JP3881006B2 - 哺乳動物の発現のための完全に障害されたコンセンサスコザク配列 - Google Patents
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Description
組み換えDNA技術を包含する典型的な戦略に従い、所望のタンパク質物質をコードするDNA配列(「cDNA」)は同定されそして天然源から単離されるか、あるいは合成的に生産される。このフラグメントの遺伝物質を操作することによって、その末端を二本鎖DNAの小さい環状分子の区画の中に組込むか、あるいは「適合」させるようにつくられる。この環状分子は典型的には「DNA発現ベクター」、または単に「ベクター」と呼ばれる。ベクターと遺伝物質との組み合わせは「プラスミド」と呼ぶことができ、そして原核宿主が複製するとき、プラスミドは自律的環状DNA分子として原核宿主(すなわち、本質的に細菌)中で複製することができる。その後、環状DNAプラスミドを単離しそして真核宿主(すなわち、本質的に哺乳動物)の中に導入し、そしてプラスミドDNAを取り込んだ宿主細胞を選択する。あるプラスミドのベクターは哺乳動物細胞の中の自律的環状DNA分子として複製するであろう(例えば、プラスミドはエプスタイン−バーN−ウイルス(「EBV」)およびウシ乳頭腫ウイルス(「BPV」)に基づくベクターを含むが、DNAベクターを包含するほとんどのプラスミド、およびRNAライノウイルスのベクターを包含するすべてのプラスミドは環状DNAの中に組込まれ、こうして真核宿主細胞の環状DNAが複製するとき、プラスミドDNAもまた複製する。したがって、真核細胞が成長しかつ分裂するとき、目的のタンパク質物質の生産(「発現」)に導く組込まれたプラスミドを含有する細胞の対応する増加が存在する。プラスミドを含有する宿主細胞を好適な増殖条件に暴露することによって、有意な量の宿主、そしてそれゆえ、目的のタンパク質が生産される。典型的には、チャイニーズハムスター卵巣(「CHO」)細胞系が真核宿主細胞として利用されるが、大腸菌(E. coli)は原核宿主細胞として利用される。
ベクターは前述においてきわめて重要な役割を演ずる。ベクターの操作はcDNAがどこに挿入されるかに関する変動性、cDNAが、事実、ベクター内に適切に挿入されたかどうかを決定する手段、遺伝物質の発現が起こるか否かの条件などを可能とする。しかしながら、ベクターの操作の大部分は単一の目標−所望の遺伝子生産物、すなわち、目的のタンパク質の発現の増加に向かって適合される。再び述べると、「改良されない」ベクターと比較したとき、「改良された」ベクターが有意により高いレベルにおいて遺伝子生産物の生産を可能とするように、大部分のベクターの操作は実施される。こうして、1つのベクターの特性/面/特性のあるものは他のベクターの特性/面/特性に類似するように想われるが、操作の全体の目標の結果−問題の遺伝子生産物の改良された生産−を検査することがしばしば必要である。
1つの「改良された」ベクターは1組の環境について望ましい特性を有することができるが、これらの特性は他の環境下に必ずしも望ましくないことがある。しかしながら、1つの特性はすべてのベクターについて望ましい:向上した効率、すなわち、生産されるタンパク質の量を増加すると同時に有意な量のこのタンパク質を生産しない宿主細胞の数を減少するスクリーニング能力。このような向上した効率は、操作のコストの減少および注目のタンパク質を発現している生活可能なコロニーについてスクリーニングする技術により消費される時間の減少を包含する、いくつかの望ましい利点を有するであろう。したがって、望ましいものおよび技術水準を有意に改良するものは、このような効率特性をもつ発現ベクターである。
発明の要約
ここに記載する本発明はこれらのおよび他の必要性を満足する。発現ベクターの一部分である転写カッセトの優性選択可能なマーカーとともに、最も典型的に使用される、十分に障害されたコンセンサスコザク(Kozak)配列をここに開示する;好ましくは、優性選択可能なマーカーは天然のイントロン挿入領域または人工のイントロン挿入領域を含んでなり、そして注目の少なくとも1つの遺伝子生産物はこのような挿入領域内に位置するDNAによりコードされる。
本明細書において使用するとき、「優性選択可能なマーカー」は遺伝子配列またはその遺伝子配列によりコードされるタンパク質である;優性選択可能なマーカーによりコードされるタンパク質の発現は、優性選択可能なマーカーを含む発現ベクターでトランスフェクションされた宿主細胞がこのタンパク質を含有しない宿主細胞をそうでなければ殺すであろう選択プロセスに生き残ることを保証する。本明細書において使用するとき、「転写カッセト」はタンパク質生産物(例えば、優性選択可能なマーカー)をコードするDNAおよび宿主細胞中のタンパク質生産物の生産に必要な遺伝要素(すなわち、プロモーター;転写開始部位;ポリアデニル化領域;など)を有する。これらのベクターは、最も好ましくは、宿主細胞のDNAの中へのベクターの組込みが起こる哺乳動物の発現系におけるタンパク質の発現のために利用される。有益なことには、このような十分に障害されたコンセンサスコザク配列の使用は、生存可能なコロニーの数を有意に減少すると同時に、このような生存可能なコロニーにより発現されるタンパク質の量を有意に増加することによって、タンパク質の発現の効率を改良することができる。本明細書において使用するとき、「天然のイントロン挿入領域」はこの場合において遺伝子内に自然に存在するDNAの領域、典型的には優性選択可能なマーカー中にあり、これは注目の遺伝子生産物をコードするDNAの挿入のために利用することができる;「人工のイントロン挿入領域」は、注目の遺伝子生産物をコードするDNAの挿入のために利用することができる、遺伝子の中に選択的につくられるDNAの領域(やはり、最も典型的には、優性選択可能なマーカー内)にある。イントロンの位置決定に関する情報は、Abramas, J. M.ら、“Intronic Positionig Maximizes Co-expression and Co-amplification of Nonselectable Heterologous Genes.”J. Biol. Chem. 264124:14016(1989)、および米国特許第5,043,270号(両方の文献をここに引用によって加える)に記載されている。
本明細書において定義、開示および特許請求するように、「十分に障害されたコンセンサスコザク(Kozak)」は次の配列を有する:
ここで:「x」はアデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)またはチミジン(T)/ウラシル(U)から成る群より選択されるヌクレオチドである;「Py」はピリミジンヌクレオチド、すなわち、CまたはT/Uである;「ATG」はアミノ酸メチオニンをコードするコドン、いわゆる「開始」コドンである;そして−3および+1はATGと向かい合った方向の参照点である、すなわち、−3はATGから3ヌクレオチド上流を示すことを意味しそして+1はATGから1ヌクレオチド下流を示すことを意味する。
好ましくは、十分に障害されたコンセンサスコザクは、発現ベクターの一部分である転写カッセトの優性選択可能なマーカー部分の翻訳を開始するメチオニン開始コドンの一部分である。好ましい優性選択可能なマーカーは次のものを包含するが、これらに限定されない:単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ;アデノシンデアミナーゼ;アスパラギンシンセターゼ;サルモネラ(Salmonella)hisD遺伝子;キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ;ヒグロマイシンBリン酸転移酵素;およびネオマイシンリン酸転移酵素。最も好ましくは、優性選択可能なマーカーはネオマイシンリン酸転移酵素である。
とくに本発明の好ましい態様において、少なくとも1つのフレーム外の開始コドン(すなわち、ATG)は十分に障害されたコンセンサスコザクの開始コドンから上流に位置し、インフレームの停止コドンは上流の開始コドンと十分に障害されたコンセンサスコザクの開始コドンとの間に位置しない。本明細書において使用するとき、用語「停止コドン」はコードされた物質の翻訳が停止するようにアミノ酸をコードしないコドンを示すことを意味する;この定義は、とくに、伝統的な停止コドンTAA,TAGおよびTGAを包含する。本明細書において使用するとき、用語「インフレーム」および「フレーム外」は十分に障害されたコンセンサスコザクの開始に関係する。例えば、次の配列において:
配列の下線部分は十分に障害されたコンセンサスコザクを代表し(ここで「x」はヌクレオチドを表す)、そしてコドンGAC,CATおよびGGCはATG開始コドンに関して「インフレーム」のコドンである。上の線が引かれたヌクレオチドは、十分に障害されたコンセンサスコザクの開始コドンから上流にある「フレーム外」の開始コドンを表す。好ましくは、フレーム外の開始コドンは十分に障害されたコンセンサスコザクの開始コドンから約1000ヌクレオチド上流内、より好ましくは十分に障害されたコンセンサスコザクの開始コドンから約350ヌクレオチド上流内、最も好ましくは十分に障害されたコンセンサスコザクの開始コドンから約50ヌクレオチド上流内に存在する。好ましくは、フレーム外の開始コドンはコンセンサスコザクの一部分である。例えば、前述の配列はこの基準を満足する:−5ヌクレオチドはプリン(G)である:ヌクレオチド−6,−7および−8はフレーム外の開始コドン(ATG)をコードする;そしてヌクレオチド−11はプリン(A)である。
さらに、二次構造内の十分に障害されたコンセンサスコザク(すなわち、いわゆる「ステム−ループ」または「ヘアピン」)の利用は、優性選択可能なマーカーによりコードされるタンパク質の翻訳の障害に対して有益には実行可能である。このような態様において、十分に障害されたコンセンサスコザクの開始コドンは最も好ましくはステム−ループのステム内に位置する。
ここに開示する本発明のこれらの面を取り込んだとくに好ましい発現ベクターは「TCAE」、および「ANEX」および「NEOSPLA」ベクターと呼ぶ;とくに好ましいベクターはANEX1,ANEX2およびNEOSPLA3Fと呼ぶ。
本明細書に開示する本発明のこれらのおよび他の面を以下の節においてさらに詳細に記載する。
【図面の簡単な説明】
第1図は、コンセンサスコザクの関係する部分およびいくつかのとくに好ましい十分に障害されたコンセンサスコザク配列の関係する部分を示す;
第2図は、優性選択可能なマーカーとしてネオマイシンリン酸転移酵素を使用する、マウス/ヒトキメラ免疫グロブリンの発現のためにデザインされたベクターTCAE5.2およびANEX1(TCAE12)の模式的表示を提供し、ここで免疫グロブリン遺伝子はタンデム配置で配置されている;
第3図は、タンパク質の発現レベルとベクターTCAE5.2およびANEX1とを比較するヒストグラムドである;
第4図は、優性選択可能なマーカーとしてネオマイシンリン酸転移酵素を使用する、マウス/ヒトキメラ免疫グロブリンの発現のためにデザインされたベクターANEX2の模式的表示を提供し、ここで免疫グロブリン遺伝子はタンデム配置で配置されている;
第5図は、タンパク質の発現レベルについて、ベクターTCAE5.2、ANEX1およびANEX2を比較するヒストグラムドである;
第6図は、マウス/ヒトキメラ免疫グロブリンの発現のためにデザインされたNEOSPLAベクターの模式的表示を提供する;そして
第7A図、第7B図および第7C図は、タンパク質の発現レベルについて、ベクターTCAE5.2/NEOSPLA3F(第7A図)、ANEX2/NEOSPLA3F(第7B図);およびGK-NEOSPLA3F/NEOSPLA3F(第7C図)を比較するヒストグラムドである;
好ましい態様の詳細な説明
最も好ましくは、哺乳動物の発現ベクターの中に取り込まれた優性選択可能なマーカーの翻訳および開始を障害しそして、好ましいが、必ずしも必要ではないが、注目の遺伝子生産物のためのコード配列に共連鎖された、核酸配列の配置をここに開示する。好ましくは、優性選択可能なマーカーは少なくとも1つの天然または人工のイントロン挿入領域を有し、そして少なくとも1つの注目の遺伝子生産物は少なくとも1つのこのようなイントロン内に位置するDNAによりコードされる。このような配置は、なかでも、細胞当り当量のトランスフェクションされたプラスミドDNAから得られた生存可能なコロニーの数を減少するが、各クローンの中で発現された遺伝子生産物の量を増加することによって、注目の遺伝子生産物の発現効率を増加するという作用を有する。
簡素化おび提示の目的で、特許の開示のこの節の焦点は、マウス/ヒトキメラ免疫グロブリンの発現ベクターの中に取り込まれた、特定の優性選択可能なマーカーであるネオマイシンリン酸転移酵素に主として向けられるであろう。しかしながら、ここに開示する本発明は、これらの特定の系に限定されることを意図せず、また限定されるとして解釈すべきでないことを理解すべきである。その反対に、開示する本発明は、ベクターDNAが宿主細胞のDNAの中に組込まれる、哺乳動物の発現系に十分に適用可能である。
高いレベルのタンパク質を生産する哺乳動物細胞系(すなわち、「生産細胞系」)を生産するために当業者により利用されている最も好ましい方法の1つは、最も典型的には、外因性DNAを組込んだ細胞の選択を可能とする、「優性選択可能なマーカー」と呼ぶ、薬物耐性遺伝子を使用することによる、所望の遺伝子生産物をコードするDNA(すなわち、「外因性DNA」)のランダム組込みを包含する。再び述べると、例えば、薬物耐性遺伝子を包含する、外因性DNAを適切に取り込んだ細胞は対応する薬物に対する耐性を維持する。次いで、最も典型的には、所望の遺伝子生産物をコードするDNAとの共増幅(co-amplification)を、トランスフェクトされた細胞中で、やはり薬物耐性、例えば、ジヒドロ葉酸リダクターゼ(DHFR)遺伝子の場合においてメトトレキセート(MTX)に対する耐性、をコードする隣接する遺伝子(「増幅遺伝子」)を増幅することによって実施する。増幅される遺伝子は優性選択可能なマーカー遺伝子と同一であることができるか、あるいは別の遺伝子であることができる。(当業者は知るように、「トランスフェクション」は典型的には哺乳動物宿主細胞の中にプラスミドを導入するプロセスまたは状態を記憶するために利用するが、「形質転換」は典型的には細菌宿主細胞の中にプラスミドを導入するプロセスまたは状態を記載するために利用する)。
典型的には2つの増幅アプローチが当業者により使用される。第1において、トランスフェクトされた細胞および薬物耐性細胞の全体の集団(各細胞は薬物耐性をコードする遺伝子の少なくとも1つの組込みを含む)を増幅する;第2において、単細胞から誘導された個々のクローンを増幅する。各アプローチは独特の利点を有する。
第1のアプローチに関すると、個々のクローンと比較して全体の集団を増幅すること(典型的には「ショットガン」アプローチ、適切な記載)は多少「いっそう容易」である。なぜなら、個々のクローンの増幅は、最初に、なかでも、「高い」レベル、すなわち、最低の検出可能な発現レベルより3桁大きい大きさのレベルで所望の遺伝子生産物を分泌する1または2つの「大ざら(grail)」のコロニーを単離する努力において、数百の単離した哺乳動物のコロニー(各々は単細胞から誘導され、それらの大部分は発現プラスミドの単一のコピーの組込み体である)のスクリーニングを含むからである。これらの細胞は、また、発現プラスミドの単一のコピーの組込みを有することがしばしば見出される。さらに、個々のクローンの増幅は、すべてのトランスフェクトされた細胞の増幅に比較して、より少ないコピーの増幅された遺伝子を含有する生産細胞系を生ずる(典型的には、10〜20/500〜1000)。
第2のアプローチに関し、個々のクローンの増幅から誘導される生産細胞系は、1または2以上の薬物耐性のための遺伝子を含んで成るコロニーの選択のために使用される薬物および外因性遺伝子生産物のより低いレベルにおいて、典型的には誘導される(すなわち、メトトレキヤートおよびDHFRの場合において、5nM/1μM)。さらに、個々のクローンは典型的にはより短い期間で単離することができる(3〜6月/6〜9月)。
次いで理想的には、両方のアプローチの現実の利益は合同されるべきである;実質的レベルにおいて、これはスクリーニングすべきコロニーの数の減少、およびこれらのコロニーが分泌する生産物の量の増加を包含する。本発明はこの仕事を達成する。
プラスミドDNAの優性選択可能なマーカーのDNAが宿主細胞の細胞DNA内に組込まれる位置は、当業者は認識するように、優性選択可能なマーカーのタンパク質の発現レベルを決定する。優性選択可能なマーカーのDNAに共連鎖するか、あるいはその近くに位置する注目のタンパク質をコードする遺伝子の発現は、優性選択可能なマーカーのタンパク質の発現に比例すると仮定される。いかなる特定の理論にも拘束されたくないが、哺乳動物細胞において外因性DNAの組込みについて選択するために使用する遺伝子(すなわち、優性選択可能なマーカー)をその優性選択可能なマーカーの翻訳が障害されるようにデザインする場合、優性選択可能なマーカーの遺伝子生産物の過度の生産によりこのような障害を克服することができるプラスミドのみが、例えば、薬物スクリーニングプロセスに、生き残ることができると発明者は仮定した。外因性DNAを優性選択可能なマーカーと関連させることによって、優性選択可能なマーカーの遺伝子生産物の過度の生産は、関連する外因性DNAから誘導される遺伝子生産物の過度の生産をも生ずるであろう。仮定するアプローチに従うと、優性選択可能なマーカー遺伝子の翻訳の障害は必要であり、そしてこのような障害の道筋は遺伝子のコンセンサスコザク部分であった。
数百の脊椎動物mRNAを比較することによって、Marilyn Kozak,“Possible role of flanking nucleotides in recognition of the AUG initiator codon by eukaryotic ribosomes,”Nucl. Acids Res. 9:5233-5252(1981)および“Compilation and analysis of sequences from the translational start site in eukaryotic mRNAs,”Nucl. Acids Ros. 12:857-872(1984)は、高等真核生物における翻訳の開示のための次の「コンセンサス」配列を提案した:
(当業者は知るように、RNAにおいて、ウラシル、U、はデオキシヌクレオチドチミジン、T、を置換する)。「コンセンサスコザク」と呼ぶ、この配列において、最も高度に保存されるヌクレオチドは、上に大文字で示す、プリン、AおよびG、である;突然変異の分析によれば、これらの2つの位置が開始に最も強い影響を及ぼした。例えば、Kozak, M.“Effects of interoistronic length on the efficency of reinitiation of eukaryotic ribosomes.”Mol. Cell. Biol. 7/10:3438-3445(1987)を参照のこと。さらに、Kozakはコンセンサスコザク配列から上流の変更が翻訳に影響を与えることができることを決定した。例えば“Inflences of mRNA secondary structure on initiation by eukaryotic ribosomes.”PNAS 83:2850−2854(1986)。Kozakは、プレプロインスリンをコードしたいくつかのプラスミドにおいてコンセンサスコザクから上流の二次ヘアピン構造領域の「人工的」導入を記載している;安全なステムループ構造はプレプロインスリン遺伝子の翻訳を阻害し、プロインスリンの収率を85〜95%だけ減少することが実験的に決定された。
驚くべきことには、プリンA(ATG開始コドンと向かい合って−3)および(+1)をピリミジンに交換することによって、翻訳の障害が有意であることを本発明者は発見した;ネオマイシンリン酸転移酵素遺伝子についてのコンセンサスコザクをこのような変更に暴露するとき(下にいっそう詳しく説明するように)、G418耐性コロニーの数は有意に減少した;しかしながら、個々のG418耐性クローンにより発現される遺伝子生産物の量は有意に増加した。当業者が認識するように、これは発現系の効率を増加するという作用を有する。すなわち、スクリーニングーされるコロニーの数はより少なく、そして生存可能なコロニーの大部分は、通常得られるよりも有意に多い生産物を生産する。本発明者の仮定した理論の確証をこうして実験的に決定した。
前述したように、この特許の記録の目的で、「コンセンサスコザク」は次の配列を有する:
「部分的に障害されたコンセンサスコザク」は次の配列
を有し、そして開示および特許請求する「十分に障害されたコンセンサスコザク」は次の配列を有する:
ここで;「x」はアデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)またはチミジン(T)(RNAの場合において、ウラシル、U)から成る群より選択されるヌクレオチドであり;「P」はプリン、すなわち、AまたはGであり、「Py」はピリジン、すなわち、CまたはT/Uであり;ATGはアミノ酸メチオニン(Mol)をコードする普通の開始コドンである;数字の表示はATGコドンに関係する、すなわち、負の数字はATGから「上流」を示し、そして正の数字はATGから「下流」を示す;部分的に障害されたコンセンサスコザクについて、次の条件が適用可能である。−3またはび+1ヌクレオチドの一方のみがピリジンであり、例えば、−3がピリジンである場合、+1はプリンでなくてはならないか、あるいは−3がプリンである場合、+1はピリジンでなくてはならない。最も好ましくは、十分に障害されたコンセンサスコザクは、注目の遺伝子生産物をコードする外因性DNAに好ましくは共連鎖した(必ずしもこれは必要ではない)優性選択可能なマーカーの翻訳開始部位に関連する。ここにおいて使用するとき、「ヌクレオチド」は天然および合成のデオキシ−およびリボヌクレオチドならびに修飾されたデオキシ−およびリボヌクレオチド、すなわち、3′OH、5′OH、糖および/または複素環式塩基が修飾されている場合、ならびにホスフェート主鎖、例えば、メチルホスフェート、ホスホロチオエートおよびホスホロアミダイトの修飾を包含することを意味する。
優性選択可能なマーカーの遺伝子配列に関する情報は好ましくは既知である;しかしながら、全体の配列の代わりに、優性選択可能なマーカーの翻訳開始部位におけるヌクレオチド配列(またはアミノ酸配列)に関する情報は既知でなくてはならない。再び述べると、コンセンサスまたは部分的に障害されたコンセンサスコザクにおける変化を行うために、その配列を知らなくてはならない。コンセンサスまたは部分的に障害されたコンセンサスコザクを十分に障害されたコンセンサスコザク配列に変化することは、当業者によく知られている種々のアプローチにより達成することができ、このようなアプローチは次のものを包含するが、これらに限定されない:部位特異的突然変異およびプライマーに基づく増幅による突然変異(例えば、PCR);最も好ましくは、このような変化は好ましくはプライマーに基づく増幅による突然変異を経て達成される。この好ましさは、この仕事を達成するときの比較的「容易さ」、ならびにそれに関連する効率に主として基づく。提示の容易さのために、十分に障害されたコンセンサスコザクへの変化を達成するために最も好ましい手段を説明する。
本質的に、プライマーに基づく増幅による突然変異は増幅プロセスそれ自体の力に頼る−PCRは日常的に利用されるので、それに焦点を合わせる。しかしながら、他のプライマーに基づく増幅技術(例えば、リガーゼ連鎖反応など)を使用することができる。2つのPCRプライマーの一方(「突然変異のプライマー」)は、注目の優性選択可能なマーカーを取り込んだ転写カッセト内で十分に障害されたコンセンサスコザクを、生ずる増幅されたDNAが取り込むことを確実にする配列を取り込んでいる;他方のPCRプライマーは優性選択可能なマーカーの他の領域;優性選択可能なマーカーを取り込んだ転写カッセト;または転写カッセトからなるベクターに対して相補的である。例えば、コンセンサスコザクを含む優性選択可能なマーカーに対する相補体は次の配列(配列番号:1)を有することができるであろう:
十分に障害されたコンセンサスコザクをつくるために、突然変異用プライマーは次の配列を有することができるであろう(配列番号:2)(便宜上、配列番号:1を比較の目的で突然変異用プライマーの上に配置する):
明らかなように、相補性はプライマーにおいて欠如している(参照、「*」の記号)。PCR反応において過剰の突然変異用プライマーを利用することによって、コンセンサスコザクを含む配列を増幅するとき、生ずる増幅されたDNA生産物は突然変異を取り込み、こうして増幅されたDNA生産物が引き続いて増幅されるとき、突然変異体は優勢であるので、十分に障害されたコンセンサスコザクは増幅生産物の中に取り込まれるであろう。
2つの基準が突然変異用プライマーについて要求される。第1に、その長さは標的へのハイブリダイゼーションが生ずるように十分でなくてはならない。理解されるように、突然変異のプライマーは標的に対して100%相補的ではない。こうして、必要なハイブリダイゼーションを確実にするために十分な数の相補的塩基が要求される。好ましくは、突然変異のプライマーの長さは約15〜約60ヌクレオチド、より好ましくは約18〜約40ヌクレオチドであるが、より長いまたはより短いものも有効である。(突然変異用プライマーがまたフレーム外の開始コドンまたは二次構造を取り込むために利用される程度に、突然変異のプライマーの長さは対応して増加することができる)。第2に、突然変異のプライマー/標的の比は突然変異を「強制」するために十分に過剰でなくてはならない。好ましくは、突然変異のプライマー/標的の比は約250:1〜約5000:1、より好ましくは約400:1〜約2500:1、最も好ましくは約500:1〜約1000:1である。
PCR反応のパラメーターは技術水準の範囲内に十分に入ると考えられるので、その反応の特定の事項に関する詳細はここに記載しない;当業者はPCR技術を使用してこの種類の突然変異を達成することができる方法を既に認識していると信じられる。詳細な教示するのではなく、説明を提供する手段として上の事柄は提供された。
前述したように、十分に障害されたコンセンサスコザクは発現ベクターの一部分を形成する転写カッセトの中に組込まれた優性選択可能なマーカーの翻訳開始部位に関連することが最も好ましい。好ましい優性選択可能なマーカーは次のものを包含するがこれらに限定されない:単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ;アデノシンデアミナーゼ;アスパラギンシンセターゼ;サルモネラ(Salmonella)hisD遺伝子;キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(「XGPRT」);ヒグロマイシンBリン酸転移酵素;およびネオマイシンリン酸転移酵素(「NEO」)。最も好ましくは、優性選択可能なマーカーはNEOである。
優性選択可能なマーカーの単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼは、次の部分的に障害されたコンセンサスコザクを有すると報告されている:
Heller, S.“Insertinal Activities of a Promotorlcss Thymidine Kinase Gene,”Molec. & Cell. Biol. 8/8:3218-3302、第4図、ヌクレオチド764を参照のこと。+1プリン(G)をピリミジン(CまたはT/U)に変化させることによって、本明細書に定義するような十分に障害されたコザクが発生する(単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼの−3はピリミジンである)。+1プリンをピリミジンに変化させることはまた、コードされたアミノ酸をアラニン(GCT)からプロリン(CCT)またはセリン(TCT)に変化させる作用を有する;ヌクレオチドの変化から保存的アミノ酸の変化が生ずることが好ましい。こうして、アラニンからセリンへの変化はアラニンからプロリンへの変化よりもいっそう保存的なアミノ酸の変化であるので、TCTへの変化を行うことが好ましい。
ヒスチジノールデヒドロゲナーゼは他の優性選択可能なマーカーである。参照、Hartmen, S. C.およびMulligan, R. C.“Two dominant acting selectable Markers for gene transfer studies in mammalian cells,”PNAS 85:8047-8051(1988)。ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)のhisD遺伝子は、次の部分的に障害されたコンセンサスコザクを有する。
−3はプリンであるので、−3をピリミジン(CまたはT/U)に変化させると、十分に障害されたコンセンサスコザクが生ずる;理解されるように、これらのヌクレオチドは開始コドンから上流にあるので、この変化からアミノ酸への翻訳への衝撃は生じない。
ヒグロマイシンBリン酸転移酵素は他の優性選択可能なマーカーである;hph遺伝子について報告された配列(参照、Gritz, L.およびDavies, J.“Plasmid encoded hygromaycin B resistance:the sequence of hygromaycin B phosphotransferase gene and its expressing in Escherichia coli and Succharomyces cerevisiae ド”Gene 25:179-188、1983)は、コンセンサスコザクが
であることを示している。−3および+1の両方はプリンである;こうして−3および+1をピリミジンに変化させると、十分に障害されたコンセンサスコザクが生ずる(これは次のコードされたアミノ酸を生ずる:+1→C−グルタミン;+1→T−停止コドン。このコドンは開始コドンから下流にあるので、停止コドンTAAへの変化は達成させるべきではい)。
XGPRTは他の優性選択可能なマーカーである。報告されたXGPRTの部分的に障害されたコンセンサスコザクは次の配列を有する:
Mulligan, R. C.およびBerg, P.“Factors governing the expression of a bacterial gene in mammalian celles.”Molec. & Cell. Biol. 1/5:499-459(1981)、第6図を参照のこと。+1プリンをピリミジンに変化させることによって、十分に障害されたコンセンサスコザクがつくられる;コードされたアミノ酸(AGC−セリン)への作用は次の通りである:CGC−アルギニン;TGC−システイン。
アデノシンデアミナーゼ(ADA)もまた、優性選択可能なマーカーとして利用することができる。アデノシンデアミナーゼのための報告されたコンセンサスコザク配列は次の通りである:
Yeung, C. Y.ら、“Identification of functional murine adenosine deaminase cDNA clones by complementation in Escherichia coli,”J. Biol. Chem. 260/18:10299-10307(1985)、第3図を参照のこと。−3および+1の両方のプリンをピリミジンに変化させることによって、十分に障害されたコンセンサスコザク配列が生ずる。GCC(アラニン)に相当するコードされたアミノ酸はプロリン(CCC)またはセリン(TCC)に変化し、セリンへの変化が、この変化の保存的性質のために、好ましい。
アスパラギンシンセターゼについて報告された部分的に障害されたコンセンサスコザクは次の通りである:
Andrulis, I. L.ら、“Isolation of human cDNAs for asparagine synthetase and expression in Jensen rat sarcoma cells,”Mol. Cell. Biol. 7/7:2435-2443(1987)を参照のこと。+3プリンをピリミジンに変化させると、十分に障害されたコンセンサスコザクが生ずる。
ネオマイシンリン酸転移酵素のための部分的に障害されたコンセンサスコザク(これは上流のフレーム外の開始コドンを含む)は次の通りである:
+1プリンのピリミジンへの変化は十分に障害されたコンセンサスコザクをつくる作用を有する(コードされたアミノ酸イソロイシン、ATT、に対する変化は次の通りである:CTT−ロイシンおよびTTT−フェニルアラニン。ロイシンへの変化は、この変化の保存的性質のために、好ましい)。
以上の説明は限定を意図せず、また限定と解釈すべきではない;むしろ、開示された本発明に関して、以上の説明はいくつかのよく知られた優性の選択可能なマーカーの報告されたコンセンサスコザク配列または部分的に障害されたコンセンサスコザク配列における変化の同等の例を提供する努力において提示された。
前述したように、最も好ましい優性選択可能なマーカーはNEOである。NEOのためにとくに好ましい十分に障害されたコンセンサス配列は次の通りである:
ここで「x」はヌクレオチドである。配列番号:3は最も好ましい;そしてxxは好ましくはCCである。
十分に障害されたコンセンサスコザクを含むか、あるいは含まないことができる、他の転写カッセトは、開示しかつ特許請求する十分に障害されたコザクを含有する転写カッセトを含むベクターの中に組込むことができる;このような「他の転写カッセト」は典型的には遺伝子生産物の抑制の「増強」、「増幅」または「調節」を可能とするために利用される。例えば、ジヒドロ葉酸リダクターゼ(DHFR)遺伝子を使用する外因性DNAの共トランスフェクションが例である。このような細胞に提示される、抗葉酸薬物メトトレキセート(MTX)、DHFRの競合インヒビターのレベルを増加することによって、DHFR遺伝子の増幅を経てDHFR生産の増加は起こることができる。有益には、広範な量のフランキング外因性DNAもまた、増幅されるようになるであろう;したがって、発現可能なDHFR遺伝子と共直線的に挿入された外因性DNAも過度に発現されるようになるであろう。さらに、発現の調節を可能とする転写カッセトを利用可能である。例えば、RSウイルスLTR(T抗原によるフィードバック発現に対して不感受性)の指令下にSV40ts突然変異体の大きいT抗原遺伝子を配置することによって誘導された、温度感受性COS細胞が記載された。227 Science 23−28(1985)を参照のこと。これらの細胞はSV40oriからの複製を33℃において支持するが、40℃において支持せず、そしてトランスフェクションされたSV40oriを含有するベクターのコピー数の調節を可能とする。以上の事柄は限定を意図せず、また限定として解釈すべきではない:むしろ以上の事柄は開示した十分に障害されたコンセンサスコザクからなる発現ベクターの中に取り込むことができるカッセトの型の例示であることを意図する。当業者は、適用可能でありかつ有利に利用することができる、発現系の目的に関して、他の転写カッセトの特定の型を決定することができると信じられる。
とくに本発明の好ましい態様において、上に示したように、少なくとも1つのフレーム外の開始コドン(すなわち、ATG)が十分に障害されたコンセンサスコザクの開始コドンから上流に位置し、停止コドンはフレーム外の開始コドンと十分に障害されたコンセンサスコザクの開始コドンとの間に位置しない。フレーム外の開始コドンの意図は、実際に、優性選択可能なマーカーの翻訳をさらに障害することである。
本明細書において使用するとき、用語「停止コドン」は「ナンセンスコドン」、すなわち、コードされた物質の翻訳が停止コドンの領域において停止するように、20の天然アミノ酸のいずれもコードしないコドンを示すことを意味する。この定義は、とくに、伝統的停止コドンTAA,TAGおよびTGAを包含する。
本明細書において使用するとき、用語「フレーム外」は十分に障害されたコンセンサスコザクの開始コドンに関する。当業者は知るように、すべてのインフレーム配列について任意のDNA高分子(またはRNA高分子)において、2つのフレーム外配列が存在する。こうして、例えば、十分に障害されたコンセンサスコザクを取り込んだ次の配列
に関すると、インフレームコドンはトリプレット、例えば、gcA,TGe,cATおよびGgcにより分離されている;フレーム外コドンは、例えば、cAT,ATG,Gcc,ccA,ATGおよびTGgを包含するであろう。こうして、2つの開始コドン(大文字および下線を引いた)は十分に障害されたコンセンサスコザクの開始コドンに関しててフレーム外である。
このようなフレーム外の開始コドンを利用するとき、これは十分に障害されたコンセンサスコザクの開始コドンの約1000ヌクレオチド内、より好ましくは十分に障害されたコンセンサスコザクの開始コドンの約350ヌクレオチド内、最も好ましくは十分に障害されたコンセンサスコザクの開始コドンの約50ヌクレオチド内にあることが好ましい。
理解されるように、上流の配列は、前述の種類の増幅のプロトコールにおいて使用する突然変異用プライマーを使用して(最も好ましくは)、十分に障害されたコンセンサスコザクの開始コドンから上流に少なくとも1つのフレーム外配列の配置を達成するように操作することができる。
二次構造(すなわち、「ステムループ」または「ヘアピン」)内に位置する十分に障害されたコンセンサスコザクの開始コドンの利用は、優性選択可能なマーカーによりコードされるタンパク質の翻訳の障害のために有益には有効である。このような態様において、開始コドンはステムループ二次構造のステム内に位置することが好ましい。これらは、このような態様において、概略的例として、十分に障害されたコンセンサスコザクの開始コドンは次のように位置する:
(二次構造の一部分ではないフレーム外の開始コドンも表されている。)理解されるように、ステムループ内で、ステムに沿った相補性は、定義により、典型的には要求される。なかでも、このような二次構造の配列の中への導入、ならびに二次構造の安定性に関する情報に関する例示的方法については、Kozak, PNAs, 1986、前掲、を参照のこと。
前述したように、天然に見出されるイントロン挿入領域または人工的につくられたイントロン挿入領域をもつ優性選択可能なマーカーを利用しそして少なくとも1つの注目の遺伝子生産物をこの領域内に挿入することが好ましい。いかなる特定の理論にも拘束されたくないが、優性選択可能なマーカーに関する選択プロセスに生き残る生存可能なコロニーの数が減少するので、このような配置は発現効率を増加すると、本発明者は仮定する;選択プロセスに事実生き残るコロニーは、定義により、生き残りに必要なタンパク質を発現しており、そしてそれに関連して、注目の遺伝子生産物が発現されるより大きい傾向を有するであろう。さらに仮定されるように、イントロン挿入領域内の注目の遺伝子から転写されるRNAは優性選択可能なマーカーの転写(RNAの伸長)の完結を妨害する;したがって、優性選択可能なマーカーが細胞DNA内の組込まれる位置は、より大きい量のRNAが最初に転写される位置であるようである。
理解されるように、原核タンパク質は典型的にはスプライスおよびイントロンを含まない。しかしながら、発現ベクター技術のために好ましい優性選択可能なマーカーの大部分は原核系から誘導される。こうして、好ましいように、原核由来の優性選択可能なマーカーを利用するとき、注目の遺伝子を含有するイントロンの挿入のための位置をつくるために、遺伝子内に人工のスプライスを発生することがしばしば必要である。原核遺伝子中のスプライス部位の選択のために次のルールを設けるが、それらは真核遺伝子に容易に適用することができることに注意すべきである。
真核細胞中のメッセンジャーRNA前駆体のスプライシングのために一般のメカニズムは、Sharp, Philip A.,“Splicing of Messenger RNA Precursors”Science, 235:736-771(1987)(とくに、第1図参照)(これをここに引用によって加える)の中に描写および要約されている。Sharpに基づき、スプライスに必要な核酸配列における4つの最小の基準が存在する:(a)5′スプライスドナー;(b)3′スプライスアクセプター;(c)分岐点、および(d)ポリピリミジントラクト。5′スプライスドナーのためにコンセンサス配列は
であり、そして3′スプライスアクセプターについて、NCAG/G(ここで「/」記号はスプライス部位を示す)であると報告されている;Mount, S. M.“A Catalogue of Splice Junction Sequences”Nucl. Acids Res. 10/2:459−472(1992)(これをここに引用によって加える)参照。分岐点のためのコンセンサス配列、すなわち、5′スプライスドナーを使用する投げ縄の形成の位置はPyNPyPAPyとして報告されている;そして哺乳動物RNAスプライシングのための報告された好ましい分岐部位はTACTAACである(Zhuang, Y.ら“UACUAAC is the preferred branch site for mammalian mRNA aplicing”PNAS 86:2752−2756(1989)、これをここに引用によって加える)。典型的には、分岐点は5′スプライスドナーから少なくともほぼ70〜約80塩基対のところに位置する(この距離の上限について定義されていない)。ポリピリミジン道は典型的には約15〜約30塩基対でありそして最も典型的には分岐点および3′スプライスアクセプターにより境界される。
以上は天然に見出されるスプライシングメカニズムに自然が付与した基準の説明である。5′スプライスドナーと分岐点との間の塩基対の数に正確な上限は存在しないので、天然のイントロンが優性選択可能なマーカー内に存在する場合に、この領域内に注目の遺伝子生産物を挿入することが好ましい。しかしながら、前述したように、このようなイントロンは好ましい優性選択可能なマーカーの多くに事実存在しない;それ自体、人工のイントロンの利用は好ましくはこれらのマーカーとともに利用される。
人工のイントロンを発生するために、「スプライスドナー:スプライスアクセプター」部位は優性選択可能なマーカーのコード配列内に位置しなくてはならない。SharpおよびMontに基づいて、次の配列はスプライスドナー:スプライスアクセプター部位として機能することが最も好ましい−−CAGG(人工のスプライスはGG領域に存在する)。好ましい配列はAAGGである。
最も好ましい配列CAGGに焦点を合わせると、次のコドンおよびアミノ酸は人工のイントロン挿入領域の発生のために優性選択可能なマーカーのコーディング領域内に位置することができる:
(理解されるように、有効なアミノ酸残基を決定する同一のアプローチをAAGGの好ましい配列のために利用することができる)。スプライスドナー:スプライスアクセプター部位の誘導のために最も好ましいコドンのグループはグループAである。これらのアミノ酸配列がいったん位置すると、人工のイントロン挿入領域の発生のための有効な点を定めることができる。
好ましいNEO優性の選択可能なマーカーに焦点を合わせると、アミノ酸残基Bln Asp(コドングループA)はNEOの位置51および52に位置し、そしてアミノ酸残基Ala Arg(コドングループC)は位置172および173に位置する(理解されるように、多数のイントロン挿入領域を利用することができる)。NEOの残基50〜53に焦点を合わせると、核酸配列およびアミノ酸配列は次の通りである:
したがって、人工のイントロン挿入領域はNEOの残基51と52との間に発生させることができる。この領域は最も好ましくは分岐点、ポリピロミジントラクトおよび、好ましくは、注目の遺伝子生産物の挿入のための領域、すなわち、酵素の消化に修正可能な領域からなる。
2つの基準が人工のイントロン挿入領域のために重要である;5′スプライス部位の最初の2つの核酸残基(例えば、隣接するCAG)は最も好ましくはGTであり、そして3′スプライス部位最初の2つの核酸残基(例えば、隣接するG)は最も好ましくはAGである。
上に定義した基準を使用して、人工のイントロン挿入領域はNEOのアミノ酸残基51と52との間に存在した:
(この人工のイントロン挿入領域をつくるための方法に関する詳細は下の実施例に記載されている)。注目の遺伝子を取り込むことができる領域として、NotI部位をつくった。したがって、取り込みのとき、NEOの伝達の間に、問題の遺伝子生産物が「スプライス−アウト」されるように、注目の遺伝子生産物はNEOの残基51と52との間に位置する。
宿主細胞系は最も好ましくは哺乳動物起源である;当業者は、その中で発現すべき所望の遺伝子生産物に最もよく適する、特定の宿主細胞系を優先的に決定することができると信じられる。宿主細胞系の例は次のものを包含するが、これらに限定されない:DG44およびDX11癌)、CV1(サル腎臓系統)、COS(SV40T抗原をもつCV1の誘導体)、R1610(チャイニーズハムスター線維芽)BALBC/3T3(マウス線維芽)、IIAK(ハムスター腎臓系統)、SP2/O(マウス骨髄腫)、P3x633−Ag3.653(マウス骨髄腫)、BFA−1c1BPT(ウシ内皮細胞)、RAJI(ヒトリンパ球)および293(ヒト腎臓)。宿主細胞系は典型的には商業源、アメリカ組織菌株保存機関(American Tissue Culture Collection)から、あるいは発表された文献から入手可能である。
好ましくは、宿主細胞系はDG44またはSP2/Oである。それぞれ、Urland, G.ら、“Effect of gamma rays and the dihydrofolate reductase locus:deletions and inversions.”Som. Cell & Mol. Gen. 12/6:555-566(1986)およびShulman, M.ら、“A better cell line for making hybridomas secreting specific antibodies.”Nature 276:269(1978)参照のこと。最も好ましくは、宿主細胞系はDG44である。宿主細胞の中へのプラスミドのトランスフェクションは、当業者にとって利用可能な任意の技術により達成することができる。これらは次のものを包含するが、これらに限定されない:トランスフェクション(電気泳動およびエレクトロポレイション)、エンベロープドDNAとの細胞融合、マイクロインジェクション、および無傷のウイルスを使用する感染。Ridgway, A. A. G.“Mammalian Expression Vectors.”Chapter 24.2, pp.470-472 Vectors, RodrigezおよびDenhardt編(マサチュセッツ州ボストン、バッターワースス)を参照のこと。最も好ましくは、宿主の中へのプラスミドの導入はエレクトロポレイションを経る。
実施例
以下の実施例は、本発明の限定を意図せず、また限定として解釈すべきではない:実施例はここに開示する本発明の態様の適用可能性を証明することを意図する。開示する十分に障害されたコンセンサスコザク配列は前述したように広く適用することを意図する。しかしながら、提示の効率のために、十分に障害されたコンセンサスコザク配列のとくに好ましい態様の例示的使用は、後述するように、直列のキメラ抗体の発現ベクター(また、ここにおいて抗体の発現ベクターと呼ぶ)と組み合わせて利用する。
I.直列のキメラ抗体の発現(「TCAE」)ベクター
B細胞リンパ球は多能性幹細胞から発生しそして個体発生を通して抗体を分泌する十分に成熟した形質細胞系に進行する。この分野において「CD20」と呼ぶ、ヒトBリンパ球制限された分化抗原Bp35は、35,000ダルトンの細胞表面非グリコシル化リンタンパク質である;CD20は、初期の前B細胞の発生の間の細胞質μ重鎖の発現の直前に発現される。CD20は形質細胞の分化段階まで絶えず発現される。CD20分子は、細胞サイクルの開始および分化のために要求される活性化プロセスにおけるステップを調節する。CD20は新形成B細胞上の発現されるので、CD20はB細胞リンパ腫および白血病の治療のための有望な標的を提供する。免疫エフェクターメカニズムを経る溶解に対する造血腫瘍のアクセス可能性および感受性のために、CD20抗原は抗CD20抗体仲介治療のための標的としてことに適当である。抗CD20抗体仲介治療は、なかでも、同時継続米国出願第07/978,891号、及び 号、本願と同時に提出、に開示されている。利用する抗体は、哺乳動物細胞中で高いレベルで発現されるマウス/ヒトキメラ抗CD20抗体(「キメラ抗CD20」)である。この抗体はここに開示するベクター、すなわち、次のベクターを使用して誘導された:TCAE5.2;ANEX1;ANEX2;GKNEOSPLA3F;およびNEOSPLA3F(追加のベクター、TCAE8、もまた利用してキメラ抗CD20を誘導した。TCAE8は、NEO翻訳開始部位が部分的に障害されたコンセンサスコザクである以外、TCAE5.2と同一である。TCAE8は本願と同時提出の同時継続米国出願の記録に記載されている。)。
本件出願人が有する米国特許出願第07/912,292号の中に、なかでも、ヒト/旧世界(Old World)サルキメラ抗体が開示されている;その中に開示されている発明の態様はベクターTCAE6中のヒト/マカクキメラ抗CD4抗である(参照、米国特許出願第07/12,292号の第6図、および対応する論考)。TCAE6はTCAE5.2と実質的に同一である;TCAE6はヒトラムダ定常領域を含有するが、TCAE5.2はヒトカッパ一定領域を含有する。TCAE5.2およびANEX1(その特許記録においてTCAE12と呼ばれている)はヒト/旧世界サルキメラ抗体と組み合わせて利用できるベクターとして開示されている。TCAE5.2およびANEX1に関して米国特許出願第07/912,292号に記載されている比較のデータは、キメラ抗CD20抗体の発現に関するものである。
TCAE5.2はベクターCLDN、すなわち、ベクターRLDN10bの誘導体から誘導された(参照、253 Science 77−91, 1991)。RLDN10bはベクターTNDの誘導体である(7DNA 651−661, 1988参照)。すなわち、ベクター「族系統」は次の通りである:TND→RLDN10b→CLDN→TCAE5.2→ANEX1(「→」記号の使用は1つのベクターから次のものへの変化を達成するために必要な努力の指標として意図せず、またそのように解釈すべきでない;例えば、その反対に、CLDNからTCAE5.2を発生するために必要な工程の数および複雑さは広範であった)。
TNDはヒト組織プラスミノゲンアクチベーターの高いレベルの発現のためにデザインされた。RLDN10bは次の方法でTNDと異なる:ジヒドロ葉酸リダクターゼ(「DHFR」)の転写カッセト(プロモター、ネズミDHFR cDNA、およびポリアデニル化領域からなる)を組織プラスミノゲンアクチベーターカッセト(「t−PA発現カッセト」)とネオマイシンリン酸転移酵素(「NEO」カッセト)との間に配置されたので、すべての3つのカッセトは直列でありかつ同一の転写の向きであった。TNDベクターは、メトトレキセートMTXに応答するDHFR遺伝子の増幅について選択する前に、G418を使用するDHFR,NEOおよびt−PAを有する細胞についての選択を可能とした。DHFR遺伝子の前のプロモーターはマウスベータグロビン主要プロモーターに変化された(参照、3 Mol. Cell. Biol. 1246−1254, 1983)。最後に、異なる注目の遺伝子をポリリンカーの中に挿入することができるように、t−PA cDNAはポリリンカーにより置換された。TNDベクターのすべての3つの真核転写カッセト(t−PA,DHFR,NEO)は、制限エンドヌクレアーゼNotIを使用する消化により細菌プラスミドDNA(pUC19誘導体)から分離することができる。
CLDNは次の点でRLDN10bと異なる:ポリリンカーの前に位置するラウスLTRは、-581におけるSpeI部位から−16におけるSstIまで(これらの番号はCell参考文献からのものである)の、ヒトサイトメガロウイルスの直接初期の遺伝子プロモーターエンハンサー(「CMV」)、(参照、41 Cell 521, 1985)と置換された。
名称が示すように、TCAEベクターはキメラ抗体の高いレベルの発現のためにデザインされた。TCAE5.2は次の点でCLDNと異なる:
A,TCAE5.2は、3つ(3)ではなく、4つ(4)転写カッセトからなり、そしてこれらは直列の順序である、すなわち、ヒト免疫グロブリンの軽鎖は可変領域を欠く;ヒト免疫グロブリンの重鎖は可変領域;DHFR;およびNEOを欠く。各転写カッセトはそれ自身の真核プロモーターおよびポリアデニル化領域を含有する(TCAE5.2ベクターの線図的表示である第2図を参照されたい)。免疫グロブリンの重鎖の前のCMVプロモーター/エンハンサーは、-350におけるNheI部位から−16におけるSstIまで(番号はCell参考文献、前掲、からのものである)の、軽鎖の前のプロモーター/エンハンサーの切形バージョンである。
詳しくは、
1)ヒト免疫グロブリンの軽鎖の定常領域は、PCR反応によりcDNAの増幅を経て誘導された。TCAE5.2において、これはヒト免疫グロブリンの軽鎖のカッパ定常領域(Kabat数、アミノ酸108-214、アロタイプKm3)、およびヒト免疫グロブリンの重鎖のガンマ1定常領域(Kabat数、アミノ酸114-478、アロタイプGmla,Gmlz)であった。軽鎖は通常のヒト血液から単離された(IDEC Pharmaceuticals Corporation、カリフォルニア州ラジョラ);それからのRNAを使用してcDNAを合成し、次いでこれをPCR技術を使用して増幅した(プライマーはコンセンサスKabatに関して誘導された)。重鎖をRNAから調製したcDNAから単離し(PCR技術を使用して)これを引き続いてヒトIgG1ベクターでトランスフェクトされた細胞から誘導された(参照、3 Prot. Eng. 531, 1990);ベクターpNγ162)。2つのアミノ酸は単離されたヒトIgG1においてKabatにおけるコンセンサスアミノ酸配列に合致するように変化させた、すなわち:アミノ酸225をバリンからアラニンに変化させ(GTT→GCA)、そしてアミノ酸287をメチオニンからのリジンに変化させた(ATG→AAG);
2)ヒト免疫グロブリンの軽鎖および重鎖のカッセトは、免疫グロブリン鎖の分泌のための合成シグナル配列を含有する;
3)ヒト免疫グロブリンの軽鎖および重鎖のカッセトは、移行リーディングフレームを維持しそして免疫グロブリン鎖の中に通常見出されるアミノ酸を変更する、軽鎖および重鎖の免疫グロブリンの可変領域の挿入を可能とするユニークDNA制限部位を含有する;
4)DHFRカッセトはそれ自身の真核プロモーター(マウスのベータグロビン主要プロモーター、「BETA」)およびポリアデニル化領域(ウシ成長ホルモンのポリアデニル化、「BGH」)を含有した;そして
5)NEOカッセトはそれ自身の真核プロモーター(BETA)およびポリアデニル化領域(SV40初期ポリアデニル化、「SV」)を含有した。
TCAE5.2およびNEOカッセトに関すると、コザク領域はコンセンサスコザク(これは上流のClaI部位配列番号:7を含んだ)であった:
ANEX1(参照したケースにおいて以前にTCAE12と命名された)は、NEOカッセトにおいて、コザク領域が十分に障害されていた(配列番号:8)以外、TCAE12と同一である:
本件出願人の他の出願に開示されているように、十分に障害されたコンセンサスコザクの利用の衝撃は顕著であった:TCAE5.2に関して、細胞につき同一量のトランスフェクトされたプラスミドDNAからのANEX1 G418耐性コロニーの数の有意な(8倍の)減少(2エレクトロポレインションからの258/6エレクトロポレイションからの98)が存在した;そして、ANEX1クローンの各々において発現された共連鎖した遺伝子生産物の量の有意な増加が存在した。第3図(本件出願人の他の出願の第16図)のヒストグラムド参照すると、翻訳開始部位にコンセンサスコザクをもつネオマイシンリン酸転移酵素の遺伝子を含有するDNAの25μgの2エレクトロポレイションから258コロニーが誘導された。これらのコロニーのうちの二百一(201)は検出可能な遺伝子生産物(25ng/mlより少ないキメラ免疫グロブリン)を発現せず、そしてわずかに8コロニーが100ng/mlより多くを発現した。再び、第3図を参照すると、翻訳開始部位に十分に障害されたコンセンサスコザクをもつネオマイシンリン酸転移酵素の遺伝子を含有するDNAの25μgのANEX1についての6エレクトロポレイションから98コロニーが誘導された(統計学的に比較する値を発生するために6エレクトロポレイションを利用した;なぜなら、平均すると、ANEX1についての各エレクトロポレイションは約16コロニーを生じ、これに対してTCAE5.2については約129コロニー/エレクトロポレイションであったからである)。ANEX1コロニーの8つ(8)は検出可能な遺伝子を発現しなかった(25ng/mlより少ない)が、これらのコロニーのうちの62では100ng/mlより多く発現されていた;これらの62コロニーのうちで、ほぼ23では250ng/mlを超えて発現されており(23%)、6では1000ng/mlより多く発現されていた(6%)。
上の証拠は、なかでも、次の通りである:1)TCAE5.2とANEX1との間の差はNEO遺伝子のコザク翻訳開始部位に限定され、そして注目の遺伝子生産物(キメラ抗CD20抗体)はNEO遺伝子に共連鎖されたので、結果におけるこれらの差はコザク翻訳開始部位における差にのみ帰属されるという結論が導かれる;2)優性選択可能なマーカーと組み合わせた十分に障害されたコンセンサスコザクの利用は有意により少ない生存可能なコロニーを生ずるということが実験的に確証された;3)所望のDNA遺伝子に共連鎖した優性選択可能なマーカーと組み合わせた十分に障害されたコンセンサスコザクの利用は発現された遺伝子生産物の量を有意に増加するということが実験的に確証された。こうして、スクリーニングすべきコロニーの数は減少すると同時に発現される遺伝子生産物の量は増加した。
II.フレーム外開始配列の衝撃
概念的には、ANEX1の優性選択可能なマーカーの転写開始のそれ以上の障害は、ネオマイシンリン酸転移酵素開始コドンから上流の少なくとも1つのフレーム外ATG開始コドンの利用により実施することができた。このアプローチのさらに1工程取ると、そのステム内にneo開始コドン取り込んだ二次構造(「ヘアピン」)の利用は転写開始をさらに阻害すると推定されるであろう。こうして、フレーム外の開始コドン/十分に障害されたコンセンサスコザクを考慮して、この領域はこのような二次構造の可能性が増加するようにデザインされた。
前に示したように、ANEX1ベクター中のneo開始コドンのためのコザク領域は次の通りである:
ANEX1と同一であるが、neo開始コドンに関して上に識別した変化を取り込んだベクターのための所望の配列(ANEX2と呼ぶ)は次の通りである:
(フレーム外の開始コドンに下線が引かれている。)ANEX2の十分に障害されたコンセンサスコザクはANEX1と同一である。主要な差は上流のフレーム外の開始コドンを含むことである。可能な差はこの配列を含む二次構造の形成であり、次のように提案される:
肉太の配列、ATG、は上流のフレーム外の開始コドンである:二次構造の「ループ」部分はCLA I部位である;そして「T」および「C」(イタリックおよび肉太)の間の配列は十分に障害されたコンセンサスコザクの開始コドン(下線)である。
この変化を実施するために、PCR断片をANEX1中の抗CD20の中にXhoI(5520)〜ClaI(5901)においてクローニングした;第4図参照。プライマーは次の通りであった:
プライマー489の上線の部分はClaI部位である;下線の部分は十分に障害されたコンセンサスコザク翻訳開始部位である。
プライマー488の上線の部分はXhoI部位である。
これらのプライマーはABI 391 PCR MATETMDNA合成装置(Applied Biosystems、カリフォルニア州フォスターシティー)を使用して調製した。ホスホルアミダイトはクルアケム(Cruachem)(グアスゴウ、スコットアンド)から入手した:dA(bz)−製品No.20−8120−21;dG(ibu)−製品No.20−8110−21;dC(bz)−製品No.20−8130−21;T−製品No.20−8100−21。
これらのプライマーを使用するPCR反応のための条件は次の通りであった:大腸菌(E.coli)株GM48(ATCCから入手した)中で増殖させたプラスミド中のTCAE5.2中の2μl(「マイクロリットル」)の抗CD20を77μlの脱イオン水;2μlのプライマー488(64pmol);および4μlのプライマー489(56pmol)と混合した。次いで、変性工程(94℃、5分)および復元工程(54℃、5分)を実施した。その後、4μlの5mnのdNTPS(Promeg、ウイスコンシン州マディソン:dATP、製品No.U1201;dCTP、製品No.U1221;dGTP、製品No.U1211;dTTp、製品No.U1231)、1μlのPfu DNAポリメラーゼ(Stratagene、カリフォルニア州ラジョラ、製品No.600135、2.5U/ml)、および50μlの鉱油オーバーレイをそれに添加し、次いで30サイクルを実施し、各サイクルは次からなっていた:72℃、2分;94℃、1分;54℃、1分。この混合物の10μlをアガロースゲルの電気泳動(結果は示されていない)により分析した;単一のバンドが約400塩基対において見出された。
PCR生成物およびベクターを結合のために次のようにして調製した:大腸菌(E.coli)細菌株GM48中で増殖させたANEX1プラスミド中の抗CD20を次のようにClaIおよびXhoIで消化した:ANEX1中の20μlの抗CD20を10μlの10×NEB4緩衝液(New England Biolabs、マサチュセッツ州ベベリイ;以後、NEB);5μlのClaI(NEB、製品No.197S、60u)および64μlの脱イオン水と混合した。この混合物を37℃において一夜インキュベーションし、次いで5μlのXhoI(NEB、製品No.146S、100u)を添加しそして37℃において2時間インキュベーションした。生ずる物質を「ClaI/XhoI切断ANEX1」と表示する。ほぼ400塩基対のPCR断片を次のようにして調製しそしてClaIおよびXhoIで消化した:90μlのPCR断片を10μlの3M NaOAc;1μlの10%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS);および90μlのフェニル/CHCl3/イソアミルと混合した。この混合物を30分間撹拌し、次いで1分間回転(1700RPM)した。水性相を回転カラムに暴露し、これにより合計85μlの混合物が得られた。この混合物に、10μlの10×NEB4、1μlのウシ血清アルブミン(BSA、100×;NEB)、2μlのClaI(24u)、および2μlのXhoI(40u)を添加した。この混合物を37℃において2時間インキュベーションした。生ずる物質を「ClaI/XhoI切断PCR488/489」と表示する。両方のClaI/XhoI切断ANEX1およびClaI/XhoI切断PCR488/489をアガロースゲルの電気泳動により分析し、そして生ずるバンドは同一の相対位置において観測された(結果は示されていない)。
ClaI/XhoI切断PCR488/489およびClaI/XhoI切断ANEX1の結合を次のように達成した:1μlのtRNA(Sigma、ミゾリー州セントルイス、製品No.R−8508)を0.75μlのトリス−ヒドロキシメチルアミノメタンエチレンジアミン四酢酸(TE);および42μlのTE中の1μlの10%SDS:10μlの3M NaOAc;45μlのClaI/XhoI切断PCR488/489(約22.5ng);1:4希釈(25μl)のClaI/XhoI切断ANEX1(約32ng)と混合した。この混合物に、90μlのフェニル/CHCl3/イソアミルを添加し、次いで30秒間撹拌しそして1分間回転(1700RPM)した。水性相を新しい管に移し、次いで270μlの100%EtOH(−20℃)を添加し、10分間回転(12,000RPM)し、次いでさらに270μlの100%EtOH(−20℃)を添加し、そしてさらに1分間回転(13,000RPM)した。この混合物をスピード(Speed)VACTM中で乾燥し、そして17μlのTE、2μlのリガーゼ緩衝液(Promega、T4DNAリガーゼキット、製品No.M180)および1μlのリガーゼ(Promega、リガーゼキット)の中に再懸濁させた。この結合混合物を14℃において一夜インキュベーションした。20μlの結合混合物を10μlの3M NaOAc、1μlの10%SDS、69μlのTE、および90μlのフェニル/CHCl3/イソアミルと混合した。この混合物を30秒間撹拌し、次いで1分間回転(1700RPM)した。水性相を新しい管に移し、そして270μlの100%EtOH(−20℃)をそれに添加し、次いで10分間回転(1700RPM)した。この混合物をスピード(Speed)VACTM中で乾燥し、そして20μlのTEの中に再懸濁させた。再懸濁させた混合物の10μlを大腸菌(E.coli)X−L1 blueTM(Stratagene、カリフォルニア州ラジョラ)中で製造業者の使用説明書に従い形質転換した。10の細菌のコロニーを、アンピシリン(50μg/ml;Sigma、製品No.A−9393)を含むLBブロス(Gibco BRL、ニューヨーク州グランドアイランド、製品No.M27950B)の中に接種した。プロメガ(Promega)DNA精製システム(製品No.PR−A7100)を製造業者の使用説明書に従い使用して10培養物からプラスミドを単離した;これらのプラスミドは、以上の十分な量に依存して、ANEX2ベクターを構成していることがある。
ANEX2はneo開始部位から上流のHinfI部位(「GAATC」)を含む(neo開始コドンに関して−9〜−13);ANEX1はこのHinfI部位を含まない。推定上のANEX2、および前に精製したANEX1標準からなる精製したプラスミドを次のようにHinfI消化した:2μlの各単離物を8μlのHinfI消化緩衝液(15μlの10×NEB2緩衝液;15μlのHinfI(NEB、製品No.155S、10u/μl);および90μlのH2O)と混合した。この混合物を37℃において3時間インキュベーションし、そして各単離物をアガロースゲルの電気泳動により分析した(結果は示されていない);バンドの9つ(9)はANEX1標準と実質的に同一であり、1つ(1)はバンドのパターンのわずかの差を示した。この単一の単離物について、最初の2つのバンドは1691および670kBに存在した;ANEX1のHinfI消化した生成物について、最初の3つのバンドは1691,766、および670kBに存在した。単一の単離物について766kBにおける欠けているバンドはその中のHinfI部位の存在に帰属され、ANEX1への所望の変化がこのベクターの中に取り込まれたことを示した。このベクターを「ANEX2中の抗CD20(G1,K)」と表示し、そして一般に本発明者はANEX2と呼ぶ。
ANEX2中の抗CD20のエレクトロポレイションを次のように達成した:240μlのANEX2中の抗CD20 DNA(400μg)を100μlの10×NEB4緩衝液;100μlのStuI(NEB、製品No.187S、1000u);および560μlのTEと混合し、そして37℃において2時間インキュベーションした。次いでこの混合物を8回転カラム(各々125μl)の上に配置し、次いで110μlの10×NotI緩衝液(NEB);10μlのBSA;および20μlのNotI(NEB、製品No.189S、800u)を添加した。この混合物を37℃において3時間インキュベーションし、次いで120μlの3M NaOAcおよび12μlの10%SDSを添加した。この混合物を2本の撹拌管に移しそして500μlのフェニル/CHCl3/イソアミルを各々に添加し、次いで30秒間撹拌し、そして1分間回転(1700RPM)した。水性相を管から取り出し、そして3本の管の中に分離し、次いで各に−20℃の100%ETOHを添加し、次いで10分間回転(13,000RPM)した。その後、−20℃の100%ETOMを各管に添加し、次いで1分間回転(13,000RPM)した。次いで管をスピード(Speed)VACTM中で乾燥し、次いで内容物を無菌のフード中で100μlのTEの中に再懸濁させた。5マイクロリットル(5μl)の再懸濁させたDNAを995μlの脱イオン水と混合した(1:200の希釈)。光学密度を読み(OD=260)そして存在するDNAの量は0.75μg/μlであると計算された。25μgのDNAをエレクトロポレイションのために利用するために、32μlのDNAを利用した(25μgは前の実施例1においてTCAE5.2およびANEX1のために利用したDNAの量であったので、これを利用した)。DNAの1:200希釈物を形式的に「TE中のANEX2(25μg)中のStuI、NotI切断抗CD20」と呼び、そして一般に「ANEX2中の抗CD20」と呼んだ。
利用した宿主細胞はDG44 CHO(「CHO」)であった(参照、Urlaub, G.Somatic Cell, 1986、前掲)。100mlの6.6×105細胞/ml(84%)を1000RPMで2分間回転した。これらを50mlのスクロース緩衝化溶液で洗浄し、次いで1000RPMで5分間回転した;次いで物質を4.5mlのスクロース緩衝化溶液の中に再懸濁させた。その後、細胞をカウントし、そして0.4mlのCHO細胞(4.0×106細胞)をBTX無菌の使い捨てエレクトロポレイションクベット内のANEX2中の32μlの抗CD20と混合した。エレクトロポレイションのセットは次の通りであった:210ボルト;400マイクロファラデーのキャパシタンス;13オームの抵抗、BTX600TM電池マニュピュレーター(BTX、カリフォルニア州サンディエゴ)を使用した。9つ(9)エレクトロポレイションを実施した;実際の時間にわたって供給された実際の電圧は次の通りであった:1〜199V、4.23msec:2〜188V、4.57msec;3〜189V、4.24msec、4〜200V;4.26msec、5〜200V、4.26msec;6〜199V、4.26msec;7〜189V、4.59msec;8〜189V、4.57msec;9〜201V、4.24msec。(実施例Iに記載したように、実施したエレクトロポレイションの数の差は、3つの条件、TCAE5.2、ANEX1およびANEX2の各々について生活可能なコロニーの統計学的に有意な数を達成するための必要性に帰属された;各エレクトロポレイションのために使用したDNAの量(25μg)は各々について同一であり、そして同一数の細胞をエレクトロポレイションした。
その後、エレクトロポレイション物質を20mlのG418成長培地(CHO−S−SFM IIマイナスハイポキサンチンおよびチミジン(Gibco、グランドアイランド、NT, Form No.91−0456PK)50μMのハイポキサンチンおよび8μMのチミジンを含む)と混合した。この混合物をおだやかに撹拌し、次いで200μl/ウェルの混合物を96ウェルのプレート、各エレクトロポレイション(9)について1プレート、に入れた。エレクトロポレイション後第2日に開始し、第17日を通して、各ウェルの150μlを取り出し、そして400μg/mlのG418を含有する新鮮なG418成長培地の150μlをそれに添加した。コロニーを第25日に分析した。
121個のコロニーは抗CD20抗体を発現した(すなわち、13コロニー/エレクトロポレイション)。これらのうちで、63(52%)は250μg/mlを超えるタンパク質を発現した;63のうちで、20のコロニー(16.5%)は1000μg/mlを超えるタンパク質を発現した。121コロニーのうちの5(4.1%)のみは25μg/mlより少ないタンパク質を発現した。第5図は、ベクターTCAE5.2、ANEX1およびANEX2から誘導されたコロニーにつきタンパク質の発現を比較するヒストグラムドを提供する。
以上のデータが示すように、なかでも、ANEX1とANEX2との間におけるように、優性の選択可能なマーカーの転写開始に関連する十分に障害されたコンセンサスコザクから上流の少なくとも1つのフレーム外の開始コドンの使用は、共連鎖した遺伝子生産物を発現する生活可能なコロニーの数を減少し、そして発現された共連鎖遺伝子生産物の量を有意に増加する。
III.優性選択可能なマーカーの少なくとも1つの人工のイントロン挿入領域内の問題の遺伝子生産物の挿入の衝撃
さらにANEX2ベクター上に構成するとき、ANEX2のNEOコード領域のアミノ酸残基51と52との間に人工のスプライスを発生させ、次いでその中に抗CD20コード領域を挿入した。2つのこのようなベクターを発生させた:第1は、NEOのためのコンセンサスコザク配列を含むが、フレーム外の開始コドンを含まず、「GKNEOSPLA3F」と呼ぶ;第2は、十分に障害されたコンセンサスコザクおよびフレーム外の開始コドンを含み、「NEOSPLA3F」と呼ぶ。
GKNEOSPLA3FおよびNEOSPLA3Fの両方は、NEOのアミノ酸残基51と52との間に人工のイントロンを含有する:
下線が引かれている部分はNotI酵素で消化可能な配列を表す;なかでも、抗CD20のためのコード領域はこの領域内に挿入された。
いかなる特定の理論にも拘束されたくないが、優性選択可能なマーカーの人工のイントロン挿入領域内に注目の遺伝子を含める(例えば、NEO遺伝子)と、開示したGKNEOSPLA3FおよびNEOSPLA3Fベクターの場合において、抗CD20抗体を生産する生存可能なコロニーの数は有意に減少すると本発明者は仮定する。これは2つの点について予測される:第1に、抗体コード領域を転写しかつ正しくスプライス−アウトしそしてNEOを正しく翻訳することができるベクターのみがG418耐性である;第2に、各抗体カッセトはそれ自身のプロモーターおよびポリアデニル化領域を有するので、抗体の転写および翻訳はNEOの翻訳に対して独立である。
GKNEOSPLA3FおよびNEOSPLA3Fベクターは次の方法で構成した:
ANEX2中の抗CD20を次のようにNotIおよびXhoIで消化して、1503bpのNEOカッセトDNA断片を単離した(参照、第4図、「NotI 7023」と「XhoI 5520」との間):10μlのANEX2中の抗CD20を6μlの脱イオンH2O(「dH2O」):1μlのNotI酵素(NEB、製品No.189S);2μlの10×NotI消化緩衝液(NEB;酵素とともに提供される);および1μlのXhoI酵素(Promega、ウイスコンシン州マディソン、製品No.R4164)と混合した。この消化混合物を37℃において一夜インキュベーションした。生ずる消化したDNAを0.8%アガロースゲルの電気泳動により大きさで分画し、そして1503において移動する所望の断片を、pブルースクリプト(Bluescript)SK(−)プラスミド(Stratagene、カリフォルニア州ラジョラ)の中に挿入するために、グラス(Glass)MAXTM法(Gibco BRL、ニューヨーク州グランドアイランド、製品No.15590−011)により単離した。
pブルースクリプト(Bluescript)SK(−)は、ANEX2中の抗CD20について前述したのと同一の条件を使用して、NotIおよびXhoIにより二重消化によりNEOカッセトの受容のために前もって調製した。次いで消化したpブルースクリプト(Bluescript)SK(−)を70μlのdH2O;2μlのtRNA(Sigma、ミゾリー州セントルイス、製品No.R−8508);10μlの3M NaOAc;および300μlの100%ETOH(−20℃)の添加によるエタノール沈澱により集めた。次いで10分間回転(13,000RPM)し、上澄み液をデカンテーションし、70%ETOHですすぎ、液体をデカンテーションし、スピード(Speed)VACTM中で乾燥し、そして20μlの1×TEの中に再懸濁させた。
調製したpブルースクリプト(Bluescript)SK(−)ベクターの中へのNEOカッセトDNA断片の結合は、次のように達成した:10μlのNEODNA断片を6μlのdH2O;1μlの切断pブルースクリプト(Bluescript)SK(−)ベクターDNA;2μlの10×結合緩衝液(Promega、酵素とともに供給された);および1μlのT−4DNAリガーゼ(Promega、製品No.M1801)と混合し、次いで14℃において一夜インキュベーションした。pブルースクリプト(Bluescript)SK(−)ベクターDNAの調製について前述したように、結合したDNAをエタノール沈澱により集めた。
10μlの再懸濁させた結合DNAを、製造業者の使用説明書に従い、大腸菌(E.coli)XL−1BlueTM(Stratagene)の中に形質転換した。10の細菌コロニーをアンピシリン(50μg/ml;Sigma、製品No.A−9393)を含むLBブロス(Gibco BRL、製品No.M27950B)の中に接種した。プラスミドを、製造業者の使用説明書に従い、10の培養物からプロメガ(Promega)DNA精製システム(製品No.PR−A7100)で単離した;これらのプラスミドは上の適切性に依存してBlueNEO+と呼ぶプラスミドを含んでいることがある(BlueNEO+は次の手順の適切性のために確証された。)
BlueNEO+は、pブルースクリプト(Bluescript)SK(−)ベクター中にNEOカッセト断片DNAの結合したとき再形成されたNotI制限認識配列を含有する。この部位は次により破壊した;1μlのBlueNEO+を16μlのdH2O;2μlの10×NotI消化緩衝液(NEB);1μlのNotI酵素(NEB)と混合した。次いで37℃において2時間インキュベーションした。次いで、この消化したDNAを回転カラムの分画により精製して、15μlの最終体積を得た。この15μlのNotI消化DNAを、4μlの5×クレノー緩衝液(20mMのTris−HCl、pH8.0、100mMのMgCl2)および1μlのDNAポリメラーゼIの大きい(Klenow)断片(Promega、製品No.M2201)と混合することによって「平滑末端」とした。この混合物を室温において30分間インキュベーションした。次いで、平滑末端のDNAを回転カラムの分画により精製して、15μlの最終体積を得た。
最終DNAを17μlの1×TEの中に再懸濁させた以外、pブルースクリプト(Bluescript)SK(−)ベクターの中へのNEOカッセト断片DNAの結合と類似の方法で、平滑末端のDNAの結合を実施した。
結合後、17μlのDNAを2μlの10×NotI消化緩衝液および1μlのNotI酵素(NEB)と混合することによって、DNAをNotIを使用する第2回の消化に付した。消化を37℃において60分間進行させた。消化後、混合物を回転カラムの分画により精製して、15μlの最終体積を得た。
10μlの精製したDNAを、製造業者の使用説明書に従い、大腸菌(E.coli)XL−1BlueTM(Stratagene)の中に形質転換した。10の細菌コロニーをLBブロス(Gibco BRL、アンピシリン(50μg/ml;Sigma)を含む)の中に接種した。プラスミドを10の培養物からプロメガDNA精製システムで製造業者の使用説明書に従い単離した;これらのプラスミドは以上の適切性に依存してBlueNEO−と呼ぶプラスミドを含んでいることがある。(BlueNEO−は次の手順の適切性のために確証された。)
BlueNEO−はアミノ酸残基51および52のためのコドンをスパニングする独特PstI制御部位を含有する。BlueNEO−を次のように消化した:15μlのdH2O;1μlのBlueNEO−DNA、2μlの消化緩衝液3(NEB)および2μlのPstI酵素(NEB、製品No.140S)を含有する混合物を形成した。この混合物を37℃において3時間インキェベーションした。次いで消化したDNAを回転カラムの分画により精製した。次いで次の合成オリゴヌクレオチドをBlueNEO−のPstI粘着末端に結合した:
5′GGTAAGTGCGGCCCCTACTAACTCTCTCCTCCCTCCTTTTTCCTGCA3′(配列番号:12)およびその相補的配列:
5′GGAAAAAGGAGGGAGGAGAGAGTTAGTAGCGGCCGCACTTACCTGCA3′(配列番号:13)。このリンカーの挿入は、上に示したように、コンセンサス5′スプライスドナー部位(結合により)、次いでNotI部位、次いでコンセンサススプライス分岐点、次いで合成ポリピリミジン道、次いでコンセンサス3′スプライスアクセプターをつくる。
2μlのPstI線状化BlueNEO−DNAおよび14μl(175pmol)のアニーリングした相補的オリゴヌクレオチドを使用する以外、pブルースクリプト(Bluescript)SK(−)中へのNEOカッセトの結合について前述したように結合を実施した。
アプライド・バイオシステム(Applied Biosystems)391 PCR MATETM合成装置(Applied Biosystems、カリフォルニア州フォスターシティー)を使用して、以上(および以下)の合成オリゴヌクレオチドを化学的に合成した。
pブルースクリプト(Bluescript)SK(−)ベクターDNAの調製について前述したように、結合したDNAをエタノール沈澱により集めた。
10μlの再懸濁させた結合DNAを、製造業者の使用説明書に従い、大腸菌(E.coli)XL−1BlueTM(Stratagene)の中に形質転換した。10の細菌コロニーをアンピシリン(50μg/ml;Sigma)を含むLBブロス(Gibco BRL)の中に接種した。プラスミドを10の培養物からプロメガDNA精製システムで製造業者の使用説明書に従い単離した;これらのプラスミドは以上の適切性およびオリゴヌクレオチドの挿入の向きに依存してNEOSPLAおよび/またはNEOSPLA−と呼ぶプラスミドを含んでいることがある。
シクエナーゼ・バージョン(Sequenase Version)2.0 DNA配列決定キット(Unites States Biochemical、オハイオ州クレブランド、製品No.70770)を製造業者の使用説明書に従い使用する核酸の配列決定により、スプライス接合リンカーの向きの決定を実施した。6つの独立のプラスミド単離物内のリンカーの向きが決定されると、挿入された接合配列がNEO転写の方向に関して正しい前方の向きにあるように、NEOSPLAの同定を行った。
15μlのdH2O;1μlのNEOSPLA DNA:2μlの10×消化緩衝液(Promega、酵素とともに供給された);および2μlのXhoI酵素(Promega、製品No.R6161)の混合物を形成することによって、NEOSPLAをXhoIで消化した。この混合物を37℃において3時間インキュベーションし、次いで回転カラムの分画によりDNAを精製した。この部位の中に次の配列を有する自己相補的合成オリゴヌクレオチドを結合した:5′TCGATTAATTAA3′(配列番号:14)。この配列の挿入はXhoI部位をPacI制限部位に効果的に変化させる(配列番号:14において下線が引かれているように)。
2μlのXhoI線状化NEOSPLA−DNAおよび14μl(175pmol)のアニーリングした相補的オリゴヌクレオチドを使用する以外、pブルースクリプト(Bluescript)SK(−)中へのNEOカッセトの結合について前述したように結合を実施した。
pブルースクリプト(Bluescript)SK(−)ベクターDNAの調製について前述したように、結合したDNAをエタノール沈澱により集めた。
10μlの再懸濁させた結合DNAを、製造業者の使用説明書に従い、大腸菌(E.coli)XL−1BlueTM(Stratagene)の中に形質転換した。10の細菌コロニーをアンピシリン(50μg/ml;Sigma)を含むLBブロス(Gibco BRL)の中に接種した。プラスミドを10の培養物からプロメガDNA精製システムで製造業者の使用説明書に従い単離した;これらのプラスミドは以上の適切性に依存してNEOSPLA3と呼ぶプラスミドを含んでいることがある。(NEOSPLA3は次のプロセスの適切性のために確証された。)
ANEX2(G1,K)中の抗CD20は、5′末端におけるNotI部位および3′末端におけるXhoI部位により結合された抗CD20の軽鎖および重鎖の免疫グロブリンのカッセトおよびDHFRカッセトを含有する。15μlのdH2O、1μlのANEX2(G1,K)中の抗CD20DNA、2μlの10×消化緩衝液D(Promega、酵素とともに供給された);および2μlのXhoI酵素(Promega、製品No.R6161)の混合物を形成することによって、ANEX2(G1,K)中の抗CD20をXhoIで消化した。この混合物を37℃において3時間インキュベーションし、次いで回転カラムの分画によりDNAを精製した。この部位の中に次の配列を有する自己相補的合成オリゴヌクレオチドを結合した:5′TCGAAGCGGCCGCT3′(配列番号:15)。この配列の挿入はXhoI部位をNotI制限部位に効果的に変化させる(配列番号:15において下線が引かれているように)。
2μlのANEX2DNA中のXhoI線状化抗CD20および14μl(175pmol)のアニーリングした相補的オリゴヌクレオチドを使用する以外、pブルースクリプト(Bluescript)SK(−)中へのNEOカッセトの結合について前述したように結合を実施した。
pブルースクリプト(Bluescript)SK(−)ベクターDNAの調製について前述したように、結合したDNAをエタノール沈澱により集めた。
10μlの再懸濁させた結合DNAを、製造業者の使用説明書に従い、大腸菌(E.coli)XL−1BlueTM(Stratagene)の中に形質転換した。10の細菌コロニーをアンピシリン(50μg/ml;Sigma、製品No.A−9393)を含むLBブロス(Gibco BRL、製品No.M27950B)の中に接種した。プラスミドを10の培養物からプロメガDNA精製システム(製品No.PR−A7100)で製造業者の使用説明書に従い単離した;これらのプラスミドは以上の適切性に依存してANEX2(G1,K)中の抗CD20と呼ぶプラスミドを含んでいることがある。(これは次のプロセスの適切性のために確証された)。
6μlのdH2O;10μlのANEX2(G1,K)中の抗CD20;2μlの10×NotI消化緩衝液(NEB、NotI酵素とともに供給された);および2μlのNotI酵素(NEB)の混合物を形成することによって、ANEX2(G1,K)中の抗CD20で消化した。この混合物を37℃において3時間インキュベーションし、次いで0.8%アガロースゲルの電気泳動による大きさ分画を実施し、そして5515において移動する所望の断片をNEOSPLA3の中への挿入のためにグラス(Glass)MAX法により単離した。
16μlのdH2O;2μlの10×NotI消化緩衝液(NEB);1μlのNotI酵素(NEB)からなる混合物を使用してNotIで1μlのDNAを消化し、次いで37℃において2時間インキュベーションすることによって、抗CD20カッセトの受容のためにNEOSPLA3を前もって調製した。次いでこの消化したDNAを回転カラムの分画により精製して、15μlの最終体積を得た。
調製したNEOSPLA3ベクターの中への抗CD20DNA断片の結合は、次のように達成した:10μlの抗CD20断片DNAを6μlのdH2O:1μlの切断NEOSPLA3ベクターDNA;2μlの10×結合緩衝液(Promega、酵素とともに供給された);および1μlのT−4DNAリガーゼ(Promega)と混合し;次いで14℃において一夜インキェベーションした。pブルースクリプト(Bluescript)SK(−)ベクターDNAの調製について前述したように、結合したDNAをエタノール沈澱により集めた。
10μlの再懸濁させた結合DNAを、製造業者の使用説明書に従い、大腸菌(E.coli)XL−1BlueTM(Stratagene)の中に形質転換した。10の細菌コロニーをアンピシリン(50μg/ml;Sigma)を含むLBブロス(Gibco BRL)の中に接種した。プラスミドを、製造業者の使用説明書に従い、10の培養物からプロメガ(Promega)DNA精製システムで単離した;これらのプラスミドは上の適切性およびNEO転写に関する挿入された断片の相対的向きに依存しNEOSPLA3F中の抗CD20およびNEOSPLA3R中の抗CD20と呼ぶプラスミドを含んでいることがある。
抗CD20カッセトの挿入の向きの決定は、次のようにNEB緩衝液1+アセテート化BSA中のKpnIおよびSpeI(NEB、製品No.1335)を使用する二重消化により実施した:4μlのDNA;2μlのNEB緩衝液1;1μlのKpnI;1μlのSpeI;2μlのBSA;および10μlのdH2Oからなる混合物を形成した。この混合物を37℃において2時間インキュベーションし、次いで0.8%アガロースゲルの電気泳動の大きさ分画を実施した。独立のプラスミド単離物内の抗CD20挿入の向きが決定されたとき、挿入された配列がNEO転写に関して前方の向きであるように、NEOSPLA3F中の抗CD20の同定を行った。
5515bpの抗CD20断片は、SV40起点、キメラマウスヒト免疫グロブリン軽鎖転写カッセト、キメラマウスヒト免疫グロブリン重鎖転写カッセト、およびネズミジヒドロ葉酸リダクターゼ転写カッセトを含有する(参照、第4図)。
14μlのdH2O、1μlのNEOSPLA3F中の抗CD20、2μlの10×消化緩衝液1(NEB、酵素とともに供給された)、2μlの10×アセチル化BSA(NEB、KpnI酵素とともに供給された)、1μlのKpnI酵素、1μlのSpuI酵素(NEB、それぞれ、製品No.142Sおよび187S)から成る混合物をつくることによって、NEOSPLA3F中の抗CD20を狂KpnIおよびStuIで二重消化した。この混合物を37℃において3時間インキュベーションし、次いで0.8%アガロースゲルの電気泳動による大きさ分画を実施し、そして9368塩基対において移動する所望の断片を断片をグラス(Glass)MAX法により単離した。
DNAのPCR断片をTCAE5.2から発生させた。2つの次の合成オリゴヌクレオチドのプライマーをPCR反応において利用した:
5′プライマー5′GCA TGC GGT ACC GGA TCC ATC GAG CTA CTA GCT TTG C3′(配列番号:16);
3′プライマー5′CTG ACT AGG CCT AGA GCG GCC GCA CTT ACC TGC AGT TCA TCC AGG GC3′(配列番号:17)
配列番号:16の下線の部分はKpnI部位を表し、そして配列番号:17の下線の部分はStuI部位を表す。
PCR生成物をKpnIおよびStuIで消化し、次いで調製したNEOSPLA3F中の抗CD20の中に結合した。
調製したNEOSPLA3F中の抗CD20の中への627bpの結合は次のように達成された:
2μlのNEOSPLA3F中の抗CD20;1μlのSDS;1μlのtRNA(Sigma);11μlの3M酢酸ナトリウム(pH4.5)を混合した。この混合物のフェニル/クロロホルムイソアミル抽出後、270μlのエタノール(氷冷)の添加によりDNAを沈澱させ、そしてこれを13,000rpmにおいて10分間回転した。70%ETOHの洗浄後、DNAを16μlのTEの中に再懸濁させ、10μlのPCR断片DNAを6μlのdH2O、1μlのNEOSPLA3FベクターDNA中の切断抗CD20、2μlの10×結合緩衝液(Promega、酵素とともに供給された)および1μlのT−4DNAリガーゼ(Promega)と混合し、次いで14℃において一夜インキュベーションした。pブルースクリプト(Bluescript)SK(−)ベクターDNAの調製について前述したように、結合したDNAをエタノール沈澱により集めた。
10μlの再懸濁させた結合DNAを、製造業者の使用説明書に従い、大腸菌(E.coli)XL−1BlueTM(Stratagene)の中に形質転換した。10の細菌コロニーをアンピシリン(50μg/ml;Sigma、製品No.A−9393)を含むLBブロス(Gibco BRL、製品No.M27950B)の中に接種した。プラスミドを10の培養物からプロメガDNA精製システム(製品No.PR−A7100)で製造業者の使用説明書に従い単離した;これらのプラスミドは以上の適切性に依存してNEOSPLA3F中の抗CD20と呼ぶプラスミドを含んでいることがある。(確証はGKNEOSPLA3F/NEOSPLA3Fの異なる領域の配列の決定に基づいた。)
新しいプラスミドは、次の通りであるの遺伝子についてそのコザク配列におけるNEOSPLA3F中の抗CD20と異なる:
TCAE5ベクター(コンセンサスコザクをもつNEOからなる)、ANEX2ベクター(完全に障害されたコザク、および上流のフレーム外の開始配列をもつNEOからなる);NEOSPLA3F(NEOのアミノ酸51と52との間の人工のイントロン挿入領域を経て挿入された抗CD20;NEOは完全に障害されたコザクおよび上流のフレーム外の開始配列を有する);およびGKNEOSPLA3F(NEOのアミノ酸51と52との間の人工のイントロン挿入領域を経て挿入された抗CD20;NEOはコンセンサスコザクを有する)中の抗CD20の発現の比較分析。
二五(25)μgの各プラスミド(次のように消化した:TCAE5およびANEX2中の抗CD20−NotI:NEOSPLA3F中の抗CD20−PacI;GKNEOSPLA3F中の抗CD20−PacIおよびKpnI)を4×106CHO細胞の中にエレクトロポレイションした;これらの消化物を利用して、哺乳動物細胞中で発現された遺伝子を細菌中のプラスミドの成長に使用したDNAから分離した。消化、DNAのEtOH沈澱、およびその乾燥後、DNAは無菌のTEの中に1μg/μlの濃度で再懸濁させた。エレクトロポレイション条件は実施例IIに記載されている通りであったが、ただし230ボルトを利用しそして、エレクトロポレイション後、細胞とDNAとの混合物を室温において無菌の使い捨てエレクトロポレイションクベット中で10分間維持した。
エレクトロポレイション後、G418耐性コロニーの期待された頻度に基づいて、表Iに下に示すように、細胞を96ウェルの皿の中にプレートした(予備的実験から誘導されるように;データは示されていない):
(細胞にG418含有培地を第2,5,7,9,12,14,18,22,26,30および34日に供給した;コロニーからの上澄み液を免疫グロブリンについてアッセイしそしてコロニーはウェル中で第18,22,26,30および34日にコンフルエントとなった)。
第7A図〜第7C図は耐性のヒストグラムドを提供しそして特定のレベルにおける発現におけるコロニーの百分率を明らかにする。
ここにおいて提供された実施例は、特定のベクター、完全に障害されたコンセンサスコザク配列、優性の選択可能なマーカー、転写カッセト、および/または発現されたタンパク質に制限されるとして解釈すべきではない。完全に障害されたコンセンサスコザク、およびその利用は、ANEX1およびANEX2ベクターに限定されるとして解釈すべきではない。同様に、好ましい完全に障害されたコンセンサスコザク配列およびベクターは、それらが本発明者が権利を与えられる配列またはベクターのみであるという、実際のまたは意味する許可を、いかなる方法においても構成しない。本発明者は適用可能な特許法の下で完全な範囲の保護を受ける権利がある。完全に障害されたコンセンサスコザク配列を取り込んだ好ましいベクターは、これらのベクターからなるプラスミドを表示することによってこれらのベクターを特許請求する目的でANEX1およびANEX2について本発明者により同定され、そして抗CD20は、特許手続きの目的のための微生物の寄託の国際的認識ついてのブダベスト条約の規定に従い、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)(ATCC)米国20852マリイランド州ロックビレパークローンアヴェニュー12301に受託された。プラスミドはATCCにより1992年11月9日に試験され、そしてその日付で生活能力があると決定された。ATCCはこれらのプラスミドに次のATCC受託番号を割り当てた:69120(TCAE12(ANEX1)中の抗CD20)および69118(ANEX2(G1,K)中の抗CD20);この受託の目的で、これらのプラスミドを大腸菌(E.coli)の中に形質転換した。
本発明をそのある種の態様に関してかなり詳細に記載したが、本発明の教示の範囲内の地の態様が可能である。したがって、開示または以下の請求の範囲は、ここに含まれる好ましい態様の記載により限定されることを意図せず、また限定されると解釈すべきではない。
配列のリスト
(1)一般的情報
(i)出願人:レフ,ミッチェル E.
(ii)発明の名称:遺伝子生産物の発現の発現の増強のための改良された優性の選択可能なマーカー配列およびイントロン挿入戦略およびそれからなる発現ベクター系
(iii)配列の数:17
(iv)通信の住所:
(A)住所:IDECファーマシュティカル・マーポレーション
(B)通り:トレヤナロード11011
(C)市:サンディエゴ
(D)州:カリフォルニア
(E)国:米国
(F)郵便番号:92121
(v)コンピューター読取り可能なフォーム:
(A)媒体の型:ディスク、3.5インチ、1.44Mb
(B)コンピューター:マシントッシュ
(C)操作システム:MS,DOS
(D)ソフトウェア:マイクロソフト語5.0
(vi)現在の出願のデータ:
(A)出願番号:
(B)出願日:
(C)分類:
(viii)代理人の情報:
(A)名前:バーグーン,リチャード P.Jr.
(B)登録番号;34,787
(C)参照/処理番号:
(ix)通信の情報:
(A)TEL:(619)550 8500
(B)FAX:(619)550 8750
(2)配列番号:1についての情報:
(i)配列の特性:
(A)長さ:17塩基
(B)型:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(iii)ハイポセティカル:あり
(iv)アンチセンス:あり
(ix)配列:配列番号:1:
(3)配列番号:2についての情報:
(i)配列の特性:
(A)長さ:17塩基
(B)型:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(iii)ハイポセティカル:あり
(iv)アンチセンス:なし
(ix)配列:配列番号:2:
(4)配列番号:3についての情報:
(i)配列の特性:
(A)長さ:9塩基
(B)型:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(iii)ハイポセティカル:あり
(iv)アンチセンス:なし
(ix)配列:配列番号:3:
(5)配列番号:4についての情報:
(i)配列の特性:
(A)長さ:9塩基
(B)型:核酸
(C)鎖:一本鎖、ニックを含む
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(iii)ハイポセティカル:あり
(iv)アンチセンス:なし
(ix)配列:配列番号:4:
(6)配列番号:5についての情報:
(i)配列の特性:
(A)長さ:9塩基
(B)型:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(iii)ハイポセティカル:あり
(iv)アンチセンス:なし
(ix)配列:配列番号:5:
(7)配列番号:6についての情報:
(i)配列の特性:
(A)長さ:9塩基
(B)型:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(iii)ハイポセティカル:あり
(iv)アンチセンス:なし
(ix)配列:配列番号:6:
(8)配列番号:7についての情報:
(i)配列の特性:
(A)長さ:29塩基
(B)型:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(iii)ハイポセティカル:あり
(iv)アンチセンス:なし
(ix)配列:配列番号:7:
(9)配列番号:8についての情報:
(i)配列の特性:
(A)長さ:29塩基
(B)型:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(iii)ハイポセティカル:なし
(iv)アンチセンス:なし
(ix)配列:配列番号:8:
(10)配列番号:9についての情報:
(i)配列の特性:
(A)長さ:30塩基
(B)型:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(iii)ハイポセティカル:なし
(iv)アンチセンス:なし
(ix)配列:配列番号:9:
(11)配列番号:10についての情報:
(i)配列の特性:
(A)長さ:52塩基
(B)型:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(iii)ハイポセティカル:あり
(iv)アンチセンス:あり
(ix)配列:配列番号:10:
(12)配列番号:11についての情報:
(i)配列の特性:
(A)長さ:18塩基
(B)型:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(iii)ハイポセティカル:なし
(iv)アンチセンス:なし
(ix)配列:配列番号:11:
(13)配列番号:12についての情報:
(i)配列の特性:
(A)長さ:47塩基
(B)型:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(iii)ハイポセティカル:なし
(iv)アンチセンス:なし
(ix)配列:配列番号:12:
(14)配列番号:13についての情報:
(i)配列の特性:
(A)長さ:47塩基
(B)型:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(iii)ハイポセティカル:なし
(iv)アンチセンス:あり
(ix)配列:配列番号:13:
(15)配列番号:14についての情報:
(i)配列の特性:
(A)長さ:12塩基
(B)型:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(iii)ハイポセティカル:なし
(iv)アンチセンス:なし
(ix)配列:配列番号:14:
(16)配列番号:15についての情報:
(i)配列の特性:
(A)長さ:14塩基
(B)型:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(iii)ハイポセティカル:なし
(iv)アンチセンス:なし
(ix)配列:配列番号:15:
(17)配列番号:16についての情報:
(i)配列の特性:
(A)長さ:37塩基
(B)型:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(iii)ハイポセティカル:なし
(iv)アンチセンス:なし
(ix)配列:配列番号:16:
(18)配列番号:17についての情報:
(i)配列の特性:
(A)長さ:47塩基
(B)型:核酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:DNA(ゲノム)
(iii)ハイポセティカル:なし
(iv)アンチセンス:なし
(ix)配列:配列番号:17:
Claims (27)
- 組換えDNA技術により目的のタンパク質の発現をもたらすDNA構成物を含有し、そして前記目的のタンパク質を発現する真核性哺乳類細胞であって、前記DNA構成物は、当該真核性哺乳類細胞のゲノムに組み込まれており、変異した翻訳開始部位を有する少なくとも1個の優性選択可能マーカー遺伝子を含んで成り、この変異した翻訳開始部位は次の配列:
(ここで「Py」はピリジンヌクレオチドであり、「x」はヌクレオチドであり、ATGに隣接して直ぐ下流のPyxxは翻訳終止コドンではなく、そして数字の表示は「ATG」に対するものである)
を含んで成り、前記変異した翻訳開始部位を有する優性選択可能マーカー遺伝子は、前記変異を含まない翻訳開始部位を有する野生型優性選択可能マーカー遺伝子に比べて低下したレベルで翻訳され、そして前記変異した優性選択可能マーカー遺伝子は、前記DNA構成物中で目的タンパク質をコードする遺伝子に連鎖している、ことを特徴とする真核性哺乳類細胞。 - 前記優性選択可能なマーカーが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、アスパラギンシンターゼ、サルモネラ(Salmonella)hisD遺伝子、キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ヒグロマイシンBリン酸転移酵素、およびネオマイシンリン酸転移酵素から成る群より選択される、請求の範囲第1項記載の真核性哺乳類細胞。
- 前記翻訳開始部位の配列がTxxATGCxx,CxxATGCxx,CxxATGTxx、およびTxxATGTxxから成る群より選択され、ここで「x」はヌクレオチドであり、ただしATGコドンの下流のコドン「Txx」は停止コドンをコードしない、請求の範囲第1項記載の真核性哺乳類細胞。
- 前記翻訳開始部位の配列がTxxATGCxxであり、ここで「x」はヌクレオチドである、請求の範囲第1項記載の真核性哺乳類細胞。
- 前記翻訳開始部位の配列がTCCATGCTTである、請求の範囲第1項記載の真核性哺乳類細胞。
- 前記翻訳開始部位の配列がステム−ループ二次構造内に位置する、請求の範囲第1項記載の真核性哺乳類細胞。
- 前記DNA構成物が前記変異した翻訳開始部位のATG開始コドンの上流約1000ヌクレオチド内に少なくとも1つのフレーム外の開始コドンをさらに含み、ただし当該フレーム外開始コドンと前記変異した翻訳開始部位との間に、前記フレーム外開始コドンと同一のフレーム内の停止コドンが位置しない、請求の範囲第1項記載の真核性哺乳類細胞。
- 前記DNA構成物が前記変異した翻訳開始部位のATG開始コドンの上流約350ヌクレオチド内に少なくとも1つのフレーム外の開始コドンをさらに含み、ただし当該フレーム外開始コドンと前記変異した翻訳開始部位との間に、前記フレーム外開始コドンと同一のフレーム内の停止コドンが位置しない、請求の範囲第1項記載の真核性哺乳類細胞。
- 前記DNA構成物が前記変異した翻訳開始部位のATG開始コドンの上流約50ヌクレオチド内に少なくとも1つのフレーム外の開始コドンをさらに含み、ただし当該フレーム外開始コドンと前記変異した翻訳開始部位との間に、前記フレーム外開始コドンと同一のフレーム内の停止コドンが位置しない、請求の範囲第1項記載の真核性哺乳類細胞。
- 前記フレーム外の開始コドンがコンセンサスコザク(Kozak)配列の一部分である、請求の範囲第7,8又は9項記載の真核性哺乳類細胞。
- 前記フレーム外の開始コドンおよび前記翻訳開始部位の配列の両方が1つのステム−ループ二次構造の一部分として含まれている、請求の範囲第9項記載の真核性哺乳類細胞。
- 前記翻訳開始部位の配列が1つのステム−ループ二次構造の一部分であり、そして前記フレーム外の開始コドンが該ステム−ループ二次構造の一部分ではない、請求の範囲第7,8又は9項記載の真核性哺乳類細胞。
- 組換えDNA技術により目的のタンパク質の発現をもたらすDNA構成物を含有し、そして前記目的のタンパク質を発現する真核性哺乳類細胞であって、前記DNA構成物は、当該真核性哺乳類細胞のゲノムに組み込まれており、変異した翻訳開始部位を有する少なくとも1個の優性選択可能マーカー遺伝子を含んで成り、この変異した翻訳開始部位は、TxxATGCxx、CxxATGCxx、CxxATGTxx、及びTxxATGTxxから成る群から選択された配列を有し、ここで「x」はヌクレオチドであり、但し前記ATGコドンの下流の「Txx」は終止コドンをコードせず、前記変異は、前記変異を含まない野生型優性選択可能マーカー遺伝子に比べて低下したレベルでの翻訳をもたらし、そして前記変異した優性選択可能マーカー遺伝子は前記目的タンパク質をコードする遺伝子に連鎖している、ことを特徴とする真核性哺乳類細胞。
- 前記優性の選択可能なマーカーが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、アスパラギンシンセターゼ、サルモネラ(Salmonella)hisD遺伝子、キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ヒグロマイシンBリン酸転移酵素、およびネオマイシンリン酸転移酵素から成る群より選択される、請求の範囲第13項記載の真核性哺乳類細胞。
- 前記翻訳開始部位の配列がTxxATGCxxであり、ここで「x」はヌクレオチドである、請求の範囲第13項記載の真核性哺乳類細胞。
- 前記翻訳開始部位の配列がTCCATGCTTである、請求の範囲第13項記載の真核性哺乳類細胞。
- 前記翻訳開始部位の配列がステム−ループ二次構造内に位置する、請求の範囲第13項記載の真核性哺乳類細胞。
- 前記DNA構成物が前記変異した翻訳開始部位のATG開始コドンの上流約1000ヌクレオチド内に少なくとも1つのフレーム外の開始コドンをさらに含み、ただし当該フレーム外開始コドンと前記変異した翻訳開始部位との間に、前記フレーム外開始コドンと同一のフレーム内の停止コドンが位置しない、請求の範囲第13項記載の真核性哺乳類細胞。
- 前記DNA構成物が前記変異した翻訳開始部位のATG開始コドンの上流約350ヌクレオチド内に少なくとも1つのフレーム外の開始コドンをさらに含み、ただし当該フレーム外開始コドンと前記変異した翻訳開始部位との間に、前記フレーム外開始コドンと同一のフレーム内の停止コドンが位置しない、請求の範囲第13項記載の真核性哺乳類細胞。
- 前記DNA構成物が前記変異した翻訳開始部位のATG開始コドンの上流約50ヌクレオチド内に少なくとも1つのフレーム外の開始コドンをさらに含み、ただし当該フレーム外開始コドンと前記変異した翻訳開始部位との間に、前記フレーム外開始コドンと同一のフレーム内の停止コドンが位置しない、請求の範囲第13項記載の真核性哺乳類細胞。
- 前記フレーム外の開始コドンがコンセンサスコザク配列の一部分である、請求の範囲第18,19及び20項記載の真核性哺乳類細胞。
- 前記フレーム外の開始コドンおよび前記翻訳開始部位の配列の両方が1つのステム−ループ二次構造の一部分として含まれている、請求の範囲第20項記載の真核性哺乳類細胞。
- 前記翻訳開始部位の配列が1つのステム−ループ二次構造の一部分であり、そして前記フレーム外の開始コドンが前記ステム−ループ二次構造の一部分ではない、請求の範囲第18,19又は20項記載の真核性哺乳類細胞。
- ANEX1(アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)の受託番号69120内に含まれる)およびANEX2(アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)の受託番号69118内に含まれる)から成る群より選択される発現ベクター。
- 前記DNA構成物がプラスミドである、請求項1に記載の真核性哺乳類細胞。
- 前記変異した翻訳開始部位を有する優性選択可能マーカー遺伝子が、人工的イントロン性挿入領域を含んで成り、この挿入領域に前記目的タンパク質をコードするコード配列がそれ自体のプロモーター及びポリアデニル化領域と共に存在する、請求項1に記載の真核性哺乳類細胞。
- 前記変異した翻訳開始部位を有する優性選択可能マーカー遺伝子が、人工的イントロン性挿入領域を含んで成り、この挿入領域に前記目的タンパク質をコードするコード配列がそれ自体のプロモーター及びポリアデニル化領域と共に存在する、請求項13に記載の真核性哺乳類細胞。
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