ES2900331T3 - Elementos promotores y reguladores para mejorar la expresión de genes heterólogos en células hospederas - Google Patents

Abstract

Un vector de expresión recombinante, caracterizado porque comprende un casete de expresión que comprende un promotor GAPDH de hámster, ligado operablemente a un gen exógeno de interés, que comprende además un elemento regulatorio que (a) es al menos 95% idéntica a la secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ ID NO: 35; y (b) está operablemente ligado al promotor, en donde el elemento regulatorio está en la orientación positiva.

Description

DESCRIPCIÓN

Elementos promotores y reguladores para mejorar la expresión de genes heterólogos en células hospederas

La solicitud actual contiene un listado de secuencias.

Antecedentes de la invención

1. Campo de la invención

La presente invención se dirige al campo de la expresión del gen recombinante.

2. Análisis de la técnica relacionada

Existe una gran demanda para las moléculas biológicas tales como proteínas, y particularmente anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, por ejemplo, biológicos que incluyen la región Fc de la inmunoglobulina.

Los sistemas de expresión para la producción de polipéptidos recombinantes son bien conocidos en el estado del arte y se describen por, por ejemplo, Marino M H (1989) Biopharm, 2: 18-33; Goeddel D V et al. (1990) Methods Enzymol 185: 3-7; Wurm F & Bernard A (1999) Curr Opin Biotechnol 10: 156-159. Los polipéptidos para uso en aplicaciones farmacéuticas se producen preferiblemente en células mamíferas tales como células de Ovario de Hámster Chino (CHO, por sus siglas en inglés), células NS0, células SP2/0, células COS, células HEK, células BHK, o los similares. Varias líneas celulares derivadas de CHO son bien adecuadas particularmente para la producción industrial de muchas moléculas biológicas terapéuticas diferentes. (Por ejemplo, Hu et al., EUA 6,210,924 B1).

Los elementos esenciales de un vector de expresión usados para este propósito se seleccionan normalmente de una unidad de propagación de plásmido procariótico, por ejemplo E. coli, que comprende un origen procariótico de replicación y un marcador de selección procariótico, opcionalmente un marcador de selección eucariótico, y uno o más casetes de expresión para la expresión de los genes estructurales de interés cada uno comprende un promotor, una secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido, y opcionalmente un terminador de transcripción que incluye una señal de poliadenilación. Para la expresión transitoria en células mamíferas un origen mamífero de replicación, tal como el SV40 Ori u OriP, puede incluirse. Como promotor puede seleccionarse un promotor inducible o constitutivo. Para la transcripción optimizada puede incluirse una secuencia Kozak en la región no traducida 5’. Para el procesamiento de mARN, en particular terminación de transcripción y empalme de mARN, señales de empalme de mARN, dependiendo de la organización del gen estructural (organización de exón/intrón), puede incluirse así como una señal de poliadenilación. La expresión de un gen se realiza ya sea en transitorio o usando una línea celular estable. Sin embargo, el nivel de expresión alta y estable de un polipéptido en una línea celular de producción es crucial para el proceso general de la producción industrial de los polipéptidos recombinantes.

El alto costo y el rendimiento relativamente pobre han sido factores limitantes en la disponibilidad de las moléculas biológicas y han sido un enfrentamiento principal para desarrollar procesos robustos que incrementan establemente el rendimiento de las moléculas biológicas deseables en una escala industrial. La presente invención proporciona estos y otros beneficios.

El documento WO 2006/123097 divulga elementos genéticos derivados de regiones no traducidas 5’ de genes de proteínas ribosómicas que pueden comprender una isla CpG y vectores que comprenden tales elementos; se cree que estos elementos mejoran la expresión. El documento WO 2008/085962 divulga métodos de cultivo celular para producir proteínas recombinantes y reducir los niveles de uno o más contaminantes utilizando elementos de ADN con islas CpG libres de metilación extendidas. Williams, S. et al. (BMC Biotechnol. 5(1), 2005, pág. 17) divulga que fragmentos de la isla CpG del locus genómico HNRPA2B1/CBX3 reducen el silenciamiento y potencian la expresión transgénica a partir del potenciador/promotor de hCMV en células de mamífero. Kwaks, T. et al. (Nature Biotechnol.

21 (5), 2003, págs. 553-8) divulga la identificación de elementos antirrepresores que confieren una producción de proteínas elevada y estable en células de mamífero. El documento WO 2013/084157 divulga casetes de expresión útiles para expresar un polipéptido en una célula hospedera basándose en el promotor de GAPDH. Le Foum, V. et al. (Metabolic Engineering 21, 2014, págs. 91-102) describe métodos para la modificación de células CHO mediante ingeniería genética para prevenir la agregación de polipéptidos y mejorar la secreción de proteínas terapéuticas.

Sumario de la invención

La presente invención involucra un vector de expresión recombinante, que comprende un casete de expresión que comprende un promotor de deshidrogenasa de gliceraldehído-3-fosfato de hámster (GAPDH, por sus siglas en inglés) (EC 1.2.1.12; GAPDH), operablemente ligado a un gen exógeno de interés. El vector de expresión también incluye un elemento regulatorio que (a) comprende una secuencia de ácido nucleico que es al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, o 100% idéntica a la SEQ ID NO:35; y (b) está operablemente ligado al promotor. Las secuencias del elemento regulatorio SEQ ID NO; 35 no se encuentra naturalmente sobre los mismos cromosomas del hámster como la secuencia promotora de GAPDH.

En modalidades del vector de expresión recombinante, el elemento regulatorio está en la orientación positiva.

La presente invención también se dirige a una célula hospedera mamífera que contiene el vector de expresión, por ejemplo, una célula de Ovario de Hámster Chino (CHO).

La presente invención es particularmente útil para crear líneas celulares pretendidas para la producción industrial de biológicos, tales como proteínas enlazadas al antígeno, hormonas, u otros péptidos terapéuticos, una conFIGURAción en la cual se necesita la expresión recombinante de rendimiento alto y estable de proteínas exógenas.

Estos y otros beneficios se describirán adicionalmente a continuación.

Breve descripción de los dibujos

La FIGURA 1 es una representación esquemática de los casetes de expresión contenidos en el vector de expresión estable pPT1 y pPT2. No se muestra la estructura del vector la cual contiene secuencias que no impactan los resultados presentados aquí.

La FIGURA 2 es una representación esquemática de los casetes de expresión contenidos en el vector de expresión estable pPT2.1. No se muestra la estructura del vector la cual contiene secuencias que no impactan los resultados presentados aquí.

La FIGURA 3 muestra un resumen de las titulaciones del grupo de expresión estable CHO-S derivados de la transfección y selección con pPT2 y pPT2.1. Las células que expresan establemente estos vectores se sembraron en células 1 E6/ml en una placa de pozo profundo de 24 pozos. El medio acondicionado (CM, por sus siglas en inglés) se cosechó 6 días después. Las titulaciones de la proteína Fc humana en el CM (reportado como mg/L) se determinaron por ForteBIO y los intervalos se muestran de transfecciones en triplicado de 2 experimentos separados.

La FIGURA 4 es una representación esquemática de los casetes de expresión contenidos en el vector de expresión estable pPT2.4. No se muestra la estructura del vector la cual contiene secuencias que no impactan los resultados presentados aquí.

La FIGURA 5 muestra un resumen de las titulaciones del grupo de expresión estable de CHO-S derivados de la transfección y selección con pPT2.1 y pPT2.4. Las células que expresan establemente estos vectores se sembraron en células 1 E6/ml en una placa de pozo profundo de 24 pozos. El medio acondicionado (CM) se cosechó 6 días después. Las titulaciones de la proteína Fc humana en CM (reportado como mg/L) se determinaron por ForteBIO y los intervalos se muestran de las transfecciones en triplicado.

La FIGURA 6 es una representación esquemática de los casetes de expresión contenidos en el vector de expresión estable pPT3. No se muestra la estructura del vector la cual contiene secuencias que no impactan los resultados presentados aquí.

La FIGURA 7 muestra grupos de expresión estable CHO-S derivados de la transfección y selección con pPT2, pPT2.4, y pPT3. Los grupos recuperados se mantuvieron en cultivo para los siguientes puntos de tiempo: derecha después de la recuperación de la selección (inicial); un mes y 2 meses después de la selección. Las células luego se sembraron en células 1 E6/ml en una placa de pozo profundo de 24 pozos. El medio acondicionado se cosechó 6 días después y las titulaciones determinadas por ForteBIO. Las barras de resultados para cada vector indicadas sobre el eje x se establecen de izquierda a derecha en los siguientes puntos de tiempo: inicial, 1 mes, y 2 meses.

La FIGURA 8 es una representación esquemática de los casetes de expresión contenidos en el vector de expresión estable pPT4.x. No se muestra la estructura del vector la cual contiene secuencias que no impactan los resultados presentados aquí.

La FIGURA 9 muestra los grupos de expresión estable CHO-S derivados de la transfección y selección con, pPT3, pPT4, pPT4.1, pPT4.2, pPT4.3. Los grupos recuperados se mantuvieron en el cultivo para los siguientes puntos de tiempo: derecha después de la recuperación de la selección (inicial); un mes y 2 meses después de la selección. Las células luego se sembraron en células 1 E6/mL en una placa de pozo profundo de 24 pozos. El medio acondicionado se cosechó 6 días después y las titulaciones determinadas por ForteBIO. Las barras de resultados para cada vector indicadas sobre el eje x se establecieron de izquierda a derecha en los siguientes puntos de tiempo: inicial, 2 semanas, 1 mes, y 2 meses.

Descripción detallada de las modalidades

Los encabezados de la sección usados en la presente son para propósitos organizacionales.

Definiciones

A menos que se define de otra manera en la presente, los términos técnicos y científicos usados en conexión con la presente solicitud tendrán los significados que se entienden comúnmente por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica. Además, a menos que se requiera de otra manera por el contexto, los términos singulares incluirán pluralidades y los términos plurales incluirán el singular. De esta manera, como se usa en esta especificación y las reivindicaciones anexas, las formas singulares “un”, “uno” y “el” incluyen los referentes plurales a menos que el contexto claramente lo indique de otra manera. Por ejemplo, la referencia a “una proteína” incluye una pluralidad de proteínas; la referencia a “una célula” incluye poblaciones de una pluralidad de células. Las referencias a “yEx” significa, y se usan intercambiablemente con, “y x 10z”, donde y es un número multiplicado por un cierto exponente de 10, y z es el exponente, por ejemplo “1E6” igual a 1 x 106, o “5E6” igual a 5 x 106, o “5E-6” igual a 5 x 10-6.

“Mamífero” se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoológico, de deportes, o mascotas, tales como perros, caballos, gatos, vacas, roedores (por ejemplo, ratas, ratones, conejillos de indias, hámsteres), conejos, cerdos, ovejas, cabras, primates (por ejemplo, monos, simios), etc. un mamífero “no humano” es un mamífero diferente de un humano. Una célula de mamífero es una célula originalmente derivada de un mamífero.

Como se usa en la presente, los términos “medio de cultivo celular” y “medio de cultivo” se refieren a una solución de nutriente usada para hacer crecer células de mamífero in vitro que típicamente proporcionan al menos un componente de una o más de las siguientes categorías: 1) una fuente de energía, usualmente en la forma de un carbohidrato tal como, por ejemplo, glucosa; 2) uno o más de todos los aminoácidos esenciales, y usualmente el conjunto básico de veinte aminoácidos más cisteína; 3) vitaminas y/u otros compuestos orgánicos requeridos en concentraciones bajas; 4) ácidos grasos libres; y 5) elementos traza, donde los elementos traza se definen como compuestos inorgánicos o elementos que se presentan naturalmente que se requieren típicamente en concentraciones muy bajas, usualmente en el intervalo micromolar. La solución de nutriente puede opcionalmente complementarse con componentes adicionales para optimizar el crecimiento, reprogramación y/o diferenciación de las células.

El cultivo celular de mamífero dentro de la presente invención se prepara en un medio adecuado para la célula particular que está cultivada. Los medios de cultivo celular adecuados que pueden usarse para cultivar un tipo de célula particular deberán ser aparentes para alguien de experiencia ordinaria en la técnica. Los medios comercialmente disponibles ejemplares incluyen, por ejemplo, F10 de Ham (SIGMA), Medio Esencial Mínimo (MEM, por sus siglas en inglés, SIGMA), RPMI-1640 (SiGm A), Medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM, por sus siglas en inglés, SIGMA), y DMEM/F12 (Invitrogen). Cualquiera de estos u otros medios adecuados para ser complementados como necesarios con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como pero no limitados a insulina, transferrinas, o factor del crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio, y fosfato), amortiguadores (tales como HEPES), nucleósidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como puromicina, neomicina, higromicina, blasticidina, o Gentamycin), elementos traza (definidos como compuestos inorgánicos usualmente presentes en concentraciones finales en el intervalo micromolar) lípidos (tales como linoleico u otros ácidos grasos) y sus portadores adecuados, y glucosa o una fuente de energía equivalente, y/o modificados como se describe en la presente para facilitar la producción de glicoproteínas recombinantes que tienen contenido bajo de manosa. En modalidades particulares, el medio de cultivo celular está libre de suero.

Cuando el medio definido que está libre de suero y/o libre de peptona se usa, el medio está usualmente enriquecido por aminoácidos, vitaminas y/o elementos traza particulares (ver, por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 5,122,469 para Mather et al., y Patente de E.U.A. No. 5,633,162 para Keen et al.). Dependiendo de los requerimientos de la línea celular particular usados o método, el medio de cultivo puede contener un aditivo de suero tal como Suero de Bovino Fetal, o un reemplazo de suero. Los ejemplos de reemplazos de suero (para crecimiento libre de suero de las células) son TCH.TM., TM-235.TM., y TCH.TM.; estos productos están comercialmente disponibles de Celox (St. Paul, Minn.), y KOSR (reemplazo del suero inactivado (KO, por sus siglas en inglés); Invitrogen).

En los métodos y composiciones de la invención, las células pueden hacer crecer en medios libres de suero, libres de proteína, libres del factor de crecimiento, y/o libres de peptona. El término “libre de suero” como se aplica a medios en general incluye cualquier medio de cultivo celular mamífero que no contiene suero, tal como suero de bovino fetal (FBS). El término “libre de insulina” como se aplica a medios incluye cualquier medio al cual no se ha agregado insulina exógena. Por exógeno significa, en este contexto, diferente de aquel producido por el cultivo de las células por sí mismas. El término “libre del factor de crecimiento” como se aplica a medios incluye cualquier medio al cual no se ha agregado el factor de crecimiento exógeno (por ejemplo, insulina, IGF-1). El término “libre de peptona” como se aplica a medios incluye cualquier medio al cual no se ha agregado hidrolisados de proteína exógena tales como, por ejemplo, hidrolisados de proteína de animal y/o planta.

Óptimamente, para propósitos de la presente invención, el medio de cultivo usado está libre de suero, o esencialmente libre de suero a menos que el suero se requiera por los métodos inventivos o por el crecimiento o mantenimiento de una línea celular o tipo de célula particular. Por “libre de suero”, se entiende que la concentración de suero en el medio es preferiblemente menos que 0.1% (v/v) de suero y más preferiblemente menos que 0.01% (v/v) de suero. Por “esencialmente libre de suero” significa que menos que alrededor de 2% (v/v) de suero está presente, más preferiblemente menos que alrededor de 1% de suero está presente, todavía más preferiblemente menos que alrededor de 0.5% (v/v) de suero está presente, aún todavía más preferiblemente menos que alrededor de 0.1% (v/v) de suero está presente. “Cultivo” o “incubación” (usado intercambiablemente con respecto al crecimiento, reprogramación, diferenciación, y/o mantenimiento de las células o líneas celulares) es bajo condiciones de esterilidad, temperatura, pH, contenido de gas atmosférico (por ejemplo, oxígeno, dióxido de carbono, dinitrógeno), humedad, contenedor de cultivo, volumen de cultivo, paso, movimiento, y otros parámetros adecuados para el propósito pretendido y conocidos convencionalmente en la técnica del cultivo celular de mamífero.

“Polipéptido” y “proteína”, o “molécula proteinácea” se usan intercambiablemente en la presente e incluyen una cadena molecular de dos o más aminoácidos ligados covalentemente a través de enlaces de péptido. Los términos no se refieren a una longitud específica del producto. De esta manera, “péptidos,” y “oligopéptidos,” se incluyen dentro de la definición de polipéptido. Los términos incluyen modificaciones post-traduccionales del polipéptido, por ejemplo, glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y los similares. Además, los fragmentos de proteína, análogos, proteínas variantes o mutadas, proteínas de fusión y los similares se incluyen dentro del significado de polipéptido. Los términos también incluyen moléculas en las cuales uno o más análogos de aminoácido o aminoácidos no canónicos o no naturales se incluyen como puede expresarse recombinantemente usando técnicas conocidas de procesamiento por ingeniería de proteína. Además, las proteínas de fusión pueden estar derivatizadas como se describe en la presente por técnicas bien conocidas de química orgánica. El término “proteína de fusión” indica que la proteína incluye componentes de polipéptido derivados de más de un polipéptido o proteína precursora. Típicamente, una proteína de fusión está expresada de un gen de fusión en el cual una secuencia de nucleótido que codifica una secuencia de polipéptido de una proteína se adjunta en el cuadro con, y opcionalmente separada por una ligadura de, una secuencia de nucleótido que codifica una secuencia de polipéptido de una proteína diferente. El gen de fusión luego puede expresarse por una célula hospedera recombinante como una proteína sencilla.

El término “proteína enlazada al antígeno” (ABP) incluye un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, como se define arriba, un BiTE (enganchador de célula T bi-específico) (por ejemplo, Baeuerle PA, et al., BiTE: Teaching antibodies to engage T-cells for cancer therapy, Curr Opin Mol Ther. 11(1 ):22-30 (2009)), o un BiKE (enganchador de célula exterminadora bi-específica) (por ejemplo, Gleason et al., Bispecific and trispecific killer cell engagers directly activate human NK cells through CD16 signaling and induce cytotoxicity and cytokine production, Mol. Cancer Ther. 11 (12):1-11 (2012)), y péptidos recombinantes u otros compuestos que contienen secuencias derivadas de las CDRs que tienen las propiedades deseadas que enlazan al antígeno de manera que enlazan específicamente un antígeno objetivo de interés. El término “antígeno” se refiere a una molécula o una porción de una molécula capaz de enlazarse por un agente de enlace selectivo, tal como una proteína enlazada al antígeno (que incluye, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento funcional inmunológico del mismo), y adicionalmente capaz de usarse en un animal para producir anticuerpos capaces de enlazar a tal antígeno. Un antígeno puede poseer uno o más epítopos que son capaces de interactuar con diferentes proteínas enlazadas al antígeno, por ejemplo, anticuerpos. El término “epítopo” es la porción de una molécula que se enlaza por una proteína enlazada al antígeno (por ejemplo, un anticuerpo). El término incluye cualquier determinante capaz de enlazar específicamente a una proteína enlazada al antígeno, tales como un anticuerpo o a un receptor de célula T. Un epítopo puede ser contiguo o no contiguo (por ejemplo, en un polipéptido de cadena sencilla, residuos de aminoácidos que no son contiguos uno con el otro en la secuencia de polipéptido pero que dentro del contexto de la molécula se enlazan por la proteína enlazada al antígeno). En ciertas modalidades, los epítopos pueden ser miméticos en que comprenden una estructura tridimensional que es similar a un epítopo usado para generar la proteína enlazada al antígeno, pero no comprenden ninguno o sólo algunos de los residuos de aminoácidos encontrados en tal epítopo usados para generar la proteína enlazada al antígeno. Más a menudo, los epítopos residen sobre las proteínas, pero en algunos casos pueden residir sobre otros tipos de moléculas, tales como ácidos nucleicos. Los determinantes de epítopo pueden incluir agrupaciones de superficie químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcar, grupos de fosforilo o sulfonilo, y pueden tener características estructurales tridimensionales específicas, y/o características de carga específicas. Generalmente, los anticuerpos específicos para un antígeno objetivo particular preferencialmente reconocerán un epítopo sobre el antígeno objetivo en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas.

El término “anticuerpo” se usa en el sentido más amplio e incluye anticuerpos completamente ensamblados, anticuerpos monoclonales (que incluyen anticuerpos humanos, humanizados o quiméricos), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), y fragmentos de anticuerpo que pueden enlazar al antígeno (por ejemplo, Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, anticuerpos de cadena sencilla, diacuerpos), que comprenden regiones que determinan la complementariedad (CDRs) de los anteriores siempre y cuando exhiban la actividad biológica deseada. Los multímeros o agregados de moléculas y/o fragmentos intactos, que incluyen anticuerpos químicamente derivados, se contemplan. Los anticuerpos de cualquier clase o subclase de isotipo, que incluyen IgG, IgM, IgD, IgA, e IgE, IgG 1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2, o cualquier alotipo, se contemplan. Diferentes isotipos tienen diferentes funciones efectoras; por ejemplo, isotipos IgG1 e IgG3 típicamente tienen actividad de citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC). Los anticuerpos glicosilados y no glicosilados se incluyen dentro del término “anticuerpo”.

En general, una proteína enlazada al antígeno, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, “específicamente enlaza” a un antígeno cuando tiene una afinidad de enlace significativamente superior para, y consecuentemente es capaz de distinguir, qué antígeno, comparado con su afinidad para otras proteínas no relacionadas, bajo condiciones de ensayo de enlace similares. Típicamente, una proteína enlazada al antígeno se dice que “específicamente enlaza” su antígeno objetivo cuando la constante de disociación de equilibrio (Kd) es <10-8 M. El anticuerpo específicamente enlaza al antígeno con “alta afinidad” cuando la Kd es <5x 10-9 M, y con “afinidad muy alta” cuando la Kd es <5x 10-10 M. En una modalidad, los anticuerpos enlazarán a un objetivo de interés con una Kd de entre alrededor de 10-8 M y 10-10 M, y en aún otra modalidad los anticuerpos se enlazarán con una Kd <5x 10-9. En modalidades particulares la proteína enlazada al antígeno, la proteína enlazada al antígeno aislada específicamente enlaza a un antígeno objetivo de interés expresado por una célula de mamífero (por ejemplo, CHO, HEK 293, Jurkat), con una Kd de 500 pM (5.0 x 10-10 M) o menos, 200 pM (2.0 x 10-10 M) o menos, 150 pM (1.50 x 10-10 M) o menos, 125 pM (1.25 x 10-10 M) o menos, 105 pM (1.05 x 10-10 M) o menos, 50 pM (5.0 x 10-11 M) o menos, o 20 pM (2.0 x 10-11 M) o menos, como se determina por un ensayo de Exclusión Cinético, conducido por el método de Rathanaswami et al. (2008) (Rathanaswami et al., High affinity binding measurements of antibodies to cell-surface-expressed antigens, Analytical Biochemistry 373:52-60 (2008; ver, por ejemplo, Ejemplo 15 en la presente).

Las proteínas enlazadas al antígeno también incluyen pepticuerpos. El término “pepticuerpo” se refiere a una molécula que comprende un dominio Fc de anticuerpo unido a al menos un péptido. La producción de pepticuerpos se describe generalmente en la publicación de PCT WO 00/24782, publicada el 4 de mayo de 2000. Cualquiera de estos péptidos pueden ligarse en tándem (es decir, secuencialmente), con o sin ligaduras. Los péptidos que contienen un residuo de cisteinilo pueden reticularse con otro péptido que contiene Cys, cualquiera o ambos de los cuales pueden ligarse a un vehículo. Cualquier péptido que tiene más de un residuo Cys puede formar un enlace de disulfuro de intrapéptido, también. Cualquiera de estos péptidos puede derivarse, por ejemplo la terminal carboxilo puede taparse con un grupo amino, las cisteínas pueden taparse, o los residuos de aminoácidos pueden sustituirse por porciones diferentes de los residuos de aminoácidos (ver, por ejemplo, Bhatnagar et al., J. Med. Chem. 39: 3814-9 (1996), y Cuthbertson et al., J. Med. Chem. 40: 2876-82 (1997)). Las secuencias de péptido pueden ser optimizados, análogos a la maduración de afinidad para los anticuerpos, o de otra manera alterados por exploración de alanina o mutagénesis dirigida o aleatoria seguida por selección para identificar los mejores enlazadores. Lowman, Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26: 401 -24 (1997). Varias moléculas pueden insertarse en la estructura de proteína enlazada al antígeno, por ejemplo, dentro de la porción de péptido por sí misma o entre el péptido y las porciones de vehículo de las proteínas enlazadas al antígeno, mientras que mantiene la actividad deseada de la proteína enlazada al antígeno. Alguien puede fácilmente insertar, por ejemplo, moléculas tales como un dominio Fc o fragmento del mismo, polietilen glicol u otras moléculas relacionadas tales como dextrano, un ácido graso, un lípido, un grupo de colesterol, un carbohidrato pequeño, un péptido, una porción detectable como se describe en la presente (que incluye agentes fluorescentes, radioetiquetas tales como radioisótopos), un oligosacárido, oligonucleótido, un polinucleótido, ARN de interferencia (u otro), enzimas, hormonas, o los similares. Otras moléculas adecuadas para inserción de esta manera se apreciarán por aquellos experimentados en la técnica, y se abarcan dentro del alcance de la invención. Esto incluye inserción de, por ejemplo, una molécula deseada entre dos aminoácidos consecutivos, opcionalmente unidos por una ligadura adecuada.

El término “recombinante” indica que el material (por ejemplo, un ácido nucleico o un polipéptido) ha sido alterado artificialmente o sintéticamente (esto es, no naturalmente) por intervención humana. La alteración puede realizarse sobre el material dentro de, o removerse de, su estado o ambiente natural. Por ejemplo, un “ácido nucleico recombinante” es uno que se hace al recombinar ácidos nucleicos, por ejemplo, durante la clonación, transposición de ADN u otros procedimientos biológicos moleculares bien conocidos. Los ejemplos de tales procedimientos biológicos moleculares se encuentran en Maniatis et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York (1982). Una “molécula de ADN recombinante,” está comprendida de segmentos de ADN unidos juntos por medio de tales técnicas biológicas moleculares. El término “proteína recombinante” o “polipéptido recombinante” como se usa en la presente se refiere a una molécula de proteína la cual se expresa usando una molécula de ADN recombinante. Una “célula hospedera recombinante” es una célula que contiene y/o expresa un ácido nucleico recombinante.

El término “polinucleótido” o “ácido nucleico” incluye tanto polímeros de nucleótido de hebra sencilla como de hebra doble que contienen dos o más residuos de nucleótidos. Los residuos de nucleótido que comprenden el polinucleótido pueden ser ribonucleótidos o desoxiribonucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. Las modificaciones incluyen modificaciones base tales como derivados de bromouridina e inosina, modificaciones de ribosa tales como 2’,3’-didesoxiribosa, y modificaciones de ligadura de internucleótido tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato y fosforoamidato.

El término “oligonucleótido” significa un polinucleótido que comprende 200 o menos residuos de nucleótido. En algunas modalidades, los oligonucleótidos tienen 10 hasta 60 bases de longitud. En otras modalidades, los oligonucleótidos tienen 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 hasta 40 nucleótidos de longitud. Los oligonucleótidos pueden ser de hebra sencilla o hebra doble, por ejemplo, para uso en la construcción de un gen mutante. Los oligonucleótidos pueden ser oligonucleótidos de sentido o antisentido. Un oligonucleótido puede incluir una etiqueta, que incluye una etiqueta isotópica (por ejemplo, 125I, 14C, 13C, 35S, 3H, 2H, 13N, 15N, 18O, 17O, etc.), para facilidad de cuantificación o detección, una etiqueta fluorescente, un hapteno o una etiqueta antigénica, para ensayos de detección. Los oligonucleótidos pueden usarse, por ejemplo, como cebadores PCR, cebadores de clonación o sondas de hibridación.

Una “secuencia de polinucleótido” o “secuencia de nucleótido” o “secuencia de ácido nucleico,” como se usa intercambiablemente en la presente, es la secuencia primaria de los residuos de nucleótido en un polinucleótido, que incluyen de un oligonucleótido, un ADN, y ARN, un ácido nucleico, o una cadena de caracteres que representan la secuencia primaria de los residuos de nucleótido, dependiendo del contexto. De cualquier secuencia de polinucleótido específica, ya sea el ácido nucleico dado o la secuencia de polinucleótido complementaria puede determinarse. Incluidos son ADN o ARN de origen genómico o sintético los cuales pueden ser de hebra sencilla o doble, y representan la hebra de sentido o antisentido. A menos que se especifique de otra manera, el extremo del lado izquierdo de cualquier secuencia de polincuelótido de hebra sencilla discutido en la presente es el extremo 5’; la dirección del lado izquierdo de las secuencias de polinucleótido de hebra doble se refiere como la dirección 5’. La dirección de la adición 5' hasta 3' de los transcriptos de ARN nacientes se refiere como la dirección de transcripción; las regiones de secuencia sobre la hebra de ADN que tienen la misma secuencia como el transcripto de ARN que son 5' hasta el extremo 5' del transcripto de ARN se refieren como “secuencia cadena arriba;” las regiones de secuencia sobre la hebra de ADN que tienen la misma secuencia como el transcripto de ARN que son 3' hasta el extremo 3' del transcripto de ARN se refieren como “secuencias cadena abajo.”

“Orientación” se refiere al orden de los nucleótidos en una secuencia de ADN dada. Por ejemplo, una orientación de una secuencia de ADN en dirección opuesta en relación a otra secuencia de ADN es una en la cual el orden de 5' hasta 3' de la secuencia en relación a otra secuencia está inversa cuando se compara con un punto de referencia en el ADN del cual la secuencia se obtuvo. Tales puntos de referencia pueden incluir la dirección de la transcripción de otras secuencias de ADN específicas en el ADN fuente y/o el origen de replicación de vectores replicables que contienen la secuencia. La hebra de ADN 5' hasta 3' está designada, para un gen dado, como hebra de “sentido,” “positiva” o de “codificación”. La hebra 3' hasta 5' complementaria relativa a la hebra “positiva” se describe como “antisentido,” “negativa” o “no de codificación.”

Como se usa en la presente, una “molécula de ácido nucleico aislada” o “secuencia de ácido nucleico aislada” es una molécula de ácido nucleico que es ya sea (1) identificada y separada de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la cual se asocia ordinariamente en la fuente natural del ácido nucleico o (2) clonada, amplificada, etiquetada, o de otra manera distinguida de los ácidos nucleicos de fondo de manera la secuencia del ácido nucleico de interés puede determinarse. Una molécula de ácido nucleico aislada es diferente en la forma o ajuste en la cual se encuentra en la naturaleza. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en las células que expresan ordinariamente un polipéptido (por ejemplo, un oligopéptido o anticuerpo) donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una ubicación cromosomal diferente de aquella de las células naturales.

Como se usa en la presente, los términos “molécula de ácido nucleico que codifica,” “secuencia de ADN que codifica,” y “ADN que codifica” se refiere al orden o secuencia de los desoxiribonucleótidos a lo largo de una hebra del ácido desoxiribonucleico. El orden de estos desoxiribonucleótidos determina el orden los ribonucleótidos a lo largo de la cadena de mARN, y también determina el orden de los aminoácidos a lo largo de la cadena de polipéptido (proteína). La secuencia de a Dn de esta manera se codifica para la secuencia de ARN y para la secuencia de aminoácidos.

El término “gen” se usa ampliamente para referir a cualquier ácido nucleico asociado con una función biológica. Los genes típicamente incluyen secuencia de codificación y/o las secuencias regulatorias se requieren para la expresión de tales secuencias de codificación. El término “gen” aplica a una secuencia recombinante o genómica específica, así como a un cADN o mARN codificado por tal secuencia. Un “gen de fusión” contiene una región de codificación que codifica un polipéptido con porciones de diferentes proteínas que no se encuentran naturalmente juntas, o no se encuentran naturalmente juntos en la misma secuencia como se presenta en la proteína de fusión codificada (es decir, una proteína quimérica). Los genes también incluyen segmentos de ácido nucleico no expresados que, por ejemplo, forman secuencias de reconocimiento para otras proteínas. Las secuencias regulatorias no expresadas que incluyen elementos de control transcripcionales a los cuales las proteínas regulatorias, tales como factores de transcripción, enlace, resultando en la transcripción de secuencias cercanas o adyacentes.

“Expresión de un gen” o “expresión de un ácido nucleico” significa la transcripción de ADN en ARN (opcionalmente que incluye modificación del ARN, por ejemplo, empalme), traducción de ARN en un polipéptido (posiblemente que incluye modificación post-traduccional posterior del polipéptido), o tanto transcripción como traducción, como se indica por el contexto.

Como se usa en la presente el término “región de codificación” o “secuencia de codificación” cuando se usa en referencia a un gen estructural se refiere a las secuencias de nucleótido que codifican los aminoácidos encontrados en el polipéptido naciente como un resultado de la traducción de una molécula de mARN. La región de codificación se enlaza, en eucariotas, sobre el lado 5' por el nucleótido triplete “ATG” el cual codifica la metionina iniciadora y sobre el lado 3' por uno de los tres tripletes que especifican los codones de paro (es decir, TAA, TAG, TGA).

El término “secuencia de control” o “señal de control” se refiere a una secuencia de polinucleótido que puede, en una célula hospedera particular, afecta la expresión y procesamiento de las secuencias de codificación a las cuales se liga. La naturaleza de tales secuencias de control puede depender del organismo hospedero. En modalidades particulares, las secuencias de control para procariotas pueden incluir un promotor, un sitio enlazado ribosómico, y una secuencia de terminación de transcripción. Las secuencias de control para eucariotas pueden incluir promotores que comprenden uno o una pluralidad de sitios de reconocimiento para los factores de transcripción, elementos o secuencias aumentadoras de la transcripción, sitios de poliadenilación, y secuencias de terminación de transcripción. Las secuencias de control pueden incluir secuencias líderes y/o secuencias compañeras de fusión. Los promotores y aumentadores consisten de arreglos cortos de ADN que interactúan específicamente con proteínas celulares involucradas en la transcripción (Maniatis, et al., Science 236:1237 (1987)). Los elementos promotores y reguladores se han aislado de una variedad de fuentes eucarióticas que incluyen genes en las células de levadura, insecto y mamífero y virus (elementos de control análogos, es decir, promotores, también se encuentran en procariotas). La selección de un aumentador y promotor particular depende de qué tipo de célula se va a utilizar para expresar la proteína de interés. Algunos aumentadores y promotores eucarióticos tienen un intervalo hospedero amplio mientras que otros son funcionales en un subconjunto limitado de tipos de célula (Ver, Voss, et al., Trends Biochem. Sci., 11:287 (1986) y Maniatis, et al., Science 236:1237 (1987); Magnusson et al., Sustained, high transgene expression in liver with plasmid vectors using optimized promoter-enhancer combinations, Journal of Gene Medicine 13(7-8):382-391 (2011); Xu et al., Optimization of transcriptional regulatory elements for constructing plasmid vectors, Gene. 272(1 -2):149-156 (2001)). Los aumentadores están generalmente actuando en cis, y en la naturaleza, se ubican hasta 1 millón de pares base lejos del gen expresado sobre un cromosoma. En algunos casos, una orientación del aumentador puede invertirse sin afectar su función.

El término “elemento regulatorio” se refiere a una secuencia de polinucleótido que funciona para proteger un promotor o aumentador de los efectos de silenciamiento del ambiente de cromatina, tales como metilación de ADN, desacetilación de histona u otras modificaciones para las estructuras de cromatina las cuales deberán de otra manera prevenir la transcripción del promotor. Tal silenciamiento del promotor es el resultado del control epigenético y puede resultar en una pérdida de expresión con el paso del tiempo (ver Li. et al., The role of chromatin during transcription. Cell. 128:707-719 (2007); Pikaart MJ. Loss of transcriptional activity of a transgene is accompanied by DNA methylation and histone deacetylation and is prevented by insulators. Genes Dev. 12:2852-62. (1998)). “Elemento regulatorio” también podría referirse a secuencias de ADN que actúan como barreras para prevenir secuencias aumentadoras distales de la activación de un promotor. Los ejemplos de los elementos regulatorios de ADN que tienen actividad aislante y protectora de cromatina incluyen elementos aisladores, elementos STAR, elementos UCOE o elementos MAR (ver Otte AP et. al. Various expression-augmenting DNA elements benefit from STAR-Select, a nove high stringency selection system for protein expression. Biotechnol Prog. 23(4):801-7 (2007); Ferrari S et al. Chromatin domains boundaries delimited by a histone binding protein in yeast. J. Biol Chem. 279:55520-30 (2001); Kellum R. et al. A group of scs elements function as domain boundaries in an enhancer-blocking assay. Mol. Cell Biol. 12: 2424-31 (1992); Chung JH et al. A 5’ element of the chicken beta-globin domain serves as an insulator in human erythroid cells and protects against position effect in Drosophila. Cell. 74:505-14 (1993); Williams S et al. CpG Island fragments from HNRAP2B1/CBX3 genomic locus reduce silencing and enhance transgene expression from the hCMV promoter/enhance in mamíferoian cells. BMC Biotechnol. 5:17 (2005)). Tales elementos se han aislado de una variedad de fuentes eucarióticas y se muestran para aumentar la actividad cuando se emparejan con el aumentador y promotor particular. La actividad de los elementos regulatorios depende de qué tipo de célula se va a utilizar para expresar la proteína de interés, y la secuencia del elemento y promotor específico. Los elementos regulatorios pueden colocarse en cualquier orientación, pero típicamente deben probarse empíricamente para la actividad óptima.

El término “vector” significa cualquier molécula o entidad (por ejemplo, ácido nucleico, plásmido, bacteriófago o virus) usada para transferir la información que codifica la proteína en una célula hospedera.

El término “vector de expresión” o “constructo de expresión” como se usa en la presente se refiere a una molécula de ADN recombinante que contiene una secuencia de codificación deseada y secuencias de control de ácido nucleico apropiadas necesarias para la expresión de la secuencia de codificación ligada operablemente en una célula hospedera particular. Un vector de expresión puede incluir, pero no se limita a, secuencias que afectan o controlan la transcripción, traducción, y, si se presentan los intrones, afectan el empalme del ARN de una región de codificación operablemente ligada a esto. Las secuencias de ácido nucleico necesarias para la expresión en procariotas incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, un sitio enlazado a la ribosoma y posiblemente otras secuencias. Las células eucarióticas se conocen para utilizar promotores, aumentadores, y señales de terminación y poliadenilación. Una secuencia de péptido de señal secretoria también puede, opcionalmente, codificarse por el vector de expresión, ligado operablemente a la secuencia de codificación de interés, de manera que el polipéptido expresado puede secretarse por la célula hospedera recombinante, para aislamiento más fácil del polipéptido de interés de la célula, si se desea. Tales técnicas son bien conocidas en la técnica. (Por ejemplo, Goodey, Andrew R.; et al., Peptide and DNA sequences, Patente de E.U.A. No. 5,302,697; Weiner et al., Compositions and methods for protein secretion, Patente de E.U.A. No. 6,022,952 y Patente de E.U.A. No. 6,335,178; Uemura et al., Protein expression vector and utilization thereof, Patente de E.U.A. No. 7,029,909; Ruben et al., 27 human secreted proteins, EUA 2003/0104400 A1).

Un vector de expresión contiene uno o más casetes de expresión. Un “casete de expresión,” en un mínimo, contiene un promotor, un gen exógeno de interés (“GOI”) para expresarse, y un sitio de poliadenilación y/u otra secuencia terminadora adecuada. El promotor típicamente incluye un cuadro TATA adecuado o región rica en G-C 5’ hasta, pero no necesariamente de manera directa adyacente al, sitio de inicio de transcripción.

Los términos “en combinación operable”, “en orden operable” y “ligado operablemente” como se usa intercambiablemente en la presente se refiere a la ligadura de dos o más secuencias de ácido nucleico de tal manera que una molécula de ácido nucleico capaz de dirigir la transcripción de un gen dado y/o la síntesis de una molécula de proteína deseada se produce. El término también se refiere a la ligadura de las secuencias de aminoácidos de tal manera que una proteína funcional se produce. Por ejemplo, una secuencia de control en un vector que se “liga operablemente” a una secuencia que codifica la proteína se liga a esto de manera que la expresión de la secuencia que codifica la proteína se logra bajo condiciones compatibles con la actividad transcripcional de las secuencias de control. Por ejemplo, una secuencia promotora y/o aumentadora, que incluye cualquier combinación de elementos de control transcripcional que actúa de forma cis está operablemente ligado a una secuencia de codificación si estimula o modula la transcripción de la secuencia de codificación en una célula hospedera apropiada u otro sistema de expresión. Las secuencias regulatorias promotoras que se ligan operablemente a la secuencia del gen transcrito están físicamente contiguas a la secuencia transcrita, pero las secuencias del elemento regulatorio que actúa de forma cis que se ligan operablemente al promotor y/o a una secuencia del gen transcrita puede ligarse operablemente a esto aún si el elemento regulatorio está no contiguo a la secuencia promotora y/o secuencia del gen transcrito. En algunas modalidades útiles de la invención el elemento regulatorio puede situarse 5’ para el casete de expresión que conduce al promotor GAPDH, y en otras modalidades útiles el aumentador puede posicionarse 3’ para el casete de expresión que conduce al promotor GAPDH.

Como se usa en la presente con respecto a una secuencia de ácido nucleico candidata que tiene una cierta cantidad o porcentaje de “identidad de secuencia” o que tiene una cierta cantidad o porcentaje “idéntica” a una secuencia de ácido nucleico de referencia, estos términos se refieren al porcentaje de nucleótidos en la secuencia de ácido nucleico candidata que son idénticas con la secuencia de ácido nucleico de referencia (por ejemplo, porcentaje de nucleótidos secuenciales idénticos a la SEQ ID NO:35 o SEQ ID NO: 38), después de alinear las secuencias e introducir los espacios, si es necesario, para lograr la identidad de secuencia de porcentaje máximo. De esta manera, la identidad de secuencia puede determinarse por métodos estándares que se usan comúnmente para comparar la similitud en posición de los nucleótidos de dos secuencias de ácido nucleico (por ejemplo, programa BLASTN). Usualmente la identidad de secuencia del ácido nucleico de la secuencia candidata a la secuencia de referencia es al menos 80%, preferiblemente al menos 85%, más preferiblemente al menos 90%, y lo más preferiblemente al menos 95%, en particular 96%, más particular 97%, aún más particular 98%, lo más particular 99%, que incluye por ejemplo, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, y 100%.

El término “célula hospedera” significa una célula que se ha transformado, o es capaz de transformarse, con un ácido nucleico y por ello expresa un gen de interés. El término incluye la progenie de la célula precursora, sí o no la progenie es idéntica en morfología o en fabricación genética a la célula precursora original, siempre y cuando el gen de interés esté presente. Cualquiera de un número grande de células hospederas bien conocidas y disponibles puede usarse en la práctica de esta invención, pero una línea celular CHO se prefiere. La selección de un hospedero particular es dependiente de un número de factores reconocidos por la técnica. Estos incluyen, por ejemplo, compatibilidad con el vector de expresión elegido, toxicidad de los péptidos codificados por la molécula de ADN, tasa de la transformación, facilidad de recuperación de los péptidos, características de expresión, bio-seguridad y costos. Un equilibrio de estos factores debe alcanzarse con el entendimiento de que no todos los hospederos pueden ser igualmente efectivos para la expresión de una secuencia de ADN particular. Dentro de estos lineamientos generales, las células hospederas microbianas útiles en cultivo incluyen bacterias (tales como Escherichia coli sp.), levadura (tales como Saccharomyces sp.) y otras células de hongos, células de insecto, células de planta, células hospederas de mamífero (incluyendo humano), por ejemplo, células CHO y células HEK-293. Las modificaciones pueden hacerse en el nivel de ADN, también. La secuencia de ADN que codifica el péptido puede cargarse a los codones más compatibles con la célula hospedera elegida. Para E. coli, los codones optimizados se conocen en la técnica. Los codones pueden sustituirse para eliminar los sitios de restricción o para incluir los sitios de restricción silenciosos, que pueden ayudar al procesamiento del ADN en la célula hospedera seleccionada. Después, el hospedero transformado se cultiva y purifica. Las células hospederas pueden cultivarse bajo condiciones de fermentación convencionales de manera que los compuestos deseados se expresan. Tales condiciones de fermentación son bien conocidas en la técnica.

El término “transfección” significa la absorción de ADN exógeno o extranjero por una célula, y una célula ha sido “transfectada” cuando el ADN exógeno se ha introducido dentro de la membrana celular. Un número de técnicas de transfección son bien conocidos en la técnica y se describen en la presente. Ver, por ejemplo, Graham et al., 1973, Virology 52:456; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra; Davis et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; Chu et al., 1981, Gene 13:197. Tales técnicas pueden usarse para introducir una o más porciones de ADN exógeno en las células hospederas adecuadas.

El término “transformación” se refiere a un cambio en las características genéticas de la célula, y una célula ha sido transformada cuando se ha modificado para contener ADN o ARN nuevo. Por ejemplo, una célula se transforma donde se modifica genéticamente de su estado nativo al introducir nuevo material genético por medio de la transfección, transducción, u otras técnicas. Después de la transfección o transducción, el ADN transformado puede recombinarse con aquel de la célula al integrarse físicamente en un cromosoma de la célula, o puede mantenerse transitoriamente como un elemento episomático sin estar replicado, o puede replicarse independientemente como un plásmido. Una célula se considera que ha sido “transformado establemente” cuando el ADN transformado está replicado con la división de la célula.

Un “dominio” o “región” (usado intercambiablemente en la presente) de una proteína es cualquier porción de la proteína completa, hasta e incluyendo la proteína completa, pero típicamente que comprende menos de la proteína completa. Un dominio puede, pero no necesita, plegarse independientemente del resto de la cadena de proteína y/o correlacionarse con una ubicación o función biológica, bioquímica, o estructural particular (por ejemplo, un dominio enlazado al ligando, o un dominio citosólico, de transmembrana o extracelular).

Un “candidato terapéutico” es cualquier compuesto, compuesto de herramienta, combinación de compuestos, molécula pequeña, polipéptido, péptido, proteína enlazada al antígeno, anticuerpo u otra molécula proteinácea o biológica, que tiene o potencialmente puede tener valor terapéutico al tratar, prevenir, o mitigar una enfermedad o trastorno. El candidato terapéutico es farmacológicamente activo. El término “farmacológicamente activo” significa que una sustancia así descrita se determina para tener la actividad que afecta un parámetro médico (por ejemplo, presión sanguínea, conteo de glóbulos, nivel de colesterol, percepción del dolor) o estado de la enfermedad (por ejemplo, cáncer, trastornos autoinmunitarios, dolor crónico). De manera inversa, el término “farmacológicamente inactivo” significa que no tiene actividad que afecta un parámetro médico o estado de la enfermedad puede determinarse para tal sustancia. De esta manera, las moléculas farmacológicamente activas, comprenden moléculas agonistas o miméticas y antagonistas como se define a continuación.

Los términos “-péptido mimético,” “péptido mimético,” y “-péptido agonista” se refieren a un péptido o proteína que tiene la actividad biológica comparable con una proteína que se presenta naturalmente de interés. Estos términos incluyen además péptidos que imitan indirectamente la actividad de una molécula de péptido que se presenta naturalmente, tal como al potenciar los efectos de la molécula que se presenta naturalmente.

Un “agonista” es una molécula que enlaza a un receptor de interés y dispara una respuesta por la célula que porta el receptor. Los agonistas a menudo imitan la acción de una sustancia que se presenta naturalmente. Un “agonista inverso” provoca una acción opuesta a aquella del agonista.

El término “antagonista” e “inhibidor” se refiere a una molécula que bloquea o de alguna manera interfiere con la actividad biológica de un receptor de interés, o tiene actividad biológica comparable con un antagonista o inhibidor conocido de un receptor de interés (tal como, pero no se limita a, un canal de ion o un Receptor Acoplado a la Proteína G (GPCR)).

Un “compuesto de herramienta” es cualquier molécula pequeña, péptido, proteína enlazada al antígeno, anticuerpo u otra molécula proteinácea, empleada como un reactivo utilizado en un experimento, como un control, o como un compuesto sustituto farmacológicamente activo en lugar de un candidato terapéutico.

El término “exógeno” se refiere a una secuencia de nucleótido aislada, originada en una especie diferente de la célula hospedera, que puede insertarse en la célula hospedera de mamífero. El gen exógeno de interés opcionalmente puede ligarse operablemente a otros elementos genéticos (tales como un promotor, secuencia de poli A y los similares) que pueden servir para modular, ya sea directamente, o indirectamente en conjunto con la maquinaría celular, la transcripción y/o expresión del gen. Alternativamente o adicionalmente, el gen exógeno puede ligarse a las secuencias de nucleótido que ayudan en la integración del gen en el ADN cromosomal del núcleo de la célula de mamífero (como por ejemplo, en recombinación homóloga). El gen exógeno puede estar comprendido de una secuencia de nucleótido que es ya sea homóloga o heteróloga a una secuencia de nucleótido particular en el genoma del mamífero, o es una secuencia híbrida (es decir una o más porciones del gen son homólogas, y una o más porciones son heterólogas al material genético del mamífero). La secuencia de nucleótido del gen de interés puede codificar un polipéptido o una variante de un polipéptido, encontrado de manera endógena en el mamífero, puede codificar un polipéptido que no se presenta naturalmente en el mamífero (es decir un polipéptido exógeno), o puede codificar un híbrido de polipéptidos endógenos y exógenos. Donde el gen de interés está operablemente ligado a un promotor, el promotor puede ser homólogo o heterólogo al mamífero y/o al gen de interés. Alternativamente, el promotor puede ser un híbrido de los elementos del promotor endógeno y exógeno (aumentadores, silenciadores, supresores, y los similares).

Selección de Genes.

Típicamente, los genes exógenos útiles en la presente invención serán una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido de interés (GAPDH no de hámster), por ejemplo, un polipéptido enlazado al objetivo, tales como un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, un ligando de proteína o péptido de un receptor, un polipéptido involucrado en el sistema nervioso, una respuesta inmunitaria, hematopoyesis, inflamación, crecimiento celular y proliferación, diferenciación de linaje celular, y/o la respuesta a la tensión. Incluido dentro del alcance de esta invención es la inserción de uno, dos, o más genes exógenos de interés en la célula hospedera.

Donde más de un gen de interés se usa en esta invención, los genes pueden prepararse e insertarse individualmente, o pueden generarse juntos como un constructo para inserción. Los genes pueden ser homólogos o heterólogos para tanto el promotor seleccionado para conducir la expresión de cada gen y/o para el mamífero. Además, el gen puede ser una secuencia de ADN genómico o cADN de longitud completa, o cualquier fragmento, subunidad o mutante del mismo que tiene al menos alguna actividad biológica es decir, exhibe un efecto en cualquier nivel (bioquímico, celular y/o morfológico) que no se observa fácilmente en un mamífero de tipo natural, no transgénico de la misma especie. Opcionalmente, el gen de interés puede ser una secuencia de nucleótido híbrido, es decir, una construida de cADN homólogo y/o heterólogo y/o fragmentos de ADN genómico. El gen también puede opcionalmente ser un mutante de una o más secuencias genómicas y/o de cADN que se presenta naturalmente, o una variante alélica de la misma.

Cada gen puede aislarse y obtenerse en cantidad adecuada usando uno o más métodos que son bien conocidos en la técnica. Estos métodos y otros útiles para aislar un gen se establecen, por ejemplo, en Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. [1989]) y en Berger and Kimmel (Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques, vol. 152, Academic Press, Inc., San Diego, Calif. [1987]).

Donde la secuencia de nucleótido de cada gen se conoce, el gen puede sintetizarse, en completo o en parte, usando métodos de síntesis química tales como aquellos descritos en Engels et al. (Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 28:716-734 [1989]). Estos métodos incluyen, inter alia, los métodos de fosfotriéster, fosforamidita y H-fosfonato de la síntesis de ácido nucleico. Alternativamente, el gen puede obtenerse al seleccionar un cADN apropiado o colección genómica usando una o más sondas de ácido nucleico (oligonucleótidos, cADN o fragmentos de ADN genómico con un nivel aceptable de homología al gen para clonarse, y los similares) que se hibridará selectivamente con la secuencia de ADN del gen de interés. Otro método adecuado para obtener una secuencia de gen es la reacción de cadena de polimerasa (PCR). Sin embargo, el uso exitoso de este método requiere que información suficiente alrededor de la secuencia de nucleótido del gen de interés está disponible a fin de diseñar cebadores de oligonucleótido adecuados útiles para la amplificación de la secuencia de nucleótido apropiada.

Donde el método de elección requiere el uso de sondas o cebadores de oligonucleótido (por ejemplo PCR, cADN o selección de colección genómica), las secuencias de oligonucleótido seleccionadas como sondas o cebadoras deberán ser de longitud adecuada y suficientemente no ambiguas a fin de minimizar la cantidad de enlace no específico que ocurrirá durante la selección de la colección o PCR. La secuencia actual de las sondas o cebadores es usualmente con base en las secuencias altamente homólogas o conservadas o regiones de las mismas o un gen similar de otro organismo. Opcionalmente, las sondas o cebadores pueden degenerarse.

En casos donde únicamente la secuencia de aminoácidos expresada del gen de interés se conoce, una secuencia de ácido nucleico funcional y probable puede inferirse para el gen usando codones preferidos y conocidos para cada residuo de aminoácidos. Esta secuencia luego puede sintetizarse químicamente.

Esta invención abarca el uso de las secuencias mutantes del gen. Un gen mutante es un gen que contiene una o más sustituciones, eliminaciones, y/o inserciones de nucleótido como se compara con la secuencia de tipo natural. La sustitución, eliminación, e/o inserción de nucleótido puede dar lugar a un producto del gen (es decir, proteína) que es diferente en su secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de tipo natural. La preparación de tales mutantes es bien conocida en la técnica, y se describe por ejemplo en Wells et al. (Gene, 34:315 [1985]), y en Sambrook et al, supra.

Selección de Secuencias de Control y Elementos Regulatorios.

Los genes están típicamente ligados operablemente a los promotores, donde un promotor se selecciona para regular la expresión de cada gen en una manera particular. Dentro del alcance de la presente invención, un promotor de deshidrogenasa de gliceraldehído-3-fosfato de hámster (GAPDH) se prefiere para la expresión en células CHO. Por ejemplo, la secuencia del promotor GAPDH de hámster del Gen ID: 100736557 (Secuencia de Referencia NCBI NW_003613610.1) puede clonarse y usarse en el vector de expresión inventivo.

En algunos ejemplos útiles del vector de expresión inventivo, el promotor GAPDH de hámster comprende la secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO:50 (posiciones del nucleótido -532 hasta -23 en relación al sitio de partida de transcripción GAPDH), o un fragmento operable del mismo. La secuencia del promotor GAPDH de hámster (SEQ ID NO:50) se clonó del ADN genómico de hámster Chino (Cricetulus griseus). Los fragmentos más grandes de la secuencia del gen GAPDH de hámster que incluye la secuencia promotor GAPDH (SEQ ID NO:50), por ejemplo SEQ ID NO:49 (posiciones de nucleótido -532 hasta 305 en relación al sitio de partida de transcripción GAPDH), el cual contiene el primer exón e intrón de GAPDH hámster, también puede usarse para proporcionar el promotor GAPDH de hámster. Los fragmentos más grandes del gen GAPDH de hámster que incluyen la secuencia promotora también pueden usarse en el vector de expresión, tales como SEQ ID NO:11 (-2049 hasta 2161 con relación al sitio de partida de transcripción), que incluye, inter alia, intrones 1 y 2 del gen GAPDH de hámster. Es más eficiente usar un fragmento que no incluye el intrón 1 (SEQ ID NO: 51; posiciones de nucleótido 64 hasta 293 con relación al sitio de partida de transcripción del gen GAPDH de hámster Chino). Sin embargo, la efectividad del vector de expresión inventivo se mejora por la inclusión del mismo, 3’ para el promotor GAPDH y 5’ del gen de interés, de la secuencia de nucleótidos de la s Eq ID NO: 52 (es decir, intrón 2).

Donde más de un gen exógeno de interés es para usarse, cada gen puede regularse por el mismo o por un diferente promotor. Además del promotor GAPDH de hámster, los promotores seleccionados pueden ser homólogos (es decir, de la misma especie ya que el mamífero a transfectarse con el gen de interés) o heterólogo (es decir, de una fuente diferente de la especie del mamífero a transfectarse con el gen). Como tal, la fuente de cada promotor puede ser de cualquier organismo unicelular, procariótico o eucariótico, o cualquier organismo vertebrado o invertebrado.

Selección de Otros Componentes del Vector

Además del gen de interés y el promotor, los vectores útiles para preparar los genes de interés para la práctica de esta invención típicamente contienen uno o más de otros elementos útiles para (1) expresión óptima del gen en el mamífero en el cual el gen se inserta, y (2) amplificación del vector en células hospederas de mamífero o bacterianas. Cada uno de estos elementos se posicionará apropiadamente en el vector con respecto a cada otro elemento a fin de maximizar sus actividades respectivas. Tal posicionamiento es bien conocido para el técnico experimentado ordinario. Los siguientes elementos pueden incluirse opcionalmente en el vector como sea apropiado.

i. Elemento de Secuencia de Señal

Para aquellas modalidades de la invención donde el polipéptido codificado por el gen de interés es para secretarse, un polipéptido pequeño llamado secuencia de señal está frecuentemente presente para dirigir el polipéptido codificado por el gen fuera de la célula donde se sintetiza. Típicamente, la secuencia de señal está posicionada en la región de codificación del gen hacia o en el extremo 5' de la región de codificación. Muchas secuencias de señal se han identificado, y aquellas que son funcionales y de esta manera compatibles con la expresión por las células de varios tipos de tejido pueden usarse en conjunto con el gen de interés. Por lo tanto, la secuencia de nucleótido que codifica la secuencia de señal puede ser homóloga o heteróloga al gen, y puede ser homóloga o heteróloga a la especie de mamífero de la cual la célula se derivó. Adicionalmente, la secuencia de nucleótido que codifica la secuencia de señal puede sintetizarse químicamente usando métodos establecidos arriba. Sin embargo, para propósitos en la presente, las secuencias de señal preferidas son aquellas que ocurren naturalmente con el gen de interés (es decir, son homólogas al gen).

ii. Elemento del Dominio de Anclaje de Membrana

En algunos casos, puede ser deseable tener un gen de interés expresado sobre la superficie de una membrana intracelular particular o sobre la membrana de plasma. Las proteínas de membrana que se presentan naturalmente contienen, como parte del polipéptido, un tramo de aminoácidos que sirven para anclar la proteína a la membrana. Sin embargo, para las proteínas que no se encuentran naturalmente sobre la membrana, tal tramo de los aminoácidos pueden agregarse para conferir esta característica. Frecuentemente, el dominio de anclaje será una porción interna de la secuencia de polipéptido y de esta manera la secuencia de nucleótido codificada se preparará por ingeniería en una región interna de la secuencia de nucleótido del gen. Sin embargo, en otros casos, la secuencia de nucleótido que codifica el dominio de anclaje puede unirse al extremo 5' o 3' de la secuencia de nucleótido del gen. Aquí, la secuencia de nucleótido que codifica el dominio de anclaje puede primero colocarse en el vector en la posición apropiada como un componente separado de la secuencia de nucleótido que codifica el gen de interés. Como para la secuencia de señal, el dominio de anclaje puede ser de cualquier fuente y de esta manera puede ser homólogo o heterólogo con respecto a tanto el gen como la especie de mamífero de la cual la célula hospedera se derivó. Alternativamente, el dominio de anclaje puede sintetizarse químicamente usando métodos establecidos arriba.

iii. Origen del Elemento de Replicación

Este componente es típicamente una parte de los vectores de expresión procariótica adquirido comercialmente, y ayuda en la amplificación del vector en una célula hospedera. Si el vector de elección no contiene un origen del sitio de replicación, uno puede sintetizarse químicamente con base sobre una secuencia conocida, y ligarse en el vector.

iv. Elemento de la Terminación de Transcripción

Este elemento, también conocido como la secuencia de poliA o poliadenilación, típicamente está ubicada 3' para la secuencia de nucleótido del gen en el vector, y sirve para terminar la transcripción del gen de interés. Aunque la secuencia de nucleótido que codifica este elemente se clona fácilmente de una colección o aún adquirido comercialmente como parte de un vector, también puede sintetizarse fácilmente usando métodos para la síntesis de la secuencia de nucleótido tales como aquellos descritos arriba.

v. Elemento de Intrón

En muchos casos, la transcripción del gen de interés se incrementa por la presencia de un intrón o más de un intrón (ligado por exones) sobre el vector de clonación. Los intrones pueden estar ocurriendo naturalmente dentro de la secuencia de nucleótido del gen, especialmente donde el gen es una longitud completa o un fragmento de una secuencia de ADN genómico. Donde los intrones no están ocurriendo naturalmente dentro de la secuencia de nucleótido (como para la mayoría de los cADNs), los intrones pueden obtenerse de otra fuente. Los intrones pueden ser homólogos o heterólogos para el gen de interés y/o para la especie de mamífero de la cual la célula hospedera se derivó. La posición del intrón con respecto al promotor y el gen de interés es importante, ya que el intrón debe transcribirse para ser efectivo. Como tal, donde el gen es una secuencia de cADN, la posición preferida para los intrones es 3' para el sitio de partida de transcripción, y 5' para la secuencia de terminación de transcripción poliA. Preferiblemente para los cADNs, el intrón se ubicará sobre un lado o el otro (es decir, 5' o 3') de la secuencia de nucleótido del gen de manera que no interrumpe la secuencia de nucleótido del gen. Cualquier intrón de cualquier fuente, incluyendo cualquiera de los organismos víricos, procarióticos e eucarióticos (planta o animal), puede usarse para practicar esta invención, con la condición de que es compatible con las células hospederas en las cuales se inserta. También incluidos en la presente son intrones sintéticos. Opcionalmente, más de un intrón puede usarse en el vector. Un conjunto útil de los intrones y exones es la secuencia de ADN de la hormona de crecimiento humano (hGH).

vi. Elemento de los Marcadores Seleccionables

Los genes del marcador seleccionables codifican los polipéptidos necesarios para la sobrevivencia y crecimiento de las células transfectadas que crecen en un medio de cultivo selectivo. Los genes marcadores de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a los antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, tetraciclina, o canomicina para células hospederas procarióticas, y neomicina, higromicina, o metotrexato para las células de mamífero; (b) las deficiencias auxotróficas de complemento de la célula; o (c) nutrientes críticas de suministro no disponibles de los medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica D-alanina racemasa para los cultivos de Bacilli.

Todos de los elementos establecidos arriba, así como otros útiles en esta invención, son bien conocidos por el técnico experimentado y se describen, por ejemplo, en Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. [1989]) y Berger et al., eds. (Guide to Molecular Cloning Techniques, Academic Press, Inc., San Diego, Calif. [1987]).

Construcción de los Vectores de Clonación

Los vectores de clonación más útiles para la amplificación de los casetes del gen útiles al preparar los vectores de expresión recombinante de esta invención son aquellos que son compatibles con los hospederos de célula procariótica. Sin embargo, los hospederos de célula eucariótica, y los vectores compatibles con estas células, están dentro del alcance de la invención.

En ciertos casos, algunos de los varios elementos pueden estar contenidos en el vector de clonación pueden estar ya presentes en los vectores de amplificación o clonación comercialmente disponibles tales como pUC18, pUC19, pBR322, los vectores pGEM (Promega Corp, Madison, Wis.), los vectores pBluescript.RTM. tales como pBIISK+/-(Stratagene Corp., La Jolla, Calif.), y los similares, todos de los cuales son adecuados para los hospederos de célula procariótica. En este caso es necesario para únicamente insertar los genes de interés en el vector.

Sin embargo, donde uno o más de los elementos para usarse ya no están presentes sobre el vector de amplificación o clonación, pueden obtenerse individualmente y ligarse en el vector. Los métodos usados para obtener cada uno de los elementos y ligarlos son bien conocidos para el técnico experimentado y son comparables con los métodos establecidos arriba para obtener un gene de interés (es decir, síntesis del ADN, selección de colección, y los similares).

Los vectores usados para clonación o amplificación de las secuencias de nucleótido de los genes de interés y/o para la transfección de las células hospederas de mamífero se construyen usando métodos bien conocidos en la técnica. Tales métodos incluyen, por ejemplo, las técnicas estándares de digestión de endonucleasa de restricción, ligación, purificación del gen de agarosa y acrilamida de ADN y/o ARN, purificación de la cromatografía de columna de ADN y/o ARN, extracción de fenol/cloroformo de ADN, procesamiento por secuencia de ADN, amplificación de la reacción de la cadena de polimerasa, y los similares, como se establece en Sambrook et al., supra.

El vector final usado para practicar esta invención típicamente está construido de un vector de amplificación o clonación de partida tales como un vector comercialmente disponible. Este vector puede o no puede contener algunos de los elementos para incluirse en el vector completado. Si ninguno de los elementos deseados se presenta en el vector de partida, cada elemento puede ligarse individualmente en el vector al cortar el vector con las endonucleasas de restricción apropiadas de manera que los extremos del elemento a ligarse en y los extremos del vector son compatibles para ligación. En algunos casos, puede ser necesario para “redondear” los extremos para ligarse juntos con objeto de obtener una ligación satisfactoria. El redondeo se realiza llenando primero en los “extremos pegajosos” usando polimerasa de ADN Klenow o polimerasa de ADN T4 en presencia de los cuatro nucleótidos. Este procedimiento es bien conocido en la técnica y se describe por ejemplo en Sambrook et al., supra.

Alternativamente, dos o más de los elementos a insertarse en el vector puede primero ligarse juntos (si son para posicionarse adyacentes uno con el otro) y luego ligarse en el vector.

Uno de otro método para construir el vector es para conducir todas las ligaciones de los varios elementos simultáneamente en una mezcla de reacción. Aquí, muchos vectores no de sentido o no funcionales se generarán debido a la ligación o inserción incorrecta de los elementos, sin embargo el vector funcional puede identificarse y seleccionarse por la digestión de endonucleasa de restricción.

Después de que el vector se ha construido, puede transfectarse en una célula hospedera procariótica para amplificación. Las células típicamente usadas para la amplificación son E coli DH5-alfa (Gibco/BRL, Grand Island, Nueva York) y otras cepas E. coli con características similares a DH5-alfa.

Donde las células hospederas de mamífero se usan, las líneas celulares tales como de ovario de hámster Chino (células CHO; Urlab et al., Proc. Natl. Acad. Sci E.U.A., 77:4216 [1980])) y línea celular de riñón embriónico humano 293 (Graham et al., J. Gen. Virol., 36:59 [1977]), así como otras líneas, son adecuados.

La transfección del vector en la línea celular hospedera seleccionada para la amplificación se realiza usando tales métodos como fosfato de calcio, electroporación, microinyección, lipofección o DEAE-dextrano. El método seleccionado en parte será una función del tipo de la célula hospedera para transfectarse. Estos métodos y otros métodos adecuados son bien conocidos para el técnico experimentado, y se establecen en Sambrook et al., supra.

Después de cultivar las células durante el tiempo suficiente para el vector para amplificarse suficientemente (usualmente durante la noche para células E. coli), el vector (a menudo llamado plásmido en esta etapa) se aísla de las células y purificadas. Típicamente, las células se lisan y el plásmido se extrae de otros contenidos celulares. Los métodos adecuados para la purificación de plásmido incluyen inter alia, el método mini-prep de lisis alcalina (Sambrook et al., supra).

Preparación del Plásmido para la Inserción

Típicamente, el plásmido que contiene el gen de interés se linealizado, y las porciones de esto se remueven usando una endonucleasa de restricción seleccionada antes de la inserción en el embrión. En algunos casos, puede ser preferible aislar el gen, promotor, otras secuencias de control, y elementos regulatorios como un fragmento lineal de las otras porciones del vector, por ello inyecta únicamente una secuencia de nucleótido lineal que contiene el gen, promotor, intrón (si uno es para usarse), aumentador, secuencia poliA, y opcionalmente una secuencia de señal o dominio de anclaje de la membrana en el embrión. Esto puede realizarse al cortar el plásmido a fin de remover la región de secuencia de ácido nucleico que contiene estos elementos, y purificar esta región usando electroforesis de gel de agarosa u otros métodos de purificación adecuados.

Compuestos Candidatos Terapéuticos

Producción de Anticuerpos

Anticuerpos Policlonales. Los anticuerpos policlonales típicamente elevan en animales por inyecciones múltiples subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) del antígeno relevante y un adyuvante. Alternativamente, el antígeno puede inyectarse directamente en el ganglio linfático del animal (ver Kilpatrick et al., Hybridoma, 16:381-389, 1997). Una respuesta de anticuerpo mejorada puede obtenerse al conjugar el antígeno relevante a una proteína que es inmunogénica en la especie para inmunizarse, por ejemplo, hemocianina de lapa Californiana, albúmina de suero, tiroglobulina de bovino, o inhibidor de tripsina de soya usando un agente bifuncional o derivatizado, por ejemplo, éster de maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de los residuos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (a través de los residuos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico u otros agentes conocidos en la técnica.

Los animales están inmunizados contra el antígeno, conjugados inmunogénicos, o derivados al combinar, por ejemplo, 100 gg de la proteína o conjugado (por ratones) con 3 volúmenes del adyuvante completo de Freund e inyectar la solución intradérmicamente en múltiples sitios. Un mes después, los animales están reforzados con 1/5 hasta 1/10 de la cantidad original de péptido o conjugado en el adyuvante completo de Freund por inyección subcutánea en múltiples sitios. En los días 7-14 después de la inyección del refuerzo, los animales se purgan y el suero se procesa por ensayo para la titulación del anticuerpo. Los animales se refuerzan hasta los niveles adecuados de las titulaciones. Preferiblemente, el animal se refuerza con el conjugado del mismo antígeno, pero se conjuga a una proteína diferente y/o a través de un reactivo de reticulación diferente. Los conjugados también pueden hacerse en el cultivo celular recombinante como fusiones de proteína. También, los agentes de agregación tales como aluminio se utilizan adecuadamente para aumentar la respuesta inmunitaria.

Anticuerpos Monoclonales. Los anticuerpos monoclonales pueden producirse usando cualquier técnica conocida en el arte, por ejemplo, la inmortalizar las células de bazo cosechadas del animal transgénico después de la terminación del programa de inmunización. Las células de bazo pueden inmortalizarse usando cualquier técnica conocida en el arte, por ejemplo, al fusionarlas con las células de mieloma para producir los hibridomas. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden hacerse usando el método de hibridoma primero descrito por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), o pueden hacerse por métodos de ADN recombinante (por ejemplo, Cabilly et al., Methods of producing immunoglobulins, vectors and transformed host cells for use therein, Patente de E.U.A. No. 6,331,415), incluyendo métodos, tales como el método “DHFR de división”, que facilitan la producción generalmente equimolar de luz y cadenas pesadas, opcionalmente usando líneas celulares de mamífero (por ejemplo, células CHO) que pueden glicosilar el anticuerpo (Ver, por ejemplo, Page, Antibody production, EP0481790 A2 y Patente de E.U.A. No.

5,545,403).

En el método de hibridoma, un ratón u otro mamífero hospedero apropiado, tales como ratas, hámster o mono macaco, se inmuniza como se describe en la presente para producir linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que específicamente enlazarán a la proteína usada para la inmunización. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro. Los linfocitos luego se fusionan con las células de mieloma usando un agente de fusión adecuado, tales como polietilen glicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, páginas 59-103 (Academic Press, 1986)).

Las células de hibridoma, una vez preparadas, se siembran y hacen crecer en un medio de cultivo adecuado que preferiblemente contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o sobrevivencia de las células de mieloma precursoras, no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma precursoras carecen de la enzima de hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas típicamente incluirán hipoxantina, aminopterina, y timidina (medio HAT), cuyas sustancias previenen el crecimiento de células deficientes de HGPRT.

Las células de mieloma preferidas son aquellas que fusionan eficientemente, soportan la producción a nivel alto estable de anticuerpo por las células que producen el anticuerpo seleccionado, y son sensibles a un medio. Las líneas de célula heteromieloma de ratón-humana y mieloma humana también se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, páginas 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987)). Las células de mieloma para uso en procedimiento de fusión que producen hibridoma preferiblemente no producen anticuerpo, tienen eficiencia de alta fusión, y deficiencias de enzima que los vuelven incapaces de crecer en ciertos medios selectivos los cuales soportan el crecimiento de únicamente las células fusionadas deseadas (hibridomas). Los ejemplos de las líneas celulares adecuadas para uso en las fusiones de ratón incluyen Sp-20, P3-X63/Ag8, P3-X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/u , MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 y S194/5x x O Bul; los ejemplos de las líneas celulares usadas en las fusiones de rata incluyen R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F y 4B210. Otras líneas celulares útiles para las fusiones celulares son U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 y UC729-6.

El medio de cultivo en el cual las células de hibridoma se hacen crecer se procesa por ensayo para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferiblemente, la especificidad de enlace de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina por inmunoprecipitación o por un ensayo de enlace in vitro, tales como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunosorbente ligado a la enzima (ELISA). La afinidad de enlace del anticuerpo monoclonal puede, por ejemplo, determinarse por análisis BIAcore® o Scatchard (Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980); Fischer et al., A peptide-immunoglobulin-conjugate, WO 2007/045463 A1, Ejemplo 10).

Después de que las células de hibridoma se identifican que producen los anticuerpos de la especificidad, afinidad, y/o actividad deseada, los clones pueden subclonarse al limitar los procedimientos de dilución y se hacen crecer por métodos estándares (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, página 59-103 (Academic Press, 1986)). Los medios de cultivo adecuados para este propósito incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden hacerse crecer in vivo como tumores de ascitos en un animal.

Los hibridomas o mAbs pueden seleccionarse además para identificar mAbs con propiedades particulares, tales como afinidad de enlace con un antígeno particular u objetivo. Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, fluido de ascitos, o suero por procedimientos de purificación de inmunoglobulina convencionales tales como, por ejemplo, proteína A-Sefarosa, cromatografía de hidroxilapatito, electroforesis de gel, diálisis, cromatografía de afinidad, o cualquier otra técnica de purificación adecuada conocida en la técnica.

Producción Recombinante de Anticuerpos y Otros Polipéptidos. Las secuencias de aminoácidos relevantes de una inmunoglobulina o polipéptido de interés puede determinarse por procesamiento en secuencia de proteína directa, y las secuencias de nucleótido de codificación adecuadas pueden diseñarse de acuerdo con una tabla de codón universal. Alternativamente, el genómimco o cADN que codifica los anticuerpos monoclonales pueden aislarse y procesarse por secuencia de las células que producen tales anticuerpos usando procedimientos convencionales (por ejemplo, al usar sondas de oligonucleótido que son capaces de enlazar específicamente a los genes que codifican las cadenas ligeras y pesadas de los anticuerpos monoclonales). Las secuencias de ADN relevantes pueden determinarse por procesamiento por secuencia de ácido nucleico directo.

La clonación de ADN se lleva a cabo usando técnicas estándares (ver, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide, Vols 1-3, Cold Spring Harbor Press). Por ejemplo, una colección de cADN puede construirse por transcripción inversa de poliA+ mARN, preferiblemente mARN asociada a la membrana, y la colección seleccionada usando sondas específicas para las secuencias del gen de polipéptido de inmunoglobulina humana. En una modalidad, sin embargo, la reacción de cadena de polimerasa (PCR) se usa para amplificar los cADNs (o porciones de cADNs de longitud completa) que codifican un segmento del gen de inmunoglobulina de interés (por ejemplo, un segmento variable de cadena pesada o ligera). Las secuencias amplificadas pueden clonarse fácilmente en cualquier vector adecuado, por ejemplo, vectores de expresión, vectores de minigen, o vectores de exhibición de fago. Se apreciará que el método particular de clonación usado no es crítico, a fin de que sea posible determinar la secuencia de alguna porción del polipéptido de inmunoglobulina de interés.

Una fuente para los ácidos nucleicos del anticuerpo es un hibridoma producido al obtener una célula B de un animal inmunizado con el antígeno de interés y fusionado a una célula inmortal. Alternativamente, el ácido nucleico puede aislarse de las células B (o bazo completo) del animal inmunizado. Aún otra fuente de los anticuerpos que codifican los ácidos nucleicos es una colección de tales ácidos nucleicos generados, por ejemplo, a través de la tecnología de exhibición de fago. Los péptidos que codifican los polinucleótidos de interés, por ejemplo, péptidos de región variable con características de enlace deseadas, pueden identificarse por técnicas estándares tales como inmunoadsorción.

La secuencia que codifica una región variable completa del polipéptido de inmunoglobulina puede determinarse; sin embargo, algunas veces será adecuada para secuenciar únicamente una porción de una región variable, por ejemplo, la porción que codifica la CDR. El procesamiento por secuencia se lleva a cabo usando técnicas estándares (ver, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide, Volúmenes 1-3, Cold Spring Harbor Press, y Sanger, F. et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A. 74: 5463-5467). Al comparar la secuencia del ácido nucleico clonaod con las secuencias publicadas de los genes de inmunoglobulina humanos y cADNs, alguien de experiencia fácilmente será capaz de determinar, dependiendo de la región secuenciada, (i) el uso del segmento de la línea germinal del polipéptido de inmunoglobulina de hibridoma (incluyendo el isotipo de la cadena pesada) y (ii) la secuencia de las regiones variables de cadena ligera y pesada, incluyendo secuencias que resultan de la adición de la región N y el proceso de la mutación somática. Una fuente de la información de secuencia del gen de inmunoglobulina es el Centro Nacional para la Información de Biotecnología, Colección Nacional de Medicina, Institutos Nacionales de Saludo, Bethesda, Md.

El ADN aislado puede ligarse operablemente a las secuencias de control o colocarse en los vectores de expresión, los cuales luego se transfectan en las células hospederas que no producen de otra manera la proteína de inmunoglobulina, para dirigir la síntesis de los anticuerpos monoclonales en las células hospederas recombinantes. La producción recombinante de los anticuerpos es bien conocida en la técnica.

El ácido nucleico está operablemente ligado cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, ADN para una presecuencia o líder secretorio está operablemente ligado a ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o aumentador está operablemente ligado a una secuencia de codificación si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio enlazado a la ribosoma está operablemente ligado a una secuencia de codificación si se posiciona a fin de facilitar la traducción. Generalmente, operablemente ligados significa que las secuencias de ADN que se ligan están contiguas, y, en el caso de un líder secretorio, contiguo y en fase de lectura. Sin embargo, los aumentadores no tienen que ser contiguos. La ligadura se realiza por ligación en sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, las ligaduras o adaptadores de oligonucleótido sintético se usan de acuerdo con la práctica convencional.

Muchos vectores se conocen en la técnica. Los componentes del vector pueden incluir uno o más de los siguientes: una secuencia de señal (que puede, por ejemplo, secreción directa del anticuerpo; por ejemplo, A T G G A C A T G A G G G T G C C C G C T C A G C T C C T G G G G C T C C T G C T G C T G T G G C T G A G AG G T G C G C G C T G T / / SEQ ID NO:53, que codifica la secuencia de péptido de señal VK-1 MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC// SEQ ID NO:54), un origen de replicación, uno o más genes marcadores selectivos (que pueden, por ejemplo, conferir resistencia antibiótica o resistencia a otro fármaco, deficiencias auxotróficas de complemento, o nutrientes críticos de suministro no están disponibles en los medios), un elemento regulatorio, un promotor, y una secuencia de terminación de transcripción, todos de los cuales son bien conocidos en la técnica.

La célula, línea celular, y cultivos celulares se usan a menudo intercambiablemente y todas las designaciones en la presente incluyen progenie. Los transformantes y las células transformadas incluyen los cultivos y célula objeto primaria derivados de los mismos sin preocupación para el número de transferencia. También se entiende que toda la progenie no puede ser precisamente idéntica en el contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. La progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica como se selecciona para la célula originalmente transformada se incluyen.

Las células hospederas ejemplares incluyen células procariotas, de levadura, o eucariotas superiores. Las células hospederas procarióticas incluyen eubacterias, tales como organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo, Enterobacteriaceae tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans, y Shigella, así como Bacillus tales como B. subtilis y B. licheniformis, Pseudomonas, y Streptomyces. Los microbios eucarióticos tales como hongos filamentosos o levadura son hospederos de expresión o clonación adecuados para polipéptidos o anticuerpos recombinantes. Saccharomyces cerevisiae, o levadura para panaderos comunes, es el uso más comúnmente entre los microorganismos hospederos eucarióticos inferiores. Sin embargo, un número de otros géneros, especies, y cepas están comercialmente disponibles y útiles en la presente, tales como Pichia, por ejemplo P. pastoris, Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces, Yarrowia; Candida; Trichoderma reesia; Neurospora crassa; Schwanniomyces tales como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentodos tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, y hospederos Aspergillus tales como A. nidulans y A. niger.

Las células hospederas para la expresión de anticuerpos glicosilados pueden derivarse de organismos multicelulares. Los ejemplos de las células invertebradas incluyen células de insecto y planta. Numerosas cepas baculovíricas y variantes y células hospederas de insecto permisivas correspondientes de los hospederos tales como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster(mosca de fruta), y Bombyx mori se han identificado. Una variedad de cepas víricas para la transfección de tales células están públicamente disponiblews, por ejemplo, la variante L-1 de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV.

Las células hospederas del vertebrado también son hospederos adecuados, y la producción recombinante de polipéptidos (que incluyen anticuerpo) de tales células se han vuelto un procedimiento de rutina. Los ejemplos de las líneas celulares hospederas de mamífero útiles son células de ovario de hámster Chino (CHO) de cualquier cepa, incluyendo pero no limitado a células CHO-K1 (ATCC CCL61), DXB-11, CHO-DG-44, ChO-S, CHO-AM1, CHO-DXB11, y células de ovario de hámster Chino/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 77: 4216 (1980)); línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embriónico humano (293 o 293 células subclonadas para crecimiento en el cultivo de suspensión, [Graham et al., J. Gen Virol. 36: 59 (1977)]; células de riñón de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10); células sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod.

23: 243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde Africano (v ErO-76, ATCC c Rl-1587); células de carcinoma cérvico humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñón caninas (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CrL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hepatoma humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)); células MRC 5 o células fS4; o células de mieloma de mamífero.

Las células hospederas se transforman o transfectan con los vectores o ácidos nucleicos descritos arriba para la producción de polipéptidos (incluyendo anticuerpos) y se cultivan en medios de nutriente convencionales modificados como sea apropiado para los promotores de inducción, transformantes de selección, o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Además, los vectores novedosos y las líneas celulares transfectadas con múltiples copias de las unidades transcripción separadas por un marcador selectivo son particularmente útiles para la expresión de polipéptidos, tales como anticuerpos.

Las células hospederas usadas para producir los polipéptidos útiles en la invención pueden cultivarse en una variedad de medios. Los medios comercialmente disponibles tales como F10 de Ham (Sigma), Medio Esencial Mínimo ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), y Medio de Eagle Modificado de Dulbecco ((DMEM), Sigma) son adecuados para cultivar las células hospederas. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham et al., Meth. Enz. 58: 44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102: 255 (1980), Patentes de E.U.A. Nos. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; o 5,122,469; WO90103430; WO 87/00195; o Patente Re. De E.U.A. No. 30,985 pueden usarse como medios de cultivo para las células hospederas. Cualquiera de estos medios puede complementarse como sea necesario con hormonas hormones y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina, o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio, y fosfato), amortiguadores (tales como HEPES), nucleótidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como fármaco Gentamycin™), elementos traza (definidos como compuestos inorgánicos usualmente presentes en concentraciones finales en el intervalo micromolar), y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualquiera de otros complementos necesarios también puede incluirse en concentraciones apropiadas que deberán conocerse para aquellos experimentados en la técnica. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH, y los similares, son aquellos previamente usados con la célula hospedera seleccionada para expresión, y serán aparentes para el técnico experimentado ordinariamente.

Durante el cultivo de las células hospederas, el polipéptido recombinante puede producirse intracelularmente, en el espacio periplásmico, o secretado directamente en el medio. Si el polipéptido, tal como un anticuerpo, se produce intracelularmente, como una primera etapa, los desechos particulados, ya sea células hospederas o fragmentos lisados, se remueve, por ejemplo, por centrifugación o ultrafiltración.

Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo) puede purificarse usando, por ejemplo, cromatografía de hidroxilapatita, cromatografía de intercambio de aniones o cationes, o preferiblemente cromatografía de afinidad, usando el antígeno de interés o proteína A o proteína G como un ligando de afinidad. La proteína A puede usarse para purificar proteínas que incluyen polipéptidos están basados en cadenas pesadas y1, y2, o y4 humanas (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)). La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para y3 humano (Guss et al., EMBO J. 5: 15671575 (1986)). La matriz a la cual el ligando de afinidad se une es más a menudo agarosa, pero otras matrices están disponibles. Las matrices mecánicamente estables tales como vidrio de poro controlado o poli(estirendivinil)benceno se permite para tasas de flujo más rápidas y tiempos de procesamiento más cortos que pueden lograrse con agarosa. Donde la proteína comprende un dominio C^h 3, la resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.) es útil para la purificación. Otras técnicas para la purificación de proteína tales como precipitación de etanol, HPLC de Fase Inversa, cromatoenfoque, SDS-PAGE, y precipitación de sulfato de amonio también son posibles dependiendo del anticuerpo a recuperarse.

Anticuerpos Quiméricos, Humanizados, Engineered™ Humanos, monoclonales Xenomouse. Los anticuerpos monoclonal quiméricos, en los cuales los dominios Ig variables de un anticuerpo monoclonal de roedor se fusionan a los dominios Ig constantes humanos, pueden generarse usando procedimientos estándares conocidos en la técnica (Ver Morrison, S. L., et al. (1984) Chimeric Human Antibody Molecules; Mouse Antigen Binding Domains with Human Constant Region Domains, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 81,6841-6855; y, Boulianne, G. L., et al, Nature 312, 643-646. (1984)). Un número de técnicas se han descrito para humanizar o modificar la secuencia de anticuerpo para ser tipo más humano, por ejemplo, al (1) injertar las regiones que determinan la complementariedad no humanas (CDRs) en una estructura humana y región constante (un proceso referido en la técnica como humanización a través de “injerto de CDR”) o (2) trasplantar los dominios variables no humanos completos, pero “encubrirlos” con una superficie tipo humano por reemplazo de los residuos de superficie (un proceso referido en la técnica como “restauración”) o (3) modificar residuos de aminoácidos no humanos seleccionados para ser más humanos, con base en cada probabilidad del residuo de participar en la estructura del anticuerpo o enlazada al antígeno y su probabilidad para inmunogenicidad. Ver, por ejemplo, Jones et al., Nature 321:522525 (1986); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., E.U.A., 81:6851 6855 (1984); Morrison y Oi, Adv. Immunol., 44:6592 (1988); Verhoeyer et al., Science239:15341536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 28:489498 (1991); Padlan, Molec. Immunol. 31 (3):169217 (1994); y Kettleborough, C.A. et al., Protein Eng.

4(7):77383 (1991); Co, M. S., et al. (1994), J. Immunol. 152, 2968-2976); Studnicka et al. Protein Engineering 7: 805­ 814 (1994).

Los anticuerpos también pueden producirse usando animales transgénicos que no tienen producción de inmunoglobulina endógena y se preparan por ingeniería para contener la ubicación de inmunoglobulina humana. (Ver, por ejemplo, Mendez et al., Nat. Genet. 15:146-156 (1997)) Por ejemplo, la WO 98/24893 describe animales transgénicos que tienen una ubicación Ig humana en donde los animales no producen inmunoglobulinas endógenas funcionales debido a la inactivación de la ubicación de cadena ligera y pesada endógena. La WO 91/10741 también describe hospederos de mamífero no primate transgénicos capaces de montar una respuesta inmunitaria a un inmunógeno, en donde los anticuerpos tienen regiones variables y/o constantes de primates, y en donde la ubicación que codifica la inmunoglobulina endógena se sustituyen o inactivan. La WO 96/30498 describe el uso del sistema Cre/Lox para modificar la ubicación de inmunoglobulina en un mamífero, tal como para reemplazar todo o una porción de la región constante o variable para formar una molécula de anticuerpo modificada. La WO 94/02602 describe hospederos de mamífero no humano que tienen ubicación Ig endógena inactivada y ubicación Ig humana funcional. La Patente de E.U.A. No.5,939,598 describe los métodos para hacer los ratones transgénicos en los cuales los ratones carecen de cadenas pesadas endógenas, y expresan una ubicación de inmunoglobulina exógena que comprende una o más regiones constantes xenogénico.

Usando un animal transgénico descrito arriba, una respuesta inmunitaria puede producirse para una molécula antigénica seleccionada, y las células que producen el anticuerpo pueden removerse del animal y usarse para producir hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales derivados de humano. Los protocolos de inmunización, adyuvantes, y los similares se conocen en la técnica, y se usan en inmunización de, por ejemplo, un ratón transgénico como se describe en la WO 96/33735. Los anticuerpos monoclonales pueden probarse para la capacidad para inhibir o neutralizar la actividad biológica o efecto fisiológico de la proteína correspondiente. Ver también Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); Mendez et al., Nat. Genet. 15:146-156 (1997); y Patente de E.U.A. No. 5,591,669, Patente de E.U.A. No. 5,589,369, Patente de E.U.A. No. 5,545,807; y Solicitud de Patente de E.U.A. No. 20020199213. Solicitud de Patente de E.U.A. No. y 20030092125 describe métodos para polarizar la respuesta inmunitaria de un animal para el epítopo deseado. Los anticuerpos humanos también pueden generarse por células B activadas in vitro (ver Patente de E.U.A. Nos. 5,567,610 y 5,229,275).

Producción de Anticuerpo por Técnicas de Exhibición de Fago

El desarrollo de las tecnologías para hacer los repertorios de los genes del anticuerpo humano recombinante, y la exhibición de los fragmentos del anticuerpo codificadas sobre la superficie del bacteriófago filamentoso, ha proporcionado otros medios para generar los anticuerpos derivados de humano. La exhibición de fago se describe en por ejemplo, Dower et al., WO 91/17271, McCafferty et al., WO 92/01047, y Caton and Koprowski, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 87:6450-6454 (1990). Los anticuerpos producidos por la tecnología de fago se producen usualmente como fragmentos enlazados al antígeno, por ejemplo fragmentos Fv o Fab, en bacterias y de esta manera carecen de funciones efectoras. Las funciones efectoras pueden introducirse por una de dos estrategias: Los fragmentos pueden prepararse por ingeniera ya sea en anticuerpos completos para expresión en células de mamífero, o en fragmentos del anticuerpo biespecíficos con un segundo sitio enlazado capaz de dirigir una función efectora.

Típicamente, el fragmento Fd (V^h-C^h1) y cadena ligera (V^l-C^l) de los anticuerpos se clonan separadamente por PCR y recombinan aleatoriamente en las colecciones de la exhibición de fago combinatorias, las cuales luego pueden seleccionarse para enlazar a un antígeno particular. Los fragmentos del anticuerpo se expresan sobre la superficie de fago, y selección de Fv o Fab (y por lo tanto el fago que contiene el ADN que codifica el fragmento de anticuerpo) por enlace de antígeno se realiza a través de varias rondas del enlace al antígeno y re-amplificación, un procedimiento nombrado inmunoadsorción. Los fragmentos del anticuerpo específicos para el antígeno se enriquecen y finalmente se aíslan.

Las técnicas de exhibición de fago también pueden usarse en un enfoque para la humanización de anticuerpos monoclonales del roedor, nombrados “selección guiada” (ver Jespers, L. S., et al., Bio/Technology 12, 899-903 (1994)). Para esto, el fragmento Fd del anticuerpo monoclonal de ratón puede mostrarse en combinación con una colección de cadena ligera humana, y la colección Fab de híbrido resultante luego puede seleccionarse con el antígeno. El fragmento Fd de ratón por ello proporciona una plantilla para guiar la selección. Posteriormente, las cadenas ligeras humanas seleccionadas se combinan con una colección de fragmento Fd humano. La selección de la colección resultante proporciona Fab completamente humano.

Una variedad de procedimiento se ha descrito para derivar los anticuerpos humanos de las colecciones de exhibición de fago (ver, por ejemplo, Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991); Patentes de E.U.A. Nos. 5,565,332 y 5,573,905; Clackson, T., and Wells, J. A., TIBTECH 12, 173-184 (1994)). En particular, la selección in vitro y evolución de los anticuerpos derivados de las colecciones de exhibición de fago se han vuelto una herramienta poderosa (ver Burton, D. R., and Barbas III, C. F., Adv. Immunol. 57, 191-280 (1994); y, Winter, G., et al., Annu. Rev. Immunol. 12, 433-455 (1994); Solicitud de patente de E.U.A. No. 20020004215 y WO92/01047; Solicitud de Patente de E.U.A. No. 20030190317 publicada el 9 de octubre de 2003 y Patente de E.U.A. No. 6,054,287; Patente de E.U.A. No. 5,877,293. Watkins, “Screening of Phage-Expressed Antibody Libraries by Capture Lift,” Methods in Molecular Biology, Antibody Phage Display: Methods and Protocols 178: 187-193, y Publicación de la Solicitud de Patente de E.U.A. No. 20030044772 publicada el 6 de marzo de 2003 describe métodos para seleccionar las colecciones de anticuerpo expresadas por fago u otras moléculas enlazadas por levantamiento de captura, un método que involucra inmovilización de las moléculas de enlace candidatas sobre un soporte sólido.

Las modalidades útiles de la invención incluyen, pero no se limitan a, lo siguiente:

Modalidad 1: Un vector de expresión recombinante, que comprende un casete de expresión que comprende un promotor GAPDH de hámster, ligado operablemente a un gen exógeno de interés, que comprende además un elemento regulatorio que

(a) comprende una secuencia de ácido nucleico que es al menos 95% idéntica a la secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ ID NO: 35; y

(b) está operablemente ligado al promotor, en donde el elemento regulatorio está en la orientación .

Modalidad 2: El vector de expresión recombinante de la Modalidad 1, en donde el promotor GAPDH comprende la secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO:50, o un fragmento operable del mismo.

Modalidad 3: El vector de expresión recombinante de cualquiera de las Modalidades 1-2, que comprende, 3’ para el promotor GAPDH y 5’ para el gen de interés, la secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO:52.

Modalidad 4: El vector de expresión recombinante de cualquiera de las Modalidades 1-3, en donde el elemento regulatorio comprende una secuencia de ácido nucleico al menos 98% idéntica a la SEQ ID NO: 35.

Modalidad 5: El vector de expresión recombinante de cualquiera de las Modalidades 1-4, en donde el elemento regulatorio comprende una secuencia de ácido nucleico al menos 99% idéntica a la SEQ ID NO: 35.

Modalidad 6: El vector de expresión recombinante de cualquiera de las Modalidades 1-5, en donde el elemento regulatorio comprende la secuencia de ácido nucleico de la s Eq ID NO: 35.

Modalidad 8: El vector de expresión recombinante de cualquiera de las Modalidades 1-7, en donde el elemento regulatorio está en la orientación positiva.

Modalidad 9: Una célula hospedera mamífera que comprende el vector de expresión recombinante de cualquiera de las Modalidades 1-8.

Modalidad 10: La célula hospedera mamífera de la Modalidad 9, en donde la célula es una célula CHO.

Por ejemplo, ciertas modalidades útiles de la invención incluyen el vector de expresión recombinante, que comprende un casete de expresión que comprende un promotor GAPDH de hámster que comprende la secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO:50, o un fragmento operable del mismo, ligado operablemente a un gen exógeno de interés, y 3’ para el promotor GAPDH y 5’ para el gen de interés, la secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO: 52; y el vector de expresión comprende además un elemento regulatorio que (a) comprende una secuencia de ácido nucleico que es al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% idéntica a la secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ iD NO:35; y (b) está operablemente ligado al promotor en el cual el elemento regulatorio está en la orientación positiva.

La invención se entenderá más completamente por la referencia a los siguientes ejemplos.

Ejemplos

Ejemplo 1: Materiales y Métodos

Se desea un vector de expresión de mamífero para la generación del grupo estable que contenga los casetes de selección y expresión separados con objeto de acelerar el tiempo para la recuperación del grupo estable mientras que mantiene los niveles razonables de la expresión de proteína sobre un periodo del mes diverso. Se inicia con 2 vectores (pPT1 y pPT2; ver la FIGURA 1) que contiene el promotor huCMV y el líder tripartida de adenovirus para la expresión del mamífero, corriente arriba del gen de interés, el cual en estos estudios es un Fc humano del gen reportero, derivado de la región constante de la cadena pesada del IgG 1 humano y se precede por el péptido de señal VH21. Un casete de selección de la resistencia de puromicina (PuroR) está corriente abajo del casete Fc, cuya expresión se conduce por un promotor SV40. El casete de selección pPT1PuroR contiene una secuencia de consenso Kozak débil (CGGCCC) que precede a PuroR. En el vector pPT2 esto se optimizó a la secuencia Kozak fuerte de consenso (GCCACC). Se señalan las conFIGURAciones del vector representadas en los dibujos que representan los casetes de expresión y los elementos regulatorios críticos sobre el vector. No se muestran los elementos de la estructura del vector que no efectúan la expresión en las células de mamífero.

Cultivo celular. Los vectores pPT que expresan Fc humano se usaron para generar los grupos de célula estable en las células CHO-S (Invitrogen). Las células precursoras CHO-S se mantuvieron en el medio CD-CHO (Invitrogen) complementado con L-glutamina 8 mM y se transfectaron con 4 Mg de ADN plásmido linealizado usando un kit de transfección LTX de Lipofectamina (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Dos días después de la transfección, los grupos se volvieron a suspender en el medio de selección que contiene 10 Mg/mL de puromicina. Cada 2-3 días hasta la recuperación, la densidad celular viable y viabilidad se monitorearon usando un contador de Célula Vi (Beckman Coulter) y el medio se intercambió. La recuperación se definió como > 90% de viabilidad por Célula Vi.

Como se describe arriba, los vectores se linealizaron y transfectaron en células CHO-S. Las células se seleccionaron con puromicina y las líneas de célula CHO-S estables recuperadas se usaron inmediatamente para sembrar las producciones de lote de 4-mL en bloques de pozo profundo de 24 pozos en 1 millón de células viables/mL en medio de producción. El medio acondicionado (CM) de estas producciones de lote se usó para determinar la titulación por ForteBio; las producciones se cosecharon por centrifugación después de seis días y las titulaciones huFc se midieron usando un ForteBio Octet Red equipado con los biosensores de la Proteína A y calcularon empleando una curva de calibre huFc. Para evaluar la estabilidad de expresión, los grupos estables se pasaron dos veces por semana durante varias longitudes de tiempo, y luego el procedimiento de producción de lote se repitió usando los grupos estables más viejos.

Resultados (La secuencia Kozak deficiente que precede a PuroR en pPT1 resulta en el incremento de la rigurosidad de selección de la selección de puromicina. Por lo tanto la recuperación de las células transfectadas con pPT1 fue variable y algunas veces no sobreviven a la selección de puromicina y la variabilidad incrementada de las titulaciones se observó. Cuando el Kozak se optimizó, la CHO-S transfectada que contiene pPT2 se recuperó más constantemente. Procedimos usando el vector pPT2 para la modificación del vector posterior.

Ejemplo 2: Clonación del Promotor GAPDH de Hámster, exones e intrones en los Vectores

La ubicación del gen GAPDH de hámster se clonó del ADN genómici CHO-K1. Consultamos la secuencia genómica GAPDH de hámster publicada dentro de NCBI (NW_003613610.1). Los cebadores PCR se diseñaron a fin de que el fragmento deberá incluir el promotor GAPDH de hámster, el primero y segundo exones e intrones así como una porción pequeña de exón 3 que incluyen el aceptor de empalme. Se ha determinado la secuencia del producto amplificado y se usa la anotación de los transcriptos GAPDH de ratón (NM_008084) y hámster (NM_001244854) publicados dentro de NCBI para anotar la secuencia de hámster que incluye los límites del exón/intrón.

De la ubicación del gen GAPDH de hámster procesado por secuencia, identificamos el promotor GAPDH de hámster del núcleo, el primer exón e intrón, y el segundo aceptor de empalme de exón. Estos se clonaron en lugar del promotor del núcleo c Mv humano dentro de pPT2, generando pPT2.1 (FIGURA 2).

También se ha determinado de la ubicación del gen GAPDH de hámster procesado por secuencia (SEQ ID NO:11), el segundo exón e intrón GAPDH de hámster más el tercer aceptor de empalme de exón de la ubicación del gen GADPH de hámster procesado por secuencia. En tanto los transcriptos de ratón como hámster, el codón de inicio para la proteína GAPDH reside dentro del exón 2. Cuando se ha clonado el segundo intrón GAPDH en el pPT2.1, nos aseguramos de abolir este sitio de inicio traduccional. pPT2.4 incorpora el líder tripartida de adenovirus, y tanto los primeros y segundos intrones GAPDH de hámster más las secuencias de exón (FIGURA 4).

En más detalle, las células CHO-K1 (5 millones en el crecimiento de fase log) se cosecharon y usaron para extraer el ADN genómico CHO-K1 usando un kit de Tejido y Sangre Qiagen DNeasy. Los cebadores se diseñaron para amplificar un fragmento aproximadamente 4-kb de la ubicación del gen GAPDH de hámster, que contiene el promotor GAPDH de hámster, así como los primeros 2 exones e intrones de GAPDH de hámster usando el cebador delantero 5’- CTA CCC AGA GAC CTA TTT CTG TCA TAG CC - 3’//SEQ ID NO: 9 y cebador inverso 5’ - CCA GGC GTC CAA TAC GGC C -3’//SEQ ID NO: 10. El producto PCR resultante se purificó con gel y TOPO se clonó usando kit redondeada pCR4-TOPO de Invitrogen (Life Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los clones positivos se sometieron a procesamiento de secuencia para confirmación de secuencia.

La secuencia de ácido nucleico confirmada para el fragmento genómico GAPDH de hámster (Mesocricetus auratus) fue la siguiente (-2049 hasta 2161 con relación al sitio de inicio de transcripción):

CTACCCAGAGACCTATTTCTGTCATAGCCTTTTGGGACACATAAAGCTTCCTTCCTGCATAGAACACCCCACAAC AGTGTATCAGGAGTGTACAAGTTGACAAACAATGCTCTAGACCTACGGTTTTCTTCCTCTGTGTGCCTCATCCCA GAAGAGATCATGACTCCCAGGAGTCAGCCTTTACTATGGGGTCTGCAGGGGCGTCCAGCCCCTCAGCGGCAAG CCATGCCCACCCTCCCCAAGTCCTTAATCTGCTGAGTCACTTGGAACAGGAGACACTGATTCTGCTGTCATGACA ACAGCACATTGCCATAGAAATGCTCCCTACCTCTTACGTGTGTGGTGGGGGAACAGTAATGACAAACCATAGGC AGGAGGCAAAAGGGAAGACGGCACCTCAGAAACATGTGTTAGGTTAGGGCAGAACTATGGAGGGGCTCCTGAG ACTCTTTGATGGGAAAGGGTTAATGCTGCTCCTGAAACCTCTGTTGGAAGGCAGAAAAGGGACAGGGCTGAGTC CCCGCACTGGGACCATTTCCATCCTCTGCATCCTGCCCCCGGCTCATGGAAAGCCTGGGCATGGGCCACACAG CTGTCAGTCTTGGCTCTGGGGCCCCAAGGAGGTAGGGCAATCCCAGAATGGCAAGGAGCCAGGACTGGATTTG GGGTGCAGCCCAGCCTGCTCCCTGCCTTTTAAGCAAAGGTTATCACCAGGCCAGCTAAACTTAGCAATTAGGCT CTTCAGCTAAAAGAGCAGGGGGCTGGTCTCAAGTTGCACTGACCTAGCAAAGAGGCCCCAGGATCCCCCTGCC CAGCACCTGTGGCTGAGCTCCCAAGCCCTTCCCGAGAGCTCAGGATCCACCCTTTCCACCCTCCCTACTCTTCA GAGGAGGAACCCCCTTTCTCCTTCCCACTTGTTGGAGGGGGCTGGGGCCAGGCTGTTCTGGCTTGGGGTATAA TAC CCCCTACCCCTTCTACTTTCCCCTCCTCTCAGACCTCACCCTGCCTCCACGAGGGCAGCCAAGAAAGGAGAGTC CCTGGCTGCAGGGCCAGTAGGCACGTCCCAGGACGGGGAGGGACTTCCGCCCTCACGTCCAGCTCTCCGCCC TGGGGCTGCAGTGGGTGAAAGGGGCAGTGTCTCCTAGCCTGGGCGGTGCAACCCTCAGGTTCCGAGGAGGAA CGCTCTGGGAGGCTTCTTTGCCTCCTCCAACCCAACCCACAACCAGGACATTGTCCTCACCCCGGGGCCCCAA CCTAGACCTTAACTGAGGAACACAGAGGCCAGTTTGTAAGTCTCAATTATGCAGGGCATCCCGACCTGTGGCGT AGGGAGCGCCCCTCCAGGCCGCTTCCCTAGCCTCCTCCTGGCCCTCACAGCCCAGGCCTCTGGCCCAAGAAAT GGAAGTGGGGGTGGGGGATGGAACTGCGAATGCGAAGGGCCCCCGCAGGAGGCAAAGTGACCCCTCCCGGG CCTTTTCTGCTCCGAGACTTGTTTTTGCCTGTGTCACTACCGAAGAACCACGAGAAGATCCTCAACTTTTCCACA GCCTTTGCATAAAGGGGAGAGGGTCGGCGGTGCAGCTGTGGCACACACGCACTTCTGCTCAACCCGCCCCCCC CCGCCCCCGTTCCTGTTCCTTCCCAGGTTCTCCCCATTTTATCGGGGCGGCAACTTTTAGGTCCCTGGGTCCTG GAAGTCCTTAGTACACACTCTTCGTCCTTAAGTCCATAGTCTGTATTCCCTCGGTCCTATCCTGTCCCCCATCAC CGGGTCACCTCCCCAGCGAAGCAATCTCAGTTCCCCTCCCCCTCTCAGCCCCGAGCCCACACGTTTGGTGCGT GCACATTTCAAAAACGAGGCGGGTCCAAAGAGAGGGGGTGGGGAGGTGCCGAGTGGCCCAGCTACTCGCGGC TTTACGGGTGCACGTAGCTCAGGCCTCAGCGCCCTTGAGCTGTGACTGGATGGATGAGCGGGGCGGGAGGCG GGGCGAGCGTCCTCGGCGCTCCCCACCACCCCAGTTCCTATAAATACGGACTGCAGCCCTCCCCGGTGCTCTC TGCTCCTCCCTGTTCTAGAGACAGCCGCATCTTTCCGTGCAGTGCCAGGTGAAAACCGCAGAGTGGGCCGCAG GTGGCCGGGGACGGTCGGAAACGGGGAAGGGGGGCGCTCAGCCCGGGACTGCGGGCGCTGGGGCGAGCTC CACTGCCCGAGCCCGGGCTCCGCATTGCAGAGGCTGGAGGGGGACGTGATGGGGCGCGCGGCGGGAATGGA GGCGGGGGGGGGGGTCGCCCTGTGACCGTGGTCCACGCTGACCTCTCTTTCTTCTCTCTCCCTCCGCAGCCTC GCTCCGGAGACGCAATGGTGAAGGTCGGCGTGAACGGGTGAGTTCGTGGCTGGGCTAGGGTGGGGCTCCGGG TCCCGCTCCGTCGCGTATGCAGGTCTACCCCACCCCGGGGCTCTGCGGGAGCGTGGGGTGGCCGGTGGGTGG CCGCAGCACCCAAGGAGACCTCAAGGTCAGCGAGCCGGCTCCGCCCTTGCGGGGATGAGCAGCGCGGAGTCC TCACGAGGAGGACCATCCCCCGCGCGCACGCATG CTTAGGCTCCATCCCGATCCCCAGCCGGGGGCTTCTTTCTTTACTTTCGCGCCCTGAGGAACCACGTGCCAGAC GGGAGCCCCTCCCCCATTGCCCTCTACCCCCCCCCCCGCGCGCGCCTCCAGGTCGGTGGCACCGGGCCGTGC GGTGCCCGCTTTAGCGCATCCATCATCTCCCAAGGGCTTCCTTTAGGGTGGCTGGCCGCCGCCATGTTGCAAAC GGGAAGGAAATGAATGAACCACCGTTAGGAAACCTCCCTTCGGCCTTCCTCCTTCCTAGCCCGTGACTAACCTC CCCACTCCCTCCCCGGGTGGAGTCGCCTCTGTACTGTAAGCCAGGTGATGCAAGGCTTCCGTGCTCTCGAGAG AGCTCTACCTCGCCAGCTGTCTCATATTATTAGCCTCAAAGCAGCCCTCAAGCCTCATTTACCTTGAGCATATGA TATATTTTGTAGATTCTCTGAGAATCGAAGCGGACTTGGAGAGGTCTGCTTGTCCTTCTCCCAGCCCAAAGGTGG TAGCTATGGCGTAGCGCCGGAGGGGGGAGTGGGGGGGGAGCTGAGTCATGGTGGTTCTGAAAAGAAAATTTCC ACCACAAAATGGCTCCGGTGCTAGCATCCCCTTCCCCCCATAACCTCTGCTTCCCATCACACCCTGACCCAAAC CCTGTAGGCCAGACTGTAAAGGTCACTAAGAGGATTGAGTGTCTGAGCCTCGGAACCCTGCCCTTCTCCCCATC CCATCCTCTGGAAACCAGATCTCCCCCGCTCCACCCTAATCTGAGGTTATATTTAGCCGGCTGACCTTTCAGTAT TTGGGGTCTGGGCCCCTACACACATCTGTTGCTCCTGCTCCTGATTTTTAGCTAGCAAATTCAAGTGCTTTGCAA ATTAGAGCCCAGGGATTAGGGGTTGGAAAGCTCAGTGGTTTTCTCAGTCTTTCCCTTTAGGGGGAGGGACTTGG AGGAAGCAGGTGGGCCGACCCCTGTCCTACTCATTCTGACCTTTAACCTTGCCCTTTGAGCTTGATGATGCTGA GTGCACGAGTTCTTCCTGTCCAGGGGGTGTAGCCTGAAGCCAGGCCAGGCTAGAACAAACTTCCCAGGGGGTG GGGGTAGTGAATGCCTTGTGCCCACACAGGGGCACACTGCCACCTCTTGGAGACTTGAAATGACTGGTGGGGG GGTTGGACAAGGCTTTGAGCCCAATCACCTCTTGGACAGGAAAGTAACCCCCACTTTATGGCCCTGCTGTAAAA GCCCAGTCAAACCTCATTTGTCCAAGGAAGATAGACCTCTTGGGGCTTCCTAAGGATAGGGGTGTTCTATATTTG GGCCCTGCTTCTAAGCATTCAGCCAGCTTTATTAAAGGAAATTCATAACAAAACTTGAATTTCCTGCTTCTTAAAT ACTAATAGTGTGCTGGATCTCCATTAAAAATGCTGTCTTGCACAGTAGGCTATGGTTTCTGTGGGCTCTCTACAG CTATGGGACAACTGGATTCTGTTTTCTGAAGGGCATGTGTCAGCTCAGTACTGACTATAGACCTATGAGTTCTCT GACCCCCTAACTCACCTTTTTTTTTCTTGCCTCAGATTTGGCCGTATTGGACGCCTGG//SEQ ID NO:11.Vector pPT2.1 incorpora porciones de la ubicación del gen GAPDH de hámster, incluyendo una porción del promotor GAPDH de Hámster (SEQ ID NO:11), es decir, la siguiente porción de la SEQ ID NO:11 de -532 hasta 305 con relación al sitio de inicio de transcripción:

ACCACGAGAAGATCCTCAACTTTTCCACAGCCTTTGCATAAAGGGGAGAGGGTCGGCGGTGCAGCTGTGGCAC ACACGCACTTCTGCTCAACCCGCCCCCCCCCGCCCCCGTTCCTGTTCCTTCCCAGGTTCTCCCCATTTTATCGG GGCGGCAACTTTTAGGTCCCTGGGTCCTGGAAGTCCTTAGTACACACTCTTCGTCCTTAAGTCCATAGTCTGTAT TCCCTCGGTCCTATCCTGTCCCCCATCACCGGGTCACCTCCCCAGCGAAGCAATCTCAGTTCCCCTCCCCCTCT CAGCCCCGAGCCCACACGTTTGGTGCGTGCACATTTCAAAAACGAGGCGGGTCCAAAGAGAGGGGGTGGGGA GGTGCCGAGTGGCCCAGCTACTCGCGGCTTTACGGGTGCACGTAGCTCAGGCCTCAGCGCCCTTGAGCTGTGA CTGGATGGATGAGCGGGGCGGGAGGCGGGGCGAGCGTCCTCGGCGCTCCCCACCACCCCAGTTCCTATAAAT ACGGACTGCAGCCCTCCCCGGTGCTCTCTGCTCCTCCCTGTTCTAGAGACAGCCGCATCTTTCCGTGCAGTGCC AGGTGAAAACCGCAGAGTGGGCCGCAGGTGGCCGGGGACGGTCGGAAACGGGGAAGGGGGGCGCTCAGCCC GGGACTGCGGGCGCTGGGGCGAGCTCCACTGCCCGAGCCCGGGCTCCGCATTGCAGAGGCTGGAGGGGGAC GTGATGGGGCGCGCGGCGGGAATGGAGGCGGGGGGGGGGGTCGCCCTGTGACCGTGGTCCACGCTGACCTC TCTTTCTTCTCTCTCCCTCCGCAGCCTCGCTCCGGAG// SEQ ID NO: 49; el primer exón e intrón; y el aceptor de empalme del segundo exón en pPT2. Primero, la porción del vector de pPT2 se digirió por XbaI y SalI y gel purificado, extirpando el promotor CMV completo de la pPT2. El aumentador CMV IE se reemplazó por un producto PCR usando el Cebador delantero 5 (5' - TGA AGT CTG GAT CCG TTA CAT AAC TTA CGG TAA ATG GC -3'//SEQ ID NO:14) y cebador inverso 5 (5' - CCA TGG TAA TAG CGA TGA CTA ATA C - 3'//SEQ ID NO:15), y finalmente, el promotor GAPDH que incluye el exón 1 e intrón 1 se incorporó por un producto PCR usando el Cebador delantero 6 (5' - GTC ATC GCT ATT ACC ATG GCC TCG AGA CCA CGA GAA GAT CCT CAA C -3'//SEQ ID NO:16) y cebador inverso 6 (5' - CAT TCC ATG GTG GCC TAG TCG ACG CTA GCC TCC GGA GCG AGG CTG - 3'//s EQ ID NO:17). Las plantillas para estas reacciones PCR fueron pPT2, pPT2 y pCR4 - fragmento genómico GAPDH respectivamente. Los 3 productos PCR se clonaron en la porción del vector linealizado XbaI y SalI de pPT2 por SLIC.

El vector pPT2.4 incorpora el segundo intrón GAPDH de hámster en pPT2.1 (FIGURA 4); sin embargo, primero se generó un constructo intermediario pPT2.2. En pPT2.2, la secuencia pPT2.1 del cuadro GAPDH TATA y la extensión del aceptor de empalme de exón 2 se reemplazó por el CMV TATA, el líder tripartida de adenovirus y el Aumentador Tardío Principal (MLE) como se encuentran en el vector de partida y pPT1. En breve, pPT2.1 se digirió con BamHI y SalI y la porción del vector se purificó por gel. Para reemplazar el promotor GAPDH y hCMV IE extirpado, un producto PCR usando el Cebador delantero 5 (SEQ ID NO:14) y cebador inverso 7 (5' - CGA GCT CTG c Tt ATA TAG GAA CTG GGG TGG TGG - 3’//SEQ ID NO:18) y plantilla pPT2.1 se combinó con un producto PCR usando el Cebador delantero 7 (5’ - GTT CCT ATA TAA GCA GAG CTC GTT TAG TGA AC - 3’//SEQ ID NO:19) y cebador inverso 8 (5’ - CAT TCC ATG GTG GCC TAG TCG ACG CTA GCA GGT TTT CCG ATC CGG TC - 3’//SEQ ID NO:20) también usando pPT1 como una plantilla. Estos productos PCR se clonaron en la porción del vector digerido BamHI y Salí de pPT2.1 por SLIC.

Un segundo intermedio, pPT2.3 se creó, por ello el adenovirus MLE, que está incrustado como un intrón entre los líderes 1 y 2 (L1 y L2) del líder tripartida de adenovirus (TPL), se extirpó y reemplazó por el GAPDH intrón 1. Tres productos PCR se clonaron en la porción del vector digerido BamHI y Sal I de pPT2.1 por SLIC. El primer producto PCR abarcado por el hCMV IE, promotor GAPDH, y que incluye la secuencia hasta el 1er líder (L1) del TPL. Estos se amplificaron usando el Cebador delantero 5 (SEQ ID NO: 14) y cebador inverso 9 (5’ - CGG TAC t Ca CCC CAA CAG CTG GCC CTC - 3’//SEQ ID NO: 21). El segundo producto Pc R usando el GAPDH intrón 1 como una plantilla y se amplificó por PCR usando el Cebador delantero 8 (5’ - CTG TTG GGG TGA GTA CCG CAG AGT GGG Cc- 3’//SEQ ID NO: 22) y cebador inverso 10 (5’ - CCG CGA GCT GCG GAG GGA GAG AGA AG - 3’//SEQ ID NO: 23). Finalmente, el tercer producto PCR amplificado L2 y L3 del TPL usando el Cebador delantero 9 (5’ - CCT CCG CAG CTC GCG GTT GAG GAC AAA C - 3’//SEQ ID NO: 24) y cebador inverso 8 (SEQ ID NO: 20).

Finalmente, pPT2.4 se derivó del constructo intermediario pPT2.3. El plásmido pPT2.4 tiene el 2o intrón incluyendo los límites de exón/intrón agregados a pPT2.3. El plásmido pPT2.4 incorpora el promotor GAPDH de hámster, es decir, las siguientes porciones de la SEQ Id NO:11 (i) de -532 hasta -23 bp con relación al sitio de inicio de transcripción:

ACCACGAGAAGATCCTCAACTTTTCCACAGCCTTTGCATAAAGGGGAGAGGGTCGGCGGTGCAGCTGTGGCAC ACACGCACTTCTGCTCAACCCGCCCCCCCCCGCCCCCGTTCCTGTTCCTTCCCAGGTTCTCCCCATTTTATCGG GGCGGCAACTTTTAGGTCCCTGGGTCCTGGAAGTCCTTAGTACACACTCTTCGTCCTTAAGTCCATAGTCTGTAT TCCCTCGGTCCTATCCTGTCCCCCATCACCGGGTCACCTCCCCAGCGAAGCAATCTCAGTTCCCCTCCCCCTCT CAGCCCCGAGCCCACACGTTTGGTGCGTGCACATTTCAAAAACGAGGCGGGTCCAAAGAGAGGGGGTGGGGA GGTGCCGAGTGGCCCAGCTACTCGCGGCTTTACGGGTGCACGTAGCTCAGGCCTCAGCGCCCTTGAGCTGTGA CTGGATGGATGAGCGGGGCGGGAGGCGGGGCGAGCGTCCTCGGCGCTCCCCACCACCCCAGTTCCTATA//(SE Q ID NO:50); (ii) Intrón 1 de 64 hasta 293:

ACCGCAGAGTGGGCCGCAGGTGGCCGGGGACGGTCGGAAACGGGGAAGGGGGGCGCTCAGCCCGGGACTG CGGGCGCTGGGGCGAGCTCCACTGCCCGAGCCCGGGCTCCGCATTGCAGAGGCTGGAGGGGGACGTGATGG GGCGCGCGGCGGGAATGGAGGCGGGGGGGGGGGTCGCCCTGTGACCGTGGTCCACGCTGACCTCTCTTTCTT CTCTCTCCCTCCGCAGCC//(SEQ ID NO: 51); y (iii) Intrón 2 de 334 hasta 2145:

GTGAGTTCGTGGCTGGGCTAGGGTGGGGCTCCGGGTCCCGCTC

CGTCGCGTATGCAGGTCTACCCCACCCCGGGGCTCTGCGGGAGCGTGGGGT GGCCGGTGGGTGGCCGCAGCACCCAAGGAGACCTCAAGGTCAGCGAGCCG GCTCCGCCCTTGCGGGGATGAGCAGCGCGGAGTCCTCACGAGGAGGACCAT CCCCCGCGCGCACGCATGCTTAGGCTCCATCCCGATCCCCAGCCGGGGGCT T CTTTCTTTACTTTCGCGCCCT GAGGAACCACGT GCCAGACGGGAGCCCCT C CCCCATTGCCCTCTACCCCCCCCCCCGCGCGCGCCTCCAGGTCGGTGGCACC GGGCCGTGCGGTGCCCGCTTTAGCGCATCCATCATCTCCCAAGGGCTTCCTT TAGGGTGGCTGGCCGCCGCCATGTTGCAAACGGGAAGGAAATGAATGAAC CACCGTTAGGAAACCT CCCTTCGGCCTT CCTCCTT CCTAGCCCGT GACTAAC CT CCCCACT CCCT CCCCGGGT GGAGTCGCCT CT GTACT GTAAGCCAGGT GAT GCAAGGCTTCCGTGCTCTCGAGAGAGCTCTACCTCGCCAGCTGTCTCATATT ATTAGCCTCAAAGCAGCCCTCAAGCCTCATTTACCTTGAGCATATGATATAT TTT GT AGATT CTCT GAGAAT CGAAGC GGACTTGGAGAGGT CTGCTTGTCCTT CT CCCAGCCCA AAGGT GGT AGCT AT GGCGT AGCGCCGGAGGGGGGAGT GG GGGGGGAGCT GAGT CAT GGT GGTT CT GAAAAGAAAATTT CC ACC AC AAAAT GGCTCCGGTGCTAGCATCCCCTTCCCCCCATAACCTCTGCTTCCCATCACAC CCT GACCCAAACCCT GT AGGCCAGACT GT AAAGGT CACT AAGAGGATT GAG T GT CT GAGCCT CGGAACCCT GCCCTT CT CCCCATCCCAT CCTCTGGAAACCA GATCTCCCCCGCTCCACCCTAATCTGAGGTTATATTTAGCCGGCTGACCTTT CAGT ATTT GGGGT CTGGGCCCCT ACACAC AT CT GTT GCTCCTGCTCCT GATT TTT AGCT AGCAA ATT CAAGT GCTTT GCA AATTAGAGCCCAGGGATT AGGGG TTGGAAAGCTCAGTGGTTTTCTCAGTCTTTCCCTTTAGGGGGAGGGACTTGG AGGAAGCAGGT GGGCCGACCCCTGTCCTACT CATTCT GACCTTTAACCTT GC CCTTT G AGCTT GAT GAT GCT GAGT GCACG AGTT CTTCCT GT CCAGGGGGT GT AGCCTGAAGCCAGGCCAGGCTAGAACAAACTTCCCAGGGGGTGGGGGTAG T GAAT GCCTT GT GCCC ACACAGGGGC AC ACTGCCACCT CTT GG AG ACTT GA AAT G ACT GGTGGGGGGGTT GGACAAGGCTTT G AGCCC AAT CACCT CTT GGA CAGGAAAGTAACCCCCACTTTATGGCCCTGCTGTAAAAGCCCAGTCAAACC T CATTT GT CCAAGGAAGATAGACCTCTTGGGGCTTCCTAAGGATAGGGGT G TTCTATATTTGGGCCCTGCTTCTAAGCATTCAGCCAGCTTTATTAAAGGAAA TT CAT A AC AAAACTT GAATTTCCT GCTTCTT AA AT ACT AATAGT GTGCT GGA T CT CCATT AAA AAT GCT GT CTT GCAC AGTAGGCT AT GGTTT CT GT GGGCTCT CT ACAGCT ATGGGACAACT GGATT CT GTTTT CT GAAGGGCAT GT GTC AGCTC AGTACTGACTATAGACCTATGAGTTCTCTGACCCCCTAACTCACCTTTTTTTT TCTTGCCTCAGATTTGGC//(SEQ ID NO:52).

Usando pPT2.3 como una plantilla, la región promotora se amplificó con los cebadores Cebador delantero 5 (SEQ ID NO:14) y cebador inverso 11 (5’ - GAA CTC ACC TGA GGT TTT CCG ATC CGG TC - 3’//SEQ ID NO:25). La secuencia de GAPDH intrón 2 (SEQ ID NO:52) se amplificó usando el Cebador delantero 10 (5’- CGG AAA ACC TCA GGT GAG TTC GTG GCT G-3’//SEQ ID NO:26) y cebador inverso 12 (5’- CAT TCC ATG GTG GCC TAG TCG ACG CTA GCC AAA TCT GAG GCA AGA AA-3’//SEQ ID NO: 27). Estos productos PCR se clonaron en la porción del vector digerido BamHI y SalI de pPT2.1 por SLIC.

Los vectores pPT2, pPT2.1 y pPT2.4 se linealizaron y transfectaron en células CHO-S. Las células se seleccionaron con puromicina y los grupos de célula CHO-S estables recuperados se usaron inmediatamente para sembrar producción en lote de 4-mL. El medio acondicionado (CM) de estas producciones de lote se usó para determinar la concentración por ForteBio, como se describe en el Ejemplo 1.

Resultados: Muchos vectores de expresión actuales contienen promotores híbridos hechos del aumentador temprano inmediato de CMV seguido por un promotor del gen de limpieza, por ejemplo GAPDH, Factor de Alargamiento alfa (EF1 a) o beta Actina de pollo (CAG) (ver, por ejemplo, Magnusson et al., Sustained, high transgene expression in liver with plasmid vectors using optimized promoter-enhancer combinations, Journal of Gene Medicine 13(7-8):382-391 (2011); Xu et al., Optimization of transcriptional regulatory elements for constructing plasmid vectors, Gene. 272(1-2):149-156 (2001)). Nuestros esfuerzos posteriores se centraron en los vectores de expresión CHO mejorados al reemplazar el promotor CMV del núcleo con tal promotor híbrido. Elegimos reemplazar el promotor del núcleo CMV con un promotor de limpieza de hámster. Para nuestros propósitos seleccionamos la ubicación del gen GAPDH de hámster para investigar su viabilidad como un compañero del promotor híbrido.

Con el reemplazo del promotor del núcleo CMV con el promotor GAPDH de hámster e intrón 1 (pPT2.1) mostramos que esta configuración del vector da los niveles de expresión comparables en los grupos CHO-S para el vector pPT 2 que contiene el promotor del núcleo CMV, sugiriendo que el promotor GAPDH hámster configurado con el aumentador CMV es muy activo en las células CHO (FIGURA 3).

Los promotores de limpieza tipo EF1 alfa así como una beta actina de pollo mantienen un intrón grande dentro de las secuencias promotoras completas. Estos intrones contienen muchos sitios enlazados al aumentador que resultan en la activación del promotor. El primer intrón dentro del promotor GAPDH es significativamente más pequeño, por lo que la hipótesis de que el segundo intrón GAPDH de hámster más grande debería mantener muchos más sitios enlazados al aumentador. Por lo tanto incluimos el primer y segundo intrón del gen GAPDH de hámster en nuestro vector de expresión pPT2.4. Esta adición fue capaz de elevar los niveles de expresión al 40% comparado con el vector pPT2.1 que contiene el promotor GAPDH e intrón 1 solo. Por lo tanto, similar al promotor de EF1 alfa y beta actina de pollo, la actividad del promotor GAPDH se aumenta por las secuencias encontradas dentro de uno de sus intrones. (FIGURA 5).

Ya que creíamos que el intrón 1 no puede tener un impacto directo sobre los niveles de expresión y nos preocupa la posibilidad de los eventos de empalme alternativos con la inclusión de 2 intrones dentro de pPT2.4, el vector pPT3 se generó usando el Cebador delantero 11 (5’ - GAT GTG TTG AAG TCT GGA TCC - 3’//SEQ ID NO:28) y cebador inverso 13 (5’ - CAA CCG CGA GCC CAA CAG CTG GCC CTC - 3’//SEQ ID NO:29) y Cebador delantero 12 (5’ -GCT GTT GGG CTC GCG GTT GAG GAC AAA CTC - 3’//SEQ ID NO:30) e inverso 12 (SEQ ID NO:27). Esto remueve las secuencias de GAPDH intrón 1 y hace una fusión directa de las 3 secuencias líderes que hacen el TPL. Estos 2 productos PCR se clonaron en la porción del vector digerido BamHI y SalI de pPT2.1 por SLIC. La estructura del vector se representa esquemáticamente en la FIGURA 6.

Los vectores pPT2, 2.4, 3, se transfectaron en las células CHO-S y las células se seleccionaron con puromicina y los grupos de célula CHO-S estables recuperados se usaron inmediatamente para sembrar las producciones en lote de 4-mL. El medio acondicionado (CM) de estas producciones de lote se usó para determinar la titulación por ForteBio. Los grupos de célula CHO-S estable recuperada también se mantuvieron bajo selección durante los periodos adicionales de 1 y 2 meses; las producciones en lote de 4-mL se ajustaron y las titulaciones se determinaron en el extremo de la corrida. Los vectores pPT que contienen el promotor GAPDH de hámster fueron capaces de generar titulaciones iniciales comparables o titulaciones excedidas del CMV original que contiene pPT2.0. Sin embargo, una caída precipitada en las titulaciones se apreció durante tiempos de cultivo más grandes en todos los vectores, pero los grupos CHO que expresan el vector pPT2 se rechazaron más rápidamente, perdiendo toda la expresión dentro de 2 meses de cultivo. (FIGURA 7). La eliminación del intrón 1 de pPT2.4 tiene poco efecto sobre las titulaciones de expresión (FIGURA 7 pPT. 3 contra pPT2.4). Como hemos hipotetizado, las secuencias dentro del intrón 1 del promotor GAPDH agregan poca actividad aumentadora adicional y hacen su inclusión menos deseable.

Ejemplo 3: Clonación de regiones genómicas Rps3 y Rps2 de Hámster

Métodos. Las células CHO-K1 que crecen logarítmicamente (5E6) se cosecharon y usaron para extraer el ADN genómico CHO-K1 usando un Kit de Tejido y Sangre Qiagen DNeasy. Los cebadores se diseñaron para amplificar un fragmento 3.3Kb aproximado que contiene la región genómica Rps3 de hámster, incluyendo el promotor y los primeros 3 exones (Cebador delantero, 5’-GAT TAG AAG CCA TCT TGT TAC AA-3’//SEQ ID No :33 y cebador inverso, 5’-TAT ATA ACT CTG AAA GTG Tc A ACC C-3’//SEQ ID NO:34). El producto PCR se purificó en gel y TOPO se clonó usando el kit redondeado pCR4-TOPO de Invitrogen. Los clones positivos se sometieron a procesamiento de secuencia y confirmación de secuencia.

La secuencia de ADN confirmada para fragmento genómico Rps3 de hámster que incluye el elemento regulatorio es la siguiente:

GATTAGAAGCC AT CTTGTT ACAAAT GT CAAAAGAT C ATTCCT GT TTT CT GT AAT ACTT GT GTTT GACCAT GT CTT GAT CC AT CTTCT GGAATTT GAC AT GTT CC ACACCTT AT ACCCT GACCT CC ATCCT GACAAGAT AAGAT GTT CT G CC ACT GTCCT ACAT AACC AAAAT GCCTCTT CA AAT CGCCC AATCCTT GA AAT TTCT G AGCTATAT AAATT CTACTTTCTTCT AT GT CC AAT G CT GTTTTTT CAAA CTCCACTTTAGGGAGACAACCCTGTTTGACAGAAAATAAAACTTCCTTAAT CT AACT AAAACAATTT GGGTAAT GGGCTTT ACTTTT ATTT GGT GGG ATTT GC ACAGGGT GAATT GGAGCCC CCT GGAGAT GACT GAGCCACGAACACT GT AGT ACA AGTT ACT GAAGCAGGATTT GCTTCT GGAC AAGGAGT GATT GCTGGT GT AGACAT CGGAGTCCCT GT GAAGGGAT GT CCT GT GGCCCAGACTTACACTTT CT GAT AAT CT GT CTT CAAAGCCCT GCT AGTTT ATTACATT GACAGCT CCCTT CT GGTAGCCCACCCCACT GT GAGTTCAAAAAGTT CAGAGGTCCT GGT GCAA GT GTTT GATACCAGAAAT GCTACAGGTAAGTCCAT CTTTAGGAT CAGGGTTT AT CTTT GT AAT AAAC AT C AT AGGATT GTAAT GTTTT AACAAT GACGT GT GTG T GT GT GTGTGT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GTGTTTGTGTTT GT GT GGGG AG AGC AT GC AT GGGAAGGT CCT AGG ACCT AGGTTCTGTC CTTT GA CCTCT GGGT GCT GGGAT CGAAAT CAAAC ACCTTTACCTA CT AAGT CACCT G GCT GGT CCCCCAAAT GAATTT CA AT GAGAGTTTT CATT AGT GT GGT CCT GAA GCTATAAGCAATAGGGTTCCAGTCTGGGTAAACTCTGTTAGTGTATGCTTAT GT CT GT GGTTTGCAT CTCTT GCCTCTT GGTTGCT CTGTT CAAAGTTTTT ATTT ATTTTTGAGTCGGGGGCTCATGTAGACCAAGCTGGCTTCGAACTCGCTATGT AGT CGAGAATGACCTT GAATTTTT GATT CT CCAGCCTCCACCT CT CTAGT GC T GAAAT CACT GGTGT GCT CCT CCACGGTGGGGTACATT GATTGTTTTT CAGA CCAGAATTAGATTTGCACTTCCTGTTCCGCCTACACTACGGGTTGCTAGGTT ACACTTCTTTTT CT CTTTTCGCCTTTATAAACT CAAAACTT CATTT CCCAT GA GCT CTT GCAAGT GTCGCCGTT GCGT GGCGTT GCGT CGT CGTTCCGCGCCCTT TATACACACTTCCGCCCGCGAGCTACTTCCTTTCCTTTCGGTGGCGCGCGGC GGCAAGAT GGCGGT GCAGATTT CCAAG AA GAGGAAGGT AAGCATTT CGGA CCGGCT CGGGGACT CGCGGCGCGTTTTAAAGCT GCCACGGT GAGACCCGCA GCT CCGTGTCCGAT CCCGGAGAGCGGCTACT GCCGCCT GGCGCTT CCGCGG GGCGCGGAT GGACGT GGATT GT GTGCTGGGCCGGCTCCGGGCTAGCT CAGT GT GGCT GAGGAAGGGAGGAACAGACGCCT CAGTT CT GGGCCGAGGTGAAC ACTGGAAGCCATCAGGCCTTTACTAGACGCTTTTGAGCGTCTCTCGGTCGCC AGAATTAGTAACCCTATGGCATAGCTTGAGAGCGTGAGCTAATCCGGCGTC TTTGGT AAGT GAGGTTT AGC AGT GCCGCCT CAGTT GAAAGGCT GCCGACT A TTGGCGTGCTCCCTCGGGACCTGCAGCAAAAGCGTCCCGGACTTTTGTCATT T CAT GGGG AAGAAGT GTGT GA AGAT CAT CAGGTTTAGAAAT AGAT GGCCTG T CTTT GT GAT CAAGCAC ATAGAT CATAAAGCT GTT GT CC ACAT GCT GTTT GG GTTAGATTT GT CCTCTCTTGCTT CAGGTACGAGTT ACAT ACAC AC ACGGT GT TCTTGCTGTGCTGTGT GAACT GCAGAT GTGCT ACTT GAAT AGATTTTT GTTC TGTGTGTGTAAATGTTTTAAAACCCTTCGATGAAGAGGTGATGACGAGTCT GACGGAGGT GTTGTCTTT GT CC AAAAGGCGT CACT GTGCTGCGTTCTGTGGC ACAGCTGAAAGCACTATGGTCAAAGGAACTTCCTAAAGATGACCTAGAGG CATTT GT CT GAGAAGGGTT GCT GCATTCCCGAAGGGTCATT GGGGT CGAAC TGGGTAAGCCTCTACCCTTTCTTAACTCTGAACTTGCTTTTGGTTTAGTTTGT GGCT GAT GGC AT CTT CA AAGCAGAGCT GAAT GAGTTT CT CACT CGGGAACT GGCTGAAGACGGCTACTCGGGAGTTGAAGTCCGAGTTACACCAACCAGAA

CT GT AAT CACT GT GT GT ATT GAGTTGCT GT GT AAACTT GGAACA ACCA ACCA GTGAACCTGCTCCTTTTTTGTTGTTGTTTTTTGTTTGTTTTTTGAGACAGGGT TTCT CTGCATT GCTT GGGAGCCT GGCCT GGAACTTGCT CT GT GGAT CAGT CT GGCCTAAGACTCACAGAGAT CCGCCT GCT CTGCCT CCT GAGTGCT GGGATT AAAGGT GT GCACCACCACCACT GCCTGGCCTT GGAGTT GCTTTTTTAAAAC ACCATTT GTAAAGAATTTACCTTAATACTTTTTTAAAGTGT GT CCTT GCT GT GT GAT AAAT GGT AT GT GAGGT GTT GC AAAT AAATT GT AATTTTCCCTT CTGC AGAACACAAAAT GTT CTT GGT GAGAAGGGTCGTCGAATCAGAGAGTT GACT GCGGTAGTTCAGAAGAGGTTCGGCTTCCCTGAGGGCAGCGTAGAGGTGAGT TTCCCT GGTTTAT ACCAGGGGCAGT AGACT GGATTT AGAAGTT GCTTCTGT A GAACGGTAATTCTGGACAATGAGTAGTACAGGTGGGTTGACACTTTCAGAG TTATATA//SEQ ID NO:35.

Las células CHO-K1 que crecen logarítmicamente se cosecharon y usaron para extraer el ADN genómico CHO-K1 usando un Kit de Tejido y Sangre Qiagen DNeasy. Los cebadores se diseñaron para amplificar un fragmento 3.2Kb aproximado que contiene la región genómica Rps2 de hámster, incluyendo el promotor y los primeros 2 exones (cebador delantero, 5’-CAA AGA GGT TGA GAT CGT ACC C-3’//SEQ ID NO: 36 y cebador inverso, 5’-TGA GAC CGC TGC CAA AGC-3’//SEQ ID NO:37). El producto PCR se purificó en gel y TOPO se clonó usando el kit redondeado pCR4-TOPO de Invitrogen. Los clones positivos se sometieron a procesamiento de secuencia y confirmación de secuencia.

La secuencia de ADN confirmada para el fragmento genómico Rps2 de hámster que incluye el elemento regulatorio es la siguiente:

CAAAGAGGTTGAGAT CGTACCCACCACT CT GCAAAGGCCAAGT TAGTGTTAAAGTCTGTCCCAAAGCACACATACCATCAAGATAACTCCATAA T CATT CT GTAGGGAGGCAGGCTACATAAAGAAACT CAAGGGCAAACCTGT G GGGGTTGAGT CCCCCAAGATTT GCCAATATTT GACT GAAGAAGCTGGAATA CC ACCT AGAGCCTT CT GAAAT GTTTT CTT GCCCCAT AAAGGAACT AT CATT C ATTCGCAGAGTGAGACAGGATCGATTCCTAGACAGCTGGGCAGCTGTCTGG AATT GAGT ACAT AT CT C AGAGCT GGT GGAAAGAAGCC AGGGCCT CACCAT G AT CT GTGT CT GGACGGCAGCTCCACT GAGGCCAAGGGCTTAGGAGCCT CCA TTT CACAGTACATGT GGACCGACAT CACAGT GGCATT GT CTAGCTTGAGCC AAT CAC AGCT CT GGT CC AGAGCCAATT GGGACCTT GT GGCTACCTTACCCTT TGCCTTGCCCTCT GAAGGT GAGT GGT AGGGT GGCCT CAACT CAGG AGTAGT CT AT GGATT CTCTTGCTTGCCTT GGTT GT GGCT GACAGCT GAGCCC AAGCTT CT AGGGACT GGTTCCCAAGGCCAGT AGGAT CCCAGGGATT GT AGCCT CCTC CATT GACT GGGT GGT C AGTTT AGAT GTTGGT CCTGCT CCACAA ACAT CCCTT CACCAAGAATTAAGCCCAATAGCAAGAGCCACATTCTTTGAAAGAGACCA GAGGCTTTT CAGTTTAACTTAAAGGCCTTT GGGGACT GGGCAGT GGTAGT G

CAAGCAAAGCCTTTAATCCTAGCACAAACGAGACAGAGGTAGTTGTATCTG TGATTTTGAGGCCAGCCTGATCTACAGAGTGAGTTCTAGGACAGCTAGAGC T GTTTCACAGAGAAACCCT GT CT GGAAGAAATAAAACAAAAGGCCTTGGAG AGAT AAGCTTT AGAAT ACAT GCTTT AGT GT AGTT CTTTTTGT GT AT AACAT G GTTT CC ATATT GGCAT AGAG AT CACACT GGGCAGAT A ACC ATATT AACT GA GCAGAAAGAATATAAAGTAGGCCTAAGGGAACATTAGTGGAGCTACTGAC AAT CCTCTCCTT C AGCT GCAAT CT ATTTT GGGAGAT GCCT GAGT ATAC ACAA AGTAAAAGGGCCACTCCATGATTAAGTGTCCAGGTCATAATCCTCGATTGG GTAGGACTGTTTGCTGTTTCAGGGCCACACACGCTCAATAACGCTTCATGA AGTT GAACTT GAGT GGAAT CAT ACTTTGGCCAT C ACT AGT GCACT ATTTGGG GT GA ACAGAT GTCTTCCCT AGA AGGGGAAAT GCCAACAC ACT ACTTCT AGG TGGTCATGTAAAAATTTTTGAAATAGACCGGGCATTGGTGGCACACACCTT TATT CCTACCACT CAGGAGGCAGAGGCAGGT GGAT CTCT GTGAATTT GCAA TCAGCCTGGTCTACAAGCCCTAGTTGCAAGGCAGCCTCCAAAGTCACAGAG AAACCCTGTCTTGAACGCACCCCCCCCCCCCCCCCCCGCCCAATTTTTTTTT TTTAAAATAACCTGGCTGGAGAGATGGCTCAGAAGTTAAGAGCACTGACTG CCCTT CCGGAGGT CCT GAGTT C AATTCCAGGCAACCTT AT GGT GGCT CAAA ACCAT CT GTAAT GAGATTT GGCGCCCTCTT CT GGCAT GCAACAT ACAT GTT G GT AGCACACT GTAT AT AT AAT A AATAAAT CTT GT CT CT GACT CT CAGT GCAA GCAACCACACCCAAGCTCCAGTCATTTAAAGAAGCCAAACACTGAAACCA AT GGGAGCTCCT GT AGCAT CCTT GTT CTGCTGCTT GAT GAT CACT CT GGAT G AGGAATACCTGTGTGGTGCACAGTACATCTGGAGCATGAGTACAAGACAAG GCCTA ACCC AGAT GAAACTT GT CAC AT ACAC ATTT CT ACCT GT GT AGT GAC ATTT GGAAGGCCG AAGCAGGATT GTTAAATT CCAT GT CCT CACT GAAT ACA CAGCAGGACCCACTCTCAAAACAAAACAAAACTTAGGGTTCAACTATACGA AACT CCAGTT CCAGGGGCT CAGATAT CTTTTTACGGCCACAGGCAT CAGAC AACGTGGTGCATATACATTCATGCAGGCAAAATAAAAGCGCACTTAAAGAA AAGCT GGAAT CTAGCAGGGT GGAAT CTAACTTACAGGGGT CT GGCT GCGT C GGCCATCCAGATGCTACCTGTTGGGACTAACACACCCGCCACGAATACGTT TTTCACCTAGATTGACAGAAACCCTCCAAGAAAACCAGAAGAAAAACACA AACAAAACACCACCACCACCACATACACGGTAGGTTATGTTAAACCACTTT ATTT GAGAAGAGGACAT CGGAACCCT GCCATTTT CGT GGGCGAAGCTGCAG CCGCCTCCAGAT CC AGT GGAACCT GT GGAT AAAGGAC AT GGTT AGGAT CGA

T GCCACACACAAGCCAGGCCGCGGGAGCCGCGAGGCGGT CGGGAAT GTAG GGGCCT GGGTTTCACCCT CCCACACT GGGGCAGCGGGCGGT GAGCT GAGGC CCCT GTGGCT CT GGGCGCCGAAT CTCACCT CCGGCCACAGCCAAGGCCGAA AATGATTTTCAACGAACGCCCATTTACCGAGCCCACGGCGAACGCGAGGCT GACGAGGT ACAACCT ACCT GAGGC AGAGAGAAAGAGCAGGAAGT GACGAG CACTAGGAGGCCTGAGAGGCGCCACCCGGACTTTTATACACCCTCACAGTC GGCGTACGTCGCGGCTTCGGCGAGGCGATATGCGCAGGCGCAGATGGAAC GTGCGGGGCGGGGGGGGGGGAGGTGACAACACGCAGCCAATTACAGCCTG CGTGTGAGCTGAGCAGGCCTGGAGATATCGCGGCGCTAGGGGCACTATAA AGT CT GCCTT CCCCACAGCCGCGCT CTT CTT CTACTTCGGGAAAACACGT GA GT CGTT GTTCCT CAGT CCCGGT GTCGGGGCCT GGGCAGTGGGAAT CCGTGG ACATCCGGACGGAGACGCCCTT GGGCGGGAGGT CCCCTAT CGGAAT CCCAA GCG ACCGC AAAGCCAATT GT CGTT CT GAGTT GCTTTTTTGCTT CT CTAGC AA ATGGCGGATGACGCCGGTGCAGCTGGAGGGCCCGGAGGACCCGGGGGCCC AGGATTAGGAGGTCGCGGAGGCTTCCGCGGAGGCTTTGGCAGCGGTCTCA//

SEQ ID NO:38.

Construcción de vectores pPT4 y pPT4.1. El elemento genómico Rps2 de hámster se introdujo dentro de pPT3 en ya sea la orientación positiva (pPT4) o negativa (pPT4.1) (FIGURA 8). En la orientación positiva, Rps2 se amplificó usando el cebador delantero 5’- GGA ATT AGA CGG ATC CCA AAG AGG TTG AGA TCG TAC C -3’//SEQ ID NO:39 y cebador inverso 5’- CGT AAG TTA TGT AAC GGA TCC TGA GAC CGC TGC CAA AGC -3’//SEQ ID NO:40. En la orientación negativa, usamos el cebador delantero 5’- GGA ATT AGA CGG ATC CTG AGA CCG CTG CCA AAG C-3’//SEQ ID NO: 41 y cebador inverso 5’- CGT AAG TTA TGT AAC GGA TCC CAA AGA GGT TGA GAT CGT ACC -3’//SEQ ID NO: 42. Para lanzar los productos PCR en pPT3, usamos enzimas de restricción PvuI y BamHI, se necesita el reemplazo de la parte del gen de Resistencia de Ampicilina y la replicación Ori. Esto se proporcionó por un producto PCR usando el cebador delantero 5’- CAA CTT ACT TCT GAC a Ac GAT CG -3’//SEQ ID NO: 43 y cebador inverso 5’- GGA TCC GTC TAA TTC CGG TCT CCC TAT AG -3’//SEQ ID NO: 44. Todos los fragmentos se ensamblaron usando la metodología SLIC.

El elemento genómico Rps3 de hámster se introdujo dentro de pPT3 en ya sea la orientación positiva (pPT4.2) o negativa (pPT4.3). en la orientación positiva, Rps3 se amplificó usando el cebador delantero 5’- GGA ATT AGA c Gg ATC CGA TTA GAA GCC ATC TTG TTA CAA A -3’//SEQ ID NO: 45 y cebador inverso 5’- CGT AAG TTA TGT AAC GGA TCC TAT ATA ACT CTG AAA GTG TCA ACC C -3’//SEQ ID NO: 46. En la orientación negativa, usamos el cebador delantero 5’- GGA ATT AGA CGG ATC CTA TAT AAC TCT GAA AGT GTC AAC CCA -3’//SEQ ID NO: 47 y cebador inverso 5’- CGT AAG TTA TGT AAC GGA TCC GAT TAG AAG CCA TCT TGT TAC AAA -3’//SEQ ID NO: 48. Estos fragmentos luego se ensamblaron usando la misma metodología usada para los constructos que contienen Rps2.

Los nuevos vectores pPT4.x (FIGURA 8) junto con los controles apropiados se transfectaron en las células CHO-S y seleccionaron con puromicina. Una vez que los grupos se recuperaron, las producciones en lote de 4-mL se ajustaron después de la recuperación inicial de los grupos y 2 semanas, 1 mes y 2 meses después de la recuperación. Para cada producción en lote, las muestras se recolectaron y el medio acondicionado (CM) de estas producciones en lote se usó para determinar la titulación por ForteBio, como en el Ejemplo 2.

Resultados: Con objeto de incrementar la estabilidad de expresión en los grupos CHO, buscamos elementos genómicos de hámster que pueden tener la función reguladora para prevenir el silenciamiento por mecanismos epigenéticos. Buscamos secuencias regulatorias que se asocian con los genes de hámster que tienen niveles de expresión alta en nuestras líneas CHO. La extracción de los datos de la secuencia de ARN de los genes expresados por CHO muestra que genes Rsp2 y Rsp3 ajustan este criterio. El Rsp2 humano se ha mostrado previamente para conferir las propiedades de estabilización para los vectores que contienen los promotores CMV (Williams S et al. CpG Island fragments from HNRAP2B1/CBX3 genomic locus reduce silencing and enhance transgene expression from the hCMV promoter/enhance in mamíferoian cells. BMC Biotechnol. 5:17 (2005)). Como se muestra en la FIGURA 9, la inclusión de las secuencias del gen Rps2 y Rps3 de hámster confiere estabilidad sobre los grupos transfectados CHO-S durante un periodo de 2 meses. El promotor GAPDH produce los niveles de expresión alta a lo largo del experimento y superó el vector pPT2 para tanto la estabilidad y titulación del gen exógeno. Los vectores de serie pPT2, sin los elementos Rps también pierden la expresión durante dos meses. Sin embargo, cuando los elementos Rps2 o Rps3

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Un vector de expresión recombinante, caracterizado porque comprende un casete de expresión que comprende un promotor GAPDH de hámster, ligado operablemente a un gen exógeno de interés, que comprende además un elemento regulatorio que

(a) es al menos 95% idéntica a la secuencia de ácido nucleico establecida en la SEQ ID NO: 35; y

(b) está operablemente ligado al promotor,

en donde el elemento regulatorio está en la orientación positiva.

2. El vector de expresión recombinante de conformidad con la reivindicación 1, en donde el promotor GAPDH comprende la secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO: 50, o un fragmento operable del mismo.

.El vector de expresión recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 -2, que comprende,

3’ para el promotor GAPDH y 5’ para el gen de interés, la secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO: 52.

4. El vector de expresión recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el elemento regulatorio comprende una secuencia de ácido nucleico al menos 96% idéntica a la SEQ ID NO: 35.

5. El vector de expresión recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el elemento regulatorio comprende una secuencia de ácido nucleico al menos 98% idéntica a la SEQ ID NO: 35.

6. El vector de expresión recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el elemento regulatorio comprende una secuencia de ácido nucleico al menos 99% idéntica a la SEQ ID NO: 35.

7. El vector de expresión recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el elemento regulatorio comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 35.

8. Una célula hospedera mamífera, que comprende el vector de expresión recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

9. La célula hospedera mamífera de conformidad con la reivindicación 8, en donde la célula es una célula CHO.