JPH025891A - ヒルディン誘導体 - Google Patents
ヒルディン誘導体Info
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Abstract
め要約のデータは記録されません。
Description
間しては、欧州特許出願(EP−A)第0.171.0
24号明細書に開示されている。
多くの利点を有することが明らかになっている。
チドをコードするDNA。
Thr−Tyr−Thr−Asp−Cys−Thr−G
、1u−S er−Gly−Gln−Asn−Leu−
Cys−Leu−Cys−C;lu−Gly−5er−
Asn−Val −Cys−Gly−Gln−Gly−
Asn−Lys−Cys−I 1 e−Leu−Gly
−5er−Agp−Gly−Glu−Lys−Asn−
Gln−Cys−Val−Thr−Gl y−Glu−
C1y−Thr−Pro−Lys −Pro−Gln−
5er−Xi s−Asn−Asp−Gly−Asp−
Phe−Glu−Glu−I l e−Pro−Glu
−C;lu−Tyr−Leu−GinEP−A第0.1
71.024号明細書において用いられた番号をこの配
列でも用いた。ヒルディンとその誘導体は、生物活性が
異なっている。これはトロンビンに対する親和性の相違
および/または安定性の相違によると考えられる。本発
明によるヒルディン誘導体は、驚いたことに、特異的な
活性によって特徴づけられる。
に有利に発現されることも明らかにされた。比較実験よ
って、N−末端Thr−Tyrまたは11e−Tyrで
始まる類似ヒルディン誘導体は、低収量でしか発現され
ないことが示された。
からだけでなく、とくに、それが実質的に量的に正しく
折り畳まれたかたちで高活性を有するので、有利である
。
よるヒルディン誘導体をコードする遺伝子構造物を構築
するために有用なりローニングベクターを示す。第2図
は、この遺伝子構造物を含む酵母発現ベクターを示す。
、例えは、細菌または昆虫細胞あるいは動物細胞などの
高等真核細胞における発現などによっても製造される。
えばEP−A第0.248,227号明細書に列記され
た酵母種、例えばピチア・バストリス(Pichia
pastoris) 、ハンセヌラ・ポリモルフイス(
llansenula polymorphis)。
be)または好ましくはサツカロミセス・セレビシx
(5accl〕aromycescerevisiae
)などを用いる発現は、好ましい。
明細書第0 、060 、057号、第0.008,6
32号、第0.116,201号、第0.121,88
4号、第0 、、+ 23 ;544号および第0.1
95,691号に記載のものなど、多数が知られている
。本発明によるヒルディン誘導体の製造法は、以下に酵
母α因子系を用いて記述されるが、これが単なる例示で
あることは、既知の方法によって池の発現系を用いるこ
とも可能であることから自明である。
、にurjanおよび1lerskovitz (Ce
ll W、933−943.1982)の記述で公知で
あるが、ここでは他の遺伝子の発現と遺伝子産生物の分
泌の可能性についても検討されている。この点に関して
は、Brakeら(Pr、oc、 Natl、 Aca
d、 Sci、 LL、 4642−4646.198
4)の記述も参照されたい。
び酵母プラスミドの複製開始点と雨宿主系における選択
のための遺伝子とを有する、いわゆるシャトルベクター
である。さらに、このタイプのベクターは、外来性遺伝
子の発現に必要なプロモーター配列と、必要であれば収
量を上げるためのターミネータ−配列を含み、ここには
(適宜分泌シグナルに融合した)異種構造 (hetero l ogous)の遺伝子がプロモー
ターとターミネータの間に位置している。
ある。パーセント表示は、重重パーセントである。
する。このDNA配列は、MFα前駆体タンパク質のア
ミノ酸49〜80をコードし、実質的には天然の(na
tural) D N A配列に相当する。
離のためのプローブとして用いられ、この目的のために
、32 pで標識する。このプローブを用いて遺伝子を
ゲノムλgtll酵母遺伝子バンク[例えば、 C1o
ntech Laboratories Inc。
o、 CA94303)から現在市販されているもの]
から単離する。この目的のために、α因子遺伝子を有す
るλgtllファージをプラークハイブリダイゼーショ
ン実験において同定する。陽性と同定されたプラークか
らのファージを単離して増殖させて、DNAを得る。
上で分析する。サザントランスファー実験の後、膜を3
2 p−標識DNA配列■とハイブリダイズさせる。D
NA配列■とハイブリダイズする約1.75kbのフラ
グメントを有するファージDNAを、再びW#素で切断
して、対応するフラグメントを単離する。ベクターpU
c19をEcoRIて開裂して、T4リガーゼを用いて
1.75kbフラグメントと反応させる。クローニング
ベクターlが得られる。
ラスミドを基礎に構築されたものである。
の5’−3’の方向で示したものである。ここで、MF
α配列を点線で、ヒルディン配列を破線で示した。実線
は、pUCおよびリンカ−配列を表す。第1図は、これ
らクローニングベクターを模式的に図示したものである
(比例尺で示したものではない)。
ョン反応混合液にて形質転換させる。白色のコロニーを
単離して、プラスミドDNAをこれらから得て、1.7
5kbのEcoRIフラグメントを含むプラスミドを同
定する。MFαの前駆体タンパク質の天然のDNA配列
は、アミノ酸8〜10をコードする領域にPstI切断
部位を、アミノ酸4B/49をコードする領域にTaq
I切断部位を、各々含む。MFα前駆体配列のアミノ
酸9〜48をコードするフラグメントは、単離されたプ
ラスミドDNAからPstlおよびTaq Iの反応に
よってここで単離される。ベクターpUC18をPst
lおよびK p n Iによって開裂させ、T4リガー
ゼを用いてPstI−TaqIフラグメントおよび合成
りNA配配列上反応させる。大腸菌79102をライゲ
ーション反応混合液で形質転換きせる。形質転換反応混
合物をIPTG−Xgal−Apプレートにブレーティ
ングする。白色コロニーを単離して、これらクローンの
プラスミドDNAを制限酵素分析によって特徴づけする
。
をコードするクローニングベクター2を得る。
ングベクター2から該コード配列を切り出゛して、下記
のライゲーション反応に導入する。
Iおよび部分的にPstlと反応させて、MFα前駆体
配列の最初の8個のアミノ酸をコードする配列からなる
フラグメントを単離する。さらに、ベクターpUC19
をEcoRIおよび1(pnIにて開裂させて、記述し
た二つのフラグメントと連結させて、クローニングベク
ター3を得る。後者は、アミノ酸80までの完全なMF
α前駆体配列物をコードする。
り、これはEP−A第0.171.024号明細書にr
D N A−配列I」として開示され、本発明におい
てはDNA配列tVとして表1に示されている。
て示されている。Acclはアミノ酸1〜3の領域を切
断し、BamHIはアミノ酸30/31の領域を切断し
、5aclは最後の終止コードンの最初を切断する。X
ba Iの突出配列は遺伝子の5′末端に位置し、5a
llの突出配列は3′末端に位置している。この合成遺
伝子を二つの部分にサブクローニングさせた(EP−A
第0.171,024号明細書の第1および第2図)。
P−A第0.171.024号明細書第2図に対応)
およびNo、6 (EP−A第0.171,024号明
細書第1図に対応)に示されている。
i n d 111で開裂させて、線状になったDNA
をDNA配列配列表1)に連結させる。このようにして
得たクローニングベクター5において平滑末端連結(b
lunt−ended ligation)をした部位
にNco I切断部位が形成される。
amH[およびAcclを用いる全消化によってクロー
ニングベクター6から切り出す。
Iて開裂しておいたクローニングベクター3とDNA
配列配列表1)とに連結させる。
列表1)と同様に番号を付す。この結果、MFα前駆体
配列の最初の80個のアミノ酸および本発明によるヒル
ディン誘導体の最初の30個のアミノ酸をコーISする
クローニングベクター7が形成される。これをDNA配
列分析によって確認する。
ントをBamHIおよびHi n d mによってクロ
ーニングベクター5から切り出す。このフラグメントを
同じ酵素で開裂させておいたクローニングベクター7に
連結させる。その結果、MFα前駆体配列の最初の80
個のアミノ酸および本発明によるヒルディン誘導体の完
全な配列をコードするクローニングベクター8が得られ
る。
ene a、121.1979)をBamHIで開裂し
て、突出末端をクレノウボリメラーゼで埋填する。DN
Aをエタノールで沈澱させて、牛アルカリホスファター
ゼで処理する。
フラグメントをNeo IおよびEcoRIでクローニ
ングベクター8(表2)から切り出して、突出末端を上
記のようにして埋填する。
pafHi r 17およびpafH1r18を構築す
る(第2図)。これら二つのプラスミドは、挿入フラグ
メントの位置方向が異なるのみである。
いるように、挿入配列の下流にターミネータ−を挿入す
ることが可能である(EP−A第0.171,024号
明細書第4〜6図)。この目的には、Ncolおよび/
またはBamHI切断部位が適している。
に、プラスミドpαfHir17にてロイシン要求性(
I euc i ne−dependent)酵母Y7
9株(α、t r p 1−1. l e u 2−
1 ) (Cantrellら: Proc、 Ac
ad、 Nat、 Sci、 USA a2.6250
.1985)およびDM6−6株<a/a l eu
2−3.112: :ura3+/1eu2: :
1ys2+trpl /1rpl his3−1
1.15/his3−11.15、ura3 /ur
a3−1ys2 /1ys2 arg4−17/
arg4+ adel /adel+)(MayaH
anna、 Dept、 Mo1. Biol、 Ma
ssac++usettsGeneral Ho5pi
tal、Boston、 USA)をltoらのリチウ
ム法(lto、H,ら: J、 Bacteriol、
L5.(、163,1983)によって形質転換させ
る。ロイシン無添加の選択培地上で増殖することができ
る単一コロニーを単離する。酵母ミニマル培地に各々の
コロニーを接種して、28℃で24時間培養する。細胞
を遠心分離して、上清液をトロンビン阻害分析してヒル
ディン活性を調べる。上清液がヒルディン活性を示した
酵母クローンからのプラスミドD N Aを再び単離し
て、制限酵素分析にて特徴づけをする。形質転換させた
酵母株を次の発現試験に用いる。
からの新鮮な一晩培養液から採取した細胞を接種して、
吸光度OD6θ、=0.1になるようにする。培養液を
振とうしながら28℃で8時間培養し、その後、90m
1の新鮮培地を加える。ざらに娠とうしながら20時間
培養を続ける。細胞を遠心分離して、上清液中のヒルデ
ィン活性を測定する。
にして、0.1Mi¥酸で平衡にしておいたスチレンお
よびジビニルベンゼンのコポリマーからなる有孔性吸着
樹脂((ll’D IA l0NHP20)を含む吸着
カラムにて処理する。トリス−MCI (pH8,5
)および50mM酢酸にて洗浄した後に、30%強度の
イソプロパツールにて溶出を行う。ヒルディン誘導体を
含む両分を集めて、20mMピペラジン−HCl (p
H6)で平衡にしておいたQ−S E P H−A R
OS E ”カラムにて精製する。この場合の溶出は、
0〜0.25MN a Cl 3度勾配にて行う。ヒル
ディン誘導体を含む両分を再び集めて、C18逆相クロ
マトグラフィーカラム上のHPLCによって精製する。
ク質配列分析機にかける。
)の代わりに次式の配列を用いる。その結果、酵母培養
液の上清液には微少のヒルディン活性しか検出されない
。
gCT TTCGAT AAA AGACA
T GGA AACCTA TTT
TCT(KpnI) Thr (Tyr) ACG T TGCATA (A(:C4) Hb (Pro) Leu Asp Lys
ArgCT TTCGAT AAA AGA
CAT GGA AACCTA TTT
TCT(Kpnl) DNA配列配列m用いる場合には、クローニングベクタ
ー7および8(表2)に対応するベクターはAccI切
断部位を含まない。
TTCTCCTA CAA CGA CAA AACG
GT AAG AGG(TaqI) AACAGT ACT AAT AACGGT TTA
TTG TTCTTG TCA TGA TTA T
TG CCA AAT AACAAGATT AAT
ACT ACT ATT GCT AGCATT GC
TTAA TTA TGA TGA TAA CC;A
TCG TAA CGAGCT AAA GAA G
AA GGG GTA CCGA T’rT CTT
CTT CCC(Kpnl) Il、 S’ CATGGA 3’ GTACCTTCG八 51 (HlndZII) (Pro) Leu Asp Lys Arg
Leu Thr (Tyr)IIl、 S’
CT TTG GAT AAA AGA
CTT ACG T 3’3’ CAT
GGA AACCTA TTT TCT G
AA TGCATA 5’(KpnI)
(AccI)tno
u O(:lOoutb Q、<E−
IL1′1為 (E−1u’lk (Jリ のgh<
u<hの−<E−1cP山 00 の山 Hく φ
Hく:l0(l−1細oυo o、ouo
c:ouoゆ一一<8 寸AぐOO寸のトくHぐ
−〇<8ml+3r−ILI(J QE4r4<HX
(r4L)Cu tOLlへOO>F4(:1−+f
−1< >CJ(j コ 8(rp+、−+
LICJ Fl、−I Ll(J cq−C)
CJ F1a 8く0ロ OO寸Q L)(J
LI’lLI Qυ ψ−00Q、C)L) ”
J<E−4Ql(JC5k OOへψ <8 へ−<
E−j N(1+ <)1 〜為 く8のく 0υ
ψa C)(J u’+< じCJ l!1
1h E−+(:nn コ E−1< 、−<E−+< wE−
+< OH(ωOE@< ω111 E@<
(71Φ OO■−〇〇NQ (JLI Fl
> OCJ ぐ(/l )t< Ll’1ll
L+ CJC)く 表2=クローニングベクター E’−(1,75kb a−FragIT+ent)・
=E−K・・・(α−80−49)・・・T・・・(α
−48−8)・・・P−B−K・・・(w−80−49
)・・4・・(a−48−8)”・P−−E−B−−−
(H1r31−64)−9−Hc−Hd−B−−−(H
ir31−64)−5−N−Hd−B−−−(H1r3
0−3)−−−A−−−X−A−Hd−B−−−(Hi
r30−3 )−−−A−−−K・・・(a−80−8
) = P−E−Hd−N−9−−−(H1r64−3
)−−−A−−−に−(α−80−8)・−4’−E−
によるヒルディン誘導体をコードする遺伝子構造物を構
築するために有用なりローニングベクターを示す、説明
図である。 第2図はこの遺伝子構造物を含む酵母発現ベクターを示
す、説明図である。 、、、MFα配列 一一−ヒルディン配列 制限酵素略号 A = AccI B= BarnHl 1: = EcoRl 1((= )IincIr Hd = HlndIII K = KpnI N = Ncol P = PstI S = Sal工 T = Taql X = Xbal
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、下記のアミノ酸配列を有するヒルディン誘導体。 【遺伝子配列があります】 2、請求項1に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドをコードするDNA。 3、請求項2に記載のDNA配列を含むベクター。 4、請求項2に記載のDNAを宿主細胞において発現さ
せることからなる、請求項1に記載のポリペプチドの製
造法。 5、宿主細胞が酵母細胞である、請求項4に記載の製造
法。 6、請求項に記載のポリペプチドを含んでなる医薬物。
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