JPS62500103A - ヒト結合組織アクチベ−タ−及び関連ペプチドの発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト結合組織アクチベーター及び関連ペプチドの発現允」Ｌｑ」Ｌ員 １、允所傅立亘 “結合組織活性化”なる用語は、グリコリシスのごとき細胞性エネルギー代謝、 グリコサミノグリカン合成の刺激、及びＤＮＡ合成の刺激を特に包含する細胞性 炎症の再生朋に生ずる多数の代謝的事象を含む。結合組織の活性化を付与するこ とができる蛋白質は結合組織アクチベーターペプチド（ＣＴＡＰ）と称される。

特定ＯＣＴＡＰはそれが由来する細胞又は組織に基いて命名される。ＣＴＡＰ− 　Ｉはリンパ様細胞（］　ｙｍｐｈｏｉｄ）に由来し、ＣＴＡＰ−ＩＩは腫瘍細 胞に由来し、ＣＴＡＰ−ＰＭＮは多形核白血球に由来し、他方ＣＴＡＰ−ＩＩＩ 及びＣＴＡＩ’　Ｐ２はヒト血小板に由来する。ＣＴＡＰ−ＩＩＩは、ＤＮＡ， ヒアルロン酸及び硫酸化されたグリコサミノグリカンの合成の刺激；解糖及びプ ロスタグランジンＥ２の分泌の刺激；並びに細胞間ｃＡＭＰ蓄積を包含する多数 の生物学的活性を有する多数の形態で存在する。β−スロンポグロブリン（β一 ＴＧ）、すなわち４個のアミノ末端アミノ酸の蛋白質分解的除去によりインビト ロで生成したＣＴＡＰ−ｍのＢＭ　Ｒ体は現在確立された生理学的活性を有しな いが、特に血小板の破壊又は活性化をもたらす疾患及び状態、例えば急性心筋梗 塞、人工心臓弁移植等を有する患者について、血小板の状態を示す血清マーカー として有用である。

その証明された活性に基いて、ＣＴＡＰ−ＩＩＩは実質的な医療的価値を有する ことが期待される。例えば、リウマチ性関節炎を有する患者ではＣＴＡＰ−ＩＩ Ｉ活性が不足していることが見出される。外からＣＴＡＩ”Ｉを投与することが 有用な治療であろう。

ＣＴＡＰ−１１１はまた、哺乳類細胞培養物、特に滑脱、軟骨、皮膚、甲状腺、 及び動脈内皮のための補完的増殖因子としても有用であると信じられる。最後に 、ＣＴＡＰ−ＩＩＩは、結合組織の治癒を促進するために患者に投与する場合に 広範囲の用途を存すると信じられる。β−ＴＧは血漿β−ＴＧのモニターにおけ る診断試薬として、特に血小板の状態の示指薬として使用することができる。

現在、ＣＴＡＩ−１１１、及びβ−ＴＧを包含するその誘導体はヒト血小板から の分離により少量得られるのみである。従って、インビボでの医療的用途のため に、並びに特にＣＴＡＰ−Ｉ［［及びβ−′ｒＧの検出のための免疫学的検定に おいてインビトロで使用する試薬として、ＣＴＡＰ−ＩＩＩペプチドをより多く 供給することは実質的に価値あることである。組換ＤＮＡ技法を用いることによ り、ＣＴＡＰ−ＩＩＩ及び変形されたペプチドを効率的に製造する機会が存在し 、この変形された生成物は天然ペプチドの生物学的活性、特にマイトジェン活性 及び／又は免疫学的反応性を有するであろう。

２、従来技術のｌ。

有力なマイトジェン及び細胞性生合成反応の刺激剤としての結合組織アクチベー ターペプチドーＩＩＩ　（ＣＴＡＰ−ＩＩ［）の役割及びＣａ５ｔｏｒ等（１９ ７９）　Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　ａｎｄ　Ｒｈｅｕｍ、、　２２：２６０−２７２ に記載されている。Ｃａｓ　ｔｏｒ等（１９８３）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａ ｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＩＪｓＡ　、　８０ニア６’５−７９６、及びＢｅｇｇ等（１９７８）　Ｂｉｏ ｃｈｅｍ、、　１７：１７３９−１７４４は、それぞれＣＴＡＰ−１１１及びβ −ＴＧのアミノ酸配列を開示している。低親和性血小板因子４、すなわちスロン ビン処理された血小板に由来する増殖因子はＣＴＡＰ−１１１と同一であると考 えられる。例えば、Ｃａｓ　ｔｏｒ等（１９８３）前掲、及びＢｒｏｗｎ等（１ ９８０）　Ｃ匡ａＣｈｉｍ鵬ａ　Ａｃｔａ、　１０１：２２５−２３３を参照の こと。　Ｃａ５ｔｏｒ等　（１９８４）　八ｂｓｔｒａｃｔｓ：　Ａｎｎｕａｌ 　Ｍｅｅｔｉｎｇ、ＡｍｅｒｉｃａｎＲｈｅｕｍａｔｉｓｎ＋　Ａｓ５ｏｃｉａ ｔｉｏｎ　（第４８）及びＡｒｔｈｒｉｔｉｓ　ＨｅａｌｔｈＰｒｏｆｅｓｓｉ ｏｎｓ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ（第１９）：３３３は、生物学的に活性なＣＴ ＡＰ−ＩＩ［の多数の形態が存在することを示す。他の興味ある参考文献には、 Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ等（１９８３）　５ｃｉｅｎｃｅ、２２１：２７５−２７７ 　（ＣＴＡＰ−１が霊長類の肉腫の転換蛋白質（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｐｒ ｏｔｅｉｎ）と同一か又は密接に関連する蛋白質に由来することを示唆する）； 及びＣａ５ｔｏｒ等（１９８１）　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ、　１７：７７７−７８５ （ＣＴＡＰ−ＩＩＩの増殖因子としての使用を検討している）が含まれる。

発１と１−叉 生物学的活性、特にマイトジェン活性及び／又は免疫学的反応性を有し、ヒト結 合組織アクチベターター蛋白質−■、及び関連ペプチド、特にβ−スロンボグロ ブリン（β−ＴＧ）のごとき蛋白質分解断片に類似するポリペプチドの製造のた めに、新規な方法及びＤＮＡ造成物が使用される。このＤＮＡ造成物には、天然 ヒ）ＣＴＡＰ−ＩＩＩ又は生物学的に活性なその断片のアミノ酸配列と実質的に 同一のアミノ酸配列をコードする配列を含む。この配列は、ｃＤＮＡ、合成りＮ Ａ、又は両者の組合わせから導びかれ得る。分泌リーダー及びプロセシングシグ ナル配列をコード配列とリーディングフレームを合わせて設け、そして得られた 造成物を適当な単細胞宿主に導入することにより、成熟ポリペプチドが増殖培地 に分泌され、効率的な回収が可能となる。精製の後、このポリペプチドは通常、 その生物学的活性を妨害せずそして哺乳類例えばヒトに投与された場合に不所望 の副作用を有しない、宿主からの天然遺伝子産物を痕跡量のみ含有するであろう 。特定の具体例においては、ＣＴＡＰ−ＩＩＩ及びβ−ＴＧのコード配列はイン ビトロで化学的に合成され、そして酵母宿主により優先的に認識されるコドンを 用いる。この造成物は酵母のための複製系を含有し、そして得られる酵母形質転 換体は、ヒ）ＣＴＡＰ−ＩＩＩ及びβ−ＴＧに特徴的な生物学的活性を有する生 成物の効率的で且つ経済的な生産をもたらす。

型皿■皿華呈脱凱 第１図は、実験の部において後記するこの発明のＣＴＡＰ−ＩＩＩを発現するこ とができる染色体外因子の造成を示す。

第２図は、実験の部において後記するこの発明のβ−ＴＧを発現することができ る染色体外因子の造成を示す。

具体・なり様の記載 ヒト結合組織アクチベークーペプチドーＩＩＩ　（ＣＴＡＰ−ＩＩＩ）、及び関 連ペプチド、例えばβ−スロンボグロブリン（β−ＴＧ）の生物学的活性に対応 する生物学的活性、例えばマイトジェン活性及び免疫学的活性を有するポリペプ チドを発現するＤＮＡ造成物が提供される。これらのポリペプチドはヒト血小板 に由来するものである。ＤＮＡ造成物は通常、自律複製を可能にする複製系に連 結され、そして得られる染色体外要素を用いて感受性の単細胞宿主が形質転換さ れる。ＣＴＡＰ−ＩＩＩ又は関連ペプチドをコードする配列とリーディング・フ レームを合わせて分泌リーダー及びプロセシングシグナル配列を含有せしめるこ とにより、宿主の形質転換が前駆体ポリペプチドの発現をもたらし、このポリペ プチドが宿主により成熟ポリペプチドにプロセシングされ、次にこれが増殖培地 中に分泌されるであろう。

以後、明細書及び請求の範囲において使用する場合、ＣＴＡＰ−■及び関連ポリ ペプチドは、この発明に従って生産され、そして認められたバイオアッセイにお いて測定された場合に天然ヒト結合組織アクチベーターポリベブチド−■の種々 形能及び関連ペプチド、例えばβ−スロンボグロブリンに類似する生物学的活性 、例えばマイトジェン活性及び／又ハ免疫学的活性を示すポリペプチド生成物を 意味する。ポリペプチド生成物は天然蛋白質と同一か又は実質的に同一なアミノ 酸配列を存し、通常５個より多くのアミノ酸が異らず、さらに普通には差異は３ 個又はさらに少いアミノ酸によってであろう。はとんどの場合、ＣＴＡＰ−Ｉ［ Ｉ又はβ−ＴＧ配列は、もし異るとすれば、非極性アミノ酸、すなわち脂肪族及 び芳香族アミノ酸中の置き換えにより、又はカルボキシ末端における５個までの アミノ酸の除去により異るであろう。天然アミノ酸配列からの相違は注目の生物 学的活性に不都合な影響を与えないであろう。

この発明の染色体外因子は、所望の宿主、典型的には酵母により認識される複製 系、ポリペプチド生成物を１−ドする構造遺伝子、並びに構造遺伝子とリーディ ングフレームを合わせて、そして転写の方向において構造遺伝子の５′に分泌リ ーダー及びプロセシングシグナル配列を含有するであろう。

発現される前駆体ポリペプチドは、宿主により該前駆体ポリペプチドの効率的な プロセシング及び分泌をもたらす。このような造成物は成熟ポリペプチド生成物 の高収量をもたらす。

この発明において使用される構造遺伝子はｃＤＮＡ、合成りＮＡ、又は両者の糺 合わ−せに由来することができ、例えば合成りＮＡをｃ、Ｄ　Ｎ　Ａと組み合わ せて構造遺伝子を完成することができる。構造遺伝子なる語は、成熟ポリペプチ ド生成物、すなわちプロセシングの後に宿主により分泌されるポリペブチ１゛を コードするＤＮＡ配列を意図する。構造遺伝子なる語は、転写、発現又はプロセ シングに関連する制御配列又は他の配列を意味しない。

この発明は、天然ヒト結合組織アクチベークーペプチド−■及びβ−ＴＧのアミ ノ酸配列に基くヌクレオチド配列を有する合成構造遺伝子を用いる染色体外因子 により例示されよう。アミノ酸配列はＣａｓ　ｔａｒ等（１９８３）　、前掲、 により報告されており、この配列は後記の実験の部で再現される。アミノ酸配列 は通常、天然ポリペプチドのそれと同一であろう。但し、ポリペプチドが所望の 生物学的活性、すなわちマイト・ジエン活性及び／又は免疫原活性を維持する限 り、ある種の相違は許容されるであろう。

ヌクレオチド配列を］−夫するに当っては、意図される酵母宿主により優先的に 使用されるコドンを用いるのが好ましい。

特に、このようなコドンは酵母解糖系酵素をコードする構造遺伝子中に高頻度で 現われるコドンであるウヌクレオチド配列は少なくとも５０％、普通には少なく とも６０％、さらに普通には少なくとも７５％の好ましいコー　トコトンを含む であろう。好ましい酵母コドンを用いる特定のヌク１／オチド配列もまた実験の 部に示される。

合成構造遺伝子は便利には、約１０〜１２５塩基、通常約２５〜１００塩基を含 有する一連の竜鎖ＤＮＡ断片のインビトロ合成により調製される。単鎖断片は、 アニーリング条件下で一諸にされた場合に所望のヌクレオチド配列を有する２木 鎖断片が生成するように選択される。

合成ヌクレオチド配列を工夫する場合、非マツチセグメント間のアニーリングが 回避されるように、個々の単鎖ＤＮＡセグメントの配列が検討される。このよう にして、生ずる２本鎖ＤＮＡ断片中でアニールすることが意図されるセグメント 間のみで塩基対合が生ずる。可能な範囲に所望の酵母バイアスを維持しながら幾 つかのコドン中の１個のヌクレオチド（通常第３番目）を変えることによって不 所望の塩基対合が回避される。

ＣＴＡＰ−ＩＩＩ又はβ−ＴＧをコードする２本鎖合成りＮＡＩ！Ｊｉ片は通常 、該断片のクローニングベクター及び発現ベクターへの挿入を促進する接着末端 を有するであろう。この断片は典型的には構造遺伝子の末端に終止コドン（１個 又は複数個）を含有するであろうし、そして該断片の５′−末端に分泌リーダー 及びプロセシングシグナル配列の部分を含有することができる。構造遺伝子の配 列を工夫する場合、ユニーク制限部位を導入して、遺伝子のその後の変形、例え ばバイブリドの造成、修復、変異、切除等を可能にすることができる。

分泌リーダー及びプロセシングシグナル配列は通常、ポリペプチドの分泌をもた らす、酵母中に天然に存在するＤＮＡ配列から誘導されるであろう。酵母により 天然に分泌されるこのようなペプチドにはα−ファクター、ａ−ファクター・酸 性ホスファターゼ等が含まれる。所望により、天然配列は、α−ファクター前駆 体のプロセシング部位に位置するｇｌｕ−ａｌａ対を除去するかもしくはその数 を減少せしめることにより、又はｍＲＮＡ　’Ｊ−グーの長さを短縮する（分泌 をもたらすのに十分な長さを維持しながら）ことにより、又は点変異、欠失、又 は操作を促進する他の変化、例えば制限認識部位を導入することにより変形され る。便利には、分泌リーダー及びプロセシングシグナル配列は、構造遺伝子に適 切な接着末端を設けることにより、アダプター分子により、又は両者の組合わせ により、構造遺伝子に連結される。

構造遺伝子、並びに分泌リーダー及びプロセシングシグナル配列に加えて、この 発明の染色体外因子は、転写開始制費配列及びターミネータ−配列、場合によっ ては、所望の酵母宿主中で自律複製することができる複製系、及び細菌宿主中で 自律複製することができる複製系を含有するであろう。便利には、分泌リーダー 及びプロセシングシグナル配列と関連するプロモーターが使用されるが、広範囲 の種類の他のプロモーターも適当であろう。特に興味あるプロモーターには、酵 母解糖経路中の酵素と関連するプロモーター、例えばアルコールデヒドロゲナー ゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ピルベートキナ ーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、ホス ホフラクトキナーゼ等のプロモーターが含まれる。これらのプロモーターを制御 配列、例えばエンハンサ−、オペレーター等と共に用い、そして無傷の制御系を 有する宿主を用いることにより、ある種の小有機分子、例えばグルコースの濃度 を変化せしめることによってＣＴＡＰ−ｍ又はβ−ＴＧ生成物の発現を制御する ことができる。これに代えて、温度を変化せしめることによる転写の調節を可能 にする温度域受性制御変異体を用いることができる。

この発明のＤＮＡ造成物中に使用されるターミネータ−は、適切な転写をもたら すようにプロモーターとバランスしているべきである。便利には、プロモーター により天然に使用されるクーミネーターが使用される。酵母及び細菌の両者のた めの複製系を含む、造成物中の残りの配列はよく知られておリ、そしζ文献中に 詳細に記載されている。

１ＤＮ　Ａ造成物中に他の能力を導入することもできる・組め込み（ｉｎｔｅｇ ｒａｔｉｏｎ）をもたらまために、ＤＮＡ造成物は宿主ゲ７ノふと相同なセグ９ メントを含有することができる。宿主染色体への構造遺伝子及び関連制御配列（ 染色体り）因子の残りの部分４除く）の組み込みは、構造遺伝子及び制御配列の いずれかの側に相同配列を設けることにより達成することができる。このことが 、挿入を前駆体ＣＴＡＰ−Ｉｎ又はβ−１゛Ｇシストロンに限定する、−重交差 現象による組み込みを可能にするゆさらに、幾つかの組み込まれた遺伝子はそれ らのフランキング領域と共Ｖこ、宿主へのストレスの際に増幅される。このよう な遺伝子を構造遺伝子及び関連する制御領域から上流に置き、そして宿主をスト レスすることにより反復する配列が得られ、ここでタンデム反復部のそれぞれは 構造遺伝子及び関連する制御配列、並びに関連する制御配列を伴う増幅遺伝子を 含有する。このような増幅をもたらす遺伝子の例にはメタロチオネイン及びジヒ ドロフオレートレダクターゼのためのそれが含まれる。

便利には、ＤＮＡ造成物は、注目のＤＮＡ配列を担持するあらかじめ存在する染 色体外因子、例えばプラスミド及びファー・ジベクターを用いで調製する。通常 、ＣＴＡＰ−ＩＩＩ又は関連遺伝子コード領域を分泌り−・ダー及びプロセシン グシグナル配列に連結するために細菌クローニングベクターが使用されよう。（ ：ＴＡＰ−ＩＩＩ又は関連遺伝子及び分泌配列は上記のようにして別々に調製し 、そして適切な相対位置を保証するような態様で、任意の便利な細菌ベクター、 例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５等に導入することができる。後記の実験の部 においては、変形されたα−ファクター分泌リーダー−及びプロセシングシグナ ル配列をｔでに担持している細菌クローニングベクター（ｐαＥＧＦ−２４）を 使用した。合成ＣＴＡＰ−ＩＩＩ又はβ−ＴＧ遺伝子の５′−末端を適切に、コ ードすることにより、変形されたα−ファクター配列内で開裂せｊ７め、合成遺 伝子を挿入し、そしてα−ファクター・配列を実質的に再生することができる。

所望の配列を挿入した後、細菌ベクターをクローニングして、分泌リーダー及び プロセシングシグナル配列（通常、必要な転写制御シグナルを含有する）及びＣ ＴＡＰ−ＩＩ［又は関連遺伝子を担持する断片を拡大することができる。この断 片を切り出し、そして適当な発現ベクター、例えば酵母発現ベクターに挿入する ことができる。酵母発現ベクターは酵母発現系及び通常１個以上の選択マーカー を含有する。実験の部において使用した酵母発現ベクター（ｐｃ１／１）は、２ μｍプラスミド由来の複製系、及びｌｅｕ”酵母宿主における選択を可能にする ＬＥＵ２遺伝子を担持する。

プラスミドは、任意の便利な手段により、酵母宿主細胞又はスフェロプラストを 使用し、そして形質転換のためにカルシウム沈澱されたＤＮＡ、リボゾーム、又 は他の便利な技法を用いて、酵母宿主中に導入される。変性された酵母宿主は、 発現プラスミドを造成するために使用されるベクター中に通常備えられている遺 伝マーカーに従って選択される。宿主を補完しそして原栄養性を付与する遺伝子 をプラスミドが含有する場合、栄養要求性宿主が使用される。他の方法として、 適当な殺生物剤、例えば抗生物質、重金属、毒素等に対する耐性をプラスミド中 のマーカーとして使用することができる。

次に、プラスミドを含有する細胞について選択するように宿主細胞をストレスす る栄養培地を用いることにより選択を達成することができる。次に、プラスミド 含有細胞を適切な栄養培地中で増殖せしめ、そして常法に従って分泌された所望 のポリペプチドを単離する。ポリペプチドはクロマトグラフィー、濾過、抽出等 により生成される。ポリペプチドは栄養培地中に成熟形として存在するであろう から、所望のポリペプチドを取り出しながら栄養培地を循環せしめることができ る。精製の後、ポリペプチド生成物は宿主からの汚染物を実質上含有しないであ ろうが、しかし通常は単細胞宿主、例えば酵母からの少なくとも痕跡量の天然遺 伝子生成物をなお含有するであろう。

次の例は限定としてではなく、例示として与えられる。

Ｃａｓ　ｔｏｒ等（１９８３）　、前掲、により報告されたアミノ酸配列に基い て、そして好ましい酵母コドンを用いて、ＣＴＡＰ−ＩＩＩのためのヌクレオチ ド配列を工夫した。コード鎖が５′から３′に示されている配列は次の通りであ る。

プロセシング部位 配列はその５′−末端（コード鎖に関して）にｘ匹Ｉ接着末端を、そしてその３ ′−末端に５ａｌｌ接着末端を含有する。

成熟ポリペプチドのコードはＬｙｓＡｒｇプロセシング部位の後から始まる。ユ ニーク入江■及び旦■工制限部位が成熟ポリペプチドのコード領域の内部に設け られ、その後の修復、変形、変異及び切除が可能にされる。最終的なコードの選 択を行う場合、望ましくないアニーリングの組合わせ、すなわち１より多くの位 置でアニールし得るセグメントを、可能であれば酵母コドンバイアスと一致する 態様で、該当するコドンの第３位のヌクレオチドを置き換えることによって変更 した。

プロセシング部位までの配列の５′−末端は天然α−ファクター分泌リーダー及 びプロセシングシグナル配列の３′−末端の変形であり、この場合３個のｇｌｕ −ａｌａ対が除去されており、ぞして該配列が、α−ファクター遺伝子の残りの 部分（下記する）を担持するクローニングベクターに挿入される場合・　Ｉｅｕ （ｓｅｔではなく）が再構成される。

すぐ上に記載した配列を有するＣＴＡＰ−１１１のための合成ＤＮＡを断片を、 Ｂｅａｕｃａｇｅ及びＣａｒｒｕｔｈｅｒｓ　（１９８１）　Ｔｅｔｒａｈｅｄ ｒｏｎ−１うｅｆｔ．　２２：１８５９−１８６２に記載されているホスホラミ ダイＥ法の変法を用いて、１１　ｒ　ｄ　ｅ　ａ等（１９８３）　Ｐｒｏｃ．　 −Ｎａｔｌ．Ａｃａ−ｄ．　Ｓｃｉ，　ＵＳＡ８０：７４６１−７，１６５に報 告されているようにして、オーバラソプするＳＳＤＮＡセグメン１・２０個を合 成することにより羽製（−，た。

ＳＳＤＮＡセグメンＩ・の配列ぱ次の通りであった。

一一名一−一称一　−−一一一』Ｃ刀−チｊ７ニニ＝Ｊ二り−一一一−〜一一− 一一Ｃ−ｉ　ＴＡＴＴＧＧＡＴＡＡＡＡＧＡＣ−２　ＡＡＣＴＴＧＧＣＣＡＡＧ ＧＧＴ八八ＧＧＡＡＧＡＡＴＣＣＴＴＣ−３　ＧＧＡＣＴＣＴＧＡＣＴＴＧＴＡ ＣＧＣＴＧＡＡＴＴＧＡＧＡＴＣ−４　ＧＴＡＴＧＴ［’；ＴＡＴＣＡＡＧ／Ｉ ｃｃＡｃｃＴｃＴＧＧＴＡＴＣ−５　ＣＣＡＣＣＣＡＡＡＧＡＡＣＡＴＣＣＡＡ ＴＣＴＴＴＧＧＡＡＧＣ−６　ＴＣＡＴＴＧＧＴＡＡＧＧＧＴＡＣＣＣＡＣＴＧ ＴＡＡＣＣＡＡＧＣ　−　７　ＴＴＧＡＡＧＴＴＡＴＣＧＣＴＡＣＣＴＴＧＡＡ ＧＧＡＣＧＧＴＣ　一−　８　＾Ｇ八＾ΔＧ八ＴＣＴＧＴＴＴＧＧＡＣＣＣＡＧ ＡＴＧＣＴＣＣＣ−９　八ＡＧＡＡＴＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＧＴＴＣＡＡＡＡＧ ＡＡＧＴＴＧＣ−ＩＯ　ＧＣＴＧＧＴＧＡＣＧＡＡＴＣＴＧＣＴＧＡＣＴＡＡＴ ／ＩＧＣＧＴ（１：ＧＣ−１１　ＣＣＴＴＧＧＣＣＡＡＧＴＴＴＣＴＴＴＴＡＴ ＣＣＡＡＴＡＧＴＡＣＣ−１２　ＡＣＡＡＧＴＣＡＧＡＧＴＣＣＡＡＧＧＡＴＴ ＣＴＴＣＣＴＴＡＣＣ−１３　ＣＴＴＧＡＴＡＣＡＣＡＴＡＣＡＴＣＴＣＡＡＴ ＴＣＡＧＣＧＴＣ−１４　ＡＴＧＴＴＣＴＴＴＧＧＧＴＧＧＡＴＡＣＣＡＧＡＧ ＧＴＧＧＴＣｉ５　ＡＣＣＣＴＴＡＣＣＡＡＴＧＩＩＣＴＴＣＣＡＡＡＧｆｌＴ ＴＧＧＣ−１６　ＡＧＣＧＡＴ八八ＣＴＴＣＡＡＣＴＴＧＧＴＴＡＣＡＧＴＧＧ Ｇ丁Ｃ　−１７　八ＡＡＣＡＧＡＴＣＴＴＴＣＴＡＣＣＧＴＣＣＴＴＣＡＡＧＧ Ｔｃ　−＋ａ　＋ｖｒｃｒｒｃＴｒｃＡｔｒｃｒｒｃｃＡｒ，ｅＡｒｃｒｃｃＧ ｒｃｅＣ−１９　ＣＡＧＡＴＴＣＧＴＣＡＣＣＡＧＣＣＡＡＣＴＴＣＴＴＴＴＧ ＡＡＣＧＣ−２０　ＴＣＧＡＣＧＡＣＧＣＴＡＴＴＡＧＴＣＡＧｓｓＤＮＡ断片 を次のようＧこして連結した。Ｃ〜１及びＣ−２０を除く各断片５００ｐｍｏｌ ｅを個別に、１．０ｍＭジチオスし・イＩ・−ル（ＤＴＴ）　、１ｍＭＡ　Ｔ　 Ｐ，　１　０１ＩＩＭ　Ｍｇ（：１．２、１００ｍｇ／ｍｌスベルミジン、５　 ０＋＋ｌＭ　｝ｉｒｉｓ−ＨＣＩ　％　＋７１１７、８　（合計容！２０μ１） 中５，６ユニットのＴ４ポリヌク１／オチドキナーゼ（ニューイングランドヌク レア）により、３′にＣにて１時間５′−リン酸化した。次に、追加のＴ４キナ ーゼ（５．６１ユッ１・）を加え、そ１、２゛−こ反応を３７℃にて２．５時間 続けた。次に、各反応混合物を水で５０μ１に稀釈し、ぞＬｒで４分間９２ｔ？ こ加熱した。

これらのキナーゼＪゾ応混合物中プ・−ルされたリン酸化セグメン１・（各セグ ノンｌ−　！’ｉ　０ｐｍｏｌｅ　，　５　１１　１）にＣ−１及びＣ＝２０セ グメンＩ−　（　５　０　ｐｍｏｌｅ）及びボリｒＡ　（１０μｇ）を加えて最 終容Ｍ１】５μ１とし，た。２　Ｍ　ＮａＯＡｃ＆：より混合物を０．　６　Ｍ 　ＮａＯＡｃに調整し、次Ｇご３容量のエタノール（１．００％）を添加しそし て−８０℃に７時間冷却することによりセグメントを同時沈澱せしめた。遠心分 離の後、ペレフトを水性エタノール（９５％）により一度洗浄し、そして真空乾 燥した。

ペレソ１・を水（１８μ１）に再溶解し、そして９０℃にて３分間加熱し、そし て次に水浴中で１．５時間にわたり徐々に２５℃に冷却した。

アニールされた断片のプールを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ニューイングランドビオ ラブス１２００ユニット）　、１ｍＭＡＴＰ，１　０ｍＭＤＴＴ，　１　０ｍＭ 　ＭｇＣ１ｚ、１００ｎｇ／ｍｌスベルミジン及び５　０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１ １ＣＩ．．ｐＨ７．　８を含存する反応混合物（３　０　μｌ）中で連結した。

１４℃にて１４時間のインキュベーションの後、十分な長さの２本鎖断片を調製 用ポリアクリルアミドゲル（７％、ネイティブ）電気泳動により部分精製した。

該当するゲル切片から電気溶出によりＤＮＡを取り出し、ポリｒＡ　（５μｇ） と共にエタノール共沈せしめた。生ずる２重鎖断片は合成単鎖セグメントから次 のように集成したものでｒ■　酊１２　Ｃ−１３　Ｃ−１４　２　『■ｒ　『■ ｌ　ｌ集成した後、合成ＣＴＡＰ−ＩＩＴを、制限エンドヌクレアーゼＫｐｎ■ 及び−ＳａｌＩによりあらかじめ消化して盈…ｒ／Ｓａｌ！断片を除去しておい た細菌クローニングプラスミドｐαＥＧＦ−２４に挿入した。プラスミドｐαＥ ＧＦ〜２４はα−ファクター分泌リーダー及びプロセシングシグナル配列の５′ 一末端を担持しており、合成ＣＴＡＰ−１１１配列が挿入された場合、ＣＴＡＩ −ＩＩＩ遺伝子とリーディングフレームが合った状態で機能的リーダー及びプロ セシング配列が再成される。このプラスミドはさらに、挿入部位の上流及び下流 にそれぞれα−ファクタープロセーター及びターミネーターを担持する。

プラスミドｐαＥＧＦ−２４は１９８３年８月１２日に出願された係属中の出願 ｌＩ＆１５２２．９０９に記載されているようにして調製された。

調製は次の通りであった。Ｈ．　Ｇｒｏｇｏｒｙ及びＢ，　Ｍ．　Ｐｒｅｓｔｏ ｎ（１９７７）　Ｉｎｔ．　Ｊ．　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ． 　，９：１０７−１１８により報告されたヒト上皮成長因子（ＥＧＦ）のアミノ 酸配列に基いてＥＧＦのための合成配列を調製した。この配列をｐＢＲ３２８の ＥｃｏＲＩ部位に挿入してブラスミドｐ３２８ＥＧＦｉを形成しそしてクローン 化した。約３０μｇのｐ３２８ＥＧＦ−１を匡ＲＩで消化し、そして予想される １９０塩基対のＥｃｏＲＩ断片約１μｇを単離した。次に、制限酵素且且■によ り消化した。次に、２個の合成オリゴヌクレオチドコネクターＨｉｎｄｌＩＩ− Ｈｐａｌ、及び旦鉦ｒ−五剰Ｊを１５９塩基対の旦叩Ｉ断片に連結した。

ＨｇａＩ一旦ｉｎｄＩＩＩリンカーは次の配列を有していた。

ＡＧＣＴＧＡＡＧＣＴ ＣＴＴＣＧＡＴＴＧＡＧ このリンカーはＨｉｎｄｌｌＩ消化により中断されるα−ファクタープロセシン グシグナルを復原し、そしてＥＧＦ遺子の５′一末端における旦且Ｉ末端をｐＡ ＢＩ１２の旦測ｄｍ末端に連結する。■±ＬＩ−ＳａｌＩリンカーは次の配列を 有していた。

ＴＧＡＧＡＴＧＡＴＡＡＧ ＡＣＴＡＴＴＣＡＧＣＴ このリンカーは２個の終止コドを有し、そしてＥＧＦ遺伝子の３′一末端の且ｇ ａｌ末端をｐＡＢ１１２の盈旦Ｉ末端に連結する。

生ずる１８１塩基対の断片を調製用ゲル電気泳動によって精製し２、そして酵素 −去１ｎｄｌｌｌ及び−む↓ｌによりあらかじめ完全消化しておいた１１００ｎ のｐＡＢ１１２に連結した。生ずる混合物を用いてＥ、コリ　（上ユニｑｌｊ） 　ＩＩＢＩＯＩ細胞を形質転換し、そしてプラスミドｐＡＢ２０１を得た。

ｐＡＢ１１２はｐＢＢｉ１２（ｐＢＲ，’３２２から一其ｊｎｄＴ［［及び災ａ −１−Ｉ部位が除去されているもの）のＥｃｏＲ１部位にクロ・〜ン化されたα −ファクター遺伝子を有する１、７５ｋｂ−レ（ｇ−（λＲＩ断片を含有するプ ラスミドである。　ｐＡＢｌｉ２は、プラスミドＹＥｐ２４の一戊ザＨｒ部位Ｑ 、ニラｌ−トーン化された部分的−δａｐ、３Ａ断片とし、て酵母α−ファクタ ー遺伝子を含イ）するプラスミドｐＡＢ１０１から誘啓された。

ｐ　Ａ　ｌ−（１０１は、公表されたα−ファクタ・−コー・ド領域（Ｋｕｒｊ ａ口及びＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、　酵母の分子生物学に関する１９８１年コール ドスプリングハーハー　ミーティング、要約２４２真）と相同の合成２０ｍｅｒ オリゴヌ、タレ；ｆ’　■１７゛ｌ−１−フ゛（３’　ＧＧｉ：ＣＧＧＴＴＧＧ ＴＴＡＣＡＴＧＡＴＴ−５”）を用いてＹ［：ｐ２４中の酵母ゲノノ、う・イブ ：〉リーをスクリーニングするご、とによｚつ得られ人４、α−ファクターリー ダー−ｈＥＧＦ融合体を含有１−ｐＡＢ２旧の１じ（Ｉ−芥ａｌｌ断片を−ファ ージＭ１３にり１コーク７′化し、そし−てり′（鎮型として単離しまた。配列 ５”　−ＧＧＧＴＡＣＣＴＴＴＧＧＡＴＡＡＡＡＧＡＡＡＣＴＣＣＧＡＣＴＣＣ ＧＡＡＴ−３’の合成３６　ｍｅｒ　’ｉ・合成し１、そしてＤ　Ｔｈｉ　Ａポ リメラーゼのに１ｅｎｏｂ＋断片により上記の鋳型１　ｐｍｏｌｅから第２鎖を 合成するためのブラ・イマーとし７て使用した。フィル−インし２、そして１４ °にて１８時間連結した餞、混合物をＳ、ヌクレアーゼにて処理しく５ユニソ１ ．１５分間）、そしてＥ。

コリＪＭＩＯＩ細胞を性質転換するために用いた。プロセシング部位の輸１ｕ− ａｌａ）３をコードする領域が除去されているＤＮＡ配列を含有するハタテリオ ファージを、プローブとして３２ｐ−ラベルプライマ・−を用いてフィルタープ ラークハイブリダイゼーションにより位置決定した。陽性プラークからのＲＦＤ ＮＡ峻単離し７、ＰｓｔＩ及び５ａｉｌで消化し、そして生ずる断片を、あらか じめ−ΣＡ↓Ｉで完全消化され、実−１１で部分消化され、そしてアルカリ性ホ スファターゼで処理されたｐＡＢ１１４？こ挿入した。生ずるプラスミド（ｐα ＥＧＦ−２４）は基匣■部位を含有し２、ここで酵母α−ファクター配列がｂＥ ＧＦ配列に連結されていた。

グラスミドｐΔＢ　１１４は次のよ・うにして誘専された。プラスミドｐＡＢ１ １２を几圭ｎｄｌＩＩにより完全消化し、ぞして次に低（４μｇ／−構造遺伝子 から除去され、成熟α−ファクタ・−コード領域の学−コピーのみが残っている ６エーｔ、：ｏＲＩによる開裂、ＤＮＡボリメラ・−ゼのＫｌｅｎｏｗ断片によ る突出末端のフィル−イン、−Ｂ、、−ａ　ｍ　Ｈ＋リンカーの連結１、−川Ｑ ＨＩによる開裂、及び再連結Ｈｒによる消化の後、１５００ｂｐに断片をゲル精 製し、そしてＢａｍＨｉにより消化されそしてアルカリ性ホスファターゼにより 処理されたｐＡＢ１２に連結し、て、α−ファクター遺伝子を担持する１５００ ｂｐのＢａｍＨＩ断片を含有するプラスミドｐＡＢ１１４を得た。

今、第１図に言及しながら、合成ＣＴＡＰ−Ｔｆｌ遺伝子配列を、１０ｍＭジチ オスレイト−ル、１ｍＭＡＴＰ、１０ｍＭ　ＭｇＣｈ、１１００ｎ／ｎ＋ｌスペ ルミジン、５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，８）及び８ユニツトのＴ ４ポリヌクレオチドキナーゼを含有する２０μｍの反応プールに溶解し、そして 混合物を３７℃にて５０分間インキュベートした。プラスミドｐαＥＧＦ−２４ （１，０μ１ｌｌ１００ｎ／μｌ）をΣａｌｌ及び基匣■で消化し、そして大断 片ゲルを単離しそしてＴ４リガーゼ（４００ユニツト）と共に反応混合物に加え た。生ずる混合物を１４℃にて２２時間インキュベートし、この後ＤＮＡをエタ ノール沈澱せしめ、そしてペレットをエタノールで１回洗浄した。

ＤＮＡを再懸濁し、そしてＥ、コリＨＢＩＯＩ細胞を形質転換するために使用し た。８個の形質転換体の内、アルカリ性ＳＤＳプラスミドミニー調製及びこれに 続く制限部位スクリーニングにより３個の推定上の形質転換体を得、これをＭ１ ３ジデオキシ配列決定法により配列スクリーニングした。３個の形質転換体のす べてが変異配列を有し、そして１個が第３９コドン（バリンのコドン）の第３位 置に１個のサイレント変異を含有し、コード鎖中のシトシンがチミンにより置き 換えられていた。この新しいコドンは最初に選択されたコドンよりも酵母に好ま れる（酵母について観察される解糖系酵母コドン使用バイアスに従う）ので、こ れ以」二のスクリーニングを行わなかった。このプラスミドをｐαＣＴＡＰと命 名した。

ＣＴＡＰ−Ｉ［１遺伝子並びに関連するα−ファクターリーダー及びプロセシン グシグナル配列を担持する酵母シャトルベクターを次のようにして調製した。プ ラスミドｐαＣＴＡＰをＢａｍＨＩで消化し、そして約１．７　ｋｂｐの断片を 調製用ゲル電気泳動により単離した。約４１１ｇのこの断片を、ｐＣ１／１の旦 ａｍＨＩ消化及びアルカリ性ホスファターゼ処理から調製された０、　１μｇの ベクターと１ｍＭＡＴＰ、］、　ＯｍＭＤＴＴ、　１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、１１ ００ｎ／ｍｌスペルミジン、５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，８）及 び４００ユニツトのＴ４リガーゼを含有する２０μｌの反応混合物中で１４℃に て２１．５時間連結した。プラスミドｐｃｉ／１はｐＪ［ｌＢ２１９（Ｂｅｇｇ ｓ（１９７Ｂ）　Ｎａｔｕｒｅ、　２７５：１０４　）の誘導体であり、ｐＪＤ Ｂ２１９中の細菌プラスミドｐＭＢ９に対応する領域がｐｃｔ／１中ではｐＢＲ ３２２により置き換えられている。Ｅ、コリ形質転換体がアンピシリン耐性によ り選択される。

Ｅ、コリＩＩ　Ｂ　１０１細胞の形質転換が約１２００個のアンピシリン耐性形 質転換体をもたらし、その内の２２個を制限部位スクリーニングした。これらの 内８個が推定上のＣＴＡＰ　−ｍ　ＭＪ、ｔＩＡ体であった。さらに行った制限 部位スクリーニングにより、第１図に示すように、組換体プラスミドの１つ（ｐ ＹαＣＴＡＰ３−１と称する）はＣＴＡＰ−ＴＩＴ遺伝子の単一コピー及び随伴 するα−ファクターセグメントを担持し、他方第２の組換体（ｐＹαＣＴＡＰ３ −２と称する）はヘッド対テイル配置で断片のタンデム反復を担持することが示 された。

酵母〔サツカロミセス・セレビシェ−（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｓｅｒｅｖ ｉｓｉａｅ）ＡＢ１０３株のスフェロプラストをｐＹ　ｃｘ　ＣＴＡＰ３−２及 びｐＹ　αｃＴＡＰ３−２により、１ｌｉｎｎｅｎ等（１９７８）　Ｐｒｏｃ、 　Ｎａｔ、八ｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＩｓＡ　、７５：１９２９−１９３３に記載されているようにして形質転換し７ 、そ（−２でロイシン原栄養性を選択した。これらの形質転換体の培養物をロイ シン−選択培地中で定常Ｍまで培養せしめた。

遠心分離により細胞を除去した後、４５ｍ１の」二清を０．　Ｉ　Ｎ１１ｃＩ　 ５．ｍヨリｐＨ３，０に調製し、０．１Ｍ酢酸によりあらかじめ平衡化しておい た０、８ｍｌのＢｉｏ−Ｒｅｘ　７０　（５０−１００メソシ、２）陽イオン交 換カラムに通した。カラムを２べ・ソドボリウムの０．１Ｍ酢酸及び２容星の５ ０％エタノールで洗浄した。２部の５ｍＭ　ＩＩｃＩ及び８部のエタノ−・ルか ら成る溶液３．０へ７・ドボリウムにより蛋白質を溶出し、そして次に蒸発乾燥 し、水中に再懸濁し、ぞして４℃にて貯蔵した。

ｐ’ｌαＣＴＡＰ３−１及びｐＹαＣＴＡＰ３−２の両者により生産された蛋白 質を特徴付け（下記のようし、て）、そして天然源からｍ離されたし１−ＣＴＡ Ｐ−１１１と実質上同一の性質を有することが見出された。蛋白質をＳＯ３−ポ リアクリル−アミドゲル上で電気泳動し、そしてクマシーブルー染色によりチト クロームＣマーカーよりわずかに小サイズの強いバンドが現われ、約］、０．０ ００ダルＩ−ンの蛋白質が示された。ＣＴＡＰ−Ｉｌｌは９２７８ダルトンの計 算された分子量を有する。既知標準との染色強度の比較は、固形質転換体につい て培養物ｌβ当り約２■の蛋白質の収量を示した。蛋白質の配列決定は、両蛋白 質の最初の１５個のＮ−末端アミノ酸がヒト結合Ｍｉ織アクチベーターベブチド ■について報告されているそれと同一であることを確立した。

精製された蛋白質は生物学的活性を示すことが示された。

ヒト血小板から単離されたヒト結合組織アクチベーターペプチドｍは培養物中の ヒ１結合Ｍｉ繊細胞のための強力なマイトジェンである。ヒト血小板から精製さ れた蛋白質に、よるヒト皮１５線維芽細胞の顕著な刺激が１、アッセイに使用さ れる細胞の由来及び個々の調製物における差巽乙に依存し７て、１〜２０、ｌｊ Ｆ、／ｍｌの範囲の）温度においで起こる。画形１１転換体により生産される物 質のフイトジェ：／活性を、Ｃａ５ｔｏｒ等（１９８３）　、、前掲、。

に１より記載されているようにして、ヒＩ−皮膚線維芽細胞を用いて測定）７人 ＝６ｐＹ＋ｒＣＴＡＰ３−１　＆びｐＹ　ＣＸ　ＣＴＡＰ３−２形質転換体の両 者の遺伝子生成物の異る濃度での存在１τでの細胞ＤＮＡの′１１−ラー・ルさ れたチミジンの取り込みを測定した。これらの結果を下記の第１表に要約する。

いずれかの形質転換体からの蛋白質の１０μｇ／ｍｌの添加は増殖の顕著な刺激 をもたらした６　１部ｇ／ｒｌという少量の蛋白質により刺激が観察された。

固形質転換体からの蛋白質のマイトジェン活性は血小板から精製された蛋白質に ついて文献に報告されているそれの範囲に属する。

第　１　表 接触阻害されたヒト皮膚線維芽細胞を用いるマイトジェン活性の測定 ２０％ヒト血清　２５．９３９　２．７ｐＹ　αＣＴＡＰ３−１ ］丁コｉ−たｌ　３６．１８３　３．７１　μｇ／ｍｌ　１６，３４５　１．７ ０、１　ｐ　ｇ／ｍｌ　？、　９３０　０．８１　μｇ／ｍｌ　１７，３４８　 １．８０．１　μｇ／ｍ１　Ｂ、３６４　０．９２、　β−スロンボグロブリン （β−ＴＧ）の発現β−］゛Ｇのために工夫されたヌクレオチド配列はＣＴＡＰ −ＩＩＩについて上に示したそれと同じであるが、但しＣＴＡＰ−ＩＩＩの４個 のＮ−末端アミノ酸（ＡｓｎＬｅｕＡｌａＬｙｓ）をコードする１２ｂｐを欠き 、そしてＣＴＡＰ−ＩＩＮの３９番目のコドンに相当するβ−ＴＧの３５位のバ リンのためにコドンＧＴＴを用いる。コード鎖につき５’−３’の方向を有する 配列を下に示す。

プロセシング部位 ＣＴＡＰ−ＩＩＩについて前記したように、この配列はその５′及び３′末端に それぞれ基匹■及び下旦１接着末端を有し、好ましい酵母コドンを使用し、そし て酵母α−ファクター分泌リーダー（３’一部分）及び変形されたプロセシング シグナル配列を含有する。

すぐ上に記載された配列を有するβ−ＴＧのためのＤＮＡ断片を次のようにして 調製する（第２図を参照のこと）。それぞれＢ−１及びＢ−２と称する８７及び ９５塩基の下記の２個の単鎖オリゴヌクレオチドを、自動ホスホラミダイト法（ Ｕｒｄｅａ等（１９８３）、前掲；　Ｂｅａｕｃａｇｅ及びＣａｒｒｕ　ｔｈｅ ｒｓ　（１９８１）、前掲）を用いて化学合成する。

名称　−ｍ−−□ＩＩ（５’−３−４−）　。

ゲル電気永劫によるオリゴヌクレオチドの精製の後、セグメントｌ３−２を］゛ ・１ボリヌクレオチドキナートで処理し、酵素を不活性化しく　ＭｉＩ記参照の こと）そＬ７てセグメンｌ＝　Ｂ−１を加える。２個のセグメンｌ−をＮ　ａ　 Ｏ胱及びエタノールＱ、二より同時性ぶ２仕しめ、回収しそし、て遠心分離によ り洗浄し、ぞ１゜て前記のようにと２で乾燥する。次に、ペレットを水１こ再溶 解１−１＜１８．＋Ｊ＋）、９５℃乙、１３分間加熱し、そして水浴中で徐ノｌ に（１，５時間）室温乙こ冷！ｆｆＪ　Ｊ−る。生ずる２本鎖！、’）　Ｎ　、 Ａ断片ばα−＝ファイアタ・−分泌リーダー（３′一部分）及びブ１−ノセシン グシグチル配列をか有（２、ぞし、てβ−”ｒ’　ｃ　ｏ）Ｎ−末端部分（約１ ７３）を：コードする。

β−”Ｉ”　Ｇ遺伝子のＣ−末・端部分を得るため、プラスミドｐＬ、ＸＣＴＡ Ｐ　（前記）を制限酵素星回Ｕ及び菱娼−■で消化し、％１ノてβ−Ｔ　Ｇ及び （’：ＴＡＰ−ＩＩ［構造遺伝子に共通な（＞−末端配列（約２／３）を含有す る１７７ｂｐ断片をゲル分離する。次に、このＣ−末端配列を５０倍過剰の合成 Ｎ−末端断片（」二記のようにして調製した）に連結し、そし−７で連結混合物 をシュ■で処理し、フェノールで抽出し、そしてエタノールで沈澱せしめる。β −ＴＧ構造遺伝子を含有する融合生成物をキナーゼ処理しく上記を参照のこと） 、そしてあらかじめＫｐｎｌ及びΣ旦Ｉにより消化して股凹」／洛互ＩＴ断片を 除去しておいた細菌クローニングプラスミドｐαＥＧＦ−２４（前記）に挿入ス る。

生ずるＤＮＡ造成物を用いてＥ、コリＩｔ　８１０１細胞を形質転換し、そして 制限部位スクリーニングによるアルカリ性ＳＤＳプラスミドミニー調製物中で目 的組換体プラスミドを同定する。β−ＴＧ遺伝子を↑Ｕ持するプラスミド（第２ 図中でＩ〕αβ−Ｔ〔；と称する）を単離し、ぞ（−７で配列決定により構造を 確認する。

他の方法として、前記のＣＴＡＰ−ＩＩＩの）、−めの断片の合成と正確に同様 の方法で、但し中鎖断片Ｃ−２、ｃ−ｔｉ、及びＣ−１２をそわ、ぞれ同量の断 片Ｃ−１２、Ｃ−２２、及びＣ−２３で置き換えることにより、β−スロンボグ ロブリンの合成断片を調製することができる。これらの５ｓＤＮＡ断片の配列は 次の通りＣ−２１（１７ｍｅｒ）　ＧＧＴＡＡＧＧＡＡＧＡＡＴＣＣＴＴＣ−２ ２（２５ｍａｒ）　Ｔ（ｌｊ；ＴＴＡＣＣＴＣＴＴＴＴＡＴＣＣＡＡＴＡＧＴＡ ＣＣ−２３（２３ｍｅｒ）　ＡＣＡＡＧＴＣＡＧＡＧＴＣＣＡＡＧＧＡＴＴＣＴ 第２の代替法として、β−スロンボグロブリンをコードする合成遺伝子断片を次 のようにして調製することができる。

α−ファクターリーダー・／ＣＴＡＰ　１１融合体を含有する一ＰｓｔＩ／−鍾 ユ■断片をｐＹαＣＴ八Ｐ３−へ（前記）のヱーｓｔＩ／溢Ａ夫Ｉ消化物から争 離し、ファージＭ１３にクローン化し、そして単鎖形として単離する。次の配列 、 ５’　−ＧＧＡＴＴＣＴＴＣＣＴＴＡＣＣＴＣＴＴＴＴＡＴＣＣ八八ｒｎＧ−３ ’の合成３０−ｍｅｒを合成し７、そへへ７０ｐｍｏｌｅをプライマーとして用 いて、Ｄ　Ｎ　ＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗ断片を用いてα−ファクターリー ダー／ＣＴＡＰ−ＩＩＩ鋳型１．　Ｑ　ｐｍｏｌｅから第２鎖を合成する。フィ ル−イン、及び１４℃にて１８時間の連結の後、混合物をＳ、ヌクレアーゼ（５ ユニット１５分間）で処理し、そして次にＥ、コリ　ＪＭＩＯＩ細胞をトランス フェクトするために用いる。４個のＮ−末端アミノ酸（ＡｓｎＬｅｕＡ　１ａＬ ｙｓ）をコードする領域が除去されているＤＮＡ配列を含有するバクテリオファ ージを、プローブとしてｆｆ２ｐ−ラベルプライマーを用いるフィルタープラー クハイブリダイゼーションにより位置決定する。陽性プラークからのＲＦ（複製 形）ＤＮＡを単離し、そしてＰｓｔｌ及び５ａｌｊにより消化し、そして生ずる 断片を、あらかじめ５ａｌｌにより完全消化され、ＰｓｔＩにより部分消化され 、そしてアリカリ性ホスファターゼで処理されたｐαＥＧＦ−２４に挿入する。

生ずるＤＮＡ造成物を用いてＥ、コリＩ（１３１０１細胞を形質転換し、そして 制限部位スクリーニクによりアルカリ性ＳＤＳミニー調製物中で目的の組換体プ ラスミドを同定する。β−ＴＧ遺伝子を含有するプラスミドを単離し、そしてそ れらの構造を配列決定により確認する。

β−ＴＧ遺伝子及び関連するα−ファクターリーダー及びプロセシングシグナル を担持する酵母シャトルベクターを、記載されたプラスミドのいずれかから、該 プラスミド（例えばｐαβ−ＴＧ）をＢａｍＨＩで消化し、そして約１．７　ｋ ｂ断片をゲル電気泳動により単離することにより調製する。次に、この単離され た断片を、あらかじめ１憇Ｈ■で消化されそしてアルカリ性ホスファクーゼで処 理されたプラスミドｐｃｔ／１（前記）中に挿入する。Ｅ、コリＨＢＩＯＩのア ンピシリン耐性形質転換体を制限部位スクリーニングし、そして生ずるプラスミ ド（第２図においてｐＹαβ−ＴＧと称する）を単離し、そしてＳ。

セレビシェ−八８１０３．１株を形質転換するために使用する。選択されたロイ シン原栄養性の培養物からの上清中の分泌されたβ−スロンボグロブリンの存在 及び構造を、Ｓ　ＯＳ　／ポリアクリルアミドゲル電気泳動、アミノ酸配列決定 、及び免疫学的測定により確認する。

この発明に従えば、ＣＴＡＰ・−Ｉｌｌ及びβ〜ＴＧの両者の前駆体ポリペプチ ドの発現、並びにそれに続く細胞内プロセシング及び成熟ポリペプチドの分泌を もたらすために適当なベクターに挿入することができる新規なりＮＡ造成物が提 供される。

この成熟ＣＴＡＰ−ＩＩＩポリペプチドは、ヒト皮Ｊｆ線維芽細胞の細胞培養物 中での組織の再生の刺激に基く認められたバイオアッセイにおいて、天然ヒトＣ ＴＡＰ−Ｔｌｌの生物学的活性に密接に相当する生物学的活性を示すことが見出 された。分泌をもたらすことにより、所望のポリペプチド生成物の非常に増加し た収量が得られ、そしてその後のポリペプチドの単離及び精製が単純化される。

理解を明確にする目的で前記の発明を説明及び例により幾分詳細に記載したが、 添付された請求の範囲の範囲内で幾つかの変化、変法を行うことかできることが 明らかであろう。

ＣＴＡＰ−ＩＩＩ 手続補正書（方式） ％式％ １　事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８５１０１６５７ ２　発明の名称 ヒト結合ｍ織アクチベーター 及び関連ペプチドの発現 ３　補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　チロン　コーポレイション ４代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号５　補正命令の日付 ６　補正の対象 ＋ｌ）　特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の「特許出願人の代表者 」の欄 （２）委　任　状 （３）　明細書の翻訳文 （４）請求の範囲の翻訳文 ７　補正の内容 ｆｉｌ　（２１別紙の通り （３）　明細書の翻訳文の浄Ｓ（内容に変更なし）（４）請求の範囲の翻訳文の 浄書（内容に変更なし）８　添付書類の目録 （１１訂正した特許法第１８４条の ５第１項の規定による書面　１通 （２）委任状及びその翻訳文　各１通 （３）明細書の翻訳文　１通 （４）請求の範囲の翻訳文　１通 国際調査報告

Claims (28)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒト宿主から単離されるヒト結合組織アクチベーターペプチドＩＩＩ及びそ の分解生成物と実質上同一のアミノ酸組成を有し、そして実質上同等の生物学的 活性を有するポリペプチドであって、単細胞宿主において生産されたものであり そして該単細胞宿主の天然遺伝子生成物の少なくとも痕跡量と共に存在するポリ ペプチド。
2. ２．存在する天然遺伝子生成物の前記の量が前記ポリペプチドの生物学的活性を 妨害せずまたは哺乳類宿主に投与された場合に不都合な生理学的効果を有しない 、請求の範囲第１項に記載のポリペプチド。
3. ３．前記ポリペプチドがヒト血小板から単離されたヒト結合組織アクチベーター ペプチドにより示されるマイトジェン活性と実質上同一のマイトジェン活性を示 す、請求の範囲第１項に記載のポリペプチド。
4. ４．前記ポリペプチドか血小板から単離されたヒトβ−スロンボグロプリンによ り示される免疫学的活性と実質上同一の免疫学的活性を示す、請求の範囲第１項 に記載のポリペプチド。
5. ５．前記単細胞宿主が酵母である請求の範囲第１項に記載のポリペプチド。
6. ６．前記酵母がサッカロミセス・セレビニエ−（Ｓａｃｃｈｏｒｏ−ｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である請求の範囲第５項に記載のポリペプチド。
7. ７．前記ポリペプチドが、酵母により認識される分泌リーダー及びプロセシング シグナル配列とリーディングフレームを合わせた合成構造遺伝子を含んで成る染 色体外因子上にコードされている、請求の範囲第１項に記載のポリペプチド。
8. ８．前記分泌リーダー及びプロセシングシグナル配列が酵母α−ファクター遺伝 子に由来するものである請求の範囲第７項に記載のポリペプチド。
9. ９．ヒト結合組織アクチベーターペプチド−ＩＩＩ及びその分解生成物と実質上 同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを適当な単細胞宿主において製造する 方法であって、該宿主により認識される分泌リーダー及びプロセシングシグナル 配列とリーディングフレームを合わせたペプチドコード遺伝子を有する染色体外 因子を含有する宿主細胞を増殖せしめ、その結果該宿主が成熟ポリペプチドを分 泌し、そして該成熟ポリペプチドを単離することを含んで成る方法。
10. １０．前記ペプチドの遺伝子が宿主により優先的に使用されるコドンを有する合 成遺伝子である請求の範囲第９項に記載の方法。
11. １１．前記宿主が酵母である請求の範囲第１０項に記載の方法。
12. １２．前記分泌リーダー及びプロセシングシグナル配列が酵母α−ファクター遺 伝子に由来する請求の範囲第１１項に記載の方法。
13. １３．前記ポリペプチドが天然ヒト結合組織アクチベーターペプチド−ＩＩＩに より示されるマイトジェン活性と実質上同一のマイトジェン活性を示す請求の範 囲第９項に記載の方法。
14. １４．前記ペプチドの遺伝子が次のヌクレオチド配列：【配列があります】 を有する請求の範囲第１３項に記載の方法。
15. １５．前記宿主が酵母であり、そして前記染色体外因子がｐＹａＣＴＡＰ３−１ 、又はｐＹαＣＴＡＰ３−２である請求の範囲第１４項に記載の方法。
16. １６．請求の範囲第９項に記載の方法により製造されるポリペプチド。
17. １７．前記ポリペプチドがヒトβ−スロンボグロブリンにより示される免疫学的 活性と実質的に同一の免疫学的活性を示す請求の範囲第９項に記載の方法。
18. １８．前記ポリペプチド遺伝子が次のヌクレオチド配列：を有する請求の範囲第 １７項に記載の方法。
19. １９．ヒト結合組織アクチベーターペプチド−ＩＩＩ及びその分解生成物と実質 上同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドのコード配列を酵母により認識され る分泌リーダー及びプロセシングシグナル配列とリーディングフレームを合わせ て含み、さらに酵母により認識される複製系を含んで成るＤＮＡ造成物。
20. ２０．前記コード配列がインビトロで合板され、そして酵母により優先的に用い られるコドンを含有する請求の範囲第１９項に記載のＤＮＡ造成物。
21. ２１．細菌により認識される複製系をさらに含んで成る請求の範囲第１９項に記 載のＤＮＡ造成物。
22. ２２．前記酵母複製系が２μｍプラスミドに由来する請求の範囲第１９項に記載 のＤＮＡ造成物。
23. ２３．前記ポリペプチドが天然ヒト結合組織アクチベーターペプチド−ＩＩＩに より示されるマイトジェン活性と同一のマイトジェン活性を示す請求の範囲第１ ９項に記載のＤＮＡ造成物。
24. ２４．前記コード配列が次の通り： 【配列があります】 である請求の範囲第２３項に記載のＤＮＡ造放物。
25. ２５．プラスミドｐＹαＣＴＡＰ３−１、又はｐＹαＣＴＡＰ３−２。
26. ２６．請求の範囲第１９項に記載のＤＮＡ造成物により形質転換された酵母細胞 。
27. ２７．前記ポリペプチドがヒトβ−スロンボグロプリンにより示される免疫学的 活性と実質的に同一の免疫学的活性を示す請求の範囲第１９項に記載のＤＮＡ造 成物。
28. ２８．前記ポリペプチド遺伝子が次のヌクレオチド配列：【配列があります】 を有する請求の範囲第２７項に記載のＤＮＡ造成物。