JP4480893B2 - トランスフェクションした細胞中の組換えタンパク質発現増大のためのホットスポットを含む発現ベクター - Google Patents
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Description
【０００１】
（背景技術）
組換えタンパク質の製造のための発現系の開発は、研究または治療に使用するための所定のタンパク質の供給源を提供するうえで重要である。発現系は、大腸菌などの原核細胞、および酵母および哺乳動物細胞の両者を含む真核細胞の両者で開発されている。哺乳動物細胞、たとえばチャイニーズハムスター卵巣（または「ＣＨＯ」）細胞での発現は、多くの場合、治療用タンパク質の製造にとって好ましい。なぜならそのような発現系での翻訳後修飾は、微生物（原核細胞）発現系で生じるタイプの翻訳後修飾に比べてヒト細胞のタンパク質発現において認められるものに類似していることが多いからである。
【０００２】
真核遺伝子の転写は、種々のシスおよびトランス作動性の調節エレメントにより制御されている（Dillonら、(1993) Trends Genet. 9: 134）。最もよく特徴付けられているシスエレメントはプロモーターおよびエンハンサーである。プロモーターは遺伝子のコード配列の直ぐ５'側にあるＤＮＡ配列であり、トランス作動性の転写因子のためのマルチプル結合部位を包含し、基本的な転写装置を形成している。エンハンサーもまたトランス作動性の転写因子のためのマルチプル結合部位を構成するが、コード配列のはるか上流または下流さらにはイントロン内にさえも見出される。これらエレメントはまた方向に依存しない仕方で作動することができる。プロモーターおよびエンハンサーの活性は一過性の発現系で検出することができ、組織に特異的なまたは特異的でないエレメントを含む。
【０００３】
他のカテゴリーのシス作動性調節エレメントはクロマチン構造を制御していると思われるものであり、遺伝子転座調節領域（「ＬＣＲ」）（Grosveldら、(1987) Cell 51: 975）、マトリックス付着領域（「ＭＡＲ」）（Phi-Vanら、(1990) Mol. Cell. Biol. 10: 2302）、スカフォールド付着領域（「ＳＡＲ」）（Gasser & Laemmli (1987) Trends Genet. 3: 16）、インスレーターエレメント（insulator elements）（Kellum & Schedl (1991) Cell 64: 941）および核マトリックス結合ＤＮＡ（Nuclear matrix-Associating DNAs）（Bode J.ら、(1992) Science 255: 195）を含む。ＭＡＲおよびＳＡＲは長い距離にわたって作動しうるという点ではエンハンサーに似ているが、その作用が安定に形質転換された細胞株またはトランスジェニック動物でしか検出できない点で独特である。ＬＣＲもまた位置および方向に依存する点および組織に特異的な仕方で活性である点でエンハンサーとは異なる。
【０００４】
所望のタンパク質の全体または一部をコードする目的遺伝子を含む組換え発現プラスミドは、所望の組換えタンパク質を発現する安定なＣＨＯ細胞またはトランスフェクトーマ（transfectomas）を生成するために常用される。これら組換えプラスミドは、組換えタンパク質を産生する宿主のゲノム中にランダムに組み込まれる。しかしながら、組換え遺伝子が安定に組み込まれ、所望の組換えタンパク質を高レベルで発現しうるトランスフェクトーマの頻度は極めて低い。通常、安定にトランスフェクションされた多数の哺乳動物トランスフェクトーマをスクリーニングして組換えタンパク質を高レベルで発現するクローンを同定しなければならない。このことは、とりわけ哺乳動物のゲノムのサイズが大きいことおよびゲノムＤＮＡの０.１％しか転写に活性な配列を含まないという事実に照らして、ゲノムの環境（ホットスポット）およびプラスミドのコピー数によるものと広く信じられている（Little (1993) Nature 366: 204）。ＣＨＯ細胞のゲノム中にプラスミドをランダムに組み込むという現在の技術が、遺伝子増幅の可能な転写ホットスポット中に組換え遺伝子が挿入され高レベルの遺伝子発現へと導く結果になるであろうことは極めてありそうにないことである。
【０００５】
発現増強配列（expression augmenting sequences）が組換えタンパク質の発現を増加させることが開示されている（Morris, A.ら、真核発現系のための発現増強エレメント（ＥＡＳＥ）：ＷＯ９７／２５４２０）。高レベル組換え遺伝子発現細胞株の頻度の増大は、高タンパク質発現トランスフェクトーマの選択のための遥かに大きなプールを提供するであろう。このことは、転写ホットスポットをターゲティングした相同な（homologous）組換えプラスミドを生成し、そのようなトランスフェクトーマの選択のための手段を工夫することにより達成できる。
【０００６】
（発明の要約）
哺乳動物宿主細胞での組換えタンパク質の増大した発現を容易にする新規な転写調節配列（本明細書では「ＨＩＲＰＥ」（タンパク質発現増大のためのホットスポット）（Hot spot for Increased Recombinant Protein Expression）と称する）が開示される。本発明の好ましい態様は、ＣＨＯ細胞のゲノムＤＮＡから得たＨＩＲＰＥである。
【０００７】
本発明は、高い組換え遺伝子発現が可能なＣＨＯ細胞ゲノム中のゲノム遺伝子座からのＨＩＲＰＥを開示する。これら遺伝子座は、哺乳動物ゲノム中の複製起点、遺伝子増幅、およびＭＡＲを規定する配列エレメントを含む。本発明の最も好ましい態様において、ＨＩＲＰＥは（ａ）配列番号１のヌクレオチド１〜５００６を含むＤＮＡ；（ｂ）ＨＩＲＰＥ活性を有する配列番号１の断片；（ｃ）（ａ）および／または（ｂ）に相補的なヌクレオチド配列；（ｄ）（ａ）、（ｂ）および／または（ｃ）の配列と少なくとも約８０％、さらに好ましくは約９０％、さらに好ましくは約９５％同一であり、ＨＩＲＰＥ活性を呈するヌクレオチド配列；および（ｅ）上記核酸配列の組合せであってＨＩＲＰＥ活性を呈するものよりなる群から選ばれる。
【０００８】
新規なＨＩＲＰＥを含む発現ベクターは、ＣＨＯ細胞を形質転換して組換えタンパク質の発現を増大させることができる。それゆえ、本発明の他の側面はＨＩＲＰＥを含む発現ベクターである。好ましい態様において、該発現ベクターはさらに、目的タンパク質の全体または一部の発現を駆動する真核生物プロモーター／エンハンサーを含む。２またはそれ以上の発現ベクターを用いて細胞（たとえば、ＣＨＯ細胞）をトランスフェクションすることができ、その際、各ベクターは（発現されたときに）組み立てられて所望のタンパク質を形成する異なるポリペプチドをコードする核酸配列を含んでいる。さらに好ましい態様において、発現ベクターは、第一のエクソンが目的遺伝子をコードしており、第二のエクソンが増幅可能なドミナント選択マーカーをコードしているようなプラスミドを含んでいる。好ましいマーカーはジヒドロ葉酸レダクターゼ（「ＤＨＦＲ」）である；他の増幅可能なマーカーもまた本発明の発現ベクターに使用するのに適している。
【０００９】
哺乳動物の宿主細胞を本発明の発現ベクターで形質転換して高レベルの組換えタンパク質を産生させることができる。従って、本発明の他の態様は本発明の発現ベクターで形質転換した哺乳動物宿主細胞を提供する。また、２つの発現ベクターで形質転換され、これら２つの各発現ベクターがポリペプチドサブユニットをコードしており、これらが同時に発現されたときに生物学的活性を有する所望のタンパク質に組み立てられるような哺乳動物宿主細胞もまた本発明の範囲に包含される。最も好ましい態様において、宿主細胞はＣＨＯ細胞である。
【００１０】
本発明はまた、組換えタンパク質を得る方法であって、宿主細胞を本発明の発現ベクターで形質転換し、形質転換した宿主細胞を該タンパク質の発現を促進する条件下で培養し、ついで該タンパク質を回収することを含む方法をも提供する。本発明の好ましい適用において、形質転換した宿主細胞は２つの選択工程で選択される。第一の工程はドミナントな増幅マーカーを発現する細胞の選択であり、第二の工程はマーカー遺伝子並びに目的遺伝子の高い発現レベルおよび／または増幅の選択である。好ましい態様において、組換えタンパク質はＣＴＬＡ４−Ｉｇまたは異なる形態のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を形成するその変異体、たとえばアミノ酸配列に対する置換、付加および欠失変異体を含む。ＣＴＬＡ４およびＣＴＬＡ４融合タンパク質（たとえば、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ）の詳細な説明についてはＷＯ９３／００４３１を参照のこと（その全体を参照のため本明細書中に引用する）。
【００１１】
（発明を実施するための最良の形態）
本願出願人は、発現ベクター中に挿入したときにリポータータンパク質の発現を安定な細胞プールにて２〜１０倍改善しうる新規な配列エレメントを単離および同定した。本願出願人は、これら新規な配列エレメントをＨＩＲＰＥ（タンパク質発現増大のためのホットスポット）と称する。
【００１２】
本発明の核酸分子を含むＤＮＡクローンは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（「ＡＴＣＣ」）（バージニア２０１１０−２２０９、マナサス、ユニバーシティー・ブールバール、１０８０１）に１９９８年８月２５日にＡＴＣＣ寄託／受託番号２０３１５３として寄託してある。本明細書に言及する寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の約定のもとに維持されるであろう。この寄託は当業者の便宜としてのみ提供されるものであって、３５Ｕ.Ｓ.Ｃ.§１１２のもとに寄託が要求されることを承認するものではない。寄託した材料に含まれるポリヌクレオチドの配列は参照のため本明細書中に引用され、本明細書中の配列の記載と矛盾する場合には照合される。寄託した材料を製造し、使用し、または販売するにはライセンスが必要であり、そのようなライセンスはここでは許可されない。
【００１３】
本発明は、ＣＨＯ細胞宿主ゲノム中の組換えタンパク質の組み込み部位の同定、およびＣＨＯ細胞で組換え遺伝子の高発現を達成するための相同組換えベクターの構築に関する。さらに詳細には、本発明は、ＣＨＯ ＤＧ４４宿主ゲノム中のＣＴＬＡ４−Ｉｇ組み込み部位の同定に関する。
【００１４】
ＨＩＲＰＥ活性は、目的タンパク質をコードする遺伝子の両末端のフランキング領域で同定された。以下に詳細に説明するように、これらフランキング領域を分離し、シークエンシングして本明細書に開示した新規なＨＩＲＰＥ配列を決定した。ＨＩＲＰＥ配列を得るのに用いたＤＮＡプライマーの詳細図を作成してある（図９）。本発明の新規なＨＩＲＰＥ配列は、下記核酸配列（配列番号１）を含む。
【００１５】
【００１６】
さらに、本発明は、ＨＩＲＰＥ活性を呈する配列番号１の断片を包含する。本発明において有用な断片の好ましい例は、配列番号１のヌクレオチド３０５０〜４６７６を含む１.６ｋｂの配列である（この好ましい断片は配列番号２に示してある）。
【００１７】
単離した５.０ｋｂの配列（配列番号１）およびより短いその断片を含む発現ベクターは、ＣＨＯ細胞を形質転換して高レベルのタンパク質発現を導くことができる。本発明の新規なＨＩＲＰＥは、それが連結しているプロモーター／エンハンサー領域によって駆動される組換えタンパク質の発現を改善するのに有用である。
【００１８】
さらに、ＨＩＲＰＥ活性を呈する配列番号１のさらなる断片、並びに他のタイプの細胞からのまたは形質転換細胞中の他の組み込み部位からの同様のＨＩＲＰＥモチーフを同定することができる。さらに、制限酵素消化により調製したＤＮＡの断片のその後のプロセシングが該断片の末端からのさらなるヌクレオチドの除去という結果となりうることが当該技術分野で知られている。
【００１９】
配列番号１の断片の他の組合せ、たとえば配列番号１の全体または一部の複数のコピーを含む配列を開発することもできる。そのような組合せは、隣接して連結させるかまたは断片の最適のスペーシングを与えるように配置することができる。さらに、配列番号１の配列と、該配列内の挿入配列（たとえば、配列番号１内のある選択した部位での所望のタンパク質をコードする遺伝子の挿入）とを含む発現ベクターも本発明の範囲に包含される。
【００２０】
本明細書に開示するＨＩＲＰＥはＣＨＯ細胞から単離した。組換えタンパク質の発現を増大させる相同配列は、他の哺乳動物種からの細胞、並びに他の組織のタイプからの細胞株にも存在することが予想され、当該技術分野でよく知られた技術、たとえば交差種（cross-species）ハイブリダイゼーションやＰＣＲベースの技術により単離することができる。さらに、配列番号１または配列番号２に示すヌクレオチド配列を、当該技術分野で知られた部位特異的突然変異誘発法またはランダム突然変異誘発法により変化させることができる。ついで、得られたＨＩＲＰＥ変異体を本明細書に記載するようにＨＩＲＰＥ活性について試験することができる。ＨＩＲＰＥ活性を有する、配列番号１の配列と少なくとも約８０％、さらに好ましくは約９０％、およびさらに好ましくは約９５％同一のＤＮＡまたはその断片は、通常の実験により単離され、ＨＩＲＰＥ活性を有することが予想される。配列番号１の断片については、同一性パーセントは該断片中に認められる参照天然配列の部分を指称している。従って、開示したＨＩＲＰＥ配列およびその変異体もまた本発明により包含される。
【００２１】
組換え発現ベクターは、哺乳動物、ウイルスまたは昆虫遺伝子由来の適当な転写または翻訳調節エレメントに作動可能に連結した、タンパク質をコードする合成またはｃＤＮＡ由来のＤＮＡ断片を含む。そのような調節エレメントとしては、転写プロモーター、適当なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、および転写および翻訳の停止を制御する配列が含まれる。哺乳動物発現ベクターはまた、非転写エレメント、たとえば、複製起点、発現すべき遺伝子に連結した適当なプロモーターおよびエンハンサー、他の５'または３'フランキング非転写配列、５'または３'非翻訳配列、たとえば必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、および転写停止配列をも含む。宿主中での複製能を付与する複製起点、および形質転換体の認識を容易にする選択遺伝子も含まれていてよい。
【００２２】
ＤＮＡ領域は、それらが互いに機能的に連関しているときに作動可能に連結しているといわれる。たとえば、プロモーターは、それがコード配列の転写を制御しているならば該配列に作動可能に連結している；またはリボソーム結合部位は、それが翻訳を可能とする位置にあるならばコード配列に作動可能に連結している。細胞を形質転換するのに用いる発現ベクター中の転写および翻訳調節配列は当該技術分野で知られている。
【００２３】
形質転換した細胞は、組換えＤＮＡ技術を用いて発現ベクターで形質転換またはトランスフェクションした細胞であり、組換えタンパク質の全体または一部をコードする配列を含む細胞である。発現タンパク質は、選択したＤＮＡに応じて細胞培養の上澄み液に分泌させるのが好ましいであろうが、細胞膜中に沈積させてもよい。組換えタンパク質を発現させるのに種々の哺乳動物細胞培養系を用いることができ、これらはすべて当該技術分野でよく知られており、たとえばサル腎臓細胞のＣＯＳ細胞株、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、およびＢＨＫ細胞株を用いることができる。
【００２４】
一般的に用いられる細胞株はＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞株であり、これはグリシン、チミジンおよびヒポキサンチン栄養要求性であり、増幅可能なドミナントマーカーとしてＤＨＦＲ ｃＤＮＡを用いて形質転換してＤＨＦＲ＋表現型とすることができる。一つのそのような知られたＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞はＤＫＸＢ１１（Urlaubら、(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216）である。特異的な選択または増幅スキームのために開発された他の細胞株もまた、本発明の新規なＨＩＲＰＥに有用であろう。
【００２５】
幾つかの形質転換プロトコールが当該技術分野で知られており、たとえばKaufmanら、(1988) Meth. Enzymology 185: 537に概説されている。選択する形質転換プロトコールは宿主細胞のタイプおよび目的遺伝子の性質に依存するであろうし、日常的な実験に基づいて選択することができる。そのようなプロトコールの基本的要件は、まず目的タンパク質をコードするＤＮＡを適当な宿主細胞に導入し、ついで該ＤＮＡを安定な発現可能な仕方で導入した宿主細胞を同定および単離することである。目的タンパク質をコードするＤＮＡを導入するのに有用な方法の例は、Wiglerら、(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567；Schaffner (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 2163；Potterら、(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 7161；およびShigekawa (1988) BioTechniques 6: 742に記載されている。
【００２６】
目的遺伝子を増幅する方法もまた組換えタンパク質を発現させるのに望ましく、典型的に選択マーカーの使用を含む。細胞毒性の薬剤に対する耐性は選択マーカーとして最も頻繁に用いられる特性であり、優性の形質（すなわち、宿主の細胞型とは独立に用いることができる）かまたは劣性の形質（すなわち、選択すべき何らかの活性に欠ける特定の細胞型で有用である）のいずれかの結果となりうる。幾つかの増幅可能なマーカーが本発明に用いるのに適している（たとえば、Maniatis, Molecular Biology: A Laboratory Manual、コールド・スプリングス・ハーバー・ラボラトリー、ニューヨーク(1989)に記載されている）。薬剤耐性の哺乳動物細胞での遺伝子増幅に有用な選択マーカーとしては、ＤＨＦＲ−ＭＴＸ（メトトレキセート）耐性（Altら、(1978) J. Biol. Chem. 253: 1357; Wiglerら、(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567）、および当該技術分野で知られた他のマーカー（たとえば、Kaufmanら、(1988) Meth. Enzymology 185: 537に概説されている）が挙げられる。
【００２７】
以下の実施例は本発明の態様を説明するものであって、いかなる意味においても本発明の範囲を限定することを意図するものではない。上記あるいは下記で本明細書中に引用された文献はすべて、参照のため本明細書中に引用される。
【００２８】
実施例１：本発明のＨＩＲＰＥの同定
ＣＨＯ細胞株Ｐは、ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質を高レベルで発現する細胞株である。この細胞株は、ランダム組み込みを含む哺乳動物細胞株を産生する最も好ましい方法を用いて選択した。細胞株Ｐを生成するのに用いた哺乳動物発現プラスミドは改変したｐＣＤＮＡ３プラスミド（Invitrogen, Inc.より入手可能）であった。このベクター中にＤＨＦＲ遺伝子を組み込んでドミナントな選択マーカーとした。このプラスミド中の組換え遺伝子発現カセットは、ＣＭＶプロモーターおよびＢＧＨポリアデニル化配列によって駆動される。細胞株ＰのゲノムＤＮＡ分析は、この細胞株にプラスミドＤＮＡの複数のコピーが安定に組み込まれていることを示唆していた。このプラスミドＤＮＡの増幅は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ遺伝子をコードするＤＮＡの同時増幅という結果となり、ＣＴＬＡ４−Ｉｇの高発現細胞株へと導いた。
【００２９】
ランダム組み込みを用いてＣＨＯトランスフェクトーマを生成する技術分野の当業者は、高発現細胞株を生成するためには選択マーカーとしてＤＨＦＲ遺伝子を含むベクターは転写ホットスポット中に組み込まれ、遺伝子コピー数が首尾よく増幅されなければならないことを認識している。トランスフェクションした細胞のうち遺伝子を充分に増幅するもののパーセントは、予想されるように低い、なぜなら文献は哺乳動物ゲノム中で遺伝子増幅が可能なゲノム遺伝子座は稀であることを示唆しているからである（Robbins (1981) Cell 23: 29; McArthur (1991) J. Biol. Chem. 266: 6000）。細胞株Ｐ中のＣＴＬＡ４−Ｉｇプラスミド組み込み部位に隣接するゲノム遺伝子座は、遺伝子増幅および高転写活性に必要なエレメントを有する独特の遺伝子座の一つを表していた。
【００３０】
ＣＨＯ細胞中のＣＴＬＡ４−Ｉｇ遺伝子に隣接するゲノム遺伝子座に組換え遺伝子を送達するための相同組換えベクターの構築には、当該技術分野で知られた方法を用い（たとえば、Yarnoldら、(1994) Cancer Research 54: 506; Adair (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 4574; Smithら、(1989) J. Mol. Bio. 213: 415を参照）、細胞株ＰからのフランキングゲノムＤＮＡをクローニングし、クローニングした断片を適当な真核発現ベクター中に挿入する必要があった。このことは、まず組み込み部位をフランキングしているＥｃｏＲＩ生成ＤＮＡ断片のサイズをマッピングし、ついで大腸菌でＣＨＯゲノムライブラリーを構築し、これらゲノム断片を含む個々のプラスミドＤＮＡを単離することにより達成した。
【００３１】
サザーンブロット分析はＣＨＯ細胞でのＣＴＬＡ４−Ｉｇ組み込み部位のマッピングを容易にした（図７）。本発明者らは、ＣＨＯ細胞株ＰでのＣＴＬＡ４−Ｉｇ組み込み部位を分析するためにサザーンブロット分析を用いた「ＤＮＡウォーキング」と呼ばれる戦略を用いた。ＤＮＡウォーキング法では、既知のプラスミドＤＮＡ配列を用いて該プラスミド配列をフランキングしている未知のＣＨＯゲノムＤＮＡを特徴付けた。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ組み込み部位を分析するため、約１０μｇのＣＨＯゲノムＤＮＡを１００単位のＥｃｏＲＩ制限酵素（New England Biolabs）で消化した。制限消化したゲノムＤＮＡを０.７％アガロースゲル上のアガロースゲル電気泳動に１５ボルトで１２時間供した。この方法によりＤＮＡは分子サイズによって分離され、高分子量のＤＮＡは上部にくる。
【００３２】
アガロースゲル中に埋められたゲノムＤＮＡを０.４Ｍ ＮａＯＨで約３０分間変性させ、バキュームブロッター（vacum blotter）（Bio-Rad）を用いて０.４５ミクロンニトロセルロースメンブレン（Boehringer and Mannheim）に９０分間移した。ブロッティングしたフィルターを２×ＳＳＰＥ緩衝液で中和し、ＵＶ架橋装置（Stratagene；Ｃ３に２０秒間セッティング）を用いてＤＮＡをメンブレンに架橋した。サザーンブロットに用いた１.２ｋｂのハイブリダイゼーションプローブは、Boehringer Mannheimの標識キットを用いてジゴキシゲニン標識したＰＣＲ断片であった。このＰＣＲ断片は細菌のベータ−ラクタマーゼ遺伝子に由来し、下記オリゴヌクレオチドプライマーを用いて調製した：フォアウォードプライマー：ＧＧＴＣＣＴＧＣＡＡＣＴＴＴＡＴＣＣＧＣＣＴＣＣ（配列番号１４）；リバースプライマー：ＣＧＧＴＣＡＧＣＣＴＴＧＣＣＴＴＧＴＴＧＴＡＧ（配列番号３）。
【００３３】
ジゴキシゲニン標識したＤＮＡを化学ルミネセンス検出キット（Boehringer Mannheim）を用いて検出した。ゲノムＤＮＡを含むニトロセルロースフィルターを５ｍｌのEasyハイブリダイゼーション緩衝液（Boehringer Mannheim）中の５μｌのハイブリダイゼーションプローブと６８℃で１６時間ハイブリダイズさせた。フィルターを２×ＳＳＣで６５℃にて３０分間、２回洗浄し、フィルターを化学ルミネセンスアッセイキット（Boehringer Mannheim）で５分間発色させた。このサザーンブロット分析により、ベータラクタマーゼプローブにハイブリダイズした７.５ｋｂのＣＨＯゲノム左フランキング領域（「ＬＦＲ」）が明らかとなった。この７.５ｋｂ断片の制限マッピングにより、該断片がベータラクタマーゼ遺伝子を含む２.５ｋｂのプラスミドＤＮＡと５.０ｋｂのＣＨＯゲノムＤＮＡとを含むことが明らかとなった。同様に、サザーンブロット中のＥｃｏＲＩ消化ＣＨＯゲノムＤＮＡをハイブリダイゼーションプローブとして０.９ｋｂのＣＴＬＡ４−Ｉｇ遺伝子を含むプラスミドＤＮＡでプローブし、ＰＣＲ反応（ＰＣＲプライマー：フォアウォードプライマー：ＧＣＡＴＣＴＣＣＡＧＧＣＡＡＡＧＣＣＡＣＴＧＡＧＧＴＣＣＧ（配列番号４）；リバースプライマー：ＣＡＣＧＧＡＧＣＡＴＧＡＧＡＡＧＡＣＧＴＴＣＣＣＣＴＧＣＴＧ（配列番号５））を用いて生成した。ジゴキシゲニン標識ハイブリダイゼーションプローブの調製およびハイブリダイゼーション条件は上記に記載した条件と全く同じであった。しかしながら、右のフランキング領域を調べるのに用いたハイブリダイゼーションプローブは（ベータ−ラクタマーゼ遺伝子の代わりに）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ遺伝子に由来するものであったので、サザーンブロット分析は１０.０ｋｂの右フランキング領域（「ＲＦＲ」）ＤＮＡバンドを明らかにした。このハイブリッドＤＮＡ断片は、５.０ｋｂのプラスミドＤＮＡ（ＣＴＬＡ４−Ｉｇおよびｄｈｆｒ遺伝子）および５.０ｋｂのＣＨＯゲノムＤＮＡを含んでいる（図７）。
【００３４】
サザーンブロット分析に基づき、ＣＨＯ細胞株ＰからのゲノムＤＮＡを用いて７.５ｋｂおよび１０.０ｋｂのフランキングゲノム断片をクローニングした。ＣＨＯゲノムＤＮＡを、２００ｍｌのＰＦＣＨＯ血清不含培地中で増殖させた１×１０８のＣＨＯ細胞から単離した。遠心分離後、細胞ペレットをＤＮＡ抽出キット（Stratagene Inc.）を用いてゲノムＤＮＡを単離するために処理した。この操作により１０ｍｇの全ゲノムＤＮＡが得られた。
【００３５】
フランキングゲノム配列を含むＥｃｏＲＩ消化ＣＨＯゲノムＤＮＡを富ませるため、１ｍｇのゲノムＤＮＡを１０００単位のＥｃｏＲＩ酵素（New England Biolabs#101S--２０単位／μｌ）で３７℃にて６時間消化した。ＥｃｏＲＩ消化をフェノール抽出およびエタノール沈殿により停止させた。エタノールペレットを２００μｌの水に再溶解し、Tris-酢酸緩衝液中、（５０Ｖの）定常電圧でのアガロースベッド電気泳動（Life Technologies Model 250電気泳動ユニット）に供した。サイズ分離したゲノムＤＮＡを６.０〜１２.０ｋｂの分子量範囲のＤＮＡについて富ませ、ＱＩＡＥＸゲル抽出キット（Qiagen Inc#20021）を用いてゲルから抽出し戻した。この操作により、２６μｇのＥｃｏＲＩ消化したサイズに富んだＣＨＯ ＤＮＡ断片が得られた。
【００３６】
ＥｃｏＲＩ末端を有する１μｇのゲノムＤＮＡを、同様に消化した抗生物質カナマイシンに対する耐性を付与するカナマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含む細菌プラスミド（ｐＳＴＫＮ）中に挿入した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（New England Biolabs）を用いてゲノムＤＮＡとプラスミドＤＮＡとをライゲートしてＣＨＯゲノムライブラリーを生成した。ライゲートしたＣＨＯゲノムＤＮＡをエレクトロポレーション装置（Bio-Rad #）を用いて大腸菌（ＸＬ１ Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’Stratagene Inc., #200230）中に形質転換し、大腸菌でＣＨＯゲノムライブラリーを得た。
【００３７】
７.５ｋｂの左フランキング領域をクローニングするため、本発明者らは抗生物質アンピシリンに対する耐性を付与するベータラクタマーゼ遺伝子の存在を利用した。ゲノムライブラリーを含む大腸菌菌体を２つの抗生物質に耐性なクローン（ａｍｐＲおよびＫｎＲ）について直接スクリーニングした；ａｍｐＲはＬＦＲ断片の寄与によるものであり、ＫｎＲ遺伝子は細菌プラスミド（ｐＳＴＫＮ）の寄与によるものであった。この手順により両抗生物質に耐性な８つの細菌クローンが得られた。これらクローンからのプラスミドＤＮＡの速やかなＤＮＡ分析は、予想されたように７.５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を有するプラスミドを与え、予想されたようにＬＦＲ断片の存在を示していた。
【００３８】
１０.０ｋｂの右フランキング領域のクローニングには、ハイブリダイゼーションプローブとしてＰ３２標識したＣＴＬＡ４−Ｉｇ遺伝子（ＤＮＡ）を用いたコロニーハイブリダイゼーションの通常の分子生物学的方法が含まれていた。コロニーハイブリダイゼーション法はMolecular Cloning laboratory Manual（コールド・スプリングス・ハーバー・ラボラトリー）に記載されている。放射性標識した
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ遺伝子特異的なハイブリダイゼーションプローブを、Amersham Life Sciencesから得たニックトランスレーションキット（#N5000）を用いて調製した。約１００万の大腸菌クローンをスクリーニングして１０.０ｋｂ断片を含む６つの推定クローンを単離した。これら推定クローンを２回目のコロニーハイブリダイゼーションで再スクリーニングしたところ陽性クローンが２つだけ得られた。２つの陽性クローンからプラスミドＤＮＡをラピッドミニライセート（rapid minilysate）プラスミドＤＮＡ単離法（Maniatis, Molecular Biology: A Laboratory Manual、コールド・スプリングス・ハーバー・ラボラトリー、ニューヨーク(1989)）を用いて単離した。両クローンともに予想された１０.０ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を生成し、ＲＦＲ断片が首尾よくクローニングされていることを示した。
【００３９】
７.５ｋｂと１０.０ｋｂのゲノムクローンの制限酵素消化パターンを比較したところ、プラスミドの組み込み部位でゲノムＤＮＡの複製をたよる（invoking）共通サイズのＤＮＡバンドが明らかとなった。このことは自動ＤＮＡシークエンサー（Applied Biosystems - PRISM310 Genetic Analyzer）を用いたＤＮＡ配列分析により確認された。これら２つの結果は、左および右のフランキング配列が同一であり、組み込み部位でのＤＮＡ複製により生じたものであることを示唆していた（図２）。これら配列を本明細書では以下、ＦＧＳ（フランキングゲノム配列（Flanking Genomic Sequences））と称する。
【００４０】
５.０ｋｂのゲノムＤＮＡのＤＮＡ配列分析は幾つかの独特の特徴を明らかにした。ＧＣＧウイスコンシンＤＮＡ配列データ分析ソフトウエアを用いたＤＮＡホモロジーサーチは、この配列が転写ホットスポットを表していることを示唆していた。クローニングしたＦＧＳは、酵母およびＣＨＯ細胞で認められるコンセンサス自律的複製配列（ＡＲＳ）と類似のＤＮＡモチーフを含んでいる（Sohnら、(1996) Journal of Bacteriology 78(15): 4420; Markら、(1990) J. Mol. Biol. 211: 19）。また、ＦＧＳは転写ホットスポットに共通に認められるＭＡＲと類似のモチーフを含んでいる（Harmuttら、(1995) Biochemistry 34: 4108）。クローニングしたＤＮＡがＣＨＯ細胞からの転写ホットスポットであるとのこの情報をもとに、本発明者らは相同組換えベクターの構築を行った。
【００４１】
哺乳動物ゲノム中への外来ＤＮＡの組み込みは、標的ゲノム中のランダムな部位でのＤＮＡ切断を伴うプロセスにより最も頻繁に起こると考えられる。最近、内生の遺伝子増幅並びに異種のトランスフェクションしたＤＮＡの増幅のモデルが提唱された。これらモデルの一つの構成要素は、遺伝子増幅の第一の工程として組み込み部位でのラージ逆方向複製（large inverted duplication）の関与である（Heartlein M. W.ら、(1988) Nucleic Acid Research 17(4): 1697-1716; Passananti C.ら、(1987) EMBO J. 6: 1697-1703）。このモデルの必須の構成要素は、逆方向繰返しの生成およびその後の遺伝子増幅の前提条件としての宿主ゲノム中のＡ−Ｔリッチ繰返しエレメント中へのプラスミドＤＮＡの組み込みである。
【００４２】
細胞株Ｐ中のＣＴＬＡ４−Ｉｇ組み込み部位での逆方向複製の存在、およびＨＩＲＰＥ中の３つの異なる繰返しエレメントの存在は、提唱されたモデルと一致している。相同挿入組換えベクター中のＨＩＲＰＥ中の繰返しエレメントの存在は、逆方向繰返しの生成および高発現に必要な遺伝子増幅を容易にするであろう。
【００４３】
実施例２：組換えベクター
相同組換えは、正確な部位特異的な遺伝子の組み込みおよび目的遺伝子の発現を可能とする、酵母での遺伝子操作のための強力な手段であると考えられる（Orr-Weaver, T.L.ら、(1981) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78(10): 6354-8）。しかしながら、哺乳動物培養細胞での相同組換え法の適用の可能性は、異常な（illegitimate）組換え事象および適当な選択法の欠如によって圧倒されている（overwhelmed）。ホットスポットへの組換え遺伝子の相同的挿入は、組換えタンパク質を高発現する細胞株の増大した頻度を研究することを可能にする。この概念は、相同組換え抗体発現系をマウス細胞に対していかにして作製するかの一つの例として以前の刊行物に記載されている（Gregoryら、ＷＯ９５／１７５１６）。
【００４４】
にもかかわらず、本発明は、すべての組換え遺伝子に対してより広く適用できること、ＣＨＯゲノム遺伝子座の選択、クローニングした組換え遺伝子を一貫して増幅しうること、およびプラスミド組み込み部位でのゲノム複製の生成の点で当該技術分野で知られているものと異なる。
【００４５】
上記のように相同組換えベクターは、遺伝子のタンパク質への転写および翻訳に必要なエレメントを含む真核発現ベクターである。本明細書に記載する相同組換えベクターは、ドミナント選択マーカーとしてＤＨＦＲ遺伝子を含むベクターｐｃＤＮＡ３（Invitrogen Inc.）に由来する再度遺伝子操作したベクターである。この発現ベクターをジヒドロ葉酸レダクターゼ酵素を欠くＣＨＯ宿主細胞ＤＧ４４およびＤＵＫＸＢ１１細胞中に導入し、ＤＨＦＲ遺伝子機能を相補することによってトランスフェクトーマをバックグラウンドに対して選択する（ジヒドロ葉酸レダクターゼを欠く変異チャイニーズハムスター卵巣細胞でのメトトレキセート代謝（Joannon P.ら、(1987) Biochem-Pharmacol. 36(7): 1091; Urlaubら、(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216））。
【００４６】
相同挿入組換えベクター（ｐＴＶ(Ｉ)として表す）は、全５.０ｋｂ ＨＩＲＰＥ配列（配列番号１）をクローニングしたゲノムＤＮＡを含んでいた（図３）。このゲノム断片を５'末端のＮｏｔＩ制限部位および同一平面の３'（平滑）末端で再構築し、前以て両立しうる（compatible）制限部位で消化しておいたｐｃＤＮＡ／ＤＨＦＲ／ＣＴＬＡ４−Ｉｇ発現ベクター中にクローニングした。得られた相同ベクターｐＴＶ(Ｉ)は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ組換え遺伝子の５'末端にＣＨＯゲノムＤＮＡを含んでいた（図３）。このプラスミドＤＮＡをQUIAGEN Inc.より市販されているMidi−プラスミド単離キットを用いて精製した。ｐＴＶ(Ｉ)プラスミドをＥｃｏＲＩ制限酵素で直線状にし、エレクトロポレーションによりＣＨＯ ＤＧ４４細胞中に導入した。
【００４７】
ヌクレオシド（ヒポキサンチン１６μｇ／ｍｌおよびチミジン０.２μｇ／ｍｌ）を含むＰＦＣＨＯ培地（JRH Biosciences，血清不含−タンパク質不含＃１４６０２−７９Ｐ）での短い回収期間（７２時間）の後、細胞を、ヌクレオシドを含まないＰＦＣＨＯ培地および２０ｎＭメトトレキセートとともに５％透析ウシ胎仔血清を含む培地中での選択に供した。これら細胞を１０の９６ウエルプレート（９６０ウエル）に分配した。３週間のインキュベーション期間の後、約１２０のトランスフェクトーマがＥＬＩＳＡにおいてＣＴＬＡ４−Ｉｇ発現について陽性であった。６つのクローン（５％）が５μｇ／ｍｌを超える一次（primary）ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質力価を生成した（表１）。これら最良の６つのクローンをＴ−７５組織培養フラスコ中に拡張し、Stratagene Inc.より市販されているゲノムＤＮＡ単離キットを用いてＣＨＯゲノムＤＮＡをサザーンブロット分析のために調製した。
【００４８】
従来の発現ベクター（たとえば、ｐｃＤＮＡ３／ＮｅｏＲおよびｐｃＤＮＡ／ｄｈｆｒ）は、５μｇ／ｍｌの最高のＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質力価を有するトランスフェクトーマを生成した。５μｇ／ｍｌを超えて生成したトランスフェクトーマを、ＨＩＲＰＥ配列が首尾よく組み込まれ増大した発現を示すものとして選択した。５μｇ／ｍｌが従来の発現ベクターで得ることのできる最高のタンパク質力価であるため、所望のタンパク質、たとえばＣＴＬＡ４−Ｉｇを一次力価において５μｇ／ｍｌを超えて発現するトランスフェクトーマはすべて有意であり、発現が「増大」していると考えられる。
【００４９】
表１
【表１】
【００５０】
上記表Ｉ中の６つのクローンは、挿入ターゲティングベクターｐＴＶ(Ｉ)を用いて生成した最良のＣＴＬＡ４−Ｉｇ産生トランスフェクトーマを表している。表Ｉ中のこれら６つのクローンはすべて５.０ｋｂのゲノムＤＮＡを含んでいる。太字で示した４つのクローンは、これらクローンからのゲノムＤＮＡをサザーンブロットにより分析したことを示す。クローン２Ｃ５および２Ｆ２（太字でない）はサザーンブロットにより分析しなかった。ＮＤは「決定せず（Not Determined）」を示し、サザーンブロットにより分析しなかったクローンを示すのに用いた。
【００５１】
使用した本発明者らの対照トランスフェクトーマ（ｐｃＤＮＡ／ｄｈｆｒ）において、本発明者らは５μｇ／ｍｌまたはそれ以上のＣＴＬＡ４−Ｉｇ力価を発現するトランスフェクトーマを見出さなかった。本発明者らの手元にある従来のランダム組み込みベクターは、所望のタンパク質、すなわちＣＴＬＡ４−Ｉｇを５μｇ／ｍｌの力価で発現する１／１０００トランスフェクトーマを生成した；この数字に基づき、ランダム組み込みベクターを用いた高産生クローンの頻度を約１／１０００（０.１％）と予測することができる。本明細書に示したデータは、本発明のＨＩＲＰＥを含む相同組換えベクターが、従来の対照ベクターに比べて高組換えタンパク質力価を有するトランスフェクトーマを得る頻度を０.１％（対照）から５％に増大させることを示している。これは、ランダム組み込みベクターに比べて高産生クローンを得る頻度における５０倍の増大を表している。
【００５２】
サザーンブロット分析を用いて４つの独立のトランスフェクトーマでのｐＴＶ(Ｉ)プラスミド組み込み部位を調べた。これらトランスフェクトーマからのゲノムＤＮＡを以下の点について分析した：（ａ）部位特異的なターゲティングを示唆するクローン間での類似のＤＮＡバンドパターン；および（ｂ）組み込み部位での逆方向繰返しの生成の証拠としての３つのバンドパターンの存在。Stratagene, Inc.からのゲノムＤＮＡ単離キットを用い、４つの異なるトランスフェクトーマからゲノムＤＮＡを調製した。約１０μｇのＣＨＯゲノムＤＮＡをＫｐｎＩ制限酵素で３７℃にて１２時間消化した。ＫｐｎＩ消化したゲノムＤＮＡを１５Ｖでの０.７％アガロースベッドゲル電気泳動により１６時間分離した。ゲルに埋もれたゲノムＤＮＡを０.４Ｍ ＮａＯＨで変性させ、Bio-Radバキュームブロッターを用いて０.４５ミクロンのニトロセルロースフィルター上にブロッティングした。
【００５３】
ＰＣＲ増幅を用い、５.０ｋｂのゲノムＤＮＡの異なる領域からそれぞれ２００ｂｐおよび５００ｂｐの２つのハイブリダイゼーションプローブを生成した。２００ｂｐのハイブリダイゼーションプローブは、ＰＣＲプライマー
ＣＴＡＧＣＣＴＧＣＣＴＣＡＣＡＡＧＣＴＴＧ（配列番号６）および
ＧＡＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＴＡＣＡＴＡＧ（配列番号７）を用いて生成した。同様に、５００ｂｐのハイブリダイゼーションプローブは、ＰＣＲプライマー
ＧＣＡＴＴＴＣＡＧＣＡＴＧＧＴＴＧＧＣＴＡＧＣ（配列番号８）および
ＧＧＡＣＴＴＣＡＴＧＴＣＴＴＣＴＣＴＣＣＴＧＣ（配列番号９）を用いて生成した。
【００５４】
上記実施例１に記載したように、ハイブリダイゼーションプローブはジゴキシゲニン標識ＵＴＰ（Boehringer Mannheim）を含んでおり、これらは化学ルミネセンス検出キット（Boehringer Mannheim）により検出される。これら２つのハイブリダイゼーションプローブを等容量で混合し、上記（実施例１）と同様のハイブリダイゼーション条件を用いてニトロセルロースにハイブリダイズさせた。ＥｃｏＲＩで消化しこれら混合ハイブリダイゼーションプローブ（２００ｂｐおよび５００ｂｐ）とハイブリダイズさせた親Ｐ細胞株のゲノムＤＮＡのサザーンブロット分析は、３つのＥｃｏＲＩ ＤＮＡバンドを生成した。これら結果は、ＥｃｏＲＩバンドのうちの２つが組み込み部位での逆方向繰返しの生成の結果であり、第三のバンドが妨害されないゲノムホモログであることを示唆している。当業者であれば、この３ＤＮＡバンドパターンを参照マーカーとして用い、部位特異的な組み込みの証拠のために同じ発現ベクターを用いて生成した他のトランスフェクトーマを分析することができる。
【００５５】
ｐＴＶ(Ｉ)ベクターを含む上位４つの産生クローン（ＩＡＩ、３Ｃ２、３Ｃ１１および６Ｂ８）からのゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化したもののサザーンブロット分析は、分析した４つのクローンの３つに共通する３バンドパターンを生成した。新たなトランスフェクトーマにおける３バンドパターンの存在は、プラスミド組み込み部位での逆方向繰返しの生成と一致している。第二に、これらトランスフェクトーマにおける同一のサイズの３バンドパターンの存在は、これら相同組換えベクターがＣＨＯゲノム中の同一部位に独立にターゲティングし、高組換え遺伝子発現を生成したことを示唆している（図５）。サザーンブロット分析はさらに、５.０ｋｂのＨＩＲＰＥが逆方向繰返しの生成および遺伝子増幅を誘発して高発現へと導くモチーフを含むことを示唆している。
【００５６】
ランダムなプラスミド組み込みは、ＣＨＯ細胞での組み込みの好ましい様式である（＞９９％）。ＣＨＯ細胞における相同組換え事象は０.１〜０.３％未満を占めるにすぎない（Thomasら、(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 615）。ランダムな組換え事象は一般に広範なＤＮＡを必要とせず、基質として全プラスミドＤＮＡ（５.０ｋｂのゲノムＤＮＡを含む）を潜在的に使用しうる。もしもそのような事象が生じたら、発現ベクターｐＴＶ(Ｉ)は相同部位とは異なる部位で組み込まれる。本出願において、サザーンブロット分析は、本願出願人の新規なベクターが圧倒的な半端物（overwhelming odds）に対して主たる高産生クローンにおいてＣＨＯ細胞中の単一のゲノム遺伝子座に組み込まれることを示唆している。
【００５７】
ｐＴＶ(Ｉ)プラスミドが一貫して高組換えタンパク質力価を有するＣＨＯトランスフェクトーマを生成することを独立に確認するため、ＣＨＯ ＤＧ４４細胞株中へのｐＴＶ(Ｉ)プラスミドの第二のトランスフェクションを行った。第二のトランスフェクションの結果を下記表IIに示す。第二のトランスフェクションからの結果から、ｐＴＶ(Ｉ)ベクターが好ましい遺伝子座での組み込みにより高組み込みタンパク質力価を有するトランスフェクトーマを一貫して生成することが確認された。表II中の太字のクローンは、部位特異的な組み込みを示すためにその後にサザーンブロットにより分析したことを示す。「ＮＤ」は試験しなかったことを示す。
【００５８】
表 II
【表２】
【００５９】
５.０ｋｂのゲノムＤＮＡをシークエンシングする際に、本発明者らは、おそらく立体障害のためにジゴキシゲニン標識ｄＴＴＰ（デオキシヌクレオシド三リン酸）を用いたＰＣＲ反応で増幅されなかった７０％Ａ−ＴリッチなＡ−Ｔリッチモチーフに出くわした。これと一致して、哺乳動物ゲノムで高度に発現される遺伝子は優勢にＡ−Ｔに富んだシス作動性のエレメントを含んでいる（Mehta (1996) J. Biol. Chem. 271(52): 33616）。このことは、下流の組換え遺伝子発現を増大させるシス作動性エレメントとしての５.０ｋｂ ＣＨＯゲノムＤＮＡ中のＡ−Ｔリッチモチーフの評価へと導く。本発明者らは、ＰＣＲ増幅および被験遺伝子（所望のタンパク質）としてのＣＴＬＡ４−Ｉｇ遺伝子および陽性の選択マーカーとしてのＤＨＦＲ遺伝子を含むベクター中への所望の生成物のクローニングを用い、２つの同遺伝子型挿入ベクターｐＴＶ(Ｉ)/１.６（配列番号１のヌクレオチド３０５０〜４６７６を含む）およびｐＲＶ(Ｉ)/１.４（配列番号１のヌクレオチド３０５０〜４４８５を含む）を構築した。
【００６０】
上記のように５.０ｋｂゲノムＤＮＡからの１４３５ヌクレオチドを含むｐＲＶ(Ｉ)/１.４ベクターは、ＰＣＲプライマー
ＡＧＣＣＴＡＴＣＴＣＣＡＴＴＣＧＴＣＡ（配列番号１０）および
ＣＣＧＣＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＣＴＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＡＧＴＧ（配列番号１１）を用いて生成した。ベクターｐＴＶ(Ｉ)/１.６（５.０ｋｂゲノムＤＮＡからの１６２６ヌクレオチドを含む）は、ＰＣＲプライマー
ＡＧＣＣＴＡＴＣＴＣＣＡＴＴＣＧＴＣＡ（配列番号１２）および
ＣＣＧＣＣＧＡＡＴＴＣＡＡＣＣＡＣＡＴＧＧＴＧＧＣＴＣＡＣＡＡ（配列番号１３）を用いて生成した。
【００６１】
ＰＣＲ由来断片を、ＣＴＬＡ４−Ｉｇリポーター遺伝子およびｄｈｆｒ選択マーカーを含む上記同発現ベクター中にクローニングした。これら２つの新たなベクターは共通するフォアウォードプライマーにより生成される同じ５'末端を有しているが、１.４ｋｂのＨＩＲＰＥの３'末端は１.６ｋｂのＨＩＲＰＥに比べて約２００ｂｐ短い。ＣＨＯ ＤＧ４４細胞中に形質転換すると、両ベクターともＥＬＩＳＡにおいてＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質発現について陽性の約１２０のトランスフェクトーマを生成した（Symingtonら、(1993) J. Immunol. 150(4): 1286）。しかしながら、各クラスの上位４つの産生クローンからのＣＴＬＡ４−Ｉｇ力価を比較したときに、ｐＴＶ(Ｉ)/１.６ベクターを含むトランスフェクトーマは約４倍高いＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質力価を発現したが、ｐＴＶ(Ｉ)/１.４を含むトランスフェクトーマはＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質発現を有意に改善しなかった（図８参照）。これら結果から、５.０ｋｂゲノムＤＮＡ中の２００ｂｐ Ａ−ＴリッチモチーフはＣＨＯ細胞で組換え遺伝子発現を増大させるシス作動性のエレメントとして作用すると結論された。
【００６２】
以下の記載は、相同置換ベクターの利点および５.０ｋｂのゲノムＤＮＡを含む置換ベクターｐＴＶ(Ｒ)の構築の詳細である。置換ベクターを用いた導入ＤＮＡと染色体ＤＮＡとの間での相同組換えは、外来ＤＮＡを哺乳動物細胞中に導入するために広く用いられている。ＣＨＯ細胞での相同組換えに影響を及ぼす変数としては、これらに限られるものではないが、遺伝子座、相同配列の量、および陽性選択カセットを含む多くの変数がある。置換ベクターは相同組換えの頻度が５〜１０倍低いが、外来プラスミド配列は組換え事象の間に切り出されながら挿入物（組換え遺伝子）が安定に組み込まれるという利点がある。このことは、プラスミド配列全体が挿入される挿入ベクター（ｐＴＶ(Ｉ)）とは対照的である。さらに、置換ベクターは、置換ベクターに適用可能な部位特異的な組み込みのための一般に受け入れられているエンリッチメント（enrichment）手順のために好ましい（Hastyら、(1991) Mol. Cell. Bio. 11: 4509）。最後に、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子と組み合わせた置換ベクターは、相同組換えの結果得られるトランスフェクトーマを単離するのに用いる最も一般的なエンリッチメント手順を提供する（Zheingら、(1990) Nature 344: 170）。
【００６３】
ヌクレオシドアナログであるアシクロビルは、ＨＳＶ−チミジンキナーゼ（「ＨＳＶ−ｔｋ」）遺伝子を発現する哺乳動物細胞を選択的に殺す。ＨＳＶ−ｔｋはアシクロビルをそのリン酸化形態に変換するが、これは細胞にとって毒性である。その結果、ＨＳＶ−ｔｋを発現する細胞のみが殺され、正常なＣＨＯ細胞は殺されない。ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子は、置換ベクター中で相同組換えの後に該ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子が欠失されるような領域に戦略的に配置され、一方、他のすべての組換え事象（ランダムな組み込み）は遺伝子をそのまま保持する。その結果、相同組換えの結果得られるトランスフェクトーマはアシクロビル選択を生き残るが他のクラスのトランスフェクトーマは殺される（Evrardら、(1996) Cell. Biol. Toxicol. 12(4-6): 345）。
【００６４】
ｐＴＶ(Ｒ)ベクターは、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ発現カセットの５'末端にＡ−Ｔリッチ領域を含む１.６ｋｂのゲノムＤＮＡおよびＤＨＦＲ選択マーカーの３'末端に２.２ｋｂのフランキングゲノム断片を含む（図４）。ゲノムＤＮＡの２つの部分へのクローニングはポリメラーゼ連鎖反応を用いて新たな制限部位を作製することにより行ったが、これは組換えＤＮＡ法の当業者には自明の方法である。置換ベクターは、相同組換えの結果得られるトランスフェクトーマではＨＳＶ−ｔｋ遺伝子が離脱されるが、異常な組換え体は活性なＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を保持するようにデザインされている。その結果、活性なＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を含む異常な組換え体はすべて阻害剤のアシクロビルにより殺され、部位特異的な組換えの結果得られるクローンのみを選択的に増殖させることができる（Pfizerら、(1987) Am. J. Cancer 40: 114; Davidsonら、(1981) Virology 113: 9）。
【００６５】
部位特異的な組換え体を選択的に富ませる戦略は予想された結果をもたらし、置換ベクターを用いて生成したトランスフェクトーマの１０％がこの選択を生き残った。エレクトロポレーションによりｐＴＶ(Ｒ)をＣＨＯ細胞株ＤＧ４４中に導入すると、第１回目の２０ｎＭメトトレキセート選択を生き残った８６０のトランスフェクトーマが得られた。しかしながら、第２回目の１.０ｍＭアシクロビルによる選択では９４のトランスフェクトーマ（１０％）のみが生き残った。これら二重の選択を生き残ったトランスフェクトーマは、部位特異的な組換え事象によるものである。これら９４のトランスフェクトーマすべてをＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質力価についてスクリーニングした。最高のＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質力価を有する上位６つのトランスフェクトーマを下記表IIIに示す。
【００６６】
表 III
【表３】
【００６７】
これら６つのトランスフェクトーマ（すなわち、１Ｃ９、２Ｂ１１、３Ｄ５、４Ｆ４、５Ｃ４および６Ｆ１）からのゲノムＤＮＡを上記手順を用いて調製した。ゲノムＤＮＡをＢｓｐ１２０１制限酵素で消化し、上記セクションで記載したのと同様にＰＣＲにより生成した２００ｂｐおよび５００ｂｐのハイブリダイゼーションプローブを用いたサザーンブロット分析に供した。アガロースゲルベッド電気泳動および洗浄条件を含むハイブリダイゼーション条件は、上記に記載した条件と同じであった。分析した６つのすべてのクローンからのＤＮＡバンドパターンは、それぞれ３.５ｋｂおよび２.７ｋｂのバンドを有する２バンドパターンを明らかにした（図６）。これらの結果から、２.７ｋｂ ＤＮＡのバンドが妨害されないゲノムホモログを表し、３.５ｋｂ ＤＮＡはプラスミドとＣＨＯ細胞での組み込み部位を説明するゲノムＤＮＡとを含むハイブリッドバンドであることが推論された。分析した６つのすべてのトランスフェクトーマからの共通する３.５ｋｂのハイブリッド断片の存在は、相同置換ベクターがＣＨＯ細胞中の特定の部位に選択的に組み込まれたことを示している。さらに、本発明のＨＩＲＰＥ遺伝子（配列番号１）またはその断片（配列番号２）を含む置換ベクター中にＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を用いて生成したトランスフェクトーマの数を減らした後でもタンパク質産生は高いままであった。
【００６８】
上記の開示は、本発明が組換えタンパク質の発現を増大させるための独特で信頼性のある方法を提供することを示している。本発明者らによって教示されたＨＩＲＰＥ配列（配列番号１）またはＨＩＲＰＥ活性を示す配列番号１の断片（好ましくは配列番号２に示す断片）を用いることにより、当業者は首尾よくトランスフェクションした細胞のパーセントを増大させることができるのみならず、それらトランスフェクションした細胞での発現をも増大させることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 親のＣＴＬＡ４−Ｉｇ発現細胞株（本明細書で細胞株「Ｐ」と称する）でのＣＴＬＡ４−Ｉｇ組み込み部位のクローニングを示す。図１Ａはサザーンブロットを示しており、５.５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片はＤＧ４４宿主およびＰ ＣＨＯ細胞株の両者中の天然染色体を表す。レーン２の８.０ｋｂおよび１０.０ｋｂのバンドは、それぞれ再配置した左および右のフランキング領域を表す。図１Ｂは、細胞株Ｐ組み込み部位の左フランキング領域（レーン１）および右フランキング領域（レーン２）を含むクローニングＥｃｏＲＩ断片が細胞株ＰからのＥｃｏＲＩ消化ゲノムＤＮＡと一緒に移動することを示している。
【図２】 細胞株Ｐ中のＣＴＬＡ４−Ｉｇ組み込み部位の分子構成を表している。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ遺伝子の両末端にフランキングする同一の５.０ｋｂゲノム配列；Ａ−Ｔリッチモチーフ；ＭＡＲ様配列（マトリックス結合領域）；およびＡｌｕ様配列を示す。
【図３】 相同挿入組換えベクター、ｐＴＶ(Ｉ)の模式図を示す。
【図４】 相同置換組換えベクター、ｐＴＶ(Ｒ)の模式図を示す。
【図５】 サザーンブロット分析を示しており、挿入組換えベクター、ｐＴＶ(Ｉ)を含むトランスフェクトーマでの部位特異的な組み込みが確認される。
【図６】 サザーンブロット分析を示しており、置換組換えベクター、ｐＴＶ(Ｒ)を含むトランスフェクトーマでの部位特異的な組み込みが確認される。ブロットは５つのすべてのクローンで３.５ｋｂのバンドを明らかにしており、置換ベクターが同様のゲノム遺伝子座をターゲティングすることを示唆している。
【図７】 サザーンブロット分析および制限酵素マッピングにより分析したＬＦＲ断片およびＲＦＲ断片の模式図を示す。
【図８】 組換え遺伝子発現に及ぼすＡ−Ｔリッチモチーフ領域の効果を示す。完全長の５.０ｋｂ核酸配列；１.６ｋｂの核酸配列（Ａ−Ｔリッチモチーフを含む）；またはＡ−Ｔリッチモチーフを含まない１.４ｋｂ領域のいずれかを含む上位４つのトランスフェクトーマからのＣＴＬＡ４−Ｉｇ発現をμｇ／ｍｌで示す。
【図９】 本発明のＨＩＲＰＥを得るのに用いたオリゴヌクレオチドを示す。
【図１０】 本発明のＨＩＲＰＥがＣＴＬＡ４−Ｉｇの発現を促進することを示す。
【図１１】 挿入ベクターおよび置換ベクターが同様の結果を与えることを示す。
（背景技術）
組換えタンパク質の製造のための発現系の開発は、研究または治療に使用するための所定のタンパク質の供給源を提供するうえで重要である。発現系は、大腸菌などの原核細胞、および酵母および哺乳動物細胞の両者を含む真核細胞の両者で開発されている。哺乳動物細胞、たとえばチャイニーズハムスター卵巣（または「ＣＨＯ」）細胞での発現は、多くの場合、治療用タンパク質の製造にとって好ましい。なぜならそのような発現系での翻訳後修飾は、微生物（原核細胞）発現系で生じるタイプの翻訳後修飾に比べてヒト細胞のタンパク質発現において認められるものに類似していることが多いからである。
【０００２】
真核遺伝子の転写は、種々のシスおよびトランス作動性の調節エレメントにより制御されている（Dillonら、(1993) Trends Genet. 9: 134）。最もよく特徴付けられているシスエレメントはプロモーターおよびエンハンサーである。プロモーターは遺伝子のコード配列の直ぐ５'側にあるＤＮＡ配列であり、トランス作動性の転写因子のためのマルチプル結合部位を包含し、基本的な転写装置を形成している。エンハンサーもまたトランス作動性の転写因子のためのマルチプル結合部位を構成するが、コード配列のはるか上流または下流さらにはイントロン内にさえも見出される。これらエレメントはまた方向に依存しない仕方で作動することができる。プロモーターおよびエンハンサーの活性は一過性の発現系で検出することができ、組織に特異的なまたは特異的でないエレメントを含む。
【０００３】
他のカテゴリーのシス作動性調節エレメントはクロマチン構造を制御していると思われるものであり、遺伝子転座調節領域（「ＬＣＲ」）（Grosveldら、(1987) Cell 51: 975）、マトリックス付着領域（「ＭＡＲ」）（Phi-Vanら、(1990) Mol. Cell. Biol. 10: 2302）、スカフォールド付着領域（「ＳＡＲ」）（Gasser & Laemmli (1987) Trends Genet. 3: 16）、インスレーターエレメント（insulator elements）（Kellum & Schedl (1991) Cell 64: 941）および核マトリックス結合ＤＮＡ（Nuclear matrix-Associating DNAs）（Bode J.ら、(1992) Science 255: 195）を含む。ＭＡＲおよびＳＡＲは長い距離にわたって作動しうるという点ではエンハンサーに似ているが、その作用が安定に形質転換された細胞株またはトランスジェニック動物でしか検出できない点で独特である。ＬＣＲもまた位置および方向に依存する点および組織に特異的な仕方で活性である点でエンハンサーとは異なる。
【０００４】
所望のタンパク質の全体または一部をコードする目的遺伝子を含む組換え発現プラスミドは、所望の組換えタンパク質を発現する安定なＣＨＯ細胞またはトランスフェクトーマ（transfectomas）を生成するために常用される。これら組換えプラスミドは、組換えタンパク質を産生する宿主のゲノム中にランダムに組み込まれる。しかしながら、組換え遺伝子が安定に組み込まれ、所望の組換えタンパク質を高レベルで発現しうるトランスフェクトーマの頻度は極めて低い。通常、安定にトランスフェクションされた多数の哺乳動物トランスフェクトーマをスクリーニングして組換えタンパク質を高レベルで発現するクローンを同定しなければならない。このことは、とりわけ哺乳動物のゲノムのサイズが大きいことおよびゲノムＤＮＡの０.１％しか転写に活性な配列を含まないという事実に照らして、ゲノムの環境（ホットスポット）およびプラスミドのコピー数によるものと広く信じられている（Little (1993) Nature 366: 204）。ＣＨＯ細胞のゲノム中にプラスミドをランダムに組み込むという現在の技術が、遺伝子増幅の可能な転写ホットスポット中に組換え遺伝子が挿入され高レベルの遺伝子発現へと導く結果になるであろうことは極めてありそうにないことである。
【０００５】
発現増強配列（expression augmenting sequences）が組換えタンパク質の発現を増加させることが開示されている（Morris, A.ら、真核発現系のための発現増強エレメント（ＥＡＳＥ）：ＷＯ９７／２５４２０）。高レベル組換え遺伝子発現細胞株の頻度の増大は、高タンパク質発現トランスフェクトーマの選択のための遥かに大きなプールを提供するであろう。このことは、転写ホットスポットをターゲティングした相同な（homologous）組換えプラスミドを生成し、そのようなトランスフェクトーマの選択のための手段を工夫することにより達成できる。
【０００６】
（発明の要約）
哺乳動物宿主細胞での組換えタンパク質の増大した発現を容易にする新規な転写調節配列（本明細書では「ＨＩＲＰＥ」（タンパク質発現増大のためのホットスポット）（Hot spot for Increased Recombinant Protein Expression）と称する）が開示される。本発明の好ましい態様は、ＣＨＯ細胞のゲノムＤＮＡから得たＨＩＲＰＥである。
【０００７】
本発明は、高い組換え遺伝子発現が可能なＣＨＯ細胞ゲノム中のゲノム遺伝子座からのＨＩＲＰＥを開示する。これら遺伝子座は、哺乳動物ゲノム中の複製起点、遺伝子増幅、およびＭＡＲを規定する配列エレメントを含む。本発明の最も好ましい態様において、ＨＩＲＰＥは（ａ）配列番号１のヌクレオチド１〜５００６を含むＤＮＡ；（ｂ）ＨＩＲＰＥ活性を有する配列番号１の断片；（ｃ）（ａ）および／または（ｂ）に相補的なヌクレオチド配列；（ｄ）（ａ）、（ｂ）および／または（ｃ）の配列と少なくとも約８０％、さらに好ましくは約９０％、さらに好ましくは約９５％同一であり、ＨＩＲＰＥ活性を呈するヌクレオチド配列；および（ｅ）上記核酸配列の組合せであってＨＩＲＰＥ活性を呈するものよりなる群から選ばれる。
【０００８】
新規なＨＩＲＰＥを含む発現ベクターは、ＣＨＯ細胞を形質転換して組換えタンパク質の発現を増大させることができる。それゆえ、本発明の他の側面はＨＩＲＰＥを含む発現ベクターである。好ましい態様において、該発現ベクターはさらに、目的タンパク質の全体または一部の発現を駆動する真核生物プロモーター／エンハンサーを含む。２またはそれ以上の発現ベクターを用いて細胞（たとえば、ＣＨＯ細胞）をトランスフェクションすることができ、その際、各ベクターは（発現されたときに）組み立てられて所望のタンパク質を形成する異なるポリペプチドをコードする核酸配列を含んでいる。さらに好ましい態様において、発現ベクターは、第一のエクソンが目的遺伝子をコードしており、第二のエクソンが増幅可能なドミナント選択マーカーをコードしているようなプラスミドを含んでいる。好ましいマーカーはジヒドロ葉酸レダクターゼ（「ＤＨＦＲ」）である；他の増幅可能なマーカーもまた本発明の発現ベクターに使用するのに適している。
【０００９】
哺乳動物の宿主細胞を本発明の発現ベクターで形質転換して高レベルの組換えタンパク質を産生させることができる。従って、本発明の他の態様は本発明の発現ベクターで形質転換した哺乳動物宿主細胞を提供する。また、２つの発現ベクターで形質転換され、これら２つの各発現ベクターがポリペプチドサブユニットをコードしており、これらが同時に発現されたときに生物学的活性を有する所望のタンパク質に組み立てられるような哺乳動物宿主細胞もまた本発明の範囲に包含される。最も好ましい態様において、宿主細胞はＣＨＯ細胞である。
【００１０】
本発明はまた、組換えタンパク質を得る方法であって、宿主細胞を本発明の発現ベクターで形質転換し、形質転換した宿主細胞を該タンパク質の発現を促進する条件下で培養し、ついで該タンパク質を回収することを含む方法をも提供する。本発明の好ましい適用において、形質転換した宿主細胞は２つの選択工程で選択される。第一の工程はドミナントな増幅マーカーを発現する細胞の選択であり、第二の工程はマーカー遺伝子並びに目的遺伝子の高い発現レベルおよび／または増幅の選択である。好ましい態様において、組換えタンパク質はＣＴＬＡ４−Ｉｇまたは異なる形態のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を形成するその変異体、たとえばアミノ酸配列に対する置換、付加および欠失変異体を含む。ＣＴＬＡ４およびＣＴＬＡ４融合タンパク質（たとえば、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ）の詳細な説明についてはＷＯ９３／００４３１を参照のこと（その全体を参照のため本明細書中に引用する）。
【００１１】
（発明を実施するための最良の形態）
本願出願人は、発現ベクター中に挿入したときにリポータータンパク質の発現を安定な細胞プールにて２〜１０倍改善しうる新規な配列エレメントを単離および同定した。本願出願人は、これら新規な配列エレメントをＨＩＲＰＥ（タンパク質発現増大のためのホットスポット）と称する。
【００１２】
本発明の核酸分子を含むＤＮＡクローンは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（「ＡＴＣＣ」）（バージニア２０１１０−２２０９、マナサス、ユニバーシティー・ブールバール、１０８０１）に１９９８年８月２５日にＡＴＣＣ寄託／受託番号２０３１５３として寄託してある。本明細書に言及する寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の約定のもとに維持されるであろう。この寄託は当業者の便宜としてのみ提供されるものであって、３５Ｕ.Ｓ.Ｃ.§１１２のもとに寄託が要求されることを承認するものではない。寄託した材料に含まれるポリヌクレオチドの配列は参照のため本明細書中に引用され、本明細書中の配列の記載と矛盾する場合には照合される。寄託した材料を製造し、使用し、または販売するにはライセンスが必要であり、そのようなライセンスはここでは許可されない。
【００１３】
本発明は、ＣＨＯ細胞宿主ゲノム中の組換えタンパク質の組み込み部位の同定、およびＣＨＯ細胞で組換え遺伝子の高発現を達成するための相同組換えベクターの構築に関する。さらに詳細には、本発明は、ＣＨＯ ＤＧ４４宿主ゲノム中のＣＴＬＡ４−Ｉｇ組み込み部位の同定に関する。
【００１４】
ＨＩＲＰＥ活性は、目的タンパク質をコードする遺伝子の両末端のフランキング領域で同定された。以下に詳細に説明するように、これらフランキング領域を分離し、シークエンシングして本明細書に開示した新規なＨＩＲＰＥ配列を決定した。ＨＩＲＰＥ配列を得るのに用いたＤＮＡプライマーの詳細図を作成してある（図９）。本発明の新規なＨＩＲＰＥ配列は、下記核酸配列（配列番号１）を含む。
【００１５】
さらに、本発明は、ＨＩＲＰＥ活性を呈する配列番号１の断片を包含する。本発明において有用な断片の好ましい例は、配列番号１のヌクレオチド３０５０〜４６７６を含む１.６ｋｂの配列である（この好ましい断片は配列番号２に示してある）。
【００１７】
単離した５.０ｋｂの配列（配列番号１）およびより短いその断片を含む発現ベクターは、ＣＨＯ細胞を形質転換して高レベルのタンパク質発現を導くことができる。本発明の新規なＨＩＲＰＥは、それが連結しているプロモーター／エンハンサー領域によって駆動される組換えタンパク質の発現を改善するのに有用である。
【００１８】
さらに、ＨＩＲＰＥ活性を呈する配列番号１のさらなる断片、並びに他のタイプの細胞からのまたは形質転換細胞中の他の組み込み部位からの同様のＨＩＲＰＥモチーフを同定することができる。さらに、制限酵素消化により調製したＤＮＡの断片のその後のプロセシングが該断片の末端からのさらなるヌクレオチドの除去という結果となりうることが当該技術分野で知られている。
【００１９】
配列番号１の断片の他の組合せ、たとえば配列番号１の全体または一部の複数のコピーを含む配列を開発することもできる。そのような組合せは、隣接して連結させるかまたは断片の最適のスペーシングを与えるように配置することができる。さらに、配列番号１の配列と、該配列内の挿入配列（たとえば、配列番号１内のある選択した部位での所望のタンパク質をコードする遺伝子の挿入）とを含む発現ベクターも本発明の範囲に包含される。
【００２０】
本明細書に開示するＨＩＲＰＥはＣＨＯ細胞から単離した。組換えタンパク質の発現を増大させる相同配列は、他の哺乳動物種からの細胞、並びに他の組織のタイプからの細胞株にも存在することが予想され、当該技術分野でよく知られた技術、たとえば交差種（cross-species）ハイブリダイゼーションやＰＣＲベースの技術により単離することができる。さらに、配列番号１または配列番号２に示すヌクレオチド配列を、当該技術分野で知られた部位特異的突然変異誘発法またはランダム突然変異誘発法により変化させることができる。ついで、得られたＨＩＲＰＥ変異体を本明細書に記載するようにＨＩＲＰＥ活性について試験することができる。ＨＩＲＰＥ活性を有する、配列番号１の配列と少なくとも約８０％、さらに好ましくは約９０％、およびさらに好ましくは約９５％同一のＤＮＡまたはその断片は、通常の実験により単離され、ＨＩＲＰＥ活性を有することが予想される。配列番号１の断片については、同一性パーセントは該断片中に認められる参照天然配列の部分を指称している。従って、開示したＨＩＲＰＥ配列およびその変異体もまた本発明により包含される。
【００２１】
組換え発現ベクターは、哺乳動物、ウイルスまたは昆虫遺伝子由来の適当な転写または翻訳調節エレメントに作動可能に連結した、タンパク質をコードする合成またはｃＤＮＡ由来のＤＮＡ断片を含む。そのような調節エレメントとしては、転写プロモーター、適当なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、および転写および翻訳の停止を制御する配列が含まれる。哺乳動物発現ベクターはまた、非転写エレメント、たとえば、複製起点、発現すべき遺伝子に連結した適当なプロモーターおよびエンハンサー、他の５'または３'フランキング非転写配列、５'または３'非翻訳配列、たとえば必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、および転写停止配列をも含む。宿主中での複製能を付与する複製起点、および形質転換体の認識を容易にする選択遺伝子も含まれていてよい。
【００２２】
ＤＮＡ領域は、それらが互いに機能的に連関しているときに作動可能に連結しているといわれる。たとえば、プロモーターは、それがコード配列の転写を制御しているならば該配列に作動可能に連結している；またはリボソーム結合部位は、それが翻訳を可能とする位置にあるならばコード配列に作動可能に連結している。細胞を形質転換するのに用いる発現ベクター中の転写および翻訳調節配列は当該技術分野で知られている。
【００２３】
形質転換した細胞は、組換えＤＮＡ技術を用いて発現ベクターで形質転換またはトランスフェクションした細胞であり、組換えタンパク質の全体または一部をコードする配列を含む細胞である。発現タンパク質は、選択したＤＮＡに応じて細胞培養の上澄み液に分泌させるのが好ましいであろうが、細胞膜中に沈積させてもよい。組換えタンパク質を発現させるのに種々の哺乳動物細胞培養系を用いることができ、これらはすべて当該技術分野でよく知られており、たとえばサル腎臓細胞のＣＯＳ細胞株、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、およびＢＨＫ細胞株を用いることができる。
【００２４】
一般的に用いられる細胞株はＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞株であり、これはグリシン、チミジンおよびヒポキサンチン栄養要求性であり、増幅可能なドミナントマーカーとしてＤＨＦＲ ｃＤＮＡを用いて形質転換してＤＨＦＲ＋表現型とすることができる。一つのそのような知られたＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞はＤＫＸＢ１１（Urlaubら、(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216）である。特異的な選択または増幅スキームのために開発された他の細胞株もまた、本発明の新規なＨＩＲＰＥに有用であろう。
【００２５】
幾つかの形質転換プロトコールが当該技術分野で知られており、たとえばKaufmanら、(1988) Meth. Enzymology 185: 537に概説されている。選択する形質転換プロトコールは宿主細胞のタイプおよび目的遺伝子の性質に依存するであろうし、日常的な実験に基づいて選択することができる。そのようなプロトコールの基本的要件は、まず目的タンパク質をコードするＤＮＡを適当な宿主細胞に導入し、ついで該ＤＮＡを安定な発現可能な仕方で導入した宿主細胞を同定および単離することである。目的タンパク質をコードするＤＮＡを導入するのに有用な方法の例は、Wiglerら、(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567；Schaffner (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 2163；Potterら、(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 7161；およびShigekawa (1988) BioTechniques 6: 742に記載されている。
【００２６】
目的遺伝子を増幅する方法もまた組換えタンパク質を発現させるのに望ましく、典型的に選択マーカーの使用を含む。細胞毒性の薬剤に対する耐性は選択マーカーとして最も頻繁に用いられる特性であり、優性の形質（すなわち、宿主の細胞型とは独立に用いることができる）かまたは劣性の形質（すなわち、選択すべき何らかの活性に欠ける特定の細胞型で有用である）のいずれかの結果となりうる。幾つかの増幅可能なマーカーが本発明に用いるのに適している（たとえば、Maniatis, Molecular Biology: A Laboratory Manual、コールド・スプリングス・ハーバー・ラボラトリー、ニューヨーク(1989)に記載されている）。薬剤耐性の哺乳動物細胞での遺伝子増幅に有用な選択マーカーとしては、ＤＨＦＲ−ＭＴＸ（メトトレキセート）耐性（Altら、(1978) J. Biol. Chem. 253: 1357; Wiglerら、(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567）、および当該技術分野で知られた他のマーカー（たとえば、Kaufmanら、(1988) Meth. Enzymology 185: 537に概説されている）が挙げられる。
【００２７】
以下の実施例は本発明の態様を説明するものであって、いかなる意味においても本発明の範囲を限定することを意図するものではない。上記あるいは下記で本明細書中に引用された文献はすべて、参照のため本明細書中に引用される。
【００２８】
実施例１：本発明のＨＩＲＰＥの同定
ＣＨＯ細胞株Ｐは、ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質を高レベルで発現する細胞株である。この細胞株は、ランダム組み込みを含む哺乳動物細胞株を産生する最も好ましい方法を用いて選択した。細胞株Ｐを生成するのに用いた哺乳動物発現プラスミドは改変したｐＣＤＮＡ３プラスミド（Invitrogen, Inc.より入手可能）であった。このベクター中にＤＨＦＲ遺伝子を組み込んでドミナントな選択マーカーとした。このプラスミド中の組換え遺伝子発現カセットは、ＣＭＶプロモーターおよびＢＧＨポリアデニル化配列によって駆動される。細胞株ＰのゲノムＤＮＡ分析は、この細胞株にプラスミドＤＮＡの複数のコピーが安定に組み込まれていることを示唆していた。このプラスミドＤＮＡの増幅は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ遺伝子をコードするＤＮＡの同時増幅という結果となり、ＣＴＬＡ４−Ｉｇの高発現細胞株へと導いた。
【００２９】
ランダム組み込みを用いてＣＨＯトランスフェクトーマを生成する技術分野の当業者は、高発現細胞株を生成するためには選択マーカーとしてＤＨＦＲ遺伝子を含むベクターは転写ホットスポット中に組み込まれ、遺伝子コピー数が首尾よく増幅されなければならないことを認識している。トランスフェクションした細胞のうち遺伝子を充分に増幅するもののパーセントは、予想されるように低い、なぜなら文献は哺乳動物ゲノム中で遺伝子増幅が可能なゲノム遺伝子座は稀であることを示唆しているからである（Robbins (1981) Cell 23: 29; McArthur (1991) J. Biol. Chem. 266: 6000）。細胞株Ｐ中のＣＴＬＡ４−Ｉｇプラスミド組み込み部位に隣接するゲノム遺伝子座は、遺伝子増幅および高転写活性に必要なエレメントを有する独特の遺伝子座の一つを表していた。
【００３０】
ＣＨＯ細胞中のＣＴＬＡ４−Ｉｇ遺伝子に隣接するゲノム遺伝子座に組換え遺伝子を送達するための相同組換えベクターの構築には、当該技術分野で知られた方法を用い（たとえば、Yarnoldら、(1994) Cancer Research 54: 506; Adair (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 4574; Smithら、(1989) J. Mol. Bio. 213: 415を参照）、細胞株ＰからのフランキングゲノムＤＮＡをクローニングし、クローニングした断片を適当な真核発現ベクター中に挿入する必要があった。このことは、まず組み込み部位をフランキングしているＥｃｏＲＩ生成ＤＮＡ断片のサイズをマッピングし、ついで大腸菌でＣＨＯゲノムライブラリーを構築し、これらゲノム断片を含む個々のプラスミドＤＮＡを単離することにより達成した。
【００３１】
サザーンブロット分析はＣＨＯ細胞でのＣＴＬＡ４−Ｉｇ組み込み部位のマッピングを容易にした（図７）。本発明者らは、ＣＨＯ細胞株ＰでのＣＴＬＡ４−Ｉｇ組み込み部位を分析するためにサザーンブロット分析を用いた「ＤＮＡウォーキング」と呼ばれる戦略を用いた。ＤＮＡウォーキング法では、既知のプラスミドＤＮＡ配列を用いて該プラスミド配列をフランキングしている未知のＣＨＯゲノムＤＮＡを特徴付けた。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ組み込み部位を分析するため、約１０μｇのＣＨＯゲノムＤＮＡを１００単位のＥｃｏＲＩ制限酵素（New England Biolabs）で消化した。制限消化したゲノムＤＮＡを０.７％アガロースゲル上のアガロースゲル電気泳動に１５ボルトで１２時間供した。この方法によりＤＮＡは分子サイズによって分離され、高分子量のＤＮＡは上部にくる。
【００３２】
アガロースゲル中に埋められたゲノムＤＮＡを０.４Ｍ ＮａＯＨで約３０分間変性させ、バキュームブロッター（vacum blotter）（Bio-Rad）を用いて０.４５ミクロンニトロセルロースメンブレン（Boehringer and Mannheim）に９０分間移した。ブロッティングしたフィルターを２×ＳＳＰＥ緩衝液で中和し、ＵＶ架橋装置（Stratagene；Ｃ３に２０秒間セッティング）を用いてＤＮＡをメンブレンに架橋した。サザーンブロットに用いた１.２ｋｂのハイブリダイゼーションプローブは、Boehringer Mannheimの標識キットを用いてジゴキシゲニン標識したＰＣＲ断片であった。このＰＣＲ断片は細菌のベータ−ラクタマーゼ遺伝子に由来し、下記オリゴヌクレオチドプライマーを用いて調製した：フォアウォードプライマー：ＧＧＴＣＣＴＧＣＡＡＣＴＴＴＡＴＣＣＧＣＣＴＣＣ（配列番号１４）；リバースプライマー：ＣＧＧＴＣＡＧＣＣＴＴＧＣＣＴＴＧＴＴＧＴＡＧ（配列番号３）。
【００３３】
ジゴキシゲニン標識したＤＮＡを化学ルミネセンス検出キット（Boehringer Mannheim）を用いて検出した。ゲノムＤＮＡを含むニトロセルロースフィルターを５ｍｌのEasyハイブリダイゼーション緩衝液（Boehringer Mannheim）中の５μｌのハイブリダイゼーションプローブと６８℃で１６時間ハイブリダイズさせた。フィルターを２×ＳＳＣで６５℃にて３０分間、２回洗浄し、フィルターを化学ルミネセンスアッセイキット（Boehringer Mannheim）で５分間発色させた。このサザーンブロット分析により、ベータラクタマーゼプローブにハイブリダイズした７.５ｋｂのＣＨＯゲノム左フランキング領域（「ＬＦＲ」）が明らかとなった。この７.５ｋｂ断片の制限マッピングにより、該断片がベータラクタマーゼ遺伝子を含む２.５ｋｂのプラスミドＤＮＡと５.０ｋｂのＣＨＯゲノムＤＮＡとを含むことが明らかとなった。同様に、サザーンブロット中のＥｃｏＲＩ消化ＣＨＯゲノムＤＮＡをハイブリダイゼーションプローブとして０.９ｋｂのＣＴＬＡ４−Ｉｇ遺伝子を含むプラスミドＤＮＡでプローブし、ＰＣＲ反応（ＰＣＲプライマー：フォアウォードプライマー：ＧＣＡＴＣＴＣＣＡＧＧＣＡＡＡＧＣＣＡＣＴＧＡＧＧＴＣＣＧ（配列番号４）；リバースプライマー：ＣＡＣＧＧＡＧＣＡＴＧＡＧＡＡＧＡＣＧＴＴＣＣＣＣＴＧＣＴＧ（配列番号５））を用いて生成した。ジゴキシゲニン標識ハイブリダイゼーションプローブの調製およびハイブリダイゼーション条件は上記に記載した条件と全く同じであった。しかしながら、右のフランキング領域を調べるのに用いたハイブリダイゼーションプローブは（ベータ−ラクタマーゼ遺伝子の代わりに）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ遺伝子に由来するものであったので、サザーンブロット分析は１０.０ｋｂの右フランキング領域（「ＲＦＲ」）ＤＮＡバンドを明らかにした。このハイブリッドＤＮＡ断片は、５.０ｋｂのプラスミドＤＮＡ（ＣＴＬＡ４−Ｉｇおよびｄｈｆｒ遺伝子）および５.０ｋｂのＣＨＯゲノムＤＮＡを含んでいる（図７）。
【００３４】
サザーンブロット分析に基づき、ＣＨＯ細胞株ＰからのゲノムＤＮＡを用いて７.５ｋｂおよび１０.０ｋｂのフランキングゲノム断片をクローニングした。ＣＨＯゲノムＤＮＡを、２００ｍｌのＰＦＣＨＯ血清不含培地中で増殖させた１×１０８のＣＨＯ細胞から単離した。遠心分離後、細胞ペレットをＤＮＡ抽出キット（Stratagene Inc.）を用いてゲノムＤＮＡを単離するために処理した。この操作により１０ｍｇの全ゲノムＤＮＡが得られた。
【００３５】
フランキングゲノム配列を含むＥｃｏＲＩ消化ＣＨＯゲノムＤＮＡを富ませるため、１ｍｇのゲノムＤＮＡを１０００単位のＥｃｏＲＩ酵素（New England Biolabs#101S--２０単位／μｌ）で３７℃にて６時間消化した。ＥｃｏＲＩ消化をフェノール抽出およびエタノール沈殿により停止させた。エタノールペレットを２００μｌの水に再溶解し、Tris-酢酸緩衝液中、（５０Ｖの）定常電圧でのアガロースベッド電気泳動（Life Technologies Model 250電気泳動ユニット）に供した。サイズ分離したゲノムＤＮＡを６.０〜１２.０ｋｂの分子量範囲のＤＮＡについて富ませ、ＱＩＡＥＸゲル抽出キット（Qiagen Inc#20021）を用いてゲルから抽出し戻した。この操作により、２６μｇのＥｃｏＲＩ消化したサイズに富んだＣＨＯ ＤＮＡ断片が得られた。
【００３６】
ＥｃｏＲＩ末端を有する１μｇのゲノムＤＮＡを、同様に消化した抗生物質カナマイシンに対する耐性を付与するカナマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含む細菌プラスミド（ｐＳＴＫＮ）中に挿入した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（New England Biolabs）を用いてゲノムＤＮＡとプラスミドＤＮＡとをライゲートしてＣＨＯゲノムライブラリーを生成した。ライゲートしたＣＨＯゲノムＤＮＡをエレクトロポレーション装置（Bio-Rad #）を用いて大腸菌（ＸＬ１ Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’Stratagene Inc., #200230）中に形質転換し、大腸菌でＣＨＯゲノムライブラリーを得た。
【００３７】
７.５ｋｂの左フランキング領域をクローニングするため、本発明者らは抗生物質アンピシリンに対する耐性を付与するベータラクタマーゼ遺伝子の存在を利用した。ゲノムライブラリーを含む大腸菌菌体を２つの抗生物質に耐性なクローン（ａｍｐＲおよびＫｎＲ）について直接スクリーニングした；ａｍｐＲはＬＦＲ断片の寄与によるものであり、ＫｎＲ遺伝子は細菌プラスミド（ｐＳＴＫＮ）の寄与によるものであった。この手順により両抗生物質に耐性な８つの細菌クローンが得られた。これらクローンからのプラスミドＤＮＡの速やかなＤＮＡ分析は、予想されたように７.５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を有するプラスミドを与え、予想されたようにＬＦＲ断片の存在を示していた。
【００３８】
１０.０ｋｂの右フランキング領域のクローニングには、ハイブリダイゼーションプローブとしてＰ３２標識したＣＴＬＡ４−Ｉｇ遺伝子（ＤＮＡ）を用いたコロニーハイブリダイゼーションの通常の分子生物学的方法が含まれていた。コロニーハイブリダイゼーション法はMolecular Cloning laboratory Manual（コールド・スプリングス・ハーバー・ラボラトリー）に記載されている。放射性標識した
【００３９】
７.５ｋｂと１０.０ｋｂのゲノムクローンの制限酵素消化パターンを比較したところ、プラスミドの組み込み部位でゲノムＤＮＡの複製をたよる（invoking）共通サイズのＤＮＡバンドが明らかとなった。このことは自動ＤＮＡシークエンサー（Applied Biosystems - PRISM310 Genetic Analyzer）を用いたＤＮＡ配列分析により確認された。これら２つの結果は、左および右のフランキング配列が同一であり、組み込み部位でのＤＮＡ複製により生じたものであることを示唆していた（図２）。これら配列を本明細書では以下、ＦＧＳ（フランキングゲノム配列（Flanking Genomic Sequences））と称する。
【００４０】
５.０ｋｂのゲノムＤＮＡのＤＮＡ配列分析は幾つかの独特の特徴を明らかにした。ＧＣＧウイスコンシンＤＮＡ配列データ分析ソフトウエアを用いたＤＮＡホモロジーサーチは、この配列が転写ホットスポットを表していることを示唆していた。クローニングしたＦＧＳは、酵母およびＣＨＯ細胞で認められるコンセンサス自律的複製配列（ＡＲＳ）と類似のＤＮＡモチーフを含んでいる（Sohnら、(1996) Journal of Bacteriology 78(15): 4420; Markら、(1990) J. Mol. Biol. 211: 19）。また、ＦＧＳは転写ホットスポットに共通に認められるＭＡＲと類似のモチーフを含んでいる（Harmuttら、(1995) Biochemistry 34: 4108）。クローニングしたＤＮＡがＣＨＯ細胞からの転写ホットスポットであるとのこの情報をもとに、本発明者らは相同組換えベクターの構築を行った。
【００４１】
哺乳動物ゲノム中への外来ＤＮＡの組み込みは、標的ゲノム中のランダムな部位でのＤＮＡ切断を伴うプロセスにより最も頻繁に起こると考えられる。最近、内生の遺伝子増幅並びに異種のトランスフェクションしたＤＮＡの増幅のモデルが提唱された。これらモデルの一つの構成要素は、遺伝子増幅の第一の工程として組み込み部位でのラージ逆方向複製（large inverted duplication）の関与である（Heartlein M. W.ら、(1988) Nucleic Acid Research 17(4): 1697-1716; Passananti C.ら、(1987) EMBO J. 6: 1697-1703）。このモデルの必須の構成要素は、逆方向繰返しの生成およびその後の遺伝子増幅の前提条件としての宿主ゲノム中のＡ−Ｔリッチ繰返しエレメント中へのプラスミドＤＮＡの組み込みである。
【００４２】
細胞株Ｐ中のＣＴＬＡ４−Ｉｇ組み込み部位での逆方向複製の存在、およびＨＩＲＰＥ中の３つの異なる繰返しエレメントの存在は、提唱されたモデルと一致している。相同挿入組換えベクター中のＨＩＲＰＥ中の繰返しエレメントの存在は、逆方向繰返しの生成および高発現に必要な遺伝子増幅を容易にするであろう。
【００４３】
実施例２：組換えベクター
相同組換えは、正確な部位特異的な遺伝子の組み込みおよび目的遺伝子の発現を可能とする、酵母での遺伝子操作のための強力な手段であると考えられる（Orr-Weaver, T.L.ら、(1981) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78(10): 6354-8）。しかしながら、哺乳動物培養細胞での相同組換え法の適用の可能性は、異常な（illegitimate）組換え事象および適当な選択法の欠如によって圧倒されている（overwhelmed）。ホットスポットへの組換え遺伝子の相同的挿入は、組換えタンパク質を高発現する細胞株の増大した頻度を研究することを可能にする。この概念は、相同組換え抗体発現系をマウス細胞に対していかにして作製するかの一つの例として以前の刊行物に記載されている（Gregoryら、ＷＯ９５／１７５１６）。
【００４４】
にもかかわらず、本発明は、すべての組換え遺伝子に対してより広く適用できること、ＣＨＯゲノム遺伝子座の選択、クローニングした組換え遺伝子を一貫して増幅しうること、およびプラスミド組み込み部位でのゲノム複製の生成の点で当該技術分野で知られているものと異なる。
【００４５】
上記のように相同組換えベクターは、遺伝子のタンパク質への転写および翻訳に必要なエレメントを含む真核発現ベクターである。本明細書に記載する相同組換えベクターは、ドミナント選択マーカーとしてＤＨＦＲ遺伝子を含むベクターｐｃＤＮＡ３（Invitrogen Inc.）に由来する再度遺伝子操作したベクターである。この発現ベクターをジヒドロ葉酸レダクターゼ酵素を欠くＣＨＯ宿主細胞ＤＧ４４およびＤＵＫＸＢ１１細胞中に導入し、ＤＨＦＲ遺伝子機能を相補することによってトランスフェクトーマをバックグラウンドに対して選択する（ジヒドロ葉酸レダクターゼを欠く変異チャイニーズハムスター卵巣細胞でのメトトレキセート代謝（Joannon P.ら、(1987) Biochem-Pharmacol. 36(7): 1091; Urlaubら、(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216））。
【００４６】
相同挿入組換えベクター（ｐＴＶ(Ｉ)として表す）は、全５.０ｋｂ ＨＩＲＰＥ配列（配列番号１）をクローニングしたゲノムＤＮＡを含んでいた（図３）。このゲノム断片を５'末端のＮｏｔＩ制限部位および同一平面の３'（平滑）末端で再構築し、前以て両立しうる（compatible）制限部位で消化しておいたｐｃＤＮＡ／ＤＨＦＲ／ＣＴＬＡ４−Ｉｇ発現ベクター中にクローニングした。得られた相同ベクターｐＴＶ(Ｉ)は、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ組換え遺伝子の５'末端にＣＨＯゲノムＤＮＡを含んでいた（図３）。このプラスミドＤＮＡをQUIAGEN Inc.より市販されているMidi−プラスミド単離キットを用いて精製した。ｐＴＶ(Ｉ)プラスミドをＥｃｏＲＩ制限酵素で直線状にし、エレクトロポレーションによりＣＨＯ ＤＧ４４細胞中に導入した。
【００４７】
ヌクレオシド（ヒポキサンチン１６μｇ／ｍｌおよびチミジン０.２μｇ／ｍｌ）を含むＰＦＣＨＯ培地（JRH Biosciences，血清不含−タンパク質不含＃１４６０２−７９Ｐ）での短い回収期間（７２時間）の後、細胞を、ヌクレオシドを含まないＰＦＣＨＯ培地および２０ｎＭメトトレキセートとともに５％透析ウシ胎仔血清を含む培地中での選択に供した。これら細胞を１０の９６ウエルプレート（９６０ウエル）に分配した。３週間のインキュベーション期間の後、約１２０のトランスフェクトーマがＥＬＩＳＡにおいてＣＴＬＡ４−Ｉｇ発現について陽性であった。６つのクローン（５％）が５μｇ／ｍｌを超える一次（primary）ＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質力価を生成した（表１）。これら最良の６つのクローンをＴ−７５組織培養フラスコ中に拡張し、Stratagene Inc.より市販されているゲノムＤＮＡ単離キットを用いてＣＨＯゲノムＤＮＡをサザーンブロット分析のために調製した。
【００４８】
従来の発現ベクター（たとえば、ｐｃＤＮＡ３／ＮｅｏＲおよびｐｃＤＮＡ／ｄｈｆｒ）は、５μｇ／ｍｌの最高のＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質力価を有するトランスフェクトーマを生成した。５μｇ／ｍｌを超えて生成したトランスフェクトーマを、ＨＩＲＰＥ配列が首尾よく組み込まれ増大した発現を示すものとして選択した。５μｇ／ｍｌが従来の発現ベクターで得ることのできる最高のタンパク質力価であるため、所望のタンパク質、たとえばＣＴＬＡ４−Ｉｇを一次力価において５μｇ／ｍｌを超えて発現するトランスフェクトーマはすべて有意であり、発現が「増大」していると考えられる。
【００４９】
表１
【表１】
上記表Ｉ中の６つのクローンは、挿入ターゲティングベクターｐＴＶ(Ｉ)を用いて生成した最良のＣＴＬＡ４−Ｉｇ産生トランスフェクトーマを表している。表Ｉ中のこれら６つのクローンはすべて５.０ｋｂのゲノムＤＮＡを含んでいる。太字で示した４つのクローンは、これらクローンからのゲノムＤＮＡをサザーンブロットにより分析したことを示す。クローン２Ｃ５および２Ｆ２（太字でない）はサザーンブロットにより分析しなかった。ＮＤは「決定せず（Not Determined）」を示し、サザーンブロットにより分析しなかったクローンを示すのに用いた。
【００５１】
使用した本発明者らの対照トランスフェクトーマ（ｐｃＤＮＡ／ｄｈｆｒ）において、本発明者らは５μｇ／ｍｌまたはそれ以上のＣＴＬＡ４−Ｉｇ力価を発現するトランスフェクトーマを見出さなかった。本発明者らの手元にある従来のランダム組み込みベクターは、所望のタンパク質、すなわちＣＴＬＡ４−Ｉｇを５μｇ／ｍｌの力価で発現する１／１０００トランスフェクトーマを生成した；この数字に基づき、ランダム組み込みベクターを用いた高産生クローンの頻度を約１／１０００（０.１％）と予測することができる。本明細書に示したデータは、本発明のＨＩＲＰＥを含む相同組換えベクターが、従来の対照ベクターに比べて高組換えタンパク質力価を有するトランスフェクトーマを得る頻度を０.１％（対照）から５％に増大させることを示している。これは、ランダム組み込みベクターに比べて高産生クローンを得る頻度における５０倍の増大を表している。
【００５２】
サザーンブロット分析を用いて４つの独立のトランスフェクトーマでのｐＴＶ(Ｉ)プラスミド組み込み部位を調べた。これらトランスフェクトーマからのゲノムＤＮＡを以下の点について分析した：（ａ）部位特異的なターゲティングを示唆するクローン間での類似のＤＮＡバンドパターン；および（ｂ）組み込み部位での逆方向繰返しの生成の証拠としての３つのバンドパターンの存在。Stratagene, Inc.からのゲノムＤＮＡ単離キットを用い、４つの異なるトランスフェクトーマからゲノムＤＮＡを調製した。約１０μｇのＣＨＯゲノムＤＮＡをＫｐｎＩ制限酵素で３７℃にて１２時間消化した。ＫｐｎＩ消化したゲノムＤＮＡを１５Ｖでの０.７％アガロースベッドゲル電気泳動により１６時間分離した。ゲルに埋もれたゲノムＤＮＡを０.４Ｍ ＮａＯＨで変性させ、Bio-Radバキュームブロッターを用いて０.４５ミクロンのニトロセルロースフィルター上にブロッティングした。
【００５３】
ＰＣＲ増幅を用い、５.０ｋｂのゲノムＤＮＡの異なる領域からそれぞれ２００ｂｐおよび５００ｂｐの２つのハイブリダイゼーションプローブを生成した。２００ｂｐのハイブリダイゼーションプローブは、ＰＣＲプライマー
ＣＴＡＧＣＣＴＧＣＣＴＣＡＣＡＡＧＣＴＴＧ（配列番号６）および
ＧＡＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＴＡＣＡＴＡＧ（配列番号７）を用いて生成した。同様に、５００ｂｐのハイブリダイゼーションプローブは、ＰＣＲプライマー
ＧＣＡＴＴＴＣＡＧＣＡＴＧＧＴＴＧＧＣＴＡＧＣ（配列番号８）および
ＧＧＡＣＴＴＣＡＴＧＴＣＴＴＣＴＣＴＣＣＴＧＣ（配列番号９）を用いて生成した。
【００５４】
上記実施例１に記載したように、ハイブリダイゼーションプローブはジゴキシゲニン標識ＵＴＰ（Boehringer Mannheim）を含んでおり、これらは化学ルミネセンス検出キット（Boehringer Mannheim）により検出される。これら２つのハイブリダイゼーションプローブを等容量で混合し、上記（実施例１）と同様のハイブリダイゼーション条件を用いてニトロセルロースにハイブリダイズさせた。ＥｃｏＲＩで消化しこれら混合ハイブリダイゼーションプローブ（２００ｂｐおよび５００ｂｐ）とハイブリダイズさせた親Ｐ細胞株のゲノムＤＮＡのサザーンブロット分析は、３つのＥｃｏＲＩ ＤＮＡバンドを生成した。これら結果は、ＥｃｏＲＩバンドのうちの２つが組み込み部位での逆方向繰返しの生成の結果であり、第三のバンドが妨害されないゲノムホモログであることを示唆している。当業者であれば、この３ＤＮＡバンドパターンを参照マーカーとして用い、部位特異的な組み込みの証拠のために同じ発現ベクターを用いて生成した他のトランスフェクトーマを分析することができる。
【００５５】
ｐＴＶ(Ｉ)ベクターを含む上位４つの産生クローン（ＩＡＩ、３Ｃ２、３Ｃ１１および６Ｂ８）からのゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化したもののサザーンブロット分析は、分析した４つのクローンの３つに共通する３バンドパターンを生成した。新たなトランスフェクトーマにおける３バンドパターンの存在は、プラスミド組み込み部位での逆方向繰返しの生成と一致している。第二に、これらトランスフェクトーマにおける同一のサイズの３バンドパターンの存在は、これら相同組換えベクターがＣＨＯゲノム中の同一部位に独立にターゲティングし、高組換え遺伝子発現を生成したことを示唆している（図５）。サザーンブロット分析はさらに、５.０ｋｂのＨＩＲＰＥが逆方向繰返しの生成および遺伝子増幅を誘発して高発現へと導くモチーフを含むことを示唆している。
【００５６】
ランダムなプラスミド組み込みは、ＣＨＯ細胞での組み込みの好ましい様式である（＞９９％）。ＣＨＯ細胞における相同組換え事象は０.１〜０.３％未満を占めるにすぎない（Thomasら、(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 615）。ランダムな組換え事象は一般に広範なＤＮＡを必要とせず、基質として全プラスミドＤＮＡ（５.０ｋｂのゲノムＤＮＡを含む）を潜在的に使用しうる。もしもそのような事象が生じたら、発現ベクターｐＴＶ(Ｉ)は相同部位とは異なる部位で組み込まれる。本出願において、サザーンブロット分析は、本願出願人の新規なベクターが圧倒的な半端物（overwhelming odds）に対して主たる高産生クローンにおいてＣＨＯ細胞中の単一のゲノム遺伝子座に組み込まれることを示唆している。
【００５７】
ｐＴＶ(Ｉ)プラスミドが一貫して高組換えタンパク質力価を有するＣＨＯトランスフェクトーマを生成することを独立に確認するため、ＣＨＯ ＤＧ４４細胞株中へのｐＴＶ(Ｉ)プラスミドの第二のトランスフェクションを行った。第二のトランスフェクションの結果を下記表IIに示す。第二のトランスフェクションからの結果から、ｐＴＶ(Ｉ)ベクターが好ましい遺伝子座での組み込みにより高組み込みタンパク質力価を有するトランスフェクトーマを一貫して生成することが確認された。表II中の太字のクローンは、部位特異的な組み込みを示すためにその後にサザーンブロットにより分析したことを示す。「ＮＤ」は試験しなかったことを示す。
【００５８】
表 II
【表２】
５.０ｋｂのゲノムＤＮＡをシークエンシングする際に、本発明者らは、おそらく立体障害のためにジゴキシゲニン標識ｄＴＴＰ（デオキシヌクレオシド三リン酸）を用いたＰＣＲ反応で増幅されなかった７０％Ａ−ＴリッチなＡ−Ｔリッチモチーフに出くわした。これと一致して、哺乳動物ゲノムで高度に発現される遺伝子は優勢にＡ−Ｔに富んだシス作動性のエレメントを含んでいる（Mehta (1996) J. Biol. Chem. 271(52): 33616）。このことは、下流の組換え遺伝子発現を増大させるシス作動性エレメントとしての５.０ｋｂ ＣＨＯゲノムＤＮＡ中のＡ−Ｔリッチモチーフの評価へと導く。本発明者らは、ＰＣＲ増幅および被験遺伝子（所望のタンパク質）としてのＣＴＬＡ４−Ｉｇ遺伝子および陽性の選択マーカーとしてのＤＨＦＲ遺伝子を含むベクター中への所望の生成物のクローニングを用い、２つの同遺伝子型挿入ベクターｐＴＶ(Ｉ)/１.６（配列番号１のヌクレオチド３０５０〜４６７６を含む）およびｐＲＶ(Ｉ)/１.４（配列番号１のヌクレオチド３０５０〜４４８５を含む）を構築した。
【００６０】
上記のように５.０ｋｂゲノムＤＮＡからの１４３５ヌクレオチドを含むｐＲＶ(Ｉ)/１.４ベクターは、ＰＣＲプライマー
ＡＧＣＣＴＡＴＣＴＣＣＡＴＴＣＧＴＣＡ（配列番号１０）および
ＣＣＧＣＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＣＴＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＡＧＴＧ（配列番号１１）を用いて生成した。ベクターｐＴＶ(Ｉ)/１.６（５.０ｋｂゲノムＤＮＡからの１６２６ヌクレオチドを含む）は、ＰＣＲプライマー
ＡＧＣＣＴＡＴＣＴＣＣＡＴＴＣＧＴＣＡ（配列番号１２）および
ＣＣＧＣＣＧＡＡＴＴＣＡＡＣＣＡＣＡＴＧＧＴＧＧＣＴＣＡＣＡＡ（配列番号１３）を用いて生成した。
【００６１】
ＰＣＲ由来断片を、ＣＴＬＡ４−Ｉｇリポーター遺伝子およびｄｈｆｒ選択マーカーを含む上記同発現ベクター中にクローニングした。これら２つの新たなベクターは共通するフォアウォードプライマーにより生成される同じ５'末端を有しているが、１.４ｋｂのＨＩＲＰＥの３'末端は１.６ｋｂのＨＩＲＰＥに比べて約２００ｂｐ短い。ＣＨＯ ＤＧ４４細胞中に形質転換すると、両ベクターともＥＬＩＳＡにおいてＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質発現について陽性の約１２０のトランスフェクトーマを生成した（Symingtonら、(1993) J. Immunol. 150(4): 1286）。しかしながら、各クラスの上位４つの産生クローンからのＣＴＬＡ４−Ｉｇ力価を比較したときに、ｐＴＶ(Ｉ)/１.６ベクターを含むトランスフェクトーマは約４倍高いＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質力価を発現したが、ｐＴＶ(Ｉ)/１.４を含むトランスフェクトーマはＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質発現を有意に改善しなかった（図８参照）。これら結果から、５.０ｋｂゲノムＤＮＡ中の２００ｂｐ Ａ−ＴリッチモチーフはＣＨＯ細胞で組換え遺伝子発現を増大させるシス作動性のエレメントとして作用すると結論された。
【００６２】
以下の記載は、相同置換ベクターの利点および５.０ｋｂのゲノムＤＮＡを含む置換ベクターｐＴＶ(Ｒ)の構築の詳細である。置換ベクターを用いた導入ＤＮＡと染色体ＤＮＡとの間での相同組換えは、外来ＤＮＡを哺乳動物細胞中に導入するために広く用いられている。ＣＨＯ細胞での相同組換えに影響を及ぼす変数としては、これらに限られるものではないが、遺伝子座、相同配列の量、および陽性選択カセットを含む多くの変数がある。置換ベクターは相同組換えの頻度が５〜１０倍低いが、外来プラスミド配列は組換え事象の間に切り出されながら挿入物（組換え遺伝子）が安定に組み込まれるという利点がある。このことは、プラスミド配列全体が挿入される挿入ベクター（ｐＴＶ(Ｉ)）とは対照的である。さらに、置換ベクターは、置換ベクターに適用可能な部位特異的な組み込みのための一般に受け入れられているエンリッチメント（enrichment）手順のために好ましい（Hastyら、(1991) Mol. Cell. Bio. 11: 4509）。最後に、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子と組み合わせた置換ベクターは、相同組換えの結果得られるトランスフェクトーマを単離するのに用いる最も一般的なエンリッチメント手順を提供する（Zheingら、(1990) Nature 344: 170）。
【００６３】
ヌクレオシドアナログであるアシクロビルは、ＨＳＶ−チミジンキナーゼ（「ＨＳＶ−ｔｋ」）遺伝子を発現する哺乳動物細胞を選択的に殺す。ＨＳＶ−ｔｋはアシクロビルをそのリン酸化形態に変換するが、これは細胞にとって毒性である。その結果、ＨＳＶ−ｔｋを発現する細胞のみが殺され、正常なＣＨＯ細胞は殺されない。ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子は、置換ベクター中で相同組換えの後に該ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子が欠失されるような領域に戦略的に配置され、一方、他のすべての組換え事象（ランダムな組み込み）は遺伝子をそのまま保持する。その結果、相同組換えの結果得られるトランスフェクトーマはアシクロビル選択を生き残るが他のクラスのトランスフェクトーマは殺される（Evrardら、(1996) Cell. Biol. Toxicol. 12(4-6): 345）。
【００６４】
ｐＴＶ(Ｒ)ベクターは、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ発現カセットの５'末端にＡ−Ｔリッチ領域を含む１.６ｋｂのゲノムＤＮＡおよびＤＨＦＲ選択マーカーの３'末端に２.２ｋｂのフランキングゲノム断片を含む（図４）。ゲノムＤＮＡの２つの部分へのクローニングはポリメラーゼ連鎖反応を用いて新たな制限部位を作製することにより行ったが、これは組換えＤＮＡ法の当業者には自明の方法である。置換ベクターは、相同組換えの結果得られるトランスフェクトーマではＨＳＶ−ｔｋ遺伝子が離脱されるが、異常な組換え体は活性なＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を保持するようにデザインされている。その結果、活性なＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を含む異常な組換え体はすべて阻害剤のアシクロビルにより殺され、部位特異的な組換えの結果得られるクローンのみを選択的に増殖させることができる（Pfizerら、(1987) Am. J. Cancer 40: 114; Davidsonら、(1981) Virology 113: 9）。
【００６５】
部位特異的な組換え体を選択的に富ませる戦略は予想された結果をもたらし、置換ベクターを用いて生成したトランスフェクトーマの１０％がこの選択を生き残った。エレクトロポレーションによりｐＴＶ(Ｒ)をＣＨＯ細胞株ＤＧ４４中に導入すると、第１回目の２０ｎＭメトトレキセート選択を生き残った８６０のトランスフェクトーマが得られた。しかしながら、第２回目の１.０ｍＭアシクロビルによる選択では９４のトランスフェクトーマ（１０％）のみが生き残った。これら二重の選択を生き残ったトランスフェクトーマは、部位特異的な組換え事象によるものである。これら９４のトランスフェクトーマすべてをＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質力価についてスクリーニングした。最高のＣＴＬＡ４−Ｉｇタンパク質力価を有する上位６つのトランスフェクトーマを下記表IIIに示す。
【００６６】
表 III
【表３】
これら６つのトランスフェクトーマ（すなわち、１Ｃ９、２Ｂ１１、３Ｄ５、４Ｆ４、５Ｃ４および６Ｆ１）からのゲノムＤＮＡを上記手順を用いて調製した。ゲノムＤＮＡをＢｓｐ１２０１制限酵素で消化し、上記セクションで記載したのと同様にＰＣＲにより生成した２００ｂｐおよび５００ｂｐのハイブリダイゼーションプローブを用いたサザーンブロット分析に供した。アガロースゲルベッド電気泳動および洗浄条件を含むハイブリダイゼーション条件は、上記に記載した条件と同じであった。分析した６つのすべてのクローンからのＤＮＡバンドパターンは、それぞれ３.５ｋｂおよび２.７ｋｂのバンドを有する２バンドパターンを明らかにした（図６）。これらの結果から、２.７ｋｂ ＤＮＡのバンドが妨害されないゲノムホモログを表し、３.５ｋｂ ＤＮＡはプラスミドとＣＨＯ細胞での組み込み部位を説明するゲノムＤＮＡとを含むハイブリッドバンドであることが推論された。分析した６つのすべてのトランスフェクトーマからの共通する３.５ｋｂのハイブリッド断片の存在は、相同置換ベクターがＣＨＯ細胞中の特定の部位に選択的に組み込まれたことを示している。さらに、本発明のＨＩＲＰＥ遺伝子（配列番号１）またはその断片（配列番号２）を含む置換ベクター中にＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を用いて生成したトランスフェクトーマの数を減らした後でもタンパク質産生は高いままであった。
【００６８】
上記の開示は、本発明が組換えタンパク質の発現を増大させるための独特で信頼性のある方法を提供することを示している。本発明者らによって教示されたＨＩＲＰＥ配列（配列番号１）またはＨＩＲＰＥ活性を示す配列番号１の断片（好ましくは配列番号２に示す断片）を用いることにより、当業者は首尾よくトランスフェクションした細胞のパーセントを増大させることができるのみならず、それらトランスフェクションした細胞での発現をも増大させることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 親のＣＴＬＡ４−Ｉｇ発現細胞株（本明細書で細胞株「Ｐ」と称する）でのＣＴＬＡ４−Ｉｇ組み込み部位のクローニングを示す。図１Ａはサザーンブロットを示しており、５.５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片はＤＧ４４宿主およびＰ ＣＨＯ細胞株の両者中の天然染色体を表す。レーン２の８.０ｋｂおよび１０.０ｋｂのバンドは、それぞれ再配置した左および右のフランキング領域を表す。図１Ｂは、細胞株Ｐ組み込み部位の左フランキング領域（レーン１）および右フランキング領域（レーン２）を含むクローニングＥｃｏＲＩ断片が細胞株ＰからのＥｃｏＲＩ消化ゲノムＤＮＡと一緒に移動することを示している。
【図２】 細胞株Ｐ中のＣＴＬＡ４−Ｉｇ組み込み部位の分子構成を表している。ＣＴＬＡ４−Ｉｇ遺伝子の両末端にフランキングする同一の５.０ｋｂゲノム配列；Ａ−Ｔリッチモチーフ；ＭＡＲ様配列（マトリックス結合領域）；およびＡｌｕ様配列を示す。
【図３】 相同挿入組換えベクター、ｐＴＶ(Ｉ)の模式図を示す。
【図４】 相同置換組換えベクター、ｐＴＶ(Ｒ)の模式図を示す。
【図５】 サザーンブロット分析を示しており、挿入組換えベクター、ｐＴＶ(Ｉ)を含むトランスフェクトーマでの部位特異的な組み込みが確認される。
【図６】 サザーンブロット分析を示しており、置換組換えベクター、ｐＴＶ(Ｒ)を含むトランスフェクトーマでの部位特異的な組み込みが確認される。ブロットは５つのすべてのクローンで３.５ｋｂのバンドを明らかにしており、置換ベクターが同様のゲノム遺伝子座をターゲティングすることを示唆している。
【図７】 サザーンブロット分析および制限酵素マッピングにより分析したＬＦＲ断片およびＲＦＲ断片の模式図を示す。
【図８】 組換え遺伝子発現に及ぼすＡ−Ｔリッチモチーフ領域の効果を示す。完全長の５.０ｋｂ核酸配列；１.６ｋｂの核酸配列（Ａ−Ｔリッチモチーフを含む）；またはＡ−Ｔリッチモチーフを含まない１.４ｋｂ領域のいずれかを含む上位４つのトランスフェクトーマからのＣＴＬＡ４−Ｉｇ発現をμｇ／ｍｌで示す。
【図９】 本発明のＨＩＲＰＥを得るのに用いたオリゴヌクレオチドを示す。
【図１０】 本発明のＨＩＲＰＥがＣＴＬＡ４−Ｉｇの発現を促進することを示す。
【図１１】 挿入ベクターおよび置換ベクターが同様の結果を与えることを示す。
Claims (16)
- （ａ）配列番号１に示す配列；
（ｂ）（ａ）の相補体；または
（ｃ）配列番号１の断片 であって、配列番号１のヌクレオチド３０５０〜４６７６を含み、該核酸断片を発現ベクター中に導入したときに目的組換えタンパク質の発現を増大させることができることを特徴とする断片
のいずれかを含む単離核酸。 - 請求項１に記載の核酸 を含む発現ベクター。
- 配列番号１のヌクレオチド３０５０〜４６７６を含む、請求項２に記載の発現ベクター。
- さらに選択マーカーを含む、請求項２に記載の発現ベクター。
- さらに選択マーカーを含む、請求項３に記載の発現ベクター。
- 目的タンパク質の全体または一部をコードする核酸 をさらに含む、請求項２に記載の発現ベクター。
- 該目的タンパク質がＣＴＬＡ４−Ｉｇまたはその変異体である、請求項６に記載の発現ベクター。
- 目的タンパク質の全体または一部をコードする核酸を さらに含む、請求項３に記載の発現ベクター。
- 該目的タンパク質がＣＴＬＡ４−Ｉｇまたはその変異体である、請求項８に記載の発現ベクター。
- 請求項２に記載の発現ベクターで形質転換した宿主細胞。
- 請求項３に記載の発現ベクターで形質転換した宿主細胞。
- 請求項６または７に記載の発現ベクターで形質転換したＣＨＯ細胞。
- 請求項８または９に記載の発現ベクターで形質転換したＣＨＯ細胞。
- 組換えタンパク質を得る方法であって、請求項１２に記載の形質転換したＣＨＯ細胞を 培養し、ついで該タンパク質を回収することを含む方法。
- 組換えタンパク質を得る方法であって、請求項１３に記載の形質転換したＣＨＯ細胞を 培養し、ついで該タンパク質を回収することを含む方法。
- 組換えＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を得る方法であって、請求項７に記載の発現ベクターで形質転換した宿主細胞を 培養し、ついで該ＣＴＬＡ４−Ｉｇを回収することを含む方法。
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