KR950010818B1

KR950010818B1 - 효모에서 단백질 감미료의 발현

Info

Publication number: KR950010818B1
Application number: KR1019900701941A
Authority: KR
Inventors: 조중명
Original assignee: 주식회사럭키; 성재갑
Priority date: 1988-12-29
Filing date: 1989-12-29
Publication date: 1995-09-23
Also published as: WO1990007580A1; AU634513B2; EP0409928A1; EP0409928B1; JPH03503002A; CA2006845A1; DE68928061D1; DE68928061T2; JP2715000B2; KR910700342A; AU4819790A; ATE153379T1; ES2101694T3; CA2006845C

Abstract

내용 없음.

Description

[발명의 명칭]

효모에서 단백질 감미료의 발현

[발명의 상세한 설명]

[관련 출원]

본원은 1987년 6월 19일자 특허출원 제064,341호의 부분계속출원이다.

[기술분야]

본 발명은 합성 단백질 감미료를 제조하기 위한 재조합 방법과 조성물에 관한 것이다.

[배경기술]

모넬린은, 서부 아프리카에서 서식하는 Dioscorephyllum comminsii하는 식물의 열매인 "이상한 액과(Serendipity berries)"에 수액에 존재하는 매우 단맛의 물질이다. 이 물질은 동질성 물질로 정제되어지는 바, 탄수화물이 전혀 함유되지 않은, 분자량 1.1×10⁴의 염기성 단백질인 것으로 나타났다. 모넬린은 열대 식물에서 찾아볼 수 있는 몇몇 감미료 또는 조미료들 중에서 그 특성이 가장 잘 알려진 물질로, 크기가 거의 비슷한 2개의 서브유니트가 비공유결합으로 결합되어 있다. 이 2개의 서브유니트는 서로 동일하지 않으며, 모넬린의 맛을내는 능력은 2개의 서브유니트와 하나의 단일 메르캅탄기에 연유하는 것으로 이를 차단하면 단맛이 상실된다.

식물 원료로부터 천연생성물을 추출하는 것의 불확실성 및 비용 때문에, 단백질 감미료를 생산하기 위한 다른 경로가 실질적인 관심을 끌고 있다. 재조합 기술은 다양한 종류의 단백질을 합성할 기회를 제공하였다. 그러나, 재조합 기술을 사용할 경우, 유전자를 제조하기 위한 전략을 개발하고 단백질이 숙주세포에서 성공적으로 발현되었는가를 입증해야 하며 생리활성을 나타내는 단백질로 분리하는 것이 필요하다. 많은 경우에, 천연적으로 발생한 시퀀스를 수정하는 것이 필요하여, 유용한 생성물 생산의 성공에 대한 불확실성은 실질적으로 증가되어진다.

관련문헌 : Morris et al., J. Biol. Chem.(1973) 248 : 534~539에 모넬린의 특성이 설명되어 있으며, 그밖에 Cagan, Science(1973) 181 : 32~35 : Wlodawer and Hodgson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1975) 72 : 398~399 : Bohak and Li. Biochimica et Biophysica Acta(1976) 427 : 153~170) : Hudson and Bieman, Biochem. Biophys. Res. Comn.(1976) 71 : 212~220 ; Jirgenson, Biochem. Biophys. Acta(1976) 446 : 255~261 및 Van der Wel and Loeve, FEBS Lett. (1973) 29 : 181~183에도 모넬린의 특성에 대해 설명되어 있다. 미합중국 특허 제3,998,798호에는 천연 모넬린의 제조방법이 설명되어 있다. 효모의 리더 시퀀스에 대해서는 Stack et al., Nucl. acidsres. (1984) 12 : 6011-6030 및 Julius et al., Cell(1984) 37 : 1075-1085에 설명되어 있다. 시스(Cis)로 작용하는 DNA 효소인 활성 시퀀스 윗쪽인 GAL에 대해서는 Davis, Mol. Cell. Biol.(1984) 4 : 1440-1448에 설명되어 있으며, 글리세르알데히드-3-포스페이트의 전사개시 부위는 Holland and Holland, J. Biol. Chem. (1979) 254 : 5466-5475 ; 9839-9845와 Holland et al., ibid.(1983) 258 : 5291-5299에 설명되어 있다.

[발명의 개요]

본 발명은 신규한 단백질 감미료를 제조하기 위한 방법과 조성물에 관한 것으로서, 감미료를 효소 숙주내에서 발현시키고 발현된 감미료가 활성형태로 분비되며 고수율로 분비되도록 하는 방법과 조성물을 제조하는 것이다.

[특정 구현예의 설명]

본 발명은 A(Ⅰ)와 B(Ⅱ) 서브유니트 사이의 연결체와 적어도 하나이상의 아미노산 치환을 포함하여 적어도 하나이상의 변이 부위를 창출함으로써 초래되어 변형된 야생형 시퀸스를 갖는 합성모넬린을 제조하는 신규한 방법을 제공하는 것이다. 그리고 본 발명은 강력한 전사 개시 부분, 특히 강력한 효모 전사 개시 부분의 3'부분과 상기 3'부분의 전사 활성을 증강시키는 5'부분을 함유하는 혼성 전사 개시 부분을 사용한 구조물을 제공한다.

목적 감미료의 발현을 위해 사용된 상기 DNA 구조물 5'→3'의 전사 방향으로 전사 개시부분과 개시 코돈을 함유한 오픈 리딩 프레임(open reading frame), 선택적으로 시그널 시퀀스를 제거하고 성숙한 펩티드 생성물을 생산할 수 있도록 분비와 프로세싱(Processing)에 제공되는 시그널 시퀀스 및 전사 종료부분을 함유하며 상기 개시부분과 종료부분은 효모에서 기능하는 것이다. 전사 개시영역은 천연 발생된 부분을 그대로 두어도 좋으며, 바람직하기는 외부로부터 도입된 것으로 인핸서(Enhancer) 및 조정 부위로 역할하는 5'부분과 효모 RNA 폴리머라제 개시부위로 역할하는 전사 개시를 위한 3'부분을 갖도록 선택할 수도 있다. 상기 5' 부분으로는 전사 발생의 강화 조절, 즉 열쇼크 유전자, 메탈로티오네인 유전자 및 대사물 유도 유전자 등과 같은 유도성 조절에 제공되는 부분들이면 어떤 것도 사용될 수 있다.

본 발명의 특징적인 부분은 GAL1, 10조절부분, 특히 윗쪽의 활성 시퀀스로서, 이들은 다른 탄소원으로 숙주 세포를 고밀도로 배양한 후 탄소원으로 갈락토오스를 단독으로 사용함으로써 유도될 수 있다. 일반적으로, 5'부분은 조절영역이 약 1kbp 미만일지라도 50bp 이상, 바람직하게는 75bp, 더욱 바람직하게는 500bp 이상일 수 있다. 전사의 유도성 조절과 관련된 시퀀스는 3'부분에 일반적으로 400bp 이하, 바람직하게는 250bp 이하의 크기를 갖는다. 3'부분이나 5'부분을 갖지 않는 프로모터 부분으로는 효모에서 가능하는 강력한 전사개시부분이나 프로모터이면 어느 것도 사용될 수 있으며, 알코올 데히드로게나제 I 또는 II, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 피루베이트키나제, 트리오스 이소머라제, 포스포글루코스 키나제 등과 같은 해당(解糖) 효소 개시영역이면 어떤 것도 사용될 수 있다.

본 발명에서 특히 바람직한 것은 글리세르 알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제이다. 그 밖에, 프로모터 부분으로서 α-아밀라제 부분, 인버타제 부분과 알칼린 포스파타제 부분 등이 포함된다. 3'부분은 일반적으로 약 150bp 이상, 보다 일반적으로는 약 250bp 이상이면서, 일반적으로 1.5kbp 이하, 보다 일반적으로 2kbp 이하이다. 3'부분은 일반적으로 약 200bp내, 보다 일반적으로는 150bp내의 개시코돈을 갖는다.

상기 두개의 부분은 편리한 방법에 따라 결찰시킬 수 있으며, 유용한 부분이 존재할 경우 이를 이용할 수 있다. 유용한 제한 부위가 없는 경우에는, 실험관내에서 변이시키거나 기초적인 수정을 할 수 있으며, 다른 제한 부위를 이용할 수 있는데 어댑터를 이용하여 두개 부분을 결합시킬 수 있다.

코딩 부분은 5'→3'의 전사 방향으로 목적물을 분비시키기 위한 시그널 시퀀스 및 상기 시그널 시퀀스와 성숙한 펩티드 생성물을 제공하기 위한 프로세싱 시그널을 제거하는 프로세싱 시퀀스 부분인 개시 코돈과 성숙한 펩티드 생성물을 코딩하는 코딩 부분을 함유한다.

코딩 시퀀스는 일반적으로 N-말단으로서 서브유니트 B(II)을 갖으며 C-말단으로서 서브유니트 A(I)을 갖도록 결합된 것이다(이때, 서브유니트는 천연 또는 변형된 것 모두 사용하여도 좋다.) 결합 부분은 변환 되어질 수 있으며 결합 부위와 접해 있는 아미노산들도 포함될 수 있고, 이때 하나 이상의 아미노산이 변화될 수 있다.

2개의 서브유니트는, 일반적으로 10개 이하 보다 일반적으로 8개 이하의 짧은 연결체를 이용하여 연결시키거나, 혹은 직접 연결 바람직하게는 연결부위의 아미노산들을 변형시켜 직접 연결시킬 수 있다. 연결체를 형성하기 위한 연결부위의 아미노산들은 극성 연결을 위해 제공되는 바, 서브유니트 말단에 존재하는 아미노산 중 적어도 50수% 이상 일반적으로 적어도 75수% 이상이 극성이 되도록 하며, 편리하게는, 적어도 25수% 이상 일반적으로는 약 50수%를 자연상태로 두도록 한다. 이러한 아미노산들은 한 루프(loop)의 서브유니트 I과 II로부터 올 수 있다.

연결과 관련하여, 연결부위는 서브유니트의 천연 시퀀스중 10개 이하 일반적으로는 6개 이하의 아미노산을 연결체로서 포함한다. 서브유니트 II의 C-말단을 서브유니트 I의 N-말단과 연결시키는데 있어서, 연결부위는 서브유니트 II의 Ile(46)와 서브유니트 I 의 Gly(6)에 존재하며, 만일 중재 아미노산이 있다면, 연결체인 이들을 포함한다.

N-말단이 서브유니트 II에 존재할 때, 서브유니트들 중 하나 또는 모두에서 연결부위의 야생형 아미노산 중 하나 이상을 제거 또는 치환시킬 수 있는 바, 일반적으로 12개 이하, 보다 일반적으로 10개 이하의 아미노산을 제거 또는 치환시키며 보다 일반적으로 6개 이하의 아미노산을 제거 또는 치환시킨다. 일반적으로, 제거되거나 치환된 아미노산 중 75% 이하가 서브유니트 중의 하나와 관련되도록 한다.

바람직한 연결체로는 다음과 같은 시퀀스를 포함한다.

aa¹ _x-aa² _x-aa³ _x-aa⁴ _x-aa⁵ _x-aa⁶ _x-aa⁷ _x-aa⁸ _x

여기서, 하나의 아미노산만은 존재할 필요가 있으며, 각 아미노산들은 다음과 같이 정의되는 바,

aa¹ _x은 A, D, E, K, R 또는 Y이며,

aa² _x는 Y, A, D, E, N, Q, R, T, K 또는 S이며,

aa³ _x은 N, Q, S, T, D, E, R, A 또는 Y이며,

aa⁴ _x는 F, W, Y, S, T, D, E, K 또는 R이며,

aa⁵ _x는 D, E, K, R, L 또는 T이며,

aa⁶ _x은 D, E, V, I, L, K 또는 R이며,

aa⁷ _x은 G, A, V, I, L, K 또는 R이며,

aa⁸ _x은 K 또는 R이고,

x는 0 또는 1이며 적어도 하나이상의 x는 1이다.

바람직한 조성은 다음과 같다.

aa¹은 Y 또는 E이고,

aa²는 D, E, Y 또는 K이며,

aa³은 N, T, A 또는 Y이며,

aa⁴는 R, S, K 또는 E이며,

aa⁵는 E, D, R 또는 T이며,

aa⁶은 K, D, E 또는 R이며,

aa⁷은 G, I 또는 L이며,

aa⁸은 K 또는 R이다.

시퀀스가 처음의 2개의 아미노산으로서 Y 및 E를 가질 경우 0 내지 4개의 x가 0의 값을 갖을 수 있으며, 처음의 2개의 아미노산으로서 그 밖의 아미노산을 가질 경우 0 내지 5개의 x가 0의 값을 갖을 수 있다. 즉, 상기 사슬은 일반적으로 3 내지 8개, 보다 일반적으로 4 내지 8개의 아미노산을 갖는다.

특히, 연결부위가 Y-E-N-E-R-E-I-K일때 페닐알라닌이 제거된다. 다른 연결체로서 Y-E-N-R-E-D-I-K, Y-K-T-R-E-D-I-K, Y-E-R-E-I-K, Y-E-N-I-K, Y-E-I-K, Y-Y-A-S-D-K-L-K, Y-A-S-D-K-L, Y-A-S-D-K, Y-S-D-K, E-D-Y-K-T-R-G-R 및 E-D-Y-T-R이 포함된다. 일반적으로, 사슬내에 Y, E, D, K 또는 R중 적어도 하나이상이 존재하도록 하며, 바람직하게는 E, D, K 또는 R중 적어도 하나이상이 존재하도록 한다. 연결체를 위한 바람직한 아미노산은 Y, I, S, T, D, E, K, R, N 또는 Q로서, 연결체의 아미노산중 50% 이상을 상기 아미노산그룹 중에서 선택하도록 한다.

연결 부위에서의 상기 변환 이외에도 서브유니트들 중 하나에서 치환, 삭제 또는 삽입 등과 같은 적어도 하나 이상의 변이가 있을 수 있는데, 그 결과 pI가 감소하거나 감미도가 증가하도록 한다. pI나 이온화 상수는 염기성 아미노산을 산성 아미노산이나 중성 아미노산으로, 바람직하게는 산성 아미노산으로 치환시키거나 염기성 아미노산을 삭제하거나 또는 산성 아미노산을 삽입시킴으로써 감소시킬 수 있다. 일반적으로 변이분위의 수는 8개 이하이나, 일반적으로는 6개 이하, 바람직하게는 4개 이하로 한다. 이때 하나의 손상부위는 하나의 아미노산 치환이나, 삽입 또는 삭제이다.

본 발명에서 특히 바람직하기로는 17 또는 43위치의 라이신을 아스파라긴산 또는 글루타민산, 특별히 글루타민산과 같은 산성 아미노산으로 치환하는 것이며, 70 또는 86위치의 아르기닌을 치환 시켜도 좋다. 이러한 치환은 pI가 8이하가 되도록 하는 것이며(모넬린의 pI는 9.3), 바람직하게는 7.5이하, 특별히 6 내지 7.5, 더욱 바람직하게는 6.5 내지 7.5의 범위내가 되도록 한다.

종료부분으로는 효모에서 기능할 수 있는 유용한 것이라면 어느 것도 사용될 수 있다. 전사 종료부분은 전사 개시부분의 3'부분의 유전자와 동일한 유전자나 전사 개시부분에 유용한 것으로 지정되어 있는 다른 유전자로부터 올 수 있다. 종료부위의 선택은 편리성을 첫째로 한다.

발현 구조물은 클로닝에 편리한 일상적 벡터면 어떤 것에도 결합 시킬 수 있다. 일반적으로 구조물을 합성시킬 때 다양한 절편들을 클로닝하고 분리 및 분석하여 결합시키고 재클로닝하는 등의 과정을 거치게 된다. 최종 구조물은 E. coli 및 효모 모두에서 복제 기능을 수행할 수 있는 셔틀(Shuttle) 벡터를 포함할 수 있다. 효모에서 기능하는 다양한 벡터들을 사용하거나 개시된 벡터들을 기초하여 용이하게 제조될 수 있다. 바람직하게는 벡터는 효모 숙주의 제놈에 통합되어 효모 숙주에서 복제하는데 있어 안정한 복제 시스템을 갖거나 불안정한 복제 시스템을 갖을 수 있고 혹은 복제 시스템을 갖지 않을 수도 있다. 사용된 벡터들은 2㎛의 플라스미드 복제 시스템이나 CEN3, ARS 등과 같은 동원체의 조합물 등을 포함할 수 있다. 통합시킬 때에는 선별을 위해 마커(Marker)를 사용할 수 있다.

상기 벡터는 또한, 상기 구조물을 함유하는 숙주를 선별하기 위해 마커를 포함할 수 있다. 마커로는 일반적으로 항생물질 내성 또는 영양요구성 숙주에 분급하는 기본영양요구성이 사용된다. 항생제 내성은 카나마이신, 클로람페니콜, 테트라사이클린, 암피실린 등에 대한 것이며, 하나이상의 마커가 있을 수 있다. 특히 다른 숙주에는 다른 마커가 사용된다.

효모 숙주로는 Saccharomyces, 특히 cerevisiae, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces 예컨대 lactis, Candida. 등의 균주가 포함된다. 바람직하게는 발효에서 안정한 산업 균주를 사용한다.

발현카세트 만을 갖거나 또는 발현카세트를 벡터나 다른 구조물의 일부분으로서 갖는 발현 숙주를 형질전환시키기 위해서, 그 숙주의 특성에 따라 다양한 기술이 사용될 수 있다. 발현카세트의 도입은, 결찰, 형질전환, 형질감염(transfection), 형질도입(transduction) 및 융합 등에 의해 수행되어질 수 있다. 본래의 숙주세포 또는 원형질체, 특히 재생산 된 원형질체 등이 외부 DNA의 도입을 위해 사용될 수 있다.

일단, 숙주가 형질전환되면, 선택배지에서 배양시켜서 표지물 또는 관련된 발현카세트를 갖는 그들의 숙주를 선별할 수 있다. 항생물질내성을 이용할 경우, 영양소를 항생물질내성 유전자 부재하에서의 항생물질 세포독성의 수준으로 포함될 수 있다. 영양요구성 상보의 경우, 영양배지는 필요한 대사물질이 부족되게 한다. 생성물이 세포질에 생산되고 존속되면, 세포가 성장하기에 충분한 시간이 지난 후에 세포를 용해시키고 종래의 정제방법에 따라 목적하는 단백질을 얻어낸다. 이러한 정제방법들로는 액체-액체추출, HPLC, 크로마토그라피, 전기영동 등이 있다. 그 다음, 생성물은 겔 제거(gel exclusion), 크로마토그라피등에 의해 보다 정제되어질 수 있다.

결과된 생성물은 감미료로서 다양한 방법으로 이용되어질 수 있는 바, 통조림 제품이나 탄산음료에 첨가하여 이용되거나 커피 또는 차 등과 같은 다양한 음료수에 첨가하기 위한 분말 또는 액체로서 이용되어질 수 있으며 요리, 추윙껌, 크림치약, 양치질약, 치아위생제, 약제, 햄이나 소세지 등의 육류제품, 인스턴트 스프, 요구르트, 후식, 곡물, 동물먹이 등에 이용될 수 있다.

본 발명의 목적물인 단백질 감미료는 액체 또는 분말로 제조될 수 있다. 액체일 경우 안정제, 완충제, 살균약 또는 프로테아제 억제제 등과 같은 다른 첨가물이 결합될 수 있다. 수용액 매체에는 감미료가 일반적으로 0.1 내지 90중량%의 조성으로 존재하도록 한다. 분말의 경우 종래의 식품첨가물인 다양한 부형제가 첨가되어질 수 있다.

다음의 실시예는 실례를 제시한 것으로서, 본 발명의 범위를 제한하지는 않는다.

[실시예]

1. 올리고뉴클리오티드의 합성, 정제 및 유도할 수 있는 갈갭(Galgap) 혼성 촉진제의 올리고머화

제 1 도에 주어진 올리고뉴클리오티드는 시퀀스를 활성화하는 GAL, 시스활성 DNA와 Applied Biosystem DNA 합성기(모델명 380-B)를 적용한 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 등의 기왕의 시퀀스를 근거로 제조되었다. 올리고머들은 각각 8M 우레아와 폴리아크릴아미드 겔로 분리하여 Sep-pack C18 컬럼(Whatman Co.)로 정제하였다.

각각의 올리고머는 50mM Tris-HCl, pH 8.0, 10mM MgCl₂, 10mM DTT, 1mM ATP와 T4 폴리뉴클레오티드 키나제 5unit를 함유하는 혼합액 38㎕에서 45분간 37℃를 유지하여 인산화한다. 반응 혼합물을 모아 같은 부피의 페놀/클로로포름으로 추출하고 에탄올 2.5배 부피비로 침전하여 진공하에서 건조한다. 15㎕ 증류수와 pH 7.5, 0.2mM Tris-HCl, 0.1M MgCl₂와 0.1mM DTT를 함유하는 결찰 완충액 7㎕에 상기 건조된 침전을 녹이고 상기 용액을 90℃ 수욕상에 방치한 후 실온에서 천천히 냉각하여 24시간 방치한다. 상기 반응 혼합물에 10mM ATP 7㎕, T4 DNA 리가제 40unit와 증류수 2㎕를 가하여 실온에서 10분간 세워둔 후 페놀/클로로포름으로 DNA를 추출하여 상기에 언급된 방법으로 침전, 건조시킨다. 생성된 고체를 증류수 85㎕에 녹이고 BamHI와 NcoI로 분해한다. 462bp 조각은 7% 아크릴아미드 겔 전기영동법으로 분리하여 Elutip-D컬럼(Schleicher & Schuell Co.)으로 용출, 정제한다.

2. Galgap 혼성 프로모터의 분자클로닝과 DNA 시퀀싱

M13mp19의 EcoR I 과 Kpn I 사이에 Nco I 부위를 가지는 M13mp19의 유도체 M13rp9RF를 Galgap 혼성프로모터 유전자로 사용하였다. pH 7.5, 20mM Tris-HCl, 10mM MgCl₂10mM DTT와 T4 DNA 리가제 200unit에서 Galgap 혼성 DNA의 겔로부터 분리된 BamH I 절편을 MrpRF를 분해한 Nco I-BamH I 과 결합시키고 결찰 혼합액을 4℃에서 항온처리하면서 하룻밤 방치한다. E.Coli JM 101 세포의 변환은 상기 세포용액 200㎕에 결찰 혼합액 5㎕를 가하여 얻을 수 있고 디데옥시 DNA 시퀀싱과 M13rp9-GG RF 결찰 생성물은 Messing, Methods in Enzymology(1983) 101 : 20-78와 Sanger et al. Proc. Natl. acad. Sci. USA(1985) 74 : 5463-5467에서 언급된 방법으로 제조된다. 상기 촉진제 영역은 제 2 도에서 보이는 시퀀스를 함유한다.

3. 단백질 감미료 유전자 발현을 위한 카셋트 구조물

M13rp9 RF-Galgap에서 합성한 Galgap 혼성 DNA 프로머터를 분리하여 상기에서 언급한 7% 폴리아크릴아미드 겔로 정제한다. E. Coli에서 합성, 클로닝되고 발현되어진 단백질 감미료 유전자는 Cla I 와 SaII 으로 분해하여 ptrp-MON-1 플라스미드에서 분리해서 부분적인 단백질 감미료 유전자 조각을 얻었다.(참조 : 미국출원번호 064341, 출원일 1987.6.19.)

융합 모넬린

단백질 감미료 유전자 N-터미널의 Nco I/Cal I 조각에 대한 합성 어댑터는 다음과 같은 시퀀스로 합성되었다.

플라스미드 pLBC는 pBR322의 유도체이며 다음과 같이 제조되었다. EcoR I 과 Sal I 로 pBR322를 분해한 후, 합성 결합체를 삽입하여 상기 부위를 BamH I 부위로 전환하여 단일 BamH I 부위와 함께 pBR322를 만든다. 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제(GAP) 유전자(Holland & Holland, Supra ; Holland et al., Supra)를 함유하는 BamH I 절편의 1300 염기쌍을 가진 pLBC의 유도체, 플라스미드 pGAP는 pLBC의 BamH I 부위에 프로머터와 데미네이터가 삽입된다. 생성된 벡터 pGAP와 GAP 유전자의 전이 되지않은 5' 부위, GAP 프로모터 약 400bp와 GAP 유전자의 전이되지 않은 3' 부위, GAP 터미네이터 약 900bp를 함유한다. 이들 두절편들은 GAP 개시제 메티오닌에서 Nco I 부위에 대한 합성 어댑터(33MER, 5' -CCA TGG GGT ACC CGG GGA TCC TCT AGA CTC GAC-')의 한쪽끝과 다른 끝인 Sal I 부위에, GAP 자의 전이되지 않은 3' 부위의 자연적인 Sal I 부위에 대한 Sal I 을 다른끝으로 하여 연결한다. GAP 터미네이터 약 900bp를 포함하는 Sal I-BamH I 절편은 pGAP에서 얻어지며 1% 아가로스 겔로 분리한다.

감미료 유전자를 운반하는 ptrp322H MON-1에서의 Cla I-Sal I 절편, Nco I-Cla I 어댑터, Galgap 프로머터 부분을 제공하는 M13rp9-GG의 BamH I-Nco I 462bp 절편과 GAP 터미네이트 부분의 약 900bp를 함유하는 부분적인 분해조각(약 4.5bp) Sal I -BamH I 들은 결찰되어 발현 카셋트를 형성하고 pLBC로 클로닝되어 pGG-MON을 만든다. BamH I 과 pGG-MON에서 절제된 발현 카셋트는 E. coli-효모 셔틀벡터 pYBC의 BamH I 부위에 삽입된다(pYLBC는 세균성 플라스미드에 해당하는 부분을 pBR322로 대치한 pJDB219(Beggs, Nature(1978)275 : 104-109)의 유도체이다.). 플라스미드 pYLBC는 손상되지 않은 효모 2㎛ 복제 시스템과 효모 LEU2 유전자를 가지는데, 생성된 플라스미드는 pYGG-MON이라고 명명한다.

분비 카셋트의 DNA합성 및 구조물

효모의 리더 시퀀스와 프로세싱 시그널은 Stack et al., Nucleic Acids Res.(1984) 12 : 6011-6030과 Julius et al., Cell(1984) 37 : 1075-1089에 언급된 시퀀스를 근거로 합성하였다. M13 디데옥시 DNA 시퀀싱방법에 의해 확인된 DNA 시퀀스는 다음과 같다.

(Nco I)

프로세싱 부분

리터 시퀀스와 프로세싱 시그널 시퀀스의 63bp 조각은 8M 우레아-아크 릴아미드 겔로 분리하여, pH 8.0, 50mM Tris-HCl, 10mM DTT, 1mM ATP와 T4 DNA 리가제 5unit 존재하에서 플라스미드 pGG-MON을 분해한 Nco I-Cla I 로 결찰하였다.

재조합분비벡터는 E. coli HB 형질전환제의 산별후에 얻어졌다. 분비 카셋트는 BamH I 으로 pGGKL-MON 을 분해하여 절제하였고 상기 절편은 pYLBC의 BamH I 부위에 결찰하여 pYGGKL-MON을 얻었다.

효모의 형질전환 및, 단백질 감미료의 배양 및 분비

Saccharomyces cervisiae D(α MAT adel leu2), DBY746(MAT α, his 3-1, leu 2-3, leu 2-112, ura 3-52, trp 1-289)는 yeast Genetic Stock Center(University of California, Berkely, CA)로부터 얻었으며 Hinnen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A(1975) 75 : 1929-1933에서 언급한 효모세포에 플라스미드 DNA(pYGGKL-MON)를 삽입하였다.

형질전환체는 루이신이 결핍된 합성배양매체 3ml에서 하룻밤동안 배양하고(Sherman, et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Labo-ratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982), 하룻밤동안 방치한 배양물을 YEPD 매체(1ℓ당 박토펩톤(Bactopeptone) 20g, 효모 추출물 10g, 글루코스 20g)에 접종하여 650±10nm에서 O.D.값을 갖도록 배양한다.

갈락토오스를 가하여 배양물의 최종 농도가 2%가 되게 하고 650±25nm에서 O.D.값을 가질 때까지 배양물을 계속 항온처리한다.

Saccharomyces cereviiase의 내부에 발현되거나 분비된 단계의 확인

유도된 세포현탁액 100㎕나 배양물 상응액 100㎕에 3배 단백질 SDS-시료 완충액(pH 6.8, 60mM Tris-HCl, 2.3% SDS, 10% 글리세롤, 2% β-머캡토에탄올) 50㎕를 가한다. 상기 혼합물을 5분간 끊이고 15% SDS-폴리아크릴아미드 겔에 10㎕를 적재한다(Laemmli, Nature(1977) 227 : 680-685). 메탄올-초산/물의 4 : 1 : 5(v/v) 용액에 쿠마시 브릴리언트 블루 R-250을 0.05%로 조제한 용액으로 염색하여, 염색제만 제외한 같은 용액으로 탈색한다. 상기 겔에서는 대조 배양체의 시료에서는 나타나지 않은 단백질의 띠가 거의 정확한 분자량(11KD)의 띠로 나타났다.

효과적인 발현 시스템은 신규한 단계 생산의 제공에 있다. 상기 생성물은 다양한 제품들의 음식 첨가 감미료로 사용되는 단백질로서 실제로 분리 정지되도록 생산된다. 상기 생성물은 더 이상의 재생없이 활성형태로 얻어지도록 적절하게 배가되어야 한다.

Claims

5'→3' 의 전사 방향으로, 효모에서 가능하는 유도성 유전자의 전사 개시부위(region)의 5' 부분(domain)과 효모 개시부위의 3' 부분으로부터 유래된 5' 부분으로 이루어진 전사 개시부위 ; 시그널 시퀀스, 프로세싱 시그널 및, 1이상의 비보존성 치환을 포함하고 결합 또는 연결체에 의해 함께 연결되어 있는 모넬린과 실질적으로 동일한 시퀀스를 가지는 단백질 감미료를 코딩하는 구조 유전자로 이루어진 상기 개시부위의 전사조절 하의 오픈 리딩 프레임 ; 및 전사 종료부위를 함유하는 효모 세포를 배양배지에서 배양한 후, 상기 유전자의 발현 생성물을 프로세싱하여 배지로 분비시키고, 상기 단백질 감미료를 단리하는 것으로 이루어진 상기 연결체를 제외한 연결체에 의해 함께 연결된 모넬린 서브유니트와 실질적으로 동일한 아미노산 시퀀스를 가지며 상기 연결체 이외에서 천연 시퀀스 내에 1이상의 변이를 갖는 단백질 감미료의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 효모 개시부위의 3' 부분이 효모 해당효소의 3' 부분인 것인 방법.
제 2 항에 있어서, 상기 효모 해당효소가 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제인 것인 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 유도성 유전자의 전사 개시부위의 5' 부분이 대사물 유도성 부분인 것인 방법.
제 4 항에 있어서, 상기 대사물은 D-갈락토오스인 것인 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 효모가 Saccharomyeces cerevisiae인 것인 방법.
5'→3' 의 전사 방향으로, 효모에서 기능하는 유도성 유전자의 전사 개시부위의 5' 부분과 효모 개시부위의 3' 부분으로부터 유래된 5' 부분으로 이루어진 전사 개시부위 ; 시그널 시퀀스, 프로세싱 시그널 및, 1이상의 비보존성 치환을 포함하고 결합 또는 연결체에 의해 함께 연결되어 있는 모넬린과 실질적으로 동일한 시퀀스를 가지는 단백질 감미료를 코딩하는 구조유전자로 이루어진 상기 개시부위의 전사조절 하의 오픈 리딩 프레임 ; 및 전사 종료부위로 이루어진 DNA 구조물을 함유하는 효모 세포.
제12항에 있어서, 상기 효모 개시부위의 3' 부분이 효모 해당효소의 3' 부분인 것인 효모 세포.
제13항에 있어서, 상기 효모 해당효소가 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제인 것인 효모 세포.
제12항에 있어서, 상기 유도성 유전자의 전사 개시부위의 5' 부분이 대사물 유도성 부분인 것인 효모 세포.
제15항에 있어서, 상기 대사물은 D-갈락토오스인 것인 효모 세포.
제12항에 있어서, 상기 효모가 Saccharomyces cercviiae이고, 상기 전사 개시부위가 GAL 상부 활성 시퀀스로부터 유래된 5' 부분과 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제로부터 유래된 3' 부분을 함유하는 것인 효모 세포.
5'→3' 의 전사 방향으로, 효모에서 기능하는 유도성 유전자의 전사 개시부위의 5' 부분과 효모 개시부위의 3' 부분으로부터 유래된 5' 부분으로 이루어진 전사 개시부위 ; 시그널 시퀀스, 프로세싱 시그널 및, 1이상의 비보존성 치환을 포함하고 결합 또는 연결체에 의해 함께 연결되어 있는 모넬린과 실질적으로 동일한 시퀀스를 가지는 단백질 감미료를 코딩하는 구조유전자로 이루어진 상기 개시부위의 전사조절 하의 오픈 리딩 프레임 ; 및 전사 종료부위를 갖는 DNA 발현 구조물.
제18항에 있어서, 상기 전사 개시부위는 GAL 상부 활성 시퀀스로부터 유래된 5' 부분과 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 프로모터로부터 유래된 3' 부분을 함유하는 것인 DNA 발현 구조물.
제18항에 있어서, 상기 시그널 시퀀스는 극독성의 Kluveromyces lacits 부분 시그널 시퀀스이며, 상기 프로세싱 시그널이 lys-arg인 것인 DNA 발현 구조물.
제18항 내지 제20항에 따른 DNA 발현 구조물을 함유하며 효모세포에서 안정하게 복제를 수행할 수 있는 벡터.