KR20230048059A - 키메라 수용체를 발현하는 세포를 포함하는 의약 조성물 - Google Patents

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KR20230048059A
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도모유키 이가와
미카 사쿠라이
다카시 스즈키
가나코 다쓰미
슌 시미즈
šœ 시미즈
고지 다마다
유키미 사코다
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추가이 세이야쿠 가부시키가이샤
고쿠리츠다이가쿠호우진 야마구치 다이가쿠
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Abstract

본 발명에 의해, 항원 결합 분자의 투여와 조합하여 이용하기 위한, 키메라 수용체를 발현하는 세포를 포함하는 의약 조성물로서, 키메라 수용체는 세포외 도메인을 포함하고, 해당 세포외 도메인은, 면역 수용체의 세포외 도메인, 면역 수용체의 세포외 도메인 개변체, 또는 그의 단편을 포함하고, 항원 결합 분자는, 표적 항원 인식 부위 및 상기 면역 수용체를 인식하는 면역 수용체 인식 부위를 갖는 다중 특이성 항원 결합 분자인, 의약 조성물이 제공된다.

Description

키메라 수용체를 발현하는 세포를 포함하는 의약 조성물
본 발명은, 키메라 수용체, 키메라 수용체를 발현하는 세포, 및 당해 세포를 이용한 질환의 처치 방법, 예를 들어, 양자 세포 면역 요법, 특히 키메라 수용체를 발현하는 T 세포를 이용한 양자 세포 면역 요법에 관한 것이다.
키메라 항원 수용체(Chimeric Antigen Receptor: 이하 「CAR」이라고도 칭해진다)는, 세포 표면의 항원을 인식하는 항원 결합 분자와 면역 세포의 활성화를 유도하는 시그널 전달 영역을 인공적으로 융합시킨 키메라 단백질이다. 면역 세포에 CAR을 코딩하는 유전자를 도입하는 것에 의해, CAR을 발현하는 면역 세포가 제작된다. CAR 발현 세포는, 주요 조직 적합 유전자 복합체(MHC)와의 상호작용에 의존하지 않고, 표적 항원을 발현하는 세포에 대해 세포 상해성을 발휘하여, 양자 세포 면역 요법에 의한 암 등의 질환의 치료에 이용된다(비특허문헌 1).
CAR 유전자를 T 세포나 내추럴 킬러 세포에 도입한, CAR-T 세포나 CAR-NK 세포를 이용한 양자 세포 면역 요법의 임상 시험이, 전 세계에서 전개되고 있다. 특히, 백혈병이나 림프종 등의 조혈기 악성 종양에 대해서 유효성을 나타내는 결과가 얻어지고 있고, CD19를 항원으로 하는 CAR-T인 Kymriah(등록상표)(Novartis, tisagenlecleucel) 및 Yescarta(등록상표)(Gilead Sciences, axicabtagene ciloleucel)가 의약품으로서 승인되어 있다.
다양한 항원을 발현하는 표적 세포를 보편적으로 인식할 수 있는 면역 세포를 제작하기 위한 기술 확립은, 양자 세포 면역 요법을 범용화하는 데 있어서 중요한 임상적 의의를 갖는다. 지금까지, 그와 같은 연구에 관한 보고예가 있다(특허문헌 1∼5, 및 비특허문헌 2∼5).
또한, 암에 대한 다른 치료법으로서, 항원 결합 분자에 의해 내재성의 면역 세포를 활성화하여, 종양 면역을 부활화(賦活化)하는 방법이 개발되고 있다. 지금까지, 면역 체크포인트 분자인 CTLA-4, PD-1, 및 PD-L1을 저해하는 항체의 치료 효과가 보고되어 있고(비특허문헌 6∼7), 의약품으로서 승인되어 있다. 또한, 면역 세포 상에 발현하는 공자극 인자를 아고니스트 항체에 의해 활성화함으로써, 항종양 효과를 발현하는 것이 마우스 모델에서 실증되어 있다(비특허문헌 8). 더욱이, 면역 세포를 활성화하는 CD137 아고니스트 항체와 CAR-T를 공투여함으로써, 약효를 높이는 치료법이 고안되어 있다(특허문헌 6, 비특허문헌 9).
WO2012/082841 WO2016/040441 WO2017/161333 WO2018/002358 WO2018/177966 WO2019/140425
June CH and Sadelain M, N Engl J Med. (2018) 379, 64 Tamada et al, Clin Cancer Res. (2012) 18, 6436 Urbanska K et al, J Transl Med. (2014) 12, 347 Kudo K et al, Cancer Res. (2014) 74, 93 Karches CH et al, Clin Cancer Res. (2019) 25, 5890 Hodi FS et al, N Engl J Med. (2010) 363, 711 Robert C et al, N Engl J Med. (2015) 372, 320 Houot R et al, Blood. (2009) 114, 3431 Mardiana S et al, Cancer Res. (2017) 77, 1296
CAR을 이용한 양자 세포 면역 요법에 의한 암의 치료의 과제로서, 고형 암에 대한 치료 효과가 부족한 것을 들 수 있다. 이 원인으로서, 암 조직에 있어서의 개개의 암 세포 상에 발현하는 종양 항원이 불균일이기 때문에 단일의 표적 항원밖에 인식하지 않는 CAR 발현 세포가 모든 종양 세포를 인식할 수 없는 것에 더하여, 종양 미소 환경에 있어서의 면역 억제 기구가 생각된다. 이 과제를 해결하기 위한 전략으로서, CAR 발현 세포뿐만 아니라 내재성의 면역 세포를 활성화하여, 내재성의 면역 세포와 협조하여 항종양 효과를 발현시키는 것이 생각되고, 그를 위한 수단의 하나로서, 면역 세포를 활성화하는 CD137 아고니스트 항체와의 병용 요법이 생각된다. 그렇지만, 임상 및 비임상에 있어서, CD137 아고니스트 항체는 간장을 비롯한 비종양 조직에 있어서의 면역 세포의 활성화를 유도하여, 독성을 발현하는 것이 과제가 되고 있다.
또한, CAR을 이용한 양자 세포 면역 요법에 의한 암의 치료의 다른 과제로서, 이하의 점을 들 수 있다. 첫번째로, 종양 세포의 표면에 발현하는 종양 항원은, 암 세포마다 상이하기 때문에, CAR의 항원 인식 부위는 표적으로 하는 종양 항원마다 구축할 필요가 있다. 두번째로, CAR이 표적으로 하는 종양 항원은 치료에 의해 발현량이 저하되거나 돌연변이하거나 함으로써, 종양 항원 도피를 야기하는 경우가 있다. 현행의 CAR 발현 세포의 상당수는 단일의 표적 항원밖에 인식하지 않기 때문에, 종양 항원 도피는 치료 효과를 저하시킨다. 세번째로, 다양한 종양 항원에 대한 항원 결합 분자를 동정하고, 그것을 융합시킨 CAR 발현 세포를 수립하기 위한 경제적 비용이나 노동적 부담이 과제가 된다. 따라서, 다양한 복수의 표적 항원을 보편적으로 인식할 수 있고, 환자의 표적 항원 세포의 성상이나 치료 단계에 따라서, 인식하는 종양 항원을 변경하는 것이 가능한, 범용적인 CAR 발현 세포의 제작 및 그것을 이용한 치료 방법의 개발이 요구되고 있다.
본 개시는, 면역 수용체에 대해 아고니스트 활성을 발휘하는 부위 및 표적 항원을 인식하는 부위를 갖는 다중 특이성 항원 결합 분자와, 당해 항원 결합 분자에 의해 인식되는 면역 수용체를 세포외 도메인에 갖는 키메라 수용체가 형질 도입된 면역 세포를 조합한 치료법을 제공하는 것이다. 일 태양에 있어서, 본 개시에 있어서의 항원 결합 분자는 표적 항원을 발현하는 병변 부위에 집적되기 때문에, 그 아고니스트 활성은 병변 부위에서 선택적으로 발현되고, 결과로서 독성의 발현을 회피하는 것이 가능하다. 또한, 본 개시에 있어서의 키메라 수용체는, 종래형의 CAR과 달리 표적 항원에 대한 결합성을 갖지 않기 때문에, 본 개시에 있어서의 항원 결합 분자의 표적 항원에의 결합을 저해하지 않는 특징을 갖는다. 더욱이, 본 개시에 있어서의 키메라 수용체는, 본 개시에 있어서의 항원 결합 분자와의 결합성을 갖기 때문에, 항원 결합 분자 단제에 의해, 내재성의 면역 세포의 활성화와 키메라 수용체를 발현하는 면역 세포의 활성화를 동시에 유기(誘起)하는 것이 가능하다.
즉, 본 발명은 이하를 개시하는 것이다.
보다 구체적으로는, 본 개시의 하나의 측면에 있어서, 하기의 발명이 제공된다.
［1］ 항원 결합 분자의 투여와 조합하여 이용하기 위한, 키메라 수용체를 발현하는 세포를 포함하는 의약 조성물로서,
키메라 수용체는 세포외 도메인을 포함하고, 해당 세포외 도메인은, 면역 수용체의 세포외 도메인, 면역 수용체의 세포외 도메인 개변체, 또는 그의 단편을 포함하고,
항원 결합 분자는, 표적 항원 인식 부위 및 상기 면역 수용체를 인식하는 면역 수용체 인식 부위를 갖는 다중 특이성 항원 결합 분자인, 의약 조성물.
［2］ 키메라 수용체를 발현하는 세포의 투여와 조합하여 이용하기 위한, 항원 결합 분자를 포함하는 의약 조성물로서,
키메라 수용체는 세포외 도메인을 포함하고, 해당 세포외 도메인은 면역 수용체의 세포외 도메인, 면역 수용체의 세포외 도메인 개변체, 또는 그의 단편을 포함하고,
항원 결합 분자는, 표적 항원 인식 부위 및 상기 면역 수용체를 인식하는 면역 수용체 인식 부위를 갖는 다중 특이성 항원 결합 분자인, 의약 조성물.
［3］ 면역 수용체 인식 부위가, 키메라 수용체의 세포외 도메인 및 내인성의 면역 수용체를 인식하는, ［1］ 또는 ［2］에 기재된 의약 조성물.
［4］ 키메라 수용체의 세포외 도메인이, 내인성의 면역 수용체의 리간드와의 결합을 감약시킨 면역 수용체의 세포외 도메인 개변체 또는 그의 단편을 포함하는, ［1］∼［3］ 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
［5］ 면역 수용체가 공자극 분자인, ［1］∼［4］ 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
［6］ 면역 수용체가 인간 CD137인, ［1］∼［5］ 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
［7］ 키메라 수용체의 세포외 도메인이, 인간 CD137 세포외 도메인의 시스테인 리치 도메인 3 및 시스테인 리치 도메인 4의 일부 또는 전부를 적어도 결실시킨 인간 CD137 세포외 도메인 개변체 또는 그의 단편을 포함하는, ［1］∼［6］ 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
［8］ 키메라 수용체가 세포내 시그널 전달 도메인을 포함하고, 세포내 시그널 전달 도메인이 CD3제타의 세포내 시그널 전달 도메인을 포함하는, ［1］∼［7］ 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
［9］ 표적 항원이 수용체, 종양 항원, MHC 항원, 또는 분화 항원인, ［1］∼［8］ 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
［10］ 표적 항원이 종양 항원인, ［1］∼［9］ 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
［11］ 항원 결합 분자가 이중 특이성 항체인, ［1］∼［10］ 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
［12］ 암의 치료 또는 예방에 있어서 이용하기 위한, ［1］∼［11］ 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
［13］ 면역 수용체의 세포외 도메인, 면역 수용체의 세포외 도메인 개변체, 또는 그의 단편을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는, 키메라 수용체.
［14］ 키메라 수용체의 세포외 도메인이, 내인성의 면역 수용체의 리간드와의 결합을 감약시킨 면역 수용체의 세포외 도메인 개변체 또는 그의 단편인, ［13］에 기재된 키메라 수용체.
［15］ 면역 수용체가 공자극 분자인, ［13］ 또는 ［14］에 기재된 키메라 수용체.
［16］ 면역 수용체가 인간 CD137인, ［13］∼［15］ 중 어느 하나에 기재된 키메라 수용체.
［17］ 키메라 수용체의 세포외 도메인이, 인간 CD137 세포외 도메인의 시스테인 리치 도메인 3 및 시스테인 리치 도메인 4의 일부 또는 전부를 적어도 결실시킨 인간 CD137 개변체 또는 그의 단편을 포함하는, ［13］∼［16］ 중 어느 하나에 기재된 키메라 수용체.
［18］ 키메라 수용체가 세포내 시그널 전달 도메인을 포함하고, 세포내 시그널 전달 도메인이 CD3제타의 세포내 시그널 전달 도메인을 포함하는, ［13］∼［17］ 중 어느 하나에 기재된 키메라 수용체.
［19］ ［13］∼［18］ 중 어느 한 항에 기재된 키메라 수용체를 발현하는 세포.
［20］ ［19］의 세포를 포함하는 조성물.
［21］ ［13］∼［18］ 중 어느 하나에 기재된 키메라 수용체를 코딩하는 핵산.
［22］ ［21］에 기재된 핵산이 삽입된 벡터.
［23］ ［21］에 기재된 핵산 또는 ［22］에 기재된 벡터를 이용하여 세포를 트랜스펙트 또는 형질 도입하는 것을 포함하는, ［19］에 기재된 세포를 제조하는 방법.
［24］ 키메라 수용체가 막관통 도메인을 추가로 포함하는, ［1］∼［12］ 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물, 또는 ［13］∼［18］ 중 어느 하나에 기재된 키메라 수용체.
［A1］ 항원 결합 분자의 투여와 조합하여 이용하기 위한, 키메라 수용체를 발현하는 세포를 포함하는 의약 조성물로서,
키메라 수용체는, 세포외 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 시그널 전달 도메인을 포함하고, 해당 세포외 도메인은 면역 수용체의 세포외 도메인, 면역 수용체의 세포외 도메인 개변체, 또는 그의 단편을 포함하고,
항원 결합 분자는, 표적 항원 인식 부위 및 상기 면역 수용체를 인식하는 면역 수용체 인식 부위를 갖는 이중 특이성 항원 결합 부위를 포함하는, 의약 조성물.
［A2］ 키메라 수용체를 발현하는 세포의 투여와 조합하여 이용하기 위한, 항원 결합 분자를 포함하는 의약 조성물로서,
키메라 수용체는, 세포외 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 시그널 전달 도메인을 포함하고, 해당 세포외 도메인은 면역 수용체의 세포외 도메인, 면역 수용체의 세포외 도메인 개변체, 또는 그의 단편을 포함하고,
항원 결합 분자는, 표적 항원 인식 부위 및 상기 면역 수용체를 인식하는 면역 수용체 인식 부위를 갖는 이중 특이성 항원 결합 부위를 포함하는, 의약 조성물.
［A3］ 면역 수용체 인식 부위가, 키메라 수용체의 세포외 도메인 및 내인성의 면역 수용체를 인식하는, ［A1］ 또는 ［A2］에 기재된 의약 조성물.
［A4］ 키메라 수용체의 세포외 도메인이, 내인성 면역 리간드와의 결합을 감약시킨 면역 수용체의 세포외 도메인 개변체 또는 그의 단편을 포함하는, ［A1］∼［A3］ 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
［A5］ 면역 수용체가 공자극 분자인, ［A1］∼［A4］ 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
［A6］ 면역 수용체가 인간 CD137인, ［A1］∼［A5］ 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
［A7］ 키메라 수용체의 세포외 도메인이, 인간 CD137 세포외 도메인의 시스테인 리치 도메인 3 및 시스테인 리치 도메인 4의 일부 또는 전부를 적어도 결실시킨 세포외 도메인 개변체 또는 그의 단편을 포함하는, ［A1］∼［A6］ 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
［A8］ 세포내 시그널 전달 도메인이 CD3제타의 세포내 시그널 전달 도메인을 포함하는, ［A1］∼［A7］ 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
［A9］ 표적 항원이 수용체, 종양 항원, MHC 항원, 또는 분화 항원인, ［A1］∼［A8］ 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
［A10］ 표적 항원이 종양 항원인, ［A1］∼［A9］ 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
［A11］ 항원 결합 분자가 이중 특이성 항체인, ［A1］∼［A10］ 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
［A12］ 암의 치료 또는 예방에 있어서 이용하기 위한, ［A1］∼［A11］ 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
［A13］ 세포외 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 시그널 전달 도메인을 포함하고, 해당 세포외 도메인은 면역 수용체의 세포외 도메인, 면역 수용체의 세포외 도메인 개변체 또는 그의 단편을 포함하는, 키메라 수용체.
［A14］ 키메라 수용체의 세포외 도메인이, 내인성 면역 리간드와의 결합을 감약시킨 면역 수용체의 세포외 도메인 개변체 또는 그의 단편을 포함하는, ［A13］에 기재된 키메라 수용체.
［A15］ 면역 수용체가 공자극 분자인, ［A13］ 또는 ［A14］에 기재된 키메라 수용체.
［A16］ 면역 수용체가 인간 CD137인, ［A13］∼［A15］ 중 어느 하나에 기재된 키메라 수용체.
［A17］ 키메라 수용체의 세포외 도메인이, 인간 CD137 세포외 도메인의 시스테인 리치 도메인 3 및 시스테인 리치 도메인 4의 일부 또는 전부를 적어도 결실시킨 세포외 도메인 개변체 또는 그의 단편을 포함하는, ［A13］∼［A16］ 중 어느 하나에 기재된 키메라 수용체.
［A18］ 세포내 시그널 전달 도메인이 CD3제타의 세포내 시그널 전달 도메인을 포함하는, ［A13］∼［A17］ 중 어느 하나에 기재된 키메라 수용체.
［A19］ ［A13］∼［A18］ 중 어느 하나에 기재된 키메라 수용체를 발현하는 세포.
［A20］ ［A19］의 세포를 포함하는 조성물.
［A21］ ［A13］∼［A17］ 중 어느 하나에 기재된 키메라 수용체를 코딩하는 핵산.
［A22］ ［A21］에 기재된 핵산이 삽입된 벡터.
［A23］ ［A21］에 기재된 핵산 또는 ［A22］에 기재된 벡터를 이용하여 세포를 트랜스펙트 또는 형질 도입하는 것을 포함하는, ［A18］에 기재된 세포를 제조하는 방법.
［B1］ 질환의 치료 방법으로서,
치료를 필요로 하는 대상에게 유효량의 항원 결합 분자를 투여하는 것,
상기 대상에게 키메라 수용체를 발현하는 세포를 투여하는 것
을 포함하고,
키메라 수용체는 세포외 도메인을 포함하고, 해당 세포외 도메인은, 면역 수용체의 세포외 도메인, 면역 수용체의 세포외 도메인 개변체, 또는 그의 단편을 포함하고,
항원 결합 분자는, 표적 항원 인식 부위 및 상기 면역 수용체를 인식하는 면역 수용체 인식 부위를 갖는 다중 특이성 항원 결합 분자인, 상기 방법.
［B2］ 키메라 수용체가 막관통 도메인 및 세포내 시그널 전달 도메인을 추가로 포함하는, ［B1］에 기재된 방법.
［B3］ 면역 수용체 인식 부위가, 키메라 수용체의 세포외 도메인 및 내인성의 면역 수용체를 인식하는, ［B1］ 또는 ［B2］에 기재된 방법.
［B4］ 키메라 수용체의 세포외 도메인이, 내인성의 면역 수용체의 리간드와의 결합을 감약시킨 면역 수용체의 세포외 도메인 개변체 또는 그의 단편을 포함하는, ［B1］∼［B3］ 중 어느 하나에 기재된 방법.
［B5］ 면역 수용체가 공자극 분자인, ［B1］∼［B4］ 중 어느 하나에 기재된 방법.
［B6］ 면역 수용체가 인간 CD137인, ［B1］∼［B5］ 중 어느 하나에 기재된 방법.
［B7］ 키메라 수용체의 세포외 도메인이, 인간 CD137 세포외 도메인의 시스테인 리치 도메인 3 및 시스테인 리치 도메인 4의 일부 또는 전부를 적어도 결실시킨 인간 CD137 세포외 도메인 개변체 또는 그의 단편을 포함하는, ［B1］∼［B6］ 중 어느 하나에 기재된 방법.
［B8］ 키메라 수용체가 세포내 시그널 전달 도메인을 포함하고, 세포내 시그널 전달 도메인이 CD3제타의 세포내 시그널 전달 도메인을 포함하는, ［B1］∼［B7］ 중 어느 하나에 기재된 방법.
［B9］ 표적 항원이 수용체, 종양 항원, MHC 항원, 또는 분화 항원인, ［B1］∼［B8］ 중 어느 하나에 기재된 방법.
［B10］ 표적 항원이 종양 항원인, ［B1］∼［9］ 중 어느 하나에 기재된 방법.
［B11］ 항원 결합 분자가 이중 특이성 항체인, ［B1］∼［B10］ 중 어느 하나에 기재된 방법.
［B12］ 질환이 암인, ［B1］∼［B11］ 중 어느 하나에 기재된 방법.
［B13］ 암이, 원발성 또는 전이성 흑색종, 흉선종, 림프종, 육종, 폐암, 결장직장암, 간장암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 백혈병, 자궁암, 자궁경부암, 방광암, 신장암, 및 선암, 예를 들어 유방암, 전립선암, 난소암, 및 췌장암으로부터 선택되는, ［B12］에 기재된 방법.
［C1］ 질환의 치료 방법으로서,
치료를 필요로 하는 대상에게 유효량의 항원 결합 분자를 투여하는 것,
상기 대상에게 키메라 수용체를 발현하는 세포를 투여하는 것
을 포함하고,
키메라 수용체는, 세포외 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 시그널 전달 도메인을 포함하고, 해당 세포외 도메인은 면역 수용체의 세포외 도메인, 면역 수용체의 세포외 도메인 개변체, 또는 그의 단편을 포함하고,
항원 결합 분자는, 표적 항원 인식 부위 및 상기 면역 수용체를 인식하는 면역 수용체 인식 부위를 갖는 이중 특이성 항원 결합 부위를 포함하는, 상기 방법.
［C2］ 키메라 수용체가 막관통 도메인 및 세포내 시그널 전달 도메인을 추가로 포함하는, ［C1］에 기재된 방법.
［C3］ 면역 수용체 인식 부위가, 키메라 수용체의 세포외 도메인 및 내인성의 면역 수용체를 인식하는, ［C1］ 또는 ［C2］에 기재된 방법.
［C4］ 키메라 수용체의 세포외 도메인이, 내인성 면역 리간드와의 결합을 감약시킨 면역 수용체의 세포외 도메인 개변체 또는 그의 단편을 포함하는, ［C1］∼［C3］ 중 어느 하나에 기재된 방법.
［C5］ 면역 수용체가 공자극 분자인, ［C1］∼［C4］ 중 어느 하나에 기재된 방법.
［C6］ 면역 수용체가 인간 CD137인, ［C1］∼［C5］ 중 어느 하나에 기재된 방법.
［C7］ 키메라 수용체의 세포외 도메인이, 인간 CD137 세포외 도메인의 시스테인 리치 도메인 3 및 시스테인 리치 도메인 4의 일부 또는 전부를 적어도 결실시킨 세포외 도메인 개변체 또는 그의 단편을 포함하는, ［C1］∼［C6］ 중 어느 하나에 기재된 방법.
［C8］ 세포내 시그널 전달 도메인이 CD3제타의 세포내 시그널 전달 도메인을 포함하는, ［C1］∼［C7］ 중 어느 하나에 기재된 방법.
［C9］ 표적 항원이 수용체, 종양 항원, MHC 항원, 또는 분화 항원인, ［C1］∼［C8］ 중 어느 하나에 기재된 방법.
［C10］ 표적 항원이 종양 항원인, ［C1］∼［C9］ 중 어느 하나에 기재된 방법.
［C11］ 항원 결합 분자가 이중 특이성 항체인, ［C1］∼［C10］ 중 어느 하나에 기재된 방법.
［C12］ 암의 치료 또는 예방에 있어서 이용하기 위한, ［C1］∼［C11］ 중 어느 하나에 기재된 방법.
［C13］ 암이, 원발성 또는 전이성 흑색종, 흉선종, 림프종, 육종, 폐암, 결장직장암, 간장암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 백혈병, 자궁암, 자궁경부암, 방광암, 신장암, 및 선암, 예를 들어 유방암, 전립선암, 난소암, 및 췌장암으로부터 선택되는, ［C12］에 기재된 방법.
[도 1] 도 1은, 면역 수용체에 대해 아고니스트 활성을 발휘하는 항원 결합 분자(예로서 이중 특이성 항체)와, 당해 항원 결합 분자에 의해 인식되는 면역 수용체를 세포외 도메인에 갖는 키메라 수용체가 형질 도입된 면역 세포를 조합한 치료법의 개념도이며, 키메라 수용체 발현 세포에 더하여 내재성 면역 세포를 동원하는 본 발명의 특징을 나타내는 도면이다.
[도 2] 도 2는, 키메라 수용체 CD137-CD8-CD28-CD137-CD3제타(CD137-CR1), trCD137-CD8-CD28-CD137-CD3제타(trCD137-CR) 및 CD137-CR1과 비교하여, CD137의 세포외 도메인에 I64R 및 V71R 변이를 갖는 키메라 수용체 CD137-CR2를 나타내는 모식도이다.
[도 3] 도 3은, 실시예 3-1에 기재된 pCDH-CD137-CR1을 발현하는 렌티바이러스 벡터 구축물 및 5＇말단으로부터 3＇말단으로의 프레임 단위의 구성 요소의 서열 순서의 개략도이다.
[도 4] 도 4는, 실시예 3-4에 기재된 리포터 어세이에 의한, 표적 항원으로서 인간 GPC3을 발현한 세포와, 항GPC3 항체와 항CD137 항체로 이루어지는 이중 특이성 항체와 공배양했을 때의 CD137-CR1 Jurkat 세포의 활성화능의 평가 결과를 나타내는 도면이다. 가로축은 이중 특이성 항체(H0000-F760nN17/GL4-k0a//hCD137VH-F760mnP17/hCD137VL-k0)의 농도, 세로축은 루시페라제의 발광 강도를 나타낸다.
[도 5] 도 5는, 실시예 3-5에 기재된 리포터 어세이에 의한, 표적 항원으로서 인간 GPRC5D를 발현한 세포와, 항GPRC5D 항체와 항CD137 항체로 이루어지는 이중 특이성 항체와 공배양했을 때의 CD137-CR1-copGFPJurkat 세포의 활성화능의 평가 결과를 나타내는 도면이다. 2종의 이중 특이성 항체, 즉, GPA0018H-F760mnN17/GPA0018L-k0C//hCD137VH-F760mnP17/hCD137VL-k0(GPA0018/CD137), GPA0039H-F760mnN17/GPA0039L-k0C//hCD137VH-F760mnP17/hCD137VL-k0(GPA0039/CD137)를 이용하고, 가로축은 그 존부를 나타내고, 세로축은 루시페라제의 발광 강도를 나타낸다.
[도 6] 도 6은, 실시예 3-6에 기재된 리포터 어세이에 의한, 표적 항원으로서 인간 IL-6R을 발현한 세포와, 항IL-6R 항체와 항CD137 항체로 이루어지는 이중 특이성 항체와 공배양했을 때의, 키메라 수용체를 발현하지 않고 copGFP만 발현하는 NFAT-RE-luc2 Jurkat 세포(copGFP) 및 CD137-CR1-copGFP Jurkat 세포(CD137-CR1)의 활성화능의 평가 결과를 나타내는 도면이다. 가로축은 이중 특이성 항체(MRAH.v1-F760mnN17/MRAL.v1-k0.v1//hCD137VH-F760mnP17/hCD137VL-k0)의 존부를 나타내고, 세로축은 루시페라제의 발광 강도를 나타낸다.
[도 7] 도 7은, 실시예 4-1에 기재된 pMSGV1-CD137-CR1을 발현하는 레트로바이러스 벡터 구축물 및 5＇말단으로부터 3＇말단으로의 프레임 단위의 구성 요소의 서열 순서의 개략도이다.
[도 8a] 도 8a는, 실시예 4-4에 기재된, 인간 간암 세포주(SK-Hep-1)와, 표적 항원으로서 인간 GPC3을 발현한 SK-pca60 세포가 이용되고, 3종의 이중 특이성 항체(항GPC3 항체와 항KLH 항체, 항KLH 항체와 항CD137 항체, 항GPC3 항체와 항CD137 항체로 이루어진다)와 공배양했을 때의, 잔존 종양 세포수를 지표로 한 CD137-CR1-eGFP 발현 T 세포의 세포 상해 활성의 평가를 행한 결과를 나타내는 그래프이다. 세로축에 잔존 종양 세포수를 나타내고, 가로축에 3종의 이중 특이성 항체의 존부를 나타낸다.
[도 8b] 도 8b는, 실시예 4-5에 기재된, 인간 간암 세포주(SK-Hep-1)와, 표적 항원으로서 인간 GPC3을 발현한 SK-pca60 세포가 이용되고, 항GPC3 항체와 항CD137 항체로 이루어지는 이중 특이성 항체와 공배양했을 때의, xCELLigence 시스템을 이용한 CD137-CR1-eGFP 발현 T 세포의 세포 상해 활성의 평가를 행한 결과를 나타내는 그래프이다. 이펙터 세포 대 표적 세포(E:T)의 비율 및 이중 특이성 항체의 존부를 바꾸어(도 8b에서는 「항체 있음」, 「항체 없음」이라고 표기한다) 평가하고 있다. 세로축에 세포 증식 활성(%)을 나타내고, 가로축에 이펙터 세포 및 항체를 첨가하고 나서의 일수를 나타낸다.
[도 9] 도 9는, 리간드를 발현하는 세포와의 결합에 의한, 키메라 수용체 발현 세포의 표적 항원 비의존적인 활성화 메커니즘을 나타내는 모식도이다.
[도 10] 도 10은, 실시예 6-4에 기재된 리포터 어세이에 의한, 표적 항원으로서 인간 GPC3을 발현한 세포와, 항GPC3 항체와 항CD137 항체로 이루어지는 이중 특이성 항체와 공배양했을 때의 trCD137-CR-copGFP Jurkat 세포(trCD137-CR)의 활성화능의 평가를 행한 결과를 나타내는 그래프이다. 가로축은 이중 특이성 항체(H0000-F760nN17/GL4-k0a//hCD137VH-F760mnP17/hCD137VL-k0)의 농도, 세로축은 루시페라제의 발광 강도를 나타낸다.
[도 11] 도 11은, 실시예 7-4에 기재된 리포터 어세이에 의한, 표적 항원으로서 인간 GPC3을 발현한 세포와, 항GPC3 항체와 항CD137 항체로 이루어지는 이중 특이성 항체와 공배양했을 때의 CD137-CR2-copGFP Jurkat 세포(CD137-CR2)의 활성화능의 평가를 행한 결과를 나타내는 그래프이다. 가로축은 이중 특이성 항체(H0000-F760nN17/GL4-k0a//hCD137VH-F760mnP17/hCD137VL-k0)의 농도, 세로축은 루시페라제의 발광 강도를 나타낸다.
[도 12a] 도 12a는, 실시예 3-2에서 조제된 CD137-CR1-copGFP Jurkat 세포(CD137-CR1)에 대해, 실시예 8에 기재된 리간드(인간 CD137L) 발현 세포(Raji) 존재하·비존재하에 있어서의 키메라 수용체 발현 세포의 활성화능의 평가를 행한 결과를 나타내는 그래프이다. 세로축은 루시페라제의 발광 강도를 나타낸다.
[도 12b] 도 12b는, 실시예 6-2에서 조제된 trCD137-CR-copGFP Jurkat 세포(trCD137-CR)에 대해, 실시예 8에 기재된 리간드(인간 CD137L) 발현 세포(Raji) 존재하·비존재하에 있어서의 키메라 수용체 발현 세포의 활성화능의 평가를 행한 결과를 나타내는 그래프이다. 세로축은 루시페라제의 발광 강도를 나타낸다.
[도 12c] 도 12c는, 실시예 7-2에서 조제된 CD137-CR2-copGFP Jurkat 세포(CD137-CR2)에 대해, 실시예 8에 기재된 리간드(인간 CD137L) 발현 세포(Raji) 존재하·비존재하에 있어서의 키메라 수용체 발현 세포의 활성화능의 평가를 행한 결과를 나타내는 그래프이다. 세로축은 루시페라제의 발광 강도를 나타낸다.
[도 13] 도 13은, 실시예 9-3-1에 기재된, BB0000 및 BB0077의 생체내 리간드(인간 CD137L)에의 결합 활성 측정을 행한 결과를 나타내는 그래프이다. 가로축은 CD137L의 농도, 세로축은 B0000 및 BB0077의 보충량에 대한 CD137L의 결합량을 나타낸다.
[도 14] 도 14는, 실시예 9-3-2에 기재된 BB0000 및 BB0077의 ECM 결합 평가를 행한 결과를 나타내는 그래프이다. 세로축에 ECM 결합을 나타내는 발광 강도를 나타낸다.
[도 15] 도 15는, 실시예 9-3-4에 기재된, BB0124로부터 BB0138까지의 생체내 리간드(인간 CD137L)에의 결합 활성 측정을 행한 결과를 나타내는 그래프이다. 가로축은 평가한 CD137 개변체, 세로축은 각 개변체의 보충량에 대한 CD137L의 결합량을 나타낸다.
[도 16a] 도 16a는, 실시예 9-3-5에 기재된 CD137 개변체 BB0124로부터 BB0138까지의 ECM 결합 평가를 행한 결과를 나타내는 그래프이다. 세로축에 ECM 결합을 나타내는 발광 강도를 나타낸다.
[도 16b] 도 16b는, 실시예 9-3-3에 기재된 CD137 개변체 BB0139의 ECM 결합 평가를 행한 결과를 나타내는 그래프이다. 세로축에 ECM 결합을 나타내는 발광 강도를 나타낸다.
[도 17] 도 17은, 실시예 10-4에 기재된 리포터 어세이에 의한 표적 세포 존재하에 있어서의 항GPC3 항체와 항CD137 항체로 이루어지는 이중 특이성 항체(도 17에서는 Ab로 나타낸다) 의존적인 활성화능의 평가를 행한 결과를 나타내는 그래프이다. 가로축은 BB0000, BB0077, BB0127, BB0128, BB0131, BB0133, BB0134, BB0139의 8종의 CD137 개변체를 세포외 도메인으로 하여, CD8-CD28-CD137-CD3제타의 세포질 영역이 연결된 키메라 수용체를 발현하는 Jurkat 세포 및 유전자 도입되어 있지 않은 NFAT-RE-luc2 Jurkat 세포의 친주(Mock)를 나타내고, 세로축은 루시페라제의 발광 강도를 나타낸다.
[도 18] 도 18은, 실시예 10-5에 기재된 리포터 어세이에 의한 리간드 발현 세포 존재하에 있어서의 CD137 개변체를 세포외 도메인에 갖는 Jurkat 세포의 활성화능의 평가를 행한 결과를 나타내는 그래프이다. 축은 BB0000, BB0077, BB0127, BB0128, BB0131, BB0133, BB0134, BB0139의 8종을 세포외 도메인으로서 CD8-CD28-CD137-CD3제타의 세포질 영역이 연결된 키메라 수용체를 발현하는 Jurkat 세포 및 유전자 도입되어 있지 않은 NFAT-RE-luc2 Jurkat 세포의 친주(Mock)를 나타내고, 세로축은 루시페라제의 발광 강도를 나타낸다.
[도 19] 도 19는, 실시예 11-1에 기재하는 렌티바이러스 벡터가 코딩하는 키메라 수용체 CD137-CD8-CD3제타를 나타내는 모식도이다.
[도 20] 도 20은, 실시예 11-4에 기재된 리포터 어세이에 의한 표적 세포 존재하에 있어서의 항GPC3 항체와 항CD137 항체로 이루어지는 이중 특이성 항체 의존적인 3종의 Jurkat 세포의 CD137 활성화능의 평가를 행한 결과를 나타내는 그래프이다. 가로축에, 실시예 11-2에서 조제한 3종의 Jurkat 세포, 즉, CD137-CR1 Jurkat 세포(CD137-CR1), CD137-CR3-copGFP Jurkat 세포(CD137-CR3), 키메라 수용체를 발현하지 않고 copGFP만 발현하는 NF-kB-Luc2/4-1BB Jurkat 세포(copGFP)와 이중 특이성 항체의 존부를 나타낸다. 세로축은 루시페라제의 발광 강도를 나타낸다.
[도 21] 도 21은, 실시예 12-1에 기재하는 렌티바이러스 벡터가 코딩하는 막관통 도메인에 인간 CD8을 이용한 컨스트럭트(CD28-CR1) 및 인간 CD28을 이용한 컨스트럭트(CD28-CR2)를 나타내는 모식도이다.
[도 22] 도 22는, 실시예 12-4에 기재된 CD28-CR1 Jurkat 세포, 및 CD28-CR2 Jurkat 세포의 표적 세포 존재하에 있어서의 활성화능의 평가를 행한 결과를 나타내는 그래프이다. 가로축에, 3종의 Jurkat 세포, 즉, 키메라 수용체를 발현하지 않고 copGFP만 발현하는 NFAT-RE-luc2 Jurkat 세포(copGFP), 실시예 12-2에서 조제된 CD28-CR1-copGFP를 발현하는 Jurkat 세포(CD28-CR1-copGFP) 및 CD28-CR2-copGFP를 발현하는 Jurkat 세포(CD28-CR2-copGFP)와 3종의 이중 특이성 항체, 즉 항GPC3 항체와 항CD28 항체로 이루어지는 이중 특이성 항체(GPC3/CD28), 항KLH 항체와 항CD28 항체로 이루어지는 이중 특이성 항체(KLH/CD28) 및 항GPC3 항체와 항KLH 항체로 이루어지는 이중 특이성 항체(GPC3/KLH)의 존부를 나타낸다. 세로축은 루시페라제의 발광 강도를 나타낸다.
본 개시의 다른 특징 및 이점은, 이하의 상세한 설명으로부터 분명해진다. 그렇지만, 이 상세한 설명으로부터 당업자에게는 본 개시의 취지 및 범위 내에서 여러 가지 변경 및 개변이 자명해지므로, 본 개시의 바람직한 실시태양을 나타내는 상세한 설명 및 구체예는 설명을 위해서만 주어지고 있는 것이라고 이해되어야 한다.
이하, 본 개시의 실시태양을 도면에 관련하여 설명한다.
본 발명에 있어서의 폴리펩티드란, 통상, 4아미노산 정도 이상의 길이를 갖는 펩티드, 및 단백질을 가리킨다. 또한, 본 발명에 있어서의 폴리펩티드는 통상, 인공적으로 설계된 서열로 이루어지는 폴리펩티드이지만, 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 생물 유래의 폴리펩티드여도 된다. 또한, 천연 폴리펩티드, 혹은 합성 폴리펩티드, 재조합 폴리펩티드 등의 어느 것이어도 된다. 더욱이, 상기의 폴리펩티드의 단편도 또한, 본 발명의 폴리펩티드에 포함된다.
본 명세서에 있어서, 예를 들어, Ala/A, Leu/L, Arg/R, Lys/K, Asn/N, Met/M, Asp/D, Phe/F, Cys/C, Pro/P, Gln/Q, Ser/S, Glu/E, Thr/T, Gly/G, Trp/W, His/H, Tyr/Y, Ile/I, Val/V로 표시되는 바와 같이, 아미노산은 1문자 코드 또는 3문자 코드, 또는 그 양쪽으로 표기되고 있다. 특정의 위치에 있는 아미노산을 표현할 때, 특정의 위치를 나타내는 숫자와 아미노산의 1문자 코드 또는 3문자 코드를 병기한 표현이 적절히 사용될 수 있다. 예를 들어, 단도메인 항체에 포함되는 아미노산인 37V라고 하는 아미노산은, Kabat 넘버링으로 표시되는 37위의 위치에 있는 Val을 나타낸다.
항체 등의 폴리펩티드의 아미노산 서열 중의 아미노산의 개변을 위해서는, 부위 특이적 변이 유발법(Kunkel 등(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492))이나 Overlap extension PCR 등의 공지된 방법이 적절히 채용될 수 있다. 또한, 천연의 아미노산 이외의 아미노산으로 치환하는 아미노산의 개변 방법으로서, 복수의 공지된 방법도 또한 채용될 수 있다(Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357). 예를 들어, 종지 코돈의 하나인 UAG 코돈(앰버 코돈)의 상보적 앰버 서프레서 tRNA에 비천연 아미노산이 결합된 tRNA가 포함되는 무세포 번역계 시스템(Clover Direct(Protein Express)) 등도 호적하게 이용된다. 본 명세서에 있어서는, 개변으로서 치환을 들 수 있지만 이것으로 한정되지 않는다.
본 명세서에 있어서, 아미노산의 개변 위치를 나타낼 때에 이용되는 「및/또는」의 용어의 의의는, 「및」과 「또는」이 적절히 조합된 모든 조합을 포함한다. 구체적으로는, 예를 들어 「37번, 45번, 및/또는 47번의 아미노산이 치환되어 있는」이란 이하의 아미노산의 개변 위치의 배리에이션이 포함된다; (a) 37번, (b) 45번, (c) 47번, (d) 37번 및 45번, (e) 37번 및 47번, (f) 45번 및 47번, (g) 37번 및 45번 및 47번.
본 명세서에 있어서, 또한, 아미노산의 개변을 나타내는 표현으로서, 특정의 위치를 나타내는 숫자의 앞뒤에 개변 전과 개변 후의 아미노산의 1문자 코드 또는 3문자 코드를 병기한 표현이 적절히 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체 가변 영역 또는 단도메인 항체에 포함되는 아미노산의 치환을 가할 때에 이용되는 F37V 또는 Phe37Val이라고 하는 개변은, Kabat 넘버링으로 표시되는 37위의 Phe의 Val로의 치환을 나타낸다. 즉, 숫자는 Kabat 넘버링으로 표시되는 아미노산의 위치를 나타내고, 그 앞에 기재되는 아미노산의 1문자 코드 또는 3문자 코드는 치환 전의 아미노산, 그 뒤에 기재되는 아미노산의 1문자 코드 또는 3문자 코드는 치환 후의 아미노산을 나타낸다. 마찬가지로, 항체 정상 영역에 포함되는 Fc 영역에 아미노산의 치환을 가할 때에 이용되는 P238A 또는 Pro238Ala라고 하는 개변은, EU 넘버링으로 표시되는 238위의 Pro의 Ala로의 치환을 나타낸다. 즉, 숫자는 EU 넘버링으로 표시되는 아미노산의 위치를 나타내고, 그 앞에 기재되는 아미노산의 1문자 코드 또는 3문자 코드는 치환 전의 아미노산, 그 뒤에 기재되는 아미노산의 1문자 코드 또는 3문자 코드는 치환 후의 아미노산을 나타낸다.
본 명세서에서 용어 「항체」는, 가장 넓은 의미로 사용되고, 소망의 항원 결합 활성을 나타내는 한은, 그것만으로 한정되는 것은 아니지만, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중 특이성 항체(예를 들어, 이중 특이성 항체), 단도메인 항체, 및 항체 단편을 포함하는, 여러 가지 항체 구조를 포함한다.
본 발명에 있어서 「다중 특이성 항원 결합 분자」란, 상이한 다종의 항원, 구체적으로는 다종의 항원에 포함되는 다종의 에피토프와 특이적으로 결합할 수 있는 분자를 말한다. 즉, 다중 특이성 항원 결합 분자는 적어도 2종류의 상이한 에피토프에 대해서 특이성을 갖는 분자이며, 상이한 항원에 결합하는 분자 외에, 동일한 항원 상의 상이한 에피토프에 결합하는 분자도 포함된다. 다중 특이성 항원 결합 분자는 이중 특이성 항원 결합 분자를 포함하는 개념이며, 그 예로서, 다중 특이성 항체, 이중 특이성 항체 등을 들 수 있다. 이중 특이성 항체(bispecific 항체)는, 이와 같은 분자는 2개의 항원과 결합하는 것이지만, 다중 특이성 항체는, 2개의 항원, 또는 그 이상의(예를 들어, 3종류의) 항원에 대해서 특이성을 갖고 있어도 된다. 이중 특이성 항체 및 다중 특이성 항체는, 전장(全長) 항체로서 또는 항체 단편을 포함하는 분자로서 조제될 수 있다.
「항체 단편」은, 완전 항체가 결합하는 항원에 결합하는 당해 완전 항체의 일부분을 포함하는, 당해 완전 항체 이외의 분자를 말한다. 항체 단편의 예는, 그것만으로 한정되는 것은 아니지만, Fv, Fab, Fab＇, Fab＇-SH, F(ab＇)2, 다이아보디, 선상 항체, 단쇄 항체 분자(예를 들어, scFv), 및 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이성 항체를 포함한다.
용어 「전장 항체」는, 천연형 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나, 또는 본 명세서에서 정의하는 Fc 영역을 포함하는 중쇄를 갖는 항체를 말한다.
본 명세서에서 용어 「호모항체」는, 단일 항원에 결합하는 항체이며, 경쇄, 중쇄의 2개의 폴리펩티드쇄가 2개씩 있는 4본쇄 구조를 갖는 항체를 말한다.
용어 「가변 영역」 또는 「가변 도메인」은, 항체를 항원으로 결합시키는 것에 관여하는, 항체의 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 말한다. 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각 VH 및 VL)은, 통상, 각 도메인이 4개의 보존된 프레임워크 영역(FR) 및 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는, 유사한 구조를 갖는다(예를 들어, Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007) 참조). 1개의 VH 또는 VL 도메인으로, 항원 결합 특이성을 준다.
본 명세서에서 이용되는 용어 「상보성 결정 영역」 또는 「CDR」은, 서열에 있어서 초가변이고, 및/또는 구조적으로 정해진 루프(「초가변 루프」)를 형성하고, 및/또는 항원 접촉 잔기(「항원 접촉」), 항체의 가변 도메인의 각 영역을 말한다. 통상, 항체는 6개의 CDR을 포함한다: VH에 3개(H1, H2, H3), 및 VL에 3개(L1, L2, L3)이다. 본 명세서에서의 예시적인 CDR은, 이하의 것을 포함한다:
(a) 아미노산 잔기 26-32(L1), 50-52(L2), 91-96(L3), 26-32(H1), 53-55(H2), 및 96-101(H3)의 장소에서 생기는 초가변 루프(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));
(b) 아미노산 잔기 24-34(L1), 50-56(L2), 89-97(L3), 31-35b(H1), 50-65(H2), 및 95-102(H3)의 장소에서 생기는 CDR(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));
(c) 아미노산 잔기 27c-36(L1), 46-55(L2), 89-96(L3), 30-35b(H1), 47-58(H2), 및 93-101(H3)의 장소에서 생기는 항원 접촉(MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); 및,
(d) HVR 아미노산 잔기 46-56(L2), 47-56(L2), 48-56(L2), 49-56(L2), 26-35(H1), 26-35 b(H1), 49-65(H2), 93-102(H3), 및 94-102(H3)를 포함하는, (a), (b), 및/또는 (c)의 조합.
특별히 나타내지 않는 경우는, CDR 잔기 및 가변 도메인 중의 다른 잔기(예를 들어, FR 잔기)는, 본 명세서에서는 상기의 Kabat 등에 따라 번호 붙여진다.
「프레임워크」 또는 「FR」은, 상보성 결정 영역(CDR) 잔기 이외의, 가변 도메인 잔기를 말한다. 가변 도메인의 FR은, 통상 4개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3, 및 FR4로 이루어진다. 그에 따라서, CDR 및 FR의 서열은, 통상 다음의 순서로 VH(또는 VL)에 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
본 명세서에서 용어 「정상 영역」 또는 「정상 도메인」은, 항체의 가변 영역 이외의 부분을 말한다. 예를 들어, IgG 항체는, 다이설파이드 결합하고 있는 2개의 동일한 경쇄와 2개의 동일한 중쇄로 구성되는 약 150,000돌턴의 헤테로4량체 당단백질이며, N말단으로부터 C말단을 향해, 각 중쇄는, 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인이라고도 불리는 가변 영역(VH)을 갖고, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인, CH3 도메인을 포함하는 중쇄 정상 영역(CH)이 계속된다. 마찬가지로, N말단으로부터 C말단을 향해, 각 경쇄는, 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인이라고도 불리는 가변 영역(VL)을 갖고, 추가로 정상 경쇄(CL) 도메인이 계속된다. 천연형 항체의 경쇄는, 그 정상 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리는, 2개의 타입 중 하나에 귀속되어도 된다.
본 명세서에서 용어 「Fc 영역」은, 적어도 정상 영역의 일부분을 포함하는 면역글로불린 중쇄의 C말단 영역을 정의하기 위해서 이용된다. 이 용어는, 천연형 서열의 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 일 실시태양에 있어서, 인간 IgG1의 경우, 중쇄 Fc 영역은 Cys226으로부터, 또는 Pro230으로부터, 중쇄의 카복실 말단까지 연장된다. 단, Fc 영역의 C말단의 리신(Lys447) 또는 글리신-리신(Gly446-Lys447)은, 존재하고 있어도 되고 존재하고 있지 않아도 된다. 본 명세서에서는 특별히 특정하지 않는 한, Fc 영역 또는 정상 영역 중의 아미노산 잔기의 번호 붙이기는, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD 1991에 기재된, EU 넘버링 시스템(EU 인덱스라고도 불린다)에 따른다.
항체의 「클래스」는, 항체의 중쇄에 구비되는 정상 도메인 또는 정상 영역의 타입을 말한다. 항체에는 5개의 주요한 클래스가 있다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이다. 그리고, 이 중 몇몇은 추가로 서브클래스(아이소타입)로 나눠져도 된다. 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2이다. 상이한 클래스의 면역글로불린에 대응하는 중쇄 정상 도메인을, 각각, 알파, 델타, 입실론, 감마, 및 뮤라고 부른다.
본 명세서에 있어서, 「표적 항원 인식 부위」는 목적으로 하는 항원(표적 항원)을 인식하여 표적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 분자의 부위이며, 표적 항원 결합 도메인이라고 칭할 수도 있다. 표적 항원 인식 부위는, 목적으로 하는 항원에 결합하는 한 어떠한 구조의 부위여도 된다. 그와 같은 부위의 예로서 그것만으로 한정하는 것은 아니지만, 예를 들어, 항체의 중쇄 가변 영역(VH) 및 항체의 경쇄 가변 영역(VL), 단도메인 항체(sdAb), 생체 내에 존재하는 세포막 단백인 Avimer에 포함되는 35아미노산 정도의 A 도메인이라고 불리는 모듈(국제 공개 WO2004/044011, WO2005/040229), 세포막에 발현하는 당단백질인 fibronectin 중의 단백질에 결합하는 도메인인 10Fn3 도메인을 포함하는 Adnectin(국제 공개 WO2002/032925), Protein A의 58아미노산으로 이루어지는 3개의 헬릭스의 다발(bundle)을 구성하는 IgG 결합 도메인을 scaffold로 하는 Affibody(국제 공개 WO1995/001937), 33아미노산 잔기를 포함하는 턴과 2개의 역병행 헬릭스 및 루프의 서브유닛이 반복하여 겹겹이 쌓인 구조를 갖는 안키린 반복(ankyrin repeat: AR)의 분자 표면에 노출되는 영역인 DARPins(Designed Ankyrin Repeat proteins)(국제 공개 WO2002/020565), 호중구 겔라티나제 결합 리포칼린(neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL)) 등의 리포칼린 분자에 있어서 고도로 보존된 8개의 역병행 스트랜드가 중앙 방향으로 비틀어진 배럴 구조의 편측을 지지하는 4개의 루프 영역인 Anticalin 등(국제 공개 WO2003/029462), 칠성장어, 먹장어 등 무악류의 획득 면역 시스템으로서 이뮤노글로불린의 구조를 갖지 않는 가변성 림프구 수용체(variable lymphocyte receptor(VLR))의 류신 잔기가 풍부한 리피트(leucine-rich-repeat(LRR)) 모듈이 반복하여 겹겹이 쌓인 말굽형의 구조의 내부의 병행형 시트 구조의 오목한 영역(국제 공개 WO2008/016854)을 들 수 있다.
본 발명의 표적 항원 인식 부위의 호적한 예로서, 항체의 중쇄 가변 영역(VH) 및 항체의 경쇄 가변 영역(VL)을 들 수 있고, 특히 호적한 예로서, 면역 수용체 인식 부위를 겸비하는 다중 특이성 항체에 있어서의 표적 항원 인식 부위, 예를 들어 이중 특이성 항체에 있어서의 표적 항원 인식 부위를 들 수 있다. 한편, 본 발명의 항원 결합 분자가 갖는 특정의 항원을 인식하여 결합할 수 있는 부위를 항원 결합 도메인이라고 칭하는 경우가 있다. 예를 들어, 다중 특이성 항체는 복수의 항원 결합 도메인을 갖고, 그 중, 표적 항원을 인식하여 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 표적 항원 결합 부위로서 기능하고, 면역 수용체를 인식하여 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 면역 수용체 인식 부위로서 기능한다. 따라서, 어느 것이나 다중 특이성 항체의 표적 항원 결합 부위 및 면역 수용체 인식 부위는, 어느 것이나 다중 특이성 항체의 항원 결합 도메인에 해당한다. 이중 특이성 항원 결합 부위를 포함하는이란 2종류의 항원 결합 도메인을 갖는 것을 말한다.
본 명세서에 있어서, 「항원」은 항체 등의 분자가 표적으로서 인식하는 물질을 의미하고, 본 발명에 있어서 「표적 항원」이란 항원 결합 분자가 표적 항원 인식 부위를 개재시켜 결합할 수 있는 항원을 의미한다. 표적 항원은 표적 항원 인식 부위가 결합할 수 있는 에피토프를 포함한다. 본 발명에 있어서 표적 항원은, 표적 조직에 기인하는 질환을 치료하기 위해서 이용되는 항원이며, 그 호적한 예로서, 그것만으로 한정되지 않지만, 예를 들어, 표적 세포(예: 암 세포, 염증 세포)의 표면에 발현하는 분자나, 표적 세포를 포함하는 조직 중의 다른 세포 표면에 발현하는 분자, 표적 세포와 표적 세포를 포함하는 조직에 대해서 면역학적 역할을 가지는 세포의 표면에 발현하는 분자, 표적 세포를 포함하는 조직의 간질 중에 존재하는 대분자 등을 들 수 있다. 이하에 나타내는 항원은, 표적 항원의 예로서 들 수 있다.
일 실시태양에서는, 본 발명에 있어서의 표적 항원은, 예를 들어, 수용체, 종양 항원, MHC 항원, 분화 항원 등을 호적하게 들 수 있다.
표적 항원으로서는 하기와 같은 분자: 17-IA, 4-1BB, 4Dc, 6-케토-PGF1a, 8-아이소-PGF2a, 8-옥소-dG, A1 아데노신 수용체, A33, ACE, ACE-2, 액티빈, 액티빈 A, 액티빈 AB, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 RIA, 액티빈 RIA ALK-2, 액티빈 RIB ALK-4, 액티빈 RIIA, 액티빈 RIIB, ADAM, ADAM10, ADAM12, ADAM15, ADAM17/TACE, ADAM8, ADAM9, ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, 아드레신, aFGF, ALCAM, ALK, ALK-1, ALK-7, 알파-1-안티트립신, 알파-V/베타-1 안타고니스트, ANG, Ang, APAF-1, APE, APJ, APP, APRIL, AR, ARC, ART, 아르테민, 항Id, ASPARTIC, 심방성 나트륨 이뇨 인자, av/b3 인테그린, Axl, b2M, B7-1, B7-2, B7-H, B-림프구 자극 인자(BlyS), BACE, BACE-1, Bad, BAFF, BAFF-R, Bag-1, BAK, Bax, BCA-1, BCAM, Bcl, BCMA, BDNF, b-ECGF, bFGF, BID, Bik, BIM, BLC, BL-CAM, BLK, BMP, BMP-2 BMP-2a, BMP-3 오스테오게닌(Osteogenin), BMP-4 BMP-2b, BMP-5, BMP-6 Vgr-1, BMP-7(OP-1), BMP-8(BMP-8a, OP-2), BMPR, BMPR-IA(ALK-3), BMPR-IB(ALK-6), BRK-2, RPK-1, BMPR-II(BRK-3), BMP, b-NGF, BOK, 봄베신, 골 유래 신경 영양 인자, BPDE, BPDE-DNA, BTC, 보체 인자 3(C3), C3a, C4, C5, C5a, C10, CA125, CAD-8, 칼시토닌, cAMP, 암 태아성 항원(CEA), 암 관련 항원, 카텝신 A, 카텝신 B, 카텝신 C/DPPI, 카텝신 D, 카텝신 E, 카텝신 H, 카텝신 L, 카텝신 O, 카텝신 S, 카텝신 V, 카텝신 X/Z/P, CBL, CCI, CCK2, CCL, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9/10, CCR, CCR1, CCR10, CCR10, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CD1, CD2, CD3, CD3E, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD27L, CD28, CD29, CD30, CD30L, CD32, CD33(p67 단백질), CD34, CD38, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD49a, CD52, CD54, CD55, CD56, CD61, CD64, CD66e, CD74, CD89, CD95, CD123, CD137, CD138, CD140a, CD146, CD147, CD148, CD152, CD164, CEACAM5, CFTR, cGMP, CINC, 보툴리누스균 독소, 웰슈균 독소, CKb8-1, CLC, CMV, CMV UL, CNTF, CNTN-1, COX, C-Ret, CRG-2, CT-1, CTACK, CTGF, CTLA-4, PD1, PDL1, LAG3, TIM3, galectin-9, CX3CL1, CX3CR1, CXCL, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCR, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, 사이토케라틴 종양 관련 항원, DAN, DCC, DcR3, DC-SIGN, 보체 제어 인자(Decay accelerating factor), des(1-3)-IGF-I(뇌 IGF-1), Dhh, 디곡신, DNAM-1, Dnase, Dpp, DPPIV/CD26, Dtk, ECAD, EDA, EDA-A1, EDA-A2, EDAR, EGF, EGFR(ErbB-1), EMA, EMMPRIN, ENA, 엔도텔린 수용체, 엔케팔리나제, eNOS, Eot, 에오택신 1, EpCAM, 에프린 B2/EphB4, EPO, ERCC, E-셀렉틴, ET-1, 팩터 IIa, 팩터 VII, 팩터 VIIIc, 팩터 IX, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), Fas, FcR1, FEN-1, 페리틴, FGF, FGF-19, FGF-2, FGF3, FGF-8, FGFR, FGFR-3, 피브린, FL, FLIP, Flt-3, Flt-4, 난포 자극 호르몬, 프랙탈카인, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, G250, Gas6, GCP-2, GCSF, GD2, GD3, GDF, GDF-1, GDF-3(Vgr-2), GDF-5(BMP-14, CDMP-1), GDF-6(BMP-13, CDMP-2), GDF-7(BMP-12, CDMP-3), GDF-8(미오스타틴), GDF-9, GDF-15(MIC-1), GDNF, GDNF, GFAP, GFRa-1, GFR-알파 1, GFR-알파 2, GFR-알파 3, GITR, 글루카곤, Glut4, 당단백질 IIb/IIIa(GPIIb/IIIa), GM-CSF, gp130, gp72, GPR20, GRO, 성장 호르몬 방출 인자, 하프텐(NP-cap 또는 NIP-cap), HB-EGF, HCC, HCMV gB 엔벨로프 당단백질, HCMV gH 엔벨로프 당단백질, HCMV UL, 조혈 성장 인자(HGF), Hep B gp120, 헤파라나제, Her2/neu(ErbB-2), Her3(ErbB-3), Her4(ErbB-4), 단순 헤르페스 바이러스(HSV) gB 당단백질, HSV gD 당단백질, HGFA, 고분자량 흑색종 관련 항원(HMW-MAA), HIV gp120, HIV IIIB gp 120 V3 루프, HLA, HLA-DR, HM1.24, HMFG PEM, HRG, Hrk, 인간 심장 미오신, 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV), 인간 성장 호르몬(HGH), HVEM, I-309, IAP, ICAM, ICAM-1, ICAM-3, ICE, ICOS, IFNg, Ig, IgA 수용체, IgE, IGF, IGF 결합 단백질, IGF-1R, IGFBP, IGF-I, IGF-II, IL, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-5R, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-18 R, IL-21, IL-23, IL-27, 인터페론(INF)-알파, INF-베타, INF-감마, 인히빈, iNOS, 인슐린 A쇄, 인슐린 B쇄, 인슐린양 증식 인자 1, 인테그린 알파 2, 인테그린 알파 3, 인테그린 알파 4, 인테그린 알파 4/베타 1, 인테그린 알파 4/베타 7, 인테그린 알파 5(알파 V), 인테그린 알파 5/베타 1, 인테그린 알파 5/베타 3, 인테그린 알파 6, 인테그린 베타 1, 인테그린 베타 2, 인터페론 감마, IP-10, I-TAC, JE, 칼리크레인 2, 칼리크레인 5, 칼리크레인 6, 칼리크레인 11, 칼리크레인 12, 칼리크레인 14, 칼리크레인 15, 칼리크레인 L1, 칼리크레인 L2, 칼리크레인 L3, 칼리크레인 L4, KC, KDR, 케라티노사이트 증식 인자(KGF), 라미닌 5, LAMP, LAP, LAP(TGF-1), 잠재적 TGF-1, 잠재적 TGF-1 bp1, LBP, LDGF, LECT2, 레프티, 루이스-Y 항원, 루이스-Y 관련 항원, LFA-1, LFA-3, Lfo, LIF, LIGHT, 리포단백질, LIX, LKN, Lptn, L-셀렉틴, LT-a, LT-b, LTB4, LTBP-1, 폐표면, 황체 형성 호르몬, 림포톡신 베타 수용체, Mac-1, MAdCAM, MAG, MAP2, MARC, MCAM, MCAM, MCK-2, MCP, M-CSF, MDC, Mer, METALLOPROTEASES, MGDF 수용체, MGMT, MHC(HLA-DR), MIF, MIG, MIP, MIP-1-알파, MK, MMAC1, MMP, MMP-1, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-2, MMP-24, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MPIF, Mpo, MSK, MSP, 무틴(Muc1), MUC18, 뮐러관 억제 물질, Mug, MuSK, NAIP, NAP, NCAD, N-C 아드헤린, NCA 90, NCAM, NCAM, 네프리라이신, 뉴로트로핀-3, -4, 또는 -6, 뉴르투린, 신경 성장 인자(NGF), NGFR, NGF-베타, nNOS, NO, NOS, Npn, NRG-3, NT, NTN, OB, OGG1, OPG, OPN, OSM, OX40L, OX40R, p150, p95, PADPr, 부갑상선 호르몬, PARC, PARP, PBR, PBSF, PCAD, P-카드헤린, PCNA, PDGF, PDGF, PDK-1, PECAM, PEM, PF4, PGE, PGF, PGI2, PGJ2, PIN, PLA2, 태반성 알칼리 포스파타제(PLAP), PlGF, PLP, PP14, 프로인슐린, 프로레락신, 프로틴 C, PS, PSA, PSCA, 전립선 특이적 막 항원(PSMA), PTEN, PTHrp, Ptk, PTN, R51, RANK, RANKL, RANTES, RANTES, 레락신 A쇄, 레락신 B쇄, 레닌, 호흡기 다핵체 바이러스(RSV) F, RSV Fgp, Ret, 리우마이드 인자, RLIP76, RPA2, RSK, S100, SCF/KL, SDF-1, SERINE, 혈청 알부민, sFRP-3, Shh, SIGIRR, SK-1, SLAM, SLPI, SMAC, SMDF, SMOH, SOD, SPARC, Stat, STEAP, STEAP-II, TACE, TACI, TAG-72(종양 관련 당단백질-72), TARC, TCA-3, T 세포 수용체(예를 들어, T 세포 수용체 알파/베타), TdT, TECK, TEM1, TEM5, TEM7, TEM8, TERT, 고환 PLAP양 알칼리 포스파타제, TfR, TGF, TGF-알파, TGF-베타, TGF-베타 Pan Specific, TGF-베타 RI(ALK-5), TGF-베타 RII, TGF-베타 RIIb, TGF-베타 RIII, TGF-베타 1, TGF-베타 2, TGF-베타 3, TGF-베타 4, TGF-베타 5, 트롬빈, 흉선 Ck-1, 갑상선 자극 호르몬, Tie, TIMP, TIQ, 조직 인자, TMEFF2, Tmpo, TMPRSS2, TNF, TNF-알파, TNF-알파 베타, TNF-베타 2, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF10A(TRAIL R1 Apo-2, DR4), TNFRSF10B(TRAIL R2 DR5, KILLER, TRICK-2 A, TRICK-B), TNFRSF10C(TRAIL R3 DcR1, LIT, TRID), TNFRSF10D(TRAIL R4 DcR2, TRUNDD), TNFRSF11A(RANK ODF R, TRANCE R), TNFRSF11B(OPG OCIF, TR1), TNFRSF12(TWEAK R FN14), TNFRSF13B(TACI), TNFRSF13C(BAFF R), TNFRSF14(HVEM ATAR, HveA, LIGHT R, TR2), TNFRSF16(NGFR p75NTR), TNFRSF17(BCMA), TNFRSF18(GITR AITR), TNFRSF19(TROY TAJ, TRADE), TNFRSF19L(RELT), TNFRSF1A(TNF RI CD120a, p55-60), TNFRSF1B(TNF RII CD120b, p75-80), TNFRSF26(TNFRH3), TNFRSF3(LTbR TNF RIII, TNFC R), TNFRSF4(OX40 ACT35, TXGP1 R), TNFRSF5(CD40 p50), TNFRSF6(Fas Apo-1, APT1, CD95), TNFRSF6B(DcR3 M68, TR6), TNFRSF7(CD27), TNFRSF8(CD30), TNFRSF9(4-1BB CD137, ILA), TNFRSF21(DR6), TNFRSF22(DcTRAIL R2 TNFRH2), TNFRST23(DcTRAIL R1 TNFRH1), TNFRSF25(DR3 Apo-3, LARD, TR-3, TRAMP, WSL-1), TNFSF10(TRAIL Apo-2 리간드, TL2), TNFSF11(TRANCE/RANK 리간드 ODF, OPG 리간드), TNFSF12(TWEAK Apo-3 리간드, DR3 리간드), TNFSF13(APRIL TALL2), TNFSF13B(BAFF BLYS, TALL1, THANK, TNFSF20), TNFSF14(LIGHT HVEM 리간드, LTg), TNFSF15(TL1A/VEGI), TNFSF18(GITR 리간드 AITR 리간드, TL6), TNFSF1A(TNF-a 커넥틴(Conectin), DIF, TNFSF2), TNFSF1B(TNF-b LTa, TNFSF1), TNFSF3(LTb TNFC, p33), TNFSF4(OX40 리간드 gp34, TXGP1), TNFSF5(CD40 리간드 CD154, gp39, HIGM1, IMD3, TRAP), TNFSF6(Fas 리간드 Apo-1 리간드, APT1 리간드), TNFSF7(CD27 리간드 CD70), TNFSF8(CD30 리간드 CD153), TNFSF9(4-1BB 리간드 CD137 리간드), TP-1, t-PA, Tpo, TRAIL, TRAIL R, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRANCE, 트랜스페린 수용체, TRF, Trk, TROP-2, TLR(Toll-like receptor) 1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TSG, TSLP, 종양 관련 항원 CA125, 종양 관련 항원 발현 루이스 Y 관련 탄수화물, TWEAK, TXB2, Ung, uPAR, uPAR-1, 유로키나제, VCAM, VCAM-1, VECAD, VE-Cadherin, VE-cadherin-2, VEFGR-1(flt-1), VEGF, VEGFR, VEGFR-3(flt-4), VEGI, VIM, 바이러스 항원, VLA, VLA-1, VLA-4, VNR 인테그린, 폰·빌레브란트 인자, WIF-1, WNT1, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9A, WNT9B, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, XCL1, XCL2, XCR1, XCR1, XEDAR, XIAP, XPD, HMGB1, IgA, Aβ, CD81, CD97, CD98, DDR1, DDR2, DKK1, EREG, Hsp90, IL-17/IL-17R, IL-20/IL-20R, 산화 LDL, PCSK9, prekallikrein, RON, TMEM16F, SOD1, Chromogranin A, Chromogranin B, tau, VAP1, 고분자 키니노겐, IL-31, IL-31R, Nav1.1, Nav1.2, Nav1.3, Nav1.4, Nav1.5, Nav1.6, Nav1.7, Nav1.8, Nav1.9, EPCR, C1, C1q, C1r, C1s, C2, C2a, C2b, C3, C3a, C3b, C4, C4a, C4b, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9, factor B, factor D, factor H, properdin, sclerostin, fibrinogen, fibrin, prothrombin, thrombin, 조직 인자, factor V, factor Va, factor VII, factor VIIa, factor VIII, factor VIIIa, factor IX, factor IXa, factor X, factor Xa, factor XI, factor XIa, factor XII, factor XIIa, factor XIII, factor XIIIa, TFPI, antithrombin III, EPCR, 트롬보모듈린, TAPI, tPA, plasminogen, plasmin, PAI-1, PAI-2, GPC3, Syndecan-1, Syndecan-2, Syndecan-3, Syndecan-4, LPA, S1P 및 호르몬 및 성장 인자를 위한 수용체가 예시될 수 있다.
상기의 표적 항원의 예시에는 수용체도 기재되지만, 이들 수용체가 생체액 중에 가용형으로 존재하는 경우에도, 본 발명의 표적 항원 인식 부위가 결합하는 항원으로서 사용될 수 있다. 그와 같은 가용형 수용체의 비한정적인 일 태양으로서, 예를 들어, Mullberg 등(J. Immunol. (1994) 152 (10), 4958-4968)에 의해 기재되어 있는 바와 같은 가용형 IL-6R인 단백질이 예시될 수 있다.
수용체의 예로서는, 예를 들어, 조혈 인자 수용체 패밀리, 사이토카인 수용체 패밀리, 티로신 키나제형 수용체 패밀리, 세린/트레오닌 키나제형 수용체 패밀리, TNF 수용체 패밀리, G 단백질 공액형 수용체 패밀리, GPI 앵커형 수용체 패밀리, 티로신 포스파타제형 수용체 패밀리, 접착 인자 패밀리, 호르몬 수용체 패밀리 등의 수용체 패밀리에 속하는 수용체 등을 들 수 있다. 이들 수용체 패밀리에 속하는 수용체, 및 그 특징에 관해서는, 다수의 문헌, 예를 들어, Cooke BA., King RJB., van der Molen HJ. ed. New Comprehesive Biochemistry Vol.18B Hormones and their Actions Part IIpp.1-46 (1988) Elsevier Science Publishers BV., 또는, 미야자카 마사유키 감수, 세포 공학 별책 핸드북 시리즈 「접착 인자 핸드북」(1994)(슈준샤, 도쿄, 일본) 등의 리뷰 외에, Patthy(Cell (1990) 61 (1), 13-14), Ullrich 등(Cell (1990) 61 (2), 203-212), Massague(e에는 아큐트·액센트 기호가 붙는다)(Cell (1992) 69 (6), 1067-1070), Miyajima 등(Annu. Rev. Immunol. (1992) 10, 295-331), Taga 등(FASEB J. (1992) 6, 3387-3396), Fantl 등(Annu. Rev. Biochem. (1993), 62, 453-481), Smith 등(Cell (1994) 76 (6) 959-962), Flower DR. Biochim. Biophys. Acta, Flower(Biochim. Biophys. Acta (1999) 1422 (3) 207-234 등에 기재되어 있다.
상기 수용체 패밀리에 속하는 구체적인 수용체로서는, 예를 들어, 인간 또는 마우스 에리트로포이에틴(EPO) 수용체(Blood (1990) 76 (1), 31-35, Cell (1989) 57 (2), 277-285), 인간 또는 마우스 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF) 수용체(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1990) 87 (22), 8702-8706, mG-CSFR, Cell (1990) 61 (2), 341-350), 인간 또는 마우스 트롬보포이에틴(TPO) 수용체(Proc Natl Acad Sci U S A. (1992) 89 (12), 5640-5644, EMBO J. (1993) 12(7), 2645-53), 인간 또는 마우스 인슐린 수용체(Nature (1985) 313 (6005), 756-761), 인간 또는 마우스 Flt-3 리간드 수용체(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1994) 91 (2), 459-463), 인간 또는 마우스 혈소판 유래 증식 인자(PDGF) 수용체(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1988) 85 (10) 3435-3439), 인간 또는 마우스 인터페론(IFN)-알파, 베타 수용체(Cell (1990) 60 (2), 225-234. 및 Cell (1994) 77 (3), 391-400), 인간 또는 마우스 렙틴 수용체, 인간 또는 마우스 성장 호르몬(GH) 수용체, 인간 또는 마우스 인터류킨(IL)-10 수용체, 인간 또는 마우스 인슐린양 증식 인자(IGF)-I 수용체, 인간 또는 마우스 백혈병 억제 인자(LIF) 수용체, 인간 또는 마우스 모양체 신경 영양 인자(CNTF) 수용체 등이 호적하게 예시된다.
상기의 표적 항원의 예시에는, 세포막에 발현하는 막형 분자, 및 세포로부터 세포외로 분비되는 가용형 분자가 포함된다. 본 발명의 항원 결합 도메인이 세포로부터 분비된 가용형 분자에 결합하는 경우, 당해 항원 결합 도메인으로서는 중화 활성을 갖고 있는 것이 호적하다.
가용형 분자가 존재하는 용액에 한정은 없고 생체액, 즉 생체 내의 맥관 또는 조직·세포의 사이를 채우는 모든 액체에 본 가용형 분자는 존재할 수 있다. 비한정적인 일 태양에서는, 본 발명의 표적 항원 인식 부위가 결합하는 가용형 분자는, 세포외액에 존재할 수 있다. 세포외액이란, 척추동물에서는 혈장, 조직간액, 림프액, 조밀한 결합 조직, 뇌척수액, 골수액, 천자액, 또는 관절액 등의 골 및 연골 중의 성분, 폐포액(기관지 폐포 세정액), 복수, 흉수, 심낭수, 낭포액, 또는 안방수(방수) 등의 세포 투과액(세포의 능동 수송·분비 활동의 결과 생긴 각종 선강 내의 액, 및 소화관강 그 외의 체강내액)의 총칭을 말한다.
용어 「종양 항원」은, 암 세포에 발현하는 항원을 말하고, 그 발현이 세포의 악성 변화에 관련하여 인식되게 되는, 항원성을 갖는 생체 분자를 의미한다. 종양 항원에는, 종양 특이적 항원(종양 세포에만 존재하고, 다른 정상 세포에는 보이지 않는 항원), 및 종양 관련 항원(다른 기관 및 조직 혹은 이종 및 동종이계의 정상 세포에도 존재하는 항원, 또는 발생 및/혹은 분화 시에 발현되는 항원)이 포함된다. 또한, 세포가 암화되었을 때에 세포 표면이나 단백질 분자 상에 나타나는 이상한 당쇄도 종양 항원이며, 암 당쇄 항원이라고도 불린다. 본 발명의 하나의 태양에 있어서, 표적 항원은 종양 항원이다.
종양 항원의 예로서는, 예를 들어, 상기의 수용체로서 GPI 앵커형 수용체 패밀리에 속하지만 간암을 비롯한 몇몇 암에 있어서 발현하고 있는 GPC3(Int J Cancer. (2003) 103 (4), 455-65), 폐암을 비롯한 복수의 암에서 발현하는 EpCAM(Proc Natl Acad Sci U S A. (1989) 86 (1), 27-31)(그 폴리뉴클레오티드 서열은 RefSeq 등록 번호 NM_002354.2에, 폴리펩티드 서열은 RefSeq 등록 번호 NP_002345.2에 각각 기재되어 있다.), EGFR, CA19-9, CA15-3, 시리얼 SSEA-1(SLX), Her2, Her3, 전립선 줄기세포 항원(PSCA), 알파-페토프로틴(AFP), 암 태아성 항원(CEA), 종양 항원-125(CA-125), 칼레티닌, MUC-1, MUC-16, 상피성 막 단백질(EMA), 상피성 종양 항원(ETA), 티로시나제, 멜라노마 관련 항원(MAGE), 크로모그라닌, 사이토케라틴, 데스민, 글리아 섬유 산성 단백질(GFAP), 육안적 낭포성 질환 액체 단백질(gross cystic disease fluid protein)(GCDFP-15), HMB-45 항원, 단백질 멜란-A(T 림프구에 인식되는 멜라노마 항원; MART-1), myo-D1, 근 특이적 액틴(MSA), 뉴로필라멘트, 신경 특이적 엔올라제(NSE), 태반 알칼리 포스파타제, 시냅토파이시스, 티로글로불린, 갑상선 전사 인자-1, 피루브산 키나제 아이소효소 타입 M2의 2량체형(종양 M2-PK), GD2(강글리오시드 G2), EGFRvIII(표피성 성장 인자 배리언트 III), 정자 단백질 17(Sp17), 메소세린, PAP(전립선 산성 포스파타제), 프로스테인, TARP(T 세포 수용체 감마 얼터네이트 리딩 프레임 단백질), Trp-p8, STEAP1(프로스테이트 1의 6회 막관통형 상피성 항원), TROP-2, 크로딘 6, RNF43a, 이상 ras 단백질, 또는 이상 p53 단백질, 인테그린 알파 v베타 3(CD61), 갈렉틴, K-Ras(V-Ki-ras2 키르스텐 래트 육종 바이러스 암 유전자), 또는 Ral-B 등을 호적하게 들 수 있다.
더욱이, 종양 항원의 예로서는, 예를 들어, 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR); CD171; CS-1(CD2 서브세트 1, CRACC, SLAMF7, CD319 및 19A24); C형 렉틴양 분자-1(CLL-1); 강글리오시드 GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer); Tn 항원(Tn Ag); T 항원(T Ag); Fms양 티로신 키나제 3(FLT3); CD38; CD44v6; B7H3(CD276); KIT(CD117); 인터류킨-13 수용체 서브유닛 알파-2(IL-13Ra2); 인터류킨 11 수용체 알파(IL-11Ra); 인터류킨 2 수용체 알파(IL-2 Ra); 전립선 줄기세포 항원(PSCA); 프로테아제 세린 21(PRSS21); 혈관 내피 세포 증식 인자 수용체 2(VEGFR2); 루이스(Y) 항원; CD24; 혈소판 유래 증식 인자 수용체 베타(PDGFR-베타); 스테이지 특이적 배성 항원-4(SSEA-4); 신경 세포 접착 분자(NCAM); 탄산 탈수 효소 IX(CAIX); 프로테아솜(프로솜, 매크로파인) 서브유닛, 베타형, 9(LMP2); 에프린 A형 수용체 2(EphA2); 푸코실 GM1; 시알릴 루이스 접착 분자(sLe); 강글리오시드 GM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer; TGS5; 고분자량 흑색종 관련 항원(HMWMAA); o-아세틸-GD2 강글리오시드(OAcGD2); 엽산 수용체 베타; 종양 내피 마커 1(TEM1/CD248); 종양 내피 마커 7 관련(TEM7R); 클로딘 6(CLDN6); G 단백질 공액 수용체 클래스 C 그룹 5, 멤버 D(GPRC5D); 염색체 X 오픈 리딩 프레임 61(CXORF61); CD97; CD179a; 미분화 림프종 키나제(ALK); 폴리시알산; 태반 특이적 1(PLAC1); globoH 글리코세라미드(GloboH)의 6당 부분; 유선 분화 항원(NY-BR-1); 유로플라킨 2(UPK2); A형 간염 바이러스 세포성 수용체 1(HAVCR1); 아드레날린 수용체 베타 3(ADRB3); 판넥신 3(PANX3); G 단백질 공액 수용체 20(GPR20); 림프구 항원 6 복합체, 좌위 K9(LY6K); 후각 수용체 51E2(OR51E2); TCR 감마 선택적 리딩 프레임 단백질(TARP); 윌름스 종양 단백질(WT1); 염색체 12p에 위치하는 ETS 전좌변이체 유전자 6(ETV6-AML); 정자 단백질 17(SPA17); X항원 패밀리, 멤버 1 A(XAGE1); 안기오포이에틴 결합 세포 표면 수용체 2(Tie 2); 흑색종 암 정소 항원-1(MAD-CT-1); 흑색종 암 정소 항원-2(MAD-CT-2); Fos 관련 항원 1; p53 변이체; 인간 텔로메라제 역전사 효소(hTERT); 육종 전좌 절단점; 아포토시스의 흑색종 저해제(ML-IAP); ERG(막관통형 프로테아제, 세린 2(TMPRSS2) ETS 융합 유전자); N-아세틸글루코사민일-트랜스페라제 V(NA17); 페어드 복스 단백질 Pax-3(PAX3); 안드로겐 수용체; 사이클린 B1; v-myc 조류 골수 세포종 바이러스 암 유전자 신경아종유래 호몰로그(MYCN); Ras 호몰로그 패밀리 멤버 C(RhoC); 시토크롬 P4501B1(CYP1B1); CCCTC 결합 인자(아연 FINGER 단백질)양(BORIS); T 세포 3에 의해 인식되는 편평 상피 세포 종양 항원(SART3); 페어드 복스 단백질 Pax-5(PAX5); 프로아크로신 결합 단백질 p32(OY-TES1); 림프구 특이적 단백질 티로신 키나제(LCK); A 키나제 앵커 단백질 4(AKAP-4); 활막 육종, X 절단점 2(SSX2); CD79a; CD79b; CD72; 백혈구 관련 면역글로불린양 수용체 1(LAIR1); IgA 수용체의 Fc 프래그먼트(FCAR); 백혈구 면역글로불린양 수용체 서브패밀리 A 멤버 2(LILRA2); CD300 분자양 패밀리 멤버 f(CD300LF); C형 렉틴 도메인 패밀리 12 멤버 A(CLEC12A); 골수 간질 세포 항원 2(BST2); EGF양 모듈 함유 무틴양 호르몬 수용체양 2(EMR2); 림프구 항원 75(LY75); 글리피칸-3(GPC3); Fc 수용체양 5(FCRL5); 및 면역글로불린 람다양 폴리펩티드 1(IGLL1) 등도 들 수 있다.
「MHC 항원」은, 주요 조직 적합 유전자 복합체(MHC)의 유전자 산물이며, 그 중, 세포막에 발현되는 당단백질은 주로 MHC class I 항원과 MHC class II 항원으로 분류된다. MHC class I 항원에는, HLA-A, -B, -C, -E, -F, -G, -H가 포함되고, MHC class II 항원에는, HLA-DR, -DQ, -DP가 포함된다. 또한, 이들 MHC 항원에 제시되는 종양 항원 유래 펩티드도 포함된다. GP100, MART-1, MAGE-1, MAGE-A4, NY-ESO-1 등의 종양 항원, 혹은, RAS나 p53 등의 변이 부분을 제시한 MHC와의 복합체에 대해서도, 종양 항원의 하나로서 파악된다.
「분화 항원」이란, 매크로파지, T 세포, B 세포 등이 골수 줄기세포로부터의 분화에 수반하여 소장(消長)하는 세포 표면 분자의 총칭이다. 분화 항원에는, CD1, CD2, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15s, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD27, CD28, CD29, CD30, CD32, CD33, CD34, CD35, CD38, CD40, CD41a, CD41b, CD42a, CD42b, CD43, CD44, CD45, CD45RO, CD48, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD51, CD54, CD55, CD56, CD57, CD58, CD61, CD62E, CD62L, CD62P, CD64, CD69, CD70, CD71, CD73, CD95, CD99, CD102, CD106, CD117, CD122, CD126, CDw130이 포함될 수 있다.
용어 「종양」은, 일반적으로, 조직, 세포가 생체 내의 제어에 반하여 자율적으로 과잉으로 증식하는 것에 의해 생기는 조직괴를 총칭한다. 종양에는 자율성 증식, 침윤과 전이, 악액질의 3개의 특징을 갖는 악성과, 자율성 증식만을 특징으로 하는 양성이 있고, 악성 종양인 「암」은, 이상한 세포의 제어 불능한 성장을 특징으로 하는 질환을 가리킨다. 암 세포는, 국소적으로, 또는 혈류 및 림프계를 개재시켜 몸의 다른 부분에 만연할 가능성이 있다. 다양한 암의 예가 본 개시에서 설명되어 있고, 이들로 한정되지 않지만, 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 췌장암, 결장직장암, 신장암, 간장암, 뇌암, 림프종, 백혈병, 폐암 및 동종의 것을 들 수 있다. 용어 「종양」 및 「암」은, 본 개시에 있어서 동의적으로 사용되고, 예를 들어, 어느 용어도, 고체 및 액성, 예를 들어, 미만성 또는 순환성의 종양을 포함한다. 용어 「암」 또는 「종양」은, 본 개시에서 사용되는 경우, 전암성(前癌性)의, 마찬가지로 악성의 암 및 종양을 포함한다.
본 개시의 항암제나, 후술하는 암의 치료 방법에 있어서의 암으로서는, 선암, 편평상피암, 선편평상피암, 미분화암, 대세포암, 소세포암, 피부암, 유방암, 전립선암, 방광암, 질암, 경부암, 자궁암, 간장암, 신장암, 췌장암, 비장암, 폐암, 기관암, 기관지암, 결장직장암, 소장암, 위암, 식도암, 담낭암, 정소암, 난소암 등의 암이나, 골 조직, 연골 조직, 지방 조직, 근 조직, 혈관 조직 및 조혈 조직의 암 외에, 연골 육종, 유잉 육종, 악성 혈관 내피종, 악성 슈원종, 골육종, 연부 조직 육종 등의 육종이나, 간아종, 골수아종, 신아종, 신경아종, 췌아종, 흉막폐아종, 망막아종 등의 아종이나, 배세포 종양이나, 림프종이나, 백혈병을 들 수 있다.
일 실시태양에 있어서, 암종과의 관련에 있어서 종양 항원은, 정상 세포와 암 세포의 양쪽에 의해 발현되는 마커, 예를 들어 계통 마커, 예를 들어, B 세포 상의 CD19이다. 어느 특정의 태양에 있어서, 본 개시의 종양 항원은, 원발성 또는 전이성 흑색종, 흉선종, 림프종, 육종, 폐암, 결장직장암, 간장암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 백혈병, 자궁암, 자궁경부암, 방광암, 신장암, 및 선암, 예를 들어 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암 및 동종의 것을 포함하지만 이들로 한정되지 않는, 암에서 유래한다. 일 실시태양에 있어서, 종양 항원은, 특정의 증식성 장애에 공통인 항원이다. 일 실시태양에 있어서, 암 관련 항원은, 정상 세포와 비교하여 암 세포에 있어서 과잉 발현되는, 예를 들어, 정상 세포와 비교하여, 1배의 발현, 2배의 과잉 발현, 3배의 과잉 발현 또는 그 이상인 세포 표면 분자이다. 일부의 실시태양에 있어서, 암 관련 항원은, 암 세포에 있어서 부적절하게 합성되는 세포 표면 분자, 예를 들어, 정상 세포에서 발현된 분자와 비교하여 결실, 부가 또는 돌연변이를 함유하는 분자이다. 일 실시태양에 있어서, 암 관련 항원은, 전체가, 또는 프래그먼트(예를 들어, MHC/펩티드)로서, 배타적으로 암 세포의 세포 표면에서 발현되고, 정상 세포의 표면에서는 합성도 발현도 되지 않는다. 통상, 내인성 단백질 유래의 펩티드는, 주요 조직 적합 복합체(MHC) 클래스 I 분자의 포켓을 채워, CD8＋ T 림프구 상의 T 세포 수용체(TCR)에 의해 인식된다. MHC 클래스 I 복합체는, 모든 유핵 세포에 의해 구성적으로 발현된다. 암에 있어서, 바이러스 특이적 및/또는 종양 특이적 펩티드/MHC 복합체는, 면역 요법을 위한 세포 표면 표적의 특유한 클래스의 대표이다. 인간 백혈구 항원(HLA)-A1 또는 HLA-A2의 상황에 있어서 바이러스 또는 종양 항원 유래의 펩티드를 표적으로 하는 TCR양 항체가, 설명되어 있다［예를 들어, Sastry et al., J Virol.2011 85(5):1935-1942; Sergeeva et al., Bood, 2011 117(16):4262-4272; Verma et al., J Immunol 2010 184(4):2156-2165; Willemsen et al., Gene Ther 2001 8(21):1601-1608; Dao et al., Sci Transl Med 2013 5(176):176ra33; Tassev et al., Cancer Gene Ther 2012 19(2):84-100이 참조되고자 한다］. 예를 들어, TCR양 항체는, 인간 scFv 파지 제시형 라이브러리 등의 라이브러리를 스크리닝하는 것에 의해 동정할 수 있다.
본 개시의 항원 결합 분자가 결합하는 항원의 예로서는, 바이러스 항원, 세균(특히, 감염성 세균) 항원, 기생충 항원, 특정의 병태에 관련하는 표적 세포 상의 세포 표면 마커(예를 들어, 종양 항원), 및 자기면역을 일으키는 면역 세포의 표면 분자가 포함된다.
본 개시는, 일 측면에 있어서, 레트로바이러스과(예를 들어, 인간 면역 부전 바이러스, 예를 들어, HIV-1 및 HIV-LP), 피코르나 바이러스과(예를 들어, 폴리오바이러스, A형 간염 바이러스, 엔테로바이러스, 인간 콕사키바이러스, 라이노바이러스, 및 에코바이러스), 풍진 바이러스, 코로나 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 광견병 바이러스, 에볼라 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 홍역 바이러스, 호흡기 합포체 바이러스, 인플루엔자 바이러스, B형 간염 바이러스, 파르보바이러스, 아데노바이러스과, 헤르페스 바이러스과［예를 들어, 1형 및 2형 단순 헤르페스 바이러스(HSV), 수두-대상 포진 바이러스, 사이토메갈로바이러스(CMV), 및 헤르페스 바이러스］, 폭스 바이러스과(예를 들어, 천연두 바이러스, 백시니아 바이러스, 및 폭스 바이러스), 또는 C형 간염 바이러스에서 유래하는 항원과 항원 결합 분자를 개재시켜 결합할 수 있는 키메라 수용체를 제공한다.
본 개시는, 다른 측면에 있어서, 포도상구균속(Staphylococci), 연쇄구균속(Streptococcus), 대장균(Escherichia coli), 슈도모나스(Pseudomonas), 또는 살모넬라균속(Salmonella)의 균주에서 유래하는 항원과 항원 결합 분자를 개재시켜 결합할 수 있는 키메라 수용체를 제공한다. 특히, 본 개시는, 감염성 세균, 예를 들어, 피롤리균(Helicobacter pyloris), 레지오넬라·뉴모필리아(Legionella pneumophilia), 마이코박테리아종의 균주(예를 들어, 결핵균(M. tuberculosis), 조류 결핵균(M. avium), M. 인트라셀룰라레(M. intracellulare), M. 칸사이(M. kansaii), 또는 M. 고르도네(M. gordonea), 황색 포도상구균(Staphylococcus aureus), 임균(Neisseria gonorrhoeae), 수막염균(Neisseria meningitides), 리스테리아균(Listeria monocytogenes), 화농 연쇄구균(Streptococcus pyogenes), A군 연쇄구균속, B군 연쇄구균속(스트렙토코커스·아갈락티에(Streptococcus agalactiae), 폐렴 연쇄구균(Streptococcus pneumoniae), 또는 파상풍균(Clostridium tetani)에서 유래하는 항원과, 항원 결합 분자를 개재시켜 결합할 수 있는 키메라 수용체를 제공한다.
본 개시는, 다른 측면에 있어서, 항원 결합 분자는, 5T4, 알파 5 베타 1-인테그린, 707-AP, AFP, ART-4, B7H4, B7H3, BAGE, 베타-카테닌/m, Bcr-abl, MN/CIX항체, CA125, CAMEL, CAP-1, CASP-8, CD4, CD19, CD20, CD22, CD25, CDC27/m, CD30, CD33, CD52, CD56, CD80, CDK4/m, CEA, CT, Cyp-B, DAM, EGFR, ErbB3, ELF2M, EMMPRIN, EpCam, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gp100, Gpc3, Gpr20, HAGE, HER-2/neu, HLA-A*0201-R170I, HPV-E7, HSP70-2M, HST-2, hTERT(또는 hTRT), iCE, IGF-1R, IL-2R, IL-5, KIAA0205, LAGE, LDLR/FUT, MAGE, MART-1/melan-A, MART-2/Ski, MC1R, 미오신/m, MUC1, MUC-16, MUM-1, MUM-2, MUM-3, NA88-A, PAP, 프로테이나제-3, p190 minor bcr-abl, Pml/RAR 알파, PRAME, PSA, PSM, PSMA, RAGE, RU1 또는 RU2, SAGE, SART-1 또는 SART-3, 서바이빈, TEL/AML1, TGF 베타, TPI/m, Trop-2, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, VEGF, WT1, NY-Eso-1 또는 NY-Eso-B 등의 종양 항원과 결합할 수 있다. 본 개시에 있어서 당해 항체는 또한, 세포 표면 접착 분자, 자기면역 질환에서 보이는 염증성 세포의 표면 분자, 또는 자기면역을 일으키는 TCR과 결합할 수 있다.
본 명세서에 있어서, 「면역 수용체 인식 부위」는 목적으로 하는 면역 수용체를 인식하여 면역 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 분자의 부위이며, 면역 수용체 결합 도메인이라고 칭할 수도 있다. 면역 수용체 인식 부위는, 목적으로 하는 면역 수용체에 결합하는 한 어떠한 구조의 부위여도 된다. 그와 같은 부위의 예로서 그것만으로 한정하는 것은 아니지만, 예를 들어, 면역 수용체를 항원으로서 인식하는 항체의 중쇄 가변 영역(VH) 및 항체의 경쇄 가변 영역(VL), 단도메인 항체(sdAb), 생체 내에 존재하는 세포막 단백인 Avimer에 포함되는 35아미노산 정도의 A 도메인으로 불리는 모듈(국제 공개 WO2004/044011, WO2005/040229), 세포막에 발현하는 당단백질인 fibronectin 중의 단백질에 결합하는 도메인인 10Fn3 도메인을 포함하는 Adnectin(국제 공개 WO2002/032925), Protein A의 58아미노산으로 이루어지는 3개의 헬릭스의 다발(bundle)을 구성하는 IgG 결합 도메인을 scaffold로 하는 Affibody(국제 공개 WO1995/001937), 33아미노산 잔기를 포함하는 턴과 2개의 역병행 헬릭스 및 루프의 서브유닛이 반복하여 겹겹이 쌓인 구조를 갖는 안키린 반복(ankyrin repeat: AR)의 분자 표면에 노출되는 영역인 DARPins(Designed Ankyrin Repeat proteins)(국제 공개 WO2002/020565), 호중구 겔라티나제 결합 리포칼린(neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL)) 등의 리포칼린 분자에 있어서 고도로 보존된 8개의 역병행 스트랜드가 중앙 방향으로 비틀린 배럴 구조의 편측을 지지하는 4개의 루프 영역인 Anticalin 등(국제 공개 WO2003/029462), 칠성장어, 먹장어 등 무악류의 획득 면역 시스템으로서 이뮤노글로불린의 구조를 갖지 않는 가변성 림프구 수용체(variable lymphocyte receptor(VLR))의 류신 잔기가 풍부한 리피트(leucine-rich-repeat(LRR)) 모듈이 반복하여 겹겹이 쌓인 말굽형의 구조의 내부의 병행형 시트 구조의 오목한 영역(국제 공개 WO2008/016854)을 들 수 있다.
본 발명의 면역 수용체 인식 부위의 호적한 예로서, 면역 수용체를 항원으로서 인식하는 항체의 중쇄 가변 영역(VH) 및 항체의 경쇄 가변 영역(VL)을 들 수 있고, 특히 호적한 예로서, 표적 항원 인식 부위를 겸비하는 다중 특이성 항체에 있어서의 면역 수용체 인식 부위, 예를 들어 이중 특이성 항체에 있어서의 면역 수용체 인식 부위를 들 수 있다. 한편, 본 발명의 항원 결합 분자가 갖는 특정의 면역 수용체를 인식하여 결합할 수 있는 부위가 면역 수용체를 항원으로서 인식하는 항체의 일부인 경우, 면역 수용체 인식 부위를 항원 결합 도메인이라고 칭하는 경우가 있다. 예를 들어, 다중 특이성 항체는 복수의 항원 결합 도메인을 갖고, 그 중, 표적 항원을 인식하여 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 표적 항원 결합 부위로서 기능하고, 면역 수용체를 인식하여 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 면역 수용체 인식 부위로서 기능한다. 따라서, 모두 다중 특이성 항체의 표적 항원 결합 부위 및 면역 수용체 인식 부위는, 모두 다중 특이성 항체의 항원 결합 도메인에 해당한다.
항원 결합 분자가 인식하는 면역 수용체의 예로서는, T 세포 상의 면역 수용체, 및 내추럴 킬러(NK) 세포 상의 면역 수용체를 들 수 있다. 그 구체적인 예로서는, TIGIT, PD-1, PD-L1, TIM-3, LAG-3, BTLA, CD268, CD267, CD266, CD226, CD160, CD137, CD96, CD70, CD47, CD40, CD30, CD28, CD27, CD18, NKG2D, VISTA, ICOS, B7-HE, GITR, OX40, KIR, SLAM7, CTLA-4, RANK, 오스테오프로테게린, BCMA, TNFR1, TNFR2, Fas, DR1, DR2, DR3, DR4, DR5, DR6, HVEM, NGFR, EDA2R, TR6, TROY 등을 들 수 있다.
하나의 태양에 있어서, 항원 결합 분자의 면역 수용체 인식 부위는, 종양괴사 인자 리셉터 슈퍼패밀리(TNFRSF)에 속하는 공자극 분자에 대한 아고니스트 항체(이하, TNFRSF의 아고니스트 항체라고 칭한다) 또는 그 항원 결합 단편을 이용할 수 있다. TNFRSF의 아고니스트 항체는, 100%의 활성화가, 등몰량의 결합 파트너에 의해 생리학적 조건하에서 달성되는 활성화 레벨인 경우에, TNF 수용체 슈퍼패밀리를 발현하는 세포, 조직 또는 생체에 부가되면, 해당 TNF 수용체 슈퍼패밀리를 발현하는 세포를 적어도 약 5%, 구체적으로는 적어도 약 10%, 보다 구체적으로는 적어도 약 15% 활성화하는 항체를 의미한다. 여러 가지 구체예에 있어서, 본 발명의 의약 조성물로서 사용하는 TNFRSF의 아고니스트 항체는, 해당 세포의 활성을, 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 750%, 1000% 또는 그 이상 활성화시킬 수 있다. 본 발명의 하나의 태양에 있어서, 항원 결합 분자의 면역 수용체 인식 부위는, 내인성의 면역 수용체에 아고니스트로서 결합하고, 또한 본 발명의 키메라 수용체에 대해서도 아고니스트로서 결합한다.
TNFRSF의 아고니스트 항체의 표적 분자로서는, TNF 수용체 슈퍼패밀리를 발현하는 세포(예를 들어, T 세포나 NK 세포 등)를 활성화하는 인자인 한 특별히 제한되지 않는다. 바람직한 인자로서는, 예를 들어 CD137, CD40을 들 수 있다. 더 바람직한 인자로서는, 예를 들어 CD137을 들 수 있다. 예를 들어, CD137 아고니스트 항체의 예로서는, Urelumab(CAS 등록 번호: 934823-49-1)나 여러 가지 공지된 CD137 아고니스트 항체를 들 수 있다.
CD137 아고니스트 항체의 예로서, 예를 들어 WO2015/156268에 기재된 서열 번호 등으로 나타나는 이하의 항체를 들 수 있다:
[1] 중쇄 가변 영역으로서 서열 번호 66에 기재된 아미노산 서열, 및 경쇄 가변 영역으로서 서열 번호 85에 기재된 아미노산 서열을 갖는 항체;
[2] 중쇄 가변 영역으로서 서열 번호 67에 기재된 아미노산 서열, 및 경쇄 가변 영역으로서 서열 번호 86에 기재된 아미노산 서열을 갖는 항체;
[3] 중쇄 가변 영역으로서 서열 번호 70에 기재된 아미노산 서열, 및 경쇄 가변 영역으로서 서열 번호 89에 기재된 아미노산 서열을 갖는 항체;
[4] 중쇄 가변 영역으로서 서열 번호 76에 기재된 아미노산 서열, 및 경쇄 가변 영역으로서 서열 번호 95에 기재된 아미노산 서열을 갖는 항체;
[5] 중쇄 가변 영역으로서 서열 번호 77에 기재된 아미노산 서열, 및 경쇄 가변 영역으로서 서열 번호 96에 기재된 아미노산 서열을 갖는 항체;
[6] 중쇄 가변 영역으로서 서열 번호 78에 기재된 아미노산 서열, 및 경쇄 가변 영역으로서 서열 번호 97에 기재된 아미노산 서열을 갖는 항체;
[7] [1]∼[6] 중 어느 하나에 기재된 항체로서, 중쇄 정상 영역으로서 서열 번호 99에 기재된 아미노산 서열, 및 경쇄 정상 영역으로서 서열 번호 59에 기재된 아미노산 서열 또는 서열 번호 60에 기재된 아미노산 서열을 갖는 항체;
[8] [1]∼[7] 중 어느 하나에 기재된 항체와 동등한 활성을 갖는 항체;
[9] [1]∼[7] 중 어느 하나에 기재된 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체.
상기 [8]에 기재된 항체에 있어서, 「동등한 활성」이란, CD137에의 아고니스트 활성이 상기 [1]∼[7] 중 어느 하나에 기재된 항체의 결합 활성의 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상인 것을 말한다.
또한 본 발명은, 상기 [9]에 기재된, 본 발명에서 개시된 항CD137 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체도 또한 제공한다. 이와 같은 항체는, 예를 들어, 이하의 방법에 의해 얻을 수 있다.
상기 [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 기재된 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체의 바람직한 예로서, 예를 들어, CD137 단백질 중의 SPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGC의 서열(WO2015/156268에 기재된 서열 번호 15)을 갖는 영역을 인식하는 항체를 들 수 있다. 또한, CD137 단백질 중의 DCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGC의 서열(WO2015/156268에 기재된 서열 번호 16)을 갖는 영역을 인식하는 항체를 들 수 있다.
전술한 항인간 CD137 항체를 종양 특이적 항원 항체(예를 들어, 항인간 GPC3 항체)와의 이중 특이성 항체로 개변하여, 종양 특이적 항원 의존적 CD137 아고니스트능을 평가함으로써, 소망의 효과를 발휘하는 항종양 항원/항인간 CD137 이중 특이성 항체를 제공할 수 있고, 당해 항체는 본 발명의 항원 결합 분자로서 사용할 수 있다.
항원 중에 존재하는 항원 결정기를 의미하는 에피토프는, 본 명세서에 있어서 개시되는 항원 결합 분자가 결합하는 항원(표적 항원 또는 면역 수용체) 상의 부위를 의미한다. 따라서, 예를 들어, 에피토프는, 그 구조에 의해 정의될 수 있다. 또한, 당해 에피토프를 인식하는 항원 결합 분자의 항원에 대한 결합 활성에 의해서도 당해 에피토프가 정의될 수 있다. 항원이 펩티드 또는 폴리펩티드인 경우에는, 에피토프를 구성하는 아미노산 잔기에 의해 에피토프를 특정하는 것도 가능하다. 또한, 에피토프가 당쇄인 경우에는, 특정의 당쇄 구조에 의해 에피토프를 특정하는 것도 가능하다.
선상 에피토프는, 아미노산 1차 서열이 인식된 에피토프를 포함하는 에피토프이다. 선상 에피토프는, 전형적으로는, 적어도 3개, 및 가장 보통으로는 적어도 5개, 예를 들어 약 8 내지 약 10개, 6 내지 20개의 아미노산이 고유의 서열에 있어서 포함된다.
입체 에피토프는, 선상 에피토프와는 대조적으로, 에피토프를 포함하는 아미노산의 1차 서열이, 인식된 에피토프의 단일의 규정 성분이 아닌 에피토프(예를 들어, 아미노산의 1차 서열이, 반드시 에피토프를 규정하는 항체에 의해 인식되지 않는 에피토프)이다. 입체 에피토프는, 선상 에피토프에 대해서 증대한 수의 아미노산을 포함할지도 모른다. 입체 에피토프의 인식에 관해서, 항원 결합 분자의 표적 항원 인식 부위 또는 면역 수용체 인식 부위는, 펩티드 또는 단백질의 삼차원 구조를 인식한다. 예를 들어, 단백질 분자가 절첩되어 삼차원 구조를 형성하는 경우에는, 입체 에피토프를 형성하는 어느 아미노산 및/또는 폴리펩티드 주쇄는, 병렬이 되어, 항체가 에피토프를 인식하는 것을 가능하게 한다. 에피토프의 입체 구조를 결정하는 방법에는, 예를 들어 X선 결정학, 2차원 핵자기 공명 분광학 및 부위 특이적인 스핀 표지 및 전자 상자성 공명 분광학이 포함되지만, 이들로는 한정되지 않는다. 예를 들어, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology (1996), 제66권, Morris(편)를 참조.
표적 항원 또는 면역 수용체의 에피토프에 결합하는 항원 결합 분자의 표적 항원 인식 부위 또는 면역 수용체 인식 부위의 구조는 파라토프라고 불린다. 에피토프와 파라토프 사이에 작용하는, 수소 결합, 정전기력, 반데르발스력, 소수 결합 등에 의해 에피토프와 파라토프는 안정되게 결합한다. 이 에피토프와 파라토프 사이의 결합력은 어피니티(affinity)로 불린다. 복수의 항원과 복수의 항원 결합 도메인이 결합할 때의 결합력의 총합은 아비디티(avidity)로 불린다. 복수의 항원 결합 도메인을 포함하는(즉 다가의) 항체 등이 복수의 에피토프에 결합할 때에는, 결합력(affinity)이 상승적으로 작용하기 때문에, 아비디티는 어피니티보다도 높아진다.
특정의 실시태양에 있어서, 본 명세서에서 제공되는 항원 결합 분자는, ≤1μM, ≤100nM, ≤10nM, ≤1nM, ≤0.1nM, ≤0.01nM 또는 ≤0.001nM(예를 들어, 10-8(1E-08)M 이하, 예를 들어 10-8(1E-08)M∼10-13(1E-13)M, 예를 들어 10-9(1E-09)M∼10-13(1E-13)M)의 해리 상수(Kd)를 갖는다.
이하에 항원에 대한 항원 결합 도메인, 또는 표적 항원 인식 부위 또는 면역 수용체 인식 부위로서의 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자에 의한 에피토프에의 결합의 확인 방법이 이하의 예시에 준하여 적절히 실시될 수 있다.
예를 들어, 항원이 세포 표면에 발현하는 수용체의 경우에 그 항원에 대한 항원 결합 도메인이, 어느 항원 분자 중에 존재하는 선상 에피토프를 인식하는 것은, 예를 들어 다음과 같이 하여 확인할 수 있다. 상기의 목적을 위해서 어느 항원의 세포외 도메인을 구성하는 아미노산 서열로 이루어지는 선상의 펩티드가 합성된다. 당해 펩티드는, 화학적으로 합성될 수 있다. 혹은, 어느 항원의 cDNA 중의, 세포외 도메인에 상당하는 아미노산 서열을 코딩하는 영역을 이용하여, 유전자 공학적 수법에 의해 얻어진다. 다음에, 세포외 도메인을 구성하는 아미노산 서열로 이루어지는 선상 펩티드와, 어느 항원에 대한 항원 결합 도메인의 결합 활성이 평가된다. 예를 들어, 고정화된 선상 펩티드를 항원으로 하는 ELISA에 의해, 당해 펩티드에 대한 당해 항원 결합 도메인의 결합 활성이 평가될 수 있다. 혹은, 어느 항원 발현 세포에 대한 당해 항원 결합 도메인의 결합에 있어서의, 선상 펩티드에 의한 저해의 레벨에 기초하여, 선상 펩티드에 대한 결합 활성이 밝혀질 수 있다. 이들 시험에 의해, 선상 펩티드에 대한 당해 항원 결합 도메인의 결합 활성이 밝혀질 수 있다.
또한, 표적 항원 인식 부위 또는 면역 수용체 인식 부위가 입체 에피토프를 인식하는 것은, 다음과 같이 하여 확인될 수 있다. 표적 항원 또는 면역 수용체를 발현하는 세포가 조제된다. 표적 항원 또는 면역 수용체에 대한 표적 항원 인식 부위 또는 면역 수용체 인식 부위가 어느 상기 세포에 접촉했을 때에 당해 세포에 강하게 결합하는 한편으로, 상기 인식 부위가, 고정화된 어느 표적 항원 또는 면역 수용체를 구성하는 아미노산 서열로 이루어지는 선상 펩티드에 대해서, 또는 구아니딘 등의 일반적인 변성제를 이용하여 변성된 어느 표적 항원 또는 면역 수용체의 세포외 도메인을 구성하는 아미노산 서열로 이루어지는 선상 펩티드에 대해서 실질적으로 결합하지 않을 때 등을 들 수 있다. 여기에서, 실질적으로 결합하지 않는이란, 후자의 결합 활성이, 표적 항원 또는 면역 수용체 발현 세포에 대한 결합 활성의 80% 이하, 통상 50% 이하, 바람직하게는 30% 이하, 특히 바람직하게는 15% 이하인 경우를 말한다.
또한, 항원 결합 분자의 표적 항원 또는 면역 수용체에 대한 결합 활성을 확인하는 방법으로서, 예를 들어, 방사성 표지 항원 결합 측정법(radiolabeled antigen binding assay: RIA)에 의해 Kd치를 측정하는 방법이 있다. 일 실시태양에 있어서, RIA는, 항원 결합 분자 및 표적 항원 또는 면역 수용체 또는 그들의 단편을 이용하여 실시된다. 예를 들어, 항원 결합 분자의 용액중 결합 어피니티는, 비표지 항원의 점증량 계열의 존재하에서 최소 농도의 (125I) 표지 항원에 의해 항원 결합 도메인을 평형화시키고, 그 다음에 결합한 항원을 항원 결합 도메인으로 코팅된 플레이트에 의해 포착하는 것에 의해 측정된다(예를 들어, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)을 참조할 것).
다른 실시태양에 의하면, Kd는, BIACORE(등록상표)를 이용한 표면 플라즈몬 공명법으로 측정된다. 예를 들어, BIACORE(등록상표)-2000 또는 BIACORE(등록상표)-3000(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)을 이용하는 측정법이, 대략 10반응 단위(response unit: RU)의 항원이 고정된 CM5 칩을 이용하여 25℃에서 실시된다. 일 실시태양에 있어서, 카복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩(CM5, BIACORE, Inc.)은, 공급원의 지시에 따라 N-에틸-N'-(3-다이메틸아미노프로필)-카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시석신이미드(NHS)를 이용하여 활성화된다. 항원은, 대략 10반응 단위(RU)의 단백질의 결합을 달성하도록, 5μl/분의 유속으로 주입되기 전에, 10mM 아세트산 나트륨, pH4.8을 이용하여 5μg/ml(대략 0.2μM)로 희석된다. 항원의 주입 후, 미반응기를 블록하기 위해서 1M 에탄올 아민이 주입된다. 키네틱스의 측정을 위해서, 25℃, 대략 25μl/분의 유속으로, 0.05% 폴리소르베이트 20(TWEEN-20(등록상표)) 계면활성제 함유 PBS(PBST) 중의 항원 결합 분자(표적 항원 인식 부위 또는 면역 수용체 인식 부위)의 2배 단계 희석물(0.78nM∼500nM)이 주입된다. 결합 속도(kon) 및 해리 속도(koff)는, 단순한 1대1 랭뮤어 결합 모델(BIACORE(등록상표) 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 이용하여, 결합 및 해리의 센서그램을 동시에 피팅하는 것에 의해 계산된다. 평형 해리 상수(Kd)는, koff/kon비로서 계산된다. 더욱이, 평형법 해석을 이용함으로써, 겉보기 해리 상수(Kd)를 구하는 것도 가능하다. 이들 방법은 BIACORE(등록상표)에 부속되어 있는 프로토콜을 참조한다. 예를 들어, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)이나 Methods Enzymol. 2000;323:325-40.을 참조할 것. 또한, 표면 플라즈몬 공명 어세이에 있어서, 고상화하는 단백질량이나 반응에 이용하는 단백질량, 온도, 용액 조성은 당업자이면 어떠하게도 바꿀 수 있다. 상기의 표면 플라즈몬 공명 어세이에 의해 온 속도가 106M-1s-1을 초과하는 경우, 온 속도는, 분광계(예를 들어 스톱 플로식 분광 광도계(Aviv Instruments) 또는 교반 큐벳을 이용하는 8000 시리즈의 SLM-AMINCO(상표) 분광 광도계(ThermoSpectronic))에 있어서 측정되는, 점증 농도의 항원의 존재하에서의 PBS, pH7.2 중 20nM의 항원 결합 도메인의 25℃에서의 형광 발광 강도(여기=295nm; 발광=340nm, 밴드 패스 16nm)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 소광 기술을 이용하는 것에 의해 결정될 수 있다.
더욱이, 항원 결합 분자의 표적 항원 또는 면역 수용체에의 결합 활성은, 전기 화학 발광법 등, 기지의 분자간 상호작용의 측정 방법으로도 측정할 수 있다. 또한 본 명세서에 기재되는 어세이에 있어서 사용되는 항원 결합 분자 대신에, 표적 항원 인식 부위 또는 면역 수용체 인식 부위에 대응하는 단편을 이용할 수 있고, 표적 항원 인식 부위 또는 면역 수용체 인식 부위로서, 표적 항원 인식 부위 또는 면역 수용체 인식 부위에 대응하는 단편, 또는 항원 결합 분자를 이용할 수 있다.
항원 결합 분자의 표적 항원 또는 면역 수용체의 발현 세포에 대한 결합 활성을 측정하는 방법으로서는, 예를 들어, Antibodies A Laboratory Manual에 기재된 방법(Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) 359-420)을 들 수 있다. 즉 표적 항원 또는 면역 수용체의 발현 세포를 항원으로 하는 ELISA나 FACS(fluorescence activated cell sorting)의 원리에 의해 평가될 수 있다.
ELISA 포맷에 있어서, 항원 결합 분자의 결합 활성은, 효소 반응에 의해 생성하는 시그널 레벨을 비교하는 것에 의해 정량적으로 평가된다. 즉, 어느 항원의 발현 세포를 고정화한 ELISA 플레이트에 피험 항원 결합 분자를 가하고, 세포에 결합한 피험 항원 결합 분자가, 피험 항원 결합 도메인을 인식하는 효소 표지 항체를 이용하여 검출된다. 혹은 FACS에 있어서는, 피험 항원 결합 분자의 희석 계열을 작성하고, 어느 항원의 발현 세포에 대한 항체 결합 역가(titer)를 결정하는 것에 의해, 어느 항원의 발현 세포에 대한 피험 항원 결합 분자의 결합 활성이 비교될 수 있다.
완충액 등에 현탁한 세포 표면 상에 발현하고 있는 표적 항원 또는 면역 수용체에 대한 피험 항원 결합 분자의 결합은, 플로 사이토미터에 의해 검출할 수 있다. 플로 사이토미터로서는, 예를 들어, 다음과 같은 장치가 알려져 있다.
FACSCantoTMII
FACSAriaTM
FACSArrayTM
FACSVantageTMSE
FACSCaliburTM(모두 BD Biosciences사의 상품명)
EPICS ALTRA HyPerSort
Cytomics FC 500
EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC
Cell Lab Quanta / Cell Lab Quanta SC(모두 Beckman Coulter사의 상품명).
항원 결합 분자의 표적 항원 또는 면역 수용체에 대한 결합 활성의 호적한 측정 방법의 일례로서, 다음의 방법을 들 수 있다. 우선, 어느 항원을 발현하는 세포와 반응시킨 피험 항원 결합 분자를 인식하는 FITC 표지한 2차 항체로 염색한다. 피험 항원 결합 분자를 적절히 호적한 완충액에 의해 희석하는 것에 의해, 당해 항원 결합 분자가 소망의 농도로 조제되어 이용된다. 예를 들어, 10μg/ml로부터 10ng/ml까지의 사이의 어느 농도로 사용될 수 있다. 다음에, FACSCaliburTM(BD사)에 의해 형광 강도와 세포수가 측정된다. 당해 세포에 대한 항원 결합 분자의 결합량은, CELL QUEST Software(BD사)를 이용하여 해석하는 것에 의해 얻어진 형광 강도, 즉 Geometric Mean의 값에 반영된다. 즉, 당해 Geometric Mean의 값을 얻는 것에 의해, 피험 항원 결합 분자의 결합량에 의해 표시되는 피험 항원 결합 분자의 결합 활성이 측정될 수 있다.
어느 항원 결합 분자가, 다른 항원 결합 분자와 에피토프를 공유하는 것은, 양자의 동일한 에피토프에 대한 경합에 의해 확인될 수 있다. 항원 결합 분자간의 경합은, 교차 블로킹 어세이 등에 의해 검출된다. 예를 들어 경합 ELISA 어세이는, 바람직한 교차 블로킹 어세이이다.
구체적으로는, 교차 블로킹 어세이에 있어서는, 마이크로타이터 플레이트의 웰 상에 코팅한 어느 표적 항원 유래 또는 면역 수용체 유래의 항원 단백질이, 후보가 되는 경합 항원 결합 분자의 존재하, 또는 비존재하에서 프리(pre)인큐베이트된 후에, 피험 항원 결합 분자가 첨가된다. 웰 중의 어느 항원 단백질에 결합한 피험 항원 결합 분자의 양은, 동일한 에피토프에의 결합에 대해서 경합하는 후보가 되는 경합 항원 결합 분자의 결합능에 간접적으로 상관하고 있다. 즉 동일 에피토프에 대한 경합 항원 결합 분자의 친화성이 커지면 커질수록, 피험 항원 결합 분자의 어느 항원 단백질을 코팅한 웰에의 결합 활성은 저하된다.
항원 단백질을 개재시켜 웰에 결합한 피험 항원 결합 분자의 양은, 미리 항원 결합 분자를 표지해 두는 것에 의해, 용이하게 측정될 수 있다. 예를 들어, 비오틴 표지된 항원 결합 분자는, 아비딘 퍼옥시다제 컨주게이트와 적절한 기질을 사용하는 것에 의해 측정된다. 퍼옥시다제 등의 효소 표지를 이용한 교차 블로킹 어세이는, 특히 경합 ELISA 어세이라고 한다. 항원 결합 분자는, 검출 혹은 측정이 가능한 다른 표지 물질로 표지될 수 있다. 구체적으로는, 방사 표지 혹은 형광 표지 등이 공지이다.
후보의 경합 항원 결합 분자 회합체의 비존재하에서 실시되는 컨트롤 시험에 있어서 얻어지는 결합 활성과 비교하여, 경합 항원 결합 분자가, 어느 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합을 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 20-50%, 더 바람직하게는 적어도 50% 블록할 수 있다면, 당해 피험 항원 결합 분자는 경합 항원 결합 분자와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하거나, 또는 동일한 에피토프에의 결합에 대해서 경합하는 항원 결합 분자이다.
항원 결합 분자가 결합하는 에피토프의 구조가 동정되어 있는 경우에는, 피험 항원 결합 분자와 대조 항원 결합 분자가 에피토프를 공유하는 것은, 당해 에피토프를 구성하는 펩티드에 아미노산 변이를 도입한 펩티드 혹은 폴리펩티드에 대한 양자의 항원 결합 분자의 결합 활성을 비교하는 것에 의해 평가될 수 있다.
이러한 결합 활성을 측정하는 방법으로서는, 예를 들어, 상기의 ELISA 포맷에 있어서 변이를 도입한 선상의 펩티드에 대한 피험 항원 결합 분자 및 대조 항원 결합 분자의 결합 활성을 비교하는 것에 의해 측정될 수 있다. ELISA 이외의 방법으로서는, 칼럼에 결합한 당해 변이 펩티드에 대한 결합 활성을, 당해 칼럼에 피검 항원 결합 분자와 대조 항원 결합 분자를 유하(流下)시킨 후에 용출액 중에 용출되는 항원 결합 분자를 정량하는 것에 의해서도 측정될 수 있다. 변이 펩티드를 예를 들어 GST와의 융합 펩티드로서 칼럼에 흡착시키는 방법은 공지이다.
또한, 동정된 에피토프가 입체 에피토프인 경우에는, 피험 항원 결합 분자와 대조 항원 결합 분자가 에피토프를 공유하는 것은, 다음의 방법으로 평가 될 수 있다. 우선, 어느 항원을 발현하는 세포와 에피토프에 변이가 도입된 어느 항원을 발현하는 세포가 조제된다. 이들 세포가 PBS 등의 적절한 완충액에 현탁된 세포 현탁액에 대해서 피험 항원 결합 분자와 대조 항원 결합 분자가 첨가된다. 그 다음에, 적절히 완충액으로 세정된 세포 현탁액에 대해서, 피험 항원 결합 분자와 대조 항원 결합 분자를 인식할 수 있는 FITC 표지된 항체가 첨가된다. 표지 항체에 의해 염색된 세포의 형광 강도와 세포수가 FACSCaliburTM(BD사)에 의해 측정된다. 피험 항원 결합 분자와 대조 항원 결합 분자의 농도는 호적한 완충액에 의해 적절히 희석하는 것에 의해 소망의 농도로 조제하여 이용된다. 예를 들어, 10μg/ml로부터 10ng/ml까지의 사이의 어느 농도로 사용된다. 당해 세포에 대한 표지 항체의 결합량은, CELL QUESTTM Software(BD사)를 이용하여 해석하는 것에 의해 얻어진 형광 강도, 즉 Geometric Mean의 값에 반영된다. 즉, 당해 Geometric Mean의 값을 얻는 것에 의해, 표지 항체의 결합량에 의해 표시되는 피험 항원 결합 분자와 대조 항원 결합 분자의 결합 활성을 측정할 수 있다.
더욱이, 항원 결합 분자가 다른 항원 결합 분자와 동일한 에피토프에 대한 경합의 확인은, 상기의 ELISA나 FACS 이외에, 방사성 표지 항원 결합 측정법(radiolabeled antigen binding assay: RIA), BIACORE(등록상표) 표면 플라즈몬 공명 어세이, 전기 화학 발광법 등을 이용할 수도 있다.
해석에 의해 얻어지는 피험 항원 결합 분자의 변이된 어느 항원의 발현 세포에 대한 결합량이 반영된 Geometric Mean 비교치(변이된 어느 항원의 분자 ΔGeo-Mean치)를, 피험 항원 결합 분자의 어느 항원의 발현 세포에 대한 결합량이 반영된 ΔGeo-Mean 비교치와 비교한다. 이 경우에 있어서, 변이된 어느 항원의 발현 세포 및 어느 항원의 발현 세포에 대한 ΔGeo-Mean 비교치를 구할 때에 사용하는 피험 항원 결합 분자의 농도는 서로 동일 또는 실질적으로 동일한 농도로 조제되는 것이 특히 바람직하다. 미리 어느 항원 중의 에피토프를 인식하고 있는 것이 확인된 항원 결합 분자가, 대조 항원 결합 분자로서 이용된다.
피험 항원 결합 분자의 변이된 어느 항원의 발현 세포에 대한 ΔGeo-Mean 비교치가, 피험 항원 결합 분자의 어느 항원의 발현 세포에 대한 ΔGeo-Mean 비교치의, 적어도 80%, 바람직하게는 50%, 더 바람직하게는 30%, 특히 바람직하게는 15%보다 작으면, 「변이된 어느 항원의 발현 세포에 실질적으로 결합하지 않는」 것으로 한다. Geo-Mean치(Geometric Mean)를 구하는 계산식은, CELL QUEST Software User's Guide(BD biosciences사)에 기재되어 있다. 비교치를 비교하는 것에 의해 그것이 실질적으로 동일시할 수 있는 정도이면, 피험 항원 결합 분자와 대조 항원 결합 분자의 에피토프는 동일하다고 평가될 수 있다.
본 명세서에서 용어 「운반 부분」은, 항원 결합 분자 중의 표적 항원 인식 부위 및 면역 수용체 인식 부위 이외의 부분을 말한다. 본 발명의 운반 부분은 통상, 아미노산에 의해 구성된 펩티드 또는 폴리펩티드이며, 구체적인 일 실시태양으로서，항원 결합 분자 중의 운반 부분은 표적 항원 인식 부위 및 면역 수용체 인식 부위와 연결되어 있다. 본 발명의 운반 부분은, 아마이드 결합에 의해 이어진 일련의 펩티드 혹은 폴리펩티드여도 되고, 복수의 펩티드 혹은 폴리펩티드가 다이설파이드 결합 등의 공유 결합 혹은 수소 결합, 소수성 상호작용 등의 비공유 결합에 의해 형성된 복합체여도 된다.
항원 결합 분자가 항체인 경우, 혈중 반감기를 연장하는 일 실시태양으로서, 항원 결합 분자에 FcRn 결합성을 부여하는 것을 들 수 있다. FcRn 결합성을 부여하려면, 통상, 항원 결합 분자 중에 FcRn 결합 영역을 마련하는 방법이 있다. FcRn 결합 영역이란, FcRn에 결합성을 가지는 영역을 말하고, FcRn에의 결합성을 가지는 한 어떤 구조라도 사용 가능하다.
FcRn 결합 영역을 포함하는 것에 의해, FcRn의 샐비지 경로에 의해 세포 내에 흡수된 후에 다시 혈장 중으로 되돌아가는 것이 가능해진다. 예를 들어, IgG 분자의 혈장중 체류성이 비교적 긴(소실이 느린) 것은, IgG 분자의 샐비지 리셉터로서 알려져 있는 FcRn가 기능하고 있기 때문이다. 피노사이토시스에 의해 엔도솜에 흡수된 IgG 분자는, 엔도솜 내의 산성 조건하에 있어서 엔도솜 내에 발현하고 있는 FcRn에 결합한다. FcRn에 결합할 수 없었던 IgG 분자는 라이소솜으로 진행되어 거기에서 분해되지만, FcRn에 결합한 IgG 분자는 세포 표면에 이행하여 혈장 중의 중성 조건하에 있어서 FcRn으로부터 해리됨으로써 다시 혈장 중으로 되돌아간다.
FcRn 결합 영역은, 직접 FcRn과 결합하는 영역인 것이 바람직하다. FcRn 결합 영역의 바람직한 예로서, 항체의 Fc 영역을 들 수 있다. 그렇지만, 알부민이나 IgG 등의 FcRn과의 결합능을 갖는 폴리펩티드에 결합 가능한 영역은, 알부민이나 IgG 등을 개재시켜 간접적으로 FcRn과 결합하는 것이 가능하므로, 본 발명에 있어서의 FcRn 결합 영역은 그와 같은 FcRn과의 결합능을 갖는 폴리펩티드에 결합하는 영역이어도 된다.
본 발명에 있어서의 FcRn 결합 영역의 FcRn, 특히 인간 FcRn에 대한 결합 활성은, 상기 결합 활성의 항에서 기술되어 있는 바와 같이, 당업자에게 공지된 방법에 의해 측정하는 것이 가능하고, 조건에 대해서는 당업자가 적절히 결정하는 것이 가능하다. 인간 FcRn에의 결합 활성은, KD(Dissociation constant: 해리 상수), 겉보기 KD(Apparent dissociation constant: 겉보기 해리 상수), 해리 속도인 kd(Dissociation rate: 해리 속도), 또는 겉보기 kd(Apparent dissociation: 겉보기 해리 속도) 등으로서 평가될 수 있다. 이들은 당업자 공지의 방법으로 측정될 수 있다. 예를 들어 Biacore(GE healthcare), 스캐처드 플롯, 플로 사이토미터 등을 사용할 수 있다.
FcRn 결합 영역의 FcRn에 대한 결합 활성을 측정할 때의 조건은 당업자가 적절히 선택하는 것이 가능하고, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, WO2009/125825에 기재되어 있는 바와 같이 MES 버퍼, 37℃의 조건에 있어서 측정될 수 있다. 또한, 본 발명의 FcRn 결합 영역의 FcRn에 대한 결합 활성의 측정은 당업자 공지의 방법에 의해 행하는 것이 가능하고, 예를 들어, Biacore(GE Healthcare) 등을 이용하여 측정될 수 있다.
측정 조건에 사용되는 pH로서, FcRn 결합 영역과 FcRn의 결합 어피니티는, pH4.0∼pH6.5의 임의의 pH에서 평가해도 된다. 바람직하게는, FcRn 결합 영역과 인간 FcRn의 결합 어피니티를 결정하기 위해서, 생체 내의 조기 엔도솜 내의 pH에 가까운 pH5.8∼pH6.0의 pH가 사용된다. 측정 조건에 사용되는 온도로서, FcRn 결합 영역과 FcRn의 결합 어피니티는, 10℃∼50℃의 임의의 온도에서 평가해도 된다. 바람직하게는, FcRn 결합 영역과 인간 FcRn의 결합 어피니티를 결정하기 위해서, 15℃∼40℃의 온도가 사용된다. 보다 바람직하게는, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 및 35℃의 어느 하나와 같은 20℃로부터 35℃까지의 임의의 온도도 마찬가지로, FcRn 결합 영역과 FcRn의 결합 어피니티를 결정하기 위해서 사용된다. 25℃라고 하는 온도는 본 발명의 태양의 비한정적인 일례이다.
FcRn 결합 영역의 하나의 예로서, 그것만으로 한정되지 않지만, 예를 들어, IgG 항체 Fc 영역을 들 수 있다. IgG 항체의 Fc 영역을 이용하는 경우, 그 종류는 한정되지 않고, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 등의 Fc 영역을 이용하는 것이 가능하다.
또한, 천연형 IgG 항체의 Fc 영역은 물론, FcRn 결합성을 갖는 한, 1개 또는 그 이상의 아미노산이 치환된 개변 Fc 영역도 사용 가능하다.
예를 들어, IgG 항체 Fc 영역에 있어서의 EU 넘버링 237번째, 238번째, 239번째, 248번째, 250번째, 252번째, 254번째, 255번째, 256번째, 257번째, 258번째, 265번째, 270번째, 286번째, 289번째, 297번째, 298번째, 303번째, 305번째, 307번째, 308번째, 309번째, 311번째, 312번째, 314번째, 315번째, 317번째, 325번째, 332번째, 334번째, 360번째, 376번째, 380번째, 382번째, 384번째, 385번째, 386번째, 387번째, 389번째, 424번째, 428번째, 433번째, 434번째 및 436번째로부터 선택되는 적어도 1개의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환한 아미노산 서열을 포함하는 개변 Fc 영역을 사용하는 것은 가능하다.
보다 구체적으로는, IgG 항체 Fc 영역에 있어서의 EU 넘버링
237번째의 Gly를 Met로 치환하는 아미노산 치환,
238번째의 Pro를 Ala로 치환하는 아미노산 치환,
239번째의 Ser을 Lys로 치환하는 아미노산 치환,
248번째의 Lys를 Ile로 치환하는 아미노산 치환,
250번째의 Thr을 Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp, 또는 Tyr로 치환하는 아미노산 치환,
252번째의 Met를 Phe, Trp, 또는 Tyr로 치환하는 아미노산 치환,
254번째의 Ser을 Thr로 치환하는 아미노산 치환,
255번째의 Arg를 Glu로 치환하는 아미노산 치환,
256번째의 Thr을 Asp, Glu, 또는 Gln으로 치환하는 아미노산 치환,
257번째의 Pro를 Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr, 또는 Val로 치환하는 아미노산 치환,
258번째의 Glu를 His로 치환하는 아미노산 치환,
265번째의 Asp를 Ala로 치환하는 아미노산 치환,
270번째의 Asp를 Phe로 치환하는 아미노산 치환,
286번째의 Asn을 Ala 또는 Glu로 치환하는 아미노산 치환,
289번째의 Thr을 His로 치환하는 아미노산 치환,
297번째의 Asn을 Ala로 치환하는 아미노산 치환,
298번째의 Ser을 Gly로 치환하는 아미노산 치환,
303번째의 Val을 Ala로 치환하는 아미노산 치환,
305번째의 Val을 Ala로 치환하는 아미노산 치환,
307번째의 Thr을 Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp, 또는 Tyr로 치환하는 아미노산 치환,
308번째의 Val을 Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln, 또는 Thr로 치환하는 아미노산 치환,
309번째의 Leu 또는 Val을 Ala, Asp, Glu, Pro, 또는 Arg로 치환하는 아미노산 치환,
311번째의 Gln을 Ala, His, 또는 Ile로 치환하는 아미노산 치환,
312번째의 Asp를 Ala 또는 His로 치환하는 아미노산 치환,
314번째의 Leu를 Lys 또는 Arg로 치환하는 아미노산 치환,
315번째의 Asn을 Ala 또는 His로 치환하는 아미노산 치환,
317번째의 Lys를 Ala로 치환하는 아미노산 치환,
325번째의 Asn을 Gly로 치환하는 아미노산 치환,
332번째의 Ile를 Val로 치환하는 아미노산 치환,
334번째의 Lys를 Leu로 치환하는 아미노산 치환,
360번째의 Lys를 His로 치환하는 아미노산 치환,
376번째의 Asp를 Ala로 치환하는 아미노산 치환,
380번째의 Glu를 Ala로 치환하는 아미노산 치환,
382번째의 Glu를 Ala로 치환하는 아미노산 치환,
384번째의 Asn 또는 Ser을 Ala로 치환하는 아미노산 치환,
385번째의 Gly를 Asp 또는 His로 치환하는 아미노산 치환,
386번째의 Gln을 Pro로 치환하는 아미노산 치환,
387번째의 Pro를 Glu로 치환하는 아미노산 치환,
389번째의 Asn을 Ala 또는 Ser로 치환하는 아미노산 치환,
424번째의 Ser을 Ala로 치환하는 아미노산 치환,
428번째의 Met를 Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp, 또는 Tyr로 치환하는 아미노산 치환,
433번째의 His를 Lys로 치환하는 아미노산 치환,
434번째의 Asn을 Ala, Phe, His, Ser, Trp, 또는 Tyr로 치환하는 아미노산 치환, 및
436번째의 Tyr 또는 Phe를 His로 치환하는 아미노산 치환
으로부터 선택되는 적어도 1개의 아미노산 치환을 포함하는, 개변 Fc 영역을 사용하는 것은 가능하다.
다른 면으로부터 보면, IgG 항체 Fc 영역에 있어서의, EU 넘버링
237번째의 아미노산에 있어서의 Met,
238번째의 아미노산에 있어서의 Ala,
239번째의 아미노산에 있어서의 Lys,
248번째의 아미노산에 있어서의 Ile,
250번째의 아미노산에 있어서의 Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp, 또는 Tyr,
252번째의 아미노산에 있어서의 Phe, Trp, 또는 Tyr,
254번째의 아미노산에 있어서의 Thr,
255번째의 아미노산에 있어서의 Glu,
256번째의 아미노산에 있어서의 Asp, Glu, 또는 Gln,
257번째의 아미노산에 있어서의 Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr, 또는 Val,
258번째의 아미노산에 있어서의 His,
265번째의 아미노산에 있어서의 Ala,
270번째의 아미노산에 있어서의 Phe,
286번째의 아미노산에 있어서의 Ala 또는 Glu,
289번째의 아미노산에 있어서의 His,
297번째의 아미노산에 있어서의 Ala,
298번째의 아미노산에 있어서의 Gly,
303번째의 아미노산에 있어서의 Ala,
305번째의 아미노산에 있어서의 Ala,
307번째의 아미노산에 있어서의 Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp, 또는 Tyr,
308번째의 아미노산에 있어서의 Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln, 또는 Thr,
309번째의 아미노산에 있어서의 Ala, Asp, Glu, Pro, 또는 Arg,
311번째의 아미노산에 있어서의 Ala, His, 또는 Ile,
312번째의 아미노산에 있어서의 Ala 또는 His,
314번째의 아미노산에 있어서의 Lys 또는 Arg,
315번째의 아미노산에 있어서의 Ala 또는 His,
317번째의 아미노산에 있어서의 Ala,
325번째의 아미노산에 있어서의 Gly,
332번째의 아미노산에 있어서의 Val,
334번째의 아미노산에 있어서의 Leu,
360번째의 아미노산에 있어서의 His,
376번째의 아미노산에 있어서의 Ala,
380번째의 아미노산에 있어서의 Ala,
382번째의 아미노산에 있어서의 Ala,
384번째의 아미노산에 있어서의 Ala,
385번째의 아미노산에 있어서의 Asp 또는 His,
386번째의 아미노산에 있어서의 Pro,
387번째의 아미노산에 있어서의 Glu,
389번째의 아미노산에 있어서의 Ala 또는 Ser,
424번째의 아미노산에 있어서의 Ala,
428번째의 아미노산에 있어서의 Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp, 또는 Tyr,
433번째의 아미노산에 있어서의 Lys,
434번째의 아미노산에 있어서의 Ala, Phe, His, Ser, Trp, 또는 Tyr, 및
436번째의 아미노산에 있어서의 His
로부터 선택되는 적어도 1개의 아미노산을 포함하는 Fc 영역을 사용하는 것은 가능하다.
또한, 혈중 반감기를 연장하는 일 실시태양으로서, 항원 결합 분자와 알부민을 결합시키는 방법이 있다. 알부민은 신장 배설을 받지 않고, 또한 FcRn 결합성을 갖기 때문에, 혈중 반감기가 17∼19일로 길다(J Clin Invest. 1953 Aug; 32(8): 746-768.). 그 때문에 알부민과 결합하고 있는 단백질은 벌키해지고, 동시에 간접적으로 FcRn과 결합하는 것이 가능해지기 때문에, 혈중 반감기가 증가하는 것이 보고되어 있다(Antibodies 2015, 4(3), 141-156).
더욱이, 혈중 반감기를 연장하는 일 실시태양으로서, 항원 결합 분자를 PEG화하는 방법이 있다. 단백질을 PEG화함으로써 단백질을 벌키하게 하고, 동시에 혈중의 프로테아제에 의한 분해를 억제함으로써, 단백질의 혈중 반감기가 연장된다고 생각되고 있다(J Pharm Sci. 2008 Oct;97(10):4167-83.).
본 발명의 몇몇 실시태양에 있어서, 항원 결합 분자는 항체 Fc 영역을 포함한다. 구체적인 일 실시태양으로서, 항원 결합 분자는 인간 IgG 항체의 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다. 구체적인 일 실시태양으로서, 항원 결합 분자는, 인간 IgG1 항체 중쇄 Cys226으로부터, 또는 Pro230으로부터, 중쇄의 카복실 말단까지 신장되는 부분을 포함한다. 단, Fc 영역의 C말단의 리신(Lys447) 또는 글리신-리신(Gly446-Lys447)은, 존재하고 있어도 존재하고 있지 않아도 된다.
본 발명의 몇몇 실시태양에 있어서, 항원 결합 분자는 항체 정상 영역을 포함한다. 보다 바람직한 실시태양에 있어서, 항원 결합 분자는 IgG 항체 정상 영역을 포함한다. 보다 바람직한 실시태양에 있어서, 항원 결합 분자는 인간 IgG 항체 정상 영역을 포함한다. 더 바람직한 실시태양에 있어서, 항원 결합 분자는 이중 특이성 항체이며, 인간 IgG 항체 정상 영역을 포함한다.
추가적인 본 발명의 몇몇 실시태양에 있어서, 항원 결합 분자는 항체 중쇄 정상 영역과 실질적으로 유사한 구조를 갖는 영역과, 당해 영역과 다이설파이드 결합 등의 공유 결합 또는 수소 결합, 소수성 상호작용 등의 비공유 결합에 의해 결합되어 있는, 항체 경쇄와 실질적으로 유사한 구조를 갖는 영역을 포함한다.
본 명세서에서 이용되는 용어 「IgG 항체양 분자」는, IgG 항체와 같은 정상 도메인 또는 정상 영역의 구조와 실질적으로 유사한 부분과, IgG 항체와 같은 가변 도메인 또는 가변 영역의 구조와 실질적으로 유사한 부분을 갖고, IgG 항체와 실질적으로 유사한 입체 구조를 갖는 분자를 정의하기 위해서 이용된다. 단, 본 명세서의 「IgG 항체양 분자」는, IgG 항체와 유사한 구조를 유지한 채로 항원 결합 활성을 발휘하는 것으로 한정되지 않는다.
항원 결합 분자가 IgG 항체양 분자인 경우, IgG 항체의 2개의 가변 영역에 상당하는 부분에 각각 표적 항원 인식 부위 및 면역 수용체 인식 부위를 마련하는 실시태양은, 본 발명에 포함된다.
본 명세서에 있어서, 용어 「특이성」이란, 항원 결합 분자의 표적 항원 인식 부위 또는 면역 수용체 인식 부위가 각각 특정의 표적 항원 또는 면역 수용체 이외의 분자에 대해서 실질적으로 결합하지 않는 성질을 말한다. 항원 결합 분자가 특정의 표적 항원 중 또는 면역 수용체 중에 포함되는 에피토프에 특이성을 갖는 경우에도 이용된다. 실질적으로 결합하지 않는이란 결합 활성 측정에 관해서 기재되는 상기 방법에 준하여 결정되고, 상기 특정의 표적 항원 또는 면역 수용체 이외의 분자에 대한 특 결합 분자의 결합 활성이, 상기 상대방의 분자에 대한 결합 활성의 80% 이하, 통상 50% 이하, 바람직하게는 30% 이하, 특히 바람직하게는 15% 이하의 결합 활성을 나타내는 것을 말한다.
본 발명에 있어서의 항원 결합 분자는, 그것을 코딩하는 핵산을, 통상, 적당한 벡터에 담지(삽입)시키고, 숙주 세포에 도입하여, 통상의 방법에 의해 작성할 수 있다. 해당 벡터로서는, 삽입한 핵산을 안정되게 유지하는 것이면 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 숙주에 대장균을 이용한다면, 클로닝용 벡터로서는 pBluescript 벡터(Stratagene사제) 등이 바람직하지만, 시판되는 여러 가지 벡터를 이용할 수 있다. 본 발명의 실시에 있어서 사용하는 폴리펩티드(예를 들어, 키메라 수용체, IgG 항체, 이중 특이성 항체, 항원 결합 분자 등)를 생산하는 목적에 있어서 벡터를 이용하는 경우에는, 특히 발현 벡터가 유용하다. 발현 벡터로서는, 시험관내, 대장균내, 배양 세포내, 생물 개체내에서 폴리펩티드를 발현하는 벡터이면 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 시험관내 발현이면 pBEST 벡터(프로메가사제), 대장균이면 pET 벡터(Invitrogen사제), 배양 세포이면 pME18S-FL3 벡터(GenBank Accession No. AB009864), 생물 개체이면 pME18S 벡터(Mol Cell Biol. 8:466-472(1988)) 등이 바람직하다. 벡터에의 본 발명의 DNA의 삽입은, 통상적 방법에 의해, 예를 들어, 제한 효소 사이트를 이용한 리가제 반응에 의해 행할 수 있다(Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 11.4-11.11).
상기 숙주 세포로서는 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 여러 가지 숙주 세포가 이용된다. 항원 결합 분자를 발현시키기 위한 세포로서는, 예를 들어, 세균 세포(예: 스트렙토코커스, 스타필로코커스, 대장균, 스트렙토미세스, 고초균), 진균 세포(예: 효모, 아스페르길루스), 곤충 세포(예: 드로소필라 S2, 스포돕테라 SF9), 동물 세포(예: CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK293, Bowes 멜라노마 세포) 및 식물 세포를 예시할 수 있다. 숙주 세포에의 벡터 도입은, 예를 들어, 인산 칼슘 침전법, 전기 펄스 천공법(Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 9.1-9.9), 리포펙타민법(GIBCO-BRL사제), 마이크로인젝션법 등의 공지된 방법으로 행하는 것이 가능하다.
숙주 세포에 있어서 발현한 항원 결합 분자를 소포체의 내강에, 세포 주변강에, 또는 세포외의 환경에 분비시키기 위해서, 적당한 분비 시그널을 목적하는 항원 결합 분자를 코딩하는 핵산에 짜넣을 수 있다. 이들 시그널은 목적하는 폴리펩티드에 대해서 내인성이어도, 이종 시그널이어도 된다.
상기 제조 방법에 있어서의 항원 결합 분자의 회수는, 본 발명의 항원 결합 분자가 배지에 분비되는 경우는, 배지를 회수한다. 본 발명의 항원 결합 분자가 세포 내에 산생되는 경우는, 그 세포를 우선 용해하고, 그 후에 항원 결합 분자를 회수한다.
재조합 세포 배양물로부터 본 발명의 항원 결합 분자를 회수하여 정제하려면, 황산 암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하는 공지된 방법을 이용할 수 있다.
본 발명에 기재하는 아미노산 서열에 포함되는 아미노산은 번역 후에 수식(예를 들어, N말단의 글루타민의 파이로글루타밀화에 의한 파이로글루타민산에의 수식은 당업자에게 잘 알려진 수식이다)을 받는 경우도 있지만, 그와 같이 아미노산이 번역 후 수식되었을 경우에도 당연하게도 본 발명에 기재하는 아미노산 서열에 포함된다.
소망의 결합 활성을 갖는 항체를 제작하는 방법은 당업자에 있어서 공지이다. 본 발명에 있어서, 표적 세포(병변 세포)의 표면에 발현하는 분자를 항원(표적 항원)으로 하는 항원 결합 분자를 이용할 수 있다. 표적 세포가 종양 세포 또는 암 세포인 경우에는, 당해 항원은 종양 항원으로서 본 명세서에 예시되는 이하에, 종양 항원에 결합하는 항체를 제작하는 방법이 예시된다.
종양 항원에 결합하는 항체는, 공지된 수단을 이용하여 폴리클로날 또는 모노클로날 항체로서 취득될 수 있다. 해당 항체로서는, 포유동물 유래의 모노클로날 항체가 호적하게 제작될 수 있다. 포유동물 유래의 모노클로날 항체에는, 하이브리도마에 의해 산생되는 것, 및 유전자 공학적 수법에 의해 항체 유전자를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환한 숙주 세포에 의해 산생되는 것 등이 포함된다.
모노클로날 항체 산생 하이브리도마는, 공지 기술을 사용하는 것에 의해, 예를 들어 이하와 같이 제작될 수 있다. 즉, 종양 항원 단백질을 감작 항원으로서 사용하여, 통상의 면역 방법에 따라 포유동물이 면역된다. 얻어지는 면역 세포가 통상의 세포 융합법에 의해 공지된 친세포와 융합된다. 다음에, 통상의 스크리닝법에 의해, 모노클로날인 항체 산생 세포를 스크리닝하는 것에 의해 항종양 항원 항체를 산생하는 하이브리도마가 선택될 수 있다.
구체적으로는, 모노클로날 항체의 제작은 예를 들어 이하에 나타내는 바와 같이 행해진다. 우선, 종양 항원 유전자를 발현시키는 것에 의해, 항체 취득의 감작 항원으로서 사용되는 종양 항원 단백질이 취득될 수 있다. 즉, 종양 항원을 코딩하는 유전자 서열을 공지된 발현 벡터에 삽입하는 것에 의해 적당한 숙주 세포가 형질 전환된다. 당해 숙주 세포 중 또는 배양 상청 중으로부터 소망의 인간 종양 항원 단백질이 공지된 방법으로 정제된다. 배양 상청 중으로부터 가용형의 종양 항원을 취득하기 위해서는, 예를 들어, 종양 항원 폴리펩티드 서열 중, 소수성 영역을 구성하는 부분을 결실시킨 단백질을 이용할 수 있다. 또한, 정제한 천연의 GPC3 단백질도 또한 마찬가지로 감작 항원으로서 사용될 수 있다.
포유동물에 대한 면역에 사용하는 감작 항원으로서 당해 정제 종양 항원 단백질을 사용할 수 있다. 종양 항원의 부분 펩티드도 또한 감작 항원으로서 사용할 수 있다. 이 때, 해당 부분 펩티드는 인간 종양 항원의 아미노산 서열로부터 화학 합성에 의해서도 취득될 수 있다. 또한, 종양 항원 유전자의 일부를 발현 벡터에 짜넣어 발현시키는 것에 의해서도 취득될 수 있다. 또한 단백질 분해 효소를 이용하여 종양 항원 단백질을 분해하는 것에 의해서도 취득될 수 있지만, 부분 펩티드로서 이용하는 종양 항원 펩티드의 영역 및 크기는 특히 특별한 태양으로 한정되지 않는다. 감작 항원으로 하는 펩티드를 구성하는 아미노산의 수는 적어도 5 이상, 예를 들어 6 이상, 혹은 7 이상인 것이 바람직하다. 보다 구체적으로는 8∼50, 바람직하게는 10∼30잔기의 펩티드가 감작 항원으로서 사용될 수 있다.
또한, 종양 항원 단백질의 소망의 부분 폴리펩티드나 펩티드를 상이한 폴리펩티드와 융합한 융합 단백질이 감작 항원으로서 이용될 수 있다. 감작 항원으로서 사용되는 융합 단백질을 제조하기 위해서, 예를 들어, 항체의 Fc 단편이나 펩티드 태그 등이 호적하게 이용될 수 있다. 융합 단백질을 발현하는 벡터는, 소망의 2종류 또는 그 이상의 폴리펩티드 단편을 코딩하는 유전자가 인프레임으로 융합되고, 당해 융합 유전자가 상기와 같이 발현 벡터에 삽입되는 것에 의해 제작될 수 있다. 융합 단백질의 제작 방법은 Molecular Cloning 2nd ed.(Sambrook, J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58(1989) Cold Spring Harbor Lab. press)에 기재되어 있다. 일례로서, 감작 항원으로서 이용되는 GPC3의 취득 방법 및 그것을 이용한 면역 방법은, WO2003/000883, WO2004/022754, WO2006/006693 등에도 구체적으로 기재되어 있다.
해당 감작 항원으로 면역되는 포유동물로서는, 특정의 동물로 한정되는 것은 아니지만, 세포 융합에 사용하는 친세포와의 적합성을 고려하여 선택하는 것이 바람직하다. 일반적으로 설치류의 동물, 예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 혹은 토끼, 원숭이 등이 호적하게 사용된다.
공지된 방법에 따라 상기의 동물이 감작 항원에 의해 면역된다. 예를 들어, 일반적인 방법으로서, 감작 항원이 포유동물의 복강내 또는 피하에 주사에 의해 투여되는 것에 의해 면역이 실시된다. 구체적으로는, PBS(Phosphate-Buffered Saline)나 생리 식염수 등으로 적당한 희석 배율로 희석된 감작 항원이, 소망에 의해 통상의 아주반트, 예를 들어 프로인트 완전 아주반트와 혼합되어 유화된 후에, 해당 감작 항원이 포유동물에 4 내지 21일마다 수회 투여된다. 또한, 감작 항원의 면역 시에는 적당한 담체가 사용될 수 있다. 특히 분자량이 작은 부분 펩티드가 감작 항원으로서 이용되는 경우에는, 알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌 등의 담체 단백질과 결합한 해당 감작 항원 펩티드를 면역하는 것이 바람직한 경우도 있다.
또한, 소망의 항체를 산생하는 하이브리도마는, DNA 면역을 사용하여, 이하와 같이 해서도 제작될 수 있다. DNA 면역이란, 면역 동물 중에서 항원 단백질을 코딩하는 유전자가 발현될 수 있는 태양으로 구축된 벡터 DNA가 투여된 당해 면역 동물 중에서, 감작 항원이 당해 면역 동물의 생체 내에서 발현되는 것에 의해, 면역 자극이 주어지는 면역 방법이다. 단백질 항원이 면역 동물에게 투여되는 일반적인 면역 방법과 비교하여, DNA 면역에는, 다음과 같은 우위성이 기대된다.
- 막단백질의 구조를 유지하여 면역 자극이 주어질 수 있다.
- 면역 항원을 정제할 필요가 없다.
DNA 면역에 의해 본 발명의 모노클로날 항체를 얻기 위해서, 우선, 종양 항원 단백질을 발현하는 DNA가 면역 동물에게 투여된다. 종양 항원을 코딩하는 DNA는, PCR 등의 공지된 방법에 따라 합성될 수 있다. 얻어진 DNA가 적당한 발현 벡터에 삽입되어, 면역 동물에게 투여된다. 발현 벡터로서는, 예를 들어 pcDNA3.1 등의 시판되는 발현 벡터가 호적하게 이용될 수 있다. 벡터를 생체에 투여하는 방법으로서, 일반적으로 이용되고 있는 방법이 이용될 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터가 흡착된 금 입자가, gene gun으로 면역 동물 개체의 세포 내에 도입되는 것에 의해 DNA 면역이 행해진다. 더욱이, 종양 항원을 인식하는 항체의 제작은 국제 공개 WO2003/104453에 기재된 방법을 이용해서도 제작될 수 있다.
이와 같이 포유동물이 면역되고, 혈청 중에 있어서의 종양 항원에 결합하는 항체 역가의 상승이 확인된 후에, 포유동물로부터 면역 세포가 채취되어, 세포 융합에 제공된다. 바람직한 면역 세포로서는, 특히 비(脾)세포가 사용될 수 있다.
상기 면역 세포와 융합되는 세포로서, 포유동물의 미엘로마 세포가 이용된다. 미엘로마 세포는, 스크리닝을 위한 적당한 선택 마커를 구비하고 있는 것이 바람직하다. 선택 마커란, 특정의 배양 조건하에서 생존할 수 있는(혹은 할 수 없는) 형질을 가리킨다. 선택 마커에는, 하이포잔틴-구아닌-포스포리보실 트랜스페라제 결손(이하 HGPRT 결손이라 생략한다), 혹은 티미딘 키나제 결손(이하 TK 결손이라 생략한다) 등이 공지이다. HGPRT나 TK의 결손을 갖는 세포는, 하이포잔틴-아미노프테린-티미딘 감수성(이하 HAT 감수성이라 생략한다)을 갖는다. HAT 감수성의 세포는 HAT 선택 배지 중에서 DNA 합성을 행하지 못하고 사멸하지만, 정상적인 세포와 융합하면 정상 세포의 샐비지 회로를 이용하여 DNA의 합성을 계속할 수 있기 때문에 HAT 선택 배지 중에서도 증식하게 된다.
HGPRT 결손이나 TK 결손의 세포는, 각각 6싸이오구아닌, 8아자구아닌(이하 8AG라고 생략한다), 혹은 5'브로모데옥시우리신을 포함하는 배지에서 선택될 수 있다. 이들 피리미딘 아날로그를 DNA 중에 흡수하는 정상적인 세포는 사멸한다. 다른 한편, 이들 피리미딘 아날로그를 흡수하지 않는 이들 효소를 결손한 세포는, 선택 배지 중에서 생존할 수 있다. 이 다른 G418 내성으로 불리는 선택 마커는, 네오마이신 내성 유전자에 의해 2-데옥시스트렙타민계 항생 물질(겐타마이신 유사체)에 대한 내성을 준다. 세포 융합에 호적한 여러 가지 미엘로마 세포가 공지이다.
이와 같은 미엘로마 세포로서, 예를 들어, P3(P3x63Ag8.653)(J. Immunol. (1979) 123 (4), 1548-1550), P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978) 81, 1-7), NS-1(C. Eur. J. Immunol. (1976) 6 (7), 511-519), MPC-11(Cell(1976) 8 (3), 405-415), SP2/0(Nature(1978) 276 (5685), 269-270), FO(J. Immunol. Methods(1980) 35 (1-2), 1-21), S194/5.XX0.BU.1(J. Exp. Med. (1978) 148 (1), 313-323), R210(Nature(1979) 277 (5692), 131-133) 등이 호적하게 사용될 수 있다.
기본적으로는 공지된 방법, 예를 들어, 쾰러와 밀스테인 등의 방법(Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46) 등에 준하여, 상기 면역 세포와 미엘로마 세포의 세포 융합이 행해진다.
보다 구체적으로는, 예를 들어 세포 융합 촉진제의 존재하에서 통상의 영양 배양액 중에서, 상기 세포 융합이 실시될 수 있다. 융합 촉진제로서는, 예를 들어 폴리에틸렌 글라이콜(PEG), 센다이 바이러스(HVJ) 등이 사용되고, 더욱이 융합 효율을 높이기 위해서 소망에 따라 다이메틸설폭사이드 등의 보조제가 첨가되어 사용된다.
면역 세포와 미엘로마 세포의 사용 비율은 임의로 설정될 수 있다. 예를 들어, 미엘로마 세포에 대해서 면역 세포를 1 내지 10배로 하는 것이 바람직하다. 상기 세포 융합에 이용하는 배양액으로서는, 예를 들어, 상기 미엘로마 세포주의 증식에 호적한 RPMI1640 배양액, MEM 배양액, 그 외, 이런 종류의 세포 배양에 이용되는 통상의 배양액이 사용되고, 더욱이, 소 태아 혈청(FCS) 등의 혈청 보액이 호적하게 첨가될 수 있다.
세포 융합은, 상기 면역 세포와 미엘로마 세포의 소정량을 상기 배양액 중에서 잘 혼합하고, 미리 37℃ 정도로 가온된 PEG 용액(예를 들어 평균 분자량 1000 내지 6000 정도)이 통상 30 내지 60%(w/v)의 농도로 첨가된다. 혼합액이 완만하게 혼합되는 것에 의해 소망의 융합 세포(하이브리도마)가 형성된다. 그 다음에, 상기에 든 적당한 배양액이 축차적으로 첨가되고, 원심하여 상청을 제거하는 조작을 반복하는 것에 의해 하이브리도마의 생육에 바람직하지 않은 세포 융합제 등이 제거될 수 있다.
이와 같이 하여 얻어진 하이브리도마는, 통상의 선택 배양액, 예를 들어 HAT 배양액(하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함하는 배양액)에서 배양하는 것에 의해 선택될 수 있다. 소망의 하이브리도마 이외의 세포(비융합 세포)가 사멸하는 데 충분한 시간(통상, 이러한 충분한 시간은 수일 내지 수주간이다) 상기 HAT 배양액을 이용한 배양이 계속될 수 있다. 그 다음에, 통상의 한계 희석법에 의해, 소망의 항체를 산생하는 하이브리도마의 스크리닝 및 단일 클로닝이 실시된다.
이와 같이 하여 얻어진 하이브리도마는, 세포 융합에 이용된 미엘로마가 갖는 선택 마커에 따른 선택 배양액을 이용하는 것에 의해 선택될 수 있다. 예를 들어 HGPRT나 TK의 결손을 갖는 세포는, HAT 배양액(하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함하는 배양액)에서 배양하는 것에 의해 선택될 수 있다. 즉, HAT 감수성의 미엘로마 세포를 세포 융합에 이용했을 경우, HAT 배양액 중에서, 정상 세포와의 세포 융합에 성공한 세포가 선택적으로 증식할 수 있다. 소망의 하이브리도마 이외의 세포(비융합 세포)가 사멸하는 데 충분한 시간, 상기 HAT 배양액을 이용한 배양이 계속된다. 구체적으로는, 일반적으로, 수일 내지 수주간의 배양에 의해, 소망의 하이브리도마가 선택될 수 있다. 그 다음에, 통상의 한계 희석법에 의해, 소망의 항체를 산생하는 하이브리도마의 스크리닝 및 단일 클로닝이 실시될 수 있다.
소망의 항체의 스크리닝 및 단일 클로닝이, 공지된 항원 항체 반응에 기초하는 스크리닝 방법에 의해 호적하게 실시될 수 있다. 예를 들어, GPC3에 결합하는 모노클로날 항체는, 세포 표면에 발현한 GPC3에 결합할 수 있다. 이와 같은 모노클로날 항체는, 예를 들어, FACS(fluorescence activated cell sorting)에 의해 스크리닝될 수 있다. FACS는, 형광 항체와 접촉시킨 세포를 레이저광으로 해석하고, 개개의 세포가 발하는 형광을 측정하는 것에 의해 세포 표면에의 항체의 결합을 측정하는 것을 가능하게 하는 시스템이다.
FACS에 의해 본 발명의 모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마를 스크리닝하기 위해서는, 우선 GPC3을 발현하는 세포를 조제한다. 스크리닝을 위한 바람직한 세포는, 이용한 종양 항원을 강제 발현시킨 포유동물 세포이다. 숙주 세포로서 사용한 형질 전환되어 있지 않은 포유동물 세포를 대조로서 이용하는 것에 의해, 세포 표면의 종양 항원에 대한 항체의 결합 활성이 선택적으로 검출될 수 있다. 즉, 숙주 세포에 결합하지 않고, GPC3 강제 발현 세포에 결합하는 항체를 산생하는 하이브리도마를 선택하는 것에 의해, 종양 항원 모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마가 취득될 수 있다.
혹은 고정화한 종양 항원 발현 세포에 대한 항체의 결합 활성이 ELISA의 원리에 기초하여 평가될 수 있다. 예를 들어, ELISA 플레이트의 웰에 GPC3 발현 세포가 고정화된다. 하이브리도마의 배양 상청을 웰 내의 고정화 세포에 접촉시켜, 고정화 세포에 결합하는 항체가 검출된다. 모노클로날 항체가 마우스 유래인 경우, 세포에 결합한 항체는, 항마우스 이뮤노글로불린 항체에 의해 검출될 수 있다. 이들 스크리닝에 의해 선택된, 항원에 대한 결합능을 갖는 소망의 항체를 산생하는 하이브리도마는, 한계 희석법 등에 의해 클로닝될 수 있다.
이와 같이 하여 제작되는 모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마는 통상의 배양액 중에서 계대 배양될 수 있다. 또한, 해당 하이브리도마는 액체 질소 중에서 장기에 걸쳐 보존될 수 있다.
당해 하이브리도마를 통상의 방법에 따라 배양하고, 그 배양 상청으로부터 소망의 모노클로날 항체가 취득될 수 있다. 혹은 하이브리도마를 이것과 적합성이 있는 포유동물에게 투여하여 증식시키고, 그의 복수(腹水)로부터 모노클로날 항체가 취득될 수 있다. 전자의 방법은, 고순도의 항체를 얻는 데 호적한 것이다.
당해 하이브리도마 등의 항체 산생 세포로부터 클로닝되는 항체 유전자에 의해 코딩되는 항체도 호적하게 이용될 수 있다. 클로닝한 항체 유전자를 적당한 벡터에 짜넣어 숙주에 도입하는 것에 의해, 당해 유전자에 의해 코딩되는 항체가 발현한다. 항체 유전자의 단리와 벡터에의 도입, 그리고 숙주 세포의 형질 전환을 위한 방법은 예를 들어, Vandamme 등에 의해 이미 확립되어 있다(Eur.J. Biochem. (1990) 192 (3), 767-775). 하기에 기술하는 바와 같이 재조합 항체의 제조 방법도 또한 공지이다.
예를 들어, 종양 항원에 결합하는 항체를 산생하는 하이브리도마 세포로부터, 해당 항체의 가변 영역(V 영역)을 코딩하는 cDNA가 취득된다. 그를 위해, 통상, 우선 하이브리도마로부터 전(全)RNA가 추출된다. 세포로부터 mRNA를 추출하기 위한 방법으로서, 예를 들어 다음과 같은 방법을 이용할 수 있다: - 구아니딘 초원심법(Biochemistry (1979) 18 (24), 5294-5299) - AGPC법(Anal. Biochem. (1987) 162 (1), 156-159).
추출된 mRNA는, mRNA Purification Kit(GE 헬스케어 바이오사이언스제) 등을 사용하여 정제될 수 있다. 혹은, QuickPrep mRNA Purification Kit(GE 헬스케어 바이오사이언스제) 등과 같이, 세포로부터 직접 전mRNA를 추출하기 위한 키트도 시판되고 있다. 이와 같은 키트를 이용하여, 하이브리도마로부터 mRNA가 취득될 수 있다. 얻어진 mRNA로부터 역전사 효소를 이용하여 항체 V 영역을 코딩하는 cDNA가 합성될 수 있다. cDNA는, AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit(생화학 공업사제) 등에 의해 합성될 수 있다. 또한, cDNA의 합성 및 증폭을 위해서, SMART RACE cDNA 증폭 키트(Clontech제) 및 PCR을 이용한 5＇-RACE법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85 (23), 8998-9002, Nucleic Acids Res. (1989) 17 (8), 2919-2932)이 적절히 이용될 수 있다. 더욱이 이러한 cDNA의 합성의 과정에 있어서 cDNA의 양 말단에 후술하는 적절한 제한 효소 사이트가 도입될 수 있다.
얻어진 PCR 산물로부터 목적으로 하는 cDNA 단편이 정제되고, 그 다음에 벡터 DNA와 연결된다. 이와 같이 재조합 벡터가 제작되어, 대장균 등에 도입되고 콜로니가 선택된 후에, 해당 콜로니를 형성한 대장균으로부터 소망의 재조합 벡터가 조제될 수 있다. 그리고, 해당 재조합 벡터가 목적으로 하는 cDNA의 염기 서열을 갖고 있는지 여부에 대해서, 공지된 방법, 예를 들어, 다이데옥시뉴클레오티드 체인 터미네이션법 등에 의해 확인된다.
가변 영역을 코딩하는 유전자를 취득하기 위해서는, 가변 영역 유전자 증폭용의 프라이머를 사용한 5＇-RACE법을 이용하는 것이 간편하다. 우선 하이브리도마 세포로부터 추출된 RNA를 주형으로 하여 cDNA가 합성되고, 5＇-RACE cDNA 라이브러리가 얻어진다. 5＇-RACE cDNA 라이브러리의 합성에는 SMART RACE cDNA 증폭 키트 등 시판되는 키트가 적절히 이용된다.
얻어진 5＇-RACE cDNA 라이브러리를 주형으로 하여, PCR법에 의해 항체 유전자가 증폭된다. 공지된 항체 유전자 서열을 기초로 마우스 항체 유전자 증폭용의 프라이머가 디자인될 수 있다. 이들 프라이머는, 이뮤노글로불린의 서브클래스마다 상이한 염기 서열이다. 따라서, 서브클래스는 미리 Iso Strip 마우스 모노클로날 항체 아이소타이핑 키트(로슈·다이아그노스틱스) 등의 시판 키트를 이용하여 결정해 두는 것이 바람직하다.
구체적으로는, 예를 들어 마우스 IgG를 코딩하는 유전자의 취득을 목적으로 할 때는, 중쇄로서 γ1, γ2a, γ2b, γ3, 경쇄로서 κ쇄와 λ쇄를 코딩하는 유전자의 증폭이 가능한 프라이머가 이용될 수 있다. IgG의 가변 영역 유전자를 증폭하기 위해서는, 일반적으로 3'측의 프라이머에는 가변 영역에 가까운 정상 영역에 상당하는 부분에 어닐링하는 프라이머가 이용된다. 한편 5'측의 프라이머에는, 5＇ RACE cDNA 라이브러리 제작 키트에 부속되는 프라이머가 이용된다.
이렇게 하여 증폭된 PCR 산물을 이용하여, 중쇄와 경쇄의 조합으로 이루어지는 이뮤노글로불린이 재구성될 수 있다. 재구성된 이뮤노글로불린의, 항원에 대한 결합 활성을 지표로 하여, 소망의 항체가 스크리닝될 수 있다. 예를 들어 GPC3에 대한 항체의 취득을 목적으로 할 때, 항체의 GPC3에의 결합은, 특이적인 것이 더 바람직하다. 본 발명에 있어서 사용하는 항체는, 예를 들어 다음과 같이 하여 스크리닝될 수 있다;
(1) 하이브리도마로부터 얻어진 cDNA에 의해 코딩되는 V 영역을 포함하는 항체를 항원 발현 세포에 접촉시키는 공정,
(2) 항원 발현 세포와 항체의 결합을 검출하는 공정, 및
(3) 항원 발현 세포에 결합하는 항체를 선택하는 공정.
항체와 종양 항원 발현 세포의 결합을 검출하는 방법은 공지이다. 구체적으로는, 먼저 기술한 FACS 등의 수법에 따라, 항체와 종양 항원 발현 세포의 결합이 검출될 수 있다. 항체의 결합 활성을 평가하기 위해서 종양 항원 발현 세포의 고정 표본이 적절히 이용될 수 있다.
결합 활성을 지표로 하는 항체의 스크리닝 방법으로서, 파지를 이용한 패닝법도 호적하게 이용된다. 폴리클로날인 항체 발현 세포군으로부터 항체 유전자를 중쇄와 경쇄의 서브클래스의 라이브러리로서 취득했을 경우에는, 파지를 이용한 스크리닝 방법이 유리하다. 중쇄와 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 유전자는, 적당한 링커 서열로 연결하는 것에 의해 싱글 체인 Fv(scFv)를 형성할 수 있다. scFv를 코딩하는 유전자를 파지 벡터에 삽입하는 것에 의해, scFv를 표면에 발현하는 파지가 취득될 수 있다. 이 파지와 소망의 항원의 접촉 후에, 항원에 결합한 파지를 회수하는 것에 의해, 목적하는 결합 활성을 갖는 scFv를 코딩하는 DNA가 회수될 수 있다. 이 조작을 필요에 따라서 반복하는 것에 의해, 소망의 결합 활성을 갖는 scFv가 농축될 수 있다.
목적으로 하는 종양 항원에 결합하는 항체의 V 영역을 코딩하는 cDNA가 얻어진 후에, 당해 cDNA의 양 말단에 삽입한 제한 효소 사이트를 인식하는 제한 효소에 의해 해당 cDNA가 소화된다. 바람직한 제한 효소는, 항체 유전자를 구성하는 염기 서열에 출현하는 빈도가 낮은 염기 서열을 인식하여 소화한다. 더욱이 1카피의 소화 단편을 벡터에 올바른 방향으로 삽입하기 위해서는, 부착 말단을 제공하는 제한 효소의 삽입이 바람직하다. 상기와 같이 소화된 항GPC3 항체의 V 영역을 코딩하는 cDNA를 적당한 발현 벡터에 삽입하는 것에 의해, 항체 발현 벡터가 취득될 수 있다. 이 때, 항체 정상 영역(C 영역)을 코딩하는 유전자와, 상기 V 영역을 코딩하는 유전자가 인프레임으로 융합되면, 키메라 항체가 취득된다. 여기에서, 키메라 항체란, 정상 영역과 가변 영역의 유래가 상이한 것을 말한다. 따라서, 마우스-인간 등의 이종 키메라 항체에 더하여, 인간-인간 동종 키메라 항체도, 본 발명에 있어서의 키메라 항체에 포함된다. 미리 정상 영역을 갖는 발현 벡터에, 상기 V 영역 유전자를 삽입하는 것에 의해, 키메라 항체 발현 벡터가 구축될 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어, 소망의 항체 정상 영역(C 영역)을 코딩하는 DNA를 보지한 발현 벡터의 5＇측에, 상기 V 영역 유전자를 소화하는 제한 효소의 제한 효소 인식 서열이 적절히 배치될 수 있다. 동일한 조합의 제한 효소로 소화된 양자가 인프레임으로 융합되는 것에 의해, 키메라 항체 발현 벡터가 구축된다.
모노클로날 항체를 제조하기 위해서, 항체 유전자가 발현 제어 영역에 의한 제어하에서 발현하도록 발현 벡터에 짜넣어진다. 항체를 발현하기 위한 발현 제어 영역이란, 예를 들어, 인핸서나 프로모터를 포함한다. 또한, 발현한 항체가 세포외로 분비되도록, 적절한 시그널 서열이 아미노 말단에 부가될 수 있다. 후에 기재되는 실시예에서는 시그널 서열로서 예를 들어 아미노산 서열 MGWSCIILFLVATATGVHS를 갖는 펩티드 등이 사용되고 있지만, 이것 이외에도 적합한 시그널 서열이 부가된다. 발현된 폴리펩티드는 상기 서열의 카복실 말단 부분에서 절단되고, 절단된 폴리펩티드가 성숙 폴리펩티드로서 세포 외에 분비될 수 있다. 그 다음에, 이 발현 벡터에 의해 적당한 숙주 세포가 형질 전환되는 것에 의해, 표적이 되는 종양 항원에 결합하는 항체를 코딩하는 DNA를 발현하는 재조합 세포가 취득될 수 있다.
항체 유전자의 발현을 위해서, 항체 중쇄(H쇄) 및 경쇄(L쇄)를 코딩하는 DNA는, 각각 다른 발현 벡터에 짜넣어진다. H쇄와 L쇄가 짜넣어진 벡터에 의해, 동일한 숙주 세포에 동시에 형질 전환(co-transfect)되는 것에 의해, H쇄와 L쇄를 구비한 항체 분자가 발현될 수 있다. 혹은 H쇄 및 L쇄를 코딩하는 DNA가 단일의 발현 벡터에 짜넣어지는 것에 의해 숙주 세포가 형질 전환될 수 있다(국제 공개 WO 94/11523을 참조할 것).
단리된 항체 유전자를 적당한 숙주에 도입하는 것에 의해 항체를 제작하기 위한 숙주 세포와 발현 벡터의 많은 조합이 공지이다. 이들 발현계는, 모두 본 발명의 항체 가변 영역을 포함하는 도메인을 단리하는 데 응용될 수 있다. 진핵세포가 숙주 세포로서 사용되는 경우, 동물 세포, 식물 세포, 혹은 진균 세포가 적절히 사용될 수 있다. 구체적으로는, 동물 세포로서는, 다음과 같은 세포가 예시될 수 있다.
(1) 포유류 세포: CHO, COS, 미엘로마, BHK(baby hamster kidney), Hela, Vero 등
(2) 양서류 세포: 아프리카발톱개구리 난모 세포 등
(3) 곤충 세포: sf9, sf21, Tn5 등.
혹은 식물 세포로서는, 니코티아나·타바컴(Nicotiana tabacum) 등의 니코티아나(Nicotiana)속 유래의 세포에 의한 항체 유전자의 발현계가 공지이다. 식물 세포의 형질 전환에는, 칼루스 배양한 세포가 적절히 이용될 수 있다.
더욱이 진균 세포로서는, 다음과 같은 세포를 이용할 수 있다.
- 효모: 사카로미세스·세레비시에(Saccharomyces serevisiae) 등의 사카로미세스(Saccharomyces)속, 메탄올자화효모(Pichia pastoris) 등의 Pichia속
- 사상균: 아스페스길루스·니거(Aspergillus niger) 등의 아스페르길루스(Aspergillus)속.
또한, 원핵세포를 이용한 항체 유전자의 발현계도 공지이다. 예를 들어, 세균 세포를 이용하는 경우, 대장균(E. coli), 고초균 등의 세균 세포가 적절히 이용될 수 있다. 이들 세포 중에, 목적으로 하는 항체 유전자를 포함하는 발현 벡터가 형질 전환에 의해 도입된다. 형질 전환된 세포를 in vitro로 배양하는 것에 의해, 당해 형질 전환 세포의 배양물로부터 소망의 항체가 취득될 수 있다.
재조합 항체의 산생에는, 상기 숙주 세포에 더하여, 트랜스제닉 동물도 이용 될 수 있다. 즉 소망의 항체를 코딩하는 유전자가 도입된 동물로부터, 당해 항체를 얻을 수 있다. 예를 들어, 항체 유전자는, 유즙(乳汁) 중에 고유하게 산생되는 단백질을 코딩하는 유전자의 내부에 인프레임으로 삽입하는 것에 의해 융합 유전자로서 구축될 수 있다. 유즙 중에 분비되는 단백질로서 예를 들어, 염소β감기 인등을 이용 될 수 있다. 항체 유전자가 삽입된 융합 유전자를 포함하는 DNA 단편은 염소의 배에 주입되고, 당해 주입된 배가 암컷 염소에게 도입된다. 배를 수용한 염소로부터 태어나는 트랜스제닉 염소(또는 그 자손)가 산생하는 유즙으로부터는, 소망의 항체가 유즙 단백질과의 융합 단백질로서 취득될 수 있다. 또한, 트랜스제닉 염소로부터 산생되는 소망의 항체를 포함하는 유즙량을 증가시키기 위해서, 호르몬이 트랜스제닉 염소에 대해서 투여될 수 있다(Bio/Technology (1994), 12 (7), 699-702).
본 명세서에 있어서 기재되는 항원 결합 분자가 인간에게 투여되는 경우, 당해 항원 결합 분자에 있어서의 항체 가변 영역을 포함하는 도메인으로서, 인간에 대한 이종 항원성을 저하시키는 것 등을 목적으로 하여 인위적으로 개변한 유전자 재조합형 항체 유래의 도메인이 적절히 채용될 수 있다. 유전자 재조합형 항체에는, 예를 들어, 인간화(Humanized) 항체 등이 포함된다. 이들 개변 항체는, 공지된 방법을 이용하여 적절히 제조된다.
본 명세서에 있어서 기재되는 항원 결합 분자에 있어서의 항체 가변 영역을 포함하는 도메인을 제작하기 위해서 이용되는 항체의 가변 영역은, 통상, 4개의 프레임워크 영역(FR)에 끼워진 3개의 상보성 결정 영역(complementarity-determining region; CDR)으로 구성되어 있다. CDR은, 실질적으로, 항체의 결합 특이성을 결정하고 있는 영역이다. CDR의 아미노산 서열은 다양성이 풍부하다. 한편 FR을 구성하는 아미노산 서열은, 상이한 결합 특이성을 갖는 항체 사이에서도, 높은 동일성을 나타내는 경우가 많다. 그 때문에, 일반적으로, CDR의 이식에 의해, 어느 항체의 결합 특이성을, 다른 항체에 이식할 수 있다고 여겨지고 있다.
인간화 항체는, 재구성(reshaped) 인간 항체라고도 칭해진다. 구체적으로는, 인간 이외의 동물, 예를 들어 마우스 항체의 CDR을 인간 항체에 이식한 인간화 항체 등이 공지이다. 인간화 항체를 얻기 위한 일반적인 유전자 재조합 수법도 알려져 있다. 구체적으로는, 마우스의 항체의 CDR을 인간의 FR에 이식하기 위한 방법으로서, 예를 들어 Overlap Extension PCR이 공지이다. Overlap Extension PCR에 있어서는, 인간 항체의 FR을 합성하기 위한 프라이머에, 이식해야 할 마우스 항체의 CDR을 코딩하는 염기 서열이 부가된다. 프라이머는 4개의 FR의 각각에 대해 준비된다. 일반적으로, 마우스 CDR의 인간 FR에의 이식에 있어서는, 마우스의 FR과 동일성이 높은 인간 FR을 선택하는 것이, CDR의 기능의 유지에 있어서 유리하다고 알려져 있다. 즉, 일반적으로, 이식해야 할 마우스 CDR에 인접하고 있는 FR의 아미노산 서열과 동일성이 높은 아미노산 서열로 이루어지는 인간 FR을 이용하는 것이 바람직하다.
또한 연결되는 염기 서열은, 서로 인프레임으로 접속되도록 디자인된다. 각각의 프라이머에 의해 인간 FR이 개별적으로 합성된다. 그 결과, 각 FR에 마우스 CDR을 코딩하는 DNA가 부가된 산물을 얻을 수 있다. 각 산물의 마우스 CDR을 코딩하는 염기 서열은, 서로 오버랩하도록 디자인되어 있다. 계속해서, 인간 항체 유전자를 주형으로 하여 합성된 산물의 오버랩된 CDR 부분을 서로 어닐링시켜 상보 쇄 합성 반응이 행해진다. 이 반응에 의해, 인간 FR이 마우스 CDR의 서열을 개재시켜 연결된다.
최종적으로 3개의 CDR과 4개의 FR이 연결된 V 영역 유전자는, 그 5'말단과 3'말단에 어닐링하여 적당한 제한 효소 인식 서열이 부가된 프라이머에 의해 그 전장이 증폭된다. 상기와 같이 얻어진 DNA와 인간 항체 C 영역을 코딩하는 DNA를 인프레임으로 융합하도록 발현 벡터 중에 삽입하는 것에 의해, 인간형 항체 발현용 벡터를 작성할 수 있다. 해당 짜넣은 벡터를 숙주에 도입하여 재조합 세포를 수립한 후에, 해당 재조합 세포를 배양하여, 해당 인간화 항체를 코딩하는 DNA를 발현시키는 것에 의해, 해당 인간화 항체가 해당 배양 세포의 배양물 중에 산생된다(유럽 특허 공개 EP 239400, 국제 공개 WO1996/002576 참조).
상기와 같이 제작된 인간화 항체의 항원에의 결합 활성을 정성적 또는 정량적으로 측정하여, 평가하는 것에 의해, CDR을 개재시켜 연결되었을 때에 해당 CDR이 양호한 항원 결합 부위를 형성하는 인간 항체의 FR이 호적하게 선택될 수 있다. 필요에 따라서, 재구성 인간 항체의 CDR이 적절한 항원 결합 부위를 형성하도록 FR의 아미노산 잔기를 치환할 수도 있다. 예를 들어, 마우스 CDR의 인간 FR에의 이식에 이용한 PCR법을 응용하여, FR에 아미노산 서열의 변이를 도입할 수 있다. 구체적으로는, FR에 어닐링하는 프라이머에 부분적인 염기 서열의 변이를 도입할 수 있다. 이와 같은 프라이머에 의해 합성된 FR에는, 염기 서열의 변이가 도입된다. 아미노산을 치환한 변이형 항체의 항원에의 결합 활성을 상기의 방법으로 측정하여 평가하는 것에 의해 소망의 성질을 갖는 변이 FR 서열이 선택될 수 있다(Sato, K.et al., Cancer Res, 1993, 53, 851-856).
또한, 인간 항체 유전자의 모든 레퍼터리를 갖는 트랜스제닉 동물(국제 공개 WO1993/012227, WO1992/003918, WO1994/002602, WO1994/025585, WO1996/034096, WO1996/033735 참조)을 면역 동물로 하여, DNA 면역에 의해 소망의 인간 항체가 취득될 수 있다.
더욱이, 인간 항체 라이브러리를 이용하여, 패닝에 의해 인간 항체를 취득하는 기술도 알려져 있다. 예를 들어, 인간 항체의 V 영역이 1본쇄 항체(scFv)로서 파지 디스플레이법에 의해 파지의 표면에 발현된다. 항원에 결합하는 scFv를 발현하는 파지가 선택될 수 있다. 선택된 파지의 유전자를 해석하는 것에 의해, 항원에 결합하는 인간 항체의 V 영역을 코딩하는 DNA 서열이 결정될 수 있다. 항원에 결합하는 scFv의 DNA 서열을 결정한 후, 당해 V 영역 서열을 소망의 인간 항체 C 영역의 서열과 인프레임으로 융합시킨 후에 적당한 발현 벡터에 삽입하는 것에 의해 발현 벡터가 제작될 수 있다. 당해 발현 벡터를 상기에 든 바와 같은 호적한 발현 세포 중에 도입하여, 해당 인간 항체를 코딩하는 유전자를 발현시키는 것에 의해 당해 인간 항체가 취득된다. 이들 방법은 이미 공지이다(국제 공개 WO1992/001047, WO1992/020791, WO1993/006213, WO1993/011236, WO1993/019172, WO1995/001438, WO1995/015388 참조).
본 명세서에 있어서, 「Fv(variable fragment)」라고 하는 용어는, 항체의 경쇄 가변 영역(VL(light chain variable region))과 항체의 중쇄 가변 영역(VH(heavy chain variable region))의 페어로 이루어지는 항체 유래의 항원 결합 도메인의 최소 단위를 의미한다. 1988년에 Skerra와 Pluckthun은, 박테리아의 시그널 서열의 하류에 항체의 유전자를 삽입하여 대장균 중에서 당해 유전자의 발현을 유도하는 것에 의해, 균일하고 또한 활성을 유지한 상태에서 대장균의 페리플라즘 획분으로부터 조제됨을 발견했다(Science (1988) 240 (4855), 1038-1041). 페리플라즘 획분으로부터 조제된 Fv는, 항원에 대한 결합을 갖는 태양으로 VH와 VL이 회합하고 있었다.
본 명세서에 있어서, Fv로서는, 예를 들어 이하의 항원 결합 분자;
2가의 scFv 중 1가의 scFv가 CD3 결합 도메인을 구성하는 중쇄 Fv 단편을 개재시켜 Fc 영역을 구성하는 하나의 폴리펩티드에, 다른 쪽의 1가의 scFv가 CD3 결합 도메인을 구성하는 경쇄 Fv 단편을 개재시켜 Fc 영역을 구성하는 다른 쪽의 하나의 폴리펩티드에 연결된 2가의 항원 결합 도메인이 2가의 scFv인 (1) 2가의 항원 결합 도메인, (2) IgG1, IgG2a, IgG3 또는 IgG4의 Fc 영역을 구성하는 아미노산 중 Fc감마 수용체에 대한 결합 활성을 갖지 않는 Fc 영역을 포함하는 도메인, 및, (3) 적어도 1가의 CD3 결합 도메인,을 포함하는 항원 결합 분자 등에 있어서 경쇄 Fv 단편 및 중쇄 Fv 단편이, 항원인 CD3에 대한 결합을 갖는 태양으로 회합하여 CD3 결합 도메인을 구성하는 1조의 Fv도 호적하게 포함된다.
본 명세서에 있어서, 「scFv」, 「단쇄 항체」, 또는 「sc(Fv)2」라고 하는 용어는, 단일의 폴리펩티드쇄 내에, 중쇄 및 경쇄의 양쪽에서 유래하는 가변 영역을 포함하지만, 정상 영역을 결여하고 있는 항체 단편을 의미한다. 일반적으로, 단쇄 항체는, 항원 결합을 가능하게 한다고 생각되는 소망의 구조를 형성하는 것을 가능하게 하는, VH 도메인과 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. 단쇄 항체는, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 113권, Rosenburg, 및, Moore편, Springer-Verlag, New York, 269∼315(1994)에 있어서 Pluckthun에 의해 상세하게 고찰되어 있다. 마찬가지로, 국제 특허 출원 공개 WO1988/001649 및 미국 특허 제4,946,778호 및 동 제5,260,203호를 참조. 특정의 태양에 있어서, 단쇄 항체는 또한, 이중 특이성이거나, 또한/또는 인간화될 수 있다.
scFv는 Fv를 구성하는 VH와 VL이 펩티드 링커에 의해 연결된 항원 결합 도메인이다(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85 (16), 5879-5883). 당해 펩티드 링커에 의해 VH와 VL이 근접한 상태로 유지될 수 있다.
sc(Fv)2는 2개의 VL과 2개의 VH의 4개의 가변 영역이 펩티드 링커 등의 링커에 의해 연결되어 1본쇄를 구성하는 단쇄 항체이다(J Immunol. Methods (1999) 231 (1-2), 177-189). 이 2개의 VH와 VL은 상이한 모노클로날 항체로부터 유래하는 경우도 있을 수 있다. 예를 들어, Journal of Immunology (1994) 152 (11), 5368-5374에 개시되는 바와 같은 동일 항원 중에 존재하는 2종류의 에피토프를 인식하는 이중 특이성(bispecific sc(Fv)2)도 호적하게 들 수 있다. sc(Fv)2는, 당업자에게 공지된 방법에 의해 제작될 수 있다. 예를 들어, scFv를 펩티드 링커 등의 링커로 결속하는 것에 의해 제작될 수 있다.
본 명세서에 있어서의 sc(Fv)2를 구성하는 항원 결합 도메인의 구성으로서는, 2개의 VH 및 2개의 VL이, 1본쇄 폴리펩티드의 N말단측을 기점으로 하여 VH, VL, VH, VL(［VH］링커［VL］링커［VH］링커［VL］)의 순서로 늘어서 있는 것을 특징으로 하는 항체를 들 수 있지만, 2개의 VH와 2개의 VL의 순서는 특별히 상기의 구성으로 한정되지 않고, 어떠한 순서로 늘어서 있어도 된다. 예를 들어 이하와 같은, 순서의 구성도 들 수 있다.
［VL］링커［VH］링커［VH］링커［VL］
［VH］링커［VL］링커［VL］링커［VH］
［VH］링커［VH］링커［VL］링커［VL］
［VL］링커［VL］링커［VH］링커［VH］
［VL］링커［VH］링커［VL］링커［VH］
sc(Fv)2의 분자 형태에 대해서는 WO2006/132352에 있어서도 상세하게 기재되어 있고, 당업자이면 이들 기재에 기초하여, 본 명세서에서 개시되는 항원 결합 분자의 제작을 위해서 적절히 소망의 sc(Fv)2를 제작하는 것이 가능하다.
또한 본 발명의 항원 결합 분자는, PEG 등의 캐리어 고분자나 항암제 등의 유기 화합물을 컨주게이트해도 된다. 또한 당쇄 부가 서열을 삽입하여, 당쇄가 소망의 효과를 얻는 것을 목적으로 하여 호적하게 부가될 수 있다.
항체의 가변 영역을 결합하는 링커로서는, 유전자 공학에 의해 도입할 수 있는 임의의 펩티드 링커, 또는 합성 화합물 링커(예를 들어, Protein Engineering, 9 (3), 299-305, 1996 참조)에 개시되는 링커 등을 이용할 수 있지만, 본 발명에 있어서는 펩티드 링커가 바람직하다. 펩티드 링커의 길이는 특별히 한정되지 않고, 목적에 따라 당업자가 적절히 선택하는 것이 가능하지만, 바람직한 길이는 5아미노산 이상(상한은 특별히 한정되지 않지만, 통상, 30아미노산 이하, 바람직하게는 20아미노산 이하)이며, 특히 바람직하게는 15아미노산이다. sc(Fv)2에 3개의 펩티드 링커가 포함되는 경우에는, 모두 동일한 길이의 펩티드 링커를 이용해도 되고, 상이한 길이의 펩티드 링커를 이용해도 된다.
예를 들어, 펩티드 링커의 경우:
Ser
Gly·Ser
Gly·Gly·Ser
Ser·Gly·Gly
Gly·Gly·Gly·Ser
Ser·Gly·Gly·Gly
Gly·Gly·Gly·Gly·Ser
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly
Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly
Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly
(Gly·Gly·Gly·Gly·Ser)n
(Ser·Gly·Gly·Gly·Gly)n
［n은 1 이상의 정수이다］ 등을 들 수 있다. 단, 펩티드 링커의 길이나 서열은 목적에 따라 당업자가 적절히 선택할 수 있다.
합성 화학물 링커(화학 가교제)는, 펩티드의 가교에 통상 이용되고 있는 가교제, 예를 들어 N-하이드록시석신이미드(NHS), 다이석신이미딜수베레이트(DSS), 비스(설포석신이미딜)수베레이트(BS3), 다이싸이오비스(석신이미딜프로피오네이트)(DSP), 다이싸이오비스(설포석신이미딜프로피오네이트)(DTSSP), 에틸렌 글라이콜 비스(석신이미딜석시네이트)(EGS), 에틸렌 글라이콜 비스(설포석신이미딜석시네이트)(설포-EGS), 다이석신이미딜 타르타르산염(DST), 다이설포석신이미딜 타르타르산염(설포-DST), 비스［2-(석신이미드옥시카보닐옥시)에틸］설폰(BSOCOES), 비스［2-(설포석신이미드옥시카보닐옥시)에틸］설폰(설포-BSOCOES) 등이고, 이들 가교제는 시판되고 있다.
4개의 항체 가변 영역을 결합하는 경우에는, 통상, 3개의 링커가 필요하지만, 모두 동일한 링커를 이용해도 되고, 상이한 링커를 이용해도 된다.
「Fab」는, 1개의 경쇄, 및 1개의 중쇄의 CH1 영역 및 가변 영역으로 구성된다. Fab 분자의 중쇄는, 다른 중쇄 분자와의 다이설파이드 결합을 형성할 수 없다.
「F(ab＇)2」 및 「Fab＇」란, 이뮤노글로불린(모노클로날 항체)을 단백질 분해 효소인 펩신 혹은 파파인 등으로 처리하는 것에 의해 제조되고, 힌지 영역 중의 2개의 H쇄 사이에 존재하는 다이설파이드 결합의 전후에서 소화되어 생성되는 항체 프래그먼트를 의미한다. 예를 들어, IgG를 파파인으로 처리하는 것에 의해, 힌지 영역 중의 2개의 H쇄 사이에 존재하는 다이설파이드 결합의 상류에서 절단되어 VL(L쇄 가변 영역)과 CL(L쇄 정상 영역)로 이루어지는 L쇄, 및 VH(H쇄 가변 영역)와 CH감마1(H쇄 정상 영역 중의 감마1 영역)로 이루어지는 H쇄 프래그먼트가 C말단 영역에서 다이설파이드 결합에 의해 결합한 상동인 2개의 항체 프래그먼트가 제조될 수 있다. 이들 2개의 상동인 항체 프래그먼트는 각각 Fab'라고 한다.
「F(ab＇)2」는, 2개의 경쇄, 및, 쇄 사이의 다이설파이드 결합이 2개의 중쇄 사이에 형성되도록 CH1 도메인 및 CH2 도메인의 일부분의 정상 영역을 포함하는 2개의 중쇄를 포함한다. 본 명세서에 있어서 개시되는 항원 결합 분자를 구성하는 F(ab＇)2는, 소망의 항원 결합 도메인을 갖는 전장 모노클로날 항체 등을 펩신 등의 단백질 분해 효소로 부분 소화한 후에, Fc 단편을 프로틴 A 칼럼에 흡착시켜 제거하는 것에 의해, 호적하게 취득될 수 있다. 이러한 단백질 분해 효소로서는 pH 등의 효소의 반응 조건을 적절히 설정하는 것에 의해 제한적으로 F(ab＇)2를 생기게 하도록 전장 항체를 소화할 수 있는 것이면 특별한 한정은 되지 않고, 예를 들어, 펩신이나 피신 등을 예시할 수 있다.
본 명세서에 있어서 개시되는 항원 결합 분자를 구성하는 Fc 영역은 모노클로날 항체 등의 항체를 펩신 등의 단백질 분해 효소로 부분 소화한 후에, 단편을 프로틴 A 칼럼, 혹은 프로틴 G 칼럼에 흡착시킨 후에, 적절한 용출 버퍼 등에 의해 용출시키는 것에 의해 호적하게 취득될 수 있다. 이러한 단백질 분해 효소로서는 pH 등의 효소의 반응 조건을 적절히 설정하는 것에 의해 모노클로날 항체 등의 항체를 소화할 수 있는 것이면 특별한 한정은 되지 않고, 예를 들어, 펩신이나 피신 등을 예시할 수 있다.
본 명세서에 기재되는 항원 결합 분자에는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 Fc 영역을 구성하는 아미노산 중 Fc감마 수용체에 대한 결합 활성이 저하되어 있는 Fc 영역이 포함된다.
항체의 아이소타입은, 정상 영역의 구조에 의해 결정된다. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4의 각 아이소타입의 정상 영역은, 각각, C감마1, C감마2, C감마3, C감마4로 불리고 있다.
Fc 영역은, 2개의 경쇄, 및, 쇄 사이의 다이설파이드 결합이 2개의 중쇄 사이에 형성되도록 CH1 도메인 및 CH2 도메인 사이의 정상 영역의 일부분을 포함하는 2개의 중쇄를 포함하는 F(ab＇)2를 제외한 영역을 말한다. 본 명세서에 있어서 개시되는 항원 결합 분자를 구성하는 Fc 영역은, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 모노클로날 항체 등을 펩신 등의 단백질 분해 효소로 부분 소화한 후에, 프로틴 A 칼럼에 흡착된 획분을 재용출하는 것에 의해 호적하게 취득될 수 있다. 이러한 단백질 분해 효소로서는 pH 등의 효소의 반응 조건을 적절히 설정하는 것에 의해 제한적으로 F(ab＇)2를 생기게 하도록 전장 항체를 소화할 수 있는 것이면 특별한 한정은 되지 않고, 예를 들어, 펩신이나 피신 등을 예시할 수 있다.
Fcγ 수용체란, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 모노클로날 항체의 Fc 영역에 결합할 수 있는 수용체를 말하고, 실질적으로 Fcγ 수용체 유전자에 코딩되는 단백질의 패밀리의 어떠한 멤버도 의미한다. 인간에서는, 이 패밀리에는, 아이소폼 FcγRIa, FcγRIb 및 FcγRIc를 포함하는 FcγRI(CD64); 아이소폼 FcγRIIa(알로타입 H131 및 R131을 포함한다), FcγRIIb(FcγRIIb-1 및 FcγRIIb-2를 포함한다) 및 FcγRIIc를 포함하는 FcγRII(CD32); 및 아이소폼 FcγRIIIa(알로타입 V158 및 F158을 포함한다) 및 FcγRIIIb(알로타입 FcγRIIIb-NA1 및 FcγRIIIb-NA2를 포함한다)를 포함하는 FcγRIII(CD16), 및 어떠한 미발견의 인간 FcγR류 또는 FcγR 아이소폼 또는 알로타입도 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. FcγR은, 인간, 마우스, 래트, 토끼 및 원숭이를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아닌, 어떠한 생물 유래여도 된다. 마우스 FcγR류에는, FcγRI(CD64), FcγRII(CD32), FcγRIII(CD16) 및 FcγRIII-2(CD16-2), 및 어떠한 미발견의 마우스 FcγR류 또는 FcγR 아이소폼 또는 알로타입도 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다. 이와 같은 Fcγ 수용체의 호적한 예로서는 인간 FcγRI(CD64), FcγRIIA(CD32), FcγRIIB(CD32), FcγRIIIA(CD16) 및/또는 FcγRIIIB(CD16)를 들 수 있다. FcγRI의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 RefSeq 등록 번호로, NM_000566.3및 NP_000557.1에, FcγRIIA의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 RefSeq 등록 번호로, BC020823.1 및 30AAH20823.1에, FcγRIIB의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 RefSeq 등록 번호로, BC146678.1 및 AAI46679.1에, FcγRIIIA의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 RefSeq 등록 번호로, BC033678.1 및 AAH33678.1에, 및 FcγRIIIB의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은, 각각 RefSeq 등록 번호로, BC128562.1 및 AAI28563.1에 기재되어 있다. Fcγ 수용체가, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 모노클로날 항체의 Fc 영역에 결합 활성을 갖는지 여부는, 상기에 기재되는 FACS나 ELISA 포맷 외, ALPHA 스크린(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)이나 표면 플라즈몬 공명(SPR) 현상을 이용한 BIACORE법 등에 의해 확인될 수 있다(Proc.Natl.Acad.Sci.USA (2006) 103 (11), 4005-4010).
또한, 「Fc 리간드」 또는 「이펙터 리간드」는, 항체의 Fc 영역에 결합하여 Fc/Fc 리간드 복합체를 형성하는, 임의의 생물에서 유래하는 분자, 바람직하게는 폴리펩티드를 의미한다. Fc 리간드의 Fc에의 결합은, 바람직하게는, 1개 또는 그 이상의 이펙터 기능을 유기한다. Fc 리간드에는, Fc 수용체, FcγR, FcαR, FcεR, FcRn, C1q, C3, 만난 결합 렉틴, 만노스 수용체, 스타필로코커스의 프로틴 A, 스타필로코커스의 단백질 G 및 바이러스의 FcγR이 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다. Fc 리간드에는, FcγR에 상동인 Fc 수용체의 패밀리인 Fc 수용체 상동체(FcRH)(Davis et al.,(2002) Immunological Reviews 190, 123-136)도 포함된다. Fc 리간드에는, Fc에 결합하는 미발견의 분자도 포함될 수 있다.
Fc 영역이 FcγI, FcγIIA, FcγIIB, FcγIIIA 및/또는 FcγIIIB의 어느 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 저하되어 있는 것은, 상기에 기재되는 FACS나 ELISA 포맷 외, ALPHA 스크린(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)이나 표면 플라즈몬 공명(SPR) 현상을 이용한 BIACORE법 등에 의해 확인할 수 있다(Proc.Natl.Acad.Sci.USA (2006) 103 (11), 4005-4010).
ALPHA 스크린은, 도너와 억셉터의 2개의 비즈를 사용하는 ALPHA 테크놀로지에 의해 하기의 원리에 기초하여 실시된다. 도너 비즈에 결합한 분자가, 억셉터 비즈에 결합한 분자와 생물학적으로 상호작용하여, 2개의 비즈가 근접한 상태의 시에만, 발광 시그널이 검출된다. 레이저에 의해 여기된 도너 비즈 내의 포토센서타이저는, 주변의 산소를 여기 상태의 일중항 산소로 변환한다. 일중항 산소는 도너 비즈 주변에 확산하고, 근접하고 있는 억셉터 비즈에 도달하면 비즈 내의 화학 발광 반응을 야기하여, 최종적으로 광이 방출된다. 도너 비즈에 결합한 분자와 억셉터 비즈에 결합한 분자가 상호작용하지 않을 때는, 도너 비즈의 산생하는 일중항 산소가 억셉터 비즈에 도달하지 않기 때문에, 화학 발광 반응은 일어나지 않는다.
예를 들어, 도너 비즈에 비오틴 표지된 항원 결합 분자가 결합되고, 억셉터 비즈에는 글루타티온 S 트랜스페라제(GST)로 태그화된 Fcγ 수용체가 결합된다. 경합하는 변이 Fc 영역을 갖는 항원 결합 분자의 비존재하에서는, 야생형 Fc 영역을 갖는 항원 결합 분자와 Fcγ 수용체는 상호작용하여 520-620nm의 시그널을 일으킨다. 태그화되어 있지 않은 변이 Fc 영역을 갖는 항원 결합 분자는, 야생형 Fc 영역을 갖는 항원 결합 분자와 Fcγ 수용체 사이의 상호작용과 경합한다. 경합의 결과 나타나는 형광의 감소를 정량하는 것에 의해 상대적인 결합 친화성이 결정될 수 있다. 항체 등의 항원 결합 분자를 Sulfo-NHS-비오틴 등을 이용하여 비오틴화하는 것은 공지이다. Fcγ 수용체를 GST로 태그화하는 방법으로서는, Fcγ 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 GST를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 인프레임으로 융합한 융합 유전자를 발현 가능한 벡터에 보지한 세포 등에 있어서 발현하고, 글루타티온 칼럼을 이용하여 정제하는 방법 등이 적절히 채용될 수 있다. 얻어진 시그널은 예를 들어 GRAPHPAD PRISM(GraphPad사, San Diego) 등의 소프트웨어를 이용하여 비선형 회귀 해석을 이용하는 일부위 경합(one-site competition) 모델에 적합시키는 것에 의해 호적하게 해석된다.
상호작용을 관찰하는 물질의 한쪽(리간드)을 센서 칩의 금 박막 상에 고정하고, 센서 칩의 이측(裏側)으로부터 금 박막과 유리의 경계면에서 전반사하도록 광을 쪼이면, 반사광의 일부에 반사 강도가 저하된 부분(SPR 시그널)이 형성된다. 상호작용을 관찰하는 물질의 다른 쪽(애널라이트)을 센서 칩의 표면에 흘려 리간드와 애널라이트가 결합하면, 고정화되어 있는 리간드 분자의 질량이 증가하여, 센서 칩 표면의 용매의 굴절률이 변화한다. 이 굴절률의 변화에 의해, SPR 시그널의 위치가 시프트한다(반대로 결합이 해리하면 시그널의 위치는 되돌아온다). Biacore 시스템은 상기의 시프트하는 양, 즉 센서 칩 표면에서의 질량 변화를 세로축에 취하고, 질량의 시간 변화를 측정 데이터로서 표시한다(센서그램). 센서그램의 커브로부터 키네틱스: 결합 속도 상수(ka)와 해리 속도 상수(kd)가, 당해 상수의 비로부터 어피니티(KD)가 구해진다. BIACORE법에서는 저해 측정법도 호적하게 이용된다. 저해 측정법의 예는 Proc.Natl.Acad.Sci.USA (2006) 103 (11), 4005-4010에 있어서 기재되어 있다.
항종양 효과를 나타내는 복수의 치료용 항체는, 암 세포의 증식에 필요한 시그널의 저해, 세포사 시그널의 유발, 혹은 ADCC(Antibody Dependent Cell-mediated Cytotoxicity; 항체 의존성 세포 상해 작용), CDC(Complement Dependent Cytotoxicity; 보체 의존성 세포 상해 작용)에 의해, 암 세포에 대한 항종양 효과를 발휘한다. 항체의 Fc 영역이 NK 세포나 매크로파지 등의 이펙터 세포 상에 존재하는 Fc 수용체에 결합하는 것에 의해, 항체가 결합한 표적의 암 세포에 대해서 이들 이펙터 세포가 발휘하는 세포 상해가 ADCC이다. 항체의 구조 중에 존재하는 보체 결합 부위에는 보체 복합체가 결합한다. 항체가 결합한 세포의 세포막 상에 당해 복합체 중에 존재하는 보체 성분이 구멍을 형성하는 것에 의해, 물이나 이온의 세포 내에의 유입이 촉진되어 세포가 파괴되어 일어나는 세포 상해가 CDC이다. Fc 수용체 중, Fcγ 수용체란, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 모노클로날 항체의 Fc 영역에 결합할 수 있는 수용체를 말하고, Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 낮은 경우, 암 항원 비의존적으로 T 세포와 NK 세포나 매크로파지 등에 발현하는 수용체가 가교되는 경우는 없다. 그 때문에, 암 항원 비의존적인 사이토카인의 유도는 일어나지 않는다. Fc 영역이 FcγI, FcγIIA, FcγIIB, FcγIIIA 및/또는 FcγIIIB의 어느 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 저하되어 있는 항체는, 항원 결합 분자로서 바람직하다.
본 명세서에 있어서, Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 저하되어 있다는 것은, 예를 들어, 상기의 해석 방법에 기초하여, 대조로 하는 항원 결합 분자의 경합 활성과 비교하여 피검 항원 결합 분자의 경합 활성이, 50% 이하, 바람직하게는 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 특히 바람직하게는 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하의 결합 활성을 나타내는 것을 말한다.
대조로 하는 항원 결합 분자로서는, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 모노클로날 항체의 Fc 영역을 갖는 항원 결합 분자가 적절히 사용될 수 있다. 당해 Fc 영역의 구조로서, RefSeq 등록 번호 AAC82527.1의 N말에 A를 부가한 서열, RefSeq 등록 번호 AAB59393.1의 N말에 A를 부가한 서열, RefSeq 등록 번호 CAA27268.1의 N말에 A를 부가한 서열, RefSeq 등록 번호 AAB59394.1의 N말에 A를 부가한 서열이 예시된다. 또한, 어느 특정의 아이소타입의 항체의 Fc 영역의 변이체를 갖는 항원 결합 분자를 피검 물질로서 사용하는 경우에는, 당해 특정의 아이소타입의 항체의 Fc 영역을 갖는 항원 결합 분자를 대조로서 이용하는 것에 의해, 당해 변이체가 갖는 변이에 의한 Fcγ 수용체에의 결합 활성에 대한 효과가 검증된다. 상기와 같이 하여, Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 저하되어 있는 것이 검증된 Fc 영역의 변이체를 갖는 항원 결합 분자가 적절히 제작된다.
이와 같은 변이체의 예로서는, EU 넘버링에 따라 특정되는 아미노산인 231A-238S의 결실(WO 2009/011941), C226S, C229S, P238S, (C220S)(J.Rheumatol (2007) 34, 11), C226S, C229S(Hum.Antibod.Hybridomas (1990) 1(1), 47-54), C226S, C229S, E233P, L234V, L235A(Blood (2007) 109, 1185-1192) 등의 변이체가 공지이다.
즉, 특정의 아이소타입의 항체의 Fc 영역을 구성하는 아미노산 중, EU 넘버링에 따라 특정되는 하기의 어느 아미노산; 220위, 226위, 229위, 231위, 232위, 233위, 234위, 235위, 236위, 237위, 238위, 239위, 240위, 264위, 265위, 266위, 267위, 269위, 270위, 295위, 296위, 297위, 298위, 299위, 300위, 325위, 327위, 328위, 329위, 330위, 331위, 332위가 치환되어 있는 Fc 영역을 갖는 항원 결합 분자를 호적하게 들 수 있다. Fc 영역의 기원인 항체의 아이소타입로서는 특별히 한정되지 않고, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 모노클로날 항체를 기원으로 하는 Fc 영역이 적절히 이용될 수 있지만, IgG1 항체를 기원으로 하는 Fc 영역이 호적하게 이용된다.
예를 들어, IgG1 항체의 Fc 영역을 구성하는 아미노산 중, EU 넘버링에 따라 특정되는 하기의 어느 치환(숫자가 EU 넘버링에 따라 특정되는 아미노산 잔기의 위치, 숫자 앞에 위치하는 1문자의 아미노산 기호가 치환 전의 아미노산 잔기, 숫자 뒤에 위치하는 1문자의 아미노산 기호가 치환 전의 아미노산 잔기를 각각 나타낸다);
(a) L234F, L235E, P331S,
(b) C226S, C229S, P238S,
(c) C226S, C229S,
(d) C226S, C229S, E233P, L234V, L235A
(e) L234A, L235A 또는 L235R, N297A
(f) L235A 또는 L235R, S239K, N297A가 실시되어 있는 Fc 영역, 또는, 231위에서 238위의 아미노산 서열이 결실된 Fc 영역을 갖는 항원 결합 분자도 적절히 사용될 수 있다.
또한, IgG2 항체의 Fc 영역을 구성하는 아미노산 중, EU 넘버링에 따라 특정되는 하기의 어느 치환(숫자가 EU 넘버링에 따라 특정되는 아미노산 잔기의 위치, 숫자 앞에 위치하는 1문자의 아미노산 기호가 치환 전의 아미노산 잔기, 숫자 뒤에 위치하는 1문자의 아미노산 기호가 치환 전의 아미노산 잔기를 각각 나타낸다);
(g) H268Q, V309L, A330S, P331S
(h) V234A
(i) G237A
(j) V234A, G237A
(k) A235E, G237A
(l) V234A, A235E, G237A가 실시되어 있는 Fc 영역을 갖는 항원 결합 분자도 적절히 사용될 수 있다.
또한, IgG3 항체의 Fc 영역을 구성하는 아미노산 중, EU 넘버링에 따라 특정되는 하기의 어느 치환(숫자가 EU 넘버링에 따라 특정되는 아미노산 잔기의 위치, 숫자 앞에 위치하는 1문자의 아미노산 기호가 치환 전의 아미노산 잔기, 숫자 뒤에 위치하는 1문자의 아미노산 기호가 치환 전의 아미노산 잔기를 각각 나타낸다);
(m) F241A
(n) D265A
(o) V264A가 실시되어 있는 Fc 영역을 갖는 항원 결합 분자도 적절히 사용될 수 있다.
또한, IgG4 항체의 Fc 영역을 구성하는 아미노산 중, EU 넘버링에 따라 특정되는 하기의 어느 치환(숫자가 EU 넘버링에 따라 특정되는 아미노산 잔기의 위치, 숫자 앞에 위치하는 1문자의 아미노산 기호가 치환 전의 아미노산 잔기, 숫자 뒤에 위치하는 1문자의 아미노산 기호가 치환 전의 아미노산 잔기를 각각 나타낸다);
(p) L235A, G237A, E318A
(q) L235E
(r) F234A, L235A가 실시되어 있는 Fc 영역을 갖는 항원 결합 분자도 적절히 사용될 수 있다.
그 외의 바람직한 예로서, IgG1 항체의 Fc 영역을 구성하는 아미노산 중, EU 넘버링에 따라 특정되는 하기의 어느 아미노산; 233위, 234위, 235위, 236위, 237위, 327위, 330위, 331위가, 대응하는 IgG2 또는 IgG4에 있어서 그 EU 넘버링이 대응하는 아미노산으로 치환되어 있는 Fc 영역을 갖는 항원 결합 분자를 들 수 있다.
그 외의 바람직한 예로서, IgG1 항체의 Fc 영역을 구성하는 아미노산 중, EU 넘버링에 따라 특정되는 하기의 어느 1개 또는 그 이상의 아미노산; 234위, 235위, 297위가 다른 아미노산에 의해 치환되어 있는 Fc 영역을 갖는 항원 결합 분자를 호적하게 들 수 있다. 치환 후에 존재하는 아미노산의 종류는 특별히 한정되지 않지만, 234위, 235위, 297위의 어느 1개 또는 그 이상의 아미노산이 알라닌으로 치환되어 있는 Fc 영역을 갖는 항원 결합 분자가 특히 바람직하다.
그 외의 바람직한 예로서, IgG1 항체의 Fc 영역을 구성하는 아미노산 중, EU 넘버링에 따라 특정되는 하기의 어느 아미노산; 265위가 다른 아미노산에 의해 치환되어 있는 Fc 영역을 갖는 항원 결합 분자를 호적하게 들 수 있다. 치환 후에 존재하는 아미노산의 종류는 특별히 한정되지 않지만, 265위의 아미노산이 알라닌으로 치환되어 있는 Fc 영역을 갖는 항원 결합 분자가 특히 바람직하다.
IgG 클래스의 항체의 이펙터 기능인 항체 의존성 세포 상해 작용(ADCC), 보체 의존성 세포 상해 작용(CDC)의 연구는, 지금까지 다수 행해지고, 인간 IgG 클래스 중에서는, IgG1 서브클래스의 항체가 가장 높은 ADCC 활성, CDC 활성을 갖는다. 또한, IgG 클래스의 항체를 개재시킨 표적 세포의 파고사이토시스인 항체 의존성 세포 개재성 파고사이토시스(ADCP)도 항체의 이펙터 기능의 하나로서 시사되어 있다. IgG1 서브클래스의 항체는, 이들의 이펙터 기능을 종양에 대해서 발휘시키는 것이 가능하기 때문에, 암 항원에 대한 대부분의 항체 의약으로서 IgG1 서브클래스의 항체가 이용되고 있다.
한편, IgG 항체가, 항체의 이펙터 기능인 ADCC, ADCP, 또는, 표적 세포의 파고사이토시스인 항체 의존성 세포 개재성 파고사이토시스(ADCP) 활성을 매개하기 위해서는, IgG 항체의 Fc 영역과 킬러 세포, 내추럴 킬러 세포, 활성화된 매크로파지 등의 이펙터 세포 표면 상에 존재하는 Fcγ 리셉터(FcγR)의 결합이 필요하다.
ADCC와 ADCP 등의 세포 상해성의 이펙터 기능의 증강은, 항암 항체의 항종양 효과를 증강하기 위한 유망한 수단이다. Fcγ 리셉터에 대한 결합이 최적화된 Fc 영역을 갖는 항체는, 보다 강력한 이펙터 기능을 매개하고, 그것에 의해 효과적인 항종양 효과를 발휘하는 것이 시사된다. 따라서, 암 항원에 대한 항체 의약의 항종양 활성을 증강 혹은 향상시키는 항체 엔지니어링의 수법으로서 지금까지 다양한 보고(예를 들어 WO2013047752 등)가 되어 있다.
Fc 영역과 Fcγ 리셉터의 결합에 대해서는, 항체의 힌지 영역 및 CH2 도메인 내의 몇몇 아미노산 잔기 및 CH2 도메인에 결합하고 있는 EU 넘버링 297번째의 Asn에 부가되는 당쇄가 중요하다는 것이 나타나 있다(Clark, M., Chemical Immunology (1997) 65, 88-110, Greenwood J, Clark M, Waldmann H., Eur. J. Immunol. (1993) 23, 1098-1104, Morgan A, Jones ND, Nesbitt AM, Chaplin L, Bodmer MW, Emtage JS., Immunology (1995) 86, 319-324). 이 결합 개소를 중심으로, 지금까지 다양한 Fcγ 리셉터 결합 특성을 가지는 Fc 영역의 변이체가 연구되어, 보다 높은 활성화 Fcγ 리셉터에 대한 친화성을 갖는 Fc 영역 변이체가 얻어지고 있다(WO2000/042072, WO2006/019447).
이와 같이, 막형 항원을 표적으로 한 항체에 있어서는, Fcγ 리셉터에 대한 결합 활성은 세포 상해 활성에 중요한 역할을 하고 있으므로, 세포 상해 활성이 필요한 경우, FcγR에 대한 결합 활성이 높은 인간 IgG1의 아이소타입이 이용되고, 추가로 Fcγ 리셉터에 대한 결합 활성을 증강하는 것에 의해 세포 상해 활성을 증강시키는 것은 널리 이용되고 있는 기술이다. 또한, 가용형 항원을 표적으로 한 항체에 있어서도, Fcγ 리셉터에 대한 결합 활성을 증강하는 것은 시도되고 있다(WO2013047752).
Fc 영역이, Fc 영역의 EU 넘버링으로 표시되는 부위 중;
221위의 아미노산이 Lys 또는 Tyr의 어느 것,
222위의 아미노산이 Phe, Trp, Glu 또는 Tyr의 어느 것,
223위의 아미노산이 Phe, Trp, Glu 또는 Lys의 어느 것,
224위의 아미노산이 Phe, Trp, Glu 또는 Tyr의 어느 것,
225위의 아미노산이 Glu, Lys 또는 Trp의 어느 것,
227위의 아미노산이 Glu, Gly, Lys 또는 Tyr의 어느 것,
228위의 아미노산이 Glu, Gly, Lys 또는 Tyr의 어느 것,
230위의 아미노산이 Ala, Glu, Gly 또는 Tyr의 어느 것,
231위의 아미노산이 Glu, Gly, Lys, Pro 또는 Tyr의 어느 것,
232위의 아미노산이 Glu, Gly, Lys 또는 Tyr의 어느 것,
233위의 아미노산이 Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr의 어느 것,
234위의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr의 어느 것,
235위의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr의 어느 것,
236위의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr의 어느 것,
237위의 아미노산이 Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr의 어느 것,
238위의 아미노산이 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr의 어느 것,
239위의 아미노산이 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp 또는 Tyr의 어느 것,
240위의 아미노산이 Ala, Ile, Met 또는 Thr의 어느 것,
241위의 아미노산이 Asp, Glu, Leu, Arg, Trp 또는 Tyr의 어느 것,
243위의 아미노산이 Leu, Glu, Leu, Gln, Arg, Trp 또는 Tyr의 어느 것,
244위의 아미노산이 His,
245위의 아미노산이 Ala,
246위의 아미노산이 Asp, Glu, His 또는 Tyr의 어느 것,
247위의 아미노산이 Ala, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Thr, Val 또는 Tyr의 어느 것,
249위의 아미노산이 Glu, His, Gln 또는 Tyr의 어느 것,
250위의 아미노산이 Glu 또는 Gln의 어느 것,
251위의 아미노산이 Phe,
254위의 아미노산이 Phe, Met 또는 Tyr의 어느 것,
255위의 아미노산이 Glu, Leu 또는 Tyr의 어느 것,
256위의 아미노산이 Ala, Met 또는 Pro의 어느 것,
258위의 아미노산이 Asp, Glu, His, Ser 또는 Tyr의 어느 것,
260위의 아미노산이 Asp, Glu, His 또는 Tyr의 어느 것,
262위의 아미노산이 Ala, Glu, Phe, Ile 또는 Thr의 어느 것,
263위의 아미노산이 Ala, Ile, Met 또는 Thr의 어느 것,
264위의 아미노산이 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp 또는 Tyr의 어느 것,
265위의 아미노산이 Ala, Leu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr의 어느 것,
266위의 아미노산이 Ala, Ile, Met 또는 Thr의 어느 것,
267위의 아미노산이 Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp 또는 Tyr의 어느 것,
268위의 아미노산이 Asp, Glu, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Thr, Val 또는 Trp의 어느 것,
269위의 아미노산이 Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr의 어느 것,
270위의 아미노산이 Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp 또는 Tyr의 어느 것,
271위의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr의 어느 것,
272위의 아미노산이 Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr의 어느 것,
273위의 아미노산이 Phe 또는 Ile의 어느 것,
274위의 아미노산이 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr의 어느 것,
275위의 아미노산이 Leu 또는 Trp의 어느 것,
276위의 아미노산이, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr의 어느 것,
278위의 아미노산이 Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val 또는 Trp의 어느 것,
279위의 아미노산이 Ala,
280위의 아미노산이 Ala, Gly, His, Lys, Leu, Pro, Gln, Trp 또는 Tyr의 어느 것,
281위의 아미노산이 Asp, Lys, Pro 또는 Tyr의 어느 것,
282위의 아미노산이 Glu, Gly, Lys, Pro 또는 Tyr의 어느 것,
283위의 아미노산이 Ala, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg 또는 Tyr의 어느 것,
284위의 아미노산이 Asp, Glu, Leu, Asn, Thr 또는 Tyr의 어느 것,
285위의 아미노산이 Asp, Glu, Lys, Gln, Trp 또는 Tyr의 어느 것,
286위의 아미노산이 Glu, Gly, Pro 또는 Tyr의 어느 것,
288위의 아미노산이 Asn, Asp, Glu 또는 Tyr의 어느 것,
290위의 아미노산이 Asp, Gly, His, Leu, Asn, Ser, Thr, Trp 또는 Tyr의 어느 것,
291위의 아미노산이 Asp, Glu, Gly, His, Ile, Gln 또는 Thr의 어느 것,
292위의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Pro, Thr 또는 Tyr의 어느 것,
293위의 아미노산이 Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr의 어느 것,
294위의 아미노산이 Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr의 어느 것,
295위의 아미노산이 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr의 어느 것,
296위의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr 또는 Val의 어느 것,
297위의 아미노산이 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr의 어느 것,
298위의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Thr, Val, Trp 또는 Tyr의 어느 것,
299위의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp 또는 Tyr의 어느 것,
300위의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val 또는 Trp의 어느 것,
301위의 아미노산이 Asp, Glu, His 또는 Tyr의 어느 것,
302위의 아미노산이 Ile,
303위의 아미노산이 Asp, Gly 또는 Tyr의 어느 것,
304위의 아미노산이 Asp, His, Leu, Asn 또는 Thr의 어느 것,
305위의 아미노산이 Glu, Ile, Thr 또는 Tyr의 어느 것,
311위의 아미노산이 Ala, Asp, Asn, Thr, Val 또는 Tyr의 어느 것,
313위의 아미노산이 Phe,
315위의 아미노산이 Leu,
317위의 아미노산이 Glu 또는 Gln,
318위의 아미노산이 His, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val 또는 Tyr의 어느 것,
320위의 아미노산이 Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Pro, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr의 어느 것,
322위의 아미노산이 Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Pro, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr의 어느 것,
323위의 아미노산이 Ile,
324위의 아미노산이 Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Thr, Val, Trp 또는 Tyr의 어느 것,
325위의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr의 어느 것,
326위의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr의 어느 것,
327위의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Thr, Val, Trp 또는 Tyr의 어느 것,
328위의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr의 어느 것,
329위의 아미노산이 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr의 어느 것,
330위의 아미노산이 Cys, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr의 어느 것,
331위의 아미노산이 Asp, Phe, His, Ile, Leu, Met, Gln, Arg, Thr, Val, Trp 또는 Tyr의 어느 것,
332위의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr의 어느 것,
333위의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Ser, Thr, Val 또는 Tyr의 어느 것,
334위의 아미노산이 Ala, Glu, Phe, Ile, Leu, Pro 또는 Thr의 어느 것,
335위의 아미노산이 Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Val, Trp 또는 Tyr의 어느 것,
336위의 아미노산이 Glu, Lys 또는 Tyr의 어느 것,
337위의 아미노산이 Glu, His 또는 Asn의 어느 것,
339위의 아미노산이 Asp, Phe, Gly, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Ser 또는 Thr의 어느 것,
376위의 아미노산이 Ala 또는 Val의 어느 것,
377위의 아미노산이 Gly 또는 Lys의 어느 것,
378위의 아미노산이 Asp,
379위의 아미노산이 Asn,
380위의 아미노산이 Ala, Asn 또는 Ser의 어느 것,
382위의 아미노산이 Ala 또는 Ile의 어느 것,
385위의 아미노산이 Glu,
392위의 아미노산이 Thr,
396위의 아미노산이 Leu,
421위의 아미노산이 Lys,
427위의 아미노산이 Asn,
428위의 아미노산이 Phe 또는 Leu의 어느 것,
429위의 아미노산이 Met,
434위의 아미노산이 Trp,
436위의 아미노산이 Ile, 및
440위의 아미노산이 Gly, His, Ile, Leu 또는 Tyr의 어느 것, 의 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산을 포함하는 Fc 영역을 갖는 IgG 항체, 또 IgG 항체양 분자가 2차 분자인 ADCC 활성을 갖는 항체로서 바람직하다.
본 발명의 항원 결합 분자로서, 다중 특이성 항체를 들 수 있다. 여기에서, 다중 특이성 항체란, 복수의 상이한 특이성을 갖는 항체이다. 다중 특이성 항체의 예로서는 이중 특이성 항체를 들 수 있다. IgG형의 이중 특이성 항체는 IgG 항체를 산생하는 하이브리도마 2종을 융합하는 것에 의해 생기는 hybrid hybridoma(quadroma)에 의해 분비시킬 수 있다(Milstein C et al. Nature (1983) 305, 537-540). 이중 특이성 항체의 Fc 영역으로서, Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 저하되어 있는 Fc 영역을 이용하는 경우, 이중 특이성 항체를 기원으로 하는 Fc 영역도 적절히 사용된다.
다중 특이성 항체를 제작하기 위한 수법은, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 페어의 재조합 공발현(Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983), WO93/08829, 및 Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991) 참조), 및 knob-in-hole 기술(예를 들어, 미국 특허 제5,731,168호 참조)을 포함한다. 다중 특이성 항체는, Fc 헤테로2량체 분자를 제작하기 위해서 정전 스티어링 효과(electrostatic steering effects)를 조작하는 것(WO2009/089004A1); 2개 이상의 항체 또는 단편을 가교하는 것(미국 특허 제4,676,980호 및 Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) 참조); 류신 지퍼를 이용하여 2개의 특이성을 갖는 항체를 작성하는 것(Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992) 참조); 「다이아보디」 기술을 이용하여 이중 특이성 항체 단편을 제작하는 것(Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) 참조); 및, 단쇄 Fv(scFv) 2량체를 이용하는 것(Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994) 참조); 및, 예를 들어 Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)에 기재되는 바와 같이 삼중 특이성 항체를 조제하는 것에 의해 제작해도 된다.
「옥토퍼스 항체」를 포함하는, 3개 이상의 기능적 항원 결합 부위를 수반하는 개변 항체도, 본 명세서에서는 포함된다(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2006/0025576호 A1 참조).
본 발명의 하나의 태양에 있어서, 항원 결합 분자는, 표적 항원 인식 부위 및 면역 수용체 인식 부위를 갖는 이중 특이성 항원 결합 부위를 포함한다. 여기에서 항원 결합 분자는, 이중 특이성 항원 결합 부위에 더하여 추가적인 항원 결합 부위를 갖고 있어도 되고, 당해 태양의 항원 결합 분자의 예로서, 이중 특이성 항원 결합 분자, 및 3종류 이상의 항원 결합 부위를 갖는 다중 특이성 항원 결합 분자를 들 수 있고, 보다 구체적으로는, 이중 특이성 항체 및 3종류 이상의 항원 결합 부위를 갖는 다중 특이성 항체를 들 수 있다.
IgG형의 이중 특이성 항체는 목적하는 2종의 IgG를 구성하는 L쇄 및 H쇄의 유전자, 합계 4종의 유전자를 세포에 도입하여 그들을 공발현시키는 것에 의해 분비된다. 그러나, 이들 방법으로 산생되는 IgG의 H쇄와 L쇄의 조합은 이론상 10가지로도 된다. 10종류의 IgG로부터 목적하는 조합의 H쇄 L쇄로 이루어지는 IgG를 정제하는 것은 곤란하다. 더욱이 목적하는 조합의 것의 분비량도 이론상 현저하게 저하되기 때문에, 큰 배양 규모가 필요하게 되어, 제조상의 비용은 더욱 증대한다.
본 발명의 이중 특이성 항체에는, 목적하는 조합의 H쇄 사이 및 L쇄 H쇄 사이의 회합을 촉진하기 위한 기술을 적용할 수 있다.
예를 들어, 다중 특이성 항체의 회합화에는, 항체 H쇄의 제2 정상 영역(CH2) 또는 H쇄의 제３ 정상 영역(CH3)의 계면에 전하적인 반발을 도입하여 목적으로 하지 않는 H쇄끼리의 회합을 억제하는 기술을 적용할 수 있다(WO2006/106905).
CH2 또는 CH3의 계면에 전하적인 반발을 도입하여 의도하지 않는 H쇄끼리의 회합을 억제시키는 기술에 있어서, H쇄의 다른 정상 영역의 계면에서 접촉하는 아미노산 잔기로서는, 예를 들어 CH3 영역에 있어서의 EU 넘버링 356번째의 잔기, EU 넘버링 439번째의 잔기, EU 넘버링 357번째의 잔기, EU 넘버링 370번째의 잔기, EU 넘버링 399번째의 잔기, EU 넘버링 409번째의 잔기에 상대하는 영역을 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 예를 들어, 2종의 H쇄 CH3 영역을 포함하는 항체에 있어서는, 제1 H쇄 CH3 영역에 있어서의 이하의 (1)∼(3)에 나타내는 아미노산 잔기의 조로부터 선택되는 1조 내지 3조의 아미노산 잔기가 동종의 전하를 갖는 항체로 할 수 있다; (1) H쇄 CH3 영역에 포함되는 아미노산 잔기로서, EU 넘버링 356위 및 439위의 아미노산 잔기, (2) H쇄 CH3 영역에 포함되는 아미노산 잔기로서, EU 넘버링 357위 및 370위의 아미노산 잔기, (3) H쇄 CH3 영역에 포함되는 아미노산 잔기로서, EU 넘버링 399위 및 409위의 아미노산 잔기.
더욱이, 상기 제1 H쇄 CH3 영역과는 상이한 제2 H쇄 CH3 영역에 있어서의 상기 (1)∼(3)에 나타내는 아미노산 잔기의 조로부터 선택되는 아미노산 잔기의 조로서, 상기 제1 H쇄 CH3 영역에 있어서 동종의 전하를 갖는 상기 (1)∼(3)에 나타내는 아미노산 잔기의 조에 대응하는 1조 내지 3조의 아미노산 잔기가, 상기 제1 H쇄 CH3 영역에 있어서의 대응하는 아미노산 잔기와는 반대의 전하를 갖는 항체로 할 수 있다.
상기 (1)∼(3)에 기재된 각각의 아미노산 잔기는, 회합했을 때에 서로 접근하고 있다. 당업자이면, 소망의 H쇄 CH3 영역 또는 H쇄 정상 영역에 대해, 시판의 소프트웨어를 이용한 호몰로지 모델링 등에 의해, 상기 (1)∼(3)에 기재된 아미노산 잔기에 대응하는 부위를 발견할 수 있고, 적절히, 해당 부위의 아미노산 잔기를 개변에 제공하는 것이 가능하다.
상기 항체에 있어서, 「전하를 갖는 아미노산 잔기」는, 예를 들어, 이하의 (a) 또는 (b)의 어느 군에 포함되는 아미노산 잔기로부터 선택되는 것이 바람직하다;
(a) 글루타민산(E), 아스파라긴산(D),
(b) 리신(K), 아르기닌(R), 히스티딘(H).
상기 항체에 있어서, 「동종의 전하를 갖는」이란, 예를 들어, 2개 이상의 아미노산 잔기의 모두가, 상기 (a) 또는 (b)의 어느 하나의 군에 포함되는 아미노산 잔기를 갖는 것을 의미한다. 「반대의 전하를 갖는」이란, 예를 들어, 2개 이상의 아미노산 잔기 중의 적어도 1개의 아미노산 잔기가, 상기 (a) 또는 (b)의 어느 하나의 군에 포함되는 아미노산 잔기를 갖는 경우에, 나머지의 아미노산 잔기가 상이한 군에 포함되는 아미노산 잔기를 갖는 것을 의미한다.
바람직한 태양에 있어서 상기 항체는, 제1 H쇄 CH3 영역과 제2 H쇄 CH3 영역이 다이설파이드 결합에 의해 가교되어 있어도 된다.
본 발명에 있어서 개변에 제공하는 아미노산 잔기로서는, 전술한 항체의 가변 영역 또는 항체의 정상 영역의 아미노산 잔기에 한정되지 않는다. 당업자이면, 폴리펩티드 변이체 또는 이종 다량체에 대해, 시판의 소프트웨어를 이용한 호몰로지 모델링 등에 의해, 계면을 형성하는 아미노산 잔기를 발견할 수 있고, 회합을 제어하도록, 해당 부위의 아미노산 잔기를 개변에 제공하는 것이 가능하다.
또한, 본 발명의 이중 특이성 항체의 회합화에는 추가로 다른 공지 기술을 이용할 수도 있다. 항체의 한쪽의 H쇄의 Fc 영역에 존재하는 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄(knob; 돌기)로 치환하고, 다른 한쪽의 H쇄의 상대하는 Fc 영역에 존재하는 아미노산 측쇄를 보다 작은 측쇄(hole; 공극)로 치환하는 것에 의해, 돌기가 공극 내에 배치될 수 있도록 함으로써, 효율적으로 Fc 영역을 갖는 상이한 아미노산을 갖는 폴리펩티드끼리의 회합화를 일으킬 수 있다(WO1996/027011, Ridgway JB et al., Protein Engineering (1996) 9, 617-621, Merchant AM et al. Nature Biotechnology (1998) 16, 677-681, US20130336973).
이것에 더하여, 본 발명의 이중 특이성 항체의 형성에는 추가로 다른 공지 기술을 이용할 수도 있다. 항체의 한쪽의 H쇄의 CH3의 일부를 그 부분에 대응하는 IgA 유래의 서열로 하고, 다른 한쪽의 H쇄의 CH3의 상보적인 부분에 그 부분에 대응하는 IgA 유래의 서열을 도입한 strand-exchange engineered domain CH3을 이용함으로써, 상이한 서열을 갖는 폴리펩티드의 회합화를 CH3의 상보적인 회합화에 의해 효율적으로 야기할 수 있다(Protein Engineering Design & Selection, 23; 195-202, 2010). 이 공지 기술을 사용해도 효율적으로 목적하는 이중 특이성 항체를 형성시킬 수 있다.
그 밖에도 이중 특이성 항체의 형성에는, WO2011/028952나 WO2014/018572나 Nat Biotechnol. 2014 Feb;32(2):191-8.에 기재된 항체의 CH1과 CL의 회합화, VH, VL의 회합화를 이용한 항체 제작 기술, WO2008/119353이나 WO2011/131746에 기재된 따로따로 조제한 모노클로날 항체끼리를 사용하여 이중 특이성 항체를 제작하는 기술(Fab Arm Exchange), WO2012/058768이나 WO2013/063702에 기재된 항체 중쇄의 CH3 사이의 회합을 제어하는 기술, WO2012/023053에 기재된 2종류의 경쇄와 1종류의 중쇄로 구성되는 이중 특이성 항체를 제작하는 기술, Christoph 등(Nature Biotechnology Vol. 31, p 753-758 (2013))에 기재된 1개의 H쇄와 1개의 L쇄로 이루어지는 항체의 편쇄를 각각 발현하는 2개의 박테리아 세포주를 이용한 이중 특이성 항체를 제작하는 기술 등을 이용할 수도 있다.
또한, 효율적으로 목적하는 이중 특이성 항체를 형성시킬 수가 없는 경우여도, 산생된 항체 중에서 목적하는 이중 특이성 항체를 분리, 정제하는 것에 의해서도, 본 발명의 이중 특이성 항체를 얻는 것이 가능하다. 예를 들어, 2종류의 H쇄의 가변 영역에 아미노산 치환을 도입하여 등전점(pI)의 차이를 부여함으로써, 2종류의 호모체와 목적하는 헤테로 항체를 이온 교환 크로마토그래피로 정제 가능하게 하는 방법이 보고되어 있다(WO2007114325). 또한, 헤테로체를 정제하는 방법으로서, 지금까지, 프로틴 A에 결합하는 마우스 IgG2a의 H쇄와 프로틴 A에 결합하지 않는 래트 IgG2b의 H쇄로 이루어지는 헤테로2량화 항체를 프로틴 A를 이용하여 정제하는 방법이 보고되어 있다(WO98050431, WO95033844). 더욱이, IgG와 Protein A의 결합 부위인 EU 넘버링 435번째 및 436번째의 아미노산 잔기를, Tyr, His 등의 Protein A에의 결합력이 상이한 아미노산으로 치환한 H쇄를 이용하거나, 혹은, 참고 실시예 5에 기재된 방법에 따라 취득된 Protein A에의 결합력이 상이한 H쇄를 이용함으로써, 각 H쇄와 Protein A의 상호작용을 변화시켜, Protein A 칼럼을 이용함으로써, 헤테로2량화 항체만을 효율적으로 정제할 수도 있다.
또한, 상이한 복수의 H쇄에 결합능을 줄 수 있는 공통의 L쇄를 취득하여, 이중 특이성 항체의 공통 L쇄로서 이용해도 된다. 이와 같은 공통 L쇄와 상이한 복수의 H쇄 유전자를 세포에 도입하는 것에 의해 IgG를 발현시킴으로써 효율이 좋은 이중 특이성 IgG의 발현이 가능해진다(Nature Biotechnology (1998) 16, 677-681). 공통 H쇄를 선택할 때에, 임의의 상이한 H쇄에 대응하여 높은 결합능을 나타내는 공통 L쇄를 선택하는 방법도 이용할 수 있다(WO2004/065611).
또한, 본 발명의 Fc 영역으로서, Fc 영역의 C말단의 헤테로제니티가 개선된 Fc 영역이 적절히 사용될 수 있다. 보다 구체적으로는, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4를 기원으로 하는 Fc 영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 446위의 글리신, 및 447위의 리신이 결실된 Fc 영역이 제공된다.
이들 기술을 복수, 예를 들어 2개 이상 조합하여 이용할 수도 있다. 또한, 이들 기술은, 회합시키고자 하는 2개의 H쇄에 적절히 따로따로 적용시킬 수도 있다. 더욱이, 이들 기술은, 전술한 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 저하되어 있는 Fc 영역에 조합하여 이용할 수도 있다. 한편, 본 발명의 항원 결합 분자는, 상기 개변이 가해진 것을 베이스로 하여, 동일한 아미노산 서열을 갖는 항원 결합 분자를 별도 제작한 것이어도 된다.
본 발명에 있어서 「기능적으로 동등」한 항체 가변 영역이란, 전술한 조건을 만족시키는 항체 H쇄 가변 영역 및/또는 항체 L쇄 가변 영역이면 특별히 한정되지 않는다. 그와 같은 항체 가변 영역으로서, 예를 들어, 전술한 표 1∼3에 기재된 가변 영역의 아미노산 서열에 1 또는 복수의 아미노산(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5 또는 10아미노산)이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입되어 있어도 된다. 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입되기 위한, 당업자에게 잘 알려진 방법으로서는, 단백질에 변이를 도입하는 방법이 알려져 있다. 예를 들어, 당업자이면, 부위 특이적 변이 유발법(Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, and Nakagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275, Zoller, MJ, and Smith, M. (1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors. Methods Enzymol. 100, 468-500, Kramer, W, Drutsa, V, Jansen, HW, Kramer, B, Pflugfelder, M, and Fritz, HJ(1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456, Kramer W, and Fritz HJ(1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350-367, Kunkel, TA(1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 488-492) 등을 이용하여 아미노산 서열에 적절히 변이를 도입하는 것에 의해, 전술한 기능을 갖는 항체 가변 영역과 기능적으로 동등한 가변 영역을 조제할 수 있다.
아미노산 잔기를 개변하는 경우에는, 아미노산 측쇄의 성질이 보존되어 있는 다른 아미노산으로 변이되는 것이 바람직하다. 예를 들어 아미노산 측쇄의 성질로서는, 소수성 아미노산(A, I, L, M, F, P, W, Y, V), 친수성 아미노산(R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), 지방족 측쇄를 갖는 아미노산(G, A, V, L, I, P), 수산기 함유 측쇄를 갖는 아미노산(S, T, Y), 황 원자 함유 측쇄를 갖는 아미노산(C, M), 카복실산 및 아마이드 함유 측쇄를 갖는 아미노산(D, N, E, Q), 염기 함유 측쇄를 갖는 아미노산(R, K, H), 및, 방향족 함유 측쇄를 갖는 아미노산(H, F, Y, W)을 들 수 있다(괄호 내는 모두 아미노산의 1문자 표기를 나타낸다). 이들 각 그룹 내의 아미노산의 치환을 보존적 치환이라 칭한다. 어느 아미노산 서열에 대한 1 또는 복수개의 아미노산 잔기의 결실, 부가 및/또는 다른 아미노산에 의한 치환에 의해 수식된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 그 생물학적 활성을 유지하는 것은 벌써 알려져 있다(Mark, D. F. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1984)81:5662-6; Zoller, M. J. and Smith, M., Nucleic Acids Res. (1982)10:6487-500; Wang, A. et al., Science(1984)224:1431-3; Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1982)79:6409-13). 이와 같은 아미노산 개변을 포함하는 본 발명의 가변 영역은, 개변 전의 가변 영역의 CDR 서열, FR 서열 또는 가변 영역 전체의 아미노산 서열과 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 그리고, 가장 바람직하게는 적어도 95%의 아미노산 서열의 동일성을 갖는다. 본 명세서에 있어서 서열의 동일성은, 서열 동일성이 최대가 되도록 필요에 따라서 서열을 정렬화하고, 적절히 갭을 도입한 후, 기본이 된 H쇄 가변 영역 또는 L쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 잔기와 동일한 잔기의 비율로서 정의된다. 아미노산 서열의 동일성은, 후술하는 방법에 의해 결정할 수 있다.
또한, 「기능적으로 동등한 항체 가변 영역」에는, 예를 들어, 전술한 표 1∼3에 기재된 가변 영역의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열로 이루어지는 핵산에 스트린전트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 핵산으로부터 얻는 것도 가능하다. 가변 영역의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열로 이루어지는 핵산에 스트린전트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 핵산을 단리하기 위한, 스트린전트한 하이브리다이제이션 조건으로서는, 6M 요소, 0.4% SDS, 0.5xSSC, 37℃의 조건 또는 이것과 동등한 스트린전시의 하이브리다이제이션 조건을 예시할 수 있다. 보다 스트린젠시가 높은 조건, 예를 들어, 6M 요소, 0.4% SDS, 0.1xSSC, 42℃의 조건을 이용하면, 보다 상동성의 높은 핵산의 단리를 기대할 수 있다. 하이브리다이제이션 후의 세정 조건은, 예를 들어 0.5xSSC(1xSSC는 0.15M NaCL, 0.015M 시트르산 나트륨, pH7.0), 및 0.1% SDS, 60℃에 있어서의 세정, 보다 바람직하게는 0.2xSSC, 및 0.1% SDS, 60℃에 있어서의 세정, 보다 바람직하게는 0.2xSSC, 및 0.1% SDS, 62℃에 있어서의 세정, 보다 바람직하게는 0.2xSSC, 및 0.1% SDS, 65℃에 있어서의 세정, 보다 바람직하게는 0.1xSSC, 및 0.1% SDS, 65℃에 있어서의 세정이다. 단리한 핵산의 서열의 결정은, 후술하는 공지된 방법에 의해 행하는 것이 가능하다. 단리된 핵산의 상동성은, 염기 서열 전체로, 적어도 50% 이상, 더 바람직하게는 70% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상)의 서열의 동일성을 갖는다.
상기 하이브리다이제이션 기술을 이용하는 방법 대신에, 가변 영역의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열 정보를 기초로 합성한 프라이머를 이용하는 유전자 증폭법, 예를 들어, 폴리메라제 연쇄 반응(PCR)법을 이용하여, 가변 영역의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열로 이루어지는 핵산과 스트린전트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 핵산을 단리하는 것도 가능하다.
염기 서열 및 아미노산 서열의 동일성은, Karlin and Altschul에 의한 알고리즘 BLAST(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90:5873-7)에 의해 결정할 수 있다. 이 알고리즘에 기초하여, BLASTN이나 BLASTX로 불리는 프로그램이 개발되고 있다(Altschul et al., J.Mol.Biol. (1990)215:403-10). BLAST에 기초하여 BLASTN에 의해 염기 서열을 해석하는 경우에는, 파라미터는 예를 들어 score=100, wordlength=12로 한다. 또한, BLAST에 기초하여 BLASTX에 의해 아미노산 서열을 해석하는 경우에는, 파라미터는 예를 들어 score=50, wordlength=3으로 한다. BLAST와 Gapped BLAST 프로그램을 이용하는 경우에는, 각 프로그램의 디폴트 파라미터를 이용한다. 이들 해석 방법의 구체적인 수법은 공지이다(NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)의 웹 사이트를 참조; http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
본 발명의 이중 특이성 항체에 포함되는 Fc 영역은, Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 저하되어 있는 Fc 영역인 한 특별히 제한되지 않지만, 본 발명의 바람직한 Fc 영역으로서는, 예를 들어, WO2016/047722A1에 기재된 E22Hh의 Fc 영역 부분과 E22Hk의 Fc 영역 부분의 조합, E2702GsKsc의 Fc 영역 부분과 E2704sEpsc의 Fc 영역 부분의 조합, E2702sKsc의 Fc 영역 부분과 E2704sEpsc의 Fc 영역 부분의 조합을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 항원 결합 분자를 코딩하는 유전자를 유전자 치료용 벡터에 조합하여, 유전자 치료를 행하는 것도 생각된다. 투여 방법으로서는, naked 플라스미드에 의한 직접 투여 외에, 리포솜 등에 패키징하거나, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 백시니어 바이러스 벡터, 폭스 바이러스 벡터, 아데노바이러스 관련 벡터, HVJ 벡터 등의 각종 바이러스 벡터로서 형성하거나(Adolph 「바이러스 게놈법」, CRC Press, Florid (1996) 참조), 또는, 콜로이드 금 입자 등의 비즈 담체에 피복(WO93/17706 등)하여 투여할 수 있다. 또한, 본 발명의 항원 결합 분자를 코딩하는 핵산은 직접 생체에 투여해도 되고, 또한 일렉트로포레이션법에 의해 직접 생체에 투여해도 된다. 예를 들어, 본 발명의 항원 결합 분자를 코딩하는 mRNA에 생체 내에서의 mRNA의 안정성을 높이기 위한 화학 수식을 실시하고, 당해 mRNA를 인간에 직접 투여하여, 생체 내에서 본 발명의 항원 결합 분자를 발현시키는 방법에 의해 본 발명의 항원 결합 분자를 투여할 수 있다(EP2101823B, WO2013/120629 참조). 그렇지만, 생체 내에 있어서 항원 결합 분자가 발현되어, 그 작용을 발휘할 수 있는 한 어떠한 방법에 의해 투여해도 된다. 바람직하게는, 적당한 비경구 경로(정맥내, 복강내, 피하, 피내, 지방 조직내, 유선 조직내, 흡입 또는 근육내의 경로를 개재시켜 주사, 주입, 또는 가스 유도성 입자 충격법(전자총 등에 의한다), 점비약 등 점막 경로를 개재시키는 방법 등)에 의해 충분한 양이 투여된다. ex vivo에 있어서 리포솜 트랜스펙션, 입자 충격법(미국 특허 제4,945,050호), 또는 바이러스 감염을 이용하여 혈액 세포 및 골수 유래 세포 등에 투여하고, 해당 세포를 동물에 재도입하는 것에 의해 본 발명의 항원 결합 분자를 코딩하는 유전자를 투여해도 된다.
본 명세서에서 이용되는 「치료」(및, 그 문법상의 파생어, 예를 들어 「치료하는」, 「치료하는 것」 등)는, 치료되는 개체의 자연 경과를 개변하는 것을 기도한 임상적 개재를 의미하고, 예방을 위해서도, 임상적 병태의 경과 동안에도 실시될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는, 그것만으로 한정되는 것은 아니지만, 질환의 발생 또는 재발의 방지, 증상의 경감, 질환에 의한 임의의 직접적 또는 간접적인 병리적 영향의 감약, 전이의 방지, 질환의 진행 속도의 저감, 질환 상태의 회복 또는 완화, 및 관해 또는 개선된 예후를 포함한다. 몇몇 실시태양에 있어서, 본 발명의 의약 조성물은, 질환의 발증을 늦추거나, 또는 질환의 진행을 느리게 하기 위해서 이용된다.
본 발명에 있어서 의약 조성물이란, 통상, 질환의 치료 혹은 예방, 혹은 검사·진단을 위한 약제를 말한다. 본 발명에 있어서, 의약 조성물을 다른 성분의 투여와 조합하여 이용하는 경우, 의약 조성물은, 다른 성분의 투여와 동시에, 따로따로, 또는 연속하여 투여할 수 있다. 본 발명의 의약 조성물은, 다른 성분을 성분으로서 포함하고 있어도 된다.
본 발명의 항원 결합 분자를 포함하는 의약 조성물은, 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 제제화될 수 있다. 예를 들어, 물 혹은 그 이외의 약학적으로 허용할 수 있는 액과의 무균성 용액, 또는 현탁액제의 주사제의 형태로 비경구적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 약리학상 허용되는 담체 혹은 매체, 구체적으로는, 멸균수나 생리 식염수, 식물유, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 향미제, 부형제, 비히클, 방부제, 결합제 등과 적절히 조합하여, 일반적으로 인정된 제약 실시에 요구되는 단위 용량 형태로 혼화하는 것에 의해 제제화될 수 있다. 이들 제제에 있어서의 유효 성분량은, 지시된 범위의 적당한 용량이 얻어지도록 설정된다.
주사를 위한 무균 조성물은 주사용 증류수와 같은 비히클을 이용하여 통상의 제제 실시에 따라 처방될 수 있다. 주사용의 수용액으로서는, 예를 들어 생리 식염수, 포도당이나 그 외의 보조약(예를 들어 D-소르비톨, D-만노스, D-만니톨, 염화 나트륨)을 포함하는 등장 용액을 들 수 있다. 적절한 용해 보조제, 예를 들어 알코올(에탄올 등), 폴리알코올(프로필렌 글라이콜, 폴리에틸렌 글라이콜 등), 비이온성 계면활성제(폴리소르베이트 80(TM), HCO-50 등)가 병용될 수 있다.
유성액으로서는 참기름, 대두유를 들 수 있고, 용해 보조제로서 벤조산 벤질 및/또는 벤질 알코올도 병용될 수 있다. 또한, 완충제(예를 들어, 인산염 완충액 및 아세트산 나트륨 완충액), 무통화제(예를 들어, 염산 프로카인), 안정제(예를 들어, 벤질 알코올 및 페놀), 산화 방지제와 배합될 수 있다. 조제된 주사액은 통상, 적절한 앰풀에 충전된다.
본 발명의 항원 결합 분자를 포함하는 의약 조성물은, 바람직하게는 비경구 투여에 의해 투여된다. 예를 들어, 주사 제형, 경비 투여 제형, 경폐 투여 제형, 경피 투여형의 조성물이 투여된다. 예를 들어, 정맥내 주사, 동맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 골수내 주사, 관절내 주사, 활액낭내 주사, 두엽내 주사, 골수강내 주사, 지주막하 주사, 피내 주사, 피하 주사, 심장내 주사, 종양 등의 병변내 주사나, 카테터를 이용하는 방법 등에 의해 전신 또는 국부적으로 투여될 수 있다.
투여 방법은, 환자의 연령, 증상에 따라 적절히 선택될 수 있다. 본 발명의 의약 조성물의 투여량은, 예를 들어, 1회에 대해 체중 1kg당 0.0001mg 내지 1000mg의 범위로 설정될 수 있다. 또는, 예를 들어, 환자당 0.001∼100000mg의 투여량이 설정될 수 있지만, 본 발명은 이들 수치로 반드시 제한되는 것은 아니다. 투여량 및 투여 방법은, 환자의 체중, 연령, 증상 등에 따라 변동하지만, 당업자이면 그들 조건을 고려하여 적당한 투여량 및 투여 방법을 설정하는 것이 가능하다.
본 발명의 필요에 따른 본 발명의 의약 조성물은 마이크로캡슐(하이드록시메틸셀룰로스, 젤라틴, 폴리［메틸메타크릴산］ 등의 마이크로캡슐)에 봉입되어, 콜로이드 드러그 딜리버리 시스템(리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀션, 나노입자 및 나노캡슐 등)이 될 수 있다(Remington＇s Pharmaceutical Science 16 th edition, Oslo Ed. (1980) 등 참조). 더욱이, 약제를 서방성의 약제로 하는 방법도 공지이며, 당해 방법은 본 발명의 이중 특이성 항원 결합 분자에 적용될 수 있다(J.Biomed.Mater.Res. (1981) 15, 267-277, Chemtech. (1982) 12, 98-105, 미국 특허 제3773719호, 유럽 특허 공개 공보 EP58481호·EP133988호, Biopolymers (1983) 22, 547-556).
용어 「키메라 수용체」는, 적어도, 세포외 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 시그널 전달 도메인을 포함하는, 면역 이펙터 세포에 발현했을 때, 표적 세포, 예를 들어 암 세포에 대한 특이성 및 세포내 시그널 산생을 시키는, 재조합 폴리펩티드를 가리킨다.
키메라 수용체의 세포외 도메인은, 소정의 분자와 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 단백질성 분자 또는 그 일부를 의미한다. 본 발명에서는, 키메라 수용체의 세포외 도메인은 면역 수용체의 세포외 도메인 또는 그 개변체의 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. 본 발명의 하나의 태양에 있어서, 키메라 수용체의 세포외 도메인은, 면역 수용체의 세포외 도메인 또는 그 개변체의 서열만으로 이루어지는 폴리펩티드여도 되고, 면역 수용체의 세포외 도메인 또는 그 개변체의 서열에 추가의 폴리펩티드 또는 아미노산 잔기를 포함하고 있어도 된다. 본 발명의 다른 태양에 있어서, 키메라 수용체의 세포외 도메인은, 면역 수용체의 세포외 도메인 또는 그 개변체의 단편의 서열을 포함하고 있어도 된다.
본 발명에 있어서의 면역 수용체의 세포외 도메인은, 내인성 면역 리간드와 결합할 수 있는 면역 수용체의 세포외 부분을 말한다. 예를 들어 CD137에 있어서는 서열 번호 129, 서열 번호 130, 서열 번호 131이나 서열 번호 132를 가리킨다.
본 발명에 있어서, 면역 수용체의 세포외 도메인 개변체란, 면역 수용체의 세포외 도메인 중 일부를 부가, 결실, 치환시킨 폴리펩티드를 의미한다. 면역 수용체의 세포외 도메인 개변체는, 바람직하게는 내인성 면역 리간드와의 결합을 감약시킨 것이며, 예를 들어 문헌에 기재된 X선 결정 구조 해석에 의해 특정되는 면역 수용체와 그 내재성 리간드의 결합 부위에 기초하여, 해당 면역 수용체의 세포외 도메인의 내재성 리간드와의 결합 부위를 개변한 것을 말한다. 예를 들어 내인성 면역 리간드와의 결합을 감약시킨 면역 수용체의 세포외 도메인 개변체의 예로서는, CD137의 면역 수용체의 세포외 도메인 중 시스테인 리치 도메인 3, 시스테인 리치 도메인 4, 및 막관통 영역에 접속하는 스토크(Genbank NM001561.6, Cys88∼Gln186)를 결실시킨 세포외 도메인 개변체를 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 면역 수용체의 세포외 도메인의 단편이란, 면역 수용체의 세포외 도메인을 구성하는 폴리펩티드의 단편이면 되고, 항원 결합 분자가 인식 가능하면, 구성하는 아미노산의 수 등은 특별히 제한되지 않는다. 당해 단편의 예로서는, 면역 수용체에 아고니스트 활성을 갖는 항체가 인식하는 에피토프를 구성하는 폴리펩티드 또는 그의 단편을 들 수 있다. 본 발명에 있어서, 키메라 수용체의 세포외 도메인이, 당해 에피토프의 개변체를 포함하고 있어도 되고, 당해 에피토프가 포함하는 면역 수용체의 세포외 도메인을 구성하는 폴리펩티드의 단편도, 「면역 수용체의 세포외 도메인의 단편」에 해당한다.
용어 「막관통 도메인」은, 해당 세포외 도메인과 해당 세포내 시그널 전달 도메인의 사이에 위치하여, 세포막을 관통하는 기능을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
용어 「세포내 시그널 전달 도메인」은, 세포 내에서의 생물학적 프로세스의 활성화 또는 저해, 예를 들어, T 세포 혹은 NK 세포 등의 면역 세포의 활성화를 야기하는 시그널을 전달하는 작용을 함이 알려진 임의의 올리고펩티드 도메인 또는 폴리펩티드 도메인을 의미하고, 후술하는, 적어도 1개의 T 세포의 자극 분자 유래의 「자극 분자 시그널 전달 도메인」을 포함하고, 추가로 후술하는, 적어도 1개의 T 세포의 공자극 분자 유래의 「공자극 분자 시그널 전달 도메인」을 포함해도 된다.
본 개시에서 사용하는 경우, 「도메인」은, 예를 들어, 다른 영역과는 독립적으로 특정의 구조로 절첩되고, 및/또는 특정의 기능을 갖는, 폴리펩티드의 일 영역을 의미한다. 도메인은, 예를 들어, 분자의 세포질 부분 또는 그 일부일 수 있다. 본 개시에서 사용하는 경우, 분자의 「세포질 도메인」은, 전장 세포질 도메인, 또는 활성화되었을 때에 세포내 시그널을 전달하는 그 일부를 의미한다.
일 실시태양에 있어서, 키메라 수용체는, 이하로 정의되는 도메인을 포함하는 분자이다.
일 실시태양에 있어서, 키메라 수용체는, 세포외 도메인과, 세포외 힌지 도메인과, 막관통 도메인과, 자극 분자 유래의 자극 분자 시그널 전달 도메인을 포함하는 세포내 시그널 전달 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 포함한다.
일 실시태양에 있어서, 키메라 수용체는, 세포외 도메인과, 세포외 힌지 도메인과, 막관통 도메인과, 공자극 분자 유래의 공자극 분자 시그널 전달 도메인 및 자극 분자 유래의 기능적인 시그널 전달 도메인을 포함하는 세포내 시그널 전달 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 포함한다.
일 실시태양에 있어서, 키메라 수용체는, 세포외 도메인과, 막관통 도메인과, 1개 또는 복수의 공자극 분자 유래의 2개의 기능적인 시그널 전달 도메인 및 자극 분자 유래의 기능적인 시그널 전달 도메인을 포함하는 세포내 시그널 전달 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 포함한다.
일 실시태양에 있어서, 키메라 수용체는, 세포외 도메인과, 막관통 도메인과, 1개 또는 복수의 공자극 분자 유래의 적어도 2개의 공자극 분자 시그널 전달 도메인, 자극 분자 유래의 자극 분자 시그널 전달 도메인, 및 그 외의 기능성 도메인 및/또는 모티프를 포함하는 세포내 시그널 전달 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 포함한다.
일 실시태양에 있어서, i) 항원 결합 분자의 면역 수용체 인식 부위에 결합할 수 있는 세포외 도메인, ii) 막관통 도메인, 및 iii) 세포질 공자극 도메인 및/또는 인터류킨 수용체쇄의 세포질 도메인으로부터 선택되는 1 이상의 세포내 시그널 전달 도메인과 외인성 STAT3 관련 모티프를 포함하여 이루어지는 CD3제타 세포내 시그널 전달 도메인을 포함하여 이루어지는 세포내 세그먼트(여기에서, 상기 세포내 세그먼트는, 내인성의 또는 외인성 JAK 결합 모티프 및 STAT5 관련 모티프를 포함하여 이루어진다)를 포함하여 이루어지는 키메라 수용체가 개시된다. 어느 실시태양에서는, 이들 도메인은, 경우에 따라, N말단으로부터 시작하여 이상의 순서로, 직접적 또는 간접적으로 융합된다. 어느 실시태양에서는, 세포내 세그먼트 내의 이들 도메인은, 반대의 순서로 융합된다.
일 실시태양에 있어서, 해당 세포외 도메인과 해당 세포내 시그널 전달 도메인 사이에 세포외 힌지 도메인 및 막관통 도메인을 포함해도 된다. 용어 「세포외 힌지 도메인」은, 세포외 도메인과 막관통 도메인을 연결하는 도메인을 의미한다. 세포외 힌지 도메인은, 세포외 도메인과 막관통 도메인을 연결할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 천연 단백질에서 유래하는 것이어도 되고, 인위적으로 설계된 것이어도 된다. 세포외 힌지 도메인은, 예를 들어, 10∼300개 정도의 아미노산, 바람직하게는 20∼100개 정도의 아미노산으로 구성할 수 있다. 세포외 힌지 도메인은, 세포외 도메인의 본 개시의 항원 결합 분자와의 결합능을 방해하지 않고, 또한 세포내 시그널 전달 도메인을 개재시킨 시그널 전달을 방해하지 않는 것인 것이 바람직하다. 용어 「막관통 도메인」은, 해당 세포외 도메인과 해당 세포내 시그널 전달 도메인 사이에 위치하고, 세포막을 관통하는 기능을 갖는 폴리펩티드이면 특별히 한정되지 않는다. 막관통 도메인은, 천연 단백질에서 유래하는 것이어도 되고, 인위적으로 설계한 것이어도 된다. 천연 단백질에서 유래하는 막관통 도메인은, 임의의 막결합 단백질 또는 막관통 단백질로부터 취득할 수 있다.
일 실시태양에 있어서, 키메라 수용체는, 키메라 수용체 융합 단백질의 아미노 말단(N-말단)에 부가적인 리더 서열을 포함한다.
일 실시태양에 있어서, 키메라 수용체는 추가로, 세포외 도메인의 N-말단에 리더 서열을 포함하고, 여기에서, 해당 리더 서열은, 세포 프로세싱 및 키메라 수용체의 세포막에의 국재화 동안에 세포외 도메인으로부터 절단되어 있어도 된다.
용어 「면역 수용체」는, 면역 세포 상에 발현하는 수용체이며, 면역 세포의 활성화 또는 억제에 관여하는 수용체를 의미한다. 면역 세포의 예로서는, T 세포, 수상 세포, B 세포, 조혈 줄기세포, 매크로파지, 단구, NK 세포 또는 조혈 세포(호중구, 호염기구) 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서 키메라 수용체는 세포외 도메인으로서, 면역 수용체의 세포외 도메인 또는 그 개변체를 갖는다. 여기에서 면역 수용체는, 면역 세포의 활성화에 관여하는 수용체가 바람직하고, 예를 들어, 종양괴사 인자 리셉터 슈퍼패밀리(TNFRSF)에 속하는 공자극 분자, 구체적으로는, CD137, CD40, OX40, RANK, GITR 등을 들 수 있다. 또한 면역 수용체는, 자극 분자 또는 공자극 분자여도 되고, 그 구체예에 대해서는 후술하는 바와 같다.
본 발명에 있어서의 항원 결합 분자의 면역 수용체 인식 부위는, 키메라 수용체의 세포외 결합 도메인에 포함되는 면역 수용체의 세포외 도메인 또는 그의 단편을 인식할 수 있다. 보다 바람직하게는, 항원 결합 분자의 면역 수용체 인식 부위는, 내재성 리간드의 결합 부위와는 상이한 부분을 인식한다. 면역 수용체 상의 내재성 리간드 결합 부위는, 예를 들어 문헌에 기재된 구조 생물학적인 해석에 의해 특정된다. 예를 들어 CD137에 있어서는, CD137L과의 복합체의 X선 결정 구조가 분명해져 있고(Chin SM et al (2018) Nat Commun. 9, 4679), CRD1 상의 F36, CRD2 상의 P49, S52, Q59, T61, C62, D63, I64, Q67, K69, V71, F72, 및 CRD3 상의 S100, M101, C102가 CD137L과의 상호작용에 관여하고 있음이 보고되어 있다. 이 중, I64 혹은 V71을 Arg로 변이시킨 변이체가 제작되고 있고, 모두 CD137L과의 결합이 감약되는 것이 나타나 있다. CD137L과의 상호작용에 관여하는 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 변이시킨 변이체는, CD137L과의 결합을 감약시킨 세포외 도메인 개변체로서 사용할 수 있다.
하나의 태양에 있어서, 키메라 수용체의 세포외 도메인은, TNFRSF에 속하는 공자극 분자의 세포외 도메인 또는 그의 단편을 포함하고, 항원 결합 분자의 면역 수용체 인식 부위는, TNFRSF에 속하는 공자극 분자에 대한 아고니스트 항체(이하, TNFRSF의 아고니스트 항체라고 칭한다) 또는 그 항원 결합 단편을 이용할 수 있다. 여러 가지 구체예에 있어서, 본 발명의 의약 조성물로서 사용하는 항원 결합 분자는, 해당 키메라 수용체 발현 세포의 활성을, 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 750%, 1000% 또는 그 이상 활성화시킬 수 있다.
본 발명의 하나의 태양에 있어서, 키메라 수용체의 세포외 도메인은, TNFRSF의 아고니스트 항체의 표적 분자 또는 그의 단편을 포함한다. TNFRSF의 아고니스트 항체의 표적 분자로서는, TNF 수용체 슈퍼패밀리를 발현하는 세포(예를 들어, T 세포나 NK 세포 등)를 활성화하는 인자인 한 특별히 제한되지 않는다. 바람직한 인자로서는, 예를 들어 CD137, CD40을 들 수 있다. 더 바람직한 인자로서는, 예를 들어 CD137을 들 수 있다. 예를 들어, CD137 아고니스트 항체의 예로서는, Urelumab(CAS 등록 번호: 934823-49-1)나 여러 가지 공지된 CD137 아고니스트 항체를 들 수 있다.
본 발명의 하나의 태양에 있어서, 키메라 수용체의 세포외 도메인은, 면역 수용체에 대해서 아고니스트 활성을 갖는 항체의 에피토프를 면역 수용체의 단편으로서 포함한다. 면역 수용체의 예로서는 전술한 바와 같으며, 바람직하게는 CD137을 들 수 있다.
본 발명의 하나의 태양에 있어서, 키메라 수용체의 세포외 도메인은, CD137 아고니스트 항체의 표적 분자 또는 그의 단편을 포함한다. CD137 아고니스트 항체의 예로서, 예를 들어 WO2015/156268에 기재된 서열 번호 등으로 나타나는 이하의 항체가 들어질 수 있다:
[1] 중쇄 가변 영역으로서 서열 번호 66에 기재된 아미노산 서열, 및 경쇄 가변 영역으로서 서열 번호 85에 기재된 아미노산 서열을 갖는 항체;
[2] 중쇄 가변 영역으로서 서열 번호 67에 기재된 아미노산 서열, 및 경쇄 가변 영역으로서 서열 번호 86에 기재된 아미노산 서열을 갖는 항체;
[3] 중쇄 가변 영역으로서 서열 번호 70에 기재된 아미노산 서열, 및 경쇄 가변 영역으로서 서열 번호 89에 기재된 아미노산 서열을 갖는 항체;
[4] 중쇄 가변 영역으로서 서열 번호 76에 기재된 아미노산 서열, 및 경쇄 가변 영역으로서 서열 번호 95에 기재된 아미노산 서열을 갖는 항체;
[5] 중쇄 가변 영역으로서 서열 번호 77에 기재된 아미노산 서열, 및 경쇄 가변 영역으로서 서열 번호 96에 기재된 아미노산 서열을 갖는 항체;
[6] 중쇄 가변 영역으로서 서열 번호 78에 기재된 아미노산 서열, 및 경쇄 가변 영역으로서 서열 번호 97에 기재된 아미노산 서열을 갖는 항체;
[7] [1]∼[6] 중 어느 하나에 기재된 항체로서, 중쇄 정상 영역으로서 서열 번호 99에 기재된 아미노산 서열, 및 경쇄 정상 영역으로서 서열 번호 59에 기재된 아미노산 서열 또는 서열 번호 60에 기재된 아미노산 서열을 갖는 항체;
[8] [1]∼[7] 중 어느 하나에 기재된 항체와 동등한 활성을 갖는 항체;
[9] [1]∼[7] 중 어느 하나에 기재된 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체.
상기 [8]에 기재된 항체에 있어서, 「동등한 활성」이란, CD137에의 아고니스트 활성이 상기 [1]∼[7] 중 어느 하나에 기재된 항체의 결합 활성의 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상인 것을 말한다.
상기 [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 기재된 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체의 바람직한 예로서, 예를 들어, CD137 단백질 중의 SPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGC의 서열을 갖는 영역을 인식하는 항체를 들 수 있다. 또한, CD137 단백질 중의 DCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGC의 서열을 갖는 영역을 인식하는 항체를 들 수 있다.
일 실시태양에 있어서, 세포외 힌지 도메인으로서는, 예를 들어, CD8알파, CD8베타, CD28, CD4, NKp30, NKp44, NKp46의 세포외 힌지 도메인 등을 들 수 있다. 또한, 면역글로불린(예를 들어, IgG4 등)의 힌지 영역을 사용해도 된다.
일 실시태양에 있어서, 막관통 도메인이 유래하는 단백질로서는, 예를 들어, T 세포 수용체의 알파쇄 및 베타쇄, CD3제타, CD28, CD3입실론, CD45, CD4, CD5, CD8알파, CD8베타, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, ICOS, CD154, GITR, NKp30, NKp44, NKp46 등을 들 수 있다. 일 실시태양에 있어서, 막관통 도메인이 유래하는 단백질은, CD8알파 또는 CD28이다.
용어 「시그널 전달 도메인」은, 제2 메신저를 생성하거나, 또는 이와 같은 메신저에 응답하여 이펙터로서 기능화하거나 하는 것에 의해 규정의 시그널 전달 경로를 개재시켜 세포 활성을 조절하기 위해서, 세포 내의 정보를 전하는 것에 의해 작용하는 단백질의 기능적인 부분을 가리킨다.
「세포내 시그널 전달 도메인」은, 이 용어가 본 개시에 있어서 사용되는 경우, 분자의 세포내 부분을 가리킨다. 세포내 시그널 전달 도메인은, 키메라 수용체를 함유하는 세포, 예를 들어 키메라 수용체 발현 T 세포의 면역 이펙터 기능을 촉진하는 시그널을 생성할 수 있다. 예를 들어 키메라 수용체 발현 T 세포에 있어서의, 면역 이펙터 기능의 예로서는, 세포 용해 활성 및 헬퍼 활성, 예를 들어 사이토카인 분비 등을 들 수 있다. 실시태양에 있어서, 세포내 시그널 전달 도메인은, 이펙터 기능 시그널을 전달하여, 세포에 특수화한 기능을 실행시키는, 단백질의 부분이다. 세포내 시그널 전달 도메인 전체가 채용되는 경우도 있지만, 많은 경우에 있어서 쇄 전체를 사용하는 것은 반드시 필요하지는 않다. 세포내 시그널 전달 도메인의 트렁케이트(truncate)된 부분이 사용되는 한에 있어서, 이와 같은 트렁케이트된 부분은, 그것이 이펙터 기능 시그널을 전달하기만 하면 무상(無傷)의 쇄 대신에 사용할 수 있다. 따라서 세포내 시그널 전달 도메인이라고 하는 용어는, 이펙터 기능 시그널을 전달하는 데 충분한 세포내 시그널 전달 도메인의 모든 트렁케이트된 부분을 포함하는 것을 의미한다.
어느 실시태양에 있어서, 세포내 시그널 전달 도메인은, 1차 세포내 시그널 전달 도메인을 포함하고 있어도 된다. 전형적인 1차 세포내 시그널 전달 도메인으로서는, 1차 자극, 또는 항원 의존성 자극(antigen dependent simulation)에 관여하는 분자 유래의 것을 들 수 있다. 어느 실시태양에 있어서, 세포내 시그널 전달 도메인은, 공자극 세포내 도메인을 포함하고 있어도 된다. 전형적인 공자극 세포내 시그널 전달 도메인으로서는, 공자극 시그널, 또는 항원 비의존성 자극에 관여하는 분자 유래의 것을 들 수 있다. 예를 들어, 키메라 수용체 발현 T 세포의 경우에 있어서, 1차 세포내 시그널 전달 도메인은, T 세포 수용체의 세포질내 서열을 포함하고 있어도 되고, 공자극 세포내 시그널 전달 도메인은, 보조 수용체 또는 공자극 분자로부터의 세포질내 서열을 포함하고 있어도 된다.
용어 「CD3제타」는, 본 개시에서 사용하는 경우, 모든 포유동물종, 바람직하게는, 인간의 분화 항원군 3(CD3) T 세포 공수용체를 의미한다. 포유동물에서는, CD3은, CD3제타쇄, CD3델타쇄 및 2개의 CD3입실론쇄를 포함하여 이루어진다. CD3제타쇄(예를 들어, NCBI RefSeq: NP＿932170.1)는, 키메라 수용체를 조작하기 위해서 사용 가능한 세포내 시그널 전달 도메인을 포함하여 이루어진다. 본 개시의 특정의 키메라 수용체에 있어서, CD3-제타의 1차 시그널 전달 서열은, Genbank NM000734.3의 세포질 영역 서열(뉴클레오티드 서열 299∼634) 전장, 혹은 일부이거나, 또는 비인간종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 및 동종의 것으로부터의 등가의 잔기이다.
일 실시태양에 있어서, 세포내 시그널 전달 도메인은 인터류킨 수용체쇄의 세포질 도메인을 포함해도 된다. 일 실시태양에 있어서, 세포내 시그널 전달 도메인은 CD28, 4-1BB, ICOS, 혹은, 복수의 시그널 전달 도메인을 연결한, CD3제타 CD28-4-1BB나 CD3제타 CD28-OX40을 이용해도 된다. 일 실시태양에 있어서, 막관통 도메인이 유래하는 단백질은, CD8알파 또는 CD28이며, 또한 세포내 시그널 전달 도메인은 CD28, 4-1BB, ICOS, 혹은, 복수의 시그널 전달 도메인을 연결한, CD3제타 CD28-4-1BB나 CD3제타 CD28-OX40이어도 된다.
일 실시태양에 있어서, i) 항원 결합 분자의 면역 수용체 인식 부위에 결합할 수 있는 세포외 도메인, ii) 막관통 도메인, 및 iii) 세포질 공자극 도메인 및/또는 인터류킨 수용체쇄의 세포질 도메인으로부터 선택되는 1 이상의 세포내 시그널 전달 도메인과 외인성 STAT3 관련 모티프를 포함하여 이루어지는 CD3제타 세포내 시그널 전달 도메인을 포함하여 이루어지는 세포내 세그먼트(여기에서, 상기 세포내 세그먼트는, 내인성의 또는 외인성 JAK 결합 모티프 및 STAT5 관련 모티프를 포함하여 이루어진다)를 포함하여 이루어지는 키메라 수용체가 개시된다. 어느 실시형태에서는, 이들 도메인은, 경우에 따라, N말단으로부터 시작하여 이상의 순서로, 직접적 또는 간접적으로 융합된다. 어느 실시형태에서는, 세포내 세그먼트 내의 이들 도메인은, 반대의 순서로 융합된다.
용어 「자극」은, 자극 분자(예를 들어, TCR/CD3 복합체 또는 키메라 수용체)와 그 리간드(또는 키메라 수용체의 경우는 항원 결합 분자의 면역 수용체 인식 부위)의 결합에 의해 유도되는 1차 응답을 가리키고, 그것에 의해, 이들로 한정되지 않지만, TCR/CD3 복합체를 개재시킨 시그널 전달, 또는 키메라 수용체의 적절한 NK 수용체 혹은 시그널 전달 도메인을 개재시킨 시그널 전달 등의, 시그널 전달 사상이 매개된다. 자극은, 어느 특정의 분자의 변경된 발현을 매개하는 경우도 있다.
용어 「자극 분자」는, 면역 세포 시그널 전달 경로의 적어도 일부의 태양에 관해서, 자극의 형태로 면역 세포의 활성화를 조절하는 세포질내 시그널 전달 서열을 가져오는 면역 세포, 예를 들어, T 세포, NK 세포 또는 B 세포에 의해 발현되는 분자를 가리킨다. 일 태양에 있어서, 시그널은, 예를 들어, TCR/CD3 복합체와 펩티드를 제시한 MHC 분자의 결합에 의해 시동하는 1차 시그널이며, 그것에 의해, 이들로 한정되지 않지만, 증식, 활성화, 분화, 및 동종의 것 등의 T 세포 응답의 매개가 일어난다. 자극의 형태로 작용하는 1차 세포질내 시그널 전달 서열(또한, 「1차 시그널 전달 도메인」이라고도 칭해진다)은, 시그널 전달 모티프를 함유하고 있어도 되고, 이것은, 면역 수용체 티로신 베이스의 활성화 모티프 또는 ITAM으로서 알려져 있다. 본 개시에 있어서 특정의 용도를 가지는 세포질내 시그널 전달 서열을 함유하는 ITAM의 예로서는, 이들로 한정되지 않지만, CD3제타, 공통 FcR감마(FCER1G), Fc감마 RIIa, FcR베타(Fc입실론 R1b), CD3감마, CD3델타, CD3입실론, CD22, CD79a, CD79b, CD278(「ICOS」), Fc입실론 RI, CD66d, CD32, DAP10, DAP12, CLEC2, CLEC7A(Dectin1), CLEC9A, EZRIN, RADIXIN 및 MOESIN 유래의 것을 들 수 있다. 본 개시의 특정의 키메라 수용체에 있어서, 본 개시의 어느 1개 또는 복수의 키메라 수용체에 있어서의 세포내 시그널 전달 도메인은, 세포내 시그널 전달 서열, 예를 들어 CD3-제타의 1차 시그널 전달 서열을 포함한다. 본 발명의 키메라 수용체의 세포외 도메인은, 상기의 자극 분자의 세포외 도메인이어도 된다.
용어 「공자극 분자」는, 공자극 리간드와 특이적으로 결합하는 것에 의해, 이들로 한정되지 않지만 증식 등의 T 세포에 의한 공자극 응답을 매개하는(2차 시그널), T 세포 상의 동 기원의 결합 파트너를 가리킨다. 공자극 분자는, 효율적인 면역 반응의 한 요인이 되는, 항원 수용체 이외의 세포 표면 분자 또는 그들의 리간드이다. 용어 「공자극 세포내 시그널 전달 도메인」은, 공자극 분자의 세포내 부분을 가리킨다. 세포내 시그널 전달 도메인은, 세포 내의 부분 전체, 혹은 그것이 얻어진 분자의 천연형 세포내 시그널 전달 도메인의 전체, 또는 그들의 기능적인 프래그먼트 또는 유도체를 포함하고 있어도 된다. 공자극 분자로서는, 이들로 한정되지 않지만, MHC 클래스 I 분자, TNF 수용체 단백질, 면역글로불린양 단백질, 사이토카인 수용체, 인테그린, 시그널 전달 림프구 활성화 분자(SLAM 단백질), 활성화 NK 세포 수용체, BTLA, Toll 리간드 수용체, OX40(CD134), CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), 4-1BB(CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS(CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM(LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80(KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD5, CD8알파, CD8베타, IL2R베타, IL2R감마, IL7R알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), CD69, SLAMF6(NTB-A, Ly108), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, CD154 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드를 들 수 있다. 본 발명의 키메라 수용체의 세포외 도메인은, 상기의 공자극 분자의 세포외 도메인이어도 된다.
일 실시태양에 있어서, 공자극 분자는, 예를 들어, 4-1BB(즉 CD137), CD27, CD28 및/또는 OX40으로부터 선택되고, T 세포 수용체 자극을 증강한다.
용어 「4-1BB」 또는 「CD137」은, GenBank 수탁 번호 AAA62478.2로서 제공되는 서열 아미노산 서열을 갖는 TNFR 슈퍼패밀리의 일원, 또는 비인간종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 및 동종의 것으로부터의 등가의 잔기를 가리키고, 「4-1BB 공자극 도메인」은, GenBank 수탁 번호 AAA62478.2의 아미노산 잔기 214∼255, 또는 비인간종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 및 동종의 것으로부터의 등가의 잔기라고 정의된다. 일 태양에 있어서, 「4-1BB 공자극 도메인」은, Genbank NM001561.5의 뉴클레오티드 서열 886∼1026 서열의 전장, 혹은 일부 또는 비인간종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 및 동종의 것으로부터의 등가의 잔기이다.
용어 「핵산」 또는 「폴리뉴클레오티드」는, 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA), 및 1본쇄 또는 2본쇄의 어느 형태의 그들의 폴리머를 가리킨다. 용어 「핵산」은, 유전자, cDNA 또는 mRNA를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 핵산 분자는, 합성(예를 들어, 화학적으로 합성된) 핵산 분자 또는 재조합 핵산 분자이다. 특별히 한정되지 않는 한, 이 용어는, 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고, 천연에 존재하는 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 유사체 또는 유도체를 함유하는 핵산을 포함한다. 특별히 다른 지정이 없는 한, 특정의 핵산 서열은 또한, 그들의 보존적으로 개편된 변이체(예를 들어, 축중(縮重) 코돈의 치환), 대립 유전자, 오소로그, SNP, 및 상보 서열, 더하여 명확하게 제시된 서열도 사실상 포함한다. 구체적으로 말하면, 축중 코돈의 치환은, 1개 또는 복수의 선택된(또는 모든) 코돈의 제３ 위치가 혼성의 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환되어 있는 서열을 생성하는 것에 의해 달성될 가능성이 있다［Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); and Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)］.
용어 「핵산 서열」은, 본 개시에서 사용하는 경우, 천연의 염기, 당 및 당간(주쇄) 결합으로 이루어지는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 모노머의 서열을 의미한다. 이 용어에는 또한, 비천연 모노머 또는 그 일부를 포함하여 이루어지는 수식 또는 치환 서열도 포함된다. 본 출원의 핵산 서열은 데옥시리보핵산 서열(DNA) 또는 리보핵산 서열(RNA)일 수 있고, 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민 및 우라실을 포함하는 천연 염기가 포함된다. 이들 서열은 또한, 수식 염기도 함유할 수 있다. 이와 같은 수식 염기의 예에는, 아자 및 데아자아데닌, 구아닌, 시토신, 티민 및 우라실; 및 잔틴 및 하이포잔틴이 포함된다.
용어 「단리된 핵산」은, 본 개시에서 사용하는 경우, 재조합 DNA 기술에 의해 생산되는 경우에는 세포 재료 혹은 배양 배지를, 또는 화학 합성되는 경우에는 화학 전구체 혹은 다른 화학물질을 실질적으로 포함하지 않는 핵산을 의미한다. 단리된 핵산은 또한, 그 핵산이 유래하는, 핵산에 천연에 인접하고 있는 서열(즉, 그 핵산의 5＇말단 및 3＇말단에 위치하는 서열)도 실질적으로 포함하지 않는다. 용어 「핵산」은, DNA 및 RNA를 포함하는 것으로서, 2본쇄 또는 1본쇄의 어느 것이어도 되고, 센스 또는 안티센스쇄에 상당한다. 더욱이, 용어 「핵산」은, 상보적 핵산 서열, 예를 들어, cDNA를 포함한다.
용어 「코딩(하는 것)」은, 뉴클레오티드(예를 들어, rRNA, tRNA 및 mRNA)의 규정의 서열 또는 아미노산의 규정의 서열의 어느 것을 갖는, 생물학적 프로세스에 있어서의 다른 폴리머 및 고분자의 합성을 위한 주형으로서 도움이 되는, 유전자, cDNA, 또는 mRNA 등의 폴리뉴클레오티드 중의 뉴클레오티드의 특이적 서열의 고유의 특성, 및 그것에 의해 생기는 생물학적인 특성을 가리킨다. 따라서, 세포 또는 다른 생물계 중에서, 유전자에 대응하는 mRNA의 전사 및 번역에 의해 단백질이 산생되는 경우, 그 유전자, cDNA, 또는 RNA는, 단백질을 코딩한다. 그 뉴클레오티드 서열이 mRNA 서열과 동일하고, 통상 서열표에 나타나는 코드쇄와, 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로서 사용되는 비코드쇄는 어느 쪽도, 그 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 다른 생성물을 코딩한다고 칭할 수 있다.
특별히 다른 규정이 없는 한, 「아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열」은, 서로의 축중형인 뉴클레오티드 서열이나 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 모두를 포함한다. 또한, 단백질 또는 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이라고 하는 성구는, 몇몇 경우에 있어서 그 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 인트론을 함유할 수 있을 정도로 인트론을 포함하고 있어도 된다. 또한, 핵산 분자는, 키메라 수용체의 발현을 위한 적어도 1개의 조절 엘리먼트와 작동 가능하도록 결합될 수 있다.
용어 「펩티드」, 「폴리펩티드」, 및 「단백질」은, 동의적으로 사용되고, 펩티드 결합에 의해 공유 결합으로 연결된 아미노산 잔기로 구성되는 화합물을 가리킨다. 단백질 또는 펩티드는, 적어도 2개의 아미노산을 함유하고 있지 않으면 안되고, 단백질 또는 펩티드의 서열을 구성할 수 있는 아미노산의 최대수에 제한은 없다. 폴리펩티드는, 서로 펩티드 결합으로 합체한 2개 이상의 아미노산을 포함하는 모든 펩티드 또는 단백질을 포함한다. 이 용어는, 본 개시에서 사용되는 경우, 당업계에서는 일반적으로 예를 들어 펩티드, 올리고펩티드 및 올리고머라고도 칭해지는 단쇄와, 당업계에서는 일반적으로 많은 타입이 존재하는 단백질이라고 칭해지는 그것보다 긴 쇄의 양쪽을 가리킨다. 「폴리펩티드」로서는, 예를 들어, 그 중에서도 생물학적으로 활성인 프래그먼트, 실질적으로 상동인 폴리펩티드, 올리고펩티드, 호모2량체, 헤테로2량체, 폴리펩티드의 변이체, 개변된 폴리펩티드, 유도체, 유사체, 융합 단백질을 들 수 있다. 폴리펩티드로서는, 천연 펩티드, 재조합 펩티드, 또는 그들의 조합을 들 수 있다.
본 개시에 있어서의 폴리펩티드란, 통상, 10아미노산 정도 이상의 길이를 갖는 펩티드, 및 단백질을 가리킨다. N말단으로부터 C말단까지 펩티드 결합으로 연결되는 아미노산의 연쇄를 일련의 펩티드쇄로 하는 경우, 본 개시의 폴리펩티드는, 복수의 일련의 펩티드쇄가 S-S 결합, 소수성 상호작용, 이온 결합 등의 상호작용에 의해 형성된 복합체 단백질이어도 된다.
용어 「단리된 폴리펩티드」는, 「단리된 단백질」이라고도 불리고, 재조합 DNA 기술에 의해 생산되는 경우에는 세포 재료 혹은 배양 배지를, 또는 화학 합성되는 경우에는 화학 전구체 혹은 다른 화학 물질을 실질적으로 포함하지 않는 폴리펩티드를 의미한다.
용어 「아미노산」은, 천연 아미노산 및 수식 아미노산의 모두를 포함한다.
「보존적 아미노산 배리에이션」은, 본 개시에서 사용하는 경우, 그 단백질의 소망의 특성을 해치지 않고 어느 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되어 있는 것이다.
본 출원에 있어서 구체적으로 나타나는 아미노산 서열은, 보존적 서열 개변을 포함하고 있어도 된다. 여기에서 「보존적 서열 개변」이란, 그 아미노산 서열을 함유하는 항체 또는 항체 프래그먼트의 결합 특징에 유의하게 영향을 주거나 또는 변경하거나 하지 않는 아미노산 변이를 가리킨다. 이와 같은 보존적 개변으로서는, 아미노산의 치환, 부가 및 결실을 들 수 있다. 개변은, 부위 특이적 변이 유발 및 PCR 개재 변이 유발 등의 당업계 공지의 표준적인 기술에 의해 본 개시의 항체 또는 항체 프래그먼트에 도입할 수 있다. 보존적 아미노산 치환이란, 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환되는 치환이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는, 당업계에 있어서 정의되어 있다. 이들 패밀리는, 염기성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파라긴산, 글루타민산), 비하전성 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타 분기 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 아이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 포함한다. 따라서, 본 개시의 키메라 수용체 내의 하나 또는 복수의 아미노산 잔기가, 동일한 측쇄 패밀리의 다른 아미노산 잔기로 치환되어 있어도 되고, 변경된 키메라 수용체는, 본 개시에서 설명되는 기능 어세이를 사용하여 테스트할 수 있다.
용어 「발현」은, 프로모터에 의해 구동되는 특정의 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역을 가리킨다.
본 개시 중의 「숙주 세포」, 「숙주 세포주」, 및 「숙주 세포 배양물」은, 서로 교환 가능하게 이용되고, 외래 핵산이 도입된 세포(그와 같은 세포의 자손을 포함한다)를 말한다. 숙주 세포는 「형질 전환체」 및 「형질 전환 세포」를 포함하고, 이것에는 초대의 형질 전환 세포 및 계대수에 상관 없이 그 세포에서 유래하는 자손을 포함한다. 자손은, 친세포와 핵산의 내용에 있어서 완전히 동일하지 않아도 되고, 변이를 포함하고 있어도 된다. 오리지널의 형질 전환 세포가 스크리닝되었을 또는 선택되었을 때에 이용된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 변이체 자손도, 본 개시에서는 포함된다.
본 개시 중의 「벡터」는, 그것이 연결된 또 1개의 핵산을 늘릴 수 있는, 핵산 분자를 말한다. 이 용어는, 자기 복제 핵산 구조로서의 벡터, 및, 그것이 도입된 숙주 세포의 게놈 중에 짜넣어지는 벡터를 포함한다. 어느 벡터는, 자신이 동작적으로 연결된 핵산의, 발현을 가져올 수 있다. 그와 같은 벡터는, 본 개시에서는 「발현 벡터」라고도 칭해진다.
트랜스펙션이란, 실제로 임의의 코드화 서열이 발현할지 여부를 알 수 없는 숙주 세포에 의한 발현 벡터의 흡수를 의미한다. 트랜스펙션의 많은 방법은, 통상의 기능을 갖는 기술자에게 알려져 있고, 예를 들어, CaPO4 침강법 및 전기 천공법이 있다. 일반적으로 성공한 트랜스펙션은, 숙주 세포 내에서 해당 벡터의 작용의 징조가 나타났을 때에 인식된다.
용어 「프로모터」는, 폴리뉴클레오티드 서열의 특이적 전사를 개시시키는 데 필요한, 세포의 합성 기구에 의해 인식되는 DNA 서열, 또는 도입된 합성 기구를 가리킨다.
용어 「렌티바이러스」는, 레트로바이러스과의 속의 하나를 가리킨다. 렌티바이러스는, 레트로바이러스 중에서도 비분열 세포에 감염할 수 있다고 하는 점에서 독특하고, 이들은, 숙주 세포의 DNA에 상당한 양의 유전 정보를 딜리버리할 수 있으므로, 유전자 딜리버리 벡터의 가장 효율적인 방법의 하나이다. HIV, SIV, 및 FIV가, 렌티바이러스의 모든 예이다.
용어 「렌티바이러스 벡터」는, 렌티바이러스 게놈의 적어도 일부에서 유래하는 벡터를 가리키고, 특히, Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)에서 나타나는 바와 같은 자기 불활성화 렌티바이러스 벡터를 들 수 있다. 진료 시설에서 사용될 가능성이 있는 렌티바이러스 벡터의 다른 예로서는, 이들로 한정되지 않지만, 예를 들어, Oxford Bio Medica제의 LENTIVECTOR(등록상표) 유전자 딜리버리 기술, Lentigen제의 LENTIMAX(상표) 벡터계 및 동종의 것을 들 수 있다. 비임상 타입의 렌티바이러스 벡터도 이용 가능하고, 벡터의 선택 및 작성은 당업자가 적절히 행할 수 있다.
본 개시에 있어서, 용어 「약학적으로 허용되는」은, 포유동물(예를 들어, 인간)에게 투여했을 때에, 생리학적으로 내용성(耐容性)이며, 전형적으로 바람직하지 않은 반응을 일으키지 않는, 이와 같은 조성물의 분자 실체 및 다른 성분을 말한다. 바람직하게는, 본 개시에 있어서의 「약학적으로 허용되는」은, 포유동물, 보다 구체적으로 인간에 있어서의 사용에 대해, 연방 정부 혹은 주 정부의 규제 당국에 승인된 또는 미국 약국방 혹은 다른 일반적으로 인식되고 있는 약국방에 기재되어 있는 것을 의미한다.
하나의 태양에 있어서, 본 개시의 키메라 수용체는, 여기에 기재하는 2개의 시그널 전달 도메인, 즉, CD3제타 및 4-1BB/CD137 혹은 CD3제타에 더하여 1개 이상의 시그널 전달 도메인을 포함한다. 하나의 특정의 태양에 있어서, 수개의 시그널 전달 도메인이, 상가적 또는 상승적 작용을 위해서 서로 융합하고 있다. 유용한 부가적 시그널 전달 도메인의 비한정적 예는, TCR 제타쇄, CD27, CD28, OX40/CD134, 4-1BB/CD137, Fc입실론 RIy, ICOS/CD278, ILRB/CD122, IL-2RG/CD132, DAP-10 및 CD40의 1개 이상의 일부 또는 모두를 포함한다.
본 개시에서는, i) 소정의 항원에 항원 결합 분자를 개재시켜 결합할 수 있는 세포외 도메인, ii) 막관통 도메인, 및 iii) 세포질 공자극 도메인 및/또는 인터류킨 수용체쇄의 세포질 도메인으로부터 선택되는 1 이상의 세포내 시그널 전달 도메인과 외인성 STAT3 관련 모티프를 포함하여 이루어지는 CD3제타 세포내 시그널 전달 도메인을 포함하여 이루어지는 세포내 세그먼트(여기에서, 상기 세포내 세그먼트는, 내인성의 또는 외인성 JAK 결합 모티프 및 STAT5 관련 모티프를 포함하여 이루어진다)를 포함하여 이루어지는 키메라 수용체가 개시된다. 어느 실시형태에서는, 이들 도메인은, 경우에 따라, N말단으로부터 시작하여 이상의 순서로, 직접적 또는 간접적으로 융합된다. 어느 실시형태에서는, 세포내 세그먼트 내의 이들 도메인은, 반대의 순서로 융합된다.
또한, 본 개시에서는, i) 항원 결합 분자를 개재시켜 결합할 수 있는 세포외 도메인, ii) 막관통 도메인, 및 iii) 인터류킨(IL) 수용체쇄의 세포질 도메인 및 경우에 따라 적어도 1개의 보완적 세포질 도메인을 포함하는 1 이상의 세포내 시그널 전달 도메인을 포함하여 이루어지는 세포내 세그먼트를 포함하여 이루어지는 키메라 수용체도 포함한다. 어느 실시형태에서는, 이들 도메인은, 경우에 따라, N말단으로부터 시작하여 이상의 순서로, 직접적 또는 간접적으로 융합된다. 하나의 실시형태에서는, 세포내 세그먼트 내의 이들의 도메인은, 반대의 순서로 융합된다.
몇몇 실시형태에서는, IL 수용체쇄는, 막관통 도메인의 근위에 있고, 및/또는 키메라 수용체 세포내 세그먼트의 N말단에 가깝거나, 또는 N말단을 형성한다. 다른 실시형태에서는, IL 수용체쇄는, 키메라 수용체의 세포내 세그먼트의 C말단에 가깝거나, 또는 C말단을 형성한다. 몇몇 실시형태에서는, IL 수용체쇄는, 외인성 STAT3 관련 모티프 YXXQ를 포함하여 이루어지는 CD3제타 세포내 시그널 전달 도메인의 상류 또는 N말단측에 있다.
세포내 세그먼트가 IL 수용체쇄의 시그널 전달 도메인만을 포함하여 이루어지는 실시형태에서는, 키메라 수용체 발현 세포는, 내인성 TCR을 개재시켜 MHC 복합체 내에 존재하는 소정의 항원에 의해, 및/또는 내인성 CD28을 개재시켜 CD80/86 분자에 의해, 예를 들어, B 세포에 의해 활성화될 수 있다.
또한, 본 개시의 키메라 수용체를 발현하는 세포도 제공된다. 이와 같은 세포는, 예를 들어, 키메라 수용체를 발현하지 않는 친세포에 비해, 항원 결합 분자를 개재시켜 키메라 수용체가 결합하는 소정의/미리 선택된 항원을 그 표면에 갖는 세포에 대해서 높은 세포 상해 활성을 가질 수 있다. 예를 들어, 실시예에 나타나는 바와 같이, 본 개시의 키메라 수용체 수용체를 발현하는 세포는, 항원 결합 분자를 투여하는 것에 의해, 항원 결합 분자 의존적이고 또한 암 항원 종양 항원 의존적인 항종양 효과를 제공한다. 따라서, 인간에서의 항종양 효과도 기대된다.
본 개시의 키메라 수용체를 발현하는 세포에 있어서는, 본 개시의 키메라 수용체가 발현하고 있으면 되고, 그 외의 형질 도입이 되어 있어도 된다.
본 개시에 의한 키메라 수용체의 세포내 세그먼트는, 1 이상의 세포내 시그널 전달 도메인을 포함하여 이루어질 수 있고, 동일한 분자 내에 존재하는 세포외 도메인이 그 코그네이트 항원/리간드와 결합(상호작용)할 때에 세포에 시그널을 전달할 수 있는, 단백질성 분자이다.
어느 측면에 있어서, 키메라 수용체 세포내 세그먼트는, 외인성 STAT3 관련 모티프를 포함하여 이루어지는 CD3제타 세포내 시그널 전달 도메인을 포함하여 이루어진다. 더하여, 키메라 수용체 세포내 세그먼트는, IL 수용체쇄의 세포질 도메인 및/또는 세포질 공자극 도메인으로부터 선택되는 1 이상의 세포내 시그널 전달 도메인을 포함하여 이루어지고, 상기 세포내 세그먼트는, 내인성 또는 외인성 JAK 결합 모티프 및 STAT5 관련 모티프를 포함하여 이루어진다.
1차 세포질 시그널 전달 서열은, TCR 복합체의 1차 활성화를 조절한다. 예를 들어, CD3제타 세포내 시그널 전달 도메인은, 1차 세포질 시그널을 제공한다. 1차 세포질 시그널 전달 서열은, 면역 수용체 티로신 활성화 모티프(ITAM)[Nature, vol. 338, pp. 383-384 (1989)]로서 알려진 시그널 전달 모티프를 포함하고 있어도 된다. 다른 한편, 저해적으로 작용하는 1차 세포질 시그널 전달 서열은, 면역 수용체 티로신 저해 모티프(ITIM)[J Immunol., vol. 162, No. 2, pp. 897-902 (1999)]로서 알려진 시그널 전달 모티프를 포함하고 있어도 된다. 본 개시에서는, ITAM 및/또는 ITIM을 갖는 세포내 시그널 전달 도메인을 사용할 수 있다.
본 개시에 있어서, CD3제타의 세포내 도메인은, 면역 수용체 티로신 활성화 모티프(ITAM)를 포함하여 이루어진다. 사용 가능한 ITAM을 갖는 세포내 시그널 전달 도메인의 예는, 예를 들어, CD3제타 대신에, 또는 CD3제타와 치환하여, FcR감마, FcR베타, CD3감마, CD3델타, CD3입실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, 및 CD66d에서 유래하는 ITAM을 갖는 세포내 시그널 전달 도메인을 포함한다. 구체적으로는, 1 이상의 ITAM을 포함하여 이루어지는 세포내 도메인의 예에는, CD3제타(NCBI RefSeq: NP＿932170.1)의 아미노산 번호 52∼164, Fc입실론 RI 감마(NCBI RefSeq: NP＿004097.1)의 아미노산 번호 45∼86, Fc입실론 RI 베타(NCBI RefSeq: NP＿000130.1)의 아미노산 번호 201∼244, CD3감마(NCBI RefSeq: NP＿000064.1)의 아미노산 번호 139∼182, CD3델타(NCBI RefSeq: NP＿000723.1)의 아미노산 번호 128∼171, CD3입실론(NCBI RefSeq: NP＿000724.1)의 아미노산 번호 153∼207, CD5(NCBI RefSeq: NP＿055022.2)의 아미노산 번호 402∼495, CD22(NCBI RefSeq: NP＿001762.2)의 아미노산 번호 707∼847, CD79a(NCBI RefSeq: NP＿001774.1)의 아미노산 번호 166∼226, CD79b(NCBI RefSeq: NP＿000617.1)의 아미노산 번호 182∼229, 및 CD66d(NCBI RefSeq: NP＿001806.2)의 아미노산 번호 177∼252의 서열을 갖는 펩티드, 및 이들 펩티드와 동일한 기능을 갖는 그들의 변이체가 포함된다. 본 명세서에 기재된 NCBI RefSeq ID 또는 GenBank의 아미노산 서열 정보에 기초하는 아미노산 번호는, 각 단백질의 전구체(시그널 펩티드 서열 등을 포함하여 이루어진다)의 전장에 기초하여 번호 붙여져 있다.
어느 실시형태에서는, STAT3 관련 모티프 YXXQ에 있어서 「X」로 표시되는 아미노산 잔기는, STAT3 결합을 유지하는 어느 수식 천연 아미노산도 포함하는, 임의의 천연 아미노산일 수 있다. 하나의 실시형태에서는, 아미노산 X는, 류신, 아르기닌, 히스티딘, 페닐알라닌, 리신, 프롤린, 메티오닌, 발린, 글루타민, 트레오닌, 아스파라긴산으로부터 독립적으로 선택된다. 예를 들어, 아미노산 X는 아르기닌이다. 예를 들어, 아미노산 X는 히스티딘이다.
어느 실시형태에서는, STAT3 관련 모티프 YXXQ의 티로신 잔기에 인접하는 2개의 아미노산 잔기는, 아르기닌-히스티딘이다. 추가로 다른 실시형태에서는, 외인성 STAT3 관련 모티프는, YRHQ이다.
외인성 STAT3 관련 모티프 YXXQ는 CD3제타의 세포내 도메인의 어느 부분에 도입되어도 되지만, 어느 실시형태에서는, YXXQ 관련 모티프는 C말단 영역 부근에 삽입된다. 특정의 이론에 얽매이는 것을 바라는 것은 아니지만, 많은 내인성 YXXQ 모티프는, C말단으로부터 100aa 부근 또는 그것 이내에 배치된다고 생각된다. 또한, C말단 영역 부근에 있는 YXXQ 모티프는, GP130 및 LIFR 연구에서 보다 근위에 있는 편이 기능성이 높음이 나타나 있다(Schmitz J et al. J Immunol. 2000;164:848-54; Tomida M et al. Blood. 1999;93:1934-41).
어느 실시형태에서는, 외인성 STAT3 관련 모티프 YXXQ는, 키메라 수용체의 C말단으로부터 200아미노산 잔기 내에 있는 CD3제타의 세포내 도메인의 임의의 부분에 도입된다. 예를 들어, STAT3 관련 모티프는, 키메라 수용체의 C말단으로부터 200아미노산 잔기 내, 150아미노산 잔기 내, 100아미노산 잔기 내, 90아미노산 잔기 내, 80아미노산 잔기 내, 70아미노산 잔기 내, 60아미노산 잔기 내, 50아미노산 잔기 내, 40아미노산 잔기 내, 30아미노산 잔기 내, 20아미노산 잔기 내 또는 10아미노산 잔기 내에 도입된다. 하나의 실시형태에서는, 외인성 STAT3 관련 모티프는, ITAM 이외의 장소에 도입된다.
어느 실시형태에서는, 외인성 STAT3 관련 모티프를 포함하여 이루어지는 CD3제타 세포내 도메인은, 적어도 1개의 ITAM 모티프를 포함하여 이루어진다. 하나의 실시형태에서는, 외인성 STAT3 관련 모티프를 포함하여 이루어지는 CD3제타 세포내 도메인은, 2개의 ITAM 모티프를 포함하여 이루어진다. 추가적인 실시형태에서는, 외인성 STAT3 관련 모티프를 포함하여 이루어지는 CD3제타 세포내 도메인은, 3개의 ITAM 모티프를 포함하여 이루어진다.
당업자는, CD3제타의 세포내 시그널 전달 도메인에 STAT3 관련 모티프를 도입하기 위해서 몇몇 방법이 사용 가능함을 인식한다. 예를 들어, 외인성 STAT3 관련 모티프는, CD3제타의 세포내 시그널 전달 도메인의 아미노산 잔기 104∼106위의 아미노산 잔기 Leu-His-Met를 잔기 104번의 티로신과 그 티로신 잔기에 105번 및 106번에서 인접하는 임의의 다른 2개의 아미노산 잔기로 치환하는 것에 의해 도입할 수 있다. CD3제타의 세포내 시그널 전달 도메인의 아미노산 잔기 104-105-106은, 전장 CD3제타(예를 들어, NCBI RefSeq: NP＿932170.1)의 아미노산 잔기 156-157-158에 상당한다.
기재한 바와 같이, 어느 실시형태에 있어서의 키메라 수용체는, IL 수용체쇄 및 세포질 공자극 도메인의 세포질 도메인으로부터 선택되는 1 이상의 세포내 시그널 전달 도메인을 포함하여 이루어지는 세포내 세그먼트를 포함하여 이루어진다.
본 개시에 있어서, IL 수용체쇄의 세포질 도메인은, IL 수용체의 임의의 쇄로부터 선택할 수 있고, 예를 들어, IL-2 수용체 베타쇄(NCBI REFSEQ: NP＿000869.1)(IL-21 수용체 알파쇄(NCBI REFSEQ: NP＿068570.1)의 아미노산 번호 256∼538)의 아미노산 번호 266∼551, 공통 IL-2 수용체 감마쇄(NCBI REFSEQ: NP＿000197.1)의 아미노산 번호 284∼369, IL-7R알파(NCBI REFSEQ: NP＿002176.2)의 아미노산 번호 265∼459, IL-9R알파(NCBI REFSEQ: NP＿002177.2)의 아미노산 번호 292∼521 또는 IL-4R알파(NCBI REFSEQ: NP＿000409.1)의 아미노산 번호 257∼825를 포함하여 이루어지는 세포질 도메인이 사용 가능하다. IL 수용체쇄의 세포질 도메인의 전체 영역이 사용 가능하다.
혹은, IL 수용체(ILR) 쇄의 상기 세포질 도메인의 말단 절단 프래그먼트도 사용 가능하다. 예를 들어, 말단 절단 프래그먼트는, ILR 세포질 도메인의 250까지의 아미노산을 포함하여 이루어지거나, 또는 50∼200아미노산 혹은 80∼150아미노산이다.
어느 실시형태에서는, IL 수용체쇄의 세포질 도메인, 경우에 따라, IL 수용체쇄의 상기 세포질 도메인의 말단 절단 프래그먼트는, 적어도 STAT 관련 모티프, 경우에 따라, STAT5 관련 모티프와, JAK 결합 모티프(box-1 모티프로서도 알려진다)를 포함하여 이루어진다. 어느 실시형태에서는, IL 수용체쇄의 세포질 도메인 또는 그 말단 절단 프래그먼트는, STAT5 관련 모티프와 JAK 결합 모티프를 포함하여 이루어진다.
어느 실시형태에서는, IL 수용체쇄의 세포질 도메인 및/또는 말단 절단 프래그먼트에는, 동일한 기능을 갖는 변이체, 예를 들어, STAT 시그널 전달, 경우에 따라, STAT5 시그널 전달 및/또는 JAK 시그널 전달을 유도하는 변이체가 포함된다.
본 개시의 하나의 측면에서는, IL-2 수용체(IL-2R) 베타쇄의 세포질 도메인이 사용 가능하다. 본 개시에서 사용 가능한 IL-2R 베타쇄의 세포질 도메인의 예에는, IL-2R 베타쇄(NCBI RefSeq: NP＿000869.1)의 아미노산 번호 266∼551이 포함된다. 일 실시태양에 있어서, 아미노산 번호 266∼337 및 530∼551의 서열의 어느 것을 갖는 펩티드가 포함된다. 본 개시의 하나의 측면에서는, IL-2R 베타쇄의 세포질 도메인의 말단 절단 프래그먼트가 사용 가능하다. 이 말단 절단 프래그먼트는, i) 티로신 키나제 JAK1과의 회합을 가능하게 하는, BOX-1 모티프로도 불리는, JAK 결합 모티프(예를 들어, NCBI RefSeq: NP＿000869.1의 아미노산 번호 278∼286), 및 ii) STAT 관련 모티프, 경우에 따라, STAT5 또는 STAT3 관련 모티프를 포함하고 있어도 된다. IL 수용체쇄의 다른 부분은, 예를 들어, 보존적 아미노산 배리에이션에 의해 변경 가능하다.
어느 실시형태에서는, 세포내 세그먼트는, 외인성 JAK 결합 모티프, 또는 JAK 결합 모티프를 포함하여 이루어지는 시그널 전달 분자를 포함하고 있어도 된다. 예를 들어, JAK 결합 모티프는, IL2R 감마(IL2RG), 에리트로포이에틴 수용체(EpoR), 트롬보포이에틴 수용체(TpoR), 과립구 매크로파지 콜로니 자극 인자 수용체(GM-CSFR), 및 성장 호르몬 수용체(GHR)에서 유래한다.
IL-2R 베타쇄는, STAT5 회합에 사용되는 3개의 기능적 STAT5 결합 모티프, YFFF, YCTF 및 YLSL을 포함하여 이루어진다. 이들 티로신 잔기의 변이는, IL-2R 베타쇄의 IL-2 반응성을 무효로 할 수 있다(Friedmann et al., 1996). 에리트로포이에틴 수용체(EpoR)는, STAT5의 활성화를 매개하는 2개의 티로신 잔기, 즉, Y343과 Y401을 포함하여 이루어지고, 양쪽 모두 YXXL 모티프를 갖는 것이 기재되어 있다(Klingmuller et al., 1996). 따라서, YXXL은, STAT5의 동원에 바람직한 모티프일 수 있다. 예를 들어, IL-2R 베타쇄 STAT5 결합 모티프로 나타나는 바와 같이, 다른 아미노산 잔기도 기능적이다. 하나의 실시형태에서는, STAT5 관련 모티프는, IL-2R 베타쇄 STAT5 관련 모티프이며, 티로신 잔기-510(티로신 잔기 510은, NCBI RefSeq: NP＿000869.1의 아미노산 번호 536이다)을 포함하여 이루어진다.
어느 실시형태에서는, STAT5 관련 모티프는, IL2R 감마, EpoR, TpoR, GM-CSFR 및 GHR에서 유래할 수 있다.
어느 실시형태에서는, IL-2R 베타쇄의 STAT5 관련 모티프는, 아미노산 잔기 YXXL을 포함하여 이루어진다. 어느 실시형태에서는, STAT5 관련 모티프에 있어서 「X」로 표시되는 아미노산 잔기는, STAT5 결합을 유지하는 임의의 수식 천연 아미노산을 포함하는, 임의의 천연 아미노산일 수 있다.
마찬가지로, 세포내 세그먼트는, 세포내 시그널 전달 도메인의 어느 것에 배치 또는 도입할 수도 있는 1 이상의 JAK 결합 모티프를 포함하여 이루어진다.
본 개시의 하나의 측면에서는, IL-21 수용체(IL-21R) 알파쇄의 세포질 도메인이 사용 가능하다. 본 개시에서 사용되는 IL-21R 알파쇄의 세포질 도메인의 예에는, IL-21R 알파쇄의 아미노산 번호 256∼538(NCBI RefSeq: NP＿068570.1)을 포함하여 이루어지는 세포내 시그널 전달 도메인이 포함된다. 본 개시의 하나의 측면에서, IL-21R 알파쇄의 세포질 도메인의 말단 절단 프래그먼트가 사용 가능하다. 말단 절단 프래그먼트에는, 티로신 키나제 JAK1과의 회합에 필요한 box-1 모티프(NCBI RefSeq: NP＿068570.1의 아미노산 번호 266∼274)가 포함되고, 또한, STAT 관련 모티프가 포함된다. 어느 실시형태에서는, STAT 관련 모티프는, 티로신 잔기-500(NCBI RefSeq: NP＿000869.1의 아미노산 번호 519) 및 STAT1/3 회합에 필요해지는 티로신 잔기 500, 즉, YLRQ의 C말단측에 인접하는 3잔기를 포함하여 이루어진다.
세포내 시그널 전달 도메인의 다른 예에는, TCR 복합체 및/또는 공자극 분자에서 유래하는 세포질 영역, 및 그들의 서열과 동일한 기능을 갖는 임의의 변이체가 포함된다. 다른 예에는, 인용하는 것에 의해 본 명세서의 일부가 되는 Sadelain et al 2009의 표 2에 들어져 있는 세포질 시그널 전달 도메인이 포함된다.
천연 T 세포의 활성화는, 2개의 상이한 종류의 세포내 시그널 전달 도메인, 즉, TCR 복합체를 개재시켜 항원 의존적 1차 활성화(예를 들어 CD3제타에 의해 제공되는, 예를 들어, 1차 세포질 시그널)를 유도하기 위한 도메인 및 2차 또는 공자극 시그널(2차 세포질 시그널)을 제공하기 위해서 항원 비의존적으로 작용하는 도메인에 의해 전달된다.
본 개시에서 사용 가능한 2차 또는 공자극 세포질 시그널 전달 도메인을 포함하여 이루어지는 세포내 도메인의 예에는, CD2, CD4, CD5, CD8알파, CD8베타, CD28, CD134, CD137(4-1BB), ICOS, 및 CD154, 예를 들어, 시그널 전달 모티프를 포함하여 이루어지는 그 말단 절단 프래그먼트에서 유래하는 서열이 포함된다. 그 구체예에는, CD2(NCBI RefSeq: NP＿001758.2)의 아미노산 번호 236∼351, CD4(NCBI RefSeq: NP＿000607.1)의 아미노산 번호 421∼458, CD5(NCBI RefSeq: NP＿055022.2)의 아미노산 번호 402∼495, CD8알파(NCBI RefSeq: NP＿001759.3)의 아미노산 번호 207∼235, CD8베타(GenBank: AAA35664.1)의 아미노산 번호 196∼210, CD28(NCBI RefSeq: NP＿006130.1)의 아미노산 번호 180∼220, CD137(4-1BB, NCBI RefSeq: NP＿001552.2)의 아미노산 번호 214∼255, CD134(OX40, NCBI RefSeq: NP＿003318.1)의 아미노산 번호 241∼277, 및 ICOS(NCBI RefSeq: NP＿036224.1)의 아미노산 번호 166∼199의 서열의 어느 것을 갖는 펩티드, 및 이들 펩티드가 갖는 것과 동일한 기능을 갖는 그들의 변이체가 포함된다.
바람직한 개시는, 하나의 측면에 있어서, 외인성 STAT3 관련 모티프를 포함하여 이루어지는 CD3제타의 세포내 시그널 전달 도메인에 더하여, 1 이상의, 예를 들어, 2 또는 3의 세포내 시그널 전달 도메인을 갖는 세포내 세그먼트를 포함하여 이루어지는 키메라 수용체를 포함한다.
본 개시는 또한, 직렬된 2 이상의 동일한 세포내 시그널 전달 도메인을 갖는 세포내 세그먼트를 포함하여 이루어지는 키메라 수용체를 포함한다. 하나의 측면에 있어서, 본 개시는, IL 수용체의 세포질 도메인이 CD3제타의 세포내 시그널 전달 도메인의 N말단측에 있는 키메라 수용체, 즉, IL 수용체의 세포질 도메인과 CD3제타의 세포내 시그널 전달 도메인이, N말단측으로부터 이 순서로 연결된 것을 포함하여 이루어지는 키메라 수용체를 제공한다. 본 개시는 또한, 전술한 키메라 수용체에 CD28(예를 들어, CD28의 세포질 공자극 도메인)의 세포내 도메인을 추가로 부가하는 것에 의해 얻어지는 키메라 수용체, 즉, CD28의 세포내 시그널 전달 도메인과, IL 수용체의 세포질 도메인과, 외인성 STAT3 모티프를 포함하여 이루어지는 CD3제타의 세포내 시그널 전달 도메인이, N말단측으로부터 이 순서로 연결된 것을 포함하여 이루어지는 키메라 수용체도 포함한다.
어느 실시형태에서는, 키메라 수용체는, 외인성 STAT3 관련 모티프와, 인터류킨 수용체쇄의 세포질 도메인 및 세포질 공자극 도메인으로부터 선택되는 세포내 시그널 전달 도메인을 포함하여 이루어지는, CD3제타 세포내 시그널 전달 도메인을 포함하여 이루어지는 세포내 세그먼트를 포함하여 이루어지고, 여기에서, 세포내 시그널 전달 도메인의 적어도 하나는, 내인성의 또는 외인성 JAK 결합 모티프 및 STAT5 관련 모티프를 포함하여 이루어진다.
하나의 실시형태에서는, 키메라 수용체는, 외인성 STAT3 관련 모티프를 갖는 CD3제타 세포내 시그널 전달 도메인과, 내인성 또는 외인성 JAK 결합 모티프 및 STAT5 관련 모티프를 포함하여 이루어지는 IL 수용체쇄 프래그먼트의 세포질 도메인과, CD28의 세포질 공자극 도메인을 포함하여 이루어진다.
본 개시의 키메라 수용체에서는, 올리고펩티드 링커 또는 폴리펩티드 링커가, 세포내 세그먼트의 도메인 사이에, 거기서 도메인을 연결하도록, 및/또는 그것들을 다른 도메인과 연결하도록 삽입할 수 있다. 예를 들어, 2∼10아미노산 길이를 갖는 링커를 사용할 수 있다. 특히, 글리신-세린 연속 서열을 갖는 링커를 사용할 수 있다. 예를 들어, 링커 IDGGGGSGGGGSGGGGS를, CD28 세포질 도메인과 부분적 세포질 IL-2 수용체 베타 도메인 사이에 삽입할 수 있다. 예를 들어, 링커 KLGGSGP를, 부분적 세포질 IL-2 수용 베타 도메인과 및 CD3제타쇄의 세포내 도메인 사이에 삽입할 수 있다.
다른 측면에서는, i) 항원 결합 분자의 면역 수용체 인식 부위에 결합할 수 있는 세포외 도메인, ii) 막관통 도메인, 및 iii) 인터류킨 수용체쇄의 세포질 도메인 및 경우에 따라 보완적 세포질 도메인을 포함하는 1 이상의 세포내 시그널 전달 도메인을 포함하여 이루어지는 세포내 세그먼트를 포함하여 이루어지는 키메라 수용체가 제공된다.
IL 수용체쇄의 세포질 도메인은, 본 명세서에 기재된 IL 수용체의 어느 쇄로부터 선택되어도 된다. IL 수용체쇄의 세포질 도메인의 전체 영역이 사용 가능하다. 혹은, IL 수용체쇄의 상기 세포질 도메인의 말단 절단 프래그먼트도 또한 사용 가능하다. 전장 및 그 말단 절단 프래그먼트의 예는 본 명세서에 나타난다.
어느 실시형태에서는, 말단 절단 프래그먼트는, 본 명세서에 기재된, 적어도 1개의 티로신 키나제 관련 모티프(box-1 모티프로서도 알려진다) 및 STAT(시그널 전달 전사 활성화 인자) 관련 모티프를 포함하고 있어도 된다. 예를 들어, 말단 절단 프래그먼트는, ILR 세포질 도메인의 250까지의 아미노산을 포함하여 이루어지거나, 또는 50∼200아미노산 혹은 80∼150아미노산이다.
IL-2R 베타쇄의 STAT 관련 모티프는, 티로신 잔기-510(티로신 잔기 510은, NCBI RefSeq: NP＿000869.1의 아미노산 번호 536이다)을 포함하여 이루어진다. 어느 실시형태에서는, STAT 관련 모티프는, 티로신 잔기 510과 티로신 잔기 510의 C말단측에 인접하는 4잔기, 즉, YLSLQ를 포함하여 이루어진다.
다른 STAT 관련 모티프도 알려져 있고, 예를 들어, IL-6의 YXXQ, 경우에 따라, YXPQ, IL-10의 YXXQ, IL-12의 YLPSNID, IL-2의 YLSLQ, YCTFP, YFFFH, IL-7의 YVTMS, IL-9의 YLPQE, 및 IL-4의 YKAFS 및 YKPFQ가 포함된다. 어느 STAT 시그널 전달 도메인도 사용 가능하고, 및/또는 ILR쇄에 도입할 수 있다.
어느 실시형태에서는, IL 수용체의 세포질 도메인에 더하여, 키메라 수용체 세포내 세그먼트는, IL 수용체 내에 존재하는 것 이외의 적어도 1개의 보완적 시그널 전달 도메인을 포함하여 이루어진다. 세포내 시그널 전달 도메인의 예에는, TCR 복합체 유래의 세포질 영역 및/또는 공자극 분자, 및 그와 같은 서열과 동일한 기능을 갖는 임의의 변이체가 포함된다. 다른 예로서는, 인용하는 것에 의해 본 명세서의 일부가 되는 Sadelain et al 2009의 표 2에 들어져 있는 세포질 시그널 전달 도메인이 포함된다.
본 개시는, IL 수용체의 세포질 도메인에 더하여, 1 이상, 예를 들어, 2 또는 3의 세포내 시그널 전달 도메인을 포함하여 이루어지는 세포내 세그먼트를 포함하여 이루어지는 키메라 수용체를 포함한다. 예를 들어, 키메라 수용체는, IL 수용체의 세포질 도메인 및 CD3제타의 세포내 시그널 전달 도메인을 포함하여 이루어진다. 예를 들어, 키메라 수용체는, IL 수용체의 세포질 도메인, CD3제타의 세포내 시그널 전달 도메인 및 CD28의 세포질 공자극 도메인을 포함하여 이루어진다.
어느 실시형태에서는, 키메라 수용체는, CD3제타 세포내 시그널 전달 도메인을 포함하여 이루어지는 세포내 세그먼트, 1 이상의 세포질 공자극 도메인을 포함하여 이루어지고, 여기에서, 상기 세포내 세그먼트는, JAK 결합 모티프, STAT5 및/또는 STAT3 관련 모티프를 포함하여 이루어진다.
본 개시의 키메라 수용체는, 막관통 도메인을 포함하여 이루어진다. 막관통 도메인은, 천연 폴리펩티드에서 유래해도 되고, 또는 인공적으로 설계되어도 된다. 천연 폴리펩티드 유래의 막관통 도메인은, 막결합 또는 막관통 단백질로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, T 세포 수용체 알파 또는 베타쇄, CD3제타쇄, CD28, CD3입실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, ICOS, CD154, 또는 GITR의 막관통 도메인이 사용 가능하다. 인공적으로 설계된 막관통 도메인은, 주로, 류신 및 발린 등의 소수성 잔기를 포함하여 이루어지는 폴리펩티드이다. 예를 들어, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 트리플렛이 합성 막관통 도메인의 각 말단에 보일 수 있다. 경우에 따라, 단쇄 올리고펩티드 링커 또는 폴리펩티드 링커, 예를 들어, 2∼10아미노산 길이의 링커를, 본 명세서에 기재된 막관통 도메인과 세포내 세그먼트 사이에 배치할 수 있다. 특히, 글리신-세린 연속 서열을 갖는 링커 서열이 사용 가능하다.
예를 들어, CD28(NCBI RefSeq: NP＿006130.1)의 아미노산 번호 153∼179의 서열의 어느 것을 갖는 막관통 도메인이 막관통 도메인으로서 사용할 수 있다.
본 개시의 키메라 수용체에서는, 스페이서 도메인을, 세포외 도메인과 막관통 도메인 사이, 또는 세포내 세그먼트와 막관통 도메인 사이에 배치할 수 있다. 스페이서 도메인은, 막관통 도메인을 세포외 도메인과 및/또는 막관통 도메인을 세포내 세그먼트와 연결하는 작용을 하는 어느 올리고펩티드 또는 폴리펩티드도 의미한다. 스페이서 도메인은, 300개까지의 아미노산, 예를 들어, 약 10∼100개의 아미노산, 또는 약 25∼50개의 아미노산을 포함하여 이루어진다.
스페이서 도메인은, 바람직하게는, 항원 결합 분자를 개재시킨 키메라 수용체의 항원과의 결합을 촉진하고, 또한, 세포에의 시그널 전달을 증강하는 서열을 갖는다. 결합을 촉진하는 것이 기대되는 아미노산의 예에는, 시스테인, 하전 아미노산, 및 잠재적 글리코실화 부위 내의 세린 및 트레오닌이 포함되고, 이들 아미노산은, 스페이서 도메인을 구성하는 아미노산으로서 사용할 수 있다.
어느 실시형태에서는, 스페이서 도메인은, CD8알파(NCBI RefSeq: NP＿001759.3)의 아미노산 번호 118∼178, 즉, CD8알파의 힌지 영역, CD8베타(GenBank: AAA35664.1)의 아미노산 번호 135∼195, CD4(NCBI RefSeq: NP＿000607.1)의 아미노산 번호 315∼396, CD28(NCBI RefSeq: NP＿006130.1)의 아미노산 번호 114∼152, 또는 그들의 일부를 포함하여 이루어지거나, 또는 그들로 이루어지는 폴리펩티드이다. 더욱이, 스페이서 도메인은 인공적 합성된 서열이어도 된다.
본 개시의 키메라 수용체는, 폴리머, 특히, 2량체를 형성하도록 설계할 수 있다. 예를 들어, 예를 들어 다이설파이드 결합을 개재시켜 키메라 수용체를 중합(2량체화)하기 위해서, 시스테인이 스페이서 도메인 및/또는 막관통 도메인에 삽입된다.
더욱이, 본 개시의 키메라 수용체에서는, 시그널 펩티드 서열을 N말단에 연결할 수 있다. 시그널 펩티드 서열은, 많은 분비 단백질 및 막단백질의 N말단에 존재하고, 15∼30아미노산 길이를 갖는다. 본 명세서에 기재된 세포내 도메인을 갖는 단백질 분자의 상당수는 막단백질이며, 시그널 펩티드 서열을 갖는다. 이와 같은 분비 단백질 및 막단백질에서 유래하는 시그널 펩티드는, 본 개시의 키메라 수용체의 시그널 펩티드로서 사용 가능하다. 어느 시그널 펩티드도 사용 가능하다. 예를 들어, 시그널 펩티드는, 온코스타틴 M 시그널 펩티드일 수 있다. 시그널 펩티드는, 인간 유래여도 되고, 또한, 비인간, 예를 들어, 곤충 세포 또는 바이러스 유래여도 된다. 어느 실시형태에서는, 시그널 펩티드는, 인간 시그널 펩티드이다.
본 개시는, 본 명세서에 기재된 키메라 수용체를 코딩하는 핵산을 제공한다. 키메라 수용체를 코딩하는 핵산은, 나타난 키메라 수용체의 아미노산 서열로부터 통상적 방법에 의해 용이하게 제작할 수 있다. 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은, 각 도메인의 아미노산 서열에 관한 전술한 NCBI RefSeq ID 또는 GenBank 수탁 번호로부터 취득할 수 있고, 표준적인 분자생물학적 및/또는 화학적 순서를 이용하여 본 개시의 핵산을 제작할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열에 기초하여 핵산을 합성할 수 있고, cDNA 라이브러리로부터 폴리메라제 연쇄 반응(PCR)을 이용하여 얻어진 DNA 프래그먼트를 조합하는 것에 의해 본 개시의 핵산을 제작할 수 있다.
본 개시의 핵산은, 적합한 프로모터의 제어하에서 발현되도록 다른 핵산에 연결할 수 있다. 프로모터의 예에는, 유전자 또는 작동 가능하게 연결된 구축물의 발현을 구성적으로 촉진하는 프로모터, 약물 등의(예를 들어, 테트라사이클린 또는 독소루비신)의 작용에 의해 유전자 또는 작동 가능하게 연결된 구축물의 발현을 유도하는 프로모터가 포함된다. 본 개시의 핵산은 또한, 핵산의 효율적인 전사를 얻기 위해서, 프로모터 또는 전사 개시 부위와 협동하는 다른 조절 엘리먼트, 예를 들어, 인핸서 서열 또는 터미네이터 서열을 포함하여 이루어지는 핵산과 연결할 수도 있다. 본 개시의 핵산에 더하여 핵산의 발현을 확인하기 위한 마커가 될 수 있는 유전자(예를 들어, 약제 내성 유전자, 리포터 효소를 코딩하는 유전자, 또는 형광 단백질을 코딩하는 유전자)를 짜넣어도 된다.
어느 실시형태에서는, 핵산은, 특정의 숙주에서의 발현을 위해서 코돈이 최적화된 핵산이다.
본 개시의 키메라 수용체를 발현하는 세포를 생산하기 위한 방법은, 본 명세서에 기재된 키메라 수용체를 코딩하는 핵산을 세포에 도입하는 공정을 포함한다. 이 공정은, ex vivo로 행해진다. 예를 들어, 세포를, 본 개시의 키메라 수용체를 발현하는 세포를 생산하도록 ex vivo로 본 개시의 핵산을 옮기는 바이러스 벡터 또는 비바이러스 벡터로 형질 전환할 수 있다.
본 개시의 방법에서는, 포유동물 유래의 세포, 예를 들어, 인간 세포, 또는 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 말, 또는 개 등의 비인간 포유동물 유래의 세포를 사용할 수 있다.
하나의 실시형태에서는, 포유동물은 인간이다.
본 개시에 의하면, 키메라 수용체, 상기 키메라 수용체를 코딩하는 핵산, 상기 키메라 수용체를 발현하는 세포, 및 해당 세포를 포함하여 이루어지는 조성물이 제공된다. 어느 실시형태에서는, 상기의 1 이상이 종양 항원 등의 항원을 표적으로 하는 양자 면역 유전자 요법의 분야에서, 및/또는 스크리닝 혹은 그 외의 인비트로(in vitro) 어세이에서 사용될 수 있다. 본 개시의 키메라 수용체를 세포에 도입하여, 예를 들어, 그 세포에 있어서 키메라 수용체의 발현량의 증강 또는 상승을 얻을 수 있다. 이와 같은 세포는, 표적 항원을 발현하는 세포에 대해서 세포 상해 활성을 발휘할 수 있다.
a) 포유동물로부터 면역 세포를 단리하는 것(경우에 따라, 상기 면역 세포는 T 세포이다);
b) 단리된 면역 세포(경우에 따라, T 세포)를, 본 명세서에 기재된 키메라 수용체를 코딩하는 핵산으로 트랜스펙트 또는 형질 도입하는 것; 및
c) 경우에 따라, 트랜스펙션 또는 형질 도입 후에 키메라 수용체 발현 세포(경우에 따라, 키메라 수용체 발현 T 세포)를 단리하고, 및/또는 확대 배양하는 것을 포함하여 이루어지는, 본 개시의 키메라 수용체를 발현하는 세포의 제작 방법이 제공된다.
일 실시태양에서는, 대상에의 재도입 전에, 자기 T 림프구 또는 자기 NK 세포, 자기 매크로파지를 엑스비보로 활성화 및/또는 증식시킨다. 일 실시태양에서는, T 림프구 또는 NK 세포는 동종이계 T 림프구 또는 동종이계 NK 세포이다. 일 실시태양에서는, 동종이계 T 림프구는, 내재성 T 세포 수용체의 발현이 저지되어 있는 또는 배제되어 있는 T 림프구이다. 일 실시태양에서는, 대상에의 도입 전에, 동종이계 T 림프구 또는 동종이계 NK 세포를 엑스비보로 활성화 및/또는 증식시킨다. 일 실시태양에서는, 키메라 수용체는, 레트로바이러스 형질 도입, 렌티바이러스 형질 도입, DNA 일렉트로포레이션 및 RNA 일렉트로포레이션, DNA 혹은 RNA 트랜스펙션 혹은 Gene editing에 의한 유전자 개변으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법에 의해, T 림프구 또는 NK 세포 또는 매크로파지에 도입된다.
본 개시의 방법에 있어서 사용하는 NK 세포는, 주요 조직 적합 항원 I 및/또는 II 분자를 결여하거나 거의 발현하지 않고, 막결합 IL-15 및 4-1BB 리간드(CDI37L)를 발현하도록 유전자 수식되어 있는 세포에 폭로하는 것에 의해 우선적으로 증식될 수 있다. 이와 같은 세포주는, K562[ATCC, CCL 243; Lozzio et al., Blood 45(3): 321-334 (1975); Klein et al., Int. J. Cancer 18: 421-431 (1976)] 및 윌름스 종양 세포주 HFWT[Fehniger T A, Caligiuri M A. Int Rev Immunol 20(3-4):503-534 (2001); Harada H, et al., Exp Hematol 32(7):614-621 (2004)], 자궁 내막 종양 세포주 HHUA, 흑색종 세포주 HMV-II, 간아종 세포주 HuH-6, 폐소세포암 세포주 Lu-130 및 Lu-134-A, 신경아종 세포주 NB 19 및 N1369, 정소 NEC 14 유래의 배성 암 세포주, 경암 세포주 TCO-2 및 골수 전이 신경아종 세포주 TNB1[Harada H., et al., Jpn. J. Cancer Res 93: 313-319 (2002)]를 포함하지만, 반드시 이들로 한정되지 않는다. 바람직하게는 사용하는 세포주는, K562 및 HFWT 세포주와 같이, MHC I 및 II 분자의 양자를 결여하거나 거의 발현하지 않는다. 고체 지지체를 세포주 대신에 사용할 수 있다. 이와 같은 지지체는, 바람직하게는 NK 세포와 결합하여, 초기 활성화 사상 및/또는 증식성 응답을 유발하거나 또는 이와 같은 작용을 갖는 분자의 결합이 가능하고, 그것에 의해 토대로서 작용하는 적어도 1개의 분자가 그 표면에 결합하고 있다. 지지체는, 그 표면에 CD137 리간드 단백질, CD137 항체, IL-15 단백질 또는 IL-15 수용체 항체가 결합하고 있어도 된다. 바람직하게는, 지지체는, 그 표면에 결합한 IL-15 수용체 항체 및 CD137 항체를 갖는다.
일 실시태양에서는, T 림프구 활성화를 포함하는 본 개시의 방법의 어느 것에 있어서도, T 림프구는, 항CD3/CD28, IL-2 및 피토헤마글루티닌으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 약제의 존재하에서 활성화할 수 있다. NK 세포 활성화를 포함하는 본 개시의 방법의 어느 것에 있어서도, NK 세포는, CD137 리간드 단백질, CD137 항체, IL-15 단백질, IL-15 수용체 항체, IL-2 단백질, IL-12 단백질, IL-21 단백질 및 K562 세포주로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 약제의 존재하에서 활성화할 수 있다.
본 개시의 방법에서 사용되는 세포는 특별히 한정되지 않고, 어느 세포도 사용 가능하다. 예를 들어, 체액, 조직 혹은 기관, 예를 들어, 혈액(말초혈, 제대혈 등) 혹은 골수로부터 채취, 단리, 혹은 정제된 세포, 또는 전술한 세포를 분화시키거나, 혹은 다능성 줄기세포(iPSC)를 제작하기 위해서 초기화하는 것에 의해 얻어진 세포가 사용 가능하다(예를 들어, Themeli et al 2013 참조). 말초혈 단핵세포(PBMC), 면역 세포［예를 들어, T 세포, 수상 세포, B 세포, 조혈 줄기세포, 매크로파지, 단구, NK 세포 또는 조혈 세포(호중구, 호염기구)를 포함한다］, 제대혈 단핵세포, 섬유아세포, 지방 세포 전구체, 간 세포, 피부 켈라티노사이트, 간엽 줄기세포, 지방 줄기세포, 여러 가지 암 세포주, 또는 신경 줄기세포가 사용 가능하다. 예를 들어, NK 세포 또는 T 세포, T 세포의 전구 세포(조혈 줄기세포, 림프구 전구 세포 등) 또는 그들을 함유하는 세포 집단이 사용 가능하다. T 세포의 예에는, CD8 양성 T 세포, CD4 양성 T 세포, 제어성 T 세포, 세포 상해성 T 세포, 및 종양 침윤 림프구가 포함된다. T 세포 및 T 세포의 전구 세포를 함유하는 세포 집단에는, PBMC가 포함된다. 전술한 세포는, 생체로부터 채취해도 되고, 생체로부터 채취한 세포의 확대 배양에 의해 얻어도 되고, 또는 세포주로서 수립해도 된다. 생산된 키메라 수용체 발현 세포 또는 생산된 키메라 수용체 발현 세포로부터 분화시킨 세포의 생체에의 이식이 바람직한 경우는, 그 생체 자체 또는 그 동종의 생체로부터 채취한 세포에 핵산을 도입할 수 있다.
폴리뉴클레오티드와 아울러, 본 개시는 또한 이와 같은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터(이와 같은 폴리뉴클레오티드가 키메라 수용체의 발현을 위한 적어도 1개의 조절 엘리먼트와 작동 가능하도록 결합하고 있는 벡터를 포함한다)도 제공한다. 본 개시의 유용한 벡터의 비한정적 예는, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터 및 렌티바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다.
하나의 특정의 태양에 있어서, 이와 같은 벡터는 또한 자살 유전자를 포함한다. 여기에서 사용하는 용어 자살 유전자는, 자살 유전자를 발현하는 세포를 죽음에 이르게 하는 유전자를 말한다. 자살 유전자는, 해당 유전자가 발현된 세포에 약제, 예를 들어, 의약에 대한 감수성을 부여하여, 해당 세포가 해당 약제와 접촉했을 때 또는 해당 약제에 폭로되었을 때에 세포를 죽음에 이르게 하는 유전자일 수 있다. 자살 유전자는 당 분야에서 알려지고(예를 들어, Suicide Gene Therapy: Methods and Reviews, Springer, Caroline J. (Cancer Research UK Centre for Cancer Therapeutics at the Institute of Cancer Research, Sutton, Surrey, UK), Humana Press, 2004 참조), 예를 들어, 단순 헤르페스 바이러스(HSV) 티미딘 키나제(TK) 유전자, 시토신 데아미나제, 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제, 나이트로 리덕타제 및 카스파제 8과 같은 카스파제를 포함한다.
본 개시의 키메라 수용체를 코딩하는 핵산은 벡터에 도입할 수 있고, 그 벡터를 세포에 도입할 수 있다. 예를 들어, 레트로바이러스 벡터(온코레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 및 위형 벡터를 포함한다), 아데노바이러스 벡터, 아데노 수반 바이러스(AAV) 벡터, 시미안 바이러스 벡터, 백시니어 바이러스 벡터 또는 센다이바이러스 벡터, 엡스타인-바 바이러스(EBV) 벡터, 및 HSV 벡터 등의 바이러스 벡터가 사용 가능하다. 예를 들어, 감염 세포 내에서 자기 복제하지 않도록 복제능을 결여하는 바이러스 벡터가 사용 가능하다.
더하여, 비바이러스 벡터도 또한, 본 개시에 있어서, WO96/10038, WO97/18185, WO97/25329, WO97/30170 및 WO97/31934(인용하는 것에 의해 본 명세서의 일부가 된다)에 기재되어 있는 바와 같이, 리포솜 또는 양이온 지질 등의 축합제와 조합하여 사용할 수 있다. 본 개시의 핵산은 또한, 인산 칼슘 형질 도입, DEAE-덱스트란, 일렉트로포레이션, 또는 입자 충격에 의해 세포에 도입할 수도 있다.
예를 들어, 레트로바이러스 벡터가 사용되는 경우, 본 개시의 방법은, LTR 서열에 기초하여 호적한 패키징 세포와 벡터에 의해 프로세싱되는 패키징 시그널 서열을 선택하는 것, 및 패키징 세포를 이용하여 레트로바이러스 입자를 제작하는 것에 의해 행할 수 있다. 패키징 세포의 예에는, PG13(ATCC CRL-10686), PA317(ATCC CRL-9078), GP＋E-86 및 GP＋envAm-12(미국 특허 제5,278,056호), 및 Psi-Crip[Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, vol. 85, pp. 6460-6464 (1988)]이 포함된다. 레트로바이러스 입자는 또한, 293 세포 또는 고트랜스펙션 효율을 갖는 293 T 세포를 이용하여 제작할 수도 있다. 레트로바이러스 및 레트로바이러스 벡터의 패키징에 사용 가능한 패키징 세포에 기초하여 생산된 많은 종류의 바이러스 벡터가, 많은 회사로부터 널리 시판되고 있다.
본 개시는 또한 상기 키메라 수용체를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 유용한 숙주 세포의 비한정적 예는, T 림프구 및 NK 세포를 포함하고, 이것은 자기여도 동종이계여도 된다(내재성 T 세포 수용체는 제거되어 있거나 또는 보지되어 있다). 어느 특정의 태양에 있어서, 숙주 세포는, 암을 갖는 환자로부터 단리된 자기 T 림프구이다. 하나의 특정의 태양에 있어서, 이와 같은 자기 T 림프구를 엑스비보로 활성화 및 증식한다.
본 개시의 키메라 수용체는, 당 분야에서 알려진 임의의 방법에 의해 숙주 세포에 도입할 수 있다. 특히 유용한 방법의 비한정적 예는, 레트로바이러스 형질 도입, 렌티바이러스 형질 도입 및 DNA 및 mRNA 일렉트로포레이션을 포함한다. 하기 실시예에 나타내는 바와 같이, mRNA 일렉트로포레이션은, T 림프구에 있어서의 본 개시의 키메라 수용체의 유효한 발현을 일으킨다. 레트로바이러스 형질 도입을 기재하는 참고 문헌의 예는, Anderson et al., 미국 특허 5,399,346호; Mann et al., Cell 33:153 (1983); Temin et al., U.S. Pat. No. 4,650,764; Temin et al., 미국 특허 5,124,263호; Dougherty et al.의 국제 특허 공개 WO95/07358호(1995년 3월 16일 공개); 및 Kuo et al., Blood 82:845 (1993)를 포함한다. 국제 특허 공개 WO95/07358호는, 초대 B 림프구의 고효율 형질 도입을 기재한다. 예를 들어, 사용할 수 있는 레트로바이러스 형질 도입 및 mRNA 일렉트로포레이션의 구체적 기술에 대해 또한 아래의 실시예의 장도 참조할 것.
숙주 세포 활성화 및 증식을 사용하여, 통상 바이러스 벡터의 게놈에의 짜넣기 및 본 개시의 키메라 수용체를 코딩하는 유전자의 발현을 가능하게 한다. 그렇지만, mRNA 일렉트로포레이션을 사용한다면, 활성화 및 증식은 필요없다(일렉트로포레이션은, 활성화 세포 상에서 실시할 때에 보다 유효하기는 하지만). 바이러스 형질 도입의 결과로서, 숙주 세포(T 림프구 또는 NKT 세포)는, 해당 수용체가 일과성으로(전형적으로 3∼5일) 발현되었을 때의 mRNA 일렉트로포레이션보다도 강한 효과를 일으킬 가능성을 갖고, 장기간 본 개시의 키메라 수용체를 발현한다. 그렇지만, 바이러스 형질 도입은 복잡하고, 고가이고, 실행이 곤란하지만, 한편 mRNA 일렉트로포레이션은 훨씬 단순하고, 실행이 훨씬 용이하다. 더욱이, 일과성 발현은, 독성의 가능성이 있다면 유용하고, 부작용의 가능성 때문에 임상 시험의 초기상에서 도움이 될 것이다.
하나의 측면은, 본 명세서에 기재된 핵산 또는 벡터로 세포를 트랜스펙트 또는 형질 도입하는 것을 포함하여 이루어지는, 본 명세서에 개시되는 세포의 제작 방법이다.
하나의 실시형태에서는, 단리되는 면역 세포는, 단리되는 T 세포이다.
어느 실시형태에서는, 단리되는 세포는 CD3＋이며, 경우에 따라, 형질 도입 또는 트랜스펙션 전에, 경우에 따라, 가용형 또는 막결합형의 항CD3 항체, 예를 들어, OKT3 또는 mOKT3, 및/또는 APC로 자극된다. 하나의 실시형태에서는, APC는 인공 APC(aAPC)이다. 다른 실시형태에서는, APC는, 막형의 항CD3 모노클로날 항체를 발현한다.
하나의 실시형태에서는, 트랜스펙션 또는 형질 도입 공정이 반복된다. 예를 들어, 트랜스펙션 또는 형질 도입 공정은, 2회, 또는 3회, 또는 4회, 또는 예를 들어, 충분한 발현 레벨이 달성될 때까지 행할 수 있다. 예를 들어, 트랜스펙션 또는 형질 도입 공정은, 5회 행할 수 있다.
하나의 실시형태에서는, 세포는, 연속 2일 이상 트랜스펙트 또는 형질 도입한다. 예를 들어, 세포는, 연속 2일, 연속 3일, 또는 연속 4일 트랜스펙트 또는 형질 도입한다.
하나의 실시형태에서는, 키메라 수용체 형질 도입 세포를, 소정의 항원을 발현하는 조사 세포로 자극한다. 예를 들어, 키메라 수용체 형질 도입 T 세포를 조사 세포로, 이펙터:표적비 100:1, 75:1, 50:1, 25:1, 20:1, 15:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:50 또는 1:100으로 자극한다. 바람직하게는, 1:1이다.
본 개시의 키메라 수용체를 발현하는 세포는, 본 명세서에 기재된 키메라 수용체를 코딩하는 핵산이 본 명세서에 기재된 생산 방법에 의해 도입 및 발현된 세포이다.
본 개시의 세포는, 키메라 수용체 및 항원 결합 분자를 개재시켜 특정의 항원과 결합하고, 그것에 의해, 시그널이 세포에 전달되어, 결과로서 세포가 활성화된다. 키메라 수용체를 발현하는 세포의 활성화는, 숙주 세포의 종류 및 키메라 수용체의 세포내 도메인에 따라서 상이하고, 지표로서, 예를 들어, 사이토카인의 방출, 세포 증식 속도의 향상, 또는 세포 표면 분자의 변화 등에 기초하여 확인할 수 있다. 예를 들어, 활성화 세포로부터의 세포 상해성 사이토카인(종양괴사 인자, 림포톡신 등의) 방출은, 항원을 발현하는 표적 세포의 파괴를 일으킨다. 더하여, 사이토카인의 방출 또는 세포 표면 분자의 변화는, 다른 면역 세포, 예를 들어, B 세포, 수상 세포, NK 세포, 및 매크로파지를 자극한다.
본 개시의 방법에 있어서 사용하는 T 림프구는, 가장 바람직하게는, 먼저 혈액 샘플로부터 단리되고, 바람직하게는 예를 들어, 항CD3/CD28 비즈, IL-2 또는 피토헤마글루티닌과 같은 표준법을 이용하여 엑스비보로 활성화 및 증식(예를 들어, 3∼5일)되어 있는, 환자의 자신의 세포(즉, 자기 세포)이다. 혹은, 동종이계 T 림프구를 사용할 수 있다(바람직하게는 내재성 T 세포 수용체의 발현이 저지되어 있는 또는 배제되어 있는 동종이계 T 림프구). Torikai et al., Blood, 2012 119: 5697-5705 참조. 단리(및 소망에 따라 활성화 및/또는 증식) 후, 환자로부터의 T 림프구 및 NK 세포에, 본 개시의 키메라 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(또는 그와 같은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터)를 형질 도입(또는 전기 천공)하고, 그렇게 해서, 키메라 수용체가 T 세포 또는 NK 세포의 세포 표면에 발현되도록 한다. 수식 세포를 그 후 환자에게 투여할 수 있다(예를 들어, 치료용 항체 점적 1일 후).
하나의 측면에서는, 질환을 치료하기 위한 본 명세서에 기재된 키메라 수용체 발현 세포, 핵산, 벡터, 세포 또는 조성물의 사용이 제공된다.
다른 측면은, 포유동물에 있어서 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 그것을 필요로 하는 포유동물에게 유효량의 본 명세서 개시에 개시되는 세포 또는 조성물을 투여하는 것을 포함하여 이루어지는 방법이다.
키메라 수용체를 발현한 세포를 유효 성분으로서 포함하여 이루어지는 의약 조성물은, 피내, 근육내, 피하, 복막내, 비강내, 동맥내, 정맥내, 종양내, 또는 수입 림프관에, 비경구 투여에 의해, 예를 들어, 주사 또는 주입에 의해 투여할 수 있지만, 투여 경로는 한정되지 않는다.
추가적인 측면에 있어서, 바이러스 벡터 등을 이용하여 본 개시의 키메라 수용체를 코딩하는 핵산을 생체 내에 짜넣어, 당해 키메라 수용체를 직접 발현시키는 방법을 들 수 있다. 바이러스 벡터로서, 아데노바이러스가 예시되지만 이것으로 한정되는 것은 아니다. 또한 바이러스 벡터를 이용하지 않고 일렉트로포레이션법이나 핵산을 직접 투여하는 수법 등에 의해 당해 키메라 수용체를 코딩하는 핵산을 직접 생체 내에 짜넣는 것도 가능하고, 당해 키메라 수용체를 분비 발현시키도록 유전자 개변한 세포를 생체에 투여함으로써, 당해 키메라 수용체를 계속적으로 생체 내에서 분비시키는 것도 가능하다.
본 개시에 의해, 환자는, 약 105(1E＋05)∼1010(1E＋10) 이상의 세포/체중 킬로그램(세포/Kg)의 범위의 치료상 유효 투여량의 본 개시의 키메라 수용체를 포함하는 T 세포 또는 NK 세포의 주입에 의해 처치될 수 있다. 주입은, 소망의 응답을 달성될 때까지, 환자가 내용성을 나타낼 수 있는 한, 가능한 한 빈번하게 또한 많은 횟수, 반복할 수 있다. 적절한 주입 용량 및 스케줄은 환자마다 상이할 것이지만, 특정의 환자에 대해 처치의가 결정될 수 있다. 전형적으로, 약 106(1E＋06)세포/Kg의 초회 투여량을 주입하고, 108(1E＋08) 이상의 세포/Kg까지 증가시킨다. IL-2를, 주입 세포를 주입 후 증식시키기 위해서 병용할 수 있다. IL-2의 양은, 약 1∼5×106(1∼5E＋06)국제 단위/체표면 평방미터일 수 있다.
의약 조성물은, 유효 성분으로서, 키메라 수용체를 발현하는 세포를 포함하여 이루어지고, 적합한 부형제를 추가로 포함하고 있어도 된다. 부형제의 예에는, 유효 성분으로서 본 개시의 핵산을 포함하여 이루어지는 조성물을 위한 전술한 약학상 허용 가능한 부형제, 여러 가지 세포 배양 배지, 및 등장성 염화 나트륨을 포함한다.
본 개시의 추가적인 면은 의약 조성물을 제공한다. 하나의 태양에 있어서, 본 개시는, (i) 본 개시의 키메라 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 그와 같은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 (ii) 약학적으로 허용되는 담체 또는 첨가물을 포함하는 의약 조성물을 제공한다.
본 개시의 의약 조성물로 사용하기 위한 적당한 첨가물은 당업자에게 주지이며, 예를 들어, 조직 배양 배지(예를 들어, 세포를 엑스비보로 생존시키기 위해) 또는 식염수 용액(예를 들어, 세포를 환자에게 주사할 때)을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 첨가물의 상세한 기재는, Remington＇s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub. Co., N.J. 1991)로부터 입수 가능하다.
본 발명의 의약 조성물이 투여되는 질환은, 그 질환이 이용한 요법에 감수성을 나타내는 한 특별히 한정되지 않는다. 하나의 실시형태에서는, 질환은 암이다. 하나의 실시형태에서는, 대상은, 암을 갖는 것이 의심되거나, 또는 암을 갖는다.
예를 들어, 암은, 혈액암 또는 고형 종양이다. 예를 들어, 혈액암은, 백혈병, 림프종 또는 골수종이다. 예를 들어, 고형 종양은, 선암, 편평상피암, 선편평상피암, 미분화암, 대세포암, 소세포암, 피부암, 유방암, 전립선암, 방광암, 질암, 경부암, 자궁암, 간장암, 신장암, 췌장암, 비장암, 폐암, 기관암, 기관지암, 결장암, 소장암, 위암, 식도암, 담낭암, 정소암, 난소암 등의 암이나, 골 조직, 연골 조직, 지방 조직, 근 조직, 혈관 조직 및 조혈 조직의 암 외에, 연골 육종, 유잉 육종, 악성 혈관 내피종, 악성 슈원종, 골육종, 연부 조직 육종 등의 육종이나, 간아종, 골수아종, 신아종, 신경아종, 췌아종, 흉막폐아종, 망막아종 등의 아종이나, 배세포 종양이다.
어느 실시형태에서는, 질환은, 염증성 질환/자기면역 질환(천식, 습진), 간염, 및 그 원인이 인플루엔자 및 HIV 등의 바이러스, 세균, 또는 진균인 감염성 질환, 예를 들어, 결핵, MRSA, VRE, 및 심재성 진균증이다. 하나의 실시형태에서는, 대상은, 이들 염증성 질환을 갖는 것이 의심되거나, 또는 염증성 질환을 갖는다.
전술한 질환의 치료를 위해서 저감 또는 제거되는 것이 바람직한 세포에 의해 프로세싱되는 항원, 즉, 종양 항원, 바이러스 항원, 또는 세균 항원 등과 결합하는 본 개시의 의약 조성물이, 이들 질환의 치료를 위해서 투여된다.
따라서, 하나의 측면은, 대상에 있어서 소정의 항원을 발현하는 세포의 수를 줄이는 방법으로서, 그것을 필요로 하는 대상에게 유효량의 본 명세서에 기재된 의약 조성물을 투여하는 것을 포함하여 이루어지는 방법을 포함하고, 여기에서, 키메라 수용체 발현 세포는 세포외 도메인과 결합하는 항원 결합 분자를 개재시켜 소정의 항원과 특이적으로 결합한다.
본 개시의 세포는 또한, 재발성 백혈병의 관해 등을 목적으로 한, 골수 이식 또는 방사선 폭로, 도너 림프구 수혈 후의 감염성 질환의 예방을 위해서 사용할 수 있다.
본 개시의 키메라 수용체는, 다양한 암 세포형에 대해서 어느 1개의 수용체를 사용하는 것을 가능하게 하는 T 세포 치료를 촉진한다. 종양이 이용하는 면역 도피 기구를 생각하면, 최종적으로 유리할 수 있는 전략이고, 동시에 다양한 항원의 타게팅도 가능하게 한다(Grupp et al., N. Engl. J. Med. 2013; 368(16):1509-1518). 항체 개재성 세포 독성은, 항체 투여의 단순한 중지에 의해, 언제라도 어느 때 이용하면 정지할 수 있다. 본 개시의 키메라 수용체를 발현하는 T 세포가, 표적 세포에 결합한 항체에 의해서만 활성화되기 때문에, 미결합 면역글로불린은, 주입된 T 세포 내에 아무런 자극을 발휘하지 않는다. 어떠한 가능성이 있는 자기면역성 반응성을 제한하기 위해서, 키메라 수용체를 일과성으로 발현하기 위한 mRNA 일렉트로포레이션의 사용에 의해 추가로 임상적 안전성을 높일 수 있다.
상기 방법의 하나의 태양에 있어서, T 림프구 또는 NK 세포는, 해당 대상으로부터 단리된 자기 T 세포 또는 NK 세포이다. 하나의 특정의 태양에 있어서, 대상에의 재도입 전에, 자기 T 세포 또는 NK 세포를 엑스비보로 활성화 및/또는 증식한다. 다른 태양에 있어서, T 세포 또는 NK 세포는 동종이계 T 림프구 또는 NK 세포이다. 어느 특정의 태양에 있어서, T 세포는 내재성 T 세포 수용체의 발현이 저지되어 있는 또는 배제되어 있는 동종이계 T 세포이다. 하나의 특정의 태양에 있어서, 대상에의 도입 전에, 동종이계 T 세포를 엑스비보로 활성화 및/또는 증식한다. T 림프구는, 예를 들어, 항CD3/CD28, IL-2 및/또는 피토헤마글루티닌의 존재하, 당 분야에서 알려진 임의의 방법에 의해 활성화할 수 있다. NK 세포는, 예를 들어, CD137 리간드 단백질, CD137 항체, IL-15 단백질, IL-15 수용체 항체, IL-2 단백질, IL-12 단백질, IL-21 단백질 및 K562 세포주로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1개 이상의 약제의 존재하, 당 분야에서 알려진 임의의 방법에 의해 활성화할 수 있다. 예를 들어, NK 세포를 증식하기 위한 유용한 방법의 기재에 대해 미국 특허 7,435,596호 및 8,026,097호를 참조할 것.
상기 방법의 하나의 태양에 있어서, 대상에의 T 세포 또는 NK 세포의 도입(또는 재도입)에 이어, PD-1/PD-L1 시그널 저해약 및/또는 VEGF 시그널 저해약의 치료 유효량을 대상에게 투여한다.
본 명세서에 기재하는 조성물 및 방법은, 화학요법, 수술, 방사선, 유전자 치료 등과 같은 암을 위한 다른 타입의 치료와 조합하여 이용할 수 있다. 이와 같은 치료는, 본 개시에 따르는 면역 요법과 동시에 또는 축차적으로(임의의 순서로) 적용할 수 있다.
추가적인 의약 조성물과 병용할 때, 각 의약 조성물의 적당한 치료상 유효한 투여량은, 상가적 또는 상승적 작용에 의해 감소시킬 수 있다.
본 개시의 처치를, 예를 들어, 치료용 백신(GVAX, DC 백신 등을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다), 체크포인트 저해제(CTLA4, PD1, LAG3, TIM3 등을 차단하는 의약 조성물을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다) 또는 액티베이터(41BB, OX40 등을 증강하는 의약 조성물을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다)와 같은, 다른 면역 조절 처치와 조합할 수 있다.
본 개시의 의약 조성물은 또한, 처치하는 특정의 적응증에 있어 필요하다면, 1개 이상의 부가적 활성 화합물, 바람직하게는 서로 악영향을 미치지 않는, 보완적 활성을 갖는 것도 포함할 수 있다. 가능한 부가적 활성 화합물의 비한정적 예는, 예를 들어, PD-1/PD-L1 시그널 저해약 및 VEGF 시그널 저해약을 포함한다.
다른 태양에 있어서, 본 개시의 의약 조성물은, 더욱이, 암 세포에 대한 세포 독성을 발휘할 수 있는 모노클로날 항체(예를 들어, 리툭시마브, 트라스투주마브, hu14.18K322A 등) 또는 Fc 부분을 포함하는 다른 항종양 분자(예를 들어, 면역글로불린의 Fc 부분 또는 Fc 함유 DNA 혹은 RNA와 조합하여 종양 표면 수용체에 결합한 리간드(예를 들어, 사이토카인, 면역 세포 수용체)로 이루어지는 혼성 분자)를 추가로 포함한다.
사용하는 항체의 적절한 투여량은, 처치하는 암의 타입, 질환의 중독도(重篤度) 및 경과, 앞의 치료, 환자의 임상력 및 항체에 대한 응답 및 처치의의 재량에 의한다. 항체를, 환자에게 한 번에 또는 일련의 복수 처치로 투여할 수 있다. 본 개시에 의한 치료의 진행은 종래의 기술 및 어세이에 의해 용이하게 모니터할 수 있다.
항체의 투여는, 전신 투여 및 질환의 부위에의(예를 들어, 초대 종양에의) 직접 투여를 포함하는, 임의의 적당한 경로에 의해 실시할 수 있다.
본 개시의 면역 요법과의 조합에 유용한 다른 치료제의 비한정적 예는 다음의 것을 포함한다.
(i) 항혈관형성제(예를 들어, TNP-470, 혈소판 인자 4, 트롬보스폰딘 1, 조직 메탈로프로테아제 저해 물질(TIMP1 및 TIMP2), 프로락틴(16Kd 프래그먼트), 안지오스타틴(플라스미노겐의 38Kd 프래그먼트), 엔도스타틴, bFGF 가용성 수용체, 트랜스포밍 증식 인자 베타, 인터페론 알파, 가용성 KDR 및 FLT-1 수용체, 태반의 프롤리페린 관련 단백질 및 Carmeliet 및 Jain(2000)에 기재된 것;
(ii) 항VEGF 항체, VEGF 배리언트, 가용성 VEGF 수용체 프래그먼트, VEGF 또는 VEGFR을 차단할 수 있는 앱타머, 중화 항VEGFR 항체, VEGFR 티로신 키나제의 저해제 및 이들의 임의의 조합과 같은 VEGF 안타고니스트 또는 VEGF 수용체 안타고니스트;
(iii) 예를 들어, 피리미딘 아날로그(5-플루오로우라실, 플록스우리신, 카페시타빈, 겜시타빈 및 시타라빈), 퓨린 아날로그, 엽산 안타고니스트 및 관련 저해제(머캅토퓨린, 티오구아닌, 펜토스타틴 및 2-클로로데옥시아데노신(클라드리빈))과 같은 화학요법 화합물; 빈카알칼로이드(빈블라스틴, 빈크리스틴 및 비노렐빈)와 같은 천연 산물, 탁세인(파클리탁셀, 도세탁셀), 빈크리스틴, 빈블라스틴, 노코다졸, 에포틸론류 및 나벨빈과 같은 미소관 교란 인자, 에피포도필로톡신(에토포시드, 테니포시드), DNA 상해제(액티노마이신, 암사크린, 안트라사이클린류, 블레오마이신, 부설판, 캄프토테신, 카보플라틴, 클로람부실, 시스플라틴, 사이클로포스파미드, 사이톡산, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 헥사메틸멜라민, 옥살리플라틴, 이포스파미드, 멜팔란, 메클로레타민, 마이토마이신, 미톡산트론, 나이트로소요소, 플리카마이신, 프로카바진, 탁솔, 탁소텔, 테니포시드, 트라이에틸렌싸이오포스포로아마이드 및 에토포시드(VP16))를 포함하는 항증식성/유사분열 저해제; 닥티노마이신(액티노마이신 D), 다우노루비신, 독소루비신(아드리아마이신), 이다루비신, 안트라사이클린류, 미톡산트론, 블레오마이신류, 플리카마이신(미트라마이신) 및 마이토마이신과 같은 항생 물질; 효소(L-아스파라긴을 전신성으로 대사하여, 자신의 아스파라긴을 합성하는 능력을 갖지 않는 세포를 제거하는 L-아스파라기나제); 항혈소판제; 질소 머스타드류(메클로레타민, 사이클로포스파미드 및 아날로그, 멜팔란, 클로람부실), 에틸렌이민류 및 메틸멜라민류(헥사메틸멜라민 및 티오테파), 알킬 설포네이트류-부설판, 나이트로소유레아류(카무스틴(BCNU) 및 아날로그, 스트렙토조신), 트라젠류-다카바진(DTIC)과 같은 항증식성/항유사분열 알킬화제; 엽산 아날로그(메토트렉세이트)와 같은 항증식성/항유사분열 대사 대항제; 백금 배위 착체류(시스플라틴, 카보플라틴), 프로카바진, 하이드록시요소, 미토탄, 아미노글루테티미드; 호르몬류, 호르몬 아날로그(에스트로겐, 타목시펜, 고세렐린, 비칼루타미드, 닐타미드) 및 아로마타제 저해제(레트로졸, 아나스트로졸); 항응혈제(헤파린, 합성 헤파린염류 및 다른 트롬빈 저해제); 섬유소용해성제(예를 들어 조직 플라스미노겐 활성화 인자, 스트렙토키나제 및 유로키나제), 아스피린, 다이피리다몰, 티클로피딘, 클로피도그렐, 압식시마브; 항유주제; 항분비제(브레펠딘); 면역 억제제(사이클로스포린, 타크로리무스(FK-506), 시롤리무스(라파마이신), 아자티오프린, 미코페놀산 모페틸); 항혈관형성 화합물(예를 들어, TNP-470, 게니스테인, 베바시주마브) 및 증식 인자 저해제(예를 들어, 섬유아세포 증식 인자(FGF) 저해제); 안기오텐신 수용체 블로커; 일산화 질소 도너; 안티센스 올리고뉴클레오티드; 항체(트라스토주마브); 세포 주기 저해제 및 분화 유도 인자(트레티노인); mTOR 저해제, 토포아이소메라제 저해제(독소루비신(아드리아마이신), 암사크린, 캄프토테신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 테니포시드, 에피루비신, 에토포시드, 이다루비신 및 미톡산트론, 토포테칸, 이리노테칸), 코르티코스테로이드(코르티존, 덱사메사존, 하이드로코르티존, 메틸프레드니졸론, 프레드니존 및 프레드니졸론); 증식 인자 시그널 형질 도입 키나제 저해제; 미토콘드리아 기능 부전 유도 인자 및 카스파제 액티베이터; 및 염색질 교란 인자.
추가적인 유용한 약제의 예에 대해서는 또한 Physician's Desk Reference, 59.sup.th edition, (2005), Thomson P D R, Montvale N.J.; Gennaro et al., Eds. Remington's The Science and Practice of Pharmacy 20.sup.th edition, (2000), Lippincott Williams and Wilkins, Baltimore Md.; Braunwald et al., Eds. Harrison's Principles of Internal Medicine, 15.sup.th edition, (2001), McGraw Hill, NY; Berkow et al., Eds. The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, (1992), Merck Research Laboratories, Rahway N.J를 참조할 것.
상기의 개시는 본 출원을 전반적으로 설명한다. 보다 완전한 이해는, 이하의 구체예를 참조하는 것에 의해 얻을 수 있다. 이들 예는 단지 예시를 위해서 기재되고, 본 출원의 범위를 한정하는 것은 아니다. 상황이 안성마춤인 것을 시사 또는 제시하면, 형태의 변화 및 등가물의 치환도 기도된다. 본 개시에서는 특정의 용어가 사용되고 있지만, 이와 같은 용어는 기술된 의미를 의도하고, 한정을 목적으로 하는 것은 아니다.
한편, 본 명세서에 있어서 인용된 모든 선행 기술 문헌은, 참조로서 본 명세서에 원용된다.
실시예
이하에 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세히 설명하지만, 이들 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
［실시예 1］ 면역 수용체의 세포외 도메인을 세포외 도메인에 갖는 키메라 수용체
면역 세포 표면 상에 있어 면역 세포의 활성화에 관여하는 면역 수용체에 대해 아고니스트 활성을 발휘하는 결합 도메인과, 표적 세포 상의 표적 항원에 대한 결합 도메인을 갖는 항원 결합 분자를 이용함으로써, 면역 수용체를 발현하고 있는 면역 세포와 표적 항원을 발현하고 있는 표적 세포가 항원 결합 분자에 의해 가교되어, 면역 세포가 활성화되는 것이 알려져 있다. 본 발명에서는, 면역 수용체에 대해 아고니스트 활성을 발휘하는 항원 결합 분자와, 당해 항원 결합 분자에 의해 인식되는 면역 수용체를 세포외 도메인에 갖는 키메라 수용체(Chimeric Receptor: 이하 「CR」이라고도 칭해진다)가 형질 도입된 면역 세포를 조합한 치료법을 고안했다(도 1).
구체적으로는, 당해 치료 방법은, 1) 면역 세포 표면 상에 있어 면역 세포의 활성화에 관여하는 면역 수용체에 대해 아고니스트 활성을 발휘하는 결합 도메인과, 치료를 필요로 하는 피험체 내의 표적 세포 상에 특이적 혹은 선택적으로 발현하는 표적 항원에 대한 결합 도메인을 갖는 항원 결합 분자를 1종류 또는 복수 종류 포함하는 제1 조성물을 투여하는 것, 2) 제1 조성물에 포함되는 항원 결합 분자가 결합 가능한 면역 수용체의 세포외 도메인을 세포외 도메인에 갖는 CR이 형질 도입된 면역 세포를 투여하는 것을 포함하고, 항원 결합 분자는 CR을 발현한 면역 세포와 표적 세포를 가교하여, CR 발현 세포를 활성화한다. 여기에서, 표적 항원의 종류를 변경하고 싶은 경우, 제1 조성물의 항원 결합 분자를 변경하는 것에 의해, 표적 항원의 종류를 변경할 수 있고, CR을 발현한 면역 세포를 다시 제작할 필요는 없다. 따라서, 이와 같은 CR 세포의 제작은, 표적 세포에 특이적 혹은 선택적으로 발현하는 항원을 직접적으로 인식하는 것과 같은 면역 세포의 제작보다도 범용성이 높아 유용하다.
더하여, 본 치료법에서는 항원 결합 분자에 의해, CR이 형질 전환된 면역 세포뿐만 아니라, 면역 수용체를 내재적으로 발현하는 내재성 면역 세포가 표적 항원 의존적으로 동시에 동원된다. 그 결과, CR이 형질 전환된 면역 세포가 활성화되는 것에 더하여, 내재성 면역 세포에 대해서도, 항원 결합 분자의 아고니스트 활성에 의해 활성화된다고 생각되어, 약효의 증강이 기대된다.
［실시예 2］ 이중 특이성 항체의 조제
(2-1) 호모 항체의 조제
표 1에서 나타내는 항체가 조제되었다. 중쇄 정상 영역은, Fcγ 수용체에의 결합을 저감하여, 2개의 중쇄가 헤테로회합화하도록 개변을 가하고 있다. 각 항체의 중쇄 및 경쇄의 염기 서열을 코딩하는 전장의 유전자는, PCR 등을 이용하여 당업자 공지의 방법으로 제작되었다. 얻어진 플라스미드 단편을 동물 세포 발현 벡터에 삽입하여, 중쇄 발현 벡터 및 경쇄 발현 벡터가 제작되었다. 얻어진 발현 벡터의 염기 서열은 당업자 공지의 방법으로 결정되었다. 제작한 플라스미드를 인간 태아 신장 암 세포 유래 FreeStyle293 세포(Invitrogen), 또는 Expi293 세포(Invitrogen)에, 일과성으로 도입되어, 항체의 발현이 행해졌다. 얻어진 배양 상청이 회수된 후, 0.22μm 필터(Millipore)를 통과시켜 배양 상청이 얻어졌다. 얻어진 배양 상청으로부터, rProtein A Sepharose(R) Fast Flow(GE 헬스케어·재팬) 또는 Protein G Sepharose(R) 4 Fast Flow(GE 헬스케어·재팬)가 이용되어 당업자 공지의 방법으로, 항체가 정제되었다. 정제 항체 농도는, 분광 광도계를 이용하여 280nm에서의 흡광도가 측정되고, 얻어진 값으로부터 PACE 등의 방법에 의해 산출된 흡광 계수를 이용하여 항체 농도가 산출되었다(Protein Science(1995) 4, 2411-2423).
한편, 본 명세서에 있어서의 항체는, 이하의 규칙에 따라 명명되고 있다;
(중쇄 가변 영역)-(중쇄 정상 영역)/(경쇄 가변 영역)-(경쇄 정상 영역)
예를 들어, H0000-F760nN17/GL4-k0a라고 하는 항체명이면, 중쇄 가변 영역은 H0000, 중쇄 정상 영역은 F760nN17, 경쇄 가변 영역은 GL4, 경쇄 정상 영역은 k0a인 것을 의미한다.
마찬가지로 항체의 가변 영역을 이하의 규칙에 따라 나타내는 경우가 있다;
(중쇄 가변 영역)/(경쇄 가변 영역)
Figure pct00001
(2-2) 이중 특이성 항체의 조제
실시예 2-1에서 조제된 항체를 이용하여, 정상 영역의 전하의 차이를 이용한 당업자 공지의 방법(Labrijn et al, Proc. Natl. Acad. Sci., (2013) 110, 5145)에 의해, 표 2에서 나타내는 이중 특이성 항체가 조제되었다.
반응 조건: PBS(pH7.4) 중, ［2-MEA(Sigma)］=25mM, 37℃, 90분.
한편, 본 명세서에 있어서의 이중 특이성 항체는, 이하의 규칙에 따라 명명되고 있다;
AA(제1 항원 중쇄)/XX(제1 항원 경쇄)//BB(제2 항원 중쇄)/YY(제2 항원 경쇄)
[표 2-1]
Figure pct00002
[표 2-2]
Figure pct00003
[표 2-3]
Figure pct00004
［실시예 3］ 세포외 도메인에 CD137의 세포외 도메인을 갖는 키메라 수용체 발현 세포의 활성화능의 평가
(3-1) 렌티바이러스 벡터의 구축
인간 CD137 세포외 도메인, 인간 CD8 힌지 및 막관통 도메인, 및 제3세대 키메라 항원 수용체 세포내 시그널 도메인(CD28-CD137-CD3제타)으로 이루어지는 키메라 수용체 CD137-CD8-CD28-CD137-CD3제타(도 2, CD137-CR1이라고 칭해진다)를 발현하는 렌티바이러스 벡터가 제작되었다. 렌티바이러스 벡터 골격으로서 pCDH-CMV-MCS-T2A-copGFP(System Bioscience)가 이용되었다. 도 3은, 벡터 구축물 및 5＇말단으로부터 3＇말단에의 프레임 단위의 구성 요소의 서열 순서의 개략도이다. 코돈 최적화된 인간 CD137의 세포외 도메인(Genbank NM001561.6, Leu24∼Gln186)에, 인간 CD8알파쇄의 힌지 영역 및 막관통 영역(Genbank NM001768.7, Phe128∼Asn210), 및 인간 CD28 분자(Genbank NM006139.4, Arg180∼Ser220), 인간 CD137 분자(Genbank NM001561.6, Arg209∼Leu255), 인간 CD3제타 분자(Genbank NM000734.4, Arg52∼Arg164)의 세포질 영역이 연결되었다. CD137-CR1(서열 번호 24)을 코딩하는 유전자는 당업자 기지의 방법에 따라 합성되었다. 이 서열을 pCDH-CMV-MCS-T2A-copGFP 벡터의 MCS로 라이게이트하여, CD137-CR1과 copGFP를 공발현하는 렌티바이러스 벡터가 구축되었다.
(3-2) NFAT-RE-luc2 Jurkat 세포에의 유전자 도입
CD137-CR1을 발현한 T 세포의 활성화능을, in vitro의 리포터 어세이에 의해 해석하기 위해, NFAT-RE-luc2 Jurkat 세포(Promega사)에 CD137-CR1-copGFP 벡터가 형질 도입되었다. 당해 세포는, 전사 인자 nuclear factor of activated T cells(NFAT) 응답 엘리먼트의 하류에 루시페라제 유전자가 삽입되어 있어, 루시페라제의 발광을 검출함으로써, NFAT 경로의 활성화를 정량화할 수 있다.
형질 도입은, 실시예 3-1에서 구축된 렌티바이러스 벡터를 이용하여, 렌티바이러스에 의한 방법으로 실시되었다. 구체적으로는 우선, Lenti-PacTM HIV Expression Packaging Kit(Genecopoeia)를 이용하여, 전술한 CD137-CR1-copGFP 벡터와, 패키징 플라스미드 믹스가 293Ta 세포주(Genecopoeia)에 트랜스펙션되어 CD137-CR1-copGFP 벡터가 도입된 렌티바이러스가 제작되었다. 트랜스펙션으로부터 48시간 후 내지 72시간 후에 상기 렌티바이러스를 함유하는 상청이 회수되고, Lenti-XTM concentrator(다카라 바이오)를 이용하여 농축되었다.
다음에, 회수된 렌티바이러스를 함유하는 상청과, 폴리브렌 용액(나카라이 테스크)을 NFAT-RE-luc2 Jurkat 세포에 첨가하고, 2000rpm으로 60분 원심함으로써, CD137-CR1-copGFP 벡터가 형질 도입된 NFAT-RE-luc2 Jurkat 세포(CD137-CR1-copGFP Jurkat 세포)가 얻어졌다. 또한, 실험의 음성 대상으로서, CD137-CR1을 라이게이트하지 않고 copGFP만 발현하는 pCDH-CMV-MCS-T2A-copGFP 벡터가 형질 도입된 NFAT-RE-luc2 Jurkat 세포가 동시에 제작되었다.
(3-3) CR 단백질 발현율의 확인
실시예 3-2에서 조제된 CD137-CR1-copGFP Jurkat 세포의 CD137-CR1의 표면 발현에 대해, CD137 항체(BioLegend사)로 염색하여 BD FACSAriaTM III 셀 소터(BD Biosciences)에 의해 해석되었다. 그 결과, 생세포 중 약 70%가 CD137-CR1을 발현하는 것이 확인되었다.
(3-4) 표적 항원이 GPC3인 경우의 CD137-CR1-copGFP Jurkat 세포의 활성화능의 평가
실시예 3-2에서 조제된 CD137-CR1-copGFP Jurkat 세포가, 종양 항원을 발현하는 종양 세포와 공배양되어, 종양 항원에 대한 항체와 항CD137 항체로 이루어지는 이중 특이성 항체가 존재하는 조건에 있어서의 Jurkat 세포의 활성화능이 해석되었다. 여기에서는, 모델의 종양 항원으로서 고형 암에 발현하는 인간 GPC3이 선택되고, 실시예 2-2에서 조제된, 항GPC3 항체와 항CD137 항체로 이루어지는 이중 특이성 항체(H0000-F760nN17/GL4-k0a//hCD137VH-F760mnP17/hCD137VL-k0)가 실험에 사용되었다.
인간 GPC3을 발현하는 종양 세포주는, 인간 간장암 세포주인 SK-HEP1(ATCC)에 인간 GPC3을 안정 발현시킨 SK-pca60 세포가 이용되었다. 우선, SK-pca60 세포가, 384웰 평저 플레이트(Corning)에 10μL/웰씩 파종되었다(1E＋04(1×104)세포/웰). 그 다음에, CD137-CR1-copGFP Jurkat 세포, 혹은 음성 대상으로서 키메라 수용체를 발현하지 않고 copGFP만 발현하는 NFAT-RE-luc2 Jurkat 세포가, 각각 5μL/웰씩 혼합되었다(1E＋04(1×104)세포/웰). 그 다음에, 각 농도로 조제된 이중 특이성 항체가 5μL/웰씩 첨가되었다(종농도 0, 16, 160, 1600, 16000ng/mL). 24시간 후에, Bio-GloTM Luciferase(Promega)를 이용하여 루시페라제 활성이 측정되었다. 루시페라제 활성은, EnVisionTM Xcite(Perkin Elmer)에 의해 측정되고, 그들의 결과를 도 4에 나타낸다.
그 결과, CD137-CR1-copGFP Jurkat 세포에서는, 이중 특이성 항체의 항체 농도 의존적인 활성화가 검출되었다. 한편, 키메라 수용체를 발현하지 않고 copGFP만 발현하는 NFAT-RE-luc2 Jurkat 세포는, 이중 특이성 항체 존재하에서도 활성화는 검출되지 않았다. 이것으로부터, CD137-CR1-copGFP-T 세포는 이중 특이성 항체 의존적으로 활성화하고, 종양 항원인 GPC3을 발현하는 세포에 대해서 세포 상해 활성을 발현하여, 항종양 효과를 유도하는 것이 시사되었다.
(3-5) 표적 항원이 GPRC5D인 경우의 CD137-CR1-copGFP Jurkat 세포의 활성화능의 평가
실시예 3-2에서 조제된 CD137-CR1-copGFP Jurkat 세포가, 종양 항원을 발현하는 종양 세포와 공배양되어, 종양 항원에 대한 항체와 항CD137 항체로 이루어지는 이중 특이성 항체가 존재하는 조건에 있어서의 Jurkat 세포의 활성화능이 해석되었다. 여기에서는, 모델의 종양 항원으로서 혈액 암에 발현하는 인간 GPRC5D가 선택되어, 실시예 2-2에서 조제된, 항GPRC5D 항체와 항CD137 항체로 이루어지는 이중 특이성 항체 2종(GPA0018H-F760mnN17/GPA0018L-k0C//hCD137VH-F760mnP17/hCD137VL-k0, 또는 GPA0039H-F760mnN17/GPA0039L-k0C//hCD137VH-F760mnP17/hCD137VL-k0)이 실험에 사용되었다.
인간 GPRC5D를 발현하는 종양 세포주는, 인간 형질 세포종 유래의 NCI-H929(ATCC)가 이용되었다. 우선, NCI-H929 세포가, 384웰 평저 플레이트(Corning)에 10μL/웰씩 파종되었다(1E＋04(1×104)세포/웰). 그 다음에, CD137-CR1-copGFP Jurkat 세포, 혹은 음성 대상으로서 키메라 수용체를 발현하지 않고 copGFP만 발현하는 NFAT-RE-luc2 Jurkat 세포가, 각각 5μL/웰씩 혼합되었다(1E＋04(1×104)세포/웰). 그 다음에, 이중 특이성 항체가 종농도 0 또는 10μg/mL로 5μL/웰씩 첨가되었다. 24시간 후에, Bio-Glo Luciferase(Promega)를 이용하여 루시페라제 활성이 측정되었다. 루시페라제 활성은, EnVisionTM Xcite(Perkin Elmer)에 의해 측정되어, 그들의 결과를 도 5에 나타낸다.
그 결과, CD137-CR1-copGFP Jurkat 세포에서는, 이중 특이성 항체 존재하에서만 활성화가 검출되었다. 한편, 키메라 수용체를 발현하지 않고 copGFP만 발현하는 NFAT-RE-luc2 Jurkat 세포는, 이중 특이성 항체 존재하에서도 활성화는 검출되지 않았다. 이것으로부터, CD137-CR1-copGFP-T 세포는 이중 특이성 항체 의존적으로 활성화되어, 종양 항원인 GPRC5D를 발현하는 세포에 대해서 세포 상해 활성을 발현하여, 항종양 효과를 유도하는 것이 시사되었다.
(3-6) 표적 항원이 IL-6R인 경우의 CD137-CR1-copGFP Jurkat 세포의 활성화능의 평가
실시예 3-2에서 조제된 CD137-CR1-copGFP Jurkat 세포가, 표적 항원을 발현하는 표적 세포와 공배양되고, 표적 항원에 대한 항체와 항CD137 항체로 이루어지는 이중 특이성 항체가 존재하는 조건에 있어서의 Jurkat 세포의 활성화능이 해석되었다. 여기에서는, 모델의 표적 항원으로서 인간 IL-6R이 선택되고, 실시예 2-2에서 조제된, 항IL-6R 항체와 항CD137 항체로 이루어지는 이중 특이성 항체(MRAH.v1-F760mnN17/MRAL.v1-k0.v1//hCD137VH-F760mnP17/hCD137VL-k0)가 실험에 사용되었다.
인간 IL-6R을 발현하는 표적 세포주는, CHO 세포에 인간 IL-6R 전장을 안정 발현시킨 Z8AGBA-01-C26-CN-006 세포(IL-6R-CHO 세포)가 이용되었다. 우선, IL-6R-CHO 세포가, 384웰 평저 플레이트(Corning)에 10μL/웰씩 파종되었다(1E＋04(1×104)세포/웰). 그 다음에, CD137-CR1-copGFP Jurkat 세포, 혹은 음성 대상으로서 키메라 수용체를 발현하지 않고 copGFP만 발현하는 NFAT-RE-luc2 Jurkat 세포가, 각각 5μL/웰씩 혼합되었다(1E＋04(1×104)세포/웰). 그 다음에, 이중 특이성 항체가 종농도 0 또는 10μg/mL로 5μL/웰씩 첨가되었다. 24시간 후에, Bio-GloTM Luciferase(Promega)를 이용하여 루시페라제 활성이 측정되었다. 루시페라제 활성은, EnVisionTM Xcite(Perkin Elmer)에 의해 측정되고, 그들의 결과를 도 6에 나타낸다.
그 결과, CD137-CR1-copGFP Jurkat 세포에서는, 이중 특이성 항체 존재하에서만 활성화가 검출되었다. 한편, 키메라 수용체를 발현하지 않고 copGFP만 발현하는 NFAT-RE-luc2 Jurkat 세포는, 이중 특이성 항체 존재하에서도 활성화는 검출되지 않았다. 이것으로부터, CD137-CR1-copGFP-T 세포는 이중 특이성 항체 의존적으로 활성화되어, 표적 항원인 IL-6R을 발현하는 세포에 대해서 세포 상해 활성을 발현하는 것이 시사되었다.
［실시예 4］ 세포외 영역에 CD137을 갖는 키메라 수용체 발현 세포의 in vitro 세포 상해 활성의 평가
(4-1) 레트로바이러스 벡터의 구축
CD137-CR1을 발현하는 키메라 수용체의 레트로바이러스 벡터가 제작되었다. 레트로바이러스 벡터 골격으로서 pMSGV1(Tamada k et al., Clin Cancer Res 18:6436-6445(2012))을 이용했다. 도 7은, 벡터 구축물 및 5'말단으로부터 3'말단으로의 프레임 단위의 구성 요소의 배치 순서의 개략도이다. CD137-CR1에, F2A 펩티드(foot and mouth disease virus 유래)와 eGFP 분자(뉴클레오티드 서열 5521∼6237bp, Genebank KF957646.1)가 연결되었다. 유전자는 당업자 기지의 방법에 의해 합성되고, pMSGV1로 라이게이트하여, CD137-CR1-eGFP 레트로바이러스 벡터가 생성되었다.
(4-2) CD137-CR1-eGFP 발현 T 세포의 제작
인간 T 세포의 레트로바이러스 형질 도입 방법을 이용하여, 실시예 4-1에서 구축된 레트로바이러스 벡터를 이용하여, CD137-CR1-eGFP를 발현하는 유전자 개변 T 세포가 제작되었다.
구체적으로는, 우선 Lipofectamine(R) 2000 또는 3000(서모 피셔 사이언티픽)에 의해, 전술한 CD137-CR1-eGFP 벡터와 pAmpho 플라스미드(다카라 바이오)가 GP2-293 패키징 세포주(다카라 바이오)에 트랜스펙션되어, CD137-CR1-eGFP 벡터가 도입된 레트로바이러스가 제작되었다. 트랜스펙션으로부터 48시간 후에 상기 레트로바이러스를 함유하는 상청이 회수되어, 2매의 24웰 플레이트에 흡착된 형질 도입용 플레이트가 제작되었다.
다음에, 인간 T 세포의 형질 도입을 위해서, 1웰당 2E＋06개의 인간 말초혈단핵구가, 항CD3 모노클로날 항체 및 레트로넥틴(등록상표: 다카라 바이오)이 고상화된 6웰 플레이트 상에서 IL-2 존재하에서 72시간 배양되었다. 배양 후 세포가 회수되고, IL-2 존재하에 있어서 전술에서 제작된 CD137-CR1-eGFP 레트로바이러스가 흡착된 형질 도입용 플레이트 상에서 하룻밤 배양된 후, 다음날 세포가 다른 1매의 형질 도입용 플레이트에 옮겨져 추가로 하룻밤 배양되어, CD137-CR1-eGFP 벡터가 도입된 인간 T 세포(CD137-CR1-eGFP 발현 T 세포)가 얻어졌다.
(4-3) CR 단백질 발현율의 확인
형질 도입 후, 세포는 인간 IL-2의 존재하에서 유지되고, 형질 도입된 말초혈 단핵구의 배양 개시부터 7∼8일 후에 실험에 사용되었다. 형질 도입 인간 T 세포에서의 CD137-CR1-eGFP의 표면 발현은, 세포를 항CD3 항체, 항CD8 항체, 및 항CD137 항체로 염색된 후에 플로 사이토메트리에 의해 결정되었다. 평균하면, 전 T 세포의 80%가 CD137-CR1-eGFP를 발현했다.
(4-4) 잔존 종양 세포수를 지표로 한 CD137-CR1-eGFP 발현 T 세포의 세포 상해 활성의 평가
실시예 4-2에서 제작된 CD137-CR1-eGFP 발현 T 세포의 세포 상해 활성은CytoFLEX(Beckman Coulter)로 평가되었다. SK-Hep1이 음성 대상으로서, 및 SK-Hep1에 인간 GPC3을 안정 발현시킨 SK-pca60이 표적 세포로서 준비되었다. 음성 대상 및 표적 세포는 6well plate에 1E＋05(1×105)cells로 파종되었다. CD137-CR1-eGFP 발현 세포를 이펙터 세포로서 이펙터 세포 대 표적 세포(E:T)의 비율이 1:1이 되도록 1E＋05cells로 혼합되었다. 다음에 실시예 2-2에서 조제된, 항GPC3 항체와 항CD137 항체로 이루어지는 이중 특이성 항체(H0000-F760mnN17/GL4-k0a//hCD137VH-F760mnP17/hCD137VL-k0)는 1well당 10μg으로 첨가되었다. 또한, 음성 대상으로서, 제1 또는 제2의 팔을 항Keyhole limpet hemocyanin(KLH) 항체로 치환한 이중 특이성 항체(IC17HdK-F760mnN17/IC17L-k0//hCD137VH-F760mnP17/hCD137VL-k0 또는 IC17HdK-F760mnN17/IC17L-k0//H0000-F760mnP17/GL4-k0a)가, 1well당 10μg으로 첨가되었다. 첨가로부터 48시간 후에 CD137-CR1-eGFP 발현 T 세포 및 표적 세포가 회수되었다. 회수된 세포는 Zombie AquaTM Fixable Viability Kit(BioLegend, 423104)를 이용하여 사(死)세포가 염색되고, 항인간 CD45 항체(BioLegend, 304039)를 이용하여 T 세포가 염색되었다.
세포 상해 활성은 잔존 암 세포수로 평가되었다. 잔존 암 세포수는, 공배양 후의 세포수 및 생세포 중의 CD45 음성 획분의 세포의 비율로부터 산출되었다.
그들의 결과를 도 8a에 나타낸다. 표적 세포가 SK-pca60이며, 항GPC3 항체와 항CD137 항체로 이루어지는 이중 특이성 항체를 첨가한 조건에서만, 잔존 종양 세포수가 현저하게 저하되었다.
이 결과로부터, in vitro에 있어서의 CD137-CR1-eGFP 발현 T 세포의 첨가 항체 의존적인 표적 세포에의 세포 상해 활성이 나타났다.
(4-5) xCELLigence 시스템을 이용한 CD137-CR1-eGFP 발현 T 세포의 세포 상해 활성의 평가
실시예 4-2에서 제작된 CD137-CR1-eGFP 발현 T 세포의 세포 상해 활성은 xCELLigence(Agilent technology)에 의해서도 평가되었다. SK-Hep1은 음성 대상으로서, 및 SK-Hep1에 인간 GPC3을 안정 발현시킨 SK-pca60이 표적 세포로서 준비되었다. 음성 대상 및 표적 세포는 E-Plate 96에 1E＋04(1×104)cells로 전날에 파종되었다. 다음날, CD137-CR1-eGFP 발현 세포를 이펙터 세포로 하여, 이펙터 세포 대 표적 세포(E:T)의 비율이 1:1, 1:3이 되도록 1E＋04(1×104), 3E＋04(3×104)cells로 혼합되었다. 다음에 실시예 2-2에서 조제된, 항GPC3 항체와 항CD137 항체로 이루어지는 이중 특이성 항체(H0000-F760mnN17/GL4-k0a//hCD137VH-F760mnP17/hCD137VL-k0)는 1well당 종농도 10μg/mL가 되도록 첨가되었다. 전기 저항치를 경시적으로 측정하는 것에 의해, CD137-CR1-eGFP 발현 세포의 세포 상해 활성을 리얼타임으로 모니터링했다.
세포 증식 저해 활성은 이하의 식으로 계산되었다. 세포 증식 저해 활성(%)=100x(A-B)/(A-1)(A: 항체 없음의 웰의 Delta Cell Index의 평균치, B: 검체의 Delta Cell Index) 그들의 결과를 도 8b에 나타낸다. 표적 세포가 SK-pca60이며, 항GPC3 항체와 항CD137 항체로 이루어지는 이중 특이성 항체를 첨가한 조건에서만, 세포 증식 저해 활성이 현저하게 인정되었다.
이 결과로부터, in vitro에 있어서의 CD137-CR1-eGFP 발현 T 세포의 첨가 항체 의존적인 표적 세포에의 세포 상해 활성이 나타났다.
［실시예 5］ 리간드와의 결합능을 감약시킨 면역 수용체를 세포외 도메인에 갖는 키메라 수용체
면역 수용체의 세포외 전장을 갖는 키메라 수용체가 형질 전환된 면역 세포는, 당해 면역 수용체에 대한 리간드와의 결합에 의해, 표적 항원 비의존적으로 활성화될 수 있다(도 9). 이것은, 표적이 아닌 세포의 상해를 야기하기 때문에, 문제가 된다. 이 과제를 해결하기 위해, 세포외 도메인의 면역 수용체를 인위적으로 개변하여, 리간드와의 결합능을 감약시키는 것이 생각되었다.
［실시예 6］ 세포외 도메인에 CD137 단편을 갖는 키메라 수용체 발현 세포의 활성화능의 평가
(6-1) trCD137-CR을 발현하는 렌티바이러스 벡터의 구축
인간 CD137의 세포외 도메인은, 시스테인 리치 도메인(CRD) 1∼4로 구성되고, 리간드인 CD137L과의 결합에는, CRD2 및 CRD3이 중요한 역할을 하는 것이 알려져 있다. 그래서, CD137L과의 결합을 감약시킨 개변 CR로서, 인간 CD137 세포외 도메인의 CRD3 및 CRD4를 결실시킨 trCD137-CR(서열 번호 25)가 제작되었다. 구체적으로는, 코돈 최적화된 인간 CD137 세포외 도메인의 CRD1 및 CRD2(Genbank NM001561.6, Leu24∼Asp87)에, 인간 CD8알파쇄의 힌지 영역 및 막관통 영역(Genbank NM001768.7, Phe128∼Asn210), 및 인간 CD28 분자(Genbank NM006139.4, Arg180∼Ser220), 인간 CD137 분자(Genbank NM001561.6, Arg209∼Leu255), 인간 CD3제타 분자(Genbank NM000734.4, Arg52∼Arg164)의 세포질 영역이 연결되었다(도 2). trCD137-CR을 코딩하는 유전자는 당업자 기지의 방법에 의해 합성되었다. 이 서열을 pCDH-CMV-MCS-T2A-copGFP 벡터의 MCS로 라이게이트하여, trCD137-CR과 copGFP를 공발현하는 렌티바이러스 벡터가 구축되었다.
(6-2) NFAT-RE-luc2 Jurkat 세포에의 유전자 도입
trCD137-CR-T의 활성화능을, in vitro의 리포터 어세이에 의해 해석하기 위해, NFAT-RE-luc2 Jurkat 세포(Promega사)에 trCD137-CR 벡터가 형질 도입되었다.
형질 도입은, 실시예 6-1에서 구축된 렌티바이러스 벡터를 이용하여, 렌티바이러스에 의한 방법으로 실시되었다. 구체적으로는 우선, Lenti-PacTM HIV Expression Packaging Kit(Genecopoeia)를 이용하여, 전술한 trCD137-CR 벡터와, 패키징 플라스미드 믹스가 293Ta 세포주(Genecopoeia)에 트랜스펙션되어, trCD137-CR-copGFP 벡터가 도입된 렌티바이러스가 제작되었다. 트랜스펙션으로부터 48시간 후 내지 72시간 후에 상기 렌티바이러스를 함유하는 상청이 회수되고, Lenti-XTMconcentrator(다카라 바이오)를 이용하여 농축되었다.
다음에, 회수된 렌티바이러스를 함유하는 상청과, 폴리브렌 용액(나카라이 테스크)을 NFAT-RE-luc2 Jurkat 세포에 첨가하고, 2000rpm으로 60분 원심함으로써, trCD137-CR-copGFP 벡터가 형질 도입된 NFAT-RE-luc2 Jurkat 세포(trCD137-CR-copGFP Jurkat 세포)가 얻어졌다. 또한, 실험의 음성 대상으로서, trCD137-CR을 라이게이트하지 않고 copGFP만 발현하는 pCDH-CMV-MCS-T2A-copGFP 벡터가 형질 도입된 NFAT-RE-luc2 Jurkat 세포가 동시에 제작되었다.
(6-3) CR 단백질 발현율의 확인
실시예 6-2에서 조제된 trCD137-CR-copGFP Jurkat 세포의 trCD137-CR의 표면 발현에 대해, CD137 항체(BioLegend사)로 염색하여 BD FACSAriaTM III 셀 소터(BD Biosciences)에 의해 해석되었다. 해석에 이용한 항체의 에피토프는, 주로 CD137의 CRD2인 것이 알려져 있다. 해석의 결과, 생세포 중 약 60%가 trCD137-CR을 발현하는 것이 확인되었다.
(6-4) 리포터 어세이에 의한 trCD137-CR-copGFP Jurkat 세포의 활성화능의 평가
실시예 5-2에서 조제된 trCD137-CR-copGFP Jurkat 세포가, 종양 항원을 발현하는 종양 세포와 공배양되어, 종양 항원에 대한 항체와 항CD137 항체로 이루어지는 이중 특이성 항체가 존재하는 조건에 있어서의 Jurkat 세포의 활성화능이 해석되었다. 여기에서는, 모델의 종양 항원으로서 인간 GPC3이 선택되어, 실시예 2-2에서 조제된, 항GPC3 항체와 항CD137 항체로 이루어지는 이중 특이성 항체(H0000-F760nN17/GL4-k0a//hCD137VH-F760mnP17/hCD137VL-k0)가 실험에 사용되었다.
인간 GPC3을 발현하는 종양 세포주는, 인간 간장암 세포주인 SK-HEP1(ATCC)에 인간 GPC3을 안정 발현시킨 SK-pca60 세포가 이용되었다. 우선, SK-pca60 세포가, 384웰 평저 플레이트(Corning)에 10μL/웰씩 파종되었다(1E＋04(1×104)세포/웰). 그 다음에, trCD137-CR-copGFP Jurkat 세포, 혹은 음성 대상으로서 키메라 수용체를 발현하지 않고 copGFP만 발현하는 NFAT-RE-luc2 Jurkat 세포가, 각각 5μL/웰씩 혼합되었다(1E＋04(1×104)세포/웰). 그 다음에, 각 농도에 조제된 이중 특이성 항체가 5μL/웰씩 첨가되었다(종농도 0, 16, 160, 1600, 16000ng/mL). 24시간 후에, Bio-Glo Luciferase(Promega)를 이용하여 루시페라제 활성이 측정되었다. 루시페라제 활성은, EnVisionTM Xcite(Perkin Elmer)에 의해 측정되고, 그들의 결과를 도 10에 나타낸다.
그 결과, trCD137-CR-copGFP Jurkat 세포에서는, 이중 특이성 항체의 항체 농도 의존적인 활성화가 검출되었다. 한편, 키메라 수용체를 발현하지 않고 copGFP만 발현하는 NFAT-RE-luc2 Jurkat 세포는, 이중 특이성 항체 존재하에서도 활성화는 검출되지 않았다. 이것으로부터, trCD137-CR-copGFP-T 세포는 이중 특이성 항체 의존적으로 활성화되어, 종양 항원을 발현하는 세포에 대해서 세포 상해 활성을 발현하여, 항종양 효과를 유도하는 것이 시사되었다.
［실시예 7］ 세포외 도메인에 CD137 개변체를 갖는 키메라 수용체 발현 세포의 활성화능의 평가
(7-1) 렌티바이러스 벡터의 구축
인간 CD137의 CRD2 상의, I64 혹은 V71을 Arg로 변이시킨 변이체는, 모두 CD137L과의 결합이 감약되는 것이 알려져 있다. 그래서, CD137L과의 결합을 감약시킨 개변 CR로서, I64 및 V71을 Arg로 변이시킨 개변 인간 CD137 세포외 도메인에, 인간 CD8알파쇄의 힌지 영역 및 막관통 영역(Genbank NM001768.7, Phe128∼Asn210), 및 인간 CD28 분자(Genbank NM006139.4, Arg180∼Ser220), 인간 CD137 분자(Genbank NM001561.6, Arg209∼Leu255), 인간 CD3제타 분자(Genbank NM000734.4, Arg52∼Arg164)의 세포질 영역이 연결된, CD137-CR2(서열 번호 26)가 제작되었다(도 2). CD137-CR2를 코딩하는 유전자는 당업자 기지의 방법에 의해 합성되었다. 이 서열을 pCDH-CMV-MCS-T2A-copGFP 벡터의 MCS로 라이게이트하여, CD137-CR2와 copGFP를 공발현하는 렌티바이러스 벡터가 구축되었다.
(7-2) NFAT-RE-luc2 Jurkat 세포에의 유전자 도입
CD137-CR2-T의 활성화능을, in vitro의 리포터 어세이에 의해 해석하기 위해, NFAT-RE-luc2 Jurkat 세포(Promega사)에 CD137-CR2 벡터가 형질 도입되었다.
형질 도입은, 실시예 7-1에서 구축된 렌티바이러스 벡터를 이용하여, 렌티바이러스에 의한 방법으로 실시되었다. 구체적으로는 우선, Lenti-PacTM HIV Expression Packaging Kit(Genecopoeia)를 이용하여, 전술한 CD137-CR2 벡터와, 패키징 플라스미드 믹스가 293Ta 세포주(Genecopoeia)에 트랜스펙션되어, CD137-CR2-copGFP 벡터가 도입된 렌티바이러스가 제작되었다. 트랜스펙션으로부터 48시간 후 내지 72시간 후에 상기 렌티바이러스를 함유하는 상청이 회수되어, Lenti-XTMconcentrator(다카라 바이오)를 이용하여 농축되었다.
다음에, 회수된 렌티바이러스를 함유하는 상청과, 폴리브렌 용액(나카라이 테스크)을 NFAT-RE-luc2 Jurkat 세포에 첨가하고, 2000rpm으로 60분 원심함으로써, CD137-CR2-copGFP 벡터가 형질 도입된 NFAT-RE-luc2 Jurkat 세포(CD137-CR2-copGFP Jurkat 세포)가 얻어졌다. 또한, 실험의 음성 대상으로서, CD137-CR2를 라이게이트하지 않고 copGFP만 발현하는 pCDH-CMV-MCS-T2A-copGFP 벡터가 형질 도입된 NFAT-RE-luc2 Jurkat 세포가 동시에 제작되었다.
(7-3) CR 단백질 발현율의 확인
실시예 7-2에서 조제된 CD137-CR2-copGFP Jurkat 세포의 CD137-CR2의 표면 발현에 대해, CD137 항체(BioLegend사)로 염색하여 FACSAriaTM III 셀 소터(BD Biosciences)에 의해 해석되었다. 그 결과, 생세포 중 95% 이상이 CD137-CR2를 발현하는 것이 확인되었다.
(7-4) 리포터 어세이에 의한 CD137-CR2-copGFP Jurkat 세포의 활성화능의 평가
실시예 7-2에서 조제된 CD137-CR2-copGFP Jurkat 세포가, 종양 항원을 발현하는 종양 세포와 공배양되어, 종양 항원에 대한 항체와 항CD137 항체로 이루어지는 이중 특이성 항체가 존재하는 조건에 있어서의 Jurkat 세포의 활성화능이 해석되었다. 여기에서는, 모델의 종양 항원으로서 인간 GPC3이 선택되고, 실시예 2-2에서 조제된, 항GPC3 항체와 항CD137 항체로 이루어지는 이중 특이성 항체(H0000-F760nN17/GL4-k0a//hCD137VH-F760mnP17/hCD137VL-k0)가 실험에 사용되었다.
인간 GPC3을 발현하는 종양 세포주는, 인간 간장암 세포주인 SK-HEP1(ATCC)에 인간 GPC3을 안정 발현시킨 SK-pca60 세포가 이용되었다. 우선, SK-pca60 세포가, 384웰 평저 플레이트(Corning)에 10μL/웰씩 파종되었다(1E＋04(1×104)세포/웰). 그 다음에, CD137-CR2-copGFP Jurkat 세포, 혹은 음성 대상으로서 키메라 수용체를 발현하지 않고 copGFP만 발현하는 NFAT-RE-luc2 Jurkat 세포가, 각각 5μL/웰씩 혼합되었다(1E＋04(1×104)세포/웰). 그 다음에, 각 농도에 조제된 이중 특이성 항체가 5μL/웰씩 첨가되었다(종농도 0, 16, 160, 1600, 16000 ng/mL). 24시간 후에, Bio-GloTM Luciferase(Promega)를 이용하여 루시페라제 활성이 측정되었다. 루시페라제 활성은, EnVisionTM Xcite(Perkin Elmer)에 의해 측정되고, 그들의 결과를 도 11에 나타낸다.
그 결과, CD137-CR2-copGFP Jurkat 세포에서는, 이중 특이성 항체의 항체 농도 의존적인 활성화가 검출되었다. 한편, 키메라 수용체를 발현하지 않고 copGFP만 발현하는 NFAT-RE-luc2 Jurkat 세포는, 이중 특이성 항체 존재하에서도 활성화는 검출되지 않았다. 이것으로부터, CD137-CR2-copGFP-T 세포는 이중 특이성 항체 의존적으로 활성화되어, 종양 항원을 발현하는 세포에 대해서 세포 상해 활성을 발현하여, 항종양 효과를 유도하는 것이 시사되었다.
［실시예 8］ 리간드 발현 세포 존재하에 있어서의 키메라 수용체 발현 세포의 활성화능의 평가
세포외 도메인에 면역 수용체를 갖는 키메라 수용체가, 당해 면역 수용체에 대한 리간드와의 결합에 의해, 표적 항원의 존재에 상관없이 활성화되는지 여부를 조사했다. 구체적으로는, 실시예 3-2에서 조제된 CD137-CR1-copGFP Jurkat 세포, 실시예 6-2에서 조제된 trCD137-CR-copGFP Jurkat 세포, 혹은 실시예 7-2에서 조제된 CD137-CR2-copGFP Jurkat 세포가, 인간 CD137L을 발현하는 세포와 공배양되어, Jurkat 세포가 활성화하는지 여부가 해석되었다.
인간 CD137L을 발현하는 세포주는, 인간 B 세포성 림프종 유래인 Raji 세포(ATCC)가 이용되었다. 우선, Raji 세포의 현탁액, 혹은 음성 대상으로서 Raji 세포를 포함하지 않는 배지가 384웰 평저 플레이트(Corning)에 10μL/웰씩 첨가되었다(1E＋04(1×104)세포/웰). 그 다음에, CD137-CR1-copGFP Jurkat 세포, trCD137-CR-copGFP Jurkat 세포, 혹은 CD137-CR2-copGFP Jurkat 세포가, 각각 5μL/웰씩 혼합되었다(1E＋04(1×104)세포/웰). 24시간 후에, Bio-Glo Luciferase(Promega)를 이용하여 루시페라제 활성이 측정되었다. 루시페라제 활성은, EnVisionTM Xcite(Perkin Elmer)에 의해 측정되고, 그들의 결과를 도 12a∼도 12c에 나타낸다.
그 결과, CD137-CR1-copGFP Jurkat 세포에서는, Raji 세포와 공배양한 조건에 있어서 활성화가 검출되었다. 한편, Raji 세포와 공배양하지 않는 조건에서는, 활성화가 검출되지 않았다. CD137-CR1-copGFP Jurkat 세포는, Raji 세포 상에 발현하는 CD137L과의 직접적인 결합에 의해, 표적 항원 비의존적으로 활성화된 것이라고 생각되었다. 그에 대해, CD137L과의 결합이 감약된 trCD137-CR-copGFP Jurkat 세포나 CD137-CR2-copGFP Jurkat 세포에서는, Raji 세포와의 공배양의 유무에 상관없이 활성화가 검출되지 않았다. 이상으로부터, CD137L과의 결합을 감약시킴으로써, 리간드와의 결합에 의한 표적 항원 비의존적인 활성화를 억제할 수 있는 것이 시사되었다.
［실시예 9］ 리간드 결합능이 감약된 CD137 개변체의 최적화
실시예 5에 기재된 바와 같이, 면역 수용체의 세포외 도메인(CD137) 전장을 갖는 키메라 수용체가 형질 전환된 면역 세포는, 당해 면역 수용체에 대한 생체내 리간드(CD137L)와의 결합에 의해, 표적 항원 비의존적으로 활성화될 수 있으므로, 표적 항원 비특이적인 세포 상해를 야기할 가능성이 있다. 이 과제를 해결할 목적으로 세포외 도메인의 면역 수용체를 인위적으로 개변하여, 생체내 리간드와의 결합을 감약시키는 것이 생각되었다. 그 방법으로서 하나는 실시예 6에 기재된 바와 같이, 세포외 도메인의 일부를 결실시키는 것을 들 수 있다. 또 하나의 방법으로서 리간드와 세포외 도메인이 상호작용하는 부위에 유전자 변이를 가함으로써, 생체내 리간드와의 결합 활성을 저감하는 것이 생각된다. 그래서, 생체내 리간드와의 결합 활성을 저감시키는 개변을 동정할 목적으로, 단변이 및 변이의 조합이 검토되었다.
(9-1) 알라닌 스캐닝에 의한 생체내 리간드와의 상호작용 부위의 동정
CD137L과의 상호작용 부위는 CRD2 및 CRD3이 중요한 역할을 하는 것이 알려져 있다. 보다 상세하게 어느 잔기가 직접 상호작용을 하고 있는지, 혹은 상호작용에 크게 영향을 주는지 알 목적으로, CRD2 및 CRD3의 모든 잔기(C48∼K118) 및 CRD1의 일부의 잔기(N40∼P47)에 대해 알라닌 스캐닝 변이 도입이 행해졌다. 구체적으로는 우선 처음에, 코돈 최적화된 인간 CD137 세포외 도메인(BB0000, 서열 번호 36)에 Factor10 절단 서열(FX, 서열 번호 37) 및 인간 IgG1 항체 정상 영역의 단편(서열 번호 38), 비오틴 부가 태그(BAP 태그, 서열 번호 39)가 연결되어, 포유동물 발현 벡터에 도입되었다(BB0000-FXFcBAP). 이 벡터를 주형으로 하여, CRD1, CRD2 및 CRD3의 각각의 잔기가 알라닌으로 치환된 개변체가 작성되었다(BB0001∼BB0076, 서열 번호 40∼115).
제작된 개변체의 서열을 코딩하는 유전자를 갖는 플라스미드가 리포펙션법에 의해 인간 태아 신장 세포 유래 Expi 293주(Invitrogen)에 도입되었다. 4일간 배양된 상청으로부터, rProtein A Sepharose(R) Fast Flow(Amersham Biosciences)를 이용하여 당업자 공지의 방법으로 정제함으로써, 목적하는 CD137 개변체가 얻어진다. 분광 광도계를 이용하여, 정제된 개변체 용액의 280nm에서의 흡광도가 측정되었다. 얻어진 측정치로부터 PACE법에 의해 산출된 흡광 계수를 이용하여 정제된 항체의 농도가 산출되었다(Protein Science(1995) 4, 2411-2423).
(9-2) CD137 개변체의 생체내 리간드에의 결합 평가
CD137 세포외 도메인, 혹은 그 개변체를 갖는 키메라 수용체가 형질 전환된 면역 세포는, 그 안전성을 위해서 생체내 리간드와의 결합을 감약할 필요가 있다. 그래서 제작된 개변체와 생체내 리간드(CD137L)의 상호작용 해석이 행해졌다.
(9-2-1) 항원으로서의 CD137L의 제작
CD137L은 표 3에 기재된 중쇄 및 경쇄의 플라스미드의 조합으로 당업자 공지의 방법으로 발현 정제된 후, Lys-C(Roche)에 의해 37℃ 1시간 처리됨으로써 절단 처리되었다. 각 단편은 MabSelect SuRe(Cytiva)의 어피니티 칼럼에 통과되어, 비결합 성분이 겔 침투 크로마토그래피에 제공되었다. 그 결과 CD137L이 분취되었다.
Figure pct00005
(9-2-2) Biacore를 이용한 상호작용 해석
실시예 9-1에서 제작된 CD137 개변체와 CD137L의 상호작용 해석에는 BiacoreTM T200(Cytiva)을 이용하여 이하의 방법으로 실시되었다. 러닝 버퍼에는 20mM ACES, 150mM NaCl, 0.05% Tween20(등록상표, pH7.4)이 이용되어, 25℃에서 측정이 실시되었다. 센서 칩에는 Series SCM4(Cytiva)에 대해, anti-Human IgG(Fc) antibody(Cytiva)가 고상된 칩이 이용되었다. 이 칩에 대해서 목적하는 CD137 개변체가 캡처된 후, 러닝 버퍼로 희석한 CD137L이 결합 분자로서 제공되었다. 칩은 3M MgCl2를 이용하여 재생되고, 반복 항체를 캡처하여 측정이 행해졌다. 각 개변체의 항CD137 항체 단편에 대한 해리 상수 KD(mol/L)는, BiacoreTM T200 Evaluation Software Version 2.0을 이용하여 1:1 Binding model을 이용하여 산출되었다.
알라닌 스캐닝의 결과. 생체내 리간드에의 결합을 야생형의 90% 이하로 낮추고, 발현량이 야생형의 50% 이상을 유지할 수 있는 개소로서, CRD1의 N42, Q43, I44가, CRD2의 C48, P50, F53, D63, I64, D87이, 더욱이 CRD3의 L95 및 M101이 발견되었다.
(9-2-3)
실시예 9-2-2에서 발견된 포지션 중, M101의 위치에, 망라적으로 1아미노산 개변을 도입함으로써, CD137L에의 결합을 저감할 수 있는 개변이 탐색되었다.
제작된 개변체는 실시예 9-2-2에 기재된 상호작용 해석과 동일한 방법으로 CD137L에의 결합 활성이 평가되었다.
그 결과 M101D라고 하는 개변(BB0139: 서열 번호 120)이 CD137L 결합을 저감할 수 있는 개변으로서 새롭게 발견되었다.
(9-3) 생체내 리간드와의 상호작용을 저감하는 개변체의 제작
실시예 7에 기재된 바와 같이, 인간 CD137의 CRD2 상의, I64 및 V71은 CD137L에의 결합을 저감할 수 있는 개변이다. 그래서 양쪽 Arg로 개편된 개변체(BB0077, 서열 번호 121)가, 생체내 리간드와의 상호작용을 보다 저감할 수 있는 개변체가 될 수 있음을 기대하여 제작되었다. 그 때, BB0000-FXFcBAP가 주형으로서 사용되었다.
(9-3-1) BB0000 및 BB0077의 생체내 리간드에의 결합 활성 측정
BB0077의 생체내 리간드에의 결합이 실시예 9-2-2에 기재된 방법으로 측정되었다. CD137L의 결합량(RU: response unit)을 CD137 개변체의 결합량(RU)으로 나눈 비로서 구했다. 그 결과, BB0077은 생체내 리간드에 결합하지 않는 것이 확인되었다(도 13).
(9-3-2) BB0000 및 BB0077의 ECM 결합 평가
제작된 개변체가 포유동물 세포에 대해서 비특이적인 결합 활성을 갖는 경우, 세포에 대해서 항원 비특이적으로 세포 상해 활성이 발휘되어 버릴 가능성이 있다. 그래서 각 개변체의 비특이적 결합의 다과를 in vitro로 평가하는 계로서 알려져 있는, Extracellular Matrix(ECM)에의 결합성이 평가되었다. 본 어세이계에서 BB0000 및 BB0077의 비특이 결합이 평가되었다(미국 특허출원공보 2014/0080153). 그 결과, BB0077은 매우 강하게 ECM에의 결합이 확인되어, 생체 내에서 비특이적으로 반응을 일으킬 수 있을 가능성이 시사되었다(도 14).
(9-3-3) CD137 개변체의 ECM 결합 평가
실시예 9-2-2에서 나타난 바와 같이, BB0077은 생체내 리간드와의 결합이 인정되지 않는 한편으로 비특이적인 결합이 있는 것에 의해, 안전성의 염려가 생각되었기 때문에, 생체내 리간드에의 결합 및 비특이 결합을 모두 억제할 수 있는 CD137 개변체의 제작이 대처되었다.
비특이 결합의 원인으로서, 개변에 의해 도입된 아르기닌의 등전점의 높이가 주목되었다. 세포막 표면 상 혹은 ECM 상에 대전하는 음전하에, 아르기닌이 가지는 양전하가 끌어 당겨짐으로써 비특이 결합이 일어나고 있다고 생각하여, 양전하를 갖지 않고, 리간드와의 결합을 저해할 수 있는 벌키성을 갖는 아미노산으로서, 아스파라긴산, 글루타민, 글루타민산으로 개변함으로써, 비특이 결합을 저감할 수 있는지 확인했다. 구체적으로는, BB0077에서 변이 도입되어 있는 I64, V71 중 편방 또는 쌍방에, 아스파라긴산, 글루타민, 글루타민산을 도입한 개변체를 제작했다. 제작된 각각의 명칭 및 BB0000에 대해서 도입된 개변 및 서열 번호의 리스트는 이하의 표 4와 같다.
Figure pct00006
(9-3-4) 새롭게 발견된 개변체의 생체내 리간드에의 결합 활성 평가
실시예 9-3-3에서 제작된 BB0124∼BB0138의 각 개변체는, 실시예 9-2-2에 기재된 바와 마찬가지의 방법으로 생체내 리간드에의 결합 활성이 평가되었다. CD137L의 결합량(RU: response unit)을 CD137 개변체의 결합량(RU)으로 나눈 비로서 구했다. 그 결과 BB0127∼BB138의 개변체가, 생체내 리간드 결합을 강하게 저감했다. (도 15)
(9-3-5) 각 개변체의 ECM 결합 평가
실시예 9-2-3 및 9-3-4에서 발견된 개변체에 관해서, 실시예 9-3-2에 기재된 방법으로 비특이 결합이 평가되었다. 그 결과 어느 개변체도 야생형(BB0000)보다도 더 비특이 결합이 저감되는 것이 확인되었다(도 16a 및 도 16b).
이상의 결과로부터, 생체내 CD137L에 결합하지 않고, 비특이 결합도 저감된 CD137 개변체가, 새롭게 발견되었다. 본 개변체를 키메라 수용체의 세포외 영역으로서 사용함으로써, 타겟 비특이적인 세포 상해를 억제한 키메라 수용체를 제작할 수 있는 것이 기대되었다.
［실시예 10］ 리간드 결합능이 감약된 CD137 개변체를 세포외 도메인에 갖는 키메라 수용체 발현 세포의 활성화능의 평가
(10-1) 렌티바이러스 벡터의 구축
실시예 9에서 구축된, CD137L과의 결합을 감약시킨 CD137 개변체 중 BB0127, BB0128, BB0131, BB0133, BB0134, BB0139의 6종을 세포외 도메인으로 하여, 인간 CD8알파쇄의 힌지 영역 및 막관통 영역(Genbank NM001768.7, Phe128∼Asn210), 및 인간 CD28 분자(Genbank NM006139.4, Arg180∼Ser220), 인간 CD137 분자(Genbank NM001561.6, Arg209∼Leu255), 인간 CD3제타 분자(Genbank NM000734.4, Arg52∼Arg164)의 세포질 영역이 연결된 키메라 수용체가 제작되었다(서열 번호 27∼32). 이들 서열을 pCDH-CMV-MCS-T2A-copGFP 벡터의 MCS로 라이게이트하여, 키메라 수용체와 copGFP를 공발현하는 렌티바이러스 벡터가 구축되었다.
(10-2) NFAT-RE-luc2 Jurkat 세포에의 유전자 도입
제작한 키메라 수용체의 활성화능을, in vitro의 리포터 어세이에 의해 해석하기 위해, NFAT-RE-luc2 Jurkat 세포(Promega사)에 형질 도입되었다.
형질 도입은, 실시예 10-1에서 구축된 렌티바이러스 벡터를 이용하여, 렌티바이러스에 의한 방법으로 실시되었다. 구체적으로는 우선, Lenti-PacTM HIV Expression Packaging Kit(Genecopoeia)를 이용하여, 렌티바이러스 벡터와 패키징 플라스미드 믹스가 293Ta 세포주(Genecopoeia)에 트랜스펙션되어, 렌티바이러스가 제작되었다. 트랜스펙션으로부터 48시간 후 내지 72시간 후에 상기 렌티바이러스를 함유하는 상청이 회수되었다.
다음에, 회수된 렌티바이러스를 함유하는 상청과, 폴리브렌 용액(나카라이 테스크)을 NFAT-RE-luc2 Jurkat 세포에 첨가하고, 3000rpm으로 60분 원심함으로써, 형질 도입된 NFAT-RE-luc2 Jurkat 세포가 얻어졌다.
(10-3) CR 단백질 발현율의 확인
실시예 10-2에서 조제된 Jurkat 세포 상의 키메라 수용체의 표면 발현에 대해, CD137 항체(BioLegend사)로 염색하여 BD FACSVerseTM(BD Biosciences)에 의해 해석되었다. 그 결과, 생세포 중 50% 이상이 키메라 수용체를 발현하는 것이 확인되었다.
(10-4) 리포터 어세이에 의한 활성화능의 평가
실시예 10-2에서 조제된 키메라 수용체를 발현하는 Jurkat 세포가, 종양 항원을 발현하는 종양 세포와 공배양되어, 종양 항원에 대한 항체와 항CD137 항체로 이루어지는 이중 특이성 항체가 존재하는 조건에 있어서의 Jurkat 세포의 활성화능이 해석되었다. 여기에서는, 모델의 종양 항원으로서 인간 GPC3가 선택되고, 실시예 2-2에서 조제된, 항GPC3 항체와 항CD137 항체로 이루어지는 이중 특이성 항체(H0000-F760nN17/GL4-k0a//hCD137VH-F760mnP17/hCD137VL-k0)가 실험에 사용되었다.
인간 GPC3을 발현하는 종양 세포주는, 인간 간장암 세포주인 SK-HEP1(ATCC)에 인간 GPC3을 안정 발현시킨 SK-pca60 세포가 이용되었다. 우선, SK-pca60 세포가, 384웰 평저 플레이트(Corning)에 5μL/웰씩 파종되었다(1E＋04(1×104)세포/웰). 그 다음에, 실시예 10-2에서 조제된 키메라 수용체를 발현하는 Jurkat 세포와, 양성 대상으로서 실시예 3-2에서 조제된 CD137-CR1-copGFP Jurkat 세포(세포외 도메인이 BB0000), 혹은 실시예 7-2에서 조제된 CD137-CR2-copGFP Jurkat 세포(세포외 도메인이 BB0077), 및 음성 대상으로서 유전자 도입되어 있지 않은 NFAT-RE-luc2 Jurkat 세포의 친주(Mock)가, 각각 10μL/웰씩 혼합되었다(1E＋04(1×104)세포/웰). 그 다음에, 이중 특이성 항체가 종농도 0 또는 10μg/mL로 5μL/웰씩 첨가되었다. 24시간 후에, Bio-Glo Luciferase(Promega)를 이용하여 루시페라제 활성이 측정되었다. 루시페라제 활성은, EnVisionTM Xcite(Perkin Elmer)에 의해 측정되고, 그들의 결과를 도 17에 나타낸다.
그 결과, 키메라 수용체를 발현하는 Jurkat 세포에서는, 이중 특이성 항체 존재하에서만 활성화가 검출되었다. 이것으로부터, CD137 개변체를 세포외 도메인에 갖는 키메라 수용체를 발현하는 T 세포는 이중 특이성 항체 의존적으로 활성화되어, 종양 항원을 발현하는 세포에 대해서 세포 상해 활성을 발현하여, 항종양 효과를 유도하는 것이 시사되었다.
(10-5) 리간드 발현 세포 존재하에 있어서의 키메라 수용체 발현 세포의 활성화능의 평가
실시예 10-2에서 조제된 키메라 수용체를 발현하는 Jurkat 세포가, CD137 리간드와의 결합에 의해, 표적 항원의 존재에 상관없이 활성화되는지 여부를 조사했다. 구체적으로는, 실시예 10-2에서 조제된 키메라 수용체를 발현하는 Jurkat 세포가, 인간 CD137L을 발현하는 세포와 공배양되어 Jurkat 세포가 활성화하는지 여부가 해석되었다.
인간 CD137L을 발현하는 세포주는, 인간 B 세포성 림프종 유래인 Raji 세포(ATCC)가 이용되었다. 우선, Raji 세포의 현탁액, 혹은 음성 대상으로서 Raji 세포를 포함하지 않는 배지가 384웰 평저 플레이트(Corning)에 5μL/웰씩 첨가되었다(1E＋04(1×104)세포/웰). 그 다음에, 실시예 10-2에서 조제된 키메라 수용체를 발현하는 Jurkat 세포와, 양성 대상으로서 실시예 3-2에서 조제된 CD137-CR1-copGFP Jurkat 세포(세포외 도메인이 BB0000), 및 음성 대상으로서 실시예 7-2에서 조제된 CD137-CR2-copGFP Jurkat 세포(세포외 도메인이 BB0077) 혹은 유전자 도입되어 있지 않은 NFAT-RE-luc2 Jurkat 세포의 친주(Mock)가, 각각 10μL/웰씩 혼합되었다(1E＋04(1×104)세포/웰). 24시간 후에, Bio-GloTM Luciferase(Promega)를 이용하여 루시페라제 활성이 측정되었다. 루시페라제 활성은, EnVisionTM Xcite(Perkin Elmer)에 의해 측정되고, 그들의 결과를 도 18에 나타낸다.
그 결과, 양성 대상인 CD137-CR1-copGFP Jurkat 세포에서는, Raji 세포와의 공배양에 의해 활성화가 검출되고, 음성 대상인 CD137-CR2-copGFP Jurkat 세포에서는, 활성화가 검출되지 않았다. 이것은 실시예 8의 결과를 재현하고 있어, CD137-CR1-copGFP Jurkat 세포는, CD137L을 개재시켜 Raji 세포와 결합하여, 표적 항원 비의존적으로 활성화되는 데 반해, CD137L과의 결합이 감약된 CD137-CR2-copGFP Jurkat 세포는, CD137L을 개재시킨 Raji 세포와의 결합이 생기지 않고, 활성화되지 않는 것이 확인되었다. 다음에, 실시예 10-2에서 조제된, 세포외 도메인에 BB0127, BB0128, BB0131, BB0133, BB0134, 혹은 BB0139를 갖는 키메라 수용체를 발현하는 Jurkat 세포는, CD137-CR2-copGFP Jurkat 세포와 마찬가지로, Raji 세포와의 공배양에 의한 활성화가 검출되지 않았다. 이것으로부터, 실시예 9에서 발견된 CD137 개변체는, 리간드와의 결합에 의한 표적 항원 비의존적인 활성화를 억제할 수 있는 것이 시사되었다.
실시예 9 및 실시예 10의 결과로부터, ECM와의 상호작용에 의한 비특이적인 활성화나, CD137L 발현 세포에의 세포 상해 활성을 동시에 회피하여, 표적 세포에 대해 선택적으로 세포 상해 활성을 발현할 수 있는 것이 나타났다.
［실시예 11］이중 특이성 항체에 의한 아고니스트 작용의 평가
(11-1) CD137 세포내 시그널 도메인을 갖지 않는 CD137-CR3을 발현하는 렌티바이러스 벡터의 구축
당해 시스템에서는, 아고니스트 작용을 갖는 항원 결합 분자를 투여함으로써, 호스트의 면역 세포나 동시에 투여하는 CR 발현 세포에 대해, 내재성의 면역 수용체를 개재시켜 아고니스트 활성을 유도할 수 있다고 생각된다. 그래서, CD137 아고니스트 작용을 갖는 항원 결합 분자에 의해, 내재성의 면역 수용체를 발현하는 세포에 대해 CD137 아고니스트 활성이 유도되는지 검증했다.
CR 발현 세포에 대해, 내재성의 면역 수용체를 개재시켜 아고니스트 활성이 유도되는지 검증하기 위해, CD137 세포내 시그널 도메인을 갖지 않는 CR을 발현하는 세포를 제작했다. 구체적으로는, 인간 CD137 세포외 도메인, 인간 CD8 힌지 및 막관통 도메인, 및 CD3제타로 이루어지는 키메라 수용체 CD137-CD8-CD3제타(도 19, CD137-CR3이라고 칭해진다)를 발현하는 렌티바이러스 벡터가 제작되었다. 렌티바이러스 벡터 골격으로서 pCDH-CMV-MCS-T2A-copGFP(System Bioscience)가 이용되었다. 코돈 최적화된 인간 CD137의 세포외 도메인(Genbank NM001561.6, Leu24∼Gln186)에, 인간 CD8알파쇄의 힌지 영역 및 막관통 영역(Genbank NM001768.7, Phe128∼Asn210), 및 인간 CD3제타 분자(Genbank NM000734.4, Arg52∼Arg164)의 세포질 영역이 연결되었다. CD137-CR3(서열 번호 33)을 코딩하는 유전자는 당업자 기지의 방법에 의해 합성되었다. 이 서열을 pCDH-CMV-MCS-T2A-copGFP 벡터의 MCS로 라이게이트하여, CD137-CR3와 copGFP를 공발현하는 렌티바이러스 벡터가 구축되었다.
(11-2) NF-kB-Luc2/4-1BB Jurkat 세포에의 유전자 도입
CD137-CR3을 발현한 T 세포의 활성화능을, in vitro의 리포터 어세이에 의해 해석하기 위해, NF-kB-Luc2/4-1BB Jurkat 세포(Promega사)에 CD137-CR3-copGFP 벡터가 형질 도입되었다. 당해 세포는, CD137을 안정 발현하고 있는 데 더하여, 전사 인자 nuclear factor-kappa B(NF-kB) 응답 엘리먼트의 하류에 루시페라제 유전자가 삽입되어 있어, 루시페라제의 발광을 검출함으로써, NF-kB 경로의 활성화를 정량화할 수 있다.
형질 도입은, 실시예 11-1에서 구축된 렌티바이러스 벡터를 이용하여, 렌티바이러스에 의한 방법으로 실시되었다. 구체적으로는 우선, Lenti-PacTM HIV Expression Packaging Kit(Genecopoeia)를 이용하여, 전술한 CD137-CR3-copGFP 벡터와, 패키징 플라스미드 믹스가 293Ta 세포주(Genecopoeia)에 트랜스펙션되어, CD137-CR3-copGFP 벡터가 도입된 렌티바이러스가 제작되었다. 트랜스펙션으로부터 48시간 후 내지 72시간 후에 상기 렌티바이러스를 함유하는 상청이 회수되고, Lenti-XTM concentrator(다카라 바이오)를 이용하여 농축되었다.
다음에, 회수된 렌티바이러스를 함유하는 상청과, 폴리브렌 용액(나카라이 테스크)을 NF-kB-Luc2/4-1BB Jurkat 세포에 첨가하고, 3000rpm으로 60분 원심함으로써, CD137-CR3-copGFP 벡터가 형질 도입된 NF-kB-Luc2/4-1BB Jurkat 세포(CD137-CR3-copGFP Jurkat 세포)가 얻어졌다. 또한, 실험의 비교 대상으로서, CD137-CR1 벡터가 형질 도입된 NF-kB-Luc2/4-1BB Jurkat 세포(CD137-CR1 Jurkat 세포), 및, 키메라 수용체를 발현하지 않고 copGFP만 발현하는 NF-kB-Luc2/4-1BB Jurkat 세포가 동시에 제작되었다.
(11-3) CR 단백질 발현율의 확인
실시예 11-2에서 조제된 CD137-CR3-copGFP Jurkat 세포 및 CD137-CR1 Jurkat 세포의 키메라 수용체의 표면 발현에 대해, CD137 항체(BioLegend사)로 염색하여 FACSAriaTM III 셀 소터(BD Biosciences)에 의해 해석되었다. 그 결과, 생세포 중 약 95% 이상이 CD137-CR3 혹은 CD137-CR1을 발현하는 것이 확인되었다.
(11-4) 리포터 어세이에 의한 CD137-CRJurkat 세포의 CD137 활성화능의 평가
실시예 11-2에서 조제된 CD137-CR3-copGFP Jurkat 세포 혹은 CD137-CR1 Jurkat 세포가, 종양 항원을 발현하는 종양 세포와 공배양되어, 종양 항원에 대한 항체와 항CD137 항체로 이루어지는 이중 특이성 항체가 존재하는 조건에 있어서의 Jurkat 세포에의 CD137 아고니스트 활성 유도능이 해석되었다. 여기에서는, 모델의 종양 항원으로서 인간 GPC3이 선택되고, 실시예 2-2에서 조제된, 항GPC3 항체와 항CD137 항체로 이루어지는 이중 특이성 항체(H0000-F760nN17/GL4-k0a//hCD137VH-F760mnP17/hCD137VL-k0)가 실험에 사용되었다.
인간 GPC3을 발현하는 종양 세포주는, 인간 간장암 세포주인 SK-HEP1(ATCC)에 인간 GPC3을 안정 발현시킨 SK-pca60 세포가 이용되었다. 우선, SK-pca60 세포가, 384웰 평저 플레이트(Corning)에 10μL/웰씩 파종되었다(1E＋04(1×104)세포/웰). 그 다음에, CD137-CR3-copGFP Jurkat 세포, CD137-CR1 Jurkat 세포, 및 copGFP만 발현하는 NF-kB-Luc2/4-1BB Jurkat 세포가, 각각 5μL/웰씩 혼합되었다(1E＋04(1×104)세포/웰). 그 다음에, 이중 특이성 항체가 종농도 0 또는 16μg/mL로 5μL/웰씩 첨가되었다. 24시간 후에, Bio-GloTM Luciferase(Promega)를 이용하여 루시페라제 활성이 측정되었다. 루시페라제 활성은, EnVisionTM Xcite(Perkin Elmer)에 의해 측정되고, 그들의 결과를 도 20에 나타낸다.
그 결과, 어느 조건에서도, 이중 특이성 항체 존재하에서 아고니스트 활성이 검출되었다. 이 중 CD137-CR1은, 세포내 도메인으로서 CD137이 융합되어 있어, 세포막 상의 CD137을 개재시킨 아고니스트 활성에 더하여, 유전자 도입한 CR을 개재시킴으로써도 아고니스트 활성이 유도된다고 생각된다. 그에 반해, 세포내 도메인으로서 CD137이 융합되어 있지 않은 CD137-CR3을 발현하는 NF-kB-Luc2/4-1BB Jurkat 세포와 copGFP만 발현하는 NF-kB-Luc2/4-1BB Jurkat 세포에서는, 세포막 상의 CD137을 개재시켜 아고니스트 활성이 유도된 것이라고 생각되었다. 이상으로부터, 당해의 시스템에서는, 아고니스트 작용을 가지는 항원 결합 분자에 의해, CR 발현의 유무를 불문하고, 내재성의 면역 수용체를 발현하는 세포에 대해서 아고니스트 활성을 유도할 수 있는 것이 나타났다.
［실시예 12］ 세포외 영역에 CD28을 갖는 키메라 수용체 발현 세포의 활성화능의 평가
(12-1) 렌티바이러스 벡터의 구축
인간 CD28의 세포외 도메인(Genbank NM006139.4, Asn19∼Pro152)가 융합된 키메라 수용체를 발현하는 렌티바이러스 벡터가 제작되었다. 막관통 도메인에 인간 CD8을 이용한 컨스트럭트와(CD28-CR1), 인간 CD28을 이용한 컨스트럭트(CD28-CR2)의 2종이 제작되었다(도 21). 렌티바이러스 벡터 골격으로서 pCDH-CMV-MCS-T2A-copGFP(System Bioscience)가 이용되었다. CD28-CR1(서열 번호 34), CD28-CR2(서열 번호 35)를 코딩하는 유전자는 당업자 기지의 방법에 의해 합성되었다. 이 서열을 pCDH-CMV-MCS-T2A-copGFP 벡터의 MCS로 라이게이트함으로써, 렌티바이러스 벡터가 구축되었다.
(12-2) NFAT-RE-luc2 Jurkat 세포에의 유전자 도입
CD28-CR1 혹은 CD28-CR2를 발현한 T 세포의 활성화능을, in vitro의 리포터 어세이에 의해 해석하기 위해, NFAT-RE-luc2 Jurkat 세포(Promega사)에 대해, 실시예 12-1에서 구축한 렌티바이러스 벡터가 형질 도입되었다.
구체적으로는 우선, Lenti-PacTM HIV Expression Packaging Kit(Genecopoeia)를 이용하여, 전술한 CD28-CR1-copGFP 혹은 CD28-CR2-copGFP 벡터와, 패키징 플라스미드 믹스가 293Ta 세포주(Genecopoeia)에 트랜스펙션되어, CD28-CR1-copGFP 혹은 CD28-CR2-copGFP 벡터가 도입된 렌티바이러스가 제작되었다. 트랜스펙션으로부터 48시간 후 내지 72시간 후에 상기 렌티바이러스를 함유하는 상청이 회수되고, Lenti-XTMconcentrator(다카라 바이오)를 이용하여 농축되었다.
다음에, 회수된 렌티바이러스를 함유하는 상청과, 폴리브렌 용액(나카라이 테스크)을 NFAT-RE-luc2 Jurkat 세포에 첨가하고, 3000rpm으로 60분 원심함으로써, CD28-CR1-copGFP 혹은 CD28-CR2-copGFP 벡터가 형질 도입된 NFAT-RE-luc2 Jurkat 세포가 얻어졌다. 또한, 실험의 음성 대상으로서, copGFP만 발현하는 pCDH-CMV-MCS-T2A-copGFP 벡터가 형질 도입된 NFAT-RE-luc2 Jurkat 세포가 동시에 제작되었다.
(12-3) 유전자 도입 효율의 확인
실시예 12-2에서 조제된, CD28-CR1-copGFP를 발현하는 Jurkat 세포와 CD28-CR2-copGFP를 발현하는 Jurkat 세포의 유전자 도입 효율에 대해, FACSAriaTM III 셀 소터(BD Biosciences)를 이용하여, 공발현시킨 copGFP의 발현율을 지표로 해석되었다. 그 결과, CD28-CR1은 약 40%의 세포에 대해서, CD28-CR2는 약 20%의 세포에 대해, 각각 유전자 도입되어 있는 것이 확인되었다.
(12-4) 리포터 어세이에 의한 활성화능의 평가
실시예 12-2에서 조제된 CD28-CR1-copGFP 발현 Jurkat 세포와 CD28-CR2-copGFP 발현 Jurkat 세포가, 각각 종양 항원을 발현하는 종양 세포와 공배양되어, 종양 항원에 대한 항체와 항CD28 항체로 이루어지는 이중 특이성 항체가 존재하는 조건에 있어서의 Jurkat 세포의 활성화능이 해석되었다. 여기에서는, 모델의 종양 항원으로서 인간 GPC3이 선택되고, 실시예 2-2에서 조제된, 항GPC3 항체와 항CD28 항체로 이루어지는 이중 특이성 항체(H0000-F760mnN17/GL4-k0a//TGN1412VH-F760mnP17.v1/TGN1412VL-KT0.v1)와, 음성 대상으로서, 제1 또는 제2의 팔을 항Keyhole limpet hemocyanin(KLH) 항체로 치환한 이중 특이성 항체(IC17HdK-F760mnN17/IC17L-k0//TGN1412VH-F760mnP17.v1/TGN1412VL-KT0.v1 또는 IC17HdK-F760mnN17/IC17L-k0//H0000-F760mnP17/GL4-k0a)가 실험에 사용되었다.
인간 GPC3을 발현하는 종양 세포주는, 인간 간장암 세포주인 SK-HEP1(ATCC)에 인간 GPC3을 안정 발현시킨 SK-pca60 세포가 이용되었다. 우선, SK-pca60 세포가, 384웰 평저 플레이트(Corning)에 10μL/웰씩 파종되었다(1E＋04(1×104)세포/웰). 그 다음에, CD28-CR1-copGFP Jurkat 세포, CD28-CR2-copGFP Jurkat 세포, 혹은 음성 대상으로서 키메라 수용체를 발현하지 않고 copGFP만 발현하는 NFAT-RE-luc2 Jurkat 세포가, 각각 5μL/웰씩 혼합되었다(1E＋04(1×104)세포/웰). 그 다음에, 각종의 이중 특이성 항체가 종농도 0 또는 10μg/mL로 5μL/웰씩 첨가되었다. 24시간 후에, Bio-GloTM Luciferase(Promega)를 이용하여 루시페라제 활성이 측정되었다. 루시페라제 활성은, EnVisionTM Xcite(Perkin Elmer)에 의해 측정되고, 그들의 결과를 도 22에 나타낸다.
그 결과, CD28-CR1-copGFP Jurkat 세포 및 CD28-CR2-copGFP Jurkat 세포는 모두, 항체를 첨가하지 않는 조건이나, 음성 대상의 이중 특이성 항체를 첨가한 조건에서의 활성화는 약했던 데 반해, 항GPC3 항체와 항CD28 항체로 이루어지는 이중 특이성 항체 존재하에서 비로소 강하게 활성화되었다. 한편, 키메라 수용체를 발현하지 않고 copGFP만 발현하는 NFAT-RE-luc2 Jurkat 세포는, 항GPC3 항체와 항CD28 항체로 이루어지는 이중 특이성 항체 존재하에서도 활성화는 검출되지 않았다. 이것으로부터, 세포외 영역에 CD28을 갖는 키메라 수용체를 발현하는 T 세포는 이중 특이성 항체 의존적으로 활성화되어, 종양 항원을 발현하는 세포에 대해서 세포 상해 활성을 발현하여, 항종양 효과를 유도하는 것이 시사되었다.
[표 5-1]
Figure pct00007
[표 5-2]
Figure pct00008
[표 5-3]
Figure pct00009
[표 5-4]
Figure pct00010
SEQUENCE LISTING <110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA <120> Pharmaceutical composition comprising cell expressing chimeric receptor <130> FA0001-21152 <150> JP 2020-131116 <151> 2020-07-31 <160> 140 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Glu Met His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 2 Asp Ile Val Met 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Leu Gly Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu 65 70 75 80 Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp 85 90 95 Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro 100 105 110 Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys Ser Val Leu Val Asn Gly Thr 115 120 125 Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro 130 135 140 Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala Pro Ala Arg Glu Pro Gly His 145 150 155 160 Ser Pro Gln <210> 131 <211> 163 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 131 Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn 1 5 10 15 Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser 20 25 30 Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Gln Cys Arg Gln Cys Lys Gly Glu 35 40 45 Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp 50 55 60 Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu 65 70 75 80 Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp 85 90 95 Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro 100 105 110 Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys Ser Val Leu Val Asn Gly Thr 115 120 125 Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro 130 135 140 Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala Pro Ala Arg Glu Pro Gly His 145 150 155 160 Ser Pro Gln <210> 132 <211> 163 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 132 Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn 1 5 10 15 Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser 20 25 30 Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Gln Cys Arg Gln Cys Lys Gly Gln 35 40 45 Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp 50 55 60 Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu 65 70 75 80 Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp 85 90 95 Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro 100 105 110 Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys Ser Val Leu Val Asn Gly Thr 115 120 125 Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro 130 135 140 Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala Pro Ala Arg Glu Pro Gly His 145 150 155 160 Ser Pro Gln <210> 133 <211> 163 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 133 Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn 1 5 10 15 Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser 20 25 30 Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Gln Cys Arg Gln Cys Lys Gly Asp 35 40 45 Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp 50 55 60 Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu 65 70 75 80 Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp 85 90 95 Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro 100 105 110 Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys Ser Val Leu Val Asn Gly Thr 115 120 125 Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro 130 135 140 Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala Pro Ala Arg Glu Pro Gly His 145 150 155 160 Ser Pro Gln <210> 134 <211> 163 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 134 Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn 1 5 10 15 Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser 20 25 30 Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Asp Cys Arg Gln Cys Lys Gly Glu 35 40 45 Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp 50 55 60 Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu 65 70 75 80 Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp 85 90 95 Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro 100 105 110 Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys Ser Val Leu Val Asn Gly Thr 115 120 125 Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro 130 135 140 Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala Pro Ala Arg Glu Pro Gly His 145 150 155 160 Ser Pro Gln <210> 135 <211> 163 <212> PRT <213> Artificial 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Ile Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val 35 40 45 Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp 50 55 60 Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu 65 70 75 80 Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp 85 90 95 Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro 100 105 110 Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys Ser Val Leu Val Asn Gly Thr 115 120 125 Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro 130 135 140 Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala Pro Ala Arg Glu Pro Gly His 145 150 155 160 Ser Pro Gln <210> 138 <211> 157 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 138 Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn 1 5 10 15 Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser 20 25 30 Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val 35 40 45 Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp 50 55 60 Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu 65 70 75 80 Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp 85 90 95 Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro 100 105 110 Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys Ser Val Leu Val Asn Gly Thr 115 120 125 Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro 130 135 140 Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala Pro Ala Arg Glu 145 150 155 <210> 139 <211> 138 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 139 Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro Ala Gly Thr Phe Cys Asp 1 5 10 15 Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys Pro Pro Asn Ser Phe Ser 20 25 30 Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile Cys Arg Gln Cys Lys Gly 35 40 45 Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys 50 55 60 Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly Ala Gly Cys Ser Met Cys 65 70 75 80 Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly Cys Lys 85 90 95 Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln Lys Arg Gly Ile Cys Arg 100 105 110 Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys Ser Val Leu Val Asn Gly 115 120 125 Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro 130 135 <210> 140 <211> 138 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 140 Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn 1 5 10 15 Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala 20 25 30 Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe 35 40 45 Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys 50 55 60 Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln 65 70 75 80 Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys 85 90 95 Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp 100 105 110 Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys 115 120 125 Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro Ser Pro 130 135

Claims (23)

  1. 항원 결합 분자의 투여와 조합하여 이용하기 위한, 키메라 수용체를 발현하는 세포를 포함하는 의약 조성물로서,
    키메라 수용체는 세포외 도메인을 포함하고, 해당 세포외 도메인은, 면역 수용체의 세포외 도메인, 면역 수용체의 세포외 도메인 개변체, 또는 그의 단편을 포함하고,
    항원 결합 분자는, 표적 항원 인식 부위 및 상기 면역 수용체를 인식하는 면역 수용체 인식 부위를 갖는 다중 특이성 항원 결합 분자인, 의약 조성물.
  2. 키메라 수용체를 발현하는 세포의 투여와 조합하여 이용하기 위한, 항원 결합 분자를 포함하는 의약 조성물로서,
    키메라 수용체는 세포외 도메인을 포함하고, 해당 세포외 도메인은 면역 수용체의 세포외 도메인, 면역 수용체의 세포외 도메인 개변체, 또는 그의 단편을 포함하고,
    항원 결합 분자는, 표적 항원 인식 부위 및 상기 면역 수용체를 인식하는 면역 수용체 인식 부위를 갖는 다중 특이성 항원 결합 분자인, 의약 조성물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    면역 수용체 인식 부위가, 키메라 수용체의 세포외 도메인 및 내인성의 면역 수용체를 인식하는, 의약 조성물.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    키메라 수용체의 세포외 도메인이, 내인성의 면역 수용체의 리간드와의 결합을 감약시킨 면역 수용체의 세포외 도메인 개변체 또는 그의 단편을 포함하는, 의약 조성물.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역 수용체가 공자극 분자인, 의약 조성물.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역 수용체가 인간 CD137인, 의약 조성물.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    키메라 수용체의 세포외 도메인이, 인간 CD137 세포외 도메인의 시스테인 리치 도메인 3 및 시스테인 리치 도메인 4의 일부 또는 전부를 적어도 결실시킨 인간 CD137 세포외 도메인 개변체 또는 그의 단편을 포함하는, 의약 조성물.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    키메라 수용체의 세포내 시그널 전달 도메인이 CD3제타의 세포내 시그널 전달 도메인을 포함하는, 의약 조성물.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    표적 항원이 수용체, 종양 항원, MHC 항원, 또는 분화 항원인, 의약 조성물.
  10. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    표적 항원이 종양 항원인, 의약 조성물.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원 결합 분자가 이중 특이성 항체인, 의약 조성물.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    암의 치료 또는 예방에 있어서 이용하기 위한, 의약 조성물.
  13. 면역 수용체의 세포외 도메인, 면역 수용체의 세포외 도메인 개변체, 또는 그의 단편을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는, 키메라 수용체.
  14. 제 13 항에 있어서,
    키메라 수용체의 세포외 도메인이, 내인성의 면역 수용체의 리간드와의 결합을 감약시킨 면역 수용체의 세포외 도메인 개변체 또는 그의 단편을 포함하는, 키메라 수용체.
  15. 제 13 항 또는 제 14 항에 있어서,
    면역 수용체가 공자극 분자인, 키메라 수용체.
  16. 제 13 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역 수용체가 인간 CD137인, 키메라 수용체.
  17. 제 13 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    키메라 수용체의 세포외 도메인이, 인간 CD137 세포외 도메인의 시스테인 리치 도메인 3 및 시스테인 리치 도메인 4의 일부 또는 전부를 적어도 결실시킨 인간 CD137 세포외 도메인 개변체 또는 그의 단편인, 키메라 수용체.
  18. 제 13 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    키메라 수용체의 세포내 시그널 전달 도메인이 CD3제타의 세포내 시그널 전달 도메인을 포함하는, 키메라 수용체.
  19. 제 13 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 기재된 키메라 수용체를 발현하는 세포.
  20. 제 19 항의 세포를 포함하는 조성물.
  21. 제 13 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 기재된 키메라 수용체를 코딩하는 핵산.
  22. 제 21 항에 기재된 핵산이 삽입된 벡터.
  23. 제 21 항에 기재된 핵산 또는 제 22 항에 기재된 벡터를 이용하여 세포를 트랜스펙트 또는 형질 도입하는 것을 포함하는, 제 19 항에 기재된 세포를 제조하는 방법.
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