JPS6279794A - 殺虫用リゾビウム科菌体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、　Ｂのｉ　な普゛日 （産業上の利用分野） 本発明は遺伝子工学、および生体に影響をおよぼす細菌
性組成物、特にバチルス属（Ｂａｃｉｌ　１ｕｓ）由来
の組成物の分野にある。

（従来の技術） 本発明に関係しその背景となる情報を開示する文献を以
下に示す。Ｈ，Ｅ、　５ｃｈｎｅｐｆ　ｅｔ　　ａｌ、
　（１９８５）Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６０
　：　６２６４−６２７２．およびＨ，Ｅ。

５ｃｈｎｅｐｆ　ａｎｄ　Ｈ，Ｒ，Ｗｈｉｔｅｌｅｙ　
（１９８５）　Ｊ、　ＢｔｏＬ。

Ｃｈｅｍ、　２６０　：　６２７３−６２８０はそれぞ
れ、　ＨＤ−１遺伝子のＤＮＡ配列を開示し、）１０−
１トキシン成分がアミノ近位６ＢｋＤペプチドに存在す
ることを報告した。

Ｍ、　Ｊ、　Ａｄａｎｇは米国特許出願番号６１７，３
２１で、バチルス・チューリンギエンシス　クルスタキ
変種ＨＤ−７３（Ｂ、　　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓ
　　ｖａｒ、　　ｋｕｒｓｔａｋｉ＋１０−７３　）結
晶性蛋白遺伝子の完全な配列を開示し。

部分的なまた完全なＩ（Ｉ）−７３プロトキシン遺伝子
を発現するエセリシア・コリ　（月エ　り旦）菌体の毒
性を、またｐＢｔ　７３−１６　、　ｐＢｔ　７３−１
０およびｐＢｔ　７３−３　（Ａｖａ）の誘導を教示し
ている。

せ バチルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔ
ｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓ　）は、バチルス・セレウス
（Ｌｃｅｒｅｕｓ）と関係の深い種の細菌で、胞子形成
時に蛋白様の結晶性封入体を作る。この結晶はパラ胞子
で、菌体内で発達中の胞子と反対側の端部に作られる。

結晶蛋白はよくδ−エンドトキシンと呼ばれており２つ
の型が存在する。すなわち２分子量（ＭＷ）約１３０キ
ロダルトン（ｋＤ）の無毒性プロトキシンと、　ＭＷ約
６８ｋＤのトキシンである。結晶には、多くの昆虫種の
幼虫の腸内で活性化されるプロトキシン蛋白が含まれて
いる。活性化中にプロトキシンは分解され、その毒性成
分はアミノ近位の５８〜６８ｋＤポリペプチドに存在す
る。ｉｎ　　ｖｉｖｏでは、結晶は可溶化され昆虫の腸
のアルカリ度およびプロテアーゼにより毒性型に変わっ
て活性化される。結晶蛋白はｉｎ　　ｖｉｔｒｏでは、
可溶化に続いてトリプシンのようなプロテアーゼの作用
により活性化されるであろう（Ｒ，Ｍ、　Ｆａｕｓｔ　
ｅｔ　　ａｌ、　　（１９７４）　Ｊ、　Ｉｎｖｅｒｔ
ｅｂｒ、　Ｐａｔｈｏｌ、　２４　：　３６５−３７３
）。

Ｙ、　Ｎａｇａｍａｔｓｕ　　ｅｔ　　ａｔ、　（１９
８４）＾ｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。

４８　：　６１１−６１９は、トリプシン耐性の毒性ペ
プチドのアミノ末端は翻訳産物のアミノ酸２９に始まる
こと、すなわち生じたペプチドのサイズは約５８ｋｄａ
ｌであることを報告している。Ｈ，Ｅ、　５ｃｈｎｅｐ
ｆ　ａｎｄＨ，Ｒ，Ｗｈｉｔｅｌｙ　（１９８５）　Ｊ
、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６０　：　６２７３−
６２８０は、　ＨＤ−１ではアミノ末端からアミノ酸残
基５０までの欠失あるいはカルボキシ末端から残基６０
３までの欠失により毒性が消失するのに対し、アミノ末
端およびカルボキシ末端からそれぞれ１０残基および６
４５残基の欠失では消失しないことを報告している。プ
ロトキシンの活性化についてはＨ，Ｅ。

Ｈｕｂｅｒ　ａｎｄ　Ｐ、　Ｌｉ１ｔｈｙ　（１９８１
）がＰａｔｈｏ　ｅｎｅｓｉｓ　ｏｆＩｎｖｅｒｔｅｂ
ｒａｔｅ　　Ｍｉｃｒｏｂｔｏｌ、Ｄｉｓｅａｓｅｓ、
ｅｄ、：　　Ｅ、Ｗ。

Ｄａｖｉｄｓｏｎ、　ｐｐ、　２０９−２３４で総説し
ている。

亙貰学 バチルス・チューリンキニンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ貝
阻ｊ四ｌ↓ｓｉｓ　）およびその結晶性エンドトキシン
は有用である。というのは、その結晶蛋白は１００を越
える昆虫種の幼虫、最も一般的には鱗翅類目や双翅類目
の幼虫、に有毒であることが知られている殺虫用蛋白で
あるからである。これら種の多くは経済上重要な病害虫
である。バチルス・チューリンキニンシス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ　　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓ　）変種の宿主
域は異なり得る（Ｒ，Ｍ、　Ｆａｕｓｔ旦　１．。

（１９８２）　ｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎ　１ｎｅｅ
ｒｉｎ　　ｉｎ　ｔｈｅ　ＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅｓ
、　ｅｄ、　Ｎ、　Ｊ、　Ｐａｎａｐｏ１０ｕｓ＋　ｐ
ｐ、　２２５−２５４）。

エンドトキシンの効力および安全性はＦａｕｓ　を等（
上記）により総説されている。他の有用な総説とＨ，Ｄ
、　Ｂｕｒｇｅｓ、　ｐｐ、　２２３−２４８やＨ，Ｅ
、　Ｈｕｂｅｒ　ａｎｄＰ、　Ｌｉ１ｔｈｙ　（１９８
１）　ｉｎ　　Ｐａｔｈｏ　ｅｎｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｉｎ
ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅＭｉｃｒｏｂｉａｌ　　Ｄｉｓｅ
ａｓｅｓ、ｅｄ、：　　Ｅ、Ｗ、Ｄａｖｉｄｓｏｎ、ｐ
ｐ。

２０９−２３４が含まれる。

丘ヱ生息ヱ 結晶蛋白遺伝子は通常、バチルス・チューリンキニンシ
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　■肛植れ並１虹）で観察され
ているいくつかの巨大プラスミドの１つに見出され得る
が、ある株では染色体上に位置し得る（Ｊ、　Ｗ、　Ｋ
ｒｏｎｓｔａｄ　　ｅｔ　　ａｌ、　（１９８３）　Ｊ
、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。

１５４　：　４１９−４２８　；　Ｊ、　Ｍ、　Ｇｏｎ
ｚａｌｅｚ　Ｊｒ、　　ｅｔ　　ａｔ、（１９８１）　
Ｐｌａｓｍｉｄ　５　：　３５１−３６５　）　、結晶
蛋白遺伝子はいくつかの研究室で、エセリシア・コリ　
（Ｌ匹旦）で増殖し得るプラスミドヘクローン化されて
いる（以下参照）。完全なあるいは部分的なプロトキシ
ン遺伝子のいずれかを発現するエセリシア・コリ　（Ｌ
　匹旦）株は細菌増殖が阻害されることは書かれていな
い。

Ｗｈｉｔｅｌｅｙのグループ（Ｈ，Ｒ，Ｗｈｉｔｅｌｙ
　ｅｔ　　ａｔ。

（１９８２）　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃ岨ａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ
　　ａｎｄ　Ｇｅｎｅ　Ｒｅ　ｕｌａｔｉｏｎ−４ｎ　
Ｂａｃｉｌｌｉ、　ｅｄｓ、：　Ａ、　Ｔ、　Ｇａｎｅ
ｓａｎ　ｅｔ　　ａｌ。ｐｐ。

１３１−１４４．　Ｈ，Ｅ、　５ｃｈｎｅｐｆ　ａｎｄ
　Ｈ，Ｒ，Ｗｈｉｔｅｌｅｙ　　（１９８１）　Ｐｒｏ
ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ　
　７８　：　２８９３−２８９７、およびヨーロッパ特
許出願番号６３，９４９）は。

バチルス・チューリンキニンシス　クルスタキ変種（Ｂ
、　　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓ　　ｖａｒ、　　ｋ
ｕｒｓｔａｋｉ）の）１０−１−Ｄｉｐｅｌ株およびＨ
Ｄ−７３株由来のプロトキシン遺伝子を含存するＤＮＡ
のクローニングを報告した。

ＨＤ４−Ｄｉｐｅｌの遺伝子はエセリシア・コリ　（Ｅ
、　　ｃｏｌｔ）中でおそらく自身のプロモーターから
転写され翻訳されたｍ　Ｗｈｉｔｅｌｅｙ等（上記）は
、　ＨＤ−１プロトキシンをコードする配列の３゛−末
端を欠失する構築を報告した。この欠失には成熟トキシ
ンの一部をコードする配列が含まれていた。核酸配列決
定により転写および翻訳の開始部位が決定された（１１
゜：、　Ｗｏｎｇ旦　ａｌ、　（１９８３）　Ｊ、　Ｂ
ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５８　：１９６０−１９６７
　’）。勧ｎｇ等は、トランスポゾン突然変異生成によ
りＨＤ−１結晶蛋白遺伝子の位置決定を行った。そして
その遺伝子の３″−末端へのトランスポゾン挿入ではエ
セリシア・コリ　（［！、　　ｃｏｌｉ）で３８ｋＤペ
プチドが産生されることを記載しているが。

１３０ｋＤプロトキシンを産生じなかった株の抽出物に
関連する殺虫活性は報告していない。ＨＤ−１遺伝子は
完全に配列決定されている（Ｉｌ、　Ｅ、　５ｃｈｎｅ
ｐｆｅｔ　　ａｌ、　（１９８５）　Ｊ、　Ｒｉｏｔ、
　Ｃｈｅｍ、　２６０　：　６２６４−６２７２）。

毒性にはプロトキシンのアミノ近位５５％で十分であり
、アミノ末端の１０個のアミノ酸残基は毒性には不要で
ある（Ｈ，Ｅ、　５ｃｈｎｅｐｆ　ａｎｄ　Ｈ，Ｒ，Ｗ
ｈｉｔｅｌｅｙ（１９８５）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ
ａｎｔ、　２６０　：　６２７３−６２８０）　、アミ
ノ末端の５０個のアミノ酸残基を欠くペプチドは毒性を
持たなかった。

Ａ、に１ｉｅｒ　　旦　ａｌ、　（１９８２）　ＲＭＢ
ＯＪ、　１　：　７９１−７９９およびＧ、　Ａ、　Ｈ
ｅ１ｄ旦　ａｌ、　（１９８２）　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　？？　
：　６０６５−６０６９は、それぞれバチルス・チュー
リンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎ　１ｅ
ｎｓｉａ　）のベーリナ−（ｂｅｒｌｉｎｅｒ）　１７
１５株およびクルスタキ（ｋｕｒｓｔａｋｉ）変種に由
来する結晶蛋白遺伝子のクローニングを報告している。

結晶蛋白遺伝子を有する断片はベクターｐＨＶ３３　（
Ｇ、Ｒａｐｏｐｏｒｔ　ｅｔ　　ａｌ、（１９７９）　
Ｍａｔ、　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ。

１７６　：　２３９−２４５　）に連結され、これはエ
セリシア・コリ（Ｅ、　　ｃｏｌｉ）およびバチルス属
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の両方で複製し得る。しかし、リ
ゾビウム科菌体中で維持されることはわかっていない。

エセリシア・コリ　（Ｅ、　　ｃｏｌｉ）および胞子形
成中のバチルス・サブチリス（Ｌエ　５ｕｂｔｉｌｉｓ
）の両方において。

ｐＨＶ３３に基づくクローンは１３０ｋＤの完全なプロ
トキシンの合成を導いた。

Ｍ、　Ｊ、　Ａｄａｎｇの米国特許出願番号６１７．３
２１は。

バチルス・チューリンギエンシス　クルスタキ変種ＨＤ
−７３（Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓ　　ｖａｒ
、　ｋｕｒｓｔａｋｉＨＤ−７３’）結晶蛋白遺伝子の
完全な配列を開示し。

またＨＤ−７３由来の部分的および完全なプロトキシン
遺伝子を発現するエセリシア・コリ　（Ｅ、　　ｃｏｌ
ｉ）菌体の毒性そしてｐＢｔ　７３−１６　、　ｐＢｔ
　７３−１０およびｐＢｔ　７３−３　（Ａｖａ）の誘
導を教示している。

（発明の要旨） 以下に詳述する目的に従い１本発明は部分的なプロトキ
シン遺伝子を有するＤＮＡプラスミド、天然に生じるト
キシンのアミノ酸配列の一部を有するポリペプチドであ
る部分的プロトキシン、またしばしば、天然に生じるプ
ロトキシンのアミノ酸配列のいくつかを欠く他のアミノ
酸配列を提供する。これら遺伝子は、アグロバクテリウ
ム属（相「辷−ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）とリゾビウム属
（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　）とを含む°リゾビウム科の細
菌の菌体で発現可能である。

意外に、ここで開示されるようなこれら遺伝子により産
生される完全なプロトキシンはリゾビウム科菌体で発現
されるとこの菌体の増殖を抑制することが確かめられて
いるのに対し１部分的なプロトキシンは増殖抑制性が有
意に低いことがわかうた。部分的なプロトキシン遺伝子
の構築法、および部分的なプロトキシン蛋白の発現法も
提供される。

バチルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔ
ｈｕｒｉｎ■並ｓｉｓ　）の結晶蛋白は、その毒性の特
異性が高く大部分の非標的生物に対しては完全に無毒性
であることから、殺虫剤として有用である。

プロトキシン結晶は毒性用に摂取される必要があるので
、この結晶は幼虫に食べられる位置になければならない
。従って２本発明の目的は、植物が生育できるようにす
る細菌あるいは植物と共生を形成できる細菌を提供する
ことにある。完全なプ、ロトキシン遺伝子のリゾビウム
科菌体での発現はその菌体の増殖を大いに遅らせまたそ
の菌体内で該遺伝子を維持するプラスミドを非常に不安
定にするので１本発明のさらなる目的は、完全なプロト
キシン遺伝子に由来し、昆虫の幼虫にとって有毒である
がリゾビウム科菌体の増殖と和合し得るような構造遺伝
子を提供することにある。

本発明の殺虫用蛋白の産生法は、以下の工程。

（ａ）リゾビウム科の菌体を１部分的なプロトキシン遺
伝子を含有するＤＮＡ分子を保持するよう形質転°摸す
ること、および（ｂ）部分的なプロトキシン遺伝子を含
むリゾビウム科菌体を、それにコードされる蛋白が発現
されるような条件下で増殖させること、を含有する。

本発明の組換えＤＮＡ分子は、リゾビウム科の菌体で維
持され得るＤＮＡと１部分的なプロトキシン遺伝子とを
含有する。

本発明のＤＮＡ分子は、リゾビウム科の菌体で維持され
得るＤＮＡと１部分的なプロトキシン遺伝子とを含有す
る組換えＤＮＡに由来する。

本発明のリゾビウム科菌体あるいはリゾビウムＫ　（Ｒ
ｈｉｚｏｂｉｕｍ　）バクテリオイドは、リゾビウム科
の菌体で維持され得るＤＮＡと１部分的なプロトキシン
遺伝子とを含有する組換えＤＮＡに由来するＤＮＡを含
存する。

以下に本発明の詳細な説明する。

明細書および特許請求の範囲における使用意図あるいは
使用範囲の不明瞭性を除くために、以下の用語を定義す
る。

完全なプロトキシンあるいはプロトキシンとはここでは
、バチルス・チューリンギエンシス（バーｃｉｌｌｕｓ
　　田肛旦註並虹Ｌ）の結晶蛋白遺伝子にコードされる
蛋白のことである。クルスタキ（崩ム５ｔａｋｉ　）変
種では、完全なプロトキシンは約１３０．０００ダルト
ンの分子量を有する。

完全なトキシンあるいはトキシンとはここでは。

結晶蛋白に由来する殺虫用蛋白のことであり、特に、蛋
白分解性消化のような本来はプロトキシンを活性化する
処理に抵抗性を有するプロトキシンの一部のことである
。クルスタキ（ｋｕｒｓｔａｋｉ）変種では、完全なト
キシンは約６８，０００ダルトンの分子量を有しプロト
キシンのカルボキシ末端側半分を欠いている。

部分的なプロトキシンとはここでは、プロトキシンのア
ミノ酸配列の一部を有する蛋白であって。

プロトキシンのカルボキシ末端のアミノ酸配列の一部ヲ
欠くがトキシンのカルボキシ末端は欠いていないような
蛋白のことをいう。トキシンのアミノ末端における欠失
を含む、プロトキシンアミノ酸配列の修飾はあってもな
くてもよい。部分的なプロトキシンはそのカルボキシ末
端に完全なプロトキシンには存在しないアミノ酸配列を
有してもよい。他の言葉でいえば１部分的なプロトキシ
ンをコードする構造遺伝子オープンリーディングフレー
ムは、プロトキシンのカルボキシ末端をコードする配列
は欠いてもよいがトキシンのカルボキシ末端をコードす
る配列は欠いてはならず、また完全なプロトキシンには
存在しない付加アミノ酸をコードする配列を含んでよい
。部分的なプロトキシンの主な必要条件は、それが完全
なプロトキシンに存在するアミノ酸配列を欠くことおよ
び数種の昆虫の幼虫に対し毒性を有することである。

推定上の部分的なプロトキシンのバイオアッセイは昆虫
生理学分野の当業者によく理解されている（例えば、実
施例３．５を参照せよ）。

完全なプロトキシン遺伝子１部分的なプロトキシン遺伝
子、およびトキシン遺伝子とはここでは。

示された蛋白をコードする発現可能な構造遺伝子のこと
で、各構造遺伝子はその５゛−末端に５°・・・ＡＴＧ
・・・３゛　という翻訳開始シグナルを、また３゛−末
端に翻訳終止シグナル（ＴＡＧ、　ＴＧ＾あるいはＴＡ
Ａ）を持つ。当業者に周知のように、蛋白をコードする
ｍＲＮＡが翻訳される場合、開始シグナルと終止シグナ
ルとは同一の読み枠、すなわち同じフェイズになければ
ならない。なぜなら、枠内にない翻訳終止コドンは翻訳
機構において無視され機能上存在しないことになるから
である。示された蛋白が転写物にコードされている限り
、遺伝学的構造の修飾は除外されない。完全なプロトキ
シン遺伝子から配列を除去して部分的なプロトキシン遺
伝子を作ることは２組換えＤＮＡ操作やＤＮＡ配列分析
の分野の当業者にはよく理解されており、ここでまた従
来技術で挙げた文献に例示されている。

２つの驚くべき発見が本発明の基礎になっている。１）
エセリシア・コリ　（Ｌｃｏｌｔ）のようなダラム陰性
菌の増殖と和合し得る完全なプロトキシン遺伝子の発現
は、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　）あるいはア
グロバクテリウム属（ガニｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）の
菌体の増殖とは完全には和合し得ないということ。およ
び２）プロトキシン遺伝子の３°−末端を除去して部分
的なプロトキシンを作ることにより。

菌体の増殖とより和合的なプロトキシン遺伝子発現が得
られること。我々はまた１部分的なプロトキシン遺伝子
はリゾビウム科菌体で異種のプロモーターの後ろに置か
れることなく発現されること。

すなわちバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）のプロモータ
ー支配下で発現されることを発見した。さらに驚くべき
発見は１部分的なプロトキシン遺伝子は根府内のリゾビ
ウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　）バクテリオイドにおい
てバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）のプロモーター支配
下で発現されるということである。多くのリゾビウム遺
伝子はバクテリオイドでのみあるいは遊離細菌でのみ発
現される。また１部分的なプロトキシンや完全なトキシ
ンを含むバクテリオイドが相席細胞内に存在することは
、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　）−植物の共生
に影響をおよぼさず。

また根瘤細胞の機能と和合し得る。部分的なプロトキシ
ンを含むバクテリオイドを有する相席は昆虫の幼虫にと
って有毒である。

部分的なプロトキシン遺伝子の発現によってリゾビウム
科菌体あるいはリゾビウム属（３ｈｉｚｏｂｉｕｍ　）
バクテリオイドで殺虫用蛋白を産生ずることは。

本開示の特別な教示と当業者に周知の様々な技術や手段
とを組み合わせている。はとんどの場合。

全工程の各段階に対し択一的手段が存在する。バチルス
・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｔｈｕ
−：）の株やプロトキシン遺伝子の出発材料、未熟な翻
訳終止用手段やその詳細９人工の部分的プロトキシン遺
伝子を有するベクター、部分的なプロトキシン遺伝子の
発現を推進するプロモーター、および部分的なプロトキ
シン遺伝子／プロモーター結合物が形質転換され発現さ
れるリゾビウム科の種や株、の選択のような変化に応じ
て手段は選択される。供給源や宿主生物、ベクター。

およびＤＮＡ操作戦法のような中間体や中間段階に対し
多くの変形が可能である。

本発明の実施にあたり通常最初に得られるのは。

完全なプロトキシン遺伝子あるいはプロトキシン遺伝子
断片のいずれかを有する組換えＤＮＡ分子である。この
ような組換えＤＮＡ分子の構築手段は当業者に周知であ
る。バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プラスミドが所望
のプロトキシン遺伝子を持っているのであれば、ここで
例示されるように、まずそのプラスミドを単離して該遺
伝子に冨んだＤＮＡを調整すればよい。代わりに、バチ
ルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　限
すエ鮪１ｂ猛１島−）　ＤＮＡ全体から、統計上受なく
とも１つのプロトキシン遺伝子代表物を持っていそうな
組換えＤＮＡを含む株のコレクションを行ってもよい（
すなわち、ゲノムクローンライブフリー）。バチルス属
（Ｂａｃｉｌ−Ｉｕｓ　）　ＤＮＡは、　ＤＮＡをまれ
に切断する制限エンドヌクレアーゼ（６塩基カツター、
例えば肛ｎ　ｄ　ｍまたはＰｓｔｌで、平均して約４　
ｋｂｐに１部位の割で切断する）で完全消化するか、あ
るいはＤＮＡを頻繁に切断する酵素（４塩基カツター、
例えば５ａｕ３ＡＩで、平均して約０．２５ｋｂｐに１
部位の割で切断する）で不完全消化（すなわち２部分消
化）すればよい。このとき、消化条件は、クローン化Ｄ
ＮＡ断片が完全なプロトキシン遺伝子を持ちそうである
に十分大きくなるよう調整する。次にバチルス属（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ）　ＤＮＡをベクターへ連結する。バチル
ス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の種で維持可能なベクターも
有用であるが、普通ベクターはエセリシア・コリ（Ｅ、
　　ｃｏｌｉ）で維持され得るものを用いる。バチルス
属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）　ＤＮＡ　／ベクターの結合物
は次に適当な宿主細胞へ形質転換される。候補物のコレ
クションを行った後、プロトキシン遺伝子／ベクター結
合物を保持する株は、当業者に周知の多くの手段のいず
れかを用いて同定すればよい。ニトロセルロース膜フィ
ルター上で候補物を増殖させ、溶菌し、放出ＤＮＡをフ
ィルターへ固定し、ハイフ゛リダイゼーションによりプ
ロトキシン遺伝子を含むコロニーを同定することができ
る。ハイブリダイゼーションプローブは、クローン化さ
れクロスハイブリダイズする別のプロトキシン遺伝子。

胞子形成段階に特異的なバチルス・チューリンギエンシ
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓ
　）　　ＲＮＡあるいはプロトキシンアミノ酸配列から
推定されたプロトキシン配列を有する合成核酸を含む供
給源に由来し得る。プロトキシン遺伝子がその宿主で発
現されるのであれば、殺虫活性用バイオアッセイにより
または免疫学的方法により選別を行うことができる。免
疫学的方法には、様々なイムノアッセイ　（例えば、ラ
ジオイムノアッセイや酵素を結合したイムノアッセイ）
およびニトロセルロースに結合し電気泳動的に解析され
るＤＮＡの精査に類似の方法（「ウェスタンプロット」
）が含まれる。

二）０セルロースフイルター上で増殖したコロニーを溶
菌して蛋白をフィルターに結合させ、酵素あるいは放射
性同位元素で標識した抗体を用いてプロトキシン蛋白を
含むコロニーを同定すればよい。

完全なプロトキシン遺伝子１部分的なプロトキシン遺伝
子および不完全なトキシン遺伝子を含有する組換えＤＮ
Ａ分子の構築は互いに複雑に結合されるようになり得る
。完全なプロトキシン遺伝子を分離しようとする際、そ
の３゛−配列が欠失した遺伝子小片が見出されるかもし
れない。３゛−欠失の極端な場合は、トキシンのカルボ
キシ末端をコードする配列が最初クローン化された遺伝
子断片から除かれて１発現されるポリペプチドで殺虫活
性がなくなる場合である。同様にして、５゛−配列を欠
く遺伝子断片の分離を導（こともあり得る。

反対に１部分的なプロトキシン遺伝子を構築しようとす
べき場合、完全なプロトキシン遺伝子が最初偶然に分離
されるかもしれない。欠けている遺伝子断片の分離およ
びそれらを用いてより大きな部分的遺伝子や完全な遺伝
子を再構築することは組換えＤＮＡ操作の当業者によく
理解されておりここで例示されている。一般に、すでに
所有の遺伝子断片を用いてプローブを作り１次にこれを
用いてプローブと重なる隣接配列を探す。制限酵素によ
る部分的消化条件で作られたライブラリーは。

プローブと重なるバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）　Ｄ
ＮＡ断片について直接選別することができる。制限酵素
による完全消化で作られるライブラリーは、プローブを
供給するプラスミドを作るために使用されたのとは異な
る酵素を用いて作られなければならない。当業者に理解
されているように、第２のライブラリーを構築する前に
、サザンプロットを利用して隣接する制限部位をマツプ
することは好都合である。また１重なり部分の配列を決
定するかあるいは他方により特徴付けるかして２つの断
片が同一遺伝子に由来することを確かめること、そして
２つの断片間の縫合部の配列を決定して融合が設計通り
に達成されていることおよびオープンリーディングフレ
ームが保存されていること２例えばフレームシフト突然
変異が導入されていないこと、を確かめることは有益で
ある。

結晶蛋白プロトキシンのカルボキシ近傍半分は。

プロトキシン遺伝子の３゛−側半分にコードされている
が、これは毒性には不要である。天然のカルボキシ末端
を欠いた様々なプロトキシン遺伝子産物（すなわち１部
分的なプロトキシン遺伝子産物）は、リゾビウム科菌体
でｉｌ　　ｖｉｖｏのプロセシングを受けて旦　血ある
いは−ｉｎ　　ｖｉｔｒｏの蛋白分解によるトキシンと
本質的に区別のつかないポリペプチドになる。この最後
の面においては２部分的なプロトキシン遺伝子の配列は
制限されており。

天然に生じる完全なプロトキシン遺伝子の配列が完全な
蛋白遺伝子の３゛−末端で除去されている。

定義より、コード配列はその３”−末端で翻訳終止シグ
ナルにより終止される。３′−末端配列の除去により、
新しい部位で翻訳が終止さ−れるようになり、またこの
終止シグナルが接近されるに従って天然にコードされて
いるプロトキシンアミノ酸配列からはずれることになる
。コード配列はいくつかの方法で除去できる。

天然の終止シグナルは物理的に除去する必要はない。そ
れは、プロトキシンをコードしているｍＲＮＡ転写物を
翻訳するリポソームが近づきにくいようにしさえすれば
よい。天然の終止部位を近づき難いものにする１手段と
して、フレームシフト突然変異１適常は１もしくは２塩
基対の挿入か欠失。

を天然の翻訳終止部位の５′側へ導入して、天然の終止
シグナルをトキシンの読み枠の外へ移し別のＴＡＡ、　
ＴＡＧあるいはＴＧＡ配列をトキシンの読み枠へ移すこ
とがある。天然の終止部位を近づき難いものにする他の
手段は、１〜３塩基対を置換あるいは挿入して、天然終
止部位の５゛側のその部位に直接終止シグナルを作るこ
とである。当業者によく理解されているように、置換や
フレームシフト突然変異は、オリゴヌクレオチドに対す
る部位特異的突然変異生成を含む多くの方法により導入
される。フレームシフト突然変異はよく、粘性末端を作
る制限酵素でＤＮＡを切断し続いて粘性末端を平滑末端
に変えて再連結することにより作られる。

多くの実施例には、完全なトキシンのどの部分をもコー
ドしないすなわち毒性には不要のプロトキシン配列をプ
ロトキシン遺伝子の３゛−側半分から欠失させることが
含まれる。もしこの欠失のどちらかの側にプロトキシン
遺伝子配列が隣接していれば、この欠失により、新しい
終止コドンの利用を導くフレームシフトが導入されよう
。欠失が読み枠を保存する場合は、無毒なプロトキシン
遺伝子配列の一部が欠失している間は天然に使用される
終止コドンが利用されることになろう、もし欠失がプロ
トキシンの構造遺伝子の３゛−末端を除去することにな
れば、トキシンで特定されるオーブンリーディングフレ
ームは非プロトキシンのＤＮＡ配列へ入り込み、最後は
その読み枠内の終止コドンで終止するであろう。バチル
ス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の非プロトキシンの配列、ベ
クターＤＮＡ　、および合成オリゴヌクレオチドは全て
２部分的なプロトキシンの終止コドンをコードするであ
ろう非プロトキシンＤＮＡの例である。

３°−配列はまた。完全なプロトキシン遺伝子の３″−
側半分へＤＮＡを挿入することにより除去されよう。ト
ランスボゾンは完全なプロトキシン遺伝子の３゛−側半
分を中断するための好都合な手段を提供する。代わりに
、　ＤＮＡを制限部位へ連結してもよい。欠失のところ
で上述したように、翻訳の終止はバチルス属（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ）ではないＤＮＡ内の終止コドンで生じる。同
様に、置換（これは後に挿入が続く欠失と考えられよう
）により完全なプロトキシン遺伝子の３′−末端を除去
してもよい。

本発明の目的の１つは部分的なプロトキシン遺伝子をリ
ゾビウム科菌体で発現させることにあるので１人工的に
構築した部分的なプロトキシン遺伝子は所望のリゾビウ
ム科菌体型で転写を導けるようなプロモーターの支配下
にある必要があり。

これは当業者にはよく理解されていることである。

一般には２組換えＤＮＡ技術を使って、構造遺伝子とプ
ロモーターとをお互いに関して、宿主細胞への導入後構
造遺伝子が発現されるような位置および方向で配置する
。このときプロモーターとしては、その中での発現が望
まれるような菌体で転写を推進することが知られている
ものを用いる。好ましい実施態様では９部分的なプロト
キシン遺伝子は、遊離生存状態もしくは細菌の状態のリ
ゾビウム科菌体で発現可能なプロモーターの支配下にあ
る。特別な場合として、プロトキシン構造遺伝子の分離
時にプロトキシン遺伝子プロモーターがプロトキシン構
造遺伝子とともに分離され、このプロトキシンプロモー
ターがバチルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ　　旦肛旦紅凱牡Ｌ）でプロトキシン遺伝子の発現
を推進するようなプロモーターであることがある。ここ
で開示されるように、このプロモーター／プロトキシン
遺伝子の結合物は、バチルス属（９ａｃｉｌｌｕｓ）の
発現可能な完全なプロトキシン遺伝子とも称してよく、
これはｐＲＫ２９０に挿入された場合、リゾビウム科菌
体およびリゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　）バクテ
リオイドで完全なプロトキシン遺伝子と部分的なプロト
キシン遺伝子の両方の発現を推進することが発見された
。プロトキシン遺伝子の前に周知のリゾビウム属（Ｒｈ
ｉｚｏｂｉｕａｉ　）プロモーターを置く必要はない。

バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）では、このＨＤ−７３
プロモーター領域は胞子形成時にのみプロトキシン遺伝
子の転写を推進する。

プロモーター／部分的なプロトキシン構造遺伝子の結合
物は次に、所望のリゾビウム科菌体型における維持に適
した周知のベクター内へ置かれる。

このプロモーター／構造遺伝子／ベクターの結合物は次
に、当業者に周知の適切な技術により、その菌体型の菌
体あるいはその菌体型が由来するところの菌体に導入さ
れ、そして部分的なプロトキシンの発現は上述のように
検出されよう。本出願は、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂ
ｉｕｍ　）の菌体およびバクテリオイドまたアグロバク
テリウム属（釦皿−ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）の菌体にお
ける。バチルス属（ＢａｃｉＬｌｕｓ　）の発現可能な
同じ完全プロトキシン遺伝子に由来するプロモーター支
配下での部分的なプロトキシン遺伝子の発現を例示して
いる。リゾビウム科プロモーター支配下における部分的
プロトキシン遺伝子の発現は当業者によく理解されてい
る。

（以下余白） （実施例） 以下の実施例は本発明の範囲内にある特別な実施態様を
説明する目的で述べられているものであって、範囲を限
定するものではない。本発明の範囲は特許請求の範囲で
特定されている。当業者にとって多くの変法が容易に明
らかとなろう。

これら実施例は１分子生物学分野の当業者に周知でかつ
入手可能な多くの技術を利用している。

この様な方法は、ここで詳述されていなければ。

引用文献の１つあるいはそれ以上の中で十分記載されて
いる。酵素は市販品を得、業者の指示あるいは当業者に
周知の他の変法に従って用いる。また、試薬、緩衝液、
および培養条件も当業者に周知である。この様な標準的
な技術を含む、参考となる研究として以下のものが含ま
れる：Ｒ，Ｗｕ。

ｅｄ、　（１９７９）　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、
　６８；　Ｒ，Ｗｕ　ｅｔ　　ａｌ、。

ｅｄｓ、　（１９８３）　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ
、１００　　ａｎｄ　１０１；　Ｌ。

Ｇｒｏｓｓｍａｎ　ａｎｄ　Ｋ、　Ｍｏ１ｄａｖｅ、　
ｅｄｓ、　（１９８０）　Ｍｅｔｈ。

Ｅｎｚｙｍｏｌ、６５；　Ｊ、　Ｈ，Ｍｉｌｌｅｒ　（
１９７２）　Ｅｘ　ｅｒｉｍｅｎｔｓ（１９８０）Ａｄ
ｖａｎｃｅｄ　　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　　Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ；　　Ｒ，Ｆ。

５ｃｈｌｅｉｆ　　ａｎｄ　　Ｐ、Ｃ，Ｗｅｎｓｉｃｋ
　　（１９８２）ＰｒａｃｔｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ　
　ｉｎ　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｂｉｏ１０　　　；
　　Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓｅｔ　　ａｌ、（１９８２）
　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　　；およびＲ５
Ｌ、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ　ａｎｄ　Ｒ，Ｃ，Ｔａ１ｔ　
　（１９８３）ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＤＮＡ　Ｔｅｃ
ｈｎｉ　ｕｅｓ　、さらに、　Ｒ，Ｆ、　Ｌａｔｈｅ　
ｅｔ　　ａｌ。

（１９８３）　Ｇｅｎｅｔ、　Ｂｎｇｉｎ、４　：１−
５６にはＤＮＡ操作上の有用な説明がある。

本文で制限エンドヌクレアーゼの名称を単独で。

例えばｒＢｃｌ　Ｉ　Ｊのように使用していれば、酵素
分解でその酵素を用いたことを意味する。但し。

図中は例外で、ここではその酵素の作用に感受性を有す
る配列部位１例えば制限部位を意味している。本文では
、制限部位は「部位」という言葉をつけて９例えばｒＢ
ｃｌ　Ｔ部位」のように表している。ｒＢｃｌＩ断片」
のように「断片」という言葉をつけて用いる場合、その
名前の酵素の作用で生じた末端を有する線状二本鎖ＤＮ
Ａ分子（例えば。

制限断片）を意味する。ｒＢｃｌ　Ｉ／Ｓｍａ　Ｉ断片
」のようなフレーズは、その制限断片がここではＢｃｌ
　ＩとＳｍａ　ｒ　という２つの異なる酵素の作用で生
じ。

その２つの末端が異なる酵素作用に由来することを意味
している。それら末端は「平滑性」　（すなわち完全に
塩基対合している）または「粘着性」（すなわち、相補
的な一本鎖オリゴヌクレオチドと塩基対合し得る対合し
ていない一本鎖の突出部を有する）のいずれかの特性を
持つこと、および通常粘性末端の配列はそれを作る酵素
の特異性によって決定されること、に注目して欲しい。

菌株は、その中に含まれるプラスミドをかっこでくくっ
て１例えばエセリシア・コリ　（Ｅ、　　ｃｏｌｔ）Ｈ
ＢＩＯＩ（６，２）のように示す。例示される全ての組
換えＤＮＡ構築は、当業者に周知で広範に入手可能な出
発材料、あるいはそれぞれＮＲＲＬ　Ｂ−１５６１２お
よびＮＲＲＬ　Ｂ−１５７５９の寄託株に保持されてい
るｐＢｔ７３−１０およびｐＢｔ７３−１６．を用いて
実施できる。

本実施例は完全なプロトキシン遺伝子と部分的なプロト
キシン遺伝子の分離およびそれらの性質を教示する。

！、１　　：Ｂｔ７３−１０とＢ　ｔ７３−３バチルス
・チューリンギエンシス　クルスタキ変種８０−７３　
（Ｂ、　　遅すエ崩五達＝ｎｓｉｓ　　ｖａｒ、　ｋｕ
ｒｓｔａｋｉＨＤ−７３）の結晶蛋白遺伝子は５０メガ
ダルトン（ＭＤ）のプラスミド上にある。このプラスミ
ドＤＮＡをＨｉｎｄ■で消化した。生じた断片をＨｉｎ
ｄｌｌｌで線状化したｐＢＲ３２２と混合してこれに連
結しくｐ、　（１（＋１ｉｖａｒ　ｅｔａｌ、　（１９
７Ｂ）　Ｇｅｎｅ　２　：９５−１１３　）　、　エセ
リシア・コリ　（Ｅ、　　ｃｏ旦）　ＨＢＩＯＩへ形質
転換した。アンピシリン耐性でテトラサイクリン感受性
の形質転換体の選別は１分離したプラスミドＤＮＡをＨ
ｉｎｄＩ［［で消化しそして６．７キロ塩基対（ｋｂｐ
）の挿入物を有するこれらクローンを選択することによ
り行った。

ｐＢｔ７３−３あるいはｐＢｔ７３−１０を保持する菌
株のバイオアッセイにより、バチルス・チューリンギエ
ンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　旦肛罰紅弘料蛙の殺虫用
蛋白の存在が証明された。

ｐＢｔ７３−３　ｐＢｔ７３−１０を制限酵素分析する
と、この２つのプラスミドはｐＢＲ３２２ベクターへ逆
方向で挿入された６、７ｋｂｐの同一のバチルス・チュ
ーリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｔｈｕｒｉｎ
　１ｅｎｓｉｓ）ＤＮＡ断片を有することが示された。

ｐＢｔ７３−１０のプロトキシンコード配列はｐＢＲ３
２２のアンピシリン遺伝子と同方向であるのに対し、　
ｐＢｔ７３−３のプロトキシンコード配列は逆方向にな
っている。ｐＢｔ７３−３は、　Ｈｉｎ　ｄ■消化、再
連結、およびＨＢＩＯＩへの形質転換に続いて適切な選
択および選別段階を経て、　ｐＢｔ７３−１０に変える
ことができる。電気泳動で分離したペプチドを蛋白プロ
ットで免疫学的に検出しまたＤＮＡ配列決定することに
より、　ｐＢｔ７３−１０およびｐＢｔ７３−３はそれ
ぞれ１つの部分的なプロトキシン遺伝子を含むことが示
された。

１．２　：　ｄ工Ｕ」遅− ５０ＭＤプラスミドに富んだＤＮＡをＰｓｔ　Ｉで完全
消化し、′Ｐｓｔｌで線状化したｐＢＲ３２２と混合し
てこれに連結し、　ＩＩＢＩＯＩへ形質転換した。テト
ラサイクリン耐性の形質転換体を、　ｐＢｔ７３−１０
の６．７ｋｂｐ　Ｈ釦ｄ■挿入物からニックトランスレ
ーションしたプローブを用いて、木質的にはＷ、　Ｄ、
Ｂｅｎｔｏｎ　ａｎｄ　Ｒ。

Ｗ、　Ｄａｖｉｓ　（１９７７）　５ｃｉｅｎｃｅ　１
９６：１８０−１８２　　に記載されているようにして
２選別した。プローブを結合した株から分離したプラス
ミドＤＮＡを制限酵素分析により特徴付けした。結晶蛋
白遺伝子の３゛−末端を含むｐＢｔ７３−１６１という
名のプラスミドを保持する菌株の同定を行った。

ＬＬ二飢豆り川 次に、プロトキシン遺伝子の５”−末端と３゛−末端と
をその特異的なＨｉｎ　ｄ　ＩＩＩ部位で互いに融合さ
せて、完全なプロトキシン遺伝子を作った。ｐＢｔ７３
−１０　ＤＮＡをハし旧で消化し、自己連結し、　ＨＢ
ＩＯＩへ形質転換した。アンピシリン耐性の形質転換体
のプラスミドＤＮＡを制限酵素分析により特徴付けし。

１１ｉｎ　ｄ　ＩＩＩ部位を持つ小さなりａｍｔ（Ｉ断
片の欠失により単一のＢａｍ　　旧部位とｔｌｉｎ　ｄ
　Ｉ［［部位とを有するｐＢｔ７３−１０　（Ｂａｍ）
という名のプラスミドを保持する菌株を同定した。アガ
ロースゲル電気泳動で分離した５ｋｂｐのｐＢｔ７３−
１６１１１ｉｎ工ｄｌｎ断片を、　）ｔｉｎ　ｄ　ｍで
消化し脱リン酸化したｐＢｔ７３−１０　（Ｂａｍ）Ｄ
ＮＡと混合してこれへ連結した。連結混合物をＨＢＩＯ
Ｉへ形質転換した後、アンピシリン耐性でテトラサイク
リン感受性の形質転換体から分離したプラスミドＤＮＡ
を制限酵素分析により特徴付けした。完全なプロトキシ
ン遺伝子を有するｐＢｔ７３−１６という名のプラスミ
ドを保持する形質転換体を同定した。

１．４　　：　　　Ｂｔ７３−３　（八ｖａ）クローン
ｐＢｔ７３−３における便利なＡｖａ　Ｉ制限部位を使
ってプロトキシン遺伝子の３゛小片を除去した。ｐＢｔ
７３−３　ＤＮＡを虹虹Ｉで消化し、自己連結し。

１＋８１０１へ形質転換した。アンピシリン耐性の形質
転換体から分離したプラスミドＤＮＡを制限酵素分析に
より特徴付けし、　ｐＢｔ７３−３　（Ａｖａ’）　と
いう名のプラスミドを保持するコロニーを同定した。

プラスミドｐＢｔ７３４６は、　ＤＮＡ配列決定により
。

１３３．３３３　Ｄのポリペプチドをコードする３５３
７ｂｐの完全なプロトキシン遺伝子を含有することが示
された。このプラスミドを保持するエセリシア・コリ　
（Ｅ、　　ｃｏｌｉ）菌体は約１３０ｋＤのペプチドを
合成し、このペプチドは免疫学的および電気泳動的に完
全なプロトキシン蛋白と区別がつかず、また同様に完全
なトキシンと区別のつかない６８ｋＤのペプチドを含む
ことが観察された。

ｐＢｔ７３−１０はＨＤ−７３プロトキシン遺伝子の５
′側２８２５ｂｐを有し、これは１０６．３４００の部
分的なプロトキシンペプチド配列をコードする。翻訳は
ｐＢＲ３２２にコードされる付加的な７８塩基の配列へ
続いているに違いなく、その結果約１０６，５６０　Ｄ
の総分子量を有するペプチドが合成される。ｐＢｔ７３
−３あるいはｐＢｔ７３−１０ヲ保持ｔ　ルエセ＋Ｊ　
、：、＋　７−　コリ　（Ｅ、　　ｃｏｌｉ）菌体によ
り産生された蛋白を分析すると、　１３０ｋＤの完全な
プロトキシンは含まれていなかった。しかし、約６８ｋ
Ｄおよび約１０４　ｋＤのペプチドが観察された。

ｐＢｔ７３−３　　（Ａｖａ）は、予想される約７２ｋ
Ｄの翻訳産物に対し、その１８３６ｂｐ中に、プロトキ
シン遺伝子のアミノ末端６８，５９１　Ｄペプチドとと
もにｐＢＲ３２２にコードされていた３２個のアミノ酸
をコードしている。エセリシア・コリ　（Ｅ、　　ｃｏ
ｌｔ）（ｐＢｔ７３−３（Ａｖａ））抽出物は約６８ｋ
Ｄのペプチドを含んでいた。

６８ｋＤペプチドは、この出願の提出時までに用いられ
たいかなる試験によっても、お互いにあるいは活性化結
晶蛋白トキシンと区別がつかなかった。

免疫学的試験、電気泳動試験、クロマトグラフィー試験
、および生物学的試験が試された。

本実施例は、リゾビウム科菌体とエセリシア・コリ　（
Ｅ、　　ｃｏｌｉ）菌体の両方で維持可能なプラスミド
の構築、このようなプラスミドのエセリシア・コリ　（
Ｅ、　　ｃｏ旦）菌体からリゾビウム科菌体への転送、
およびそこでの発現を教示する。ＥＩＯおよび６．２の
構築を第１図に示す。

２．１　：　ＥＩＯ 部分的なプロトキシン遺伝子は、　ｐＢｔ７３−３から
。

プロトキシン構造遺伝子の５′側からの０．３８ｋｂｐ
　Ｂａｎ旧／ＨｉｎｄｌＨ小片を除いたｐＢｔ７３−３
の全バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）　ＤＮＡ　とｐＢ
Ｒ３２２由来の０．３５ｋｂｐ　Ｂａｍ−１１１／肚ｎ
ｄｌＩ［小片とを有する６、７ｋｂｐＯ田ｍ１ｌＴ断片
上で取り出される。Ｂａｍ旧で消化したｐＢｔ７３−３
　ＤＮＡを、雇■で消化し脱リン酸化したｐＲＫ２９０
　（ｐＲＫ２９０はｐＲＫ２０１３により可動の広宿主
域プラスミドである。Ｇ、　Ｄｉｔｔａ旦　ａｌ、　（
１９８０）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７７：７３４７−７３５７゜その使
用法の１例として、　Ｇ、Ｂ、　Ｒｕｖｋｕｎ　ａｎｄ
　Ｆ、　Ｍ、　Ａｕ５ｕｂｅｌ　（１９８１）　Ｎａｔ
ｕｒｅ２８９　：　８５−８８を参照せよ。）と混合し
これに連結した。連結混合物をエセリシア・コリ　（Ｅ
、　　ｃｏｌｉ）ＩＩ　８１０１へ形質転換し、テトラ
サイクリン耐性の形質転換体を同定した。この形質転換
体は、　ｐＲＫ２９０のＥｃｏ　Ｒｒ部位から離れかつ
ｐ＋？に２９０の虱遺伝子近傍にある部分的なプロトキ
シン遺（云子の３”−末端を有するＥＩＯという名のプ
ラスミドを保持するものである。

２．２　　：６．２ ｐＢｔ７３−１６１を肛ｎｄＩ［［、ハ［Ｉおよび拡Ｉ
で消化した。後者２つの酵素はｐＢＲ３２２ベクターの
退縮に使用されるものである。結晶蛋白配列は５ｋｂｐ
の肛ｎｄＩ［断片上にある。消化したｐＢｔ７３−１６
１　ＤＮＡを、　１ｌｉｎ　ｄ　ｍで線状化し脱リン酸
化したＥＩＯＤＮＡと混合しこれに連結した。あるいは
、　５ｋｂｐのｌ１ｉｎｄ■断片は、　ｐＢｔ７３−１
６を肛ｎｄＩＩ［で消化して電気泳動で分離するかもし
くはｐＢｔ７３−１６を肛ｎｄＩ［［、ハ［■およびＳ
ａｌ　１で消化することにより分離され。

次いでこの５ｋｂｐ断片は、　ｔｌｉｎ　ｄ　ＩＩ［で
線状化し脱リン酸化したＥＩＯＤＮＡ　と混合されてこ
れに連結される。連結混合物をＨＢＩＯＩへ形質転換し
、テトラサイクリン耐性の形質転換体を同定した。この
形質転換体は、完全なプロトキシン遺伝子を運ぶ５ｋｂ
ｐのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）　ＤＮＡ　Ｈ４ｎ
　ｄ　ＩＩＩ断片とプロトキシンの３“側にある０、３
５ｋｂｐのｐＢＲ３２２肛ｎｄｍ／Ｂａｍ旧断片とを有
する６、２と名付けられたプラスミドを保持するもので
ある。プラスミドでは。

バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）およびｐＢＲ３２２の
配列はｐＲＫ２９０のｂ上」部位に挿入されており、　
ｐＢＲ３２２配列とプロトキシン遺伝子３′−末端とは
ｐＲＫ２９０のｔｅｔ遺伝子近傍でかつｐＲＫ２９０の
Ｅｃｏ　Ｒ１部位から離れた位置にある。

ＬＬ：リゾビウム゛　　への−漢 当業者に周知の方法である三親交配（例えば３Ｒｕｖｋ
ｕｎ　ａｎｄ　Ａｕ５ｕｂｅｌ、上記）において、プラ
スミドＥＩＯとプラスミド６．２とをｐＲＫ２０１３　
（Ｇ、Ｄｉｔｔａ旦虹、、上記）を導入してアグロバク
テリウム・チューメファシエンス（Ａ　ｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ　　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＡＴＣＣ１５９
５５およびリソ゛ビウム・ジャポニカム（Ｒｈｉｚｏｂ
ｉｕｍ　　ｄＵｓＤＡ　１９１　ｓｔｒ’　（ＵＳＤＡ
　１９１は増殖の速いリゾビウム属（Ｒｈ　１ｚｏｂ　
ｉｕｍ）の菌株である。　Ｈ，Ｈ，Ｋｅｙｓｅｒ　　ｅ
ｔ　　ａｌ、　（１９８２）　５ｃｉｅｎｃｅ　２１５
：１６３１−１６３２）へ可動させた。

６．２）の両方で結晶蛋白の配列が発現されることが。

バイオアッセイにより、また電気泳動分離後プロットさ
れた蛋白を免疫学的に検出することにより示された。こ
れに対し、　ＵＳＤＡ　１９１　ｓｔｒ’　　（ｐＲＫ
２９０）のコントロールは幼虫に対し毒性がなく、また
免疫学的に検出可能なトキシンあるいはプロトキシンの
配列を持っていなかった。

液体培養では、　［ｌ５ＤＡ　１９１　ｓｔｒ’　　（
ＥＩＯ）は［ｌ５ＤＡ１９１皿’（ｐＲＫ２９０）コン
トロールに比べいくぶん増殖が遅いことが観察されたの
に対し、　ＵＳＤＡ　１９１」江ゝ（６，２）はコント
ロールより大部増殖が遅いことが観察された。増殖速度
の違いはこれらの株を固形培地で増殖させると容易に観
察された（第２図）。Ｅ１０を保持する菌株（第２図Ｂ
）はコントロール（第２図Ａ）よりいくらか小さいコロ
ニーを形成したのに対し、６．２を保持する菌株（第２
図Ｃ）は部分的なプロトキシン遺伝子を含む菌株とコン
トロールの菌株とを長期間観察しないと目に見えないよ
うな非常に小さいコロニーを形成した。

発現可能な結晶蛋白遺伝子配列の存在により。

ｐＲＫ２９０に基づくベクターは不安定化された。栄養
に冨んだ培地ＴＹ　（５ｇ／ｌ　）リプトン、３ｇ／ｌ
イースト　エキストラフＦ　ｒ　　７　ｍＭ　ＣａＣ１
２）における液体培養でテトラサイクリン耐性なしで増
殖させると、　ＵＳＤＡ　１９１　ｓｔｒ’　　（ｐＲ
Ｋ２９０）培養の５０個の分離体のうち４９個がテトラ
サイクリン耐性であることが見出されたのに対し、　Ｕ
ＳＤＡ　１９１　ｓｔｒ′（Ｅ１０）由来の５０個の分
離体では１０個だけがそうであった。

ｐＲＫ２９０．　ＥＩＯあるいは６．２を保持する菌株
はまたダイズに植菌され、植菌後１８日目および２４日
目に採取し表面を殺菌した小瘤由来の分離体をテトラサ
イクリン耐性で試験した。ｔｌｓＤＡ　１９１　　ｓｔ
ｒ’　　（ｐＲＫ２９０）植菌物を用いると、１８日目
および２４日目の植物体それぞれに由来する手痛１２細
巾１２個および１６個中１６個が薬剤耐性分離体を産生
じた。これに対し、　ＵＳＤＡ　１９１　ｓｔｒ’　　
（ＥＩＯ）植菌物を用いた場合は、１８日目および２４
日目の植物体それぞれに由来する手痛１２細巾７個およ
び１６個中５個が薬剤耐性分離体を産生じた。　ＵＳＤ
Ａ　１９１　ｓｔｒ’　　（６，２）ヲ植菌した１８日
目の植物体に由来するリゾビウム・ジャポニカム（Ｒ，
暉狙四遅９搬−の手痛１６個中２個がテトラサイクリン
耐性分離体を産生じたく２４日目の根瘤は試験しなかっ
た）。ＵＳＤＡ　１９１　ｓｔ旦（ＥＩＯ）の植菌によ
り形成された根瘤の抽出物はＭ、　　５ｅｘｔａの幼虫
に有毒であることがわかった。

これらの結果から、結晶蛋白配列の発現はリゾビウム科
菌体の増殖を遅＜シ、またこの配列を運ぶプラスミドを
不安定化するかあるいはその欠除で選択するかし、この
影響は部分的なプロトキシン配列より完全なプロトキシ
ン配列でより厳しいことが示された。完全なプロトキシ
ン配列の発現は相席形成と和合し得ないが９部分的なプ
ロトキシン配列は手痛形成と和合可能であり根瘤中で発
現されると昆虫の幼虫に有毒な小瘤を形成する。

プラスミドｐＲＫ２９０．　ＥＩＯおよび６．２はまた
アグロバクテリウム・チューメファシエンス（釦匹−ｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＡＴＣ
Ｃ１５９５５へも転送した。これらプラスミドを保持す
るアグロバクテリウム属（ム「ａ狙ｃｔｅｒｉｕｍ）−
菌体の増殖および殺虫性は同じプラスミドを保持すリゾ
ビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）菌体の場合と同様であ
り、　ｐＲＫ２９０．　ＥＩＯそして６．２の順で増殖
が遅くなり、またコロニーのサイズおよび安定性が減少
した。１５９５５　（Ｅ１０）と１５９５５（６，２）
の抽出物は昆虫の幼虫に有毒であったが１５９５５　（
ｐＲＫ２９０）の抽出物はそうでなかった。

次１１」１ニスｍ止り 本実施例は、実施例１および２で使用する材料および方
法を開示する。

３．１　　：ｉ抹 バチルス・チューリンギエンシス　クルスタキ変種ＨＤ
−７３株（β、　　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓ　　ｖ
ａｒ、　ｋｕｒｓｔａｋｉｓｔｒａｉｎ　ＨＤ−７３）
　（ＮＲＲＬ　Ｂ−４４８８）はバチルス　ジエネティ
クス　ストックコレクションから得た。

バチルス・チューリンギエンシス　クルスタキ変種ＨＤ
−１（Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓ　　ｖａｒ、
　ｋｕｒｓｔａｋｉＨＤ−１）　　（ＮＲＲＬ　Ｂ−３
７９２）はＤｉｐｅｌ　（アボットラボラドリース）か
ら分離した。全てのエセリシア・コリ　（Ｅ、ｃｏｌｉ
）形質転換においてエセリシア・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）
　８８１０１株（ＮＲＲＬ　Ｂ−１１３７１）　（Ｈ，
Ｗ、　Ｂｏｙｅｒａｎｄ　Ｄ、　Ｒｏｕｌｌａｎｄ−Ｄ
ｕｓｓｏｉｘ　（１９６９）　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏ
ｌ。

４１：　４５９−４７２）を使用した。エセリシア・コ
リ　（Ｌｃｏｌｉ）　ＨＢ１０ｌ（ｐ１２３１５８−１
０）　　（ｐ１２３１５８−１０はココではｐＢｔ７３
−１０と称する）およびエセリシア・コリ　（Ｅ、　　
ｃ！；！ｗ）　ＩＩＢＩＯＩ　　（ｐＢｔ７３−１６）
はそれぞれＮＲＲＬＢ−１５６１２およびＮＲＲＬ　Ｂ
−１５７５９として、　ＮｏｒｔｈｅｒｎＲｅｇｉｏｎ
ａｌ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ＋　　１８１
５　Ｎ、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＳｔ、、　Ｐｅｏｒｉａ
、　ｌ１ｌｉｎｏｉｓ　６１６０４　ＵＳＡに寄託され
ている。アグロバクテリウム・チューメファシエンス（
Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎ
ｓ　）　１５９５５はＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃ
ｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ＋　１２３０１　
ＰａｋｌａｗｎＤｒ、、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａ
ｒｙｌａｎｄ　２０８５２　ＵＳＡにＡＴＣＣ１５９５
５で寄託されている。

３−Ｌ：プラノｊＵ９λ」堅 ｐＢＲ３２２およびバチルス・チューリンギエンシス（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓ）の
プラスミドＤＮＡはいずれもアルカリ分解法（Ｈ，Ｃ，
Ｂｉｒｎｂｏｉｍ　ａｎｄ　Ｊ。

Ｄｏｌｙ　（１９７９）　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ
ｅｓ、ユニ１５１３−１５２３）により調整した。クロ
ーニングする前に、バチルス・チューリンギエンシス（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｔｈμｍ岨旦μ＋ｉｓ　）プラス
ミドを、　０．５５Ｍ　ＮａＣ１，０，００５Ｍ　Ｎａ
ＥＤＴＡおよび０．０５Ｍ　　）リス−〇ＣＩ、ｐＨ８
，０を含む５％から２５％のショ糖勾配で、ベックマン
５Ｗ４０−１０−ターを用いて３９．　ＯＯＯｒｐｍ、
　１５℃で９０分間遠心分離して分画し。

この分画を０．５％アガロースゲル上で分析した。

線状化したベクターＤＮＡは通常、細菌のアルカリ性フ
ォスファターゼとともにインキュベーションして脱リン
酸化してから、そのベクターに挿入しようとするＤＮＡ
と混合してこれへ連結された。

３Ｌ３　　’ＩＬＩ″ｌ　白に、する　血ｔ“の討バチ
ルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕ
ｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓ）のＨＤ−１−Ｄｉｐｅ１株およ
び＋１０−７３株を変更Ｇ培地（Ａ、１．Ａｒｏｎｓｏ
ｎ　ｅｔ　　計、　（１９７１）　Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１０６　　：　１０１６−１０２
５）で増殖させて胞子形成を行い、結晶をＨｙｐａｑｕ
ｅ−７６（Ｗｉｎｔｈｒｏｐ）勾配（Ｋ。

Ｍｅｅｎａｋｓｈｉ　ａｎｄ　Ｋ、　Ｊａｙａｒａｍａ
ｎ　（１９７９）　Ａｒｃｈ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

１２０　：　９−１４））に３回通して精製し、　ＩＭ
　ＮａＣ１の脱イオン水で洗い、凍結乾燥した。結晶を
１％５Ｏ５（ドデシル硫酸ナトリウム）、２％２−メル
カプトエタノール、６Ｍ尿素、　０．１Ｍリン酸ナトリ
ウム。

ｐＨ７，２のクランキングバッファー中で０．０２％ブ
ロムフェノール　ブルーとともに９５℃で５分間加熱し
て、可溶化した。既述（Ｍ、　Ｊ、　Ａｄａｎｇ　ａｎ
ｄ　Ｌ、　Ｋ。

Ｍｉｌｌｅｒ　（１９８２）　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　４
４　：　７８２−７９３）のようにＵ、　Ｋ、　Ｌａｅ
ｍｍｌｉ　（１９７０）　Ｎａｔｕｒｅ　２２７　：６
８０−６８５の手順に変更を加えて電気泳動を行った。

ゲルを５分間染色し、脱イオン水で１時間脱染色した。

１３０ｋＤのバンドを切り出し、凍結乾燥し、　Ｗｉｇ
ｌ−ＢｕｇＡｍａ　Ｉｇａｍａ　ｔｏｒ　（タレセント
マニュファクチュアリングカンパニー）で粉砕して粉末
にした。ウサギにＦｒｅｕｎｄの完全アジュバントに浮
遊させた５０ｎＨの結晶蛋白を皮下注射し、続いて４週
問おいて不完全アジュバントに浮遊させた５０ｎｇ結晶
蛋白を２回注射した。ＨＤ−７３結晶蛋白に対して調整
されたモノクローナル抗体は解釈上ポリクローナル血清
で得られた結果と等しい結果を生じた。

３、Ｌニブロートされたペプチドの　　　　、エセリシ
ア・コリ　（Ｅ、　　ｃｏｌｉ）クローンをＬ−７’ロ
ス中で一晩増殖させて、ペレットにし、フェニルメチル
スルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ、プロテアーゼ阻害
剤）を２００ｎｇ／ｍ　ｌまで含む１０ｍＭ　ＮａＣ１
゜１０ｍＭ　）リス−〇ＣＩ　ｐＨ８，０，および１　
ｍＭ　ＥＤＴＡで１００倍濃縮浮遊液にした。この浮遊
液を氷上で音波処理し、その抽出液を凍結保存した。エ
セリシア・コリ　（Ｌ　匹旦）抽出液の電気泳動は上記
の通りであり、「ウェスタン」プロット上のペプチドの
免疫学的検出はＨ，Ｔｏｔｍｂｉｎ　ｅｔ　　ａｌ、　
（１９７９）　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　７６：
４３５０−４３５４の手順に従った。

ｓ、ｓ：Ｈのパイオア・・セイ 昆虫は市販品から得１本質的にはＲ，Ａ、　Ｂｅ１ｌａ
ｎｄ　Ｆ、　Ｇ、　Ｊｏａｃｈｉｍ　（１９７６）　Ａ
ｎｎ、　Ｅｎｔｏｍｏｌ、　Ｓｏｃ。

Ａｍｅｒ、　６９　：　３６５＝３７３あるいはＲ，Ｔ
、　Ｙａｍａｍｏｔｏ　　（１９６９）　Ｊ、　Ｅｃｏ
ｎ、　Ｅｎｔｏｍｏｌ、　６２　：　１４２７−１４３
１に記載されているように保存した。殺虫用蛋白に対す
るバイオアッセイは１本質的にはＪ、　Ｈ，５ｃｈｅｓ
ｓｅｒ旦　ａｌ、　（１９７７）　Ａｐｐｌ、　Ｅｎｖ
ｉｒｏｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、３３：８７８−８８
０に記載されているように、Ｍａｎｄｕｃａ　　５ｅｘ
ｔａの幼虫に抽出液を与えることにより行った。バイオ
アッセイ用のエセリシア・コリ　（Ｅ、　　ｃｏｌｉ）
抽出液の場合は、音波処理用緩衝液にＰＭＳＦを含まな
い。

（発明の概要） バチルス・チューリンギエンシス　クルスタキ変種ＨＤ
−７３（Ｂ、　　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓ　　ｖａ
ｒ、　ｋｕｒｓｔａｋｉ＋１Ｄ−７３）の完全な結晶蛋
白プロトキシン遺伝子および不完全な結晶蛋白プロトキ
シン遺伝子をｐｌ？に２９０へクローン化した。これら
組換えプラスミドを保持するエセリシア・コリ　（Ｅ、
、　ｃｏｌｉ）菌体はＭａｎｄｕｃａｓｅｘｔａ　　（
タバコ　イモムシ）の幼虫に有毒な蛋白を産生じた。こ
れらプラスミドはアグロバクテリウム属（幻ド舅狙屡毘
わユリ−およびリゾビウム属（Ｒｈ　１ｚｏｂ　ｉ　ｕ
ｍ）の菌体の増殖において不安定でありしかもその増殖
を抑制した。完全なプロトキシン遺伝子の存在は部分的
なプロトキシン遺伝子が存在する場合に比べはるかに不
安定でありまた抑制的であった。部分的なプロトキシン
遺伝子を含有するリゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）
菌体はマメ類の根に根瘤を形成し、これはＭ、　　５ｅ
ｘｔａの幼虫に有毒であった。完全なプロトキシン遺伝
子を運ぶプラスミドは相席形成と全く和合し得なかった
。すなわち完全な遺伝子を含有する菌株の植菌により形
成された手痛中のバクテリオイドはこの遺伝子を運ぶプ
ラスミドを持っておらず、しかも手痛は昆虫の幼虫に有
毒ではなかった。本発明は９部分的なプロトキシン遺伝
子を構築し続いてこの遺伝子をバクテリオイドやリゾビ
ウム科菌体で発現させることにより、殺虫用蛋白を産生
ずる方法を提供す−る。有用なプラスミドおよび菌体も
また提供される。

４、　ス　　の　　′　なｉＢ 第１図は実施例２に記載のＤＮＡ操作の概略図であり、
縮尺は必ずしも合っていない。ＡｍｐおよびＬｅｔはそ
れぞれ機能的なアンピシリン耐性遺伝子およびテトラサ
イクリン耐性遺伝子を示す。プラスミドを現す円と離れ
ている曲線はプロトキシンをコードする配列の位置を示
し、半丸および矢印の頭はそれぞれアミノ末端（５”−
末端）およびカルボキシ末端（３”−末端）を示してい
る。制限酵素および制限部位は以下のように示す：Ｂ、
’Ｒａｍ旧；ｔｌ、　Ｈｉｎｄｌｌｌ；にＪＬＩ；　　
８１．、　！！ＪＬＬ　ＩＩ；　Ｅ、　ＥＣＯＲｒ　：
Ｐ、ハ［Ｉ；およびＳ＋　Ｓａｌ　Ｉｓプラスミドの配
列は次のように現す：細線はｐＲＫ２９０に由来し、オ
ープンボックスはｐＢＲ３２２に由来し、そして様々に
斜線を入れたボックスはバチルス・チューリンギエンシ
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　↓ｈｕｒｉｎ　ｔｅｎｓｉｓ
）−に由来する。

第２図は、それぞれＡ、ＢおよびＣで示されるように、
プラスミドｐＲＫ２９０．　ＥＩＯおよび６．２を保持
するＵＳＤＡ　１９１　ｓｔｒ’　誘導体のコロニーの
写真である。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、殺虫用蛋白の産生法であって、以下の工程、 （ａ）リゾビウム科の菌体を、部分的なプロトキシン遺
   伝子を含有するＤＮＡ分子を保持するよう形質転換する
   こと、および （ｂ）部分的なプロトキシン遺伝子を含むリゾビウム科
   菌体を、それにコードされる蛋白が発現されるような条
   件下で増殖させること、 を含有し、これにより殺虫用蛋白が産生される方法。 ２、完全なプロトキシン遺伝子あるいは部分的なプロト
   キシン遺伝子からコード配列が欠失により除去される特
   許請求の範囲第１項に記載の産生法。 ３、３′配列除去後の部分的なプロトキシン遺伝子が、
   完全なトキシンをコードする配列を含有する特許請求の
   範囲第２項に記載の産生法。 ４、（ｂ）工程で発現される前記部分的なプロトキシン
   遺伝子がプロモーター支配下にあり、該プロモーターお
   よび該部分的プロトキシン遺伝子がバチルス属（￥Ｂａ
   ｃｉｌｌｕｓ￥）の発現可能な同一の完全プロトキシン
   遺伝子に由来する特許請求の範囲第１項に記載の産生法
   。 ５、（ａ）工程あるいは（ｂ）工程の前記菌体がアグロ
   バクテリウム属（￥Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ￥）ま
   たはリゾビウム属（￥Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ￥）である特
   許請求の範囲第１項に記載の産生法。 ６、前記プロトキシンが、バチルス・チューリンギエン
   シス　クルスタキ変種ＨＤ−７３（￥Ｂ．￥　￥ｔｈｕ
   −ｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ￥　ｖａｒ．　￥ｋｕｒｓｔａ
   ｋｉ￥　ＨＤ−７３）により産生されるのと実質的に等
   しいプロトキシンに由来する特許請求の範囲第１項に記
   載の産生法。 ７、ＨＤ−７３に由来するプロトキシンコード配列ある
   いはその遺伝子誘導体が、ＨＤ−７３由来のｐＢｔ７３
   −１６、ｐＢｔ７３−３、ｐＢｔ７３−１０もしくはｐ
   Ｂｔ７３−３（Ａｖａ）コード配列から実質的に成る特
   許請求の範囲第６項に記載の産生法。 ８、リゾビウム科の菌体で維持され得るＤＮＡと、部分
   的なプロトキシン遺伝子とを含有する組換えＤＮＡ分子
   。 ９、前記部分的なプロトキシン遺伝子がバチルス・チュ
   ーリンギエンシス　クルスタキ変種ＨＤ−７３（￥Ｂ．
   ￥　￥ｔｈｕｒｉｎｉｅｎｓｉｓ￥　ｖａｒ．　￥ｋｕ
   ｒｓｔａｋｉ￥　ＨＤ−７３）から得られる特許請求の
   範囲第８項に記載のＤＮＡ分子。 １０、前記部分的なプロトキシン遺伝子がｐＢｔ７３−
   ３（Ａｖａ）、ｐＢｔ７３−１６、ｐＢｔ７３−１０も
   しくはｐＢｔ７３−３のコード配列を実質的に含有する
   特許請求の範囲第９項に記載のＤＮＡ分子。 １１、前記部分的なプロトキシン遺伝子が完全なトキシ
   ンをコードする配列を含有する特許請求の範囲第８項に
   記載のＤＮＡ分子。 １２、プロモーターおよび部分的プロトキシン遺伝子が
   バチルス属（￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥）の発現可能な同一
   の完全プロトキシン遺伝子に由来する特許請求の範囲第
   ８項に記載のＤＮＡ分子。 １３、リゾビウム科で維持可能な前記ＤＮＡ分子がプラ
   スミドである特許請求の範囲第８項に記載のＤＮＡ分子
   。 １４、リゾビウム科で維持可能な前記プラスミドベクタ
   −がｐＲＫ２９０あるいはその誘導体である特許請求の
   範囲第１３項に記載のＤＮＡ分子。 １５、前記ＤＮＡがＥ１０または６．２、あるいはその
   誘導体である特許請求の範囲第１０項または特許請求の
   範囲第１４項に記載のＤＮＡ分子。 １６、リゾビウム科の菌体で維持され得るＤＮＡと、部
   分的なプロトキシン遺伝子とを含有する組換えＤＮＡに
   由来するＤＮＡ分子。 １７、リゾビウム科の菌体で維持され得るＤＮＡと、部
   分的なプロトキシン遺伝子とを含有する組換えＤＮＡに
   由来するＤＮＡを含有するリゾビウム科菌体あるいはリ
   ゾビウム属（￥Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ￥）バクテリオイド
   。 １８、前記菌体がアグロバクテリウム属（￥Ａｇｒｏ−
   ｂａｃｔｅｒｉｕｍ￥）またはリゾビウム属（￥Ｒｈｉ
   ｚｏｂｉｕｍ￥）である特許請求の範囲第１７項に記載
   の菌体。 １９、前記ＤＮＡがリゾビウム科菌体あるいはリゾビウ
   ム属（￥Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ￥）バクテリオイドに含ま
   れる特許請求の範囲第１６項に記載のＤＮＡ分子。 ２０、前記リゾビウム科菌体がアグロバクテリウム属（
   ￥Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ￥）またはリゾビウム属
   （￥Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ￥）である特許請求の範囲第１
   ９項に記載のＤＮＡ分子。