏ　ｌおよ
びＸｂａ　ｌで完全１μｇ／ＩＩＬＩのエチジウムプロ
ミド含有１％低温融解アガロースゲルで電気泳動にかけ
て分画する。
電気泳動後、ＤＮＡバンド全螢光で確認し、およそ１、
ＱＫｂＯ下の方のバンドを切シ出す。ＤＮＡ　ｆｆｒ片
をアガロースより精製する。
（Ｉｌｌ　　２μ＆のシラスミドｐ２５＊ＲＢＳ　［ｉ
同じＬうに制限酵素ＸｈＯｌおよびＸ’ｂａｌで完全消
化し、１μｇ／ｍｌエチジウムプロミド含有の１％低温
融解性アガロ−スケ９ルで分画する。螢光でＤＮＡバン
ドを確認し、およそ４．６ＫｂＯ上のバンドを切り出し
てアガロースより精製する。
（１）　　実施例７（１）および（Ｉｌｌで調製したＤ
ＮＡ断片の等モル量を結合し、結合生成物ｆ　Ｂ、　５
ｕｂｔｉｌｉｓＢＲ１５１株のコンぎ−テント細胞に導
する。１０μｇ／ゴのカナマイシンおよび１０μＩ／−
のクロラムフェニコールに耐性な形質転換株よジブラス
ミドＤＮＡ　’ｉ単離し、１．□ｘ’ｂのｘｈｏ　Ｉ　
／　ｘｂａ　ｌ断片の存在を分析する。確認されたプラ
スミド全ｐ６０２／１８と命名した。ｐ６０２／１８の
構築１！−第７図に図示する。
側　プラスミドｐ６０２／１８を含有するＢ。
５ｕｂｔｉｌｉｓのコロニーｅｌＯμ９／ｍｌクロラム
フェニコール含有Ｌ−ブロス中で培養し、培養物によｐ
生成された全たん白質ｉ　ＳＤＳ　／ポリアクリルアミ
ドデル電気泳動により分析する。大腸菌ファージプロモ
ーターＰＮ２５とリボゾーム結合部位をフードする合成
りＮＡ配列ＲＢＳ■、９Ａ１とが利用されたことは、Ｒ
ＢＳｌｌ、９Ａ１の近接に始まり、Ｅ。
ｃｏｌｉ　ｃａｔ、遺伝子の天然の翻訳停止コドンで終
了する融合ＣＡＴたん白の合成により確認される。分析
結果は第９図に示す。
実施例　８ １９の構築 （１）２μＩのプラスミドｐ　Ｄ　Ｓ　５／ＲＢＳ　Ｉ
ｔ、３Ａ十５Ａｅ制限エンドヌクンアーゼＸｈｏ　ｌお
よびＸ’ｂａ　１で完全消化し、１μ９７ｍ１のエチジ
ウムプロミドを営む１％低温融解アガロースデルの電気
泳動により分画する。電気泳動後、ＤＮＡバンド全螢光
により検出し、およそ１．ＱＫｂＯ下のバンドを切り出
す。本断片をアガロースより精製する。
（Ｉｔ）　　２μｇのプラスミドｐ　２５＊ＲＢＳ　Ｉ
Ｎを同様に制限酵素Ｘｈｏ　ｌおよびＸｂａ　ｌで完全
消化し、１μｇ／ｒｎｌのエチジウムプロミド含有の１
％低温融解アガロースデルの電気泳動で分画する。ＤＮ
Ａバンド全螢光によシ検出し、およそ４．７　Ｋｂの上
部バンド金切り出してアガロースよシ精製する。
（夏）　　実施例８の（１）および（Ｉｌｌで精製した
ＤＮＡ断片を等モル量ずつ結合し、結合生成物ｆ　Ｂ、
　５ｕｂｔｉｌｉｓＢＲ１５１株のコンピーテント細胞
に導入する。
１０μｇ／Ｉｌｌのカナマイシンおよび１０μｇ／Ｉｌ
ｌのクロラムフェニコールに耐性な形質転換株エクゾラ
スミドＤＮＡを精製し、１．０に１）のｘｈｏ　Ｉ　／
Ｘｂａ　１断片の存在を確認する。確認できたプラスミ
ドＤＮＡをｐ６０２／１９と命名した。ｐ６０２／１９
の構築全第７図に示す。
実施例　９ （１）２μＪのシラスミドｐ　Ｄ　Ｓ　３／　ＲＢＳ　
ＩＩ全制限酵素ＸｈｏｌおよびＸｂａ　ｌで完全消化し
た後、１μ９７ゴのエチジウムプロミドを含む１％低温
融解アガロースデルの電気泳動で分画する。電気泳動後
ＤＮ八へンドを螢光で検出し、下のおよそ２．ＯＫｂの
バンドを切り出す。次にその断片をアガロ−スより精製
する。
（■）２μｇのプラスミドｐ　２５＊ＲＢＳ　［１を同
じように制限酵素Ｘｈｏ　ｌおよびＸｂａ　ｌで完全消
化した後、１μｍ１７ｍ１のエチジウムプロミド含有の
１チ低温融解アガロースデル電気泳動にて分画する。Ｄ
ＮＡバンド全螢光で検出し、上のおよそ４．７　ｘｂの
バンド８吟出し、アガロースより精製する。
（１）　　実施例９゛の（１１および（Ｉｔ）で調製し
たＤＮＡ断片の等モル量全結合し、結合生成物ｔ　Ｂ、
　ｓｕ’ｂｔ、１ｌｉｓＢＲ１５１株のコンぎ−テント
細胞に導入する。
１０μＩ／ゴのカナマイシンおよび１０μＳ／ゴのトリ
メトプリムに耐ａを示す形質転換株よりプラスミドＤＮ
Ａｋ’ＭＨし、２．０　Ｋ１：＋のＸｈｏ　ｌ　／　Ｘ
ｂａ　１断片の存在を分析する。そのような性質が確認
され友プラスミドＤＮＡをｐ　６０２／２０と命名した
、ｐ　６０２／２０の構築を第８図に示す。
α）　プラスミドｐ６０２／２０を含有するＢ。
５ｕｂｚｉｌｉｓのコロニーを１０μｇ／−のカナマイ
シンを含むし一ブロス中で培養し、生成する全たん白質
’ｉ　ＳＤＳ　／ポリアクリルアミドデル電気泳動で分
析する。大腸菌ファージＴ５プロモーターＰＮ２５とリ
ボゾーム結合部位をコードする合成りＮＡ配列ＲＢＳ　
１１の利用はＲＢＳ　Ｉｔの近接から開始し、ｄｈｆｒ
遺伝子の天然の湘訳停止コドンで終了する融合ＩＥＦＲ
几ん白の合成により確認できる。分析結果全第９図に示
す。
実施例１０ ２１の構築 （１）２μＩのプラスミドｐＤｓ８／ＲＢＳＩＩ、３Ａ
＋５Ａｔ−制限エンドヌクレアーゼＸｈｏ　ｌおよびＸ
ｂａ　１で完全消化した後、１μ９／ｍｌのエチゾウム
ブロミド′を含む１％低温融解アガロースデルの電気泳
動にかげて分画する。電気泳動後ＤＮＡバンド全螢光で
検出し、下のおよそ２．０　Ｋｌ）のバンドを切り出し
てアガロースからｖＩ製する。
（ｎｌ　　２　ｐｌｉ　Ｏプラ、ｘ、　　’トル　２５
　　ＲＢＳ　ＩＩ　ｋ同様に制限酵素Ｘｈｏ　ｌおよび
Ｘｂａ　ｌで完全消化踵消化物を１μ９７ｍ１のエチジ
ウムプロミド含有１チ低温融解アガロースデルで分画す
る。電気泳動後、ＤＮＡバンドを螢光で検出して下のお
よそ２．ＯＫｂのバンドを切シ出し、アガロースよＱ精
製する。
（Ｉ）　　実施例１０、（１）および（ＩＩ）により精
製し次ＤＮＡ断片を等モル量結合し、結合生成物ｆ　Ｂ
、　５ｕｂｔｉｌｉｓＢＲ１５１株のコンピーテント細
胞に導入する。
１０μｇ／１Ｆ１６のカナマイシンお工び１０μｉ／ｍ
ｌのトリメトプリムに耐性な形質転換株よりプラスミド
ＤＮＡ１単離し、２．０　Ｋｌ）のＸｈｏ　ｌ　／　Ｘ
ｂａ　ｌ断片の存在全分析する。性質が確認され几プラ
スミドＤＮＡ全ｐ６０２／２１と命名した。ｐ６０２／
２１の構築を第８図に図示する。
潤　プラスミドｐ６０２／２１を含有するＢ。
ｓｕｂ’ｔ、１ｌｉｓの”　ロニｋ　１０　μｌｌ　／
　ｍｌカナマイシン含有のＬ−ブロス中で培養し、合成
され友全たん白質上８ＤＳ　／ポリアクリルアミドデル
電気泳動で分析する。大腸菌ファージＴ５のプロモータ
ーＰＮ２５とリボゾーム結合部位をコードする合成りＮ
Ａ配列ＲＢＳＩＩ、３Ａ＋５Ａの有効性はＲＢＳＩＩ、
３Ａ＋５Ａのすぐ近接よシ開始し、ｄｈｆｒ遺伝子の天
然の停止コドンで停止した融合ＤＨＦＲたん白の合成で
確認される。分析の結果は第９図に水力
【図面の簡単な説明】
第１図は基本的なＥ、　ｃｏｌｉ　／　Ｂ、　５ｕｂｔ
ｉｌｉｓシヤトルベクターｐ６０２１５の構築を示す模
式図である。 第２図は一般の発現ベクターｐ６０２／７およびｐ６０
２／２５、ならびにベクターｐ　６０２／７　ＲＢＳ　
ｌおよびｐ６０２／７ＲＢｓｎの構築を示す模式図であ
る。 第６図はベクターｐ２５　ＲＢＳ　ｌ、　Ｉ）２５ＲＢ
ＳＩｌおよびｐ２５＊ＲＢＳＩｌの構築を示す模式図で
ある。 第４図は発現ベクターｐ２５　ＲＢＳ　Ｉ　、　　ｐ２
５ＲＢｓＩｌおよ゛びｌ）　２５＊ＲＢＳ　ｎ　ｆ含有
するＢ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ第５図はベクターり　２５
　ＲＢＳ　ｌ　、　　ｐ２５　ＲＥＳ　Ｉｔおよびｐ　
２５＊ＲＢＳ　ｎ　を含有するＢ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ
中で生産されるＣＡＴたん白質合成を示す模式図である
。 第６図は第１表に示した７’ロモーターのインビトロ系
転写解析を示す１気泳動パターンである。 第７図はシャトルベクターｐ６０２／１８およびｐ６０
２／１９の構築を示す模式図である。 第８図はシャトルベクターｐ　６０２　／　２０および
ｐ６０２／２１の構築を示す模式図である。 第９図はプラスミドｐ６０２／１８、ｐ６０２／１９、
ｐ６０２／２０およびｐ６０２／２１を含有するＢ、　
５ｕｂｔｉｌｉｓ　Ｂ　Ｒ１５１株により生産される全
たん白質を示す電気泳動パターンである。

Claims (76)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）一方の末端付近にグラム陰性菌由来の転写開始Ｄ
    ＮＡ配列を、もう一方の末端付近にグラム陰性菌または
    グラム陽性菌由来の転写終了ＤＮＡ配列を有し、該転写
    開始ＤＮＡ配列と転写終了ＤＮＡ配列の中間にグラム陽
    性菌またはグラム陰性菌由来のリボゾーム結合部位をコ
    ードするＤＮＡ配列が随意に原核細胞或いは真核細胞ポ
    リペプチドをコードする異種遺伝子に有効に結合して有
    するグラム陽性菌の発現調節ＤＮＡ配列。
  2. （２）一方の末端付近にグラム陰性菌由来の転写開始Ｄ
    ＮＡ配列を、もう一方の末端付近にグラム陰性菌由来の
    転写終了ＤＮＡ配列を有し、該転写ＤＮＡ配列の中間に
    グラム陽性菌由来のリボゾーム結合部位をコードするＤ
    ＮＡ配列が原核細胞または真核細胞ポリペプチドをコー
    ドする外来遺伝子に随意に、有効に結合して有する上記
    第（１）項記載の発現調節ＤＮＡ配列。
  3. （３）一方の末端付近にグラム陰性菌由来の転写開始Ｄ
    ＮＡ配列を、もう一方の末端付近にグラム陰性菌由来の
    転写終了ＤＮＡ配列を有し、該転写ＤＮＡ配列の中間に
    グラム陰性菌由来のリボゾーム結合部位をコードするＤ
    ＮＡ配列が随意に、原核細胞または真核細胞ポリペプチ
    ドをコードする外来遺伝子に有効に結合して有する上記
    第（１）項記載の発現調節ＤＮＡ配列。
  4. （４）転写開始ＤＮＡ配列が大腸菌ファージＴ５のプロ
    モーターである上記第（１）項〜第（３）項のいずれか
    記載の発現調節ＤＮＡ配列。
  5. （５）大腸菌ファージＴ５のプロモーターがＰ＿Ｎ＿２
    ＿５プロモーターである上記第（４）項記載の発現調節
    ＤＮＡ配列。
  6. （６）大腸菌ファージＴ５のプロモーターがＰ＿Ｎ＿２
    ＿６プロモーターである上記第（４）項記載の発現調節
    ＤＮＡ配列。
  7. （７）大腸菌ファージＴ５のプロモーターがＰ＿Ｇ＿２
    ＿５プロモーターである上記第（４）項記載の発現調節
    ＤＮＡ配列。
  8. （８）大腸菌ファージＴ５のプロモーターがＰ＿Ｊ＿５
    プロモーターである上記第（４）項記載の発現調節ＤＮ
    Ａ配列。
  9. （９）大腸菌ファージＴ５プロモーターがＰ＿Ｄ＿／＿
    Ｅ＿＿２＿＿０プロモーターである上記第（４）項記載
    の発現調節ＤＮＡ配列。
  10. （１０）大腸菌ファージＴ５プロモーターがＰ＿Ｋ＿２
    ＿８＿ａプロモーターである上記第（４）項記載の発現
    調節ＤＮＡ配列。
  11. （１１）大腸菌ファージＴ５プロモーターがＰ＿Ｋ＿２
    ＿８＿ｂプロモーターである上記第（４）項記載の発現
    調節ＤＮＡ配列。
  12. （１２）転写開始ＤＮＡ配列が大腸菌ファージＴ７のプ
    ロモーターである上記第（１）項〜第（３）項いずれか
    記載の発現調節ＤＮＡ配列。
  13. （１３）Ｔ７プロモーターがＴ７Ａ１プロモーターであ
    る上記第（１２）項記載の発現調節ＤＮＡ配列。
  14. （１４）Ｔ７プロモーターがＴ７Ａ２プロモーターであ
    る上記第（１２）項記載の発現調節ＤＮＡ配列。
  15. （１５）リボゾーム結合部位をコードするＤＮＡ配列が
    リボゾーム結合部位をコードする可動性の合成ＤＮＡ配
    列である上記第（１）項〜第（１４）項記載の発現調節
    ＤＮＡ配列。
  16. （１６）リボゾーム結合部位をコードする可動性のＤＮ
    Ａ配列が第II表に示すようにＳＲＢＳ I 、ＳＲＢＳII
    、ＲＢＳII、ＲＢＳII、９Ａ或いはＲＢＳII、３Ａ＋５
    Ａのヌクレオチド配列より成る発現調節配列。
  17. （１７）転写終了ＤＮＡ配列がＥ．ｃｏｌｉ由来のター
    ミネーターである上記第（１）項〜第（１６）項記載の
    発現調節ＤＮＡ配列。
  18. （１８）Ｅ．ｃｏｌｉ由来のターミネーターがｔ＿０タ
    ーミネーターである上記第（１７）項記載の発現調節Ｄ
    ＮＡ配列。
  19. （１９）Ｅ．ｃｏｌｉ由来のターミネーターがＴ１ター
    ミネーターである上記第（１７）項記載の発現調節ＤＮ
    Ａ配列。
  20. （２０）Ｅ．ｃｏｌｉ由来のターミネーターがＴ２ター
    ミネーターである上記第（１７）項記載の発現調節ＤＮ
    Ａ配列。
  21. （２１）Ｅ．ｃｏｌｉ由来のターミネーターがＴ７ター
    ミネーターである上記第（１７）項記載の発現調節ＤＮ
    Ａ配列。
  22. （２２）Ｂａｃｉｌｌｕｓで機能可能な上記第（１）項
    〜第（２１）項記載の発現調節ＤＮＡ配列。
  23. （２３）Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ中で機能
    可能な上記第（２２）項記載の発現調節ＤＮＡ配列。
  24. （２４）グラム陽性菌中で機能可能なリボゾーム結合部
    位をコードする可動性の合成ＤＮＡ配列。
  25. （２５）Ｂａｃｉｌｌｕｓ中で機能可能な上記第（２４
    ）項記載のリボゾーム結合部位コードする可動性の合成
    ＤＮＡ配列。
  26. （２６）Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ中で機能
    可能な上記第（２５）項記載のリボゾーム結合部位をコ
    ードする合成ＤＮＡ配列。
  27. （２７）第II表に示すＳＲＢＳ I ヌクレオチド配列よ
    り成る上記第（２４）項〜第（２６）項のいずれか記載
    のリボゾーム結合部位をコードする可動性の合成ＤＮＡ
    配列。
  28. （２８）第II表に示すＳＲＢＳIIヌクレオチド配列より
    成る上記第（２０）項〜第（２６）項のいずれか記載の
    可動性の、リボゾーム結合部位をコードする合成ＤＮＡ
    配列。
  29. （２９）第II表に示すＲＢＳIIヌクレオチド配列より成
    る上記第（２４）項〜第（２６）項のいずれか記載のリ
    ボゾーム結合部位をコードする可動性合成ＤＮＡ配列。
  30. （３０）第II表に示すＲＢＳII、９Ａヌクレオチド配列
    より成る上記第（２４）項〜第（２６）項のいずれか記
    載のリボゾーム結合部位をコードする可動性の合成ＤＮ
    Ａ配列。
  31. （３１）第II表に示すＲＢＳII、３Ａ＋５Ａヌクレオチ
    ド配列より成る上記第（２４）項〜第（２６）項のいず
    れか記載のリボゾーム結合部位をコードする可動性の合
    成ＤＮＡ配列。
  32. （３２）グラム陽性微生物中で機能可能なＥ．ｃｏｌｉ
    由来のターミネーター。
  33. （３３）Ｂａｃｉｌｌｕｓ中で機能可能な上記第（３２
    ）項記載のＥ．ｃｏｌｉ由来ターミネーター。
  34. （３４）Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ中で機能
    可能な上記第（３３）項記載のＥ．ｃｏｌｉ由来ターミ
    ネーター。
  35. （３５）ターミネーターがｔ＿０ターミネーターである
    上記第（３２）項〜第（３４）項のいずれか記載のＥ．
    ｃｏｌｉ由来ターミネーター。
  36. （３６）Ｔ１ターミネーターである上記第（３２）項〜
    第（３４）項のいずれか記載のＥ．ｃｏｌｉ由来ターミ
    ネーター。
  37. （３７）Ｔ２ターミネーターである上記第（３２）項〜
    第（３４）項のいずれか記載のＥ．ｃｏｌｉ由来のター
    ミネーター。
  38. （３８）Ｔ７ターミネーターである上記第（３２）項〜
    第（３４）項のいずれか記載のＥ．ｃｏｌｉ由来ターミ
    ネーター。
  39. （３９）（ａ）リボゾーム結合部位をコードするＤＮＡ
    配列が原核細胞または真核細胞ポリペプチドをコードす
    る外来遺伝子に随意に、有効に結合している上記第（１
    ）項〜第（２３）項のいずれか記載のグラム陽性菌用発
    現調節ＤＮＡ配列、 （ｂ）少なくとも一個のベクター複製開始点および（ｃ
    ）少なくとも一つの抗生物質耐性遺伝子を含む発現ベク
    ター。
  40. （４０）グラム陰性およびグラム陽性細菌で複製可能な
    プラスミド性シャトルベクターである上記第（３９）項
    記載の発現ベクター。
  41. （４１）Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢａｃｉｌｌｕｓ菌株中で
    複製可能な上記第（４０）項記載の発現ベクター。
  42. （４２）Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの菌
    株中で複製可能な発現ベクター。
  43. （４３）ｐ２５群の一つである上記第（４０）項〜第（
    ４２）項のいずれか記載の発現ベクター。
  44. （４４）ｐ２５ＲＢＳ I である上記第（４３）項記載
    の発現ベクター。
  45. （４５）ｐ２５ＲＢＳIIである上記第（４３）項記載の
    発現ベクター。
  46. （４６）ｐ２５＾＊ＲＢＳIIである上記第（４３）項記
    載の発現ベクター。
  47. （４７）ｐ６０２群の一つである上記第（４０）項〜第
    （４２）項のいずれか記載の発現ベクター。
  48. （４８）ｐ６０２／１８である上記第（４７）項記載の
    発現ベクター。
  49. （４９）ｐ６０２／１９である上記第（４７）項記載の
    発現ベクター。
  50. （５０）ｐ６０２／２０である上記第（４７）項記載の
    発現ベクター。
  51. （５１）ｐ６０２／２１である上記第（４７）項記載の
    発現ベクター。
  52. （５２）上記第（３９）項〜第（５１）項のいずれかに
    記載の発現ベクターを保持する形質転換株。
  53. （５３）Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ株である
    上記第（５２）項記載の形質転換株。
  54. （５４）Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ＢＲ１
    ５１株である上記第（５３）項記載の形質転換株。
  55. （５５）下流方向にグラム陽性細菌由来の転写開始ＤＮ
    Ａ配列、グラム陽性菌またはグラム陰性菌由来のリボゾ
    ーム結合部位をコードするＤＮＡ配列、およびグラム陽
    性またはグラム陰性細菌由来の転写終了ＤＮＡ配列を公
    知のＤＮＡ配列え技術により機能ユニットに結合するこ
    とより成る、上記第（１）項〜第（２３）項のいずれか
    記載のグラム陽性細菌用発現調節ＤＮＡ配列の作製方法
    。
  56. （５６）（ａ）クローニング用の既存ベクター中に転写
    方向下流に向つて、グラム陰性細菌由来の少なくとも一
    個の転写開始ＤＮＡ配列、およびグラム陽性またはグラ
    ム陰性細菌由来のリボゾーム結合部位をコードするＤＮ
    Ａ配列を挿入し、 （ｂ）該クローニング用ベクターに、上記リボゾーム結
    合部位をコードするＤＮＡ配列に隣接して少なくとも一
    個制限エンドヌクレアーゼ切断部位を持ち、 （ｃ）リボゾーム結合部位をコードするＤＮＡ配列に隣
    接する上記制限エンドヌクレアーゼ切断部位に原核細胞
    または真核細胞ポリペプチドをコードする少なくとも一
    個の外来遺伝子を挿入し、 （ｄ）原核細胞または真核細胞ポリペプチドをコードす
    る上記外来遺伝子の下流側に少なくとも一個の転写終了
    ＤＮＡ配列を挿入するステップより成り、それ自体公知
    のＤＮＡ組換え技術により、上記第（３９）項〜第（５
    １）項いずれか記載の発現ベクターの製造方法。
  57. （５７）リボゾーム結合部位をコードするＤＮＡ配列が
    グラム陽性又はグラム陰性細菌由来であり、転写終了Ｄ
    ＮＡ配列がグラム陰性細菌由来である上記第（５６）項
    記載の方法。
  58. （５８）上記第（１）項〜第（２３）項いずれか記載の
    発現調節ＤＮＡ配列にポリペプチドをコードするＤＮＡ
    配列が機能的に結合して含有する上記第（３９）項〜第
    （５１）項いずれか記載の発現ベクターで宿主を形質転
    換し、適当な生育条件下で形質転換株を培養し、培養液
    より生成ポリペプチドを単離することより成る原核細胞
    または真核細胞ポリペプチドの製造方法。
  59. （５９）ベクターがグラム陽性およびグラム陰性細菌中
    で複製可能なプラスミド性シャトルベクターである上記
    第（５８）項記載のポリペプチド製造方法。
  60. （６０）プラスミド性シャトルベクターがＥ．ｃｏｌｉ
    およびＢａｃｉｌｌｕｓ菌株中で複製可能である上記第
    （５９）項記載のポリペプチド製造方法。
  61. （６１）プラスミド性シャトルベクターがＥ．ｃｏｌｉ
    およびＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ菌株中で複
    製可能であるような上記（６０）項記載のポリペプチド
    製造方法。
  62. （６２）プラスミド性シャトルベクターがｐ２５群の一
    つである上記第（５９）項〜第（６１）項のいずれか記
    載のポリペプチド製造方法。
  63. （６３）シャトルベクターがｐ２５ＲＢＳ I である上
    記第（６２）項記載のポリペプチド製造方法。
  64. （６４）シャトルベクターがｐ２５ＲＢＳ I である上
    記第（６２）項記載のポリペプチド製造方法。
  65. （６５）シャトルベクターがｐ２５＾＊ＲＢＳIIである
    上記第（６２）項記載のポリペプチド製造方法。
  66. （６６）プラスミド性シャトルベクターがＰ６０２群の
    一つである上記第（５９）項〜第（６１）項のいずれか
    記載のポリペプチド製造方法。
  67. （６７）シャトルベクターがｐ６０２／１８である上記
    第（６６）項記載のポリペプチド製造方法。
  68. （６８）シャトルベクターがｐ６０２／１９である上記
    第（６６）項記載のポリペプチド製造方法。
  69. （６９）シャトルベクターがｐ６０２／２０である上記
    第（６６）項記載のポリペプチド製造方法。
  70. （７０）シャトルベクターがｐ６０２／２１である上記
    第（６６）項記載のポリペプチド製造方法。
  71. （７１）ポリペプチドがＥ．ｃｏｌｉクロラムフエニコ
    ールアセチルトランスフエラーゼである上記第（５８）
    項〜第（６８）項記載の製造方法。
  72. （７２）ポリペプチドがマウスジヒドロ葉酸レダクター
    ゼである上記第（６６）項、第（６９）項または第（７
    ０）項記載の製造方法。
  73. （７３）原核細胞または真核細胞ポリペプチドをコード
    する遺伝子を発現するための上記第（１）項〜第（２３
    ）項記載の発現調節ＤＮＡ配列の使用。
  74. （７４）上記第（５５）項記載の方法を用いて製造され
    た上記第（１）項〜第（２３）項のいずれか記載のグラ
    ム陽性細菌用発現調節ＤＮＡ配列。
  75. （７５）上記第（５６）項または第（５７）項記載の方
    法を用いて製造された上記第（３９）項〜第（５１）項
    のいずれか記載の発現ベクター。
  76. （７６）上記第（３９）項、第（５１）項のいずれか記
    載の発現ベクターを用い、上記第（５８）項〜第（７２
    ）項のいずれか記載の方法により製造された原核細胞ま
    たは真核細胞ポリペプチド。
JP61157771A 1985-07-05 1986-07-04 グラム陽性菌の新規発現調節配列 Expired - Lifetime JP2632809B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB858517071A GB8517071D0 (en) 1985-07-05 1985-07-05 Gram-positive expression control sequence
GB8517071 1985-07-05

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP8185740A Division JP2887248B2 (ja) 1985-07-05 1996-07-16 ポリペプチドの製造方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPS6214786A true JPS6214786A (ja) 1987-01-23
JP2632809B2 JP2632809B2 (ja) 1997-07-23

Family

ID=10581857

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP61157771A Expired - Lifetime JP2632809B2 (ja) 1985-07-05 1986-07-04 グラム陽性菌の新規発現調節配列
JP8185740A Expired - Lifetime JP2887248B2 (ja) 1985-07-05 1996-07-16 ポリペプチドの製造方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP8185740A Expired - Lifetime JP2887248B2 (ja) 1985-07-05 1996-07-16 ポリペプチドの製造方法

Country Status (12)

Country Link
US (1) US4868111A (ja)
EP (1) EP0207459B1 (ja)
JP (2) JP2632809B2 (ja)
AT (1) ATE62020T1 (ja)
AU (1) AU594349B2 (ja)
CA (1) CA1316850C (ja)
DE (1) DE3678343D1 (ja)
DK (1) DK175206B1 (ja)
GB (1) GB8517071D0 (ja)
IE (1) IE59165B1 (ja)
IL (1) IL79291A (ja)
NZ (1) NZ216688A (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH02107191A (ja) * 1988-05-18 1990-04-19 Dr Karl Thomae Gmbh 化合物製造生合成法
JP2009525038A (ja) * 2006-02-03 2009-07-09 アベシア・バイオロジックス・リミテッド 発現系

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5266474A (en) * 1987-06-24 1993-11-30 Genentech, Inc. Balanced inducible transcription system
EP0303925B1 (de) * 1987-08-17 1995-06-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Hochreprimierbare Expressionskontrollsequenzen
US5726042A (en) * 1988-04-07 1998-03-10 Abbott Laboratories Expression of heterologous proteins in Bacillus megaterium utilizing sporulation promoters of Bacillus subtilis
US7049102B1 (en) 1989-09-22 2006-05-23 Board Of Trustees Of Leland Stanford University Multi-gene expression profile
FR2679568B1 (fr) * 1991-07-22 1994-09-02 Pasteur Institut Nouveau type de replicon gram-positif - construction de vecteurs recombinants le contenant.
JPH07504815A (ja) 1992-02-27 1995-06-01 マイクロバイアル　テクニクス　リミティド 乳酸菌における異種遺伝子の発現およびその発現産物
US6022730A (en) * 1994-06-17 2000-02-08 Robinson; Douglas H. Methods for the isolation of bacteria containing eukaryotic genes
US5629205A (en) * 1995-05-19 1997-05-13 Allelix Biopharmaceuticals Inc. Promoters for gene expression
US6194168B1 (en) * 1997-09-30 2001-02-27 Human Genome Sciences, Inc. Expression control sequences
US6146848A (en) * 1998-07-23 2000-11-14 The Hong Kong University Of Science & Technology Bacterial expression system
US6720174B1 (en) 1999-01-28 2004-04-13 Novozymes A/S Phytases
WO2000061762A1 (en) * 1999-04-09 2000-10-19 Techlab, Inc. RECOMBINANT TOXIN A/TOXIN B VACCINE AGAINST $i(CLOSTRIDIUM DIFFICILE)
EP1201767B1 (en) * 2000-10-25 2010-07-21 FUJIFILM Corporation Method of analyzing double stranded DNA
AU2002365184A1 (en) * 2001-10-26 2003-07-30 Id Biomedical Corporation Of Washington Efficient protein expression system
US9453251B2 (en) 2002-10-08 2016-09-27 Pfenex Inc. Expression of mammalian proteins in Pseudomonas fluorescens
BRPI0416744A (pt) 2003-11-19 2007-01-16 Dow Global Technologies Inc sistemas de expressão de proteìna aperfeiçoados
AU2004317306B2 (en) 2003-11-21 2010-09-02 Pelican Technology Holdings, Inc. Improved expression systems with Sec-system secretion
ES2707786T3 (es) 2004-01-16 2019-04-05 Pfenex Inc Expresión de proteínas de mamífero en Pseudomonas fluorescens
EP2412816B1 (en) 2004-07-26 2014-12-03 Pfenex Inc. Process for improved protein expression by strain engineering
EP2086642B1 (en) * 2006-10-18 2014-06-25 Periness Ltd. Dnase for the treatment of male sub-fertility
US7618799B2 (en) 2007-01-31 2009-11-17 Dow Global Technologies Inc Bacterial leader sequences for increased expression
US9580719B2 (en) 2007-04-27 2017-02-28 Pfenex, Inc. Method for rapidly screening microbial hosts to identify certain strains with improved yield and/or quality in the expression of heterologous proteins
MX2009011523A (es) 2007-04-27 2009-11-09 Dow Global Technologies Inc Metodo para clasificar rapidamente huespedes microbianos para identificar ciertas cepas con rendimiento y/o calidad mejorados en la expresion de proteinas heterologas.
US9243253B2 (en) 2009-05-11 2016-01-26 Pfenex, Inc. Production of recombinant proteins utilizing non-antibiotic selection methods and the incorporation of non-natural amino acids therein
CN102906108B (zh) 2010-03-04 2016-01-20 菲尼克斯公司 用于无变性制备可溶性重组干扰素蛋白的方法
EP2553102B1 (en) 2010-03-30 2015-12-09 Pfenex Inc. High level expression of recombinant toxin proteins
PL2552949T3 (pl) 2010-04-01 2017-01-31 Pfenex Inc. Sposoby wytwarzania G-CSF w komórce gospodarza Pseudomonas
US9169304B2 (en) 2012-05-01 2015-10-27 Pfenex Inc. Process for purifying recombinant Plasmodium falciparum circumsporozoite protein
US11408007B2 (en) 2014-09-26 2022-08-09 Yale University Compositions and methods for biocontainment of microorganisms
AU2015355242B2 (en) 2014-12-01 2020-10-08 Pelican Technology Holdings, Inc. Fusion partners for peptide production
SG11202002943PA (en) 2017-10-27 2020-05-28 Pfenex Inc Method for production of recombinant erwinia asparaginase
WO2019083795A1 (en) 2017-10-27 2019-05-02 Pfenex Inc. GUIDED BACTERIAL SEQUENCES FOR EXPRESSION OF PERIPLASMIC PROTEINS
US11149280B2 (en) 2019-10-29 2021-10-19 Yale University Engineering organisms resistant to viruses and horizontally transferred genetic elements
US20220313798A1 (en) 2021-03-30 2022-10-06 Jazz Pharmaceuticals Ireland Ltd. Dosing of recombinant l-asparaginase
WO2023178316A2 (en) 2022-03-17 2023-09-21 Yale University Compositions and methods for expressing synthetic genetic elements across diverse microorganisms

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4495280A (en) * 1981-05-20 1985-01-22 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University Cloned high signal strength promoters
GR81701B (ja) 1983-01-18 1984-12-12 Lilly Co Eli
EP0115936A1 (en) * 1983-01-24 1984-08-15 Kabushiki Kaisha Yakult Honsha Chimeric plasmids

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOCHEM.SOC.SUMP=1983 *
NUCLEIC.ACIDS.RES=1984 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH02107191A (ja) * 1988-05-18 1990-04-19 Dr Karl Thomae Gmbh 化合物製造生合成法
JP2009525038A (ja) * 2006-02-03 2009-07-09 アベシア・バイオロジックス・リミテッド 発現系
JP2013078323A (ja) * 2006-02-03 2013-05-02 Fujifilm Diosynth Biotechnologies Uk Ltd 発現系

Also Published As

Publication number Publication date
DK320686D0 (da) 1986-07-04
NZ216688A (en) 1990-06-26
ATE62020T1 (de) 1991-04-15
DE3678343D1 (de) 1991-05-02
AU5938586A (en) 1987-01-08
JPH10229878A (ja) 1998-09-02
EP0207459A3 (en) 1988-07-06
GB8517071D0 (en) 1985-08-14
IL79291A0 (en) 1986-09-30
EP0207459B1 (en) 1991-03-27
EP0207459A2 (en) 1987-01-07
DK175206B1 (da) 2004-07-12
IE59165B1 (en) 1994-01-12
AU594349B2 (en) 1990-03-08
US4868111A (en) 1989-09-19
IL79291A (en) 1991-06-30
JP2632809B2 (ja) 1997-07-23
CA1316850C (en) 1993-04-27
DK320686A (da) 1987-01-06
IE861806L (en) 1987-01-05
JP2887248B2 (ja) 1999-04-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPS6214786A (ja) グラム陽性菌の新規発現調節配列
US4977247A (en) Immobilized protein G variants and the use thereof
US4956296A (en) Cloned streptococcal genes encoding protein G and their use to construct recombinant microorganisms to produce protein G
AU643511B2 (en) Bacterial vectors
EP0235410B1 (en) Prokaryotic expression system
US4954618A (en) Cloned streptococcal genes encoding protein G and their use to construct recombinant microorganisms to produce protein G
US5082773A (en) Cloned streptococcal genes encoding protein G and their use to construct recombinant microorganisms to produce protein G
JPS62181789A (ja) バチルスの制御領域のクロ−ニング及び解析のためのプラスミド
WO1987005025A1 (en) Cloned streptococcal genes encoding protein g and their use to construct recombinant microorganisms to produce protein g
US5312901A (en) Cloned streptococcal genes encoding protein G and their use to construct recombinant microorganisms to produce protein G
Lampe et al. Cloned gene encoding the delta subunit of Bacillus subtilis RNA polymerase
Larson et al. Sequence and transcriptional regulation of com101A, a locus required for genetic transformation in Haemophilus influenzae
JPH1084978A (ja) 改良されたリボフラビン生産
US5229492A (en) Cloned streptococcal genes encoding protein G and their use to construct recombinant microorganisms to produce protein G
US5654169A (en) Vectors and transformed host cells for recombinant protein production at reduced temperatures
EP0048497A2 (en) DNA transducing vector and microorganism containing it
JPH06311884A (ja) プラスミド及びそれで形質転換されたエ シェリチア・コリ
JPS63501053A (ja) 異種タンパク質の生産方法
US4585739A (en) Plasmid for foreign gene expression in B. subtilis
Madu et al. Molecular cloning and in vitro expression of a silent phenoxazinone synthase gene from Streptomyces lividans
US5585260A (en) PSM112 plasmid vector for expression in bacillus subtilis
JPS6279794A (ja) 殺虫用リゾビウム科菌体
WO2005113583A1 (en) An expression system comprising operably linked rgg gene and gtfg promoter
EP0547873B1 (en) A novel translational activating sequence
JPH01502478A (ja) 線維芽細胞のヒトβ１―インターフェロンの合成をコードする組換えプラスミドＤＮＡ　ｐＰＲ―ＩＦＮβ１―１３、それの操作方法、および同プラスミドＤＮＡを含有する、ヒトβ１―インターフェロンを生産する大腸菌

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

EXPY Cancellation because of completion of term