JP6749898B2 - 宿主細胞における異種由来遺伝子の発現を改善するためのプロモーター及び調節エレメント - Google Patents
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Description
タンパク質などの生物学的分子、特に抗体または抗体断片、例えば免疫グロブリンFc領域を含む生物学的製剤に対する需要は多い。
本明細書中に別途の記載がない限り、本出願に関して用いられる科学技術用語は、当該技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。更に、文脈により別途の定めがない限り、単数形の用語は複数を包含し、複数形の用語は単数を包含するものとする。したがって、本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用されるとき、単数形の「a」、「an」及び「the」は、その内容について別途の明確な指示がない限り、複数の指示対象を含む。例えば、「タンパク質(a protein)」への言及は複数のタンパク質を含み、「細胞(a cell)」への言及は複数の細胞の集団を含む。「yEx」への言及は、「y×10z」を意味し、また区別なく用いられ、ここで、yは、特定の指数10を乗じる数であり、zは、指数であり、例えば、「1E6」は1×106に等しく、「5E6」は5×106に等しく、「5E−6」は5×10−6に等しい。
典型的に、本発明にて有用な外因性遺伝子(複数可)は、目的のポリペプチド(ハムスターGAPDH以外)、例えば、抗体または抗体断片などの標的結合ポリペプチド、タンパク質または受容体のペプチドリガンド、神経系、免疫応答、造血、炎症、細胞の成長及び増殖、細胞系統分化ならびに/またはストレス応答に関与するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であろう。本発明の範囲内には、1、2または3つの外因性目的遺伝子の宿主細胞への挿入が含まれる。
遺伝子は、典型的には、プロモーターに機能的に連結され、この場合、プロモーターは、特定の方法で各遺伝子の発現を調節するように選択される。本発明の範囲内において、ハムスターグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)プロモーターがCHO細胞での発現に好ましい。例えば、遺伝子番号100736557(NCBIリファレンス配列NW_003613610.1)のハムスターGAPDHプロモーター配列をクローニングし、本発明の発現ベクターに使用することができる。
目的遺伝子及びプロモーターに加えて、本発明を実施するための目的遺伝子(複数可)の調製に有用なベクターは、(1)遺伝子が挿入される哺乳動物中での遺伝子の最適発現、及び(2)細菌または哺乳動物宿主細胞中でのベクターの増幅に有用な1つ以上の他のエレメントを典型的に含有する。これらのエレメントのそれぞれは、それぞれの活性を最大化するために、ベクター中で、他の各エレメントに対して適切に配置される。このような位置決めは、当業者によく知られている。必要に応じて、以下のエレメントをベクター中に任意に含めることができる。
目的遺伝子によりコードされたポリペプチドが分泌される本発明の実施形態では、多くの場合、シグナル配列と呼ばれる小さなポリペプチドが存在し、これにより、遺伝子によりコードされたポリペプチドは、当該ポリペプチドが合成される細胞の外に誘導される。典型的に、シグナル配列は、遺伝子のコード領域中、コード領域の5’末端近傍または5’末端に配置される。多くのシグナル配列が同定されており、機能的であるもの、したがって、種々の組織種に由来する細胞による発現と適合するものが目的遺伝子とともに使用され得る。したがって、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列は、遺伝子と相同であっても異種であってもよく、細胞の由来である哺乳動物種と相同であっても異種であってもよい。更に、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列は、上述の方法を使用して、化学的に合成してもよい。ただし、本明細書での目的上、好ましいシグナル配列は、目的遺伝子とともに天然に生じるもの(すなわち、遺伝子と相同であるもの)である。
場合により、特定の細胞内膜の表面上または原形質膜上に目的遺伝子を発現させることが望ましいことがある。天然膜タンパク質は、ポリペプチドの一部として、タンパク質を膜に係留する役割を持つ一続きのアミノ酸を含有する。一方、膜上に天然に存在しないタンパク質の場合には、このような一続きのアミノ酸を付加して、この特徴を付与することができる。多くの場合、アンカードメインは、ポリペプチド配列の内部部分であるため、アンカードメインをコードするヌクレオチド配列は、遺伝子のヌクレオチド配列の内部領域中へ工学的に操作する。しかしながら、他の場合には、アンカードメインをコードするヌクレオチド配列は、遺伝子のヌクレオチド配列の5’末端または3’末端に結合され得る。この場合、アンカードメインをコードするヌクレオチド配列は、目的遺伝子をコードするヌクレオチド配列とは別個の成分として、ベクター中の適切な位置にまず配置され得る。シグナル配列の場合と同様に、アンカードメインは、いずれの供給源であってもよく、したがって、遺伝子及び宿主細胞の由来である哺乳動物種の両方に対して、相同であっても異種であってもよい。あるいは、アンカードメインは、上述の方法を使用して、化学的に合成してもよい。
この成分は、典型的に、市販されている原核生物発現ベクターの一部であり、宿主細胞中におけるベクターの増幅を助けるものである。最適なベクターが複製起点部位を含まない場合、既知の配列に基づいて化学的に合成し、ベクターにライゲーションしてもよい。
このエレメントは、ポリアデニル化またはポリA配列としても知られ、典型的に、ベクター中の遺伝子のヌクレオチド配列の3’側に位置し、目的遺伝子の転写を終結させる役割を持つ。このエレメントをコードするヌクレオチド配列はライブラリーから簡単にクローニングでき、またベクターの一部として市販もされているが、上述のようなヌクレオチド配列合成方法を使用して容易に合成することもできる。
多くの場合、目的遺伝子の転写は、クローニングベクター上の1つのイントロンまたは1つより多いイントロン(エクソンによって連結されている)の存在によって増加する。イントロン(複数可)は、遺伝子がゲノムDNA配列の完全長または断片である場合は特に、遺伝子ヌクレオチド配列中に天然に存在し得るものである。イントロン(複数可)が(ほとんどのcDNAのように)ヌクレオチド配列中に天然に存在しない場合、イントロン(複数可)は、別の供給源から得ることができる。イントロン(複数可)は、目的遺伝子及び/または宿主細胞の由来である哺乳動物種に対して、相同であっても異種であってもよい。イントロンは、有効であるように転写される必要があるため、プロモーター及び目的遺伝子に対するその位置が重要である。したがって、遺伝子がcDNA配列である場合、イントロン(複数可)の好ましい位置は、転写開始点の3’側かつポリA転写終結配列の5’側である。cDNAの場合、好ましくは、イントロンは、遺伝子のヌクレオチド配列を遮断しないように、遺伝子のヌクレオチド配列の一方の側または他方の側(すなわち、5’または3’)に配置される。挿入される宿主細胞(複数可)に適合するのであれば、あらゆるウイルス、原核生物及び真核生物(植物または動物)を含む、いかなる供給源由来のいかなるイントロンも本発明を実施するために使用することができる。合成イントロンも本明細書に含まれる。所望により、2つ以上のイントロンをベクターに使用してもよい。イントロン及びエクソンの有用なセットは、ヒト成長ホルモン(hGH)DNA配列である。
選択マーカー遺伝子は、選択培養培地中で成長するトランスフェクトされた細胞の生存及び成長に必要なポリペプチドをコードする。典型的な選択マーカー遺伝子は、(a)抗生物質もしくは他の毒素、例えば、原核生物宿主細胞の場合はアンピシリン、テトラサイクリンもしくはカナマイシン、また哺乳動物細胞の場合はネオマイシン、ハイグロマイシンもしくはメトトレキサートに対する耐性を付与するタンパク質、(b)細胞の栄養要求性欠損を補うタンパク質、または(c)複合培地もしくは規定培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
本発明の組換え発現ベクターを調製するのに有用な遺伝子カセットの増幅に最も有用なクローニングベクターは、原核生物宿主に適合するものである。しかしながら、真核細胞宿主及び当該細胞に適合するベクターも本発明の範囲内である。
典型的に、目的遺伝子を含有するプラスミドは、線状化され、胚への挿入の前に、選択された制限エンドヌクレアーゼの使用により、その一部が除去される。場合により、遺伝子、プロモーター、他の制御配列及び調節エレメントを線状断片としてベクターの他の部分から単離し、遺伝子、プロモーター、イントロン(使用される場合)、エンハンサー、ポリA配列及び任意選択のシグナル配列または膜アンカードメインを含有する線状ヌクレオチド配列のみを胚に導入するのが好ましいことがある。これは、これらのエレメントを含有する核酸配列領域を取り出すようにプラスミドを切断し、アガロースゲル電気泳動または他の好適な精製方法を使用してこの領域を精製することによって、達成することができる。
抗体の産生
ポリクローナル抗体。ポリクローナル抗体は、典型的に、適切な抗原及びアジュバントの複数の皮下(sc)または腹腔内(ip)注射により、動物中にて産生される。あるいは、動物のリンパ節中に抗原を直接注入してもよい(Kilpatrick et al.,Hybridoma,16:381−389,1997参照)。抗体応答の改善は、二官能性または誘導体化試薬、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を介した結合)、N−ヒドロキシスクシンイミド(リシン残基を介する)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸または当該技術分野において知られている他の試薬を使用して、適切な抗原を、免疫化対象の種にて免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリンまたはダイズトリプシン阻害物質と複合体化することによって得ることができる。
組換えヒト抗体遺伝子のレパートリー構築技術及び繊維状バクテリオファージ表面上へのコード化抗体断片のディスプレイ技術の開発により、ヒト由来抗体の別の作製手段が提供された。ファージディスプレイについては、例えば、Dower et al.,WO91/17271、McCafferty et al.,WO92/01047、及びCaton and Koprowski,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:6450−6454(1990)に記載されており、当該文献のそれぞれは、その全体を参照により本明細書に援用する。ファージ技術によって作製された抗体は、通常、細菌中で、抗原結合断片、例えば、FvまたはFab断片として生成されるため、エフェクター機能を欠く。エフェクター機能は、次の2つの手法のうちの1つにより導入することができる。当該断片を工学的に操作して、哺乳動物細胞中での発現のための完全抗体にするか、またはエフェクター機能を誘発できる第2の結合部位を含む二重特異性抗体断片にすることが可能である。
(a)配列番号35に記載の核酸配列または配列番号38に記載の核酸配列に少なくとも95%同一である核酸配列を含み、かつ
(b)前記プロモーターに機能的に連結された調節エレメントを更に含む、組換え発現ベクター。
数ヶ月の期間にわたって妥当なタンパク質発現レベルを維持しつつ、安定プールの回復までの時間を速めるために、別個の発現カセット及び選択カセットを含有する安定プールを作製するための哺乳動物発現ベクターを求めた。目的遺伝子の上流にhuCMVプロモーターと哺乳動物発現のためのアデノウイルス3成分リーダーとを含む、2つのベクター(pPT1及びpPT2;図1参照)から始めた。目的遺伝子は、本研究において、ヒトIgG1の重鎖の定常領域に由来するレポーター遺伝子のヒトFcであり、VH21シグナルペプチドが先行する。Fcカセットの下流にはピューロマイシン耐性(PuroR)選択カセットがあり、その発現はSV40プロモーターによって駆動される。pPT1PuroR選択カセットは、PuroRの前に弱いKozakコンセンサス配列(CGGCCC)を含有する。ベクターpPT2では、これを、強いKozakコンセンサス配列(GCCACC)に最適化した。図面に表すベクター構造は、ベクター上の重要な調節エレメント及び発現カセットを表していることに留意されたい。哺乳動物細胞における発現に影響しないベクターの骨格要素は示していない。
CHO−K1ゲノムDNAからハムスターGAPDH遺伝子座をクローニングした。NCBI内で公開されているハムスターGAPDHゲノム配列を参照した(NW_003613610.1)。PCRプライマーを、その断片がハムスターGAPDHプロモーター、1番目及び2番目のエクソン及びイントロンならびにスプライス受容部位を含むエクソン3の小部分を含むように設計した。増幅産物の配列を決定し、NCBI内で公開されているマウス(NM_008084)及びハムスター(NM_001244854)のGAPDH転写物のアノテーションを使用して、エクソン/イントロン境界を含むハムスター配列についてアノテーションをおこなった。
CTACCCAGAGACCTATTTCTGTCATAGCCTTTTGGGACACATAAAGCTTCCTTCCTGCATAGAACACCCCACAACAGTGTATCAGGAGTGTACAAGTTGACAAACAATGCTCTAGACCTACGGTTTTCTTCCTCTGTGTGCCTCATCCCAGAAGAGATCATGACTCCCAGGAGTCAGCCTTTACTATGGGGTCTGCAGGGGCGTCCAGCCCCTCAGCGGCAAGCCATGCCCACCCTCCCCAAGTCCTTAATCTGCTGAGTCACTTGGAACAGGAGACACTGATTCTGCTGTCATGACAACAGCACATTGCCATAGAAATGCTCCCTACCTCTTACGTGTGTGGTGGGGGAACAGTAATGACAAACCATAGGCAGGAGGCAAAAGGGAAGACGGCACCTCAGAAACATGTGTTAGGTTAGGGCAGAACTATGGAGGGGCTCCTGAGACTCTTTGATGGGAAAGGGTTAATGCTGCTCCTGAAACCTCTGTTGGAAGGCAGAAAAGGGACAGGGCTGAGTCCCCGCACTGGGACCATTTCCATCCTCTGCATCCTGCCCCCGGCTCATGGAAAGCCTGGGCATGGGCCACACAGCTGTCAGTCTTGGCTCTGGGGCCCCAAGGAGGTAGGGCAATCCCAGAATGGCAAGGAGCCAGGACTGGATTTGGGGTGCAGCCCAGCCTGCTCCCTGCCTTTTAAGCAAAGGTTATCACCAGGCCAGCTAAACTTAGCAATTAGGCTCTTCAGCTAAAAGAGCAGGGGGCTGGTCTCAAGTTGCACTGACCTAGCAAAGAGGCCCCAGGATCCCCCTGCCCAGCACCTGTGGCTGAGCTCCCAAGCCCTTCCCGAGAGCTCAGGATCCACCCTTTCCACCCTCCCTACTCTTCAGAGGAGGAACCCCCTTTCTCCTTCCCACTTGTTGGAGGGGGCTGGGGCCAGGCTGTTCTGGCTTGGGGTATAATACCCCCTACCCCTTCTACTTTCCCCTCCTCTCAGACCTCACCCTGCCTCCACGAGGGCAGCCAAGAAAGGAGAGTCCCTGGCTGCAGGGCCAGTAGGCACGTCCCAGGACGGGGAGGGACTTCCGCCCTCACGTCCAGCTCTCCGCCCTGGGGCTGCAGTGGGTGAAAGGGGCAGTGTCTCCTAGCCTGGGCGGTGCAACCCTCAGGTTCCGAGGAGGAACGCTCTGGGAGGCTTCTTTGCCTCCTCCAACCCAACCCACAACCAGGACATTGTCCTCACCCCGGGGCCCCAACCTAGACCTTAACTGAGGAACACAGAGGCCAGTTTGTAAGTCTCAATTATGCAGGGCATCCCGACCTGTGGCGTAGGGAGCGCCCCTCCAGGCCGCTTCCCTAGCCTCCTCCTGGCCCTCACAGCCCAGGCCTCTGGCCCAAGAAATGGAAGTGGGGGTGGGGGATGGAACTGCGAATGCGAAGGGCCCCCGCAGGAGGCAAAGTGACCCCTCCCGGGCCTTTTCTGCTCCGAGACTTGTTTTTGCCTGTGTCACTACCGAAGAACCACGAGAAGATCCTCAACTTTTCCACAGCCTTTGCATAAAGGGGAGAGGGTCGGCGGTGCAGCTGTGGCACACACGCACTTCTGCTCAACCCGCCCCCCCCCGCCCCCGTTCCTGTTCCTTCCCAGGTTCTCCCCATTTTATCGGGGCGGCAACTTTTAGGTCCCTGGGTCCTGGAAGTCCTTAGTACACACTCTTCGTCCTTAAGTCCATAGTCTGTATTCCCTCGGTCCTATCCTGTCCCCCATCACCGGGTCACCTCCCCAGCGAAGCAATCTCAGTTCCCCTCCCCCTCTCAGCCCCGAGCCCACACGTTTGGTGCGTGCACATTTCAAAAACGAGGCGGGTCCAAAGAGAGGGGGTGGGGAGGTGCCGAGTGGCCCAGCTACTCGCGGCTTTACGGGTGCACGTAGCTCAGGCCTCAGCGCCCTTGAGCTGTGACTGGATGGATGAGCGGGGCGGGAGGCGGGGCGAGCGTCCTCGGCGCTCCCCACCACCCCAGTTCCTATAAATACGGACTGCAGCCCTCCCCGGTGCTCTCTGCTCCTCCCTGTTCTAGAGACAGCCGCATCTTTCCGTGCAGTGCCAGGTGAAAACCGCAGAGTGGGCCGCAGGTGGCCGGGGACGGTCGGAAACGGGGAAGGGGGGCGCTCAGCCCGGGACTGCGGGCGCTGGGGCGAGCTCCACTGCCCGAGCCCGGGCTCCGCATTGCAGAGGCTGGAGGGGGACGTGATGGGGCGCGCGGCGGGAATGGAGGCGGGGGGGGGGGTCGCCCTGTGACCGTGGTCCACGCTGACCTCTCTTTCTTCTCTCTCCCTCCGCAGCCTCGCTCCGGAGACGCAATGGTGAAGGTCGGCGTGAACGGGTGAGTTCGTGGCTGGGCTAGGGTGGGGCTCCGGGTCCCGCTCCGTCGCGTATGCAGGTCTACCCCACCCCGGGGCTCTGCGGGAGCGTGGGGTGGCCGGTGGGTGGCCGCAGCACCCAAGGAGACCTCAAGGTCAGCGAGCCGGCTCCGCCCTTGCGGGGATGAGCAGCGCGGAGTCCTCACGAGGAGGACCATCCCCCGCGCGCACGCATGCTTAGGCTCCATCCCGATCCCCAGCCGGGGGCTTCTTTCTTTACTTTCGCGCCCTGAGGAACCACGTGCCAGACGGGAGCCCCTCCCCCATTGCCCTCTACCCCCCCCCCCGCGCGCGCCTCCAGGTCGGTGGCACCGGGCCGTGCGGTGCCCGCTTTAGCGCATCCATCATCTCCCAAGGGCTTCCTTTAGGGTGGCTGGCCGCCGCCATGTTGCAAACGGGAAGGAAATGAATGAACCACCGTTAGGAAACCTCCCTTCGGCCTTCCTCCTTCCTAGCCCGTGACTAACCTCCCCACTCCCTCCCCGGGTGGAGTCGCCTCTGTACTGTAAGCCAGGTGATGCAAGGCTTCCGTGCTCTCGAGAGAGCTCTACCTCGCCAGCTGTCTCATATTATTAGCCTCAAAGCAGCCCTCAAGCCTCATTTACCTTGAGCATATGATATATTTTGTAGATTCTCTGAGAATCGAAGCGGACTTGGAGAGGTCTGCTTGTCCTTCTCCCAGCCCAAAGGTGGTAGCTATGGCGTAGCGCCGGAGGGGGGAGTGGGGGGGGAGCTGAGTCATGGTGGTTCTGAAAAGAAAATTTCCACCACAAAATGGCTCCGGTGCTAGCATCCCCTTCCCCCCATAACCTCTGCTTCCCATCACACCCTGACCCAAACCCTGTAGGCCAGACTGTAAAGGTCACTAAGAGGATTGAGTGTCTGAGCCTCGGAACCCTGCCCTTCTCCCCATCCCATCCTCTGGAAACCAGATCTCCCCCGCTCCACCCTAATCTGAGGTTATATTTAGCCGGCTGACCTTTCAGTATTTGGGGTCTGGGCCCCTACACACATCTGTTGCTCCTGCTCCTGATTTTTAGCTAGCAAATTCAAGTGCTTTGCAAATTAGAGCCCAGGGATTAGGGGTTGGAAAGCTCAGTGGTTTTCTCAGTCTTTCCCTTTAGGGGGAGGGACTTGGAGGAAGCAGGTGGGCCGACCCCTGTCCTACTCATTCTGACCTTTAACCTTGCCCTTTGAGCTTGATGATGCTGAGTGCACGAGTTCTTCCTGTCCAGGGGGTGTAGCCTGAAGCCAGGCCAGGCTAGAACAAACTTCCCAGGGGGTGGGGGTAGTGAATGCCTTGTGCCCACACAGGGGCACACTGCCACCTCTTGGAGACTTGAAATGACTGGTGGGGGGGTTGGACAAGGCTTTGAGCCCAATCACCTCTTGGACAGGAAAGTAACCCCCACTTTATGGCCCTGCTGTAAAAGCCCAGTCAAACCTCATTTGTCCAAGGAAGATAGACCTCTTGGGGCTTCCTAAGGATAGGGGTGTTCTATATTTGGGCCCTGCTTCTAAGCATTCAGCCAGCTTTATTAAAGGAAATTCATAACAAAACTTGAATTTCCTGCTTCTTAAATACTAATAGTGTGCTGGATCTCCATTAAAAATGCTGTCTTGCACAGTAGGCTATGGTTTCTGTGGGCTCTCTACAGCTATGGGACAACTGGATTCTGTTTTCTGAAGGGCATGTGTCAGCTCAGTACTGACTATAGACCTATGAGTTCTCTGACCCCCTAACTCACCTTTTTTTTTCTTGCCTCAGATTTGGCCGTATTGGACGCCTGG//配列番号11。ベクターpPT2.1には、ハムスターGAPDHプロモーターの部分を含むハムスターGAPDH遺伝子座(配列番号11)の部分、すなわち、配列番号11の次の部分(転写開始点を基準として−532〜+305)が組み込まれている。ACCACGAGAAGATCCTCAACTTTTCCACAGCCTTTGCATAAAGGGGAGAGGGTCGGCGGTGCAGCTGTGGCACACACGCACTTCTGCTCAACCCGCCCCCCCCCGCCCCCGTTCCTGTTCCTTCCCAGGTTCTCCCCATTTTATCGGGGCGGCAACTTTTAGGTCCCTGGGTCCTGGAAGTCCTTAGTACACACTCTTCGTCCTTAAGTCCATAGTCTGTATTCCCTCGGTCCTATCCTGTCCCCCATCACCGGGTCACCTCCCCAGCGAAGCAATCTCAGTTCCCCTCCCCCTCTCAGCCCCGAGCCCACACGTTTGGTGCGTGCACATTTCAAAAACGAGGCGGGTCCAAAGAGAGGGGGTGGGGAGGTGCCGAGTGGCCCAGCTACTCGCGGCTTTACGGGTGCACGTAGCTCAGGCCTCAGCGCCCTTGAGCTGTGACTGGATGGATGAGCGGGGCGGGAGGCGGGGCGAGCGTCCTCGGCGCTCCCCACCACCCCAGTTCCTATAAATACGGACTGCAGCCCTCCCCGGTGCTCTCTGCTCCTCCCTGTTCTAGAGACAGCCGCATCTTTCCGTGCAGTGCCAGGTGAAAACCGCAGAGTGGGCCGCAGGTGGCCGGGGACGGTCGGAAACGGGGAAGGGGGGCGCTCAGCCCGGGACTGCGGGCGCTGGGGCGAGCTCCACTGCCCGAGCCCGGGCTCCGCATTGCAGAGGCTGGAGGGGGACGTGATGGGGCGCGCGGCGGGAATGGAGGCGGGGGGGGGGGTCGCCCTGTGACCGTGGTCCACG
CTGACCTCTCTTTCTTCTCTCTCCCTCCGCAGCCTCGCTCCGGAG//配列番号49;pPT2への1番目のエクソン及びイントロン、ならびに2番目のエクソンのスプライス受容部位。まず、pPT2のベクター部分をXbaI及びSalIで消化し、ゲル精製し、pPT2からCMVプロモーター全体を除去した。CMV IEエンハンサーを、フォワードプライマー5(5’−TGA AGT CTG GAT CCG TTA CAT AAC TTA CGG TAA ATG GC−3’//配列番号14)及びリバースプライマー5(5’−CCA TGG TAA TAG CGA TGA CTA ATA C−3’//配列番号15)を使用したPCR産物により再配置し、最後に、エクソン1及びイントロン1を含むGAPDHプロモーターを、フォワードプライマー6(5’−GTC ATC GCT ATT ACC ATG GCC TCG AGA CCA CGA GAA GAT CCT CAA C−3’//配列番号16)及びリバースプライマー6(5’−CAT TCC ATG GTG GCC TAG TCG ACG CTA GCC TCC GGA GCG AGG CTG−3’//配列番号17)を使用したPCR産物により組み込んだ。これらのPCR反応の鋳型は、それぞれpPT2、pPT2及びpCR4−GAPDHゲノム断片であった。3つ全てのPCR産物を、SLICにより、XbaI及びSalIで線状化したpPT2のベクター部分にクローニングした。
(i)転写開始点を基準とした−532〜−23bp:
ACCACGAGAAGATCCTCAACTTTTCCACAGCCTTTGCATAAAGGGGAGAGGGTCGGCGGTGCAGCTGTGGCACACACGCACTTCTGCTCAACCCGCCCCCCCCCGCCCCCGTTCCTGTTCCTTCCCAGGTTCTCCCCATTTTATCGGGGCGGCAACTTTTAGGTCCCTGGGTCCTGGAAGTCCTTAGTACACACTCTTCGTCCTTAAGTCCATAGTCTGTATTCCCTCGGTCCTATCCTGTCCCCCATCACCGGGTCACCTCCCCAGCGAAGCAATCTCAGTTCCCCTCCCCCTCTCAGCCCCGAGCCCACACGTTTGGTGCGTGCACATTTCAAAAACGAGGCGGGTCCAAAGAGAGGGGGTGGGGAGGTGCCGAGTGGCCCAGCTACTCGCGGCTTTACGGGTGCACGTAGCTCAGGCCTCAGCGCCCTTGAGCTGTGACTGGATGGATGAGCGGGGCGGGAGGCGGGGCGAGCGTCCTCGGCGCTCCCCACCACCCCAGTTCCTATA//(配列番号50);
(ii)イントロン1(+64〜+293):
ACCGCAGAGTGGGCCGCAGGTGGCCGGGGACGGTCGGAAACGGGGAAGGGGGGCGCTCAGCCCGGGACTGCGGGCGCTGGGGCGAGCTCCACTGCCCGAGCCCGGGCTCCGCATTGCAGAGGCTGGAGGGGGACGTGATGGGGCGCGCGGCGGGAATGGAGGCGGGGGGGGGGGTCGCCCTGTGACCGTGGTCCACGCTGACCTCTCTTTCTTCTCTCTCCCTCCGCAGCC//(配列番号51);及び
(iii)イントロン2(+334〜+2145):
GTGAGTTCGTGGCTGGGCTAGGGTGGGGCTCCGGGTCCCGCTCCGTCGCGTATGCAGGTCTACCCCACCCCGGGGCTCTGCGGGAGCGTGGGGTGGCCGGTGGGTGGCCGCAGCACCCAAGGAGACCTCAAGGTCAGCGAGCCGGCTCCGCCCTTGCGGGGATGAGCAGCGCGGAGTCCTCACGAGGAGGACCATCCCCCGCGCGCACGCATGCTTAGGCTCCATCCCGATCCCCAGCCGGGGGCTTCTTTCTTTACTTTCGCGCCCTGAGGAACCACGTGCCAGACGGGAGCCCCTCCCCCATTGCCCTCTACCCCCCCCCCCGCGCGCGCCTCCAGGTCGGTGGCACCGGGCCGTGCGGTGCCCGCTTTAGCGCATCCATCATCTCCCAAGGGCTTCCTTTAGGGTGGCTGGCCGCCGCCATGTTGCAAACGGGAAGGAAATGAATGAACCACCGTTAGGAAACCTCCCTTCGGCCTTCCTCCTTCCTAGCCCGTGACTAACCTCCCCACTCCCTCCCCGGGTGGAGTCGCCTCTGTACTGTAAGCCAGGTGATGCAAGGCTTCCGTGCTCTCGAGAGAGCTCTACCTCGCCAGCTGTCTCATATTATTAGCCTCAAAGCAGCCCTCAAGCCTCATTTACCTTGAGCATATGATATATTTTGTAGATTCTCTGAGAATCGAAGCGGACTTGGAGAGGTCTGCTTGTCCTTCTCCCAGCCCAAAGGTGGTAGCTATGGCGTAGCGCCGGAGGGGGGAGTGGGGGGGGAGCTGAGTCATGGTGGTTCTGAAAAGAAAATTTCCACCACAAAATGGCTCCGGTGCTAGCATCCCCTTCCCCCCATAACCTCTGCTTCCCATCACACCCTGACCCAAACCCTGTAGGCCAGACTGTAAAGGTCACTAAGAGGATTGAGTGTCTGAGCCTCGGAACCCTGCCCTTCTCCCCATCCCATCCTCTGGAAACCAGATCTCCCCCGCTCCACCCTAATCTGAGGTTATATTTAGCCGGCTGACCTTTCAGTATTTGGGGTCTGGGCCCCTACACACATCTGTTGCTCCTGCTCCTGATTTTTAGCTAGCAAATTCAAGTGCTTTGCAAATTAGAGCCCAGGGATTAGGGGTTGGAAAGCTCAGTGGTTTTCTCAGTCTTTCCCTTTAGGGGGAGGGACTTGGAGGAAGCAGGTGGGCCGACCCCTGTCCTACTCATTCTGACCTTTAACCTTGCCCTTTGAGCTTGATGATGCTGAGTGCACGAGTTCTTCCTGTCCAGGGGGTGTAGCCTGAAGCCAGGCCAGGCTAGAACAAACTTCCCAGGGGGTGGGGGTAGTGAATGCCTTGTGCCCACACAGGGGCACACTGCCACCTCTTGGAGACTTGAAATGACTGGTGGGGGGGTTGGACAAGGCTTTGAGCCCAATCACCTCTTGGACAGGAAAGTAACCCCCACTTTATGGCCCTGCTGTAAAAGCCCAGTCAAACCTCATTTGTCCAAGGAAGATAGACCTCTTGGGGCTTCCTAAGGATAGGGGTGTTCTATATTTGGGCCCTGCTTCTAAGCATTCAGCCAGCTTTATTAAAGGAAATTCATAACAAAACTTGAATTTCCTGCTTCTTAAATACTAATAGTGTGCTGGATCTCCATTAAAAATGCTGTCTTGCACAGTAGGCTATGGTTTCTGTGGGCTCTCTACAGCTATGGGACAACTGGATTCTGTTTTCTGAAGGGCATGTGTCAGCTCAGTACTGACTATAGACCTATGAGTTCTCTGACCCCCTAACTCACCTTTTTTTTTCTTGCCTCAGATTTGGC//(配列番号52)。
方法。対数的に増殖するCHO−K1細胞(5E6個)を採取し、これを使用して、CHO−K1ゲノムDNAをQiagen DNeasy Blood and Tissue Kitの使用により抽出した。ハムスターRps3ゲノム領域を含有し、プロモーター及び最初の3つのエクソンを含む、約3.3Kb断片を増幅するためにプライマーを設計した(フォワードプライマー、5’−GAT TAG AAG CCA TCT TGT TAC AA−3’//配列番号33及びリバースプライマー、5’−TAT ATA ACT CTG AAA GTG TCA ACC C−3’//配列番号34)。PCR産物をゲル精製し、InvitrogenのpCR4−TOPO平滑キットを使用してTOPOクローニングした。ポジティブクローンをシークエンシング及び配列確認に供した。
GATTAGAAGCCATCTTGTTACAAATGTCAAAAGATCATTCCTGTTTTCTGTAATACTTGTGTTTGACCATGTCTTGATCCATCTTCTGGAATTTGACATGTTCCACACCTTATACCCTGACCTCCATCCTGACAAGATAAGATGTTCTGCCACTGTCCTACATAACCAAAATGCCTCTTCAAATCGCCCAATCCTTGAAATTTCTGAGCTATATAAATTCTACTTTCTTCTATGTCCAATGCTGTTTTTTCAAACTCCACTTTAGGGAGACAACCCTGTTTGACAGAAAATAAAACTTCCTTAATCTAACTAAAACAATTTGGGTAATGGGCTTTACTTTTATTTGGTGGGATTTGCACAGGGTGAATTGGAGCCCCCTGGAGATGACTGAGCCACGAACACTGTAGTACAAGTTACTGAAGCAGGATTTGCTTCTGGACAAGGAGTGATTGCTGGTGTAGACATCGGAGTCCCTGTGAAGGGATGTCCTGTGGCCCAGACTTACACTTTCTGATAATCTGTCTTCAAAGCCCTGCTAGTTTATTACATTGACAGCTCCCTTCTGGTAGCCCACCCCACTGTGAGTTCAAAAAGTTCAGAGGTCCTGGTGCAAGTGTTTGATACCAGAAATGCTACAGGTAAGTCCATCTTTAGGATCAGGGTTTATCTTTGTAATAAACATCATAGGATTGTAATGTTTTAACAATGACGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTTTGTGTTTGTGTGGGGAGAGCATGCATGGGAAGGTCCTAGGACCTAGGTTCTGTCCTTTGACCTCTGGGTGCTGGGATCGAAATCAAACACCTTTACCTACTAAGTCACCTGGCTGGTCCCCCAAATGAATTTCAATGAGAGTTTTCATTAGTGTGGTCCTGAAGCTATAAGCAATAGGGTTCCAGTCTGGGTAAACTCTGTTAGTGTATGCTTATGTCTGTGGTTTGCATCTCTTGCCTCTTGGTTGCTCTGTTCAAAGTTTTTATTTATTTTTGAGTCGGGGGCTCATGTAGACCAAGCTGGCTTCGAACTCGCTATGTAGTCGAGAATGACCTTGAATTTTTGATTCTCCAGCCTCCACCTCTCTAGTGCTGAAATCACTGGTGTGCTCCTCCACGGTGGGGTACATTGATTGTTTTTCAGACCAGAATTAGATTTGCACTTCCTGTTCCGCCTACACTACGGGTTGCTAGGTTACACTTCTTTTTCTCTTTTCGCCTTTATAAACTCAAAACTTCATTTCCCATGAGCTCTTGCAAGTGTCGCCGTTGCGTGGCGTTGCGTCGTCGTTCCGCGCCCTTTATACACACTTCCGCCCGCGAGCTACTTCCTTTCCTTTCGGTGGCGCGCGGCGGCAAGATGGCGGTGCAGATTTCCAAGAAGAGGAAGGTAAGCATTTCGGACCGGCTCGGGGACTCGCGGCGCGTTTTAAAGCTGCCACGGTGAGACCCGCAGCTCCGTGTCCGATCCCGGAGAGCGGCTACTGCCGCCTGGCGCTTCCGCGGGGCGCGGATGGACGTGGATTGTGTGCTGGGCCGGCTCCGGGCTAGCTCAGTGTGGCTGAGGAAGGGAGGAACAGACGCCTCAGTTCTGGGCCGAGGTGAACACTGGAAGCCATCAGGCCTTTACTAGACGCTTTTGAGCGTCTCTCGGTCGCCAGAATTAGTAACCCTATGGCATAGCTTGAGAGCGTGAGCTAATCCGGCGTCTTTGGTAAGTGAGGTTTAGCAGTGCCGCCTCAGTTGAAAGGCTGCCGACTATTGGCGTGCTCCCTCGGGACCTGCAGCAAAAGCGTCCCGGACTTTTGTCATTTCATGGGGAAGAAGTGTGTGAAGATCATCAGGTTTAGAAATAGATGGCCTGTCTTTGTGATCAAGCACATAGATCATAAAGCTGTTGTCCACATGCTGTTTGGGTTAGATTTGTCCTCTCTTGCTTCAGGTACGAGTTACATACACACACGGTGTTCTTGCTGTGCTGTGTGAACTGCAGATGTGCTACTTGAATAGATTTTTGTTCTGTGTGTGTAAATGTTTTAAAACCCTTCGATGAAGAGGTGATGACGAGTCTGACGGAGGTGTTGTCTTTGTCCAAAAGGCGTCACTGTGCTGCGTTCTGTGGCACAGCTGAAAGCACTATGGTCAAAGGAACTTCCTAAAGATGACCTAGAGGCATTTGTCTGAGAAGGGTTGCTGCATTCCCGAAGGGTCATTGGGGTCGAACTGGGTAAGCCTCTACCCTTTCTTAACTCTGAACTTGCTTTTGGTTTAGTTTGTGGCTGATGGCATCTTCAAAGCAGAGCTGAATGAGTTTCTCACTCGGGAACTGGCTGAAGACGGCTACTCGGGAGTTGAAGTCCGAGTTACACCAACCAGAACAGAAATCATTATTTTAGCCACCAGGTAAAAATATGTTTGACTGGCTATTACCTGTAATCACTGTGTGTATTGAGTTGCTGTGTAAACTTGGAACAACCAACCAGTGAACCTGCTCCTTTTTTGTTGTTGTTTTTTGTTTGTTTTTTGAGACAGGGTTTCTCTGCATTGCTTGGGAGCCTGGCCTGGAACTTGCTCTGTGGATCAGTCTGGCCTAAGACTCACAGAGATCCGCCTGCTCTGCCTCCTGAGTGCTGGGATTAAAGGTGTGCACCACCACCACTGCCTGGCCTTGGAGTTGCTTTTTTAAAACACCATTTGTAAAGAATTTACCTTAATACTTTTTTAAAGTGTGTCCTTGCTGTGTGATAAATGGTATGTGAGGTGTTGCAAATAAATTGTAATTTTCCCTTCTGCAGAACACAAAATGTTCTTGGTGAGAAGGGTCGTCGAATCAGAGAGTTGACTGCGGTAGTTCAGAAGAGGTTCGGCTTCCCTGAGGGCAGCGTAGAGGTGAGTTTCCCTGGTTTATACCAGGGGCAGTAGACTGGATTTAGAAGTTGCTTCTGTAGAACGGTAATTCTGGACAATGAGTAGTACAGGTGGGTTGACACTTTCAGAGTTATATA//配列番号35。
CAAAGAGGTTGAGATCGTACCCACCACTCTGCAAAGGCCAAGTTAGTGTTAAAGTCTGTCCCAAAGCACACATACCATCAAGATAACTCCATAATCATTCTGTAGGGAGGCAGGCTACATAAAGAAACTCAAGGGCAAACCTGTGGGGGTTGAGTCCCCCAAGATTTGCCAATATTTGACTGAAGAAGCTGGAATACCACCTAGAGCCTTCTGAAATGTTTTCTTGCCCCATAAAGGAACTATCATTCATTCGCAGAGTGAGACAGGATCGATTCCTAGACAGCTGGGCAGCTGTCTGGAATTGAGTACATATCTCAGAGCTGGTGGAAAGAAGCCAGGGCCTCACCATGATCTGTGTCTGGACGGCAGCTCCACTGAGGCCAAGGGCTTAGGAGCCTCCATTTCACAGTACATGTGGACCGACATCACAGTGGCATTGTCTAGCTTGAGCCAATCACAGCTCTGGTCCAGAGCCAATTGGGACCTTGTGGCTACCTTACCCTTTGCCTTGCCCTCTGAAGGTGAGTGGTAGGGTGGCCTCAACTCAGGAGTAGTCTATGGATTCTCTTGCTTGCCTTGGTTGTGGCTGACAGCTGAGCCCAAGCTTCTAGGGACTGGTTCCCAAGGCCAGTAGGATCCCAGGGATTGTAGCCTCCTCCATTGACTGGGTGGTCAGTTTAGATGTTGGTCCTGCTCCACAAACATCCCTTCACCAAGAATTAAGCCCAATAGCAAGAGCCACATTCTTTGAAAGAGACCAGAGGCTTTTCAGTTTAACTTAAAGGCCTTTGGGGACTGGGCAGTGGTAGTGCAAGCAAAGCCTTTAATCCTAGCACAAACGAGACAGAGGTAGTTGTATCTGTGATTTTGAGGCCAGCCTGATCTACAGAGTGAGTTCTAGGACAGCTAGAGCTGTTTCACAGAGAAACCCTGTCTGGAAGAAATAAAACAAAAGGCCTTGGAGAGATAAGCTTTAGAATACATGCTTTAGTGTAGTTCTTTTTGTGTATAACATGGTTTCCATATTGGCATAGAGATCACACTGGGCAGATAACCATATTAACTGAGCAGAAAGAATATAAAGTAGGCCTAAGGGAACATTAGTGGAGCTACTGACAATCCTCTCCTTCAGCTGCAATCTATTTTGGGAGATGCCTGAGTATACACAAAGTAAAAGGGCCACTCCATGATTAAGTGTCCAGGTCATAATCCTCGATTGGGTAGGACTGTTTGCTGTTTCAGGGCCACACACGCTCAATAACGCTTCATGAAGTTGAACTTGAGTGGAATCATACTTTGGCCATCACTAGTGCACTATTTGGGGTGAACAGATGTCTTCCCTAGAAGGGGAAATGCCAACACACTACTTCTAGGTGGTCATGTAAAAATTTTTGAAATAGACCGGGCATTGGTGGCACACACCTTTATTCCTACCACTCAGGAGGCAGAGGCAGGTGGATCTCTGTGAATTTGCAATCAGCCTGGTCTACAAGCCCTAGTTGCAAGGCAGCCTCCAAAGTCACAGAGAAACCCTGTCTTGAACGCACCCCCCCCCCCCCCCCCCGCCCAATTTTTTTTTTTTAAAATAACCTGGCTGGAGAGATGGCTCAGAAGTTAAGAGCACTGACTGCCCTTCCGGAGGTCCTGAGTTCAATTCCAGGCAACCTTATGGTGGCTCAAAACCATCTGTAATGAGATTTGGCGCCCTCTTCTGGCATGCAACATACATGTTGGTAGCACACTGTATATATAATAAATAAATCTTGTCTCTGACTCTCAGTGCAAGCAACCACACCCAAGCTCCAGTCATTTAAAGAAGCCAAACACTGAAACCAATGGGAGCTCCTGTAGCATCCTTGTTCTGCTGCTTGATGATCACTCTGGATGAGGAATACCTGTGTGGTGCACAGTACATCTGGAGCATGAGTACAAGACAAGGCCTAACCCAGATGAAACTTGTCACATACACATTTCTACCTGTGTAGTGACATTTGGAAGGCCGAAGCAGGATTGTTAAATTCCATGTCCTCACTGAATACACAGCAGGACCCACTCTCAAAACAAAACAAAACTTAGGGTTCAACTATACGAAACTCCAGTTCCAGGGGCTCAGATATCTTTTTACGGCCACAGGCATCAGACAACGTGGTGCATATACATTCATGCAGGCAAAATAAAAGCGCACTTAAAGAAAAGCTGGAATCTAGCAGGGTGGAATCTAACTTACAGGGGTCTGGCTGCGTCGGCCATCCAGATGCTACCTGTTGGGACTAACACACCCGCCACGAATACGTTTTTCACCTAGATTGACAGAAACCCTCCAAGAAAACCAGAAGAAAAACACAAACAAAACACCACCACCACCACATACACGGTAGGTTATGTTAAACCACTTTATTTGAGAAGAGGACATCGGAACCCTGCCATTTTCGTGGGCGAAGCTGCAGCCGCCTCCAGATCCAGTGGAACCTGTGGATAAAGGACATGGTTAGGATCGATGCCACACACAAGCCAGGCCGCGGGAGCCGCGAGGCGGTCGGGAATGTAGGGGCCTGGGTTTCACCCTCCCACACTGGGGCAGCGGGCGGTGAGCTGAGGCCCCTGTGGCTCTGGGCGCCGAATCTCACCTCCGGCCACAGCCAAGGCCGAAAATGATTTTCAACGAACGCCCATTTACCGAGCCCACGGCGAACGCGAGGCTGACGAGGTACAACCTACCTGAGGCAGAGAGAAAGAGCAGGAAGTGACGAGCACTAGGAGGCCTGAGAGGCGCCACCCGGACTTTTATACACCCTCACAGTCGGCGTACGTCGCGGCTTCGGCGAGGCGATATGCGCAGGCGCAGATGGAACGTGCGGGGCGGGGGGGGGGGAGGTGACAACACGCAGCCAATTACAGCCTGCGTGTGAGCTGAGCAGGCCTGGAGATATCGCGGCGCTAGGGGCACTATAAAGTCTGCCTTCCCCACAGCCGCGCTCTTCTTCTACTTCGGGAAAACACGTGAGTCGTTGTTCCTCAGTCCCGGTGTCGGGGCCTGGGCAGTGGGAATCCGTGGACATCCGGACGGAGACGCCCTTGGGCGGGAGGTCCCCTATCGGAATCCCAAGCGACCGCAAAGCCAATTGTCGTTCTGAGTTGCTTTTTTGCTTCTCTAGCAAATGGCGGATGACGCCGGTGCAGCTGGAGGGCCCGGAGGACCCGGGGGCCCAGGATTAGGAGGTCGCGGAGGCTTCCGCGGAGGCTTTGGCAGCGGTCTCA//配列番号38。
Claims (9)
- 外因性目的遺伝子に機能的に連結されたハムスターGAPDHプロモーターを含む発現カセットを含む、組換え発現ベクターであって、
(a)配列番号35に記載の核酸配列または配列番号38に記載の核酸配列に少なくとも95%同一である、プラス方向である核酸配列を含み、及び
(b)前記プロモーターに機能的に連結された
調節エレメントをさらに含む、組換え発現ベクター。 - 前記GAPDHプロモーターが配列番号50のヌクレオチド配列を含む、請求項1に記載の組換え発現ベクター。
- 前記GAPDHプロモーターの3’側かつ前記目的遺伝子の5’側に、配列番号52のヌクレオチド配列を含む、請求項1または2に記載の組換え発現ベクター。
- 前記調節エレメントが、配列番号35または配列番号38と少なくとも98%同一である核酸配列を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組換え発現ベクター。
- 前記調節エレメントが、配列番号35または配列番号38と少なくとも99%同一である核酸配列を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の組換え発現ベクター。
- 前記調節エレメントが、配列番号35の核酸配列を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の組換え発現ベクター。
- 前記調節エレメントが、配列番号38の核酸配列を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の組換え発現ベクター。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載の組換え発現ベクターを含む、哺乳動物宿主細胞。
- 前記細胞がCHO細胞である、請求項8に記載の哺乳動物宿主細胞。
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