CZ103990A3 - Polypeptid, konstrukce DNA, rekombinantní expresní vektor a způsob výroby heterologního polypeptidu a kmen kvasinek k tomuto účelu - Google Patents
Polypeptid, konstrukce DNA, rekombinantní expresní vektor a způsob výroby heterologního polypeptidu a kmen kvasinek k tomuto účelu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ103990A3 CZ103990A3 CS901039A CS103990A CZ103990A3 CZ 103990 A3 CZ103990 A3 CZ 103990A3 CS 901039 A CS901039 A CS 901039A CS 103990 A CS103990 A CS 103990A CZ 103990 A3 CZ103990 A3 CZ 103990A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- glu
- polypeptide
- leu
- ala
- asp
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 117
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 102
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 97
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims abstract description 70
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title claims description 10
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 title claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 99
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 85
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims abstract description 84
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims abstract description 75
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 claims abstract description 57
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 claims abstract description 48
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 47
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 claims abstract description 42
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims abstract description 29
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims abstract description 29
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims abstract description 17
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims abstract description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 36
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 claims description 22
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 17
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 9
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 9
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 claims description 9
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 4
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 claims description 3
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 claims description 3
- UZGFHWIJWPUPOH-IHRRRGAJSA-N Arg-Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N UZGFHWIJWPUPOH-IHRRRGAJSA-N 0.000 claims description 3
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 claims description 3
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 claims description 3
- YBAFDPFAUTYYRW-YUMQZZPRSA-N Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-YUMQZZPRSA-N 0.000 claims description 3
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 claims description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 claims description 3
- VSMYBNPOHYAXSD-GUBZILKMSA-N Asp-Lys-Glu Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O VSMYBNPOHYAXSD-GUBZILKMSA-N 0.000 claims description 2
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 claims description 2
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 claims description 2
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 claims description 2
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 claims description 2
- 108010071289 Factor XIII Proteins 0.000 claims description 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 claims description 2
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 claims description 2
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 claims description 2
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 claims description 2
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 claims description 2
- NLOAIFSWUUFQFR-CIUDSAMLSA-N Ser-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O NLOAIFSWUUFQFR-CIUDSAMLSA-N 0.000 claims description 2
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 claims description 2
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 claims description 2
- 229940012413 factor vii Drugs 0.000 claims description 2
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 claims description 2
- 229940012444 factor xiii Drugs 0.000 claims description 2
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 claims description 2
- 108010071185 leucyl-alanine Proteins 0.000 claims 2
- PCTMTFRHKVHKIS-BMFZQQSSSA-N (1s,3r,4e,6e,8e,10e,12e,14e,16e,18s,19r,20r,21s,25r,27r,30r,31r,33s,35r,37s,38r)-3-[(2r,3s,4s,5s,6r)-4-amino-3,5-dihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-19,25,27,30,31,33,35,37-octahydroxy-18,20,21-trimethyl-23-oxo-22,39-dioxabicyclo[33.3.1]nonatriaconta-4,6,8,10 Chemical group C1C=C2C[C@@H](OS(O)(=O)=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2.O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 PCTMTFRHKVHKIS-BMFZQQSSSA-N 0.000 claims 1
- PXXLQQDIFVPNMP-UHFFFAOYSA-N 3-(diethylcarbamoyl)benzoic acid Chemical compound CCN(CC)C(=O)C1=CC=CC(C(O)=O)=C1 PXXLQQDIFVPNMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 claims 1
- 102400000321 Glucagon Human genes 0.000 claims 1
- RCFDOSNHHZGBOY-UHFFFAOYSA-N L-isoleucyl-L-alanine Natural products CCC(C)C(N)C(=O)NC(C)C(O)=O RCFDOSNHHZGBOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 108010002311 N-glycylglutamic acid Proteins 0.000 claims 1
- 229940025131 amylases Drugs 0.000 claims 1
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 claims 1
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 claims 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 claims 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 abstract description 13
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 abstract description 12
- 230000004927 fusion Effects 0.000 abstract 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 79
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 67
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 62
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 58
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 42
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 27
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 21
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 18
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 16
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 16
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 15
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 14
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 9
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 9
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 9
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 8
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 7
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 7
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 6
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 6
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 6
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 6
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 6
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 5
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 5
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 4
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 101150033985 TPI gene Proteins 0.000 description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 4
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 101150028074 2 gene Proteins 0.000 description 2
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N Propionic acid Substances CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 2
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- LPQOADBMXVRBNX-UHFFFAOYSA-N ac1ldcw0 Chemical compound Cl.C1CN(C)CCN1C1=C(F)C=C2C(=O)C(C(O)=O)=CN3CCSC1=C32 LPQOADBMXVRBNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- -1 i.e. Chemical compound 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000007261 sc medium Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 238000000954 titration curve Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 2
- FJVAQLJNTSUQPY-CIUDSAMLSA-N Ala-Ala-Lys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN FJVAQLJNTSUQPY-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- DWOGMPWRQQWPPF-GUBZILKMSA-N Asp-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O DWOGMPWRQQWPPF-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 101150071434 BAR1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100228206 Caenorhabditis elegans gly-6 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100126625 Caenorhabditis elegans itr-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 1
- 101500025353 Homo sapiens Insulin A chain Proteins 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 102100027612 Kallikrein-11 Human genes 0.000 description 1
- 101150118523 LYS4 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000235087 Lachancea kluyveri Species 0.000 description 1
- NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N Leu-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N Lys-Arg Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- GQUDMNDPQTXZRV-DCAQKATOSA-N Lys-Arg-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O GQUDMNDPQTXZRV-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- DJJBHQHOZLUBCN-WDSOQIARSA-N Met-Lys-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O DJJBHQHOZLUBCN-WDSOQIARSA-N 0.000 description 1
- FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycine Chemical compound OCCN(CCO)CC(O)=O FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 101100491597 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) arg-6 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 101100378536 Ovis aries ADRB1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010033645 Pancreatitis Diseases 0.000 description 1
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 1
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 1
- 108010023197 Streptokinase Proteins 0.000 description 1
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710152431 Trypsin-like protease Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 1
- 239000007998 bicine buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- AAOVKJBEBIDNHE-UHFFFAOYSA-N diazepam Chemical compound N=1CC(=O)N(C)C2=CC=C(Cl)C=C2C=1C1=CC=CC=C1 AAOVKJBEBIDNHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000004029 hydroxymethyl group Chemical group [H]OC([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000000988 hyperfibrinolytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical group C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000001573 invertase Substances 0.000 description 1
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- VBEGHXKAFSLLGE-UHFFFAOYSA-N n-phenylnitramide Chemical compound [O-][N+](=O)NC1=CC=CC=C1 VBEGHXKAFSLLGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000004526 pharmaceutical effect Effects 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 229940057838 polyethylene glycol 4000 Drugs 0.000 description 1
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 210000003079 salivary gland Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 210000004739 secretory vesicle Anatomy 0.000 description 1
- 230000036303 septic shock Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
- C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
- C07K14/8114—Kunitz type inhibitors
- C07K14/8117—Bovine/basic pancreatic trypsin inhibitor (BPTI, aprotinin)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/033—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a motif for targeting to the internal surface of the plasma membrane, e.g. containing a myristoylation motif
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/04—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing an ER retention signal such as a C-terminal HDEL motif
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/61—Fusion polypeptide containing an enzyme fusion for detection (lacZ, luciferase)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Mycology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Botany (AREA)
- Virology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Processing Of Solid Wastes (AREA)
- Chemical Or Physical Treatment Of Fibers (AREA)
- Silver Salt Photography Or Processing Solution Therefor (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Thermotherapy And Cooling Therapy Devices (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Particle Accelerators (AREA)
Description
(57) Anotace:
Polypeptid, obsahující signální peptid, vedoucí peptid a heterologní bílkovinu, přičemž na C-terminálním zakončení vedoucího peptidú a/nebo N-terminálním zakončení heterologní bílkoviny je polypeptid modifikován tak, že místo zpracování je přístupnější proteolytickému štěpení.Toho se dosahuje přidáním jedné nebo většího počtu aminokyselin, z nichž alespoň jedna nese negativní náboj do uvedených míst. Heterologní bílkovinou může být například aprotinin nebo prekursor nebo analog Insulinu. Dále je popsána konstrukce DNA, rekombinantní expresní vektor a způsob výroby heterologního polypeptidu v kvasinkách.
T? OC.
?Y m 3 - 'Sú
Polypeptid, konstrukce DNA, rekombinantní expresní vektor a způsob výroby heterologního polypeptidu
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu výroby heterologních bílkovin nebo polypeptidů expresí vektorů s obsahem řetězců DNA, které jsou kódem pro tyto bílkoviny nebo polypeptidy v buňkách kvasinek, které byly transformovány tímto vektorem.
Dosavadní stav techniky
Kvasinkové organismy produkují řadu bílkovin, které jsou syntetizovány uvnitř buňky, jejich funkce však probíhá mimo buňky. Tyto bílkoviny se obvykle nazývají vyměšované bílkoviny. K jejich expresi dochází uvnitř buňky ve formě prekursoru nebo preproteinu, které obsahují navíc řetězec, který zajišťuje účinný průchod produktu po expresi membránou endoplasmatického retikula (ER) . Tento řetězec, obvykle nazývaný signálním peptidem, se obvykle odštěpí z produktu v průběhu jeho přemístění. Jakmile dochází k tomuto pochodu, je bílkovina transportována do Golgiho aparátu. Odtud se může dostat různými cestami do buněčných orgánů, například vakuol, nebo membrány, nebo může být vyloučena do vnějšího prostředí, jak bylo popsáno v publikaci Pfeffer S.R., a Rothman J.E., Ann.Rev.Biochem. 56 (1987), 829 aš 852.
Byla navršena řada postupů pro expresi a vylučování heterologních bílkovin kvasinkami. V evropském patentovém spisu č. 88 632A se popisuje postup exprese bílkovin, heterolognich, vzhledem ke kvasinkovým buňkám. Podle tohoto postupu dochází k expresi těchto bílkovin v kvasinkách, tyto bílkoviny jsou pak zpracovávány a vylučovány. Kvasinky se transformují vektorem pro expresi s obsahem DNA, která je kódem pro požadovanou bílkovinu a pro signální peptid, transformovaný organismus se pěstuje a bílkovina se izoluje zf živného prostředí. Signálním peptidem může být vlastní signální peptid požadované bílkoviny, heterologní signální peptid nebo hybrid přírodního a heterologního signálního peptidů.
Problém spo]eny použitím signálních pept idů^ heterologních pro kvasinky^ může spočívat v tom, že tento heterologní peptid nezajišťuje dostatečné translokace a/nebo odštěpení signálního peptidů.
“Λ
S.cerevisie MFccl (cc-faktor) se syntetizuje jako prepro-forma s obsahem 165 aminokyselin, a to 19 aminokyselin v signálním peptidů, nebo-li prepeptidu, 64 aminokyselin ve Avedoucím* peptidů nebo propeptidu, v této části jsou tři g 1 ykos i|l ačn i místa, vázaná na atom dusí ku, ^sledovaná řetězcem (LysArgíAsp/Glu, Al a) 2-3<*-faktor) 4 podle publikace Kurjan J. a Herskovitz I., Cell 30 (1982), 933 až 943. Uvedený signální a vedoucí peptid preproMFotl je často používán k získání heterologních bílkovin v S.cerevisiae.
Použití homologních signálních a vedoucích peptidů pro kvasinky je známo například z US patentového spisu č. 4 546 082, z evropských patentových spisů č. 116 201, 123 294, 123 544, 163 529 a 123 289 a z dánského patentového spisu č. 2484/84 a 3614/83.
V evropském patentovém využ i 11 prekursoru cc - f aktoru patentovém spisu spisu č. 123 289 se popisuje
S.cerevisiae, kdežto v dánském popisuje využití signálního
2484/84 se peptidů invertázy S.cerevisiae a v dánském patentovém spisu č 3614/83 využití signálního peptidů S.cerevisiae PH05 pro sekreci cizorodých bílkovin.
V US patentovém spisu č. 4 546 082 a v evropských patentových spisech č. 16 201, 123 294, 123 544 a 163 529 se popisuje postup, při němě se využívá signálního a vedoucího řetězce «-faktoru S. cerevisiae <MF«1 nebo MG«2) pro vylučování heterolognich bílkovin z kvasinek po jejich expresi. Postupuje se tak, že se spojí řetězec DNA, který je kódem pro MF«1 a signální a vedoucí řetězec S.cerevisiae na 5' zakončení genu pro požadovanou bílkovinu s následnou expresí této bílkoviny.
V evropském patentovém spisu 206 783 se popisuje systém pro sekreci polypeptidu u S.cerevisiae, V tomto případě byl vedoucí řetězec «-faktoru zkrácen k odstraněni čtyř peptidů «-faktoru přírodního vedoucího řetězce, takže vedoucí peptid byl spojen s heterologním polypeptidem přes řetězec «-faktoru LysArgGluAlaGluAla. Tato konstrukce vedla k účinné výrobě malých peptidu s obsahem méně než 50 aminokyselin. Pro sekreci a získání větších polypeptidu byl nativní vedoucí řetězec «-faktoru zkrácen tak, aby byly pouze 1 nebo 2 peptidy «-faktoru mezi vedoucím peptidem a polypeptidem.
Celá řada vylučovaných bílkovin je vystavena proteolytickému systému, který muže odštěpit peptidovou vazbu na zakončení dvou za sebou zařazených aminokyselin, na němž se nachází karboxylová skupina. Tato enzymatická účinnost je v S.cerevisiae zakódována jako gen KEX 2, popsaný v publikaci
D.A.Julius a další, Cell. 37. (1984), 1075. Gen KEX 2 je nutný pro sekreci aktivního faktoru «1 S.cerevisiae (MF«1 nebo «-faktor), avšak nikoliv pro sekreci aktivního faktoru «.
Sekrece a správné zpracování polypeptidu, který má být vyloučen, je dosaženo v některých případech při pěstování kvasinek, transformovaných vektorem, jehož konstrukce je uvedena ve svrchu uvedených publikacích. Avšak v řadě případů je sekrece velmi nízká, nebo k ní nedojde, nebo může být produkt zpracován nesprávně nebo neúplně. S největší pravděpodobností je příčinou tohoto jevu nedostupnost místa.
v němž má zpracování proběhnout a které C-terminálním zakončením vedoucího peptidu zakončením heterologní bílkoviny, takže je uloženo mezi a N-terminálním toto místo je nedostupné nebo málo dostupné pro proteolytické štěpení.
Nyní bylo neočekávaně zjištěno, že v případě, že dojde k určitým modifikacím v blízkosti místa zpracování na C-terminálním zakončení vedoucího peptidu a/nebo N-terminálním zakončení heterologního peptidu, spojeného s vedoucím peptidem, je možno získat vyšší výtěžek správně zpracované bílkoviny, kterou lze získat při použití nemodifikované konstrukce vedoucího peptidu a heterologního polypeptidu.
Podstata vynálezu
Vynález se tedy týká polypeptidu a způsobu výroby tohoto polypeptidu, který je tvořen signálním peptidem, hlavním peptidem a heterologním proteinem nebo polypeptidem, přičemž tento polypeptid je ve svém řetězci aminokyselin modifikován na němž dochází k jeho zpracování je uloženo mezi C-terminálním zakončením N-terminálním zakončením heterologního takové stavbě místa, na němž ke toto místo je přístupno pro v blízkost i místa, v kvasinkácha které hlavního peptidu a peptidu, takže dochází k zpracování dochází, že proteolytické štěpení, přičemž polypeptid je následující strukturou /
signální peptid-hlavni peptidmožno vyj ádř i t
-X1-X2-X3-X4-heterologní protein,
O.
i v němž Xx znamená peptidovou vazbu nebo 1-6 aminokyselin, které mohou být stejné nebo různé, X a X , jež mohou být stejné nebo rozdílné, znamenají bázickou aminokyselinu ze skupiny Lys a Arg, X^ a definují společně kvasinkové procesní místo a X4 znamená peptidovou vazbu nebo 1-6 aminokyselin, jež mohou b^t stejné nebo různé a pokud X4 znamená jednu nebo více aminokyselin, je mezi a N-konec místo vsunuto přídavné procesní _ heterologního proteinu y a za předpokladu, že X^ a/nebo X4 znamená 1-6 aminokyselin a alespoň jedna z aminokyselin ve významu X1 a/nebo X4 znamená negativně nabitou aminokyselinu ze skupiny. Glu a Asp a za dalšífe© ^přeůf>ek3ra-du, že pokud X1 znamená peptidovou vazbu, X4 má jiný význam než Glu-Ala-Glu-Ala, Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala, Glu-Ala-Glu-Ala-Ser-Leu-Asp-Lys-Arg nebo Glu-Ala-Glu-Ala-Ser-Leu-Asp a znamená-li X4 peptidovou vazbu, X^ má jiný význam než Ser-Leu-Asp a ještě za dalšílSD rl ze sestava signální peptid-vedoucí peptid-X^ má jiný význam než signální peptid α-faktoru a vedoucí peptid a-faktoru (1-85)-Glu-Ala-Glu-Ala-Ser-Leu-Asp, signální peptid α-faktoru a vedoucí peptid a-faktoru (1-80)-Pro-Leu-Asp, signální peptid α-faktoru a vedoucí peptid a-faktoru (1-80)-Glu-Leu-Asp a Met-Lys-Trp-Val-Ser-Phe-Ile-Ser-Leu-Leu-Phe- Leu-Phe-Ser-Ser-Ala-Tyr-Ser-Arg-Ser-Leu-Asp.
4ο.
stejné nebo různé znamenají basickou aminokyselinu ze skupiny Lys a Arg a tvoří spolu mrpto pro zpracování kvasinl^í znamená peptidcr^ou vazbu nebo jednu nebo vě^$í počet strefených nebo různých aminokyselin, z^ předpokladu, žé X^ a/nebo X^ znamenají jednu nebo vět^í p^čet^aminokyselin, z nichž alespoň jedna nese negativní^ náboj aýJe^vOlena ze skupiny Glu a Asp.
Pod pojmem signální peptid se v příběhu přihlášky rozumí řetězec, který se nachází před hlavním řetězcem, má převážně hydrofobní povahu a je zařazen jako N-terminální řetězec prekursorové formy extracelulární bílkoviny, k jejíž expresi dochází v kvasince. Funkcí signálního peptidu je umožnit sekreci heterologní bílkoviny do endoplasmatického retikula. V průběhu tohoto postupu obvykle dochází k odštěpení signálního peptidu. Signální peptid může být heterologní nebo homologní vzhledem k organismu kvasinky, který uvedenou bílkovinu produkuje, avšak, jak již bylo svrchu uvedeno, je možno dosáhnou účinnějšího odštěpení signálního peptidu v případě, že je homologní vzhledem k organismu kvasinky.
Pod pojmem vedoucí peptid se rozumí převážně hydrofilni peptid, jehož funkcí je umožnit sekreci heterologní bílkoviny z endoplasmatického retikula do Golgiho aparátu a dále do sekietorického vesicula pro sekreci do okolního prostředí, tj. buněčnou stěnou nebo alespoň buněčnou membránou do periplasmatického prostoru buňky.
Pod pojmem heterologní bílkovina’ nebo polypeptid se rozumí bílkovina nebo polypeptid, kteI ré nejsou přirozeným produktem hostitelské kvasinky. Pojmy bílkovina a polypeptid hudou v průběhu přihlášky užívány také střídavě vzhledem k tomu, že jejich význam je v pod statě stejný.
K modifikaci polypeptidu dochází v místě zpracování, jde o místo, v němž vedoucí peptid je odstraňován z heterologní bílkoviny proteolytickým štěpením působením enzymů kvasinky. Tato modifikace je uskutečňována tuci nebo deleci jedné nebo většího počtu aminokyselin na C-terminálním zakončení vedoucího peptidů a/nebo na N-terminálním zakončení heterologní bílkoviny.
Nyní bylo neočekávaně zjištěno, že účinnějšího a správnějšího zpracování heterologní bílkoviny je možno dosáhnout v případě, že alespoň jedna aminokyselina, užitá k prodloužení polypeptidového řetězce nebo k náhradě jedné nebo většího počtu přirozených aminokyselin v řetězci nese negativní náhoj, může jít o některou se svrchu uvedených aminokyselin. Podobného výsledku je možno dosáhnout v případě, že se uloží aminokyselina, která ne„se negativní náboj do blízkosti místa zpracování vypuštěním jedné nebo většího počtu aminokyselin na C-terminálním zakončení vedoucího řetězce nebo na N-terminálním zakončení řetězce bílkoviny tak, že se v těsné blízkosti místa zpracování pak nachází aminokyselina, nesoucí negativní nátjoj.
Aniž by měl být vynález omezen na určitou teorii, je tento účinek pravděpodobně možno připsat zvýšení hydrofility, k níž dojde uložením aminokyseliny s negativním nábojem do blízkosti místa zpracování, což má za následek větší dostupnost terciární struktury polypeptidu v místě zpracování v nitrobuněčném vodném prostředí, což současně znamená větší dostupnost pro proteolytické štěpení. Výhodný účinek negativně nabité aminokyseliny na rozdíl od kladně nabité nebo neutrální aminokyseliny je možno připeat negativně nabitým postranním řetězcům těchto aminokyselin, které přispívají k hydrofilnosti terciární struktury v místě zpracování, aniž by docházelo k potenciální inhibici štěpícího enzymu.
Je také možno, že negativně nabité aminokyseliny přispívají k tvorbě a udržování terciární struktury v místě zpracování (může jít o smyčky, ohyby nebo vlásenkové struktury) jiným způsobem, například interakcí s dalšími zbytky aminokyselin v polypeptidu. Mimoto by také mohlo docházet k přímé interakci mezi negativně nabitými aminokyselinami a příslušným enzymem. Je pravděpo10 dobné, že negativné nabité aminokyseliny, uložené v blízkosti dvou bazických aminokyselin v místě zpracování mohou zaměřit příslušný enzym tak, že dojde ke správnému a účinnému štěpení interakcí nábojů mezi bílkovinani a/nebo mezi bílkovinou a rozpouštědlem.
Vynález se rovněž týká konstrukce řetězce DNA, která je kódem pro svrchu uvedený polypeptid.
Vynález se rovněž týká rekombinantní ho vektoru pro expresi, který je schopen replikace v kvasin kových buňkách a který nese konstrukci DNA, která je kódem pro svrchu uvedený polypeptid, jakož i kmene kvasinek, který je schopen exprese heterologní bílkoviny nebo polypeptidu a který je transformován uvedeným vektorem.
Vynález se rovněž týká způsobu výroby heterologní bílkoviny nebo polypeptidu v kvasinkových buňkách, tento postup spočívá v tom, že se transformovaný kmen kvasinek pěstuje ve vhodném prostředí k dosažení exprese a sekrece heterologní bílkoviny nebo polypeptidu, načež se tato bílkovina nebo polypeptid izolují ze živného prostředí.
Dále bude vynález podrobněji popsán na základě jednotlivých provedení.
Jak již bylo svrchu uvedeno, v případě+ že X^ znamená jedinou aminokyselinu, jde o aminokyselinu Glu nebo Asp.
χΐ a/nebo X^ znamenají s výhodou 1 až 6 zbytků aminokyselin.
V případě, že X^· znamená dva spojené zbytky aminokyselin, může jít o strukturu BA, v níž A znamená Glu nebo Asp a B znamená Glu, Asp, Val, Gly nebo Leu, jde tedy například o LeuGlu.
V případě, že X^- znamená tři spojené zbytky aminokyselin, může jít o strukturu CBA, v níž A a 5 mají svrchu uvedený význam a C znamená Glu, Asp, Pro, Gly, Val, Leu, Arg, nebo Lys, například AspLeuGlu.
V případě, že X^ znamená řetězec s obsahem více než dvou zbytků aminokyselin, může být jednou z těchto aminokyselin Pro nebo Gly vzhledem k tomu, že je známo, že tyto aminokyseliny vyvolávají a/nebo tvoří část ohybů, vlásenkových nebo smyčkových struktur, které usnadňují dostupnost místa zpracování pro proteolytický enzym.
V případě, že X^ znamená řetězec čtyř zbytků aminokyselin, může jít o strukturu LCBA, kde A, 3 a C mají svrchu uvedený význam a D má stejný význam jako C, například GluArgLeuGlu, LysGluLeuGlu nebo LeuAspLeuGlu.
V případě, že X^ znamená řetězec pěti zbytků aminokyselin, může jít o strukturu EEC3A, v níž A, B, C a D mají svrchu uvedený význam a E má stejný význam jako C, například LeuGluArgLeuGlu.
V případě, že X1 znamená řetězec šesti zbytků aminokyselin, může jít o strukturu FEDCBA, v níž A, B, C, D a E mají svrchu uvedený význam a F má stejný význam jako C, například ValLeuGluArgLeuGlu.
Je zřejmé, že jsou možné i jiné kom binace zbytků aminokyselin, aniž by přitom došlo k odchýle· ní od podstaty vynálezu za předpokladu, že alespoň jedna aminokyselina z řetězce uvedených zbytků nese negativní náboj, jak již bylo svrchu uvedeno.
X^ může mít stejný význam jako x\ přestože pořadí aminokyselin bude obvykle obrácené, tj.
ABC místo CBA a podobně.
V těch provedeních, kde heterologní bílkovina začíná jedním nebo větším počtem kladně nabitých 4 nebo hydrofobních zbytků aminokyselin, znamená X s výhodo jednu nebo větší počet aminokyselin a nikoliv peptidovou vazbu, protože v tomto případě dochází k větší dostupnosti místa zpracování pro proteolytický enzym.
V případě, že X znamená N-terminál ní prodloužení s obsahem 1 až 6 zbytků aminokyselin, může
- 13 být vhodné zařadit další místo zpracování mezi aminokyselinu nebo aminokyseliny ve významu X^ a N-terminální zakončení heterologní bílkoviny. To je zvláště důležité v případě, že bílkovina má být užita k účelům, u nichž je nežádoucí N-terminální prodloužení. Přídatné N-terminální aminokyseliny mohou být odstraněny in vitro proteolytickým štěpením při použití vhodného proteolytického enzymu, například proteázy typu trýpsinu nebo působením chemických látek, například bromkyanu. Může být také účelné odštěpit přídatné místo zpracování přímo v hostitelském organismu tak, že se toto místo volí jako místo, specifické pro jiný proteolytický enzym z kvasinek.
Pro některé účely může být účelné volit N-terminální prodloužení tak, aby vyhovovalo určitému účelu. Může například být označením pro detekci bílkoviny, pomocným řetězcem, usnadňujícím čištění bílkoviny nebo prostředkem pro řízení farmaceutického účinku látky in vivo například prodloužením poločasu této látky nebo jejím cílením na specifické místo v těle.
Ve výhodném provedení znamenají X1 s/nebo X^ řetězce 1 až 4 zbytků aminokyselin. V tomto provedení je zbytkem aminokyseliny, bezprostředně sousedícím o
s X s výhodou Glu nebo Asp, aminokyselinou, bezprostředně sousedící s X^ je s výhodou Glu nebo Asp nebo jsou oběma uvedenými aminokyselinami Glu nebo Asp, protože tímto způ- 14 sobem vzniká výhodné místo zpracování vzhledem k hydrofilní povaze těchto zbytků aminokyselin, jak již bylo vysvětleno. Řetězec zbytků aminokyselin X^ nebo X^ může obsahovat větší počet zbytků Glu nebo Asp.
V jiném zajímavém provedení znamenají X^i řetězec s obsahem jednoho nebo většího počtu zbytků aminokyselin, což znamená, že polypeptid je modifikován jak na C-terminálníra zakončení vedoucího peptidů, tak na N-terminálním zakončení heterologní bílkoviny. V tomto provedení mohou být X^ a X^ symetricky totožné, to znamená, že řetěη Λ 2 zec zbytku aminokyseliny X1 a X4 je stejný a vychází z X a X3.
Signálním peptidem uvedeného polypeptidu může být signální peptid, který zajištuje účinné směrování polypeptidu po jeho expresi do sekietoricke dráhy v'buňce. Může jít o přírodně se vyskytující signální peptid nebo jeho funkční části, nebo může jít o syntetický peptid. Vhodným signálním peptidem je například signální peptid α-faktoru, signální peptid amylázy z myších slin nebo signální peptid modifikovaný karboxypeptidázy, nebo také signální peptid BARI z kvasinek. Signální řetězec amylázy z myších slinných žláz byl popsán v publikaci 0. Hagenbuchle a další, Nátuře 289. 1981, str. 643 až 646. Signální řetězec pro karboxypeptidázu byl popsán v publikaci
L. A. Valls a další, Cell. 4B, 1937, str. 887 až 897. Signál ní peptid BARI byl uveden v WO 87/02670.
- 15 Řetězec vedoucího peptidu svrchu uvedeného polypeptidu může být vedoucí peptid, jehož funkcí je směrovat polypeptid po expresi do endoplasmatického retikula a dále po sekretorické dráze. Vhodnými řetězci pro toto použití jsou přírodní pep/tidy, odvozené od kvasinek nebo jiných organismů, například vedoucí peptid a-faktoru nebo jeho funkční analog. Může jít také o syntetický vedoucí peptid, například o jeden z řetězců, které byly uvedeny v WO 89/02463, a to
A. Ala-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Sěr-Sfcr-Val-Glu-IlePro-Glu-Glu-Ser-Leu-Ile-Gly-Phe-Leu-Asp-Leu-AlaGly-Glu-Glu-Ile-Ala-Glu-Asn-Thr-Thr-Leu-Ala
o. Ala-Pro-Val-Thi-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-Glu-IlePro-Glu-Glu-Ser-Leu-Ile-Ile-Ala-Glu-Asn-Thr-ThrLeu-Ala
C. Ala-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-Glu-IlePro-Ile-Ala-Glu-Asn-Thi—Thr-Leu-Ala
D. Ala-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-Glu-IlePro-Glu-Gl u-Ser-Leu-Ile-Ile-Ala-Glu-Asn-Thr-ThrLeu-Ala-Asn-Val-Ala-Met-Ala a
E. Gln-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-Glu-IlePro-Glu-Glu-Ser-Leu-Ile- Ile-A.la-Glu-Asn-Thr-ThrLeu-Ala-Asn-Val-Ala-Met-Ala
- 16 nebo může jít také o derivát některého z řetězců, uvedených pod A až E..
Heterologní bílkovinou, získanou způsobem podle vynálezu může být jakákoliv bílkovina, kterou je možno výhodně získat z kvasinek. Příkladem těchto bílkovin může být aprotinin nebo jiné inhibitory proteázy, insulin včetně prekursorů insulinu, růstový hormon člověka nebo skotu, interleukin, glukegon, tkáňový aktivátor plasminogenu, faktor VII, faktor VIII, faktor XIII, růstový faktor, odvozený od krevních destiček, enzymy a podobně, nebo může jít o funkční analogy těchto látek. Pod pojmem funkční analog se rozumí polypeptid s podobnou funkcí jako přírodní bílkovina, jde spíše o povahu účinku než o biologickou účinnost. Polypeptid může být strukturou příbuzný přírodní bílkovině a může být od ní odvozen přidáním jedné nebo většího počtu amitScyselin na C-terminálním a/nebo N-terminálním zakončení přírodní bílkoviny, substitucí jedné nebo většího počtu aminokyselin v jednom nebo ve větším '£očtu různých míst v přírodním řetězci zbytků aminokyselin, vypuštěním jednoho nebo většího počtu zbytků aminokyselin na kterémkoliv nebo na obou zakončeních přírodní bílkoviny nebo na jednom nebo větším počtu různých míst řetězce aminokyselin. Tyto modifikace jsou dobře známé v případě několika svrchu uvedených bílkovin.
- 17 Nyní bylo neočekávaně zjištěno, že modifikací C-terminálního zakončení vedoucího peptidu nebo N-terminálního zakončení heterologní bílkoviny je možno získat vysoký výtěžek aprotininu nebo jeho funkčního analogu, jak již bylo uvedeno. Aprotinin je bílkovina, působící inhibici proteáz, tato vlastnost ji uschopňuje pro použití pro různé účely v lékařství, například pro léčbu zánětu slinivky břišní, pro septický šok, u hyperfibrinolytického krvácení a u infarktu myokardu. Podání aprotininu ve vysokých dávkách podstatně snižuje ztrátu krve u chirurgických zákroků na srdci nebo jiných velkých chirurgických zákroků. Aprotinin je také užitečný jako přísada k živným prostředím protože způsobuje inhibici proteáz buněk hostitele, které by mohly jinak způsobit nežádoucí proteolytické štěpení bílkovin, k jejichž expresi dochází. Získání vysokých výtěžků správně zpracovaného aprotininu v kvasinkách při použití známých přírodních vedoucích řetězců, například vedoucího řetězce α-faktoru působilo až dosud potíže. K iniciaci natývního ^rotininu dochází na N-terminální zakončení bazickou aminokyselinou Arg, z tohoto důvodu může být předcházející místo zpracování méně dostupné pro proteolytické štěpení (jak bylo vysvětleno svrchu) v případě, že se užije některého ze známých vedoucích peptidů, například α-faktoru bez modifikace způsobem podle vynálezu, což má za následek malé výtěžky správně zpracovaného aprotininu nebo není možno aptotinin vůbec získat.
Způsobem podle vynálezu bylo možno dosáhnout zvláště dobrých výsledků při výrobě aprotininu v případě, že X znamená GluArgLeuGlu nebo v případě, že X^ znamená GluLeu nebo GluLeuAspLeu, jak bude také uvedeno v příkladech, přesto že by mělo být dosaženo dobrých výtěžků aprotininu i při jiných významech X1 a X^ za předpokladu, že alespoň jedna aminokyselina, zvláště ta, které je nejblíže k místu zpracování bude negativně nabitá, jak již bylo svrchu uvedeno.
Bylo také zjištěno, že modifikací C-terminálního zakončení vedoucího peptidů nebo N-terminálního zakončení heterologní bílkoviny svrchu uvedeným způsobem je možno získat ve vysokém výtěžku správně zpracovaný prekursor insulinu nebo jeho funkční analog. Při tomto provedení může znamenat X1 zejména Glu-Arg-Leu-Glu nebo Lys-Glu-Leu-Glu, přičemž X^ obvykle znamená peptidovou vazbu. Podle jiného provedení může X^ znamenat Glu, v tomto případě X^ obvykle znamená peptidovcu vazbu. Zvláště výhodných výsledků bylo možno dosáhnout při expresi prekursoru insulinového analogu B(l-29)-AlaAlaLys-A(l-29), a to v případě, že X^ znamená Lys-Glu-Leu-Glu nebo v případě X^ znamená substituci Phe jako první aminokyseliny z prekursoru insulinu za Glu, jak bude také uvedeno v příkladové části. Dobrých výtěžků bude také možno dosáhnout u prekursoru insulinového analogu 3(l-29)SerAspAspAlaLys-A(l-29) v případě, že X1
- 19 znamená LysGluLeuGlu. Mimo to je možno očekávat, že vysokých výtěžků prekursoru insulinu bude možno dosáhnout i v případě jiných významů X1 a X^ za předpokladu, že alespoň jedna aminokyselina, a to s výhodou nejbližší místu zpracování bude negativně nabitá aminokyselina, jak již bylo uvedeno.
Konstrukce DNA podle vynálezu, která je kódem pro polypeptid, může být připravena synteticky standardním postupem, například metodou s použitím fosfoamíditu podle publikace S. L. Beaucage a Μ. H. Caruthers, Tetrahedron Letters 22, 1981, str. 1859 až 1869 nebo způsobem podle publikace Matthes a další, ΈΜΒΟ Journal 3» 1984, str. 801 až 805. Podle postupu s použitím fosfoamiditu je možno syntetizovat oligonukleotidy například v automatickém syntetizátoru DNA, pak je čistit, vázat za vzniku dvojitého řetězce a vytvářet syntetickou konstrukci DNA.
Konstrukce DNA podle vynálezu může mít také původ v genomu nebo cDNA, například je možno postupovat tak, že se připraví sestava genomu nebo cDNA a tato sestava se zkoumá na přítomnost řetězců DNA, které jsou kódem pro celý řetězec nebo část řetězce polypeptidu hybridizací při použití syntetických oligonukleotidových sond známým způsobem, který byl shrnut v publikací T. Maniatis a další, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982. V tomto případě je možno spojit řetězec genomu nebo cDNA, který je kódem pro signální a vedoucí peptid s řetězcem genomu nebo cDNA, který je kódem pro heterologní bílkovinu, načež je možno řetězec DNA modifikovat v místě, které odpovídá řetězci aminokyselin X-X -X -X^ pólypeptidu, například řízenou mutagenesí při použití syntetického oligonukleotidu, který je kódem pro požadovaný řetězec aminokyselin při homologní rekombinaci známými postupy.
Konstrukce DNA může být také směsí e syntetického řetězce a řetězce genomu, syntetického řetězce cDNA nebo smíšeného řetězce genomu a cDNA, takový řetězec je možno připravit spojením fragmentů syntetického původu a původu z genomu nebo cDNA, přičemž tyto fragmenty odpovídají různým částem úplné konstrukce DNA podle známých postupů. Js tedy zřejmé, že řetězec DNA, který je kódem pro heterologní bílkovinu může být genomového typu, kdežto řetězec, který je kódem pro vedoucí peptid, je možno připravit synteticky·»
Výhodné konstrukce DNA, které jsou kódem pro aprotinin, jsou znázorněny na přiložených výkresech 4, 7, 9, 11 a 12, nebo může jít o vhodné modifikace těchto řetězců, které jsou kódem pro aprotinin nebo jeho funkční analog. Příkladem vhodných modifikací řetězce DNA mohou být substituce nukleotidů, při nichž nedojde k zařazení jiné aminokyseliny do bílkoviny, avšak které mohou odpovídat kodonňm, obvyklým v organismu kvasinek, do nichž byla včleněna konstrukce DNA nebo může jít o substituce nukleotidů, při nichž vzniká odlišný řetězec aminokyselin a tím i odlišná struktura bílkoviny, aniž by však došlo k ovlivnění antiproteázových vlastností nativního aprotininu. Dalším příkladem možných modifikací je včlenění jednoho nebo většího počtu nukleotidů do řetězce, přidání jednoho nebo většího počtu nukleotidů na kterémkoliv konci řetězce a vypuštění jednoho nebo většího počtu nukleotidů na kterémkoliv místě řetězce včetně jeho zakončení. Příklady specifických analogů aprotininu byly popsány v evropském patentovém spisu č. 339 942.
Výhodné konstrukce DNA, které jsou kódem pro prekursor insulinu jsou znázorněny na výkresech 16 a 17, může jít také o vhodné modifikace těchto řetězců.
Rekombinantní vektor pro expresi, v němž je uložen řetězec DNA, který je kódem pro polypeptid, vyráběný způsobem podle vynálezu může být jakýkoliv vektor, k jehož replikaci může dojít v organismu kvasinek. V tomto vektoru má být řetězec DNA, který je kódem pro uvedený polypeptid správně spojen s vhodným řetězcem promotoru. Promotorem může být jakýkoliv řetězec DNA, který má transkripční účinnost u kvasinek a může být odvozen od genů, které jsou kódem pro bílkoviny, homologní nebo heterologní pro kvasinky. Promotor se s výhodou odvodí od genu pro homologní bílkovinu. Příkladem vhodného promotoru mohou být promotory Saccharomyces cerevisiae Maal, SPI, ADH nebo PGK.
Řetězec DNA, který je kódem pro polypeptid by měl být rovněž správně spojen s vhodným terminá-» torem, například TPI, který byl popsán v publikaci T. Alber a G. Kawasaki, J. Mol. Appl. Genet. 1, 1982, str. 419-434.
Rekombinantní vektor pro expresi podle vynálezu dále obsahuje řetězec DNA, který umožňuje replikaci vektoru v kvasince. Příkladem takového řetězce je plasmid kvasinek 2/u, replikační geny REP 1-3 a počátek replikace. Vektor může rovněž obsahovat označení, umožňující selekci, například gen TPI Schizosaccharoces pombe, popsaný v publikaci P. R. Russell, Gene 40. 1985, str. 125-130
Postupy, užité k vazbě řetězců DNA, které jsou kódem pro polypeptid, promotory a terminátoru a pro uložení těchto řetězců do vektorů, vhodných pro kvasinky s obsahem informace, nutné pro replikaci v těchto kvasinkách jsou známé a byly popsány například ve svrchu uvedené publikaci Maniatise a dalších. Vektor je možno zkonstruovat tak, že se-mejprve připraví konstrukce s obsahem celého řetězce DNA, který je kódem pro polypeptid a pak se tento fragment včlení do vhodného vektoru pro expresi, nebo se postupně včleňují fragmenty DNA, obsahující genetickou informaci pro jednotlivé prvky, jako signální a vedoucí řetězec nebo heterologní bílkovina s následnou vazbou.
- 23 Organismus kvasinek, užitý při provádění způsobu podle vynálezu může být jakýkoliv kvasinkový organismus, který při pěstování produkuje velká množství heterologní bílkoviny nebo požadovaného polypeptidů. Příkladem vhodných kvasinek mohou být čeledi Saccharomyces cere— visiae, Saccharomyces kluyveri, Schizosaccharomyces pombe nebo Saccharomyces uvařum. Transformace kvasinkových buněk může být uskutečněna například tvorbou protoplastů, jak bude popsáno v příkladu 1 s následnou transformací známým způeobem. K pěstování buněk je možno užít jakéhokoliv běžného prostředí, vhodného pro pěstování kvasinek. Vyloučená heterologní bílkovina, jejíž podstatná část bude přítomna v živném prostředí ve správně zpracované formě pak může být izolována z prostředí běžným způsobem včetně oddělení kvasinkových buněk z prostředí odstředěním nebo filtrací, vysrážením bílkovinných složek ze supernatantu nebo filtrátu působením soli, například síranu amonného s následným čištěním některým z chromatografických postupů, jako je chromatografie na iontoměniči, afinitní chromatografie a podobně.
Vynález se rovněž týká způsobu výroby nového analogu aprotininu obecného vzorce X^-aprotinin(1-53), kde X^ znamená N-terminální prodloužení jednou nebo větším počtem aminokyselin, z nichž alespoň jedna má negativní náboj a je volena ze skupiny Glu a Asp. X^ může tvořit řetězec 1 až 6 aminokyselin, s výhodou 1 až 4 aminokyselin
4 ve svrchu uvedeném významu. Zvláště výhodnými významy X jsou Glu-Leu a Glu-Leu-Asp-Leu.
Vynález bude podrobněji popsán v příkladové části v souvislosti s přiloženými výkresy.
Na obr. 1 je znázorněna DNA a řetězec aminokyselin pro aprotinin(1-58). Jsou označena místa v řetězci DNA, na něž došlo k vazbě duplexů, vytvořených ze syntetických oligonukleotidů.
Na obr. 2 je znázorněna konstrukce plasmidů pKFN-802 a pXEN-803.
Na obr. 3 je znázorněna konstrukce plasmidů pKFN-849 a pKFN-855.
Na obr. 4 je znázorněn řetězec DNA o 406 bp, jde o fragment EcoRI-Xbal z plasmidů pKFN-849 a pKFN-855. Šipky označují místa, v němž dochází k proteolytickému štěpení v průběhu sekrece.
Na obr. 5A a 5B je znázorněna inhibice trypsinu a plasmijíu aprotininem. elipsou je označen pankreatický aprotinin skotu, X znamená Glu-Leu-aprotinin a delta znamená Glu-Leu-Asp-Leu-aprotinin.
Na obr. δ je znázorněna konstrukce plasmidů pKEN-852 a pKEN-858.
Na obr. 7 je znázorněn řetězec DNA o 412 bp, jde o fragment EcoRI-Xbal z plasmidů pKFN-852 a
- 25 pKFN-858- Šipka označuje místo, v němž dochází v průběhu sekrece k proteolytickému Štěpení.
Na obr. 8 je znázorněna konstrukce plasmidů pKFN-995 a pKFN-998.
Na obr. 9 je znázorněn řetězec DNA o 412 bp, jde o fragment EcoEI-Xbal z plasmidů pKFN-995 a pKFN-998. šipka označuje místo proteolytického štěpení v průběhu sekrece.
Na obr. 10 je znázorněna konstrukce plasmidů pKFN-1000 a pXFN-1003.
Na obr. 11 je znázorněn řetězec DNA o 412 bp, jde c fragment EcoEI-Xbal z plasmidů pXFN-1000 a pKFN 1003. Šipkou je označeno místo, v němž docriází v průběhu sekrece k proteolytickému Štěpení.
Na obr, 12 je znázorněn řetězec DNA genu pro syntetický aprotinin(3-58). Jsou označena místa vazby pěti duplexů, vytvořených z deseti syntetizovaných oligonukleotidů.
Na obr. 13 je znázorněna konstrukce plasmidů pKFN 305 a pKFN-374/375·
Na obr. 14 je znázorněna konstrukce plasmidů pMT-636.
Na obr. 15 je znázorněna konstrukce plasmidů pLaC-240.
Na obr. 16 je znázorněn řetězec DNA modifikovaného vedoucího řetězce genu pro prekursor insulinu z plasmidu pLaC-240.
Na obr. 17 je znázorněn řetězec DNA o 508 bp, jde o fragment Eco-RI-Xbal z plasmidu pKFN-458, který je kódem pro MFal-signální řetězec-vedoucí řetězec(1-85) a prekuřsor analogu insulinu B(l-29, lGlu+27Glu)-AlaAlaLys-A(l-21)-,
Praktické provedení způsobu podle vynálezu bude osvětleno následujíčímipříklady.
Příklad 1
Produkce Glu-Leu-aprotininu(l-58) z kvasinek KFN-837
a) Konstrukce plasmidu pKFN-SO2
Byl zkonstruován z 10 oligonukleotidů jejich navázáním syntetický gen, který je kódem pro aprotinin(l-58)·
Oligonukleotidy byly syntetizovány na automatickém syntetizátoru DNA postupem s použitím fosforamiditu na skleněné podložce s póry podle publikace Beaucage S.L. a Caruthers Μ- H., Tetrahedron Letters 22. (1981) 1359-1869.
- 27 Bylo syntetizováno následujících oligonukleotidů:
NOR-76O: CATGGCCAAAAGAAGGCCTGATTTCTGTTTGGAACCTCCATACACTGGTCC
NOR-754: TTACATGGACCAGTGTATGGAGGTTCCAAACAGAAATCAGGCCTTCTTTTGGC
NOR-354: ATGTAAA.GCTAGAATCATCAGATACTTCTACAACG
NOR-355: CTTGGCGTTGTAGAAGTATCTGATGATTCTAGCT
NOR-356: CCAAGGCTGGTTTGTGTCAAACTTTCGTTTACGGTGGCT
NOR-357: CTCTGCAGCCACCGTAAACGAAAGTTTGACACAAACCAGC
NOR-358: GCAGAGCTAAGAGAAACAACTTCAAGT
NOR-359: AGCAGACTTGAAGTTGTTTCTCTTAG
NOR-36O: CTGCTGAGACTGATGAGAACTTGTGGTGGTGCCTAAT
NOR-361: CTAGATTAGGCACCACCACAAGTTCTC1TGCAGTCTTC
Ze svrchu uvedených deseti oligonukleotidů bylo vytvořeno pět duplexů A až E, tak jak jsou znázorněny na obr. 1.
pmolů každého z duplexů A až E bylo vytvořeno z odpovídajících párů 5 -fosforylovaných oligonukleotidů fcahříváním na 5 minut na teplotu 90 °C s následným zchlazením na teplotu místnosti na 75 minut. Pět duplexů bylo smíseno a na směs bylo působeno DNA ligázou. Syntetický gen byl izolován jako pás o 191 bp po elektro28 forézou směsi na 2% agarosovém gelu. Získaný syntetický gen je znázorněn na obr. 1.
Syntetický gen byl nevázán na fragment BcoRI-NcoI o velikosti 209 bp z plasmidu pLaC2l2spx3 a na 2,7 kb fragment EcoRI-Xbal z plasmidu pUCl? podle publikace Yaniseh-Perron C., Vieira, J. a Messing, J., Gene 33 (1985), 103 až 119. Plasmid pLaC212spx3 byl popsán v příkladu 3 patentového spisu δ. WO 89/02463.
Fragment EcoRI-NcoI o 209 bp z plasmidu pLaC212spx3 je kódem pro syntetický vedoucí peptid z kvasinek.
Směs po vazbě byla užita k transformaci kompetentního kmene E, coli r”, m+ se selekcí na odol32 nost proti ampicilinu. Analýzou řetězce fragmentu p-Xbal-EcoRI podle publikace Maxam A. a Gilbert W., Methods Enzymol Ř2 (1980), 499 až 580 bylo prokázáno, že plasmidy z výsledných kolonií obsahovaly správný řetězec DNA pro aprotinin(1-58).
Jeden z plasmidů pKFN-802 byl vyčleněn pro další použití. Konstrukce tohoto plasmidu je znázorněna na obr. 2.
b) Konstrukce plasmidů pKFN-849, pKFN-855 a kmene KFN-837
Fragment o 3,0 kb po štěpení enzymy Ncol-Stul z plasmidu pKFN-802 byl navázán na syntetický fragment NOR-790/791 působením DNA ligázy.
Μ A K R E L R CATGGCTAAGAGAGAATTGAGA
CGATTCTCTCTTAACTCT
Směs byla rozštěpena restrikčním enzymem Stul tak, aby bylo sníženo jakékoliv pozadí pKFN-802 a výsledná směs pak byla použita k transformaci kompetentního kmene E. coli Cr”, c+) k selekci na odolnost proti ampίο jtlinu. Analýzou řetězce bylo prokázáno, še plasmid pKFN-349 z jedné z výsledních kolonií (Sanger F., Micklen S. a Coulson
A. R., Proč. Nati. Acad. Sci., USA 24 (1977), 5463 až 5467) obsahuje řetězec DNA pro Glu-Leu-aprotinin(l-58), správně navázaný na gen pro syntetický vedoucí sled kvasinek. Konstrukce plasmidu pKFN-849 je znázorněna na obr. 3.
Plasmid pKFN-849 byl rozštěpen působením enzymu EcoRI a Xbal a fragment o velikosti 406 bp byl navázán na fragment Ecol-Xbal o velikosti 9,5 kb z plasmidu pMT636 a fragment NcoI-NcoRl o velikosti 1,4 kb z plasmidu pMT636, čímž byl získán plasmid pKFN-855, jak je zřejmé z obr. 3. Plasmid pMT636 byl popsán v patentovém spisu č. PCT/EK88/00138.
Plasmíd pMT636 je vektor, který obsahuje gen TPI ze Schizosaccharomyces pombe (POT) popsaný v publikaci Russell F. R., Gene 40 (1985), 125 až 130 a promotor a terminátor triosofosfátisomerázy TPIp a TPI»p ze S. cerevisiae podle publikace Alber T. a Kawasaki G., <J. Mol. Appl. Gen., .1, (1982), 419 až 434. Plasmid pKFN-855 obsahuje následující řetězec:
TPIp-LaC212spx3-signální řetězec-vedoucí řetězec-Glu-Leu-aprotinin(l-58)-TPIT v němž LaC212spx3 signální řetězec-vedauci řetězec je syntetický vedoucí řetězec plasmidu popsaný v patentovém spisu č. WO 89/02463. Řetězec DNA fragmentu EcoRI-Xbal o velikosti 406 bp z plasmidu pKFN-849 a pKFN-855 je znázorněn na obr. 4.
S. cerevisiae kmen MT-663 (E2-7B XE11-36 a/α, delta-tpi, delta-tpi, pep 4-3/pep 4-3) byl pěstován na prostředí YPGaL s obsahem 1 % extraktu z kvasnic (Bacto), 2 % peptonu (Bacto), 2 % galaktosy a 1 % laktátu až do optické hustoty 0,6 při 600 nm.
100 ml kultury bylo odstředěno, promyto 10 ml vody, znovu odstředěno a uvedeno do suspenze v 10 ml roztoku s obsahem 1,2 M sorbitolu, 25 mM NagEETA o pH 8,0 a 6,7 mg/ml dithiothreitolu. Suspenze byla inkubována 15 minut při teplotě 30 °C, pak byla odstředěna a buňky byly
- 31 znovu uvedeny do suspenze v 10 ml roztoku s obsahem 1,2K sorbitolu, 10 mM Na2EDTA, 0,1 M citronanu sodného o pH 5,8 o
a 2 mg Novozym* 234. Suspenze se inkubuje 30 minut pri teplotě 30 °C, buňky se oddělí odstředěním, promyjí se 10 ml
1,2 M sorbitolu a 10 ml prostředí CAS, které obsahuje 1,2 M sorbitolu, 10 wM chloridu vápenatého a 10 wM tris HC1 o pH
7,5, načež se buňky znovu uvedou do suspenze ve 2 ml CAS.
Pro transformaci se smísí 0,1 ml CAS s buňkami a přibližně 1/Ug plasmidu pKNF-855 a směs se nechá stát 15 minut při teplotě místnosti. Pak se přidá 1 ml směsi 20% polyethylenglykolu 4000, 20mM chloridu vápenatého, 10 mM chloridu vápenatého a 10 mM tris tiCl o pH 7,5 a směs se nechá ještě 30 minut stát při teplotě místnosti. Pak se směs odstředí a usazenina se znovu uvede do suspenze v 0,1 ml prostředí SOS, které obsahuje 1,2 M sorbitolu, 33 % objemových YPD, 6,7 mM chloridu vápenatého a 14/Ug/ml leucinu, načež se suspenze inkubuje 2 hodiny při teplotě 30 °C. Pak se suspenze odstředí a usazenina se znovu uvede do suspenze v 0,5 ml 1,2 M sorbitolu. Pak se přidá 6 ml agaru, jde o prostředí SC podle publikace Sherman a další, Methods in Yaest Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1981) s obsahem 1,2 M sorbitolu a 2,5 % agaru při teplotě 52 °C a suspenze se vlije na horní část ploten, které již obsahují ztuhlé agarové prostředí s obsahem sorbitolu. Kolonie transformantň se po 3 dnech při teplotě 30 °C odeberou, reizolují a užijí k založení kultur v kapalném prostředí. Transformant KPN-837 byl užit k další charakterizaci.
- 32 Kmen KFN-837 byl pěstován na prostředí YPD, které obsahuje 1 % extraktu z kvasnic, 2 % peptonu (Difco Laboratories) a 6 % glukosy. 200 ml kultury bylo protřepáváno rychlostí 250 ot/min při teplotě 30 °C celkem 3 dny do optické hustoty 20 při 600 nm, suchá biomasa kvasinek 18,8 g/1. Po odstředění byl supernatant analyzován chromatografii na iontoměniči (FPLC). Supernatant byl pak zfiltrován přes filtr Millex GV s otvory pórů 0,22/um, 1 ml filtrátu se nanese na sloupec iontoměniče MonoS s rozměrem 0,5 x x 5 cm v rovnovážném ?tavu ve 20 mM Bicinu o pH 8,7. Pd promytí ekvílibračním pufrem byl sloupec vymýván lineárním gradientem chloridu sodného 0 až IM v ekvilibračním pufru.
V jednotlivých frakcích bylo stanoveno kvantitativně účinnost inhibitoru trypBinu spektrofotometricky podle publikace Kassel B., Methods Enzymol. 19. (1970), 844 až 852 a dále integrací absorpce při 280 nm podle rovnice E280 (aprotinin) =8,3
Výtěžek byl 120 g/1 Glu-Leu-aprotininu(l-58)·»
Pro analýzu aminokyselin a stanovení N-terminálního řetězce a pro další čištění získaného produktu byl Glu-Leu-aprotinin (1-5S) čištěn vysokotlakou kapalinovou chromatografii v reversní fázi na sloupci (Vydac 04,
- 33 4,6 χ 250 mm). Sluce se provádí při použití gradientu methy1kyanidu v 0,1% TFA. Odebrané frakce se zahustí na 100/ul odstředěním ve vakuu a byly odebrány vzorky pro stanovení N-ter minálního řetězce a analýzu aminokyselin.
Při stanovení N-terminálního zakončení bylo možno prokázat následující řetězec:
Glu-Leu-Arg-Pro-Asp-Phe-X-Leu-Glu-Pro-Pro-Tyr-Thr-Gly-Pro-XLys-Ala-Arg-Ile-Ile-Arg-Tyr-Phe-Tyr-Asn-Ala-Lys-Ala což znamená, že N-terminální zakončení je správné. Bbytky poloviny cysteinu nebyly tímto způsobem stanoveny, což je ve shodě se slepými zkouškami (X), získanými ze zbytků č. 7 a 16.
Analýza aminokyselin je znázorněna v tabulce 1. 2 tabulky je zřejmé, že produkt má očekávané složení aminokyselin, tj. větší množství Glu a Leu. Mírně snížený obsah Ile je pravděpodobně možno připsat neúplné hydrolýze Ile(18)-Ile(l9), což je v oboru dobře známo. Také obsah Arg je o něco vyšší, než bylo očekáváno. To je však možno pozorovat také u nativního aprotininu, jak je zřejmé z tabulky 1, třetí sloupec.
V případě srovnání svrchu uvedeného postupu Kasselova je možno prokázat, že specifická účinnost 3lu-Leu-aprotininu(l-53) je rovna specifické účinnosti na34 tívního aprotinunu v rámci experimentálních chyb. Inhibice trypsinu a plasminu působením Glu-Leu-aprotinin(l-56) pocí titračních křivek byla neodlišitelná od inhibice p&nkre&tivkým aprotininem skotu (Aprotinin Novo). Fo inkubaci enzymu s aprotininem nebo jeho analogy 30 minut bylo přidáno 0,6 wM S 2251 (KabiVitrum) a účinnost byla měřena jako rychlost tvorby nitroanilinu. Účinnost je jako funkce koncentrace aprotininu vyjádřena na obr. 5A a 5B, Bylo možno pozorovat úplnou inhibici obou enzymů všemi třemi inhibitory
Příklad 2
Produkce Glu-Leu-Asp-Leu-aprotininu(l-58) kmenem kvasinek KFN-840
Syntetický gen, který je kódem pro Glu-Leu-Asp-Leu-aprotinin(l-5S) byl zkonstruován způsobem podle příkladu 1. Syntetický fragment NOP.-793z/794 byl užit místo NOR-790/791:
MAKRELE».LP
CATGGCTAAGAGAGAATTGGACTTGAGA
CGATTCTCTCTTAACCTGAACTCT
Plasmid pKFN-852, odvozený od pUC19 byl zkonstruován podobně jako pKFN-849.
Způsobem podle příkladu 1 byl získán plasmid pKFN-858, který obsahuje následující konstrukci:
TPIp-LaQ212spx3-signální řetězec-vedoucí řetězec-Glu-LeuAsp-Leu-aprotinin(i-58)-TPI,p.
Konstrukce plasmidů pKFN-852 a pKFN-858 je znázorněna na obr. 6. Řetězec DNA fragmentu EcoRI-Xbal o 412 bp z plasmidů pKFN-852 a pKFN-858 je znázorněn na obr. 7.
Plasmid pKFN-858 byl transformován v kvasinkovém kmenu MT663 svrchu uvedeným způsobem za vzniku kmene KFN-84O.
200 ml prostředí YPD s obsahem KFN-840 bylo protřepáváno 3 dny při teplotě 30 °C a 250 ot/min do optické hustoty 18 při 600 nm, což odpovídá suché biomase 16,7 mg/1. Chromatografii supernatantu na iontoměniči (FPI£) bylo získáno 90 mg/1 Glu-Leu-Asp-Leu-aprotininu(l-58).
Analýza aminokyselin je uvedena v tabulce 1 a potvrzuje očekávané složení produktu.
Titrační křivky pro inhibici trypsinu a plasminu působením Glu-Leu-Asp-Leu-aprotininu(l-58) jsou neodlišitelné od křivek pro pankreatický aprotinin sketu (aprotinin Novo), jak je znázorněno na obr. 5A a 5B.
- 36 Příklad 3
Produkce aprotininu(1-53) z kmene KFN-1006 kvasinek
Plasmid pKFN-995 byl zkonstruován z plasmidu pKFN-802 navázáním fragmentu Ncol-Stul o 3,0 kb na syntetický fragment NOR-848/849:
MAKELEKRR
CATGGCTAAGGAATTGGAGAAGAGAAGG
CGATPCGTTAACCTCTTCTCTTCC
Vazná směs se štěpí působením restrikčního enzymu Balí ke snížení jakéhokoliv pozadí plasmi· du kPFN-802.
Plasmid pKFN-998 pro expresi v kvasinkách byl zkonstruován podle příkladu 1, je znázorněn na obr. 8 a má následující konstrukci:
TPIp-LaC212spx3-signální řetězec-vedoucí řetězec(I-47)Lys-Glu-Leu-Glu(Lys-Arg)-aprotinin(l-58)-T?IT
Setězec DNA fragmentu EcoRI-Xbal o 412 bp z plasmidů pKFN-995 a pKFN-998 je znázorněn na obr. 9.
Plasmid pKFN-998 byl užit pro trans formaci kvasinkového kmene MT663 způsobem podle příkladu 1 za vzniku kvasinkového kmenu KřTí-1006. Pěsotávním transformovaného:- kmenu KřTí-1006 v prostředí YPD byl získán aprotinin(1-58), jehož analýza v supernatantu byla provedena svrchu uvedeným způsobem.
Celkový výtěžek byl 30 mg/1 aprotininu(l-58).
Analýza aminokyselin čištěného materiálu potvrdila jeho očekávané složení.
Příklad 4
Produkt aprctininu/1-58) z kvasinkového kmene KPN-1008
Plasmid pKFN-1000, odvozený od pUC- byl zkonstruován způsobem podle přikladu 1 navázáním fragmentu Ncol-Stul o 3,0 kb plasmidu pKPN-802 na syntetický fragment NOR-85O/851:
MAERLSKRR C AT GGCTGAGAGATTGGAGAAGAGAAGG
CGACTCTCTAACCTCTTCTCTTCC
Opakováním postupu z příkladů 1 a 3 byl získán plasmid pKFN-1003 pro expresi v kvasinkách, který obsahoval následující konstrukci:
- 38 TPIp-LsC212spx3-signální řetězec-vedoucí řetězec (1-47)G1 u Ar gLe uGl u (Ly s- Ar g) - a pr o t in in (1- 5 δ > -TPI™.
Konstrukce plasmidů pKFN-lOOO a pKFN-1003 je znázorněn na obr. 10. Řetězec DNA fragmentu EcoRI-Xbal o 412 bp z plasmidů pKBN-1000 a pKFN-1003 je znázorněn na obr. 11.
Plasmid pKFN-1003 byl užit pro transformaci kvasinkového kmene MT663 svrchu uvedeným způsobem za vzniku kvasinkového kmene KFN-I008.
Transformovaný kmen KFN-1008 byl pěstován v prostředí YPD, analýza získaného aprotininu-(1-53) v supernatantu byla provedena svrchu uvedeným způsobem. Výtěžek byl 120 mg/1 eprotininu(l-53)Tr
Analýza aminokyselin čištěného materiálu potvrdila jeho očekávané složení. Mimoto bylo možno potvrdit úplnou primární strukturu analýzou redukovaného, pyridylethylováného polypeptidu v plynné fázi.
Mimoto bylo možno prokázat, že specifická inhibiční účinnost rekombinantního aprotininu(l-55) proti trypsinu je neodlučitelná od specifické inhibiční účinnosti pankreatického aprotininu skotu.
- 39 Příklad 5
Produkce aprotininu(1-58) z kvasinkového kmene KFN-783
Plasmid pKFN-802 z příkladu 1 byl rozštěpen enzymy EcoRI a Xbal a fragment o 400 bp byl navázán na fragment Ncol-Xbal o 9,5 kb z plasmidu ρΜΤοβδ a na fragment NcoI-EcoRI o 1,4 kb z plasmidu pMT636, čímž byl získán plasmid pKFN-803, který je znázorněn na obr. 2 a je tvořen následující konstrukcí:
T?Ip-LaC212spx3-3Ígnální řetězec-vedoucí řetězec-aprotinin(1-58)-TPIj
Plasmid pKFN-803 byl užit k transformaci kmene MT663 kvasinek svrchu uvedeným způsobem. Transformovaný kmen KFN-783 byl pěstován na prostředí TPD, chromatografii supernatantu na iontoměniči (FPLC) byl získán aprotinin(l-58), který byl stanoven kvantitativně srovnáním s chromatografii standardisovaného roztoku autentického aprotininu, získaného čištěním ze slinivky skotu. Výtěžek aprctininu(l-5o) byl nižší než 1 mg,7!.
| Tabulka 1 | ||
| Složení | aminokyselin | |
| amino- | aprotinin aprotinin XPN-837 | KFN-840 |
| kyselina | vypočteno nalezeno nalezeno | nalezeno |
Asp 5
Thr 3
Ser 1
Glu 3
Pro 4
Gly 6
Ala o
Cys 6
Val i
Met 1
Ile 2
Leu 2
Tyr 4
Pne 4
Lys 4
Arg 6
| 5,00 | 4,95 |
| 2,86 | 2,84 |
| 0,94 | 0,92 |
| 3,04 | 3,97 |
| 4,18 | 3,90 |
| 5,95 | 5,91 |
| 5,85 | 5,92 |
| 5,20 | 5,21 |
| 0,99 | 1,00 |
| 0,83 | 0,65 |
| 1,39 | 1,58 |
| 3 ,97 | 3,00 |
| 3,84 | 3,74 |
| 3,98 | 3,94 |
| 3,92 | 3,99 |
| 6,39 | 6,35 |
5.93 (+1)
2.85 0,93 (+1) 3,99 (+1)
3.86
5.94
5,94 5,22 1,01 0,67 1,58 (+1) 4,00 (+2) 3,71 3,92 3,99 6,34 celkem
56,33 57,87 59,83
Příklad o
Frodukce aprotininu-(3-58)
Syntetický gen pro aprotinin(3-58) byl zkonstruován z řady oligonukleotidů.
Následujících 10 oligonukleotidů bylo syntetizováno způsobem podle příkladu-I:
I: AAAGAGATTTCTGTTTGGAACCTCCATACACTGGTCC
37-mer
II: TTACATGGACCAGTGTATGGAGGTTCCAAACAGAAACT 3o-mer
III: ATGTAAAGCTAGAATCATCAGATACTTCTACAACG 35-mer
IV: CTTGGCGTTGTAGAAGTATCTGATGATTCTAGCT
34-mer
V: CCAAGGCTGGTTTGTGTCAAACTTTCGTTTACGGTGGCT
39- mer
VI: CTCTGCAGCCACCGTAAACGAAAGTTTGACACAAACGAGG
40- mer
VII: GCAGAGCTAAGAGAAACAACTTCAAGT
27-mer
- 42 VIII: AGCAGACTTGAAGTTGTTTCTCTTAG
26-mer
IX: CTGCTGAAGACTGCATGAGAACTTGTGGTGGTGCCTAAT
39-mer
X: CTAGATTAGGCACCACCACCAGTTCTCATGCAGTCTTC
38-raer
Z těchto deseti oligonukleotidů byly vytvořeny duplexy A až E, celkem tedy pět duplexů, jak je znázorněno na obr. 12.
pmol každého z duplexů A až E bylo vytvořeno z odpovídajících párů 5 '-fosforylovaných oligonukleotidů I až X zahříváním 5 minut na 90 °G s následným zchlazením na teplotu místnosti v průběhu 75 minut. Všechpy duplexy byly smíseny a podrobeny působení T4 ligázy. Syntetický gen byl izolován jako pás o velikosti 176 bp po elektroforéze vaáné směsi na 2% agarosovém gelu. Získaný systetický gen je znázorněn na obr. 12.
Syntetický gen o velikosti 176 bp byl navázán na fragment EcoRI-Hgal o 330 bp z plasmidů pXFN-9, který je kódem pro řetězec αΐ-signální řetězec-vedoucí řetězec (1-58) cerevisiae podle publikace Markussen
J. a další, Protein-Engineering 1 (1987), 215 až 223 a na fragment EcoRI-Xbal o 2,7 kb z plasmidů pUC!9 podle publikace
- 43 Yanish-Perron C., Vieira J. a Messing J., Gene (1985),
103 až 119. Konstrukce plasmidu pKFN-9, obsahující místo působení Kgal bezprostředně za vedoucím řetězcem MFal je znázorněna v evropském patentovém spisu č. 214 826.
Vazná směs byla užita k transformaci kompetentního kmene E. coli (R , m+) s odolností proti ampicilinu, které byla užita pro selekci. Při analýze řetězce fragmentu ^2p-XbaI-ScoRI podle publikace Maxam A. s Gilbert W., Methods Enzymol. 65 (1980), 499 až 560, bylo možno prokázat, že plasraidy z výsledných kolonií obsahovaly správný řetězec DNA pro aprotinin-(3-5θ)·
Jeden z plasmidu pKEN-305 byl vybrán pro další použití. Konstrukce tohoto plasmidu je znázorněna na obr. 13.
Plasmid pKFN305 byl rozštěpen enzymy EcoRI a Xbal a fragment o velikosti 0,5 kb byl navázán na fragment Neol-Xbal o 9,5 kb z plasmidu pMT636 a fragment NcoI-EcoRI o 1,4 kb z plasmidu pMT63ó, čímž byl získán plasmid pKFN374, znázorněný na obr. 13. Plasmid pMT636 byl zkonstruován z plasmidu pMT603 po vypuštění genu LEU-2 a z plasmidu pMT479, jak je znázorněno na obr. 14. Plasmid pMT608 byl popsán v evropském patentovém spsu c. 195 691 a plasmid piáT479 byl popsán v evropském patentovém spisu č. 163 529. Tento plasmid obsahuje gen TRI (POT) ze Schizosaccharomyces
- 44 pombe a promotor a terminátor triofosfátisomerázy TPIp a
TPIrp ze S. cerevisiae, jak bylo uvedeno v publikaci Alber
T. a Kawasaki G., J. Mol. Appl. Gen. 1. (1982), 419 SŽ434.
Plasmid pKFN374 obsahuje následující konstrukci:
TPIp-MFocl-signální řetězec-vedoucí řetězec(l-85)-aprotinin(3-58)-TPIT, kde MFal je kódový řetězec pro al z S.cerevisiae podle publikace Kurjan J. a Herskowitz I., Cell 30 (1982), 933 až 943, řetězec obsahuje prvních osmdesátpět zbytků aminokyselin signálního a vdoucího řetězce MFal a aprotinin(3-58) je syntetický řetězec, který je kódem pro aprotininový derivát, jemuž chybí první dva zbytky aminokyselin.
Kmen S. cerevisiae MT663 (Ξ2-73 XE11-36 a/α, delta-tpidelta-tpi, pep 4-3/pep 4-3) byl pěstován na prostředí YPGaL s obsahem 1 % extraktu z kvasnic (Bacto), 2 % peptonu (Bacto), 2 % galaktosy a 1 % laktátu až do optické hustoty 0,6 při 600 nm.
100 ml výsledné kultury bylo odstředěno, usazenina byla promyta 10 ml vody, znovu odstředěna a uvedena do suspenze v 10 ml roztoku s obsahem 1,2 M sorbitolu, 25 mM N&2 ΒΠΓΑ o pH 8,0 a 6,7 mg/ml dithiothreitolu. Suspenze byla inkubována 15 minut při teplotě 30 °C, pak byla odstředěna a buňky byly znovu uvedeny do suspenze v 10 ml roztoku s obsahem 1,2 M sorbitolu, 10 mM NaA*
S
0,1 M citronanu sodného o pH 5,6 a 2 mg prostředku Novozyra 234. Suspenze byla inkubována 30 minut při. teplotě 30 °G, · buňky byly odděleny odstředěním, promyty 10 ml 1,2 iď sorbitolu a 10 ml CAS, což je prostředí s obsahem 1,2 M sorbitolu, 10 mM chloridu vápenatého, 10 mM tris HCL (tris = = tris(hydroxymethyl)aminoraethan) při pH 7,5, načež se znovu uvedou do suspenze ve 2 ml CAS. Pro transformaci se smísí 0,1 ml CAS se suspenzí buněk s přibližně 1/Ug plasmidu pKFN374 a smě3 se nechá stát při teplotě místnosti 15 minut. Pak se přidá 1 ml směsi 20% póly ethylenglykolu 4000, 10 mM chloridu vápenatého. 10 mM tris HCL o pH 7,5 a směs se nechá stát ještě 30 minut při teplotě místnosti. Pak se směs odstředí a usazenina se znovu uvede do suspenze v 0,3. ml prostředí SOS, které obsahuje 1,2 M sorbitolu, 33 & objemových YFD, 6,7 mM chloridu vápenatého a 14/Ug/ml leucinu, načež se směs inkubuje 2 hodiny při teplotě 30 °C. Pak se suspenze odstředí a usazenina se znovu uvede do suspenze” v 0,5 ml 1,2 K sorbitolu. Pak se přidá 6 ml agaru, jde o prostředí SC z publikace Sherman a další, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981 s obsahem
1,2 M sorbitolu a 2,5 % agaru, při teplotě 52 °C a suspenze se pak vlije na povrch ploten, které již obsahují totéž ztuhlé agarové prostředí s obsahem sorbitolu. Kolonie transformantň se oddělí po 3 dnech při teplotě 30 °C, izolují a užijí k založení kultur v kapalném prostředí.
- 46 Jeden z takto získaných transformantů KFN322 se užije pro další charakterizaci.
Kmen KFK322 se pěstuje na prostředí
YPD, které obsahuje 1 % extraktu z kvasnic, 2 % peptonu (Difco Laboratories) a 2 % glukózy. 10 ml kultury tohoto kmene bylo protřepáváno při teplotě 30 °C až do dosažení optické hustoty 32 při 600 nm. Po odstředění byl supernatant analyzován chromatografií na iontoměniěi (FPLC). SuR pernatant byl zfiltrován přes filtr Millex GV s otvory o průměru 0,22/um a 1 ml filtrátu byl nanesen na sloupec kationtoměniče MonoS s rozměrem 0,5 x 5 cm v rovnovážném stavu s 20 mM Bicinu o pH 8,7. Fo promytí ekvilibračním pufrem byl sloupec promýván lineárním gradientem chloridu sodného 0-1 U v ekvilibraěním pufru. Ve frakcích byla stanovena inhibiční účinnost pro trypsin spektrofotometricky a pak integrací absorpce při 280 nm podle výrazu E280 (šprotinin) = 8>3.
Celkový výtěžek byl přibližně 3 mg/1 aprotíninu(3-58).
- 47 Příklad 7
Produkce prekursoru insulinu B(l-29)-AlaAlaLys-A(1-21)z kvasinkového kmene L&C1667
Fragmenty SphI-NcoI o 589 bp a Hpal-Xbal o 172 bp byly izolovány z plasmidu pLaC212spx3, který byl popsán ve WO 89/02463. Tyto fragmenty byly spojeny se syntetickým adapterem
M AK Ξ L EK R F V NOR-962 CATGGCTAAGGAATTGGAAAAGAGATTCGTT
NOR-964 CGATTCGCTAACCTTTTCTCTAAGCAA a se syntetickým fragmentem Xbal-Sphl o 10 kb z plasmidu pMT743, který byl popsán ve svrchu uvedeném patentovém spisu, čímž vznikl plasmid pLaC24O, znázorněný na obr. 15. Řetězec DNA modifikovaného genu pro prekursor insulinu s vedoucím řetězcem z plasmidu lPaC24O je znázorněn na obr. 16.
Transformací kvasinkového kmene MT663 plasmidem !PaC24O byl získán kmen LaCl667 (MT663/pLaC24O), který vylučuje insulin a jeho produktivita je 165 % ve srovnání s produktivitou kmene LaCl4l4 (MT663/pEaC2l2spx3), který obsahuje gen pro nemodifikovaný prekursor insulinu s vedoucím řetězcem, tak jak byl popaár ve WO 89/02463.
- 48 Produkce prekursoru analogu insulinu 3(1-25, lGlm-27Glu)AlaAlaLys-A(l-21) z kvasinkového kmene KPN-470
Příklad 8
Vazbou 10 oligonukleotidů bylo dosaženo konstrukce syntetického genu, který je kódem pro prekursor svrchu uvedeného analogu insulinu. 3(1-29,lGlu+27Glu) znamená polypeptid, který obsahuje prvních dvacetdevět zbytk aminokyselin řetězce 3 lidského insulinu, v němž byly zbytky Glu zavedeny místo BlP'ne a E27Thr. A(l-21) je řetězec A lidského insulinu. Tripeptid AlaAlaLys spojuje zbytek B29Lys se zbytkem AlGly.
Bylo syntetizováno následujících oligonukleotidů:
NOR-542: AAAGAGAAGTTAACCAACACTTGTGCGGTTCCCAC
NOR-543: AACCAAGTGGGAACCGGACAAGTGTTGGTTAACITC
NOR-6 9: TTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGCGGTGAAAGAGGTTTCT
NOR-73: GTAGAAGAAACCTCTTTCACCGCAAACCAAGTACAAAGCTTC
NOR-315: TCTACGAACCTAAGGCTGCTAAGGGTATTGCT NOR-316: ATTGTTCGACAATACCCTTAGCAGCCTTACGTTC N0R-70: GAACAATGCTGTACCTCCATCTGCTCCTTGTACCAAT
NOR-71: TTTTCCAATTGGTACAAGGAGCAGATGGAGGTACAGC
NOR:78: TGGAAAACTACTGCAACTAGACGCAGCCCGCAGGCT
NOR-72: CTAGAGCCTGCGGGCTGCGTCTAGTTGCAGTAG
Z uvedených 10 oligonukleotidů bylo vytvořeno 5 duplexů, které byly vzájemně návázány způsobem podle příkladu 1.
Syntetický gen o 178 bp byl navázán na fragment EcoRI-Hgal o 330 bp z plasmidů pKFN-9, tento fragment je kódem pro al signální řetězec a vedoucí řetězec (1-35) S. cerevisiae, jak bylo popsáno v publikaci Markussen J. a další, Protein Engineering 1 (1987), 215 až 223 a na fragment EcoRI-Xbal o 2,7 kb z plasmidů pUC19, který byl popsán v publikaci Aynisch-Perron, C., Vieira J. a Messing J., Genesi (1985), 103 až 119.
Vazná směs byla užita k transformaci kompetentního kmene E. coli (ř , m+), selekce byla prováděna podle odolnosti proti ampicilinu. Analýza řetězce fragmentu 3^?-Xbal-ScoRI podle publikace Maxaa A. a Gilbert V/., Methods En2ymol. 65 (1980), 499 až 540 prokázala, že plasmidy z výsledných kolonií obsahovaly správný řetězec DNA pro prekursor analogu insulinu.
Jeden z takto získaných plasmidů pKFN-45o byl vybrán pro další použití.
Způsobem podle příkladu 1 byl získán plasmid pKFN-458 pro expresi v kvasinkách, který obsahoval následující konstrukci:
Tabulka 2
Úroveň exprese prekursoru insulinu a analogů insulinu v tran3formantech kvasinek prekursor úroveň exprese
B(l-29)-AlaAlaLys-A(l-21) 100 %
B(l-29 ,27Glu)-AlaAlaLys-A(l-21) 148 %
B(1-29,lGlu+27Glu)-AlaAlaLys-A(1-21) 479 % x Úroveň exprese je uváděna v procentech exprese pro prekursoi’ insulinu B(l-29)-AlaAlaLys-A(l-2l), která j pokládána za 100
- 50 TPIp-MFal-signální řetězec-vedoucí řetězec(l-85)-B(l-29·lGlu+27Glu)-AlaAlaLys-A(l-2l)-TPIT.
řetězec DNA pro fragment EcoRI-Xbal o 508 bp z plasmidů pKFN-456 a pKFN-458 je znázorněn na obr. 17.
Plasmid pKFN-458 byl užit k transformaci kvasinkového kmene MT-663 svrchu uvedeným způsobem za vzniku kvasinkového kmene KFN-470.
Transformovaný kmen KFN-470 byl pěstován v prostředí YFD svrchu uvedeným způsobem. Výtěžek prekursoru insulinového analogu v supernatantu byl stanoven vysokotlakou kapalinovou chromatografií podle publikace L. Snel a další, Chromátogra£hia 24 (1987), 329-332.
V tabulce 2 je uvedena pro srovnání úroveň exprese prekursorů insulinových analogů B(l-29,lGlu*27Glu)-AlaAlaLys-A(l-21) a B(l-29,27Glu).-AlaAlaLys-A(l-21) a prekursoru insulinu B(l-29)-AlaAlaLysA(l-2l), Exprese všech tří prekursorů bylo dosaženo v tomtéž hostitelském kmeni MT-663, který byl transformován plas midy S obsahem genu TPI ze 3. pombe.
Všechny plasmidy obsahovaly následující konstrukcí:
TPIp-MFal-signální řetězec-vedoucí řetězec(l-85)-prekursortpit.
Claims (33)
- PATENTOVÉ NÁROKY \ V “ y. τ ·./ v \ v '·.· I V '•ΛPolypeptid obsahující spojení signálního peptidu, který je hydrofobní, vedoucího peptidu, který je převážně·» hydrofilní y a heterologního proteinu či polypeptidu, přičemž polypeptid je modifikován ve své aminokyselinové sekvenci sousedící s kvasinkovým procesním místem, umístěným mezi C-koncem peptidu a N-koncem heterologního proteinu, přičemž polypeptid má strukturu ^signální peptid-vedoucí peptid-X^-X^-X^-X^-heteroí??! proteinj v němž X1 znamená peptidovou vazbu nebo 1-6 *----- 2 o aminokyselin, které mohou být stejné nebo různé, X a X , jež mohou být stejné nebo rozdílné, znamenají bázickou aminokyselinu ze skupiny Lys a Arg, když X a X definují společně kvasinkové procesní místo a X4 znamená peptidovou vazbu nebo 1-6 aminokyselin, jež mohou být stejné nebo různé/a pokud X4 znamená jednu nebo více aminokyselin, je vsunuto přídavné procesní místo mezi X4 a N-konec heterologního proteinu/ a za ^re^>okTadu, že X^ a/nebo X4 znamená 1-6 aminokyselin a alespoň jedna z aminokyselin ve významu Xx aminokyselinu a/nebo zeX4 znamena anegativné Asp a za nabitou dalšího.skupiny GluĚLá&u, že pokud X^ znamená peptidovou vazbu, X** má jiný význam než Glu-Ala-Glu-Ala, Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala, Glu-Ala-Glu-Ala-Ser-Leu-Asp-Lys-Arg nebo Glu-Ala-Glu-Ala-Ser-Leu-Asp a znamená-li X4 peptidovou vazbu, X^ má jiný význam než Ser-Leu-Asp a ještě za dalšíHfe. předpokladu·, že sestava signální peptid-vedoucí peptid-X1 má jiný význam než signální peptid α-faktoru a vedoucí peptid a-faktoru (1-85)-Glu-Ala-Glu-Ala-Ser-Leu-Asp, signální peptid α-faktoru a vedoucí peptid a-faktoru (1-80)-Pro-Leu-Asp, signální peptid α-faktoru a vedoucí peptid a-faktoru (1-80)-Glu-Leu-Asp a Met-Lys-Trp-Val-Ser-Phe-Ile-Ser-Leu-Leu-Phe- Leu-Phe-Ser-Ser-Ala-Tyr-Ser-Arg-Ser-Leu-Asp.
- 2. Polypeptid podle nároku 1, kde znamená Glu nebo Asp.
- 3. Polypeptid podle nároku 1, kde X^ znamená sekvenci dvou aminokyselin se strukturou BA, kde A znamená Glu nebo Asp a B znamená Glu, Asp, Val, Gly nebo Leu.
- 4. Polypeptid podle nároku 1, kde X^ znamená sekvenci tři aminokyselin se strukturou CBA a kde A a B mají výše uvedené významy a C znamená Glu, Asp, Pro, Gly, Val, Leu, Arg nebo Lys.
- 5. Polypeptid podle nároku 1, kde X^ znamená sekvenci čtyř aminokyselin se strukturou DCBA, kde A, B a C mají výše uvedené významy a D má týž význam jako C.
- 6. Polypeptid podle nároku 1, kde X^ znamená sekvenci pěti aminokyselin se strukturou EDCBA, kde A, B, C a D mají výše uvedené významy a E má týž význam jako C.
- 7. Polypeptid podle nároku 1, kde X^ znamená sekvenci šesti aminokyselin se strukturou FEDCBA, kde A, B, C, D a E mají výše uvedené významy a F má týž význam jako C.
- 8. Polypeptid podle nároku 1, kde X4 znamená Glu nebo Asp.
- 9. Polypeptid podle nároku 1, kde X4 znamená sekvenci dvou aminokyselin se strukturou AB, kde A znamená Glu nebo Asp a B znamená Glu, Asp, Val, Gly nebo Leu,
- 10. Polypeptid podle nároku 1, kde X4 znamená sekvenci tři aminokyselin se strukturou ABC, kde A a B mají výše uvedené významy a C znamená Glu, Asp, Pro, Gly, Val, Leu, Arg nebo Lys.
- 11. Polypeptid podle nároku 1, kde X2* znamená sekvenci čtyř aminokyselin se strukturou ABCD, kde A, B a C mají výše uvedené významy a D má stejný význam jako C.
- 12. Polypeptid podle nároku 1, kde X4 znamená sekvenci pěti aminokyselin se strukturou ABCDE, kde A, B, C a D mají výše uvedené významy a E má týž význam j ako C.
- 13. Polypeptid podle nároku 1, kde X4 znamená sekvenci šesti aminokyselin se strukturou ABCDEF, kde A, B, C, D a E mají výše uvedené významy a F má stejný význam jako C.
- 14. Polypeptid podle nároku 1, kde - pokud X^ a/nebo X4 znamená více než jednu aminokyselinu, pak aminokyselinou bezprostředně sousedící s X je Glu nebo Asp, αaminokyselinou bezprostředně sousedící s X je Glu nebo Asp nebo v obou případech Glu nebo Asp.
- 15. Polypeptid podle nároku 1, kde - pokud X^ a/nebo X4 znamenají více než jednu aminokyselinu, buď X^ nebo X4 nebo oba tyto symboly znamenají více než jednu Glu či Asp.
16. Polypeptid podle nároku 1, kde χΐ a X4 v obou případech znamenaj i j ednu aminokyselinu nebo více než jednu aminokyselinu. 17. Polypeptid podle totožné. nároku 16, kde χΐ a X4 jsou symetricky 18. Polypeptid podle nároku 1, kde pokud X4 znamená jednu nebo více aminokyselin, je vsunuto přídavné procesní místo mezi X4 a N-konec heterologního peptidu. - 19. Polypeptid podle nároku 1, kde signálním peptidem je signální peptid α-faktoru, signální peptid myš^í slinné-úsignální peptid nebo amylasy, karboxypeptidasový kvasinkový BARI signální peptid.
- 20. Polypeptid podle nároku 1, kde vedoucím peptidem je některý z přírodních vedoucích peptidů, jako je vedoucí peptid a-faktoru.
- 21. Polypeptid podle nároku 1, kde vedoucím peptidem je syntetický vedoucí peptid, jako jeA. Ala-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Ser-Leu-Ile-Gly-Phe-Leu-Asp-Leu-Ala-Gly-Glu-Glu-Ile-Ala-Glu-Asn-Thr-Thr-Leu-Ala.B. Ala-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Ser- Leu- Ile - Ile-Ala-Glu-Asn-Thr-Thr-Leu-Ala.C. Ala-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-Glu-Ile-Pro-Ile-Ala-Glu-Asn-Thr-Thr-Leu-Ala.D. Ala-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-Glu- Ile-Pro-Glu-Glu-Ser-Leu- Ile - Ile-Ala-Glu-Asn-Thr-Thr-Leu-Ala-Asn-Val -Ala-Met-Ala aE. Gln-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Ser-Leu-Ile-Ile-Ala-Glu-Asn-Thr-Thr-Leu-Ala-Asn-Val-Ala-Met-Ala.
- 22. Polypeptid podle nároku 1, kde heterologní protein nebo polypeptid je zvolen ze skupiny, zahrnující aprotinin či další inhibitory proteázy, inzulín a jeho prekurzory, lidské nebo hovězí růstové hormony, interleukin, aktivátor tkáňového plazminogenu, glukagon, faktor VII, faktor VIII, faktor XIII, destičkový růstový faktor, enzymy a funkční analog kteréhokoli z uvedených proteinů.-fí
- 23. Polypeptid podle nároku 22, kde heterologní^ proteinem nebo polypeptidem je aprotinin nebo jeho funkční obdoba.
- 24. Polypeptid podle nároku 23, kde znamenáGlu-Arg-Leu-Glu nebo Lys-Glu-Leu-Glu.
- 25. Polypeptid podle nároku 23, kde znamená Glu-Leu neboGlu-Leu-Asp-Leu.
- 26. Polypeptid podle nároku 22, kde heterologním proteinem nebo polypeptidem je inzulín nebo j=eSo prekurzory inzulínu nebo jejich funkční obdoba.
- 27. Polypeptid podle nároku 26, kde znamenáGlu-Arg-Leu-Glu nebo Lys-Glu-Leu-Glu.
- 28. Polypeptid podle nároku 26, kde X^ znamená Glu.
- 29. Polypeptid podle kteréhokoli z nároků 26-28, kde heterologním proteinem nebo polypeptidem je prekurzor inzulínového analogu B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-29), kde X^ znamená Lys-Glu-Leu-Glu.
- 30. Polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 26 až 28, v němž heterologním proteinem nebo polypeptidem je prekurzor inzulínového analogu B(l-29)-Ser-Asp-Asp-Ala-Lys-A(l-29), v níž χΐ znamená Lys-Glu-Leu-Glu.
- 31. Konstrukce DNA obsahující sekvenci DNA sc^za^óďovaným polypeptidem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 30.
- 32. Konstrukce DNA podle nároku 31, obsahující sekvenci DNA podle obrázku 4, 7, 9 nebo 11.
- 33, Rekombinantní expresní vektor nesoucí konstrukci DNA podle nároku 31 nebo 32, vybraný ze skupiny zahrnující pKFN-802, pKFN-803, pKFN-849, pKFN-855, pKFN-852, pKFN-858, pKFN-995, pKFN-998, pKFN-1000, pKFN-1003, £<4/ chr. 2 i 3 f C i á. to ·
- 34. Rekombinantní expresní vektor nesoucí konstrukci DNA podle nároku 31 nebo 32 vybraný ze skupiny(zahrnující pKFN-305, pKFN-374, pMT-636 a pLaC-240, j^kvívfžieno na obxázoích-; e
- 35. Kmen kvasinek, schopný exprese heterologního proteinu nebo polypeptidu, který je transformován vektorem podle nároku 33.
- 36. Způsob výroby polypeptidu v buňce., vyznačující se tím, že zahrnuje kultivování kmene kvasinek podle nároku 35 v živném prostředí za exprese a sekrece vznikajícího heterologního proteinu nebo polypeptidu, načež se protein nebo polypeptid izoluji z prostředí.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK105489A DK105489D0 (da) | 1989-03-03 | 1989-03-03 | Polypeptid |
| DK494189A DK494189D0 (da) | 1989-10-06 | 1989-10-06 | Polypeptid |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ103990A3 true CZ103990A3 (cs) | 1999-03-17 |
| CZ285239B6 CZ285239B6 (cs) | 1999-06-16 |
Family
ID=26065137
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS901039A CZ285239B6 (cs) | 1989-03-03 | 1990-03-02 | Polypeptid, konstrukce DNA, rekombinantní expresní vektor a způsob výroby heterologního polypeptidu a kmen kvasinek k tomuto účelu |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US5395922A (cs) |
| EP (1) | EP0461165B2 (cs) |
| JP (1) | JP2609367B2 (cs) |
| KR (1) | KR970005928B1 (cs) |
| AT (1) | ATE110414T1 (cs) |
| AU (1) | AU624694B2 (cs) |
| CA (1) | CA2050336C (cs) |
| CZ (1) | CZ285239B6 (cs) |
| DD (1) | DD296965A5 (cs) |
| DE (1) | DE69011853T3 (cs) |
| DK (2) | DK105489D0 (cs) |
| ES (1) | ES2062514T5 (cs) |
| FI (1) | FI104985B (cs) |
| HU (2) | HU215538B (cs) |
| IE (1) | IE66469B1 (cs) |
| IL (1) | IL93609A (cs) |
| NO (2) | NO304236B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ232742A (cs) |
| PL (1) | PL163532B1 (cs) |
| RU (1) | RU2194758C2 (cs) |
| UA (1) | UA27706C2 (cs) |
| WO (1) | WO1990010075A1 (cs) |
| ZA (1) | ZA901476B (cs) |
Families Citing this family (72)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5591603A (en) * | 1987-08-28 | 1997-01-07 | Novo Nordisk A/S | Process for preparing aprotinin and aprotinin analogs in yeast cells |
| DK105489D0 (da) * | 1989-03-03 | 1989-03-03 | Novo Nordisk As | Polypeptid |
| WO1990014431A1 (en) * | 1989-05-19 | 1990-11-29 | Biotechnology Research And Development Corporation | Fusion proteins having an in vivo post-translational modification site and methods of manufacture and purification |
| GB9015825D0 (en) * | 1990-07-18 | 1990-09-05 | Ciba Geigy Ag | In vitro processing of fusion proteins |
| DK300090D0 (da) * | 1990-12-19 | 1990-12-19 | Novo Nordisk As | Fremgangsmaade til fremstilling af leadersekvenser |
| GB9106185D0 (en) * | 1991-03-22 | 1991-05-08 | Wellcome Found | Biological control agents |
| FR2686899B1 (fr) * | 1992-01-31 | 1995-09-01 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant. |
| FI92601C (fi) * | 1992-03-11 | 1994-12-12 | Marja Makarow | Menetelmä hyötyproteiinien erittämiseksi hiivoista |
| US5521086A (en) * | 1993-09-16 | 1996-05-28 | Cephalon, Inc. | Secretion sequence for the production of a heterologous protein in yeast |
| DE4417353A1 (de) * | 1994-05-18 | 1996-01-25 | Bayer Ag | Verfahren zur Herstellung von rekombinantem Aprotinin und rekombinanten Aprotinin Varianten mit der natürlichen N-terminlaen Sequenz |
| IL114160A (en) * | 1994-06-17 | 2006-12-31 | Novo Nordisk As | Dna constructs encoding heterologous proteins and processes for the heterologous protein production in yeast |
| US6500645B1 (en) | 1994-06-17 | 2002-12-31 | Novo Nordisk A/S | N-terminally extended proteins expressed in yeast |
| US5861267A (en) * | 1995-05-01 | 1999-01-19 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Methods, nucleotide sequences and host cells for assaying exogenous and endogenous protease activity |
| ZA9610456B (en) * | 1995-12-20 | 1997-06-20 | Novo Nordisk As | N-terminally extended proteins expressed in yeast |
| US5851800A (en) * | 1996-05-14 | 1998-12-22 | Pharmacia & Upjohn Ab | Process for producing a protein |
| DE19629982A1 (de) | 1996-07-25 | 1998-01-29 | Bayer Ag | Aprotinin-Varianten mit verbesserten Eigenschaften |
| EP1365028B1 (en) | 1996-12-13 | 2009-03-18 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Method for expression of PDGF or IGF proteins in yeast |
| AU7873798A (en) * | 1996-12-20 | 1998-07-17 | Novo Nordisk A/S | N-terminally extended proteins expressed in yeast |
| EP0954589A1 (en) * | 1997-01-24 | 1999-11-10 | Novo Nordisk A/S | Synthetic leader peptide sequences |
| US6046000A (en) * | 1997-11-07 | 2000-04-04 | Millennium Biotherapeutics, Inc. | Method for identifying genes encoding signal sequences |
| KR20010034305A (ko) | 1998-01-23 | 2001-04-25 | 한센 핀 베네드 | 효모에서 원하는 폴리펩티드를 만드는 방법 |
| CN1415019A (zh) | 1999-12-29 | 2003-04-30 | 诺沃挪第克公司 | 用于生产在酵母中具有改进发酵产量的胰岛素前体和胰岛素前体类似物的方法 |
| US20050100991A1 (en) * | 2001-04-12 | 2005-05-12 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| CA2405557C (en) | 2000-04-12 | 2013-09-24 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| US20050054051A1 (en) * | 2001-04-12 | 2005-03-10 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| US7507413B2 (en) * | 2001-04-12 | 2009-03-24 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| US7595172B2 (en) | 2001-07-24 | 2009-09-29 | Novo Nordisk A/S | Method for making acylated polypeptides |
| AU2002364587A1 (en) | 2001-12-21 | 2003-07-30 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| EP2261250B1 (en) | 2001-12-21 | 2015-07-01 | Human Genome Sciences, Inc. | GCSF-Albumin fusion proteins |
| US7309505B2 (en) | 2002-09-13 | 2007-12-18 | Cornell Research Foundation, Inc. | Using mutations to improve Aspergillus phytases |
| EP1594530A4 (en) | 2003-01-22 | 2006-10-11 | Human Genome Sciences Inc | HYBRID PROTEINS OF ALBUMIN |
| JP2007532096A (ja) | 2003-11-14 | 2007-11-15 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | アシル化されたインスリンの製造方法 |
| CN102816228A (zh) | 2003-12-03 | 2012-12-12 | 诺和诺德公司 | 单链胰岛素 |
| WO2007020256A1 (en) | 2005-08-16 | 2007-02-22 | Novo Nordisk A/S | Method for making mature insulin polypeptides |
| US8722620B2 (en) | 2006-02-27 | 2014-05-13 | Novo Nordisk A/S | Insulin derivatives |
| US20080026376A1 (en) * | 2006-07-11 | 2008-01-31 | Huaming Wang | KEX2 cleavage regions of recombinant fusion proteins |
| US8198046B2 (en) | 2006-07-11 | 2012-06-12 | Danisco Us Inc. | KEX2 cleavage regions of recombinant fusion proteins |
| HUE029512T2 (en) | 2006-09-22 | 2017-03-28 | Novo Nordisk As | Protease Resistant Insulin Analogs |
| JP5503968B2 (ja) | 2006-09-27 | 2014-05-28 | ノボ・ノルデイスク・エー／エス | 成熟インスリンポリペプチドの作製方法 |
| ES2425413T3 (es) | 2006-11-22 | 2013-10-15 | Novo Nordisk A/S | Método para preparar carboxipeptidasa activada |
| JP5688969B2 (ja) | 2007-07-16 | 2015-03-25 | ノボ・ノルデイスク・エー／エス | プロテアーゼに対して安定しているペグ化インスリンアナログ |
| ES2558930T3 (es) | 2007-08-13 | 2016-02-09 | Novo Nordisk A/S | Análogos de la insulina de acción rápida |
| EP2178912B1 (en) | 2007-08-15 | 2015-07-08 | Novo Nordisk A/S | Insulin analogues with an acyl and aklylene glycol moiety |
| ES2526924T3 (es) | 2007-08-15 | 2015-01-16 | Novo Nordisk A/S | Insulinas con una fracción acilo que comprende unidades repetitivas de aminoácidos que contienen alquilenglicol |
| US8501449B2 (en) | 2007-12-04 | 2013-08-06 | Proteon Therapeutics, Inc. | Recombinant elastase proteins and methods of manufacturing and use thereof |
| WO2009115469A1 (en) | 2008-03-18 | 2009-09-24 | Novo Nordisk A/S | Protease stabilized, acylated insulin analogues |
| WO2009121884A1 (en) | 2008-04-01 | 2009-10-08 | Novo Nordisk A/S | Insulin albumin conjugates |
| CA2755300A1 (en) * | 2009-03-12 | 2010-09-16 | Bigtec Private Limited | A polynucleotide and polypeptide sequence and methods thereof |
| PT2612677E (pt) | 2009-06-26 | 2015-09-10 | Novo Nordisk As | Preparação compreendendo insulina, nicotinamida e arginina |
| CN102639559B (zh) | 2009-11-25 | 2015-04-29 | 诺沃—诺迪斯克有限公司 | 用于制备多肽的方法 |
| CN102791730A (zh) | 2010-01-22 | 2012-11-21 | 诺沃—诺迪斯克有限公司 | 低度o-糖基化的fgf21的制备方法 |
| WO2011161125A1 (en) | 2010-06-23 | 2011-12-29 | Novo Nordisk A/S | Insulin derivatives containing additional disulfide bonds |
| CN102933599A (zh) | 2010-06-23 | 2013-02-13 | 诺沃—诺迪斯克有限公司 | 包含额外的二硫键的人胰岛素 |
| EP2585484A1 (en) | 2010-06-23 | 2013-05-01 | Novo Nordisk A/S | Insulin analogues containing additional disulfide bonds |
| JP2014501239A (ja) | 2010-12-14 | 2014-01-20 | ノヴォ ノルディスク アー／エス | インスリン、ニコチンアミドおよびアミノ酸を含む製剤 |
| EP2651432A1 (en) | 2010-12-14 | 2013-10-23 | Novo Nordisk A/S | Fast-acting insulin in combination with long-acting insulin |
| EP2720711A1 (en) | 2011-06-15 | 2014-04-23 | Novo Nordisk A/S | Multi substituted insulins |
| RU2460795C1 (ru) * | 2011-07-06 | 2012-09-10 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") | Способ микробиологического синтеза секретируемого соматотропина человека и штамм дрожжей saccharomyces cerevisiae - продуцент секретируемого соматотропина человека |
| WO2013186138A1 (en) | 2012-06-14 | 2013-12-19 | Novo Nordisk A/S | Preparation comprising insulin, nicotinamide and arginine |
| EP2925345B1 (en) | 2012-12-03 | 2018-09-05 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Method for making o-glycosylated carboxy terminal portion (ctp) peptide-based insulin and insulin analogues |
| CN103254277B (zh) * | 2013-05-03 | 2017-02-08 | 南京工业大学 | 强分泌性信号肽增强小肽模序及其应用 |
| JP2016521701A (ja) | 2013-06-07 | 2016-07-25 | ノヴォ ノルディスク アー／エス | 成熟インスリンポリペプチドを作製するための方法 |
| PL233560B1 (pl) | 2014-12-05 | 2019-10-31 | Mabion Spolka Akcyjna | Sposób otrzymywania insuliny lub analogu insuliny z prekursora rekombinowanego białka |
| US10562951B2 (en) | 2015-03-10 | 2020-02-18 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Process for preparing recombinant insulin using microfiltration |
| EP3303380B1 (en) | 2015-06-02 | 2020-01-15 | Novo Nordisk A/S | Insulins with polar recombinant extensions |
| JP2018531901A (ja) | 2015-08-25 | 2018-11-01 | ノヴォ ノルディスク アー／エス | 新規インスリン誘導体及びその医学的使用 |
| WO2017032797A1 (en) | 2015-08-25 | 2017-03-02 | Novo Nordisk A/S | Novel insulin derivatives and the medical uses hereof |
| JP2018531900A (ja) | 2015-08-25 | 2018-11-01 | ノヴォ ノルディスク アー／エス | 新規インスリン誘導体及びその医学的使用 |
| KR102043067B1 (ko) * | 2017-08-08 | 2019-11-11 | 엘지전자 주식회사 | 차량용 사이드 미러 및 차량 |
| CN111032685A (zh) | 2017-08-17 | 2020-04-17 | 诺沃挪第克公司 | 新型酰化胰岛素类似物及其用途 |
| CA3159114A1 (en) | 2019-12-11 | 2021-06-17 | Frantisek Hubalek | Novel insulin analogues and uses thereof |
| WO2023144240A1 (en) | 2022-01-26 | 2023-08-03 | Novo Nordisk Research Centre Oxford Limited | Glucose sensitive insulin derivatives and uses thereof |
Family Cites Families (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU5712580A (en) * | 1979-04-05 | 1980-10-09 | James Joseph Connell | Engine charging and scavenging |
| US4546082A (en) * | 1982-06-17 | 1985-10-08 | Regents Of The Univ. Of California | E. coli/Saccharomyces cerevisiae plasmid cloning vector containing the alpha-factor gene for secretion and processing of hybrid proteins |
| JPS60501140A (ja) * | 1983-04-22 | 1985-07-25 | アムジエン | 酵母による外因性ポリペプチドの分泌 |
| US4588684A (en) * | 1983-04-26 | 1986-05-13 | Chiron Corporation | a-Factor and its processing signals |
| DK58285D0 (da) * | 1984-05-30 | 1985-02-08 | Novo Industri As | Peptider samt fremstilling og anvendelse deraf |
| JPS61264000A (ja) * | 1985-03-21 | 1986-11-21 | イミユネツクス コ−ポレイシヨン | 標識ペプチドによるタンパク質の合成 |
| JPS6236183A (ja) * | 1985-06-20 | 1987-02-17 | ザ・サルク・インステイチユ−ト・バイオテクノロジ−／インダストリアル・アソシエイツ・インコ−ポレ−テツド | サツカロミセス・セレビシエからのポリペプチドの発現および分泌 |
| MC1834A1 (fr) * | 1986-07-10 | 1988-06-03 | Transgene Sa | Bloc fonctionnel d'adn et plasmide codant pour l'hirudine,levure transformee,procede de preparation de l'hirudine,hirudine obtenue et son utilisation |
| US4987070A (en) * | 1987-03-04 | 1991-01-22 | Suntory Limited | Use of a 97 amino acid leader sequence from the E. coli B-galactosidase gene for the production of hanp and hptc as fusion proteins |
| AU1987088A (en) * | 1987-06-24 | 1989-01-19 | Novo Nordisk A/S | A process for preparing a protein or polypeptide, a dna sequence coding for the polypeptide, a microorganism containing the dna sequence as well as the polypeptide and its use as a pharmaceutical preparation |
| DK450187D0 (da) * | 1987-08-28 | 1987-08-28 | Novo Industri As | Fremgangsmaade til fremstilling af proteiner |
| DK463887D0 (da) * | 1987-09-07 | 1987-09-07 | Novo Industri As | Gaerleader |
| JPH01240191A (ja) * | 1988-02-16 | 1989-09-25 | Green Cross Corp:The | 酵母で機能する新規シグナルペプチドおよびこれを用いた異種蛋白質の分泌発現 |
| DK336188D0 (da) * | 1988-06-20 | 1988-06-20 | Nordisk Gentofte | Propeptider |
| EP0387319B1 (en) * | 1988-07-23 | 1996-03-06 | Delta Biotechnology Limited | Secretory leader sequences |
| DK105489D0 (da) * | 1989-03-03 | 1989-03-03 | Novo Nordisk As | Polypeptid |
-
1989
- 1989-03-03 DK DK105489A patent/DK105489D0/da not_active Application Discontinuation
-
1990
- 1990-02-27 ZA ZA901476A patent/ZA901476B/xx unknown
- 1990-03-01 WO PCT/DK1990/000058 patent/WO1990010075A1/en active IP Right Grant
- 1990-03-01 DK DK90904258.2T patent/DK0461165T3/da active
- 1990-03-01 KR KR1019910701029A patent/KR970005928B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1990-03-01 CA CA002050336A patent/CA2050336C/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-03-01 RU SU5010019/13A patent/RU2194758C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1990-03-01 ES ES90904258T patent/ES2062514T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-01 EP EP90904258A patent/EP0461165B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-01 UA UA5010019A patent/UA27706C2/uk unknown
- 1990-03-01 JP JP2504527A patent/JP2609367B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-01 NZ NZ232742A patent/NZ232742A/xx unknown
- 1990-03-01 AT AT90904258T patent/ATE110414T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-03-01 HU HU902376A patent/HU215538B/hu not_active IP Right Cessation
- 1990-03-01 DE DE69011853T patent/DE69011853T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-01 AU AU52612/90A patent/AU624694B2/en not_active Ceased
- 1990-03-02 IL IL9360990A patent/IL93609A/en not_active IP Right Cessation
- 1990-03-02 DD DD90338353A patent/DD296965A5/de unknown
- 1990-03-02 PL PL90284146A patent/PL163532B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1990-03-02 CZ CS901039A patent/CZ285239B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1990-03-02 IE IE74990A patent/IE66469B1/en not_active IP Right Cessation
-
1991
- 1991-09-02 NO NO913427A patent/NO304236B1/no unknown
- 1991-09-02 FI FI914125A patent/FI104985B/fi not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-02-15 US US08/196,887 patent/US5395922A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-03-02 US US08/397,595 patent/US5510249A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-02 US US08/397,597 patent/US5514585A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-29 HU HU95P/P00592P patent/HU211600A9/hu unknown
-
1997
- 1997-10-23 NO NO974899A patent/NO974899D0/no unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ103990A3 (cs) | Polypeptid, konstrukce DNA, rekombinantní expresní vektor a způsob výroby heterologního polypeptidu a kmen kvasinek k tomuto účelu | |
| JP3730255B2 (ja) | イーストにおいて発現されたｎ末端に伸長した蛋白質 | |
| FI104564B (fi) | Peptidi ja DNA-sekvenssit | |
| JP3085973B2 (ja) | 組換え酵母による成熟タンパク質の分泌に関するシグナルペプチドについてコードする配列として新規ｄｎａ断片の適用、発現カセット、形質転換酵母及びそれに対応するタンパク質の製造方法 | |
| JPH10501413A (ja) | 合成リーダーペプチド配列類 | |
| PL178924B1 (pl) | Konstrukt DNA, zrekombinowany wektor ekspresji, komórka transformowana i sposób wytwarzania heterologicznego polipeptydu | |
| HU206518B (en) | Process for producing new insuline analogues and pharmaceutical compositions containing them | |
| US20110111460A1 (en) | Method for Making Mature Insulin Polypeptides | |
| NO180593B (no) | Fremgangsmåte for fremstilling, i Saccharomyces cerevisiae, av et heterologt protein i homogen form | |
| US6358705B1 (en) | Method of making proteins in transformed yeast cells | |
| EP0375718B1 (en) | Process for the production of aprotinin and aprotinin homologues in yeast | |
| ES2242969T3 (es) | Vector para la expresion de proteinas con prolongacion n-terminal en celulas de levadura. | |
| EP1097228B1 (en) | Method of making proteins in transformed yeast cells | |
| DK171239B1 (da) | Fremgangsmåde til fremstilling af aprotinin eller homologer deraf, vektor der er i stand til at replicere i gær samt gærstamme | |
| CZ20015A3 (cs) | Rekombinantní exprimovaný kvasinkový vektor, způsob jeho získávání a transformovaná kvasinková buňka | |
| DK157938B (da) | Dna-sekvens for insulinprecursorer, vektorer indeholdende denne sekvens, gaerstammer transformeret med disse vektorer samt en fremgangsmaade til fremstilling af insulinprecursorerne og en fremgangsmaade til fremstilling af humaninsulin |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20060302 |