JPS5991886A - 調節された蛋白質表現のための解糖性プロモ−タ−：プロテア−ゼ阻害剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 単細胞微生物中で異質す女わち外反性ＤＮＡの表現を得
ることできるようになって関心のある長い？リイプチド
儲を都合よく製造する機会が生じた。はとんど直ちに、
小ホルモンソマトスタチン（ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｌｎ
　）　　およびインシュリン、インターフェロン、カプ
シド蛋白質を有する種々のワクチンなどのようなもつと
複雑なポリペプチドのような種々のポリペプチドが製造
され、文献に報告された。大体に於て、初期の研究は、
科学者がその遺伝的構造および性質を熟知している大腸
菌（Ｅ、　ｃａｌｌ　）で行われた。従って、初期の注
意は、大腸菌（Ｅ、ｃｎｌｅ　）　　中に於ける異質蛋
白質（ｆｏｒａｌｇｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　）の構造に同
けられた。一度大ｇ％１ｌ１１　（Ｅ、　ｃａｌｌ　）
　　を宿主として使用することができるようになると、
大Ｓ菌（Ｅ、ｃｏｌｌ）　　を用いる限界と不利益とが
他の宿主の使用を刺激した。

大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｌ　）　　の多くの欠点をもたない
ために特に魅力的なものとなった１つの宿主は酵母であ
る。しかし、酵母は真核生物であり、より不純′／ｒ面
伝系を有している。さらに、酵母ゲノムについては大腸
菌（Ｅ、　ｃｏｌ　ｌ　）　　？”Ｌど知られていない
。

酵母を酵母にとって異質な蛋白質の生産のための宿主と
して用いるためには、故多くの発見が必要であり、かつ
新規物質が人手可能にならねばならない。

初期には、染色体外要素として、あるいは酵母染色体中
への組込みによって酵母に安定性を賦−与する複製系か
要求された。さらに、所債の蛋白質の表現を可能にする
ために転写および表現に関するｄ、を節機能を開発しな
ければならなかった。異質ＤＮＡ配列順序が転写され翻
訳されるかどうか、また、表現されたならば、得られた
ペプチドが酵母イ、用胞中で生存するかどうかも不確か
であった。

有糸分裂、胞子形成、栄養増りｆｉ　（ｖａｇａｔａｔ
ｌｖ・ｇｒｏｗｔｈ　）　　に及はす組換傅ＯＮ＾（Ｒ
ＤＮＡ）の影ｄのような、酵母細砲の住存能力に及はす
異質（ｆｏｒｅｉｇｎ　）　１Ｍ白質の影響も決定しな
ければならないものとして残婆れた。

従って、関心ある蛋白’ｔ’Ｊの調節された表現ならび
にかかる蛋白質の高度に有効な製造を可能にする、酵母
中での新規ＲＤＮＡ系の開発にかなシの努力が向けられ
た。

ヒップｘ　−ｒ　７　（Ｈｌｔｚａｍａｎ　）　　らは
Ｊ、　Ｂｌｏｌ、　Ｃｈｅｍ、。

２５５：１２０７３−１２０８０（１９８０）に、酵母
３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧに）遺伝子を有
しかつ酵母中で表現することができる調節信号を伴うプ
ラスミドを記載している・関連する他の文献には、クリ
フトン（Ｃ１目ｔｏｎ　）　ラの報文ダネテイツクス（
Ｇｅｎｅｔｌｅｓ　）　、８８．１−１１（１９７８）
：クラークおよびカーがン（Ｃ１ａｒｋａｎｄ　Ｃａｒ
ｂｏｎ　）　　の報文セル（ｃｏｌ冒）、叉、９ｌ−９
９（１９７８）：）五ソン（ＴｏｍｓＯｎ　）　の報文
ジーン（Ｇｅｎｅ　）　、１．５４７〜５５６（１９７
７）：ホランドおよびホランド（Ｈｏ１ｌａｎｄ　ａｎ
ｄ　Ｈｏ１ｌａｎｄ）の報文ｊ、引ｏ１．ｃｈｅｍ、　
　２５４．５４６６−５４７４（１９７９）：ホランド
およびホランド（Ｈｏｌｌａｎｄａｎｄ　Ｈｏ１ｌａｎ
ｄ　）、の報文Ｊ＃　Ｂｌｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２５
４．９８５０−９８４５　（１９７９）　：ナスζスお
よびリード（Ｎａｓｍｙｔｈ　ａｎｄ　Ｒｅ＠ｄ　）の
報文Ｐｒ０６．　Ｎａｔ。

Ａｅａｄ、　Ｓｃ１．　、　７７．２１１９−２１２５
（１９８０）：ブローチ（８ｒＯａｅｈ　）　　らの報
文ジーン（Ｇｏｎｅ　）、８．１２１〜１３５（１９７
９）：ライリアきソ７　（Ｗｌｌｌｌａｍｓｏｎ　）ら
の報文ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２８３．２１４−
２１６（１９８０）が含まれる。

解ｆｉ　（８１ｙｃｏｌｙｔｌｃ　）経路中で遺伝子の
転写を制御しかつ酵母にとって異質な蛋白質の調節され
た生産に使用することができる新規酵母プロモーターが
提供される。特に関心のあるプロモーターには、三脚糖
燐酸インメラーゼ、ビルピル酸キナーセ、ホスホグルコ
ースイソメラーゼ、ホスホグリセリン酸ムターゼ、ヘキ
ソキナーゼ１、ヘキソキナーゼ２、グルコキナ−ぜ、ホ
スホフルクトースキナーゼ、了ルＰラーゼならびに解糖
１節遺伝子のためのプロモーターが含まれる。プロテア
−Ｊ＃ｔｋ阻害剤、哺乳類（ｆ−１−アンチトリプシン
は三脚１＃４燐酸インメラーゼのためのプロモーターを
用いて表現される。

酵母？ａ主中に外来または異質ＯＮ＾の調節された有効
表現を与える方法および組成物が提供される（外来また
はＪＡ質ＤＮＡとは、野生型中に天然に存在しない、特
に異種からのＤＮＡであり、通常、宿主と遺伝情報を交
換しない）。解糖経路中に含まれかつ高いレベルの蛋白
質生産を与え、その結果、酵母細胞によって生産される
全蛋白質の実質的な部分が関心ある蛋白質へ捧げられる
新規プロモーターを用いる。その上、解糖酵素の生産の
調節に付随する調節機構が得られるので、所望の生成物
の生産を調節することができる。さらに、表現の効率お
よび量を増強するため、生存能力のある細胞を保持する
ことができる。

１Ｊ４ｅあるプロモーターは、特に、三次糖燐酸イソメ
ラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ホスホグルコースイソメ
ラーゼ、ホスホグリセリン酸ムターゼ、ヘキソキナーゼ
１、ヘキソキナーゼ２、グルコキナーゼ、ホスホフルク
トキナーゼ、アルドラーゼの表現に関連のあるプロモー
ターであり、解糖調節遺伝子ＧＣＲ１によって制御され
る。解糖経路の遺伝子には、ヘキソキナーゼ１お！ヒ２
（ＨＥＸｌ、２）、ホスホグルコースイソメラーゼ（Ｐ
ＧＩ）、１ 三脚糖燐ｔソイツメラーゼ（ＴＰＩ）、ホスホグリセリ
ン酸キナーゼ（ＰＧに）、ホスホグリセリン酸キナ−ゼ
（Ｇ　ＰＭ　）、ピルビン酸キナーゼ（ＰＹに）、ホス
ホフルクトキナーゼ（ＰＦに）、エノラーゼ（ＥＮＯ）
、フルクヘース１，６−二・＋、ｎ　ｒρアルドラーゼ
（ＦＤＡ）、グリセルアルデヒド３−　ｆ４　（ｉ＠デ
ヒドロｒナーゼ（ＰＧＫ　）、解オ唐調節蛋白質（ＧＣ
Ｒ）が含まれる。

プロモーターは、酵母ＤＮＡの大断片を有する遺伝子銀
ｈ′を用いることによって得られる。適当なベクトル、
特に原核生物および酵母のためのレプリコンを有するシ
ャトルベクトル（５ｈｕｔｔｌｅｖｅｃｔｏｒ　）　　
中へ断片を導入することにより、細菌中で酵母ＤＮＡを
容易に増幅またはクローニングし、かつそのあとで相補
性のために突然変異株酵母４、ｌｌＩ胞中へこの酵母Ｄ
ＮＡを導入することができる。この方法で、酵母宿主中
で栄養素要求的害または突然変異を補充する酵素断片を
同定することができる。

特に興味のあるものけ、宿主が関心のある解糖２ 経路段階と別個の生化学的経路との両方に於て栄養素要
求的である場合であり、ベクトル中のマーカーによって
補光される場合である。所望の遺伝子を有するＤＮＡ分
節を一度確立してしまうと、種々の技術によって再クロ
ーニングして、ＤＮＡ分節を短くし、かつ転写および表
現のためのその調節信号とともに主として関心のある遺
伝子である分節を与えることができる。

プロモーターを保持するためには、開始暗号メチオニン
を決定し、この暗号を、プロモーターから下流に外来Ｄ
ＮＡを導入するための戦略を開発するために用いること
が不可欠である。解糖経路中でプロモーターの調節制御
下にあるように外来ＤＮＡを導入するための部位を与え
るために、種種の技術を用いることができる。

制限部位が、都合よくイニシエーターメチオニンコード
ンに隣接している場合には、解糖遺伝子（ｇｌｙｃｏｌ
ｙｔｌｃ　ｇｅｎｅ　）をその部位で分裂させ、ＤＮＡ
をＢａｌ　３１で種々の時間かみもどして、イニシエー
ターメチオニンコードン中へまたは過ぎて噛むようにし
あるいは開始暗号メチオニンを保持するようにすること
ができる。

都合のよい制限部位が無い場合には、プライマー（１キ
復のような他の接合（ｓｐＨｃｌｎｇ　）技術を用いる
ことができる。生体外の突然変異誘発を用いることによ
っても、所望の蛋白質の最初のアミノ酸のための暗号と
なる制限部位をイニシエーターメチオニンの隣りに導入
することができる。おのおのの場合に、解糖生成物のた
めのインタクト（Ｉｎｔａｃｔ　）　　プロモーターを
有しかつインタクトレプリコン、１個以上のマーカーな
どのような他のＤＮＡ配列順序を通常含む線形化ＤＮＡ
分節が得られる。

上記の方法の代表例は、ＴｐＨ遺伝子のためのプロそ一
ターを有するベクトルの開発である。

ｐ８Ｒ３２２および酵母の２μｍプラスミドからのレプ
リコンまたは複製系を有する代表的ベクトルｃＶ１５な
らびにＬＥＵ２遺伝子が、＝ＴｐＨ遺伝子を有すること
が示された酵母断片の挿入のために用いられた。これは
、ＩＩ！ＩＬＩ”％　ｔｐｌ−である突然変異体酵母と
の二重選択を用いることによって達成された。ＴｐＨ遺
伝子は独特のにｏｎ　１部位を有することがわかった。

そのベクトルをにｐｎ１部位で分裂させた後、二重スト
ランドエクソ賀りレアーゼ（ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ　
）　８ａｌ　５１で種々の時間処理してそのＤＮＡをｔ
−ｍｅｔコードンにチューバツク（ｃｈ＠ｗ　ｂａｃｋ
　）　Ｌ／た。次に所望の制限部位を与えるリンカ−を
挿入した。次に、開始のための適当な位茸にｆ　−ｍｅ
ｔコードンを有する配列順序を４える外来ＤＮＡを挿入
することができた。

別法では、異ノＩ！ｔＤＮＡを、ＴＰｆ１遺伝子のｆ−
ｍａｔコードンを用いて表現することができる。

他の被験体解糖遺伝子については、これらの遺伝子に関
連するプロモーターを与えるために、同様な方法を行う
ことができる。ｐｙに配列順序は制限のための都合のよ
いＸｂａｌ　　部位を有し、この場合には、所要ならば
、Ｂａｌ　３１を短時間用いて２．３の付加的塩基を除
去して、メチオニンコードンへまたけコードン中へチュ
ー（ｃｈｅｗ　）　　することができる。特に関心のあ
ることは、解糖経路５ 中に含まれる油の遺伝子の表現を制御するためにＯＣＲ
プロモーターを使用することである。外来ＯＮ＾の表現
を調節する他の解糖プロモーターと共にＯＣＲ遺伝子を
用いることにより、他のプロモーターをターンオンおよ
びターンオフして外来ＤＮＡの表現を調節することがで
きる。かくして、所望の細胞密度に達するまで栄養増殖
を進行させた後に、所望のポリペプチドの中度を行うこ
とができる。

適当な栄養・素要求体を用いることによ抄、適当な栄種
培地を選んで関心のあるポリペプチドの表現をざらに調
節することができる。選ばれたプロモーターが代謝妨害
のため、特別な栄養累で抑制される場合、栄養素の性質
を変化させることによって表現を誘起することができる
。さらに、μ■遺伝子またはその他の調節的制御によっ
て表現を抑制または活性什することにより、解糖経路中
の多数のプロモーターの活性に影響を与えることができ
る。また、ＯＣＲ調節信号を用いてＯＣＲの表現の調節
剤としで働くポリペプチドを滴定する１に ともできる。コピ一番号を制御することができるベクト
ルをもつことにより、野牛型ＯＣＲ遺伝子の活性を変化
させることができる。

表現を得るため、異なる機能を限定する多数の配列順序
を有する染色体外要素構造物が製造される。

１つの機能は複製系であり、ベクトルの部分を形成する
。もう１つの機能は、それ自体、あるいは外来ＯＮ＾と
共にプロモーターである。そめ他の機能には、表現のイ
ニシエーターおよびター建ネーターが含まれる。選択音
−カーもある。

適当なベクトルの開発には、どうして本必要というわけ
でけないが、ベクトルは通常、酵母□のためのａＳ系と
原核生物のための４！［製糸〔シャトルペクトＡ／　（
５ｈｕｔｔｌｅ　ｖｅｃｔｏｒ　）　）　の両方を有す
る。

酵母のための複製系は、染色体外要素の安定な保持を与
える系であってもよく、あるいは宿主中での［）ＮＡの
十分な寿命を与える系であって亀よく、宿主中への［）
ＮＡの組込みの受容できる確率がある系である。宿主に
相同の配列順序を与えて組換を与え不ようにすることに
より、組込みが非常に助けられる。一般に相同配列順序
は、少なくとも約８００　ｂｐ　　であり、通常的２０
００　ｂｐ　以下である。従って、μ−艶互１遺伝子の
使用のような、組込みまたは自律複製系を用いて、酵母
宿主中に於ける外来ＤＮＡの保持を与えることができる
・選ばれる複製系は、通常１より大きく、好ましくは５
より大きい合理的なコピー数を与えねばならない。ｐ８
Ｒ３２２、ｐＡｃＹｃ　１８４、ｐＳＣ１０１、ｐＭ日
９などのような多種の原核生物に対して多種の摺＃系が
有効である。別法では、ＯＮＡＭ８造物の１つ以上めコ
ピーを宿主染色体中へ組込むことができる。複製系は、
条件的に調節することもでき、通常、温度を変えること
によって複製をターンオンおよびターンオフすることが
できるように感温的に調節することができる。

複製系に加えて、１個以上の選択可能をマーカーもあり
、通常、マーカーとして働くことができる外来ＯＮＡに
加えて少なくとも１個のマーカーがある。通常のマーカ
ーに、は、抗生物質抵抗性を与える殺菌□性マーカーと
、毒素および重金属に附して抵抗性を与えるマーカーと
が含まれる。栄養素要求宿主を用いかつ相補性による原
栄養を与えることも有用である。すぐ、上で述べた通常
の選択系に加えて、本発明の解糖性遺伝子は、適当な突
然変異宿主株に於て、糖を「判択的基質として用いる選
択を与えることができるので特に望ましいマーカーであ
る。

他の遺伝子も、１重々の目的のために染色体外要素中へ
挿入することができる。宿主のゲノム中への組込みが噛
ましい場合、宿主ゲノムの特別な領域の相同配列順序を
染色体外要素中に含むことができる。１つ以上の配列順
序の増幅が雫ましい場合には、メトトレキセートストレ
ス（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅｓｔｒｅｓｓ）に感応す
るジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子または重金属ストレ
スに感応するメタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｌ
ｏｎｅｌｎ　）遺伝子のようなかかる増幅を与えること
が知られている遺伝子を、反復されるべ＠（）ＮＡ領領
域片側にある染色体外要素中に含むことができる。動原
体、自律複層分節などのような他の調節信号をも含むこ
とができる。

９ 問題のプロモーターを単離するために、酵母ゲノムのラ
ンダム消化（ｒａｎｄｏｍ　ｄｌｇｅｓｔｌｏｎ　）　
　または機械曲回１祈により、＋１ψ母染色体ＤＮＡで
クローンを作ることができる。次に、所雀の遺伝子の存
在は、相補性のための栄養素要求宿主中へ酵母ｉｆＴ片
の均一クローンを導入することによって決定される。望
−ましくに、クローニング伝播体は、選択のための付加
的基礎をｉＪ能にして二Ｍ１選択技術を使用することが
できるようにするもう１つの遺伝子を有することができ
る。突然変異株は、限定でれた栄誉培１１１ムでは夷゛
Ｌ４的に増殖することができないので、培地のフ゛へ択
によって所望の解糖性遺伝子の存在のために選択するこ
とができる。所望の遺伝子を有する酵母断片を隔離した
後、その断片をサブクローニングして（５ｕｉ）ｃｌｏ
ｎｅｄ）余分なりＮＡフランキング（ｆｌａｎｋｉｎｇ
　）　領域を除きかつより容易に取扱われる断片を与え
ることができる。サイズが約５００塩基対より少ない、
所望遺伝子を含むより小感い断片を、仄に、さらにクロ
ーニングし、制限地図作成しかつ配列順序をきめて、有
０ 用な所望のブロモ−ター源および外来ＤＮＡの挿入を与
えるようにすることができる。また、上記したように、
プロモーター自体も、酵母宿主中に於ける特別な酵素の
生産を変えたい場合、リプレッサー（ｒｅｐｒｅｓｓｎ
ｒ　）　またはアクチベータ−（ａｃｔｌｖａｔｏｒ　
）のためのタイトレータ−（ｔｌｔ−ｒａｔｏｒ　）と
して作用して、有用であることができる。外米ｒ）ＮＡ
け、天然産でも合成でもよく、また原核生物でも真核生
物のものでもよく、どんカＤＮＡ源からのものでもよい
。特に興味あるものけ、ポリ（アミノ酸）すなわち生理
活性を有するプリペプチド−または蛋白質を表現する哺
乳類遺伝子である。酵母中で生成されたポリ（アミノ酸
）は１種々の程度に、グリコジル化（ｑｌｙｃｏｓｙ−
Ｉａｔｌｏｎ　）　　を１８飾することができ、この場
合、グリコジル化は起こらなくてもよく、または天然産
浦乳煩４″す（プチドから異なる部位で起こってもよく
、かつ（あるいＦｉ）種々の糖類で種々の度合に起こる
ことができる。従って、大きな関心事は。

グリコジル化の度合および方法によって天然産ポリペプ
チドと異なり、かつ多くの場合に、アミノＱ配列順序に
関して１つ以上の方法で異なる可能性かあり、その場合
、１ｐｉｉ以上のアミノ酸が欠けるかあるいは１１ｆＭ
以上のアミノ酸が１η換されることができるポリペプチ
ドの製造が可能だということである。哺乳類遺伝子は、
家畜（例えば牛、豚、羊、馬）および゛霊長類、例えば
ヒトおよび猿のような多種の＋ｌ＋ｔ！乳類源からのも
のでよい。

活性号？リペデテド組成物の製造に於ける主題プロモー
ターの使用の代表例として、ならびに種々の目的のため
に特に関心あるものとして、プロテアーゼ−阻害剤ｆ記
載しかつ製造する。このプロテアーゼ阻害剤は、ヒトの
α−１−アンチトリプシンと同じまたはほとんど同じア
ミノ酸配列（ｌ序を有しており、多数の蛋白質分解酵素
を阻害する能力がある。ヒトのα−１−アンチトリプシ
ン遺伝子は、ヒト遺伝子中の９　、６　ｋｂ　ＥｃｑＲ
Ｉ　ＯＮ＾断片中に存在するようである。成熟したｍＲ
ＮＡは約１４００個のヌクレオチドを有するようである
。

１個のヒトα−１−アンチトリプシンｃＤＮＡ　ｎ第１
Ｂ図に示した配列順序を有する。ヒトα−１−アンチト
リプシンの優勢形は第１八図に示しである。他の天然に
存在する形（多形）も知られている。

α−アンチトリプシンの染色体ＤＮＡ暗号の配列順序は
クラチ（にｕｒａｃｈｌ　）らによってＰｒｏｃ　。

Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃ１．　　Ｕ、Ｓ、Ａ
、、　　７８．　６８２６−６８３０（１９８１）に、
およびチャンドラ（Ｃｈａｎｄｒａ　）らによってＲ１
ｏｃｈ＠ｍ、　Ｂｌｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｎｖ
ｖ＋、　１０３゜７５１−７５８（１９８１）に記載さ
れており、これらの記載は参照文として本明細書に含ま
れるものとする。α−１−アンチトリプシンのための霊
長類遺伝子は上記チャンドラ（Ｃｈａｎｄｒａ　）らの
文献中に記載されているＤＮＡクローニング方法で得ら
れる。［）ＮＡ雑瑠形成グローブとしてひひの配列１ｗ
ｉ序を用いることによってヒトｃＤＮＡう。

イブラリ−から隔離された、ヒトα−１−アンチトリプ
シンの優勢形のための遺伝子暗号をボ１へ図に示す。

ヒトα−１−アンチトリプシンは、成熟プロテ３ インから１個のグルタミン酸の情報を除去することによ
る遺伝子の切断を可能にするＲａｍＨｌ　　制限部位を
有する。解糖性プロモーターの隣シに、このプロモータ
ーの調節下にあるようにヒトα−−１−アンチトリブタ
ン遺伝子を導入するために種々のスキーム（ｓｃｈｅｍ
ｅｓ　）を用いることができる。

プロモーターがｆ　−ｍｅ　ｔ　　コードンの近くに都
合のよい制限部位をもたな論場合には、解糖性遺伝子を
Ｒａ１５１　で分裂させかつプロモーターにチューバッ
ク（ｃｈ＠ｗｅｄ　ｂａｃｋ　）することができる。次
に、プロモーターから下流にリンカ−を導入して、ヒト
α−１−アンチトリプシン遺伝子へ接合するための便利
な相補末端またはフラッシュ末端を与えることができる
。リンカ−は、α−１−アンチトリブタン遺伝子のＮ−
末端に於けるアミノ酸のための１つ以上のコードンを与
えることもでき、とのアミノ酸は天然産アミノ酸と同じ
であっても異っていてもよい。

ヒトα−１−アンチトリプシンのための遺伝子ｆ１次に
、ｆ−ｍｅｔ　　コードンがヒトα−１−アン４ チドリデシンの表現の開始のために与えられる解糖性プ
ロモーターから下流の染色体外要素中へ導入することが
できる。

例えば、シャトルプラスミドデラスミドＣＶ　１３のＢ
ａｍＨｌに挿入された三脚糖燐−イツメラーゼ（ＴＰＩ
）のための酵母プロモーターを含むＣ丁ＥＡ３２（第２
図）のような表現ベクトル中へ、α−１−アンチトリプ
シン（以下′＾Ｔｌと称す）のためのｅｒ）ＮＡ暗号を
挿入することができる。［Ｊ、Ｒ，ブローチ、Ｊ、Ｎ、
ストラを一ン、Ｊ、Ｂ、ヒツクス（Ｂｒｏａｃｈ　Ｊ、
Ｒ，、５ｔｒａｔｈｅｒｎＪ、Ｎ、、　Ｎ１ｃｋｓ　Ｊ
、Ｆｌ、、　　ゾーン（町１）、土、１２１−１５５　
（１９７９）　）、　Ｔ　Ｐ　ｌ暗号領域内のにｐｎ　
ｌ制限部位からＥＩＡＬ３１消化によってＴＰＩ構造配
列）１序を除いた後、ＴＰｌｆ＊モーター中へ合成ｎＮ
Ａアダゲタ−を結紮した。〔アルバー（八Ｉｂｑｒ）ら
　、　　Ｊ、　　Ｍｏ１ｅｃ、　　Ａｐｐｌｉｅｄ　　
Ｇｅｎｅｔ、、　　　１　　　＊　　４１９−４５４（
１９８２）］。　このアメゲタ−け、翻訳開始とそれに
続く配列順序ＧＡＧＧＡＴＣＣのためのＡ丁Ｇコードン
を含んでいた。ＧＡＧコードンは、天然産ヒトＡＴの第
１アきノ酸であるグルタミン酸残基を指定する。アダプ
ターのＧＧＡＴＣＣ部分け、ＢａｍＨＩエンドヌクレア
ーゼのための切断部位であり、ヒ）ＡＴｒ）ＮＡ配列順
序の残りのこのベクトル中へ接合を可能にする。

ＣＴＥ＾３２のＱａｒＢＨ１部位は、Ａ丁構造遺伝子の
残りと′インフレーム（Ｉｎずｒａｍｓ　）　’　　で
あるように構成されておル、それによって、クローニン
グされたｃＤＮ＾からの！！」曵Ｈ１断片を適当にＣＴ
ＥＡ５２中へ挿入するときポリペプチドの表現１’［１
７！’：Ｃ１゜ＣＴＥＡ３２＋ＡＴ　　遺伝子カラなる
シラスミツドをＣＡＴｌと呼ぶ（第２図）。

酵母三次Ｍ燐、酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）プロモーター
断片に対して下流に位置するヒ）ＡＴのための遺伝子を
含むこのｆ）ＮＡ構造物は酵母株Ｎ　５０１−８および
Ｇに１００に形質転換された。

酵母への形質転換は、ベッグズ（Ｂｅｇｇｓ　）によっ
てネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２７５．１０４−１０
９（１９７Ｂ　）に記載されて−いる。免疫学的試験（
α−１−アンチトリプシンに対する抗体を用いる競合試
験およびＥＬＩＳＡ試験）による形質転換酵母株のスク
リーニングによシ、シラスミツドＣＡＴ１から作った酵
母中に多量のヒトＡＴが存在することを確認した。′野
生型Ｉ酵母株Ｎ５０１−１Ｂ〔カワサキ（Ｋａｗａｓａ
ｋｌ　）らによってＢｌｏｃｈａｍ、　８１ｏｐｈｙｓ
、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ、、　１０８　、１１０７−１
１１２（１９８２）に利己載されている１は、ＣＡ　Ｔ
　１で形質転換されるとき、６チグルコースを有する合
成最小培地〔改良ウイツカーノ・ム（Ｗｌｃｋｅｒ−ｈ
ａｍ’＊　’）培地〕で３０℃に於て増殖させるとき。

可溶性蛋白質１を当たり１．８１ｎｆのα−１−アンチ
トリプシン（すなわち［１，１８１のα−１−アンチト
リプシン）を生成した。突然受具酵母株Ｇに１００は、
ＣＡＴｌで形質転換されるとき。

同一増殖条件下で、可溶性蛋白質１ｆ当たシ１０〜１５
ｖｕＪのα−１−アンチトリプシン（すなわち１〜１．
５係α−１−アンチトリプシン）を生成した。１株Ｎ５
０１−１８およびＧに１００のおのおのは、おのおのが
機能性す巴２遺伝子を含むＣＶ１３およびＣＶ１３ｔｌ
導シラスミクシラスミツド７ のような）の最小および無ロイシン培地での選択的維持
（Ｉ−可ｎＦにする欠損Ｌ！ｍｕ　Ｚをもっている。対
照としてＣＶ１３のみを有する最小培地で増殖させＺ、
とき、Ｎ５ｎ１−ＩＢとＧに１００とは検知できるＡＴ
を生成しない。かくして、ＡＴは。

０４丁１プラスミツドによってゲｒ異的に生成される。

ＧＫｌ（１０は、Ｎ５０１−１８より顕著に多１１ｔ１
／ＣＡ　Ｔ　？生成するので好ましい。しかし、本発明
ｔ：ｔ、ＧＫ１００によるＡＴ生成に限定されるもので
はない６ＡＴの高生成に導（ＧＫ　１００に於ける突然
変異の利用が望−タしい。

ＣＮ日「活性化ヒファロースにヒトＡＴに対する親１１
件梢νＪ羊抗体を共有結合させることによってＪ、　８
１ｏ１．　Ｃｈｅｍ、、　２４５　、３０５９　（１９
７０）に記畝（１）Ｐ、クアトレカサス（Ｃｕａｔｒｅ
ｃａｓａｓ、　Ｐ、　）方法に従って作った兎１ケ吸着
カラムを調製１−た。破壊したＧに１００酵母細胞を、
　０　、５Ｍ　ＮａＣ１を含むｐＨ７、２の４酸塩緩衝
食塩水３容で抽出し、抽出液をカラムにかけた。酵母が
生産したヒトＡＴ８ （０，５〜１．０”ＩＰ）を％３　Ｍ　Ｎａ５ＣＮでカ
ラムから溶出した。岩出物を透析して塩を除去した後、
ドデシル硫酸ナトリウムの存在下でボリアクリルアはド
ｒルで電気泳動によって分析した。結果は第３図に示し
である。１ｒル中の蛋白質の相対的移動に基づいて、酵
母中で生成したヒトα−１−アンチトリプシンのおよそ
の分子−１Ｆｉ４２．ｏｏｏ〜４３．０００グルトンで
ある。天然産のヒトＡＴは、約５４．ＯＯ［１ダルトン
の分子量を有し、ホラジス（Ｈｏｄｑｅｓ　）　　らに
よってＪ、　Ｂｌｏｌ　、　Ｃｈｅｍ、。

２５４．８２０８〜８２１２（１９７９）に示されたよ
うに、約１６係の炭水化物組成物を有する。従って。

酵母が生産したＡＴは、　グリコジル化されていないか
あるいは実質的にグリコジル化されておらずかつ天然産
蛋白質中に存在する炭水化物部分が欠けているものと思
われる。

別法では、α−１−アンチトリプシンのための暗号づけ
をする分節を含む他の表現ベクトルを作ることができる
。かかる表現ベクトルは、入手できるＤＮＡ構造物を用
いて、当業者に公知の方法で作ることができる。好まし
いベクトル＆ｊプラスミツドＣ１／１であり、このもの
［、ＣＡＴｌのように、ＣＶ１３およびｃ　ｖ　１３　
Ｎ％導ベクトルよりも安定である。Ｃ１／１け、プラス
ミツドルミｎ日２４８［１，Ｉ−ペッグズ（Ｊ、　Ｂｅ
ｇｇｓ　）　、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）２７５　
、１０４−１０９（１９７８）〕から作られた６Ｅｃｏ
　　Ｒ１による部分的浄化によってｐＪｎＢ２４８から
ｐＭＢ９　配列順序を除去し、ＥｃｏＲＩで切断したｐ
ＲＲ３２２ｒ）ＮＡで置換した。Ｃ１／１の＋ｌＮｌ限
地図は第４図に示しである。

ＣＩ／１７”ラスミツドは、曾母［Ｓ、ｔルビシアエ（
Ｓｓ　ｃｅｒｖｌｓｌａａ　）　］　　からの全２μＤ
ＮＡを含み、Ｅｃｏ　Ｒ１部位にｐｅＲ３２２が挿入さ
れている。このプラスミツドはＬＥＤ　２をも含む。か
くして、アダプターをもつ酵母ＴＰＩプロモーターを。

Ｃ１／１のＴｃ　　　＠伝子中の琳−セニーＨ１部位中
に挿入することができる。次に、酵母ＴＰＩ遺伝子から
の転写終了暗号断片に結合したＡ丁配列を、ＴＰ　＋ｆ
ロモーターから下流のＲａｍＨＩ側中へ挿入することが
できる。得られたデラスミツドＨＡＴ４を、次に、上記
の方法で、Ｎ５Ｑ１−１ＢおよびＧに１００に形質転換
することができる。

ｔｇ母生産ＡＴ中の最初の１０個のアぐノ酸の配列順序
は、アミノ酸配列順序分析により、天然産ヒ）ＡＴの最
初の１０個のアミノ酸と同一であることを確認すること
ができる。

この酵母生産ＡＴはＡＴＧ開始コードンで指定された開
始メチオニンを含まない。それ故、この酵母細胞はメチ
オニンをプロセスから除外して天然産ヒトへＴのアミノ
酸配列順序を生成する。

１ 本発明によって製造され九へＴ活性を有する４リ−ｅｆ
チドは、遺伝的ＡＴ欠失および不十分なＡＴレベルに関
連する他の疾病状態の治療に有用である。かくして、気
腫、および慢性閉塞性肺疾患や成人呼吸困難症候群のよ
うな、肺嚢の進行性消化に関連する他の肺障害を治療す
ることができる。６胞線維症や関節炎のような、必ずし
も肺に制限されない症状も治療することができる。＾Ｔ
欠失のａ説については、Ｊ、Ｅ、　　ガデツクおよびＲ
，クリメタＡＺ、（Ｇａｄｅｋ　、　　Ｊ、Ｅ、ａｎｄ
Ｒ，Ｃｒｙｓｔａｌ）。

ｌα−１−アンチトリプシン欠失（Ａｌｐｈａ　−１−
Ａｎｔｌｔｒｙｐｓｌｎ　Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　）’
、ザ・メタがリック・ベイシス・オブ・インへリテツド
拳ディシーズ（Ｔｈｅ　Ｍａｔａｂｏｌｌｃ　Ｂａ５ｉ
ｓ　ｏｆ　１ｎｈｅｒｌｔｅｄ　Ｄｉｓ＠ａｓｅ）。

Ｊ、Ｂ、　　スタンドバリー、Ｊ、Ｂ、ワインガーデン
、０、Ｓ、フレドリクソン（Ｊ、Ｂ、　５ｔａｎｄｂｕ
ｒｙ、　Ｊ、Ｂ。

Ｗｙｎｇａａｒｄｅｎ、　Ｄ、Ｓ、Ｆｒｅｄｒｌｃｋｓ
ｏｎ　）　％マグロー・ヒｙｂ　（Ｍｃ　Ｇｒａｗ−Ｈ
ｌｌｌ　）、Ｎ、Ｙ、　Ｄｐ−１４５０−６７（１９８
２）を参照されたり。

α−１−アンチトリプシンに、α−１−アンチ２ トリプシンの欠失を有する宿主中への導入のため、ある
いは哺乳類宿主中の蛋白分解活性を変えるために、ヒト
α−１−アンチトリプシンに対する？・ｌリフローンお
よびモノクローン抗体の生産のための抗原として用いる
ことができる・特に、α−１−アンチトリプシンは、タ
バコおよび他の喫煙によって不活性化（消化）されたα
−１−アンチトリプシンを置換するためにヒトに投与す
ることができる。

本発明の４リペデチドは、通常の薬学的担体と混合する
ことができる。好ましくけ、本発明の−ｊＪ　−？　７
°チドけ、静脈内または吸入により投与すべきである。

有効投与ｇｋｈ、症状の重罵度、患者の体重によって異
なるが、多くの場合、０．５〜１０　、　Ｏｔ／ｙｊ！
４　　の範囲の４リペクチドを静脈内に注射するが有効
である。投与方法が吸入の場合には、これよりも少楚で
有効である・ＡＴを、消化管中での早期消化からカプセ
ルまたはコーティング担体で保護するならば、経口投与
も有効である。

以下に本発明の特別な実施態様を実施例で示すが、本発
明がこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１ 菌株；　　ｓ、−ｔ　ｖ　ヒシ７　ｘ　（Ｓ、　ｃｅｒ
ｅｖｌｓｌａａ　（ｊ、ｃ、））Ｘ　２１８０−Ｉ　Ａ
　［ＭＡＴａ　５ＵＣ２ＣＵＰ１釘±２ｓバークレー・
イースト・ストック・センター（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ　Ｙ
ｅａｓｔ　５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ　）よ抄〕のメタ
ンスルホン酸エチル（ＥＭＳ　）突然受具誘発によって
得られたＰＧｌｌ、ＰＧに１、ＧＰＭｌ、Ｐ’ｆに”１
、ＧＣＲＩ　　中に突然変異を有する同質遺伝子菌株９
・Ｙ　Ｅ　Ｐ　−３９；グリセリン−２％エタノール上
テ３５．０００の独立コロニーを増殖させ、ＹＥＰ−４
９６デキストロース上で増殖不能であることによってレ
プリカ平板でスクリーニングした（第１表）。

特別な損傷の同定は、公知の解糖突然変異株による相補
性試験〔シリアシーおよびプライテンバッハ（Ｃ１ｒｉ
ａｃｙ　ａｎｄ　Ｂｖａｌｔｅｎｂａｃｈ　）、Ｊ、　
８ａｃｔｅｒｌｏ１．、　１５９．１５２　６０（１９
７９））によって行ったが、突然変異株の相互かけ合わ
せによって、少なくとも１５穐の刊加的な相補性基を見
いだした。酵素試醇〔クリ７トン（Ｃｌｌｆｔｏｎ）ら
、ゲネテイツクｘ　（Ｇａｎｅｔｌｘ）　８８．１−１
１された。

Ｓ、セレビシＩｘ　（Ｓ、　ｃａｒｅｖｌｓｌａｅ　）
　Ｘ２１８０−１Ａから、ＥＭＳ処理によってＬＥＵ２
　　突然変異株をも誘導し、Ｘ２１８Ｑ−Ｉ８（同質遺
伝子ＭＡＴａ株）とかけ合わせてＮ５０１−１８（ＭＡ
Ｔａ　ｌｅｕ　２　５ＵＣ２ＣＬＪＰｌ　　ｇａ１２）
を生産した。次に、シクロヘキシミ）”（ｃｙｈ２　）
およびカナパニン（９巳１）抵抗性を、Ｎ５０１−１８
中の偶発突然変異として選択した。解糖突然変異株をＮ
５Ｑ１−１８にかけ合わせて、おのおのが単一解糖機能
または見ＣＲ１に欠けている一連の同質遺伝子力則２株
を生産した。

＝（リー１　突然に異様、ｊ、セレビシアエ（Ｓ。

ｃｏｒｅｖｌｓｌａｅ）　Ｇ　Ｌ　Ｕ　７７をＮ５５１
Ｎ３５ｌ−１−Ａ（υす、２シ匹２　りぜ１　Ｕ已２）
にかけ合わせ、このかけ合わせから藺導された菌株をＮ
５０１−１Ｂと２回かけ合わせてｔｐｌ　１１ｅｕ　２
株、Ｎ５８７−２Ｄを生産した。この株は遺伝的背景が
他の解糖突然変異株と類似していた。

６釉のグルコース燐酸化酵素に於ける突然変異は、唯一
の炭素原としてのデキストロースで増殖することができ
ずかつ２−デオキシグルコースおよびグルコサミンによ
るカタがライトリプレッションに対して↑１（抗性であ
る株を生産する◎ｈｘｋ　１−〜（ト）２　ｌ■１株、
０３０８．３から、グルコサミン抵抗性胞子コロニーに
つｈてスクリーニングすることによって％　Ｎ　５１７
　６　Ｃ（ｈｘｋ　１　ｈｘｋ　２−ｇｌｋ　Ｉ　Ｉａ
ｕ　２　ｃａｎ　１−１００　ｃｙｈ　２　ａｄｓ　２
−１　）を誘導した。試敏によって、グルコースキナー
シング活性の欠損が確認された。

５ 第１表 Ｘ２１８０−ＩＡのｇｌｕ−誘導体の相補性群ＰＹに１
　　　　　１４ ＰＤＣｌ　　　　　　　　９ ＧＣＲｌ　　　　　　　　４ ＰＧｌｌ　　　　　　　　５ ＧＰＭｌ　　　　　　　　３ ＰＧＫｌ　　　　　　　　１ ＴＰｌｌ　　　　　　　　０ ＦＯＰ　　　　　　　　　０ （ＬＥＵ２）　　　　　　（１） １　　　　　１１ １Ｉ　　　　　１０ ｉｌｌ　　　　　　３ ｖ５ ■１ ％１１１ ■　　　　　２ ６ ■　　　　３　６０の他の突然変異は相補性ＩＸ　　　
　　２　　　群中にはない。

３ ＸＩ　　　　　２ Ｘｕ　　　　　ｌ Ｘ１ｌｆ　　　　　１ ｘｔｖ　　　　　５ ＸＶ　　　　　１ ２７０滅−ｇｌｕ’″　菌株 ３５．００ｆｌコロニーをスクリーニン／シタ（５０％
死滅のためのＥＭＳ突然変異肪発）ホモタリツクニ倍体
株、Ｓ、ｃ、ＡＢ３２０は、酵母ＤＮＡ７’−ルの桜源
であり〔ナフミスおよびリー、ド（Ｎａｓｍｙｔｈ　ａ
ｎｄ　Ｒｅａｄ　）ｓ　　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃ
ａｄ。

！３ｃ１．，７１，２１　１９−２１２３（１９８０）
玉これを幾つかの実験で対照として使用した。

三次糖燐酸イソメラーゼ遺伝子（調節信号を有する上流
配列順序を廿む）は第１Ｃ図に示す通りである。

調節信号を有するピルビン酸キナーゼ遺伝子上流配列順
序は第１０図に示す通υである。

野生型遺伝子を有する高コピーシラスミツドＤＹＥ１３
中へ挿入された酵母ＤＮＡ７’−ルで形質転換させた〔
ブローチ（Ｂｒｏａｃｈ　）　　ら、ジーン（Ｇｅｎｅ
＼８．１２１−１３３（１９７９））。

解糖性遺伝子は、グルコースおよびロイシン原栄養性で
の増殖のための同時選択を含む、相補性によって得られ
た。酵母窃素塩基と４％のグルコースと、１ノ肖たシ下
記の補充成分：アデニン４０■、アルギニン２０〜、ア
スパラギン酸塩５０ダ、ヒスチジン１０ダ、イソロイシ
ン６０〜、リジン４０Ｉ＃ｙｓメチオニン１０Ｉｎ９、
フェニル７９二ン６０■、スレオニン５０■、トリプト
ファン４０■、チロシン５０１１＃９、ウラシル２０吋
、バリン６０ダとを含む合成培地を用いた。

形質転換体（ｔｒｓｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ　）を無ロイ
シン培地で精製した後、非選択性培地（ＹＥＰＧＥ）　
　で増殖させてシラスミツドの有糸分裂分離を可能にし
た。−堕旦２と適訳性培地でレプリカ平板によって決定
される解糖突然変異株表現型とを共分離（ｃｏｓＢｒｅ
ｇａｔｅｄ　）　　した株の解糖性酵素活性の試験をし
た・酵母ＤＮＡｆレゾス（ｐｒｏｐｓ）　を作り、大腸
菌（Ｅ、　；ｏｆ　ｌ　）株ＲＲ１を、アンピシリン抵
抗４ｚ＋・で選択して、形質転換し、これらの酵母解抛
件形質転換体中にプラスミツドＤＮＡ５　　の存在をＶ
証した。

酵素試験　形質転換した酵母株を、グルコース８％を含
む最小培地（アデニンを最終一度５０ＷＱ／１になるよ
うに添加した）で選択的に増殖させた。

野生型対照Ｎ５０１−ｌＢｉｊ、同じ培地にロイシン（
１００ダ／１）を加えたもので増殖させた・解糖突然変
異株け、ＹＥＰ−グリセリン５％−乳酸塩１％で増殖さ
せた。１晩中、培養菌に新しい培地を供給し、３０°で
４時間好気増殖させたのち、収積した。細胞を２回水洗
し、に２ＨＰＯ４５０ｍＭ。

ＥＤＴ＾　２ｒｎＭ、２−メルカプトエタノール３ｒｎ
Ｍ９ （ＨＣ）でＤＨ７，４に調節）中に再懸濁させた・細胞
を、等容量のガラスビード（直径０．４５鋼）と共に、
高速で２分間ゲーテクシンダ（Ｖｏｒｔａｘｌｎｇ）す
ることによって抽出物を得たａ４°で、１５分間ミクロ
遠心分離器中で遠心分離することによって細胞破片を除
し、酵素を、上記クリ７トンおよび！ライテンパツ／％
　（Ｃｌ１ｆｔｏｎ　ａｎｄ　Ｂｒｅｌｔｅｎｂａｃｈ
）の文献に記載されたようＫして試験した。蛋白質濃度
は、ビウレッ）−ＴＣＡ法で測定した一実施例２ 形質転換体中の種々の解糖性遺伝子の活性を決定するた
め、種々の酵素を試験し、形質転換体についての結果を
、突然変異体および野生型株と比較した。…（１突然変
異株は、はとんどの解糖性活性の（ＰＧ・、アルドラー
ゼ、エノラーゼで代表される）野生型レベルの５−１０
％を有し、グルコース培地で増殖が極めて不良である。

対照的に、ＧＣＲＩ形質転換体は、はとんど野生型レベ
ルの酵素を有し、グルコース培地での増殖は野生型とほ
とんど同じであった自他の解糖突然変異株０ け、それぞれの酵素活性の辿常レベルの５係未満の活性
を有していた。しかし、相補性高コピーシラスミツドで
形質瞥換させるとき、特異的酵素活性は、はぼ野生型レ
ベルを越えて実質的に上昇した（典型的にＦｉ５〜１０
倍高く）。Ｆ記載２表はこれらの結果を示す。

第　　２　　表 野生型、突然変異株、形／ｄ転換株 ＰＧＩ　　　２．８５　　．００６５　　３１．４９（
１１ｍ　　　１１．１ＴＰＩ　　　　　　１８．５　　
　　　　　．１１０００　　　　１５７．８　　　Ｃ１
１９，２ＰＧＫ　　　１．９９　　．００４６　　１７
．６７　（３）　　　８．９ＧＰＭ　　　Ｏ，７４、（
１０００４，８０Ｑ４　　６．５ＰＹＫ　　　４．０２
　　．００５７　　１４．７７　Ｑｏ　　　３．７Ｐ　
Ｇ　ｌ　　　　　　　２．８５　　　　．２４５６　　
　２．４２　Ｑｒｉ　　　、ａｓアルドラーゼ　　　４
．３５　　　　．４４１５　　　２．９６員　　、６８
エノラーゼ　　　　０．４５　　　　．０２７４　　　
　．３１め（Ｓ　　　、７４ａ　野生型はＮ５０１−１
８である。

ｂ　それぞれの突然変異株は、Ｎ５４３−９Ｄ（シリ１
　レリ遍２）、Ｎ５８７−２０（を剣　１１ｅｕ２　）
、　Ｎ　５４８−８Ａ　（ｐ−ｊ＜ｑ　１１−ｅｕ　２
　　）。

Ｎ５８５−Ｎ３８５−２０（むｕ２）、Ｎ５４９−３＾
（船上１１ｅｕ２　）である。

Ｃ形質転換株の活性は、多くの異なる隔離物の平均値で
ある。（）内の数字は試験された独立形質転換株の数を
示す。

ｄ　　５−ｃｒ１珈Ｊ２突然変異株はＮ５２５−２０で
ある。

実施例３ 解糖性酵素の高東産が特別なシラスミツドによ３ つて相補される突然変異欠損に特異的であることを示す
ために、１０釉のシ″４なる解糖性蛋白質の試験金、Ａ
ｉ、ｔｌ々の形質転換株について行った。、Ｆ記載３表
は、詳細に試験した６柿の異なる解糖遺伝子のおのおの
に対する１つの形質転団株についての結果を示す。

／ ／ ４ ＯＣＲ−８形質転換株は全１ＯｆＩｔの酵素のほぼ野生
型レベルを示したが、ＰＧＩ−１９、ＴＰＩ−１０、Ｐ
ＧＫ−２、ＧＰＭ−２、Ｐ　Ｙ　Ｋ　−１の形質転餉株
はそれぞれの解糖性蛋白質を過剰生産したが、他の酵素
に過剰生産しなかった。

グラスミツドけ、ロイシン原栄養性の選択的圧力Ｆでも
十分に増殖した培養附で容易に分離（典や的には５〜５
０チ分離）することが認められた。

そこで、試＾倹した培養菌け、おそらく、ある範囲の数
のシラスミツドを有する。！：ｌ１１胞を含む。大腸菌
（、Ｅ、　ｃｏ月）に於ける相補性および（または）配
列１．６序づけにより、■」−（１およびＰＹＫｌは。

共に構造遺伝子であることを示した。

実施例 ヒトα−１−アンチトリグシンの生産のためのＴＰ、１
１のプロモーターの利用は次のように示された。シラス
ミツドＣＶ１３を用いた。ＣＶ１５は、泊ＩＩ　１ｌｌ
Ｉ２１個当たり平均約１０コピーで酵素の選択によって
保持され得る。ＣＶ１５は、２μｍプラスミツドのため
のレノリコンｐＢＲ５２２と酵母ＬＥＵ２遺伝子とを含
む。丁ｐＨプロモーター断片は、ＴｐＨ遺伝子を独特の
にｐｎ１部位（塩基５１１〜５１８）の所で切断するこ
とによって得られ、得られた線状化ＯＮＡを次にＢａｔ
１５で４〜５分間処理してＴｐＨ構造配列を除去した。

次に、ＥｃｏＲｌまたけＨｌｎｄｍｔたはＢａｒｎＨＩ
のいずれかのリンカ−を挿入した・次に、このリンカ−
を適当な制限酵紫で分裂させて、ヒトα−１−アンチ）
　＋３デシン遺伝子の挿入のための相補末端を与えた。

ヒトα−１−アンチトリプシン遺伝子をＢａｒｎＨＩ　
で消化し、８ａｍＨＩ　　は暗号ストランドの５′末端
の所で分裂させて成熟蛋白質から単一グルタミン酸コー
ドンのための情報を除去する。

下記第４表に示すように、４種の異なる構造物が填遺さ
れた。第４表から、グルタミン酸コードンは、イニシエ
ーターメチオエンを有する構造物の３種中のアラニンお
よびプロリンのためのコードンで箭換されることがわか
る。

ｃｖｉ３プラスミツド中へのヒトα−１−アンチトリプ
シン構造物の結紮後、得られたデラスミ７ ラドを見、Ｌ、扁５０１−１８へ形質転換した。得られ
た酵母細＃ｆｉｌを１次に最小合成培地で増殖させた。

第４表 シラスミツド　Ｎ−末端アミノ酸　　　ＣＶｌ　３中の
指向本 ＣＡＴｌ　　嵐の＋ｈＡＴ　　　時げ［方向Ｃ−Ｔａ２
　　ｙｅｔ　ａｌａ　ｐｒｏ＋ｈＡＴ　　反時ロ一方向
Ｃ−Ｔａ　１　　ｍａｔ　１ｅ４　トＡ＋ｈＡ丁　時計
方向Ｃ−ＴＳａ２　　　ｙｅｔ　　ａ／−ａ　ｐｒｏ＋
ｈＡＴ。

但し、ＴＰＩプロモー　反時計方向 ターの欠崩部分 ＊　ヒトα−１−アンチトリプシンの約４００種のアミ
ノ酸の残り。

ヒトα−１−アンチトリプシン遺伝子を含む酵母細胞を
、がラスピード（０，４５ｍ１＋）と共に、高速度で２
〜３分間ｌ−テツクシング（ｖｏｒｔｅｘ−ｌｎｇ　）
することによって、破壊、開鎖した。抽出ｓａ　ｒｔｔ
液は５０ｍＭに２ＨＰＯ４、２ｍＭ　ＥＤＴ＾、２ｍＭ
８ ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ　　ＰＭＳＦ　（ｐ
Ｈ７，４）を含み、細胞破片を遠心分離で除去し。

抽出液は、ローリ−分析（Ｌｏｗｒｙ　ａｓｓａｙｓ　
）　　”ｔ’ｌｌ定して３〜４　′ＩＩｆ／　１−の蛋
白質を含む。

ヒトα−１−アンチトリプシンの存在ｔＬ　ＲＩＡを用
い、トリチウム標識ヒトα−１−アンチトリプシンと＃
蛋白質に対して指向けられた抗体とを、用いて決定され
た。結果は下記の第５表に示しである。

第　　５　　表 ０μｆα−１６８４４０ ０，２５μｔα−１６５５５３ ０，６μｙ（ｔ−１５８９２８ １，０μｔα−１３８４６８ ２，０μｔα−１１９５５９ ３，０μ炉α−１１４４，５２ ４，０μｆα−１１１１５５ ５，０μＶα−１９６１５ ＊　シラスミツドは酵母株Ｎ５０１−１８中で増させた
、、１００μｔの抽出物を分析した。

＃１００μｔの酵素抽出物と混合した非放射性α−１−
アンチトリプシン（蛋白質３３０μｆ）上の結果から、
天然蛋白質に対する抗体に対して天然産ヒトα−１−ア
ンチトリプシンと競合することができる。免疫学的に活
性な生成物が得られることが明らかである。

さらに、α−１−アンチトリプシン遺伝子の表現がビ１
プロモーターによって調節される。

すなわち表かられかるように、ＴＰＩプロモーターの一
部分が除かれる場合にはα−１−アンチトリプシンは生
成されない。その上、哺乳類蛋白質ヒトα−１−アンチ
トリプシンの生産は上記研究では最適になっていないの
で、この結果は生成物の最低の生産を示し、さらに増強
される可能性がある。かくして、−ユ■は、外来ＤＮＡ
の表現生ｂＶ物の高収率ｆ能率よく生産するための有効
なブロモ−ターであることがわかった。

１ 実施例５ 酵母Ｇに１００酵母抽出物からのα−１−了ンクアトレ
カサス（Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ　）　＋　Ｊ、　Ｂｉ
ｏｌ。

ｃｈｅｍ、＋　　２４５．３［］５９ｒ１９７ｎ）の方
法に従って、ヒトα−１−アンチトリプシンに対する親
和カー精製した抗体をＣＮ　８ｒ−活性化セファロース
に共有結合させることによって免疫吸着カラムを調製し
た。破壊したＧＫ１００細胞を、０．５Ｍ　Ｎａ（１／
を含むｐＨ７、２の燐酸塩緩衝食塩水の３容で抽出し、
カラムにかけた。カラムを３ＭＮａ５ＣＮで浴出し１回
収物を、ドデシルψ階ナトリウムの存在下で？リアクリ
ルアミ−グルでの電気泳動によって分析した。電気泳動
の結果は第３図に示す。トラック１は分子量標準の混合
物を含すｔ　：　（ａ）ホスホリラーゼ日、９７．（ｌ
［］０　　ダルトン：伽）牛血精アルブミン（ＢＳＡ）
、６５．０００ダルトン＝（Ｃ）オパルプミン、４！１
．５［］０／Ａ−）ｙ　：　ｆｄｔ炭飯炭水脱水酵素０
，０００ダルトン；（ｅ）大豆トリジシン抑制剤、２０
．０００ダルトン：２ （チ）α−ラクトアルブミン１４，０００ダルトン０ト
ラツク３は免疫吸着によって精製した、分子量約４２．
０００の酵母生産ＡＴを含む。トラック７はシグマ・ケ
ミカルカンノ臂ニー（ＳｌｇｍａＣｈｅｍｌｃａｌ　Ｃ
ｏｍｐａｎｙ　）　　から購入した天然産ＡＴの試料で
、血液蛋白でひどく汚染されている。トラック７の主成
分は分子−Ｊｉ５４，０００ダルトンのヒトα−１−ア
ンチトリプシンである。

実施例６ 血精プロテアーゼトリプシンに対する酵母生産対照とし
て、１００μψ／−トリプシンと１００μ％（１００μ
ｔ）の牛血清アルブミンとの溶液１０μｔ（１μ？）と
、１ｍＭベンゾイル−アルギニオイル−ｐ−ニトロアニ
ＩＪ　Ｐヲ含ｔｒ　Ｏ、０５モルＴＲｌ５．ｐＨ８，０
緩衝液１００μｔとを混合し、分光光度計で経時による
４Ｑ５ｎｒｎの吸光度の増加を測定した。この゛溶液の
吸光度値を１００憾トリプシン活性の標菫として用いた
。３つの追加試料の反４試験を行い、毎回１ｊＩｔトリ
プシンを含み、それぞれ２５μｔＡＴ溶液＋１７５μを
緩衝液ｈ　　Ｉ　Ｄ　Ｏｌｔｔ’（１−１−アンチトリ
プシン＋　Ｉ　ｎ　［１μを綬衝蔽２００μｔα−１−
了ンチトリゾシンを含んでいた。結果は、２５μｔのＡ
Ｔｆ用いると、トリプシン活性の７３優が残り、１００
μｔのＡＴではトリプシン活性の４１係が残存し、２０
０μｔのα−１−アンチトリプシンでは２６係のトリプ
シン活性が残存していた。このことＦｉ。

酵母生産ＡＴの量を増すことによってトリジシン抑制活
性も増加することを示している。

実施例７ 酵母プラスミツドからの増加した遺伝的安定性ｃｖ１３
よりも遺伝的に安定なプラスミツｒであるＣ１／１を用
いることにより、増加した旬゛のＡＴを得ることができ
る。Ｃ１／１プラスミツドけＳ、セレビシアエ（Ｓ、　
ｃｅｒｅｖｌｓｌａｅ　）　　からの全２−μＯＮ・Ａ
を含むので、遺伝的マーカーのための選択の不在下に於
て酵母中でのそれ自体の複製および保持を促進すること
ができる。また＆　ＣＩ／１プラスミツドはＴＱ　　遺
伝子中にある単一のＢａｍ８１部位をも有する。Ｃ１／
１を有する形質転換株は、大腸菌（Ｅ、　ｃｏム）中で
、アンピシリン−またはテトラサイクリン−抵抗性で選
択す・ることかでき、酵母中でＦｉ四イシ原栄養性で選
択することができる。Ｃ１／１け２μＤＮＡのＥｃｏ　
Ｒｌ中へ挿入されたｐＢＲ３２２を含み、Ｊ、ペッグズ
（Ｊ、８ｍｇｇＳ　）　％　　ネーチャー（Ｎｅｔｕｒ
ｅ　）ａ　２７ふ１０４−１０９（１９７Ｂ）が記載し
ているＬＥυ２遺伝子を担持する。

酵母ＴＰ目プロモーター（ＣＴＥ＾３２からの）を２合
成りＮＡアダプター（上述）と共に。

Ｃ１／１の単−四二Ｈ１部位中へ、四Ｖ」−勤二Ｈ１断
片（約９００塩基対）として挿入した。この挿入によっ
て、その中にヒ）ＡＴ遺伝子を酵母中の表現のために接
合することができる単−ｅａｒｎＨ１部位が生じた。Ｃ
ＡＴ１プラスミツｙの場合のように、へＴ遺伝子（第１
図）を挿入するとき２得られたプラスミツドは＾ＴＣ開
始暗号とそれに続（ＧＡＧ（グルタミン酸コーｒン）と
を有する５ ことにたり、酵母中で成熟したヒトＡＴＩ白質角己列の
生命が可能になる。

酵母下Ｐ１遺伝子の３′フランキング（ｆｌａｎｋｌｎ
ｇ）領域の約７００の塩基対をヒト八Ｔの後に付加して
転写終了を助ける。′終了″断片は、シラスミツドＴＰ
ＩＣ１０中のＸｂａｌからＥＣ０ＲＩ　　ｔでの部位の
配列順序である［　Ｔ、アルパーおよびＧ、力’７　？
　ｄＦ　（Ｔ、　Ａｊ！ｂａｒ　ａｎｄ　Ｇ、にａｗａ
ｓａｋ　ｌ　）　％Ｊ、　Ｍｏ１ｅｃＡｐｐＨｅｄ　Ｇ
ｅｎａｔ、、工、　　４１９−４３４　（１９８２））
。

酵母終了配列を、終了暗号およびＡＴＤＮＡ’ｓを別個
にその中に挿入することができる多重クローニング部位
を有するベクトルｐＵｃ１３を用いて、ヒトＡＴに結合
させたａ　ｐＵ　Ｃ１３プラスミツドけ、」、ピエイラ
およびｊ、メツシング（Ｖｌｅｌｒａ　、Ｊ。

ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ　＊　　Ｊ−）　％　ジーン（
Ｇｉｎ＠　Ｌ　　１９％２５９−２６８ｒ１９８２）が
ベクトルｐＵｃＱおよびｐＵＣ９について記載したよう
にして作られた。

ｐＵｃ１３７’ラスミツドは、蕗５図に示すように。

ＡａｃＺ遺伝子の開始に於ける多重制限部位を含んでい
た。ヒ）Ａ丁遺伝子をＴＰ１転写終了暗号に６ 結合させるために、ＡＴ　ｃＤＮ＾クローン（第１図）
を単−Ｐｇ口部位に於て、ｐＵｃ１５中へＰｓｔ　ｌ断
片として挿入した。ＡＴ遺伝子の後には、多重クローニ
ング配列中のＸｂａ　Ｉ部位およびＥｃｏ　Ｒ１部位が
続いた。ｐｕｃ１３のこれらＸｂａ部位とＥＣｏＲｌ部
位との間に、酵母終了暗号を％ｐＴＰｌｃ１０からの７
００塩基対Ｘｂａ　Ｉ　−Ｅｃｏ　Ｒｌ断片として挿入
した。得られたプラスミツｐ　ｐＵＣａ１＋ＥＧ１け、
酵母転写終了暗号と共にヒ）ＡＴ遺伝子を含んでいた。

（第６図参照）。次に％このプラスミツｒのＥｃｏＲ１
部位へＥｃｏＲｌ−ＢａｍＨＩ合成ＯＮ＾アダプターを
付加させ、酵母終了暗号の５′末端に８ｍｍＨ１を生成
させた。このアダプターを用いるととＫより、ヒ）ＡＴ
−酵母終了暗号配列を％Ｂａ、、ｌ５−ｚで切断する仁
とによって除去し、約２１００塩基対の断片を遊離させ
る仁とができる。

このＢａｍＨ１断片を８ｍｍＨＩアダプターと共Ｋ。

ＴＰＩプロモーターを含むＣＩ／１７”ラスミツｙ中へ
挿入した。得られたプラスミツＰＨＡＴ４は。

ＴＰＩプロモーターとＡＴＧ　ＧＡＧＯＡＴＣＣアダシ
タ−とヒトＡＴ遺伝子（８ｍｍＨＩ部位からの）とＣ１
／１中へ挿入されたＴＰＩ終了暗号とを有する。ＨＡＴ
４のメＩロジーは第７図に示しである。

ＨＡＴ４をＮ５（’＋１−１８ＴｈよびＧに１００に形
質転換させた。６％のグルフース、２−３憾の酵母を有
する最小培地で２可溶性蛋白質はα−１−アンチドリプ
シンであり１細胞密度は約３１／ｌ（湿潤重量）であっ
た。ＨＡＴ４けＣ１／１を含んでいるので、このプラス
ミツドは種々の富んだ培地中で保持可能であり、ＹＥＰ
Ｄ（１ｍの酵母抽出物、２憾のペプトン、２憾のダルコ
ース）を含んでいた・富培地では、２−５４のＡＴが依
然として生産されるが、細胞密度Ｆｉ１０−２０９−／
ｌ（湿ａ重ｉｔ）・と高かった。このＨＡＴ４シラスミ
ツＰ＃ｉ、富培地上で３０回以上の分裂に対してＮ５０
１−１８中で選択力しに保持され、７０％より多くの細
胞がプラスミツｒを含んでいた。

Ｇに１００でＦｉ、細胞の９５係以上が、富培地上での
３０回の分裂後にＨＡ、Ｔ４を有していた。

ＣＡＴｌよりもＨＡＴ４を用いることの利益は、１）プ
ラスミツド安定性がより大きく％２）全蛋白質の百分率
としてのＡＴ−ｌがより高く１３）富培地を用いる結果
として１を当たりの細胞収量がずっと大きく、４）合成
（無ロイシン）培地に比べて富培地のコストが安いこと
であった。突然変異酵母＆Ｇに１００は、米国メリーラ
ンド州ロックビル市のアメリカン・タイプ・カルチャー
噛コレクショｙ　（Ａｍｅｒｌｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ
１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　）にＡＴＣＣＡ２
０６６９として寄託されている。

上記の結果から、酵母中で外来ＤＮＡの表現を調節する
ことによる異質蛋白質の製造に酵母プロモータを有効に
使用できることは明らかである。

これらのプロモーターは強力なプロモーターであるので
、高度の表現を与えることがわかった。さらに、このメ
ツセンジャーは十分に安定なので所望の表現生成物中へ
のかなりの明瞭な翻訳の程度を与えることができるよう
に思われる。その上、解糖性プロモーターと適当な栄養
培地とを用いることにより、外来ＤＮＡの表現を変える
ことができる。、この方法で、外来ＤＮＡの生産をター
ン第９ ンおよびターンオフすることができる。かぐして、本発
明は、異質蛋白質の製造に於て、製造を変えることがで
きる有効な宿主として酵母を用いる方法を提供するもの
である。さらに、解糖性調節遺伝子を用いることにより
、複数の解糖性プロモーターをターンオンおよびターン
オフすることが可能である。

以上１本発明を明瞭に理解して頂くための説明と実施例
とによっである程度詳細に説明したが、本発明の特許請
求の範囲内で変化や変形を行うことができることは明ら
かであろう。

【図面の簡単な説明】

第１Ａ図および第１Ｂ図は、ヒトα−１−アンチトリプ
シンを暗号づけする２つの形の遺伝子のｃＤＮＡ配列順
序であり、 第１Ｃ図は調節信号を有する三脚糖燐酸インメラーゼ遺
伝子の上流配列順序であり、 第１Ｄ図は調節信号を有するピルビン酸キナーゼ遺伝子
上流配列順序であり、 第２図け、プラスミツドＣＴＥ＾３２および０ ＣＡＴ　１の制限地図を示し。 第３図は１本発明に従って製造された精製α−１−アン
チトリプシンを示す電気泳動クロマトグラムの図であり
。 第４図４−ｔ、プラスミツドＣ１／１の制限地図を示し
。 第５図は、ｐｕｃ１３の多重制限部位のＤＮＡ配列順序
を示し、 第６図は、第１図からのＤＮＡ配列順序を含むプラスミ
ツＦ’ｐＵＣａ１の制限地図を示し、第７図は、プラス
ミツ）’ＨＡ　Ｔ　４の制限地図である。 部目　　７：Ｅ　Ｆ３　　　　　＄−１ＣＪ　Ｏ切Ｅ−
１＜Ｌｌ　　　　自Ｑの 目　　５已　市 く 期ドロ　　＞Ｑ　　　　Ｈ＜ ＞ｃｙ’ｔ ＄８　　　と旨。　　ミざ　　昌自ミ ０） 口Ｃ：）Ｑ、。ｇ 敞胃　ｈ国　　。Ｏ＜。 −＜　　　いく 酢　　σ上部　鰺　　３１ 一〇 ｇ目　　　片時 、０　　　イ。　　　ご１部　・＄ご “°　　肝　　酵　　３ヨ。 −く （ｊＵ　　　　−Ｕ Ｃく ５１０− 車　　　　　　鴫ζ（〕　　　　　　　　　ベー（）０
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く　　　ヒ　　　ヒ　　　Ｕ し−リ　　　ヒ　　　く　　　Ｕ （） く　　　Ｕ　　　し　　　く　　　−−Ｈくンη　　＞
Ｕ　　　　１−１−寸 ヒく　鳴ｌｒ：＠晒叩く （ＪＣＪ　　　　　ＵＵぐ　　（〕　リ；＞　（Ｊ　Ｌ
ｌ”ｌ　ＩＪ　ＩＪ　　ＩＪ　ＩＪ　Ｌ’１陣　Ｉ−Ｌ
Ｌｌ：″′ＩＵＪ−シ十 ｑ　　匡○　＜Ｅ−＠　　氷炬！ 工Ｕ　　−（Ｊｏ−ｋ　　　〉 （シ／ｌ’　　／ｒＲバルー Ｆ−１日　　　　（） ｔ−Ｉ　　　　　Ｕ　　　　　Ｅ−１ Ｆ息Ｇ。 −２３７ ＦＩＧ、　３゜ ２゜ ＦＩＧ、　４゜ 第１頁の続き ■Ｉｎｔ、　Ｃ１，３識別記号　　　庁内整理番号／／
（Ｃ１２Ｎ　　１／１６ Ｃ１２Ｒ１／８６５）　　　　　　　　　　　６７６０
−４Ｂ優先権主張　０１９８３年４月２８日■米国（Ｕ
Ｓ）■４８９４０６ ０発　明　者　リチャード・ウッドベリーアメリカ合衆
国ワシントン用９８ １５５シアトル・ノース・イース ト・テンス・アベニュー１５４６４ １、事件の表示　昭和５８年　特許前　第１４７９０７
号３、補正をする者 事件との関係　　出願人 名称　　　　ジモス　コーポレーション４、代理人 ５、補正命令の日付　　　昭和５８年１１月２９日７、
補正の内容　　　　　別紙の通り 図面の浄書（内容に変更なし）。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　酵母内で複製が可能でありかつ解糖性蛋白質（ｇ
   ｌｙｃｏｌｙｔｌｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ　）が三脚糖燐酸
   イソメラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ホスホグルコース
   イソメラーゼ、ホスホグリセリン酸ムターゼ。 ヘキソキナーゼ１、ヘキソキナーゼ２、グルコキナーゼ
   、ホスホフルクトースキナーゼ、アルｒラーゼである解
   糖性蛋白質または解糖性調節蛋白質（ｇｌｙｃｏｌｙｔ
   ｌｃ　ｒｅｇｕｌａｔｌｏｎ　ｐｒｏｔｅｌｎ　）の転
   写する能力のある酵母プロモーターを含みかつかかるプ
   ロモーターによって正規に調節される蛋白質を表現する
   遺伝子以外の遺伝子が該酵母プロモーターの下流に続く
   染色体外要素。 ２、酵母宿主中に於ける選択のためのマーカーを有する
   、特許請求の範囲第１項記載の染色体外要素。 ３、　プロモーターから下流にかつ該プロモーターの調
   節下で異質（ｆｏｒｅｉｇｎ　）蛋白質を表現する遺伝
   子を有する。特許請求の範囲ｐＡ１項記載の染色体外要
   素。 ４、ｑ−１−アンチトリジシンと実質的に閤じ構造を有
   するプロテアーゼ明害剤を表現する遺伝子がプロモータ
   ーのあとに続く、特許請求の範囲第、１項記載の染色体
   外要素。 ５、　　プロモーターの調節下で異質（ずｏｒａｌｇｎ
   　）　１１日質を表現する遺伝子があとに続く三脚糖燐
   酸イソメラーゼプロモーターを含むＤＮＡ構造物（ｃｏ
   ｎｓｔｒｕｃｔ　）。 ６、特許請求の範囲第１項寸たけ第２項または第３項ま
   たは＃！４項記載の染色体外要素を酵母宿主中に導入す
   る工程と該酵母宿主を適当な培地中で増殖させる工程と
   異質（ｆｏｒｅｌｇｎ　）　Ｄ　Ｎ　Ａによって表現さ
   れる蛋白質を隔離する工程とを含む異質（ｆｏｒｅｉｇ
   ｎ　）蛋白質の製造方法。 Ｚ　酵母細胞のゲノム中へ組込まれた特許請求の範囲＃
   ！１項または第２項または第３項また＃ｉ第４項のいず
   れか１項に記載の染色体外要素の少なくとも一部分を含
   む酵母細胞であって、該一部分が少なくとも該プロモー
   ターと該遺伝子とを含む酵母細胞。 ８、酵母細胞ｒツム中へ組込まれる染色体外要素の少な
   くとも一部分を含む酵素細胞を培養することによって生
   産きれるプロテアーゼ抑制剤であって、該一部分が、解
   糖性蛋白質が三脚糖燐酸イソメラーゼ、ピルビン酸キナ
   ーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、ホスホグリセリ
   ン酸ムターゼ、ヘキソキナーゼ１．ヘキソキナーゼ２、
   グルコキナーゼ、ホスホフにクトースキナーゼ、アルｒ
   ラーゼである解糖性蛋白質（ｇｌｙｃｏｌｙｔｌｃ　ｐ
   ｒｏｔｅｌｎ　）　　！ｌたは解糖性調節蛋白質（ｇｌ
   ｙｃｏｌｙｔｌｃ　ｒｃｒｇｕｌａｔｌｏｎ　ｐｒｏｔ
   ｓｌｎ　）の転写を調節する能力のある酵母プロモータ
   ーと該プロモーターの転写調節下にありかつα−１−ア
   ンチトリプシンと実質的に同じ構造−を有するプロテア
   ーゼ阻害剤を表現するｒツムとを含むプロテアーゼ抑制
   剤。 ９　哺乳類のα−１−アンチトリプシンのための暗号分
   節を含むＤＮＡ転移ベクトルによって形質転換された微
   生物の培養菌を増殖させる工程？含ｔｒ、ｌ１ｔｆｆ乳
   類のα−１−アンチトリプシンのプロテアーゼ阻害活性
   を有するポリペグチげの製造方法。 １０、特許請求の範囲第９項記載の方法で１１１．！Ｉ
   造される？リペデチド。 １１、天然産の哺乳類α−１−アンチトリプシンの炭水
   化物部分が無いことを特徴とする特許請求の範囲第１０
   項記載のぼりペプチド９゜１２、特許請求の範囲第１１
   項記載の実質的にグリコジル化されていない／　ＩＪ−
   ｅブチｒ。 １３、％許請求の範囲第１２項記載の実質的に純粋なポ
   リ／−ｅ７°チド。 １４、特許請求の範囲環９項記載の方法で製造されるｄ
   リペデチＩｐ０ １５、天然産の哺乳類α−１−アンチトリプシンの炭水
   化物部の無いことｆｒ特徴とする特許請求の範囲第１４
   項記載のポリペプチド。 １６、特許請求の範囲第１５項記載の実質的だグリコジ
   ル化されていないｆリベデテＹ０ １７、特許請求の範囲第１６項記載の実質的に純粋な？
   リペプチド。 １８、＃乳類α−１−アンチトリプシンのアミノ酸配列
   順序を特徴とする実質的にグリコジル化されていかいポ
   リペグチ？。 １９実質的に純粋で、実質的にグリコジル化されていな
   い哺乳類α−１−アンチトリプシン。 ２、特許請求の範囲第１０項記載のｆリイデチドの薬学
   的有効量を哺乳類に投与する工程を含む、哺乳類に於け
   るα−１−アンチトリプシンの不十分な量に関連する疾
   病状態の治療方法。 ２１、投与が静脈内である特許請求の範囲第２０項記載
   の方法。 ２２、投与が吸入による特許請求の範囲第２０項記載の
   方法・ ２、特許請求の範囲第１４項記載の？リベデチｙの薬学
   的有効量を哺乳類に投与する工程を含む、哺乳類に於け
   るα−１−アンチトリプシンの不十分量に関連する疾病
   状態の治療方法。 ２４、投与が静脈内である特許請求の範囲ｗＸ２５項記
   載の方法。 ２５、投与が吸入による特許請求の範囲第２５項記載の
   方法。