FI104564B - Peptidi ja DNA-sekvenssit - Google Patents

Peptidi ja DNA-sekvenssit Download PDF

Info

Publication number
FI104564B
FI104564B FI901428A FI901428A FI104564B FI 104564 B FI104564 B FI 104564B FI 901428 A FI901428 A FI 901428A FI 901428 A FI901428 A FI 901428A FI 104564 B FI104564 B FI 104564B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
leu
ser
phe
lys
arg
Prior art date
Application number
FI901428A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI901428A0 (fi
Inventor
Andrew Robert Goodey
Graham Paul Belfield
Darrell Sleep
Original Assignee
Delta Biotechnology Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB888817598A external-priority patent/GB8817598D0/en
Priority claimed from GB898906920A external-priority patent/GB8906920D0/en
Application filed by Delta Biotechnology Ltd filed Critical Delta Biotechnology Ltd
Publication of FI901428A0 publication Critical patent/FI901428A0/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI104564B publication Critical patent/FI104564B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/90—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification

Description

Peptidi- ja DNA-sekvenssit - Peptid och DNA-sekvenser 104564 Tämä keksintö kohdistuu erittäviin alukesekvensseihin, joita voidaan käyttää hetero-5 logisen proteiinin (kuten ihmisen seerumialbumiinin) sekreetion säätämiseen sienestä (esimerkiksi Saccharomyces cerevisiae -hiivasta).
Proteiinimolekyylien translokaatio bi-lipidimembraanien kautta toisesta soluosastos-ta toiseen riippuu tavallisesti proteiinin itsensä primaarisessa aminohapposekvens-10 sissä olevasta informaatiosta. Vallitsevin ja siten parhaiten luonnehdittu sekvenssi-informaatio on prokaiyoottisten ja eukaiyoottisten organismien aminoterminaalinen aluke- tai signaalisekvenssi. Geneettiset tutkimukset, joissa signaalisekvenssi on de-letoitu kokonaan tai laajasti, osoittavat, että signaalisekvenssi on oleellinen proteii-nitranslokaatiolle (Benson, S.A. et ai. 1985, Ann. Rev. Biochem. 54, 101-134). 15 Useista sadoista tunnetuista sekvensseistä (Watson, M.E.E., 1984, Nuc. Acid. Res. 12, 5145-5164) ei voida erottaa yhtään konsensus-signaalisekvenssiä tai edes absoluuttista aminohapon tarvetta missään tietyssä asemassa, vaikka monien alukesek-venssien yleisenä piirteenä on 7-10 hydrofobisen aminohapon ydin. Geneettiset manipuloinnit, jotka suoritetaan joko deletoimalla tai insertoimalla varattuja tähteitä ja 20 jotka johtavat hydrofobisen ytimen muutoksiin, saavat tavallisesti aikaan proteiinit-ranslokaation eston (Benson, S.A., et ai. 1985, Ann. Rev. Biochem. 54, 101-134). Lisäksi kananpojan lysotsyymialukesekvenssin laajassa modifikaatiosaijassa, Yamamoto et ai. 1987 (Biochem. and Biofys. Res. Comm. 149. 431-436) osoitettiin, että kun jotkin hydrofobisen ytimen muutokset voivat johtaa sekreetion lakkaami-·., 25 seen, toiset voivat voimistaa alukesekvenssitoimintaa saaden aikaan proteiinisekree- tion kohonneita tasoja.
Vaikkakin alukesekvenssi on tavallisesti proteiinien poikki membraanien translokaa-tiolle oleellinen, niin translokatoituneena nämä sekvenssit ovat tavallisesti endopro-30 teolyyttisesti entsyymien pilkkomia, jotka ensyymit sisältyvät soluosastoihin, joihin " '« proteiinit ovat siirtyneet. Nämä entsyymit tunnistavat translokatoituneen proteiinin primaarisessa rakenteessa olevat spesifiset aminohapposekvenssit. Lisäksi tiettyjen eukaiyoottisten proteiinien täydellinen käsitteleminen kypsäksi muodokseen riippuu proteolyyttisestä pilkontasarjasta (Bussey, H., 1988, Yeast 4, 17-26).
Yhdistelmä-DNA-tekniikan nykyisellä tasolla on saatu esiin lisääntyviä edellytyksiä sienten, erityisesti hiivojen, kaupalliseen käyttämiseen apuaineena erilaisten proteiinien tuottamisessa.
35 2 104564 ·
Koska monet näistä proteiineista on luonnollisesti eritettyjä tuotteita, on mahdollista käyttää alukesekvenssiin sisältyvää tietoa proteiinin ohjaamiseksi sekreetiopolkua. Tämä informaatio ei kuitenkaan sisälly peptidiin, joka on hiivalle vieras. Sen tunnistaminen ja sitä seuraava hiivaerityspolulla käsitteleminen eivät ole välttämättä niin 5 tehokkaita kuin homologisilla hiiva-alukesekvensseillä. Tästä johtuen vaihtoehtoisena keinona on ollut korvata alukesekvenssi luonnollisesti erittyneestä hiivaproteii-nista johdetulla sekvenssillä.
Eniten käytetty erittävä hiivasekvenssi on alfa-faktori-liitäntäferomonin 89 amino-10 happoalukesekvenssi. Tämän alukkeen käsittelemistä on tutkittu laajasti (Kurjan & Herskowitz, Cell 30, 933-943, 1982, Julius et ai. 1983, Cell 32, 839-852, Dmochowska et ai. Cell 50, 573-584, 1987, Julius et ai., Cell 36, 309-318, 1984, Julius et ai., Cell 37, 1075-1085, 1984) ja se edellyttää vähintään neljää geeni-tuotetta täydelliseen proteolyyttiseen pilkontaan kypsän 13 aminohappo-alfa-faktori-15 feromonin vapauttamiseksi.
Alfa-faktorin primaarisen translaatiotuotteen täydellinen proteolyyttinen pilkonta edellyttää, että ensin poistetaan N-terminaalinen 19 aminohapposignaalisekvenssi signaalipeptidaasin avulla solun kalvoverkossa. Tätä seuraava kolmen Golgin lait-20 teessä sijaitsevan geenituotteen jaksoittainen toiminta tuottaa suuren prekursorimo-lekyylin vapauttaen alfa-faktoriferomonin neljä kopiota. Nämä ovat KEX2-geeni-tuote, endopeptidaasi, joka pilkkoutuu Lys-Arg-kaksiemäksisen aminohappoparin jälkeen, karboksipeptidaasi-P-tyyppinen pilkkouma, joka on äskettäin identifioitu KEX1-geenin tuotteeksi, ja dipeptidyyliaminopeptidaasi, STE12-geenin tuote, joka 25 poistaa jaksoittain Glu-Ala- tai Asp-Ala-diaminohappoparin, joka on kypsän alfa-faktoriferomonin edellä.
Alfa-faktori-prepro-alukesekvenssiä on käytetty menetyksellä erilaisten proteiinien ja peptidien erittämiseen. Kun alfa-faktorisignaalia käytetään ihmisen seerumialbu-30 miinin sekreetion ohjaamiseen, on kuitenkin havaittu, että suuri osa tuotetusta solun-ulkoisesta HSA.sta on 45 KD:n N-terminaalisena fragmenttina.
EP-A-252 56l:ssä selostetaan Kluyveromyces lactisin tappajatoksiinista peräisin j olevan 16 aminohapposignaalipeptidin (pre-sekvenssi) käyttö heterologisten prote- j 35 iinien sekreetion auttamiseksi hiivassa.
3 104564
Toinen mahdollisuus on käyttää erittävää fuusioalukesekvenssiä. Se voidaan generoida fuusioimalla kaksi itsenäistä sekvenssiä. Hybridisignaali, jossa happofosfataa-sisignaalin ensimmäiset aminohapot fuusioitiin ihmisen alfa-interferonin proteolyyt-tiseen pilkkoutumispaikkaan, sai aikaan interferonin ekspression ja sekreetion 5 (Hinnen et ai., Foundation for Biochemical and Industrial Fermentation Research, 229, 1219-1224, 1983); 10 % tuotettua interferonia erittyi väliaineeseen. Samanlaisessa tutkimuksessa alfa-faktorialukkeen ensimmäiset 22 aminohappoa fuusioitiin ihmisen interferoni-alfa-2-signaalisekvenssin viimeiseen 12 aminohappoon, jolloin saatiin aikaan interferoni-alfa-2:n sekreetio viljelysupematanttiin (Piggott et ai., 10 Curr. Genet. 12, 561-567, 1987). Identtinen konstruointi, jossa interferoni-alfa-2-geeni korvattiin interferoni-p-geenillä, ei saanut aikaan minkäänlaista ihmisen interferoni^ :n sekreetiota viljelysupematanttiin. Sarjassa kokeita, joiden tarkoituksena oli todeta alukesekvenssien vaikutus ihmisen lysotsyymin sekreetioon, Yoshimura et ai. (Biochem. & Biophys. Res. Comm. 145, 712-718, 1987) kuvasi fuusioaluketta, 15 joka käsittää kananpojan lysotsyymialukkeen ensimmäiset 9 aminohappoa ja Aspergillus awamori -glykoamylaasialukkeen viimeiset 9 aminohappoa. Vaikka tämä fiiusioaluke oli tehokas erittäen 60 % tuotetusta materiaalista viljelysupematanttiin, se oli vain 15 % niin tehokas kuin kokonainen kananpojan lysotsyymialuke. Sitä paitsi mitään erittynyttä tuotetta ei voitu havaita, kun ihmisen lysotsyymisekvenssejä 20 edelsi kokonainen Aspergillus-glykoamylaasi-aluke, tai fuusio, joka oli johdettu As- pergillus-glykoamylaasi-alukkeen ensimmäisestä 9 aminohaposta ja kananpojan lysotsyymialukkeen viimeisestä 9 aminohaposta.
Nyt on saatu aikaan uusia ja edullisia alukesekvenssejä sienissä käytettäväksi.
25
Yhtäältä keksintö saa aikaan seuraavan aminohapposekvenssin:
(a) IkN-Met-Lys-Trp-Val-Ser-Phe-Ile-Ser-Leu-Leu-Phe-Leu-Phe-Ser-Ser-Ala-Tyr-S er-Arg- S er-Leu-Asp-Lys-Arg-COOH
30 tai ^ ·
(b) H2N-Met-Asn-Ile-Phe-Tyr-Ile-Phe-Leu-Phe-Leu-Leu-Ser-Phe-Val-Gln-Gly-Ser-Leu-Asp-Lys-Arg-COOH
tai jommankumman sekvenssin konservatiivisesti modifioituja muunnelmia.
Taulukko 1 esittää vaihtoehtoisia aminohappoja kutakin asemaa varten paitsi alku-metioniinia. Mikä tahansa mahdollisista permutaatioista kuuluu keksinnön piiriin.
35 4 104564 .
Lysiinin tai arginiinin valitseminen kahteen viimeiseen asemaan ei ole erityisen kriittistä, vaikka kummassakin näistä asemista pitäisi aina olla Lys tai Arg. Edullisesti sekvenssin (a) asemat 20 ja 21 eivät ole Gly tai Vai. Sekvenssit, jotka ovat neljään aminohappoon saakka lyhempiä tai pidempiä, kuuluvat myös mukaan edel-5 lyttäen, että C-terminaali- (Lys, Arg), Lys-Lys- tai Arg-Arg-olemus säilytetään, että N-terminaalin 5 tähteessä on positiivinen tähde ja että sekvenssin keskellä tai sen vieressä on tavallisesti hydrofobinen alue.
Taulukko 1 10 Aluke (a) 1 10 Met Lys Tip Vai Ser Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser
Arg Phe Leu Thr Trp Leu Thr He He Tip Ile Trp Thr
His Tyr Ile Gly Tyr Vai Gly Vai Vai Tyr Vai Tyr Gly 15 Gin Met Ala Met Ala Met Met Met Ala
Asn 20
Ser Aa Tyr Ser Ag Ser Leu Asp Lys Ag 20 Thr Thr Phe Thr Lys Thr Ile Glu Ag Lys
Gly Gly Trp Gly His Gly Vai Asn
Aa Ser Aa Gin Aa Met Gin
Asn His | *' 25 Aluke (b)
Met Asn Ile Phe Tyr Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Phe Vai
Asp Leu Trp Phe Leu Trp Ile Trp Ile Ile Thr Trp Leu
Glu Vai Tyr Trp Vai Tyr Vai Tyr Vai Vai Gly Tyr Ile ; . 30 Gin Met Met Met Met Aa Aa Met . His
Gin Gly Ser Leu Asp Lys Ag
Asp Ser Thr Ile Asn Ag Lys e 35 Asn Thr Gly Vai Glu £ Glu Aa Aa Met Gin * His His 104564 5
Toinen kohde saa aikaan fuusioyhdisteen, joka sisältää minkä tahansa mainituista aminohapposekvensseistä kytkettynä, edullisesti suoraan, karboksyyliterminaalissa polypeptidin N-terminaaliseen tähteeseen. Polypeptidi voi olla minkä tahansa haluttu polypeptidi mukaan lukien "pro-polypeptidit" (toisin sanoen prekursorit, jotka 5 pilkotaan post-translationaalisesti tai modifioidaan muuten, kuten glykosyloidaan). Termi "polypeptidi" käsittää oligopeptidit. Polypeptidi voi olla fibronektiini tai sen osa (esimerkiksi kollageeni tai fibriiniä sitovat osat, jotka on kuvattu EP-207 751:ssä, urokinaasi, prourokinaasi, CD4:n 1-368-osa (D. Smith et ai. (1987) Science 328. 1704-1070,) verihiutaleista johdettu kasvutekijä (Collins et ai. (1985) Nature 10 316. 748-750), transformoiva kasvutekijä β (Derynck et ai. (1985) Nature 316. 701- 705), Von Willebrand -tekijän 1-272-osa (Bontham et ai., Nucl Acids Res. J4, 7125-7127), fibronektiinin Cathepsin D -fragmentti (585-1578), cci-antitrypsiini, plasminogeeniaktivaattori-inhibiittorit, faktori VIII, a-globiini, β-globiini, myoglo-biini tai hermokasvutekijä tai minkä tahansa näistä konservatiivinen variantti. Poly-15 peptidi voi olla myös HSA.n tai sen N-terminaalisen osan ja minkä tahansa muun polypeptidin, kuten niiden, jotka on mainittu edellä, fuusio. Polypeptidi on edullisesti luonnollisesti esiintyvä ihmisen seerumialbumiini, modifioitu ihmisen seeru-mialbumiini tai jommankumman fragmentti, jolloin tällaisia modifioituja muotoja ja fragmentteja nimitetään "varianteiksi". Nämä variantit käsittävät HSA:n kaikki muo-20 dot ja fragmentit, jotka toteuttavat vähintään yhden HS A:n fysiologisista funktioista ja jotka ovat riittävän samankaltaisia kuin HSA rakenteeltaan (erityisesti tertiaarinen rakenne), jotta asiantuntija pitää niitä HSA:n muotoina tai fragmentteina.
Erityisesti HSA.n variantit tai fragmentit, jotka säilyttävät vähintään 50 % ligandia !!. 25 sitovista ominaisuuksista, esimerkiksi bilirubiinin tai rasva-happojen suhteen (edul lisesti 80 % tai 95 %) sisältyvät tähän. Näitä ominaisuuksia selostavat Brown, J.R & Shockley, P. (1982) Lipid-Protein Interactions i, 26-68, toim. Jost, P C. & Griffith, OH.
30 EP-322 094:ssä selostettu HSA.n osa on esimerkki HSA.n käyttökelpoisesta frag- mentista, jota voidaan erittää käyttämällä keksinnön mukaisia alukesekvenssejä.
Kolmas kohde saa aikaan nukleotidisekvenssin, joka koodaa mitä tahansa mainituista aminohapposekvensseistä tai mainittua fuusioyhdistettä. Nukleotidisekvenssi (sen 35 alukesekvenssiä koodaava osa) voidaan valita taulukoissa 2 ja 3 esitetyistä mahdollisuuksista, esimerkiksi sekvenssit (a) ja (b), joissa kutakin aminohappoa koodaavat kodonit on lueteltu aminohappojen alla. Taulukon 2 ja 3 kodonit liittyvät RNA.han, 6 104564 mutta on ymmärrettävä, että ekvivalenttiset DNA-nukleotidisekvenssit kuuluvat myös keksinnön tämän kohteen piiriin.
Taulukko 2
5 Met Lys Tip Vai Ser Phe He Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser AUG AAA UGG GUU UCU UUU AUU UCU UUA UUA UUU UUA UUU UCU AAG GUC UCC UUC AUC UCC UUG UUG UUC UUG UUC UCC
GUAUCA AUAUCACUUCUU CUU UCA
GUGUCG UCGCUCCUC CUC UCG
10 AGU AGUCUACUA CUA AGU
AGC AGCCUGCUG CUG AGC
Ser Ala Tyr Ser Arg Ser Leu Asp Lys Arg UCU GCU UAU UCU CGU UCU UUA GAU AAA CGU 15 UCC GCC UAC UCC CGC UCC UUG GAC AAG CGC UCAGCA UCA CGA UCA CUU CGA
UCG GCG UCG CGG UCG CUC CGG
AGU AGU AGA AGU CUA AGA
AGC AGC AGG AGC CUG AGG
20
Taulukko 3
Met Asn Ile Phe Tyr Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Phe Vai AUG AAU AUU UUU UAU AUU UUU UUA UUU UUA UUA UCU UUU GUU AAC AUC UUC UAC AUC UUC UUG UUC UUG UUG UCC UUC GUC 25 AUA AUA CUU CUU CUU UCA GUA
CUC CUC CUC UCG GUG
CUA CUA CUA AGU CUG CUG CUG AGC
30 Gin Gly Ser Leu Asp Lys Arg
CAA GGUUCU UUA GAU AAA CGU CAG GGC UCC UUG GAC AAG CGC GGAUCA CUU CGA
GGGUCGCUC CGG
35 AGU CUA AGA
AGC CUG AGG
J
i 104564 7
Neljäntenä kohteena saadaan aikaan DNA-konstruktio, joka käsittää sopivan kontrollialueen tai -alueet ja edellä määritellyn nukleotidisekvenssin sekvenssin ollessa kontrollialueen kontrollin alainen. "Sopivalla kontrollialueella" tarkoitetaan sellaisia DNA-alueita, joita tarvitaan, jotta sanottu nukleotidisekvenssi voidaan ilmentää 5 isännässä, johon konstruktio on tarkoitettu. Kontrollialue käsittää tavallisesti transkriptionaaliset aloitus- ja lopetussekvenssit, 3'-polyadenylaatiosekvenssit, promoottorin ja usein vastavirta-aktivointipaikan promoottoria varten. Alan asiantuntija voi helposti valita ja koota sopivat alueet alalla saatavista. Kuitenkin sopivien eks-pressiovektoreiden ja niiden konstruoinnin spesifiset esimerkit käsittävät ne, jotka 10 on selostettu EP-198 745:ssä, GB-2 171 703:ssa (B. subtilikselle), EP-207 165:ssä, EP-116 201:ssä, EP-123 244:ssä, EP-123 544:ssä, EP-147 198:ssä, EP-201 239:ssä, EP-248 637:ssä, EP-251 744:ssä, EP-258 067:ssä, EP-286 424:ssä ja EP 322 094:ssä.
15 Viides kohde saa aikaan mainitulla DNA-rakenteella transformoidun isännän. Isäntä voi olla mikä tahansa isäntä, jossa rakenteen todetaan toimivan tarkoitustaan vastaavasti bakteerit, hiivat, rihmasienet, hyönteissolut, kasvisolut ja eläinsolut mukaan lukien. Isäntä on edullisesti kuitenkin Saccharomyces cerevisiae tai Schizosaccha-romyces pombe ensin mainitun ollessa edullisin. Koska moni luontainen sekreetio-20 signaali on tehokas hetorologisissa isännissä (esimerkiksi luonnollinen HSA-aluke-sekvenssi hiivassa), on täysin järkevää otaksua, että keksinnön mukaiset alukesek-venssit toimivat muissa isännissä kuin hiivassa.
Kuudes kohde saa aikaan polypeptidin valmistusmenetelmän, joka käsittää mainitun 25 isännän viljelemisen ja polypeptidin, joka on ilmennetty sanotulla nukleotidisek-venssillä, tai sen modifioidulla muunnoksella, isännästä talteenottamisen.
"Sen modifioidulla muunnoksella" tarkoitetaan varsinaista polypeptidiä, joka erotettuna voi olla modifioitu posttranslationaalisesti, erityisesti alukesekvenssin pilkon-30 nalla.
v
Seitsemäs kohde saa aikaan tällaisella menetelmällä valmistetun polypeptidin.
Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.
Jotta keksintöä voidaan ymmärtää helpommin, edullisia aspekteja valaistaan esimerkin avulla ja viitaten oheen liitettyihin piirroksiin, joissa: 35 8 104564 kuvio 1 on plasmidin pEKl 13 restriktiokartta, kuvio 2 on plasmidin pEK25 restriktiokartta, kuvio 3 on plasmidin pAYE230 restriktiokartta, kuvio 4 on plasmidin pAYE238 restriktiokartta, 5 kuvio 5 on plasmidin pAYE304 restriktiokartta, ja kuvio 6 on plasmidin pAYE305 restriktiokartta.
Esimerkki tekniikan tason mukaisesta alukesekvenssistä 10 Kypsän HSA-proteiinin DNA:ta koodaava sekvenssi on sijoitettu välittömästi myötävirtaan DNA-sekvenssistä, joka koodaa alfa-faktori-pre-pro-alukesekvenssiä (85 aminohappoa). Kun tämä proteiinisekvenssi sijoitetaan promoottorin kontrollin alaiseksi hiivassa, joka itsenäisesti replikoi plasmidin ja transformoidaan Saccharo-myces cerevisiae -hiivan haploidilajiin, voidaan kypsä DNA havaita viljelysupema-15 tantissa. N-terminaalinen aminohapposekvenssi-informaatio osoittaa, että erittyneellä proteiinilla on sama N-terminaalinen aminohappokoostumus kuin luonnollisella HSAdla, nimittäin Asp-Ala-His. Tämä osoittaa myös, että erittyneen HSA:n ensimmäiset kaksi aminohappoa eivät ole herkkiä dipeptidyyliendopeptidaasille, STE13-geenin tuotteelle, tämän entsyymin ollessa vastuussa tällaisten sekvenssien poista-20 misesta alfa-faktoriferomonin perättäisten toistojen välistä. Vaikka kypsä HSA on viljelysupematantista saatu päätuote, havaittiin myös HSA:n N-terminaalinen fragmentti (45 kilodaltonia), joka edustaa noin 15 % syntetoidusta kokonais-HSA:sta. Tämä fragmenttikomponentti ei edusta pelkästään sekreetiokyvyn hukkaa vaan myös tiettyjä myötävirtaan puhdistamisen ongelmia siinä, että HSA:n fragmenttina sillä on 25 joitakin biokemiallisia ja biofysikaalisia ominaisuuksia intaktin HSA:n kanssa.
j Esimerkki 1 }
Konstruoitiin fuusioaluke, jota voidaan pitää luonnollisena HSA-alukesekvenssinä, 30 josta on poistettu viimeiset viisi aminohappoa, jotka korvataan viidellä aminohapol-:* la, jotka edeltävät alfa-faktori-pre-pro-alukesekvenssin KEX2-pilkontapaikkaa, so.
aminohapot 81-85 ovat Ser-Leu-Asp-Lys-Arg (taulukko 2).
Kun hiiva transformoidaan sopivilla plasmidivektoreilla, jotka sisältävät fuusioaluk-35 keen, se erittää kypsää HSA:ta viljelysupematanttiin määrinä, jotka ovat verrattavissa niihin määriin, jotka on havaittu alfa-faktorialukesekvenssin yhteydessä. N-ter- a n 9 104564 minaalinen sekvenssianalyysi osoittaa, että kypsällä HSA.lla on oikea N-terminaali-nen aminohappokoostumus.
Alfa-faktorialukkeen substituoimisen fuusioalukesekvenssillä on havaittu aiheutta-5 van 6-kertaisen reduktion 45 kd fragmentin tasoissa, jotka on havaittu viljelysuper-natantissa. Tämä edustaa siten merkittävää parannusta kontaminoivien polypeptidien vähentämisessä ja auttaa täten kypsän HSA:n puhdistamista hiivaviljelmäsupema-tanteista.
10 Yksityiskohdat
Jollei toisin ole mainittu, suoritettiin kaikki menetelmät Maniatis et al.:n (1982) kuvaamalla tavalla. Plasmidi pEK113 (kuvio 1) (EP-A-248 637) hajotettiin täydellisesti restriktioendonukleaaseilla Mstll ja Hind III. DNA otettiin talteen uuttamalla 15 fenoli/kloroformilla ja etanolilla presipitoimalla. Linearisoitua plasmidi-DNA:ta käsiteltiin sitten E. colin DNA-polymeraasi I:n Klenow-fragmentilla linearisoidun tylppäpäisen DNA-molekyylin generoimiseksi.
Automatisoidulla Applied Biosystems Inc 380 B DNA-syntetoijalla konstruoitiin 20 seuraava oligonukleotididupleksi (I) (valmistajan ohjeiden mukaisesti).
Oligonukleotidi I
5' 3'
GGC TT A TAA GGA TCC TTA TAA GCC 25 CCG AAT ATT CCT AGG AAT ATT CGG
Oligonukleotididupleksiin ligatoitiin ekvimolaarinen määrä linearisoitua tylppäpäistä pEK113:a. E. coli -laji MC1061 transformoitiin ligaatioseoksella ja DNA:ta vastaanottavat solut valikoitiin ampisilliinia sisältävässsä väliaineessa (50 pg/ml ampi-30 silliinia). Oligonukleotididupleksia sisältävät yhdistelmäplasmidit seulottiin hajot-tamalla DNA, joka oli valmistettu yksittäisistä kolonioista restriktioendokleaasilla Mstll ja EcoRI. Täten muodostui plasmidi pEK25 (kuvio 2).
Plasmidi pEK25 hajotettiin täydellisesti restriktioendonukleaasilla Xbal ja BamHI, 35 DNA-fragmentit erotettiin elektroforeesilla 1 % (paino/til) agaroosiggeelin läpi ja 688 emäsparin Xbal-BamHI-DNA-fragmentti otettiin talteen elektroeluoimalla.
10 104564
Plasmidi mpl9.7 (EP-A-248 637) hajotettiin täydellisesti restriktioendonukleasilla Xhol. Linearisoitu DNA uutettiin fenoli/kloroformilla ja uutettiin etanolilla. Sitten talteenotettua DNA:ta käsiteltiin E. coli-DNA-polymeraasi I:n Klenow-fragmentilla, kuten edellä kuvattiin, minkä jälkeen DNA uutettiin fenoli/kloroformilla ja presipi-5 toitiin etanolilla. Sitten talteenotettu DNA hajotettiin täydellisesti XbaLllä ja hajo-tustuotteet erotettiin agaroosigeelielektroforeesilla. Geelistä otettiin talteen 1067 emäsparin fragmentti elektroeluaatiolla. Seuraava oligonukleotididupleksi (Π) valmistettiin kuten edellä kuvattiin.
10 Oligonukleotidi Π 5’
GATCC ATGAAGTGGGTAAGCTTT ATT TCC CTT CTT TTT CTC TAC TTC ACC CAT TCGAAATAA AGGGAAGAAAAAGAG
15 3'
TTT AGCTCG GCT TAT TCC AGGAGCTTG GAT AAAAGA AAATCG AGC CGAATA AGGTCC TCG AAC CTA TTT TCT
Plasmidi pUC19 (Yanisch-Perron et ai. 1985) hajotettiin täydellisesti restriktioen-20 donukleaasilla BamHI. Linearisoitu DNA otettiin talteen uuttamalla fenoli/kloroformilla ja presipitoimalla etanolilla.
Ekvimolaariset määrät BamHLllä hajotettua pUC19:ä, oligonukleotididupleksia 11, mpl9.7:stä johdettua 1067 emäsparin DNA-fragmenttia ja pEK25:stä johdettua 688 • 25 emäsparin DNA-fragmenttia ligatoitiin yhteen. E. coli DH5 transformoitiin ligatoi- dulla DNA:lla ja transformantit valikoitiin 50 μg/nιl ampisilliini-L-liemi-agarilla. Yhdistelmäkoloniat, jotka sisälsivät haluttua plasmidia, joka nimettiin pAYE 230:ksi (kuvio 3), valikoitiin hajotetulla DNA:lla, joka saatiin yksittäisistä kolonioista restriktioendonukleaasilla BamHI.
30 :* . Plasmidi pAYE 230 hajotettiin täydellisesti BamHLllä ja tuotteet erotettiin elektro foreesilla 1 % agaroosigeelin läpi. HSA:ta koodaavan sekvenssin sisältävä 1832 emäsparin fragmentti otettiin talteen elektroeluaatiolla.
35 Plasmidi pMA91 (Mellor et ai. 1983) hajotettiin täydellisesti BgllLlla standardiolo-suhteissa. Linearisoitu plasmidi uutettiin fenoli/kloroformilla ja presipitoitiin eta-: nolilla.
! 104564 11
Ekvivalenttiset määrät linearisoitua pMA91:ä ja pAYE 230:stä valmistettua DNA-fragmenttia ligatoitiin standardiolosuhteissa. E. coli DH5 transformoitiin ligatoin-tiseoksella ja DNA:ta vastaanottavat solut valikoitiin 50 pg/ml ampisilliinia sisältävässä L-liemiagarissa. Koloniat, jotka sisälsivät haluttua plasmidia, jonka nimettiin 5 pAYE 238:ksi (kuvio 4), valikoitiin hajottamalla tällaisista kolonioista peräisin oleva DNA PvuII.lla.
Plasmidi pAYE 238 transformoitiin hiivan Saccharomyces cerevisiae -lajiin S150-2B, kuten Hinnen et ai. (1978) ovat kuvanneet. pAYE 238:aa vastaanottavat solut 10 valikoitiin minimaalisessa väliaineessa, jota oli täydennetty 2 % (paino/til.) glukoosia, 20 mg/ml histidiiniä, 20 mg/ml tryptofaania ja 20 mg/1 urasiilia.
Transformoidut S150-2B-solut siirrostettiin 10 ml:aan YEPD-väliainetta, joka sisälsi 2 % (paino/til.) glukoosia, ja niitä inkuboitiin 30 °C:ssa 200 rpm.ssä 72 tuntia. 15 Soluttomat viljelysupematantit analysoitiin jaksoittaisella luonnollisella 8-25 % gradienttipolyakryyliamidigeelielektroforeesilla Pharmacia Phast Systemissä valmistajan ohjeiden mukaan. Solut värjättiin ja väri poistettiin ja suhteelliset määrät luontaista HSA:ta ja HSA-fragmenttia arvioitiin geeliskannauksella 595 nmissä 20 Esimerkki 2
Konstruoitiin myös toinen fuusioaluke, joka koostuu 97000 daltonin Kluyveromyces lactis -tappaja-(ORF 2)-toksiinin 16 aminohappo-pre-alueesta (Stark and Boyd, 1986, Tokumaga et ai. 1987) fuusioituneena viiteen alfa-faktori-prepro-alukesek-25 venssin KEX2-pilkontapaikkaa edeltävään aminohappoon, so. aminohapot 81-85, Ser-Leu-Asp-Lys-Arg (taulukko 3).
Kun hiiva transformoitiin taulukossa 3 kuvatun fuusioalukkeen sisältävillä plasmidi-vektoreilla, se eritti kypsää HSA:ta viljelysupematantteihin määränä, joka oli suu-30 rempi kuin mitä luonnollista K. lactis -prepro-tappajatoksiinialukesekvenssiä tai al-. fa-faktori-prepro-alukesekvenssiä käytettäessä. N-terminaalisen sekvenssin analyysi osoittaa, että kypsällä HSA:lla on oikea N-terminaalinen aminohappokoostumus.
Alfa-faktorialukkeen substituoiminen K. lactis -tappaja/alfa-faktorifuusioalukesek-35 venssillä sai aikaan viljelysupematantissa havaitun 45 kd fragmentin tasoissa 6-ker-taisen reduktion. Tämä edustaa siten merkittävää parannusta kontaminoivien poly- 12 104564 peptiden vähentämisessä, ja auttaa siten kypsän HSA:n puhdistamista hiivaviljelysu-pematanteista.
Yksityiskohdat 5
Kokeelliset menetelmät, joita käytettiin hiiva-HSA-sekreetiovektorin generoimiseen käyttämällä K. lactis -tappaja/alfa-faktorifuusioaluketta, olivat identtiset niiden kanssa, jotka on kuvattu esimerkissä 1 paitsi, että oligonukleotididupleksi (Π) korvattiin oligonukleotididupleksilla (III), joka syntetoitiin automaattisessa Applied 10 Biosystems Inc. 380 DNA-syntetoijassa (valmistajan ohjeiden mukaisesti).
Oligonukleotididupleksi ΠΙ
GATCC ATG AAT ATA TTT TAC ATA TTT TTG TTT TTG CTG TCA TTC 15 TAC TTA TAT AAAATGTAT AAAAAC AAAAACGACAGT AAG
GTT CAAGGAAGC TTG GAT AAA AGA CAAGTT CCT TCG AAC CTA TTT TCT
20 Ekvimolaariset määrät BamHI:llä hajotettua pUC19:ää, oligotididupleksia ΙΠ, mpl9.7:stä johdettua 1067 emäsparin DNA-fragmenttia ja pEK25:stä johdettua 688 emäsparin DNA-fragmenttia ligatoitiin yhteen. E. coli DH 5 transformoitiin ligatoi-dulla DNA.lla ja transformantit valikoitiin 50 pg/ml ampisilliini-L-liemiagarilla. Yhdistelmäkoloniat, jotka sisälsivät haluttua plasmidia, joka nimettiin pAYE304:ksi 25 (kuvio 5), valikoitiin hajotetulla DNA:lla, joka saatiin yksittäisistä kolonioista rest-riktioendonukleaasilla BamHI.
Plasmidi pAYE304 hajotettiin täydellisesti BamHI:llä ja tuotteet erotettiin elektroforeesilla 1 % agaroosigeelin läpi. HSA:ta koodaavan sekvenssin sisältävä 1823 emäs-30 parin fragmentti otettiin talteen elektroeluoinnilla.
Plasmidi pMA91 (Mellor et ai., 1983) hajotettiin täydellisesti BglII:lla standardiolo-suhteissa. Linearisoitu plasmidi uutettiin fenoli/kloroformilla ja presipitoitiin etanolilla.
Ekvivalenttiset määrät linearisoitua pMA91:ä ja pAYE304:stä valmistettua DNA-fragmenttia ligatoitiin standardiolosuhteissa. E. coli DH5 transformoitiin ligatointi- 35 104564 13 seoksella ja DNA:ta vastaanottavat DNA-solut valikoitiin L-liemi-agarissa, joka sisälsi 50 pg/ml ampisilliinia. Koloniat, jotka sisälsivät haluttua plasmidia, joka nimettiin pAYE 305:ksi (kuvio 6), valikoitiin hajottamalla DNA tällaisista kolonioista PvuIIilla.
5
Plasmidi pAYE305 transformoitiin hiivan Saccharomyces cerevisiae -lajiin S150-2B, kuten Hinnen et ai. (1978) kuvasivat. Plasmidia pAYE305 vastaanottavat solut valikoitiin minimaalisessa väliaineessa, jota täydennettiin 2 % (paino/til.) glukoosia, 20 mg/ml histidiiniä, 20 mg/1 tryptofaania ja 20 mg/ml urasiilia.
10
Transformoidut S150-2B-solut siirrostettiin 10 ml:aan YEPD-väliainetta, joka sisälsi 2 % (paino/til.) glukoosia, ja niitä inkuboitiin 30 °C:ssa, 200 rpm, 72 tuntia. So-luttomat viljelysupematantit analysoitiin jaksoittaisella natiivilla 8-25-prosenttisella gradienttipolyakryyliamidigeelielektroforeesilla Pharmacia Phast Systemissä valmis-15 tajan ohjeiden mukaisesti.
Solut värjättiin ja väri poistettiin ja natiivin HSA:n ja HSA-fragmentin suhteelliset määrät arvioitiin geeliskannauksella 595 nm:ssä.
20 Esimerkki 3
Schizosaccharomyces pombe (laji Leul.32h) transformoitiin käyttämällä vektoria, joka perustui EP286424:n (Delta Biotechnology) disintegraatiovektoreihin, sopivaa promoottoria ja esimerkin 1 fuusioaluketta, ja se fermentoitiin 30 °C:ssa 10 mlissa 25 EMM (Edinburgh minimal medium, Ogden, J.E. & Fantes, P.A. (1986) Curr. Genetics 10 509-514), puskuroituna pH:hon 5,6 0,1 Milla sitruunhappo/natriumfosfaattia, jotta saatiin 10-15 mg/ml HSAita viljelysupematantissa 3 päivän kuluttua.
* 104564 14
Viitteet
Beggs, J.D. (1978) Nature 275, 104-109
Beggs, J.D. (1981), Molecular Genetics in yeast, Alfred Benzon Symp. 16, 383-395 5 Bimboim, H.C. & Doly, J. (1979) Nucl. Acids Res. 7, 1513-1523 Hanahan, D. (1983) J. Mol Biol. 166, 557-580
Henderson, R.C.A., Cox, B.S. & Tubb. R. (1985) Curr. Genet. 9, 135-136 Hinnen et al. (1988) PNAS 75: 1929
Hitzeman, R.A., Clarke, L. & Carbon, J. (1980) J. Biol. Chem., 255(24), 12073-10 12080
Hitzeman, R.A., Hagie, F.E., Levine, H.L., Goeddel. D.V., Ammerer, G. & Hall, B.D. (1981) Nature 293, 717-722
Julius, D., Brake, A., Blair, L., Kunisawa, R. & Thomer, J. (1984) Cell 37, 1075-1089 15 Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.
Mandel, M. & Higa, A. (1970) J. Mol. Biol. 53, 159-162 Mellor et al. (1983) Gene 24, 1-14
Sherman, F., Fink, G.R. & Lawrence, C. (1979) Methods in Yeast Genetics, Cold 20 Spring Harbor, N.Y.
Sleep, D., Belfield, G.P. & Goodey, A.R. (1988) Yeast 4 (14th Int. Conf. on Yeast Genet. & Mol. Biol., Helsinki, Conf. Poster)
Stark M.J.R. & Boyd, A. (1986) E.M.B.O.J. 5, 1995-2002 Tokumaga, M., Wada, N. & Hishinuma, F. (1987) Biochem. Biophys. Res. Comm. 25 144,613-619
Towbin, H., Staehelin, T. & Gordon, J. (1979) P.N.A.S. 76, 4350-4354 Vogelstein, B. (1987), Anal. Biochem. 160. 115-118 Yanish-Perron et al. (1985) Gene 33 103-109 : ·

Claims (11)

104564 .
1. Polypeptid med följ ande aminosyrasekvens: (a) 20 1 10 Met Lys Trp Vai Ser Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Arg Phe Leu Thr Tip Leu Thr Ile Ile Trp Ile Trp Thr His Tyr Ile Gly Tyr Vai Gly Vai Vai Tyr Vai Tyr Gly Gin Met Ala Met Ala Met Met Met Ala
25 Asn 1 Ser Ala Tyr Ser Arg Ser Leu Asp Lys Arg Thr Thr Phe Thr Lys Thr Ile Glu Arg Lys
30 Gly Gly Trp Gly His Gly Vai Asn Ala Ser Ala Gin Ala Met Gin Asn His 1β 104564 eller (b) Met Asn lie Phe Tyr lie Phe Leu Phe Leu Leu Ser Phe Val
1. Polypeptidi, jolla on seuraava aminohapposekvenssi: 5 (a) 1 10 Met Lys Trp Vai Ser Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Arg Phe Leu Thr Trp Leu Thr Ile Ile Trp Ile Trp Thr
2. Polypeptid enligt patentkrav 1, kännetecknad av att den har följande aminosy-25 rasekvens: (a) fyN-Met-Lys-Trp-Val-Ser-Phe-Ile-Ser-Leu-Leu-Phe-Leu-Phe-Ser-Ser-Ala-Tyr-Ser-Arg-Ser-Leu-Asp-Lys-Arg-COOH eller 30 (b) H2N-Met-Asn-lle-Phe-Tyr-Ile-Phe-Leu-Phe-Leu-Leu-Ser-Phe-VaI-Gln-Gly- Ser-Leu-Asp-Lys-Arg-COOH eller konservativt modifierade varianter av nägondera sekvensen. . 35 3. Fusionsförening, kännetecknad av att den innefattar en polypeptid enligt pa tentkrav 1 eller 2 kopplad i karboxylterminalen till en N-terminalrest av en andra polypeptid. i 104564
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen polypeptidi, tunnettu siitä, että sillä on seu-raava aminohapposekvenssi: 10 (a) HbN-Met-Lys-Trp-Val-Ser-Phe-IIe-Ser-Leu-Leu-Phe-Leu-Phe-Ser-Ser-Ala-Tyr-Ser-Arg-Ser-Leu-Asp-Lys-Arg-COOH tai (b) H2N-Met-Asn-Ile-Phe-Tyr-Ile-Phe-Leu-Phe-Leu-Leu-Ser-Phe-Val-Gln-Gly-
15 Ser-Leu-Asp-Lys-Arg-COOH tai jommankumman sekvenssin konservatiivisesti modifioidut muunnelmat.
3. Fuusioyhdiste, tunnettu siitä, että se käsittää patenttivaatimuksen 1 tai 2 mu-20 kaisen polypeptidin kytkettynä karboksyyliterminaalissa toisen polypeptidin N-ter- minaaliseen tähteeseen.
4. Fusionsförening enligt patentkrav 3, kännetecknad av att polypeptiden enligt patentkrav 1 kopplats direkt tili nämnda andra polypeptid.
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen fuusioyhdiste, tunnettu siitä, että patenttivaatimuksen 1 mukainen polypeptidi on kytketty suoraan sanottuun toiseen polypepti- 25 diin.
5. Fusionsförening enligt patentkrav 4, kännetecknad av att den andra polypep-5 tiden är naturligt förekommande mänskligt serumalbumin med en tertiär struktur som är likadan som den motsvarande hos HSA, och som har atminstone en likadan fysiologisk funktion som HSA, eller ett fragment av nägondera.
5 Asp Leu Trp Phe Leu Trp He Tip Ile He Thr Trp Leu Glu Vai Tyr Trp Vai Tyr Vai Tyr Vai Vai Gly Tyr He Gin Met Met Met Met Ala Ala Met His
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen fuusioyhdiste, tunnettu siitä, että toinen polypeptidi on luonnossa esiintyvä ihmisen seerumialbumiini, jolla on tertiäärinen rakenne, joka on samanlainen kuin HSA:n vastaava, ja jolla on ainakin yksi samanlai- 30 nen fysiologinen toiminto kuin HSAilla, tai toisen niistä fragmentti.
6. Polynukleotidsekvens som kodar polypeptid enligt patentkrav 1 eller 2 eller en 10 fusionsförening enligt nägot av patentkraven 3-5.
6. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaista polypeptidiä tai jonkin patenttivaatimuksen 3-5 mukaista fuusioyhdistettä koodaava polynukleotidisekvenssi. 1 i
7. Polynukleotid enligt patentkrav 6, kännetecknad av att den valts bland sek-venser i tabell 2 eller 3.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen polynukleotidi, tunnettu siitä, että se on välit- tu taulukossa 2 tai 3 esitetyistä sekvensseistä. 104564
8. DNA-konstruktion, kännetecknad av att den innefattar ett lämpligt kontroll- omräde eller -omraden och en polynukleotid enligt patentkrav 6 eller 7, som kontrol-leras av kontrollomrädet.
8. DNA-konstruktio, tunnettu siitä, että se käsittää sopivan kontrollialueen tai -alueet ja patenttivaatimuksen 6 tai 7 mukaisen polynukleotidin, joka on kontrolli-alueen kontrollin alaisena.
9. Värd transformerad med en DNA-konstruktion enligt patentkrav 8. 20
9. Patenttivaatimuksen 8 mukaisella DNA-konstruktiolla transformoitu isäntä.
10. Saccharomyces cerevisiae eller Schizosaccharomyces pombe enligt patentkrav 9.
10 Gin Gly Ser Leu Asp Lys Arg Asp Ser Thr He Asn Arg Lys Asn Thr Gly Val Glu Glu Ala Ala Met Gin His His 15 i vilken man bland aminosyragruppema i vertikal linje kan väljä vilken aminosyra som heist, eller en polypeptid som är högst fyra aminosyror kortare eller längre under förutsättning, (i) att C-terminalhelheten (Lys, Arg), Lys-Lys eller Arg-Arg bi-behalls, (ii) att det bland fem rester i N-terminalen finns en positivt laddad rest, (iii) 20 att det mitt i sekvensen eller närä dess mitt finns en allmänt hydrofob grupp, (iv) att tre aminosyror av C-terminalens Lys/Arg, Lys/Arg-helhet i N-terminalens riktning bibehalls, och (v) att sekvensens (a) positioner 20 och 21 inte är Gly respektiveVal.
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen Saccharomyces cerevisiae tai Schizosaccha-romyces pombe.
11. Polypeptidin valmistusmenetelmä, tunnettu siitä, että se käsittää patenttivaati muksen 9 tai 10 mukaisen isännän viljelemisen ja sanotulla nukleotidisekvenssillä tai sen modifioidulla muunnoksella ilmennetyn polypeptidin talteen ottamisen siitä. 15
10 His Tyr Ile Gly Tyr Vai Gly Vai Vai Tyr Vai Tyr Gly Gin Met Ala Met Ala Met Met Met Ala Asn 20
15 Ser Ala Tyr Ser Arg Ser Leu Asp Lys Arg Thr Thr Phe Thr Lys Thr Ile Glu Arg Lys Gly Gly Trp Gly His Gly Vai Asn Ala Ser Ala Gin Ala Met Gin Asn His 20 tai (b) Met Asn Ile Phe Tyr Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Phe Vai .· 25 Asp Leu Trp Phe Leu Trp Ile Trp Ile Ile Thr Trp Leu Glu Vai Tyr Trp Vai Tyr Vai Tyr Vai Vai Gly Tyr Ile Gin Met Met Met Met Ala Ala Met His
30 Gin Gly Ser Leu Asp Lys Arg Asp Ser Thr Ile Asn Arg Lys Asn Thr Gly Vai Glu Glu Ala Ala Met Gin His His jossa pystysuorassa linjauksessa olevista aminohapporyhmistä voidaan valita mikä aminohappo tahansa, tai polypeptidi, joka on korkeintaan neljä aminohappoa lyhy- 35 104564 empi tai pidempi sillä edellytyksellä, (i) että C-päätykokonaisuus (Lys, Arg), Lys-Lys tai Arg-Arg säilytetään, (ii) että N-päädyn viiden tähteen joukossa on positiivisesti varautunut tähde, (iii) että sekvenssin keskellä tai keskiosan lähellä on yleensä hydrofobinen ryhmä, (iv) että kolme aminohappoa C-päädyn Lys/Arg, Lys/Arg-5 kokonaisuudesta N-päädyn suuntaan säilytetään, ja (v) että sekvenssin (a) asemat 20 ja 21 eivät ole Gly ja Vai, vastaavasti.
11. Förfarande för framställning av en polypeptid, kännetecknat av att det inne- .· 25 fattar odling av en värd enligt patentkrav 9 eller 10 och utvinning av en polypeptid exponerad med nämnda nukleotidsekvens eller en modifierad variant av denna. 1 · m
FI901428A 1988-07-23 1990-03-21 Peptidi ja DNA-sekvenssit FI104564B (fi)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB888817598A GB8817598D0 (en) 1988-07-23 1988-07-23 Dna & peptide sequences
GB8817598 1988-07-23
GB8900816 1989-01-14
GB898906920A GB8906920D0 (en) 1989-03-28 1989-03-28 Peptide and dna sequences
GB8906920 1989-03-28
PCT/GB1989/000816 WO1990001063A1 (en) 1988-07-23 1989-07-14 New secretory leader sequences

Publications (2)

Publication Number Publication Date
FI901428A0 FI901428A0 (fi) 1990-03-21
FI104564B true FI104564B (fi) 2000-02-29

Family

ID=26294196

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI901428A FI104564B (fi) 1988-07-23 1990-03-21 Peptidi ja DNA-sekvenssit

Country Status (15)

Country Link
US (1) US5302697A (fi)
EP (1) EP0387319B1 (fi)
JP (1) JP3092811B2 (fi)
KR (1) KR100195632B1 (fi)
AT (1) ATE135045T1 (fi)
AU (1) AU633020B2 (fi)
CA (1) CA1340547C (fi)
DE (1) DE68925893T2 (fi)
DK (1) DK175853B1 (fi)
FI (1) FI104564B (fi)
GB (1) GB2230268B (fi)
HU (1) HU213571B (fi)
IE (1) IE62266B1 (fi)
IL (1) IL91024A (fi)
WO (1) WO1990001063A1 (fi)

Families Citing this family (68)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1340772C (en) 1987-12-30 1999-09-28 Patricia Tekamp-Olson Expression and secretion of heterologous protiens in yeast employing truncated alpha-factor leader sequences
US5759802A (en) * 1988-10-26 1998-06-02 Tonen Corporation Production of human serum alubumin A
DK105489D0 (da) * 1989-03-03 1989-03-03 Novo Nordisk As Polypeptid
US5766883A (en) * 1989-04-29 1998-06-16 Delta Biotechnology Limited Polypeptides
FR2650598B1 (fr) * 1989-08-03 1994-06-03 Rhone Poulenc Sante Derives de l'albumine a fonction therapeutique
DK300090D0 (da) * 1990-12-19 1990-12-19 Novo Nordisk As Fremgangsmaade til fremstilling af leadersekvenser
FR2686899B1 (fr) * 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
US5521086A (en) * 1993-09-16 1996-05-28 Cephalon, Inc. Secretion sequence for the production of a heterologous protein in yeast
DE69636536T2 (de) * 1995-02-03 2007-10-25 Asahi Glass Co., Ltd. Sekretionssignal-Gen und dieses enthaltender Expressionsvektor
US5712114A (en) * 1995-06-06 1998-01-27 Basf Aktiengesellschaft Compositions for expression of proteins in host cells using a preprocollagen signal sequence
GB9526733D0 (en) * 1995-12-30 1996-02-28 Delta Biotechnology Ltd Fusion proteins
GB9712370D0 (en) 1997-06-14 1997-08-13 Aepact Ltd Therapeutic systems
WO1999024075A2 (en) * 1997-11-07 1999-05-20 Conjuchem, Inc. Affinity markers for human serum albumin
GB9902000D0 (en) 1999-01-30 1999-03-17 Delta Biotechnology Ltd Process
US6946134B1 (en) 2000-04-12 2005-09-20 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
EP1274720A4 (en) 2000-04-12 2004-08-18 Human Genome Sciences Inc ALBUMIN FUSED PROTEINS
US20050100991A1 (en) * 2001-04-12 2005-05-12 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US20050054051A1 (en) * 2001-04-12 2005-03-10 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US20060084794A1 (en) * 2001-04-12 2006-04-20 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US20050244931A1 (en) * 2001-04-12 2005-11-03 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US7507413B2 (en) 2001-04-12 2009-03-24 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US7176278B2 (en) 2001-08-30 2007-02-13 Biorexis Technology, Inc. Modified transferrin fusion proteins
WO2003030821A2 (en) * 2001-10-05 2003-04-17 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US20080194481A1 (en) 2001-12-21 2008-08-14 Human Genome Sciences, Inc. Albumin Fusion Proteins
CA2841097A1 (en) * 2001-12-21 2003-07-24 Human Genome Sciences, Inc. Albumin and g-csf fusion proteins
CA2484556A1 (en) * 2001-12-21 2003-07-24 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
NZ579419A (en) 2002-02-07 2011-02-25 Dyax Corp Albumin-fused kunitz domain peptides
GB0217033D0 (en) 2002-07-23 2002-08-28 Delta Biotechnology Ltd Gene and polypeptide sequences
CA2513213C (en) 2003-01-22 2013-07-30 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
EP1689348B1 (en) 2003-12-05 2013-05-15 Children's Hospital Medical Center Oligosaccharide compositions and use thereof in the treatment of infection
GB0329722D0 (en) 2003-12-23 2004-01-28 Delta Biotechnology Ltd Modified plasmid and use thereof
GB0329681D0 (en) 2003-12-23 2004-01-28 Delta Biotechnology Ltd Gene expression technique
WO2005066348A2 (en) 2004-01-05 2005-07-21 Emd Lexigen Research Center Corp. Interleukin-12 targeted to oncofoetal fibronectin
EP2330200B1 (en) 2004-12-23 2017-04-05 Albumedix A/S Gene expression technique
EP1816201A1 (en) 2006-02-06 2007-08-08 CSL Behring GmbH Modified coagulation factor VIIa with extended half-life
AU2007278994B2 (en) 2006-07-24 2013-08-15 Biorexis Pharmaceutical Corporation Exendin fusion proteins
US9505823B2 (en) 2006-08-07 2016-11-29 TEV A Biopharmaceuticals USA, Inc. Albumin-insulin fusion proteins
WO2008051383A2 (en) * 2006-10-19 2008-05-02 Amgen Inc. Use of alcohol co-solvents to improve pegylation reaction yields
US7825093B2 (en) 2006-10-25 2010-11-02 Amgen Inc. Methods of using OSK1 peptide analogs
EP2738257A1 (en) 2007-05-22 2014-06-04 Amgen Inc. Compositions and methods for producing bioactive fusion proteins
JP2010535484A (ja) 2007-08-08 2010-11-25 ノボザイムス バイオファーマ デーコー アクティーゼルスカブ トランスフェリン変異体と複合体
JP2012516878A (ja) 2009-02-06 2012-07-26 ノボザイムス バイオファーマ デーコー アクティーゼルスカブ 精製プロセス
DK2396347T3 (en) 2009-02-11 2017-07-24 Albumedix As ALBUMIN VARIANTS AND CONJUGATES
US20120121591A1 (en) 2009-03-20 2012-05-17 Amgen Inc. SELECTIVE AND POTENT PEPTIDE INHIBITORS OF Kv1.3
MX2012005864A (es) 2009-11-20 2012-08-31 Amgen Inc Proteinas de enlace al antígeno anti-orai 1 y usos de las mismas.
SG187787A1 (en) 2010-08-10 2013-03-28 Amgen Inc Dual function in vitro target binding assay for the detection of neutralizing antibodies against target antibodies
SG188591A1 (en) 2010-09-22 2013-04-30 Amgen Inc Carrier immunoglobulins and uses thereof
EA201370161A1 (ru) 2011-01-18 2013-12-30 Амген Инк. НОКАУТНЫЕ ПО Na1.7 МЫШИ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
WO2012116453A1 (en) 2011-03-03 2012-09-07 Zymeworks Inc. Multivalent heteromultimer scaffold design and constructs
KR20140145947A (ko) 2011-03-16 2014-12-24 암젠 인크 Nav1.3과 nav1.7의 유효한 선별적 저해제
US20150201588A1 (en) 2012-02-22 2015-07-23 Amgen Inc. Autologous Mammalian Models Derived from Induced Pluripotent Stem Cells and Related Methods
AU2013289881B2 (en) 2012-07-13 2018-01-18 Zymeworks Bc Inc. Multivalent heteromultimer scaffold design and constructs
US10344060B2 (en) 2013-03-12 2019-07-09 Amgen Inc. Potent and selective inhibitors of Nav1.7
JP2016520586A (ja) 2013-05-08 2016-07-14 ザイムワークス，インコーポレイテッド 二重特異性ｈｅｒ２およびｈｅｒ３抗原結合性構築物
EP3039129B1 (en) 2013-08-30 2018-06-27 Amgen Inc. High titer recombinant aav vector production in adherent and suspension cells
WO2016061141A1 (en) 2014-10-13 2016-04-21 University Of Maryland, Baltimore Methods for treating cardiovascular dysfunction and improving fluid homeostasis with a peptide hormone
JP6749898B2 (ja) 2014-10-15 2020-09-02 アムジエン・インコーポレーテツド 宿主細胞における異種由来遺伝子の発現を改善するためのプロモーター及び調節エレメント
CA2874083C (en) 2014-12-05 2024-01-02 Universite Laval Tdp-43-binding polypeptides useful for the treatment of neurodegenerative diseases
BR112018012851A2 (pt) 2015-12-22 2018-12-26 Albumedix Ltd cepas de expressão de proteína melhoradas
US11028410B2 (en) 2016-01-27 2021-06-08 Just-Evotec Biologics, Inc. Hybrid promoter and uses thereof
WO2018094316A1 (en) 2016-11-21 2018-05-24 Just Biotherapeutics, Inc. Aflibercept formulations and uses thereof
EP3642343B1 (en) 2017-06-20 2021-12-08 Albumedix Ltd. Improved protein expression strains
CA3067735A1 (en) 2017-08-17 2019-02-21 Just Biotherapeutics, Inc. Method of purifying glycosylated protein from host cell galectins and other contaminants
JP7183268B2 (ja) 2017-11-20 2022-12-05 ジャスト－エヴォテック バイオロジックス、インコーポレイテッド 等張化剤としてリジン塩を含有するアフリベルセプト製剤及びその使用
US20220119757A1 (en) 2019-02-15 2022-04-21 Just-Evotec Biologics, Inc. Automated biomanufacturing systems, facilities, and processes
US11739166B2 (en) 2020-07-02 2023-08-29 Davol Inc. Reactive polysaccharide-based hemostatic agent
WO2023287707A1 (en) 2021-07-15 2023-01-19 Just-Evotec Biologics, Inc. Bidirectional tangential flow filtration (tff) perfusion system
WO2023154305A2 (en) 2022-02-10 2023-08-17 Amgen Inc. Antibody protein product expression constructs for high throughput sequencing

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ207926A (en) * 1983-04-25 1988-04-29 Genentech Inc Use of yeast #a#-factor to assist in expression of proteins heterologus to yeast
NZ207925A (en) * 1983-04-25 1988-05-30 Genentech Inc Yeast expression vehicle consisting of a yeast promoter and signal peptide encoding region linked to a heterologus peptide coding region; expression and culture
US4588684A (en) * 1983-04-26 1986-05-13 Chiron Corporation a-Factor and its processing signals
FR2593518B1 (fr) * 1985-05-02 1989-09-08 Transgene Sa Vecteurs d'expression et de secretion de l'hirudine par les levures transformees
JPS6236183A (ja) * 1985-06-20 1987-02-17 ザ・サルク・インステイチユ−ト・バイオテクノロジ−／インダストリアル・アソシエイツ・インコ−ポレ−テツド サツカロミセス・セレビシエからのポリペプチドの発現および分泌
RU2091490C1 (ru) * 1985-10-25 1997-09-27 Зимодженетикс, Инк. Способ получения гетерологичного полипептида в эукариотических микроорганизмов
AU6543286A (en) * 1985-10-25 1987-05-19 Zymogenetics Inc. Method of using bar1 for secreting foreign proteins
GB8613388D0 (en) * 1986-06-03 1986-07-09 Delta Biotechnology Ltd Induction of galactose regulated gene expression in yeast
IT1196484B (it) * 1986-07-11 1988-11-16 Sclavo Spa Vettore ad espressione e secrezione in lieviti,utile per la preparazione di proteine eterologhe
JP2507874B2 (ja) * 1986-11-27 1996-06-19 工業技術院長 分泌シグナルペプチドをコ−ドするｄｎａ配列

Also Published As

Publication number Publication date
DK175853B1 (da) 2005-04-04
WO1990001063A1 (en) 1990-02-08
EP0387319A1 (en) 1990-09-19
ATE135045T1 (de) 1996-03-15
AU633020B2 (en) 1993-01-21
EP0387319B1 (en) 1996-03-06
HU213571B (en) 1997-08-28
JPH03500370A (ja) 1991-01-31
JP3092811B2 (ja) 2000-09-25
HU894572D0 (en) 1991-05-28
HUT57829A (en) 1991-12-30
US5302697A (en) 1994-04-12
FI901428A0 (fi) 1990-03-21
CA1340547C (en) 1999-05-18
GB2230268A (en) 1990-10-17
GB2230268B (en) 1992-01-29
IL91024A0 (en) 1990-02-09
DE68925893D1 (de) 1996-04-11
AU4042789A (en) 1990-02-19
GB8928849D0 (en) 1990-07-18
IE62266B1 (en) 1995-01-11
KR920700288A (ko) 1992-02-19
KR100195632B1 (ko) 1999-06-15
DK72990D0 (da) 1990-03-21
DE68925893T2 (de) 1996-08-08
IE892361L (en) 1990-01-23
DK72990A (da) 1990-03-21
IL91024A (en) 1995-08-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI104564B (fi) Peptidi ja DNA-sekvenssit
JP2791418B2 (ja) 異種蛋白質の製造方法、組換えｄｎａ、形質転換体
US4588684A (en) a-Factor and its processing signals
FI104985B (fi) Hiivan muokkausjärjestelmä, joka käsittää muokkauskohdan vieressä negatiivisesti varautuneen aminohapon
KR100227167B1 (ko) 인체혈청알부민의 n-말단 단편을 함유하는 융합단백질
AU660161B2 (en) A method of constructing synthetic leader sequences
PL178924B1 (pl) Konstrukt DNA, zrekombinowany wektor ekspresji, komórka transformowana i sposób wytwarzania heterologicznego polipeptydu
JPS6236183A (ja) サツカロミセス・セレビシエからのポリペプチドの発現および分泌
EP1015612B1 (en) Process for preparing recombinant proteins using highly efficient expression vector from saccharomyces cerevisiae
WO1992013951A1 (en) Production of human serum albumin in methylotrophic yeast cells
Müller II et al. Production of IFNα-2a in Hansenula polymorpha
CA2048676C (en) Artificial promoter for the expression of proteins in yeast
JP3732516B2 (ja) タンパク質の製造法
EP0245479B1 (en) Shortened phosphoglycerate kinase promoter
Goodey et al. Expression and secretion of foreign polypeptides in yeast
EP0547171A1 (en) Production of human lysozyme in methylotrophic yeast cells and efficient secretion therefrom

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Owner name: DELTA BIOTECHNOLOGY LIMITED

PC Transfer of assignment of patent

Owner name: NOVOZYMES DELTA LIMITED

Free format text: NOVOZYMES DELTA LIMITED

PC Transfer of assignment of patent

Owner name: NOVOZYMES BIOPHARMA UK LIMITED

Free format text: NOVOZYMES BIOPHARMA UK LIMITED