TWI580693B - 促進抗原消失的抗原結合分子 - Google Patents

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Description

促進抗原消失的抗原結合分子
本發明提供促進結合之抗原攝入細胞內之抗原結合分子、增加一分子能結合之抗原之數目之抗原結合分子、藥物動態有所改善之抗原結合分子、促進於細胞外結合之抗原在細胞內解離之抗原結合分子、促進以未與抗原結合之狀態釋放到細胞外之抗原結合分子、具有減少血漿中之總抗原濃度或游離抗原濃度之機能之抗原結合分子、含有該抗原結合分子之醫藥組成物、及此等之製造方法。
抗體在血漿中之安定性高、副作用也少，因此作為醫藥品受到重視。其中，又以IgG型之抗體醫藥已有多數上市，現在也有許多抗體醫藥正在開發當中(非專利文獻1及非專利文獻2)。另一方面，就第二代之抗體醫藥能應用之技術而言，已有各種技術被開發出來，已有人報告使效應子機能、抗原結合能力、藥物動態、安定性提高或免疫原性風險減少的技術等(非專利文獻3)。抗體醫藥一般而言投予量非常高，所以據認為有皮下投予製劑之製作困難、製造成本高等課題。就減少抗體醫藥之投予量之方法而言，據認為有改善抗體之藥物動態之方法、以及提高抗體與抗原間之親和性(affinity)之方法。
就改善抗體之藥物動態之方法而言，據報告有將不變區進行人為胺基酸取代之方法(非專利文獻4及5)。就增強抗原結合能力、抗原中和能力的技術而言，據報告有親 和性成熟技術(非專利文獻6)，可藉由對於可變區之CDR區等的胺基酸導入變異而增強對於抗原之結合活性。藉由抗原結合能力的增強，可提高於體外之生物活性、或減少投予量，而且可提高於活體內(in vivo)的藥效(非專利文獻7)。
另一方面，抗體每一分子能中和之抗原量取決於親和性，藉由增強親和性能以少量抗體中和抗原，能以各種方法加強抗體之親和性(非專利文獻6)。再者，若能對於抗原以共價鍵結合並能使親和性無限大，則能以一分子抗體中和一分子抗原(二價的情形為二分子抗原)。但至今為止的方法，以一分子抗體來中和一分子抗原(二價的情形為二分子抗原)的化學理論中和反應為極限，無法以抗原量以下的抗體量將抗原完全中和。亦即，強化親和性的效果存在極限(非專利文獻9)。為中和抗體之情形，為了使其中和效果持續一定期間，必須在其期間在活體內投予產生之抗原量以上之抗體量，僅是上述抗體之藥物動態改善、或親和性成熟技術，對於減少必要抗體投予量存在極限。所以，為了持續目的期間以抗原量以下的抗體量達到中和抗原的效果，需要以一抗體中和多數抗原。就達成此目的之新方法，最近有人報告對於抗原以pH依存性結合之抗體(專利文獻1)。能對於抗原於血漿中於中性條件下強力結合且於內體(endosome)內之酸性條件下從抗原解離之pH依存性抗原結合抗體，能於內體內從抗原解離。pH依存性抗原結合抗體，當從抗原解離後，抗體若由FcRn再循環於血漿 中，可再度與抗原結合，故能以一個pH依存性抗原結合抗體重複結合於多數抗原。
又，抗原在血漿中之滯留性，比起結合於FcRn並再循環的抗體，係非常之短。若如此之血漿中滯留性長的抗體與此抗原結合，抗體抗原複合體之血漿中滯留性會與抗體同樣增長。所以，藉由使抗原結合於抗體，血漿中滯留性增長且血漿中抗原濃度上升。
如此，pH依存性抗原結合抗體能以一抗體結合於多數抗原，且相較於通常的抗體，能促進抗原從血漿中消失，所以，有通常的抗體所無法達到之作用。但至今為止，並未有人報告該pH依存性抗原結合抗體對於抗原能反複結合的效果、及促進抗原從血漿中消失之效果更加提高之抗體工程的方法。
IgG抗體藉由與FcRn結合而有長血漿中滯留性。IgG與FcRn之結合，僅在酸性條件下(pH6.0)能觀測到，於中性條件下(pH7.4)幾乎未觀測到有結合。IgG抗體係非專一性的被攝入細胞，但於內體內之酸性條件下藉由於與內體內之FcRn結合而回到細胞表面上，在血漿中之中性條件下從FcRn解離。若對於IgG之Fc區導入變異，使於pH酸性域之條件下對於FcRn失去結合，則不會從內體內再循環到血漿中，抗體之血漿中滯留性會顯著受損。就改善IgG抗體之血漿中滯留性之方法而言，有人報告提高於pH酸性域之條件下對於FcRn之結合之方法。藉由對於IgG抗體之Fc區導入胺基酸取代並使在pH酸性域之條件下對於FcRn 之結合提高，使從內體內向血漿中之再循環效率升高，結果，血漿中滯留性改善。
於為IgG類別之抗體之效應子機能的抗體依存性細胞傷害活性(以下記載為ADCC)、補體依存性細胞傷害活性(以下記載為CDC)的研究，至今已有許多進行，在人類IgG類別之中，據報告IgG1次類別之抗體有最高的ADCC活性、CDC活性(非專利文獻13)。又，據啟示經由IgG類別之抗體為媒介之標的細胞之胞吞作用，即抗體依存性細胞中介性胞吞作用(ADCP)，也是抗體之效應子機能之一(非專利文獻14、非專利文獻15)。IgG1次類別之抗體，由於該等的效應子機能可對於腫瘤發揮，故作為抗癌抗原之幾乎所有的抗體醫藥都是使用IgG1次類別之抗體。
IgG抗體為了媒介ADCC、ADCP活性，IgG抗體之Fc區必須與殺手細胞、天然殺手細胞、經活化之巨噬細胞等的效應子細胞表面上所存在的抗體受體(以下記載為Fcγ受體或FcγR)結合。在人類，Fcγ受體之蛋白質家族已有人報告FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、FcγRIIIb之同型異構物(isoform)，其個別的副型(allotype)也有人報告(非專利文獻16)。
ADCC與ADCP等細胞傷害性之效應子機能之增強，作為用於增強抗癌抗體之抗腫瘤效果之有前景的方法受到重視。以抗體之抗腫瘤效果為目的之由Fcγ受體媒介之效應子機能之重要性，已有人使用小鼠模式報告(非專利文獻17、非專利文獻18)。又，在人類之臨床效果、與FcγRIIIa 之高親和性多型(V158)與低親和性多型(F158)之間，觀察到相關性(非專利文獻19)。從該等報告，啟示具有對於特定之Fcγ受體之結合為最適化之Fc區的抗體，會媒介較強力之效應子機能，且藉此能發揮更有效的抗腫瘤效果。抗體對於包括FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIIa、FcγRIIIb之活化受體、包括FcγRIIb之抑制性受體各別之親和性之平衡，在最佳化抗體之效應子機能方面是重要的要素。藉由增強對於活化受體之親和性，能對於抗體賦予媒介更強力效應子機能之性質(非專利文獻20)，所以至今已有各種使對抗癌抗原之抗體醫藥之抗腫瘤活性增強或提高之抗體工程的方法被提出報告。
針對Fc區與Fcγ受體之結合，抗體之鉸鏈區及CH2分域內中幾個胺基酸殘基及與CH2分域結合之EU編號297號之Asn上附加之糖鏈，顯示有重要性(非專利文獻13、非專利文獻21、非專利文獻22)。以該結合部位為中心，至今已有各種帶有Fcγ受體結合特性之Fc區之變異體被人研究，已獲得了對於活化Fcγ受體有更高親和性之Fc區變異體(專利文獻2、專利文獻3)。例如Lazar等人，藉由將人類IgG1之EU編號表示之239位之Ser、330位之Ala、332位之Ile分別取代為Asp、Leu、Glu，而成功地使人類IgG1對於人類FcγRIIIa(V158)之結合增加達約370倍(非專利文獻23、專利文獻3)。該變異體相較於天然型，對於FcγRIIIa以及FcγRIIb之結合之比(A/I比)成為約9倍，Shinkawa等人藉由使EU編號表示之297位 之Asn上附加之糖鏈之岩藻糖缺損，而成功地使對於FcγRIIIa之結合增加達約100倍(非專利文獻24)。藉由該等方法，能使人類IgG1相較於天然型人類IgG1之ADCC活性大幅提高。
以此方式，於以膜型抗原作為標的之抗體，對於Fcγ受體之結合活性在細胞傷害活性方面發揮重要的作用，所以細胞傷害活性為必要的情形，使用對於FcγR之結合活性高的人類IgG1的構造同型，而且藉由使對於Fcγ受體之結合活性增強而使得細胞傷害活性增強，係廣為使用的技術。另一方面，於以可溶型抗原作為標的之抗體，對於Fcγ受體之結合活性發揮的作用為未知，據認為對於Fcγ受體之結合活性高之人類IgG1以及對於FcγR之結合活性低之人類IgG2或人類IgG4的效果沒有差異。所以，至今為止，並沒有人嘗試在以可溶型抗原作為標的之抗體中使對於Fcγ受體之結合活性增強，且關於其效果也無人報告。
【先前技術文獻】 【專利文獻】
【專利文獻1】WO2009/125825
【專利文獻2】WO2000/042072
【專利文獻3】WO2006/019447
【非專利文獻】
【非專利文獻1】Janice M Reichert, Clark J Rosensweig, Laura B Faden & Matthew C Dewitz, Monoclonal antibody successes in the clinic., Nat. Biotechnol. (2005) 23, 1073-1078
【非專利文獻2】Pavlou AK, Belsey MJ., The therapeutic antibodies market to 2008., Eur J Pharm Biopharm. (2005) 59 (3), 389-396
【非專利文獻3】Kim SJ, Park Y, Hong HJ., Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies., Mol Cells. (2005) 20 (1), 17-29
【非專利文獻4】Hinton PR, Xiong JM, Johlfs MG, Tang MT, Keller S, Tsurushita N., An engineered human IgG1 antibody with longer serum half-life., J. Immunol. (2006) 176 (1), 346-356
【非專利文獻5】Ghetie V, Popov S, Borvak J, Radu C, Matesoi D, Medesan C, Ober RJ, Ward ES., Increasing the serum persistence of an IgG fragment by random mutagenesis., Nat. Biotechnol. (1997) 15 (7), 637-640
【非專利文獻6】Rajpal A, Beyaz N, Haber L, Cappuccilli G, Yee H, Bhatt RR, Takeuchi T, Lerner RA, Crea R., A general method for greatly improving the affinity of antibodies by using combinatorial libraries., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (2005) 102 (24), 8466-8471
【非專利文獻7】Wu H, Pfarr DS, Johnson S, Brewah YA, Woods RM, Patel NK, White WI, Young JF, Kiener PA., Development of Motavizumab, an Ultra-potent Antibody for the Prevention of Respiratory Syncytial Virus Infection in the Upper and Lower Respiratory Tract., J. Mol. Biol. (2007) 368, 652-665
【非專利文獻8】Hanson CV, Nishiyama Y, Paul S., Catalytic antibodies and their applications., Curr Opin Biotechnol. (2005) 16 (6), 631-636
【非專利文獻9】Rathanaswami P, Roalstad S, Roskos L, Su QJ, Lackie S, Babcook J., Demonstration of an in vivo generated sub-picomolar affinity fully human monoclonal antibody to interleukin-8., Biochem. Biophys. Res. Commun. (2005) 334 (4), 1004-1013
【非專利文獻10】Dall’ Acqua WF, Woods RM, Ward ES, Palaszynski SR, Patel NK, Brewah YA, Wu H, Kiener PA, Langermann S., Increasing the affinity of a human IgG1 for the neonatal Fc receptor: biological consequences., J. Immunol. (2002) 169 (9), 5171-5180
【非專利文獻11】Yeung YA, Leabman MK, Marvin JS, Qiu J, Adams CW, Lien S, Starovasnik MA, Lowman HB., Engineering human IgG1 affinity to human neonatal Fc receptor: impact of affinity improvement on pharmacokinetics in primates., J. Immunol. (2009) 182 (12), 7663-7671
【非專利文獻12】Datta-Mannan A, Witcher DR, Tang Y, Watkins J, Wroblewski VJ., Monoclonal antibody clearance. Impact of modulating the interaction of IgG with the neonatal Fc receptor., J. Biol. Chem. (2007) 282 (3), 1709-1717
【非專利文獻13】Clark, M., Antibody Engineering IgG Effector Mechanisms., Chemical Immunology (1997) 65, 88-110
【非專利文獻14】Horton HM, Bernett MJ, Pong E, Peipp M, Karki S, Chu SY, Richards JO, Vostiar I, Joyce PF, Repp R, Desjarlais JR, Zhukovsky EA., Potent in vitro and in vivo activity of an Fc-engineered anti-CD19 monoclonal antibody against lymphoma and leukemia., Cancer Res. (2008) 68, 8049-8057
【非專利文獻15】Zalevsky J, Leung IW, Karki S, Chu SY, Zhukovsky EA, Desjarlais JR, Carmichael DF, Lawrence CE., The impact of Fc engineering on an anti-CD19 antibody: increased Fcγ受體affinity enhances B-cell clearing in nonhuman primates., Blood (2009) 113, 3735-3743
【非專利文獻16】Jefferis R,Lund J., Interaction sites on human IgG-Fc for FcgammaR: current models., Immunol. Lett. (2002) 82, 57-65
【非專利文獻17】Clynes, R., Yoshizumi, T., Moroi, Y., Houghton, A. N., and Ravetch, J. V., Fc Receptors are required for passive and active immunity to melanoma., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (1998) 95, 652-656
【非專利文獻18】Clynes RA, Towers TL, Presta LG, Ravetch JV., Inhibitory Fc受體s modulate in vivo cytoxicity against tumor targets., Nat. Med. (2000) 6, 443-446
【非專利文獻19】Cartron G, Dacheux L, Salles G, Solal-Celigny P, Bardos P, Colombat P, Watier H., Therapeutic activity of humanized anti-CD20 monoclonal antibody and polymorphism in IgG Fc receptor FcgammaRIIIa gene., Blood (2002) 99, 754-758
【非專利文獻20】Nimmerjahn F, Ravetch JV., Divergent immunoglobulin g subclass activity through selective Fc receptor binding., Science (2005) 310, 1510-1512
【非專利文獻21】Greenwood J, Clark M, Waldmann H., Structural motifs involved in human IgG antibody effector functions., Eur. J. Immunol. (1993) 23, 1098-1104
【非專利文獻22】Morgan A, Jones ND, Nesbitt AM, Chaplin L, Bodmer MW, Emtage JS., The N-terminal end of the CH2 domain of chimeric human IgG1 anti-HLA-DR is necessary for C1q, Fc gamma RI and Fc gamma RIII binding., Immunology (1995) 86, 319-324
【非專利文獻23】Lazar GA, Dang W, Karki S, Vafa O, Peng JS, Hyun L, Chan C, Chung HS, Eivazi A, Yoder SC, Vielmetter J, Carmichael DF, Hayes RJ, Dahiyat BI., Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function., Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. A. (2006) 103, 4005-4010
【非專利文獻24】Shinkawa T, Nakamura K, Yamane N, Shoji-Hosaka E, Kanda Y, Sakurada M, Uchida K, Anazawa H, Satoh M, Yamasaki M, Hanai N, Shitara K., The absence of fucose but not the presence of galactose or bisecting N-acetylglucosamine of human IgG1 complex-type oligosaccharides shows the critical role of enhancing antibody-dependent cellular cytotoxicity., J. Biol. Chem. (2003) 278, 3466-3473
本發明係有鑑於如此的狀況而生，其目的在於提供促進結合之抗原攝入細胞內之抗原結合分子、增加每一分子能結合之抗原數目之抗原結合分子、藥物動態有所改善之抗原結合分子、促進在細胞外結合之抗原於細胞內解離之抗原結合分子、促進以未結合於抗原之狀態釋放到細胞外之抗原結合分子、具有使血漿中之總抗原濃度或游離抗原 濃度減少之機能之抗原結合分子、含有該抗原結合分子之醫藥組成物、及此等之製造方法。
本案發明人等為了達成上述目的努力研究，創作出一種抗原結合分子，其包含：抗原結合分域，於pH酸性域之條件下對於人類FcRn有結合活性，且依照離子濃度之條件，抗原結合分子對於抗原之結合活性會變化；及Fcγ受體結合分域，其於pH中性域之條件下對於Fcγ受體之結合活性，比起結合於EU編號297位之糖鏈為含岩藻糖(fucose)之糖鏈的天然型人類IgG之Fc區對於Fcγ受體之結合分域高。又，本案發明人等發現：促進使抗原結合分子所結合之抗原攝入細胞內之方法、增加一分子之抗原結合分子能結合之抗原數目之方法、改善抗原結合分子之藥物動態之方法、促進在細胞外與抗原結合分子結合之抗原在細胞內從抗原結合分子解離之方法、促進以未與抗原結合之狀態釋放到細胞外之方法、及減少血漿中之總抗原濃度或游離抗原濃度之方法，包含以下步驟：使前述抗原結合分子在活體內或活體外接觸表現Fcγ受體之細胞。又，本案發明人等發現具有上述性質之抗原結合分子之製造方法，而且發現含有如此之抗原結合分子或含有依本發明之製造方法製造之抗原結合分子作為有效成分之醫藥組成物之有用性，而完成本發明。
亦即本發明，更具體而言，係提供以下[1]~[46]。
[1]一種醫藥組成物，其係包含抗原結合分子，該抗原 結合分子包含：抗原結合分域，其於pH酸性域之條件下對於人類FcRn有結合活性，且依離子濃度之條件對於抗原之結合活性會變化；及Fcγ受體結合分域，其於pH中性域之條件下對於Fcγ受體之結合活性高於結合於EU編號297位之糖鏈係含岩藻糖之糖鏈的天然型人類IgG之Fc區對於Fcγ受體之結合活性。
[2]如[1]之醫藥組成物，其中，前述抗原為可溶型抗原。
[3]如[1]或[2]之醫藥組成物，其中，前述離子濃度為鈣離子濃度。
[4]如[3]之醫藥組成物，其中，前述抗原結合分域，係在高鈣離子濃度之條件下對於抗原之結合活性高於在低鈣離子濃度之條件下對於該抗原之結合活性之抗原結合分域。
[5]如[1]或[2]之醫藥組成物，其中，前述離子濃度之條件為pH的條件。
[6]如[5]之醫藥組成物，其中，前述抗原結合分域，係在pH中性域之條件下對於抗原之結合活性高於在pH酸性域之條件下對於該抗原之結合活性之抗原結合分域。
[7]如[1]至[6]中任一項之醫藥組成物，其中，前述抗原結合分子對於前述抗原有中和活性。
[8]如[1]至[7]中任一項之醫藥組成物，其中，前述Fcγ受體結合分域包含抗體之Fc區。
[9]如[8]之醫藥組成物，其中，前述Fc區，在Fc區之以 EU編號表示之部位當中，選自於221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、243位、244位、245位、246位、247位、249位、250位、251位、254位、255位、256位、258位、260位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、339位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位及440位之群中至少1個以上之胺基酸，與天然型Fc區之對應部位之胺基酸不同。
[10]如[9]之醫藥組成物，其中，前述Fc區，包含選自於Fc區之以EU編號表示之部位當中；221位之胺基酸為Lys或Tyr中之任一者、222位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中之任一者、223位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Lys中之任一者、224位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中之任一者、 225位之胺基酸為Glu、Lys或Trp中之任一者、227位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、228位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、230位之胺基酸為Ala、Glu、Gly或Tyr中之任一者、231位之胺基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中之任一者、232位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、233位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、234位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、235位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、236位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、237位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、238位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、 239位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、240位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、241位之胺基酸為Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中之任一者、243位之胺基酸為Leu、Glu、Leu、Gln、Arg、Trp或Tyr中之任一者、244位之胺基酸為His、245位之胺基酸為Ala、246位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、247位之胺基酸為Ala、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Thr、Val或Tyr中之任一者、249位之胺基酸為Glu、His、Gln或Tyr中之任一者、250位之胺基酸為Glu或Gln中之任一者、251位之胺基酸為Phe、254位之胺基酸為Phe、Met或Tyr中之任一者、255位之胺基酸為Glu、Leu或Tyr中之任一者、256位之胺基酸為Ala、Met或Pro中之任一者、258位之胺基酸為Asp、Glu、His、Ser或Tyr中之任一者、260位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、262位之胺基酸為Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中之任一者、263位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、264位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、 Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、265位之胺基酸為Ala、Leu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、266位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、267位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、268位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Trp中之任一者、269位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、270位之胺基酸為Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、271位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、272位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、273位之胺基酸為Phe或Ile中之任一者、274位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、 275位之胺基酸為Leu或Trp中之任一者、276位之胺基酸為、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、278位之胺基酸為Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中之任一者、279位之胺基酸為Ala、280位之胺基酸為Ala、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gln、Trp或Tyr中之任一者、281位之胺基酸為Asp、Lys、Pro或Tyr中之任一者、282位之胺基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中之任一者、283位之胺基酸為Ala、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg或Tyr中之任一者、284位之胺基酸為Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中之任一者、285位之胺基酸為Asp、Glu、Lys、Gln、Trp或Tyr中之任一者、286位之胺基酸為Glu、Gly、Pro或Tyr中之任一者、288位之胺基酸為Asn、Asp、Glu或Tyr中之任一者、290位之胺基酸為Asp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、291位之胺基酸為Asp、Glu、Gly、His、Ile、Gln或Thr中之任一者、292位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中之任一者、 293位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、294位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、295位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、296位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr或Val中之任一者、297位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、298位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、299位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中之任一者、300位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中之任一者、301位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、302位之胺基酸為Ile、303位之胺基酸為Asp、Gly或Tyr中之任一者、304位之胺基酸為Asp、His、Leu、Asn或Thr中之任一者、 305位之胺基酸為Glu、Ile、Thr或Tyr中之任一者、311位之胺基酸為Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中之任一者、313位之胺基酸為Phe、315位之胺基酸為Leu、317位之胺基酸為Glu或Gln、318位之胺基酸為His、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Tyr中之任一者、320位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、322位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、323位之胺基酸為Ile、324位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、325位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、326位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、327位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、328位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、 Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、329位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、330位之胺基酸為Cys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、331位之胺基酸為Asp、Phe、His、Ile、Leu、Met、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、332位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、333位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Ser、Thr、Val或Tyr中之任一者、334位之胺基酸為Ala、Glu、Phe、Ile、Leu、Pro或Thr中之任一者、335位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中之任一者、336位之胺基酸為Glu、Lys或Tyr中之任一者、337位之胺基酸為Glu、His或Asn中之任一者、339位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser或Thr中之任一者、376位之胺基酸為Ala或Val中之任一者、 377位之胺基酸為Gly或Lys中之任一者、378位之胺基酸為Asp、379位之胺基酸為Asn、380位之胺基酸為Ala、Asn或Ser中之任一者、382位之胺基酸為Ala或Ile中之任一者、385位之胺基酸為Glu、392位之胺基酸為Thr、396位之胺基酸為Leu、421位之胺基酸為Lys、427位之胺基酸為Asn、428位之胺基酸為Phe或Leu中之任一者、429位之胺基酸為Met、434位之胺基酸為Trp、436位之胺基酸為Ile、及440位之胺基酸為Gly、His、Ile、Leu或Tyr中之任一者之群中至少1個以上之胺基酸。
[11]如[1]至[10]中任一項之醫藥組成物，其中，前述結合於EU編號297位之糖鏈為含岩藻糖之糖鏈的天然型人類IgG的Fc區，為結合於EU編號297位之糖鏈係含岩藻糖之糖鏈的天然型人類IgG1、天然型人類IgG2、天然型人類IgG3或天然型人類IgG4中之任一者的Fc區。
[12]如[1]至[11]中任一項之醫藥組成物，其中，前述人類Fcγ受體為FcγRIa、FcγRIIa(R)、FcγRIIa(H)、FcγRIIb、FcγRIIIa(V)、或FcγRIIIa(F)。
[13]如[1]至[11]中任一項之醫藥組成物，其中，前述人類Fcγ受體為FcγRIIb。
[14]如[8]至[13]中任一項之醫藥組成物，其中，前述Fc區，包含在Fc區之以EU編號表示之部位當中；238位之胺基酸為Asp、或328位之胺基酸為Glu、中至少1個以上的胺基酸。
[15]一種以下(i)~(vi)中之任一者之方法；(i)使能結合於一分子之抗原結合分子之抗原數目增加之方法、(ii)使血漿中抗原消失之方法、(iii)改善抗原結合分子之藥物動態之方法、(iv)促進在細胞外結合於抗原結合分子之抗原在細胞內從抗原結合分子解離之方法、(v)促進未結合於抗原之狀態之抗原結合分子釋放到細胞外之方法，或(vi)減少血漿中之總抗原濃度或游離抗原濃度之方法；其係包含以下步驟：使抗原結合分子在細胞活體內或活體外接觸表現Fcγ受體之細胞，該抗原結合分子包含：抗原結合分域，其於pH酸性域之條件下對於人類FcRn有結合活性，且依離子濃度之條件對於抗原之結合活性會變化；及 Fcγ受體結合分域，其於pH中性域之條件下對於Fcγ受體之結合活性高於結合於EU編號297位之糖鏈係含岩藻糖之糖鏈的天然型人類IgG之Fc區對於Fcγ受體之結合活性。
[16]如[15]之方法，其中，前述抗原為可溶型抗原。
[17]如[15]或[16]之方法，其中，前述離子濃度為鈣離子濃度。
[18]如[17]之方法，其中，前述抗原結合分域，在高鈣離子濃度之條件下對於抗原之結合活性高於在低鈣離子濃度之條件下對於該抗原之結合活性。
[19]如[15]或[16]之方法，其中，前述離子濃度之條件為pH之條件。
[20]如[19]之方法，其中，前述抗原結合分域，在pH中性域之條件下對於抗原之結合活性高於在pH酸性域之條件下對於該抗原之結合活性。
[21]如[15]至[20]中任一項之方法，其中，前述抗原結合分子，對於前述抗原有中和活性。
[22]如[15]至[21]中任一項之方法，其中，前述Fcγ受體結合分域包含抗體之Fc區。
[23]如[22]之方法，其中，前述Fc區，在Fc區之以EU編號表示之部位當中，選自於221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、243位、244位、245位、246位、247位、249 位、250位、251位、254位、255位、256位、258位、260位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、339位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位及440位之群中至少1個以上之胺基酸，與天然型Fc區之對應部位之胺基酸不同。
[24]如[23]之方法，其中，前述Fc區，包含選自於Fc區之以EU編號表示之部位當中；221位之胺基酸為Lys或Tyr中之任一者、222位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中之任一者、223位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Lys中之任一者、224位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中之任一者、225位之胺基酸為Glu、Lys或Trp中之任一者、227位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、228位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、230位之胺基酸為Ala、Glu、Gly或Tyr中之任一者、 231位之胺基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中之任一者、232位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、233位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、234位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、235位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、236位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、237位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、238位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、239位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、240位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、 241位之胺基酸為Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中之任一者、243位之胺基酸為Leu、Glu、Leu、Gln、Arg、Trp或Tyr中之任一者、244位之胺基酸為His、245位之胺基酸為Ala、246位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、247位之胺基酸為Ala、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Thr、Val或Tyr中之任一者、249位之胺基酸為Glu、His、Gln或Tyr中之任一者、250位之胺基酸為Glu或Gln中之任一者、251位之胺基酸為Phe、254位之胺基酸為Phe、Met或Tyr中之任一者、255位之胺基酸為Glu、Leu或Tyr中之任一者、256位之胺基酸為Ala、Met或Pro中之任一者、258位之胺基酸為Asp、Glu、His、Ser或Tyr中之任一者、260位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、262位之胺基酸為Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中之任一者、263位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、264位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、265位之胺基酸為Ala、Leu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或 Tyr中之任一者、266位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、267位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、268位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Trp中之任一者、269位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、270位之胺基酸為Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、271位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、272位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、273位之胺基酸為Phe或Ile中之任一者、274位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、275位之胺基酸為Leu或Trp中之任一者、276位之胺基酸為、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、278位之胺基酸為Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、 Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中之任一者、279位之胺基酸為Ala、280位之胺基酸為Ala、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gln、Trp或Tyr中之任一者、281位之胺基酸為Asp、Lys、Pro或Tyr中之任一者、282位之胺基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中之任一者、283位之胺基酸為Ala、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg或Tyr中之任一者、284位之胺基酸為Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中之任一者、285位之胺基酸為Asp、Glu、Lys、Gln、Trp或Tyr中之任一者、286位之胺基酸為Glu、Gly、Pro或Tyr中之任一者、288位之胺基酸為Asn、Asp、Glu或Tyr中之任一者、290位之胺基酸為Asp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、291位之胺基酸為Asp、Glu、Gly、His、Ile、Gln或Thr中之任一者、292位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中之任一者、293位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、294位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、 295位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、296位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr或Val中之任一者、297位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、298位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、299位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中之任一者、300位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中之任一者、301位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、302位之胺基酸為Ile、303位之胺基酸為Asp、Gly或Tyr中之任一者、304位之胺基酸為Asp、His、Leu、Asn或Thr中之任一者、305位之胺基酸為Glu、Ile、Thr或Tyr中之任一者、311位之胺基酸為Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中之任一者、313位之胺基酸為Phe、 315位之胺基酸為Leu、317位之胺基酸為Glu或Gln、318位之胺基酸為His、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Tyr中之任一者、320位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、322位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、323位之胺基酸為Ile、324位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、325位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、326位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、327位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、328位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、329位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr 中之任一者、330位之胺基酸為Cys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、331位之胺基酸為Asp、Phe、His、Ile、Leu、Met、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、332位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、333位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Ser、Thr、Val或Tyr中之任一者、334位之胺基酸為Ala、Glu、Phe、Ile、Leu、Pro或Thr中之任一者、335位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中之任一者、336位之胺基酸為Glu、Lys或Tyr中之任一者、337位之胺基酸為Glu、His或Asn中之任一者、339位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser或Thr中之任一者、376位之胺基酸為Ala或Val中之任一者、377位之胺基酸為Gly或Lys中之任一者、378位之胺基酸為Asp、379位之胺基酸為Asn、380位之胺基酸為Ala、Asn或Ser中之任一者、 382位之胺基酸為Ala或Ile中之任一者、385位之胺基酸為Glu、392位之胺基酸為Thr、396位之胺基酸為Leu、421位之胺基酸為Lys、427位之胺基酸為Asn、428位之胺基酸為Phe或Leu中之任一者、429位之胺基酸為Met、434位之胺基酸為Trp、436位之胺基酸為Ile、及440位之胺基酸為Gly、His、Ile、Leu或Tyr中之任一者之群中至少1個以上的胺基酸。
[25]如[15]至[24]中之任一項之方法，其中，前述結合於EU編號297位之糖鏈係含岩藻糖之糖鏈之天然型人類IgG之Fc區，為結合於EU編號297位之糖鏈係含岩藻糖之糖鏈的天然型人類IgG1、天然型人類IgG2、天然型人類IgG3或天然型人類IgG4中之任一者之Fc區。
[26]如[15]至[25]中之任一項之方法，其中，前述人類Fcγ受體，為FcγRIa、FcγRIIa(R)、FcγRIIa(H)、FcγRIIb、FcγRIIIa(V)、或FcγRIIIa(F)。
[27]如[15]至[25]中之任一項之方法，其中，前述人類Fcγ受體為FcγRIIb。
[28]如[22]至[27]中之任一項之方法，其中，前述Fc區，含有Fc區之以EU編號表示之部位中； 238位之胺基酸為Asp、或328位之胺基酸為Glu、中之至少1個以上的胺基酸。
[29]一種以下(i)~(vii)中之任一者之方法；(i)促進結合的抗原攝入細胞內之抗原結合分子之改變方法、(ii)使一分子抗原結合分子能結合之抗原之數目增加之方法、(iii)使抗原結合分子在血漿中之抗原消失能力增大之方法、(iv)改善抗原結合分子之藥物動態之方法、(v)促進於細胞外結合於抗原結合分子之抗原在細胞內從抗原結合分子解離之方法、(vi)促進以結合於抗原之狀態攝入細胞內的抗原結合分子以未與抗原結合之狀態釋放到細胞外之方法，或(vii)能減少血漿中之總抗原濃度或游離抗原濃度之抗原結合分子之改變方法；其係包含以下步驟：使包含於pH酸性域條件下對於人類FcRn有結合活性且依離子濃度之條件對於抗原之結合活性會變化之抗原結合分域及Fcγ受體結合分域的抗原結合分子，其Fcγ受體結合分域在pH中性域條件下對於Fcγ受體之結合活性比起結合於EU編號297位之糖鏈係含岩藻糖之糖鏈的天然型人類IgG之Fc區在pH中性域條件下對於Fcγ受體之結合活 性更為增強。
[30]如[29]之方法，其中，該抗原為可溶型抗原。
[31]如[29]或[30]之方法，其中，前述離子濃度為鈣離子濃度。
[32]如[31]之方法，其中，前述抗原結合分域，在高鈣離子濃度之條件下對於抗原之結合活性高於在低鈣離子濃度之條件下對於該抗原之結合活性。
[33]如[29]或[30]之方法，其中，前述離子濃度之條件為pH之條件。
[34]如[33]之方法，其中，前述抗原結合分域，在pH中性域之條件下對於抗原之結合活性高於在pH酸性域之條件下對於該抗原之結合活性。
[35]如[29]至[34]中任一項之方法，其中，前述抗原結合分子係對於前述抗原有中和活性之抗原結合分子。
[36]如[29]至[35]中任一項之方法，其中，前述Fcγ受體結合分域包含抗體之Fc區。
[37]如[36]之方法，其中，前述Fc區，在Fc區之以EU編號表示之部位中，221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、243位、244位、245位、246位、247位、249位、250位、251位、254位、255位、256位、258位、260位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276 位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、339位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位及440位之群中1個以上之胺基酸，與天然型Fc區之對應部位之胺基酸不同。
[38]如[37]之方法，其中，前述Fc區，含有從Fc區之以EU編號表示之部位當中；221位之胺基酸為Lys或Tyr中之任一者、222位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中之任一者、223位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Lys中之任一者、224位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中之任一者、225位之胺基酸為Glu、Lys或Trp中之任一者、227位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、228位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、230位之胺基酸為Ala、Glu、Gly或Tyr中之任一者、231位之胺基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中之任一者、232位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、233位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、 Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、234位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、235位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、236位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、237位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、238位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、239位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、240位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、241位之胺基酸為Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中之任一者、243位之胺基酸為Leu、Glu、Leu、Gln、Arg、Trp或Tyr 中之任一者、244位之胺基酸為His、245位之胺基酸為Ala、246位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、247位之胺基酸為Ala、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Thr、Val或Tyr中之任一者、249位之胺基酸為Glu、His、Gln或Tyr中之任一者、250位之胺基酸為Glu或Gln中之任一者、251位之胺基酸為Phe、254位之胺基酸為Phe、Met或Tyr中之任一者、255位之胺基酸為Glu、Leu或Tyr中之任一者、256位之胺基酸為Ala、Met或Pro中之任一者、258位之胺基酸為Asp、Glu、His、Ser或Tyr中之任一者、260位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、262位之胺基酸為Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中之任一者、263位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、264位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、265位之胺基酸為Ala、Leu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、266位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、267位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、 Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、268位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Trp中之任一者、269位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、270位之胺基酸為Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、271位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、272位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、273位之胺基酸為Phe或Ile中之任一者、274位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、275位之胺基酸為Leu或Trp中之任一者、276位之胺基酸為、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、278位之胺基酸為Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中之任一者、279位之胺基酸為Ala、 280位之胺基酸為Ala、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gln、Trp或Tyr中之任一者、281位之胺基酸為Asp、Lys、Pro或Tyr中之任一者、282位之胺基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中之任一者、283位之胺基酸為Ala、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg或Tyr中之任一者、284位之胺基酸為Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中之任一者、285位之胺基酸為Asp、Glu、Lys、Gln、Trp或Tyr中之任一者、286位之胺基酸為Glu、Gly、Pro或Tyr中之任一者、288位之胺基酸為Asn、Asp、Glu或Tyr中之任一者、290位之胺基酸為Asp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、291位之胺基酸為Asp、Glu、Gly、His、Ile、Gln或Thr中之任一者、292位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中之任一者、293位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、294位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、295位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、 296位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr或Val中之任一者、297位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、298位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、299位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中之任一者、300位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中之任一者、301位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、302位之胺基酸為Ile、303位之胺基酸為Asp、Gly或Tyr中之任一者、304位之胺基酸為Asp、His、Leu、Asn或Thr中之任一者、305位之胺基酸為Glu、Ile、Thr或Tyr中之任一者、311位之胺基酸為Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中之任一者、313位之胺基酸為Phe、315位之胺基酸為Leu、317位之胺基酸為Glu或Gln、318位之胺基酸為His、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、 Val或Tyr中之任一者、320位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、322位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、323位之胺基酸為Ile、324位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、325位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、326位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、327位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、328位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、329位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、330位之胺基酸為Cys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr 中之任一者、331位之胺基酸為Asp、Phe、His、Ile、Leu、Met、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、332位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、333位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Ser、Thr、Val或Tyr中之任一者、334位之胺基酸為Ala、Glu、Phe、Ile、Leu、Pro或Thr中之任一者、335位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中之任一者、336位之胺基酸為Glu、Lys或Tyr中之任一者、337位之胺基酸為Glu、His或Asn中之任一者、339位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser或Thr中之任一者、376位之胺基酸為Ala或Val中之任一者、377位之胺基酸為Gly或Lys中之任一者、378位之胺基酸為Asp、379位之胺基酸為Asn、380位之胺基酸為Ala、Asn或Ser中之任一者、382位之胺基酸為Ala或Ile中之任一者、385位之胺基酸為Glu、392位之胺基酸為Thr、 396位之胺基酸為Leu、421位之胺基酸為Lys、427位之胺基酸為Asn、428位之胺基酸為Phe或Leu中之任一者、429位之胺基酸為Met、434位之胺基酸為Trp、436位之胺基酸為Ile、及440位之胺基酸為Gly、His、Ile、Leu或Tyr中之任一者、之群中選出之至少1個以上的胺基酸。
[39]如[29]至[38]中任一項之方法，其中，前述結合於EU編號297位之糖鏈係含岩藻糖之糖鏈的天然型人類IgG之Fc區，係結合於EU編號297位之糖鏈為含岩藻糖之糖鏈的天然型人類IgG1、天然型人類IgG2、天然型人類IgG3或天然型人類IgG4中之任一者之Fc區。
[40]如[29]至[39]中任一項之方法，其中，前述人類Fcγ受體，係FcγRIa、FcγRIIa(R)、FcγRIIa(H)、FcγRIIb、FcγRIIIa(V)、或FcγRIIIa(F)。
[41]如[29]至[39]中任一項之方法，其中，前述人類Fcγ受體為FcγRIIb。
[42]如[36]至[41]中任一項之方法，其中，前述Fc區，在Fc區之以EU編號表示之部位當中；含有238位之胺基酸為Asp、或328位之胺基酸為Glu、中之至少1個以上的胺基酸。
[43]一種抗原結合分子之製造方法，包含以下(a)~(f)之步驟：(a)獲得在高鈣離子濃度之條件下抗原結合分域對於抗原之結合活性；(b)獲得在低鈣離子濃度之條件下抗原結合分域對於抗原之結合活性；(c)選擇在(a)獲得之抗原結合活性高於在(b)獲得之抗原結合活性的抗原結合分域；(d)將編碼為於(c)選擇之抗原結合分域之聚核苷酸，連結於編碼為於pH酸性域條件下對於人類FcRn有結合活性且於pH中性域條件下對於Fcγ受體之結合活性比起結合於EU編號297位之糖鏈為含岩藻糖之糖鏈之天然型人類IgG之Fc區對於Fcγ受體之結合活性為高之Fcγ受體結合分域的聚核苷酸；(e)培養導入有於(d)獲得之聚核苷酸以能作用地連結的載體的細胞；及(f)從於(e)培養之細胞之培養液回收抗原結合分子。
[44]一種抗原結合分子之製造方法，包含以下(a)~(f)之步驟：(a)獲得在高鈣離子濃度之條件下抗體對於抗原之結合活性；(b)獲得在低鈣離子濃度之條件下抗體對於抗原之結合活性；(c)選擇在(a)獲得之抗原結合活性高於在(b)獲得之抗原 結合活性的抗體；(d)將編碼為於(c)選擇之抗體之抗原結合分域之聚核苷酸，連結於編碼為於pH酸性域條件下對於人類FcRn有結合活性且於pH中性域條件下對於Fcγ受體之結合活性比起結合於EU編號297位之糖鏈為含岩藻糖之糖鏈之天然型人類IgG之Fc區對於Fcγ受體之結合活性為高之Fcγ受體結合分域的聚核苷酸；(e)培養導入有於(d)獲得之聚核苷酸以能作用地連結的載體的細胞；及(f)從於(e)培養之細胞之培養液回收抗原結合分子。
[45]一種抗原結合分子之製造方法，包含以下(a)~(f)之步驟：(a)獲得於pH中性域之條件下抗原結合分域對於抗原之結合活性；(b)獲得於pH酸性域之條件下抗原結合分域對於抗原之結合活性；(c)選擇在(a)獲得之抗原結合活性高於在(b)獲得之抗原結合活性的抗原結合分域；(d)將編碼為於(c)選擇之抗原結合分域之聚核苷酸，連結於編碼為於pH酸性域條件下對於人類FcRn有結合活性且於pH中性域條件下對於Fcγ受體之結合活性比起結合於EU編號297位之糖鏈為含岩藻糖之糖鏈之天然型人類IgG之Fc區對於Fcγ受體之結合活性為高之Fcγ受體結合分域的聚核苷酸； (e)培養導入有於(d)獲得之聚核苷酸以能作用地連結的載體的細胞；及(f)從於(e)培養之細胞之培養液回收抗原結合分子。
[46]一種抗原結合分子之製造方法，包含以下(a)~(f)之步驟：(a)獲得於pH中性域之條件下抗體對於抗原之結合活性；(b)獲得於pH酸性域之條件下抗體對於抗原之結合活性；(c)選擇在(a)獲得之抗原結合活性高於在(b)獲得之抗原結合活性的抗體；(d)將編碼為於(c)選擇之抗體之抗原結合分域之聚核苷酸，連結於編碼為於pH酸性域條件下對於人類FcRn有結合活性且於pH中性域條件下對於Fcγ受體之結合活性比起結合於EU編號297位之糖鏈為含岩藻糖之糖鏈之天然型人類IgG之Fc區對於Fcγ受體之結合活性為高之Fcγ受體結合分域的聚核苷酸；(e)培養導入有於(d)獲得之聚核苷酸以能作用地連結的載體的細胞；及(f)從於(e)培養之細胞之培養液回收抗原結合分子。
[47]如[43]至[46]中任一項之製造方法，其中，前述抗原為可溶型抗原。
[48]如[43]至[47]中任一項之製造方法，其中，前述Fcγ受體結合分域，包含抗體之Fc區。
[49]如[48]之製造方法，其中，前述Fc區，在Fc區之以EU編號表示之部位當中，選自於221位、222位、223位、 224位、225位、227位、228位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、243位、244位、245位、246位、247位、249位、250位、251位、254位、255位、256位、258位、260位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、339位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位及440位之群中至少1個以上之胺基酸，與天然型Fc區之對應部位之胺基酸不同。
[50]如[49]之製造方法，其中，前述Fc區，其中，該Fc區，包含選自於在Fc區之EU編號表示之部位當中；221位之胺基酸為Lys或Tyr中之任一者、222位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中之任一者、223位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Lys中之任一者、224位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中之任一者、225位之胺基酸為Glu、Lys或Trp中之任一者、 227位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、228位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、230位之胺基酸為Ala、Glu、Gly或Tyr中之任一者、231位之胺基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中之任一者、232位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、233位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、234位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、235位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、236位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、237位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、238位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、239位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、 Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、240位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、241位之胺基酸為Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中之任一者、243位之胺基酸為Leu、Glu、Leu、Gln、Arg、Trp或Tyr中之任一者、244位之胺基酸為His、245位之胺基酸為Ala、246位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、247位之胺基酸為Ala、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Thr、Val或Tyr中之任一者、249位之胺基酸為Glu、His、Gln或Tyr中之任一者、250位之胺基酸為Glu或Gln中之任一者、251位之胺基酸為Phe、254位之胺基酸為Phe、Met或Tyr中之任一者、255位之胺基酸為Glu、Leu或Tyr中之任一者、256位之胺基酸為Ala、Met或Pro中之任一者、258位之胺基酸為Asp、Glu、His、Ser或Tyr中之任一者、260位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、262位之胺基酸為Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中之任一者、263位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、264位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr 中之任一者、265位之胺基酸為Ala、Leu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、266位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、267位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、268位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Trp中之任一者、269位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、270位之胺基酸為Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、271位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、272位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、273位之胺基酸為Phe或Ile中之任一者、274位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、275位之胺基酸為Leu或Trp中之任一者、 276位之胺基酸為、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、278位之胺基酸為Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中之任一者、279位之胺基酸為Ala、280位之胺基酸為Ala、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gln、Trp或Tyr中之任一者、281位之胺基酸為Asp、Lys、Pro或Tyr中之任一者、282位之胺基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中之任一者、283位之胺基酸為Ala、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg或Tyr中之任一者、284位之胺基酸為Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中之任一者、285位之胺基酸為Asp、Glu、Lys、Gln、Trp或Tyr中之任一者、286位之胺基酸為Glu、Gly、Pro或Tyr中之任一者、288位之胺基酸為Asn、Asp、Glu或Tyr中之任一者、290位之胺基酸為Asp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、291位之胺基酸為Asp、Glu、Gly、His、Ile、Gln或Thr中之任一者、292位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中之任一者、293位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、 Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、294位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、295位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、296位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr或Val中之任一者、297位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、298位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、299位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中之任一者、300位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中之任一者、301位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、302位之胺基酸為Ile、303位之胺基酸為Asp、Gly或Tyr中之任一者、304位之胺基酸為Asp、His、Leu、Asn或Thr中之任一者、305位之胺基酸為Glu、Ile、Thr或Tyr中之任一者、 311位之胺基酸為Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中之任一者、313位之胺基酸為Phe、315位之胺基酸為Leu、317位之胺基酸為Glu或Gln、318位之胺基酸為His、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Tyr中之任一者、320位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、322位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、323位之胺基酸為Ile、324位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、325位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、326位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、327位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、328位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或 Tyr中之任一者、329位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、330位之胺基酸為Cys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、331位之胺基酸為Asp、Phe、His、Ile、Leu、Met、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、332位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、333位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Ser、Thr、Val或Tyr中之任一者、334位之胺基酸為Ala、Glu、Phe、Ile、Leu、Pro或Thr中之任一者、335位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中之任一者、336位之胺基酸為Glu、Lys或Tyr中之任一者、337位之胺基酸為Glu、His或Asn中之任一者、339位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser或Thr中之任一者、376位之胺基酸為Ala或Val中之任一者、377位之胺基酸為Gly或Lys中之任一者、 378位之胺基酸為Asp、379位之胺基酸為Asn、380位之胺基酸為Ala、Asn或Ser中之任一者、382位之胺基酸為Ala或Ile中之任一者、385位之胺基酸為Glu、392位之胺基酸為Thr、396位之胺基酸為Leu、421位之胺基酸為Lys、427位之胺基酸為Asn、428位之胺基酸為Phe或Leu中之任一者、429位之胺基酸為Met、434位之胺基酸為Trp、436位之胺基酸為Ile、及440位之胺基酸為Gly、His、Ile、Leu或Tyr中之任一者、之群中至少1個以上的胺基酸。
[51]如[43]至[50]中任一項之製造方法，其中，前述結合於EU編號297位之糖鏈係含岩藻糖之糖鏈之天然型人類IgG之Fc區，為結合於EU編號297位之糖鏈係含岩藻糖之糖鏈之天然型人類IgG1、天然型人類IgG2、天然型人類IgG3或天然型人類IgG4中之任一者之Fc區。
[52]如[43]至[51]中任一項之製造方法，其中，前述人類Fcγ受體，為FcγRIa、FcγRIIa(R)、FcγRIIa(H)、FcγRIIb、FcγRIIIa(V)、或FcγRIIIa(F)。
[53]如[43]至[51]中任一項之製造方法，其中，前述人類 Fcγ受體為FcγRIIb。
[54]如[48]至[53]中任一項之製造方法，其中，前述Fc區，含有在Fc區之以EU編號表示之部位當中；238位之胺基酸為Asp、或328位之胺基酸為Glu、中之至少1個以上的胺基酸。
【實施發明之形態】
以下定義及詳細說明，在本說明書係為了容易理解本發明之說明而提供。
胺基酸
本說明書中，以例如Ala/A、Leu/L、Arg/R、Lys/K、Asn/N、Met/M、Asp/D、Phe/F、Cys/C、Pro/P、Gln/Q、Ser/S、Glu/E、Thr/T、Gly/G、Trp/W、His/H、Tyr/Y、Ile/I、Val/V所表示，將胺基酸以單字母碼或三字母碼、或其兩者表示記載。
胺基酸之改變
為了抗原結合分子之胺基酸序列中之胺基酸之改變，可適當採用部位專一性的變異誘發法(Kunkel等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82,488-492))或Overlap extension PCR等公知方法。依照該等公知方法可適當加以胺基酸附加、缺失、及/或取代。胺基酸殘基取代，係藉由取代為其他胺基酸殘基，而針對例如以下(a)~(c)之點改變為目的。
(a)板片構造、或螺旋構造之區中之多胜肽之背骨構造；(b)標的部位之電荷或疏水性、或(c)側鏈大小。
胺基酸殘基依其構造所含側鏈之特性分類為以下群：(1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)鹼性：His、Lys、Arg；(5)影響鏈配向之殘基：Gly、Pro；及(6)芳香族性：Trp、Tyr、Phe。
該等各群內之胺基酸殘基之取代稱為保守性取代，另外，在其他群間彼此的胺基酸殘基取代稱為非保守的取代。本發明之取代，可為保守的取代也可為非保守的取代，也可為保守的取代與非保守的取代的組合。又，取代為天然胺基酸以外之胺基酸之胺基酸之改變方法，也可採用多數公知方法(Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.(2006)35,225-249、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2003)100(11),6353-6357)。例如於含有為終止密碼子的1個UAG密碼子(amber codon)的互補amber suppressor tRNA結合有非天然胺基酸之tRNA的無細胞轉譯系系統(Clover Direct(Protein Express))等也可理想地使用。
又，表示胺基酸改變之表達，可適當使用在表示特定位置之數字前後使用改變前與改變後之胺基酸之單字母碼之表達。例如，對抗體不變區所含之Fc區施以胺基酸取代 時之稱為P238D改變，係表示EU編號表示之238位之Pro取代為Asp。亦即數字表示EU編號表示之胺基酸之位置，在其前記載之胺基酸單字母碼代表取代前之胺基酸，之後記載之胺基酸之單字母碼代表取代後之胺基酸。
及/或
本說明書中，「及/或」之用語之含意義，係「及/或」之前後之用語之組合，包括「及」與「或」適當組合的各種組合。具體而言，例如「326位、328位、及/或428位之胺基酸被取代」，代表以下胺基酸的改變的多樣性；(a)326位、(b)328位、(c)428位、(d)326位及328位、(e)326位及428位、(f)328位及428位、(g)326位及328位及428位。
抗原
本說明書中，「抗原」只要含有抗原結合分域所結合之抗原決定基(epitope)即可，其構造不限於特定構造。就其他含意而言，抗原也可為無機物也可為有機物，但宜為以本發明之抗原結合分子能結合之態樣存在於活體之體液中之可溶型抗原。抗原可列舉如下列分子；17-IA、4-1BB、4Dc、6-酮-PGF1a、8-異-PGF2a、8-側氧基-dG、A1腺苷受體、A33、ACE、ACE-2、活化素(activin)、活化素A、活化素AB、活化素B、活化素C、活化素RIA、活化素RIA ALK-2、活化素RIB ALK-4、活化素RIIA、活化素RIIB、ADAM、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、Addressin、aFGF、 ALCAM、ALK、ALK-1、ALK-7、alpha-1-antitrypsin、alpha-V/beta-1拮抗劑、ANG、Ang、APAF-1、APE、APJ、APP、APRIL、AR、ARC、ART、Artemin、抗Id、ASPARTIC、心房性鈉利尿因子、av/b3細胞黏合素、Ax1、b2M、B7-1、B7-2、B7-H、B-淋巴球刺激因子(BlyS)、BACE、BACE-1、Bad、BAFF、BAFF-R、Bag-1、BAK、Bax、BCA-1、BCAM、Bc1、BCMA、BDNF、b-ECGF、bFGF、BID、Bik、BIM、BLC、BL-CAM、BLK、BMP、BMP-2 BMP-2a、BMP-3 Osteogenin(Osteogenin)、BMP-4BMP-2b、BMP-5、BMP-6Vgr-1、BMP-7(OP-1)、BMP-8(BMP-8a、OP-2)、BMPR、BMPR-IA(ALK-3)、BMPR-IB(ALK-6)、BRK-2、RPK-1、BMPR-II(BRK-3)、BMP、b-NGF、BOK、Bombesin、骨來源神經營養因子(Bone-derived neurotrophic factor)、BPDE、BPDE-DNA、BTC、補體因子3(C3)、C3a、C4、C5、C5a、C10、CA125、CAD-8、calcitonin、cAMP、癌胎兒抗原(CEA)、癌關連抗原(carcinoma-associated antigen)、CathepsinA、CathepsinB、CathepsinC/DPPI、CathepsinD、CathepsinE、CathepsinH、CathepsinL、CathepsinO、CathepsinS、CathepsinV、CathepsinX/Z/P、CBL、CCI、CCK2、CCL、CCL1、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9/10、CCR、CCR1、CCR10、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CD1、CD2、CD3、 CD3E、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27L、CD28、CD29、CD30、CD30L、CD32、CD33(p67蛋白質)、CD34、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD49a、CD52、CD54、CD55、CD56、CDG1、CD64、CD66e、CD74、CD80(B7-1)、CD89、CD95、CD123、CD137、CD138、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD152、CD164、CEACAM5、CFTR、cGMP、CINC、肉毒桿菌(Clostridium botulinum)毒素、Clostridium perfringens(Clostridium perfringens)毒素、CKb8-1、CLC、CMV、CMV UL、CNTF、CNTN-1、COX、C-Ret、CRG-2、CT-1、CTACK、CTGF、CTLA-4、CX3CL1、CX3CR1、CXCL、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCR、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、cytokeratin腫瘤關連抗原、DAN、DCC、DcR3、DC-SIGN、補體控制因子(Decay accelerating factor)、des(1-3)-IGF-I(腦IGF-1)、Dhh、Digoxin、DNAM-1、Dnase、Dpp、DPPIV/CD26、Dtk、ECAD、EDA、EDA-A1、EDA-A2、EDAR、EGF、EGFR(ErbB-1)、EMA、EMMPRIN、ENA、endothelin受體、enkephalinase、eNOS、Eot、eotaxin 1、EpCAM、Ephrin B2/EphB4、EPO、ERCC、E-selectin、ET-1、第IIa因子、第VII因子、第VIIIc因子、第IX因子、纖維母細胞活化蛋白質(FAP)、Fas、FcR1、FEN-1、ferritin、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF3、FGF-8、 FGFR、FGFR-3、fibrin、FL、FLIP、Flt-3、Flt-4、卵泡刺激荷爾蒙、fractalkine、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、G250、Gas6、GCP-2、GCSF、GD2、GD3、GDF、GDF-1、GDF-3(Vgr-2)、GDF-5(BMP-14、CDMP-1)、GDF-6(BMP-13、CDMP-2)、GDF-7(BMP-12、CDMP-3)、GDF-8(myostatin)、GDF-9、GDF-15(MIC-1)、GDNF、GDNF、GFAP、GFRa-1、GFR-alpha1、GFR-alpha2、GFR-alpha3、GITR、升糖素、Glut4、糖蛋白IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)、GM-CSF、gp130、gp72、GRO、成長荷爾蒙釋放因子、半抗原(NP-cap或NIP-cap)、HB-EGF、HCC、HCMV gB外被糖蛋白、HCMV gH外被糖蛋白、HCMV UL、造血成長因子(HGF)、Hep B gp120、heparanase、Her2、Her2/neu(ErbB-2)、Her3(ErbB-3)、Her4(ErbB-4)、單純皰疹病毒(HSV)gB糖蛋白、HSV gD糖蛋白、HGFA、高分子量黑色素瘤關連抗原(High molecular weight melanoma-associated antigen)(HMW-MAA)、HIV gp120、HIV IIIB gp 120 V3環圈、HLA、HLA-DR、HM1.24、HMFG PEM、HRG、Hrk、人類心肌肌凝蛋白、人類細胞巨病毒(HCMV)、人類成長荷爾蒙(hGH)、HVEM、I-309、IAP、ICAM、ICAM-1、ICAM-3、ICE、ICOS、IFNg、Ig、IgA受體、IgE、IGF、IGF結合蛋白質、IGF-1R、IGFBP、IGF-I、IGF-II、IL、IL-1、IL-1R、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-5R、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-18R、IL-23、干擾素(INF)-alpha、INF-beta、 INF-gamma、inhibin、iNOS、胰島素A鏈、胰島素B鏈、胰島素狀增殖因子1、細胞黏合素alpha2、細胞黏合素(integrin)alpha3、細胞黏合素alpha4、細胞黏合素alpha4/beta 1、細胞黏合素alpha4/beta 7、細胞黏合素alpha5(alphaV)、細胞黏合素alpha5/beta 1、細胞黏合素alpha5/beta 3、細胞黏合素alpha6、細胞黏合素beta 1、細胞黏合素beta 2、干擾素gamma、IP-10、I-TAC、JE、kallikrein2、kallikrein5、kallikrein6、kallikrein11、kallikrein12、kallikrein14、kallikrein15、kallikreinL1、kallikreinL2、kallikreinL3、kallikreinL4、KC、KDR、角質化細胞增殖因子(KGF)、laminin 5、LAMP、LAP、LAP(TGF-1)、潛在型TGF-1、潛在型TGF-1 bp1、LBP、LDGF、LECT2、lefty、Lewis-Y抗原、Lewis-Y關連抗原、LFA-1、LFA-3、Lfo、LIF、LIGHT、脂蛋白、LIX、LKN、Lptn、L-selectin、LT-a、LT-b、LTB4、LTBP-1、肺界面活性劑、黃體形成荷爾蒙、lympotoxin beta受體、Mac-1、MAdCAM、MAG、MAP2、MARC、MCAM、MCAM、MCK-2、MCP、M-CSF、MDC、Mer、METALLOPROTEASES、MGDF受體、MGMT、MHC(HLA-DR)、MIF、MIG、MIP、MIP-1-alpha、MK、MMAC1、MMP、MMP-1、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP-24、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MPIF、Mpo、MSK、MSP、mutin(Muc1)、MUC18、Muller管抑制物質、Mug、MuSK、NAIP、NAP、NCAD、N-Cadherin、NCA 90、NCAM、NCAM、 neprilysin、neurotrophin-3、-4、或-6、neurturin、神經成長因子(NGF)、NGFR、NGF-beta、nNOS、NO、NOS、Npn、NRG-3、NT、NTN、OB、OGG1、OPG、OPN、OSM、OX40L、OX40R、p150、p95、PADPr、副甲狀腺荷爾蒙、PARC、PARP、PBR、PBSF、PCAD、P-Cadherin、PCNA、PDGF、PDGF、PDK-1、PECAM、PEM、PF4、PGE、PGF、PGI2、PGJ2、PIN、PLA2、胎盤性鹼性磷解酶(PLAP)、PlGF、PLP、PP14、胰島素前體、prorelaxin、proteinC、PS、PSA、PSCA、前列腺專一性膜抗原(PSMA)、PTEN、PTHrp、Ptk、PTN、R51、RANK、RANKL、RANTES、RANTES、relaxinA鏈、relaxinB鏈、腎素(renin)、呼吸器多核體病毒(RSV)F、RSV Fgp、Ret、風濕因子、RLIP76、RPA2、RSK、S100、SCF/KL、SDF-1、SERINE、血清白蛋白、sFRP-3、Shh、SIGIRR、SK-1、SLAM、SLPI、SMAC、SMDF、SMOH、SOD、SPARC、Stat、STEAP、STEAP-II、TACE、TACI、TAG-72(腫瘤關連糖蛋白-72)、TARC、TCA-3、T細胞受體(例如T細胞受體alpha/beta)、TdT、TECK、TEM1、TEM5、TEM7、TEM8、TERT、睾丸PLAP狀鹼性磷解酶、TfR、TGF、TGF-alpha、TGF-beta、TGF-beta Pan Specific、TGF-beta RI(ALK-5)、TGF-beta RII、TGF-beta RIIb、TGF-beta RIII、TGF-beta 1、TGF-beta 2、TGF-beta 3、TGF-beta 4、TGF-beta 5、凝血酶(thrombin)、胸腺Ck-1、甲狀腺刺激荷爾蒙、Tie、TIMP、TIQ、組織因子、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、TNF、TNF-alpha、TNF-alpha beta、TNF-beta 2、TNFc、TNF-RI、TNF-RII、 TNFRSF10A(TRAIL R1 Apo-2、DR4)、TNFRSF10B(TRAIL R2 DR5、KILLER、TRICK-2A、TRICK-B)、TNFRSF10C(TRAIL R3 DcR1、LIT、TRID)、TNFRSF10D(TRAIL R4 DcR2、TRUNDD)、TNFRSF11A(RANK ODF R、TRANCE R)、TNFRSF11B(OPG OCIF、TR1)、TNFRSF12(TWEAK R FN14)、TNFRSF13B(TACI)、TNFRSF13C(BAFF R)、TNFRSF14(HVEM ATAR、HveA、LIGHT R、TR2)、TNFRSF16(NGFR p75NTR)、TNFRSF17(BCMA)、TNFRSF18(GITR AITR)、TNFRSF19(TROY TAJ、TRADE)、TNFRSF19L(RELT)、TNFRSF1A(TNF RI CD120a、p55-60)、TNFRSF1B(TNF RII CD120b、p75-80)、TNFRSF26(TNFRH3)、TNFRSF3(LTbR TNF RIII、TNFC R)、TNFRSF4(OX40 ACT35、TXGP1 R)、TNFRSF5(CD40 p50)、TNFRSF6(Fas Apo-1、APT1、CD95)、TNFRSF6B(DcR3 M68、TR6)、TNFRSF7(CD27)、TNFRSF8(CD30)、TNFRSF9(4-1BB CD137、ILA)、TNFRSF21(DR6)、TNFRSF22(DcTRAIL R2 TNFRH2)、TNFRST23(DcTRAIL R1 TNFRH1)、TNFRSF25(DR3 Apo-3、LARD、TR-3、TRAMP、WSL-1)、TNFSF10(TRAIL Apo-2配體、TL2)、TNFSF11(TRANCE/RANK配體ODF、OPG配體)、TNFSF12(TWEAK Apo-3配體、DR3配體)、TNFSF13(APRIL TALL2)、TNFSF13B(BAFF BLYS、TALL1、THANK、TNFSF20)、TNFSF14(LIGHT HVEM配體、LTg)、TNFSF15(TL1A/VEGI)、TNFSF18(GITR配體AITR配體、TL6)、TNFSF1A(TNF-aConectin、DIF、TNFSF2)、TNFSF1B(TNF-b LTa、TNFSF1)、TNFSF3(LTb TNFC、p33)、TNFSF4(OX40配體gp34、TXGP1)、 TNFSF5(CD40配體CD154、gp39、HIGM1、IMD3、TRAP)、TNFSF6(Fas配體Apo-1配體、APT1配體)、TNFSF7(CD27配體CD70)、TNFSF8(CD30配體CD153)、TNFSF9(4-1BB配體CD137配體)、TP-1、t-PA、Tpo、TRAIL、TRAIL R、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRANCE、transferrin受體、TRF、Trk、TROP-2、TSG、TSLP、腫瘤關連抗原CA125、腫瘤關連抗原表現Lewis Y關連碳水化合物、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、尿激酶、VCAM、VCAM-1、VECAD、VE-Cadherin、VE-cadherin-2、VEFGR-1(flt-1)、VEGF、VEGFR、VEGFR-3(flt-4)、VEGI、VIM、病毒抗原、VLA、VLA-1、VLA-4、VNR細胞黏合素、Von Willebrand因子、WIF-1、WNT1、WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16、XCL1、XCL2、XCR1、XCR1、XEDAR、XIAP、XPD、HMGB1、IgA、Aβ、CD81,CD97,CD98,DDR1,DKK1,EREG、Hsp90,IL-17/IL-17R、IL-20/IL-20R、氧化LDL,PCSK9,prekallikrein,RON,TMEM16F、SOD1,Chromogranin A,Chromogranin B、tau,VAP1、高分子kininogen、IL-31、IL-31R、Navl.1、Navl.2、Navl.3、Navl.4、Navl.5、Navl.6、Navl.7、Navl.8、Navl.9、EPCR、C1、C1q、C1r、C1s、C2、C2a、C2b、C3、C3a、C3b、C4、C4a、C4b、C5、C5a、C5b、C6、C7、C8、C9、factor B、factor D、factor H、properdin、sclerostin、fibrinogen、fibrin、prothrombin、thrombin、組織因子、factor V、 factor Va、factor VII、factor VIIa、factor VIII、factor VIIIa、factor IX、factor IXa、factor X、factor Xa、factor XI、factor XIa、factor XII、factor XIIa、factor XIII、factor XIIIa、TFPI、antithrombin III、EPCR、thrombomodulin、TAPI、tPA、plasminogen、plasmin、PAI-1、PAI-2、GPC3、Syndecan-1、Syndecan-2、Syndecan-3、Syndecan-4、LPA、S1P、Acetylcholine受體、AdipoR1、AdipoR2、ADP ribosyl cyclase-1、alpha-4/beta-7 integrin、alpha-5/beta-1 integrin、alpha-v/beta-6 integrin、alphavbetal integrin、Angiopoietin配體-2、Angptl2、Anthrax、Cadherin、Carbonic anhydrase-IX、CD105、CD155、CD158a、CD37、CD49b、CD51、CD70、CD72、Claudin 18、Clostridium difficile toxin、CS1、Delta-like protein配體4、DHICA oxidase、Dickkopf-1配體、Dipeptidyl peptidase IV、EPOR、F protein of RSV、Factor Ia、FasL、Folate受體alpha、Glucagon受體、Glucagon-like peptide 1受體、Glutamate carboxypeptidase II、GMCSFR、Hepatitis C virus E2糖蛋白、Hepcidin、IL-17受體、IL-22受體、IL-23受體、IL-3受體、Kit tyrosine kinase、Leucine Rich Alpha-2-Glycoprotein 1(LRG1)、Lysosphingolipid受體、膜糖蛋白OX2、Mesothelin、MET、MICA、MUC-16、Myelin associated糖蛋白、Neuropilin-1、Neuropilin-2、Nogo受體、PLXNA1、 PLXNA2、PLXNA3、PLXNA4A、PLXNA4B、PLXNB1、PLXNB2、PLXNB3、PLXNC1、PLXND1、程式化細胞死亡配體1、Proprotein convertase PC9、P-selectin糖蛋白配體-1、RAGE、Reticulon 4、RF、RON-8、SEMA3A、SEMA3B、SEMA3C、SEMA3D、SEMA3E、SEMA3F、SEMA3G、SEMA4A、SEMA4B、SEMA4C、SEMA4D、SEMA4F、SEMA4G、SEMA5A、SEMA5B、SEMA6A、SEMA6B、SEMA6C、SEMA6D、SEMA7A、Shiga like toxin II、Sphingosine-1-phosphate受體-1、ST2、Staphylococcal lipoteichoic acid、Tenascin、TG2、Thymic stromal lymphoprotein受體、TNF superfamily受體12A、穿膜糖蛋白NMB、TREM-1、TREM-2、Trophoblast糖蛋白、TSH受體、TTR、Tubulin、ULBP2及激素及成長因子用之受體當中，在活體體液中不會留在細胞而以可溶型式存在之分子。受體之中，例如細胞表面表現之受體等會由於包含以蛋白酶消化等之某些機制而存在於活體之體液中之可溶型抗原也是本發明之可溶型抗原之理想例。如此之分子，例如本說明書記載之可溶型IL-6R分子(J.Immunol.(1994)152,4958-4968)或CD20、CD52(Br.J.Haematol.(2003)123(5),850-857)等。又，不僅是在活體內固有表現之分子，由病毒等感染性生物或在該等生物上提示之抗原、病原性蛋白顆粒(prion)等感染性分子且於活體之體液中存在之可溶型抗原，也可作為本發明之可溶型抗原之例示。體液可列舉血液、血漿、血清、尿、淋巴液、唾液、涙液等液體為等理想例。
抗原決定部位
意指抗原中存在之抗原決定基(epitope)之抗原決定部位，係指本說明書揭示之抗原結合分子中之抗原結合分域所結合之抗原上之部位。因此，例如：抗原決定部位可由其構造定義。又，該抗原決定部位也可由認識該抗原決定部位之抗原結合分子中對於抗原之結合活性定義。抗原為胜肽或多胜肽時，也可利用構成抗原決定部位之胺基酸殘基指定抗原決定部位。又，抗原決定部位為糖鏈時，也可利用特定糖鏈構造來指定抗原決定部位。
直線狀抗原決定部位，係包含認識胺基酸一次序列的抗原決定部位的抗原決定部位。直線狀抗原決定部位典型在固有序列中至少含有3個，且最普通為至少5個，例如約8至約10個，6至20個胺基酸。
立體構造抗原決定部位，與直線狀抗原決定部位相對照，係指含有抗原決定部位之胺基酸之一次序列並非所認識之抗原決定部位之單一規定成分的抗原決定部位(例如：胺基酸之一次序列不一定由規定抗原決定部位之抗體所認識之抗原決定部位)。立體構造抗原決定部位，可能包含對於直線狀抗原決定部位為更多之數之胺基酸。關於立體構造抗原決定部位之認識，抗體認識胜肽或蛋白質之三維構造。例如：蛋白質分子折疊形成三維構造時，形成立體構造抗原決定部位之某個胺基酸及/或多胜肽主鏈，可以並排，抗體可認識抗原決定部位。決定抗原決定部位之立體構造之方法，包含例如X射線結晶學、二維核磁共振分光學及 部位專一性旋轉標誌及電磁常磁性共振分光學，但不限於該等。例如參考：Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology(1996)、第66卷、Morris(編)。
結合活性
以下例示確認含有對抗IL-6R之抗原結合分域的待驗抗原結合分子其對於抗原決定部位之結合的確認方法，但是確認含有對抗IL-6R以外之抗原的抗原結合分域之待驗抗原結合分子其對於抗原決定部位之結合的確認方法，也可依照下列例示適當實施。
例如：含有對抗IL-6R之抗原結合分域的待驗抗原結合分子會認識IL-6R分子中存在之線狀抗原決定部位之情事，例如可以如下方式確認。為了上述目的，合成由構成IL-6R之細胞外分域之胺基酸序列構成的線狀胜肽。該胜肽可化學合成。或，利用IL-6R之cDNA中之編碼為相當於細胞外分域之胺基酸序列之區域，以基因工程方法可獲得。其次，評價由構成細胞外分域之胺基酸序列所構成的線狀胜肽與含有對於IL-6R之抗原結合分域的待驗抗原結合分子間的結合活性。例如，利用以經固定化之線狀胜肽為抗原之ELISA，可評價該抗原結合分子對於該胜肽之結合活性。或，依據IL-6R表現細胞中，該抗原結合分子之結合時由於線狀胜肽所致抑制的水平，可以明確獲得對於線狀胜肽之結合活性。利用該等試驗，可以明確獲得該抗原結合分子對於線狀胜肽之結合活性。
又，含有對抗IL-6R之抗原結合分域的待驗抗原結合 分子會認識立體構造抗原決定部位之情事，可由以下方式確認。為了上述目的，製備表現IL-6R之細胞。含有對抗IL-6R之抗原結合分域的待驗抗原結合分子接觸IL-6R表現細胞時，會強力結合於該細胞，另一方面，對於固定化有該抗原結合分子之由構成IL-6R之細胞外分域的胺基酸序列而成的線狀胜肽，實質上不結合時等。在此，實質上不結合，係指對於人類IL-6R表現細胞之結合活性之80%以下、通常50%以下，較佳為30%以下，尤佳為15%以下之結合活性。
包含對抗IL-6R之抗原結合分域之待驗抗原結合分子其對於IL-6R表現細胞之結合活性之測定方法，例如：Antibodies A Laboratory Manual記載之方法(Ed Harlow,David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)359-420)。亦即，可利用以IL-6R表現細胞為抗原之ELISA或FACS(fluorescence activated cell sorting)之原理評價。
ELISA格式中，包含對抗IL-6R之抗原結合分域之待驗抗原結合分子其對於IL-6R表現細胞之結合活性，可利用比較酵素反應所生成之信號水平而定量評價。亦即，在固定化有IL-6R表現細胞之ELISA板添加待驗抗原結合分子，利用認識待驗抗原結合分子之酵素標記檢測結合於抗體細胞之待驗抗原結合分子。或FACS中，製作待驗抗原結合分子之稀釋系列，決定對於IL-6R表現細胞之抗體結合力價(titer)，藉此可比較待驗抗原結合分子對於IL-6R表 現細胞之結合活性。
待驗抗原結合分子對於在懸浮於緩衝液等之細胞表面上表現之抗原之結合，可利用流式細胞計數器檢測。流式細胞計數器已知例如如下裝置。
FACSCantoTM II
FACSAriaTM
FACSArrayTM
FACSVantageTM SE
FACSCaliburTM(均為BD Biosciences公司的商品名)
EPICS ALTRA HyPerSort
Cytomics FC 500
EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC
Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC(均為Beckman Coulter公司之商品名)
例如：包含對抗IL-6R之抗原結合分域之待驗抗原結合分子其對於抗原之結合活性之理想測定方法，例如以下方法。首先，以認識與表現IL-6R之細胞反應之待驗抗原結合分子的經FITC標定的二次抗體染色。將待驗抗原結合分子以適當理想的緩衝液稀釋，可將該抗原結合分子製成所望濃度。例如可使用10μg/ml至10 ng/ml之間的任一濃度。其次，以FACSCalibur(BD公司)測定螢光強度及細胞數。抗體對於該細胞之結合量，反映於使用CELL QUEST軟體(BD公司)解析所得之螢光強度，亦即幾何平均值(幾何平均)。亦即，藉由獲得該幾何平均之值，可測定待驗抗 原結合分子之結合量所代表之待驗抗原結合分子之結合活性。
包含對抗IL-6R之抗原結合分域之待驗抗原結合分子與某抗原結合分子共有抗原決定部位之情事，可藉由兩者對於相同抗原決定部位之彼此競爭而確認。抗原結合分子間之彼此競爭，可利用交叉阻斷試驗等檢測。例如彼此競爭ELISA試驗為較佳的交叉阻斷試驗。
具體而言，交叉阻斷試驗中，塗覆在微滴定板之井上的IL-6R蛋白質，於候選的彼此競爭抗原結合分子存在下或非存在下，預備溫育後，添加待驗抗原結合分子。井中之IL-6R蛋白質所結合之待驗抗原結合分子之量，間接相關於成為彼此競爭之候選的彼此競爭抗原結合分子對於相同抗原決定部位之結合之結合能力。亦即，彼此競爭抗原結合分子對於相同抗原決定部位之親和性愈大，則對於塗覆有待驗抗原結合分子之IL-6R蛋白質之井的結合活性愈低。
經由IL-6R蛋白質而結合於井之待驗抗原結合分子之量，可藉由預先標記抗原結合分子而輕易測定。例如，經生物素標記之抗原結合分子，可藉由抗生物素蛋白過氧化酶接合體及適當基質測定。利用過氧化酶等酵素標記之交叉阻斷試驗，尤其稱為彼此競爭ELISA試驗。抗原結合分子可以用能檢測或測定之其他標記物質予以標記。具體而言，放射標記或螢光標記等為公知。
比起於不存在候選之彼此競爭抗原結合分子下實施之 對照試驗中獲得之結合活性，彼此競爭抗原結合分子若能阻斷包含對抗IL-6R之抗原結合分域之待驗抗原結合分子之結合至少20%，較佳為至少20-50%，更佳為至少50%，則該待驗抗原結合分子係與彼此競爭抗原結合分子實質上結合於相同抗原決定部位，或對於相同抗原決定部位之結合為彼此競爭之抗原結合分子。
包含對抗IL-6R之抗原結合分域之待驗抗原結合分子所結合之抗原決定部位在鑑定構造時，待驗抗原結合分子與對照抗原結合分子共有抗原決定部位之情事，可藉由比較兩者之抗原結合分子對於構成該抗原決定部位之胜肽導入有胺基酸變異而成之胜肽之結合活性而予以評價。
如此測定結合活性之方法，例如可藉由比較前述ELISA格式中，待驗抗原結合分子及對照抗原結合分子對於導入有變異的線狀胜肽的結合活性而測定。就ELISA以外之方法而言，也可藉由將對於結合於管柱之該變異胜肽的結合活性，以使待驗抗原結合分子與對照抗原結合分子流下該管柱後溶出到溶出液中之抗原結合分子進行定量而測定。使變異胜肽例如與GST之融合胜肽吸附於管柱之方法為公知。
又，當鑑定的抗原決定部位為立體抗原決定部位時，待驗抗原結合分子與對照抗原結合分子共有抗原決定部位之情事，可藉由以下方法評價。首先，製備表現IL-6R之細胞以及表現對於抗原決定部位導入有變異之IL-6R的細胞。對於該等細胞懸浮於PBS等適當緩衝液而成的細胞懸 浮液添加待驗IL-6R與對照IL-6R。其次，對於經適當緩衝液洗滌的細胞懸浮液，添加能夠認識待驗IL-6R與對照IL-6R的經FITC標記的抗體。利用FACSCalibur(BD公司)測定由標記抗體染色之細胞之螢光強度及細胞數。將待驗IL-6R與對照IL-6R之濃度以適當緩衝液適當稀釋以製備為所望濃度後使用。例如可使用10μg/ml至10 ng/ml之間的任一濃度。標記抗體對於該細胞之結合量，反映於使用CELL QUEST軟體(BD公司)解析所獲得之螢光強度，亦即幾何平均值。亦即藉由獲得該幾何平均值，可以測定以標記抗體之結合量所代表之待驗抗原結合分子與對照抗原結合分子之結合活性。
本方法中，例如「實質上不結合於變異IL-6R表現細胞」之情事，可藉由以下方法判斷。首先，將已對於表現變異IL-6R之細胞結合之待驗抗原結合分子與對照抗原結合分子以標記抗體染色。接著，檢測細胞之螢光強度。螢光檢測使用FACSCalibur當做流式細胞計數儀時，獲得之螢光強度可以使用CELL QUEST軟體解析。從抗原結合分子存在下及非存在下之幾何平均值，將其比較值(△幾何平均)依下列計算式計算，可以求得抗原結合分子之結合所致之螢光強度之增加比例。
△幾何平均值=幾何平均值(抗原結合分子存在下)/幾何平均值(抗原結合分子非存在下)
將由解析獲得之反映待驗抗原結合分子對於變異IL-6R表現細胞之結合量的幾何平均比較值(變異IL-6R分 子△幾何平均值)，與反映待驗抗原結合分子對於IL-6R表現細胞之結合量的△幾何平均值比較值進行比較。於該情形，求取對於變異IL-6R表現細胞及IL-6R表現細胞之△幾何平均比較值時使用之待驗抗原結合分子之濃度調整為彼此相同或實質上為相同濃度尤佳。可利用預先確認認識IL-6R中之抗原決定部位的抗原結合分子當做對照抗原結合分子。
待驗抗原結合分子對於變異IL-6R表現細胞之△幾何平均比較值，若比起待驗抗原結合分子對於IL-6R表現細胞之△幾何平均比較值之至少80%、較佳為50%、更佳為30%、尤佳為15%還小，則判定為「實質上不結合於變異IL-6R表現細胞」。求取幾何平均值(Geometric Mean)之計算式，記載於CELL QUEST Software User’s Guide(BD biosciences公司)。若比較比較值而其實質上可視為相同之程度，則可評價待驗抗原結合分子與對照抗原結合分子之抗原決定部位為相同。
抗原結合分域
本說明書中，「抗原結合分域」只要能結合於目的之抗原則可使用任意構造之分域。如此的分域，例如：抗體之重鏈及輕鏈之可變區、存在於生體內之細胞膜蛋白質Avimer所含之約35個胺基酸之稱為A分域之模組(WO2004/044011、WO2005/040229)、包含於細胞膜表現之糖蛋白質fibronectin中之蛋白質所結合之域10Fn3分域之Adnectin(WO2002/032925)、以構成由ProteinA之58 個胺基酸構成的3個螺旋束(bundle)的IgG結合分域為支架(scaffold)的Affibody(WO1995/001937)、具含33個胺基酸殘基之轉彎(turn)與2個反向並行之螺旋以及迴圈的次單元返覆層疊的構造的ankyrin返覆(ankyrin repeat：AR)之分子表面所露出之區DARPins(Designed Ankyrin Repeat proteins)(WO2002/020565)、將嗜中性球明膠酶結合lipocalin(neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL))等lipocalin分子中高度保守的8個反向並行的股中央方向扭曲成的活塞桶(barrel)構造的單側予以支撐的4個迴圈區Anticalin等(WO2003/029462)、就八目鰻、沼田鰻等無顎類之獲得免疫系統而言不具免疫球蛋白之構造的可變性淋巴球受體(variable lymphocyte receptor(VLR))之富含白胺酸殘基之返覆(leucine-rich-repeat(LRR))模組返覆疊層而獲得之馬蹄形構造之內部之平行型片構造之中空區(WO2008/016854)為佳。本發明之抗原結合分域之較佳例，例如含抗體之重鏈及輕鏈之可變區的抗原結合分域。如此的抗原結合分域，例如「scFv(single chain Fv)」、「單鏈抗體(single chain antibody)」、「Fv」、「scFv2(single chain Fv 2)」、「Fab」或「F(ab’)2」等為較佳。
本發明之抗原結合分子中，抗原結合分域可以結合於相同的抗原決定部位。在此，相同之抗原決定部位可存在於由例如：序列編號：1記載之胺基酸序列構成的蛋白質中。又，可存在於由序列編號：1記載之胺基酸序列之20 號至365號之胺基酸構成的蛋白質中。或，本發明之抗原結合分子中，抗原結合分域可以結合於彼此不同的抗原決定部位。在此，不同的抗原決定部位，可存在於由例如：序列編號：1記載之胺基酸序列構成的蛋白質中。又，可存在於由序列編號：1記載之胺基酸序列之20號至365號之胺基酸構成之蛋白質中。
專一性
專一性係指專一性結合的分子對於其一或多數之結合對象的分子以外之分子未顯示任何顯著結合之狀態。又，抗原結合分域也可用在對於某抗原中所含之多數抗原決定部位當中特定抗原決定部位為專一性的情形。又，抗原結合分域所結合之抗原決定部位包含在多數不同抗原時，具該抗原結合分域之抗原結合分子可以與含該抗原決定部位之各種抗原結合。
抗體
本說明書中，抗體係指天然者或部分或完全合成所製造之免疫球蛋白。抗體可從其天然存在之血漿或血清等天然資源或產生抗體之融合瘤細胞之培養上清單離，或可使用基因重組等方法部分或完全合成。抗體例如免疫球蛋白之構造同型(isotype)及此等構造同型之次類(subclass)為較佳例。人類免疫球蛋白已知有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgM9種類型(構造同型)。本發明之抗體在該等構造同型之中，可含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。IgG之不變區之後自然產生的變異體等也包括在內。人類 IgG1、人類IgG2、人類IgG3、人類IgG4抗體之不變區，由於基因多型而致之多數副型序列記載於Sequences of proteins of immunological interest,NIH Publication No.91-3242，但本發明可為其中任一者。尤其人類IgG1之序列，可為EU編號356-358號之胺基酸序列為DEL，也可為EEM。
製作具有所望結合活性之抗體之方法於該技術領域之具有通常知識者為公知。以下列舉製作與IL-6結合之抗體(抗IL-6R抗體)之方法。與IL-6R以外之抗原結合的抗體也可依據下列例示適當製作。
抗IL-6R抗體可使用公知方法以多株或單株抗體之形式取得。抗IL-6R抗體，宜製作哺乳動物來源的單株抗體。哺乳動物來源的單株抗體，包含由融合瘤產生者，及由基因工程的方法以含抗體基因之表現載體轉形而得之寄主細胞所產生者等。本發明之單株抗體包括「人類化抗體」或「嵌合抗體」。
單株抗體產生融合瘤，可使用公知技術依例如以下方式製作。亦即，使用IL-6R蛋白質當做感作抗原，依通常之免疫方法將哺乳動物免疫。將獲得之免疫細胞以通常的細胞融合法與公知之親代細胞融合。其次依照通常之篩選法，篩選單株抗體產生細胞，可選擇產生抗IL-6R抗體之融合瘤。
具體而言，單株抗體之製作係依例如以下所示方式實行。首先，藉由表現在序列編號：2揭示其核苷酸序列之 IL-6R基因，取得當做抗體取得之感作抗原使用的以序列編號：1表示的IL-6R蛋白質。亦即，藉由將編碼為IL-6R之基因序列插入公知之表現載體，而將適當的寄主細胞轉形。從該寄主細胞中或培養上清中以公知方法精製所望之人類IL-6R蛋白質。為了從培養上清中取得可溶型之IL-6R，例如可使Mullberg等人(J.Immunol.(1994)152(10),4958-4968)記載之序列編號：1表示之IL-6R多胜肽序列當中1至357號之胺基酸構成之蛋白質表現，以代替表現以序列編號：1表示之IL-6R蛋白質。又，經精製的天然IL-6R蛋白質也同樣可當做感作抗原使用。
對於哺乳動物免疫時使用之感作抗原，可使用該精製IL-6R蛋白質。IL-6R之部分胜肽也可當做感作抗原使用。於此時，該部分胜肽可利用人類IL-6R之胺基酸序列以化學合成取得。又，也可將IL-6R基因之一部分納入表現載體使表現而取得。再者，使用蛋白質分解酵素將IL-6R蛋白質分解也可取得，但是當做部分胜肽使用之IL-6R胜肽之區域及大小不限於特別之態樣。較佳區域可從序列編號：1之胺基酸序列當中相當於20-357號胺基酸之胺基酸序列選擇任意序列。構成當做感作抗原之胜肽的胺基酸的數目至少為5以上，例如6以上或7以上較佳。更具體而言，可將8~50、較佳為10~30個殘基之胜肽當做感作抗原使用。
又，將IL-6R蛋白質之所望之部分多胜肽或胜肽與不同的多胜肽融合成的融合蛋白質可利用為感作抗原。為了 製造當做感作抗原使用之融合蛋白質，例如可適當利用抗體之Fc片段或胜肽標籤(tag)等。表現融合蛋白質之載體，可藉由將編碼為所望之二種或更多種多胜肽片段之基因於同一讀框(inframe)融合，並將該融合基因以前述方式插入表現載體而製作。融合蛋白質之製作方法記載於Molecular Cloning 2nd ed.(Sambrook,J et al.,Molecular Cloning 2nd ed.,9.47-9.58(1989)Cold Spring Harbor Lab.press)。可當做感作抗原使用之IL-6R之取得方法及使用其之免疫方法，在WO2003/000883、WO2004/022754、WO2006/006693等亦有具體記載。
以該感作抗原免疫之哺乳動物不限於特定動物，宜考慮與細胞融合使用之親代細胞之間的適合性選擇。一般的囓齒類動物例如小鼠、大鼠、倉鼠，或兔、猴等較佳。
依公知方法將上述動物以感作抗原免疫。例如就一般方法而言，係藉由將感作抗原對於哺乳動物之腹胺內或皮下注射而投予以實施免疫。具體而言，將以PBS(Phosphate-Buffered Saline)或生理食鹽水等以適當稀釋倍率稀釋過的感作抗原，視所望與通常的佐劑例如佛洛依德完全佐劑混合並乳化後，將該感作抗原對於哺乳動物每4至21日投予數次。又，感作抗原免疫時可以使用適當擔體。尤其使用小分子量之部分胜肽當做感作抗原時，有時以結合有白蛋白、血藍蛋白(keyhole lympet hemocvanin)等擔體蛋白質的該感作抗原胜肽進行免疫為理想。
又，產生所望抗體之融合瘤可使用DNA免疫並依以下方式製作。DNA免疫，係指在免疫動物中投予以能表現編碼為抗原蛋白質之基因的態樣構建之載體DNA的該免疫動物中，藉由感作抗原在該免疫動物之活體內表現，能提供免疫刺激之免疫方法。比起對於免疫動物投予蛋白質抗原之一般免疫方法，DNA免疫可期待如下的優越性。
-可維持如IL-6R之膜蛋白質之構造而提供免疫刺激
-無需精製免疫抗原
為了以DNA免疫獲得本發明之單株抗體，首先將表現IL-6R蛋白質之DNA對於免疫動物投予。編碼為IL-6R之DNA可利用PCR等公知方法合成。將獲得之DNA插入適當表現載體並對於免疫動物投予。表現載體例如可以理想地利用pcDNA3.1等市售表現載體。將載體對於活體投予之方法，可使用一般使用之方法。例如，可藉由將吸附有表現載體之金粒子以基因槍導入免疫動物個體之細胞內而實施DNA免疫。再者，認識IL-6R之抗體之製作也可使用國際公開WO2003/104453記載之方法製作。
以此方式將哺乳動物免疫，確認血清中與IL-6R結合之抗體力價上升後，從哺乳動物採取免疫細胞以供細胞融合。較佳之免疫細胞尤佳為使用脾細胞。
與前述免疫細胞融合之細胞，可使用哺乳動物之骨髓瘤細胞。骨髓瘤細胞宜具有為了篩選的適當選擇標記。選擇標記，係指能於特定培養條件下生存之(或無法生存)之形質。選擇標記中，次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶 (hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase)缺損(以下簡稱為HGPRT缺損)、或胸腺嘧啶激酶缺損(以下簡稱為TK缺損)等為公知。具HGPRT或TK缺損之細胞，具有次黃嘌呤-胺基喋呤-胸腺嘧啶感受性(以下簡稱為HAT感受性)。HAT感受性之細胞在HAT選擇培養基中無法合成DNA會死滅，但若與正常細胞融合則會利用正常細胞之補救合成路徑(salvage pathway)繼續合成DNA，故能在HAT選擇培養基中增殖。
HGPRT缺損或TK缺損之細胞，各可以含6硫鳥嘌呤(thioguanine)、8氮雜鳥嘌呤(以下簡稱為8AG)、或5’溴去氧尿嘧啶之培養基選擇。於DNA中納入該等嘧啶類似物之正常細胞會死滅。另一方面，未納入該等嘧啶類似物之該等酵素缺損之細胞，能在選擇培養基中生存。其他稱為G418耐受性之選擇標記，係利用新黴素耐受性基因提供對於2-去氧鏈黴胺(streptamine)系抗生物質(慶大黴素(gentamycin類似體)之耐受性。對細胞融合為理想的各種骨髓瘤細胞為公知。
如此的骨髓瘤細胞例如可理想地使用P3(P3x63Ag8.653)(J.Immunol.(1979)123(4),1548-1550)、P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81,1-7)、NS-1(C.Eur.J.Immunol.(1976)6(7),511-519)、MPC-11(Cell(1976)8(3),405-415)、SP2/0(Nature(1978)276(5685),269-270)、FO(J. Immunol.Methods(1980)35(1-2),1-21)、S194/5.XX0.BU.1(J.Exp.Med.(1978)148(1),313-323)、R210(Nature(1979)277(5692),131-133)等。
基本上可依照公知方法例如Keller與Milstein等人的方法(Methods Enzymol.(1981)73,3-46)等，實施前述免疫細胞與骨髓瘤細胞之細胞融合。
更具體而言，可於例如細胞融合促進劑存在下於通常的營養培養液中實施前述細胞融合。融合促進劑可使用例如聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(HVJ)等，為更提高融合效率，可視所望添加使用二甲基亞碸等輔助劑。
免疫細胞與骨髓瘤細胞之使用比例可任意設定。例如相對於骨髓瘤細胞將免疫細胞定為1至10倍較佳。前述細胞融合使用之培養液，例如適於前述骨髓瘤細胞株增殖之RPMI1640培養液、MEM培養液、此外，可使用該種細胞培養使用之通常之培養液，再者，可理想地添加胎牛血清(FCS)等血清補液。
細胞融合係將前述免疫細胞與骨髓瘤細胞以既定量於前述培養液中充分混合，並且將預先加溫至約37℃之PEG溶液(例如平均分子量1000至6000左右)以通常30至60%(w/v)之濃度添加。藉由將混合液緩慢混合，會形成所望之融合細胞(融合瘤)。接著，逐次添加上述列舉之適當培養液，反複實施離心並去除上清之操作，可將對於融合瘤之生長不利的細胞融合劑等除去。
以如此方式獲得之融合瘤，可藉由於通常之選擇培養 液，例如HAT培養液(含次黃嘌呤、胺基喋呤、胸腺嘧啶之培養液)培養而選擇。為了使所望之融合瘤以外之細胞(非融合細胞)死滅，可使繼續進行使用上述HAT培養液之培養足夠時間(通常該足夠時間為數日至數週)。其次，以通常之極限稀釋法，實施產生所望抗體之融合瘤之篩選及單一選殖。
以如此方式獲得之融合瘤，可利用因應細胞融合使用之骨髓瘤具有之選擇標記的選擇培養液而選擇。例如具HGPRT或TK缺損之細胞，可藉由以HAT培養液(含次黃嘌呤、胺基喋呤及胸腺嘧啶之培養液)培養而選擇。亦即，當使用HAT感受性骨髓瘤細胞於細胞融合時，可在HAT培養液中將成功與正常細胞細胞融合的細胞選擇性增殖。為了使所望融合瘤以外之細胞(非融合細胞)死滅，可以繼續使用上述HAT培養液之培養足夠時間。具體而言，一般可藉由數日至數週的培養而選擇所望之融合瘤。其次可利用通常之極限稀釋法，實施產生所望之抗體的融合瘤的篩選及單一選殖。
所望之抗體之篩選及單一選殖，可依照基於公知抗原抗體反應之篩選方法而理想地實施。例如，結合於IL-6R之單株抗體可以結合於在細胞表面表現的IL-6R。如此的單株抗體例如可藉由FACS(fluorescence activated cell sorting)篩選。FACS係將與螢光抗體接觸之細胞以雷射光解析，並測定各個細胞發出之螢光，而可測定抗體對於細胞表面之結合的系統。
為了利用FACS篩選產生本發明之單株抗體的融合瘤，首先要製備表現IL-6R之細胞。用於篩選之較佳細胞為使IL-6R強制表現之哺乳動物細胞。藉由以當做寄主細胞之未經轉形之哺乳動物細胞為對照，可以選擇性檢測抗體對於細胞表面之IL-6R的結合活性。亦即，藉由選擇產生未結合於寄主細胞而結合於IL-6R強制表現細胞的抗體的融合瘤，可以取得產生IL-6R單株抗體之融合瘤。
或抗體對於經固定化之IL-6R表現細胞的結合活性可依據ELISA之原理評價。例如，將IL-6R表現細胞固定化在ELISA板的井。使融合瘤之培養上清接觸井內之固定化細胞，以檢測結合於固定化細胞的抗體。單株抗體為小鼠來源時，與細胞結合之抗體可利用抗小鼠免疫球蛋白抗體檢測。該等篩選所選擇之產生具有對於抗原之結合能力的所望抗體的融合瘤，可利用極限稀釋法等選殖。
以此方式製作之產生單株抗體之融合瘤可在通常之培養液中繼代培養。而且，該融合瘤可於液態氮中長期保存。
將該融合瘤依照通常方法培養，可從其培養上清取得所望之單株抗體。或可將融合瘤對於與其具適合性之哺乳動物投予使增殖，並從其腹水獲取單株抗體。前者之方法對於獲得高純度抗體為適當。
從該融合瘤等抗體產生細胞選殖的抗體基因所編碼之抗體也可適當利用。藉由將經選殖的抗體基因納入適當載體並導入寄主，可以表現該基因所編碼的抗體。抗體基因之單離與對於載體之導入、及用於將寄主細胞轉形之方 法，例如已由Vandamme等人確立(Eur.J.Biochem.(1990)192(3),767-775)。下列所述重組抗體之製造方法亦為公知。
例如，可從產生抗IL-6R抗體之融合瘤細胞取得編碼為抗IL-6R抗體之可變區(V區)之cDNA。為此，通常首先從融合瘤萃取全體RNA。用於從細胞萃取mRNA之方法，例如可利用如下方法。
-胍(guanidine)超離心法(Biochemistry(1979)18(24),5294-5299)
-AGPC法(Anal.Biochem.(1987)162(1),156-159)
萃取到的mRNA可使用mRNA Purification Kit(GE Health care bioscience製)等精製。或如QuickPrep mRNA Purification Kit(GE Health care bioscience製)等，也有用於從細胞直接萃取全體mRNA之市售套組。使用如此的套組，可從融合瘤取得mRNA。從獲得之mRNA使用反轉錄酵素可合成編碼為抗體V區之cDNA。cDNA可利用AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit(生化學工業社製)等合成。又，為了cDNA之合成及放大，可適當利用SMART RACE cDNA放大套組(Clontech製)及使用PCR之5’-RACE法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85(23),8998-9002、Nucleic Acids Res.(1989)17(8),2919-2932)。又，在如此的cDNA合成之過程中，可在cDNA的兩末端導入後述適當的限制酶部位。
從獲得之PCR產物精製目的之cDNA片段，其次與載體 DNA連結。以如此方式製作重組載體，並導入大腸菌等，選擇群落(colony)後，從形成有該群落之大腸菌製備所望之重組載體。並且針對該重組載體是否具有目的cDNA之鹼基序列，可使用公知之方法例如二去氧核苷酸鏈終結法等確認。
為了取得編碼為可變區之基因，利用使用可變區基因放大用引子之5’-RACE法係屬簡便。首先，以從融合瘤細胞萃取之RNA當做模板，合成cDNA，獲得5’-RACE cDNA庫。5’-RACE cDNA庫之合成可適當使用SMART RACE cDNA放大套組等市售套組。
以獲得之5’-RACE cDNA庫為模板，以PCR法將抗體基因放大。依據公知之抗體基因序列可設計小鼠抗體基因放大用之引子。此等引子為依免疫球蛋白之次類而各不相同的鹼基序列。因此，次類理想為預先使用Iso Strip小鼠單株抗體同種型決定套組(Roche diagnostics)等市售套組決定。
具體而言，當目的為取得例如編碼為小鼠IgG之基因時，可利用能將編碼為當做重鏈之γ1、γ2a、γ2b、γ3、當做輕鏈之κ鏈與λ鏈的基因放大的引子。為了放大IgG之可變區基因，一般係利用於3’側之引子黏合有相當於接近可變區之不變區之部分的引子。另一方面，5’側之引子係利用5’ RACE cDNA庫製作套組所附帶的引子。
利用如此放大之PCR產物，可再構成由重鏈與輕鏈之組合而成的免疫球蛋白。以再構成之免疫球蛋白對於IL-6R 之結合活性當做指標，可以篩選所望之抗體。例如目的為取得對抗IL-6R之抗體時，抗體對於IL-6R之結合，更佳為專一性的。與IL-6R結合之抗體可藉由例如以下方式篩選；(1)使從融合瘤獲得之含有由cDNA編碼之V區的抗體接觸IL-6R表現細胞之步驟、(2)檢測IL-6R表現細胞與抗體之間的結合之步驟、及(3)選擇與IL-6R表現細胞結合之抗體之步驟。
檢測抗體與IL-6R表現細胞之間的結合的方法為公知。具體而言，可利用先前所述FACS等方法，檢測抗體與IL-6R表現細胞間之結合。為了評價抗體之結合活性，可適當利用IL-6R表現細胞之固定標本。
以結合活性為指標之抗體之篩選方法，亦宜使用利用噬菌體載體之淘選法。從多株抗體表現細胞群，以重鏈與輕鏈之次類之庫的形式取得抗體基因時，利用噬菌體載體之篩選方法係屬有利。編碼為重鏈與輕鏈之可變區之基因，可藉由以適當連結子序列連結，而形成單鏈Fv(scFv)。藉由將編碼為scFv之基因插入噬菌體載體，可取得於表面表現scFv之噬菌體。該噬菌體與所望抗原接觸後，藉由回收與抗原結合之噬菌體，可以回收編碼為具目的結合活性之scFv的DNA。該操作可視需要反複實施，而將具所望之結合活性之scFv濃縮。
獲得編碼為目的抗IL-6R抗體之V區的cDNA後，將該cDNA以認識插入於該cDNA之兩末端的限制酶部位之限制 酶消化。較佳之限制酶，係認識構成抗體基因之鹼基序列中出現頻度低之鹼基序列並消化。再者，為了將1副本的消化片段以正確方向插入載體，宜插入提供附著末端之限制酶。藉由將以上述方式經消化之編碼為抗IL-6R抗體之V區的cDNA插入適當表現載體，可以取得抗體表現載體。此時，若將編碼為抗體不變區(C區)之基因、與編碼為前述V區之基因於同一讀框融合，則可取得嵌合抗體。在此，嵌合抗體係指不變區與可變區之來源不同者。因此，除了小鼠-人類等的異種嵌合抗體，人類-人類同種嵌合抗體也包含在本發明之嵌合抗體。藉由預先在具不變區之表現載體插入前述V區基因，可以構建嵌合抗體表現載體。具體而言，可於例如保持有編碼為所望之抗體不變區(C區)之DNA的表現載體之5’側，適當配置消化前述V區基因之限制酶之限制酶認識序列。藉由將以相同組合之限制酶消化過的兩者於同一讀框融合，可以構建嵌合抗體表現載體。
為了製造抗IL-6R單株抗體，可以將抗體基因於由表現控制區控制之下表現的方式納入表現載體。用於表現抗體之表現控制區，包含例如增強子或啟動子。又，也可在胺基末端附加適當的信號序列，以使表現的抗體分泌到細胞外。例如係使用具胺基酸序列MGWSCIILFLVATATGVHS(序列編號：3)之胜肽當做信號序列，但是也可附加其他適當的信號序列。將表現的多胜肽在上述序列之羧基末端部分切斷，切斷的多肽肽可以成熟多胜肽之形式分泌到細胞外。其次，藉由以該表現載體將適當的寄主細胞轉形，可 以取得表現編碼為抗IL-6R抗體之DNA的重組細胞。
為了表現抗體基因，可將編碼為抗體重鏈(H鏈)及輕鏈(L鏈)之DNA納入分別的表現載體。藉由納入有H鏈與L鏈之載體，對於相同寄主細胞同時轉形(co-transfect)，可以表現具備H鏈與L鏈之抗體分子。或可將編碼為H鏈及L鏈之DNA納入單一的表現載體，而將寄主細胞轉形(參照國際公開WO 1994/11523)。
用以藉由將經單離之抗體基因導入適當寄主而製作抗體之寄主細胞與表現載體的多數組合為公知。該等表現系均可應用於單離本發明之抗原結合分域。真核細胞當做寄主細胞時，可適當使用動物細胞、植物細胞、或真菌細胞。具體而言，動物細胞例如以下細胞。
(1)哺乳類細胞、：CHO、COS、骨髓瘤、BHK(baby hamster kidney)、Hela、Vero、HEK(human embryonic kidney)293、FreestyleTM293等
(2)兩生類細胞：非洲爪蟾卵母細胞等
(3)昆蟲細胞：sf9、sf21、Tn5等
或植物細胞以煙草(Nicotiana tabacum)等煙草(Nicotiana)屬來源之細胞而得之抗體基因表現系為公知。植物細胞之轉形可以適當利用癒傷組織培養之細胞。
又，真菌細胞可以利用如下的細胞。
酵母：啤酒酵母(Saccharomyces serevisiae)等糖化酵母(Saccharomyces)屬、甲醇同化酵母(Pichia pastoris)等Pichia屬
絲狀菌：黑麴黴(Aspergillus niger)等麴菌(Aspergillus)屬
又，利用原核細胞之抗體基因之表現系亦為公知。例如使用細菌細胞時，可以適當利用大腸菌(E.coli)、枯草菌等細菌細胞。於該等細胞中，以轉形導入含有目的抗體基因之表現載體。藉由將經轉形之細胞於體外培養，可從該轉形細胞之培養物獲取所望之抗體。
重組抗體之產生，除了上述寄主細胞，尚可利用基因轉殖動物。亦即，從導入有編碼為所望抗體之基因的動物，可獲取該抗體。例如，將抗體基因藉由於同一讀框插入編碼為乳汁中固有產生之蛋白質的基因內部，可以構建融合基因。乳汁中分泌之蛋白質，例如可利用羊β酪蛋白等。將含有插入有抗體基因之融合基因的DNA片段注入羊胚，並將該經注入之胚胎導入雌羊體內。從接受胚胎的羊產生之基因轉殖羊(或其子孫)所產之乳汁，可以取得所望之抗體與乳汁蛋白質之融合蛋白質。又，為了增加從基因轉殖羊產生之含所望之抗體之乳汁量，可對於基因轉殖羊投予荷爾蒙(Bio/Technology(1994),12(7),699-702)。
本說明書記載之抗原結合分子對於人類投予時，該分子中之抗原結合分域，可適當採用以降低對於人類之異種抗原性等為目的經人為改變過的基因重組型抗體來源的抗原結合分域。基因重組型抗體例如包含人類化(Humanized)抗體等。該等改變抗體可使用公知方法適當製造。
本說明書記載之用於製作抗原結合分子中的抗原結合 分域所使用之抗體之可變區，通常由插入在4個框架區(FR)的3個互補性決定區(complementarity-determining region；CDR)構成。CDR係實質上決定抗體之結合專一性之區域。CDR之胺基酸序列富有多樣性。另一方面，構成FR之胺基酸序列，即使在具有不同之結合專一性的抗體之間也常會顯示高度同一性。所以，一般可利用CDR之移植而將某抗體之結合專一性移植到其他抗體。
人類化抗體也稱為再構成(reshaped)人類抗體。具體而言，將人類以外之動物例如小鼠抗體之CDR移植到人類抗體而成之人類化抗體等為公知。為了獲得人類化抗體之一般基因重組方法亦為已知。具體而言，就將小鼠抗體之CDR移植到人類FR的方法而言，例如Overlap Extension PCR為公知。於Overlap Extension PCR，係對於用於合成人類抗體FR之引子中，附加編碼為待移植之小鼠抗體之CDR的鹼基序列。引子係針4個FR各別準備。一般將小鼠CDR移植到人類FR時，選擇與小鼠之FR具高同一性之人類FR時，對於維持CDR機能為有利。亦即，一般較佳為利用與相鄰於待移植之小鼠CDR的FR之胺基酸序列為高同一性之胺基酸序列構成之人類FR。
又，連結之鹼基序列可設計為彼此於同一讀框連接。藉由各引子，可個別合成人類FR。其結果，可獲得於各FR附加有編碼為小鼠CDR之DNA的產物。各產物之編碼為小鼠CDR之鹼基序列，可設計成彼此重疊。接著，使以人類抗體基因為模板而合成之產物之重疊的CDR部分彼此黏 合，進行互補鏈合成反應。利用該反應，人類FR經由小鼠CDR之序列而連結。
最後，將連結有3個CDR與4個FR之V區基因，利用黏合在其5’末端與3’末端並附加有適當之限制酶認識序列的引子，將其全長放大。藉由將以上述方式獲得之DNA與編碼為人類抗體C區之DNA以於同一讀框融合之方式插入於表現載體中，藉此可製作人類型抗體表現用載體。將該重組載體導入寄主並樹立重組細胞後，培養該重組細胞，使編碼為該人類化抗體之DNA表現，藉此使該培養細胞之培養物中產生該人類化抗體(參照歐洲專利公開EP 239400、國際公開WO1996/002576)。
以定性或定量測定以上述方式製作之人類化抗體對於抗原之結合活性並進行評價，可以理想地選擇當經由CDR連結時該CDR會形成良好之抗原結合部位的人類抗體之FR。視需要，可以將FR之胺基酸殘基取代，使再構成人類抗體之CDR能形成適當的抗原結合部位。例如，應用將小鼠CDR移植到人類FR時使用之PCR法，可對於FR導入胺基酸序列之變異。具體而言，可對於與FR黏合之引子導入部分的鹼基序列的變異。以如此的引子合成之FR，導入有鹼基序列之變異。以上述方法測定並評價將胺基酸取代過的變異型抗體對於抗原之結合活性，可以選擇具所望性質之變異FR序列(Cancer Res,1993,53,851-856)。
又，可以將具有人類抗體基因所有曲目的基因轉殖動物(參照國際公開WO1993/012227、WO1992/003918、 WO1994/002602、WO1994/025585、WO1996/034096、WO1996/033735)當做免疫動物，以DNA免疫取得所望之人類抗體。
再者，使用人類抗體庫以淘選取得人類抗體之技術亦為已知。例如，將人類抗體之V區以單鏈抗體(scFv)之形式，以噬菌體呈現法使表現在噬菌體之表面。可以選擇表現與抗原結合之scFv的噬菌體。藉由解析選擇之噬菌體之基因，可以決定編碼為與抗原結合之人類抗體之V區的DNA序列。決定與抗原結合之scFv之DNA序列後，將該V區序列與所望之人類抗體C區之序列於同一讀框融合後插入適當表現載體，可以製作表現載體。將該表現載體導入上述列舉之適當表現細胞中，並使編碼為該人類抗體之基因表現，可取得該人類抗體。該等方法已為公知(參照國際公開WO1992/001047、WO1992/020791、WO1993/006213、WO1993/011236、WO1993/019172、WO1995/001438、WO1995/015388)。
又，就取得抗體基因之而言，除上述以外，也可適當使用Bernasconi等人(Science(2002)298,2199-2202)或WO2008/081008記載之B細胞選殖(各抗體之編碼序列之鑑定及選殖、其單離、及各抗體(尤其IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)製作用之表現載體構建之用途等)之方法。
EU編號及Kabat編號
依照本發明使用之方法，指定為抗體之CDR與FR之胺基酸位置係依照Kabat規定(Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health,Bethesda,Md.,1987年及1991年)。本說明書中，抗原結合分子為抗體或抗原結合片段時，可變區之胺基酸係依照Kabat編號，不變區之胺基酸係依照Kabat之胺基酸位置的EU編號表示。
離子濃度之條件 金屬離子濃度之條件
本發明之一態樣中，離子濃度係指金屬離子濃度。「金屬離子」，係指屬於氫以外之鹼金屬及銅族等第I族、鹼土類金屬及鋅族等第II族、硼以外之第III族、碳與矽以外之第IV族、鐵族及鉑族等第VIII族、V、VI及VII族之各A亞族的元素、及銻、鉍、釙等金屬元素的離子。金屬原子具有釋出原子價電子而成為陽離子之性質，此稱為離子化傾向。離子化傾向大的金屬，富有化學活性。
本發明理想的金屬離子，例如鈣離子。鈣離子涉及許多生命現象的調節，涉及骨骼肌、平滑肌及心肌等肌肉的收縮、白血球的運動及吞噬等的活化、血小板的變形及分泌等之活化、淋巴球之活化、組織胺之分泌等的肥胖細胞的活化、經由兒茶酚胺α受體或乙醯膽鹼受體之細胞之回應、胞吐作用、由神經原末端釋出傳遞物質、神經原之軸策流(axonal flow)等。細胞內之鈣離子受體，已知有具多個鈣離子結合部位，且據認為在分子進化上來自共通起源之TroponinC、Calmodulin、parvalbumin、肌球蛋白輕鏈等，其結合模體(motif)已有多數已知。例如，Cadherin 分域、Calmodulin所含之EF手、Protein kinase C所含之C2分域、血液凝固蛋白質FactorIX所含之Gla分域、脫唾液酸糖蛋白(asialoglycoprotein)受體或甘露糖結合受體所含之C型lectin、LDL受體所含之A分域、annexin、thrombospondin 3型分域及EGF狀分域為人所熟知。
本發明中，金屬離子為鈣離子之情形，鈣離子濃度之條件可列舉低鈣離子濃度之條件與高鈣離子濃度之條件。依據鈣離子濃度之條件而使結合活性改變，係指由於低鈣離子濃度與高鈣離子濃度之條件之不同而使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變。例如，比起在低鈣離子濃度之條件下之抗原結合分子對於抗原之結合活性，在高鈣離子濃度之條件下之抗原結合分子對於抗原之結合活性較高之情形。又，例如比起在高鈣離子濃度之條件下之抗原結合分子對於抗原之結合活性，在低鈣離子濃度之條件下之抗原結合分子對於抗原之結合活性較高之情形。
本說明書中，高鈣離子濃度並非特別限於單值的數值，較佳可為從100μM至10 mM之間選擇之濃度。又，另一態樣中，可為從200μM至5 mM之間選擇之濃度。又，於不同態樣，可為從500μM至2.5 mM之間選擇之濃度，另一態樣中，可為從200μM至2 mM之間選擇之濃度。又，也可為從400μM至1.5 mM之間選擇之濃度。尤其，接近在活體內之血漿中(血中)之鈣離子濃度的從500μM至2.5 mM之間選擇之濃度為理想。
本說明書中，低鈣離子濃度並非特別限於單值的數 值，較佳為可從0.1μM至30μM之間選擇之濃度。又，另一態樣中，可為從0.2μM至20μM之間選擇之濃度。又，於不同態樣中，也可為從0.5μM至10μM之間選擇之濃度，於另一態樣中，也可為從1μM至5μM之間選擇之濃度。再者，也可為從2μM至4μM之間選擇之濃度。尤其，宜為接近活體內之早期內體內之離子化鈣濃度之從1μM至5μM之間選擇之濃度。
本發明中，在低鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性比起在高鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性低，係指抗原結合分子在從0.1μM至30μM之間選擇之鈣離子濃度對於抗原之結合活性，弱於在從100μM至10 mM之間選擇之鈣離子濃度對於抗原之結合活性。較佳為，抗原結合分子在從0.5μM至10μM之間選擇之鈣離子濃度對於抗原之結合活性，弱於在從200μM至5 mM之間選擇之鈣離子濃度對於抗原之結合活性，尤佳為在活體內之早期內體內的鈣離子濃度之抗原結合活性比起在活體內之血漿中之鈣離子濃度之抗原結合活性弱，具體而言，抗原結合分子在從1μM至5μM之間選擇之鈣離子濃度對於抗原之結合活性，弱於在從500μM至2.5 mM之間選擇之鈣離子濃度對於抗原之結合活性。
依金屬離子濃度之條件，抗原結合分子對於抗原之結合活性是否會變化，例如可依在前述結合活性之項目記載之公知測定方法而決定。例如，為了確認比起在低鈣離子濃度之條件下抗原結合分子對於抗原之結合活性，在高鈣 離子濃度之條件下抗原結合分子對於抗原之結合活性變化為較高，係比較在低鈣離子濃度及高鈣離子濃度之條件下之抗原結合分子對於抗原之結合活性。
又，本發明中，「在低鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性低於在高鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性」之表現方式，也可表達為抗原結合分子在高鈣離子濃度條件下對於抗原之結合活性高於在低鈣離子濃度條件下對於抗原之結合活性。又，本發明中，有時將「在低鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性低於在高鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性」記載為「在低鈣離子濃度條件下之抗原結合能力弱於在高鈣離子濃度條件下對於抗原之結合能力」，又，有時將「使在低鈣離子濃度之條件之抗原結合活性低於在高鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性」，記載為「使在低鈣離子濃度條件下之抗原結合能力弱於在高鈣離子濃度條件下對於抗原之結合能力」。
測定對於抗原之結合活性時，鈣離子濃度以外之條件可由該技術領域中具有通常知識者適當選擇，不特別限定。例如可於HEPES緩衝液、37℃的條件測定。例如可使用Biacore(GE Healthcare)等測定。抗原結合分子與抗原之結合活性之測定，於抗原為可溶型抗原之情形，可藉由以抗原作為分析物流過固定有抗原結合分子之晶片以評價對於可溶型抗原之結合活性，當抗原為膜型抗原時，可藉由以抗原結合分子作為分析物，使流過固定有抗原之晶片以評價對於膜型抗原之結合活性。
本發明之抗原結合分子中，只要在低鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性弱於在高鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性即可，在低鈣離子濃度條件下對於抗原之結合活性與在高鈣離子濃度條件下對於抗原之結合活性之比不特別限定，但較佳對於抗原，在低鈣離子濃度之條件之KD(Dissociation constant：解離常數)與在高鈣離子濃度之條件之KD之比，即KD(Ca 3μM)/KD(Ca 2 mM)之值為2以上，較佳為KD(Ca 3μM)/KD(Ca 2 mM)之值為10以上，又更佳為KD(Ca 3μM)/KD(Ca 2 mM)之值為40以上。KD(Ca 3μM)/KD(Ca 2 mM)之值之上限不特別限定，只要該技術領域中具有通常知識者之技術可製作即可，可為400、1000、10000等各種值。又，KD(Ca3μM)/KD(Ca 1.2 mM)之值也能指定。亦即，KD(Ca 3μM)/KD(Ca 1.2 mM)之值為2以上，更佳為KD(Ca 3μM)/KD(Ca 1.2 mM)之值為10以上，又更佳為KD(Ca 3μM)/KD(Ca 1.2 mM)之值為40以上。KD(Ca 3μM)/KD(Ca 1.2 mM)之值之上限不特別限定，只要在該技術領域中具有通常知識者之技術可製作即可，可為400、1000、10000等各種值。
對於抗原之結合活性之值，於抗原為可溶型抗原之情形，可使用KD(解離常數)，於抗原為膜型抗原之情形，可使用視KD(Apparent dissociation constant：視解離常數)。KD(解離常數)、及視KD(視解離常數)可依該技術領域中具有通常知識者公知之方法測定，例如可使用Biacore(GE healthcare)、scatchard作圖法、流式細胞 計數器等。
又，代表本發明之抗原結合分子在低鈣濃度之條件對於抗原之結合活性與在高鈣濃度之條件對於抗原之結合活性之比之其他指標，例如也可理想地使用解離速度常數kd(Dissociation rate constant：解離速度常數)。代表結合活性之比之指標，使用kd(解離速度常數)代替KD(解離常數)時，對於抗原在低鈣濃度之條件之kd(解離速度常數)與在高鈣濃度之條件之kd(解離速度常數)之比，即kd(低鈣濃度之條件)/kd(高鈣濃度之條件)之值，較佳為2以上，更佳為5以上，又更佳為10以上，再更佳為30以上。Kd(低鈣濃度之條件)/kd(高鈣濃度之條件)之值之上限不特別限定，只要該技術領域中具有通常知識者之技術常識可製作即可，可為50、100、200等各種值。
抗原結合活性之值，於抗原為可溶型抗原之情形，可使用kd(解離速度常數)，於抗原為膜型抗原之情形，可使用視kd(Apparent dissociation rate constant：視解離速度常數)。kd(解離速度常數)、及視kd(視解離速度常數)，可使用該技術領域中具有通常知識者公知之方法測定，例如可使用Biacore(GE healthcare)、流式細胞計數器等。又，本發明中，當測定不同鈣離子濃度時抗原結合分子對於抗原之結合活性時，宜將鈣濃度以外之條件設為相同。
例如本發明提供之一個態樣，即在低鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性低於在高鈣離子濃度之條件對於抗 原之結合活性之抗原結合分域或抗體，可依包含以下步驟(a)~(c)之抗原結合分域或抗體之篩選取得。
(a)獲得在低鈣濃度之條件下抗原結合分域或抗體之抗原結合活性；(b)獲得在高鈣濃度之條件下抗原結合分域或抗體之抗原結合活性；及(c)選擇在低鈣濃度之條件下抗原結合活性低於在高鈣濃度之條件下抗原結合活性之抗原結合分域或抗體。
又，本發明提供之一個態樣，即在低鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性低於在高鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性之抗原結合分域或抗體，可依包含以下步驟(a)~(c)之抗原結合分域或抗體或此等庫之篩選而取得。
(a)在高鈣濃度之條件使抗原結合分域或抗體或此等之庫接觸抗原；(b)將於前述步驟(a)與抗原結合之抗原結合分域或抗體放置在低鈣濃度條件下；及(c)將在前述步驟(b)解離之抗原結合分域或抗體單離。
又，本發明提供之一個態樣，即在低鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性低於在高鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性之抗原結合分域或抗體，可依包含以下步驟(a)~(d)之抗原結合分域或抗體或此等之庫之篩選取得。
(a)於低鈣濃度條件下使抗原結合分域或抗體之庫接觸抗原；(b)選擇在前述步驟(a)未與抗原結合之抗原結合分域或抗 體；(c)使於前述步驟(b)選擇之抗原結合分域或抗體於高鈣濃度條件下與抗原結合；及(d)將在前述步驟(c)與抗原結合之抗原結合分域或抗體單離。
再者，本發明提供之一個態樣，即在低鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性低於在高鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性之抗原結合分域或抗體，可依包含以下步驟(a)~(c)之篩選方法取得。
(a)在高鈣濃度條件下使抗原結合分域或抗體之庫接觸固定有抗原之管柱；(b)將在前述步驟(a)與管柱結合之抗原結合分域或抗體於低鈣濃度條件下從管柱溶出；及(c)將在前述步驟(b)溶出之抗原結合分域或抗體單離。
又，本發明提供之一個態樣，即在低鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性低於在高鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性之抗原結合分域或抗體，可依包含以下步驟(a)~(d)之篩選方法取得。
(a)於低鈣濃度條件下使抗原結合分域或抗體之庫通過固定有抗原之管柱；(b)回收在前述步驟(a)未與管柱結合而溶出之抗原結合分域或抗體；(c)使於前述步驟(b)回收之抗原結合分域或抗體於高鈣濃度條件下與抗原結合；及 (d)將在前述步驟(c)與抗原結合之抗原結合分域或抗體單離。
又，本發明提供之一個態樣，即在低鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性低於在高鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性之抗原結合分域或抗體，可依包含以下步驟(a)~(d)之篩選方法取得。
(a)在高鈣濃度條件下使抗原結合分域或抗體之庫接觸抗原；(b)取得在前述步驟(a)與抗原結合之抗原結合分域或抗體；(c)將於前述步驟(b)取得之抗原結合分域或抗體放置在低鈣濃度條件下；及(d)將在前述步驟(c)之抗原結合活性弱於在前述步驟(b)選擇之基準之抗原結合分域或抗體單離。
又，前述步驟也可重複2次以上。因此，依本發明，可提供利用上述篩選方法中，更包含重複(a)~(c)或(a)~(d)之步驟2次以上之篩選方法取得之在低鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性低於在高鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性之抗原結合分域或抗體。(a)~(c)或(a)~(d)之步驟重複的次數不特別限定，通常為10次以內。
本發明之篩選方法中，低鈣濃度條件下之抗原結合分域或抗體之抗原結合活性，只要是離子化鈣濃度為0.1μM~30μM之間之抗原結合活性即不特別限定，理想之離子化鈣濃度例如0.5μM~10μM之間之抗原結合活性。更佳 的離子化鈣濃度，例如活體內之早期內體內之離子化鈣濃度，具體而言，例如1μM~5μM之抗原結合活性。又，於高鈣濃度條件下之抗原結合分域或抗體之抗原結合活性，只要是離子化鈣濃度為100μM~10 mM之間之抗原結合活性即不特別限定，理想之離子化鈣濃度為例如200μM~5 mM之間之抗原結合活性。更佳的離子化鈣濃度，可舉在活體內之血漿中之離子化鈣濃度，具體而言可舉於0.5 mM~2.5 mM之抗原結合活性。
抗原結合分域或抗體之抗原結合活性，可利用該技術領域中具有通常知識者公知之方法測定，針對離子化鈣濃度以外之條件可由該技術領域中具有通常知識者適當決定。抗原結合分域或抗體之抗原結合活性，可就KD(Dissociation constant：解離常數)、視KD(Apparent dissociation constant：視解離常數)、解離速度kd(Dissociation rate：解離速度常數)、或視kd(Apparent dissociation：視解離速度常數)等評價。此等可利用該技術領域中具有通常知識者公知之方法測定，例如可使用Biacore(GE healthcare)、Scatchard作圖法、FACS等。
本發明中，選擇在高鈣濃度條件下之抗原結合活性高於在低鈣濃度條件下之抗原結合活性之抗原結合分域或抗體之步驟，係與選擇在低鈣濃度條件下之抗原結合活性低於在高鈣濃度條件下之抗原結合活性的抗原結合分域或抗體之步驟含意相同。
只要在高鈣濃度條件下之抗原結合活性高於在低鈣濃 度條件下之抗原結合活性即可，在高鈣濃度條件下之抗原結合活性與在低鈣濃度條件下之抗原結合活性之差不特別限定，較佳為在高鈣濃度條件下之抗原結合活性為在低鈣濃度條件下之抗原結合活性之2倍以上，更佳為10倍以上，又更佳為40倍以上。
依前述篩選方法篩選之本發明之抗原結合分域或抗體可為各種抗原結合分域或抗體，例如可選擇上述抗原結合分域或抗體。例如可篩選具有天然序列之抗原結合分域或抗體，也可篩選胺基酸序列經取代之抗原結合分域或抗體。
庫
依某一態樣，本發明之抗原結合分域或抗體，可由依據離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之至少一個胺基酸殘基係含於抗原結合分域之彼此序列互異之多數抗原結合分子為主而得之庫取得。離子濃度之例，可理想地列舉金屬離子濃度或氫離子濃度。
本說明書中，「庫」係指包含多數抗原結合分子或抗原結合分子之多數融合多胜肽、或編碼為該等序列之核酸、聚核苷酸。庫中所含之多數抗原結合分子或含有抗原結合分子之多數融合多胜肽之序列，並非單一序列，而是序列彼此互異之抗原結合分子或含有抗原結合分子之融合多胜肽。
本說明書中，序列彼此互異之多數抗原結合分子的記載中，用語「序列彼此互異」，係指庫中之各個抗原結合分子的序列彼此相異。亦即庫中彼此相異之序列之數目，反 映出庫中之序列不同之獨立選殖體之數目，有時也稱為「庫大小」。通常的噬菌體提示庫為106至1012，可使用核糖體提示法(ribosome display)等公知技術，將庫大小擴大到1014。但，噬菌體庫之淘選選擇時使用之噬菌體粒子實際數目，通常比起庫大小大10至10,000倍。該過大倍數也稱為「庫當量數」，代表可能存在10至10,000個有相同胺基酸序列之各個選殖體。是以，本發明之「序列彼此互異」之用語，意指排除當量數之庫中之各個抗原結合分子之序列彼此不同，更具體而言，意指存在序列彼此互異之抗原結合分子106至1014個分子，較佳為107至1012個分子，更佳為108至1011個分子，尤佳為108至1012。
又，本發明記載之以多數抗原結合分子為主而成之庫中之用語「多數」，例如本發明之抗原結合分子、融合多胜肽、聚核苷酸分子、載體或病毒通常為其物質之2個以上種類的集合。例如若為某2個以上之物質就特定形質互異，則代表該物質有存在2種以上。舉例來說，在胺基酸序列中之特定胺基酸位置觀察到的變異體胺基酸。例如，柔性殘基以外、或露出於表面之非常多樣的胺基酸位置的特定變異體胺基酸以外係實質相同，較佳為有相同序列之本發明之2個以上抗原結合分子時，本發明之抗原結合分子存在多個。其他實施例中，若編碼為柔性殘基之鹼基以外、或編碼為露出於表面之非常多樣之胺基酸位置之特定變異體胺基酸之鹼基以外為實質相同，較佳為有相同序列之本發明之2個以上之聚核苷酸分子，則本發明之聚核苷 酸分子有多個存在。
再者，本發明之以多數抗原結合分子為主而成之庫中記載之用語「以其為主而成」，係反映庫中之序列相異之獨立選殖體之數目當中，依離子濃度之條件不同，抗原結合分子對於抗原之結合活性相異之抗原結合分子之數目。具體而言，宜在庫中至少存在顯示如此之結合活性之抗原結合分子104個分子。又，更佳為，能從至少存在如此之顯示結合活性之抗原結合分子有105個分子之庫取得本發明之抗原結合分域。又更佳為，可從顯示如此之結合活性之抗原結合分子至少有106個分子存在之庫取得本發明之抗原結合分域。尤佳為可從顯示如此之結合活性之抗原結合分子至少有107個分子存在之庫取得本發明之抗原結合分域。又，再更佳為可從顯示如此之結合活性之抗原結合分子至少有108個分子存在之庫取得本發明之抗原結合分域。其他表達方式中，也可以庫中之序列相異之獨立選殖體之數目當中，依離子濃度之條件，抗原結合分子對於抗原之結合活性相異之抗原結合分子之比例的形式理想地表現。具體而言，本發明之抗原結合分域，可從顯示如此之結合活性之抗原結合分子在庫中之序列相異之獨立選殖體之數含有0.1%至80%，較佳為0.5%至60%，更佳為1%至40%，又更佳為2%至20%，尤佳為4%至10%之庫取得。融合多胜肽、聚核苷酸分子或載體之情形，亦與上述相同，可以用分子數或在分子全體之比例表現。又，於病毒之情形，也與上述相同，可以用病毒個體之數或在個體全體比例表 現。
依鈣離子濃度之條件，抗原結合分域對於抗原之結合活性會改變之胺基酸
依前述篩選方法篩選之本發明之抗原結合分域或抗體可以用任意方式製備，例如當金屬離子為鈣離子濃度時，可使用預先存在之抗體、預先存在之庫(噬菌體庫等)、由對於動物免疫獲得之融合瘤或從來自免疫動物之B細胞製作之抗體或庫、對於該等抗體或庫導入可螯合鈣之胺基酸(例如天冬胺酸或麩胺酸)或導入有非天然胺基酸變異而得之抗體或庫(可螯合鈣之胺基酸(例如天冬胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸之含有率提高之庫或於特定部位導入有可螯合鈣之胺基酸(例如天冬胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸變異之庫等)等。
如前述依離子濃度之條件，使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之胺基酸，例如，金屬離子為鈣離子時，只要是形成鈣結合模體之胺基酸即可，其種類不限。鈣結合模體對於該技術領域中具有通常知識者為周知並已有詳細記載(例如Springer等人(Cell(2000)102,275-277)、Kawasaki及Kretsinger(Protein Prof.(1995)2,305-490)、Moncrief等人(J.Mol.Evol.(1990)30,522-562)、Chauvaux等人(Biochem.J.(1990)265,261-265)、Bairoch及Cox(FEBS Lett.(1990)269,454-456)、Davis(New Biol.(1990)2,410-419)、Schaefer等人(Genomics(1995)25,638~643)、Economou等人 (EMBO J.(1990)9,349-354)、Wurzburg等人(Structure.(2006)14,6,1049-1058))。亦即ASGPR、CD23、MBR、DC-SIGN等C型外源凝集素(lectin)等任意公知之鈣結合模體，包括在本發明之抗原結合分子。如此之鈣結合模體之理想例，除了上述以外，也可列舉序列編號：62記載之抗原結合分域所含之鈣結合模體。
又，依照鈣離子濃度之條件，抗原結合分子對於抗原之結合活性會變化之胺基酸，例如具有金屬螯合作用之胺基酸亦為理想。有金屬螯合作用之胺基酸，例如絲胺酸(Ser(S))、蘇胺酸(Thr(T))、天冬醯胺酸(Asn(N))、麩醯胺酸(Gln(Q))、天冬胺酸(Asp(D))及麩胺酸(Glu(E))等。
前述之胺基酸所含之抗原結合分域之位置不限定於特定位置，只要依鈣離子濃度之條件會使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變即可，可為形成抗原結合分域之重鏈可變區或輕鏈可變區中之任意位置。亦即，本發明之抗原結合分域，可從由依鈣離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之胺基酸係包含在重鏈之抗原結合分域之序列彼此互異之抗原結合分子為主而成庫取得者。又，其他非限定態樣中，本發明之抗原結合分域，係從該胺基酸係包含在重鏈CDR3之序列彼此互異之抗原結合分子為主而成之庫取得。其他非限定態樣中，本發明之抗原結合分域，可從該胺基酸包含在重鏈CDR3之以Kabat編號表示之95位、96位、100a位及/或101位之序列彼此互異之抗原結合分子為主而成之庫取得。
又，本發明之一非限定態樣中，本發明之抗原結合分域，可能依鈣離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之胺基酸係包含在輕鏈之抗原結合分域之序列彼此互異之抗原結合分子為主而成之庫取得。又，於其他態樣中，本發明之抗原結合分域，可從該胺基酸係包含在輕鏈CDR1之序列彼此互異之抗原結合分子為主之庫取得。其他態樣中，本發明之抗原結合分域，可從該胺基酸係包含在輕鏈之CDR1以Kabat編號表示之30位、31位及/或32位之序列彼此互異之抗原結合分子為主而成之庫取得。
又，其他非限定態樣中，本發明之抗原結合分域，可從該胺基酸殘基係包含在輕鏈之CDR2之序列彼此互異之抗原結合分子為主之庫取得。其他態樣中，提供由該胺基酸殘基係包含在輕鏈CDR2之以Kabat編號表示之50位之序列彼此互異之抗原結合分子為主之庫。
又，於其他非限定態樣中，本發明之抗原結合分域，可從該胺基酸殘基係包含在輕鏈CDR3之序列彼此互異之抗原結合分子為主而成之庫取得。於其他態樣中，本發明之抗原結合分域，可從該胺基酸殘基係包含在輕鏈CDR3之以Kabat編號表示之92位之序列彼此互異之抗原結合分子為主而成之庫取得。
又，本發明之抗原結合分域，可從該胺基酸殘基包含在前述記載之輕鏈之CDR1、CDR2及CDR3中選出的2個或3個CDR之序列彼此互異之抗原結合分子為主而成之庫取 得作為本發明之不同態樣。再者，本發明之抗原結合分域，可從該胺基酸殘基包含在輕鏈之以Kabat編號表示之30位、31位、32位、50位及/或92位中之任一者以上的序列彼此互異之抗原結合分子為主而成之庫取得。
尤理想的實施形態中，抗原結合分子之輕鏈及/或重鏈可變區之框架序列，以具有人類之生殖細胞系框架序列為理想。因此，於本發明之一態樣中，若框架序列完全為人類序列，且對於人類投予(例如疾病之治療)時，可認為本發明之抗原結合分子幾乎或完全不會引起免疫原性反應。由上述含意，本發明之「含有生殖細胞系列之序列」，係指本發明之框架序列的一部分與任一人類之生殖細胞系框架序列的一部分為相同。例如，當為本發明之抗原結合分子之重鏈FR2之序列與多數不同之人類之生殖細胞系框架序列之重鏈FR2序列組合而得之序列時，亦為本發明之「含有生殖細胞系列之序列」抗原結合分子。
框架，例如V-Base(http：//vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)等網站包括的現在已知之完全人類型之框架區之序列為理想。該等框架區之序列可適當使用作為在本發明之抗原結合分子包含之生殖細胞系列之序列。生殖細胞系列之序列，也可依其類似性分類(Tomlinson等人(J.Mol.Biol.(1992)227,776-798)Williams及Winter(Eur.J.Immunol.(1993)23,1456-1461)及Cox等人(Nat.Genetics(1994)7,162-168))。可從分類為7個次群之Vκ、分類為10個次 群之Vλ、分類為7個次群之VH適當選擇理想的生殖細胞系列之序列。
完全人類型之VH序列不僅限定於下列，但可舉例如VH1次群(例如，VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH1-24、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1-69)、VH2次群(例如，VH2-5、VH2-26、VH2-70)、VH3次群(VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-72、VH3-73、VH3-74)、VH4次群(VH4-4、VH4-28、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-59、VH4-61)、VH5次群(VH5-51)、VH6次群(VH6-1)、VH7次群(VH7-4、VH7-81)之VH序列等為理想例。該等在公知文獻(Matsuda等人(J.Exp.Med.(1998)188,1973-1975))等也有記載，該技術領域中具有通常知識者可依據該等序列資訊適當設計本發明之抗原結合分子。該等以外之完全人類型之框架或框架之準區也可理想地使用。
完全人類型之VK序列，不僅限定於下列，例如可舉分類於Vk1次群之A20、A30、L1、L4、L5、L8、L9、L11、L12、L14、L15、L18、L19、L22、L23、L24、O2、O4、O8、O12、O14、O18、分類於Vk2次群之A1、A2、A3、A5、A7、A17、A18、A19、A23、O1、O11、分類於Vk3次群之A11、A27、L2、L6、L10、L16、L20、L25、分類於Vk4次群之B3、分類於Vk5次群之B2(本說明書中，也記載為Vk5-2))、分類於VK6次群之A10、A14、A26等(Kawasaki等人(Eur. J.Immunol.(2001)31,1017-1028)、Schable及Zachau(Biol.Chem.Hoppe Seyler(1993)374,1001-1022)及Brensing-Kuppers等人(Gene(1997)191,173-181))。
完全人類型之VL序列不僅限定於下列，例如可舉分類於VL1次群之V1-2、V1-3、V1-4、V1-5、V1-7、V1-9、V1-11、V1-13、V1-16、V1-17、V1-18、V1-19、V1-20、V1-22、分類於VL1次群之V2-1、V2-6、V2-7、V2-8、V2-11、V2-13、V2-14、V2-15、V2-17、V2-19、分類於VL3次群之V3-2、V3-3、V3-4、分類於VL4次群之V4-1、V4-2、V4-3、V4-4、V4-6、分類於VL5次群之V5-1、V5-2、V5-4、V5-6等(Kawasaki等人(Genome Res.(1997)7,250-261))為理想。
通常該等框架序列由於一個或更多胺基酸殘基的不同而彼此互異。該等框架序列可以與本發明之「依離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之至少一個胺基酸殘基」一起使用。與本發明之「依離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之至少一個胺基酸殘基」一起使用之完全人類型之框架之例，不僅限定於此，其他也有比如KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY、POM等(例如前述Kabat等人(1991)及Wu等人(J.Exp.Med.(1970)132,211-250))。
本發明不拘於特定理論，在使用生殖細胞系序列能期待排除幾乎於個人的有害免疫反應之理由之一，據認為係如下所述。由於在通常之免疫反應中發生之親和性成熟步驟，會在免疫球蛋白之可變區頻繁地發生體細胞之突變。 該等突變主要產生在其該序列為超可變的CDR的周邊，但也會影響到框架區的殘基。該等框架的突變在生殖細胞系之基因不存在，成為患者之免疫原性的可能性少。據推論此係通常之人類族群係已暴露於由生殖細胞系之基因表現的框架序列中的大多數，而有免疫寛容，結果該等生殖細胞系之框架在患者為低免疫原性或非免疫原性。為了使免疫寛容之可能性最大，可從普通存在之機能性生殖細胞系基因之集合選擇編碼為可變區之基因。
本發明之依鈣離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之胺基酸，為了製作包含前述框架序列之抗原結合分子，可適當採用部位專一性的變異誘發法(Kunkel等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82,488-492))或Overlap extension PCR等公知方法。
例如，可藉由將選擇預先含有依鈣離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之至少1個胺基酸殘基之作為框架序列之輕鏈可變區、及製作為隨機化可變區序列庫之重鏈可變區予以組合，而製作本發明之含有多數序列彼此互異之抗原結合分子之庫。如此之非限定例，離子濃度為鈣離子濃度時，例如可舉序列編號：62(Vk5-2)記載之輕鏈可變區序列為代表之屬於Vk5-2家族之輕鏈可變區序列與製作為隨機化可變區序列庫之重鏈可變區組合而得之庫。
又，在選擇預先含有前述依鈣離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之至少一個胺基酸殘基 之作為框架序列之輕鏈可變區之序列中，也可設計使得含有多樣的胺基酸作為該胺基酸殘基以外之殘基。本發明中，如此之殘基稱為柔性殘基。本發明之抗原結合分子對於抗原之結合活性，只要會依離子濃度之條件改變即可，該柔性殘基之數目及位置不限定於特定態樣。亦即重鏈及/或輕鏈之CDR序列及/或FR序列可包括一個或更多柔性殘基。例如，離子濃度為鈣離子濃度時，導入於序列編號：62(Vk5-2)記載之輕鏈可變區序列之柔性殘基之非限定例，可舉表1或表2記載之胺基酸殘基。
本說明書中，柔性殘基係指當比較公知之及/或天然抗體或抗原結合分域之胺基酸序列時，在該位置提示之幾個具有不同胺基酸之輕鏈及重鏈可變區上之胺基酸為非常多樣的位置所存在胺基酸殘基的變化(variation)。非常多樣的位置一般存在於CDR區。於一態樣中，當決定公知之及/或天然抗體之非常多樣的位置時，Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health Bethesda Md.)(1987年及1991年) 提供之資料係為有效。又，在網路上的許多資料庫(http：//vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/http：//www.bioinf.org.uk/abs/index.html)，提供收集的多數人類輕鏈及重鏈序列及其配置，該等序列及其配置的資訊在決定本發明中之非常多樣的位置時有用。依本發明，當胺基酸位在的位置較佳有約2至約20，更佳為約3至約19，較佳為約4至約18、較佳為5至17、較佳為6至16、較佳為7至15、較佳為8至14、較佳為9至13、較佳為10至12個可能的不同胺基酸殘基的多樣性時，其位置可稱為非常多樣。在一些實施形態中，有些胺基酸位置，可具有較佳為至少約2、較佳為至少約4、較佳為至少約6、較佳為至少約8、較佳為約10、較佳為約12之可能的相異胺基酸殘基的多樣性。
又，藉由組合導入有前述依離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之至少一個胺基酸殘基而得之輕鏈可變區及製作為作為隨機化可變區序列庫之重鏈可變區，也能製作本發明之含有多數序列彼此互異之抗原結合分子之庫。如此之非限定例，當離子濃度為鈣離子濃度時，例如組合序列編號：5(Vk1)、序列編號：6(Vk2)、序列編號：7(Vk3)、序列編號：8(Vk4)等生殖細胞系列之特定殘基取代為依鈣離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之至少一個胺基酸殘基而得之輕鏈可變區序列與作為隨機化可變區序列庫而製作之重鏈可變區而得之庫為理想例。該胺基酸殘基之非限定例，例如輕鏈 之CDR1包含之胺基酸殘基。此外，該胺基酸殘基之非限定例，可舉輕鏈之CDR2所含之胺基酸殘基。又，該胺基酸殘基之非限定之另一例，可舉輕鏈之CDR3所含之胺基酸殘基。
如前述，該胺基酸殘基係在輕鏈之CDR1所含之胺基酸殘基之非限定例，可舉輕鏈可變區之CDR1中之Kabat編號表示之30位、31位、及/或32位之胺基酸殘基。又，該胺基酸殘基係在輕鏈之CDR2所含之胺基酸殘基之非限定例，可舉輕鏈可變區之CDR2中之Kabat編號表示之50位之胺基酸殘基。又，該胺基酸殘基係在輕鏈之CDR3所含胺基酸殘基之非限定例，可舉輕鏈可變區之CDR3中之Kabat編號表示之92位之胺基酸殘基。又，該等胺基酸殘基，只要可形成鈣結合模體，及/或依照鈣離子濃度之條件，抗原結合分子對於抗原之結合活性會變化即可，該等胺基酸殘基可單獨含有，也可組合該等胺基酸二個以上含有。又，已知有具多個鈣離子結合部位且據認為在分子進化上來自於共通起源之TroponinC、Calmodulin、parvalbumin、肌球蛋白輕鏈等，也可設計輕鏈CDR1、CDR2及/或CDR3使含有其結合模體。例如可以上述目的適當使用Cadherin分域、Calmodulin所含之EF手、Protein kinase C所含之C2分域、血液凝固蛋白質FactorIX所含之Gla分域、脫唾液酸糖蛋白(asialoglycoprotein)受體或甘露糖結合受體所含之C型外源凝集素、LDL受體所含之A分域、annexin、thrombospondin 3型分域及EGF狀分域。
於組合導入有前述依離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之至少一個胺基酸殘基而得之輕鏈可變區以及製作為隨機化可變區序列庫之重鏈可變區時，亦與前述同樣，可設計使柔性殘基含於該輕鏈可變區之序列。本發明之抗原結合分子對於抗原之結合活性，只要會依離子濃度之條件變化即可，該柔性殘基之數及位置不限於特定態樣。亦即，重鏈及/或輕鏈之CDR序列及/或FR序列中可含有一個或更多柔性殘基。例如，離子濃度為鈣離子濃度時，導入於輕鏈可變區序列之柔性殘基之非限定例，可舉表1或表2記載之胺基酸殘基。
組合之重鏈可變區之例，可理想地舉隨機化可變區庫。隨機化可變區庫之製作方法，可適當組合公知之方法。本發明之一非限定態樣中，依據經特定抗原免疫之動物、感染症患者或接種疫苗而使血中抗體價升高之人類、癌患者、自體免疫疾病之淋巴球來源之抗體基因而構建的免疫庫，可理想地作為隨機化可變區庫。
又，本發明之一非限定態樣中，基因體DNA中之V基因或再構建且有功能的V基因之CDR序列取代為含有編碼為適當長度之密碼組之序列之合成寡核苷酸組而得之合成庫，也可理想地作為隨機化可變區庫。於該等情形，由觀察重鏈之CDR3之基因序列之多樣性，也可僅取代CDR3序列。於抗原結合分子之可變區生出胺基酸之多樣性的基準，係使露出於抗原結合分子表面之位置之胺基酸殘基帶有多樣性。露出於表面之位置，係指可基於抗原結合分子 之構造、構造整體、及/或模式化的構造而判斷可露出表面，及/或可與抗原接觸之位置，一般為其CDR。較佳為露出表面之位置，係使用來自如InsightII程式(Accelrys)之電腦程式，使用來自抗原結合分子之三維模型的座標決定。露出表面之位置，可使用在該技術領域公知之演算法(例如，Lee及Richards(J.Mol.Biol.(1971)55,379-400)、Connolly(J.Appl.Cryst.(1983)16,548-558))決定。露出表面之位置之決定，可使用適於蛋白質模型化之軟體及從抗體獲得之三維構造資訊實施。為了如此的目的可利用之軟體，可列舉SYBYL活體高分子模組軟體(Tripos Associates)。一般而言，又較佳為當演算法需要使用者輸入的大小參數時，將計算使用之探針的「大小」設為半徑約1.4埃以下。再者，使用個人電腦用軟體決定露出於表面之區及面積之方法，記載於Pacios(Comput.Chem.(1994)18(4),377-386及J.Mol.Model.(1995)1,46-53)。
又，本發明之一非限定態樣中，尤佳為使用從健康正常人之淋巴球來源的抗體基因所構建，在其曲目不含偏差(bias)之抗體序列即未改變序列構成之未改變庫作為隨機化可變區庫(Gejima等人(Human Antibodies(2002)11,121-129)及Cardoso等人(Scand.J.Immunol.(2000)51,337-344))。本發明記載之含有未改變序列之胺基酸序列，係指從如此之未改變庫取得的胺基酸序列。
本發明之一態樣中，係從組合選擇預先含有「依離子 濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之至少一個胺基酸殘基」之作為框架序列之重鏈可變區、及作為隨機化可變區序列庫製作之輕鏈可變區而含有本發明之多數序列彼此互異之抗原結合分子之庫，獲得本發明之抗原結合分域。如此之非限定例，當離子濃度為鈣離子濃度時，例如組合序列編號：9(6RL#9-IgG1)或序列編號：10(6KC4-1#85-IgG1)記載之重鏈可變區序列及製作為隨機化可變區序列庫之輕鏈可變區而得之庫為理想例。又，可將製作為隨機化可變區序列庫之輕鏈可變區，替換為從具有生殖細胞系列之序列之輕鏈可變區之中適當選擇而製作。例如組合序列編號：9(6RL#9-IgG1)或序列編號：10(6KC4-1#85-IgG1)記載之重鏈可變區序列以及具有生殖細胞系列之序列之輕鏈可變區而得之庫為理想例。
又，也可設計使得選擇預先含有前述「依離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之至少一個胺基酸殘基」之作為框架序列的重鏈可變區之序列，含有柔性殘基。本發明之抗原結合分子對於抗原之結合活性，只要能依離子濃度之條件改變即可，該柔性殘基之數目及位置不限定於特定態樣。亦即重鏈及/或輕鏈之CDR序列及/或FR序列可含有一個或更多的柔性殘基。例如，當離子濃度為鈣離子濃度時，導入於序列編號：9(6RL#9-IgG1)記載之重鏈可變區序列之柔性殘基之非限定例，比如重鏈CDR1及CDR2之全部胺基酸殘基以外，重鏈CDR3之95位、96位及/或100a位以外之CDR3之胺基酸殘基。或導入於 序列編號：10(6KC4-1#85-IgG1)之重鏈可變區序列之柔性殘基之非限定例，可舉重鏈CDR1及CDR2之全部胺基酸殘基以外，重鏈CDR3之95位及/或101位以外之CDR3之胺基酸殘基。
又，藉由將前述導入有「依離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之至少一個胺基酸殘基」之重鏈可變區及製作為隨機化可變區序列庫之輕鏈可變區或有生殖細胞系列之序列之輕鏈可變區組合，也能製作含有多數序列彼此互異之抗原結合分子之庫。如此之非限定例，於離子濃度為鈣離子濃度時，例如將重鏈可變區之特定殘基取代為依鈣依離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之至少一個胺基酸殘基而得之重鏈可變區序列及製作為隨機化可變區序列庫之輕鏈可變區或有生殖細胞系列之序列之輕鏈可變區予以組合而得之庫。該胺基酸殘基之非限定例可列舉重鏈之CDR1所含之胺基酸殘基。此外，就該胺基酸殘基之非限定例可列舉重鏈之CDR2所含之胺基酸殘基。又，該胺基酸殘基之另一非限定例可列舉重鏈之CDR3所含之胺基酸殘基。該胺基酸殘基為重鏈之CDR3包含之胺基酸殘基之非限定例，可列舉重鏈可變區之CDR3中之Kabat編號表示之95位、96位、100a位及/或101位之胺基酸。又，此等胺基酸殘基，只要能形成鈣結合模體，及/或鈣依照離子濃度之條件，抗原結合分子對於抗原之結合活性會變化即可，該等胺基酸殘基可單獨含有，也可組合該等胺基酸二個以上並含有。
前述將導入有依離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之至少一個胺基酸殘基之重鏈可變區以及製作為隨機化可變區序列庫之輕鏈可變區或有生殖細胞系列之序列之輕鏈可變區組合時，也與前述同樣，可設計使柔性殘基含於該重鏈可變區之序列。本發明之抗原結合分子對於抗原之結合活性，只要可依離子濃度之條件改變即可，該柔性殘基之數目及位置不限定於特定態樣。亦即重鏈之CDR序列及/或FR序列可含一個或更多柔性殘基。又，依離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之胺基酸殘基以外之重鏈可變區之CDR1、CDR2及/或CDR3之胺基酸序列，也可使用隨機化可變區庫。輕鏈可變區使用生殖細胞系列之序列時，例如序列編號：5(Vk1)、序列編號：6(vk2)、序列編號：7(vk3)、序列編號：8(Vk4)等生殖細胞系列之序列為非限定例。
前述，依鈣離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之胺基酸，只要能形成鈣結合模體即可，且任一胺基酸均能理想地使用，但如此之胺基酸具體而言可舉有電子提供性之胺基酸。如此之具有電子提供性之胺基酸，可舉絲胺酸、蘇胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、天冬胺酸或麩胺酸。
氫離子濃度之條件
又，本發明之一態樣中，離子濃度之條件係指氫離子濃度之條件或pH之條件。本發明中，質子亦即氫原子之原子核之濃度條件，可以與氫指數(pH)之條件同樣處理。水 溶液中之氫離子之活動量若以aH+表示，pH定義為-log10aH+。水溶液中之離子強度若(例如比10-3低)低，aH+大約等於氫離子強度。例如於25℃、1大氣壓，水之離子積為Kw=aH+aOH=10-14，所以純水中，aH+=aOH=10-7。此時之pH=7為中性，pH小於7的水溶液為酸性，pH大於7之水溶液為鹼性。
本發明中，離子濃度之條件使用pH的條件時，pH之條件可列舉高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件，與低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件。依pH之條件，結合活性改變，係指由於高氫離子濃度或低pH(pH酸性域)與低氫離子濃度或高pH(pH中性域)之條件不同，抗原結合分子對於抗原之結合活性改變。例如，比起於pH酸性域之條件下抗原結合分子對於抗原之結合活性，在pH中性域之條件下抗原結合分子對於抗原之結合活性較高的情形。又，也可列舉pH酸性域之條件時抗原結合分子對於抗原之結合活性高於在pH中性域之條件時抗原結合分子對於抗原之結合活性的情形。
本說明書中，pH中性域並不限於單值的數值，理想者為從pH6.7至pH10.0之間選擇。又，其他態樣中，可從pH6.7至pH9.5之間選擇。又，不同態樣中，可從pH7.0至pH9.0之間選擇，其他態樣中，可從pH7.0至pH8.0之間選擇。尤其，在活體內之血漿中(血中)的pH附近的pH7.4為理想。
本說明書中，pH酸性域並非限於單值的數值，宜從 pH4.0至pH6.5之間選擇。又，另一態樣中，可從pH4.5至pH6.5之間選擇。又，不同態樣中，可從pH5.0至pH6.5之間選擇，其他態樣中，可從pH5.5至pH6.5之間選擇。尤以接近活體內之早期內體內之離子化鈣濃度之pH5.8較理想。
本發明中，抗原結合分子在高氫離子濃度或低pH(pH酸性域)之條件對於抗原之結合活性低於在低氫離子濃度或高pH(pH中性域)之條件對於抗原之結合活性，係指抗原結合分子在從pH4.0至pH6.5之間選擇之pH對於抗原之結合活性，弱於在從pH6.7至pH10.0之間選擇之pH對於抗原之結合活性之意。較佳為，抗原結合分子在從pH4.5至pH6.5之間選擇之pH對於抗原之結合活性，弱於在從pH6.7至pH9.5之間選擇之pH對於抗原之結合活性，更佳為抗原結合分子在從pH5.0至pH6.5之間選擇之pH對於抗原之結合活性，弱於在從pH7.0至pH9.0之間選擇之pH對於抗原之結合活性。又，較佳為抗原結合分子在從pH5.5至pH6.5之間選擇之pH對於抗原之結合活性，弱於在從pH7.0至pH8.0之間選擇之pH對於抗原之結合活性。尤佳為，在活體內之早期內體內之pH之抗原結合活性弱於在活體內之血漿中之pH之抗原結合活性，具體而言，抗原結合分子在pH5.8對於抗原之結合活性弱於在pH7.4對於抗原之結合活性。
抗原結合分子對於抗原之結合活性是否依pH之條件而改變，例如可使用在前述結合活性之項目記載之公知之 測定方法決定。亦即，依該測定方法測定在不同pH之條件下之結合活性。例如，為了確認在pH中性域之條件下抗原結合分子對於抗原之結合活性高於在pH酸性域之條件下抗原結合分子對於抗原之結合活性，比較在pH酸性域及pH中性域之條件下，抗原結合分子對於抗原之結合活性。
又本發明中，「在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件對於抗原之結合活性，低於在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件對於抗原之結合活性」之表達方式，也可表達為：抗原結合分子在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件對於抗原之結合活性，高於在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件對於抗原之結合活性。又，本發明中，有時將「在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件對於抗原之結合活性低於在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件對於抗原之結合活性」記載為「在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件對於抗原之結合活性弱於在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件對於抗原之結合能力」，又，有時將「使在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件對於抗原之結合活性，低於低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件對於抗原之結合活性」記載為「使在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件對於抗原之結合活性，弱於在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件對於抗原之結合能力」。
對於測定抗原之結合活性時之氫離子濃度或pH以外之條件，可由該技術領域中具有通常知識者適當選擇，不 特別限定。例如，可於HEPES緩衝液、37℃之條件測定。例如可使用Biacore(GE Healthcare)等測定。抗原結合分子與抗原之結合活性之測定，當抗原為可溶型抗原的情形，可藉由將抗原作為分析物流過固定有抗原結合分子之晶片，而評價對於可溶型抗原之結合活性，於抗原為膜型抗原之情形，可藉由將抗原結合分子作為分析物，使流過固定有抗原之晶片，而評價對於膜型抗原之結合活性。
本發明之抗原結合分子，只要在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件對於抗原之結合活性弱於低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件對於抗原之結合活性即可，在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件下對於抗原之結合活性與在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件下對於抗原之結合活性之比不特別限定，較佳為對於抗原在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件之KD(Dissociation constant：解離常數)與低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件之KD之比KD(pH5.8)/KD(pH7.4)之值為2以上，更佳為KD(pH5.8)/KD(pH7.4)之值為10以上，又更佳為KD(pH5.8)/KD(pH7.4)之值為40以上。KD(pH5.8)/KD(pH7.4)之值之上限不特別限定，只要是該技術領域中具有通常知識者之技術可製作即可，可為400、1000、10000等任意值。
對於抗原之結合活性之值，於抗原為可溶型抗原之情形，可使用KD(解離常數)，於抗原為膜型抗原之情形，可使用視KD(Apparent dissociation constant：視解離常 數)。KD(解離常數)、及視KD(視解離常數)，可以用該技術領域中具有通常知識者公知之方法測定，例如可使用Biacore(GE healthcare)、Scatchard plot、流式細胞計數器等。
又，代表本發明之抗原結合分子在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件對於抗原之結合活性與在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件對於抗原之結合活性之比之其他指標，例如也可理想地使用解離速度常數kd(Dissociation rate constant：解離速度常數)。代表結合活性之比之指標，使用kd(解離速度常數)代替KD(解離常數)時，對於抗原在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件之kd(解離速度常數)與在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件之kd(解離速度常數)之比，即kd(pH酸性域之條件)/kd(pH中性域之條件)之值，較佳為2以上，更佳為5以上，又更佳為10以上，再更佳為30以上。Kd(pH酸性域之條件)/kd(pH中性域之條件)之值之上限不特別限定，只要該技術領域中具有通常知識者之技術常識可製作即可，可為50、100、200等各種值。
抗原結合活性之值，於抗原為可溶型抗原之情形，可使用kd(解離速度常數)，於抗原為膜型抗原之情形，可使用視kd(Apparent dissociation rate constant：視解離速度常數)。kd(解離速度常數)、及視kd(視解離速度常數)，可使用該技術領域中具有通常知識者公知之方法測定，例如可使用Biacore(GE healthcare)、流式細胞計數 器等。又，本發明中，當測定不同氫離子濃度亦即pH時抗原結合分子對於抗原之結合活性時，宜將氫離子濃度亦即pH以外之條件設為相同。
例如本發明提供之一個態樣，即在氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件對於抗原之結合活性低於在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件對於抗原之結合活性之抗原結合分域或抗體，可依包含以下步驟(a)~(c)之抗原結合分域或抗體之篩選取得。
(a)獲得在pH酸性域之條件下抗原結合分域或抗體之抗原結合活性；(b)獲得在pH中性域之條件下抗原結合分域或抗體之抗原結合活性；及(c)選擇在pH酸性域之條件之抗原結合活性低於在pH中性域之條件之抗原結合活性之抗原結合分域或抗體。
又，本發明提供之一個態樣，即在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件對於抗原之結合活性低於在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件對於抗原之結合活性之抗原結合分域或抗體，可依包含以下步驟(a)~(c)之抗原結合分域或抗體或此等之庫之篩選而取得。
(a)在pH中性域之條件使抗原結合分域或抗體或此等之庫接觸抗原；(b)將於前述步驟(a)與抗原結合之抗原結合分域或抗體放置在pH酸性域之條件下；及(c)將在前述步驟(b)解離之抗原結合分域或抗體單離。
又，本發明提供之一個態樣，即在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件對於抗原之結合活性低於在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件對於抗原之結合活性之抗原結合分域或抗體，可依包含以下步驟(a)~(d)之抗原結合分域或抗體或此等之庫之篩選取得。
(a)於pH酸性域之條件下使抗原結合分域或抗體之庫接觸抗原；(b)選擇在前述步驟(a)未與抗原結合之抗原結合分域或抗體；(c)使於前述步驟(b)選擇之抗原結合分域或抗體於pH中性域之條件與抗原結合；及(d)將在前述步驟(c)與抗原結合之抗原結合分域或抗體單離。
再者，本發明提供之一個態樣，即在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件對於抗原之結合活性低於在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件對於抗原之結合活性之抗原結合分域或抗體，可依包含以下步驟(a)~(c)之篩選方法取得。
(a)在pH中性域之條件使抗原結合分域或抗體之庫接觸固定有抗原之管柱；(b)將在前述步驟(a)與管柱結合之抗原結合分域或抗體於pH酸性域之條件從管柱溶出；及(c)將在前述步驟(b)溶出之抗原結合分域或抗體單離。
又，本發明提供之一個態樣，即在高氫離子濃度或低 pH亦即pH酸性域之條件對於抗原之結合活性低於在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件對於抗原之結合活性之抗原結合分域或抗體，可依包含以下步驟(a)~(d)之篩選方法取得。
(a)於pH酸性域之條件使抗原結合分域或抗體之庫通過固定有抗原之管柱；(b)回收在前述步驟(a)未與管柱結合而溶出之抗原結合分域或抗體；(c)使於前述步驟(b)回收之抗原結合分域或抗體於pH中性域之條件與抗原結合；及(d)將在前述步驟(c)與抗原結合之抗原結合分域或抗體單離。
又，本發明提供之一個態樣，即在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件對於抗原之結合活性低於在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件對於抗原之結合活性之抗原結合分域或抗體，可依包含以下步驟(a)~(d)之篩選方法取得。
(a)在pH中性域之條件使抗原結合分域或抗體之庫接觸抗原；(b)取得在前述步驟(a)與抗原結合之抗原結合分域或抗體；(c)將於前述步驟(b)取得之抗原結合分域或抗體放置在pH酸性域之條件；及(d)將在前述步驟(c)之抗原結合活性弱於在前述步驟(b) 選擇之基準之抗原結合分域或抗體單離。
又，前述步驟也可重複2次以上。因此，依本發明，可提供利用上述篩選方法中，更包含重複(a)~(c)或(a)~(d)之步驟2次以上之篩選方法取得之在pH酸性域之條件對於抗原之結合活性低於在pH中性域之條件對於抗原之結合活性之抗原結合分域或抗體。(a)~(c)或(a)~(d)之步驟重複的次數不特別限定，通常為10次以內。
本發明之篩選方法中，高氫離子濃度條件或低pH亦即pH酸性域之抗原結合分域或抗體之抗原結合活性，只要是pH為4.0~6.5之間之抗原結合活性即不特別限定，理想之pH例如pH為4.5~6.6之間之抗原結合活性。更佳的pH，例如pH為5.0~6.5之間之抗原結合活性，更佳為pH為5.5~6.5之間之抗原結合活性。更佳之pH例如活體內之早期內體內之pH，具體而言例如於pH5.8之抗原結合活性。又，於低氫離子濃度條件或高pH亦即pH中性域之抗原結合分域或抗體之抗原結合活性，只要是pH為6.7~10之間之抗原結合活性即不特別限定，理想之pH為例如pH為6.7~9.5之間之抗原結合活性。其他理想的pH可列舉pH為7.0~9.5之間之抗原結合活性，更佳為pH為7.0~8.0之間之抗原結合活性。更佳的pH，可舉在活體內之血漿中之pH，具體而言可舉於pH為7.4之抗原結合活性。
抗原結合分域或抗體之抗原結合活性，可利用該技術領域中具有通常知識者公知之方法測定，針對離子化鈣濃度以外之條件可由該技術領域中具有通常知識者適當決 定。抗原結合分域或抗體之抗原結合活性，可就KD(Dissociation constant：解離常數)、視KD(Apparent dissociation constant：視解離常數)、解離速度kd(Dissociation rate：解離速度常數)、或視kd(Apparent dissociation：視解離速度常數)等評價。此等可利用該技術領域中具有通常知識者公知之方法測定，例如可使用Biacore(GE healthcare)、Scatchard作圖法、FACS等。
本發明中，選擇在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件之抗原結合活性高於在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件之抗原結合活性之抗原結合分域或抗體之步驟，係與選擇在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件之抗原結合活性低於在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之抗原結合活性的抗原結合分域或抗體之步驟含意相同。
只要在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件之抗原結合活性高於在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件之抗原結合活性即可，在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件之抗原結合活性與在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件之抗原結合活性之差不特別限定，較佳為在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件之抗原結合活性為在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件之抗原結合活性之2倍以上，更佳為10倍以上，又更佳為40倍以上。
依前述篩選方法篩選之本發明之抗原結合分域或抗體 可為各種抗原結合分域或抗體，例如可選擇上述抗原結合分域或抗體。例如可篩選具有天然序列之抗原結合分域或抗體，也可篩選胺基酸序列經取代之抗原結合分域或抗體。
依前述篩選方法篩選之本發明之抗原結合分域或抗體可以用任意方式製備，例如可使用預先存在之抗體、預先存在之庫(噬菌體庫等)、由對於動物免疫獲得之融合瘤或從來自免疫動物之B細胞製作之抗體或庫、對於該等抗體或庫導入側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸變異而得之抗體或庫或非天然胺基酸之含有率提高之庫或於特定部位導入有側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸變異之庫等)等。
從對於動物免疫獲得之融合瘤或從來自免疫動物之B細胞製作之抗原結合分域或抗體，取得在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件之抗原結合活性高於在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件之抗原結合活性之抗原結合分域或抗體之方法，例如將如WO2009/125825記載之抗原結合分域或抗體中之胺基酸之至少一個取代為側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或取代為非天然胺基酸變異或抗原結合分域或抗體中，插入側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸之抗原結合分子或抗體為理想例。
側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸之變異導入之位置不特別限定，只要比起 取代或插入前，在pH酸性域之抗原結合活性比在pH中性域之抗原結合活性弱(KD(pH酸性域)/KD(pH中性域)之值增大、或kd(pH酸性域)/kd(pH中性域)之值為增大)即可，可在任意部位。例如，於抗原結合分子為抗體之情形，抗體之可變區或CDR等為理想例。取代為側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸之胺基酸之數目、或插入之胺基酸之數目可由該技術領域中具有通常知識者適當決定，可由側鏈之pKa為4.0-8.0的1個胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸取代，可插入側鏈之pKa為4.0-8.0的1個胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸，可由側鏈之pKa為4.0-8.0之2個以上之多數胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸取代，可插入側鏈之pKa為4.0-8.0之2個以上之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸。又，取代為側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸或插入側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸以外，可同時進行其他胺基酸之缺失、附加、插入及/或取代等。取代為側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸或插入側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸，可由該技術領域中具有通常知識者公知之丙胺酸掃描之丙胺酸取代為組胺酸等之組胺酸等掃描等的方法隨機進行，可從側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸之取代或插 入之變異經隨機導入之抗原結合分域或抗體之中，選擇比起變異前，KD(pH酸性域)/KD(pH中性域)或kd(pH酸性域)/kd(pH中性域)之值變大的抗原結合分子。
如前述，該側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸之變異已進行且於pH酸性域之抗原結合活性低於在pH中性域之抗原結合活性之抗原結合分子之理想例，例如變異為其側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸後在pH中性域之抗原結合活性，與變異為其側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸前在pH中性域之抗原結合活性為同等的抗原結合分子為理想例。本發明中，變異為其側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸之後之抗原結合分子，具有與變異為其側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸之抗原結合分子有同等抗原結合活性，係指變異為其側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸前之抗原結合分子之抗原結合活性定為100%時，變異為其側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸後之抗原結合分子之抗原結合活性至少為10%以上，較佳為50%以上，更佳為80%以上，又較佳為90%以上。變異為其側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸後，於pH7.4之抗原結合活性，也可高於變異為其側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或 非天然胺基酸之前在pH7.4之抗原結合活性。藉由取代為或插入其側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸而使抗原結合分子之抗原結合活性減低時，可藉由將抗原結合分子中之1或多數胺基酸進行取代、缺失、附加及/或插入等，使得抗原結合活性與取代為或插入其側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸前之抗原結合活性為同等。本發明中，如此之側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸之取代或插入後，藉由進行1或多數胺基酸之取代、缺失、附加及/或插入使得結合活性成為同等的抗原結合分子，也包括在內。
又，抗原結合分子為包含抗體不變區之物質時，在pH酸性域之抗原結合活性低於在pH中性域之抗原結合活性之抗原結合分子之另一理想態樣，可列舉改變抗原結合分子所含之抗體不變區之方法。改變後之抗體不變區之具體例，例如序列編號：11、12、13、或14記載之不變區為理想例。
使抗原結合分域對於抗原之結合活性依氫離子濃度之條件改變之胺基酸
依前述篩選方法篩選之本發明之抗原結合分域或抗體可以用任意方式製備，例如當離子濃度之條件為氫離子濃度之條件或pH之條件時，可使用預先存在之抗體、預先存在之庫(噬菌體庫等)、由對於動物免疫獲得之融合瘤或從來自免疫動物之B細胞製作之抗體或庫、對於該等抗體或 庫導入側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸變異而得之抗體或庫(側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸之含有率提高之庫或於特定部位導入有側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸變異之庫等)等。
就本發明之一非限定態樣而言，藉由組合導入有「依氫離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之至少一個胺基酸殘基」之輕鏈可變區及製作為隨機化可變區序列庫之重鏈可變區，也可製作包含本發明之多數序列彼此互異之抗原結合分子之庫。
該胺基酸殘基之非限定例，可列舉輕鏈之CDR1所含之胺基酸殘基。此外，該胺基酸殘基之非限定例，可列舉輕鏈之CDR2所含之胺基酸殘基。又，該胺基酸殘基之另一非限定例，也可列舉輕鏈之CDR3所含之胺基酸殘基。
如前述，該胺基酸殘基為輕鏈之CDR1所含之胺基酸殘基之非限定例，可列舉輕鏈可變區之CDR1中之Kabat編號表示之24位、27位、28位、31位、32位及/或34位之胺基酸殘基。又，該胺基酸殘基為輕鏈之CDR2所含之胺基酸殘基之非限定例，可列舉輕鏈可變區之CDR2中之Kabat編號表示之50位、51位、52位、53位、54位、55位及/或56位之胺基酸殘基。又，該胺基酸殘基為輕鏈之CDR3所含之胺基酸殘基之非限定例，可列舉輕鏈可變區之CDR3中之Kabat編號表示之89位、90位、91位、92位、93位、 94位及/或95A位之胺基酸殘基。又，該等胺基酸殘基，只要是依氫離子濃度之條件，抗原結合分子對於抗原之結合活性會變化即可，該等胺基酸殘基可單獨含有也可組合2種以上該等胺基酸而含有。
前述組合導入有「依氫離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之至少一個胺基酸殘基」之輕鏈可變區及製作為隨機化可變區序列庫之重鏈可變區之情形，亦與前述同樣，可設定為使柔性殘基含於該輕鏈可變區之序列。本發明之抗原結合分子對於抗原之結合活性，只要會依氫離子濃度之條件改變即可，該柔性殘基之數目及位置不限定於特定態樣。亦即，重鏈及/或輕鏈之CDR序列及/或FR序列可含一個或更多柔性殘基。例如，導入於輕鏈可變區序列之柔性殘基之非限定例，可列舉表3或表4記載之胺基酸殘基。又，依氫離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之胺基酸殘基或柔性殘基以外之輕鏈可變區之胺基酸序列，就非限定例可理想地使用Vk1(序列編號：5)、Vk2(序列編號：6)、Vk3(序列編號：7)、Vk4(序列編號：8)等生殖細胞系列之序列。
【表3】 (位置表示Kabat編號)
【表4】 (位置表示Kabat編號)
前述依氫離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之胺基酸殘基，任一胺基酸殘基均可理想地使用，但如此之胺基酸殘基，具體而言可舉側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸。如此之具有電子提供性之胺基酸，除了組胺酸或麩胺酸等天然胺基酸以外，也可列舉組胺酸類似物(US20090035836)或m-NO2-Tyr(pKa 7.45)、3,5-Br2-Tyr(pKa 7.21)或3,5-I2-Tyr(pKa 7.38)等非天然的胺基酸(Bioorg.Med.Chem.(2003)11(17),3761-2768。又，該胺基酸殘基之特佳例，可列舉側鏈之 pKa為6.0-7.0之胺基酸。如此之有電子提供性之胺基酸，例如組胺酸。
為了改變抗原結合分域之胺基酸，可適當採用部位專一性的變異誘發法(Kunkel等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82,488-492))或Overlap extension PCR等公知之方法。又，就取代為天然胺基酸以外之胺基酸之胺基酸改變方法，可採用多數公知之方法(Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.(2006)35,225-249、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2003)100(11),6353-6357)。例如於含有為終止密碼子的1個UAG密碼子(amber codon)的互補amber suppressor tRNA結合有非天然胺基酸之tRNA的無細胞轉譯系系統(Clover Direct(Protein Express))等也可理想地使用。
組合之重鏈可變區之例，以隨機化可變區庫為理想例。隨機化可變區庫之製作方法，可適當組合公知方法。本發明之一非限定態樣中，依據以特定抗原免疫之動物、感染症患者或接種疫苗而使血中抗體價升高之人類、癌患者、自體免疫疾病之淋巴球來源之抗體基因構建之免疫庫，可理想地作為隨機化可變區庫。
又，本發明之一非限定態樣中，與前述同樣，基因體DNA中之V基因或再構建且有功能的V基因之CDR序列取代為含有編碼為適當長度之密碼組之序列之合成寡核苷酸組而得之合成庫，也可理想地作為隨機化可變區庫。於該等情形，由觀察重鏈之CDR3之基因序列之多樣性，也可僅 取代CDR3序列。於抗原結合分子之可變區生出胺基酸之多樣性的基準，係使露出於抗原結合分子表面之位置之胺基酸殘基帶有多樣性。露出於表面之位置，可基於抗原結合分子之構造、構造整體、及/或模式化的構造而判斷可露出表面，及/或與抗原接觸之位置，一般為其CDR。較佳為露出表面之位置，係使用來自如InsightII程式(Accelrys)之電腦程式，使用來自抗原結合分子之三維模型之座標決定。露出表面之位置，可使用在該技術領域公知之演算法(例如，Lee及Richards(J.Mol.Biol.(1971)55,379-400)、Connolly(J.Appl.Cryst.(1983)16,548-558))決定。露出表面之位置之決定，可使用適於蛋白質模型化之軟體及從抗體獲得之三維構造資訊獲得。為了如此的目的可利用之軟體，可列舉SYBYL活體高分子模組軟體(Tripos Associates)。一般而言，又較佳為當演算法需要使用者輸入的大小參數時，將計算使用之探針的「大小」設為半徑約1.4埃以下。再者，使用個人電腦用軟體決定露出於表面之區及面積之方法，記載於Pacios(Comput.Chem.(1994)18(4),377-386及J.Mol.Model.(1995)1,46-53)。
又，本發明之一非限定態樣中，尤佳為使用從健康正常人之淋巴球來源的抗體基因所構建，在其曲目不含偏差(bias)之抗體序列即未改變序列構成之未改變庫作為隨機化可變區庫(Gejima等人(Human Antibodies(2002)11,121-129)及Cardoso等人(Scand.J.Immunol.(2000) 51,337-344))。本發明記載之含有未改變序列之胺基酸序列，係指從如此之未改變庫取得的胺基酸序列。
中和活性
本發明之一非限定態樣中，提供抗原結合分子及含該抗原結合分子之醫藥組成物，該抗原結合分子包含：於pH酸性域對於人類FcRn有結合活性、依離子濃度之條件對於抗原之結合活性會變化之抗原結合分域；及於pH中性域之條件下對於Fcγ受體之結合活性比起結合於EU編號297位之糖鏈係含岩藻糖之糖鏈之天然型人類IgG之Fc區對於Fcγ受體之結合活性高之Fcγ受體結合分域；且對於抗原有中和活性。一般而言，中和活性係指抑制對於病毒或毒素等對細胞有生物學活性之配體之該生物學活性之活性。亦即，有中和活性之物質，係指結合於該配體或該配體所結合之受體，並抑制該配體與受體之結合之物質。利用中和活性使與配體結合受抑制之受體，不能發揮經由該受體媒介之生物學活性。抗原結合分子為抗體之情形，具有如此之中和活性之抗體，一般稱為中和抗體。某待驗物質之中和活性，係藉由將在配體之存在下其生物學活性在待驗物質存在或非存在下之條件之間比較而測定。
例如，作為IL-6R之主要配體考量者，以序列編號：15表示之IL-6為理想例。其胺基末端形成細胞外分域之I型膜蛋白質IL-6R，會與因IL-6而誘導二聚物化之gp130受體一起形成異四聚物(HEINRICH等人(Biochem.J.(1998)334,297-314))。由於該異四聚物之形成，組合於gp130 受體之Jak活化。Jak進行自磷酸化及受體之磷酸化。受體及Jak之磷酸化部位，對於屬於如Stat3之有SH2之Stat家族之分子、或MAP激酶、PI3/Akt、其他具SH2之蛋白質或適應子(adaptor)，發揮結合部位之作用。其次，結合於gp130受體之Stat由於Jak而磷酸化。經磷酸化之Stat形成二聚物並移到核內，調整標的基因之轉錄。Jak或Stat經由其他類別之受體而涉及信號的串流。脫離控制的IL-6之信號串流，會觀察到自體免疫疾病之病態或發炎、多發性骨髓癌或前列腺癌等癌。能作為癌基因之Stat3，在許多癌中係持續地被活化。前列腺癌與多發性骨髓瘤中，來自IL-6R之信號串流與來自上皮成長因子受體(EGFR)家族成員之信號串流之間有串音(crosstalk)(Ishikawa等人(J.Clin.Exp.Hematopathol.(2006)46(2),55-66))。如此之細胞內之信號串流對每一細胞種類不同，可因應目的標的細胞適當設定標的分子，不限定於上述因子。藉由測定活體內信號之活化，可評價中和活性。又，以對於存在活體內信號串流之下游的標的基因的轉錄誘導作用作為指標，可檢測活體內信號之活化。標的基因之轉錄活性之改變，可利用報告子試驗法的原理檢測。具體而言，在標的基因之轉錄因子或起動子區之下游配置GFP(Green Fluorescence Protein)或發光酶等報告子基因，並測定其報告子活性，可就轉錄活性之改變測定作為報告子活性。活體內信號活化之測定套組，也可適當使用市售品(例如，Mercury Pathway Profiling Luciferase System(Clontech) 等)。
再者，通常就測定作用於促進細胞增殖之方向之作用於信號串流的EGF受體家族等受體配體之中和活性之方法而言，可藉由測定標的細胞之增殖活性而評價中和抗體之中和活性。例如，就抗HB-EGF抗體基於中和活性對於例如HB-EGF等其增殖受EGF家族之成長因子而促進之細胞增殖之抑制效果予以評價或測定之方法而言，可理想地使用以下方法。在試管內評價或測定該細胞增殖抑制活性之方法，可使用測定培養基中添加之[3H]標記胸腺嘧啶由活細胞之攝入作為DNA複製能力指標的方法。就更簡便的方法，有於顯微鏡下計測將trypan blue等色素排除到細胞外之能力的色素排除法、或MTT法。後者係利用活細胞有將四唑鎓鹽MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)轉換為藍色的formazan產物的能力。更具體而言，在待驗細胞的培養液中同時加入配體及待驗抗體並經過一定時間後，將MTT溶液加入培養液並靜置一定時間以使細胞攝入MTT。其結果黃色化合物MTT由於細胞內之粒腺體內的琥珀酸脫氫酵素而變換為藍色的化合物。使該藍色生成物溶解並呈色後測定其吸光度，作為活細胞數的指標。MTT以外，也有MTS、XTT、WST-1、WST-8等試藥有市售(nacalai tesque等)，可理想地使用。活性測定時，作為對照抗體，將與抗HB-EGF抗體有相同之構造同型之抗體且不具有該細胞增殖抑制活性之結合抗體與抗 HB-EGF抗體同樣地使用，藉由抗HB-EGF抗體顯示比對照抗體強的細胞增殖抑制活性，可判定活性。用於評價活性之細胞，例如其增殖受HB-EGF促進之細胞，例如卵巢癌細胞RMG-1細胞株、經利用將以編碼為人類EGFR之細胞外分域與小鼠GCSF受體之細胞內分域於同一讀框融合而得之融合蛋白質hEGFR/mG-CSFR之基因表現之方式結合之載體轉形之小鼠Ba/F3細胞等可理想地使用。如此，該技術領域中具有通常知識者可適當選擇用於評價活性之細胞而使用於測定前述細胞增殖活性。
本發明提供之抗原結合分子，由於能使抗原從血漿中消失，所以抗原結合分子本身不一定要有中和活性。但在利用經由Fcγ受體之內吞作用使抗原與抗原結合分子一起進入到表現Fcγ受體之細胞內為止的期間，藉由發揮對於抗原之中和活性，能進一步阻斷血漿中存在之抗原之機能為更佳。
又，本發明提供之抗原結合分子，能促進在細胞外結合於抗原結合分子之抗原在細胞內從抗原結合分子解離，所以在細胞內從抗原結合分子解離的抗原會於溶體內分解。所以抗原結合分子本身不一定要有中和活性。但在利用經由Fcγ受體之內吞作用使抗原與抗原結合分子一起進入到表現Fcγ受體之細胞內為止的期間，藉由發揮對於抗原之中和活性，能進一步阻斷血漿中存在之抗原之機能為更佳。
再者，本發明提供之抗原結合分子，由於能使血漿中 之總抗原濃度或游離抗原濃度減少，所以抗原結合分子本身不一定要有中和活性。但在利用經由Fcγ受體之內吞作用使抗原與抗原結合分子一起進入到表現Fcγ受體之細胞內為止的期間，藉由發揮對於抗原之中和活性，能進一步阻斷血漿中存在之抗原之機能為更佳。
Fcγ受體
Fcγ受體(FcγR)，係指能與IgG1、IgG2、IgG3、IgG4單株抗體之Fc區結合的受體，實質上意指由Fcγ受體基因編碼之蛋白質之家族的任一成員。人類中，該家族包括含同型異構物FcγRIa、FcγRIb及FcγRIc之FcγRI(CD64)；含同型異構物FcγRIIa(包括副型H131及R131)、FcγRIIb(包括FcγRIIb-1及FcγRIIb-2)及FcγRIIc之FcγRII(CD32)；及含同型異構物FcγRIIIa(包括副型V158及F158)及FcγRIIIb(包括副型FcγRIIIb-NA1及FcγRIIIb-NA2)之FcγRIII(CD16)，以及任意未曾發現的人類FcγR類或FcγR同型異構物或副型，但不限定於該等。FcγR，包括人類、小鼠、大鼠、兔及猴來源者，但不限定於此等，可為任意生物來源。小鼠FcγR類，包括FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)及FcγRIII-2(FcγRIV、CD16-2)、及任意未曾發現的小鼠FcγR類或FcγR同型異構物或副型，但不限定於該等。如此的Fcγ受體之理想例，可舉人類FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)、FcγRIIb(CD32)、FcγRIIIa(CD16)及/或FcγRIIIb(CD16)。人類FcγRI之 聚核苷酸序列及胺基酸序列各記載於序列編號：16(NM_000566.3)及17(NP_000557.1)，人類FcγRIIa(副型H131)之聚核苷酸序列及胺基酸序列各記載於序列編號：18(BC020823.1)及19(AAH20823.1)(副型R131為序列編號：19之166號之胺基酸取代為Arg之序列)、FcγRIIb之聚核苷酸序列及胺基酸序列各記載於序列編號：20(BC146678.1)及21(AAI46679.1)，FcγRIIIa之聚核苷酸序列及胺基酸序列各記載於序列編號：22(BC033678.1)及23(AAH33678.1)，FcγRIIIb之聚核苷酸序列及胺基酸序列各記載於序列編號：24(BC128562.1)及25(AAI28563.1)(括弧內代表RefSeq註冊編號)。Fcγ受體是否有與IgG1、IgG2、IgG3、IgG4單株抗體之Fc區結合之活性，除了上述記載之FACS或ELISA格式以外，也可利用ALPHA篩選(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)或利用表面電漿子共振(SPR)現象之BIACORE法等確認(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11),4005-4010)。
又，「Fc配體」或「效應子配體」，係指與抗體之Fc區結合並形成Fc/Fc配體複合體之來自任意生物之分子，較佳為多胜肽。Fc配體對於Fc之結合，較佳為引起1個或更多效應子機能。Fc配體包括Fc受體、FcγR、FcαR、FcεR、FcRn、C1q、C3、甘露聚糖結合外源凝集素、甘露糖受體、葡萄球菌屬(staphylococcus)的ProteinA、葡萄球菌屬之蛋白質G及病毒之FcγR，但不限定於該等。Fc 配體中，也包括與FcγR相同之Fc受體之家族即Fc受體相同體(FcRH)(Davis et al.,(2002)Immunological Reviews 190,123-136)或FCRL(Annu Rev Immunol,2007；25：525-60)。Fc配體也包括與Fc結合之未曾發現的分子。
包括FcγRIa、FcγRIb及FcγRIc之FcγRI(CD64)及包括同型異構物FcγRIIIa(包括副型V158及F158)及FcγRIIIb(包括副型FcγRIIIb-NA1及FcγRIIIb-NA2)之FcγRIII(CD16)，會與IgG之Fc部分結合之α鏈及在細胞內傳遞活化信號之有ITAM之共通γ鏈組合。另一方面，含有同型異構物FcγRIIa(包括副型H131及R131)及FcγRIIc之FcγRII(CD32)本身的細胞質分域，包括ITAM。該等受體在巨噬細胞或肥大細胞(mast cell)、抗原提示細胞等許多免疫細胞表現。該等受體藉由與IgG之Fc部分結合而傳遞的活化信號，促進巨噬細胞之吞噬能力或發炎性細胞激素產生、肥大細胞之脫顆粒、抗原提示細胞之機能亢進。如上述，具有傳遞活化信號之能力之Fcγ受體，在本發明也稱為活性型Fcγ受體。
另一方面，FcγRIIb(包括FcγRIIb-1及FcγRIIb-2)本身的細胞質內分域包括傳遞抑制型信號之ITIM。B細胞中，由於FcγRIIb與B細胞受體(BCR)的交聯，抑制來自BCR之活化信號。結果使BCR之抗體產生受抑制。巨噬細胞中，由於FcγRIII與FcγRIIb之交聯使吞噬能力或發炎性細胞激素的產生能力受抑制。如上述有傳遞抑制化信號之能力之Fcγ受體，在本發明也稱為抑制型Fcγ受體。
對於Fcγ受體之結合活性
本發明之抗原結合分子所含之FcγR結合分域之FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa及/或FcγRIIIb中之任一者對於人類Fcγ受體之結合活性，可利用如上記載之FACS或ELISA格式確認，此外也可利用ALPHA篩選(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)或利用表面電漿子共振(SPR)現象之BIACORE法等確認(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11),4005-4010)。在該等試驗法中，人類Fcγ受體之細胞外分域可作為可溶性抗原使用。
ALPHA篩選，係利用使用提供者與接受者的2種珠之ALPHA技術，依下列之原理實施。接近於提供者珠之分子會與結合於接受者珠之分子以生物學交互作用，僅在2珠接近的狀態檢測出發光信號。由雷射激發的提供者珠內的光敏劑將周邊的氧變換為激發狀態的單態氧。單態氧擴散到提供者珠周邊，到達接近的接受者珠時會引起珠內之化學發光反應，最終發出光。與提供者珠結合之分子及結合於接受者珠之分子彼此未交互作用時，提供者珠產生之單態氧未到達接受者珠，故不起化學發光反應。
例如。於提供者珠結合有包括經生物素標記之Fc區之抗原結合分子，於接受者珠結合有以麩胱甘肽S轉移酶(GST)標籤化的Fcγ受體。競爭的含Fc區變異體之抗原結合分子不存在時，有天然型Fc區之抗原結合分子與Fcγ受體會交互作用並產生520-620 nm的信號。含有未標籤化 的Fc區變異體之抗原結合分子，會與有天然型Fc區之抗原結合分子在與Fcγ受體間之交互作用競爭。將競爭結果表示之螢光減少予以定量，可決定相對的結合親和性。抗體等抗原結合分子使用Sulfo-NHS-生物素等予以生物素化係為公知。將Fcγ受體以GST予以標籤化之方法，可適當採用將編碼為Fcγ受體之聚核苷酸與編碼為GST之聚核苷酸於同一讀框融合而得之融合基因連結於保持有可作用之載體的細胞等中表現，並使用麩胱甘肽管柱精製之方法等。獲得之信號可藉由使用例如GRAPHPAD PRISM(GraphPad公司、San Diego)等的軟體以非線性回歸解析之一部位競合(one-site competition)模型擬合(fitting)而理想地解析。
將觀察交互作用之物質的其中之一(配體)固定在感應晶片之金薄膜上，並從感應晶片的背側照射光使在金薄膜與玻璃的交界面發生全反射，則反射光的一部分會形成反射強度下降的部分(SPR信號)。將觀察交互作用之物質的其中另一者(分析物)流過感應晶片的表面並使配體與分析物結合，則經固定化之配體分子的質量增加，感應晶片表面之溶劑之折射率會改變。藉由該折射率的變化，SPR信號的位置會偏移(反之，結合若解離，則回到信號位置)。Biacore系統取上述偏移量，亦即感應晶片表面之質量變化作為縱軸，將質量之時間變化作為測定資料表示(感測圖)。從感測圖的曲線，求出動力學：結合速度常數(ka)與解離速度常數(kd)，由該常數之比求出親和性(KD)。 BIACORE法也可理想地使用於抑制測定法。抑制測定法，例如Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11),4005-4010。
Fcγ受體結合分域
比起結合於EU編號297位之糖鏈係含岩藻糖之糖鏈之天然型人類IgG之Fc區對於Fcγ受體之結合活性，對於Fcγ受體之結合活性較高之Fcγ受體結合分域，可藉由改變天然型人類IgG之Fc區之胺基酸而製作。又，Fcγ受體結合分域也可使用以結合於Fcγ受體為特徵之先前記載之抗原結合分域之任一構造的分域。於此情形，無需導入胺基酸改變可製作，且可進一步導入改變，而提高對於Fcγ受體之親和性。如此的Fcγ受體結合分域，可舉Protein Eng Des Sel.2009 Mar；22(3)：175-88、Protein Eng Des Sel.2008 Jan；21(1)：1-10.及J Immunol.2002 Jul 1；169(1)：137-44記載之結合於FcγRIIIa之Fab片段抗體、駱駝來源之單分域抗體及single chain Fv抗體、及FASEB J.2009 Feb；23(2)：575-85.記載之FcγRI結合環狀胜肽等。Fcγ受體結合分域對於FcγR之結合活性，是否比起結合於EU編號297位之糖鏈係含岩藻糖之糖鏈之天然型人類IgG之Fc區對於FcγR之結合活性高，可使用前述結合活性之項目記載的方法適當實施。
本發明中，初始Fcγ受體結合分域，例如以人類IgG之Fc區為理想例。本發明中，Fc區之「胺基酸之改變」或「胺基酸改變」，包括改變為與初始Fc區之胺基酸序列 相異之胺基酸序列。初始Fc區之修飾變異體只要在pH中性域能與人類Fcγ受體結合即可，可使用任一Fc區當作初始Fc區。又，將已有改變之Fc區作為初始Fc區並更施加改變而得之Fc區也可理想地作為本發明之Fc區。初始Fc區，可意指多胜肽本身、包括初始Fc區之組成物、或編碼為初始Fc區之胺基酸序列。初始Fc區中，包括在抗體之項目概說之以重組產生的公知之Fc區。初始Fc區之起源不限定，可從非人類動物之任意生物或人類取得。較佳為，任意生物為從小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠、長爪沙鼠、貓、兔、狗、山羊、綿羊、牛、馬、駱駝、及非人類靈長類選出的生物為理想例。其他態樣中，初始Fcγ受體結合分域也可從食蟹猴、狨猴、獼猴、黑猩猩、或人類取得。較佳為，初始Fc區從人類IgG1取得，且不限定於IgG之特定類別。其意指人類IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4之Fc區可理想地作為初始Fcγ受體結合分域使用。同樣，本說明書中，前述來自任意生物之IgG之任意類別或次類別之Fc區較佳為可作為初始Fc區。天然存在之IgG之變異體或操作之型之例，記載於公知文獻(Curr.Opin.Biotechnol.(2009)20(6),685-91、Curr.Opin.Immunol.(2008)20(4),460-470、Protein Eng.Des.Sel.(2010)23(4),195-202、WO2009/086320、WO2008/092117、WO2007/041635、及WO2006/105338)，但不限於此等。
改變例如包括：一個以上之變異，例如，取代為與初始Fc區之胺基酸相異之胺基酸殘基之變異、或對於初始Fc 區之胺基酸插入一個以上之胺基酸殘基或使初始Fc區之胺基酸有一個以上胺基酸缺失等。較佳為，改變後之Fc區之胺基酸序列中包括至少一部分非天然之Fc區之胺基酸序列。如此的變種必然與初始Fc區有少於100%之序列同一性或類似性。理想之實施形態中，變種與初始Fc區之胺基酸序列有約75%~少於100%之胺基酸序列同一性或類似性，更佳為約80%~少於100%，又更佳為約85%~少於100%，再更佳為約90%~少於100%，最佳為約95%~少於100%之同一性或類似性之胺基酸序列。本發明之一非限定態樣中，初始Fc區及本發明之經改變之Fc區之間，有至少1個胺基酸之差異。初始Fc區與改變Fc區之胺基酸之不同，尤其以前述EU編號指定之胺基酸殘基之位置之經指定之胺基酸之差異也可理想地指定。
為了改變Fc區之胺基酸，可適當採用部位專一性的變異誘發法(Kunkel等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82,488-492))或Overlap extension PCR等公知之方法。又，取代為天然胺基酸以外之胺基酸之胺基酸之改變方法，也可採用多數公知之方法(Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.(2006)35,225-249、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2003)100(11),6353-6357)。例如於含有為終止密碼子的1個UAG密碼子(amber codon)的互補amber suppressor tRNA結合有非天然胺基酸之tRNA的無細胞轉譯系系統(Clover Direct(Protein Express))等也可理想地使用。
本發明之抗原結合分子所含之在pH中性域對於Fcγ受體有結合活性之Fc區，可依任一方法取得，但具體而言，可藉由作為初始Fc區之人類IgG型免疫球蛋白之胺基酸改變，而取得在pH中性域對於Fcγ受體有結合活性之Fc區。用於改變之理想IgG型免疫球蛋白之Fc區，例如人類IgG(IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4、及此等之變異體)之Fc區。IgG之Fc區也包括從其自然產生之變異體等。人類IgG1、人類IgG2、人類IgG3、人類IgG4抗體之Fc區，由於基因多型而生之多數副型序列記載於Sequences of proteins of immunological interest,NIH Publication No.91-3242，但本發明可為其中任一者。尤其人類IgG1之序列，可為EU編號356-358號之胺基酸序列為DEL，也可為EEM。
改變為其他胺基酸之改變，只要能使在pH中性域對於Fcγ受體有結合活性、或在中性域對於Fcγ受體結合之結合活性提高即可，任一位置之胺基酸均可改變。抗原結合分子包括作為人類Fc區之人類IgG1之Fc區的情形，宜包括帶來在pH中性域對於Fcγ受體之結合比人類IgG1之初始Fc區之結合活性有增強的效果的改變較佳。為了在pH中性域之條件下對於Fcγ受體之結合活性增強之胺基酸改變，例如WO2007/024249、WO2007/021841、WO2006/031370、WO2000/042072、WO2004/029207、WO2004/099249、WO2006/105338、WO2007/041635、WO2008/092117、WO2005/070963、WO2006/020114、 WO2006/116260及WO2006/023403等已有報告。
可如此改變之胺基酸，例如EU編號表示之221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、243位、244位、245位、246位、247位、249位、250位、251位、254位、255位、256位、258位、260位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、339位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位及440位之群中選出之至少1個以上之胺基酸。藉由此等的胺基酸之改變，IgG型免疫球蛋白之Fc區在pH中性域之條件下對於Fcγ受體之結合會增強。
為了在本發明使用，尤佳改變例如Fc區之EU編號表示之；221位之胺基酸為Lys或Tyr中之任一者、 222位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中之任一者、223位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Lys中之任一者、224位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中之任一者、225位之胺基酸為Glu、Lys或Trp中之任一者、227位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、228位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、230位之胺基酸為Ala、Glu、Gly或Tyr中之任一者、231位之胺基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中之任一者、232位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、233位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、234位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、235位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、236位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、237位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、 238位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、239位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、240位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、241位之胺基酸為Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中之任一者、243位之胺基酸為Leu、Glu、Leu、Gln、Arg、Trp或Tyr中之任一者、244位之胺基酸為His、245位之胺基酸為Ala、246位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、247位之胺基酸為Ala、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Thr、Val或Tyr中之任一者、249位之胺基酸為Glu、His、Gln或Tyr中之任一者、250位之胺基酸為Glu或Gln中之任一者、251位之胺基酸為Phe、254位之胺基酸為Phe、Met或Tyr中之任一者、255位之胺基酸為Glu、Leu或Tyr中之任一者、256位之胺基酸為Ala、Met或Pro中之任一者、258位之胺基酸為Asp、Glu、His、Ser或Tyr中之任一者、260位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、 262位之胺基酸為Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中之任一者、263位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、264位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、265位之胺基酸為Ala、Leu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、266位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、267位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、268位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Trp中之任一者、269位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、270位之胺基酸為Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、271位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、272位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、273位之胺基酸為Phe或Ile中之任一者、 274位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、275位之胺基酸為Leu或Trp中之任一者、276位之胺基酸為、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、278位之胺基酸為Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中之任一者、279位之胺基酸為Ala、280位之胺基酸為Ala、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gln、Trp或Tyr中之任一者、281位之胺基酸為Asp、Lys、Pro或Tyr中之任一者、282位之胺基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中之任一者、283位之胺基酸為Ala、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg或Tyr中之任一者、284位之胺基酸為Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中之任一者、285位之胺基酸為Asp、Glu、Lys、Gln、Trp或Tyr中之任一者、286位之胺基酸為Glu、Gly、Pro或Tyr中之任一者、288位之胺基酸為Asn、Asp、Glu或Tyr中之任一者、290位之胺基酸為Asp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、291位之胺基酸為Asp、Glu、Gly、 His、Ile、Gln或Thr中之任一者、292位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中之任一者、293位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、294位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、295位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、296位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr或Val中之任一者、297位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、298位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、299位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中之任一者、300位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中之任一者、301位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、 302位之胺基酸為Ile、303位之胺基酸為Asp、Gly或Tyr中之任一者、304位之胺基酸為Asp、His、Leu、Asn或Thr中之任一者、305位之胺基酸為Glu、Ile、Thr或Tyr中之任一者、311位之胺基酸為Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中之任一者、313位之胺基酸為Phe、315位之胺基酸為Leu、317位之胺基酸為Glu或Gln、318位之胺基酸為His、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Tyr中之任一者、320位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、322位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、323位之胺基酸為Ile、324位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、325位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、326位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、327位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、 Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、328位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、329位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、330位之胺基酸為Cys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、331位之胺基酸為Asp、Phe、His、Ile、Leu、Met、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、332位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、333位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Ser、Thr、Val或Tyr中之任一者、334位之胺基酸為Ala、Glu、Phe、Ile、Leu、Pro或Thr中之任一者、335位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中之任一者、336位之胺基酸為Glu、Lys或Tyr中之任一者、337位之胺基酸為Glu、His或Asn中之任一者、 339位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser或Thr中之任一者、376位之胺基酸為Ala或Val中之任一者、377位之胺基酸為Gly或Lys中之任一者、378位之胺基酸為Asp、379位之胺基酸為Asn、380位之胺基酸為Ala、Asn或Ser中之任一者、382位之胺基酸為Ala或Ile中之任一者、385位之胺基酸為Glu、392位之胺基酸為Thr、396位之胺基酸為Leu、421位之胺基酸為Lys、427位之胺基酸為Asn、428位之胺基酸為Phe或Leu中之任一者、429位之胺基酸為Met、434位之胺基酸為Trp、436位之胺基酸為Ile、或440位之胺基酸為Gly、His、Ile、Leu或Tyr中之任一者、之群中選出之至少1個以上的胺基酸之改變。又，改變的胺基酸之數目不特別限定，可僅有一處之胺基酸改變，也可有二處以上之胺基酸改變。二處以上之胺基酸之改變之組合，例如表5(表5-1~表5-3)記載的組合。
【表5-1】
【表5-2】
【表5-3】
測定本發明之抗原結合分子所含之Fcγ受體結合分域與Fcγ受體之結合活性之pH之條件，可適當使用pH酸性域或pH中性域之條件。作為測定本發明之抗原結合分子所含之Fcγ受體結合分域與Fcγ受體之結合活性之條件之pH中性域，通常指pH6.7~pH10.0。較佳為pH7.0~pH8.0之任意pH值所示之範圍，較佳為從pH7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、及8.0選擇，尤佳為接 近活體內之血漿中(血中)之pH的pH7.4。本發明中，作為本發明之抗原結合分子所含之Fcγ受體結合分域與Fcγ受體有結合活性之條件的pH酸性域，通常為pH4.0~pH6.5。較佳為指pH5.5~pH6.5，尤佳為接近活體內之早期內體內之pH的pH5.8~pH6.0。測定條件使用之溫度，可於10℃~50℃之任意溫度評價Fcγ受體結合分域與人類Fcγ受體的結合親和性。較佳為，為了決定人類Fcγ受體結合分域與Fcγ受體之結合親和性，使用15℃~40℃之溫度。更佳為，20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、及35℃中之任一之20℃至35℃的任意溫度，也同樣可用在決定Fcγ受體結合分域與Fcγ受體之結合親和性。25℃的溫度為本發明之態樣之一非限定例。
本說明書中，Fcγ受體結合分域對於Fcγ受體之結合活性比起天然型Fc區對於Fcγ受體之結合活性高，係指Fcγ受體結合分域之FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa及/或FcγRIIIb中之任一者對於人類Fcγ受體之結合活性，高於天然型Fcγ受體結合分域對於該等人類Fcγ受體之結合活性。例如依上述解析方法，與作為對照之含天然型人類IgG之Fc區之抗原結合分子之結合活性比較，含Fcγ受體結合分域之抗原結合分子之結合活性顯示105%以上、較佳為110%以上、115%以上、120%以上、125%以上、尤佳為130%以上、135%以上、140%以上、145%以上、150%以上、155%以上、160%以上、165%以上、170%以上、 175%以上、180%以上、185%以上、190%以上、195%以上、2倍以上、2.5倍以上、3倍以上、3.5倍以上、4倍以上、4.5倍以上、5倍以上、7.5倍以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、100倍以上之結合活性。作為天然型Fcγ受體結合分域，可使用初始Fcγ受體結合分域，也可使用同次類別之天然型抗體之Fcγ受體結合分域。
本發明中，作為對照之天然型人類IgG之Fc區，特適合使用EU編號表示之297位之胺基酸所結合之糖鏈係含岩藻糖之糖鏈的天然型人類IgG之Fc區。EU編號表示之297位之胺基酸所結合之糖鏈是否係含岩藻糖之糖鏈，可使用非專利文獻24記載之方法獲得。例如可依如下方法判定是否天然型人類IgG之Fc區所結合之糖鏈是含岩藻糖之糖鏈。藉由使待驗天然型人類IgG與N-Glycosidase F(Roche diagnostics)反應，可從待驗天然型人類IgG使糖鏈游離(Weitzhandler等人(J.Pharma.Sciences(1994)83,12,1670-1675)。然後使乙醇反應，將蛋白質已除去之反應液(Schenk等人(J.Clin.Investigation(2001)108(11)1687-1695)的濃縮乾固物以2-胺基吡啶進行螢光標記(Bigge等人(Anal.Biochem.(1995)230(2)229-238)。將經以使用纖維素匣體之固相萃取脫試藥、經螢光標記的2-AB化糖鏈以順相層析解析。觀察檢測到的層析圖的峰部，可判定是否天然型人類IgG之Fc區所結合之糖鏈為含 岩藻糖之糖鏈。如此之EU編號表示之297位之胺基酸所結合之糖鏈係含岩藻糖之糖鏈的天然型人類IgG之Fc區之非限定例，可舉將編碼為含天然型人類IgG之Fc區之抗體的基因於CHO-K1(American Type Culture Collection,ATCC No.CRL-61)、DXB11(American Type Culture Collection,ATCC No.CRL-11397)等CHO細胞表現而得之抗體所含之Fc區。以該等抗體所含之Fc區對於Fcγ受體之結合活性作為對照，比較本發明之Fc區對於Fcγ受體之結合活性，可確認本發明之Fcγ受體結合分域對於Fcγ受體之結合活性，是否高於結合於EU編號297位之糖鏈係含岩藻糖之糖鏈之天然型人類IgG之Fc區對於Fcγ受體之結合活性。又，藉由依上述等方法測定該等抗體所含之Fc區所結合之糖鏈之岩藻糖含量與本發明之Fc區所結合之糖鏈之岩藻糖含量，也可比較所比較之Fc區所含之糖鏈結合的岩藻糖含量。
作為對照之含同次類別之天然型抗體之Fc區之抗原結合分子，也可適當使用有IgG單株抗體之Fc區之抗原結合分子。該Fc區之構造，記載於序列編號：11(RefSeq註冊編號AAC82527.1之N末端有A附加)、12(RefSeq註冊編號AAB59393.1之N端有附加A)、13(RefSeq註冊編號CAA27268.1)、及14(RefSeq註冊編號AAB59394.1之N端有附加A)。又，當以含某特定之構造同型之抗體之Fc區之抗原結合分子作為待驗物質的情形，藉由使用具有該特定之構造同型之IgG單株抗體之Fc區的抗原結合分子作為 對照，可驗證含有待驗Fc區之抗原結合分子對於Fcγ受體之結合活性之效果。以上述方式，可適當選擇含有已驗證對於Fcγ受體之結合活性高之Fc區之抗原結合分子。
又，本發明中理想地使用之Fcγ受體結合分域，例如：有對特定之Fcγ受體之結合活性比對於其他Fcγ受體之結合活性高之性質之Fcγ受體結合分域(選擇性的對於Fcγ受體有結合活性之Fcγ受體結合分域)亦為較佳。抗原結合分子使用抗體(Fc區作為Fcγ受體結合分域)的情形，由於一分子抗體僅能結合一分子Fcγ受體，所以一分子抗原結合分子結合於抑制型Fcγ受體之狀態，無法與其他活性型FcγR結合，在結合於活性型Fcγ受體之狀態，無法與其他活性型Fcγ受體或抑制型Fcγ受體結合。
如前述，作為活性型Fcγ受體，含FcγRIa、FcγRIb及FcγRIc之FcγRI(CD64)及含同型異構物FcγRIIIa(包括副型V158及F158)及FcγRIIIb(包括副型FcγRIIIb-NA1及FcγRIIIb-NA2)之FcγRIII(CD16)為理想例。又，FcγRIIb(包括FcγRIIb-1及FcγRIIb-2)可舉作為抑制型Fcγ受體之理想例。
對於Fcγ受體有選擇性結合活性之FcγR結合分域
本發明之FcγR結合分域是否有選擇性結合活性，可將利用前述之對於Fcγ受體之結合活性之項目記載的方法所決定之對於各Fcγ受體之結合活性加以比較以確認。依本發明提供之抗原結合分子所含之選擇性的FcγR結合分域，可使用相對於對於活性型Fcγ受體，對於抑制 型Fcγ受體之結合活性較高之FcγR結合分域。一非限定態樣中，尤本發明提供之抗原結合分子所含之選擇的FcγR結合分域，可使用對於從包括FcγRIa、FcγRIb及FcγRIc之FcγRI(CD64)、(包括副型V158及F158)包括同型異構物FcγRIIIa及(包括副型FcγRIIIb-NA1及FcγRIIIb-NA2)FcγRIIIb之FcγRIII(CD16)、及包括(包括副型H131及R131)同型異構物FcγRIIa及FcγRIIc之FcγRII(CD32)中之任一者選出之活性型Fcγ受體，對於(包括FcγRIIb-1及FcγRIIb-2)FcγRIIb之結合活性高之FcγR結合分域。又，於本發明之一非限定態樣中，作為依本發明提供之抗原結合分子所含之選擇的FcγR結合分域，可使用比起對於FcγRIa、FcγRIb、FcγRIc、包括副型V158之FcγRIIIa、包括副型F158之FcγRIIIa、包括副型FcγRIIIb-NA1之FcγRIIIb、包括副型FcγRIIIb-NA2之FcγRIIIb、包括副型H131之FcγRIIa、包括副型R131之FcγRIIa、及/或FcγRIIc，對於FcγRIIb-1及/或FcγRIIb-2之結合活性較高之FcγR結合分域。待驗對象之FcγR結合分域，是否為對於Fcγ受體有選擇性結合活性之FcγR結合分域，可藉由比較例如前述之對於Fcγ受體之結合活性之項目記載之方法決定之FcγR結合分域對於FcγRIa、FcγRIb、FcγRIc、包括副型V158之FcγRIIIa、包括副型F158之FcγRIIIa、包括副型FcγRIIIb-NA1之FcγRIIIb、包括副型FcγRIIIb-NA2之FcγRIIIb、包括副型H131之FcγRIIa、 包括副型R131之FcγRIIa、及/或對於FcγRIIc之KD值除以對於FcγRIIb-1及/或FcγRIIb-2之KD值而得之值(比)。亦即式1表示之FcγR選擇性指數而進行判斷。
[式1]FcγR選擇性指數=對於活性型FcγR之KD值/對於抑制型FcγR之KD值
上式1中，活性型FcγR，係指FcγRIa、FcγRIb、FcγRIc、包括副型V158之FcγRIIIa、包括副型F158之FcγRIIIa、包括副型FcγRIIIb-NA1之FcγRIIIb、包括副型FcγRIIIb-NA2之FcγRIIIb、包括副型H131之FcγRIIa、包括副型R131之FcγRIIa、及/或FcγRIIc，抑制型FcγR係指FcγRIIb-1及/或FcγRIIb-2，KD值測定使用之活性型FcγR及抑制型FcγR可從任一組合選擇，但一非限定態樣，可使用將對於包括副型H131之FcγRIIa之KD值除以對於FcγRIIb-1及/或FcγRIIb-2之KD值而得之值(比)。
FcγR選擇性指數，例如1.2以上、1.3以上、1.4以上、1.5以上、1.6以上、1.7以上、1.8以上、1.9以上、2以上、3以上、5以上、6以上、7以上、8以上、9以上、10以上、15以上、20以上、25以上、30以上、35以上、40以上、45以上、50以上、55以上、60以上、65以上、70以上、75以上、80以上、85以上、90以上、95以上、100以上、110以上、120以上、130以上、140以上、150以上、160以上、170以上、180以上、190以上、200以 上、210以上、220以上、230以上、240以上、250以上、260以上、270以上、280以上、290以上、300以上、310以上、320以上、330以上、340以上、350以上、360以上、370以上、380以上、390以上、400以上、410以上、420以上、430以上、440以上、450以上、460以上、470以上、480以上、490以上、500以上、520以上、540以上、560以上、580以上、600以上、620以上、640以上、660以上、680以上、700以上、720以上、740以上、760以上、780以上、800以上、820以上、840以上、860以上、880以上、900以上、920以上、940以上、960以上、980以上、1000以上、1500以上、2000以上、2500以上、3000以上、3500以上、4000以上、4500以上、5000以上、5500以上、6000以上、6500以上、7000以上、7500以上、8000以上、8500以上、9000以上、9500以上、10000以上、100000以上。
本發明之抗原結合分子所含之選擇性的FcγR結合分域之一非限定態樣，例如構成人類IgG1(序列編號：14)、IgG2(序列編號：15)、IgG3(序列編號：16)、或IgG4(序列編號：17)表示之不變區之一部分的Fc區(IgG類別之Fc區，意指以EU編號例如從226號之半胱胺酸至C末端、或230號之脯胺酸至C末端，但不限定於此)所含之FcγR結合分域經改變之Fc區。該改變Fc區之製作方法，可舉例前述胺基酸之改變之項目記載之方法。如此改變Fc區，例如人類IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)之EU編號表示之 238位之胺基酸為Asp之Fc區、或EU編號表示之328位之胺基酸為Glu之Fc區。人類IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)之EU編號表示之238位之胺基酸為Asp之Fc區、或EU編號表示之328位之胺基酸為Glu之Fc區及含該Fc區之抗原結合分子，比起對於FcγRIa、FcγRIb、FcγRIc、包括副型V158之FcγRIIIa、包括副型F158之FcγRIIIa、包括副型FcγRIIIb-NA1之FcγRIIIb、包括副型FcγRIIIb-NA2之FcγRIIIb、包括副型H131之FcγRIIa、包括副型R131之FcγRIIa、及/或FcγRIIc之結合活性，對於FcγRIIb-1及/或FcγRIIb-2之結合活性較高。
本發明之抗原結合分子所含之含選擇性FcγR結合分域之不變區及該不變區之抗原結合分子，也可為相較於構成人類IgG1(序列編號：14)、IgG2(序列編號：15)、IgG3(序列編號：16)、或IgG4(序列編號：17)之一部分之Fc區(IgG類別之Fc區意指以EU編號例如226號之半胱胺酸至C末端、或230號之脯胺酸至C末端，但不限定於此。)(以下總稱為野生型Fc區)及含該野生型Fc區之抗原結合分子，對於活性型FcγR(FcγRIa、FcγRIb、FcγRIc、包括副型V158之FcγRIIIa、包括副型F158之FcγRIIIa、包括副型FcγRIIIb-NA1之FcγRIIIb、包括副型FcγRIIIb-NA2之FcγRIIIb、包括副型H131之FcγRIIa、包括副型R131之FcγRIIa、及/或FcγRIIc)之結合活性維持或減少之Fc區及含該Fc區之抗原結合分子。
相較於野生型Fc區及含野生型Fc區之抗原結合分子，本發明之抗原結合分子所含之含選擇的FcγR結合分域之Fc區及含該Fc區之抗原結合分子對於前述活性型FcγR之結合活性減少的程度，例如99%以下、98%以下、97%以下、96%以下、95%以下、94%以下、93%以下、92%以下、91%以下、90%以下、88%以下、86%以下、84%以下、82%以下、80%以下、78%以下、76%以下、74%以下、72%以下、70%以下、68%以下、66%以下、64%以下、62%以下、60%以下、58%以下、56%以下、54%以下、52%以下、50%以下、45%以下、40%以下、35%以下、30%以下、25%以下、20%以下、15%以下、10%以下、5%以下、4%以下、3%以下、2%以下、1%以下、0.5%以下、0.4%以下、0.3%以下、0.2%以下、0.1%以下、0.05%以下、0.01%以下、0.005%以下。
本發明之抗原結合分子所含之含選擇的FcγR結合分域之Fc區及含該Fc區之不變區、及含該不變區之抗原結合分子，也可為相較於人類IgG1(序列編號：14)、IgG2(序列編號：15)、IgG3(序列編號：16)、或IgG4(序列編號：17)表示之不變區之一部構成 Fc區(IgG類別之Fc區，意指EU編號例如226號之半胱胺酸至C末端、或230號之脯胺酸至C末端，但不限定於此。)(以下總稱為野生型Fc區)及該含野生型Fc區之抗原結合分子，對於抑制型FcγR(FcγRIIb-1及/或FcγRIIb-2)之結合活性增強之Fc區及含該Fc區之抗原結合分子。
相較於野生型Fc區及含野生型Fc區之抗原結合分 子，本發明之抗原結合分子所含之含選擇性FcγR結合分域之Fc區及含該Fc區之抗原結合分子對於前述抑制型FcγR之結合活性增強之程度，例如101%以上、102%以上、103%以上、104%以上、105%以上、106%以上、107%以上、108%以上、109%以上、110%以上、112%以上、114%以上、116%以上、118%以上、120%以上、122%以上、124%以上、126%以上、128%以上、130%以上、132%以上、134%以上、136%以上、138%以上、140%以上、142%以上、144%以上、146%以上、148%以上、150%以上、155%以上、160%以上、165%以上、170%以上、175%以上、180%以上、185%以上、190%以上、195%以上、2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、100倍以上、200倍以上、300倍以上、400倍以上、500倍以上、600倍以上、700倍以上、800倍以上、900倍以上、1000倍以上、10000倍以上、100000倍以上。
又，本發明之抗原結合分子所含之含選擇性FcγR結合分域之Fc區及含該Fc區之抗原結合分子，也可為相較於構成人類IgG1(序列編號：14)、IgG2(序列編號：15)、IgG3(序列編號：16)、或IgG4(序列編號：17)表示之不變區之一部分之Fc區(IgG類別之Fc區指以EU編號例如226號之半胱胺酸至C末端、或230號之脯胺酸至C末端，但不限定於此。)(以下總稱為野生型Fc區)及該含野生型Fc 區之抗原結合分子，對於活性型FcγR(FcγRIa、FcγRIb、FcγRIc、包括副型V158之FcγRIIIa、包括副型F158之FcγRIIIa、包括副型FcγRIIIb-NA1之FcγRIIIb、包括副型FcγRIIIb-NA2之FcγRIIIb、包括副型H131之FcγRIIa、包括副型R131之FcγRIIa、及/或FcγRIIc)之結合活性維持或減少，及相較於構成人類IgG1(序列編號：14)、IgG2(序列編號：15)、IgG3(序列編號：16)、或IgG4(序列編號：17)表示之不變區之一部分之Fc區(IgG類別之Fc區指以EU編號例如226號之半胱胺酸至C末端、或230號之脯胺酸至C末端，但不限定於此。)(以下總稱為野生型Fc區)及該含野生型Fc區之抗原結合分子，對於抑制型FcγR(FcγRIIb-1及/或FcγRIIb-2)之結合活性增強之Fc區及含該Fc區之抗原結合分子。
又，本發明之抗原結合分子所含之含選擇性FcγR結合分域之Fc區及含該Fc區之抗原結合分子，也可為相較於構成人類IgG1(序列編號：14)、IgG2(序列編號：15)、IgG3(序列編號：16)、或IgG4(序列編號：17)表示之不變區之一部分之Fc區(IgG類別之Fc區指EU編號例如226號之半胱胺酸至C末端、或230號之脯胺酸至C末端，但不限定於此。)(以下總稱為野生型Fc區)及該含野生型Fc區之抗原結合分子，對於抑制型Fcγ受體(FcγRIIb-1及/或FcγRIIb-2)之結合活性之增強程度比起對於活性型Fcγ受體(FcγRIa、FcγRIb、FcγRIc、包括副型V158之FcγRIIIa、包括副型F158之FcγRIIIa、包括副型 FcγRIIIb-NA1之FcγRIIIb、包括副型FcγRIIIb-NA2之FcγRIIIb、包括副型H131之FcγRIIa、包括副型R131之FcγRIIa)之結合活性之增強程度高之Fc區及含該Fc區之抗原結合分子。
本發明可為對於EU編號表示之238位之胺基酸為Asp之Fc區或EU編號表示之328位之胺基酸為Glu之Fc區，以前述胺基酸之改變之項目說明之態樣等，再施加其它至少一個對Fc區之改變。又，該等改變以外，可更含有附加性的改變。附加性的改變，例如可從胺基酸之取代、缺損、或修飾中之任一者、或此等之組合中選擇。例如可施加增強對FcγRIIb之結合活性，及施加使對FcγRIIa(H型)及FcγRIIa(R型)之結合活性維持或減低之改變。藉由施加如此的改變，能使對於FcγRIIb之結合選擇性高於對於FcγRIIa。
其中，使對於FcγRIIb之結合選擇性高於對於FcγRIIa(R型)之改變為佳，更佳為使對於FcγRIIb之結合選擇性高於對於FcγRIIa(H型)之改變。如此改變之理想胺基酸取代，例如EU編號237位表示之Gly取代為Trp之改變、EU編號237位表示之Gly取代為Phe之改變、EU編號238位表示之Pro取代為Phe之改變、EU編號325位表示之Asn取代為Met之改變、EU編號267位表示之Ser取代為Ile之改變、EU編號328位表示之Leu取代為Asp之改變、EU編號267位表示之Ser取代為Val之改變、EU編號328位表示之Leu取代為Trp之改變、EU編號267位 表示之Ser取代為Gln之改變、EU編號267位表示之Ser取代為Met之改變、EU編號236位表示之Gly取代為Asp之改變、EU編號327位表示之Ala取代為Asn之改變、EU編號325位表示之Asn取代為Ser之改變、EU編號235位表示之Leu取代為Tyr之改變、EU編號266位表示之Val取代為Met之改變、EU編號328位表示之Leu取代為Tyr之改變、EU編號235位表示之Leu取代為Trp之改變、EU編號235位表示之Leu取代為Phe之改變、EU編號239位表示之Ser取代為Gly之改變、EU編號327位表示之Ala取代為Glu之改變、EU編號327位表示之Ala取代為Gly之改變、EU編號238位表示之Pro取代為Leu之改變、EU編號239位表示之Ser取代為Leu之改變、EU編號328位表示之Leu取代為Thr之改變、EU編號328位表示之Leu取代為Ser之改變、EU編號328位表示之Leu取代為Met之改變、EU編號331位表示之Pro取代為Trp之改變、EU編號331位表示之Pro取代為Tyr之改變、EU編號331位表示之Pro取代為Phe之改變、EU編號327位表示之Ala取代為Asp之改變、EU編號328位表示之Leu取代為Phe之改變、EU編號271位表示之Pro取代為Leu之改變、EU編號267位表示之Ser取代為Glu之改變、EU編號328位表示之Leu取代為Ala之改變、EU編號328位表示之Leu取代為Ile之改變、EU編號328位表示之Leu取代為Gln之改變、EU編號328位表示之Leu取代為Val之改變、EU編號326位表示之Lys取代為Trp之改變、EU編號334位 表示之Lys取代為Arg之改變、EU編號268位表示之His取代為Gly之改變、EU編號268位表示之His取代為Asn之改變、EU編號324位表示之Ser取代為Val之改變、EU編號266位表示之Val取代為Leu之改變、EU編號271位表示之Pro取代為Gly之改變、EU編號332位表示之Ile取代為Phe之改變、EU編號324位表示之Ser取代為Ile之改變、EU編號333位表示之Glu取代為Pro之改變、EU編號300位表示之Tyr取代為Asp之改變、EU編號337位表示之Ser取代為Asp之改變、EU編號300位表示之Tyr取代為Gln之改變、EU編號335位表示之Thr取代為Asp之改變、EU編號239位表示之Ser取代為Asn之改變、EU編號326位表示之Lys取代為Leu之改變、EU編號326位表示之Lys取代為Ile之改變、EU編號239位表示之Ser取代為Glu之改變、EU編號326位表示之Lys取代為Phe之改變、EU編號326位表示之Lys取代為Val之改變、EU編號326位表示之Lys取代為Tyr之改變、EU編號267位表示之Ser取代為Asp之改變、EU編號326位表示之Lys取代為Pro之改變、EU編號326位表示之Lys取代為His之改變、EU編號334位表示之Lys取代為Ala之改變、EU編號334位表示之Lys取代為Trp之改變、EU編號268位表示之His取代為Gln之改變、EU編號326位表示之Lys取代為Gln之改變、EU編號326位表示之Lys取代為Glu之改變、EU編號326位表示之Lys取代為Met之改變、EU編號266位表示之Val取代為Ile之改變、EU編號334位 表示之Lys取代為Glu之改變、EU編號300位表示之Tyr取代為Glu之改變、EU編號334位表示之Lys取代為Met之改變、EU編號334位表示之Lys取代為Val之改變、EU編號334位表示之Lys取代為Thr之改變、EU編號334位表示之Lys取代為Ser之改變、EU編號334位表示之Lys取代為His之改變、EU編號334位表示之Lys取代為Phe之改變、EU編號334位表示之Lys取代為Gln之改變、EU編號334位表示之Lys取代為Pro之改變、EU編號334位表示之Lys取代為Tyr之改變、EU編號334位表示之Lys取代為Ile之改變、EU編號295位表示之Gln取代為Leu之改變、EU編號334位表示之Lys取代為Leu之改變、EU編號334位表示之Lys取代為Asn之改變、EU編號268位表示之His取代為Ala之改變、EU編號239位表示之Ser取代為Asp之改變、EU編號267位表示之Ser取代為Ala之改變、EU編號234位表示之Leu取代為Trp之改變、EU編號234位表示之Leu取代為Tyr之改變、EU編號237位表示之Gly取代為Ala之改變、EU編號237位表示之Gly取代為Asp之改變、EU編號237位表示之Gly取代為Glu之改變、EU編號237位表示之Gly取代為Leu之改變、EU編號237位表示之Gly取代為Met之改變、EU編號237位表示之Gly取代為Tyr之改變、EU編號330位表示之Ala取代為Lys之改變、EU編號330位表示之Ala取代為Arg之改變、EU編號233位表示之Glu取代為Asp之改變、EU編號268位表示之His取代為Asp之改變、EU編號268位 表示之His取代為Glu之改變、EU編號326位表示之Lys取代為Asp之改變、EU編號326位表示之Lys取代為Ser之改變、EU編號326位表示之Lys取代為Thr之改變、EU編號323位表示之Val取代為Ile之改變、EU編號323位表示之Val取代為Leu之改變、EU編號323位表示之Val取代為Met之改變、EU編號296位表示之Tyr取代為Asp之改變、EU編號326位表示之Lys取代為Ala之改變、EU編號326位表示之Lys取代為Asn之改變、EU編號330位表示之Ala取代為Met之改變。
再者，該等改變之中較佳之胺基酸取代，例如EU編號237位表示之Gly取代為Trp之改變、EU編號237位表示之Gly取代為Phe之改變、EU編號267位表示之Ser取代為Val之改變、EU編號267位表示之Ser取代為Gln之改變、EU編號268位表示之His取代為Asn之改變、EU編號271位表示之Pro取代為Gly之改變、EU編號326位表示之Lys取代為Leu之改變、EU編號326位表示之Lys取代為Gln之改變、EU編號326位表示之Lys取代為Glu之改變、EU編號326位表示之Lys取代為Met之改變、EU編號239位表示之Ser取代為Asp之改變、EU編號267位表示之Ser取代為Ala之改變、EU編號234位表示之Leu取代為Trp之改變、EU編號234位表示之Leu取代為Tyr之改變、EU編號237位表示之Gly取代為Ala之改變、EU編號237位表示之Gly取代為Asp之改變、EU編號237位表示之Gly取代為Glu之改變、EU編號237位表示之Gly取代 為Leu之改變、EU編號237位表示之Gly取代為Met之改變、EU編號237位表示之Gly取代為Tyr之改變、EU編號330位表示之Ala取代為Lys之改變、EU編號330位表示之Ala取代為Arg之改變、EU編號233位表示之Glu取代為Asp之改變、EU編號268位表示之His取代為Asp之改變、EU編號268位表示之His取代為Glu之改變、EU編號326位表示之Lys取代為Asp之改變、EU編號326位表示之Lys取代為Ser之改變、EU編號326位表示之Lys取代為Thr之改變、EU編號323位表示之Val取代為Ile之改變、EU編號323位表示之Val取代為Leu之改變、EU編號323位表示之Val取代為Met之改變、EU編號296位表示之Tyr取代為Asp之改變、EU編號326位表示之Lys取代為Ala之改變、EU編號326位表示之Lys取代為Asn之改變、EU編號330位表示之Ala取代為Met之改變。
上述改變可為一處，也可為二處以上之組合。如此之改變的理想例，可列舉表14~15、表17~24、表26~28記載之改變。
本發明之抗原結合分子所含之選擇的FcγR結合分域之另一非限定態樣，可舉人類IgG1(序列編號：14)、IgG2(序列編號：15)、IgG3(序列編號：16)、或IgG4(序列編號：17)表示之Fc區所含之FcγR結合分域經改變之Fc區。該改變Fc區之製作方法，可列舉前述胺基酸改變之項目記載之方法。如此改變Fc區，例如人類IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)之EU編號表示之238位之胺基酸為Asp、及EU編號 表示之271位之胺基酸為GlyFc區。人類IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)之EU編號表示之238位之胺基酸為Asp、及EU編號表示之271位之胺基酸為Gly之Fc區及含該Fc區之抗原結合分子，比起對於FcγRIa、FcγRIb、FcγRIc、包括副型V158之FcγRIIIa、包括副型F158之FcγRIIIa、包括副型FcγRIIIb-NA1之FcγRIIIb、包括副型FcγRIIIb-NA2之FcγRIIIb、包括副型H131之FcγRIIa、包括副型R131之FcγRIIa、及/或FcγRIIc，對於FcγRIIb-1及/或FcγRIIb-2之結合活性較高。
本發明中，可對於EU編號表示之238位之胺基酸為Asp及EU編號表示之271位之胺基酸為Gly之Fc區，藉由前述胺基酸之改變之項目說明之態樣等，而更對於其他至少一個Fc區施加改變。又，除了該等改變以外，可更含有附加性改變。附加性改變，可從例如胺基酸之取代、缺損、或修飾中之任一者、或此等之組合選擇。例如，可施以維持或減低對於活性型Fcγ受體(FcγRIa、FcγRIb、FcγRIc、包括副型V158之FcγRIIIa、包括副型F158之FcγRIIIa、包括副型FcγRIIIb-NA1之FcγRIIIb、包括副型FcγRIIIb-NA2之FcγRIIIb、包括副型H131之FcγRIIa、包括副型R131之FcγRIIa)之結合活性之改變。可施加增強對於抑制型Fcγ受體(FcγRIIb-1及/或FcγRIIb-2)之結合活性並且維持或減少對於FcγRIIa(H型)及FcγRIIa(R型)之結合活性之改變。又，也可施加使對於抑制型Fcγ受體(FcγRIIb-1及/或FcγRIIb-2)之結 合活性之增強程度高於對於活性型Fcγ受體(FcγRIa、FcγRIb、FcγRIc、包括副型V158之FcγRIIIa、包括副型F158之FcγRIIIa、包括副型FcγRIIIb-NA1之FcγRIIIb、包括副型FcγRIIIb-NA2之FcγRIIIb、包括副型H131之FcγRIIa、包括副型R131之FcγRIIa)之結合活性之增強程度高的改變。藉由施加如此的改變，可相較於對於FcγRIIa，更提高對於FcγRIIb之結合選擇性。
就含有選擇性FcγR結合分域之改變Fc區，例如人類IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)之EU編號表示之238位之胺基酸為Asp及EU編號表示之271位之胺基酸為Gly之Fc區之EU編號表示之233位、234位、237位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、272位、296位、326位、327位、330位、331位、332位、333位、396位中之任一者以上經取代之改變Fc區為一非限定態樣之例。
又，含有選擇性的EcγR結合分域之改變Fc區之一非限定態樣，可舉人類IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)之238位之胺基酸為Asp及EU編號表示之271位之胺基酸為Gly之Fc區之EU編號表示之：233位之胺基酸為Asp、234位之胺基酸為Tyr、237位之胺基酸為Asp、264位之胺基酸為Ile、265位之胺基酸為Glu、266位之胺基酸為Phe、Met、或Leu中之任一者、 267位之胺基酸為Ala、Glu、Gly、或Gln中之任一者、268位之胺基酸為Asp、或Glu中之任一者、269位之胺基酸為Asp、272位之胺基酸為、Asp、Phe、Ile、Met、Asn、或Gln中之任一者、296位之胺基酸為Asp、326位之胺基酸為Ala、或Asp中之任一者、327位之胺基酸為Gly、330位之胺基酸為Lys、或Arg中之任一者、331位之胺基酸為Ser、332位之胺基酸為Thr、333位之胺基酸為Thr、Lys、或Arg中之任一者、396位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Ile、Lys、Leu、Met、Gln、Arg、或Tyr中之任一者、中之任一者以上的改變Fc區。
前述含有更對於其他至少一個Fc區施加改變，再者含有附加性改變之Fc區之一非限定態樣，可列舉表6-1~表6-7記載之Fc區。
【表6-1】 (表6-2係接續表6-1之表。)
【表6-2】 (表6-3係接續表6-2之表。)
【表6-3】 (表6-4為接續表6-3之表。)
【表6-4】 (表6-5為接續表6-4之表。)
【表6-5】 (表6-6為接續表6-5之表。)
【表6-6】 (表6-7為接續表6-6之表。)
【表6-7】
在小鼠中至今已發現FcγRI、FcγRIIb、FcγRIII、FcγRIV的4種FcγR。在人類中，就對應於此等之FcγR，已發現FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、FcγRIIIa、FcγRIIIb。該等FcγR之中，唯一認為是抑制型之FcγRIIb，在人類、小鼠均有保守性。其他FcγR，除了FcγRIIIb以外，都會經由Immuno receptor tyriosine-based activating motif(ITAM)傳遞活化信號，FcγRIIb係經由細胞內具有的imunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif(ITIM)傳遞抑制信號(Nat.Rev.Immunol.(2008)8,34-47)。
FcγRIIb之切斷變異體(splicing variant)據報告有FcγRIIb1及FcγRIIb2。人類及小鼠均為，FcγRIIb1比FcγRIIb2有較長的細胞內分域，且確認FcγRIIb1在B細胞表現，FcγRIIb2確認在巨噬細胞、肥胖細胞、樹狀細胞、嗜鹼性球、嗜中性球、嗜酸性球表現(J.Clin.Immunol.(2005)25(1),1-18)。
至今為止，人類中已報告FcγRIIb之機能不完整、表現低落與自體免疫疾病的發病有相關。例如，SLE患者中，位於FcγRIIb之表現起動子區的基因多型之影響會減弱轉錄活化因子之結合，而有FcγRIIb表現低落之例被報告 (Hum.Genet.(2005)117,220-227、J.Immunol.(2004)172,7192-7199、J.Immunol.(2004)172,7186-7191)。又，SLE患者之中，據報告FcγRIIb之233號之胺基酸為Ile或Thr的二種基因多型。該部位存在於FcγRIIb之細胞膜貫穿區，比起233號之胺基酸為Thr的情形、Ile的情形，FcγRIIb不易存在於脂筏(lipid raft)，結果據報告FcγRIIb之信號傳遞機能低落(Nat.Med.(2005)11,1056-1058、Hum.Mol.Genet.,(2005)14,2881-2892)。在小鼠亦為，C57BL/6小鼠之FcγRIIb基因經破壞之基因剔除小鼠，據報告會呈現自體抗體之產生或絲球體腎炎等SLE狀的症狀(Immunity 13(2000)277-285、J.Exp.Med.(2002)195,1167-1174)。又，至今為止考慮為SLE之自然發病模式的小鼠，亦據報告有FcγRIIb表現量下降等(Immunogenetics(2000)51,429-435、Int.Immunol.(1999)11,1685-1691、Curr.Biol.(2000)10,227-230、J.Immunol.(2002)169,4340-4346)。由此等，據認為在小鼠中亦與人類同樣，FcγRIIb係控制液性免疫。
具有本發明之Fc之抗體經由FcγRIIb使抗原消失時，據認為在FcγRIIb之機能中，FcγRIIb之內吞作用之機能有最重要的貢獻。如上述，FcγRIIb之切斷變異體存在有FcγRIIb1與FcγRIIb2，但是據報告後者主要涉及抗體與抗原之免疫複合體之內吞作用(J.Immunol.(1994),152 574-585、Science(1992)256,1808-1812、Cell(1989)58,317-327)。至今為止，據報告小鼠之 FcγRIIb2係被納入clathrin-coated pit並引起內吞作用(Cell(1989)58,317-327)。又，經由FcγRIIb2之內吞作用中據報告dileucine motif係為必要，人類及小鼠中均為dileucine motif係保守性的(EMBO J.(1994)13(13),2963-2969)。由此也可認為人類中也與小鼠同樣，FcγRIIb2有內吞作用能力。
另一方面，FcγRIIb1與FcγRIIb2不同，據報告不會引起內吞作用。FcγRIIb1存在有在FcγRIIb2未觀察到的細胞內分域中之插入序列。該序列會抑制FcγRIIb1納入於clathrin-coated pit，其結果據認為會抑制內吞作用(J.Cell.Biol.(1992)116,875-888、J.Cell.Biol.(1989)109,3291-3302)。在人類中亦為，與小鼠同樣，在FcγRIIb1與FcγRIIb2同樣的存在有插入序列，所以以類似的機制預測FcγRIIb1與FcγRIIb2之內吞作用能力有差異。又，在人類中、小鼠中均為，據報告在20分鐘內細胞表面上之約40%之免疫複合體會攝入細胞內(Mol.Immunol.(2011)49,329-337、Science(1992)256,1808-1812)。由此可預測，在人類中，將FcγRIIb2與在小鼠以同樣速度將免疫複合體納入於細胞內。
FcγR家族當中，FcγRIIb在人類、小鼠均唯一細胞內具有ITIM且表現細胞之分布也相同，故免疫控制的機能也推測為相同。又，若考慮在人類、小鼠均以同樣速度將免疫複合體攝入細胞內之事實，藉由使用小鼠，可預測在人類經由FcγRIIb以抗體使抗原消失之效果。實際上在實 施例5中，相較於對於正常小鼠投予具有以pH依存性地結合於可溶性抗原之性質之抗原結合分子mIgG1，當對於正常小鼠投予具有以pH依存性結合於可溶性抗原之性質且對於小鼠FcγRIIb及FcγRIII之親和性增強之抗原結合分子mF44及mF46時，比起投予mIgG1的情形，顯示抗原之廓清率增加。
又，在後述實施例6中，使用Fc受體γ鏈缺損小鼠實施同樣實驗。在小鼠的情形，FcγRIIb以外之FcγR據報告僅在gamma鏈共存下表現，所以於Fc受體γ鏈缺損小鼠僅會表現FcγRIIb。藉由對Fc受體γ鏈缺損小鼠投予有以pH依存性結合於可溶性抗原之性質之抗原結合分子mF44、mF46，可觀察到增強FcγRIIb選擇性結合時之加速抗原消失之效果。由實施例6之結果，顯示：對於Fc受體γ鏈缺損小鼠投予之有以pH依存性結合於可溶性抗原之性質之抗原結合分子mF44及mF46，比起對於同小鼠投予之有以pH依存性結合於可溶性抗原之性質之抗原結合分子mIgG1，抗原之廓清率有增加。又，從實施例6的結果，可知：mF44及mF46在投予到Fc受體γ鏈缺損小鼠的情形、投予到正常小鼠之情形，均以大致同程度使抗原消失。
於實施例6使用FcγRIII缺損小鼠實施同樣實驗。mIgG1及mF44、mF46，在mFcγR當中僅會與FcγRIIb及FcγRIII結合，所以藉由對於FcγRIII缺損小鼠投予此等抗體，可觀察到增強FcγRIIb選擇性結合時之加速抗原 消失之效果。從實施例6之結果，對於FcγRIII缺損小鼠投予之mF44及mF46比起對於同小鼠投予之mIgG1，抗原之廓清率顯示增加。又，從實施例6之結果可知：mF44及mF46對於FcγRIII缺損小鼠投予之情形、對於正常小鼠之情形，及對於Fc受體γ鏈缺損小鼠投予之情形，以大致同程度使抗原消失。
由該等結果可知：未增強對於活性型FcγR之結合，僅增強對於FcγRIIb選擇的結合，可加速抗原消失。
除了先前考察到的至今為止的文獻報告以外，從使用上述小鼠之驗證結果，可認為：在人類之活體中亦與小鼠同樣，經由FcγRIIb將免疫複合體攝入細胞內，其結果具有增強對於人類FcγRIIb而增強選擇的結合之Fc的抗體，可加快該抗原消失。又，如先前所考察，在小鼠與人類中，經由FcγRIIb之免疫複合體攝入細胞內係以同程度之速度發生，所以據認為：具有增強對小鼠FcγRIIb之親和性的Fc的抗體加速抗原消失之效果為同程度之效果，藉由使用將對人類FcγRIIb之親和性以同程度增強之Fc，也能於人類活體內達成。
如WO2009/125825之記載，將人類化抗IL-6受體抗體H54/L28-IgG1對於抗原之結合活性會依pH之條件變化，亦即於pH7.4與抗原結合，於pH5.8將抗原解離之改變賦予到可變區之Fv4-IgG1與為抗原之可溶型人類IL-6受體同時投予的小鼠中，可溶型人類IL-6受體之消失，比起將H54/L28-IgG1與該抗原同時投予之小鼠中的可溶型人類 IL-6受體之消失，顯示有大幅加速。又，本說明書中，H54/L28-IgG1所含之重鏈H54-IgG1及輕鏈L28-CK，各以序列編號：36及序列編號：37表示，Fv4-IgG1所含之重鏈VH3-IgG1及輕鏈VL3-CK，各以序列編號：38及序列編號：39表示。
可溶型人類IL-6受體所結合之抗體H54/L28-IgG1結合之可溶型人類IL-6受體，係與抗體一起由FcRn而再循環於血漿中，相對於此，以pH依存性地與可溶型人類IL-6受體結合之抗體Fv4-IgG1，在內體內之酸性條件下會將與抗體結合之可溶型人類IL-6受體解離。經解離之可溶型人類IL-6受體由溶體分解，故可大幅加速可溶型人類IL-6受體之消失，且將以pH依存性地與可溶型人類IL-6受體結合之抗體Fv4-IgG1在內體內與FcRn結合後於血漿中再循環。經再循環之該抗體能再度與可溶型人類IL-6受體結合，因此會反複對於抗原(可溶型人類IL-6受體)結合及利用FcRn於血漿中再循環。其結果，據認為一個抗體分子能重複多次結合於可溶型人類IL-6受體(WO2009/125825)。
另一方面，如本發明揭示，發現：藉由投予包含依pH等離子濃度之條件對於抗原之結合活性會變化之抗原結合分域、於pH酸性域之條件下對FcRn有結合活性之FcRn結合分域、及含Fcγ受體結合分域之抗原結合分子所含之Fcγ受體結合分域對於FcγR之結合活性經增強之抗原結合分子，能使可溶型抗原在血漿中濃度大幅下降。
雖不拘於特定理論，但藉由投予包含對於FcγR之結 合經增強之依pH等離子濃度之條件對於抗原之結合活性會改變之抗原結合分域、於pH酸性域之條件下對FcRn有結合活性之FcRn結合分域之抗原結合分子所觀察到之預料外之血漿中可溶型抗原濃度之下降，也可如以下方式說明。
如前述，Fv4-IgG1等包含由於離子濃度之條件對於抗原之結合活性會變化之抗原結合分域之抗原結合分子，據認為可重複多次與抗原結合，但於內體內將可溶型抗原解離並加快其從血漿中消失之效果，據認為係取決於抗原與抗原結合分子之複合體攝入內體內之速度。含有對於各種FcγR之結合活性經增強之依離子濃度之條件對於抗原之結合活性會變化之抗原結合分域之抗原結合分子，會藉由與細胞膜上表現之各種FcγR結合，而積極地攝入細胞內，於透過該分子中所含之pH酸性域之條件下對FcRn有結合活性之FcRn結合分域經由FcRn之結合之再循環，可再度於血漿中循環。亦即血漿中，會與可溶型抗原形成複合體之前述抗原結合分子，會經由在細胞膜上表現之FcγR而積極攝入細胞內，所以據認為加快血漿中之可溶型抗原消失之效果，會比起未增強對於各種之FcγR之結合活性的抗原結合分子更顯著。
與膜型抗原結合之抗體對於FcγR之結合活性，在該抗體之細胞傷害活性發揮重要作用。所以當作醫藥之抗體需要細胞傷害活性時，係使用對FcγR之結合活性高的人類IgG1的構造同型，且廣為使用藉由增強該抗體對於 FcγR之結合活性而增強該抗體之細胞傷害活性之技術。另一方面，作為醫藥使用且與可溶型抗原結合之抗體對FcγR之結合活性發揮的作用，至今為止尚為未知，對FcγR之結合活性高的人類IgG1與對FcγR之結合活性低之人類IgG2或人類IgG4之對FcγR之結合活性之不同，對於投予該抗體之活體造成之生理上的效果的不同，至今為止尚未經充分探討。實際上，在本實施例如後述，確認投予對FcγR之結合活性有缺損之抗體之個體之血漿中，不影響可溶型抗原之濃度變化。另一方面，本發明中，發現：投予含有對FcγR之結合活性增強且依離子濃度之條件可溶型對於抗原之結合活性變化之抗原結合分域之抗原結合分子的個體，血漿中之可溶型抗原濃度大幅下降。亦即，可稱首度發現藉由將以可溶型抗原為標的之抗原結合分子所含之於pH酸性域之條件下對FcRn有結合活性之FcRn結合分域以及依離子濃度之條件對可溶型抗原之結合會變化之抗原結合分域加以組合，能有增強對於FcγR之結合的優點。
抗原結合分子
本發明中，抗原結合分子在pH酸性域對於人類FcRn有結合活性且含抗原結合分域及含有Fcγ受體結合分域之分子，係以最廣含意使用，具體而言，此等只要顯示對於抗原之結合活性即可，包括各種分子型。例如，抗原結合分域與Fc區結合之分子，例如抗體。抗體包括單一單株抗體(包含致效劑及拮抗劑抗體)、人類抗體、人類化抗體、 嵌合抗體等。又，當作抗體之片段使用時，抗原結合分域及抗原結合片段(例如，Fab、F(ab’)2、scFv及Fv)為理想例。將既有之安定的α/β筒狀蛋白質構造等立體構造作為支架(scaffold)，僅將其一部分構造用於建構抗原結合分域而庫化之支架分子，也包括在本發明之抗原結合分子。
本發明之抗原結合分子，可包含媒介對FcRn之結合及對Fcγ受體之結合之Fc區之至少一部分。例如，於非限定之一態樣中，抗原結合分子可為抗體或Fc融合蛋白質。融合蛋白質，係指含有與在天然在具有其自然不連結之第二胺基酸序列之多胜肽連結之第一胺基酸序列之多胜肽的嵌合多胜肽。例如，融合蛋白質可包括編碼為Fc區之至少部分(例如賦予對FcRn之結合之Fc區之部分或賦予對Fcγ受體之結合之Fc區之部分)之胺基酸序列、及編碼為例如受體之配體結合分域或配體之受體結合分域之胺基酸序列之非免疫球蛋白多胜肽。胺基酸序列也可存在於一起運到融合蛋白質之其他蛋白質，或此等通常存在於相同蛋白質但會重新再編入融合多胜肽中。融合蛋白質例如可依化學合成，或製作編碼為所望胜肽區之聚核苷酸並以表現其之基因重組的方法製作。
本發明之各分域可利用多胜肽鍵直接連結，並可經由連結子連結。連結子，可使用能依基因工程導入之任意胜肽連結子、或合成化合物連結子(例如Protein Engineering(1996)9(3),299-305)揭示之連結子等，但本發明以胜肽連結子較理想。胜肽連結子之長度不特別 限定，可視目的由該技術領域中具有通常知識者適當選擇，但理想長度為5個胺基酸以上(上限不特別限定，通常為30個胺基酸以下，較佳為20個胺基酸以下)，尤佳為15個胺基酸。
例如，胜肽連結子之情形，可理想地列舉：Ser Gly‧Ser Gly‧Gly‧Ser Ser‧Gly‧Gly Gly‧Gly‧Gly‧Ser(序列編號：26)Ser‧Gly‧Gly‧Gly(序列編號：27)Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Ser(序列編號：28)Ser‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly(序列編號：29)Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Ser(序列編號：30)Ser‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly(序列編號：31)Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Ser(序列編號：32)Ser‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly(序列編號：33)(Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Ser(序列編號：28))n(Ser‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly(序列編號：29))n[n為1以上之整數]等為理想例。惟，胜肽連結子之長度或序列可視目的由該技術領域中具有通常知識者適當選擇。
合成化學物連結子(化學交聯劑)，為胜肽交聯通常使用之交聯劑，例如N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)、辛二酸二琥 珀醯亞胺酯(DSS)、辛二酸二(硫琥珀醯亞胺基)酯(BS 3)、二硫雙(琥珀醯亞胺基丙酸酯)(DSP)、二硫雙(硫琥珀醯亞胺基丙酸酯)(DTSSP)、乙二醇雙(琥珀醯亞胺基琥珀酸酯)(EGS)、乙二醇雙(硫琥珀醯亞胺基琥珀酸酯)(硫-EGS)、二琥珀醯亞胺基酒石酸鹽(DST)、二硫琥珀醯亞胺基酒石酸鹽(硫-DST)、雙[2-(琥珀醯亞胺氧羰基氧)乙基]碸(BSOCOES)、雙[2-(硫琥珀醯亞胺氧羰基氧)乙基]碸(硫-BSOCOES)等，該等交聯劑在市面上可購得。
連結各分域之連結子使用多個時，可均使用同種連結子，也可使用異種連結子。又，上述記載例示之連結子以外，也可適當使用有例如His標籤、HA標籤、myc標籤、FLAG標籤等胜肽標籤之連結子。又，氫鍵、雙硫鍵、共價鍵、離子性交互作用或該等結合之組合而彼此結合之性質也可適當利用。例如利用抗體之CH1與CL間之親和性、利用與異Fc區組合時以前述雙專一性抗體為起源之Fc區。再者，在分域間形成之雙硫鍵也可適當地利用。
為了將各分域以胜肽鍵連結，將編碼為該分域之聚核苷酸於同一讀框連結。聚核苷酸於同一讀框連結之方法，以限制片段之接合或融合PCR、重疊PCR等方法為公知，本發明之抗原結合分子之製作也可適當單獨或組合使用該等方法。本發明中，用語「經連結」、「經融合」、「連結」或「融合」可相互交換的使用。該等用語，指利用包含上述化學結合手段或重組方法之所有方法將二個以上之多胜 肽等的要素或成分形成為單一構造的方式進行連結。於同一讀框融合，當二以上之要素或成分為多胜肽時，係指以維持該多胜肽之正確讀取框之方式，為了形成連續的較長的讀取框之二個以上讀取框單位之連結。當二分子之Fab作為抗原結合分域使用時，該抗原結合分域與Fc區未經連結子而以胜肽鍵於同一讀框連結而得之本發明之抗原結合分子抗體，可作為本申請案之理想抗原結合分子使用。
FcRn
與屬於免疫球蛋白超級家族之Fcγ受體不同，FcRn尤其是人類FcRn，在構造的上與主要組織不適合性複合體(MHC)第I類之多胜肽在構造相類似，且與第I類之MHC分子有22至29%之序列同一性(Ghetie等人，Immunol.Today(1997)18(12),592-598)。FcRn，係由與可溶性β或輕鏈(β2微球蛋白)複合體化之穿膜α或重鏈構成的異二聚體的形式表現。如MHC，FcRn之α鏈係由3個細胞外分域(α1、α2、α3)構成，且短的細胞質分域係將蛋白質留在細胞表面。α1及α2域會與抗體之Fc區中之FcRn結合分域交互作用(Raghavan等人(Immunity(1994)1,303-315)。
FcRn係於哺乳動物之母性胎盤或卵黃嚢表現，其涉及IgG從母親移動到胎兒。此外，於表現FcRn之囓齒類新生兒的小腸中，涉及母體IgG從攝取FcRn之初乳或乳橫切移動到刷子緣上皮。FcRn有多數種類，在多數其他組織、及各種內皮細胞系表現。其在人類成人血管內皮、肌肉血管 系、及肝臓洞狀毛細血管也有表現。FcRn會與IgG結合，並且再循環到血清，而據認為有維持IgG之血漿中濃度之作用。FcRn對於IgG分子之結合，通常係嚴格依存於pH，最適結合據認為是小於7.0之pH酸性域。
以含序列編號：34表示之信號序列之多胜肽當做前驅體之人類FcRn，於活體內(序列編號：35記載包含信號序列之其多胜肽)會與人類β2-微球蛋白形成複合體。如後述參考實施例所示，與β2-微球蛋白形成複合體之可溶型人類FcRn可使用通常之重組表現方法製造。可以評價本發明之FcRn結合分域對於與如此的與β2-微球蛋白形成複合體之可溶型人類FcRn的結合活性。本發明中，未特別記載時，人類FcRn指能與本發明之FcRn結合分域結合之形態者，例如人類FcRn與人類β2-微球蛋白之複合體。
本發明之抗原結合分子具有FcRn結合分域。FcRn結合分域，只要是抗原結合分子在酸性pH域具有FcRn結合活性即不特別限定、又，也可為直接或間接對於FcRn具結合活性之分域。如此的分域，例如：直接對於FcRn具結合活性之IgG型免疫球蛋白之Fc區、白蛋白、白蛋白domain3、抗FcRn抗體、抗FcRn胜肽、抗FcRn Scaffold分子等、或間接對於人類FcRn具結合活性之與IgG或白蛋白結合之分子等。本發明中，於pH酸性域及pH中性域具FcRn結合活性之分域為較佳。該分域只要是預先在pH酸性域具FcRn結合活性之分域，即可直接使用。該分域在pH酸性域沒有FcRn結合活性或弱時，可改變抗原結合分 子中之胺基酸而賦予FcRn結合活性。又，也可預先將在pH酸性域對FcRn有結合活性之分域中之胺基酸改變，而提高FcRn結合活性。FcRn結合分域之胺基酸改變，可藉由比較胺基酸改變前與改變後在pH酸性域對FcRn之結合活性，而找出目的之改變。
人類FcRn結合分域，宜為直接與FcRn結合之區。FcRn結合區之較佳例，例如抗體之Fc區。但是能與白蛋白或IgG等具有與FcRn之結合活性之多胜肽結合之區，也可經由白蛋白或IgG等而間接結合於FcRn。所以，本發明之FcRn結合區，也可為具與FcRn結合活性之多胜肽結合之區。Fc區包括來自於抗體重鏈之不變區的胺基酸序列。Fc區，係EU編號表示之約216之胺基酸之木瓜酶切斷部位之鉸鏈區之N末端起含有該鉸鏈、CH2及CH3分域之抗體之重鏈不變區之部分。
FcRn結合分域或含該分域之抗原結合分子對於FcRn尤其是人類FcRn之結合活性
本發明中，FcRn結合分域對於FcRn尤其對於人類FcRn之結合活性，如前述結合活性之項目中所述，可依照該技術領域之人士所公知之方法測定，針對pH以外之條件，可由該技術領域之人士適當決定。抗原結合分子之抗原結合活性與人類FcRn結合活性，可就KD(Dissociation constant：解離常數)、視KD(Apparent dissociation constant：視解離常數)、解離速度kd(Dissociation rate：解離速度常數)、或視kd(Apparent dissociation：視解離 速度常數)等評價。該等可由該技術領域之人士公知之方法測定，例如可使用Biacore(GE healthcare)、Scatchard作圖法、流式細胞計數器等。
測定FcRn結合分域對於FcRn之結合活性時之pH以外之條件，可由該技術領域中具有通常知識者適當選擇，不特別限定。例如可如WO2009/125825記載，於MES緩衝液、37℃之條件測定。又，本發明之FcRn結合分域對於FcRn之結合活性之測定，可依該技術領域中具有通常知識者公知之方法進行，例如可使用Biacore(GE Healthcare)等測定。FcRn結合分域與FcRn之結合活性之測定，可藉由分別以FcRn或FcRn結合分域或含FcRn結合分域之本發明之抗原結合分子作為分析物流過固定有FcRn結合分域或含FcRn結合分域之本發明之抗原結合分子或FcRn的晶片而評價。
作為本發明之抗原結合分子所含之FcRn結合分域與FcRn有結合活性之條件的pH酸性域，通常指pH4.0~pH6.5。較佳指pH5.5~pH6.5，尤佳為接近活體內之早期內體內之pH的pH5.8~pH6.0。作為本發明之抗原結合分子或該分子所含之FcRn結合分域與FcRn有結合活性之條件的pH中性域，通常指pH6.7~pH10.0。pH中性域較佳為pH7.0~pH8.0之任意pH值所示之範圍，較佳為從pH7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、及8.0選擇，尤佳為接近活體內之血漿中(血中)之pH之pH7.4。由於在pH7.4時人類FcRn結合分域或含該分域之抗原結合 分子與人類FcRn之結合親和性低，當難評價其結合親和性時，可將pH7.4替換為使用pH7.0。就測定條件使用之溫度而言，FcRn結合分域與FcRn之結合親和性可於10℃~50℃之任意溫度評價。較佳為為了決定FcRn結合分域與人類FcRn之結合親和性，使用15℃~40℃之溫度。更佳為與從20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、及35℃中之任一者之20℃至35℃的任意溫度，也同樣用於決定FcRn結合分域與FcRn之結合親和性而可使用。25℃的溫度為本發明之態樣之一非限定例。
依Yeung等人(J.Immunol.(2009)182,7663-7671)，天然型人類IgG1對於人類FcRn之結合活性，在pH酸性域(pH6.0)KD為1.7μM，但於pH中性域幾乎未能檢測到活性。是以良好態樣中，可使用包括在pH酸性域之條件下對於人類FcRn之結合活性為KD 20μM或更強，在pH中性域之條件下對於人類FcRn之結合活性與天然型人類IgG為同等之抗原結合分子且在pH酸性域之條件下對於人類FcRn有結合活性之本發明之抗原結合分子。更佳的態樣中，可使用包括在pH酸性域之條件下對人類FcRn結合活性為KD 2.0μM或更強之抗原結合分子的本發明之抗原結合分子。又更佳的態樣中，可使用在pH酸性域之條件下對人類FcRn結合活性為KD 0.5μM或更強之抗原結合分子。上述KD值，可依The Journal of Immunology(2009)182：7663-7671記載之方法(將抗原結合分子固定在晶片，並流過作為分析物之人類FcRn)決定。
本發明中，在pH酸性域之條件下對FcRn有結合活性之Fc區較理想。該分域若要是預先在pH酸性域之條件下對於FcRn有結合活性之Fc區則可直接使用。該分域在pH酸性域之條件下對於FcRn無結合活性或結合活性弱的情形，可藉由改變抗原結合分子中之胺基酸而取得所望之對FcRn有結合活性之Fc區，但藉由改變Fc區中之胺基酸，也可理想地取得在pH酸性域之條件下對所望之FcRn有結合活性之Fc區或活性有增強之Fc區。帶來如此之所望結合活性之Fc區之胺基酸改變，可藉由比較胺基酸改變前與改變後在pH酸性域之條件下對於FcRn之結合活性而找到。可使用與前述之用於改變對於Fcγ受體之結合活性使用之方法為同樣的公知手法，由該技術領域中具有通常知識者實施適當胺基酸之改變。
本發明之抗原結合分子所含之在pH酸性域之條件下對FcRn有結合活性之Fc區可由任一方法取得，但具體而言，可藉由將作為初始Fc區使用之人類IgG型免疫球蛋白之胺基酸改變，而取得在pH酸性域之條件下對FcRn有結合活性之FcRn結合分域或結合活性有增強的FcRn結合分域。用於改變的理想的IgG型免疫球蛋白之Fc區，例如人類IgG(IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4、及此等之變異體)之Fc區。改變為其他胺基酸之改變，只要可在pH酸性域之條件下對FcRn有結合活性之、或可提高於酸性域之條件下對於人類FcRn之結合活性即可，可將任一位置之胺基酸改變。抗原結合分子含有作為Fc區之人類IgG1之Fc區的情 形，pH酸性域之條件下對於FcRn之結合包括帶來使人類IgG1之初始Fc區之結合活性更增強之效果之改變為理想。可為如此之改變之胺基酸，例如WO2000/042072所記載，EU編號表示之238位、252位、253位、254位、255位、256位、265位、272位、286位、288位、303位、305位、307位、309位、311位、312位、317位、340位、356位、360位、362位、376位、378位、380位、382位、386位、388位、400位、413位、415位、424位、433位、434位、435位、436位、439位及/或447位之胺基酸為理想。同樣地，可為如此之改變之胺基酸，例如WO2002/060919所記載，EU編號表示之251位、252位、254位、255位、256位、308位、309位、311位、312位、385位、386位、387位、389位、428位、433位、434位及/或436位之胺基酸為理想。又，可為如此之改變之胺基酸，可舉WO2004/092219所記載之EU編號表示之250位、314位及428位之胺基酸。又，可為如此之改變之胺基酸，例如WO2010/045193所記載，EU編號表示之251位、252位、307位、308位、378位、428位、430位、434位及/或436位之胺基酸為理想。利用該等胺基酸之改變，IgG型免疫球蛋白之Fc區在pH酸性域之條件下對於FcRn之結合會增強。
本發明中，在pH酸性域之條件下對FcRn有結合活性之Fc區較佳。該分域若為預先在pH酸性域之條件下對於FcRn有結合活性之Fc區則可直接使用。該分域在pH酸性 域之條件下對於FcRn無結合活性或結合活性弱的情形，可藉由改變抗原結合分子中之胺基酸而獲得對所望之FcRn有結合活性之Fc區，但藉由改變Fc區中之胺基酸，也可理想地取得在pH酸性域之條件下對所望之FcRn有結合活性之Fc區、或結合活性有增強之Fc區。帶來如此之所望結合活性之Fc區之胺基酸改變，可藉由比較胺基酸改變前與改變後在pH酸性域之條件下對於FcRn之結合活性而找出。可使用與前述之用於改變對於Fcγ受體之結合活性而使用的手法為同樣之公知手法，由該技術領域中具有通常知識者實施適當胺基酸之改變。
本發明之抗原結合分子所含之在pH酸性域之條件下對FcRn有結合活性之Fc區，可由任一方法取得，具體而言，可藉由改變作為初始Fc區使用之人類IgG型免疫球蛋白之胺基酸，而取得在pH酸性域之條件下對FcRn有結合活性、或結合活性增強之FcRn結合分域。用於改變之理想IgG型免疫球蛋白之Fc區，例如人類IgG(IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4、及此等之變異體)之Fc區。改變為其他胺基酸之改變，只要在pH酸性域之條件下對FcRn有結合活性、或可提高在酸性域之條件下對於人類FcRn之結合活性即可，任一位置之胺基酸都可改變。抗原結合分子係含有人類IgG1之Fc區作為Fc區之情形，包含帶來使在pH酸性域之條件下對於FcRn之結合比人類IgG1之初始Fc區之結合活性更增強之效果的改變較佳。可為如此之改變之胺基酸，例如國際公開WO1997/034631所記載，EU編號表示 之252位、254位、256位、309位、311位、315位、433位、及/或434位及與該等胺基酸組合之253位、310位、435位、及/或426位之胺基酸。國際公開WO2000/042072所記載，EU編號表示之238位、252位、253位、254位、255位、256位、265位、272位、286位、288位、303位、305位、307位、309位、311位、312位、317位、340位、356位、360位、362位、376位、378位、380位、382位、386位、388位、400位、413位、415位、424位、433位、434位、435位、436位、439位及/或447位之胺基酸為理想例。同樣地，可為如此之改變之胺基酸、例如國際公開WO2002/060919所記載、EU編號表示之251位、252位、254位、255位、256位、308位、309位、311位、312位、385位、386位、387位、389位、428位、433位、434位及/或436位之胺基酸亦為理想例。再者，可為如此之改變之胺基酸也可舉國際公開WO2004/092219所記載，EU編號表示之250位、314位及428位之胺基酸。此外，可為如此之改變之胺基酸，例如國際公開WO2006/020114所記載、238位、244位、245位、249位、252位、256位、257位、258位、260位、262位、270位、272位、279位、283位、285位、286位、288位、293位、307位、311位、312位、316位、317位、318位、332位、339位、341位、343位、375位、376位、377位、378位、380位、382位、423位、427位、430位、431位、434位、436位、438位、440位、及/或442位之胺基酸亦為理想例。又，可為如此之改 變之胺基酸，例如國際公開WO2010/045193所記載、EU編號表示之251位、252位、307位、308位、378位、428位、430位、434位及/或436位之胺基酸亦為理想例。藉由該等胺基酸之改變，IgG型免疫球蛋白之Fc區在pH酸性域之條件下對於FcRn之結合會增強。
含有人類IgG1之Fc區作為Fc區之情形，帶來在pH酸性域之條件下對於FcRn之結合係比起人類IgG1之初始Fc區之結合活性更增強之效果之改變之一非限定態樣，可舉從EU編號表示之251位之胺基酸為Arg或Leu中之任一者、252位之胺基酸為Phe、Ser、Thr、或Tyr中之任一者、254位之胺基酸為Ser或Thr中之任一者、255位之胺基酸為Arg、Gly、Ile、或Leu中之任一者、256位之胺基酸為Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、或Thr中之任一者、308位之胺基酸為Ile或Thr中之任一者、309位之胺基酸為Pro、311位之胺基酸為Glu、Leu、或Ser中之任一者、312位之胺基酸為Ala或Asp中之任一者、314位之胺基酸為Ala或Leu中之任一者、385位之胺基酸為Ala、Arg、Asp、Gly、His、Lys、Ser、或Thr中之任一者、386位之胺基酸為Arg、Asp、Ile、Lys、Met、Pro、Ser、或Thr中之任一者、 387位之胺基酸為Ala、Arg、His、Pro、Ser、或Thr中之任一者、389位之胺基酸為Asn、Pro、或Ser中之任一者、428位之胺基酸為Leu、Met、Phe、Ser、或Thr中之任一者433位之胺基酸為Arg、Gln、His、Ile、Lys、Pro、或Ser中之任一者、434位之胺基酸為His、Phe、或Tyr中之任一者、或436位之胺基酸為Arg、Asn、His、Lys、Met、或Thr中之任一者、之群中選出之至少1個以上的胺基酸之改變。又，改變的胺基酸之數不特別限定，可僅改變一處之胺基酸，也可改變二處以上之胺基酸。
含有人類IgG1之Fc區作為Fc區之情形，帶來使在pH酸性域之條件下對於FcRn之結合比起人類IgG1之初始Fc區之結合活性有增強之效果之改變之一非限定態樣，可為包括EU編號表示之308位之胺基酸為Ile、309位之胺基酸為Pro、及/或311位之胺基酸為Glu之改變。又，該改變之另一非限定態樣，可為包括308位之胺基酸為Thr、309位之胺基酸為Pro、311位之胺基酸為Leu、312位之胺基酸為Ala、及/或314位之胺基酸為Ala之改變。又，該改變之又另一非限定態樣，可為包括308位之胺基酸為Ile或Thr、309位之胺基酸為Pro、311位之胺基酸為Glu、Leu、或Ser、312位之胺基酸為Ala、及/或314位之胺基 酸為Ala或Leu之改變。該改變之一相異之非限定態樣，可為包括308位之胺基酸為Thr、309位之胺基酸為Pro、311位之胺基酸為Ser、312位之胺基酸為Asp、及/或314位之胺基酸為Leu之改變。
含有人類IgG1之Fc區作為Fc區之情形，帶來使在pH酸性域之條件下對於FcRn之結合比起人類IgG1之初始Fc區之結合活性更增強之效果之改變之一非限定態樣，可為包括EU編號表示之、251位之胺基酸為Leu、252位之胺基酸為Tyr、254位之胺基酸為Ser、或Thr、255位之胺基酸為Arg、及/或256位之胺基酸為Glu之改變。
含有人類IgG1之Fc區作為Fc區之情形，帶來使在pH酸性域之條件下對於FcRn之結合比起人類IgG1之初始Fc區之結合活性更增強之效果之改變之一非限定態樣，可為包括EU編號表示之428位之胺基酸為Leu、Met、Phe、Ser、或Thr中之任一者、433位之胺基酸為Arg、Gln、His、Ile、Lys、Pro、或Ser中之任一者、434位之胺基酸為His、Phe、或Tyr中之任一者、及/或436位之胺基酸為Arg、Asn、His、Lys、Met、或Thr中之任一者之改變。又，該改變其他非限定態樣，可為包括428位之胺基酸為His或Met、及/或434位之胺基酸為His或Met之改變。
含有人類IgG1之Fc區作為Fc區之情形，帶來使在pH酸性域之條件下對於FcRn之結合比起人類IgG1之初始Fc區之結合活性更增強之效果之改變之一非限定態樣，可為包括EU編號表示之385位之胺基酸為Arg、386位之胺 基酸為Thr、387位之胺基酸為Arg、及/或389位之胺基酸為Pro之改變。又，該改變之其他非限定態樣，可為包括385位之胺基酸為Asp、386位之胺基酸為Pro及/或389位之胺基酸為Ser之改變。
又，含有人類IgG1之Fc區作為Fc區之情形，帶來使在pH酸性域之條件下對於FcRn之結合比起人類IgG1之初始Fc區之結合活性更增強之效果之改變之一非限定態樣，可列舉從EU編號表示之250位之胺基酸為Gln或Glu中之任一者、或428位之胺基酸為Leu或Phe中之任一者、之群中選出之至少1個以上的胺基酸之改變。又，改變的胺基酸之數不特別限定，可僅改變一處之胺基酸，也可改變二處胺基酸。
含有人類IgG1之Fc區作為Fc區之情形，帶來在pH酸性域之條件下對於FcRn之結合比起人類IgG1之初始Fc區之結合活性更增強之效果之改變之一非限定態樣，可為包括EU編號表示之250位之胺基酸為Gln、及/或428位之胺基酸為Leu或Phe中之任一者之改變。又，該改變之其他非限定態樣，可為包括250位之胺基酸為Glu、及/或428位之胺基酸為Leu或Phe中之任一者之改變。
含有人類IgG1之Fc區作為Fc區之情形，帶來使在pH酸性域之條件下對於FcRn之結合比起人類IgG1之初始Fc區之結合活性更增強之效果之改變之一非限定態樣，可舉從EU編號表示之 251位之胺基酸為Asp或Glu中之任一者、252位之胺基酸為Tyr、307位之胺基酸為Gln、308位之胺基酸為Pro、378位之胺基酸為Val、380位之胺基酸為Ala、428位之胺基酸為Leu、430位之胺基酸為Ala、或Lys中之任一者、434位之胺基酸為Ala、His、Ser、或Tyr中之任一者、或436位之胺基酸為Ile、之群選出之至少二個以上之胺基酸之改變。又，改變的胺基酸之數不特別限定，可僅有二處胺基酸改變，也可有三處以上之胺基酸改變。
含有人類IgG1之Fc區作為Fc區之情形，帶來使在pH酸性域之條件下對於FcRn之結合比起人類IgG1之初始Fc區之結合活性更增強之效果之改變之一非限定態樣，可為包括EU編號表示之307位之胺基酸為Gln、及434位之胺基酸為Ala或Ser中之任一者之改變。又，該改變之其他非限定態樣，可為包括308位之胺基酸為Pro、及434位之胺基酸為Ala之改變。又，該改變之另一非限定態樣，可為包括252位之胺基酸為Tyr、及434位之胺基酸為Ala之改變。該改變之相異之一非限定態樣，可為包括378位之胺基酸為Val、及434位之胺基酸為Ala之改變。該改變之另一相異之一非限定態樣，可為包括428位之胺基酸 為Leu、及434位之胺基酸為Ala之改變。又，該改變之又另一相異之一非限定態樣，可為包括434位之胺基酸為Ala、及436位之胺基酸為Ile之改變。又，該改變之又一非限定態樣，可為包括308位之胺基酸為Pro、及434位之胺基酸為Tyr之改變。又，該改變之又一非限定態樣，可為包括307位之胺基酸為Gln、及436位之胺基酸為Ile之改變。
含有人類IgG1之Fc區作為Fc區之情形，帶來使在pH酸性域之條件下對於FcRn之結合比起人類IgG1之初始Fc區之結合活性更增強之效果之改變之一非限定態樣，可為包括EU編號表示之307位之胺基酸為Gln、380位之胺基酸為Ala、及434位之胺基酸為Ser中之任一者之改變。又，該改變之其他非限定態樣，可為包括307位之胺基酸為Gln、380位之胺基酸為Ala、及434位之胺基酸為Ala之改變。又，該改變之又一非限定態樣，可為包括252位之胺基酸為Tyr、308位之胺基酸為Pro、及434位之胺基酸為Tyr之改變。該改變之相異之一非限定態樣，可為包括251位之胺基酸為Asp、307位之胺基酸為Gln、及434位之胺基酸為His之改變。
含有人類IgG1之Fc區作為Fc區之情形，帶來使在pH酸性域之條件下對於FcRn之結合比起人類IgG1之初始Fc區之結合活性更增強之效果之改變之一非限定態樣，可列舉從EU編號表示之238位之胺基酸為Leu、 244位之胺基酸為Leu、245位之胺基酸為Arg、249位之胺基酸為Pro、252位之胺基酸為Tyr、256位之胺基酸為Pro、257位之胺基酸為Ala、Ile、Met、Asn、Ser、或Val中之任一者、258位之胺基酸為Asp、260位之胺基酸為Ser、262位之胺基酸為Leu、270位之胺基酸為Lys、272位之胺基酸為Leu、或Arg中之任一者、279位之胺基酸為Ala、Asp、Gly、His、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp、或Tyr中之任一者、283位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp、或Tyr中之任一者、285位之胺基酸為Asn、286位之胺基酸為Phe、288位之胺基酸為Asn、或Pro中之任一者、293位之胺基酸為Val、307位之胺基酸為Ala、Glu、或Met中之任一者、311位之胺基酸為Ala、Ile、Lys、Leu、Met、Val、或Trp中之任一者、 312位之胺基酸為Pro、316位之胺基酸為Lys、317位之胺基酸為Pro、318位之胺基酸為Asn、或Thr中之任一者、332位之胺基酸為Phe、His、Lys、Leu、Met、Arg、Ser、或Trp中之任一者、339位之胺基酸為Asn、Thr、或Trp中之任一者、341位之胺基酸為Pro、343位之胺基酸為Glu、His、Lys、Gln、Arg、Thr、或Tyr中之任一者、375位之胺基酸為Arg、376位之胺基酸為Gly、Ile、Met、Pro、Thr、或Val中之任一者、377位之胺基酸為Lys、378位之胺基酸為Asp、或Asn中之任一者、380位之胺基酸為Asn、Ser、或Thr中之任一者、382位之胺基酸為Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中之任一者、423位之胺基酸為Asn、427位之胺基酸為Asn、430位之胺基酸為Ala、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、或Tyr中之任一者、431位之胺基酸為His、或Asn中之任一者、434位之胺基酸為Phe、Gly、His、Trp、或Tyr中之任一 者、436位之胺基酸為Ile、Leu、或Thr中之任一者、438位之胺基酸為Lys、Leu、Thr、或Trp中之任一者、440位之胺基酸為Lys、或、442位之胺基酸為Lys、之群選出之至少二個以上之胺基酸之改變。又，改變的胺基酸之數不特別限定，可僅改變二處之胺基酸，也可改變三處以上之胺基酸。
含有人類IgG1之Fc區作為Fc區之情形，帶來使在pH酸性域之條件下對於FcRn之結合比起人類IgG1之初始Fc區之結合活性更增強之效果之改變之一非限定態樣，可為包括EU編號表示之257位之胺基酸為Ile、及311位之胺基酸為Ile之改變。又，該改變其他非限定態樣，可為包括257位之胺基酸為Ile、及434位之胺基酸為His之改變。又，該改變之又一非限定態樣，可為包括376位之胺基酸為Val、及434位之胺基酸為His之改變。
又，如後述，本發明之抗原結合分子所含之FcRn結合分域，可理想地使用在pH中性域之條件下對FcRn有結合活性之Fc區。依據前述取得在pH酸性域之條件下對FcRn有結合活性之Fc區之方法，如此之Fc區也可依任一方法取得，具體而言，可藉由作為初始Fc區使用之人類IgG型免疫球蛋白之胺基酸之改變，而取得在pH中性域之條件下對FcRh有結合活性或增強之FcRn結合分域。用於改變之理想IgG型免疫球蛋白之Fc區，例如人類IgG(IgG1、IgG2、 IgG3、或IgG4、及此等之變異體)之Fc區。改變為其他胺基酸之改變，只要在pH中性域之條件下對FcRn有結合活性或提高在酸性域之條件下對於人類FcRn之結合活性即可，任一位置之胺基酸都可改變。抗原結合分子含有人類IgG1之Fc區作為Fc區之情形，宜包括帶來使在pH中性域之條件下對於FcRn之結合比起人類IgG1之初始Fc區之結合活性更增強之效果之改變較佳。經如此之改變之Fc區，例如人類FcRn結合分域，在從初始Fc區之以EU編號表示之部位當中，從237位、238位、239位、248位、250位、252位、254位、255位、256位、257位、258位、265位、270位、286位、289位、297位、298位、303位、305位、307位、308位、309位、311位、312位、314位、315位、317位、325位、332位、334位、360位、376位、380位、382位、384位、385位、386位、387位、389位、424位、428位、433位、434位、及436位之群選出之至少一個以上之胺基酸係與天然型Fc區之對應胺基酸為相異之Fc區為理想例。
又，經如此改變之Fc區，例如含有從Fc區之EU編號表示之；237位之胺基酸為Met、238位之胺基酸為Ala、239位之胺基酸為Lys、248位之胺基酸為Ile、250位之胺基酸為Ala、Phe、Ile、Met、Gln、Ser、 Val、Trp、或Tyr中之任一者、252位之胺基酸為Phe、Trp、或Tyr中之任一者、254位之胺基酸為Thr、255位之胺基酸為Glu、256位之胺基酸為Asp、Glu、或Gln中之任一者、257位之胺基酸為Ala、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Ser、Thr、或Val中之任一者、258位之胺基酸為His、265位之胺基酸為Ala、270位之胺基酸為Phe、286位之胺基酸為Ala或Glu中之任一者、289位之胺基酸為His、297位之胺基酸為Ala、298位之胺基酸為Gly、303位之胺基酸為Ala、305位之胺基酸為Ala、307位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp、或Tyr中之任一者、308位之胺基酸為Ala、Phe、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、或Thr中之任一者、309位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Pro、或Arg中之任一者、311位之胺基酸為Ala、His、或Ile中之任一者、 312位之胺基酸為Ala或His中之任一者、314位之胺基酸為Lys或Arg中之任一者、315位之胺基酸為Ala或His中之任一者、317位之胺基酸為Ala、325位之胺基酸為Gly、332位之胺基酸為Val、334位之胺基酸為Leu、360位之胺基酸為His、376位之胺基酸為Ala、380位之胺基酸為Ala、382位之胺基酸為Ala、384位之胺基酸為Ala、385位之胺基酸為Asp或His中之任一者、386位之胺基酸為Pro、387位之胺基酸為Glu、389位之胺基酸為Ala或Ser中之任一者、424位之胺基酸為Ala、428位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中之任一者、433位之胺基酸為Lys、434位之胺基酸為Ala、Phe、His、Ser、Trp、或Tyr中之任一者、及436位之胺基酸為His、 之群中選出之至少1個以上胺基酸之Fc區為理想例。
例如該等的胺基酸之改變可單獨或組合多個而增強IgG之Fc區在pH酸性域及/或中性域對於FcRn之結合，但導入之胺基酸改變不特別限定，只要可帶來改善血漿中滯留性之效果即可，可導入任意胺基酸改變。
醫藥組成物
若投予對抗可溶型抗原之既有的中和抗體，預測抗原會與抗體結合而提高在血漿中之持續性。抗體一般有長的半衰期(1週~3週)，但另一方面，抗原一般有短的半衰期(1日以下)。所以在血漿中與抗體結合之抗原，比起抗原單獨存在的情形，有顯著較長的半衰期。其結果，藉由投予既有的中和抗體，會引起血漿中之抗原濃度之上升。如此的事例在以各種可溶型抗原作為標的之中和抗體已有人報告，若舉一例，有：IL-6(J.Immunotoxicol.(2005)3,131-139)、amyloid beta(mAbs(2010)2(5),1-13)、MCP-1(ARTHRITIS & RHEUMATISM(2006)54,2387-2392)、hepcidin(AAPS J.(2010)4,646-657)、sIL-6受體(Blood(2008)112(10),3959-64)等。藉由既有中和抗體之投予，據報告血漿中總抗原濃度會從基線升高約10倍~1000倍(上升的程度依抗原而異)。在此，血漿中總抗原濃度，係指就在血漿中存在之抗原之總量的濃度，亦即以抗體結合型與抗體非結合型之抗原濃度之和表示。對於如此之以可溶型抗原作為標的之抗體醫藥，血漿中總抗原濃度宜不要上升。原因為，若要中和可溶型抗原，至少需要 超過血漿中總抗原濃度之血漿中抗體濃度。亦即，血漿中總抗原濃度升高10倍~1000倍，係指就為了將其中和之血漿中抗體濃度(亦即抗體投予量)，需比起不發生血漿中總抗原濃度之上升的情形，為10倍~1000倍。另一方面，若比起既有中和抗體能使血漿中總抗原濃度下降10倍~1000倍，可以同樣分量減少抗體之投予量。如此之方式，能從血漿中使可溶型抗原消失並減少血漿中總抗原濃度之抗體，比起既有之中和抗體，有用性顯著較高。本發明之方法，不拘於特定理論，例如可使在pH酸性域之條件下對於抗原之結合活性低於在pH中性域之條件對於抗原之結合活性之方式，促進含有依離子濃度之條件對於抗原之結合活性改變之抗原結合分域及在pH中性域之條件下對於人類Fcγ受體有結合活性之抗體不變區等之FcRn結合分域之抗原結合分子對於活體投予時攝入活體中之細胞，而使一分子抗原結合分子能結合之抗原數目增加之理由、及促進血漿中抗原濃度之消失促進之理由，例如可如以下說明。
例如：當將膜抗原結合之抗體對於活體內投予時，該抗體係與抗原結合，維持與抗原結合並與抗原一起利用內化(internalization)而攝入細胞內之內體。之後，抗體維持與抗原結合的狀態移動到溶體，抗體與抗原一起由溶體分解。經由內化而從血漿中消失，稱為抗原依存性的消失，已有人報告許多抗體分子(Drug Discov Today.2006 Jan；11(1-2)：81-88)。1分子之IgG抗體以2價結合於抗 原時，1分子之抗體係以結合於2分子之抗原的狀態內化，並且維持此狀態於溶體被分解。因此，為通常之抗體時，1分子之IgG抗體無法結合於3分子以上之抗原。例如為具中和活性之1分子之IgG抗體時，無法中和3分子以上之抗原。
IgG分子之血漿中滯留性較長(消失慢)，係由於已知當做IgG分子之再利用(salvage)受體的FcRn的作用。利用胞飲作用攝入內體之IgG分子，在內體內之酸性條件下會與在內體內表現的FcRn結合。無法結合於FcRn之IgG分子會前進到溶體，於此被分解。另一方面，與FcRn結合之IgG分子會移往細胞表面。於血漿中之中性條件下IgG分子從FcRn解離，藉此該IgG分子再度回到血漿中再循環。
又，抗原結合分子為與可溶型抗原結合之抗體時，對於活體內投予之抗體會與抗原結合，之後抗體維持與抗原結合的狀態被攝入細胞內。攝入細胞內之抗體中的多數會在內體內與FcRn結合之後移到細胞表面。但在血漿中之中性條件下，抗體會從FcRn解離，所以會釋出細胞外。但依pH等離子濃度之條件，包括對於抗原之結合活性不會變化之通常之抗原結合分域的抗體會維持與抗原結合之狀態釋放到細胞外，因此無法再度與抗原結合。因此，與和膜抗原結合之抗體同樣，為依pH等離子濃度之條件對於抗原之結合活性不會改變化之通常之一分子之IgG抗體，無法與3分子以上之抗原結合。
對於抗原會在血漿中之pH中性域條件下強力結合，且 於內體內之pH酸性域條件下從抗原解離之pH依存性抗原結合抗體(對於抗原會在pH中性域之條件下結合，並在pH酸性域之條件下解離之抗體)、或對於抗原會在血漿中之高鈣離子濃度之條件下強力結合並於內體內之低鈣離子濃度之條件下從抗原解離之鈣離子濃度依存性結合抗原之抗體(對於抗原在高鈣離子濃度之條件下結合並在低鈣離子濃度之條件下解離之抗體)能於內體內從抗原解離。對於pH依存性地對抗原結合之抗體或以鈣離子濃度依存性地對抗原結合之抗體，由於將抗原解離後，抗體若利用FcRn於血漿中再循環，能再度與抗原結合，因此1分子抗體能與多數抗原返覆結合。又，與抗原結合分子結合之抗原藉由於內體內解離，不會於血漿中再循環，而在溶體內被分解。藉由將如此的抗原結合分子對於活體投予，能促進抗原攝入細胞內，並且使血漿中之抗原濃度降低。
對於抗原在血漿中之pH中性域之條件下強力結合，於內體內之pH酸性域之條件下從抗原解離之以pH依存性地對抗原結合之抗體(對於抗原在pH中性域之條件下結合、在pH酸性域之條件下解離之抗體)或對於在抗原血漿中之高鈣離子濃度之條件下強力結合並在內體內之低鈣離子濃度之條件下從抗原解離之以鈣離子濃度依存性地對於抗原結合之抗體(對於抗原在高鈣離子濃度之條件下結合、在低鈣離子濃度之條件下解離之抗體)，藉由賦予在pH中性域之條件下(pH7.4)對於Fcγ受體之結合能力或使結合能力增強，更能促進有抗原結合分子結合之抗原攝入細胞內。 亦即，藉由將如此的抗原結合分子投予到活體，可促進抗原消失，並使血漿中之抗原濃度下降。不具有pH依存性的對抗原之結合能力、或不具有鈣離子濃度依存性的對抗原之結合能力之通常抗體及其抗體-抗原複合體，係利用非專一性的內吞作用攝入細胞內，在內體內之酸性條件下結合於FcRn而被輸送到細胞表面，在細胞表面之中性條件下從FcRn解離而於血漿中再循環。所以，當以足夠的pH依存性地對於抗原結合之(在pH中性域之條件下結合，在pH酸性域之條件下解離)、或以足夠的鈣離子濃度依存性對於抗原結合(在高鈣離子濃度之條件下結合並在低鈣離子濃度之條件下解離)之抗體在血漿中與抗原結合，並在內體內將已結合之抗原解離的情形，據認為抗原之消失速度會等於利用非專一性內吞作用之抗體及其抗體-抗原複合體攝入細胞的速度。抗體與抗原間之結合之pH依存性或鈣離子濃度依存性不夠的情形，在內體內未從抗體解離的抗原也會與抗體一起於血漿中再循環，但於pH依存性足夠的情形，抗原之消失速度會以非專一性的內吞作用所為之攝入細胞之速度成為速率限制條件。又，FcRn係將抗體從內體內輸送到細胞表面，所以據認為FcRn的一部分也存在於細胞表面。
本案發明人等認為：在pH中性域之條件下對於Fcγ受體有結合活性、或該結合活性有增強之IgG型免疫球蛋白，能與存在細胞表面的Fcγ受體結合，且藉由與細胞表面存在之Fcγ受體結合，該IgG型免疫球蛋白據認為會以 Fcγ受體依存性地攝入細胞內。經由Fcγ受體攝入細胞之速度，比起利用非專一性的內吞作用攝入細胞之速度快。所以，藉由增強在pH中性域之條件下對於Fcγ受體之結合能力，據認為能更加快利用抗原結合分子使抗原消失之速度。亦即在pH中性域之條件下對於Fcγ受體有結合能力之抗原結合分子，會比通常之(天然型人類)IgG型免疫球蛋白更快將抗原送入細胞內，在內體內與FcRn結合並將抗原解離後，再度於血漿中再循環，然後再與抗原結合，並經由Fcγ受體攝入細胞內。藉由提高在pH中性域之條件下對於Fcγ受體之結合能力，能加快該循環的周轉速度，所以加快使抗原從血漿中消失之速度。又，藉由使抗原結合分子在pH酸性域之條件下對於抗原之結合活性低於在pH中性域之條件下對於抗原之結合活性，能提高抗原從血漿中消失之速度。又，由於加快該循環之周轉速度使循環數增大，據認為一分子之抗原結合分子能結合之抗原之分子數也會增多。本發明之抗原結合分子，係由抗原結合分域與Fcγ受體結合分域構成，且Fcγ受體結合分域不影響對於抗原之結合，所以從上述機制考慮，也可認為不依存於抗原種類，藉由使抗原結合分子在pH酸性域或低鈣離子濃度之條件等離子濃度之條件對於抗原之結合活性(結合能力)低於在pH中性域或高鈣離子濃度之條件等離子濃度之條件對於抗原之結合活性(結合能力)，及/或增大在血漿中之pH對於Fcγ受體之結合活性，能促進利用抗原結合分子使抗原攝入到細胞內，且加快抗原之消失速 度。因此本發明之抗原結合分子據認為在減少抗原帶來的副作用、抗體之投予量上升、抗體之活體內之動態改善此等觀點，可較習知之治療用抗體發揮更優異的效果。
圖1表示藉由投予比起既有的中和抗體在中性pH對於Fcγ受體之結合增強之離子濃度依存性抗原結合抗體，可溶型抗原從血漿中消失之機制之一樣態。以下舉離子濃度依存性抗原結合抗體之一例，以氫離子濃度(亦即pH)依存性抗原結合抗體為例說明，但該機制不限定於氫離子濃度。不具pH依存性抗原結合能力之既有的中和抗體，於血漿中結合於可溶型抗原後，據認為主要利用與細胞之非專一性的交互作用而緩慢攝入。攝入細胞內之中和抗體與可溶型抗原之複合體，移到酸性的內體，並由於FcRn而往血漿中再循環。另一方面在中性條件下對於Fcγ受體之結合經增強之pH依存性抗原結合抗體，在血漿中結合於可溶型抗原後，除了非專一性的交互作用，據認為尚經由與Fcγ受體之交互作用而快速攝入在細胞膜上有表現Fcγ受體的細胞中。在此，與pH依存性抗原結合抗體結合之可溶型抗原，在酸性內體之中，會由於pH依存性結合能力而從抗體解離。從抗體解離之可溶型抗原之後移到溶體，利用蛋白質分解活性受分解。另一方面，將已解離可溶型抗原之抗體，在酸性之內體之中與FcRn結合之後，由於FcRn往細胞膜上再循環，再度釋出到血漿中。如此經再循環而成為游離的抗體，可以與其他可溶型抗原再度結合。將如此之經由Fcγ受體攝入細胞內、可溶型抗原之解離與分解、 抗體之再循環此種循環反複進行，如此在中性條件下對於Fcγ受體之結合有增強之pH依存性抗原結合抗體，可將大量的可溶型抗原移到溶體，並使血漿中總抗原濃度降低。
亦即本發明係關於本發明之抗原結合分子、依本發明之改變方法製作之抗原結合分子、或包含依本發明之製造方法製造之抗原結合分子之醫藥組成物。本發明之抗原結合分子或依本發明之製造方法製造之抗原結合分子，藉由投予，比起通常之抗原結合分子使血漿中之抗原濃度下降之作用高，且由於經投予之活體所為之免疫回應或該活體中之藥物動態等有改變，故作為醫藥組成物有用。本發明之醫藥組成物可含醫藥上可容許之擔體。
本發明中之醫藥組成物係通常指疾病之治療或預防、或檢查‧診斷用之藥劑。
本發明之醫藥組成物，能以該技術領域之人士公知之方法製劑化。例如：能以與水或其他藥學上可容許之液體的無菌性溶液、或懸浮液劑之注射劑之形式以非經口的使用。例如：藥理學上可容許之擔體或介質，具體而言，可考慮適當組合滅菌水或生理食鹽水、植物油、乳化劑、懸浮劑、界面活性劑、安定劑、香味劑、賦形劑、運載劑、防腐劑、黏結劑等，以一般認可的製藥實務要求的單位用量形態混合而製劑化。該等製劑中的有效成分量，可設定為可獲得指示範圍之適當容量。
用於注射之無菌組成物，可使用如注射用蒸餾水之運載劑而依通常之製劑實務配方。注射用之水溶液，例如生 理食鹽水、葡萄糖或含其他輔助藥(例如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化鈉)之等張液。也可併用適當的溶解輔助劑，例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇、聚乙二醇等)、非離子性界面活性劑(聚山梨糖醇酸酯80(TM)、HCO-50等)。
油性液，例如麻油、黃豆油，溶解輔助劑可併用苯甲酸苄酯及/或苯甲醇。又，也可摻合緩衝劑(例如：磷酸鹽緩衝液及乙酸鈉緩衝液)、止痛劑(例如：鹽酸普羅卡因)、安定劑(例如：苯甲醇及酚)、抗氧化劑。製備的注射液通常充填在適當的安瓿。
本發明之醫藥組成物較佳為以非經口投予。例如可製成注射劑型、經鼻投予劑型、經肺投予劑型、經皮投予型之組成物。例如可利用靜脈內注射、肌肉內注射、腹腔內注射、皮下注射等對於全身或局部投予。
投予方法可視患者之年齡、症狀適當選擇。含抗原結合分子之醫藥組成物之投予量，例如可設定為每次體重1 kg為0.0001 mg至1000 mg之範圍。或，可定為例如每位患者為0.001~100000 mg之投予量，但本發明不一定限於該等數值。投予量及投予方法，視患者之體重、年齡、症狀等而變動，但如為該技術領域之人士，可考慮該等條件，設定適當的投予量及投予方法。
又，本發明記載之胺基酸序列所包含之胺基酸，有時會受到轉譯後修飾(例如：N末端之麩醯胺酸由於焦麩胺醯基化而修飾為焦麩胺酸為該技術領域之人士熟知之修 飾)，但如此的胺基酸為轉譯後修飾時，當然也包含在本發明記載之胺基酸序列。
使用本發明之抗原結合分子之方法
又，本發明係關於以下(i)~(vi)中之任一者之方法；(i)使能結合於一分子之抗原結合分子之抗原數目增加之方法、(ii)使血漿中抗原消失之方法、(iii)改善抗原結合分子之藥物動態之方法、(iv)促進在細胞外結合於抗原結合分子之抗原在細胞內從抗原結合分子解離之方法、(v)促進未結合於抗原之狀態之抗原結合分子釋放到細胞外之方法，或(vi)減少血漿中之總抗原濃度或游離抗原濃度之方法；其係包含以下步驟：使抗原結合分子在細胞活體內或活體外接觸表現Fcγ受體之細胞，該抗原結合分子包含：抗原結合分域，其於pH酸性域之條件下對於人類FcRn有結合活性，且依離子濃度之條件對於抗原之結合活性會變化；及Fcγ受體結合分域，其於pH中性域之條件下對於Fcγ受體之結合活性高於結合於EU編號297位之糖鏈係含岩藻糖之糖鏈的天然型人類IgG之Fc區對於Fcγ受體之結合活性。
又，本發明係關於以下(i)~(vii)中之任一者之方法；(i)促進結合的抗原攝入細胞內之抗原結合分子之改變方法、(ii)使一分子抗原結合分子能結合之抗原之數目增加之方法、(iii)使抗原結合分子在血漿中之抗原消失能力增大之方法、(iv)改善抗原結合分子之藥物動態之方法、(v)促進於細胞外結合於抗原結合分子之抗原在細胞內從抗原結合分子解離之方法、(vi)促進以結合於抗原之狀態攝入細胞內的抗原結合分子以未與抗原結合之狀態釋放到細胞外之方法，或(vii)能減少血漿中之總抗原濃度或游離抗原濃度之抗原結合分子之改變方法；其係包含以下步驟：使包含於pH酸性域條件下對於人類FcRn有結合活性且依離子濃度之條件對於抗原之結合活性會變化之抗原結合分域、及Fcγ受體結合分域的抗原結合分子，其Fcγ受體結合分域在pH中性域條件下對於Fcγ受體之結合活性比起結合於EU編號297位之糖鏈係含岩藻糖之糖鏈的天然型人類IgG之Fc區在pH中性域條件下對於Fcγ受體之結合活性更為增強。
使抗原結合分子在表現Fcγ受體之細胞中在活體內或活體外接觸細胞之方法，例如(1)將包含抗原結合分子及 結合於抗原結合分子之抗原的血漿先取出到活體外後，使接觸表現Fcγ受體之細胞，於經過一定期間使於細胞外再循環(也稱為再分泌或再循環)的含有未與抗原結合之抗原結合分子的血漿回到活體內之在活體外(ex vivo)之方法，或(2)將抗原結合分子對於活體內投予之方法。又，(1)之方法，也可利用將包含結合於抗原結合分子之抗原之血漿先取出到活體外後，使接觸抗原結合分子及表現Fcγ受體之細胞，經過一定期間使血漿回到活體內之方法。
本發明中，表現Fcγ受體之細胞，只要是表現所望之Fcγ受體之細胞即可，可使用任意細胞，不限於特定細胞。為了表現特定所望之Fcγ受體之細胞，可使用Human Protein Atlas(http：//www.proteinatlas.org/)等公知之資料庫。又，可利用確認編碼為所望之Fcγ受體之基因之表現的方法，又，利用使用與所望之Fcγ受體結合之抗體之免疫學的方法，確認用於接觸本發明之抗原結合分子所用之細胞是否有表現該受體。如此之方法也為公知。表現Fcγ受體之細胞、與抗原結合分子及該結合於抗原結合分子之抗原間的接觸，也可在活體內進行，故本發明中，在表現Fcγ受體之細胞中使抗原結合分子接觸，包括將抗原結合分子對於活體投予。接觸時間例如1分鐘至數週、30分鐘至1週、1小時至3日、2小時至1日之間且為適當時間，亦即可適當採用抗原結合分子或該結合於抗原結合分子之抗原利用經由Fcγ受體之內吞作用而攝入細胞內所必要之時間。例如表現Fcγ受體之細胞可使用各種免 疫細胞。
使Fcγ受體結合分域在pH中性域之條件下對於Fcγ受體之結合活性，比起結合於EU編號297位之糖鏈係含岩藻糖之糖鏈之天然型Fcγ受體結合分域在pH中性域之條件下對於Fcγ受體之結合活性更增強之方法，記載於後述本發明之抗原結合分子之製造方法之項目。
促進有抗原結合分子結合之抗原攝入細胞內之抗原結合分子之改變方法
本發明提供促進有抗原結合分子結合之抗原攝入細胞內之抗原結合分子之改變方法，包含以下步驟：使包含於pH酸性域條件下對於人類FcRn有結合活性且依離子濃度之條件對於抗原之結合活性會變化之抗原結合分域、及Fcγ受體結合分域的抗原結合分子，其Fcγ受體結合分域在pH中性域條件下對於Fcγ受體之結合活性比起結合於EU編號297位之糖鏈係含岩藻糖之糖鏈的天然型人類IgG之Fc區在pH中性域條件下對於Fcγ受體之結合活性更為增強。
本發明中，利用抗原結合分子使「抗原攝入細胞內」，係指抗原利用經由Fcγ受體之內吞作用、內化而被攝入細胞內。又，本發明中，「促進攝入細胞內」，係指在血漿中與抗原結合之抗原結合分子攝入細胞內之速度受促進，及/或已攝入之抗原於血漿中再循環之量減少，且抗原結合分子在pH中性域對於Fcγ受體之結合活性增大，並且使抗原結合分子在pH酸性域或低鈣離子濃度等離子濃度之條 件之抗原結合活性(結合能力)比起在pH中性域或高鈣離子濃度等離子濃度之條件之抗原結合活性下降之前之抗原結合分子，對於細胞內之攝入速度有促進即可，比起結合於EU編號297位之糖鏈係含岩藻糖之糖鏈之天然型之人類IgG更促進較佳，尤其比起天然型之人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中之任一者更促進較佳。因此本發明中，是否由於抗原結合分子使抗原攝入細胞內受促進，可由抗原向細胞內之攝入速度是否增大來判斷可能。抗原攝入細胞內之速度，例如可藉由在含有Fcγ受體表現細胞之培養液添加抗原結合分子與抗原，經時測定抗原在培養液中濃度之減少，或經時測定攝入Fcγ受體表現細胞內之抗原之量以計算。利用本發明之抗原結合分子促進抗原攝入細胞內之速度之方法，可藉由投予例如抗原結合分子，而促進抗原在血漿中之消失速度。因此是否由於抗原結合分子使抗原促進細胞內之攝入受促進，例如可藉由測定血漿中存在之抗原之消失速度是否加速、或藉由投予抗原結合分子是否使血漿中之總抗原濃度減少來確認。
本發明中，「血漿中總抗原濃度」，係指將抗原結合分子結合抗原與非結合抗原合計的濃度、或抗原結合分子非結合抗原之濃度「血漿中游離抗原濃度」。用於測定「血漿中總抗原濃度」或「血漿中游離抗原濃度」之各種方法在本說明書如以下記載，為該技術領域中周知。
本發明中，「天然型之人類IgG」，係指非修飾人類IgG，且不限於IgG之特定類別。又，「天然型之人類IgG」， 希望結合於EU編號297位之糖鏈係含岩藻糖之糖鏈。此意指只要人類IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4在pH酸性域能與人類FcRn結合，則可作為「天然型之人類IgG」使用。較佳為「天然型之人類IgG」為人類IgG1。
增加一分子之抗原結合分子能結合之抗原數目之方法
本發明提供增加一分子之抗原結合分子能結合之抗原數目之方法，包含以下步驟：使抗原結合分子在表現Fcγ受體之細胞中在活體內或活體外接觸細胞，該抗原結合分子包含：於pH酸性域條件下對於人類FcRn有結合活性且依離子濃度之條件對於抗原之結合活性會變化之抗原結合分域；及在pH中性域條件下對於Fcγ受體之結合活性比起結合於EU編號297位之糖鏈係含岩藻糖之糖鏈的天然型人類IgG之Fc區在pH中性域條件下對於Fcγ受體之結合活性高之Fcγ受體結合分域。
又，本發明提供增加一分子之抗原結合分子能結合之抗原數目之方法，包含以下步驟：使包含於pH酸性域條件下對於人類FcRn有結合活性且依離子濃度之條件對於抗原之結合活性會變化之抗原結合分域、及Fcγ受體結合分域的抗原結合分子，其Fcγ受體結合分域在pH中性域條件下對於Fcγ受體之結合活性比起結合於EU編號297位之糖鏈係含岩藻糖之糖鏈的天然型人類IgG之Fc區在pH中性域條件下對於Fcγ受體之結合 活性更為增強。
本發明中「一分子之抗原結合分子能結合之抗原之數目」，係指在直到抗原結合分子分解消失為止的期間能結合之抗原之數目。本發明中「使一分子之抗原結合分子能結合之抗原之數目增加」，係指增加已與抗原結合分子結合之抗原分子解離並再度結合於抗原分子之次數。結合於抗原結合分子之抗原分子，可為存在兩分子之反應系中存在的相同抗原分子，也可為相異之分子。亦即換言之，表示該反應系中抗原結合分子與抗原結合之延長次數。其他表達，有增加當以結合於抗原之抗原結合分子，以有抗原結合之抗原結合分子攝入細胞內並於內體內將抗原解離之後，抗原結合分子回到細胞外作為1個循環時，直到抗原結合分子分解並消失為止之期間能周轉的該循環的數目。pH中性域對於Fcγ受體有結合活性之本發明之抗原結合分子，結合於Fcγ受體後，會利用內吞作用而攝入該表現Fcγ受體之細胞之細胞內。在pH酸性域或低鈣離子濃度等離子濃度之條件從Fcγ受體游離之本發明之抗原結合分子，藉由在pH酸性域之條件結合於FcRn，而於細胞外再度再循環。在pH酸性域或低鈣離子濃度等離子濃度之條件，將抗原從抗原結合分子解離之後於細胞外再循環之本發明之抗原結合分子，能再度與抗原結合。因此循環數是否增加，可由是否前述「對於細胞內之攝入受促進」、或是否後述「藥物動態提高」來判斷。
使血漿中抗原消失之方法或抗原結合分子使抗原在血漿中 消失之能力增大之方法
本發明提供使血漿中抗原消失之方法，包含以下步驟：使抗原結合分子在表現Fcγ受體之細胞中在活體內或活體外接觸細胞，該抗原結合分子包含：於pH酸性域條件下對於人類FcRn有結合活性且依離子濃度之條件對於抗原之結合活性會變化之抗原結合分域；及在pH中性域條件下對於Fcγ受體之結合活性比起結合於EU編號297位之糖鏈係含岩藻糖之糖鏈的天然型人類IgG之Fc區在pH中性域條件下對於Fcγ受體之結合活性高之Fcγ受體結合分域。
又，本發明提供增加抗原結合分子使抗原在血漿中消失之能力增大之方法，包含以下步驟：使包含於pH酸性域條件下對於人類FcRn有結合活性且依離子濃度之條件對於抗原之結合活性會變化之抗原結合分域、及Fcγ受體結合分域的抗原結合分子，其Fcγ受體結合分域在pH中性域條件下對於Fcγ受體之結合活性比起結合於EU編號297位之糖鏈係含岩藻糖之糖鏈的天然型人類IgG之Fc區在pH中性域條件下對於Fcγ受體之結合活性更為增強。
本發明中，「使血漿中抗原消失能力增加之方法」，與「增加抗原結合分子使抗原從血漿中消失之能力之方法」為同義。
本發明中，「血漿中抗原消失能力」，係指抗原結合分子對活體內投予、或抗原結合分子在活體內分泌時，使血 漿中存在之抗原從血漿中消失之能力。因此，發明中，「增加抗原結合分子之血漿中抗原消失能力」，係指在投予抗原結合分子時，比起抗原結合分子在pH中性域對於Fcγ受體之結合活性增大，且此外在pH酸性域或低鈣離子濃度等離子濃度之條件之抗原結合活性比起在pH中性域或高鈣離子濃度之抗原結合活性降低之前，使抗原從血漿中消失之速度加快。抗原結合分子之血漿中抗原消失能力是否增加，例如可藉由測定將可溶型抗原與抗原結合分子對於活體內投予且投予後可溶型抗原在血漿中濃度來判斷。由於使抗原結合分子在pH中性域之條件下對於Fcγ受體之結合活性增大、或使其對於Fcγ受體之結合活性之增大以外，在pH酸性域或低鈣離子濃度等離子濃度之條件之抗原結合活性比起在pH中性域或高鈣離子濃度等離子濃度之條件之抗原結合活性下降時，以使可溶型抗原及抗原結合分子投予後可溶型抗原在血漿中之濃度有下降的情形，可判斷抗原結合分子之血漿中抗原消失能力有增加。可溶型抗原是目前有抗原結合分子結合之抗原(置於抗原-抗原結合分子複合體之狀態之抗原)，或未有抗原結合分子結合之抗原均可，其濃度可各作為「血漿中抗原結合分子結合抗原濃度」及「血漿中抗原結合分子非結合抗原濃度」(後者與「血漿中游離抗原濃度」同義)。「血漿中總抗原濃度」，係指將抗原結合分子結合抗原與抗原結合分子非結合抗原合計之濃度、或抗原結合分子非結合抗原濃度「血漿中游離抗原濃度」，所以可溶型抗原濃度可作為「血漿中總抗原 濃度」。測定「血漿中總抗原濃度」或「血漿中游離抗原濃度」之各種方法，在本說明書如以下記載，在該技術領域為周知。
改善抗原結合分子之藥物動態之方法
本發明提供改善抗原結合分子之藥物動態之方法，包含以下步驟：使抗原結合分子在表現Fcγ受體之細胞中在活體內或活體外接觸細胞，該抗原結合分子包含：於pH酸性域條件下對於人類FcRn有結合活性且依離子濃度之條件對於抗原之結合活性會變化之抗原結合分域；及在pH中性域條件下對於Fcγ受體之結合活性比起結合於EU編號297位之糖鏈係含岩藻糖之糖鏈的天然型人類IgG之Fc區在pH中性域條件下對於Fcγ受體之結合活性高之Fcγ受體結合分域。
又，本發明提供改善抗原結合分子之藥物動態之方法，包含以下步驟：使包含於pH酸性域條件下對於人類FcRn有結合活性且依離子濃度之條件對於抗原之結合活性會變化之抗原結合分域、及Fcγ受體結合分域的抗原結合分子，其Fcγ受體結合分域在pH中性域條件下對於Fcγ受體之結合活性比起結合於EU編號297位之糖鏈係含岩藻糖之糖鏈的天然型人類IgG之Fc區在pH中性域條件下對於Fcγ受體之結合活性更為增強。
本發明中，「藥物動態之提高」、「藥物動態之改善」、 及「優異的藥物動態」，可代換為「血漿中(血中)滯留性之提高」、「血漿中(血中)滯留性之改善」、「優異的血漿中(血中)滯留性」、「增長血漿中(血中)滯留性」，該等語句以相同含意使用。
本發明中「藥物動態改善」係指：包括從抗原結合分子投予到人類、或小鼠、大鼠、猴、兔、犬等非人類動物到從血漿中消失為止(例如在細胞內受分解等而成為抗原結合分子不能再回到血漿中的狀態為止)的時間延長，且包括從抗原結合分子投予到經分解消失為止之期間可結合於抗原之狀態(例如抗原結合分子未結合於抗原之狀態)在血漿中滯留之時間延長。天然型IgG，可結合於非人類動物來源之FcRn。例如，由於天然型人類IgG，比起對人類FcRn之結合，更能強力結合於小鼠FcRn(Int.Immunol.(2001)13(12),1551-1559)，所以為了確認本發明之抗原結合分子之特性，較佳為使用小鼠投予。就其他例，小鼠原本之FcRn基因有缺損且有關於人類FcRn基因之轉殖基因(transgene)並表現之小鼠(Methods Mol.Biol.(2010)602,93-104)，為了確認以下記載之本發明之抗原結合分子之特性，可使用作為進行投予之對象。具體而言「藥物動態改善」，也包括未結合於抗原之抗原結合分子(抗原非結合型抗原結合分子)分解消失為止的時間延長。即使抗原結合分子存在血漿中，該抗原結合分子已有抗原結合的情形，該抗原結合分子不能重新與抗原結合。所以抗原結合分子未結合於抗原之時間若加長，能重新與抗原結合之時 間延長(能重新與抗原之機會增多)、在活體內抗原未與抗原結合分子結合之時間可減少，抗原結合於抗原結合分子之時間可延長。若能利用抗原結合分子之投予加速抗原從血漿中消失，則抗原非結合型抗原結合分子之血漿中濃度增加，且抗原結合於抗原結合分子之時間延長。亦即，本發明中「抗原結合分子之藥物動態之改善」係包括：抗原非結合型抗原結合分子中之任一者之藥物動態參數之改善(血漿中半衰期之增加、平均血漿中滯留時間之增加、血漿中廓清率之下降中之任一者)、或抗原結合分子投予後抗原結合於抗原結合分子之時間延長、或加速利用抗原結合分子使抗原從血漿中消失。可藉由測定抗原結合分子或抗原非結合型抗原結合分子之血漿中半衰期、平均血漿中滯留時間、血漿中廓清率等中之任一者之參數(藥理動力學(pharmacokinetics)利用演習來理解(南山堂))而判斷。例如，將抗原結合分子對於小鼠、大鼠、猴、兔、犬、人類等投予時，測定抗原結合分子或抗原非結合型抗原結合分子之血漿中濃度並計算各參數，於血漿中半衰期延長或平均血漿中滯留時間延長之情形等，可謂抗原結合分子之藥物動態有改善。該等之參數可利用對該技術領域中具有通常知識者公知之方法測定，例如，使用藥物動態解析軟體WinNonlin(Pharsight)，依附帶的實驗步驟書進行無房室(Noncompartmental)解析可適當評價。未結合於抗原之抗原結合分子之血漿中濃度之測定，可用該技術領域中具有通常知識者公知之方法實施，例如使用在公知之方法 (Clin.Pharmacol.(2008)48(4),406-417)測定之方法。
本發明中「藥物動態改善」也包括抗原結合分子投予後抗原結合於抗原結合分子之時間延長。抗原結合分子投予後抗原結合於抗原結合分子之時間是否有延長，可藉由測定游離抗原之血漿中濃度，由游離抗原之血漿中濃度、或游離抗原濃度相對於總抗原濃度之比例開始上升的時間判斷。
未與抗原結合分子結合之游離抗原之血漿中濃度、或游離抗原濃度相對於總抗原濃度之比例，可依該技術領域中具有通常知識者公知之方法實施，例如可使用於Pharm.Res.(2006)23(1),95-103測定之方法。又，當抗原在活體內顯示某些機能的情形，抗原是否與中和抗原機能之抗原結合分子(拮抗劑分子)結合，也可藉由評價該抗原之機能是否已被中和來判斷。抗原之機能是否已被中和，可藉由測定反映抗原機能之某些活體內標記來評價。抗原是否與活化抗原機能之抗原結合分子(致效劑分子)結合，可藉由測定反映抗原機能之某些活體內標記來評價。
游離抗原之血漿中濃度之測定、血漿中之游離抗原量相對於血漿中之總抗原量之比例之測定、活體內標記之測定等測定不特別限定，宜於抗原結合分子投予經過一定時間後實施較佳。本發明中抗原結合分子投予經過一定時間後，係不特別限定，可視投予之抗原結合分子之性質等由該技術領域中具有通常知識者適時決定，例如在抗原結合分子投予後經過1日後、抗原結合分子投予後經過3日後、 抗原結合分子投予後經過7日後、抗原結合分子投予後經過14日後、抗原結合分子投予後經過28日後等。本發明中，「血漿中抗原濃度」係指：為抗原結合分子結合抗原與抗原結合分子非結合抗原合計濃度之「血漿中總抗原濃度」、或抗原結合分子非結合抗原濃度即「血漿中游離抗原濃度」中之任一者。
相較於投予含有結合於EU編號297位之糖鏈係含岩藻糖之糖鏈之天然型人類IgG Fc區作為Fcγ受體結合分域之參考抗原結合分子之情形、或相較於未投予含有本發明之抗原結合分域之抗原結合分子之情形，藉由本發明之抗原結合分子之投予，血漿中總抗原濃度能減少2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或更多。
抗原/抗原結合分子莫耳比可以下列所示算出：A值=在各時點之抗原之莫耳濃度
B值=在各時點之抗原結合分子之莫耳濃度
C值=在各時點之抗原結合分子之單位莫耳濃度之抗原之莫耳濃度(抗原/抗原結合分子莫耳比)
C=A/B。
C值較小係指：每一抗原結合分子之抗原消失效率較高，C值較大係指：每一抗原結合分子之抗原消失效率較低。
抗原/抗原結合分子莫耳比可如上所述算出。
相較於投予含有天然型人類IgG Fc區作為人類Fcγ受體結合分域之參考抗原結合分子之情形，藉由本發明之 抗原結合分子之投予，抗原/抗原結合分子莫耳比能減少2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或或更多。
本發明中，天然型人類IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4，較佳為就Fcγ受體結合活性或活體內之活性與抗原結合分子比較之參考天然型人類IgG之用途，作為天然型人類IgG。較佳為適當使用包含天然型人類IgG Fc區作為與目的抗原結合分子有相同抗原結合分域及Fcγ受體結合分域之參考抗原結合分子。更佳為，天然型人類IgG1，使用在就Fcγ受體結合活性或活體內之活性與抗原結合分子比較之參考天然型人類IgG用途。又，本發明中，與本發明之抗原結合分子比較之參考抗原結合分子，也可因應目的視需要適當使用包含對於抗原之結合活性不會依離子濃度變化之抗原結合分域之抗原結合分子、包含於pH酸性域之條件下對於FcRn之結合活性未增強之FcRn結合分域之抗原結合分子、或含對於Fcγ受體無選擇性結合活性之Fcγ受體結合分域之抗原結合分子等。
血漿中總抗原濃度或抗原/抗體莫耳比之減少，可依實施例6、8及13記載評價。更具體而言，抗原結合分子與小鼠配對物抗原無交叉反應的情形，可使用人類FcRn基因轉殖小鼠系統32或系統276(Jackson Laboratories,Methods Mol Biol.2010；602：93-104)，以抗原抗體同時投予模型或不變狀態抗原注入模型中之任一者評價。抗原結合分子與小鼠配對物有交叉反應的情形，可藉由單將 抗原結合分子對於人類FcRn基因轉殖小鼠系統32或系統276(Jackson Laboratories)投予以評價。同時投予模型中，係將抗原結合分子與抗原之混合物對於小鼠投予。不變狀態抗原注入模型中，為了達到一定的血漿中抗原濃度，係在小鼠埋入填充有抗原溶液之注入泵，然後將抗原結合分子對於小鼠投予。試驗抗原結合分子以相同用量投予。血漿中總抗原濃度、血漿中游離抗原濃度、及血漿中抗原結合分子濃度，使用該技術領域中具有通常知識者公知之方法在適當時點測定。
評價對於Fcγ受體有選擇性的結合活性之Fcγ受體結合分域之影響之情形中，血漿中總抗原濃度或抗原/抗體莫耳比之減少，當抗原結合分子與小鼠配對物抗原無交叉反應的情形，也可使用通常使用之C57BL/6J小鼠(Charles River Japan)，依抗原抗體同時注射模型或不變狀態抗原注入模型中之任一者評價。抗原結合分子與小鼠配對物有交叉反應的情形，也可單注射抗原結合分子到通常使用之C57BL/6J小鼠(Charles River Japan)以評價。
投予2日後、4日後、7日後、14日後、28日後、56日後、或84日後，測定血漿中之總抗原濃度或游離抗原濃度及抗原/抗原結合分子莫耳比，可評價本發明之長期效果。換言之，為了評價本發明之抗原結合分子之特性，可藉由測定抗原結合分子投予2日後、4日後、7日後、14日後、28日後、56日後、或84日後血漿中之總抗原濃度或游離抗原濃度及抗原/抗原結合分子莫耳比而決定長期 間之血漿中抗原濃度。依本發明記載之抗原結合分子是否達成血漿中抗原濃度或抗原/抗原結合分子莫耳比之減少，可依先前記載之在任意之一或多數時點評價其減少以決定。
投予15分鐘後、1小時後、2小時後、4小時後、8小時後、12小時後、或24小時後，測定血漿中之總抗原濃度或游離抗原濃度及抗原/抗原結合分子莫耳比可評價本發明之短期效果。換言之，為了評價本發明之抗原結合分子之特性，可藉由抗原結合分子之投予15分鐘後、1小時後、2小時後、4小時後、8小時後、12小時後、或24小時後測定血漿中之總抗原濃度或游離抗原濃度及抗原/抗原結合分子莫耳比而決定在短期間之血漿中抗原濃度。
本發明之抗原結合分子之投予路徑，可從皮內注射、靜脈內注射、玻璃體內注射、皮下注射、腹腔內注射、非經口注射、及肌肉內注射選擇。
本發明中，人類之藥物動態改善較佳。難以測定在人類之血漿中滯留性的情形，可依據小鼠(例如，正常小鼠、人類抗原表現基因轉殖小鼠、人類FcRn表現基因轉殖小鼠、等)或猴(例如，食蟹猴等)之血漿中滯留性預測在人類之血漿中滯留性。
促進在細胞外結合於抗原結合分子之抗原在細胞內從抗原結合分子解離之方法
本發明提供促進在細胞外結合於抗原結合分子之抗原在細胞內從抗原結合分子解離之方法，包含以下步驟： 使抗原結合分子在表現Fcγ受體之細胞中在活體內或活體外接觸細胞，該抗原結合分子包含：於pH酸性域條件下對於人類FcRn有結合活性且依離子濃度之條件對於抗原之結合活性會變化之抗原結合分域；及在pH中性域條件下對於Fcγ受體之結合活性比起結合於EU編號297位之糖鏈係含岩藻糖之糖鏈的天然型人類IgG之Fc區在pH中性域條件下對於Fcγ受體之結合活性高之Fcγ受體結合分域。
又，本發明提供促進在細胞外結合於抗原結合分子之抗原在細胞內從抗原結合分子解離之方法，包含以下步驟：使包含於pH酸性域條件下對於人類FcRn有結合活性且依離子濃度之條件對於抗原之結合活性會變化之抗原結合分域、及Fcγ受體結合分域的抗原結合分子，其Fcγ受體結合分域在pH中性域條件下對於Fcγ受體之結合活性比起結合於EU編號297位之糖鏈係含岩藻糖之糖鏈的天然型人類IgG之Fc區在pH中性域條件下對於Fcγ受體之結合活性更為增強。
本發明中抗原從抗原結合分子解離之處只要是在細胞內即可，可為任一處，但較佳為早期內體內。本發明中，「在細胞外結合於抗原結合分子之抗原在細胞內從抗原結合分子解離」，並不需要使結合於抗原結合分子而攝入細胞內之抗原全部在細胞內從抗原結合分子解離，只要比起抗原結合分子在pH酸性域或低鈣離子濃度等離子濃度之條件之抗原結合活性低於在pH中性域或高鈣離子濃度等離子濃 度之條件之抗原結合活性，而且在pH中性域對於Fcγ受體之結合活性提高之前，在細胞內從抗原結合分子解離之抗原之比例增高即可。又，促進在細胞外結合於抗原結合分子之抗原在細胞內從抗原結合分子解離之方法，也可稱為對於抗原結合分子賦予容易促進與抗原結合之抗原結合分子攝入細胞內、在細胞內從抗原結合分子使抗原解離之性質的方法。
促進未與抗原結合之狀態之抗原結合分子釋放到細胞外之方法
本發明提供促進未與抗原結合之狀態之抗原結合分子釋放到細胞外之方法，包含以下步驟：使抗原結合分子在表現Fcγ受體之細胞中在活體內或活體外接觸細胞，該抗原結合分子包含：於pH酸性域條件下對於人類FcRn有結合活性且依離子濃度之條件對於抗原之結合活性會變化之抗原結合分域；及在pH中性域條件下對於Fcγ受體之結合活性比起結合於EU編號297位之糖鏈係含岩藻糖之糖鏈的天然型人類IgG之Fc區在pH中性域條件下對於Fcγ受體之結合活性高之Fcγ受體結合分域。
又，本發明促進未與抗原結合之狀態之抗原結合分子釋放到細胞外之方法，包含以下步驟：使包含於pH酸性域條件下對於人類FcRn有結合活性且依離子濃度之條件對於抗原之結合活性會變化之抗原結合分 域、及Fcγ受體結合分域的抗原結合分子，其Fcγ受體結合分域在pH中性域條件下對於Fcγ受體之結合活性比起結合於EU編號297位之糖鏈係含岩藻糖之糖鏈的天然型人類IgG之Fc區在pH中性域條件下對於Fcγ受體之結合活性更為增強。
本發明中，「以結合於抗原之狀態攝入細胞內之抗原結合分子以未與抗原結合之狀態釋放到細胞外」，並不需要以結合於抗原之狀態攝入細胞內之抗原結合分子全部以未與抗原結合之狀態釋放到細胞外，只要比起抗原結合分子在pH酸性域或低鈣離子濃度等離子濃度之條件之抗原結合活性低於在pH中性域或高鈣離子濃度等離子濃度之條件之抗原結合活性，且在pH中性域對於Fcγ受體之結合活性提高前，以未結合於抗原之狀態釋放到細胞外之抗原結合分子之比例增高即可。釋放到細胞外之抗原結合分子，宜維持抗原結合活性較佳。又，促進以結合於抗原之狀態攝入細胞內之抗原結合分子以未與抗原結合之狀態釋放到細胞外之方法，也可稱為對於抗原結合分子賦予容易促進與抗原結合之抗原結合分子攝入到細胞內，並促進抗原結合分子以未結合於抗原之狀態釋放到細胞外之性質之方法。減少血漿中之總抗原濃度或游離抗原濃度之方法或能減少血漿中之總抗原濃度或游離抗原濃度之抗原結合分子之改變方法
本發明提供使血漿中之總抗原濃度或游離抗原濃度減少之方法 ，包含以下步驟：使抗原結合分子在表現Fcγ受體之細胞中在活體內或活體外接觸細胞，該抗原結合分子包含：於pH酸性域條件下對於人類FcRn有結合活性且依離子濃度之條件對於抗原之結合活性會變化之抗原結合分域；及在pH中性域條件下對於Fcγ受體之結合活性比起結合於EU編號297位之糖鏈係含岩藻糖之糖鏈的天然型人類IgG之Fc區在pH中性域條件下對於Fcγ受體之結合活性高之Fcγ受體結合分域。
又，本發明提供能使血漿中之總抗原濃度或游離抗原濃度減少之抗原結合分子之改變方法，包含以下步驟：使包含於pH酸性域條件下對於人類FcRn有結合活性且依離子濃度之條件對於抗原之結合活性會變化之抗原結合分域、及Fcγ受體結合分域的抗原結合分子，其Fcγ受體結合分域在pH中性域條件下對於Fcγ受體之結合活性比起結合於EU編號297位之糖鏈係含岩藻糖之糖鏈的天然型人類IgG之Fc區在pH中性域條件下對於Fcγ受體之結合活性更為增強。
評價血漿中之總抗原濃度或游離抗原濃度之減少之方法，記載於前述改善抗原結合分子之藥物動態之方法之項目。
用以使該抗原從血漿中消失之在活體外(ex vivo)之方法
依本發明提供之用以使該抗原從血漿中消失之方法中，抗原結合分子之使用之一非限定態樣，包括使從對象 單離之血漿接觸本發明之抗原結合分子而形成之免疫複合體，接觸表現FcRn及Fcγ受體之細胞。用於使該抗原從血漿中消失之所謂在活體外(ex vivo)之方法中，也例示該抗原結合分子之使用。替代/或組合將抗原結合分子對於活體內之方法，藉由將包含抗原結合分子及結合於抗原結合分子之抗原之血漿先取出到活體外後，再接觸表現FcRn及Fcγ受體之細胞，經過一定期間使細胞外再循環(也稱為再分泌或再循環)之包含未與抗原結合之抗原結合分子之血漿回到活體內之所謂在活體外(ex vivo)之方法，也可促進抗原在血漿中之消失速度。
又，依本發明提供之用以使該抗原從血漿中消失之方法中，抗原結合分子之使用之一非限定態樣，可列舉包括使從投予本發明之抗原結合分子之對象單離之血漿中所存在之免疫複合體接觸表現FcRn及Fcγ受體之細胞之使該抗原從血漿中消失之所謂在活體外(ex vivo)之方法中，使用該抗原結合分子之用途。
該抗原是否從血漿消失，可藉由評價前述抗原在血漿中之消失速度，將本發明之抗原結合分子替換為包含對於抗原之結合活性不會依離子濃度變化之抗原結合分域之抗原結合分子、包含在pH酸性域之條件下對於FcRn之結合活性未增強之FcRn結合分域之抗原結合分子、或包含對於Fcγ受體未有選擇的結合活性之Fcγ受體結合分域之抗原結合分子作為對照進行比較時是否有促進等以確認。
抗原結合分子之製造方法
又，本發明提供一種抗原結合分子之製造方法，該抗原結合分子包含：在pH酸性域之條件下對於人類FcRn有結合活性且依離子濃度之條件對於抗原之結合活性會變化之抗原結合分域；及在pH中性域之條件下對於Fcγ受體之結合活性比起結合於EU編號297位之糖鏈係含岩藻糖之糖鏈之天然型Fcγ受體結合分域對於Fcγ受體之結合活性高之Fcγ受體結合分域。
亦即本發明包含以下(a)~(f)之步驟：(a)獲得在高鈣離子濃度之條件下抗原結合分域對於抗原之結合活性；(b)獲得在低鈣離子濃度之條件下抗原結合分域對於抗原之結合活性；(c)選擇在(a)獲得之抗原結合活性高於在(b)獲得之抗原結合活性的抗原結合分域；(d)將編碼為於(c)選擇之抗原結合分域之聚核苷酸，連結於編碼為於pH酸性域條件下對於人類FcRn有結合活性且於pH中性域條件下對於Fcγ受體之結合活性比起結合於EU編號297位之糖鏈為含岩藻糖之糖鏈之天然型人類IgG之Fc區對於Fcγ受體之結合活性為高之Fcγ受體結合分域的聚核苷酸；(e)培養導入有於(d)獲得之聚核苷酸以能作用地連結的載體的細胞；及(f)從於(e)培養之細胞之培養液回收抗原結合分子。
又，本發明提供抗原結合分子之製造方法，包含以下 (a)~(f)之步驟：(a)獲得在高鈣離子濃度之條件下抗體對於抗原之結合活性；(b)獲得在低鈣離子濃度之條件下抗體對於抗原之結合活性；(c)選擇在(a)獲得之抗原結合活性高於在(b)獲得之抗原結合活性的抗體；(d)將編碼為於(c)選擇之抗體之抗原結合分域之聚核苷酸，連結於編碼為於pH酸性域條件下對於人類FcRn有結合活性且於pH中性域條件下對於Fcγ受體之結合活性比起結合於EU編號297位之糖鏈為含岩藻糖之糖鏈之天然型人類IgG之Fc區對於Fcγ受體之結合活性為高之Fcγ受體結合分域的聚核苷酸；(e)培養導入有於(d)獲得之聚核苷酸以能作用地連結的載體的細胞；及(f)從於(e)培養之細胞之培養液回收抗原結合分子。
又，本發明提供抗原結合分子之製造方法，包含以下(a)~(f)之步驟：(a)獲得於pH中性域之條件之抗原結合分域對於抗原之結合活性；(b)獲得於pH酸性域之條件之抗原結合分域對於抗原之結合活性；(c)選擇在(a)獲得之抗原結合活性高於在(b)獲得之抗原結合活性的抗原結合分域； (d)將編碼為於(c)選擇之抗原結合分域之聚核苷酸，連結於編碼為於pH酸性域條件下對於人類FcRn有結合活性且於pH中性域條件下對於Fcγ受體之結合活性比起結合於EU編號297位之糖鏈為含岩藻糖之糖鏈之天然型人類IgG之Fc區對於Fcγ受體之結合活性為高之Fcγ受體結合分域的聚核苷酸；(e)培養導入有於(d)獲得之聚核苷酸以能作用地連結的載體的細胞；及(f)從於(e)培養之細胞之培養液回收抗原結合分子。
此外，本發明提供抗原結合分子之製造方法，包含以下(a)~(f)之步驟：(a)獲得於pH中性域之條件之抗體對於抗原之結合活性；(b)獲得於pH酸性域之條件之抗體對於抗原之結合活性；(c)選擇在(a)獲得之抗原結合活性高於在(b)獲得之抗原結合活性的抗體；(d)將編碼為於(c)選擇之抗體之抗原結合分域之聚核苷酸，連結於編碼為於pH酸性域條件下對於人類FcRn有結合活性且於pH中性域條件下對於Fcγ受體之結合活性比起結合於EU編號297位之糖鏈為含岩藻糖之糖鏈之天然型人類IgG之Fc區對於Fcγ受體之結合活性為高之Fcγ受體結合分域的聚核苷酸；(e)培養導入有於(d)獲得之聚核苷酸以能作用地連結的載體的細胞；及(f)從於(e)培養之細胞之培養液回收抗原結合分子。
「細胞」、「細胞系」及「細胞培養」在本說明書以相同含意使用，如此之稱呼可包括細胞或細胞系的所有子孫。如此，例如「轉形」及「轉形細胞」之用語，無論繼代數，包括由此等而來之一次對象細胞及培養物。又，可理解由於故意或偶發的突變，並非所有子孫中的DNA的內容正確地為相同。也可包括以當初之轉形細胞篩選之實質上有相同機能或生物學的活性之變異體之子孫。當記載為相異之名稱時，從該記載之前後關係，可明白如此之意圖。
提及編碼序列之表現之情形，控制序列係指為了能在特定寄主生物作用地連結之編碼序列之表現所必要之DNA鹼基序列。例如原核生物之理想控制序列，包括起動子、視情形之操作子序列、核糖體結合部位、及可能尚未非常了解的其他序列。為了在真核細胞表現編碼序列，利用起動子、聚腺苷化信號及增強子係為公知。
關於核酸「可作用地連結」，係指該核酸與其他核酸序列在機能方面有關係。例如，前驅序列(presequence)或分泌前導的DNA，當就某多胜肽之分泌以前驅體蛋白質的形式表現的情形，與該多胜肽之DNA以可作動地結合。起動子或增強子，在其影響某編碼序列之轉錄的情形，與其序列以可作用地連結。或核糖體結合部，在位於其容易轉譯的位置的情形，以可作用地與編碼序列連結。通常，「可作用地連結」，係指結合之DNA序列連續，且為分泌前導的情形，連續且位於讀取框內。但增強子不需連續。連結可藉由以適當的限制部位接合而達成。不存在如此之部位之情 形，合成寡核苷酸適應子(adaptor)或連結子可依習知的慣用方式使用。又，依前述Overlap Extension PCR之方法也可製作連結的核酸。
「接合」係在2個核酸片段之間形成磷酸二酯鍵之方法。為了將2個片段接合，必需使片段的末端彼此搭配。視情形，該末端在核酸內切酶消化之後立即可有搭配性。但為了適於接合，首先在核酸內切酶消化之後需將一般形成之附著末端改為平滑末端。為了成為平滑末端，將DNA於適當緩衝液中於15℃、於4種去氧核糖核苷酸三磷酸之存在下，以DNA聚合酶I或T4DNA聚合酶之Klenow片段的約10單位處理至少15分鐘。其次將DNA以酚氯仿萃取與乙醇沉澱、或二氧化矽精製精製。待連結之DNA片段係以等莫耳量加到溶液中。在該溶液中，加入ATP、接合酶緩衝液，以外，如T4DNA接合酶之接合酶係就DNA0.5μg含有約10單位。將DNA連結到載體的情形，載體首先由適當的限制核酸內切酶以消化作用使成線狀。成為線狀之片段其次以細菌之鹼性磷解酶或小牛腸管之磷解酶處理，而預防在接合之步驟之間之該片段自行接合。
本發明之製造方法中，將由上述「離子濃度之條件」之項目說明之方法選擇之比起在高鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性，在低鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性較高之抗原結合分域或抗體予以單離。又，將由上述「離子濃度之條件」之項目說明之方法選擇之比起在pH酸性域之條件對於抗原之結合活性，在pH中性域之條件對於 抗原之結合活性較高之抗原結合分域或抗體單離。例如以此方式單離之抗原結合分域係從庫選出的情形，係依後述實施例所記載，將編碼為該抗原結合分域之聚核苷酸利用從噬菌體等病毒依通常之基因放大而單離。又，當如此之經單離之抗原結合分域或抗體係從融合瘤等細胞之培養液選出的情形，如前述抗體之項目所示，係從該細胞將抗體基因等依通常之基因放大單離。
其次，將依上述記載單離之編碼為抗原結合分域之聚核苷酸，以同一讀框連結於編碼為在pH酸性域對於人類FcRn有結合活性且在pH中性域之條件下對於Fcγ受體之結合活性比起結合於EU編號297位之糖鏈係含岩藻糖之糖鏈之天然型Fcγ受體結合分域對於Fcγ受體之結合活性高之Fcγ受體結合分域之聚核苷酸。如前述之Fcγ受體結合分域之項目所記載，Fcγ受體結合分域之理想例，可舉抗體之Fc區。又，作為Fcγ受體，可舉FcγRIa、FcγRIIa(R)、FcγRIIa(H)、FcγRIIb或FcγRIIIa(V)、FcγRIIIa(F)中之任一者。
作為抗體之Fc區，例如在Fc區之以EU編號表示之部位當中，從221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、243位、244位、245位、246位、247位、249位、250位、251位、254位、255位、256位、258位、260位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270 位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、339位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位及440位之群選出之至少1個以上之胺基酸與天然型Fc區之對應部位之胺基酸不同之Fc區為理想例。天然型Fc區以IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中之任一者之Fc區為理想例。
又，一非限定態樣中，作為抗體之Fc區，例如包含Fc區之EU編號表示之；221位之胺基酸為Lys或Tyr中之任一者、222位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中之任一者、223位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Lys中之任一者、224位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中之任一者、225位之胺基酸為Glu、Lys或Trp中之任一者、227位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、228位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、230位之胺基酸為Ala、Glu、Gly或Tyr中之任一者、 231位之胺基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中之任一者、232位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、233位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、234位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、235位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、236位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、237位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、238位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、239位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、240位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、 241位之胺基酸為Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中之任一者、243位之胺基酸為Leu、Glu、Leu、Gln、Arg、Trp或Tyr中之任一者、244位之胺基酸為His、245位之胺基酸為Ala、246位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、247位之胺基酸為Ala、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Thr、Val或Tyr中之任一者、249位之胺基酸為Glu、His、Gln或Tyr中之任一者、250位之胺基酸為Glu或Gln中之任一者、251位之胺基酸為Phe、254位之胺基酸為Phe、Met或Tyr中之任一者、255位之胺基酸為Glu、Leu或Tyr中之任一者、256位之胺基酸為Ala、Met或Pro中之任一者、258位之胺基酸為Asp、Glu、His、Ser或Tyr中之任一者、260位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、262位之胺基酸為Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中之任一者、263位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、264位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、265位之胺基酸為Ala、Leu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或 Tyr中之任一者、266位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、267位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、268位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Trp中之任一者、269位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、270位之胺基酸為Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、271位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、272位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、273位之胺基酸為Phe或Ile中之任一者、274位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、275位之胺基酸為Leu或Trp中之任一者、276位之胺基酸為、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、278位之胺基酸為Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、 Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中之任一者、279位之胺基酸為Ala、280位之胺基酸為Ala、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gln、Trp或Tyr中之任一者、281位之胺基酸為Asp、Lys、Pro或Tyr中之任一者、282位之胺基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中之任一者、283位之胺基酸為Ala、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg或Tyr中之任一者、284位之胺基酸為Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中之任一者、285位之胺基酸為Asp、Glu、Lys、Gln、Trp或Tyr中之任一者、286位之胺基酸為Glu、Gly、Pro或Tyr中之任一者、288位之胺基酸為Asn、Asp、Glu或Tyr中之任一者、290位之胺基酸為Asp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、291位之胺基酸為Asp、Glu、Gly、His、Ile、Gln或Thr中之任一者、292位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中之任一者、293位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、294位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、 295位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、296位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr或Val中之任一者、297位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、298位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、299位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中之任一者、300位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中之任一者、301位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、302位之胺基酸為Ile、303位之胺基酸為Asp、Gly或Tyr中之任一者、304位之胺基酸為Asp、His、Leu、Asn或Thr中之任一者、305位之胺基酸為Glu、Ile、Thr或Tyr中之任一者、311位之胺基酸為Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中之任一者、313位之胺基酸為Phe、 315位之胺基酸為Leu、317位之胺基酸為Glu或Gln、318位之胺基酸為His、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Tyr中之任一者、320位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、322位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、323位之胺基酸為Ile、324位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、325位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、326位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、327位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、328位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、329位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr 中之任一者、330位之胺基酸為Cys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、331位之胺基酸為Asp、Phe、His、Ile、Leu、Met、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、332位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、333位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Ser、Thr、Val或Tyr中之任一者、334位之胺基酸為Ala、Glu、Phe、Ile、Leu、Pro或Thr中之任一者、335位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中之任一者、336位之胺基酸為Glu、Lys或Tyr中之任一者、337位之胺基酸為Glu、His或Asn中之任一者、339位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser或Thr中之任一者、376位之胺基酸為Ala或Val中之任一者、377位之胺基酸為Gly或Lys中之任一者、378位之胺基酸為Asp、379位之胺基酸為Asn、380位之胺基酸為Ala、Asn或Ser中之任一者、 382位之胺基酸為Ala或Ile中之任一者、385位之胺基酸為Glu、392位之胺基酸為Thr、396位之胺基酸為Leu、421位之胺基酸為Lys、427位之胺基酸為Asn、428位之胺基酸為Phe或Leu中之任一者、429位之胺基酸為Met、434位之胺基酸為Trp、436位之胺基酸為Ile、及440位之胺基酸為Gly、His、Ile、Leu或Tyr中之任一者、之群選出之至少1個以上的胺基酸之Fc區為理想例。
又，本發明之Fc區可理想地使用在pH酸性域之條件下對FcRn有結合活性或增強之Fc區。如此之Fc區，可列舉IgG型免疫球蛋白之Fc區，例如人類IgG(IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4、及此等之變異體)之Fc區。改變為其他胺基酸之變異體，只要在pH酸性域對FcRn有結合活性或在pH酸性域之條件下對於人類FcRn之結合活性提高即可，可使用任一位置之胺基酸經改變之Fc區，但抗原結合分子含有人類IgG1之Fc區作為Fc區之情形，包括能帶來在pH酸性域之條件下對於FcRn之結合比起人類IgG1之初始Fc區之結合活性更增強之效果之改變較佳。可為如此之改變之胺基酸，例如，WO2000/042072所記載，EU編號表示之238位、252位、253位、254位、255位、256位、265 位、272位、286位、288位、303位、305位、307位、309位、311位、312位、317位、340位、356位、360位、362位、376位、378位、380位、382位、386位、388位、400位、413位、415位、424位、433位、434位、435位、436位、439位及/或447位之胺基酸為理想例。同樣地，可為如此之改變之胺基酸，例如WO2002/060919所記載，EU編號表示之251位、252位、254位、255位、256位、308位、309位、311位、312位、385位、386位、387位、389位、428位、433位、434位及/或436位之胺基酸亦為理想例。又，可為如此之改變之胺基酸，WO2004/092219所記載之EU編號表示之250位、314位及428位之胺基酸亦為理想例。又，可為如此之改變之胺基酸，例如WO2010/045193所記載、EU編號表示之251位、252位、307位、308位、378位、428位、430位、434位及/或436位之胺基酸亦為理想例。利用該等胺基酸之改變，可將IgG型免疫球蛋白之Fc區在pH酸性域對於FcRn之結合有增強之Fc區使用在本發明之製造方法。
又，如後述，本發明之抗原結合分子所含之Fc區，也可理想地使用在pH中性域對FcRn有結合活性之Fc區。依據取得前述在pH酸性域對FcRn有結合活性之Fc區之方法，如此之Fc區能依任一方法取得，但具體而言，可藉由作為初始Fc區使用之人類IgG型免疫球蛋白之Fc區之胺基酸之改變，取得包含在pH中性域對FcRn有結合活性或增強之FcRn結合分域之Fc區。用於改變之理想IgG型免 疫球蛋白之Fc區，例如人類IgG(IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4、及此等之變異體)之Fc區。改變為其他胺基酸之改變，只要在pH中性域對FcRn有結合活性或在中性域對人類FcRn之結合活性提高即可，可使用任一位置之胺基酸有改變之Fc區。抗原結合分子含有人類IgG1之Fc區作為Fc區之情形，宜包含帶來在pH中性域對FcRn之結合比起人類IgG1之初始Fc區之結合活性更增強之效果之改變較佳。如此之經改變之Fc區，例如，人類Fc區在初始Fc區之以EU編號表示之部位當中，從237位、238位、239位、248位、250位、252位、254位、255位、256位、257位、258位、265位、270位、286位、289位、297位、298位、303位、305位、307位、308位、309位、311位、312位、314位、315位、317位、325位、332位、334位、360位、376位、380位、382位、384位、385位、386位、387位、389位、424位、428位、433位、434位、及436位之群選出之至少1個以上之胺基酸與天然型Fc區之對應胺基酸為相異之Fc區為理想例。
又，如此之經改變之Fc區，例如，包含Fc區之EU編號表示之從；237位之胺基酸為Met、238位之胺基酸為Ala、239位之胺基酸為Lys、248位之胺基酸為Ile、250位之胺基酸為Ala、Phe、Ile、Met、Gln、Ser、 Val、Trp、或Tyr中之任一者、252位之胺基酸為Phe、Trp、或Tyr中之任一者、254位之胺基酸為Thr、255位之胺基酸為Glu、256位之胺基酸為Asp、Glu、或Gln中之任一者、257位之胺基酸為Ala、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Ser、Thr、或Val中之任一者、258位之胺基酸為His、265位之胺基酸為Ala、270位之胺基酸為Phe、286位之胺基酸為Ala或Glu中之任一者、289位之胺基酸為His、297位之胺基酸為Ala、298位之胺基酸為Gly、303位之胺基酸為Ala、305位之胺基酸為Ala、307位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp、或Tyr中之任一者、308位之胺基酸為Ala、Phe、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、或Thr中之任一者、309位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Pro、或Arg中之任一者、311位之胺基酸為Ala、His、或Ile中之任一者、 312位之胺基酸為Ala或His中之任一者、314位之胺基酸為Lys或Arg中之任一者、315位之胺基酸為Ala或His中之任一者、317位之胺基酸為Ala、325位之胺基酸為Gly、332位之胺基酸為Val、334位之胺基酸為Leu、360位之胺基酸為His、376位之胺基酸為Ala、380位之胺基酸為Ala、382位之胺基酸為Ala、384位之胺基酸為Ala、385位之胺基酸為Asp或His中之任一者、386位之胺基酸為Pro、387位之胺基酸為Glu、389位之胺基酸為Ala或Ser中之任一者、424位之胺基酸為Ala、428位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中之任一者、433位之胺基酸為Lys、434位之胺基酸為Ala、Phe、His、Ser、Trp、或Tyr中之任一者436位之胺基酸為His、 之群選出之至少1個胺基酸之Fc區為理想例。
例如藉由將該等之胺基酸之改變單獨、或組合多數使用，可增強IgG之Fc區在pH酸性域及/或在中性域對於FcRn之結合，但導入之胺基酸改變不特別限定，只要能帶來改善血漿中滯留性之效果即可，可導入任何胺基酸改變。
從以上述所記載連結之編碼為抗原結合分域之聚核苷酸及編碼為在pH酸性域對於人類FcRn有結合活性且在pH中性域之條件下對於Fcγ受體之結合活性高於結合於EU編號297位之糖鏈係含岩藻糖之糖鏈之天然型Fcγ受體結合分域對於Fcγ受體之結合活性之Fcγ受體結合分域之聚核苷酸，以可作用地連結之所望之表現載體轉形之細胞之培養液，將本發明之抗原結合分子單離。使用依上述抗體之項目記載之抗體之製造方法之方法，可製造本發明之抗原結合分子。
又，本說明書引用之所有先前技術文獻，納入於本說明書作為參考。
以下將本發明以實施例更具體說明，但本發明不受該等實施例限制。
【實施例】 (實施例1)在pH中性域之條件下對小鼠FcγR之結合活性高於天然型人類IgG之Fc區之結合活性之抗原結合分子之製作 (1-1)關於pH依存性人類IL-6受體結合抗體
WO2009/125825記載之由H54-IgG1(序列編號：36)與 L28-CK(序列編號：37)構成之H54/L28-IgG1為人類化抗IL-6受體抗體，且由VH3-IgG1(序列編號：38)與VL3-CK(序列編號：39)構成之Fv4-IgG1，係賦予了對於H54/L28-IgG1以pH依存性結合於可溶型人類IL-6受體之特性(在pH7.4結合，並在pH5.8解離)之人類化抗IL-6受體抗體。在WO2009/125825記載之小鼠之體內試驗中，相較於投予H54/L28-IgG1與為抗原之可溶型人類IL-6受體之混合物之群，投予Fv4-IgGI與為抗原之可溶型人類IL-6受體之混合物之群中，顯示可溶型人類IL-6受體從血漿中之消失大幅加快。
結合於可溶型人類IL-6受體之抗體亦即與H54/L28-IgG1結合之可溶型人類IL-6受體，會與抗體一起由FcRn而於血漿中再循環，相對於此，以pH依存性地結合於可溶型人類IL-6受體之抗體Fv4-IgG1，在內體內之酸性條件下會將與抗體結合之可溶型人類IL-6受體解離。已解離之可溶型人類IL-6受體會由溶體分解，所以可大幅加快可溶型人類IL-6受體之消失，且以pH依存性地結合於可溶型人類IL-6受體之抗體Fv4-IgG1，在內體內與FcRn結合之後會於血漿中再循環。經再循環之該抗體能再次與可溶型人類IL-6受體結合，所以可重複對於抗原(可溶型人類IL-6受體)之結合及以FcRn在血漿中再循環。其結果，據認為1個抗體分子能重複多次與可溶型人類IL-6受體結合(WO2009/125825)。
(1-2)對於小鼠FcγR之結合增強之抗人類IL-6受體抗體 及對於小鼠FcγR不結合之抗人類IL-6受體抗體之製作
作為對於小鼠FcγR之結合增強之抗原結合分子，製作VH3-IgG1之EU編號表示之326位之Lys取代為Asp、EU編號表示之328位之Leu取代為Tyr之VH3-IgG1-F1022(序列編號：40)。使用參考實施例2之方法，製作包含VH3-IgG1-F1022作為重鏈，包含VL3-CK作為輕鏈之Fv4-IgG1-F1022。
另一方面作為對於小鼠FcγR不結合之抗原結合分子，製作VH3-IgG1之EU編號表示之235位之Leu取代為Arg、239位之Ser取代為Lys之VH3-IgG1-F760(序列編號：41)。使用參考實施例2之方法，製作包含VH3-IgG1-F760作為重鏈、包含VL3-CK作為輕鏈之Fv4-IgG1-F760。
(1-3)對小鼠FcγR之結合活性之確認
包含VH3-IgG1、VH3-IgG1-F1022及VH3-IgG1-F760作為重鏈、包含L(WT)-CK(序列編號：42)作為輕鏈之VH3/L(WT)-IgG1、VH3/L(WT)-IgG1-F1022及VH3/L(WT)-IgG1-F760，係依參考實施例2之方法製作。如以下方式，將該等之抗體對於小鼠FcγR之結合以動力理論解析。
(1-4)對於小鼠FcγR之結合之動力理論解析
使用Biacore T100或T200(GE Healthcare)，將小鼠FcγRI、FcγRIIb、FcγRIII、FcγRIV(參考實施例26中製備)(以下稱為小鼠FcγRs)與抗體之結合以動力理論解 析。使以胺偶聯法在感測晶片CM4(GE Healthcare)上固定有適當量之protein L(ACTIGEN)捕捉目的抗體。其次注入小鼠FcγRs之稀釋液及為空白之運行緩衝液，使捕捉於感應晶片上之抗體與小鼠FcγRs交互作用。運行緩衝液可使用20 mmol/L ACES、150 mmol/L NaCl、0.05%(w/v)Tween20、pH7.4，小鼠FcγRs稀釋時也使用該緩衝液。感應晶片之再生係使用10 mmol/L Glycine-HCl,pH1.5。測定均在25℃實施。從測定得到的感測圖，計算為動力學參數之結合速度常數ka(1/Ms)、及解離速度常數kd(1/s)。依該等之值，計算各抗體對於人類FcγR之KD(M)。各參數之計算，係使用Biacore T100或T200 Evaluation軟體(GE Healthcare)。
其結果，獲得表7所示之測定結果。VH3/L(WT)-IgG1-F1022，相較於VH3/L(WT)-IgG1，顯示對mFcγRI、mFcγRIIb及mFcγRIII之結合活性增強。另一方面，VH3/L(WT)-IgG1-F760對於各種小鼠FcγR未檢測到有結合，故顯示VH3/L(WT)-IgG1-F760對各種小鼠FcγR之結合活性缺損。
(1-5)低岩藻糖型抗體之製作
使抗體對FcγR之結合活性增強之方法，已知有對於抗體之Fc區導入胺基酸改變之方法，此外已知有使與抗體連結之糖鏈成為低岩藻糖型糖鏈之方法(J.Biol.Chem.(2003)278,3466-3473)。依參考實施例4之方法，將岩藻糖轉運蛋白基因缺損之CHO細胞(WO2006067913)作為寄主細胞使用並表現Fv4-IgG1，製作低岩藻糖型Fv4-IgG1(以下記載為Fv4-IgG1-Fuc)。mFcγR(小鼠Fcγ受體)當中，據報告低岩藻糖型抗體對於FcγRIV之結合活性選擇性的提高(Science(2005)310(5753)1510-1512)。
(實施例2)對FcγR之結合活性高於天然型人類IgG之Fc區之結合活性之抗原結合分子使抗原從血漿中消失之效果(2-1)H54/L28-IgG1及Fv4-IgG1使抗原從血漿中消失之效果
為抗人類IL-6受體抗體之H54/L28-IgG1、及有以pH依存性地結合於人類IL-6受體之性質之Fv4-IgG1，依參考實施例1之方法製作。使用製作之H54/L28-IgG1及Fv4-IgG1之體內輸液試驗，依下列方法實施。
(2-1-1)使用人類FcRn基因轉殖小鼠之體內輸液試驗
在人類FcRn基因轉殖小鼠(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg line 32 +/+ mouse、Jackson Laboratories、Methods Mol Biol.(2010)602,93-104)之背部皮下埋入填充有可溶型人類IL-6受體之輸液泵浦(MINI-OSMOTIC PUMP MODEL2004、alzet)，以製作維持血漿中可溶型人類IL-6受體濃度為不變狀態之動物模型。評價對於該動物模型投 予之抗人類IL-6受體抗體在投予後之體內動態。為了抑制產生對抗可溶型人類IL-6受體之中和抗體，將(以公知之方法取得)抗小鼠CD4單株抗體對於尾靜脈以20mg/kg單次投予。之後，在小鼠背部皮下埋入填充有92.8μg/mL之可溶型人類IL-6受體之輸液泵浦。埋入輸液泵浦3日後，將抗人類IL-6受體抗體以1 mg/kg對於尾靜脈單次投予。投予抗人類IL-6受體抗體後經過15分鐘、7小時、1日、2日、4日、7日後從該小鼠採血。將採取的血液立刻於4℃以15,000 rpm進行15分鐘離心分離以獲得血漿。將分離的血漿直到實施測定為止保存在設定為-20℃以下之冷凍庫。
(2-1-2)利用電化學發光法測定血漿中人類IL-6受體(hsIL-6R)濃度
小鼠之血漿中hsIL-6R濃度，係以電化學發光法測定。製備調整為2000、1000、500、250、125、62.5、31.25 pg/mL之hsIL-6R檢量線試樣及稀釋50倍以上之小鼠血漿測定試樣，與SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)釕化之Monoclonal Anti-human IL-6R Antibody(R&D)及Biotinylated Anti-human IL-6 R Antibody(R&D)及tocilizumab混合，於37℃使反應1晚。製備成Tocilizumab之終濃度成為333μg/mL。之後，將反應液分注到MA400 PR Streptavidin Plate(Meso Scale Discovery)。再於室溫使反應1小時並洗滌反應液後，分注Read Buffer T(×4)(Meso Scale Discovery)。之後立即以SECTOR PR 400 reader(Meso Scale Discovery)進行測定。人類IL-6受體濃度係由檢量線之回應，使用解析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices)計算。
測定之人類IL-6受體濃度變動如圖2。相較於H54/L28-IgG1，對於人類IL-6受體以pH依存性地結合之Fv4-IgG1能降低人類IL-6受體濃度，但是人類IL-6受體濃度無法比抗體非投予時之基線低。亦即，對於抗原以pH依存性地結合之抗體，未能由於抗體投予使血漿中之抗原濃度低於抗體投予前。
(2-2)對FcγR之結合活性增強或下降之抗體使抗原從血漿中消失之效果
對於係pH依存性人類IL-6受體結合抗體的Fv4-IgG1，藉由使對FcγR之結合活性增強或下降，對於人類IL-6受體濃度變動造成之影響依下列之方法評價。使用實施例1製作之Fv4-IgG1、Fv4-IgG1-F760、Fv4-IgG1-F1022、Fv4-IgG1-Fuc之體內輸液試驗依下列之方法實施。
(2-2-1)使用人類FcRn基因轉殖小鼠之體內輸液試驗
在人類FcRn基因轉殖小鼠(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg line 32 +/+ mouse、Jackson Laboratories、Methods Mol Biol.(2010)602,93-104)之背部皮下埋入填充有可溶型人類IL-6受體之輸液泵浦(MINI-OSMOTIC PUMP MODEL2004、alzet)，以製作維持血漿中可溶型人類IL-6受體濃度為不變狀態之動物模型。評價對於該動物模型投 予之人類免疫球蛋白製劑Sanglopor(CSL behring(股)公司)以及同時投予的抗人類IL-6受體抗體在投予後之體內動態。為了抑制產生對抗可溶型人類IL-6受體之中和抗體，將(以公知之方法取得)單株抗小鼠CD4 antibody對於尾靜脈以20mg/kg單次投予。之後，在小鼠背部皮下埋入填充有92.8μg/mL之可溶型人類IL-6受體之輸液泵浦。埋入輸液泵浦3日後，將抗人類IL-6受體抗體以1 mg/kg、Sanglopor以1000 mg/kg對於尾靜脈單次投予。投予抗人類IL-6受體抗體後經過15分鐘、7小時、1日、2日、4日、7日後從該小鼠採血。將採取的血液立刻於4℃以15,000 rpm進行15分鐘離心分離以獲得血漿。將分離的血漿直到實施測定為止保存在設定為-20℃以下之冷凍庫。
(2-2-2)利用電化學發光法所為之血漿中可溶型人類IL-6受體(hsIL-6R)濃度測定
與(2-1-2)記載之方法同樣，以電化學發光法測定小鼠血漿中hsIL-6R濃度。
結果如圖3。確認投予使Fv4-IgG1對於小鼠FcγR之結合缺損之Fv4-IgG1-F760之小鼠血漿中之人類IL-6受體濃度變動，與投予Fv4-IgG1之小鼠之血漿中之人類IL-6受體濃度為同等。由於對於膜型抗原之細胞傷害活性係依存於對於FcγR之結合，已知若對於FcγR之結合缺損，會變得無細胞傷害活性。另一方面，由於即使投予使對抗為可溶型抗原之人類IL-6受體之抗體之對於小鼠FcγR之 結合缺損之抗體，投予後小鼠血漿中之人類IL-6受體濃度之變動仍無影響，所以據認為針對投予對抗可溶型抗原之抗體之小鼠血漿中之抗原濃度之變動，抗體對於FcγR之結合無貢獻。
但意外地，投予對於小鼠FcγR結合增強之Fv4-IgG1-F1022之小鼠血漿中之人類IL-6受體濃度，比起投予Fv4-IgG1之小鼠血漿中之人類IL-6受體濃度大幅下降，其下降程度確認比抗體非投予時之人類IL-6受體濃度基線更低。尤其，從Fv4-IgG1-F1022投予3日後之被投予之小鼠血漿中人類IL-6受體濃度，比起投予Fv4-IgG1之情形之被投予之小鼠血漿中人類IL-6受體濃度，下降成約100分之1。由此顯示，藉由投予以pH依存性地結合於人類IL-6受體且對於FcγR之結合增強之抗體，能使被投予之小鼠血漿中人類IL-6受體濃度大幅下降，且其下降程度可使血漿中之抗原濃度比起抗體投予前更低。
又，投予有低岩藻糖型之糖鏈且對於小鼠FcγRIV之結合活性增強之Fv4-IgG1-Fuc後小鼠血漿中人類IL-6受體濃度，也比起投予Fv4-IgG1之小鼠血漿中人類IL-6受體濃度有下降。尤其，Fv4-IgG1-Fuc投予7日後之被投予之小鼠血漿中之人類IL-6受體濃度，比起投予Fv4-IgG1之情形之小鼠血漿中之人類IL-6受體濃度，下降為約2分之1。由此顯示，藉由投予以pH依存性地結合於人類IL-6受體且對於FcγR之結合增強之pH依存性抗原結合分子，能降低被投予之小鼠血漿中之可溶型抗原之濃度，此時作 為用以增強對於FcγR之結合之方法，不特別限定於導入胺基酸改變，例如使用結合於EU編號297位之糖鏈係低岩藻糖型糖鏈之人類IgG之Fc區也能達成。但抗原濃度下降之效果，相較於Fv4-F1022，Fv4-IgG1-Fuc明顯較小。由此結果可認為：多數存在之FcγR(小鼠中，FcγRI,II,III,IV)之中，Fv4-IgG1-Fuc之結合增強之mFcγIV，作為FcγR使抗原濃度下降之貢獻不大。
如上發現，藉由投予以pH依存性地結合於可溶型抗原之抗體對於FcγR之結合增強之抗體，能使被投予之個體中存在之可溶型抗原之血漿中濃度大幅下降。
雖不拘於特定理論，但藉由投予包含對於FcγR之結合增強之依pH等離子濃度之條件對於抗原之結合活性會變化之抗原結合分域、在pH酸性域之條件下對FcRn有結合活性之FcRn結合分域之抗原結合分子可觀察到的預料外之血漿中可溶型抗原濃度之下降，也可說明如下。
非專一性的攝入到細胞內之IgG抗體，在內體內之酸性條件下結合於內體內之FcRn而回到細胞表面上，在血漿中之中性條件下從FcRn解離。在此，藉由對血漿中可溶型抗原維持一定濃度之小鼠投予藉由與可溶型抗原結合將其機能中和之抗體之情形，血漿中之可溶型抗原會與被投予的抗體形成複合體。在形成了該複合體之狀態攝入到細胞內之可溶型抗原，抗體之Fc區在內體內之酸性條件下結合於內體內之FcRn，故據認為會以結合於抗體之狀態與抗體一起再循環到血漿中。
另一方面對抗可溶型抗原之抗體係以pH依存性地結合於抗原之抗體(亦即在內體內之酸性條件將可溶型抗原解離之抗體)的情形，以與抗體形成複合體之狀態以非專一性的攝入到細胞內之可溶型抗原，在內體內會從抗體解離並於細胞內溶體內分解，不會再循環到血漿中。亦即，可認為：以與可溶型抗原形成複合體之狀態攝入到細胞內之Fv4-IgG1，在內體內將可溶型抗原解離，可加快其消失。
如前述，Fv4-IgG1等包含依離子濃度之條件對於抗原之結合活性會變化之抗原結合分域之抗原結合分子，據認為可重複數次與抗原結合，但是在內體內將可溶型抗原並加快其從血漿中消失之效果，據認為係取決於抗原與抗原結合分子之複合體攝入到內體內之速度。包含對於各種FcγR之結合活性增強、依離子濃度之條件對於抗原之結合活性會變化之抗原結合分域之抗原結合分子，會藉由與在細胞膜上表現之各種FcγR結合，而積極地被攝入細胞內，可藉由該分子中所含之在pH酸性域之條件下對FcRn有結合活性之FcRn結合分域及經由FcRn之結合之再循環，而再度在血漿中循環。亦即血漿中與可溶型抗原形成複合體之前述抗原結合分子，會經由在細胞膜上表現之FcγR而積極地被攝入細胞內，所以加快血漿中之可溶型抗原消失之效果，據認為比起對於各種FcγR之結合活性未增強之抗原結合分子更顯著。
活體內，各種FcγR係在免疫細胞之細胞膜上表現且擔當其多樣的機能，但用於將抗體攝入細胞內之情形，據 認為任一FcγR都可使用。亦即，在人類已知存在活性型FcγRFcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa或抑制型FcγRIIb等，但經由此等任一者攝入均可。該等之中，可經由任一FcγR攝入，也可經由所有FcγR攝入。又，可為僅經由各種活性型FcγR攝入的樣態或僅經由抑制型FcγRIIb攝入之樣態。
又，為了達成此等目標，可使用用於增強抗原結合分子之FcγR結合分域對於FcγR之結合活性的任一方法。例如，如實施例1所示，可導入用於增強抗原結合分子之FcγR結合分域對FcγR之結合活性之胺基酸變異，或使用低岩藻糖型抗體。又，依該等之方法獲得之對FcγR之結合活性增強之效果，可為對於任一FcγR之結合增強之效果。亦即，可為對任一之FcγR之結合活性增強，也可對數個FcγR之結合活性增強，也可對所有之FcγR之結合活性增強。又，可僅對於各種活性型FcγR之結合活性增強，或僅對於抑制型FcγRIIb之結合活性增強。
結合於膜型抗原之抗體對FcγR之結合活性，在該抗體之細胞傷害活性發揮重要作用。所以當作醫藥使用之抗體需要細胞傷害活性之情形，係使用對FcγR之結合活性高的人類IgG1的構造同型，而且藉由增強該抗體對FcγR之結合活性，使該抗體之細胞傷害活性增強之技術已廣為使用。
另一方面，作為醫藥使用，結合於可溶型抗原之抗體對FcγR之結合活性發揮的作用至今為止尚未知，對FcγR 之結合活性高之人類IgG1及對FcγR之結合活性低之人類IgG2或人類IgG4之對FcγR之結合活性之不同，賦予投予了該抗體之活體之效果差異，至今並未充分探討。實際上在本實施例中，已確認在投予了對FcγR之結合活性缺損之抗體的個體之血漿中，不影響可溶型抗原之濃度變動。另一方面，本發明發現：包含投予了對FcγR之結合活性增強且依離子濃度之條件可溶型對於抗原之結合活性會改變之抗原結合分域之抗原結合分子之個體之血漿中，可溶型抗原之濃度大幅下降。亦即，可稱得上藉由將以可溶型抗原作為標的之抗原結合分子所含之在pH酸性域之條件下對FcRn有結合活性之FcRn結合分域及依離子濃度之條件對於可溶型抗原之結合會變化之抗原結合分域組合使對於FcγR之結合增強之好處，係首次發現。
(實施例3)對FcγR之結合活性高於天然型人類IgG之Fc區之結合活性、在pH酸性域之條件下人類FcRn結合活性增強之抗原結合分子使抗原從血漿中消失之效果 (3-1)對FcγR之結合活性高於天然型人類IgG之Fc區之結合活性、在pH酸性域之條件下人類FcRn結合活性增強之抗原結合分子之製作
改善IgG抗體之血漿中滯留性之方法，據報告有使在pH酸性域之條件下對於FcRn之結合提高之方法。對於IgG抗體之Fc區導入胺基酸取代並使在pH酸性域之條件下對於FcRn之結合提高，據認為從內體內往血漿中之再循環效率上升，其結果，該IgG抗體之血漿中滯留性改善。
使在pH酸性域之條件下對於人類FcRn之結合活性提高以改善血漿中滯留性之胺基酸改變之一例，已有IgG抗體之EU編號表示之428位之Met取代為Leu、434位之Asn取代為Ser之方法(Nat.Biotechnol,,(2010)28：,157-159.)、434位之Asn取代為Ala之方法(Drug.Metab.Dispos.(2010)38(4),600-605)、252位之Met取代為Tyr、254位之Ser取代為Thr、256位之Thr取代為Glu之方法(J.Biol.Chem.(2006)281,23514-23524)、250位之Thr取代為Gln、428位之Met取代為Leu之方法(J.Immunol.(2006)176(1)346-356)、434位之Asn取代為His之方法(Clin.Pharm.& Ther.(2011)89(2)283-290.)、及WO2010/106180、WO2010/045193、WO2009/086320、WO2009/058492、WO2008/022152、WO2006/050166、WO2006/053301、WO2006/031370、WO2005/123780、WO2005/047327、WO2005/037867、WO2004/035752、WO2002/060919等多數被報告。
實施例2中，為了使藉其之投予顯示可溶型抗原在血漿中濃度顯著下降之效果的Fv4-IgG1-F1022的藥物動態提升，製作VH3-IgG1-F1022之EU編號表示之428位之Met取代為Leu、434位之Asn取代為Ser之VH3-IgG1-F1093(序列編號：43)。使用參考實施例2之方法製作含有VH3-IgG1-F1093作為重鏈、含有VL3-CK作為輕鏈之Fv4-IgG1-F1093。
(3-2)對FcγR之結合活性高於天然型人類IgG之Fc區之 結合活性、在pH酸性域之條件下人類FcRn結合活性增強之抗原結合分子之使抗原從血漿中消失之效果
使用血漿中可溶型人類IL-6受體濃度維持不變狀態之人類FcRn基因轉殖小鼠，與實施例(2-1-1)之方法同樣地進行Fv4-IgG1-F1093之體內輸液試驗。該小鼠血漿中之可溶型人類IL-6受體濃度以實施例(2-1-2)之方法測定。其結果如圖4所示。
(3-2-1)利用ELISA法測定血漿中抗人類IL-6受體抗體濃度
小鼠血漿中之抗人類IL-6受體抗體濃度係以ELISA法測定。首先，將抗Fv4個體遺傳型(idiotype)抗體分注到Nunc-Immuno Plate,MaxiSoup(Nalge nunc International)，於4℃靜置1晚，製作成抗Fv4個體遺傳型抗體固相化板。同個體遺傳型抗體係將Fv4-M73(WO2009/125825)對兔免疫而得之血清以離子交換樹脂精製後，以固定有Fv4-M73之管柱進行親和性精製，之後以人類固定化管柱吸收而得。製備含血漿中濃度為0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125μg/mL之抗人類IL-6受體抗體之檢量線試樣以及稀釋100倍以上之小鼠血漿測定試樣。將該等之檢量線試樣及及在血漿測定試樣100μL加入有20ng/mL之可溶型人類IL-6受體200μL之混合液，於室溫靜置1小時。之後將該混合液分注於各井而得之抗Fv4個體遺傳型抗體固相化板再於室溫靜置1小時。之後與Biotinylated Anti-human IL-6 R Antibody(R&D)於室溫反應1小時，再與Streptavidin-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)於室溫反應1小時進行反應液之發色反應，係以TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)作為基質。藉由添加1N-硫酸(Showa Chemical)使反應停止之各井之反應液在450 nm之吸光度，以微板讀取儀測定。小鼠血漿中之抗體濃度，係從檢量線之吸光度使用解析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices)算得。
其結果如圖5所示。
(3-3)利用在pH酸性域之條件下增強人類FcRn結合活性所得之藥物動態之改善
如圖5所示，投予了Fv4-IgG1在pH中性域之條件下對FcγR之結合活性增強之Fv4-IgG1-F1022之群中，比起投予了Fv4-IgG1之群，確認已投予之抗體之血漿中滯留性下降。另一方面，投予了Fv4-IgG1-F1022在pH酸性域之條件下對人類FcRn之結合活性增強之Fv4-IgG1-F1093之群中，比起投予了Fv4-IgG1-F1022之群，確認已投予之抗體之血漿中滯留性大幅改善。
又，如圖4所示，血漿中之可溶型人類IL-6受體濃度，在Fv4-IgG1-F1022之投予群與Fv4-IgG1-F1093之投予群中均在直到抗體投予後第3日為止顯示同等的變動。投予後第3日，比起Fv4-IgG1之投予群，Fv4-IgG1-F1022及Fv4-IgG1-F1093任一投予群，均觀察到血漿中之可溶型人 類IL-6受體濃度之約100倍的顯著濃度下降。但抗體投予後第7日，Fv4-IgG1-F1022投予群之血漿中之可溶型人類IL-6受體濃度比起投予後第3日觀察到上升的傾向，另一方面，Fv4-IgG1-F1093投予群中，未觀察到血漿中之可溶型人類IL-6受體濃度上升，顯示本投予群中可溶型人類IL-6受體濃度下降之效果持續中。
亦即Fv4-IgG1-F1093之投予，已投予之個體之血漿中之可溶型人類IL-6受體濃度比起Fv4-IgG1可降下到約100分之1，且其狀態能長期間維持，顯示為非常優異的抗原結合分子。雖不拘於特定理論，但在此觀察到的現象也可說明如下。Fv4-IgG1在pH中性域之條件下對FcγR之結合活性增強之Fv4-IgG1-F1022，據認為主要在細胞膜上表現FcγR之免疫細胞中有攝入多量。攝入並移到內體的抗體，在內體內藉由結合於FcRn而在血漿中再循環。在內體內之酸性pH之條件下，抗體對於FcRn之結合活性不足的情形，據認為攝入內體的抗體無法充分再循環。亦即作為Fv4-IgG1-F1022比Fv4-IgG1之血漿中滯留性低的理由，是因為攝入內體內之抗體經由對FcRn之結合而充分於血漿中再循環的程度，在pH酸性域之條件下對於FcRn之結合活性不足，未再循環之抗體於溶體受分解的原故。
另一方面，Fv4-IgG1-F1022在pH酸性域之條件下對於人類FcRn之結合活性增強之Fv4-IgG1-F1093，與Fv4-IgG1-F1022同樣，據認為主要在細胞膜上表現FcγR之免疫細胞有攝入多量。被攝入並移到內體之抗體，藉由 在內體內結合於FcRn而與血漿中再循環，但由於Fv4-IgG1-F1093在pH酸性域之條件下對於人類FcRn之結合活性增強，所以據認為在內體內對於FcRn有足夠結合活性。所以即使Fv4-IgG1-F1093攝入細胞內後，其許多仍會在血漿中再循環。所以比起Fv4-IgG1-F1022，據認為Fv4-IgG1-F1093會提高在已投予之個體之血漿中滯留性。
另一方面至今也已知藉由在pH酸性域之條件下提高對於FcRn之結合活性，通常之抗體之血漿中滯留性會提高。但若抗體之血漿中滯留性提高，結合於抗體之抗原之血漿中滯留性也提高，故據認為相應地抗原之血漿中濃度也提高。實際上，如WO2010/088444所記載之對於對抗IL-6之人類IgG1抗體Antibody 18導入在pH酸性域之條件下對於FcRn之結合活性提高之YTE改變之Antibody 18E，在食蟹猴中，抗體之血漿中滯留性提高，但同時抗原IL-6之血漿中濃度也提高。
但令人意外地，對對於抗原以pH依存性地結合且對FcγR之結合活性增強之Fv4-F1022，投入已導入與YTE改變同樣之在pH酸性域之條件下對於FcRn之結合活性提高之改變之Fv4-IgG1-F1093的情形，儘管在投予之個體中抗體之血漿中滯留性大幅提高，但該個體中，為抗原之可溶型人類IL-6受體濃度未提高，在抗體投予第7日，已投予Fv4-IgG1-F1093之個體比起已投予Fv4-F1022之個體，可溶型人類IL-6受體濃度維持較低。
雖不受特定理論拘束，在此觀察到的現象也可如以下 方式說明。將對於抗原未顯示pH依存性結合之抗體對活體投予後，該抗體非專一性的攝入到細胞內，維持結合於該抗體之抗原，與抗體以相同程度於血漿中再循環。另一方面，在pH酸性域之條件下對於FcRn之結合活性增強之抗體，在被投予之活體之血漿中再循環的程度高於對於FcRn之結合活性增強之抗體，所以該維持結合於抗原之抗原在該活體之血漿中再循環的程度也提高。所以可認為：藉由提高被投予抗體所被投予之活體在血漿中滯留性，該抗體所結合之抗原在該活體之血漿中濃度也會上升。
另一方面，當將對於抗原以pH依存性地結合且對FcγR之結合活性增強之抗體對於活體投予時，該抗體會由於攝入主要在細胞膜上表現FcγR之免疫細胞內而其在血漿中滯留性下降。另一方面，結合於該抗體之抗原也攝入該細胞內後，在內體內從該抗體解離後在溶體分解，藉此該活體之血漿中抗原濃度也下降。在pH酸性域之條件下對於FcRn之結合活性有提高之情形，藉由增強對FcγR之結合活性而惡化之抗體之血漿中滯留性，可藉由提高經由FcRn之再循環率而改善。在此，對於抗原以pH依存性地結合之抗體所結合之抗原，在內體內從該抗體解離，且直接在溶體被分解，所以據認為抗原之血漿中濃度不上升。再者，由於被投予到活體之抗體之血漿中滯留性提高，據認為該抗體之抗原消失效果持續，能更久維持抗原濃度在低濃度。
由以上顯示：對FcγR之結合活性高於天然型人類IgG 之Fc區之結合活性之抗原結合分子，在投予了在pH酸性域之條件下人類FcRn結合活性有增強之抗體之活體中，被投予之抗體之血漿中滯留性提高。又，於該情形中顯示即使抗體之血漿中滯留性提高，抗原消失效果未減弱。
[實施例4]對FcγR之結合活性高於天然型人類IgG之Fc區之結合活性、在pH酸性域之條件下人類FcRn結合活性增強之抗原結合分子之使抗原從血漿中消失之效果之更進一步驗證 (4-1)投予了對FcγR之結合活性高於天然型人類IgG之Fc區之結合活性、在pH酸性域之條件下人類FcRn結合活性增強之抗體使活體中之抗原之消失效果
實施例2中，在投予了對小鼠FcγR之結合增強之Fv4-IgG1-F1022之群中，顯示血漿中之抗原濃度大幅下降。又，實施例3中，Fv4-IgG1-F1022之投予群之血漿中滯留性之下降，顯示藉由增強Fv4-IgG1-F1022在pH酸性域之條件下對人類FcRn之結合活性而有大幅改善。其次對於由於增強對小鼠FcγR之結合而得之血漿中可溶型抗原之消失效果、以及由於增強在pH酸性域之條件下對人類FcRn之結合活性而得到提高投予了抗體之活體中之該抗體之血漿中滯留性之效果，以如下方式進一步驗證。
(4-2)對於小鼠FcγR結合有增強之抗人類IL-6受體抗體之製作
作為對小鼠FcγR之結合有增強之抗原結合分子，製作VH3-IgG1之EU編號表示之326位之Lys取代為Asp之 VH3-IgG1-F1087(序列編號：123)及VH3-IgG1之EU編號表示之239位之Ser取代為Asp、332位之Ile取代為Glu之VH3-IgG1-F1182(序列編號：124)。使用參考實施例2之方法，製作含有VH3-IgG1-F1087作為重鏈、含有VL3-CK作為輕鏈之Fv4-IgG1-F1087，及含有VH3-IgG1-F1182作為重鏈、含有VL3-CK作為輕鏈之Fv4-IgG1-F1182。
(4-3)對小鼠FcγR之結合活性之確認
以參考實施例2之方法製作含有VH3-IgG1-F1087及VH3-IgG1-F1182作為重鏈、含有L(WT)-CK(序列編號：42)作為輕鏈之VH3/L(WT)-IgG1-F1087及VH3/L(WT)-IgG1-F1182。以參考實施例2之方法評價該等之抗體及VH3/L(WT)-IgG1-F1022對小鼠FcγR之結合活性。其結果如表8所示。又，各變異體對小鼠FcγR之結合活性比起施以改變前之IgG1增強了幾倍，如表9所示。
如表9所示，F1087及F1022對於小鼠FcγRI、小鼠FcγRIIb及小鼠FcγRIII之結合活性，比起IgG1增強，但對於小鼠FcγRIV之結合活性未增強。又，F1087對於小鼠FcγRI、小鼠FcγRIIb、小鼠FcγRIII及小鼠FcγRIV之結合活性，若比起F1022對於此等之結合活性，其增強程度弱。另一方面，F1182對小鼠FcγRI及小鼠FcγRIV之結合活性大幅增強，另一方面，其對FcγRIIb及FcγRIII之結合活性若比起F1022及F1087對於此等之結合活性，其增強之程度弱。如此，該等3種變異體均對於小鼠FcγR之結合顯示增強效果，但對哪一FcγR顯示選擇的結合活性增強、及其增強之程度，則依變異體而異。
(4-4)投予了Fv4-IgG1-F1087及Fv4-IgG1-F1182之活體中使抗原從血漿中消失之效果
使用人類FcRn基因轉殖小鼠之體內輸液試驗與實施例2之方法同樣實施，並測定該小鼠血漿中之可溶型IL-6受體之濃度。其結果如圖6所示。
在活體內投予了對小鼠FcγR之結合活性比起Fv4-IgG1為增強之Fv4-IgG1-F1087及Fv4-IgG1-F1182之群中，均比起投予了Fv4-IgG1之群，活體中之血漿中可溶型人類IL-6受體之濃度下降。前述血漿中可溶型人類IL-6受體之濃度下降之效果，特別在投予了對小鼠FcγRII及小鼠FcγRIII之結合為增強之Fv4-IgG1-F1087之群中為大。另一方面，在活體內投予了對小鼠FcγRI及小鼠FcγRIV之結合活性大幅提高之(對小鼠FcγRII及小鼠 FcγRIII之結合也有數倍增強)F1182之群中，由於F1182之投予所得之血漿中可溶型人類IL-6受體之濃度下降之效果小。由該等結果可知：對投予了pH依存性抗原結合抗體之小鼠血漿中之抗原濃度有效率的下降的效果較有貢獻的小鼠FcγR，為小鼠FcγRII及/或小鼠FcγRIII。亦即藉由將對於小鼠FcγRII及/或小鼠FcγRIII之結合增強之pH依存性抗原結合抗體對於活體內投予，據認為能更有效率的降低活體內之抗原之血漿中濃度。
(4-5)對FcγR之結合活性高於天然型人類IgG之Fc區之結合活性、在pH酸性域之條件下人類FcRn結合活性增強之抗原結合分子之製作
實施例3中，被投予對小鼠FcγR之結合活性有增強之Fv4-IgG1-F1022、於pH酸性域之條件下人類FcRn結合活性增強之Fv4-IgG1-F1093之人類FcRn基因轉殖小鼠中，比起被投予Fv4-IgG1-F1022之人類FcRn基因轉殖小鼠，被投予之抗體之血漿中滯留性大幅提高。該效果是否是在已投予Fv4-IgG1-F1087及Fv4-IgG1-F1182之人類FcRn基因轉殖小鼠中也會顯示，以及是否在投予了施予與實施例3驗證之改變為相異之改變且在pH酸性域之條件下對於人類FcRn之結合活性增強之變異體之小鼠也會顯示同樣效果，以如下方式驗證。
為了增強Fv4-IgG1-F1087及Fv4-IgG1-F1182在pH酸性域之條件下對於人類FcRn之結合活性，製作各重鏈VH3-IgG1-F1087及VH3-IgG1-F1182之EU編號表示之428 位之Met取代為Leu、434位之Asn取代為Ser之VH3-IgG1-F1180(序列編號：125)及VH3-IgG1-F1181(序列編號：126)。又，為了增強Fv4-IgG1-F1087在pH酸性域之條件下對於人類FcRn之結合活性，製作重鏈VH3-IgG1-F1087之EU編號表示之434位之Asn取代為Ala之VH3-IgG1-F1412(序列編號：127)。使用參考實施例2之方法，製作包含該等作為重鏈、含有VL3-CK作為輕鏈之Fv4-IgG1-F1180、Fv4-IgG1-F1181及Fv4-IgG1-F1412。
(4-6)在pH酸性域之條件下人類FcRn結合活性增強之抗體之藥物動態之改善
對人類FcRn基因轉殖小鼠各投予Fv4-IgG1-F1180、Fv4-IgG1-F1181及Fv4-IgG1-F1412之體內輸液試驗與實施例2之方法同樣地實施，並測定該小鼠群之血漿中可溶型IL-6受體之濃度。投予了Fv4-IgG1-F1087、Fv4-IgG1-F1180、Fv4-IgG1-F1412、Fv4-IgG1之小鼠群之血漿中抗體濃度之結果如圖7，投予了Fv4-IgG1-F1182、Fv4-IgG1-F1181、Fv4-IgG1之小鼠血漿中抗體濃度之結果如圖8所示。又，該小鼠群之血漿中抗體濃度依實施例3之方法測定。該小鼠群中，Fv4-IgG1-F1087、Fv4-IgG1-F1180、Fv4-IgG1-F1412、Fv4-IgG1之血漿中可溶型IL-6受體濃度之結果如圖9，Fv4-IgG1-F1182、Fv4-IgG1-F1181、Fv4-IgG1之血漿中可溶型IL-6受體濃度之結果如圖10所示。
在投予了Fv4-IgG1-F1182在pH酸性域對人類FcRn之 結合活性增強之Fv4-IgG1-F1181之小鼠群中，比起已投予Fv4-IgG1-F1182之小鼠群，抗體之血漿中滯留性確認有提高。另一方面，在投予了Fv4-IgG1-F1181之小鼠群之血漿中可溶型IL-6受體濃度，與投予了Fv4-IgG1-F1182之小鼠群之該等為同等，且比起投予了Fv4-IgG1之小鼠群，血漿中可溶型IL-6受體濃度均下降。
另一方面，投予了Fv4-IgG1-F1087在pH酸性域對人類FcRn之結合活性增強之Fv4-IgG1-F1180及投予了Fv4-IgG1-F1412之小鼠群中，均比起投予了Fv4-IgG1-F1087之小鼠群，被投予之抗體之血漿中滯留性提高，令人意外地，與投予了Fv4-IgG1之小鼠群之血漿中滯留性改善到同程度。又，伴隨抗體之血漿中滯留性之改善，被投予之小鼠群之血漿中可溶型IL-6受體之濃度之減少效果之持續性也改善。亦即從Fv4-IgG1-F1180及Fv4-IgG1-F1412之投予起14日後及21日後，接受該投予之小鼠群之血漿中可溶型IL-6受體之濃度，比起Fv4-IgG1-F1087之投予起14日後及21日後之該濃度顯著下降。
由以上顯示：藉由投予對FcγR之結合活性高於天然型人類IgG之Fc區之結合活性之抗原結合分子在pH酸性域之條件下對人類FcRn結合活性增強之抗體，接受該投予之活體之血漿中滯留性可提高，係在投予了Fv4-IgG1-F1093、Fv4-IgG1-F1181、Fv4-IgG1-F1180及Fv4-IgG1-F1412之4例之抗體的小鼠群中顯示。且投予了 抗原結合分子之活體之血漿中滯留性即使提高，在該活體之抗原消失效果不減弱，換言之可顯示持續的抗原消失效果。
(4-7)在pH酸性域之條件下人類FcRn結合活性增強且抑制對風溼病因子之結合之抗原結合分子之製作
為了使人類化抗CD4抗體在pH酸性域之條件下對於人類FcRn之結合活性增強且提高血漿中滯留性，近年有人報告將EU編號表示之434位之Asn取代為His之抗體分子對風溼病因子(Rheumatiod factor、RF)之結合(Clin.Pharmacol.Ther.(2011)89(2),283-290)。該抗體有人類IgG1之Fc區且位於對於FcRn之結合部位之EU編號表示之434位之Asn取代為His，顯示風溼病因子會結合於認識該經取代之處。
如實施例(4-6)所示，對小鼠FcγR之結合活性有增強之Fv4-IgG1-F1087在pH酸性域之條件下對於人類FcRn之結合活性有增強之Fv4-IgG1-F1180，於對於人類FcRn基因轉殖小鼠投予之情形中，顯示比起投予了Fv4-IgG1-F1087之情形，血漿中滯留性提高。用於增強在pH酸性域之條件下對於人類FcRn之結合活性之改變，已有各種者被報告，但是此等之改變當中，據報告重鏈之EU編號表示之428位之Met取代為Leu、434位之Asn取代為Ser變異體，對於風溼病因子之結合增強。但，該等EU編號表示之428位及434位之取代以外，EU編號表示之436位之Tyr取代為Thr之變異體，維持在pH 酸性域之條件下對於人類FcRn之結合活性增強，對於風溼病因子之結合顯著下降。
亦即藉由將在pH酸性域之條件下對於FcRn之結合活性不下降、僅對於風溼病因子之結合活性下降之改變導入於Fc區之該部位，能製作不具對風溼病因子之結合性，在pH酸性域之條件下對於人類FcRn之結合活性有增強之抗原結合分子。
如此之使對風溼病因子之結合活性下降之改變，係使用EU編號表示之248-257、305-314、342-352、380-386、388、414-421、423、425-437、439、441-444位之改變。較佳為使用EU編號表示之387、422、424、426、433、436、438、440位之改變。尤佳為使用EU編號表示之422位之Val取代為Glu或Ser之改變、424位之Ser取代為Arg之改變、433位之His取代為Asp之改變、436位之Tyr取代為Thr之改變、438位之Gln取代為Arg或Lys之改變、440位之Ser取代為Glu或Asp之改變。該等改變可以單獨使用，也可組合多處使用。
或為了降低對於風溼病因子之結合活性，也可導入N型糖鏈之附加序列。具體而言，N型糖鏈附加序列已知有Asn-Xxx-Ser/Thr(Xxx為Pro以外的任意胺基酸)，藉由將該序列導入Fc區，能附加N型糖鏈並利用N型糖鏈之立體障礙抑制與RF之結合。用於附加N型糖鏈之改變，較佳為使用EU編號表示之248位之Lys取代為Asn之改變、424位之Ser取代為Asn之改變、436位之Tyr取代為Asn且 438位之Gln取代為Thr之改變、438位之Qln取代為Asn之改變。尤佳為使用EU編號表示之424位之Ser取代為Asn之改變。
(4-8)在pH酸性域之條件下人類FcRn結合活性增強且對於風溼病因子之結合下降之抗原結合分子之藥物動態之改善效果之驗證
為了驗證包含上述對風溼病因子之結合活性下降之改變之抗體之效果，使用參考實施例2之方法製作對於Fv4-IgG1-F1087之重鏈將EU編號表示之428位之Met取代為Leu、434位之Asn取代為Ser、且436位之Tyr取代為Thr之Fv4-IgG1-F1782。如實施例(4-7)記載，Fv4-IgG1-F1782比起天然型人類IgG1，係對小鼠FcγR之結合活性增強，且在酸性pH條件下對於人類FcRn之結合活性增強，但另一方面對於風溼病因子之結合性未增強之抗體。為了驗證Fv4-IgG1-F1782比起Fv4-IgG1-F1087是否血漿中滯留性提高，與實施例2之方法同樣地評價投予了該等抗體之人類FcRn基因轉殖小鼠血漿中之該抗體之藥物動態。血漿中可溶型人類IL-6受體之濃度，依實施例(2-1-2)記載之方法測定，血漿中抗體濃度依實施例(3-2-1)記載之方法測定。
血漿中抗體濃度變動之結果如圖11，血漿中可溶型人類IL-6受體濃度變動之結果如圖12所示。Fv4-IgG1-F1782比起Fv4-IgG1-F1087，顯示抗體之血漿中滯留性提高。另一方面，投予了上述抗體之群之血漿中可溶型人類IL-6受 體濃度，比起投予了Fv4-IgG1之群之該等濃度，顯著下降。
雖不受特定理論拘束，針對該等之結果也可如以下方式解釋。從實施例3及4之結果，顯示藉由投予對FcγR之結合活性高於天然型人類IgG之Fc區之結合活性之抗原結合分子之在pH酸性域之條件下人類FcRn結合活性有增強之抗體，可提高接受該投予之活體之血漿中滯留性。再者，顯示：即使投予了抗原結合分子之活體之血漿中滯留性提高，於該活體之抗原消失效果不減弱，而可持續抗原消失效果。
但，導入該等有用於使在pH酸性域之條件下人類FcRn結合活性增強之改變之抗原結合分子，會有對風溼病因子之結合性增強的顧慮。而藉由對於該結合分子導入在pH酸性域之條件下維持人類FcRn結合活性且對風溼病因子之結合性下降之變異，能不使對風溼病因子之結合性增加，而使血漿中滯留性提高。
換言之，將具有以pH依存性地結合於抗原之性質且對FcγR之結合活性高於天然型人類IgG之Fc區之結合活性、在pH酸性域之條件下人類FcRn結合活性有增強，而且對風溼病因子之結合性下降之抗原結合分子投予到活體內之情形，明顯可知該抗原結合分子有使該活體內之可溶型抗原之濃度有效下降、不使該抗原結合分子對風溼病因子之結合性增加，而會使血漿中滯留性提高的優異性質。
[實施例5]投予對FcγR之結合活性高於天然型小鼠IgG之Fc區之結合活性之抗原結合分子在活體中使抗原從血 漿中消失之效果 (5-1)投予了對FcγR之結合活性已增強之小鼠抗體之活體中之使抗原從血漿中消失之效果
實施例1至4中，投予了具有人類抗體之Fc區且具有以pH依存性地結合於人類IL-6受體之性質之抗原結合分子之對小鼠FcγR之結合活性有增強之抗原結合分子的人類FcRn基因轉殖小鼠群中，確認該小鼠血漿中可溶型人類IL-6受體之消失加快。該效果在有小鼠FcRn之正常小鼠中、投予了具有小鼠抗體之Fc區且具有以pH依存性地結合於人類IL-6受體之性質之抗原結合分子的具有小鼠FcRn之正常小鼠中是否也會顯示，係依以下所示驗證。
(5-2)對FcγR之結合活性增強之小鼠抗體之製作
使用參考實施例2之方法製作作為具有以pH依存性地結合於人類IL-6受體之性質之小鼠IgG1抗體之重鏈的VH3-mIgG1(序列編號：128)、作為輕鏈之VL3-mk1(序列編號：129)。又，為了使VH3-mIgG1對小鼠FcγR之結合活性增強，製作EU編號表示之327位之Ala取代為Asp之VH3-mIgG1-mF44(序列編號：130)。同樣地，製作VH3-mIgG1之EU編號表示之239位之Ser取代為Asp、327位之Ala取代為Asp之VH3-mIgG1-mF46(序列編號：131)。使用參考實施例2之方法製作含有VH3-mIgG1、VH3-mIgG1-mF44或VH3-mIgG1-mF46作為重鏈、含有VL3-mk1作為輕鏈之Fv4-mIgG1、Fv4-mIgG1-mF44或Fv4-mIgG1-mF46。
(5-3)對FcγR之結合活性增強之小鼠抗體對小鼠FcγR之 結合活性之確認
以參考實施例2之方法製作含有VH3-mIgG1、VH3-mIgG1-mF44或VH3-mIgG1-mF46作為重鏈、含有L(WT)-CK(序列編號：42)作為輕鏈之VH3/L(WT)-mIgG1、VH3/L(WT)-mIgG1-mF44或VH3/L(WT)-mIgG1-mF46。以參考實施例25之方法評價該等之抗體對小鼠FcγR之結合活性。結果如表10所示。又，各變異體對小鼠FcγR之結合活性比起施加改變之前之mIgG1增強幾倍，係如表11所示。
由具有天然型小鼠IgG1抗體之Fc區之VH3/L(WT)-mIgG1，對小鼠FcγRI及小鼠FcγRIV未顯示結合，僅對小鼠FcγRIIb及小鼠FcγRIII顯示結合之實施例4之探討結果，啟示對於使抗原濃度下降為重要的小鼠FcγR為小鼠FcγRII及或小鼠FcγRIII。又，導入了據認為會增強VH3/L(WT)-mIgG1對FcγR之結合活性之改變的VH3/L(WT)-mIgG-mF44及VH3/L(WT)-mIgG1-mF46，對於 小鼠FcγRIIb及小鼠FcγRIII之結合活性均顯示有增強。
(5-4)正常小鼠中之血漿中可溶型IL-6受體濃度之減少效果之確認
以下列方式驗證投予了作為抗人類IL-6受體抗體之Fv4-mIgG1、Fv4-mIgG1-mF44或Fv4-mIgG1mF46之正常小鼠血漿中可溶型IL-6受體之消失效果。
藉由在正常小鼠(C57BL/6J mouse、Charles River Japan)之背部皮下埋入填充有可溶型人類IL-6受體之輸液泵浦(MINI-OSMOTIC PUMP MODEL2004、alzet)，製作維持血漿中可溶型人類IL-6受體濃度為不變狀態之動物模型。評價對於該動物模型投予了抗人類IL-6受體抗體後之可溶型人類IL-6受體之體內動態。為了抑制產生對抗可溶型人類IL-6受體之抗體，單株抗小鼠CD4抗體係在尾靜脈以20 mg/kg單次投予。之後，將填充有92.8μg/mL之可溶型人類IL-6受體之輸液泵浦埋入小鼠背部皮下。於埋入輸液泵浦3日後，將抗人類IL-6受體抗體以1 mg/kg對尾靜脈單次投予。抗人類IL-6受體抗體投予後經過15分鐘、7時間、1日、2日、4日、7日、14日(或15日)、21日(或22日)後從該小鼠採血。將採取的血液立即於4℃以15,000 rpm進行15分鐘離心分離，獲得血漿。已分離之血漿直到實施測定為止保存於設定在-20℃以下之冷凍庫。
血漿中之可溶型人類IL-6受體濃度以實施例(2-1-2)之方法測定。其結果如圖13所示。
令人意外地，投予了已導入mIgG1(天然型小鼠IgG1) 對小鼠FcγRIIb及小鼠FcγRIII之結合活性增強之改變的mF44及mF46的小鼠，比起投予了mIgG1之小鼠，均確認血漿中IL-6受體濃度之顯著下降。尤其，即使mF44之投予後第21日，mF44投予群之血漿中IL-6受體濃度比起抗體非投予群之血漿中IL-6受體濃度下降約6倍，相較於mIgG1投予群下降約10倍。另一方面mF46之投予後第7日，mF46投予群之血漿中IL-6受體濃度比起抗體非投予群之血漿中IL-6受體濃度顯著下降約30倍、比起mIgG1投予群顯著下降約50倍。
由以上顯示：與具有人類IgG1抗體之Fc區之抗原結合分子對小鼠FcγR之結合活性有增強之抗體同樣，投予了具有小鼠IgG1抗體之Fc區之抗原結合分子對小鼠FcγR之結合活性有增強之抗體的小鼠中，亦顯示血漿中可溶型IL-6受體之消失加速。雖不受特定理論拘束，在此觀察到的現象也可依如下方式說明。
若將以pH依存性地結合於可溶型抗原且對FcγR之結合活性增強之抗體對小鼠投予，會積極地被攝入主要在細胞膜上表現FcγR之細胞。被攝入之抗體在內體內之酸性pH之條件下將可溶型抗原解離後，會經由FcRn之媒介於血漿中再循環。所以，由如此之抗體帶來之使血漿中之可溶型抗原消失之效果之一要素，可列舉該抗體對FcγR之結合活性之強度。亦即，對FcγR之結合活性愈強，能更積極地被攝入FcγR表現細胞，據認為能加快血漿中之可溶型抗原消失。又，如此之效果在抗體所含之Fc區係來自 人類IgG1、來自小鼠IgG1的情形，只要對FcγR之結合活性有增強，據認為均同樣可驗證。亦即，人類IgG1、人類IgG2、人類IgG3、人類IgG4、小鼠IgG1、小鼠IgG2a、小鼠IgG2b、小鼠IgG3、大鼠IgG、猴IgG、兔IgG等任一動物種之Fc區，只要被投予之動物種對FcγR之結合活性有增強，據認為均能使用在驗證。
[實施例6]由於FcγRIIb選擇的結合有增強之抗體所得之抗原消失效果 (6-1)對FcγRIIb之結合活性有選擇的增強之抗體之抗原消失效果
FcγRIII缺損小鼠(B6.129P2-FcgrFcγR3tm1Sjv/Jmouse,Jackson Laboratories)是表現小鼠FcγRI、小鼠FcγRIIb、小鼠FcγRIV，但不表現小鼠FcγRIII之小鼠。另一方面，Fc受體γ鏈缺損小鼠(Fcerlg mouse,Taconic,Cell(1994)76,519-529)為僅表現小鼠FcγRIIb，且不表現小鼠FcγRI、小鼠FcγRIII、小鼠FcγRIV之小鼠。
實施例5中，相對於天然型小鼠IgG1，對FcγR之結合活性增強的mF44及mF46對小鼠FcγRIIb及小鼠FcγRIII顯示選擇的結合增強。利用該選擇的增強的抗體之結合活性，對於不表現小鼠FcγRIII之小鼠FcγRIII缺損小鼠或Fc受體γ鏈缺損小鼠投予mF44及mF46，據認為可模擬投予對小鼠FcγRIIb之結合有選擇的增強之抗體之狀況。
(6-2)使用FcγRIII缺損小鼠之投予了對小鼠FcγRIIb之 結合有選擇的增強之抗體之活體之抗原消失效果之驗證
投予了作為抗人類IL-6受體抗體之Fv4-mIgG1、Fv4-mIgG1-mF44或Fv4-mIgG1-mF46之FcγRIII缺損小鼠血漿中可溶型IL-6受體之消失效果，與實施例5之方法同樣地驗證。該小鼠血漿中之可溶型人類IL-6受體濃度以實施例(2-1-2)之方法測定。其結果如圖14所示。
令人意外地，投予了模擬mIgG1(天然型小鼠IgG1)對小鼠FcγRIIb之結合活性有選擇的增強之狀況之mF44及mF46之FcγRIII缺損小鼠血漿中IL-6受體濃度，確認均比起投予了mIgG1之小鼠血漿中IL-6受體濃度有顯著下降。尤其，mF44之投予群之血漿中IL-6受體濃度比起mIgG1投予群之此濃度下降約3倍，抑制了由於抗體投予引起的抗原濃度之累積。另一方面，mF46之投予群之血漿中IL-6受體濃度在投予後第3日，比起抗體非投予群之血漿中IL-6受體濃度顯著下降約6倍，比起mIgG1投予群之血漿中IL-6受體濃度顯著下降約25倍。從該結果顯示：以pH依存性地結合於抗原之抗人類IL-6受體抗體對小鼠FcγRIIb之結合活性愈高，在投予其時之小鼠血漿中IL-6受體濃度會愈下降。
(6-3)使用Fc受體γ鏈缺損小鼠之投予了對小鼠FcγRIIb之結合有選擇的增強之抗體之活體之血漿中之抗原消失效果之驗證
投予了作為抗人類IL-6受體抗體之Fv4-mIgG1、Fv4-mIgG1-mF44或Fv4-mIgG1mF46之Fc受體γ鏈缺損小 鼠血漿中可溶型IL-6受體之消失效果，與實施例5之方法同樣地驗證。該小鼠血漿中之可溶型人類IL-6受體濃度以實施例(2-1-2)之方法測定。其結果如圖15所示。
與對FcγRIII缺損小鼠投予mF44及mF46時同樣，投予了模擬相對於mIgG1(天然型小鼠IgG1)僅對小鼠FcγRIIb之結合活性有選擇的增強之狀況之mF44及mF46之Fc受體γ鏈缺損小鼠血漿中IL-6受體濃度，均比起投予了mIgG1之Fc受體γ鏈缺損小鼠血漿中IL-6受體濃度確認有顯著下降。尤其mF44之投予群之血漿中IL-6受體濃度，比起mIgG1投予群之血漿中IL-6受體濃度下降約3倍，由於抗體投予引起之抗原濃度之累積受抑制。另一方面，mF46之投予群之血漿中IL-6受體濃度投予後第3日，比起抗體非投予群之血漿中IL-6受體濃度顯著下降約5倍，比起mIgG1投予群之血漿中IL-6受體濃度顯著下降約15倍。
從實施例(6-2)及(6-3)之結果，顯示：投予了以pH依存性地結合於可溶型抗原、對小鼠FcγRIIb之結合活性有選擇的增強之抗體之群之血漿中之可溶型抗原濃度可大幅下降。
[實施例7]由於對FcγRIII之結合有選擇的增強之抗體所獲得之抗原消失效果 (7-1)投予了對FcγRIII之結合活性有選擇的增強之抗體之活體之血漿中之抗原消失效果
FcγRIIb缺損小鼠(FcgrFcγR2b(FcγRII)mouse, Taconic)(Nature(1996)379(6563),346-349)，係表現小鼠FcγRI、小鼠FcγRIII、小鼠FcγRIV但不表現小鼠FcγRIIb之小鼠。實施例5中，使天然型小鼠IgG1對FcγR之結合活性增強之mF44及mF46，顯示對小鼠FcγRIIb及小鼠FcγRIII之選擇性結合有增強。利用該選擇性增強之抗體之結合活性，對於不表現小鼠FcγRIIb之小鼠FcγRIIb缺損小鼠投予mF44及mF46，據認為可模擬投予對小鼠FcγRIII之結合有選擇的增強之抗體之狀況。
實施例6中，模擬投予了對小鼠FcγRIIb之結合活性有選擇的增強之抗體之狀況的FcγRIII缺損小鼠血漿中之可溶型抗原濃度顯示下降。另一方面，模擬投予了對小鼠FcγRIII之結合活性有選擇性增強之抗體的狀況的FcγRIIb缺損小鼠血漿中之可溶型抗原濃度是否下降，係利用以下試驗確認。
(7-2)使用FcγRIIb缺損小鼠之由小鼠FcγRIII選擇性的結合增強所獲得之抗原消失效果之驗證
對於FcγRIIb缺損小鼠投予作為抗人類IL-6受體抗體之Fv4-mIgG1、Fv4-mIgG1-mF44或Fv4-mIgG1mF46之FcγRIIb缺損小鼠血漿中可溶型IL-6受體之消失效果，與實施例5之方法同樣驗證。血漿中之可溶型人類IL-6受體濃度以實施例(2-1-2)之方法測定。其結果如圖16所示。
令人意外地，模擬mIgG1(天然型小鼠IgG1)對小鼠FcγRIII之結合活性選擇性增強之mF44及mF46之投予群中，血漿中IL-6受體濃度下降，但未確認有實施例6所示 程度的下降。
雖不受特定理論拘束，從實施例5、6及7之結果也可以下列方式推察。投予了mIgG1(天然型小鼠IgG1)對小鼠FcγRIIb及對小鼠FcγRIII之結合活性有選擇的增強之mF44及mF46之表現小鼠FcγRIIb及小鼠FcγRIII兩者之正常小鼠血漿中可溶型IL-6受體之消失，確認顯著加速。又，對於表現小鼠FcγRIIb但不表現小鼠FcγRIII之小鼠(FcγRIII缺損小鼠、及Fc受體γ鏈缺損小鼠)投予mF44及mF46之情形，也確認該小鼠血漿中可溶型IL-6受體之消失顯著加速。另一方面，對於表現小鼠FcγRIII但不表現小鼠FcγRIIb之小鼠(FcγRII缺損小鼠)投予mF44及mF46的情形，該小鼠血漿中可溶型IL-6受體之消失未達如投予FcγRIII缺損小鼠、及Fc受體γ鏈缺損小鼠時加速之程度。
由以上可認為：mIgG1(天然型小鼠IgG1)對小鼠FcγRIIb及對小鼠FcγRIII之結合活性有選擇的增強之抗體mF44及mF46，主要藉由小鼠FcγRIIb之媒介攝入表現FcγR之細胞內，而造成結合於該抗體之血漿中之可溶型抗原消失。另一方面，經由FcγRIII媒介之抗體抗原複合體攝入FcγR表現細胞，據認為並未對於血漿中之可溶型抗原之消失有大助益。
又，如實施例4所示，特別是投予了對小鼠FcγRIIb及對小鼠FcγRIII之結合活性提高之Fv4-IgG1-F1087之小鼠血漿中可溶型IL-6受體濃度顯著下降，另一方面，特 別是投予了對小鼠FcγRI及小鼠FcγRIV之結合活性提高之Fv4-IgG1-F1182之小鼠血漿中可溶型IL-6受體之消失效果，比起Fv4-IgG1-F1087之此效果較小。
又，在實施例2中投予了由於具有低岩藻糖型糖鏈而使對小鼠FcγRIV之結合活性大幅增強之(Science(2005)310(5753)1510-1512)Fv4-IgG1-Fuc之小鼠血漿中可溶型IL-6受體濃度，比起投予了Fv4-IgG1之小鼠血漿中可溶型IL-6受體濃度雖下降，但其下降之效果為約2倍之小。所以，據認為經由小鼠FcγRIV之媒介之抗體攝入FcγR表現細胞，對於血漿中之可溶型抗原之消失未有大助益。
由該等結果發現：在小鼠中，抗體攝入FcγR表現細胞，在多數的小鼠FcγR之中，小鼠FcγRIIb及小鼠FcγIII，尤其小鼠FcγRIIb係發揮主要的作用。所以，雖不特別限定，但作為導入於小鼠FcγR結合分域之變異，可認為以增強對小鼠FcγRIIb及小鼠FcγIII之結合，尤其增強對小鼠FcγRIIb之結合之變異較佳。
由本探討顯示：為了藉由投予以pH依存性地結合於可溶型抗原且對FcγR之結合活性增強之抗原結合分子使被投予之活體之血漿中之可溶型抗原之消失加快，在小鼠宜增強被投予之抗體對小鼠FcγRIIb及小鼠FcγIII之結合活性，尤其增強對FcγRIIb之結合活性。亦即，當將以pH依存性地結合於可溶型抗原且對小鼠FcγRIIb及小鼠FcγIII之結合活性，尤其對FcγRIIb之結合活性增強之 抗原結合分子對活體內投予之情形，可加快血漿中之可溶型抗原之消失，並有效下降血漿中之可溶型抗原濃度，明顯有極有效的作用。
[實施例8]含有施加了對FcγRIIb之結合增強之既有的改變的Fc區之抗體之血小板凝集能力之評價 (8-1)製作含有施加了對FcγRIIb之結合增強之既有的改變之Fc區之抗體
如實施例7所記載，藉由將對FcγRIIb之選擇性結合活性增強之抗體對活體投予，能從該活體之血漿中使抗原有效率的消失。又，投予含有對FcγRIIb之結合活性有選擇的增強之Fc區之抗體，從對於被投予抗體之活體的安全性、副作用的觀點亦為理想。但，mF44、mF46，對於小鼠FcγRIIb與小鼠FcγRIII兩者的結合增強，對小鼠FcγRIIb之選擇性結合未增強。此可認為原因在於小鼠FcγRIIb與小鼠FcγRIII之同源性(homology)高，故不易找到能識別兩者且增強對小鼠FcγRIIb之選擇性的結合的改變。又，至今為止尚無人報告對小鼠FcγRIIb之選擇性的結合增強之Fc區。同樣，已知人類FcγRIIb與人類FcγRIIa(131Arg及131His之兩副型)之同源性亦高。又，至今為止也尚無人報告能識別兩者且包含對人類FcγRIIb之選擇性的結合增強之改變之Fc區(Seung等人(Mol.Immunol.(2008)45,3926-3933)、Greenwood等人(Eur.J.Immunol.(1993)23(5),1098-1104))。又，至今為止已有人報告對FcγRIIa 之結合係對由抗體所得血小板之凝集活性發揮重要作用(Meyer等人(J.Thromb.Haemost.(2009),7(1),171-181)、Robles-Carrillo等人(J.Immunol.(2010),185(3),1577-1583))。由該等之報告，被投予對FcγRIIa之結合增強之抗體的活體發生血栓症的風險有可能提高。而抗體對FcγRIIa之結合有增強之抗體之血小板凝集活性是否有增強，係依下列方式驗證。
(8-2)含有施加了對FcγRIIb之結合增強之既有的改變之Fc區之抗體對人類FcγR之結合活性之評價
含有施加了對人類FcγRIIb之結合增強之既有的改變之Fc區之抗體對人類FcγRIa、FcγRIIa之R型及H型、FcγRIIb、FcγRIIIa之親和性，依下列方式解析。製作包含作為抗體H鏈可變區之揭示於WO2009/125825之對抗人類介白素6受體之抗體之可變區IL6R-H(序列編號：132)、作為抗體H鏈不變區之人類IgG1之C末端之Gly及Lys經除去之有G1d之IL6R-G1d(序列編號：133)的H鏈。其次製作IL6R-G1d之Fc區利用Seung等人(Mol.Immunol.(2008)45,3926-3933)記載之改變即EU編號267位表示之Ser取代為Glu、EU編號328位表示之Leu取代為Phe之改變的IL6R-G1d-v3(序列編號：138)。抗體L鏈共通使用對抗人類介白素6受體之抗體之L鏈IL6R-L(序列編號：135)，將各H鏈同時依參考實施例1之方法表現而得之抗體精製。含有IL6R-G1d、IL6R-G1d-v3作為重鏈之抗體，以下各稱為IgG1、IgG1-v3。
其次將該等之抗體與FcγR之交互作用使用Biacore T100(GE Healthcare)進行動力理論解析。運行緩衝液使用HBS-EP+(GE Healthcare)，於25℃的溫度測定該交互作用。使用以胺偶聯法將Protein A固定於Series S Sencor Chip CM5(GE Healthcare)之晶片。使捕捉於該晶片之目的抗體、以及經運行緩衝液稀釋之各FcγR交互作用，測定各FcγR對抗體之結合。測定後於10 mM glycine-HCl、pH1.5與晶片反應，將捕捉於晶片之抗體洗滌，並將經再生之晶片重複使用。測定結果獲得之感測圖利用Biacore Evaluation軟體以1：1 Langmuir binding model解析，從算出之結合速度常數ka(L/mol/s)、解離速度常數kd(1/s)之值計算解離常數KD(mol/L)。IgG1、IgG1-v3對各FcγR之KD值如表12所示(各抗體對各FcγR之KD值)，IgG1對各FcγR之KD值除以IgG1-v3對各FcγR之KD值而得之IgG1-v3之相對KD值如表13所示。
(8-3)血小板凝集能力之評價
其次使用從FcγRIIa之H型、R型之提供者而來之血小板驗證：由於含有IgG1之Fc區之EU編號表示之267位之Ser取代為Glu、328位之Leu取代為Phe之Fc區之抗體對FcγRIIa之親和性之強弱，是否血小板凝集能力有所變化。使用參考實施例2之方法製作含有結合於IgE之hIgG1抗體(人類IgG1不變區)之重鏈可變區及G1d重鏈不變區之重鏈omalizumab_VH-G1d(序列編號：136)、作為輕鏈之omalizumab_VL-CK(序列編號：137)之抗體。又，製作omalizumab_VH-G1d之EU編號表示之267位之Ser取代為Glu、328位之Leu取代為Phe之omalizumab_VH-G1d-v3(序列編號：138)。使用參考實施例2之方法，製作包含omalizumab_VH-G1d-v3作為重鏈、包含omalizumab_VL-CK作為輕鏈之omalizumab-G1d-v3。評價該抗體之血小板凝集能力。
血小板凝集係使用血小板凝集能力測定裝置HEMATRACER712(LMS(股)公司)測定。首先，將於含有0.5 mL之3.8%檸檬酸鈉之4.5 mL真空採血管逐一採取一定分量之約50 mL之全血以200 g進行15分鐘離心分離，將回收之上清當作Platelet Rich Plasma(PRP)。使用緩衝液A(137 mM NaCl、2.7 mM KCl、12 mM NaHCO3、0.42 mM NaH2PO4、2 mM MgCl2、5 mM HEPES、5.55 mM dextrose、1.5 U/mL apyrase、0.35% BSA)洗滌過的PRP再替換為緩衝液B(137 mM NaCl、2.7 mM KCl、12 mM NaHCO3、0.42 mM NaH2PO4、2 mM MgCl2、5 mM HEPES、5.55 mM dextrose、2 mM CaCl2、 0.35% BSA)。其結果製備密度約300,000/μL之洗淨血小板。在設置於血小板凝集能力測定裝置、含攪拌棒之測定用比色管中分注156μL之洗淨血小板。在該裝置內維持在37.0℃之比色管內，將血小板利用攪拌棒以1000 rpm攪拌。於其中加入製備為最終濃度各成為600μg/mL及686μg/mL之莫耳比1：1之omalizumab-G1d-v3與IgE之免疫複合體44μL，使血小板與該免疫複合體反應5分鐘。再將不會起二次凝集之濃度之腺苷二磷酸(ADP、SIGMA)加到反應液，確認是否凝集增強。
該試驗法獲得之FcγRIIa之各基因多型(R/H或H/H)之提供者之血小板凝集之結果，各如圖17及18所示。從圖17之結果，觀察到：在對於有FcγRIIa之多型(R/H)之提供者之血小板添加了免疫複合體之情形，有血小板凝集。另一方面，如圖18所示，對有FcγRIIa多型(H/H)之提供者之血小板添加免疫複合體的情形，未觀察到血小板凝集。
其次使用活化標記評價血小板之活化。血小板之活化，可利用CD62p(p-selectin)或活性型細胞黏合素此類活化標記在血小板膜表面之表現增加以測定。於依前述方法製備之洗淨血小板7.7μL之洗淨血小板添加免疫複合體2.3μL，於室溫反應5分鐘後，再添加ADP使最終濃度成為30μM，誘發活化，並確認是否由於免疫複合體增強ADP所致之活化。陰性對照係將免疫複合體替換為添加磷酸緩衝液(pH7.4)(Gibco)之樣本。對反應後之各樣本加入 PE標識抗CD62抗體(BECTON DICKINSON)、PerCP標識抗CD61抗體、FITC標識PAC-1抗體(BD bioscience)以染色。各染色之螢光強度使用流式細胞計數器(FACS CantoII、BD bioscience)測定。
該試驗法獲得之CD62p表現之結果如圖19所示，活化細胞黏合素表現之結果如圖20所示。作為洗淨血小板，使用FcγRIIa之多型為R/H之一名健常人獲得之洗淨血小板。利用ADP刺激在血小板膜表面誘導表現之CD62p及活性型細胞黏合素之表現量，在免疫複合體存在下均增加。
從該等結果可知：含有已施加IgG1之Fc區之EU編號表示之267位之Ser取代為Glu、328位之Leu取代為Phe之對人類FcγRIIb之結合增強之既有的改變之Fc區之抗體，比起表現FcγRIIa之基因多型當中131號之胺基酸為H之FcγRIIa之血小板，會較促進表現131號之胺基酸為R之FcγRIIa之血小板之凝集。亦即將含有已施加既有的對人類FcγRIIb之結合增強之既有的改變之Fc區之抗體對於在其中之一的對偶基因有FcγRIIaR型的人類投予的情形，啟示有由於血小板凝集所致血栓症發病的風險提高之危險性。含有對FcγRIIb更選擇性的結合增強之Fc區之本發明的抗原結合分子，不僅抗原之血漿中滯留性改善，且顯示克服上述問題之可能性，本發明之抗原結合分子之有用性係為明顯。
(8-4)含有對FcγRIIb之結合有選擇的增強之Fc(BP230)與既存之對FcγRIIb之結合有選擇的增強之Fc之抗體之 血小板凝集能力之比較 (8-4-1)對FcγRIIb之結合有選擇的增強之抗體之製作
如實施例(8-3)所述，對FcγRIIa之結合有增強之抗體，其血小板凝集能力及血小板活化能增強，顯示有提高對人類投予時血栓症之發病風險的可能性。另一方面，若考慮表現於血小板之FcγR僅為FcγRIIa，對FcγRIIb之結合有選擇的增強之抗體，其血小板凝集能力及活化能力不增強，據認為即使對人類投予，也不提高血栓症之發病風險。為了確認此，實際驗證對FcγRIIb之結合有選擇的增強之抗體之血小板凝集能力、血小板活化能力。
具體而言，使用參考實施例2之方法製作作為結合於IgE之hIgG1抗體(人類IgG1不變區)之重鏈之omalizumab_VH-G1d(序列編號：136)、作為輕鏈之omalizumab_VL-CK(序列編號：137)。其次為了對於omalizumab_VH-G1d，使對人類FcγRIIb之結合活性選擇性的增強，製作EU編號表示之233位之Glu取代為Asp、237位之Gly取代為Asp、238位之Pro取代為Asp、268位之His取代為Asp、271位之Pro取代為Gly、296位之Tyr取代為Asp、330位之Ala取代為Arg、439位之Lys取代為Glu之omalizumab_VH-BP230(序列編號：140)。同樣進行，為了增強omalizumab_VH-G1d對人類FcγRIIb及FcγRIIaR之結合活性，製作EU編號表示之267位之Ser取代為Glu、328位之Leu取代為Phe之omalizumab_VH-G1d-v3(序列編號：138)。
使用參考實施例2之方法，製作含有omalizumab_VH-BP230(序列編號：140)作為重鏈、omalizumab_VL-CK(序列編號：137)作為輕鏈之omalizumab-BP230，並製作含有omalizumab_VH-G1d-v3(序列編號：138)作為重鏈、omalizumab_VL-CK(序列編號：137)作為輕鏈之omalizumab-G1d-v3。評價該等之抗體之血小板凝集能力及血小板活化能力。
(8-4-2)omalizumab-BP230及omalizumab-G1d-v3對人類FcγR之結合活性之評價
為既存抗體之omalizumab對人類FcγRIIb之結合有增強之omalizumab-G1d-v3之Fc區與對各人類FcγR之親和性解析之結果，如實施例(8-2)所示。omalizumab-BP230之Fc區以與對各人類FcγR之親和性也同樣地解析，其結果如表22所示。
(8-4-3)血小板凝集能力之評價
其次使用來自FcγRIIa之基因多型係R/H型之提供者之血小板測定實施例(8-4-1)製作之omalizumab-BP230與omalizumab-G1d-v3之結合，從其測定結果驗證是否由於對FcγRIIa之親和性之強弱會改變血小板凝集能力。
血小板凝集使用血小板凝集能力測定裝置HEMATRACER712(LMS(股)公司)測定。首先，將於含有0.5 mL之3.8%檸檬酸鈉之4.5 mL真空採血管逐一採取一定分量之約50 mL之全血以200 g進行15分鐘離心分離，將回收之上清當作Platelet Rich Plasma(PRP)。將使用緩衝液 A(137 mM NaCl、2.7 mM KCl、12 mM NaHCO3、0.42 mM NaH2PO4、2 mM MgCl2、5 mM HEPES、5.55 mM dextrose、1.5 U/mL apyrase、0.35% BSA)洗滌過的PRP再替換為緩衝液B(137 mM NaCl、2.7 mM KCl、12 mM NaHCO3、0.42 mM NaH2PO4、2 mM MgCl2、5 mM HEPES、5.55 mM dextrose、2 mM CaCl2、0.35% BSA)。其結果製備密度約300,000/μL之洗淨血小板。在設置於血小板凝集能力測定裝置、含攪拌棒之測定用比色管中分注150.2μL之洗淨血小板。在該裝置內維持在37.0℃之比色管內，將血小板利用攪拌棒以1000 rpm攪拌。於其中加入製備為最終濃度各成為600μg/mL之24.3μL之omalizumab-G1d-v3或omalizumab-BP230，反應1分鐘後，加入製備為與抗體之莫耳比成為1：1之IgE 25.4μL，使混合液反應5分鐘。再將不會起二次凝集之濃度之腺苷二磷酸(ADP、SIGMA)加到反應液，確認是否凝集增強。洗淨血小板使用從FcγRIIa之多型為R/H之1名健常人獲得之洗淨血小板。
上述試驗法獲得之結果如圖21所示。從圖21所示之結果，當添加含有omalizumab-G1d-v3之免疫複合體的情形，觀察到明顯的血小板凝集，另一方面，添加含有omalizumab-BP230之免疫複合的情形，比起添加PBS之情形未觀察到有差別的血小板凝集。
其次測定由於omalizumab-G1d-v3及omalizumab-BP230所致血小板之活化。血小板之活化可藉由CD62p(p-selectin)或活性型細胞黏合素此類活化標記 在血小板膜表面之表現增加以測定。在依前述方法製備之洗淨血小板7.51μL添加製備成最終濃度成為600μg/mL之1.22μL的omalizumab-G1d-v3或omalizumab-BP230，於室溫反應5分鐘。之後，加入製備為使與抗體之莫耳比為1：1的IgE 1.27μL，再於室溫反應5分鐘後，確認是否有誘導血小板之活化。作為陰性對照，使用將免疫複合體替換為添加磷酸緩衝液(pH7.4、Gibco)之樣本。將反應後之各樣本使用PE標識抗CD62抗體(BECTON DICKINSON)、PerCP標識抗CD61抗體、FITC標識PAC-1抗體(BD bioscience)進行螢光染色，各螢光強度使用流式細胞計數器(FACS CantoII、BD bioscience)測定。洗淨血小板使用從FcγRIIa之多型為R/H之1名健常人獲得之洗淨血小板。
上述試驗法獲得之結果如圖22及圖23所示。血小板膜表面之CD62p及活性型細胞黏合素之表現，均由於添加含omalizumab-G1d-v3之免疫複合體而增加。另一方面，添加了omalizumab-BP230之免疫複合體在血小板膜表面之該等之分子之表現，與添加磷酸緩衝液在血小板膜表面之表現為同程度。
從該等之結果，可知：包含IgG1之Fc區之EU編號表示之267位之Ser取代為Glu、328位之Leu取代為Phe之既有的改變Fc區且對人類FcγRIIb之結合增強、對人類FcγRIIaR之結合也增強之抗體，比起包含EU編號表示之233位之Glu取代為Asp、237位之Gly取代為Asp、238 位之Pro取代為Asp、268位之His取代為Asp、271位之Pro取代為Gly、296位之Tyr取代為Asp、330位之Ala取代為Arg、439位之Lys取代為Glu取代之Fc區且對人類FcγRIIb之結合有選擇的增強之抗體，較會促進FcγRIIa之基因多型當中至少其中之一之對偶基因之131號之胺基酸為Arg之血小板之凝集及活化。亦即含有既有的對人類FcγRIIb之結合增強之Fc區變異體之抗體，啟示對於有FcγRIIaR之對偶基因之人類可能有提高由於血小板凝集所致血栓症發病之風險之可能性之問題，對FcγRIIb之結合有選擇的增強之Fc區變異體則顯然可克服此問題。
[實施例9]除了導入P238D改變尚導入鉸鏈部分之改變的變異體對FcγRIIb之結合之全面解析
若相對於人類天然型IgG1，要使EU編號表示之238位之Pro取代為Asp之Fc對FcγRIIb之結合更提高，而組合從天然型抗體之解析預測的其他改變，仍無法獲得期待的組合效果。所以嘗試藉由對於EU編號表示之238位之Pro取代為Asp之改變Fc導入全面性的改變，找尋對FcγRIIb之結合增強之變異體。製作作為抗體H鏈使用之導入有IL6R-G1d(序列編號：133)之EU編號表示之252位之Met取代為Tyr之改變、EU編號表示之434位之Asn取代為Tyr之改變的IL6R-F11(序列編號：141)。再製作對於IL6R-F11，導入有EU編號表示之238位之Pro取代為Asp之改變之IL6R-F652(序列編號：142)。分別製備含有 對於L6R-F652，EU編號表示之238位之殘基附近的區(EU編號表示之234位至237位、239位)分別取代為原本的胺基酸及半胱胺酸以外的18種胺基酸而得之抗體H鏈序列之表現質體。抗體L鏈使用IL6R-L(序列編號：135)。該等之變異體係與參考實施例2以同樣方法表現、精製。該等Fc變異體稱為PD變異體。與參考實施例25依同樣方法，全面性的評價各PD變異體對FcγRIIaR型及FcγRIIb之交互作用。
依以下方法，製作表示與各FcγR之交互作用解析結果之圖。將各PD變異體對於各FcγR之結合量之值除以作為對照之改變導入前之抗體(EU編號表示之238位之Pro取代為Asp之改變IL6R-F652/IL6R-L)對各FcγR之結合量之值再乘以100倍的值代表各PD變異體對各FcγR之相對的結合活性之值。橫軸表示各PD變異體對FcγRIIb之相對的結合活性之值、縱軸表示各PD變異體對FcγRIIaR型之相對的結合活性之值(圖24)。
其結果發現：11種變異體對FcγRIIb之結合比起該各改變導入前之抗體有增強，且有維持或增強對FcγRIIaR型之結合之效果。該等之11種變異體對FcγRIIb及FcγRIIaR之結合活性的整理結果如表14所示。又，表中之序列編號表示待評價之變異體之H鏈之序列編號，改變係代表對IL6R-F11(序列編號：141)導入之改變。
【表14】
對已導入P238D之變異體將前述11種改變進一步組合並導入之變異體之對FcγRIIb之相對的結合活性之值、及對不含P238D之Fc導入了該改變之變異體之對FcγRIIb之相對的結合活性之值，如圖25所示。若將該等11種之改變對P238D改變進一步導入，比起導入前對FcγRIIb之結合量增強。另一方面，將G237F、G237W、及S239D以外的8種改變對於不含P238D之變異體導入之情形，顯示對FcγRIIb之結合有減少的效果(資料未顯示)。
從該結果，可知：要依據對天然型IgG1導入之改變之效果預測對含有P238D改變之變異體將相同改變組合並導入時之效果係為困難。又，換言之，本次找到的8種改變，係若未進行對於包含P238D改變之變異體將相同改變組合並導入之本探討則不可能找到的改變。
將表14所示變異體對FcγRIa、FcγRIIaR、FcγRIIaH、FcγRIIb、FcγRIIIaV之KD值，以與參考實施例25同樣方法測定之結果如表15所示。又，表中之改變表示對IL6R-F11(序列編號：141)導入之改變。惟，針 對製作IL6R-F11時作為模板之IL6R-G1d/IL6R-L，以*表示。又，表中之KD(IIaR)/KD(IIb)及KD(IIaH)/KD(IIb)，分別代表將各變異體對於FcγRIIaR之KD值除以各變異體對於FcγRIIb之KD值而得之值、各變異體對於FcγRIIaH之KD值除以各變異體對於FcγRIIb之KD值而得之值。親多胜肽之KD(IIb)/變異體之KD(IIb)，係指親多胜肽對於FcγRIIb之KD值除以各變異體對於FcγRIIb之KD值而得之值。
除此以外，各變異體對於FcγRIIaR及FcγRIIaH之結合活性當中較強之KD值/親多胜肽對於FcγRIIaR及FcγRIIaH之結合活性當中較強之KD值，如表15所示。在此親多胜肽係指：H鏈帶有IL6R-F11(序列編號：141)之變異體。又，表15中以灰色塗滿的小格，FcγR對IgG之結合微弱，判斷為以動力理論解析無法正確解析，係利用參考實施例25記載之[式2]之式計算得之值。
[式2]KD=C˙Rmax/(Req-RI)-C
表15所示，任一變異體比起IL6R-F11，對FcγRIIb之親和性均提高，其提高程度為1.9倍至5.0倍。各變異體對於FcγRIIaR之KD值/各變異體對於FcγRIIb之KD值之比、及各變異體對於FcγRIIaH之KD值/各變異體對於FcγRIIb之KD值之比，表示相對於對FcγRIIaR及FcγRIIaH之結合活性，對FcγRIIb之結合活性之相對 值。亦即，該值係代表各變異體對FcγRIIb之結合選擇性的大小之值，該值愈大，對FcγRIIb之結合選擇性愈高。親多胜肽IL6R-F11/IL6R-L對於FcγRIIaR之KD值/對FcγRIIb之KD值之比、及對FcγRIIaH之KD值/對FcγRIIb之KD值之比均為0.7，故表15之任一變異體比起親多胜肽對FcγRIIb之結合選擇性均較提高。變異體對於FcγRIIaR及FcγRIIaH之結合活性當中較強者之KD值/親多胜肽對於FcγRIIaR及FcγRIIaH之結合活性當中較強者之KD值為1以上係指：其變異體對於FcγRIIaR及FcγRIIaH之結合活性當中較強者之結合與親多胜肽對於FcγRIIaR及FcγRIIaH之結合活性當中較強者之結合為同等、或較減少。本次獲得之變異體中，該值為0.7至5.0，所以可說：本次獲得之變異體對於FcγRIIaR及FcγRIIaH之結合活性當中較強者之結合比起親多胜肽之該結合為大約同等、或更減少。從該等之結果，可知：本次獲得之變異體比起親多胜肽，對FcγRIIaR型及H型之結合活性維持或減少，對FcγRIIb之結合活性增強，對FcγRIIb之選擇性提高。又，對FcγRIa及FcγRIIIaV，任一變異體比起IL6R-F11，親和性均下降。
【表15】
[實施例10]含P238D之Fc與FcγRIIb細胞外區之複合體之X射線結晶構造解析
如前面的實施例9所示，即使對含P238D之Fc導入與FcγRIIb之結合活性提高、或對FcγRIIb之選擇性提高及從天然型IgG1抗體之解析預測之改變，對FcγRIIb之結合活性仍會減弱，其原因據認為係Fc與FcγRIIb之交互作用界面之構造由於導入P238D而改變。而，為了追究該現象之原因，將帶有P238D之變異之IgG1之Fc(以下稱為Fc(P238D))與FcγRIIb細胞外區之複合體之立體構造利用X射線結晶構造解析明確化，並比對天然型IgG1之Fc(以下稱為Fc(WT))與FcγRIIb細胞外區之複合體之立體構造，以比較該等之結合樣式。又，關於Fc與FcγR細胞外區之複合體之立體構造已有多數報告，已有人解析Fc(WT)/FcγRIIIb細胞外區複合體(Nature(2000)400,267-273、J.Biol.Chem.(2011)276,16469-16477)、Fc(WT)/FcγRIIIa細胞外區複合體(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2011)108,12669-126674)、及Fc(WT)/FcγRIIa細胞外區複合體(J.Immunol.(2011)187,3208-3217)之立體構造。至今為止尚無人解析Fc(WT)/FcγRIIb細胞外區複合體之立體構造，但與Fc(WT)之複合體之立體構造為既知之FcγRIIa與FcγRIIb，在細胞外區的胺基酸序列有93%一致，有非常高相同性，所以Fc(WT)/FcγRIIb細胞外區複合體之立體構造，係從Fc(WT)/FcγRIIa細胞外區複合體之結晶構造以模型推定。
針對Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區複合體，利用X射線結晶構造解析以解析能力2.6埃決定立體構造。該 解析結果之構造如圖26所示。係在2個Fc CH2分域之間夾有FcγRIIb細胞外區的方式結合，與至今為止所解析之Fc(WT)與FcγRIIIa、FcγRIIIb、FcγRIIa之各細胞外區之複合體之立體構造類似。其次為了詳細比較，將Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區複合體之結晶構造以及Fc(WT)/FcγRIIb細胞外區複合體之模型構造，對於FcγRIIb細胞外區及Fc CH2分域A以Cα原子間距離為準依最小平方法重合(圖27)。此時、Fc CH2分域B彼此之重疊程度並非良好，可知在該部分的立體構造有差異。再使用Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區複合體之結晶構造及Fc(WT)/FcγRIIb細胞外區複合體之模型構造，比較抽出的FcγRIIb細胞外區與Fc CH2分域B之間其距離為3.7埃以下之原子對，以比較FcγRIIb與Fc(WT)CH2分域B之間之原子間交互作用以及FcγRIIb與Fc(P238D)CH2分域B之間之原子間交互作用。如表16所示，Fc(P238D)與Fc(WT)中，Fc CH2分域B與FcγRIIb之間之原子間交互作用不一致。
【表16】
再將Fc CH2分域A及Fc CH2分域B單獨彼此依照以Cα原子間距離為基準的最小平方法，進行Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區複合體之X射線結晶構造與Fc(WT)/FcγRIIb細胞外區複合體之模型構造之重合，來比較P238D附近之詳細構造。了解到為Fc(P238D)之變異導入位置之EU編號表示之238位之胺基酸殘基之位置隨著Fc(WT)改變，從鉸鏈區起接續之238位之胺基酸殘基的附近的環圈構造在Fc(P238D)與Fc(WT)會改變(圖28)。原本在Fc(WT)，EU編號表示之238位之Pro位於Fc之內側， 與238位之周圍殘基形成疏水性核。但當EU編號表示之238位之Pro改變為帶電荷之非常親水的Asp之情形，變化的Asp殘基直接存在於疏水性核在脫溶劑和的觀點、能量觀點為不利。而，Fc(P238D)中，為了解除該能量上的不利，EU編號表示之238位之胺基酸殘基會改變為配向於溶劑側之形態，據認為對於238位之胺基酸殘基附近之環圈構造也會帶來變化。且該環圈由於距離以S-S鍵交聯的鉸鏈區不遠，所以該構造變化不限於局部變化，也會影響到Fc CH2分域A與分域B的相對配置，其結果據推測也會造成FcγRIIb與Fc CH2分域B之間之原子間交互作用的差異。所以，據認為即使對已有P238D改變之Fc組合在天然型IgG對FcγRIIb之選擇性、結合活性提高之改變，仍無法獲得預測的效果。
又，由於P238D導入造成構造變化之結果，在Fc CH2分域A中，相鄰於已導入變異之P238D的EU編號表示之237位之Gly之主鏈與FcγRIIb之160位之Tyr之間會產生氫鍵(圖29)。相當於Tyr160之殘基在FcγRIIa為Phe，在與FcγRIIa結合之情形，並未形成該氫鍵。160位之胺基酸，若一併考慮係在與Fc之交互作用界面，EcγRIIa與FcγRIIb之間之少數差異之一，可推測FcγRIIb特有之該氫鍵之有無，會成為Fc(P238D)之對FcγRIIb之結合活性之提高、對FcγRIIa之結合活性之減少、選擇性提高的原因。又，針對Fc CH2分域B，在EU編號表示之270位之Asp與FcγRIIb之131位之Arg之間可觀察到靜電的 交互作用(圖30)。為FcγRIIa之一副型的FcγRIIaH型中，FcγRIIb之131位之Arg所對應之殘基為His，未能形成該靜電交互作用。由此可說明比起FcγRIIaR型，FcγRIIaH型對Fc(P238D)之結合活性減少之理由。從依據如此之X射線結晶構造解析之結果推測，可知：由於P238D導入所致其附近之環圈構造變化及伴隨的分域配置之相對變化，會形成在天然型IgG與FcγR之結合所未見的新的交互作用，可能與P238D變異體對於FcγRIIb之選擇性的結合輪廓相關。
[Fc(P238D)之表現精製]
包含P238D改變之Fc之製備依以下方式進行。首先將hIL6R-IgG1-v1(序列編號：143)之EU編號表示之220位之Cys取代為Ser且EU編號表示之236位之Glu起其C末端利用PCR選殖之基因序列Fc(P238D)，與參考實施例1及2記載之方法以同樣方法進行之表現載體之製作、表現、精製。又，EU編號表示之220位之Cys在通常之IgG1中，係與L鏈之Cys形成雙硫鍵，但僅製備Fc的情形，未使L鏈共表現，所以為了避免不必要的雙硫鍵形成，將該Cys殘基取代為Ser。
[FcγRIIb細胞外區之表現精製]
FcγRIIb細胞外區依參考實施例25之方法製備。
[Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區複合體之精製]
對於在結晶化使用之獲得之FcγRIIb細胞外區樣本2 mg，加入作為與glutathione S-transferase之融合蛋 白由大腸菌表現精製之Endo F1(Protein Science(1996)5,2617-2622)0.29 mg，以0.1M Bis-Tris pH6.5之緩衝條件在室溫靜置3日，以將與FcγRIIb細胞外區之Asn直接鍵結之N-乙醯基葡萄糖胺以外之N型糖鏈切斷。然後將利用5000MWCO之超過濾膜濃縮且經糖鏈切斷處理之FcγRIIb細胞外區樣本，利用經以20mM HEPS pH7.5,0.05M NaCl平衡化之凝膠過濾管柱層析(Superdex200 10/300)精製。再於獲得之糖鏈切斷FcγRIIb細胞外區級分，將Fc(P238D)以莫耳比計算時FcγRIIb細胞外區有若干過量的方式混合。將經10000MWCO之超過濾膜濃縮之前述混合液使用經20 mM HEPS pH7.5、0.05M NaCl平衡化之凝膠過濾管柱層析(Superdex200 10/300)精製，獲得Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區複合體之樣本。
[Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區複合體之結晶化]
使用經10000MWCO之超過濾膜濃縮成約10 mg/ml之前述Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區複合體之試樣，利用sitting-drop蒸氣擴散法將該複合體結晶化。結晶化使用Hydra II Plus One(MATRIX)，對100 mM Bis-Tris pH6.5、17% PEG3350、0.2 M Ammonium acetate、及2.7%(w/v)D-Galactose之貯池溶液，以貯池溶液：結晶化樣本為0.2μl：0.2μl混合，製成結晶化液滴。將密封的該結晶化液滴於20℃靜置，獲得薄板狀之結晶。
[來自Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區複合體結晶之X射線繞射資料之測定]
將獲得之Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區複合體之1個單結晶浸於100 mM Bis-Tris pH6.5、20% PEG3350、Ammonium acetate、2.7%(w/v)D-Galactose、Ethylene glycol 22.5%(v/v)之溶液後，藉由使用附微小的尼龍環的銷，將溶液鏟出，於液態氮中冷凍。使用高能量加速器研究機構之放射光設施Phonton Factory之BL-1A，測定前述結晶之X射線繞射數據。又，測定中一直將冷凍結晶放置在-178℃之氮氣流中，藉此維持冷凍狀態。使用束線具備並安裝的CCD偵測器Quantum 270(ADSC)，使結晶每次旋轉0.8°，收集總共225張X射線繞射影像。從獲得之繞射影像之晶格常數之決定、對於繞射斑點賦予指數、及繞射數據之處理，係以程式Xia2(CCP4 Software Suite)、XDS Package(Walfgang Kabsch)及Scala(CCP4 Software Suite)進行。最終，獲得解析能力至多2.46埃之該結晶之繞射強度數據。本結晶，屬於空間群P21，晶格常數a=48.85埃、b=76.01埃、c=115.09埃、α=90°、β=100.70°、γ=90°。
[Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區複合體之X射線結晶構造解析]
利用使用程式Phaser(CCP4 Software Suite)之分子取代法，決定Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區複合體之結晶之結構。從獲得之結晶格子之大小以及Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區複合體之分子量，預測非對稱單元中之分子數為一個。從為Fc(WT)/FcγRIIIa細胞外區複合 體之結晶構造之PDB code：3SGJ之結構座標，取出之A鏈239-340號及B鏈239-340號之胺基酸殘基部分當做另一座標，各設定為Fc CH2分域之探索用模型。同樣從PDB c0de：3SGJ之結構座標取出之A鏈341-444號與B鏈341-443號之胺基酸殘基部分作為一個座標，設定為Fc CH3分域之探索用模型。最後，從為FcγRIIb細胞外區之結晶構造之PDB code 2FCB之結構座標取出之A鏈6-178號之胺基酸殘基，設定為FcγRIIb細胞外區之探索用模型。依照Fc CH3分域、FcγRIIb細胞外區、Fc CH2分域之順序，從旋轉函數及並進函數決定各探索用模型於結晶格子內之走向與位置，而獲得Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區複合體結晶構造之初始結構模型。對於該初始結構模型，進行使2個Fc CH2分域、2個Fc CH3分域及FcγRIIb細胞外區各域移動的剛體精密化，在該時點對於25-3.0埃之繞射強度資料，結晶學的可靠度因子R值為40.4%、Free R值為41.9%。又，一面參考利用使用程式Refmac5(CCP4 Software Suite)之結構精密化、與由實驗決定之結構因子Fo與從模型計算之結構因子Fc及使用位相計算之以2Fo-Fc、Fo-Fc當做係數之電子密度輿圖，一面反複進行於程式Coot(Paul Emsley)上進行模型修正。藉此進行模型之精密化。最後，依據以2Fo-Fc、Fo-Fc當做係數之電子密度輿圖，將水分子納入模型，進行精密化，使用解析能力為25-2.6埃之24291個繞射強度資料，最終，對於含4846個非氫原子之模型，結晶學的可靠度因子R值為 23.7%、Free R值為27.6%。
[Fc(WT)/FcγRIIb細胞外區複合體之模型構造製作]
依據為Fc(WT)/FcγRIIa細胞外區複合體之結晶構造之PDB code：3RY6之構造座標，使用程式Disovery Studio 3.1(Accelrys)之Build Mutants機能，以使與FcγRIIb之胺基酸序列一致之方式，對於構造座標中之FcγRIIa導入變異。此時，定Optimization Level為High、Cut Radius為4.5，使產生5個模型，採用其中能量分數最好者，設定為Fc(WT)/FcγRIIb細胞外區複合體之模型構造。
[實施例11]依據結晶構造決定改變處之Fc變異體對於FcγR之結合之解析
依實施例10獲得之Fc(P238D)與FcγRIIb細胞外區之複合體之X射線結晶構造解析之結果，構建對於EU編號表示之238位之Pro取代為Asp之改變Fc中，預測會影響與FcγRIIb之交互作用之部位(EU編號表示之233位、240位、241位、263位、265位、266位、267位、268位、271位、273位、295位、296位、298位、300位、323位、325位、326位、327位、328位、330位、332位、334位之殘基)導入全面性改變之變異體，以探討是否可獲得除了P238D改變還有增強FcγRIIb之結合之改變之組合。
製作對IL6R-G1d(序列編號：134)，EU編號表示之439位之Lys取代為Glu之IL6R-B3(序列編號：144)。其次， 製作IL6R-B3之EU編號表示之238位之Pro取代為Asp之IL6R-BF648。抗體L鏈共通使用IL6R-L(序列編號：135)。將依照與參考實施例2為同樣之方法表現之該等之抗體之變異體精製。依參考實施例25之方法，全面性的評價該等抗體變異體對各FcγR(FcγRIa、FcγRIIaH型、FcγRIIaR型、FcγRIIb、FcγRIIIaV型)之結合。
依以下方法，製作表示對各FcγR之交互作用解析結果之圖。將各變異體對各FcγR之結合量之值除以作為對照之改變導入前之抗體(EU編號表示之238位之Pro取代為Asp之改變IL6R-BF648/IL6R-L)對於各FcγR之結合量之值再乘以100倍的值代表各變異體對各FcγR之相對的結合活性之值。橫軸表示各變異體對FcγRIIb之相對的結合活性之值、縱軸表示各變異體對FcγRIIaR型之相對的結合活性之值(圖31)。
其結果如圖31所示發現：所有改變中，24種變異體對比起改變導入前之抗體，維持或增強對FcγRIIb之結合。關於該等變異體對FcγR之結合如表17所示。又，表中之改變係代表對IL6R-B3(序列編號：144)導入之改變。惟，針對製作IL6R-B3時作為模板之IL6R-G1d/IL6R-L，以*表示。
【表17】
表17所示變異體對FcγRIa、FcγRIIaR、FcγRIIaH、FcγRIIb、FcγRIIIaV型之KD值依參考實施例25之方法測定之結果，整理如表18。表中之改變係代表對 IL6R-B3(序列編號：144)導入之改變。惟，針對製作IL6R-B3時作為模板之IL6R-G1d/IL6R-L，以*表示。又，表中之KD(IIaR)/KD(IIb)及KD(IIaH)/KD(IIb)，分別代表將各變異體對於FcγRIIaR之KD值除以各變異體對於FcγRIIb之KD值而得之值、各變異體對於FcγRIIaH之KD值除以各變異體對於FcγRIIb之KD值而得之值。親多胜肽之KD(IIb)/變異體之KD(IIb)，係指親多胜肽對於FcγRIIb之KD值除以各變異體對於FcγRIIb之KD值而得之值。除此以外，各變異體對於FcγRIIaR及FcγRIIaH之結合活性當中較強者之KD值/親多胜肽對於FcγRIIaR及FcγRIIaH之結合活性當中較強者之KD值，如表18所示。在此親多胜肽係指：H鏈帶有IL6R-B3(序列編號：144)之變異體。又，表18中以灰色塗滿的小格，FcγR對IgG之結合微弱，判斷為以動力理論解析無法正確解析，係利用參考實施例25記載之[式2]之式計算得之值。
[式2]KD=C˙Rmax/(Req-RI)-C
【表18】
從表18，任一變異體均比起IL6R-B3對FcγRIIb之 親和性提高、其提高的幅度為2.1倍至9.7倍。各變異體對於FcγRIIaR之KD值/各變異體對於FcγRIIb之KD值之比、及各變異體對於FcγRIIaH之KD值/各變異體對於FcγRIIb之KD值之比，表示相對於對FcγRIIaR及FcγRIIaH之結合活性，對FcγRIIb之結合活性之相對值。亦即，該值係代表各變異體對FcγRIIb之結合選擇性的大小之值，該值愈大，對FcγRIIb之結合選擇性愈高。親多胜肽IL6R-F11/IL6R-L對於FcγRIIaR之KD值/對FcγRIIb之KD值之比、及對FcγRIIaH之KD值/對FcγRIIb之KD值之比各為0.3、0.2，故表18之任一變異體比起親多胜肽對FcγRIIb之結合選擇性均較提高。變異體對於FcγRIIaR及FcγRIIaH之結合活性當中較強者之KD值/親多胜肽對於FcγRIIaR及FcγRIIaH之結合活性當中較強者之KD值為1以上係指：其變異體對於FcγRIIaR及FcγRIIaH之結合活性當中較強者之結合與親多胜肽對於FcγRIIaR及FcγRIIaH之結合活性當中較強者之結合為同等、或較減少。本次獲得之變異體中，該值為4.6至34.0，所以可說：本次獲得之變異體對於FcγRIIaR及FcγRIIaH之結合活性當中較強者之結合比起親多胜肽之該結合為減少。從該等之結果，可知：本次獲得之變異體比起親多胜肽，對FcγRIIaR型及H型之結合活性維持或減少，對FcγRIIb之結合活性增強，對FcγRIIb之選擇性提高。又，對FcγRIa及FcγRIIIaV，任一變異體比起IL6R-B3，親和性均下降。
針對獲得之組合變異體之中有前景者從結晶構造推察其效果之要因。圖32顯示Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區複合體之結晶構造。其中，位在左側之H鏈為FcA鏈、位在右側之H鏈為Fc鏈B。在此可知FcA鏈之EU編號表示之233位之部位，位在FcγRIIb之113位之Lys之附近。惟，本結晶構造中，E233之側鏈其電子密度未能順利觀察，處於運動性相當高的狀態。因此EU編號表示之233位之Glu取代為Asp之改變，由於側鏈短了1個碳的分量造成側鏈之自由度減小，其結果在FcγRIIb之113位與Lys交互作用形成時之熵損失減少，結果據推測有助於結合自由能之提高。
圖33，顯示同樣Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區複合體之構造之中，EU編號表示之330位之部位附近之環境。從該圖可知Fc(P238D)之Fc A鏈之EU編號表示之330位之部位周邊係由FcγRIIb之85位之Ser、86位之Glu、163位之Lys等構成的親水性的環境。因此推測EU編號表示之330位之Ala取代為Lys、或取代為Arg之改變，有助於強化與FcγRIIb之85位之Ser、86位之Glu之交互作用。
圖34係將Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區複合體及Fc(WT)/FcγRIIIa細胞外區複合體之結晶構造，以相對於Fc鏈B依Cα原子間距離之最小平方法重合之EU編號表示之271位之Pro之構造。該等二個構造良好地一致，但EU編號表示之271位之Pro之部位，成為相異之立體構 造。又，若一併考慮Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區複合體結晶構造中，其周邊之電子密度弱，藉由使Fc(P238D)/FcγRIIb中，EU編號表示之271位為Pro，在構造上會有大負荷，啟示可能因而造成該環圈構造未能取得最適構造。因此EU編號表示之271位之Pro取代為Gly之改變，據推測藉由對該環圈構造賦予柔軟性、減少與FcγRIIb交互作用時採最適構造時之能量障礙，有助於結合增強。
[實施例12]藉由與P238D組合以增強對FcγRIIb之結合之改變之組合效果之驗證
驗證在實施例9及11獲得之改變之中，觀察到有增強對FcγRIIb之結合之效果或維持對FcγRIIb之結合，並抑制對其他FcγR之結合之效果之改變彼此組合獲得之效果。
與實施例11之方法同樣，將從表14及18選出之特別優異的改變對於抗體H鏈IL6R-BF648導入。抗體L鏈使用IL6R-L，依與參考實施例1同樣之方法精製表現的抗體。依照與參考實施例25同樣之方法，全面性的評價對各FcγR(FcγRIa、FcγRIIaH型、FcγRIIaR型、FcγRIIb、FcγRIIIaV型)之結合。
依以下方法，製作表示與各FcγR之交互作用解析結果之圖。將各變異體對於各FcγR之結合量之值除以作為對照之改變導入前之抗體(EU編號表示之238位之Pro取代為Asp之改變IL6R-BF648/IL6R-L)對各FcγR之結合量 之值再乘以100倍的值代表各變異體對各FcγR之相對的結合活性之值(表19)。又，表中之改變表示對IL6R-B3(序列編號：144)導入之改變。惟，針對製作IL6R-B3時作為模板之IL6R-G1d/IL6R-L，以*表示。
【表19-1】 表19-2係接續表19-1之表。
【表19-2】
將表19所示變異體對FcγRIa、FcγRIIaR、FcγRIIaH、FcγRIIb、FcγRIIIaV之KD值，以與參考實施例25同樣方法測定之結果整理於表20-1及20-2。又， 表中之改變表示對IL6R-B3(序列編號：144)導入之改變。惟，針對製作IL6R-B3時作為模板之IL6R-G1d/IL6R-L，以*表示。又，表中之KD(IIaR)/KD(IIb)及KD(IIaH)/KD(IIb)，分別代表將各變異體對於FcγRIIaR之KD值除以各變異體對於FcγRIIb之KD值而得之值、各變異體對於FcγRIIaH之KD值除以各變異體對於FcγRIIb之KD值而得之值。親多胜肽之KD(IIb)/變異體之KD(IIb)，係指親多胜肽對於FcγRIIb之KD值除以各變異體對於FcγRIIb之KD值而得之值。除此以外，各變異體對於FcγRIIaR及FcγRIIaH之結合活性當中較強者之KD值/親多胜肽對於FcγRIIaR及FcγRIIaH之結合活性當中較強者之KD值，如表20-1及20-2所示。在此親多胜肽係指：H鏈帶有IL6R-B3(序列編號：144)之變異體。又，表20-1及20-2中以灰色塗滿的小格，FcγR對IgG之結合微弱，判斷為以動力理論解析無法正確解析，係利用參考實施例25記載之[式2]之式計算得之值。
[式2]KD=C˙Rmax/(Req-RI)-C
從表20-1及20-2，任一變異體比起IL6R-B3，對FcγRIIb之親和性均提高，其提高程度為3.0倍至99.0倍。各變異體對於FcγRIIaR之KD值/各變異體對於FcγRIIb之KD值之比、及各變異體對於FcγRIIaH之KD值/各變異體對於FcγRIIb之KD值之比，表示相對於對 FcγRIIaR及FcγRIIaH之結合活性，對FcγRIIb之結合活性之相對值。亦即，該值係代表各變異體對FcγRIIb之結合選擇性的大小之值，該值愈大，對FcγRIIb之結合選擇性愈高。親多胜肽IL6R-B3/IL6R-L對於FcγRIIaR之KD值/對FcγRIIb之KD值之比、及對FcγRIIaH之KD值/對FcγRIIb之KD值之比各為0.3、0.2，故表20-1及20-2之任一變異體比起親多胜肽對FcγRIIb之結合選擇性均較提高。變異體對於FcγRIIaR及FcγRIIaH之結合活性當中較強者之KD值/親多胜肽對於FcγRIIaR及FcγRIIaH之結合活性當中較強者之KD值為1以上係指：其變異體對於FcγRIIaR及FcγRIIaH之結合活性當中較強者之結合與親多胜肽對於FcγRIIaR及FcγRIIaH之結合活性當中較強者之結合為同等、或較減少。本次獲得之變異體中，該值為0.7至29.9，所以可說：本次獲得之變異體對於FcγRIIaR及FcγRIIaH之結合活性當中較強者之結合比起親多胜肽之該結合為大約同等、或更減少。從該等之結果，可知：本次獲得之變異體比起親多胜肽，對FcγRIIaR型及H型之結合活性維持或減少，對FcγRIIb之結合活性增強，對FcγRIIb之選擇性提高。又，對FcγRIa及FcγRIIIaV，任一變異體比起IL6R-B3，親和性均下降。
【表20-1】 表20-2為接續表20-1之表。
[實施例13]對FcγRIIb之結合有增強之變異體之製作
如實施例8所示，當對FcγRIIb之結合增強時，宜在儘可能限制其他活性型對於FcγR之結合的前提，增強對FcγRIIb之結合較佳。而製作將增強對FcγRIIb之結合、或有選擇性提高效果之改變彼此組合，以及對FcγRIIb之結合增強或選擇性提高之變異體。具體而言，以在對FcγRIIb之結合之增強、選擇性之提高顯示優異效果之P238D之改變作為基礎，與在實施例9、實施例11、實施例12之P238D之改變組合觀察到有效果之改變彼此更進一步組合。
製作組合於IL6R-G1d(序列編號：133)、IL6R-B3(序列編號：144)之Fc區，與在實施例9、實施例11、實施例12之P238D之改變組合認為有效果之改變、E233D、L234Y、G237D、S267Q、H268D、P271G、Y296D、K326D、K326A、A33OR、A330K之變異體。抗體L鏈使用IL6R-L(序列編號：135)，依參考實施例1及2之方法，將重鏈含有該等變異體之抗體表現、精製。依參考實施例25之方法評價各變異體對各FcγR(FcγRIa、FcγRIIaH、FcγRIIaR、FcγRIIb、FcγRIIIaV)之結合。
各變異體對各FcγR之KD如表21所示。改變表示對IL6R-B3(序列編號：144)導入之改變。惟，針對製作各變異體時作為模板之IL6R-B3/IL6R-L，以*表示。又，表中之「KD(IIaR)/KD(IIb)」，該值愈大表示對FcγRIIb之選擇性愈高。「親多胜肽之KD(IIb)/改變多胜肽之KD (IIb)」，係指將IL6R-B3/IL6R-L對於FcγRIIb之KD值除以各變異體對於FcγRIIb之KD值而得之值。又，「親多胜肽之KD(IIaR)/改變多胜肽之KD(IIaR)」，係指將IL6R-B3/IL6R-L對於FcγRIIaR之KD值除以各變異體對於FcγRIIaR之KD值而得之值。又，表21中以灰色塗滿的小格，FcγR對IgG之結合微弱，判斷為以動力理論解析無法正確解析，係利用參考實施例25記載之[式2]之式計算得之值。
[式2]KD=C˙Rmax/(Req-RI)-C
【表21】
令對於含有人類天然型IgG1之序列之IL6R-G1d/IL6R-L之H鏈導入了K439E之改變而得之IL6R-B3/IL6R-L對各FcγR之結合為1之情形，IL6R-G1d/IL6R-L對FcγRIa之結合為1.3倍、對FcγRIIaR之結合為1.1倍、對FcγRIIaH之結合為1.1倍、對FcγRIIb之結合為1.2倍、對FcγRIIIaV之結合為0.9倍，IL6R-G1d/IL6R-L之IL6R-B3/IL6R-L之對於該等全部FcγR之結合為同等。因此，將各變異體對各FcγR之結合與該改變導入前之IL6R-B3/IL6R-L比較，可認為與將各變異體對各FcγR之結合與含人類天然型IgG1之序列之IL6R-G1d/IL6R-L對各FcγR之結合比較為同等。而在之後的實施例，將各變異體對各FcγR之結合活性，與該改變導入前之IL6R-B3/IL6R-L對各FcγR之結合活性比較。從表21，比起改變導入前之IL6R-B3，任一變異體對FcγRIIb之結合活性均提高，最低之IL6R-BF648/IL6R-L之結合活性提高2.6倍、最高之IL6R-BP230/IL6R-L之結合活性提高147.6倍。又，代表選擇性之KD(IIaR)/KD(IIb)之數值，最低的IL6R-BP234/IL6R-L為10.0、最高的IL6R-BP231/IL6R-L成為32.2，任一變異體之該數值均比改變導入前之IL6R-B3/IL6R-L之0.3的選擇性提高。又，任一變異體均為對FcγRIa、FcγRIIaH、FcγRIIIaV之結合活性比起改變導入前之IL6R-B3/IL6R-L之此等結合活性低。
[實施例14]對FcγRIIb之結合增強之Fc區與FcγRIIb 細胞外區之複合體及與FcγRIIaR細胞外區之複合體之X射線結晶構造解析
實施例13中，對FcγRIIb之結合最增強之變異體IL6R-BP230/IL6R-L對FcγRIIb之結合，比起改變導入前之IL6R-B3/IL6R-L增強約150倍，對FcγRIIaR之結合也壓抑在約1.9倍之增強。因此，摸索製作係IL6R-BP230/IL6R-L對FcγRIIb之結合、選擇性均優異的變異體，且在儘可能抑制對FcγRIIaR之結合之前提更增強對FcγRIIb之結合之更佳的變異體之可能性。
如實施例10之圖30所示，在含有P238D之改變之Fc區，CH2分域B之EU編號270位表示之Asp與FcγRIIb之131號之Arg之間形成強固的靜電交互作用，但該131號之胺基酸殘基在FcγRIIIa及FcγRIIaH為His，相對於此，在FcγRIIaR與FcγRIIb同樣為Arg。其結果，在FcγRIIaR與FcγRIIb之間，131號之胺基酸殘基與CH2分域B之EU編號270位表示之Asp的交互作用不會有差異。此據認為是Fc區對FcγRIIb之結合與對FcγRIIaR之結合不易展現選擇性的要因。
另一方面，FcγRIIa與FcγRIIb細胞外區之胺基酸序列，其93%為相同，有非常高相同性。若分析天然型IgG1之Fc區(以下Fc(WT))與FcγRIIaR之細胞外區複合體之結晶構造(J.Imunol.(2011)187,3208-3217)，在兩者之交互作用之界面附近，FcγRIIaR與FcγRIIb之間僅找出3個胺基酸(Gln127、Leu132、Phe160)的差異，可預見 改善Fc區對FcγRIIb之結合與對FcγRIIaR之結合之選擇性相當困難。
所以，為了達成Fc區對FcγRIIb之結合活性更增強，及提高Fc區對FcγRIIb之結合與對FcγRIIaR之結合之選擇性，不僅解析對FcγRIIb之結合增強之Fc區與FcγRIIb細胞外區之複合體之立體構造，也一併解析對FcγRIIb之結合增強之Fc區與FcγRIIaR細胞外區之複合體之立體構造，明瞭該Fc區與FcγRIIb之交互作用以及該Fc區與FcγRIIaR之交互作用的微妙差異，係為重要。而，解析成為在最早製作IL6R-BP230/IL6R-L之基礎的變異體且從實施例12製作之IL6R-BP208/IL6R-L之Fc區排除K439E之改變後之Fc(P208)與FcγRIIb細胞外區、或FcγRIIaR細胞外區之複合體之X射線結晶構造。
(14-1)Fc(P208)與FcγRIIb細胞外區之複合體之X射線結晶構造解析 [Fc(P208)之表現精製]
Fc(P208)依如以下方式製備。首先製作IL6R-BP208之EU編號表示之439位之Glu取代為天然型人類IgG1之序列Lys之IL6R-P208。然後以編碼為EU編號表示之220位之Cys取代為Ser之變異體的DNA作為模板，選殖EU編號表示之216位之Glu開始其C末端利用PCR選殖之基因序列Fc(P208)。依參考實施例1及2記載之方法進行表現載體之製作、表現、精製。又，通常之IgG1之EU編號表示之220位之Cys，會與L鏈存在之Cys形成雙硫鍵， 但僅製備Fc之情形，為了不共表現L鏈，為了避免不必要的雙硫鍵形成，將該220位之Cys取代為Ser。
[FcγRIIb細胞外區之表現精製]
FcγRIIb細胞外區依參考實施例25之方法製備。
[Fc(P208)FcγRIIb細胞外區複合體之精製]
對於在結晶化使用之獲得之FcγRIIb細胞外區樣本1.5 mg，加入作為與glutathione S-transferase之融合蛋白由大腸菌表現之精製產物Endo F1(Protein Science(1996)5,2617-2622)0.15 mg，以0.1M Bis-Tris pH6.5之緩衝條件在室溫靜置3日，以將與FcγRIIb細胞外區樣本中之Asn直接鍵結之N-乙醯基葡萄糖胺以外之N型糖鏈切斷。然後將利用5000MWCO之超過濾膜濃縮且經前述糖鏈切斷處理之FcγRIIb細胞外區樣本，利用經以20mM HEPS pH7.5,0.05M NaCl平衡化之凝膠過濾管柱層析(Superdex200 10/300)精製。再於獲得之糖鏈切斷FcγRIIb細胞外區之精製級分，將Fc(P208)以莫耳比計算時FcγRIIb細胞外區有若干過量的方式加入，經10000MWCO之超過濾膜濃縮後，使用經20 mM HEPS pH7.5、0.05M NaCl平衡化之凝膠過濾管柱層析(Superdex200 10/300)精製。如前述獲得之精製級分作為Fc(P208)/FcγRIIb細胞外區複合體之樣本，供之後的探討使用。
[Fc(P208)/FcγRIIb複合體細胞外區複合體之結晶化]
將利用10000MWCO之超過濾膜濃縮成約10 mg/ml之Fc(P208)/FcγRIIb細胞外區複合體之樣本，利用 hanging drop蒸氣擴散法併用Seeding法結晶化。結晶化使用VDXm板(Hampton Research)，對0.1M Bis-Tris pH6.5、19%(w/v)PEG3350、0.2 M Potassium Phosphate dibasic之貯池溶液，以貯池溶液：結晶化樣本=0.85μl：0.85μl混合製成之結晶化液滴，添加從以同樣條件獲得之同複合體之結晶使用Seed Bead(Hampton Research)粉碎之種結晶溶液製成之稀釋溶液0.15μl，密閉於裝有貯池之井，於20℃靜置以獲得板狀結晶。
[從Fc(P208)/FcγRIIb細胞外區複合體結晶而來之X射線繞射資料之測定]
將獲得之Fc(P208)/FcγRIIb細胞外區複合體之1個單結晶浸於0.1M Bis-Tris pH6.5、24%(w/v)PEG3350、0.2 M Potassium Phosphate dibasic、20%(v/v)Ethylene glycol之溶液後，藉由使用附微小的尼龍環的銷，將溶液鏟出，於液態氮中冷凍之該單結晶而來之X射線繞射資料，係以Spring-8之BL32XU測定。又，測定中一直將冷凍結晶放置在-178℃之氮氣流中，藉此維持冷凍狀態。使用束線具備並安裝的CCD偵測器MX-225HE(RAYONIX)，使結晶每次旋轉0.6°，收集總共300張X射線繞射影像。從獲得之繞射影像之晶格常數之決定、對於繞射斑點賦予指數、及繞射數據之處理，係以程式Xia2(J.Appl.Cryst.(2010)43,186-190)、XDS Package(Acta Cryst.(2010)D66,125-132)及Scala(Acta Cryst.(2006)D62,72-82)進行。最終，獲得解析能力至 多2.81埃之該單結晶之繞射強度數據。本結晶，屬於空間群C2221，晶格常數a=156.69埃、b=260.17埃、c=56.85埃、α=90°、β=90°、γ=90°。
[Fc(P208)/FcγRIIb細胞外區複合體之X射線結晶構造解析]
Fc(P208)/FcγRIIb細胞外區複合體之構造利用使用程式Phaser(J.Appl.Cryst.(2007)40,658-674)之分子取代法決定。從獲得之結晶格子之大小以及Fc(P208)/FcγRIIb細胞外區複合體之分子量，預測非對稱單元中之複合體數為一個。從為Fc(WT)/FcγRIIIa細胞外區複合體之結晶構造之PDB code：3SGJ之結構座標，取出之A鏈239-340號及B鏈239-340號之胺基酸殘基部分當做另一座標，各設定為Fc CH2分域之探索用模型。同樣從PDB code：3SGJ之結構座標取出之A鏈341-444號與B鏈341-443號之胺基酸殘基部分作為一個座標，設定為Fc CH3分域之探索用模型。最後，從為FcγRIIb細胞外區之結晶構造之PDB code 2FCB之結構座標取出之A鏈6-178號之胺基酸殘基，設定為Fc(P208)之探索用模型。欲將Fc CH3分域、FcγRIIb細胞外區、Fc CH2分域之各探索用模型於結晶格子內之走向與位置，依旋轉函數與並進函數決定，結果未能順利決定CH2分域之一之位置。而從基於其餘三個部分計算的位相計算之電子密度輿圖，參考Fc(WT)/FcγRIIIa細胞外區複合體之結晶構造來決定最後之CH2分域A之位置，獲得Fc(P208)/FcγRIIb細胞外區複合 體結晶構造之初始模型。對於該初始模型，進行使2個FcCH2分域、2個Fc CH3分域及FcγRIIb細胞外區各域移動的剛體精密化，在已進行了剛體精密化之該時點，使用25-3.0埃之繞射強度資料之構造模型之結晶學的信賴度因子R值為42.6%、Free R值為43.7%。又，一面觀察依據使用程式REFMAC5(Acta Cryst.(2011)D67,355-367)之構造精密化、與由依據實驗決定之結構因子Fo與從模型計算之結構因子Fc計算之位相計算之以2Fo-Fc、Fo-Fc當做係數之電子密度輿圖，一面反複進行於程式Coot(Acta Cryst.(2010)D66,486-501)上進行模型修正，藉此進行模型之精密化。再依據以2Fo-Fc、Fo-Fc當做係數之電子密度輿圖，將水分子納入構造模型，進行精密化，最終使用解析能力為25-2.81埃之27259個繞射強度資料，對於含4786個非氫原子之模型，結晶學的可靠度因子R值為24.5%、Free R值為28.2%。
構造解析之結果，Fc(P208)/FcγRIIb細胞外區複合體之立體構造以解析能力2.81埃決定。其解析之結果，取得之構造如圖35所示。係2個Fc區之CH2分域之間以夾入FcγRIIb之細胞外區之方式結合，與至今為止所解析之天然型IgG之FcFc(WT)與FcγRIIIa(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2011)108,12669-126674)、FcγRIIIb(Nature(2000)400,267-273、J.Biol.Chem.(2011)276,16469-16477)、及FcγRIIa(J.Immunol.(2011)187(6),3208-3217) 之各細胞外區之複合體之立體構造與類似。
若觀察細部，Fc(P208)/FcγRIIb細胞外區之複合體，由於G237D及P238D之改變導入之影響，比起Fc(WT)/FcγRIIaR細胞外區之複合體，Fc區之CH2分域A之鉸鏈區起接續之EU編號表示之233位至239位之環圈構造已變化(圖36)。其結果，Fc(P208)之EU編號表示之237位之Asp主鏈與FcγRIIb之160號之Tyr側鏈之間認為會形成牢固的氫鍵(圖37)。該160號之胺基酸殘基，在FcγRIIaH及FcγRIIaR均為Phe，不可能形成氫鍵，因此本氫鍵據認為對於獲得Fc(P208)對FcγRIIb之結合活性之提高及對FcγRIIa之結合活性減少這些Fc(P208)對FcγRIIb之結合及對FcγRIIa之結合之選擇性有重要的貢獻。
另一方面，Fc(P208)之EU編號表示之237位之Asp之側鏈本身在與FcγRIIb結合時，未形成特別顯著的交互作用，未觀察到與Fc區內部其他殘基的交互作用。在該EU編號表示之237位之Asp之周圍，Fc區內之EU編號表示之332位之Ile、333位之Glu、334位之Lys位於附近(圖38)。若藉由將該等之部位之胺基酸殘基取代為親水性殘基，與Fc(P208)之EU編號表示之237位之Asp側鏈形成交互作用，能使環圈構造安定化，據認為該Fc區與FcγRIIb之160號之Tyr形成氫鍵，伴隨於此熵的能量損失輕減，結合自由能增加，也就是結合活性可能提高。
將實施例10所示之含P238D之改變之Fc(P238D)與 FcγRIIb細胞外區之複合體之X射線結晶構造、及Fc(P208)與FcγRIIb細胞外區之複合體之X射線結晶構造加以比較，Fc(P208)比起Fc(P238D)，多了新的5個變異，多是在側鏈水平的變化。惟，在Fc區之CH2分域B藉由將EU編號表示之271位之Pro改變為Gly，在主鏈水平觀察到位置變化，同時EU編號表示之266-270位之環圈之構造也會起變化(圖39)。如實施例11所示，Fc(P238D)之EU編號表示之270位之Asp與FcγRIIb之131號之Arg形成牢固的靜電交互作用時，該EU編號表示之271位之Pro部分啟示可能受有立體化學性的壓力。本次EU編號表示之271位之胺基酸改變為Gly所見到的構造變化，據認為係消除改變前之Pro累積的構造性應變的結果，其消除分量據推測與FcγRIIb之結合自由能之改善，亦即結合活性之提高有關。
再者，確認：起因於該EU編號表示之266-271位之環圈之構造變化，EU編號表示之292位之Arg會以二狀態起構造變化。此時，該EU編號表示之292位之Arg與Fc(P208)之一改變殘基即EU編號表示之268位之Asp所形成之靜電交互作用(圖39)，據認為有助於本環圈構造之安定化。本環圈中之EU編號表示之270位之Asp與FcγRIIb之131號之Arg形成之靜電交互作用，對於Fc(P208)與FcγRIIb之結合活性大有貢獻，所以藉由使該環圈構造結合時之構形安定化，能減輕伴隨結合之熵的能量損失，可能與本改變增加結合自由能，亦即結合活性之提高相關。
又，依據本構造解析結果，詳細調查目標為活性更高之改變之可能性，就作為改變導入部位之一候選者，找到EU編號表示之239位之Ser。如圖40所示，該CH2分域B之EU編號表示之239位之Ser位在FcγRIIb之117號之Lys從構造上觀察以最自然形態延伸之方向。但本次解析未觀察FcγRIIb之117號之Lys之電子密度，所以未採一定之構造，現狀也認為該Lys117涉及與Fc(P208)之交互作用係有限定的。該CH2分域B之EU編號表示之239位之Ser改變為有負電荷之Asp或Glu之情形，能期待與帶正電荷之FcγRIIb之117號之Lys之間之靜電交互作用，其結果可期待對FcγRIIb之結合活性提高。
另一方面，若觀察CH2分域A之EU編號表示之239位之Ser之構造，本胺基酸側鏈與EU編號表示之236位之Gly之主鏈形成氫鍵，使從鉸鏈區起接續之包含與FcγRIIb之160號之Tyr之側鏈形成氫鍵之以EU編號表示之237位之Asp之233位至239位之環圈構造安定化(圖37)。該環圈構造結合時之構形安定化係指伴隨結合之熵的能量損失減少，結果使結合自由能之增加，亦即結合活性提高。另一方面，CH2分域A之EU編號表示之239位之Ser改變為Asp或Glu之情形，喪失與EU編號表示之236位之Gly之主鏈間的氫鍵，環圈構造可能不安定化。且可能與鄰近存在之EU編號表示之265位之Asp發生靜電排斥，據認為使環圈構造更不安定化。該不安定化分量之能量，作用於FcγRIIb之結合自由能之減少，結果可能導致結合活 性下降。
(14-2)Fc(P208)與FcγRIIaR細胞外區之複合體之X射線結晶構造解析 [FcγRIIaR細胞外區之表現精製]
FcγRIIaR細胞外區，依參考實施例2之方法製備。
[Fc(P208)/FcγRIIaR型細胞外區複合體之精製]
對於在經精製之FcγRIIaR細胞外區樣本1.5 mg，加入作為與glutathione S-transferase之融合蛋白由大腸菌表現之Endo F1(Protein Science(1996)5,2617-2622)精製產物0.15 mg、20μl之5 U/ml濃度之Endo F2(QA-bio)及20μl之5 U/ml濃度之Endo F3(QA-bio)，以0.1M Na Acetate pH4.5之緩衝條件在室溫靜置9日後，追加0.07 mg之前述Endo F1、7.5μl之前述Endo F2及7.5μl之前述Endo F3後靜置3日，以將與FcγRIIaR細胞外區樣本中之Asn直接鍵結之N-乙醯基葡萄糖胺以外之N型糖鏈切斷。然後將利用10000MWCO之超過濾膜濃縮且經前述糖鏈切斷處理之FcγRIIaR細胞外區樣本，利用經以25 mM HEPES pH7、0.1M NaCl平衡化之凝膠過濾管柱層析(Superdex200 10/300)精製。再於獲得之糖鏈切斷FcγRIIaR細胞外區之精製級分，將Fc(P208)以莫耳比計算時FcγRIIaR細胞外區有若干過量的方式加入，經10000MWCO之超過濾膜濃縮後，使用經25mM HEPES pH7、0.1M NaCl平衡化之凝膠過濾管柱層析(Superdex200 10/300)精製。如前述獲得之精製級分作為Fc(P208)/ FcγRIIaR細胞外區複合體之樣本，供之後的探討使用。
[Fc(P208)/FcγRIIaR型細胞外區複合體之結晶化]
使用經10000MWCO之超過濾膜濃縮成約10 mg/ml之前述Fc(P208)/FcγRIIaR型細胞外區複合體之試樣，利用sitting-drop蒸氣擴散法結晶化。對0.1 M Bis-Tris pH7.5、26%(w/v)PEG3350、0.2 M Ammonium Sulfae之貯池溶液，以貯池溶液：結晶化樣本為0.8μl：1.0μl混合，製成結晶化液滴以密封劑密閉並於20℃靜置，獲得板狀之結晶。
[來自Fc(P208)/FcγRIIaR細胞外區複合體結晶之X射線繞射資料之測定]
將前述獲得之Fc(P208)/FcγRIIaR細胞外區複合體之1個單結晶浸於0.1 M Bis-Tris pH7.5、27.5%(w/v)PEG3350、0.2 M Ammonium Sulfate、20%(v/v)Glycerol之溶液後，藉由使用附微小的尼龍環的銷，將溶液鏟出，於液態氮中冷凍之來自該單結晶中之X射線繞射資料係使用高能量加速器研究機構之放射光設施Phonton Factory之BL-1A測定。又，測定中一直將冷凍結晶放置在-178℃之氮氣流中，藉此維持冷凍狀態，使用束線具備並安裝的CCD偵測器Quantum 315r(ADSC)，使該單結晶每次旋轉0.6°，收集總共225張X射線繞射影像。從獲得之繞射影像之晶格常數之決定、對於繞射斑點賦予指數、及繞射數據之處理，係以程式Xia2(J.Appl.Cryst.(2010)43,186-190)、XDS Package(Acta Cryst.(2010)D66,125-132) 及Scala(Acta Cryst.(2006)D62,72-82)進行。最終，獲得解析能力至多2.87埃之繞射強度數據。本結晶，屬於空間群C2221，晶格常數a=154.31埃、b=257.61埃、c=56.19埃、α=90°、β=90°、γ=90°。
[Fc(P208)/FcγRIIaR型細胞外區複合體之X射線結晶構造解析]
利用使用程式Phaser(J.Appl.Cryst.(2007)40,658-674)之分子取代法，決定Fc(P208)/FcγRIIaR型細胞外區複合體之結晶之結構。從獲得之結晶格子之大小以及Fc(P208)/FcγRIIaR細胞外區複合體之分子量，預測非對稱單元中之分子數為一個。使用實施例(14-1)獲得之Fc(P208)/FcγRIIb細胞外區複合體之結晶構造作為探索用模型，從旋轉函數及並進函數決定Fc(P208)/FcγRIIaR細胞外區複合體在結晶格子內之走向及位置。對於該獲得之初始構造模型，進行使2個Fc CH2分域、2個Fc區之CH3分域及FcγRIIaR細胞外區獨立移動的剛體精密化，在已結束剛體精密化之該時點，使用25-3.0埃之繞射強度資料之構造模型之結晶學的信賴度因子R值為38.4%、Free R值為30.0%。又，一面觀察依據使用程式REFMAC5(Acta Cryst.(2011)D67,355-367)之構造精密化、與由依據實驗決定之結構因子Fo與從模型計算之結構因子Fc計算之位相計算之以2Fo-Fc、Fo-Fc當做係數之電子密度輿圖，一面反複進行於程式Coot(Acta Cryst.(2010)D66,486-501)上進行模型修正，藉此進行模型之精密化。再依 據以2Fo-Fc、Fo-Fc當做係數之電子密度輿圖，將水分子納入構造模型，進行精密化，最終使用解析能力為25-2.87埃之24838個繞射強度資料，對於含4758個非氫原子之模型，結晶學的可靠度因子R值為26.3%、Free R值為38.0%。
構造解析之結果，Fc(P208)/FcγRIIaR細胞外區複合體之立體構造以解析能力2.87埃決定。將Fc(P208)/FcγRIIaR型細胞外區複合體之結晶構造，與實施例(14-1)所示Fc(P208)/FcγRIIb細胞外區複合體之結晶構造比較。結果兩Fcγ受體間反映非常高之胺基酸同一性，從全體構造掌握的水平幾乎未見到差異(圖41)。
但若詳細觀察在電子密度水平的構造，可找出可能改善Fc區對FcγRIIb之結合與對FcγRIIaR之結合之選擇性的差異。FcγRIIaR之160號之胺基酸殘基不是Tyr而是Phe，如圖42所示，包含P238D之改變之Fc區與FcγRIIb結合時存在之Fc區CH2分域A之EU編號表示之237位之胺基酸殘基之主鏈與FcγRIIb之160號Tyr之間之氫鍵，據認為在包含P238D之改變之Fc區與FcγRIIb之結合未形成。該氫鍵不形成據認為係改善導入有P238D之改變之Fc區對FcγRIIb之結合與對FcγRIIaR之結合之選擇性之要因，進一步於電子密度水平比較時，可明確認認該Fc區與FcγRIIb之複合體中以EU編號表示之235位之Leu、及EU編號表示之234位之Leu之側鏈之電子密度，相對於此，在該Fc區與FcγRIIaR之複合體，該等側鏈之電儀密度不明確，以EU編號表示之237位附近之環圈，隨著與在 其附近之FcγRIIaR交互作用之下降，而搖動。另一方面，比較該Fc區之CH2分域B之相同區之構造(圖43)時，該Fc區與FcγRIIb之複合體構造中，可確認直到EU編號表示之237位之Asp之電子密度，相對於此，該Fc區與FcγRIIaR之複合體中，比EU編號表示之237位之Asp前面的3個殘基，亦即直到EU編號表示之234位之Leu左右可確認電子密度，比起對FcγRIIb之結合，據認為使用較廣區域形成交互作用。從以上啟示：在該Fc區與FcγRIIb之結合，EU編號表示之234位至238位之區之Fc區之CH2分域A側之貢獻大，在該Fc區與FcγRIIaR之結合，EU編號表示之234位至238位之區之Fc區之CH2分域B側之貢獻大。
[實施例15]依據結晶構造決定改變處之Fc變異體
於在實施例14對EcγRIIb之結合為增強之變異體(P208)之分域B內，伴隨P271G改變之導入所致周圍之構造變化之結果，啟示EU編號表示之268位之Asp與EU編號表示之292位之Arg有靜電交互作用(圖39)。該交互作用形成係作用於EU編號表示之266位至271位之環圈構造之安定化，結果據認為可能有助於對FcγRIIb之結合增強。探討藉由將該變異體之EU編號表示之268位之Asp取代為Glu，是否能使前述靜電交互作用強化、該變異體之環圈構造更安定化，對FcγRIIb之結合增強。又，如圖38所示，FcγRIIb之EU編號表示之160位之Tyr，與P208之分域A之EU編號表示之237位之Asp之主鏈交互作用。 另一方面，EU編號表示之237位之Asp之側鏈，位在分子內之EU編號表示之332位之Ile、333位之Glu、334位之Lys之附近，但未有特別突出的交互作用。一併驗證藉由將該等之部位取代為親水性胺基酸殘基，使與EU編號表示之237位之Asp之側鏈之交互作用增強、EU編號表示之266位至271位之環圈構造安定化，是否與FcγRIIb之160號之Tyr之交互作用會增強。
以對於實施例13製作之FcγRIIb顯示優異選擇性之IL6R-BP230/IL6R-L作為模板，製作分別導入從構造資訊找出的H268E、I332T、I332S、I332E、I332K、E333K、E333R、E333S、E333T、K334S、K334T、K334E之改變而得的變異體。抗體L鏈使用IL6R-L(序列編號：135)。將依參考實施例1及2之方法表現之含有前述重鏈之變異體與IL6R-L之輕鏈的抗體精製。經精製之抗體對各FcγR(FcγRIa、FcγRIIaH、FcγRIIaR、FcγRIIb、FcγRIIIaV)之結合依參考實施例25之方法評價。各變異體對各FcγR之KD如表22所示。又，表中之改變表示對IL6R-B3(序列編號：144)導入之改變。惟，針對製作IL6R-BP230時作為模板之IL6R-B3/IL6R-L，以*表示。又，表中之親多胜肽之KD(IIb)/改變多胜肽之KD(IIb)，係指IL6R-B3/IL6R-L對於FcγRIIb之KD值除以各變異體對於FcγRIIb之KD值而得之值。又，親多胜肽之KD(IIaR)/改變多胜肽之KD(IIaR)，係指將IL6R-B3/IL6R-L對FcγRIIaR之KD值除以各變異體 對FcγRIIaR之KD值而得之值。KD(IIaR)/KD(IIb)係指：各變異體對於FcγRIIaR之KD除以該變異體對於FcγRIIb之KD而得之值，該值愈大代表對FcγRIIb之選擇性愈高。又，表22之中以灰色塗滿的小格之數值，係FcγR對IgG之結合微弱，判斷為無法以動力理論解析正確解析，故依參考實施例25記載之式算得之數值。
[式2]KD=C˙Rmax/(Req-RI)-C
對IL6R-BP230/IL6R-L導入有H268E之改變之IL6R-BP264/IL6R-L、導入有E333K之改變之IL6R-BP465/IL6R-L、導入有E333R之改變之IL6R-BP466/IL6R-L、導入有E333T之改變之IL6R-BP470對FcγRIIb之結合活性、及FcγRIIb之選擇性，比起IL6R-BP230/IL6R-L之這些性質均為提高。又，導入有I332T之改變之IL6R-BP391/IL6R-L之FcγRIIb之選擇性，比起IL6R-BP230/IL6R-L雖下降，但對FcγRIIb之結 合活性提高。
[實施例16]對EU編號表示之271位之周邊之胺基酸殘基之改變的全面性導入
在Fc(P208)與FcγRIIb之構造與Fc(P238D)/FcγRIIb之構造之比較中，觀察到最大差異係Fc區之CH2分域B之EU編號表示之271位之附近之構造(圖39)。如實施例11所示，在Fc(P238D)，EU編號表示之270位之Asp與FcγRIIb之131號之Arg形成牢固的靜電交互作用時，啟示對於EU編號表示之271位之Pro部分可能施加立體化學性的壓力。Fc(P208)/FcγRIIb之構造中，藉由將EU編號表示之271位之Pro取代為Gly，會在主鏈水平引起位置變化，使該構造的應變消除，其結果，據認為271位之附近之構造會起大變化。若能使該變化之271位之附近之構造更安定化，據認為伴隨與FcγRIIb之131號之Arg形成靜電交互作用之結合，能更減少熵的能量損失。而藉由將對EU編號表示之271位之周邊之胺基酸殘基之改變全面性的導入，探索顯示Fc區對FcγRIIb之結合之增強或選擇性提高之改變。
作為將改變全面性的導入的模板，製作對IL6R-B3(序列編號：144)導入了E233D、G237D、P238D、H268E、P271G之改變的IL6R-BP267。抗體L鏈使用IL6R-L(序列編號：135)。將依參考實施例1及2之方法表現之包含前述重鏈之變異體與IL6R-L之輕鏈之抗體精製。經精製之抗體對各FcγR(FcγRIa、FcγRIIaH、FcγRIIaR、FcγRIIb、 FcγRIIIaV)之結合，依參考實施例25之方法評價。將IL6R-BP267之EU編號表示之264位、265位、266位、267位、269位、272位之胺基酸，各取代為取代前之胺基酸與Cys以外的18種胺基酸。抗體L鏈使用IL6R-L(序列編號：135)。將依參考實施例1及2之方法表現之含前述重鏈之變異體與IL6R-L之輕鏈之抗體精製。依參考實施例25之方法精製之抗體對各FcγR(FcγRIa、FcγRIIaH、FcγRIIaR、FcγRIIb、FcγRIIIaV))之結合，依參考實施例25之方法評價。從獲得之變異體之中，比起導入改變前之IL6R-BP267/IL6R-L對FcγRIIb之結合或FcγIIb之選擇性，對FcγRIIb之結合為增強之變異體、或對FcγRIIb之選擇性提高之變異體，如表23所示。
各變異體對各FcγR之KD如表23所示。又，表中之改變係指：對作為模板之IL6R-BP267導入之改變。惟製作IL6R-B3時作為模板使用之IL6R-B3/IL6R-L以*表示。又，表中之親多胜肽之KD(IIb)/改變多胜肽之KD(IIb)，係 將IL6R-B3/IL6R-L對於FcγRIIb之KD值除以各變異體對於FcγRIIb之KD值而得之值。又，親多胜肽之KD(IIaR)/改變多胜肽之KD(IIaR)，係指將IL6R-B3/IL6R-L對FcγRIIaR之KD值除以各變異體對FcγRIIaR之KD值而得之值。KD(IIaR)/KD(IIb)係指：各變異體對於FcγRIIaR之KD除以該變異體對於FcγRIIb之KD而得之值，該值為愈大，代表對FcγRIIb之選擇性愈高。又，表23中以灰色塗滿的小格中之數值，FcγR對IgG之結合為微弱，判斷為以動力理論解析無法正確解析，係利用參考實施例25記載之[式2]之式計算得之值。
[式2]KD=C˙Rmax/(Req-RI)-C
表23所示之變異體對FcγRIa、FcγRIIaH、FcγRIIIaV之結合活性，均比IL6R-B3/IL6R-L之此等性質維持或減少。又，對IL6R-BP267/IL6R-L各施加S267A、V264I、E269D、S267E、V266F、S267G、V266M之改變之變異體對FcγRIIb之結合活性，比起施加改變前之IL6R-BP267/IL6R-L之此等性質有增強。又，對IL6R-BP267/IL6R-L各施加S267A、S267G、E272M、E272Q、D265E、E272D、E272N、V266L、E272I、E272F之改變之變異體之KD(IIaR)/KD(IIb)之值，比起施加改變前之IL6R-BP267/IL6R-L之此等性質為增加，可知S267A、S267G、E272M、E272Q、D265E、E272D、E272N、V266L、E272I、 E272F之改變顯示對FcγRIIb之選擇性提高之效果。
[實施例17]由於對CH3區導入改變所得之對FcγRIIb之結合增強
據報告EU編號表示之396位之Pro取代為Leu之改變會增強對FcγRIIb之結合(Cancer Res.(2007)67,8882-8890)。EU編號表示之396位之胺基酸係與FcγR之交互作用無直接相關的部位，但藉由使抗體之構造變化，據認為會影響與FcγR之交互作用。而藉由對於Fc區之EU編號表示之396位之胺基酸導入全面性改變，驗證Fc領域對FcγRIIb之結合或選擇性是否提高。
作為將改變全面性的導入的模板，製作對IL6R-B3(序列編號：144)導入有E233D、G237D、P238D、S267A、H268E、P271G、A330R之改變之IL6R-BP423。製作IL6R-BP423之EU編號表示之396位之胺基酸取代為取代前之胺基酸與半胱胺酸以外的18種胺基酸的變異體。抗體L鏈使用IL6R-L(序列編號：135)。依參考實施例1之方法，將表現之含前述重鏈之變異體與IL6R-L之輕鏈之抗體精製。經精製之抗體對各FcγR(FcγRIa、FcγRIIaH、FcγRIIaR、FcγRIIb、FcγRIIIaV)之結合，依參考實施例25之方法評價。獲得之變異體對各FcγR之結合如表24所示。
【表24】
又，表中之「對IL6R-BP423施加之改變」係指對於作 為模板之IL6R-BP423導入之改變。惟，製作IL6R-BP423時當作模板之IL6R-B3/IL6R-L以*表示。又，表中之親多胜肽之KD(IIb)/改變多胜肽之KD(IIb)，係指將IL6R-B3/IL6R-L對於FcγRIIb之KD值除以各變異體對於FcγRIIb之KD值而得之值。又，親多胜肽之KD(IIaR)/改變多胜肽之KD(IIaR)，係指將IL6R-B3/IL6R-L對FcγRIIaR之KD值除以各變異體對FcγRIIaR之KD值而得之值。KD(IIaR)/KD(IIb)係指：各變異體對於FcγRIIaR之KD除以該變異體對於FcγRIIb之KD而得之值，該值為愈大，代表對FcγRIIb之選擇性愈高。又，表24中以灰色塗滿的小格中之數值，FcγR對IgG之結合為微弱，判斷為以動力理論解析無法正確解析，係利用參考實施例25記載之[式2]之式計算得之值。
[式2]KD=C˙Rmax/(Req-RI)-C
從表24之結果，對IL6R-BP423/IL6R-L導入有P396M之改變之IL6R-BP456/IL6R-L、導入有P396L之改變之IL6R-BP455/IL6R-L、導入有P396Y之改變之IL6R-BP464/IL6R-L、導入有P396F之改變之IL6R-BP450/IL6R-L、導入有P396D之改變之IL6R-BP448/IL6R-L、導入有P396Q之改變之IL6R-BP458/IL6R-L、導入有P396I之改變之IL6R-BP453/IL6R-L、導入有P396E之改變之 IL6R-BP449/IL6R-L、導入有P396K之改變之IL6R-BP454/IL6R-L、導入有P396R之改變之IL6R-BP459/IL6R-L對FcγRIIb之結合活性，均比導入改變前之IL6R-BP423/IL6R-L之此性質為提高。又，對IL6R-BP423/IL6R-L導入有P396M之改變之IL6R-BP456/IL6R-L之KD(IIaR)/KD(IIb)之值，比起改變導入前之IL6R-BP423/IL6R-L之此性質大，對FcγRIIb之選擇性提高。表24中製作之變異體，對FcγRIa、FcγRIIaH、FcγRIIIaV之結合活性，均比親多胜肽IL6R-B3/IL6R-L之該性質低。
[實施例18]以次類別序列之利用製作對FcγRIIb之結合為增強之變異體
依人類IgG存在之次類別，對FcγR之結合輪廓相異。驗證IgG1與IgG4對各FcγR之結合活性之差異，能否利用在對FcγRIIb之結合活性之增強、及/或選擇性之提高。首先，解析IgG1與IgG4對各FcγR之結合活性。作為抗體H鏈，製作包含人類IgG4之EU編號表示之228位之Ser取代為Pro、C末端之Gly及Lys經除去之Fc區G4d之IL6R-G4d(序列編號：164)作為抗體H鏈。抗體L鏈使用IL6R-L(序列編號：135)。將依參考實施例1及2之方法表現之含IL6R-L之輕鏈與IL6R-G1d/IL6R-L或IL6R-G4d/IL6R-L之抗體精製。經精製之抗體對各FcγR(FcγRIa、FcγRIIaH、FcγRIIaR、FcγRIIb、FcγRIIIaV)之結合，依參考實施例25之方法評價。獲得 之變異體對各FcγR之結合，整理於表25。
IL6R-G4d/IL6R-L對FcγRIIb之結合，比起IL6R-G1d/IL6R-L之此性質，強1.5倍，相對於此IL6R-G4d/IL6R-L對FcγRIIaR之結合，比起IL6R-G1d/IL6R-L之此性質，顯示弱2.2倍。又，IL6R-G4d/IL6R-L對FcγRIa、FcγRIIaH、FcγRIIIaV之結合活性，比起IL6R-G1d/IL6R-L之此性質弱。從以上之結果，可知：IL6R-G4d對FcγRIIb之結合活性、選擇性，都比IL6R-G1d有較好性質。
圖44係顯示G1d與G4d之CH1至C末端為止的序列(EU編號表示之118位至445位)的比較的排列。圖44中之粗框包圍的胺基酸顯示於G1d與G4d相異之胺基酸殘基。該等之相異之胺基酸之中，選擇幾個預測會涉及於FcγR之交互作用的部位，將從對FcγRIIb之結合活性、選擇性之觀點都提供理想性質之G4d之序列中之至少1個以上的胺基酸殘基移植到對FcγRIIb之結合有增強之變異體，驗證是否對FcγRIIb之結合更增強、及/或選擇性更提高。
具體而言製作為IL6R-BP230導入有A327G之改變之IL6R-BP473、導入有A330S之改變之IL6R-BP472、導入有 P331S之改變之IL6R-BP471、導入有A330S及P331S之改變之IL6R-BP474、導入有A327G及A330S之改變之IL6R-BP475、導入有A327G、A330S、及P331S之改變之IL6R-BP476、導入有A327G及P331S之改變之IL6R-BP477。又，製作IL6R-BP230之EU編號表示之118位之Ala至225位之Thr為止之胺基酸取代為EU編號表示之118位之Ala至222位之Pro構成之G4d之序列之胺基酸的IL6R-BP478。抗體L鏈使用IL6R-L(序列編號：135)。依參考實施例1及2之方法，將含前述重鏈之變異體與IL6R-L之輕鏈之抗體精製。經精製之抗體對各FcγR(FcγRIa、FcγRIIaH、FcγRIIaR、FcγRIIb、FcγRIIIaV)之結合依參考實施例25之方法評價。
各變異體對各FcγR之KD如表26所示。又，表中之「親多胜肽之KD(IIb)/改變多胜肽之KD(IIb)」，指IL6R-B3/IL6R-L對於FcγRIIb之KD值除以各變異體對於FcγRIIb之KD值而得之值。表中之「對IL6R-BP230施加之改變」，表示對IL6R-BP230導入之改變。惟，製作IL6R-BP230時當作模板之IL6R-B3/IL6R-L以*1表示。又，IL6R-BP230之EU編號表示之118位之Ala至225位之Thr取代為由EU編號表示之118位之Ala至222位之Pro構成之G4d之序列的IL6R-BP478，以*2表示。「親多胜肽之KD(IIaR)/改變多胜肽之KD(IIaR)」，指IL6R-B3/IL6R-L對FcγRIIaR之KD值除以該變異體對於EcγRIIaR之KD值而得之值。KD(IIaR)/KD(IIb)係指：各變異體對於 FcγRIIaR之KD除以該變異體對於FcγRIIb之KD而得之值，該值愈大代表對FcγRIIb之選擇性愈高。又，表26之中以灰色塗滿的小格之數值，係FcγR對IgG之結合微弱，判斷為無法以動力理論解析正確解析，故依參考實施例25記載之式算得之數值。
[式2]KD=C˙Rmax/(Req-RI)-C
【表26】
表26記載之變異體之中，導入有A327G之改變之IL6R-BP473/IL6R-L對FcγRIIb之結合，比起 IL6R-BP230/IL6R-L之此性質，有1.2倍增強。又，IL6R-BP230之EU編號表示之118位之Ala至225位之Thr之胺基酸取代為由EU編號表示之118位之Ala至222位之Pro構成之G4d之序列之胺基酸之IL6R-BP478/IL6R-L對FcγRIIb及對FcγRIIaR之結合，比起IL6R-BP230/IL6R-L之此性質，皆有1.1倍增強。任一變異體對FcγRIa、FcγRIIaH、FcγRIIIaV之結合活性，都比親多胜肽IL6R-B3/IL6R-L之此性質低。
對圖44所示之其他部位之變異體也進一步驗證。具體而言，製作對抗體H鏈之IL6R-BP230導入有K274Q之IL6R-BP541、導入有Y296F之IL6R-BP542、導入有H268Q之IL6R-BP543、導入有R355Q之IL6R-BP544、導入有D356E之IL6R-BP545、導入有L358M之IL6R-BP546、導入有K409R之IL6R-BP547、導入有Q419E之IL6R-BP548。抗體L鏈共通使用IL6R-L。依參考實施例1及2之方法，將含前述重鏈之變異體與IL6R-L之輕鏈之抗體精製。將經精製之抗體依參考實施例25之方法，對各FcγR(FcγRIa、FcγRIIaH、FcγRIIaR、FcγRIIb、FcγRIIIaV)之結合依參考實施例25之方法評價。
各變異體對各FcγR之KD如表27所示。又，表中之「親多胜肽之KD(IIb)/改變多胜肽之KD(IIb)」，指IL6R-B3/IL6R-L對於FcγRIIb之KD值除以各變異體對於FcγRIIb之KD值得到之值。表中之「對IL6R-BP230施加之改變」表示對IL6R-BP230導入之改變。惟，製作 IL6R-BP230時之模板之IL6R-B3/IL6R-L以*1表示。「親多胜肽之KD(IIaR)/改變多胜肽之KD(IIaR)」，指IL6R-B3/IL6R-L對FcγRIIaR之KD值除以該變異體對FcγRIIaR之KD值而得之值。KD(IIaR)/KD(IIb)係指：各變異體對於FcγRIIaR之KD除以該變異體對於FcγRIIb之KD而得之值，該值愈大代表對FcγRIIb之選擇性愈高。又，表27之中以灰色塗滿的小格之數值，係FcγR對IgG之結合微弱，判斷為無法以動力理論解析正確解析，故依參考實施例25記載之式算得之數值。
[式2]KD=C˙Rmax/(Req-RI)-C
如表27所示，對IL6R-BP230/IL6R-L導入有K274Q之IL6R-BP541/IL6R-L、導入有R355Q之IL6R-BP544/IL6R-L、導入有D356E之IL6R-BP545/IL6R-L、導入有L358M之IL6R-BP546/IL6R-L，比起改變導入前之IL6R-BP230/IL6R-L對FcγRIIb之結合為增強。又，其中，對IL6R-BP230/IL6R-L導入有R355Q之IL6R-BP544/IL6R-L、導入有D356E之IL6R-BP545/IL6R-L、導入有L358M之IL6R-BP546/IL6R-L，比起改變導入前之IL6R-BP230/IL6R-L，KD(IIaR)/KD(IIb)之值為增加，為針對對FcγRIIb之選擇性也顯示提高之改變。
[實施例19]帶來對FcγRIIb之結合之增強、選擇性之提高之改變之組合之探討
在直到實施例18為止的實施例，係探討在對FcγRIIb之結合之增強或選擇性之提高方面觀察到有效果之改變的進一步組合。具體而言，對IL6R-B3(序列編號：144)導入至今為止之探討中帶來對FcγRIIb之結合之增強、及/或選擇性之提高之改變之組合。又，作為比較對照，製作既存對FcγRIIb之結合增強之改變(Seung等人(Mol.Immunol.(2008)45,3926-3933))、S267E、及L328F之改變導入於IL6R-B3之IL6R-BP253。抗體L鏈使用IL6R-L(序列編號：135)。將依參考實施例1及2之方法表現之含前述重鏈之變異體與IL6R-L之輕鏈之抗體精製。經精製之抗體對各FcγR(FcγRIa、FcγRIIaH、FcγRIIaR、FcγRIIb、FcγRIIIaV)之結合依參考實施例25之方法評價。
各變異體對各FcγR之KD如表28所示。又，表中之 改變係代表對IL6R-B3(序列編號：144)導入之改變。惟製作各變異體時作為模板之IL6R-B3/IL6R-L以*表示。親多胜肽之KD(IIb)/改變多胜肽之KD(IIb)，係將IL6R-B3/IL6R-L對於FcγRIIb之KD值除以各變異體對於FcγRIIb之KD值而得之值。又，親多胜肽之KD(IIaR)/改變多胜肽之KD(IIaR)，係將IL6R-B3/IL6R-L對FcγRIIaR之KD值除以該變異體對FcγRIIaR之KD而得之值。KD(IIaR)/KD(IIb)係指：各變異體對於FcγRIIaR之KD除以該變異體對於FcγRIIb之KD而得之值，該值愈大，代表比FcγRIIaR對FcγRIIb之選擇性愈高。又，KD(IIaH)/KD(IIb)係指：各變異體對於FcγRIIaH之KD除以該變異體對於FcγRIIb之KD而得之值，該值愈大代表比起FcγRIIaH，對FcγRIIb之選擇性愈高。又，表28之中以灰色塗滿的小格之數值，係FcγR對IgG之結合微弱，判斷為無法以動力理論解析正確解析，故依參考實施例25記載之式算得之數值。
[式2]KD=C˙Rmax/(Req-RI)-C
【表28-1】
表28-2係接續表28-1之表。
【表28-2】
表28-3係接續表28-2之表。
【表28-3】
表28記載之變異體之中，施加增強對FcγRIIb之結合之既有的改變的IL6R-BP253/IL6R-L對FcγRIIb及FcγRIIaR之結合活性，比起改變導入前之 IL6R-B3/IL6R-L之此性質，各有277倍、及529倍增強。又，IL6R-BP253/IL6R-L對FcγRIa之結合活性也比起IL6R-B3/IL6R-L之此性質增強。另一方面IL6R-BP253/IL6R-L對FcγRIIaH及對FcγRIIIaV之結合，比IL6R-B3/IL6R-L之此性質減弱。其他變異體之中，IL6R-BP436/IL6R-L與IL6R-BP438/IL6R-L對FcγRIa之結合，比起改變導入前之IL6R-B3/IL6R-L之此性質，稍有增強，但其他變異體對FcγRIa之結合均減弱。又，任一變異體對FcγRIIaH、及對FcγRIIIaV之結合，比起IL6R-B3/IL6R-L之此性質均減弱。
若比較本探討製作之變異體、既存對FcγRIIb之結合增強之變異體IL6R-BP253/IL6R-L，KD(IIaH)/KD(IIb)之值，在最低之IL6R-BP480/IL6R-L為107.7、最高之IL6R-BP426/IL6R-L為8362，任一變異體均比IL6R-BP253/IL6R-L之107.1高。又，KD(IIaR)/KD(IIb)之值，在最低之IL6R-BP479/IL6R-L為16.1、最高之IL6R-BP559/IL6R-L為58.4，任一變異體均比IL6R-BP253/IL6R-L之0.2高。從該等之結果顯示：表28所示之變異體對於FcγRIIb之選擇性，比起施加了既存對FcγRIIb之結合增強之改變之變異體對於FcγRIIb之選擇性，對FcγRIIb之選擇性均提高。尤其IL6R-BP559/IL6R-L、IL6R-BP493/IL6R-L、IL6R-BP557/IL6R-L、IL6R-BP492/IL6R-L、及IL6R-BP500/IL6R-L對FcγRIIaR之結合，比起 IL6R-B3/IL6R-L均維持1.5倍以下，另一方面，對FcγRIIb之結合活性增強100倍以上，故可期待避免藉由增強對FcγRIIaR之結合可能產生之副作用，且同時顯示對FcγRIIb之結合增強之效果。
又，IL6R-BP489/IL6R-L、IL6R-BP487/IL6R-L、IL6R-BP499/IL6R-L、IL6R-BP498/IL6R-L、IL6R-BP503/IL6R-L、IL6R-BP488/IL6R-L、IL6R-BP490/IL6R-L、IL6R-BP445/IL6R-L、IL6R-BP552/IL6R-L、IL6R-BP507/IL6R-L、IL6R-BP536/IL6R-L、IL6R-BP534/IL6R-L、IL6R-491/IL6R-L、IL6R-BP553/IL6R-L、IL6R-BP532/IL6R-L、IL6R-BP506/IL6R-L、IL6R-BP511/IL6R-L、IL6R-BP502/IL6R-L、IL6R-BP531/IL6R-L、IL6R-BP510/IL6R-L、IL6R-BP535/IL6R-L、IL6R-BP497/IL6R-L、IL6R-BP533/IL6R-L、IL6R-BP555/IL6R-L、IL6R-BP554/IL6R-L、IL6R-BP436/IL6R-L、IL6R-BP423/IL6R-L、IL6R-BP440/IL6R-L、IL6R-BP538/IL6R-L、IL6R-BP429/IL6R-L、IL6R-BP438/IL6R-L、IL6R-BP565/IL6R-L、IL6R-BP540/IL6R-L、BP426/IL6R-L、IL6R-BP437/IL6R-L、IL6R-BP439/IL6R-L、IL6R-BP551/IL6R-L、IL6R-BP494/IL6R-L、IL6R-BP537/IL6R-L、IL6R-BP550/IL6R-L、IL6R-BP556/IL6R-L、 IL6R-BP539/IL6R-L、IL6R-BP558/IL6R-L、IL6R-BP425/IL6R-L、IL6R-BP495/IL6R-L對FcγRIIb之結合，比施加了對FcγRIIb之結合增強之既有改變之IL6R-BP253/IL6R-L之此性質高。該等之中，對FcγRIIb之結合為最低之IL6R-BP495/IL6R-L至最高之IL6R-BP489/IL6R-L之增強幅度，當令IL6R-B3/IL6R-L之結合為1之情形，為321倍至3100倍。因此，該等之變異體，可說是在對FcγRIIb之結合活性增強之程度、及選擇性的兩個方面，比起習知技術更優異的變異體。
[實施例20]鈣依存性的與人類IgA結合之抗體之製備 (20-1)人類IgA(hIgA)之製備
實施例2至4顯示對於小鼠FcγR結合為增強之以pH依存性地結合於抗原即人類IL-6受體之分子，能使血漿中之抗原濃度大幅下降。其次，為了針對投予了對於人類IL-6受體以外之抗原以pH依存性地結合且對小鼠FcγR之結合有增強之抗體之活體之血漿中之可溶型抗原消失效果是否也能被同樣觀察到加以驗證，重新實施使用人類IgA作為抗原之使用抗體之試驗。抗原人類IgA(以下也稱hIgA)(可變區為抗人類IL6R抗體)使用如以下之重組技術製備。將藉由培養含有含H(WT)-IgA1(序列編號：145)與L(WT)(序列編號：42)之重組載體的寄主細胞而表現的hIgA依該技術領域之人士公知之方法使用離子交換層析及凝膠過濾層析精製。
(20-2)與hIgA結合之抗體之表現與精製
GA2-IgG1(重鏈序列編號：146、輕鏈序列編號：147)，係與hIgA結合之抗體。再者，與實施例6及實施例7同樣，為了使抗原(hIgA)從血漿中之消失更為增大，為了增強小鼠FcRn對於GA2-IgG1於pH7.4之結合，製作導入有N434W之胺基酸取代之GA2-N434W(重鏈序列編號：92、輕鏈序列編號：87)。將編碼為GA2-IgG1(重鏈序列編號：146、輕鏈序列編號：147)之DNA序列以該技術領域之人士公知之方法納入動物表現用質體。抗體之表現及精製使用以下方法進行。將人類胎兒腎細胞來源FreeStyle 293-F株(Invitrogen)懸浮於FreeStyle 293 Expression Medium培養基(Invitrogen)而得之細胞懸浮液，以1.33 x 106個/mL之細胞密度對於6井盤的各井各接種3 mL。其次將以脂轉染法製備之質體導入細胞。將該細胞於CO2培養箱(37℃、8%CO2,90 rpm)培養4日，從單離之培養上清使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)以該技術領域之人士公知之方法精製抗體。經精製之抗體溶液之吸光度(波長：280nm)使用分光光度計測定。從獲得之測定值使用依PACE法計算之吸光係數，計算抗體濃度(Protein Science 1995；4：2411-2423)。
(20-3)取得之抗體對於hIgA之Ca依存性結合能力評價
使用Biacore T200(GE Healthcare)評價在實施例(20-2)單離之抗體之hIgA結合活性(解離常數KD(M))。運行緩衝液使用含3μM或1.2 mM CaCl2之0.05% tween20, 20 mmol/l ACES,150 mmol/l NaCl(pH7.4或pH5.8)，測定該結合活性。於感測晶片CM5(GE Healthcare)上以胺基偶聯法將重組型PROTEIN A/G(Thermo Scientific)適量固定化後，使抗體結合。其次注入當做分析物之適當濃度的hIgA(記載於(A1-1))，使與感應晶片上之抗體交互作用。測定於37℃進行。測定後，注入10 mmol/L Glycine-HCl,pH1.5，使感應晶片再生。測定結果使用Biacore T200 Evaluation軟體(GE Healthcare)，利用曲線適擬之解析及平衡值解析，從測定結果計算解離常數KD(M)。其結果如表29。可知：GA2-IgG1在Ca2+濃度為1.2 mM之條件下會與hIgA強力結合，但在Ca2+濃度為3μM之條件下與hIgA顯示弱結合。又，GA2-IgG1在Ca2+濃度為1.2 mM之條件下，於pH7.4與人類IgA強力結合，但在pH5.8與人類IgA為弱結合。亦即GA2-IgG1對人類IgA，以pH依存性、及鈣依存性的結合。
[實施例21]以鈣依存性的結合於hIgA之抗體之變異體之製備
其次，為了使抗原(hIgA)從血漿中之消失更增大，製 作對於以鈣依存性的結合於hIgA之GA2-IgG1對於小鼠FcγR之結合增強，GA2-IgG1之EU編號表示之326位之Lys取代為Asp之GA2-F1087(重鏈序列編號：148)。使用將編碼為GA2-F1087(重鏈序列編號：148、輕鏈序列編號：147)之DNA序列依該技術領域中具有通常知識者公知之方法納入之動物表現用質體，在精製後測定以上述方法表現之該等之抗體變異體之濃度。含有該改變之抗體，如實施例(4-3)所示，對於小鼠FcγR結合大幅增強。
[實施例22]投予了Ca依存性hIgA結合抗體之正常小鼠中，對抗原之血漿中滯留性之影響之評價 (22-1)使用正常小鼠之體內試驗
對正常小鼠(C57BL/6J mouse、Charles River Japan)單獨投予hIgA(人類IgA：於實施例(20-1)製作)、或同時投予hIgA及抗hIgA抗體後之hIgA及抗hIgA抗體之體內動態進行評價。將hIgA溶液(80μg/mL)、或hIgA與抗hIgA抗體之混合溶液，對尾靜脈以10 mL/kg之用量單次投予。抗hIgA抗體使用上述GA2-IgG1及GA2-F1087。
混合溶液中之hIgA濃度皆為80μg/mL，抗hIgA抗體濃度為2.69 mg/mL。此時，相對於hIgA，抗hIgA抗體以以足量過量存在，所以據認為hIgA大部分與抗體結合。在投予GA-IgG1之群中，於投予後5分鐘、7小時、1日、2日、3日、7日從小鼠採血。又，在投予GA-F1087之群中，在投予後5分鐘、30分鐘、1小時、2小時、1日、3日、7日從小鼠採血。將採取的血液立即於4℃以12,000 rpm 進行15分鐘離心分離，獲得血漿。經分離之血漿在直到實施測定為止，保存在設定為-20℃以下的冷凍庫。
(22-2)利用ELISA法測定正常小鼠血漿中之抗hIgA抗體濃度
小鼠血漿中之抗hIgA抗體濃度以ELISA法測定。首先，將Anti-Human IgG(γ-chain specific)F(ab’)2 Fragment of Antibody(SIGMA)分注於Nunc-Immuno Plate,MaxiSoup(Nalge nunc International)的各井，於4℃靜置1晚，製作Anti-Human IgG固相化板。製備血漿中濃度為0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.01563、0.07813μg/mL之抗hIgA抗體之檢量線試樣及稀釋100倍以上之小鼠血漿測定試樣，分注到Anti-Human IgG固相化板，將該板於25℃溫育1小時。之後，使Goat Anti-Human IgG(γ chain specific)Biotin(BIOT)Conjugate(Southern Biotechnology Associats Inc.)分注於該板之各井後，將該板於25℃反應1小時，再將Streptavidin-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)分注於該板之各井後，將該板於25℃反應1小時，使用TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)為基質進行發色反應，以1N-硫酸(Showa Chemical)使反應停止後，以微板讀取儀測定各井之反應液於450 nm之吸光度。小鼠血漿中之抗hIgA抗體濃度，係從檢量線之吸光度使用解析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices)計算。該方法測定之靜脈內投予 後之正常小鼠中的GA2-IgG1及GA2-F1087之血漿中抗體濃度變動如圖45所示。其結果，確認與hIgA有強pH依存性性結合活性之選殖體GA2-IgG1即使FcγR之結合有增強，其血漿中抗體濃度不大幅下降。
(22-3)利用ELISA法測定血漿中hIgA濃度
小鼠之血漿中hIgA濃度，以ELISA法測定。首先，將Goat anti-Human IgA Antibody(BETHYL)分注於Nunc-Immuno Plate,MaxiSoup(Nalge nunc International)的各井，於4℃靜置1晚，製作Anti-Human IgA固相化板。製備血漿中濃度為0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625μg/mL之hIgA檢量線試樣，作為血漿中濃度之標準液。對該等檢量線試樣及稀釋100倍以上之小鼠血漿測定試樣各100μL添加500 ng/mL之hsIL-6R200μL並混合，於室溫靜置1小時。之後分注混合溶液100μL於Anti-Human IgA固相化板，再於室溫靜置1小時。之後，使Biotinylated Anti-human IL-6 R Antibody(R&D)分注於前述板之各井，將該板於室溫反應1小時，再使Streptavidin-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)分注於前述板之各井，將該平於室溫反應1小時，以TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)為基質進行發色反應，以1N-硫酸(Showa Chemical)使反應停止後，以微板讀取儀測定各井之反應液在450 nm之吸光度。小鼠血漿中濃度，係從檢量線之吸光度使用解析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices)計算。該方法測定之靜脈內投予後之正常小鼠中之血漿中hIgA濃度變化如圖46。結果，相對於hIgA單獨之消失，同時投予hIgA與有100倍以上之Ca依存性結合之GA2-IgG1的小鼠，hIgA之消失比起hIgA單獨時大幅加速。且投予hIgA與對FcγR之結合為增強之GA2-F1087之小鼠血漿中，在投予一日後比起測定範圍(0.006μg/mL以上)，hIgA之濃度下降，比投予GA-IgG1之小鼠血漿中hIgA之消失更大幅地加速。由以上，實施例2至實施例7中，投予IL6R與抗IL6R抗體之小鼠中，對於FcγR之結合有增強之抗體所得之抗原除去效果顯示增強，但在投予抗原為hIgA與抗hIgA抗體之小鼠也顯示同樣效果。
[實施例23]pH依存性抗IgE抗體之取得 (23-1)抗人類IgE抗體之取得
為了取得pH依存性抗人類IgE抗體，將抗原人類IgE(重鏈序列編號：149、輕鏈序列編號：150)(可變區由抗人類Glypican3抗體構成)使用FreeStyle293(Life Technologies)表現。將表現的人類IgE依該技術領域中具有通常知識者公知之一般的管柱層析法精製並製備。從取得之多數抗體之中，篩選對於人類IgE以pH依存性地結合之抗體。使用將篩選之抗人類IgE抗體之重鏈及輕鏈之可變區納入有與人類IgG1重鏈不變區、及人類輕鏈不變區融合之抗體基因的載體，精製表現的重組抗人類IgE抗體。製作的抗體命名為選殖體278(以下記載為278-IgG1，重鏈 序列編號：151、輕鏈序列編號：152)。
(23-2)抗人類IgE抗體對人類IgE之結合活性及pH依存性結合活性之評價
能於內體內將抗原解離之抗體，也能藉由結合於以不僅能對於抗原以pH依存性地結合也能以Ca依存性的結合的抗原以創製。而，評價278-IgG1及成為對照之不具pH/Ca依存性IgE結合能力人類IgG1抗體Xolair(omalizumab,Novartis)對人類IgE(hIgE)之pH依存性結合能力及pH/Ca依存性結合能力。亦即使用Biacore T200(GE Healthcare)評價278-IgG1及Xolair對hIgE之結合活性(解離常數KD(M))。運行緩衝液使用以下3種，進行測定。
‧1.2 mmol/1 CaCl2/0.05% tween20,20 mmol/1 ACES,150 mmol/1 NaCl,pH7.4
‧1.2 mmol/1 CaCl2/0.05% tween20,20 mmol/1 ACES,150 mmol/1 NaCl,pH5.8
‧3μmol/1 CaCl2/0.05% tween20,20 mmol/1 ACES,150 mmol/1 NaCl,pH5.8
將對於適量的化學合成的人類Glypican3蛋白質來源序列(序列編號：153)之C末端存在的Lys附加生物素而得之胜肽(以下記載為「生物素化GPC3胜肽」)添加到感測晶片SA(GE Healthcare)上，利用鏈黴親合素與生物素的親和性固定在該感測晶片SA上。注入適當濃度之人類IgE，由生物素化GPC3胜肽捕捉而將人類IgE固定於晶片上。注入作為分析物之適當濃度之278-IgG1，使與感應晶片上之 人類IgE交互作用。之後，注入10 mmol/L Glycine-HCl,pH1.5，使感應晶片再生。交互作用均於37℃測定。利用使用Biacore T200 Evaluation軟體(GE Healthcare)之曲線擬合所為之測定結果之解析，計算結合速度常數ka(1/Ms)及解離速度常數kd(1/s)。依該等常數計算解離常數KD(M)。並且計算在pH5.8,1.2 mM Ca條件與pH7.4,1.2 mM Ca條件下之各抗體之KD比以評價pH依存性結合，計算於pH5.8,3μM Ca條件與pH7.4,1.2 mM Ca條件之下之各抗體之KD比以評價pH/Ca依存性結合。其結果如表30所示。
[實施例24]以pH依存性地人類結合於IgE之抗體之變異體之製備
其次，為了使從血漿中之抗原(人類IgE)之消失更增大，為了使相對於以pH依存性地人類結合於IgE之278-IgG1，對於小鼠FcγR結合增強，將編碼為278-IgG1之EU編號表示之326位之Lys取代為Asp之278-F1087(重鏈序列編號：154、輕鏈序列編號：152)之DNA序列依該技術領域中具有通常知識者公知之方法納入動物表現用質 體。使用導入有該質體之動物細胞，精製後測定以上述方法表現之該等之抗體變異體之濃度。
[實施例25]278-IgG1之體內評價 (25-1)體內評價用之人類IgE(hIgE(Asp6))之製備
由重鏈(序列編號：155)及輕鏈(序列編號：150)構成之體內評價用之人類IgEhIgE(Asp6)(可變區為抗人類Glypican3抗體)依與實施例(23-1)同樣之方法製備。hIgE(Asp6)，係以為了使人類IgE之N型糖鏈之不均勻性不受抗原人類IgE之血漿中濃度變動之影響之方式，將人類IgE之6處N型糖鏈結合部位的天冬醯胺酸改變為天冬胺酸之分子。
(25-2)投予了選殖體278之正常小鼠血漿中之人類IgE之消失加速效果之驗證
於實施例2至4及22，投予了以pH依存性地結合於為抗原之人類IL-6受體及人類IgA並且對於小鼠FcγR之結合有增強之分子之小鼠血漿中之抗原濃度顯示大幅下降。對小鼠FcγR之結合增強之情形，為了進一步驗證投予了人類IL-6受體、及人類IgA以外之對於抗原以pH依存性地結合且對小鼠FcγR之結合有增強之抗體之活體之血漿中之可溶型抗原之消失效果是否也可同樣觀察到，重新實施以人類IgE作為抗原之抗體之試驗。
評價對於C57BL/6J小鼠(Charles river Japan)單獨投予hIgE(Asp6)、或同時投予hIgE(Asp6)及抗hIgE抗體(278-IgG1與278-F1087)後之hIgE(Asp6)及抗人類IgE抗 體之體內動態。將hIgE(Asp6)(20μg/mL)或hIgE(Asp6)及抗人類IgE抗體之混合溶液(濃度如表31記載，任一抗體均製備為成為同濃度)從尾靜脈以10mL/kg單次投予。此時，由於各抗體相對於IgE(Asp6)均以足量過量存在，所以據認為IgE(Asp6)大約全部結合在抗體。於投予了選殖體278(278-IgG1)之群中，在投予後5分鐘、2小時、7小時、1日、2日、4日、5日、7日、14日、21日從該小鼠採血。在投予了278-F1087之群中，於5分鐘、30分鐘、1小時、2小時、1日、3日、7日、14日、21日從該小鼠採血。將採取的血液立即於4℃以15,000進行5分鐘離心分離，獲得血漿。經分離之血漿在直到實施測定為止，保存在設定為-20℃以下的冷凍庫。
(25-3)正常小鼠血漿中之抗人類IgE抗體濃度之測定
小鼠血漿中之抗hIgE抗體濃度以ELISA法測定。製備血漿中濃度為0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625μg/mL之檢量線試樣。為了使hIgE(Asp6)與抗hIgE抗體之免疫複合體均勻，於檢量線及小鼠血漿測定試樣添加1μg/mL hIgE(Asp6)，將278-hIgG1投予群及對應之檢量線試樣於室溫靜置30分鐘。又，將278-F1087投予 群及對應之檢量線試樣於37℃攪拌一晚。將靜置或攪拌後之檢量線及小鼠血漿測定試樣分注到固定了Anti-Human Kappa Light Chain Antibody(Bethyl Laboratories)之免疫板(Nunc-Immuno Plate,MaxiSorp(Nalge nunc International))，於室溫靜置攪拌2小時(278-F1087投予群之試樣及278-F1087之檢量線試樣)或於4℃靜置一晚(278-hIgG1投予群之試樣及278-hIgG1之檢量線試樣)。之後依序使Rabbit anti-Human IgG(Fc)Secondary antibody,Biotin conjugate(Pierce Biotechnology)及Streptavidin-Poly HRP80(Stereospecific Detection Technologies)反應1小時。將使用TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)作為基質之發色反應以1 N-硫酸(Showa Chemical)停止反應後，將該發色以微板讀取儀測定450nm之吸光度之方法來測定小鼠血漿中濃度。小鼠血漿中濃度，係從檢量線之吸光度使用解析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices)計算。該方法測得之靜脈內投予後之血漿中抗體濃度變動如圖47所示。其結果，投予了對於人類IgE有強pH依存性結合活性之278-IgG1對FcγR之結合為增強之變異體的小鼠中，該小鼠血漿中之抗體濃度比起278-IgG1之該濃度確認未大幅下降。
(25-4)正常小鼠血漿中之hIgE(Asp6)濃度之測定
小鼠血漿中之hIgE(Asp6)濃度以ELISA法測定。製備血漿中濃度為192、96、48、24、12、6、3 ng/mL之檢量 線試樣。為了使hIgE(Asp6)與抗hIgE抗體之免疫複合體均勻，於檢量線及小鼠血漿測定試樣添加Xolair(Novartis)，使在投予278-hIgG1之群中成為10μg/mL，於於室溫靜置30分鐘。使投予278-F1087之群中成為20μg/mL之方式，添加278-F1022(重鏈序列編號：156、輕鏈序列編號：152，與實施例24同樣地製備)或278-F760(重鏈序列編號：157、輕鏈序列編號：152，與實施例24同樣地製備)，於37℃攪拌60小時。將小鼠血漿測定試樣分注到固定了anti-human IgE之免疫板(MABTECH)或固定了anti-human IgE(clone 107、MABTECH)之免疫板(Nunc F96 MicroWell Plate(Nalge nunc International))，於室溫靜置或攪拌2小時或於4℃靜置一晚。之後依序使human GPC3 core protein(序列編號：158)、經NHS-PEG4-Biotin(Thermo Fisher Scientific)生物素化之抗GPC3抗體(社內製備)、Sterptavidin-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)反應1小時。將使用TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)作為基質之發色反應以1 N-硫酸(Showa Chemical)停止反應後，將該發色以微板讀取儀測定450nm之吸光度之方法，或以SuperSignal(r) ELISA Pico Chemiluminescent Substrate(Thermo Fisher Scientific)作為基質進行發光反應，以微板讀取儀測定發光強度之方法來測定小鼠血漿中濃度。小鼠血漿中濃度，係從檢量線之吸光度或發光強 度使用解析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices)計算。該方法測得之靜脈內投予後之血漿中hIgE(Asp6)濃度變動如圖48所示。
其結果，相對於人類IgE單獨之消失，同時投予了有強pH依存性結合活性之278-IgG1及人類IgE之小鼠中，人類IgE之消失比起人類IgE單獨為加速。且，投予了相對於278-IgG1之FcγR之結合為增強之278-F1087與人類IgE之小鼠中，人類IgE之消失確認比起單獨投予人類IgE及投予278-IgG1與人類IgE之小鼠有大幅加速。亦即不僅至今為止所述之FcγR之結合有增強之抗IL6R抗體或抗IgA抗體，投予了FcγR之結合有增強之抗IgE抗體之小鼠，抗原之消失也顯示加速。
(參考實施例1)胺基酸經取代之IgG抗體之表現載體之構築
使用QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)，以附帶說明書記載之方法將製作之含變異體之質體片段插入於動物細胞表現載體，以製作目的之H鏈表現載體及L鏈表現載體。獲得之表現載體之鹼基序列依該技術領域中具有通常知識者公知之方法決定。
(參考實施例2)IgG抗體之表現與精製
抗體之表現使用以下之方法進行。將人類胎兒腎癌細胞來源HEK293H株(Invitrogen)懸浮於含10%胎牛血清(Invitrogen)之DMEM培養基(Invitrogen)，以5~6×105細胞/mL之細胞密度各接種10 mL到黏著細胞用培養皿(直 徑10 cm,CORNING)之各皿，於CO2培養箱(37℃、5% CO2)內培養一日夜後，吸走培養基，添加CHO-S-SFM-II(Invitrogen)培養基6.9 mL。將製備的質體以脂轉染法導入到細胞。回收獲得之培養上清後，進行離心分離(約2000 g、5分鐘、室溫)，去除細胞，再通過0.22μm濾器MILLEX(R)-GV(Millipore)滅菌並獲得培養上清。在獲得之培養上清使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)依該技術領域中具有通常知識者公知之方法精製。精製抗體濃度使用分光光度計測定於280 nm之吸光度。從獲得之值使用依Protein Science(1995)4,2411-2423記載之方法算出之吸光係數計算抗體濃度。
(參考實施例3)可溶型人類IL-6受體(hsIL-6R)之製備
為抗原之人類IL-6受體之重組人類IL-6受體，以下列方式製備。以該技術領域之人士公知之方法構建並培養穩定表現由J.Immunol.152,4958-4968(1994)報告之N末端側1號至357號之胺基酸序列構成的可溶型人類IL-6受體(以下稱為hsIL-6R)之CHO穩定表現株，使hsIL-6R表現。從獲得之該CHO株之培養上清，以Blue Sepharose 6 FF管柱層析、凝膠過濾管柱層析2個步驟精製hsIL-6R。於最終步驟，以溶出為主要峰部之區分當做最終精製品。
(參考實施例4)低岩藻糖抗體之製備
低岩藻糖抗體之表現依以下之方法進行。將懸浮於含 10%胎牛血清(CCB)之α-MEM培養基(Invitrogen)的CHO細胞岩藻糖轉運蛋白缺損株(專利文獻WO2006/067913)，以2E+6個/10mL之濃度接種於黏著細胞用培養皿(直徑10 cm,CORNING)。將在CO2培養箱(37℃、5% CO2)內培養一日夜之培養基抽走後，添加CHO-S-SFM-II(Invitrogen)培養基7mL。在將經另外製備的質體以脂轉染法導入後的細胞，添加CHO-S-SFM-II(Invitrogen)培養基7mL。72小時後以離心分離(約2000 g、5分鐘、室溫)回收之培養上清再通過0.22μm濾器MILLEX(R)-GV(Millipore)滅菌。從獲得之培養上清使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)，以該技術領域中具有通常知識者公知之方法將抗體精製。精製抗體濃度，係使用分光光度計測得之於280 nm之吸光度依Protein Science(1995)4,2411-2423記載之方法算出之吸光係數計算。
(參考實施例5)使用噬菌體提示技術從人類抗體庫取得鈣依存性結合於IL-6受體之抗體 (5-1)未改變人類抗體噬菌體提示庫之製作
以從人類PBMC製作之polyA RNA、或市售之人類polyA RNA等作為模板，依該技術領域中具有通常知識者公知之方法，構建由彼此相異之提示人類抗體序列之Fab分域之多數噬菌體構成之人類抗體噬菌體提示庫。
(5-2)利用珠淘選由庫取得Ca依存性的結合於抗原之抗體片段
從構建之未改變(naïve)人類抗體噬菌體提示庫之最 初之選拔，係僅濃縮具備對於抗原(IL-6受體)之結合能力之抗體片段、或以Ca依存性的結合於抗原(IL-6受體)之能力為指標濃縮。濃縮成具備Ca依存性的結合於抗原(IL-6受體)能力之抗體片段時，係於Ca離子存在下利用EDTA將Ca離子螯合，以從IL-6受體結合之噬菌體庫溶出噬菌體。抗原使用經生物素標記之IL-6受體。
由保持以上述方式構建之噬菌體提示用噬粒之大腸菌產生噬菌體。藉由對於進行噬菌體產生之大腸菌之培養液添加2.5 M NaCl/10%PEG，使沉澱的噬菌體的集團以TBS稀釋，藉此獲得噬菌體庫液。其次，對於噬菌體庫液添加BSA及CaCl2，使終濃度成為4%BSA及1.2mM鈣離子濃度。淘選方法，係參照一般方法即使用固定化於磁性珠之抗原的淘選方法(J.Immunol.Methods.(2008)332(1-2),2-9、J.Immunol.Methods.(2001)247(1-2),191-203、Biotechnol.Prog.(2002)18(2)212-20、Mol.Cell Proteomics(2003)2(2),61-9)。磁性珠可使用NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或Streptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)。
具體而言，於製備的噬菌體庫液添加250 pmol之生物素標記抗原，藉此使該噬菌體庫液於室溫接觸抗原60分鐘。添加以BSA阻斷的磁性珠，將抗原與噬菌體之複合體於室溫結合於磁性珠15分鐘。將珠以1.2 mM CaCl2/TBST(含1.2 mM CaCl2之TBST)1 mL洗滌1次。之後，於將具有對 IL-6受體之結合能力之抗體片段濃縮的情形，利用一般的方法使溶出，於將以Ca濃度依存性對IL-6受體之結合能力作為指標將抗體片段濃縮的情形，利用從懸浮於2 mM EDTA/TBS(含2mMEDTA之TBS)之珠溶出，將噬菌體溶液回收。將回收的噬菌體溶液，添加到處於對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10 mL之大腸菌株TG1。於37℃緩慢攪拌培養上述大腸菌1小時，藉此使噬菌體感染大腸菌。將經感染之大腸菌，接種到225 mm x 225 mm的板。其次，從經接種之大腸菌之培養液回收噬菌體，以製備噬菌體庫液。
第2次後之淘選，係以Ca依存性結合能力為指標，實施噬菌體之濃縮。具體而言，係於製備的噬菌體庫液添加40 pmol之生物素標記抗原，藉此使噬菌體庫於室溫與抗原接觸60分鐘。添加經BSA阻斷的磁性珠，使抗原與噬菌體之複合體於室溫結合於磁性珠15分鐘。珠以1 mL之1.2 mM CaCl2/TBST與1.2 mM CaCl2/TBS洗滌。之後，將添加有0.1 mL之2 mM EDTA/TBS的珠於室溫懸浮後，立即使用磁座分離珠，並回收噬菌體溶液。將回收的噬菌體溶液回收之噬菌體，添加到處於對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10 mL之大腸菌株TG1。於37℃緩慢攪拌進行1小時上述大腸菌之攪拌培養，使噬菌體感染大腸菌。將感染的大腸菌接種在225 mm x 225 mm之板。其次，從接種的大腸菌的培養液回收噬菌體，藉此回收噬菌體庫液。以Ca依存性結合能力為指標之淘選，重複數次。
(5-3)利用噬菌體ELISA所為之評價
從依照上述方法獲得之大腸菌之單一菌落，參考常法(Methods Mol.Biol.(2002)178,133-145)回收含噬菌體之培養上清。將添加有BSA及CaCl2使終濃度為4%BSA及1.2 mM鈣離子濃度之含噬菌體之培養上清，以下列步驟供ELISA。將StreptaWell 96微滴定板(Roche)以含生物素標記抗原之100μL之PBS塗覆一晚。將該板之各井以PBST洗滌，以去除抗原後，將該井以250μL之4%BSA-TBS阻斷1小時以上。將已去除4%BSA-TBS之各井中添加有製備之培養上清的該板，於37℃靜置1小時，藉此使提示噬菌體之抗體結合於各井存在之抗原。於以1.2 mM CaCl2/TBST洗滌之各井中，添加1.2 mM CaCl2/TBS或1 mM EDTA/TBS，將該板於37℃靜置30分鐘並溫育。以1.2 mM CaCl2/TBST洗滌後，將以設為終濃度4%BSA及1.2 mM離子化鈣濃度之TBS稀釋過的HRP結合抗M13抗體(Amersham Pharmacia Biotech)添加到各井之板溫育1小時。以1.2 mM CaCl2/TBST洗滌後，使添加有TMB single溶液(ZYMED)之各井中之溶液之發色反應藉由添加硫酸而停止後，於450 nm之吸光度測定該發色。
將以對於上述噬菌體ELISA之結果判斷為有Ca依存性的對抗原之結合能力的抗體片段作為模板，利用專一性的引子放大之基因之鹼基序列進行解析。
(5-4)抗體之表現與精製
將噬菌體ELISA之結果判斷為具有對於Ca依存性抗原之結合能力之選殖體，導入動物細胞表現用質體。抗體之 表現係使用以下方法實施。將人類胎兒腎細胞來源FreeStyle 293-F株(Invitrogen)懸浮於FreeStyle 293 Expression Medium培養基(Invitrogen)，以1.33 x 106細胞/mL之細胞密度對於6井板之各井各接種3 mL。製備之質體，以脂轉染法導入細胞。於CO2培養箱(37度、8%CO2、90 rpm)中培養4日。使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)，以該技術領域之人士公知之方法，從上述獲得之培養上清精製抗體。使用分光光度計測定經精製之抗體溶液於280 nm之吸光度。藉由使用PACE法計算之吸光係數，從得到之測定值計算抗體濃度(Protein Science(1995)4,2411-2423)。
(參考實施例6)取得之抗體對人類IL-6受體之Ca依存性結合能力之評價
為了判斷參考實施例5取得之抗體6RL#9-IgG1(重鏈(序列編號：44、序列編號：9連接著來自IgG1之不變區之序列)、輕鏈序列編號：45)、及FH4-IgG1(重鏈序列編號：46、輕鏈序列編號：47)對人類IL-6受體之結合活性是否為Ca依存性，將該等抗體與人類IL-6受體之抗原抗體反應之動力理論解析使用Biacore T100(GE Healthcare)進行。就對於人類IL-6受體無Ca依存性之結合活性之對照抗體，使用WO2009125825記載之H54/L28-IgG1(重鏈序列編號：36、輕鏈序列編號：37)。作為高鈣離子濃度及低鈣離子濃度之條件，各於2 mM及3μM之鈣離子濃度之溶液中進行抗原抗體反應之動力理論解析。在以胺偶聯法適 量固定protein A(Invitrogen)之感測晶片CM4(GE Healthcare)上，使目的抗體被捕捉。運行緩衝液使用10 mM ACES、150 mM NaCl、0.05%(w/v)Tween20、2 mM CaCl2(pH7.4)或10 mM ACES、150 mM NaCl、0.05%(w/v)Tween20、3μmol/L CaCl2(pH7.4)之2種緩衝液。人類IL-6受體之稀釋也使用各自的緩衝液。測定均在37℃實施。
當進行使用H54L28-IgG1抗體之抗原抗體反應之動力理論解析，將IL-6受體之稀釋液與為空白之運行緩衝液以流速20μL/min注入3分鐘，使在感應晶片上捕捉的H54L28-IgG1抗體與IL-6受體交互作用。之後，以流速20μL/min流入10分鐘運行緩衝液，觀察到IL-6受體之解離後，將10 mM Glycine-HCl(pH1.5)以流速30μL/min注入30秒，使感應晶片再生。從測定獲得之感測圖，計算動力理論參數結合速度常數ka(1/Ms)、及解離速度常數kd(1/s)。使用該等值，計算H54L28-IgG1抗體對人類IL-6受體之解離常數KD(M)。各參數之計算使用Biacore T100 Evaluation軟體(GE Healthcare)。
在實施使用FH4-IgG1抗體及6RL#9-IgG1抗體之抗原抗體反應之動力理論解析時，將IL-6受體之稀釋液與為空白之運行緩衝液以流速5μL/min注入I5分鐘，使在感應晶片上捕捉之FH4-IgG1抗體或6RL#9-IgG1抗體與IL-6受體交互作用。之後，將10 mM Glycine-HCl(pH1.5)以流速30μL/min注入30秒，使感應晶片再生。從測定獲得之感測圖使用steady state親和性model計算解離常數 KD(M)。各參數之計算使用Biacore T100 Evaluation軟體(GE Healthcare)。
依該方法決定之2 mM CaCl2存在下之各抗體與IL-6受體之解離常數KD如表32。
Ca濃度為3μM之條件下之H54/L28-IgG1抗體之KD，可與2 mM Ca濃度存在下以同樣之方法計算。Ca濃度為3μM之條件下，FH4-IgG1抗體及6RL#9-IgG1抗體對IL-6受體幾乎未觀察到結合，所以難以依上述方法計算KD。但使用下列之式3(Biacore T100 Software Handbook,BR-1006-48,AE 01/2007)，可預測於Ca濃度為3μM之條件下該等之抗體之KD。
(式3)Req=C x Rmax/(KD+C)+RI
上(式3)中之各項目之含意如下；Req(RU)：不變狀態結合水平(Steady state binding levels)
Rmax(RU)：分析物之表面結合能力(Analyte binding capacity of the surface)
RI(RU)：試樣中之容積折射率貢獻(Bulk refractive index contribution in the sample)
C(M)：分析物濃度(Analyte concentration)
KD(M)：平衡解離常數(Equilibrium dissociation constant)。
使用上述(式3)之Ca濃度為3μmol/L之情形之各抗體與IL-6受體間之解離常數KD之預測概算結果如表33。表33中之Req、Rmax、RI、C，係依測定結果假定之值。
從上述結果，可預測：FH4-IgG1抗體及6RL#9-IgG1抗體，藉由使緩衝液中之CaCl2之濃度從2 mM減少為3μM，對IL-6受體之KD各有約60倍、約120倍上升(60倍、120倍以上親和性減少)。
表34整理H54/L28-IgG1、FH4-IgG1、6RL#9-IgG1之3種抗體在2 mM CaCl2存在下及3μM CaCl2存在下之KD值、及KD值之Ca依存性。
未觀察到由於Ca濃度之差異所致H54/L28-IgG1抗體對IL-6受體之結合之差異。另一方面，在低濃度Ca條件下，觀察到FH4-IgG1抗體及6RL#9-IgG1抗體對IL-6受體 之結合顯著減弱(表34)。
(參考實施例7)對於取得之抗體之鈣離子結合評價
其次，作為評價鈣離子對於抗體之結合之指標，利用差示掃描型熱量測定(DSC)測定熱變性中間溫度(Tm值)(MicroCal VP-Capillary DSC、MicroCal製)。熱變性中間溫度(Tm值)係安定性之指標，若鈣離子結合而蛋白質安定化，則熱變性中間溫度(Tm值)比起鈣離子未結合時會增高(J Bio Chem.2008 Sep 12；Vol.283；No.37：pp 25140-25149)。藉由評價抗體溶液中之鈣離子濃度之變化所因應之抗體之Tm值之變化，可評價鈣離子對抗體之結合活性。將經精製之抗體供以20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、2 mM CaCl2(pH7.4)或20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl,3μM CaCl2(pH7.4)之溶液作為外液之透析(EasySEP、TOMY)處理。將使用透析用之溶液製備為約0.1 mg/mL之抗體溶液當作待驗物質，於20℃至115℃之240℃/hr之升溫速度測定DSC。依據獲得之DSC之變性曲線，計算各抗體之Fab域之熱變性中間溫度(Tm值)，如表35。
從表35之結果，顯示鈣依存性結合能力之FH4-IgG1抗體及6RL#9-IgG1抗體之Fab之Tm值會依鈣離子之濃度 之變化而變動，未顯示鈣依存性結合能力之H54/L28-IgG1抗體之Fab之Tm值不會依鈣離子之濃度之變化變動。FH4-IgG1抗體及6RL#9-IgG1抗體之Fab之Tm值之變動，顯示該等之抗體有鈣離子結合且Fab部分安定化。由上述結果顯示：FH4-IgG1抗體及6RL#9-IgG1抗體會與鈣離子結合，另一方面H54/L28-IgG1抗體不與鈣離子結合。
(參考實施例8)利用6RL#9抗體之鈣離子結合部位之X射線結晶構造解析之鑑定 (8-1)X射線結晶構造解析
如參考實施例7所示，6RL#9抗體與鈣離子結合，係由熱變性溫度Tm值之測定所啟示。但是由於無法預測6RL#9抗體之哪個部位與鈣離子結合，因此，藉由使用X射線結晶結構解析之方法，指定鈣離子所交互作用之6RL#9抗體之序列中之殘基。
(8-2)6RL#9抗體之表現及精製
將為了X射線結晶結構解析使用而使表現之6RL#9抗體予以精製。具體而言，將各能表現6RL#9抗體之重鏈(序列編號：44)與輕鏈(序列編號：45)之方式製備之動物表現用質體，暫時導入動物細胞。對於懸浮於FreeStyle 293 Expression Medium培養基(Invitrogen)，使得最終細胞密度成為1 x 106細胞/mL之800 mL之人類胎兒腎細胞來源FreeStyle 293-F株(Invitrogen)，導入以脂轉染法製備的質體。將導入有質體之細胞，於CO2培養箱(37℃、8%CO2、90 rpm)中培養5日。依照使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)之該技術領域之人士公知之方法，從如上述獲得之培養上清精製抗體。使用分光光度計測定精製之抗體溶液於280 nm之吸光度。使用依PACE法計算之吸光係數，由測定值計算抗體濃度(Protein Science(1995)4,2411-2423)。
(8-3)從6RL#9抗體精製Fab片段
使用分子量區分尺寸10000MWCO之超過濾膜，將6RL#9抗體濃縮至21 mg/mL。使用L-Cystein 4 mM、EDTA 5 mM、20 mM磷酸鈉緩衝液(pH 6.5)，製備以5 mg/mL稀釋而得之2.5 mL之該抗體之試樣。添加0.125 mg之Papain(Roche Applied Science)，並將經攪拌之該試樣於35℃靜置2小時。靜置後，溶解蛋白酶抑制劑cocktail mini，再將溶有無EDTA(Roche Applied Science)1錠之10 mL之25 mM MES緩衝液(pH6)添加到該試樣，於冰中靜置，藉此，以Papain停止蛋白酶反應。其次，將該試樣添加到於下游串聯連結之1 mL尺寸之ProteinA擔體管柱HiTrapMabSelect Sure(GE Healthcare)之經25 mM MES緩衝液pH6平衡化之1 mL尺寸之陽離子交換管柱HiTrap SP HP(GE Healthcare)。同緩衝液中之NaCl濃度藉由直線上升到300 mM並進行溶出可獲得6RL#9抗體之Fab片段之精製區分。其次，將獲得之精製區分以5000MWCO超過濾膜濃縮為約0.8 mL。於以含50 mM NaCl之100 mM HEPES緩衝液(pH 8)平衡化之凝膠過濾管柱Superdex 200 10/300 GL(GE Healthcare)中，添加濃縮液。結晶化用之精製6RL#9抗體 之Fab片段使用同緩衝液從管柱溶出。又，上述所有的管柱操作係於6至7.5℃之低溫下實施。
(8-4)6RL#9抗體之Fab片段於Ca存在下之結晶化
預先以一般的條件設定獲得6RL#9 Fab片段之種結晶。其次，使用以使成為5 mM之方式添加有CaCl2之精製6RL#9抗體之Fab片段，使用5000MWCO之超過濾膜濃縮為12 mg/mL。其次，利用hanging-drop蒸氣擴散法，實施如前述方式濃縮之試樣之結晶化。貯存溶液，使用含20-29% PEG4000之100 mM HEPES緩衝液(pH7.5)。在蓋玻片上對於0.8μl之貯存溶液及0.8μl之前述濃縮試樣之混合液，添加含29% PEG4000及5 mM CaCl2之於100 mM HEPES緩衝液(pH7.5)中破碎之前述種結晶稀釋成100-10000倍之稀釋系列之溶液0.2μl，藉此製備結晶化滴劑。將該結晶化滴劑於20℃靜置2日至3日，測定藉此獲得之薄板狀結晶之X射線繞射數據。
(8-5)6RL#9抗體之Fab片段於Ca非存在下之結晶化
精製6RL#9抗體之Fab片段使用5000MWCO之超過濾膜，濃縮為15 mg/ml。其次，利用hanging-drop蒸氣擴散法，實施以前述方式濃縮之試樣之結晶化。貯存溶液使用含18-25%之PEG4000之100 mM HEPES緩衝液(pH7.5)。在蓋玻片上對於0.8μl之貯存溶液及0.8μl之前述濃縮試樣之混合液，添加以含25% PEG4000之100 mM HEPES緩衝液(pH7.5)中破碎之Ca存在下獲得之6RL#9抗體之Fab片段之結晶稀釋為100-10000倍而得之稀釋系列之溶液 0.2μl，製備結晶化滴劑。將該結晶化滴劑於20℃靜置2日至3日，測定藉此獲得之薄板狀之結晶之X射線繞射數據。
(8-6)6RL#9抗體之Fab片段於Ca存在下之結晶X射線繞射數據之測定
將浸於含35% PEG4000及5 mM CaCl2之100mM HEPES緩衝液(pH7.5)之溶液而得之6RL#9抗體之Fab片段於Ca存在下獲得之單結晶，使用微小的附尼龍環的銷，將各外液鏟出，而使該單結晶於液態氮中凍結。使用高能量加速器研究機構之放射光設施Phonton Factory之束線BL-17A，測定前述冷凍結晶之X射線繞射數據。又，測定中藉由一直於-178℃之氮氣流中放置冷凍結晶，維持冷凍狀態。使用束線具備並安裝的CCD偵測器Quantum315r(ADSC)，使結晶每次旋轉1°，收集總共180張繞射影像。晶格常數之決定、對於繞射斑點賦予指數、及繞射數據之處理，係以程式Xia2(CCP4 Software Suite)、XDS Package(Walfgang Kabsch)及Scala(CCP4 Software Suite)進行。最終，獲得解析能力至多2.2埃之繞射強度數據。本結晶，屬於空間群P212121，晶格常數a=45.47埃、b=79.86埃、c=116.25埃、α=90°、β=90°、γ=90°。
(8-7)6RL#9抗體之Fab片段於Ca非存在下之結晶之X射線繞射數據之測定
將浸於含35% PEG4000之100 mM HEPES緩衝液(pH7.5) 之溶液的6RL#9抗體之Fab片段於Ca非存在下獲得之單結晶之一，藉由使用附微小的尼龍環的的銷，將外液鏟出，使該單結晶於液態氮中冷凍。使用高能量加速器研究機構之放射光設施Phonton Factory之束線BL-5A，測定前述冷凍結晶之X射線繞射數據。又，測定中一直將冷凍結晶放置在-178℃之氮氣流中，藉此維持冷凍狀態。使用束線具備並安裝的CCD偵測器Quantum210r(ADSC)，使結晶每次旋轉1°，收集總共180張繞射影像。晶格常數之決定、對於繞射斑點賦予指數、及繞射數據之處理，係以程式Xia2(CCP4 Software Suite)、XDS Package(Walfgang Kabsch)及Scala(CCP4 Software Suite)進行。最終，獲得解析能力至多2.3埃之繞射強度數據。本結晶，屬於空間群P212121，晶格常數a=45.40埃、b=79.63埃、c=116.07埃、α=90°、β=90°、γ=90°，與Ca存在下之結晶為同型。
(8-8)6RL#9抗體之Fab片段於Ca存在下之結晶之結構解析
利用使用程式Phaser(CCP4 Software Suite)之分子取代法，決定6RL#9抗體之Fab片段於Ca存在下之結晶之結構。從獲得之結晶格子之大小以及6RL#9抗體之Fab片段之分子量，預測非對稱單元中之分子數為一個。依據一次序列上之相同性，將從PDB code：1ZA6之結構座標取出之A鏈112-220號及B鏈116-218號之胺基酸殘基部分當做CL及CH1區之探索用模型分子。其次，將從PDB code： 1ZA6之結構座標取出之B鏈1-115號之胺基酸殘基部分，當做VH區之探索用模型分子。最後，將從PDB code 2A9M之結構座標取出之輕鏈3-147號之胺基酸殘基，當做VL區之探索用模型分子。依照該順序，從旋轉函數及並進函數決定各探索用模型分子於結晶格子內之走向與位置，而獲得6RL#9抗體之Fab片段之初始結構模型。對於該初始結構模型，進行使VH、VL、CH1、CL之各域移動的剛體精密化，對於25-3.0埃之反射數據，結晶學的可靠度因子R值為46.9%、Free R值為48.6%。又，一面參考利用使用程式Refmac5(CCP4 Software Suite)之結構精密化、與由實驗決定之結構因子Fo與從模型計算之結構因子Fc及使用位相計算之以2Fo-Fc、Fo-Fc當做係數之電子密度輿圖，一面反複進行於程式Coot(Paul Emsley)上進行模型修正，藉此進行模型之精密化。最後，依據以2Fo-Fc、Fo-Fc當做係數之電子密度輿圖，將Ca離子及水分子納入模型，以使用程式Refmac5(CCP4 Software Suite)進行精密化。藉由使用解析能力為25-2.2埃之21020個反射數據，最終，對於3440個原子之模型，結晶學的可靠度因子R值為20.0%、Free R值為27.9%。
(8-9)6RL#9抗體之Fab片段於Ca非存在下之結晶之X射線繞射數據之測定
6RL#9抗體之Fab片段於Ca非存在下之結晶之結構，係使用同型Ca存在下結晶之結構決定。從6RL#9抗體之Fab片段於Ca存在下之結晶之結構座標，窺視水分子與Ca 離子分子，進行使VH、VL、CH1、CL之各域移動之剛體精密化。對於25-3.0埃之反射數據，結晶學的可靠度因子R值為30.3%、Free R值為31.7%。再者，一面參考利用使用程式Refmac5(CCP4 Software Suite)之結構精密化、與由實驗決定之結構因子Fo與從模型計算之結構因子Fc及使用位相計算之以2Fo-Fc、Fo-Fc當做係數之電子密度輿圖，一面反複進行於程式Coot(Paul Emsley)上進行模型修正，藉此進行模型之精密化。最後，依據以2Fo-Fc、Fo-Fc當做係數之電子密度輿圖，將水分子納入模型，以使用程式Refmac5(CCP4 Software Suite)進行精密化。藉由使用解析能力為25-2.3埃之18357個反射數據，最終，對於3351個原子之模型，結晶學的可靠度因子R值為20.9%、Free R值為27.7%。
(8-10)6RL#9抗體之Fab片段於Ca存在或非存在下之結晶之X射線繞射數據之比較
若比較6RL#9抗體之Fab片段於Ca存在下之結晶及Ca非存在下之結晶之結構，可觀察到重鏈CDR3有重大變化。圖49顯示由X射線結晶結構解析決定之6RL#9抗體之Fab片段之重鏈CDR3之結構。具體而言，於Ca存在下之6RL#9抗體之Fab片段之結晶中，重鏈CDR3環圈部分之中心部分存在有鈣離子。鈣離子，據認為會與重鏈CDR3之95位、96位及100a位(Kabat編號)交互作用。Ca存在下時，與抗原之結合會由於重要重鏈CDR3環圈與鈣結合而安定化，據認為成為對與抗原之結合最適之結構。抗體之重 鏈CDR3有鈣結合之例，至今為止無人報告，抗體之重鏈CDR3有鈣結合之結構為新穎結構。
從6RL#9抗體之Fab片段之構造得知之在重鏈CDR3存在之鈣結合模體，能成為取得本發明之抗原結合分子所含之依離子濃度對抗原之抗原結合分域時使用之Ca庫的設計的新要素。在後述參考實施例18及19，係在輕鏈可變區導入了鈣結合模體，但例如可為含6RL#9抗體之重鏈CDR3且在含輕鏈以外之CDR含柔性殘基之庫。
(參考實施例9)使用噬菌體提示技術從人類抗體庫取得Ca依存性的結合於IL-6的抗體
(9-1)未改變(naïve)人類抗體噬菌體提示庫之製作以從人類PBMC製作之polyA RNA或市售人類polyA RNA等當做模板，參考(Methods Mol Biol.2002；178：87-100.)，構建由提示彼此相異之人類抗體序列之Fab分域之多數噬菌體構成之人類抗體噬菌體提示庫。
(9-2)利用珠淘選由庫取得Ca依存性的結合於抗原之抗體片段
從構建之未經改變的人類抗體噬菌體提示庫之最初之選拔，係僅濃縮具備對於抗原(IL-6)之結合能力之抗體片段。抗原使用經生物素標記之IL-6。
由保持以上述方式構建之噬菌體提示用噬粒之大腸菌產生噬菌體，對已進行噬菌體產生之大腸菌之培養液以2.5 M NaCl/10%PEG而沉澱的噬菌體之集團以TBS稀釋，製成噬菌體庫液。對於噬菌體庫液添加BSA,CaCl2，製成使終 濃度4% BSA，離子化鈣濃度1.2 mM。淘選係參考一般方法，即使用固定化於磁性珠之抗原之淘選方法(J Immunol Methods.2008 Mar 20；332(1-2)：2-9.、J Immunol Methods.2001 Jan 1；247(1-2)：191-203.、Biotechnol Prog.2002 Mar-Apr；18(2)：212-20.、Mol Cell Proteomics.2003 Feb；2(2)：61-9.)。磁性珠使用NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或Streptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)。
具體而言，於製備的噬菌體庫液添加250 pmol之生物素標記抗原，藉此使該噬菌體庫液於室溫接觸抗原60分鐘。添加以BSA阻斷的磁性珠，將抗原與噬菌體之複合體於室溫結合於磁性珠15分鐘。將珠以1.2 mM CaCl2/TBST(含1.2 mM CaCl2之TBST)洗滌3次後，以1 mL之1.2 mM CaCl2/TBS(含1.2 mM CaCl2之TBS)再洗滌2次。之後，將添加有0.5 mL之1 mg/mL之胰蛋白酶之珠於室溫懸浮15分鐘後，立即使用磁座分離珠，將噬菌體溶液回收。將回收的噬菌體溶液，添加到處於對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10 mL之大腸菌株TG1。於37℃緩慢攪拌，培養上述大腸菌1小時，藉此使噬菌體感染大腸菌。將經感染之大腸菌，接種到225 mm x 225 mm的板。其次，從經接種之大腸菌之培養液回收噬菌體，以製備噬菌體庫液。
第2次後之淘選，係以Ca依存性結合能力為指標，實施噬菌體之濃縮。具體而言，係於製備的噬菌體庫液添加 40 pmol之生物素標記抗原，藉此使噬菌體庫於室溫與抗原接觸60分鐘。添加經BSA阻斷的磁性珠，使抗原與噬菌體之複合體於室溫結合於磁性珠15分鐘。珠以1 mL之1.2 mM CaCl2/TBST與1.2 mM CaCl2/TBS洗滌。之後，將添加有0.1 mL之2 mM EDTA/TBS的珠於室溫懸浮後，立即使用磁座分離珠，並回收噬菌體溶液。於回收之噬菌體溶液添加100 mg/mL之胰蛋白酶5μL，藉此切斷未呈現Fab之噬菌體之pIII蛋白質(幫助者(helper)噬菌體來源之pIII蛋白質)，使未呈現Fab之噬菌體失去對於大腸菌之感染能力。將從經胰蛋白酶處理之噬菌體溶液回收之噬菌體，添加到處於對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10 mL之大腸菌株TG1。於37℃緩慢攪拌進行1小時上述大腸菌之攪拌培養，使噬菌體感染大腸菌。將感染的大腸菌接種在225 mm x 225 mm之板。其次，從接種的大腸菌的培養液回收噬菌體，藉此回收噬菌體庫液。以Ca依存性結合能力為指標之淘選，重覆3次。
(9-3)利用噬菌體ELISA所為之評價
從依照上述方法獲得之大腸菌之單一菌落，參考常法(Methods Mol.Biol.(2002)178,133-145)回收含噬菌體之培養上清。
將添加有BSA及CaCl2使終濃度為4%BSA及1.2 mM鈣離子濃度之含噬菌體之培養上清，以下列步驟供ELISA。將StreptaWell 96微滴定板(Roche)以含生物素標記抗原之100μL之PBS塗覆一晚。將該板之各井以PBST洗滌， 以去除抗原後，將該井以250μL之4%BSA-TBS阻斷1小時以上。將已去除4%BSA-TBS之各井中添加有製備之培養上清的該板，於37℃靜置1小時，藉此使呈現噬菌體之抗體結合於各井存在之抗原。於以1.2 mM CaCl2/TBST洗滌之各井中，添加1.2 mM CaCl2/TBS或1 mM EDTA/TBS，將該板於37℃靜置30分鐘並溫育。以1.2 mM CaCl2/TBST洗滌後，將以設為終濃度4%BSA及1.2 mM離子化鈣濃度之TBS稀釋過的HRP結合抗M13抗體(Amersham Pharmacia Biotech)添加到各井之板溫育1小時。以1.2 mM CaCl2/TBST洗滌後，使添加有TMB single溶液(ZYMED)之各井中之溶液之發色反應藉由添加硫酸而停止後，從450 nm之吸光度測定該發色。
使用經單離之96選殖體進行噬菌體ELISA，獲得對於IL-6具有Ca依存性結合能力之6KC4-1#85抗體。由上述噬菌體ELISA之結果，進行判斷為具有對於Ca依存性抗原之結合能力的抗體片段為模板，而以專一性引子放大之基因之鹼基序列解析。6KC4-1#85抗體之重鏈可變區之序列記載於序列編號：10，及輕鏈可變區之序列記載於序列編號：48。將編碼為6KC4-1#85抗體之重鏈可變區(序列編號：10)之聚核苷酸，以PCR法與編碼為IgG1來源序列之聚核苷酸連結成之DNA片段，納入動物細胞表現用載體，構建表現序列編號：49表示之重鏈之載體。將編碼為6KC4-1#85抗體之輕鏈可變區(序列編號：48)之聚核苷酸、以PCR法與編碼為天然型Kappa鏈之不變區(序列編號：50) 之聚核苷酸連結成之序列之DNA片段，納入動物細胞表現用載體。製作之變異體之序列，經該技術領域之人士公知之方法確認。製作之變異體之序列，經該技術領域之人士公知之方法確認。
(9-4)抗體之表現與精製
將噬菌體ELISA之結果判斷為具有Ca依存性對於抗原之結合能力之選殖體6KC4-1#85，導入動物細胞表現用質體。抗體之表現係使用以下方法實施。將人類胎兒腎細胞來源FreeStyle 293-F株(Invitrogen)懸浮於FreeStyle 293 Expression Medium培養基(Invitrogen)，以1.33 x 106細胞/mL之細胞密度對於6井板之各井各接種3 mL。製備之質體，以脂轉染法導入細胞。於CO2培養箱(37度、8%CO2、90 rpm)中培養4日。使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)，以該技術領域之人士公知之方法，從上述獲得之培養上清精製抗體。使用分光光度計測定經精製之抗體溶液於280 nm之吸光度。藉由使用PACE法計算之吸光係數，從得到之測定值計算抗體濃度(Protein Science(1995)4,2411-2423)。
(參考實施例10)6KC4-1#85抗體之鈣離子結合評價
評價從人類抗體庫取得之鈣依存性的抗原結合抗體6KC4-1#85抗體是否會與鈣結合。以離子化鈣濃度不同之條件，依實施例7記載之方法評價所測定之Tm值是否有變動。
6KC4-1#85抗體之Fab域之Tm值如表36。如表36， 6KC4-1#85抗體之Fab域之Tm值會由於鈣離子之濃度而變動，所以可知：6KC4-1#85抗體會與鈣結合。
(參考實施例11)6KC4-1#85抗體之鈣離子結合部位之鑑定
參考實施例10顯示6KC4-l#85抗體會與鈣離子結合，但是6KC4-1#85從後述hVk5-2序列之探討可知不具鈣結合模體。所以，為了鑑定鈣離子是否與6KC4-1#85抗體之重鏈還是輕鏈還是兩者結合，評價鈣離子對於各交換為不與鈣離子結合之抗Glypican3抗體(重鏈序列GC_H(序列編號：51)、輕鏈序列GC_L(序列編號：52))之重鏈與輕鏈之改變抗體之結合。依參考實施例7之方法測得之改變抗體之Tm值如表37所示。其結果，帶有6KC4-1#85抗體之重鏈之改變抗體之Tm值會依鈣離子之濃度變化，故可認為以6KC4-1#85抗體之重鏈與鈣結合。
而為了鑑定鈣離子是否與6KC4-1#85抗體之重鏈之哪一個殘基有鈣離子結合，製作6KC4-1#85抗體之CDR所存在之Asp(D)殘基取代為與鈣離子之結合或螯合無關的Ala(A)殘基之改變重鏈(6_H1-11(序列編號：53)、6_H1-12(序列編號：54)、6_H1-13(序列編號：55)、6_H1-14(序列編號：56)、6_H1-15(序列編號：57))、或改變輕鏈(6_L1-5(序列編號：58)及6_L1-6(序列編號：59))。從導入有含改變抗體基因之表現載體的動物細胞的培養液，依實施例9記載之方法精製改變抗體。經精製之改變抗體之鈣結合，依實施例7記載之方法測定。測定結果如表38。如表38所示，藉由將6KC4-1#85抗體之重鏈CDR3之95位或101位(Kabat編號)取代為Ala殘基，6KC4-1#85抗體會失去鈣結合能力，因此可認為該殘基對於與鈣之結合為重要。從6KC4-1#85抗體之改變抗體之鈣結合性可知，6KC4-1#85抗體之重鏈CDR3之環圈基部附近存在之鈣結合模體，也可利用為取得本發明之抗原結合分子所包含之依離子濃度對抗抗原之抗原結合分域時使用之Ca庫設計的新要素。後述參考實施例18及19係於輕鏈可變區導入鈣結合模體，但例如據認為含有6KC4-1#85抗體之重鏈CDR3、且含有輕鏈之此以外之CDR含有柔性殘基之庫。
【表38】
(參考實施例12)使用正常小鼠之Ca依存性結合抗體對抗原之血漿中滯留性之影響之評價 (12-1)使用正常小鼠之體內試驗
評價對於正常小鼠(C57BL/6J mouse、Charles River Japan)將hsIL-6R(可溶型人類IL-6受體：於參考實施例3製作)單獨投予或將hsIL-6R及抗人類IL-6受體抗體同時投予後之hsIL-6R及抗人類IL-6受體抗體之體內動態。將hsIL-6R溶液(5μg/mL)、或hsIL-6R與抗人類IL-6受體抗體之混合溶液對於尾靜脈以10 mL/kg單次投予。抗人類IL-6受體抗體，使用上述H54/L28-IgG1、6RL#9-IgG1、FH4-IgG1。
混合溶液中之hsIL-6R濃度均為5μg/mL，但抗人類IL-6受體抗體濃度因應各抗體而不同，H54/L28-IgG1為0.1 mg/mL、6RL#9-IgG1及FH4-IgG1為10 mg/mL。此時，由於對於hsIL-6R之抗人類IL-6受體抗體係有足量過剩，故可認為hsIL-6R大部分與抗體結合。投予後15分鐘、7小時、1日、2日、4日、7日、14日、21日、28日進行採血。將採取之血液立即於4℃以12,000 rpm進行15分鐘離心分離，獲得血漿。分離之血漿直到實施測定為止，保存在設定為-20℃以下之冷凍庫。
(12-2)利用ELISA法測定正常小鼠血漿中之抗人類IL-6受體抗體濃度
小鼠血漿中之抗人類IL-6受體抗體濃度以ELISA法測定。首先，將Anti-Human IgG(γ-chain specific)F(ab’)2 Fragment of Antibody(SIGMA)分注於Nunc-Immuno Plate,MaxiSoup(Nalge nunc International)，於4℃靜置1晚，製作Anti-Human IgG固相化板。將血漿中濃度為0.64、0.32、0.16、0.08、0.04、0.02、0.01μg/mL之檢量線試樣及稀釋100倍以上之小鼠血漿測定試樣，分注到Anti-Human IgG固相化板，於25℃溫育1小時。之後，使Biotinylated Anti-human IL-6 R Antibody(R&D)於25℃反應1小時，再將Streptavidin-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)於25℃反應0.5小時，使用TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories) 為基質進行發色反應，以1N-硫酸(Showa Chemical)使反應停止後，以微板讀取儀測定450 nm之吸光度。小鼠血漿中濃度，係從檢量線之吸光度使用解析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices)計算。該方法測定之靜脈內投予後之正常小鼠中的H54/L28-IgG1、6RL#9-IgG1、FH4-IgG1之血漿中抗體濃度變化如圖50。
(12-3)利用電化學發光法測定血漿中hsIL-6R濃度
小鼠之血漿中hsIL-6R濃度，以電化學發光法測定。製備調整為2000、1000、500、250、125、62.5、及31.25 pg/mL之濃度的hsIL-6R檢量線試樣及稀釋50倍以上之小鼠血漿測定試樣。將試樣與以SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)釕化之單株抗人類IL-6R抗體(R&D)、生物素化抗人類IL-6 R抗體(R&D)、及tocilizumab(重鏈序列編號：60、輕鏈序列編號：61)溶液之混合液於4℃反應1晚。為了使樣本中之游離Ca濃度下降，樣本中幾乎所有的hsIL-6R從6RL#9-IgG1或FH4-IgG1解離，且成為與添加之tocilizumab結合之狀態，此時之Assay buffer含有10 mM EDTA。之後，將該反應液分注到MA400 PR Streptavidin Plate(Meso Scale Discovery)。再將於25℃反應1小時之板之各井洗滌後，在各井分注Read Buffer T(×4)(Meso Scale Discovery)。立即將反應液使用SECTOR PR 400 reader(Meso Scale Discovery)測定。hSIL-6R濃度係使用檢量線之應答使用解析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices)計算。以前述方法測定之靜脈內 投予後之正常小鼠血漿中之hsIL-6R之濃度變動如圖51所示。
其結果，hsIL-6R單獨非常快消失，相對於此同時投予hsIL-6R及無Ca依存性結合之通常之抗體H54/L28-IgG1的情形，hsIL-6R之消失大幅減慢。相對於此，同時投予hsIL-6R及有100倍以上之Ca依存性結合之6RL#9-IgG1或FH4-IgG1的情形，hsIL-6R之消失大幅加速。比起同時投予H54/L28-IgG1之情形，同時投予6RL#9-IgG1及FH4-IgG1的情形，一日後之血漿中之hsIL-6R濃度各減少39倍及2倍。藉此可確認鈣依存性結合抗體能加速抗原從血漿中消失。
[參考實施例13]與鈣離子結合之人類生殖細胞系列序列之探索 (13-1)鈣依存性地結合於抗原之抗體
以鈣依存性地結合於抗原之抗體(鈣依存性抗原結合抗體)，係由於鈣之濃度使與抗原之交互作用變化之抗體。鈣依存性抗原結合抗體，據認為係介由鈣離子之媒介而結合於抗原，所以形成抗原側之抗原決定部位之胺基酸，係能成為可螯合鈣離子之負電荷之胺基酸或氫鍵接受者之胺基酸。從形成如此之抗原決定部位之胺基酸之性質，可導向藉由導入組胺酸製作之以pH依存性地結合於抗原之結合分子以外之抗原決定部位。再者，藉由使用併具鈣依存性及以pH依存性地結合於抗原之性質之抗原結合分子，能製作可分別導向有廣泛性質之多樣抗原決定部位之抗原結 合分子。而據認為若能構建含鈣結合模體之分子之集合(Ca庫)，且從該分子之集團取得抗原結合分子，能有效率地取得鈣依存性抗原結合抗體。
(13-2)人類生殖細胞系列序列之取得
含有鈣結合模體之分子之集合之例可舉該分子為抗體之例。換言之，可考慮含鈣結合模體之抗體庫為Ca庫之情形。
(11-1)人類生殖細胞系列序列之取得
至今為止無人報告以含人類生殖細胞系列序列之抗體與鈣離子結合之情事。所以，為了判定含人類生殖細胞系列序列之抗體是否會與鈣離子結合，選殖包含以從Human Fetal Spreen Poly RNA(Clontech)製備之cDNA當做模板之人類生殖細胞系列序列的抗體之生殖細胞系列的序列。將經選殖之DNA片段插入動物細胞表現載體。將獲得之表現載體之鹼基序列依該技術領域之人士公知之方法決定，其序列編號如表39。編碼為序列編號：5(Vk1)、序列編號：6(Vk2)、序列編號：7(Vk3)、序列編號：8(Vk4)及序列編號：62(Vk5-2)之聚核苷酸，與利用PCR法編碼為天然型Kappa鏈之不變區(序列編號：50)之聚核苷酸連結成的DNA片段，納入動物細胞表現用載體。又，編碼為序列編號：63(Vk1)、序列編號：64(Vk2)、序列編號：65(Vk3)及序列編號：66(Vk4)之重鏈可變區之聚核苷酸，與編碼為利用PCR法(天然型序列之C末端2個胺基酸缺損之序列編號：163表示之IgG1之聚核苷酸連結之DNA片段，納入動物細 胞表現用載體。製作之變異體之序列經以該技術領域之人士公知之方法確認。
(13-3)抗體之表現與精製
將插入有取得之5種人類生殖細胞系列序列的DNA片段的動物細胞表現載體導入動物細胞。抗體之表現係以以下方法進行。將人類胎兒腎細胞來源FreeStyle 293-F株(Invitrogen)懸浮於FreeStyle 293 Expression Medium培養基(Invitrogen)，以1.33 x 106細胞/mL之細胞密度對於6井板之各井接種3 mL。製備之質體以脂轉染法導入細胞。於CO2培養箱(37度、8%CO2、90 rpm)中進行4日培養。使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)並使用該技術領域之人士公知之方法，從上述獲得之培養上清精製抗體。使用分光光度計精製之抗體溶液測定於280 nm之吸光度。使用依PACE法計算之吸光係數，可從獲得之測定值計算抗體濃度(Protein Science(1995)4,2411-2423)。
(13-4))含人類生殖細胞系列序列之抗體之鈣離子結合活性之評價
評價經精製之抗體之鈣離子結合活性。作為鈣離子對抗體之結合之評價指標，測定由示差掃描型熱量測定(DSC)所得之熱變性中間溫度(Tm值)(MicroCal VP-Capillary DSC、MicroCal)。熱變性中間溫度(Tm值)為安定性之指標，若由於鈣離子之結合使蛋白質安定化，熱變性中間溫度(Tm值)會比起鈣離子未結合之情形提高(J.Biol.Chem.(2008)283,37,25140-25149)。利用評價抗體溶液中之因鈣離子濃度之變化之抗體之Tm值之變化，來評價鈣離子對抗體之結合活性。
將經精製之抗體提供給以20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、2 mM CaCl2(pH7.4)或20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl,3μM CaCl2(pH7.4)之溶液為外液之透析(EasySEP、TOMY)處理。使用供透析之溶液及製備為0.1 mg/mL之抗體溶液當做待驗物質，從20℃至115℃以240℃/hr之升溫速度進行DSC測定。依據獲得之DSC之變性曲線計算之各抗體之Fab域之熱變性中間溫度(Tm值)，如表40。
其結果，含hVk1、hVk2、hVk3、hVk4序列之抗體之 Fab域之Tm值，不依存於含該Fab域之溶液中之鈣離子濃度，不變動。另一方面，含hVk5序列之抗體之Fab域之Tm值，會由於含該Fab域之抗體溶液中之鈣離子濃度而變動，因此顯示hVk5序列會與鈣離子結合。
(13-5)hVk5-2序列之鈣結合評價
獲得於參考實施例5之(5-2)之Vk5-2(序列編號：4)以外，分類為Vk5-2之Vk5-2變異體1(序列編號：68)及Vk5-2變異體2(序列編號：69)。針對該等之變異體也進行鈣結合評價。將Vk5-2、Vk5-2變異體1及Vk5-2變異體2之DNA片段分別納入動物細胞用表現載體。獲得之表現載體之鹼基序列依該技術領域中具有通常知識者公知之方法決定。Vk5-2、Vk5-2變異體1及Vk5-2變異體2之DNA片段分別被納入之動物細胞用表現載體，與表現作為重鏈之CIM_H(序列編號：67)之方式納入之動物表現用之載體，依參考實施例12之(12-3)記載之方法一起導入動物細胞中並將抗體精製。評價經精製之抗體之鈣離子結合活性。將經精製之抗體供以20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、2 mM CaCl2(pH7.5)或20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl(pH7.5)之溶液(表41記為鈣離子濃度0mM)作為外液之透析(EasySEP、TOMY)處理。使用在透析之溶液將製備為約0.1 mg/mL之抗體溶液作為待驗物質，從20℃至115℃以240℃/hr之升溫速度進行DSC測定。依據獲得之DSC之變性曲線計算之各抗體之Fab分域之熱變性中間溫度(Tm值)如表41所示。
其結果，含Vk5-2、Vk5-2變異體1及Vk5-2變異體2之序列之抗體之Fab分域之Tm值，會隨含該Fab分域之抗體溶液中之鈣離子之濃度變動，所以顯示帶有分類為Vk5-2之序列之抗體會與鈣離子結合。
(參考實施例14)人類Vk5(hVk5)序列之評價 (14-1)hVk5序列
Kabat資料庫中，hVk5序列僅有hVk5-2序列登載。本說明書將hVk5與hVk5-2以相同含意處理。WO2010/136598中，記載hVk5-2序列之生殖細胞系列序列中之存在比為0.4%。其他報告中，記載hVk5-2序列之生殖細胞系列序列中之存在比為0~0.06%(J.Mol.Biol.(2000)296,57-86、Proc.Natl.Acad.Sci.(2009)106,48,20216-20221)。如上所述，hVk5-2序列為生殖細胞系列序列中出現頻度低的序列，所以據認為從以人類生殖細胞系列序列構成之抗體庫或從藉由對表現人類抗體之小鼠免疫取得之B細胞，來取得與鈣結合之抗體並非有效率。而，有人考慮設計含有人類hVk5-2序列之Ca庫之可能性，但據報告之合成抗體庫(WO2010/105256或WO2010/136598)未含hVk5序列。而且，hVk5-2序列之物性未有人報告， 其實現之可能性為未知。
(14-2)糖鏈非附加型hVk5-2序列之構建、表現及精製
hVk5-2序列在20位(Kabat編號)之胺基酸具有附加N型糖鏈之序列。對於蛋白質附加之糖鏈由於存在異質性，故由物質均勻性之觀點，以不附加糖鏈為理想。而，製作20位(Kabat編號)之Asn(N)殘基取代為Thr(T)殘基之變異體hVk5-2_L65(序列編號：70)。胺基酸之取代，係使用QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)之該技術領域之人士公知之方法進行。將編碼為變異體hVk5-2_L65之DNA納入動物表現用載體。納入有製作之變異體hVk5-2_L65之DNA的動物表現用載體，與納入有表現當做重鏈之CIM_H(序列編號：67)的動物表現用載體，以參考實施例5記載之方法一起導入到動物細胞中。於導入之動物細胞中表現之含hVk5-2_L65及CIM_H之抗體，以參考實施例13記載之方法精製。
(14-3)含糖鏈非附加型hVk5-2序列之抗體之物性評價
經取得之含改變序列hVk5-2_L65之抗體，是否比起為供改變之基礎的hVk5-2序列之抗體，其異質性有所減少之情事，係使用離子交換層析分析。離子交換層析之方法如表42所示。分析結果如圖52所示，顯示糖鏈附加部位經改變之hVk5-2_L65，比起原本的hVk5-2序列，異質性有所減少。
【表42】
其次，將含有異質性減少之hVk5-2_L65序列的抗體是否會與鈣離子結合之情事，使用參考實施例13記載之方法評價。其結果，如表43所示，含有糖鏈附加部位經改變之hVk5-2_L65之抗體之Fab域之Tm值，也會由於抗體溶液中之鈣離子濃度之變化而變動。亦即，顯示含糖鏈附加部位經改變之hVk5-2_L65之抗體之Fab域，會有鈣離子結合。
(參考實施例15)對於含hVk5-2序列之CDR序列之抗體分子之鈣離子結合活性之評價 (15-1)含hVk5-2序列之CDR序列之改變抗體之製作、表現及精製
hVk5-2_L65序列，係存在於人類Vk5-2序列之框架的糖鏈附加部位之胺基酸受改變之序列。於參考實施例14顯示即使改變糖鏈附加部位，鈣離子仍會結合，但是一般而 言，框架序列為生殖細胞系列之序列從免疫原性之觀點為理想。所以，探討是否可能將抗體之框架序列取代為未附加糖鏈之生殖細胞系列序列之框架序列而維持對於該抗體之鈣離子之結合活性。
將編碼為經化學合成之hVk5-2序列之框架序列改變為hVk1、hVk2、hVk3及hVk4序列之序列(各為CaVk1(序列編號：71)、CaVk2(序列編號：72)、CaVk3(序列編號：73)、CaVk4(序列編號：74)的聚核苷酸，以PCR法與編碼為天然型Kappa鏈之不變區(序列編號：50)之聚核苷酸連結成的DNA片段，納入動物細胞表現用載體。經製作之變異體之序列以該技術領域之人士公知之方法確認。以上述方式製作之各質體，與納入有編碼為CIM_H(序列編號：67)之聚核苷酸之質體，一起以參考實施例記載之方法導入動物細胞。從以上述方式導入之動物細胞之培養液，精製表現之所望之抗體分子。
(15-2)含hVk5-2序列之CDR序列之改變抗體之鈣離子結合活性之評價
以參考實施例5記載之方法評價鈣離子是否會結合於含hVk5-2序列以外之生殖細胞系列序列(hVk1、hVk2、hVk3、hVk4)之框架序列及hVK5-2序列之CDR序列的改變抗體。評價結果如表44。各改變抗體之Fab域之Tm值，顯示會由於抗體溶液中之鈣離子濃度變化而變動。是以，顯示含hVk5-2序列之框架序列以外的框架序列的抗體也會與鈣離子結合。
再者，可知：改變為含有hVk5-2序列以外之生殖細胞系列序列(hVk1、hVk2、hVk3、hVk4)之框架序列及hVK5-2序列之CDR序列的各抗體之Fab域之熱安定性之指標熱變性溫度(Tm值)，比以含有當做供改變之基礎的hVk5-2序列的抗體之Fab域之Tm值為增加。從該結果，發現：含hVk1、hVk2、hVk3、hVk4之框架序列及hVk5-2序列之CDR序列的抗體，具有與鈣離子結合之性質，此外，於熱安定性之觀點也為優異之分子。
(參考實施例16)人類生殖細胞系列hVk5-2序列存在之鈣離子結合部位之鑑定 (16-1)hVk5-2序列之CDR序列中之變異部位之設計
如參考實施例15記載，含hVk5-2序列之CDR部分導入於其他生殖細胞系列之框架序列之輕鏈之抗體也會顯示與鈣離子結合。由此結果，啟示hVk5-2存在之鈣離子結合部位在CDR之中存在。與鈣離子結合，亦即螯合鈣離子之胺基酸，例如負電荷之胺基酸或能成為氫鍵之接受者之胺基酸。所以，評價含有hVk5-2序列之CDR序列中存在之 Asp(D)殘基或Glu(E)殘基取代為Ala(A)殘基之變異hVk5-2序列的抗體是否會與鈣離子結合。
(16-2)hVk5-2序列之Ala取代體之製作及抗體之表現及精製
製作含有hVk5-2序列之CDR序列中存在之Asp及/或Glu殘基改變為Ala殘基之輕鏈的抗體分子。如參考實施例14記載，由於未附加糖鏈之變異體hVk5-2_L65維持與鈣離子結合，故由鈣離子結合性之觀點，可認為與hVk5-2序列為同等。本實施例中，以hVk5-2_L65為模板序列，進行胺基酸取代。製作之變異體如表45。胺基酸之取代使用QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)、PCR或In fusion Advantage PCR cloning kit(TAKARA)等該技術領域之人士公知之方法進行，構建胺基酸經取代之改變輕鏈之表現載體。
獲得之表現載體之鹼基序列以該技術領域之人士公知之方法決定。將製作之改變輕鏈之表現載體與重鏈CIM_H(序列編號：67)之表現載體，一起暫時性導入人類胎兒腎癌細胞來源HEK293H株(Invitrogen)、或FreeStyle293細胞(Invitrogen)，以使抗體表現。從獲得之培養上清，使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(GE Healthcare)，以該技術領域之人士公知之方法精製抗體。經精製之抗體溶液於280 nm之吸光度，使用分光光度計測定。藉由使用PACE法計算之吸光係數，從獲得之測定值計算抗體濃度(Protein Science(1995)4,2411-2423)。
(16-3)含hVk5-2序列之Ala取代體的抗體之鈣離子結合活性評價
判定獲得之精製抗體是否會與鈣離子結合係依參考實施例13記載之方法判定。其結果如表46所示。藉由將hVk5-2序列之CDR序列中存在之Asp或Glu殘基取代為與鈣離子之結合或螯合無關的Ala殘基，存在由於抗體溶液之鈣離子濃度之變化其Fab域之Tm值不會變動之抗體。顯示由於Ala取代而Tm值不變動之取代部位(32位及92位(Kabat編號))，對於鈣離子與抗體之結合特別重要。
【表46】
(參考實施例17)含具鈣離子結合模體之hVk1序列之抗體之評價 (17-1)具鈣離子結合模體之hVk1序列之製作及抗體之表現及精製
從參考實施例16記載之Ala取代體之鈣之結合活性之結果，顯示hVk5-2序列之CDR序列之中，Asp或Glu殘基對於鈣結合為重要。所以，評價是否僅將30位、31位、32位、50位及92位(Kabat編號)之殘基導入其他生殖細胞系列之可變區序列，仍能與鈣離子結合。具體而言，製作人類生殖細胞系序列hVk1序列之30位、31位、32位、50位及92位(Kabat編號)之殘基取代為hVk5-2序列之30位、31位、32位、50位及92位(Kabat編號)之殘基之變異體LfVk1_Ca(序列編號：83)。亦即，判定是否含有僅導入有hVk5-2序列中之該等5殘基的hVk1序列的抗體能與鈣結合。變異體之製作與參考實施例16同樣進行。將獲得之輕鏈變異體LfVk1_Ca與含輕鏈hVk1序列之LfVk1(序列 編號：84)，與重鏈CIM_H(序列編號：67)一起表現。抗體之表現及精製與參考實施例16以同樣方法實施。
(17-2)含具鈣離子結合模體之人類hVk1序列之抗體之鈣離子結合活性之評價
以參考實施例13記載之方法判定如上述獲得之精製抗體是否會與鈣離子結合。其結果如表47。含有具hVk1序列之LfVk1的抗體之Fab域之Tm值不會隨抗體溶液中之鈣濃度變化而變動，另一方面，含有LfVk1_Ca之抗體序列之Tm值會隨抗體溶液中之鈣濃度之變化而變化1℃以上，因此，顯示含LfVk1_Ca之抗體會與鈣結合。由上述結果，鈣離子之結合，完全不需要hVk5-2之CDR序列，僅在構建LfVk1_Ca序列時導入之殘基也就足夠。
(17-3)分解抑制型LfVk1_Ca序列之構建、表現及精製製作參考實施例17之(17-1)中的人類生殖細胞系序列hVk1序列之30位、31位、32位、50位及92位(Kabat編號)之殘基改為hVk5-2序列之30位、31位、32位、50位及92位(Kabat編號)之殘基的變異體LfVk1_Ca(序列編號：66)，顯示鈣離子結合。而，據認為可設計含LfVk1_Ca序列之Ca庫，但由於LfVk1_Ca序列之物性未有人報 告，其實現可能性為未知。LfVk1_Ca序列，據報告於30位、31位及32位(Kabat編號)存在Asp且於酸性條件下分解之Asp-Asp序列存在於CDR1序列中(J.Pharm.Biomed.Anal.(2008)47(1),23-30)。從保存安定性之觀點，希望避免在酸性條件分解。而，製作有分解可能性之Asp(D)殘基取代為Ala(A)殘基之變異體LfVk1_Cal(序列編號：85)、LfVk1_Ca2(序列編號：86)及LfVk1_Ca3(序列編號：87)。胺基酸之取代係依使用QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)之該技術領域中具有通常知識者公知之方法進行。將編碼為變異體之DNA納入動物表現用載體。將納入有製作之變異體之DNA之動物表現用載體、與以表現GC_H(序列編號：51)作為重鏈而納入之動物表現用之載體，依參考實施例13記載之方法一起導入動物細胞中。在導入之動物細胞中表現之抗體，依參考實施例13記載之方法精製。
(17-4)含分解抑制型LfVk1_Ca序列之抗體之安定性評價
利用熱加速後之各抗體之異質性之比較以評價於實施例17之(17-3)取得之抗體是否比起含成為供改變之基礎之LfVk1_Ca序列之抗體在pH6.0溶液中之分解受抑制。將抗體於20 mM Histidine-HCl、150 mM NaCl、pH6.0之溶液以一晚4℃之條件透析。將透析之抗體製備為0.5mg/mL，於5℃或50℃保存3日。保存後之各抗體以參考實施例14記載之方法進行離子交換層析。分析之結果， 如圖53所示，分解部位經改變之LfVk1_Cal，比起原本的LfVk1_Ca序列的異質性少，由於熱加速所致分解顯示顯著受抑制。亦即，顯示LfVk1_Ca序列中之30位存在之Asp(D)殘基分解，並且顯示Asp殘基之分解能藉由胺基酸改變避免。
(17-5)輕鏈30位Asp殘基分解抑制型LfVk1_Ca序列之製作及抗體之表現及精製
從參考實施例17之(17-4)記載之Ala取代體之分解抑制之結果，顯示LfVk1_Ca序列之CDR序列之中之30位(Kabat編號)之Asp(D)殘基於酸性條件分解，且藉由將30位(Kabat編號)取代為其他胺基酸((17-4)中係取代為Ala(A)殘基)，能抑制分解。而，對於30位(Kabat編號)之殘基取代為能螯合鈣離子之殘基之一個Ser(S)殘基而成序列(稱為LfVk1_Ca6。序列編號：88)，是否能於維持鈣結合能力之下使分解受抑制進行評價。變異體之製作與參考實施例9同樣進行。將獲得之輕鏈變異體LfVk1_Ca6及輕鏈LfVk1_Ca序列與重鏈GC_H(序列編號：51)一起表現。抗體之表現及精製，係與參考實施例16以同樣方法實施。
(17-6)輕鏈30位Asp殘基分解抑制型LVk1_Ca序列之評價
如以上述方法獲得之精製抗體之酸性條件下之保存安定性，以參考實施例17之(17-4)記載之方法判定。其結果如圖54所示，含LfVk1_Ca6序列之抗體，顯示比起含原本的LfVk1_Ca序列之抗體其分解受抑制。
再者，以參考實施例13記載之方法判定含LfVk1_Ca 序列之抗體及含LfVk1_Ca6序列之抗體是否會與鈣離子結合。其結果如表48。含LfVk1_Ca序列之抗體及含分解抑制型LfVk1_Ca6序列之抗體之Fab域之Tm值，各隨抗體溶液中之鈣濃度之變化而變化1℃以上。
(參考實施例18)以能以良好效率取代以Ca濃度依存性結合於抗原之結合抗體之方式將鈣離子結合模體導入於可變區之抗體分子之集團(Ca庫)之設計
鈣結合模體，例如hVk5-2序列或其CDR序列，再者，殘基受擠的30位、31位、32位、50位、92位(Kabat編號)為理想例。以外，具有與鈣結合之蛋白質之EF手模體(calmodulin等)或C型外源凝集素(ASGPR等)也該當於鈣結合模體。
Ca庫係由重鏈可變區與輕鏈可變區構成。重鏈可變區使用人類抗體序列，並對輕鏈可變區導入鈣結合模體。選擇hVk1序列作為導入有鈣結合模體之輕鏈可變區之模板序列。含對hVk1序列導入有鈣結合模體之其中一hVk5-2之CDR序列的LfVk1_Ca序列之抗體，如參考實施例16所示，顯示與鈣離子結合。於模板序列出現多數胺基酸，構成庫之抗原結合分子之多樣性擴大。多數胺基酸出現之位 置，選擇在與抗原交互作用之可能性高之可變區之表面露出之位置。具體而言，選擇30位、31位、32位、34位、50位、53位、91位、92位、93位、94位及96位(Kabat編號)作為如此的柔性殘基。
然後設定出現之胺基酸殘基之種類及其出現率。解析於Kabat資料庫(KABAT,E.A.ET AL.：’Sequences of proteins of immunological interest’,vol.91,1991,NIH PUBLICATION)登載的hVk1與hVk3之序列中，在柔性殘基之胺基酸之出現頻度。依解析結果，從各位置出現頻度高之胺基酸，選擇在Ca庫出現之胺基酸之種類。此時，為了使胺基酸之性質不偏向，也選擇在解析結果判定出現頻度少的胺基酸。又，經選擇之胺基酸之出現頻度，係參考Kabat資料庫之解析結果設定。
考慮如以上設定之胺基酸及出現頻度，作為Ca庫，設計含鈣結合模體且重視該模體以外之各殘基含有多數胺基酸之序列之多樣性的Ca庫。表1及2記載Ca庫之詳細設計(各表中之位置表示Kabat編號)。又，表1及2記載之胺基酸之出現頻度，於Kabat編號表示之92位為Asn(N)之情形，94位不是Ser(S)而是Leu(L)。
(參考實施例19)Ca庫之製作
以從人類PBMC製作之polyA RNA或市售人類polyA RNA等當做模板，以PCR法將抗體重鏈可變區之基因庫放大。針對抗體輕鏈可變區部分，依參考實施例18所記載，設計維持鈣結合模體且以鈣濃度依存性對於抗原結合之抗體之出 現頻度提高的抗體可變區輕鏈部分。又，柔性殘基當中，導入有鈣結合模體之殘基以外之胺基酸殘基，係參考在天然人類抗體之胺基酸出現頻度之資訊((KABAT,E.A.ET AL.：’Sequences of proteins of immunological interest’,vol.91,1991,NIH PUBLICATION)，且設計在天然人類抗體之序列中出現頻度高之胺基酸均等分布而得之抗體輕鏈可變區之庫。將以此方式製作之抗體重鏈可變區之基因庫與抗體輕鏈可變區之基因庫之組合插入噬粒載體，構建提示由人類抗體序列構成之Fab分域之人類抗體噬菌體提示庫(Methods Mol Biol.(2002)178,87-100)。
依後述參考實施例23記載之方法，針對從導入由抗體基因庫之大腸菌單離之抗體基因部分確認序列。獲得之290種選殖體之序列之胺基酸分布、及設計之胺基酸分布，如圖55所示。
(參考實施例20)Ca庫所含之分子之鈣離子結合活性之評價 (20-1)Ca庫所含之分子之鈣離子結合活性
如參考實施例14所示，顯示與鈣離子結合之hVk5-2序列係在生殖細胞系列序列中出現頻度低之序列，故從以人類生殖細胞系列序列構成之抗體庫或從對表現人類抗體之小鼠之免疫取得之B細胞取得與鈣結合之抗體並非有效率。而構建Ca庫。評價構建的Ca庫是否存在與鈣結合之選殖體。
(20-2)抗體之表現與精製
將Ca庫所含之選殖體對於動物細胞表現用質體的導入。抗體之表現係使用以下方法進行。將人類胎腎細胞來源的FreeStyle 293-F株(Invitrogen)懸浮於FreeStyle 293 Expression Medium培養基(Invitrogen)，以1.33×106個/mL的細胞密度在6井盤的各井各接種3 mL，以脂轉染法將製備的質體導入細胞。於CO2培養箱(37度、8%CO2,90 rpm)培養4日，從獲得之培養上清，使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)，以該技術領域之人士公知之方法精製抗體。精製抗體濃度，使用分光光度計測定於280 nm之吸光度。從獲得之值，以PACE法使用計算之吸光係數，計算抗體濃度(Protein Science 1995；4：2411-2423)。
(20-3)鈣離子對於取得之抗體之結合評價
如上所述獲得之精製抗體是否與鈣離子結合，係依參考實施例6記載之方法判定。其結果如表49所示。Ca庫所含之多數抗體之Fab分域之Tm依鈣離子濃度變動，顯示含有與鈣離子結合之分子。
【表49】
(參考實施例21)以Ca依存性地結合於IL-6受體之抗體之取得 (21-1)從珠淘選所得之庫取得以Ca依存性地結合於抗原之抗體片段
從構建之以Ca依存性地與IL-6受體結合之抗體庫最初之篩選，係藉由濃縮成僅具對於抗原(IL-6受體)之結合能力之抗體片段而實施。
從保持有經構建之噬菌體呈現用噬粒(phagemid)之大腸菌生產噬菌體。藉由對於進行噬菌體生產之大腸菌之培 養液添加2.5 M NaCl/10%PEG，使沉澱的噬菌體的集團以TBS稀釋，藉此獲得噬菌體庫液。其次，對於噬菌體庫液添加BSA及CaCl2，使終濃度成為4%BSA及1.2mM鈣離子濃度。淘選方法，係參照一般方法，即，使用固定化於磁性珠之抗原的淘選方法(J.Immunol.Methods.(2008)332(1-2),2-9、J.Immunol.Methods.(2001)247(1-2),191-203、Biotechnol.Prog.(2002)18(2)212-20、Mol.Cell Proteomics(2003)2(2),61-9)。磁性珠可使用NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或Streptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)。
具體而言，於製備的噬菌體庫液添加250 pmol之生物素標記抗原，藉此使該噬菌體庫液於室溫接觸抗原60分鐘。添加以BSA阻斷的磁性珠，將抗原與噬菌體之複合體於室溫結合於磁性珠15分鐘。將珠以1.2 mM CaCl2/TBST(含1.2 mM CaCl2之TBST)洗滌3次後，以1 mL之1.2 mM CaCl2/TBS(含1.2 mM CaCl2之TBS)再洗滌2次。之後，將添加有0.5 mL之1 mg/mL之胰蛋白酶之珠於室溫懸浮15分鐘後，立即使用磁座分離珠，將噬菌體溶液回收。將回收的噬菌體溶液，添加到處於對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10 mL之大腸菌株ER2738。於37℃緩慢攪拌，培養上述大腸菌1小時，藉此使噬菌體感染大腸菌。將經感染之大腸菌，接種到225 mm x 225 mm的板。其次，從經接種之大腸菌之培養液回收噬菌體，以製備噬菌體庫液。
第2次後之淘選，係以抗原結合能力或Ca依存性結合能力為指標，實施噬菌體之濃縮。
具體而言，進行以抗原結合能力為指標之濃縮時，係於製備的噬菌體庫液添加40 pmol之生物素標記抗原，藉此使噬菌體庫於室溫與抗原接觸60分鐘。添加經BSA阻斷的磁性珠，使抗原與噬菌體之複合體於室溫結合於磁性珠15分鐘。珠以1 mL之1.2 mM CaCl2/TBST與1.2 mM CaCl2/TBS洗滌。之後，將添加有0.1 mL之2 mM EDTA/TBS的珠於室溫懸浮15分鐘後，立即使用磁座分離珠，並回收噬菌體溶液。於回收之噬菌體溶液添加100 mg/mL之胰蛋白酶5μL，藉此切斷未呈現Fab之噬菌體之pIII蛋白質(幫助者(helper)噬菌體來源之pIII蛋白質)，使未呈現Fab之噬菌體失去對於大腸菌之感染能力。回收之噬菌體，添加到處於對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10 mL之大腸菌株ER2738。於37℃緩慢攪拌進行1小時上述大腸菌之攪拌培養，使噬菌體感染大腸菌。將感染的大腸菌接種在225 mm x 225 mm之板。其次，從接種的大腸菌的培養液回收噬菌體，藉此回收噬菌體庫液。
以Ca依存性結合能力作為指標濃縮時，係在經製備之噬菌體庫液施加40 pmol之生物素標記抗原，並使噬菌體庫於室溫與抗原接觸60分鐘。加入經BSA阻斷的磁珠，將抗原與噬菌體之複合體以磁珠於室溫進行15分鐘結合。珠以1 mL1.2 mM CaCl2/TBST與1.2 mM CaCl2/TBS洗滌。之後，將加有0.1 mL之2 mM EDTA/TBS(包括2 mM之EDTA 之TBS)之珠於室溫懸浮後，立即使用磁性台將珠分離，回收噬菌體溶液。藉由對回收之噬菌體溶液加入100 mg/mL的胰蛋白酶5μL，將未提示Fab之噬菌體之pIII蛋白質(幫手噬菌體來源的pIII蛋白質)切斷，使未提示Fab之噬菌體對大腸菌失去感染能力。回收之噬菌體溶液，添加於成為對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10 mL大腸菌株ER2738，上述大腸菌於37℃緩慢培養1小時，進行攪拌培養，使噬菌體感染大腸菌。將感染的大腸菌接種於225 mm x 225 mm之板。其次從接種的大腸菌培養液回收噬菌體，以回收噬菌體庫液。
(21-2)利用噬菌體ELISA之評價
從依上述方法獲得之大腸菌單一菌落，參考(Methods Mol Biol.2002；178：133-145.)回收含噬菌體之培養上清。
將已添加BSA、CaCl2之含噬菌體之培養上清依以下程序供ELISA。將StreptaWell 96微滴定板(Roche)以含生物素標記抗原之PBS 100μL塗覆一晚。以PBS洗滌該板之各井以去除抗原後，將該井以4% BSA-TBS 250μL阻斷1小時以上。去除4% BSA-TBS，於各井添加製備的培養上清，將該板於37℃靜置1小時，使提示噬菌體之抗體結合於在各井存在的抗原。於以1.2 mM CaCl2/TBST洗滌之各井添加1.2 mM CaCl2/TBS或1 mM EDTA/TBS，將該板於37℃靜置30分鐘並溫育。以1.2 mM CaCl2/TBST洗滌後，將經離子化鈣濃度1.2 mM之TBS稀釋成的HRP結合抗M13抗體(Amersham Parmacia Biotech)添加於各井的板溫育1小 時。以1.2 mM CaCl2/TBST洗滌後，將添加有TMB single solution(ZYMED)之各井中之溶液之發色反應藉由硫酸之添加使反應停止後，測定450 nm之吸光度以測定該發色。
對於已實施上述噬菌體ELISA之選殖體，進行使用專一性引子放大之基因之鹼基序列解析。
噬菌體ELISA、序列解析之結果如以下之表50所示。
(21-3)抗體之表現與精製
噬菌體ELISA之結果，對判斷有Ca依存性的對抗原的結合能力的選殖體，進行對於動物細胞表現用質體的導入。抗體之表現係使用以下方法進行。將人類胎腎細胞來源的FreeStyle 293-F株(Invitrogen)懸浮於FreeStyle 293 Expression Medium培養基(Invitrogen)，以1.33×106個/mL的細胞密度在6井盤的各井各接種3 mL，以脂轉染法將製備的質體導入細胞。於CO2培養箱(37度、8%CO2,90 rpm)培養4日，從獲得之培養上清，使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)，以該技術領域之人士公知之方法精製抗體。精製抗體濃度，使用分光光度計測定於280 nm之吸光度。從獲得之值，以PACE法使用計算之吸光係數，計算抗體濃度(Protein Science 1995；4：2411-2423)。
(21-4)取得之抗體對於人類IL-6受體之Ca依存性的結合能力之評價
為了判斷如前述取得之抗體6RC1IgG_010(重鏈序列編號：111、輕鏈序列編號：112)、及6RC1IgG_012(重鏈序列編號：113、輕鏈序列編號：114)、及6RC1IgG_019(重鏈序列編號：115、輕鏈序列編號：116)對IL-6受體之結合活性是否為Ca依存性，使用Biacore T100(GE Healthcare)解析該等抗體與人類IL-6受體之交互作用。作為對於人類IL-6受體不具Ca依存性之結合活性之對照抗體，使用tocilizumab(重鏈序列編號：60、輕鏈序列編號：61)。作為高鈣離子濃度及低鈣離子濃度之條件，各於1.2 mM及3μM之鈣離子濃度之溶液中進行交互作用解析。在以胺基偶聯法將重組型protein A/G(Invitrogen)適量固定化後之感測晶片CM4(GE Healthcare)上，捕捉抗體。運行緩衝液使用20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05%(w/v)Tween20、1.2 mM CaCl2(pH7.4)或20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05%(w/v)Tween20、3μM CaCl2(pH7.4)之2種緩衝液。人類IL-6受體之稀釋也使用各緩衝液，測定均於37℃進行。
進行使用對照抗體tocilizumab抗體、6RC1IgG_010抗體及6RC1IgG_012抗體及6RC1IgG_019抗體之抗原抗體反應之交互作用解析時，藉由以流速5μL/min注入IL-6受體之稀釋液與為空白之運行緩衝液3分鐘，使捕捉於感應晶片上之tocilizumab抗體、6RC1IgG_010抗體及6RC1IgG_012抗體及6RC1IgG_019抗體與IL-6受體交互作用。之後，以流速30μL/min注入10 mM Glycine-HCl(pH1.5)30秒使感應晶片再生。
依此方法測定之高鈣離子濃度中之感測圖如圖56所示。
針對低鈣離子濃度之條件下之tocilizumab抗體、6RC1IgG_010抗體及6RC1IgG_012抗體及6RC1IgG_019抗體之感測圖，也依同樣方法取得。低鈣離子濃度之感測圖如圖57所示。
從上述結果，6RC1IgG_010抗體及6RC1IgG_012抗體及6RC1IgG_019抗體，藉由使緩衝液中之鈣離子濃度從1.2mM減少到3μM，觀察到對IL6受體之結合能力大幅減少。
(參考實施例22)pH依存性結合抗體庫之設計 (22-1)pH依存性結合抗體之取得方法
WO2009/125825揭示藉由對於抗原結合分子導入組胺酸，而在pH中性區與pH酸性區性質變化之pH依存性抗原結合抗體。所揭示之pH依存性結合抗體，係藉由將所望之抗原結合分子之胺基酸序列之一部分取代為組胺酸而取 得。為了不預先獲得改變對象之抗原結合分子而更有效率的獲得pH依存性結合抗體，考慮從組胺酸導入於可變區(更佳為有涉及抗原結合之可能性之位置)之抗原結合分子之集團(稱為His庫)取得結合於所望之抗原之抗原結合分子。從His庫獲得之抗原結合分子比通常之抗體庫，組胺酸以較高頻度出現，所以據認為能有效率地取得具有所望性質之抗原結合分子。
(22-2)為了能以良好效率取得以pH依存性地結合於抗原之結合抗體，將組胺酸殘基導入於可變區之抗體分子之集團(His庫)之設計
首先以His庫選擇導入組胺酸之位置。WO2009/125825中，揭示藉由將IL-6受體抗體、IL-6抗體及IL-31受體抗體之序列中之胺基酸殘基取代為組胺酸而製作pH依存性抗原結合抗體。然後，將抗原結合分子之胺基酸序列取代為組胺酸，製作有pH依存性抗原結合能力之抗蛋白溶菌酶抗體(FEBS Letter 11483,309,1,85-88)及抗hepcidin抗體(WO2009/139822)。在IL-6受體抗體、IL-6抗體、IL-31受體抗體、蛋白溶菌酶抗體及hepcidin抗體導入組胺酸之位置如表51所示。表51所示之位置，可列舉能控制抗原與抗體之結合之位置之候選者。再者，以表51表示之位置以外，只要與抗原接觸之可能性高之位置也可適當考慮作為導入組胺酸之位置。
【表51】
在由重鏈可變區與輕鏈可變區構成之His庫中，重鏈可變區使用人類抗體序列，對輕鏈可變區導入組胺酸。於His庫導入組胺酸之位置，選擇上列舉之位置、可能涉及抗原結合之位置，亦即輕鏈之30位、32位、50位、53位、91位、92位及93位(Kabat編號、Kabat EA et al.1991.Sequence of Proteins of Immunological Interest.NIH)。又，作為導入組胺酸之輕鏈可變區之模板序列，選擇Vk1序列。使模板序列出現多數胺基酸，擴大構成庫之抗原結合分子之多樣性。出現多數胺基酸之位置，選擇在與抗原交互作用之可能性高之可變區之表面露出之位置。具體而言，選擇輕鏈之30位、31位、32位、34位、50位、53位、91位、92位、93位、94位及96位(Kabat編號、Kabat EA et al.1991.Sequence of Proteins of Immunological Interest.NIH)作為如此的柔性殘基。
然後設定使出現之胺基酸殘基種類及其出現率。解析 在Kabat資料庫(KABAT,E.A.ET AL.：’Sequences of proteins of immunological interest’,vol.91,1991,NIH PUBLICATION)登載的hVk1及hVk3之序列中之柔性殘基中之胺基酸之出現頻度。依解析結果，從各位置出現頻度高的胺基酸挑選在His庫出現之胺基酸之種類。此時，為了使胺基酸之性質不會不均勻，也選擇解析結果判定為出現頻度少之胺基酸。又，選擇之胺基酸之出現頻度，參考Kabat資料庫之解析結果設定。
考慮如以上設定之胺基酸及出現頻度，作為His庫，設計組胺酸在各CDR固定一定會有一個的His庫1，及比His庫1更重視序列之多樣性之His庫2。His庫1及His庫2之詳細設計如表3及表4(各表中之位置表示Kabat編號)。又，表3及4記載之胺基酸之出現頻度，於Kabat編號表示之92位為Asn(N)之情形，94位可排除Ser(S)。
(參考實施例23)用於取得以pH依存性地結合於抗原之抗體之人類抗體噬菌體提示庫(His庫1)之製作
以從人類PBMC製作之polyA RNA、或市售之人類polyA RNA等作為模板，以PCR法將抗體重鏈可變區之基因庫放大。將實施例22記載之設計作為His庫1之抗體輕鏈可變區之基因庫使用PCR法放大。將以此方式製作之抗體重鏈可變區之基因庫與抗體輕鏈可變區之基因庫組合插入噬粒載體，構建提示由人類抗體序列構成之Fab分域之人類抗體噬菌體提示庫。構建方法參考(Methods Mol Biol.(2002)178,87-100)。當上述庫之構建時，使用連結噬粒之Fab 與噬菌體pIII蛋白質之連結子部分、及在幫手噬菌體pIII蛋白質基因之N2分域與CT分域之間插入有胰蛋白酶切斷序列之噬菌體提示庫之序列。確認從導入有抗體基因庫之大腸菌單離之抗體基因部分之序列，獲得132個選殖體之序列資訊。設計之胺基酸分布、確認之序列中之胺基酸之分布，如圖58所示。構建含有與設計之胺基酸分布對應之多樣序列之庫。
(參考實施例24)以pH依存性地結合於IL-6R之抗體之取得 (24-1)利用珠淘選由庫取得pH依存性的結合於抗原之抗體片段
從構建之His庫1之最初之選拔，係僅濃縮具備對於抗原(IL-6R)之結合能力之抗體片段以實施。
由保持以上述方式構建之噬菌體提示用噬粒之大腸菌產生噬菌體。藉由對於進行噬菌體產生之大腸菌之培養液添加2.5 M NaCl/10%PEG，使沉澱的噬菌體的集團以TBS稀釋，藉此獲得噬菌體庫液。其次，對於噬菌體庫液添加BSA及CaCl2，使終濃度成為4%BSA及1.2mM鈣離子濃度。淘選方法，係參照一般方法即使用固定化於磁性珠之抗原的淘選方法(J.Immunol.Methods.(2008)332(1-2),2-9、J.Immunol.Methods.(2001)247(1-2),191-203、Biotechnol.Prog.(2002)18(2)212-20、Mol.Cell Proteomics(2003)2(2),61-9)。磁性珠可使用NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或Streptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)。
具體而言，於製備的噬菌體庫液添加250 pmol之生物素標記抗原，藉此使該噬菌體庫液於室溫接觸抗原60分鐘。添加以BSA阻斷的磁性珠，將抗原與噬菌體之複合體於室溫結合於磁性珠15分鐘。將珠以1.2 mM CaCl2/TBST(含1.2 mM CaCl2、0.1% Tween20之TBS)1 mL洗滌3次後，之後，再以1ml的1.2 mM CaCl2/TBS(pH7.6)洗滌2次。將添加有0.5 mL之1 mg/mL之胰蛋白酶之珠於室溫懸浮15分鐘mL的後，立即使用磁座分離珠，將噬菌體溶液回收。將回收的噬菌體溶，添加到處於對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10 mL之大腸菌株ER2738。於37℃緩慢攪拌，培養上述大腸菌1小時，藉此使噬菌體感染大腸菌。將經感染之大腸菌，接種到225 mm x 225 mm的板。其次，從經接種之大腸菌之培養液回收噬菌體，以製備噬菌體庫液。
第2次後之淘選，係以抗原結合能力或pH依存性結合能力為指標，實施噬菌體之濃縮。具體而言，係於製備的噬菌體庫液添加40 pmol之生物素標記抗原，藉此使噬菌體庫於室溫與抗原接觸60分鐘。添加經BSA阻斷的磁性珠，使抗原與噬菌體之複合體於室溫結合於磁性珠15分鐘。珠以1 mL之1.2 mM CaCl2/TBST與1.2 mM CaCl2/TBS洗滌數次。之後，於以抗原結合能意為指標進行濃縮時，將添加有0.5mL之1 mg/mL胰蛋白酶的珠於室溫懸浮15分鐘後，立即使用磁座分離珠，並回收噬菌體溶液。於以pH 依存性抗原結合能力作為指標濃縮的情形，將加有0.1mL50mM MES/1.2mM CaCl2/150mM NaCl(pH5.5)之珠於室溫懸浮後，立刻以磁座分離珠，於回收的噬菌體溶液加入100mg/mL的胰蛋白酶5μL，將未提示Fab之噬菌體之pIII蛋白質(來自幫手噬菌體之pIII蛋白質)切斷，使未提示Fab之噬菌體喪失對大腸菌之感染能力。將回收之噬菌體，添加到處於對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10 mL之大腸菌株ER2738。於37℃緩慢攪拌進行1小時上述大腸菌之攪拌培養，使噬菌體感染大腸菌。將感染的大腸菌接種在225 mm x 225 mm之板。其次，從接種的大腸菌的培養液回收噬菌體，藉此回收噬菌體庫液。以抗原結合能力或pH依存性結合能力為指標之淘選，重覆2次。
(24-2)利用噬菌體ELISA之評價
從依上述方法獲得之大腸菌單一菌落，依常法(Methods Mol Biol.2002；178：133-145.)回收含噬菌體之培養上清。
將已添加BSA、CaCl2使終濃度為終濃度4%BSA及鈣離子濃度1.2 mM之含噬菌體之培養上清依以下程序供ELISA。將StreptaWell 96微滴定板(Roche)以含生物素標記抗原之PBS 100μL塗覆一晚。以PBST(含0.1%Tween20之PBS)洗滌該板之各井以去除抗原後，將該井以4% BSA-TBS 250μL阻斷1小時以上。去除4% BSA-TBS，於已去除4% BSA-TBS之各井添加製備的培養上清，將該板於37℃靜置1小時，使提示噬菌體之抗體結合於在各井存在 的抗原。於以1.2 mM CaCl2/TBST洗滌之各井添加1.2 mM CaCl2/TBS(pH7.6)或1.2 mM CaCl2/TBS(pH5.5)，將該板於37℃靜置30分鐘並溫育。以1.2 mM CaCl2/TBST洗滌後，將以4% BSA及離子化鈣濃度1.2 mM之TBS稀釋成的HRP結合抗M13抗體(Amersham Parmacia Biotech)添加於各井的板溫育1小時。以1.2 mM CaCl2/TBST洗滌後，將添加有TMB single solution(ZYMED)之各井中之溶液之發色反應藉由硫酸之添加使反應停止後，測定450 nm之吸光度以測定該發色。
以抗原結合能力作為指標進行濃縮之情形，針對已實施淘選2次者實施噬菌體ELISA，結果成為抗原專一性的ELISA陽性者在96個選殖體中有17個選殖體，所以解析經淘選3次者。另一方面，於以pH依存性抗原結合能力作為指標進行濃縮之情形，針對經淘選2次者實施噬菌體ELISA，成為ELISA陽性者在94個選殖體中有70個選殖體，所以解析經淘選2次者。
對已實施上述噬菌體ELISA之選殖體，解析使用專一性引子放大之基因之鹼基序列。
噬菌體ELISA及序列解析之結果如以下之表52所示。
依同樣之方法，從未經改變之人類抗體噬菌體提示庫取得具有pH依存性抗原結合能力之抗體。以抗原結合能作為指標進行濃縮之情形，在88個選殖體評價中取得13種pH依存性結合抗體。又，以pH依存性抗原結合能力作為指標進行濃縮之情形，在83個選殖體評價中取得27種pH依存性結合抗體。
由以上結果，比起未經改變之人類抗體噬菌體提示庫，確認從His庫1獲得之具有pH依存性抗原結合能力之選殖體之多樣性較多。
(24-3)抗體之表現與精製
將噬菌體ELISA之結果判斷為具有對於pH依存性抗原之結合能力之選殖體，導入動物細胞表現用質體。抗體之表現係使用以下方法實施。將人類胎兒腎細胞來源FreeStyle 293-F株(Invitrogen)懸浮於FreeStyle 293 Expression Medium培養基(Invitrogen)，以1.33 x 106細胞/mL之細胞密度對於6井板之各井各接種3 mL。製備之質體，以脂轉染法導入細胞。於CO2培養箱(37度、8%CO2、90 rpm)中培養4日。使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)，以該技術領域之人士公知之方法，從上述獲得之培養上清精製抗體。使用分光光度計測定經精製之抗體溶液於280 nm之吸光度。藉由使用PACE法計算之吸光係數，從得到之測定值計算抗體濃度 (Protein Science(1995)4,2411-2423)。
(24-4)取得之抗體對人類IL-6受體之pH依存性結合能力之評價
為了判斷(24-3)取得之抗體6RpH#01(重鏈序列編號：117、輕鏈序列編號：118)、及6RpH#02(重鏈序列編號：119)、輕鏈序列編號：120)、及6RpH#03(重鏈序列編號：121)、輕鏈序列編號：122)對人類IL-6受體之結合活性是否為pH依存性，將該等抗體與人類IL-6受體之抗原抗體反應之動力理論解析使用Biacore T100(GE Healthcare)進行。就對於人類IL-6受體無pH依存性之結合活性之對照抗體，使用tocilizumab(重鏈序列編號：60)、輕鏈序列編號：61)。作為中性域pH及酸性域pH之條件，各於pH7.4及pH6.0之溶液中進行抗原抗體反應之交互作用解析。在以胺偶聯法適量固定protein A/G(Invitrogen)之感測晶片CM5(GE Healthcare)上，使目的抗體被捕捉約300RU。運行緩衝液使用20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05%(w/v)Tween20、1.2 mM CaCl2(pH7.4)或20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05%(w/v)Tween20、1.2mM CaCl2(pH6.0)之2種緩衝液。人類IL-6受體之稀釋也使用各自的緩衝液。測定均在37℃實施。
當進行使用對照抗體tocilizumab抗體、6RpH#01抗體及6RpH#02抗體及6RpH#03抗體之抗原抗體反應之交互作用之解析，將IL-6受體之稀釋液與為空白之運行緩衝液以流速5μL/min注入3分鐘，使在感應晶片上捕捉的 tocilizumab抗體、6RpH#01抗體及6RpH#02抗體及6RpH#03抗體與IL-6受體交互作用。之後，以流速30μL/min將10 mM Glycine-HCl(pH1.5)以流速30μL/min注入30秒，使感應晶片再生。
依前述方法測得之於pH7.4之感測圖如圖59所示。又依同樣方法取得之在pH6.0之條件下之感測圖如圖60所示。
從前述結果，6RpH#01抗體、6RpH#02抗體及6RpH#03抗體，藉由使在緩衝液中之pH從pH7.4改為pH6.0，觀察到對IL6受體之結合能力大幅減少。
(參考實施例25)人類FcγR之製備方法及改變抗體與人類FcγR之交互作用解析方法
人類FcγR之細胞外分域依以下之方法製備。首先將FcγR之細胞外分域之基因依該技術領域中具有通常知識者公知之方法合成。此時，依作為各FcγR之序列登載於NCBI之資訊製作該基因。具體而言，FcγRI依據NCBI之存取編號NM_000566(版本編號NM_000566.3)之序列、FcγRIIa依NCBI之存取編號NM_001136219(版本編號NM_001136219.1)之序列、FcγRIIb依NCBI之存取編號NM_004001(版本編號NM_004001.3)之序列、FcγRIIIa依NCBI之存取編號NM_001127593(版本編號NM_001127593.1)之序列、FcγRIIIb依NCBI之存取編號NM_000570(版本編號NM_000570.3)之序列，在其C末端附加His標籤而製作。又，FcγRIIa、FcγRIIIa、FcγRIIIb已知存在多型， FcγRIIa之多型部位參考Warmerdam等人(J.Exp.Med.(1990)172,19-25)、FcγRIIIa之多型部位參考Wu等人(J.Clin.Invest.(1997)100(5),1059-1070)、FcγRIIIb之多型部位參考Ory等人(J.Clin.Invest.(1989)84,1688-1691)製作。
製作獲得之基因片段插入於動物細胞表現載體之表現載體。將製作之表現載體對於來自人類胎腎癌細胞之FreeStyle293細胞(Invitrogen公司)過渡性導入，表現目的蛋白質。又，結晶構造解析用使用之FcγRIIb，係藉由於終濃度10μg/mL之Kifunesine存在下使目的蛋白質表現，而成為對FcγRIIb附加之糖鏈為高甘露聚糖型。將從上述過渡性導入之細胞之培養液獲得之培養上清通過0.22μm濾器而得之製備液，原則依其次4步驟精製。第1步驟為陽離子交換管柱層析(SP Sepharose FF)、第2步驟為對His標籤之親和性管柱層析(HisTrap HP)、第3步驟為凝膠過濾管柱層析(Superdex200)、第4步驟為無菌過濾精製。惟，當FcγRI精製時，第1步驟係用使用Q sepharose FF之陰離子交換管柱層析。經精製之蛋白質於280 nm之吸光度使用分光光度計測定，使用從獲得之測定值以PACE等方法計算之吸光係數，計算精製蛋白質之濃度(Protein Science(1995)4,2411-2423)。
各改變抗體與上述中製備之Fcγ受體間之交互作用，使用Biacore T100(GEhealthcare)、Biacore T200(GEhealthcare)、Biacore A100、Biacore 4000解析。 運行緩衝液中，使用HBS-EP+(GEhealthcare)之測定之溫度設為25℃。使用在Series S Sensor Chip CM5(GEhealthcare)或Series S sensor Chip CM4(GEhealthcare)以胺偶聯法固定有抗原胜肽、ProteinA(Thermo Scientific)、Protein A/G(Thermo Scientific)、Protein L(ACTIGEN或BioVision)之晶片、或使預先生物素化之抗原胜肽與Series S Sensor Chip SA(certified)(GEhealthcare)交互作用並固定該胜肽之晶片。
使該等之感應晶片捕捉目的抗體，使與以運行緩衝液稀釋之Fcγ受體交互作用，測定對抗體之結合量，並將該測定值在抗體間比較。惟，Fcγ受體之結合量依存於捕捉之抗體之量，故比較Fcγ受體之結合量除以各抗體之捕捉量之校正值。又，使10 mM glycine-HCl、pH1.5反應，將捕捉到感應晶片之抗體洗滌，將感應晶片再生並反複使用。
又，各改變抗體對FcγR之KD值依以下之方法解析動力理論。首先，使上述感應晶片捕捉目的抗體，使與以運行緩衝液稀釋之Fcγ受體交互作用，從對於獲得之感測圖以Biacore Evaluation Software將測定結果以1：1 Langmuir binding model進行global fitting而計算之結合速度常數ka(L/mol/s)、及解離速度常數kd(1/s)之值，計算解離常數KD(mol/L)。
又，各改變抗體與FcγR之交互作用微弱且判斷無法以上述動力理論解析正確解析之情形，利用Biacore T100 Software Handbook BRI006-48 Edition AE記載之以下之1：1結合模型式，計算KD。
以1：1 binding model交互作用之分子在Biacore上之舉動，可依以下式4表達。
[式4]Req=C˙Rmax/(KD+C)+RI
Req：對分析物濃度為穩定狀態結合水平
C：濃度
RI：於試樣中之容積折射率之貢獻
Rmax：分析物之表面結合能力
若將該式變形，KD可如以下式2表達。
[式2]KD=C˙Rmax/(Req-RI)-C
於該式代入Rmax、RI、C之值可計算KD。RI、及C係從測定結果之感測圖、測定條件求得。Rmax依以下方法計算。以上述1：1 Langmuir binding model進行global fitting時獲得之在與該測定次同時評價之作為比較對象使用之交互作用足夠強之抗體之Rmax之值除以成為比較對象之抗體在感應晶片之捕捉量，乘以待評價之改變抗體之捕捉量而獲得之值，當作Rmax。
(參考實施例26)mFcγR之製備方法
小鼠之FcγR之細胞外分域依以下方法製備。首先將 FcγR之細胞外分域之基因依該技術領域中具有通常知識者公知之方法合成。此時，作為各FcγR之序列依登載於NCBI之資訊製作該基因。具體而言，mFcγRI依據NCBI Reference Sequence：NP_034316.1、mFcγRII依據NCBI Reference Sequence：NP_034317.1、mFcγRIII依據NCBI Reference Sequence：NP_034318.2、mFcγRIV依據NCBI Reference Sequence：NP_653142.2之序列製作，並在其C末端附加His標籤製作。
將從上述過渡性導入之細胞之培養液獲得之培養上清通過0.22μm濾器而得之製備液，原則依其次4步驟精製。第1步驟為陽離子交換管柱層析(SP Sepharose FF)、第2步驟為對His標籤之親和性管柱層析(HisTrap HP)、第3步驟為凝膠過濾管柱層析(Superdex200)、第4步驟為無菌過濾精製。惟，當FcγRI精製時，第1步驟係用使用Q sepharose FF之陰離子交換管柱層析。經精製之蛋白質於280 nm之吸光度使用分光光度計測定，使用從獲得之測定值以PACE等方法計算之吸光係數，計算精製蛋白質之濃度(Protein Science(1995)4,2411-2423)。
製作獲得之基因片段插入於動物細胞表現載體之表現載體。將製作之表現載體對於來自人類胎腎癌細胞之FreeStyle293細胞(Invitrogen公司)過渡性導入，表現目的蛋白質。將從上述過渡性導入之細胞之培養液獲得之培養上清通過0.22μm濾器而得之製備液，原則依其次4步驟精製。第1步驟為離子交換管柱層析、第2步驟為對His 標籤之親和性管柱層析(HisTrap HP)、第3步驟為凝膠過濾管柱層析(Superdex200)、第4步驟為無菌過濾精製。惟，當FcγRI精製時，第1步驟之離子交換管柱層析，在mFcγRI精製使用Q Sepharose HP，FcγRII及mFcγRIV精製時使用SP Sepharose FF，FcγRIII精製時使用Sepharose HP。又，第3步驟以後溶劑使用D-PBS(-)，但mFcγRIII精製時同溶劑使用含0.1M Arginine之D-PBS(-)。經精製之蛋白質於280 nm之吸光度使用分光光度計測定，使用從獲得之測定值以PACE等方法計算之吸光係數，計算精製蛋白質之濃度(Protein Science(1995)4,2411-2423)。
(參考實施例27)抑制對風溼病因子之結合之改變 (27-1)Fv4-YTE、Fv4-N434H及LS變異體對風溼病因子結合之抑制
為了抑制在pH酸性域對FcRn之結合改善之血漿中滯留性提高之Fv4-YTE、Fv4-N434H及LS變異體對風溼病因子之結合，對該等之變異體導入Q438R/S440E改變或S424N改變。具體而言，製作表53表示之新穎Fc變異體。首先評價該等之變異體在pH6.0對FcRn之結合親和性。其結果如表53所示。
【表53】
其次，評價該等之變異體(Fv4-F1166、F1167、F1172、F1173、F1170及F1171)對風溼病因子之結合。對風溼病因子之結合試驗法，在pH7.4利用電化學發光法(electrochemiluminescene、ECL)實施。本試驗法中，使用15或30位風溼病患者之血清(Protogenex)。經經50倍稀釋之血清試樣、經生物素標記之待驗抗體(1μg/mL)、經SULFO-TAG NHS酯標記之待驗抗體(1μg/mL)之混合液於室溫溫育3小時。其次，將該混合液分注到各井之經鏈黴親合素塗覆之MULTI-ARRAY 96井板(Meso Scale Discovery)在室溫溫育2小時後，將各井洗滌。將已分注Read Buffer(x4)到各井之該板安裝在SECTOR imager 2400 Reader(Meso Scale Discovery)。測定各井之化學發光。
其結果如圖61所示。比起對90216S及90214S提供者之血清中之風溼病因子顯示強結合活性之YTE變異體，F1166(Q438R/S440E)及F1167(S424N)變異體對風溼病因子之結合受強烈抑制。且含S424N改變之F1173及F1171變異體，均由於N434H及LS變異體使各對風溼病因子之結合受強烈抑制。但，由於Q438R/S440E改變之N434H及LS變 異體未能完全抑制對風溼病因子之結合，結合於1或2位提供者之血清中之風溼病因子。
(27-2)LS變異體對風溼病因子之結合之抑制
依表54所示製作對Fv4-LS導入了新穎的一個改變之Fc變異體。其中，在pH6.0維持FcRn結合之變異體(Fv4-F1380、F1384-F1386、F1388及F1389)對風溼病因子之結合，依實施例(27-1)記載之方法評價。其結果如圖62所示。該等變異體在提供者之血清中對風溼病因子之結合受強烈抑制。尤其，含Y436T之Fv4-F1389顯示與天然IgG1同程度之對風溼病因子之結合。
如上示，藉由將在pH酸性域之條件下對於FcRn之結合活性不下降、僅對風溼病因子之結合活性下降之改變，導入Fc區之該部位，能製作不具對風溼病因子之結合性，在pH酸性域之條件下對於人類FcRn之結合活性有增強之抗原結合分子。
如此之對風溼病因子之結合活性下降之改變，可使用 EU編號表示之248-257、305-314、342-352、380-386、388、414-421、423、425-437、439、441-444位之改變。較佳為使用EU編號表示之387、422、424、426、433、436、438、440位之改變。尤佳為使用EU編號表示之422位之Val取代為Glu或Ser之改變、424位之Ser取代為Arg之改變、433位之His取代為Asp之改變、436位之Tyr取代為Thr之改變、438位之Gln取代為Arg或Lys之改變、440位之Ser取代為Glu或Asp之改變。此等之改變，可單獨使用，也可組合多數處使用。
或為了使對風溼病因子之結合活性下降，也可導入N型糖鏈之附加序列。具體而言已知N型糖鏈附加序列有Asn-Xxx-Ser/Thr(Xxx為Pro以外的任意胺基酸)，藉由將該序列對Fc區導入使N型糖鏈附加，能利用N型糖鏈之立體障礙抑制RF之結合。附加N型糖鏈之改變，較佳為使用EU編號表示之248位之Lys取代為Asn改變、424位之Ser取代為Asn改變、436位之Tyr取代為Asn且438位之Gln取代為Thr之改變、438位之Qln取代為Asn之改變。尤佳為使用EU編號表示之424位之Ser取代為Asn之改變。
【產業利用性】
依本發明，提供使促進利用抗原結合分子將抗原攝入細胞內之方法、增強1分子之抗原結合分子能結合之抗原之數目之方法、利用其投予促進血漿中之抗原濃度之減少之方法。藉由促進利用抗原結合分子使抗原攝入細胞內，能促進利用抗原結合分子之投予使抗原之血漿中之抗原濃 度減少，且同時能改善抗原結合分子之藥物動態，可增加1分子之抗原結合分子能結合之抗原之數目增加，在體內可較通常之抗原結合分子發揮更優異的效果。
圖1顯示藉由投予比起既有的中和抗體在中性pH對Fcγ受體之結合有增強之以離子濃度依存性對於抗原結合之抗體，可溶型抗原從血漿中消失之非限定之作用機制。
圖2顯示對H54/L28-IgG1或人類IL-6受體以pH依存性地結合之Fv4-IgG1，當對於人類FcRn基因轉殖小鼠投予時在該小鼠血漿中之人類IL-6受體濃度變動。
圖3顯示對人類IL-6受體以pH依存性地結合之Fv4-IgG1、對於小鼠FcγR結合有缺損之Fv4-IgG1之變異體Fv4-IgG1-F760、對於小鼠FcγR結合為有增強之Fv4-IgG1之變異體Fv4-IgG1-F1022、或Fv4-IgG1之低岩藻糖型抗體Fv4-IgG1-Fuc，當對於人類FcRn基因轉殖小鼠投予時在該小鼠血漿中之人類IL-6受體濃度變動。
圖4顯示Fv4-IgG1、Fv4-IgG1-F1022、及為Fv4-IgG1-F1022之變異體且含有在pH酸性域對於FcRn之結合提高之Fv4-IgG1-F1093作為重鏈之抗原結合分子，當對於人類FcRn基因轉殖小鼠投予時在該小鼠血漿中之人類IL-6受體濃度變動。
圖5顯示Fv4-IgG1、Fv4-IgG1-F1022、及為Fv4-IgG1-F1022之變異體且含在pH酸性域對於FcRn之結合提高之Fv4-IgG1-F1093作為重鏈之抗原結合分子，當對 於人類FcRn基因轉殖小鼠投予時在該小鼠血漿中之被投予之抗原結合分子之濃度變動。
圖6顯示Fv4-IgG1、對於小鼠FcγR結合有增強之(尤其對小鼠FcγRIIb、對小鼠FcγRIII之結合有增強)Fv4-IgG1之變異體Fv4-IgG1-F1087、及對於小鼠FcγR結合有增強之(尤其對小鼠FcγRI、小鼠FcγRIV之結合有增強)Fv4-IgG1之變異體Fv4-IgG1-F1182，當對於人類FcRn基因轉殖小鼠投予時在該小鼠血漿中之人類IL-6受體濃度變動。
圖7顯示Fv4-IgG1、Fv4-IgG1-F1087、及在pH酸性域對於FcRn之結合提高Fv4-IgG1-F1087之變異體Fv4-IgG1-F1180、Fv4-IgG1-F1412，當對於人類FcRn基因轉殖小鼠投予時在該小鼠血漿中之被投予之抗原結合分子之濃度變動。
圖8顯示Fv4-IgG1、Fv4-IgG1-F1182、及在pH酸性域對於FcRn之結合提高Fv4-IgG1-F1182之變異體Fv4-IgG1-F1181，當對於人類FcRn基因轉殖小鼠投予時在該小鼠血漿中之被投予之抗原結合分子之濃度變動。
圖9顯示Fv4-IgG1、Fv4-IgG1-F1087、及在pH酸性域對於FcRn之結合提高Fv4-IgG1-F1087之變異體Fv4-IgG1-F1180、Fv4-IgG1-F1412，當對於人類FcRn基因轉殖小鼠投予時在該小鼠血漿中之人類IL-6受體濃度變動。
圖10顯示Fv4-IgG1、Fv4-IgG1-F1182、及在pH酸性 域對於FcRn之結合提高Fv4-IgG1-F1182之變異體Fv4-IgG1-F1181，當對於人類FcRn基因轉殖小鼠投予時在該小鼠血漿中之人類IL-6受體濃度變動。
圖11顯示Fv4-IgG1、Fv4-IgG1-F1782或Fv4-IgG1-F1087當對於人類FcRn基因轉殖小鼠投予時，在該小鼠血漿中之Fv4-IgG1、Fv4-IgG1-F1782或Fv4-IgG1-F1087之濃度變動。
圖12顯示Fv4-IgG1、Fv4-IgG1-F1782或Fv4-IgG1-F1087當對於人類FcRn基因轉殖小鼠投予時，該小鼠血漿中之可溶型人類IL-6受體濃度變動之結果。
圖13顯示Fv4-mIgG1、對小鼠FcγRIIb、對小鼠FcγRIII之結合有增強之Fv4-mIgGI之變異體Fv4-mIgG1-mF44、及對小鼠FcγRIIb、對小鼠FcγRIII之結合有增強之Fv4-mIgG1之變異體Fv4-mIgG1-mF46，當對正常小鼠投予時在該小鼠血漿中之人類IL-6受體濃度變動。
圖14顯示Fv4-mIgG1、對小鼠FcγRIIb、對小鼠FcγRIII之結合有增強之Fv4-mIgG1之變異體Fv4-mIgG1-mF44、及對小鼠FcγRIIb、對小鼠FcγRIII之結合有增強之Fv4-mIgG1之變異體Fv4-mIgG1-mF46，當對FcγRIII缺損小鼠投予時在該小鼠血漿中之人類IL-6受體濃度變動。
圖15顯示Fv4-mIgG1、對小鼠FcγRIIb、對小鼠FcγRIII之結合有增強之Fv4-mIgG1之變異體 Fv4-mIgG1-mF44、及對小鼠FcγRIIb、對小鼠FcγRIII之結合有增強之Fv4-mIgG1之變異體Fv4-mIgG1-mF46，當對Fc受體γ鏈缺損小鼠投予時在該小鼠血漿中之人類IL-6受體濃度變動。
圖16顯示Fv4-mIgG1、對小鼠FcγRIIb、對小鼠FcγRIII之結合有增強之Fv4-mIgG1之變異體Fv4-mIgG1-mF44、及對小鼠FcγRIIb、對小鼠FcγRIII之結合有增強之Fv4-mIgG1之變異體Fv4-mIgG1-mF46，當對FcγRIIb缺損小鼠投予時在該小鼠血漿中之人類IL-6受體濃度變動。
圖17顯示使用具有FcγRIIa之多型(R/H)之提供者來源之血小板之血小板凝集試驗法中，由於omalizumab-G1d-v3/IgE免疫複合體所得之血小板凝集能力之評價結果。
圖18顯示使用具有FcγRIIa之多型(H/H)之提供者來源之血小板之血小板凝集試驗法中，由於omalizumab-G1d-v3/IgE免疫複合體所得之血小板凝集能力之評價結果。
圖19顯示評價洗淨血小板之膜表面之CD62p表現之結果。以黑色塗滿的圖係代表與PBS反應後加入ADP並刺激之情形之結果，圖中未塗滿者代表與免疫複合體反應後以ADP刺激之情形之結果。
圖20顯示評價洗淨血小板之膜表面之活性型細胞黏合素表現結果。以黑色塗滿的圖代表與PBS反應後加入ADP 並刺激之情形之結果，圖中未塗滿者代表與免疫複合體反應後以ADP刺激之情形之結果。
圖21顯示使用有FcγRIIa之多型(R/H)之提供者來源之血小板之血小板凝集試驗法，由omalizumab-G1d-v3/IgE免疫複合體及omalizumab-BP230/IgE免疫複合體所得之血小板凝集能力之評價結果。
圖22顯示評價洗淨血小板之膜表面之CD62p表現之結果。以灰色塗滿的圖係代表與PBS反應後加入ADP並刺激之情形之結果，實線表示與omalizumab-G1d-v3/IgE免疫複合體、虛線表示與omalizumab-BP230/IgE免疫複合體反應後以ADP刺激之情形之結果。
圖23顯示評價洗淨血小板之膜表面之活性型細胞黏合素表現之結果。以灰色塗滿的圖係代表與PBS反應後加入ADP並刺激之情形之結果，實線表示與omalizumab-G1d-v3/IgE免疫複合體、虛線表示與omalizumab-BP230/IgE免疫複合體反應後以ADP刺激之情形之結果。
圖24之橫軸代表各PD變異體對於FcγRIIb之相對的結合活性之值、縱軸代表各PD變異體對於FcγRIIa R型之相對的結合活性之值。各PD變異體對各FcγR之結合量之值除以作為對照之改變導入前之抗體IL6R-F652/IL6R-L(IL6R-F652為以序列編號：142規定之含有EU編號表示之238位之Pro取代為Asp之改變Fc之 抗體重鏈)對各FcγR之結合量之值再乘以100倍後之值，作為各PD變異體對各FcγR之相對的結合活性之值。圖中之F652的圖線代表IL6R-F652/IL6R-L之值。
圖25中，縱軸表示對不具P238D改變之GpH7-B3(序列編號：159)/GpL16-k0(序列編號：160)導入各改變之變異體對於FcγRIIb之相對的結合活性之值，橫軸表示對有P238D改變之IL6R-F652(序列編號：142)/IL6R-L導入各改變之變異體對於FcγRIIb之相對的結合活性之值。又，各變異體對FcγRIIb之結合量之值除以改變導入前之抗體對FcγRIIb之結合量之值再乘以100倍之值，作為相對的結合活性之值。在此，導入於不具P238D之GpH7-B3/GpL16-k0之情形，與導入到有P238D之IL6R-F652/IL6R-L之情形，均發揮FcγRIIb之結合增強效果之改變係包括在區A，導入到無P238D之GpH7-B3/GpL16-k0的情形發揮對FcγRIIb之結合增強效果且導入到有P238D之IL6R-F652/IL6R-L的情形未發揮對FcγRIIb之結合增強效果之改變，包括在區B。
圖26顯示Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區複合體之結晶構造。
圖27顯示將Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區複合體之結晶構造與Fc(WT)/FcγRIIb細胞外區複合體之模型構造以依對FcγRIIb細胞外區及對Fc CH2分域A之Cα原子間距離的最小平方法重合之圖。
圖28顯示針對Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區複合 體之結晶構造與Fc(WT)/FcγRIIb細胞外區複合體之模型構造，將Fc CH2分域A及Fc CH2分域B單獨彼此利用依據Cα原子間距離之最小平方法重合，並比較P238D附近之詳細構造之圖。
圖29顯示在Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區複合體之結晶構造中，Fc CH2分域A之EU編號表示之237位之Gly之主鏈與FcγRIIb之160位之Tyr之間觀察到氫鍵之圖。
圖30顯示Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區複合體之結晶構造中，Fc CH2分域B之EU編號表示之270位之Asp與FcγRIIb之131號之Arg之間認為有靜電的交互作用之圖。
圖31中，橫軸為各2B變異體對於FcγRIIb之相對的結合活性之值、縱軸為各2B變異體對FcγRIIaR型之相對的結合活性之值。各2B變異體對各FcγR之結合量之值除以作為對照之改變導入前之抗體(EU編號表示之238位之Pro取代為Asp之改變Fc)對各FcγR之結合量之值再乘以100倍之值，當作各2B變異體對各FcγR之相對的結合活性之值。
圖32顯示在Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區複合體之結晶構造中，FcA鏈之EU編號表示之233位之Glu與在FcγRIIb細胞外區之周邊殘基。
圖33顯示在Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區複合體之結晶構造，FcA鏈之EU編號表示之330位之Ala與在 FcγRIIb細胞外區之周邊殘基。
圖34顯示將Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區複合體及Fc(WT)/FcγRIIIa細胞外區複合體之結晶構造，以對Fc鏈B之依Cα原子間距離之最小平方法重合，Fc鏈B之EU編號表示之271位之Pro之構造。
圖35顯示由X射線結晶構造解析決定之Fc(P208)/FcγRIIb細胞外區複合體之圖。針對Fc部分CH2分域、CH3分域，朝左側為分域A、右側為分域B。
圖36顯示將由X射線結晶構造解析決定之Fc(P208)/FcγRIIb細胞外區複合體之構造與Fc(WT)/FcγRIIa細胞外區複合體之構造(PDB code：3RY6)，利用在Fc部分CH2分域A中依據Cα原子間距離之最小平方法重合並比較者。圖中粗線為Fc(P208)/FcγRIIb細胞外區複合體，細線為Fc(WT)/FcγRIIa細胞外區複合體之構造。又，Fc(WT)/FcγRIIa細胞外區複合體之構造中，僅畫出Fc部分CH2分域A。
圖37顯示在Fc(P208)/FcγRIIb細胞外區複合體之X射線結晶構造中，FcγRIIb之160號Tyr與主鏈部分形成氫鍵之Fc部分CH2分域A之EU編號表示之237位之Asp附近之構造之細節。
圖38顯示在Fc(P208)/FcγRIIb細胞外區複合體之X射線結晶構造中，FcγRIIb之160號之Tyr與主鏈部分形成氫鍵之Fc部分CH2分域A之EU編號表示之237位之Asp側鏈周圍之胺基酸殘基之構造。
圖39顯示將在實施例10所示之Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區複合體之X射線結晶構造與Fc(P208)/FcγRIIb細胞外區複合體之X射線結晶構造，利用在Fc部分CH2分域B之依據Cα原子間距離之最小平方法重合，並比較EU編號表示之266位至271位之環圈周邊之圖。本環圈中，係將Fc(P208)與Fc(P238D)比較，EU編號表示之268位帶有H268D之改變，EU編號表示之271位帶有P271G之改變。
圖40顯示在Fc(P208)/FcγRIIb細胞外區複合體之X射線結晶構造中，Fc部分CH2分域B之Ser239周邊之構造，以及作為依X射線結晶構造解析獲得之2Fo-Fc係數之電子密度。
圖41顯示將由X射線結晶構造解析決定之Fc(P208)/FcγRIIaR細胞外區複合體之立體構造與Fc(P208)/FcγRIIb細胞外區複合體之立體構造，利用依據Cα原子間距離之最小平方法重合並比較之圖。
圖42顯示將Fc(P208)/FcγRIIaR細胞外區複合體之X射線結晶構造與Fc(P208)/FcγRIIb細胞外區複合體之X射線結晶構造，在Fc部分CH2分域A之EU編號表示之237位之Asp附近以及作為X射線結晶構造解析獲得之2Fo-Fc係數之電子密度一起比較之圖。
圖43顯示將Fc(P208)/FcγRIIaR細胞外區複合體之X射線結晶構造與Fc(P208)/FcγRIIb細胞外區複合體之X射線結晶構造，在Fc部分CH2分域B之EU編號表示之 237位之Asp附近與作為由X射線結晶構造解析獲得之2Fo-Fc係數之電子密度一起比較。
圖44顯示比較G1d與G4d之不變區之序列。圖中、粗框包圍的胺基酸代表在G1d與G4d為相異之胺基酸殘基之部位。
圖45顯示在正常小鼠，GA2-IgG1及GA2-F1087之血漿中抗體濃度變動。
圖46顯示在投予GA2-IgG1及GA2-F1087之正常小鼠中，血漿中hIgA濃度變動。
圖47顯示C57BL/6J小鼠中，278-IgG1及278-F1087之血漿中抗體濃度變動。
圖48顯示在投予278-IgG1及278-F1087之C57BL/6J小鼠中，血漿中hIgE(Asp6)濃度變動。
圖49顯示X射線結晶構造解析決定的6RL#9抗體之Fab片段之重鏈CDR3之構造。(i)代表在鈣離子存在之結晶化條件獲得之結晶構造之重鏈CDR3。(ii)代表在鈣離子不存在之結晶化條件獲得之結晶構造之重鏈CDR3。
圖50顯示投予H54/L28-IgG1抗體、FH4-IgG1抗體、及6RL#9-IgG1抗體之正常小鼠血漿中之各抗體濃度之變動。
圖51顯示在投予H54/L28-IgG1抗體、FH4-IgG1抗體、及6RL#9-IgG1抗體之正常小鼠血漿中之可溶型人類IL-6受體(hsIL-6R)之濃度變動。
圖52顯示含人類Vk5-2序列之抗體、及含人類Vk5-2 序列中之糖鏈附加序列經改變之h Vk5-2_L65序列之抗體之離子交換層析圖。實線表示含人類Vk5-2序列之抗體(重鏈：CIM_H、序列編號：67及輕鏈：hVk5-2、序列編號：4)之層析圖、虛線表示帶有hVk5-2-L65序列之抗體(重鏈：CIM_H(序列編號：67)、輕鏈：hVk5-2_L65(序列編號：70))之層析圖。
圖53A顯示將含LfVk1_Ca序列之抗體(重鏈：GC_H、序列編號：51及輕鏈：LfVk1_Ca、序列編號：83)、及含LfVk1_Ca序列中之Asp(D)殘基改變為Ala(A)殘基之序列之抗體在5℃保存後(實線)或50℃保存後(虛線)之離子交換層析圖。以各於5℃保存後之離子交換層析圖中最高峰部當作主峰，於主峰將y軸常態化之圖。顯示含有作為輕鏈之LfVk1_Ca(序列編號：83)之抗體之層析圖。
圖53B顯示含有作為輕鏈之LfVk1_Cal(序列編號：85)之抗體之層析圖。
圖53C顯示含有作為輕鏈之LfVk1_Ca2(序列編號：86)之抗體之層析圖。
圖53D顯示含有作為輕鏈之LfVk1_Ca3(序列編號：87)之抗體之層析圖。
圖54A顯示含有LfVk1_Ca序列之抗體(重鏈：GC_H、序列編號：51及輕鏈：LfVk1_Ca、序列編號：83)、及含有LfVk1_Ca序列中之30位(Kabat編號)之Asp(D)殘基改變為Ser(S)殘基之LfVk1_Ca6序列(重鏈：GC_H、序列編號：51及輕鏈：LfVk1_Ca6、序列編號：88)之抗體在5℃ 保存後(實線)或50℃保存後(虛線)之離子交換層析圖。各表示於5℃保存後之離子交換層析圖中最高峰部作為主峰，在主峰以y軸常態化之圖。顯示含有作為輕鏈之LfVk1_Ca(序列編號：83)之抗體之層析圖。
圖54B顯示含有作為輕鏈之LfVk1_Ca6(序列編號：88)之抗體之層析圖。
圖55顯示從導入有以Ca依存性結合於抗原之抗體基因庫之大腸菌單離之290個選殖體之序列資訊胺基酸之分布(表示為Library)與設計之胺基酸分布(表示為Design)間之關係。橫軸表示Kabat編號表示之胺基酸之部位。縱軸表示胺基酸之分布之比率。
圖56顯示在高鈣離子濃度之條件(1.2 mM)下之抗IL-6R抗體(tocilizumab)、6RC1IgG_010抗體、6RC1IgG_012抗體及6RC1IgG_019抗體之感測圖。橫軸表示時間、縱軸表示RU值。
圖57顯示在低鈣離子濃度之條件(3μM)下之抗IL-6R抗體(tocilizumab)、6RC1IgG_010抗體、6RC1IgG_012抗體及6RC1IgG_019抗體之感測圖。橫軸表示時間、縱軸表示RU值。
圖58顯示從導入有以pH依存性結合於抗原之抗體基因庫之大腸菌單離之132個選殖體之序列資訊胺基酸之分布(表示為Library)與設計之胺基酸分布(表示為Design)間之關係。橫軸表示Kabat編號表示之胺基酸之部位。縱軸表示胺基酸之分布之比率。
圖59表示抗IL-6R抗體(tocilizumab)、6RpH#01抗體、6RpH#02抗體及6RpH#03抗體在pH7.4之感測圖。橫軸表示時間、縱軸表示RU值。
圖60表示抗IL-6R抗體(tocilizumab)、6RpH#01抗體、6RpH#02抗體及6RpH#03抗體在pH6.0之感測圖。橫軸表示時間、縱軸表示RU值。
圖61A表示對於天然型Fc及改變Fc，從15或30位獨立的風溼病患者單離之血清之ECL反應。圖表示對於各天然型Fc(圖61A)Fv4-YTE(圖61B)、Fv4-F1166(=YTE+Q438R/S440E)(圖61C)、Fv4-F1167(=YTE+S424N)(圖61D)、Fv4-LS(圖61E)、Fv4-F1170(=LS+Q438R/S440E)(圖61F)，Fv4-F1171(=LS+S424N)(圖61G)、Fv4-N434H(圖61H)、Fv4-F1172(=N434H+Q438R/S440E)(圖61I)、Fv4-F1173(=N434H+S424N)(圖61J)之ECL反應。
圖61B係接續圖61A。
圖61C係接續圖61B。
圖61D係接續圖61C。
圖61E係接續圖61D。
圖61F係接續圖61E。
圖61G係接續圖61F。
圖61H係接續圖61G。
圖61I係接續圖61H。
圖61J係接續圖61I。
圖62A顯示對於改變Fc，從30位獨立的風溼病患者 單離之血清之ECL反應。圖表示各表示對於Fv4-LS(圖62A)、Fv4-F1380(圖62B)、Fv4-F1384(圖62C)、Fv4-F1385(圖62D)、Fv4-F1386(圖62E)、Fv4-F1388(圖62F)及Fv4-F1389(圖62G)之ECL反應。
圖62B係接續圖62A。
圖62C係接續圖62B。
圖62D係接續圖62C。
圖62E係接續圖62D。
圖62F係接續圖62E。
圖62G係接續圖62F。
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<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 72
<210> 73
<211> 107
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 73
<210> 74
<211> 107
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 74
<210> 75
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 75
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 76
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<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
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<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 80
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 81
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<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
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<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
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<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 85
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<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
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<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
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<211> 456
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
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<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
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<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 91
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<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 92
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<211> 452
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
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<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
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<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
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<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
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<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
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<211> 450
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
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<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 101
<210> 102
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 102
<210> 103
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 103
<210> 104
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
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<210> 105
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 105
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 106
<210> 107
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 107
<210> 108
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 108
<210> 109
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
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<211> 453
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
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<210> 112
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
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<211> 451
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
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<210> 114
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 114
<210> 115
<211> 452
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 115
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 116
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<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 117
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
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<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
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<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
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<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
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<210> 122
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 122
<210> 123
<211> 447
<212> PRT
<213> 人造sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 123
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<212> PRT
<213> 人造sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 124
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<211> 447
<212> PRT
<213> 人造sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
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<211> 447
<212> PRT
<213> 人造sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
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<212> PRT
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<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
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<211> 443
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 128
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<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 129
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<211> 443
<212> PRT
<213> 人造sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 130
<210> 131
<211> 443
<212> PRT
<213> 人造sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 131
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<211> 119
<212> PRT
<213> 人造sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 132
<210> 133
<211> 447
<212> PRT
<213> 人造sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 133
<210> 134
<211> 447
<212> PRT
<213> 人造sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 134
<210> 135
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 135
<210> 136
<211> 449
<212> PRT
<213> 人造sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 136
<210> 137
<211> 218
<212> PRT
<213> 人造sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 137
<210> 138
<211> 449
<212> PRT
<213> 人造sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 138
<210> 139
<211> 447
<212> PRT
<213> 人造sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 139
<210> 140
<211> 449
<212> PRT
<213> 人造sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 140
<210> 141
<211> 447
<212> PRT
<213> 人造sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 141
<210> 142
<211> 447
<212> PRT
<213> 人造sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 142
<210> 143
<211> 447
<212> PRT
<213> 人造sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 143
<210> 144
<211> 447
<212> PRT
<213> 人造sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 144
<210> 145
<211> 464
<212> PRT
<213> 人造sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 145
<210> 146
<211> 451
<212> PRT
<213> 人造sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 146
<210> 147
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 147
<210> 148
<211> 451
<212> PRT
<213> 人造sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 148
<210> 149
<211> 543
<212> PRT
<213> 人類
<400> 149
<210> 150
<211> 219
<212> PRT
<213> 人類
<400> 150
<210> 151
<211> 443
<212> PRT
<213> 人造sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 151
<210> 152
<211> 217
<212> PRT
<213> 人造sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 152
<210> 153
<211> 32
<212> PRT
<213> 人造sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 153
<210> 154
<211> 443
<212> PRT
<213> 人造sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 154
<210> 155
<211> 543
<212> PRT
<213> 人造Sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 155
<210> 156
<211> 443
<212> PRT
<213> 人造sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 156
<210> 157
<211> 443
<212> PRT
<213> 人造sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 157
<210> 158
<211> 545
<212> PRT
<213> 人造Sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 158
<210> 159
<211> 443
<212> PRT
<213> 人造sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 159
<210> 160
<211> 219
<212> PRT
<213> 人造sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 160
<210> 161
<211> 328
<212> PRT
<213> 人造sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 161
<210> 162
<211> 325
<212> PRT
<213> 人造sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 162
<210> 163
<211> 328
<212> PRT
<213> 人造Sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 163
<210> 164
<211> 432
<212> PRT
<213> 人造Sequence
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 164

Claims (42)

  1. 一種醫藥組成物，其係包含抗原結合分子，該抗原結合分子包含：抗原結合分域，其於pH酸性域之條件下對於人類FcRn有結合活性，且依離子濃度之條件對於抗原之結合活性會變化；及Fc γ受體結合分域，其於pH中性域之條件下對於Fc γ受體之結合活性高於結合於EU編號297位之糖鏈係含岩藻糖之糖鏈的天然型人類IgG之Fc區對於Fc γ受體之結合活性，其中在該抗原結合分域中，對於抗原在鈣離子濃度為3μM之條件下的KD與在鈣離子濃度為2mM之條件下的KD之比，即KD(Ca 3μM)/KD(Ca 2mM)之值為2以上，且對於抗原在pH5.8的條件下的KD與在pH7.4的條件下的KD之比，即KD(pH5.8)/KD(pH7.4)之值為2以上。
  2. 如申請專利範圍第1項之醫藥組成物，其中，該抗原為可溶型抗原。
  3. 如申請專利範圍第1項之醫藥組成物，其中，該抗原結合分子對於該抗原有中和活性。
  4. 如申請專利範圍第1項之醫藥組成物，其中，該Fc γ受體結合分域包含抗體之Fc區。
  5. 如申請專利範圍第4項之醫藥組成物，其中，該Fc區，在Fc區之以EU編號表示之部位當中，選自於221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237 位、238位、239位、240位、241位、243位、244位、245位、246位、247位、249位、250位、251位、254位、255位、256位、258位、260位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、339位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位及440位之群中至少1個以上之胺基酸，與天然型Fc區之對應部位之胺基酸不同。
  6. 如申請專利範圍第5項之醫藥組成物，其中，該Fc區，包含選自於Fc區之以EU編號表示之部位當中：221位之胺基酸為Lys或Tyr中之任一者、222位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中之任一者、223位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Lys中之任一者、224位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中之任一者、225位之胺基酸為Glu、Lys或Trp中之任一者、227位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、 228位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、230位之胺基酸為Ala、Glu、Gly或Tyr中之任一者、231位之胺基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中之任一者、232位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、233位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、234位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、235位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、236位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、237位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、238位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、239位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr 中之任一者、240位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、241位之胺基酸為Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中之任一者、243位之胺基酸為Leu、Glu、Leu、Gln、Arg、Trp或Tyr中之任一者、244位之胺基酸為His、245位之胺基酸為Ala、246位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、247位之胺基酸為Ala、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Thr、Val或Tyr中之任一者、249位之胺基酸為Glu、His、Gln或Tyr中之任一者、250位之胺基酸為Glu或Gln中之任一者、251位之胺基酸為Phe、254位之胺基酸為Phe、Met或Tyr中之任一者、255位之胺基酸為Glu、Leu或Tyr中之任一者、256位之胺基酸為Ala、Met或Pro中之任一者、258位之胺基酸為Asp、Glu、His、Ser或Tyr中之任一者、260位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、262位之胺基酸為Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中之任一者、263位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、264位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、 265位之胺基酸為Ala、Leu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、266位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、267位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、268位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Trp中之任一者、269位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、270位之胺基酸為Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、271位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、272位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、273位之胺基酸為Phe或Ile中之任一者、274位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、275位之胺基酸為Leu或Trp中之任一者、276位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、 Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、278位之胺基酸為Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中之任一者、279位之胺基酸為Ala、280位之胺基酸為Ala、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gln、Trp或Tyr中之任一者、281位之胺基酸為Asp、Lys、Pro或Tyr中之任一者、282位之胺基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中之任一者、283位之胺基酸為Ala、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg或Tyr中之任一者、284位之胺基酸為Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中之任一者、285位之胺基酸為Asp、Glu、Lys、Gln、Trp或Tyr中之任一者、286位之胺基酸為Glu、Gly、Pro或Tyr中之任一者、288位之胺基酸為Asn、Asp、Glu或Tyr中之任一者、290位之胺基酸為Asp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、291位之胺基酸為Asp、Glu、Gly、His、Ile、Gln或Thr中之任一者、292位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中之任一者、293位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、 294位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、295位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、296位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr或Val中之任一者、297位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、298位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、299位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中之任一者、300位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中之任一者、301位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、302位之胺基酸為Ile、303位之胺基酸為Asp、Gly或Tyr中之任一者、304位之胺基酸為Asp、His、Leu、Asn或Thr中之任一者、305位之胺基酸為Glu、Ile、Thr或Tyr中之任一者、311位之胺基酸為Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中之 任一者、313位之胺基酸為Phe、315位之胺基酸為Leu、317位之胺基酸為Glu或Gln、318位之胺基酸為His、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Tyr中之任一者、320位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、322位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、323位之胺基酸為Ile、324位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、325位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、326位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、327位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、328位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、 329位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、330位之胺基酸為Cys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、331位之胺基酸為Asp、Phe、His、Ile、Leu、Met、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、332位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、333位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Ser、Thr、Val或Tyr中之任一者、334位之胺基酸為Ala、Glu、Phe、Ile、Leu、Pro或Thr中之任一者、335位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中之任一者、336位之胺基酸為Glu、Lys或Tyr中之任一者、337位之胺基酸為Glu、His或Asn中之任一者、339位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser或Thr中之任一者、376位之胺基酸為Ala或Val中之任一者、377位之胺基酸為Gly或Lys中之任一者、378位之胺基酸為Asp、 379位之胺基酸為Asn、380位之胺基酸為Ala、Asn或Ser中之任一者、382位之胺基酸為Ala或Ile中之任一者、385位之胺基酸為Glu、392位之胺基酸為Thr、396位之胺基酸為Leu、421位之胺基酸為Lys、427位之胺基酸為Asn、428位之胺基酸為Phe或Leu中之任一者、429位之胺基酸為Met、434位之胺基酸為Trp、436位之胺基酸為Ile、及440位之胺基酸為Gly、His、Ile、Leu或Tyr中之任一者之群中至少1個以上之胺基酸。
  7. 如申請專利範圍第1項之醫藥組成物，其中，該結合於EU編號297位之糖鏈為含岩藻糖之糖鏈的天然型人類IgG的Fc區，為結合於EU編號297位之糖鏈係含岩藻糖之糖鏈的天然型人類IgG1、天然型人類IgG2、天然型人類IgG3或天然型人類IgG4中之任一者的Fc區。
  8. 如申請專利範圍第1項之醫藥組成物，其中，該人類Fc γ受體為Fc γ RIa、Fc γ RIIa(R)、Fc γ RIIa(H)、Fc γ RIIb、Fc γ RIIIa(V)、或Fc γ RIIIa(F)。
  9. 如申請專利範圍第1項之醫藥組成物，其中，該人類Fc γ受體為Fc γ RIIb。
  10. 如申請專利範圍第4項之醫藥組成物，其中，該Fc區，包含在Fc區之以EU編號表示之部位當中：238位之胺基酸為Asp、或328位之胺基酸為Glu、中至少1個以上的胺基酸。
  11. 一種以下(i)~(vi)中之任一者之方法；(i)使能結合於一分子之抗原結合分子之抗原數目增加之方法、(ii)使血漿中抗原消失之方法、(iii)改善抗原結合分子之藥物動態之方法、(iv)促進在細胞外結合於抗原結合分子之抗原在細胞內從抗原結合分子解離之方法、(v)促進未結合於抗原之狀態之抗原結合分子釋放到細胞外之方法，或(vi)減少血漿中之總抗原濃度或游離抗原濃度之方法；其係包含以下步驟：使抗原結合分子在細胞活體內或活體外接觸表現Fc γ受體之細胞，該抗原結合分子包含：抗原結合分域，其於pH酸性域之條件下對於人類FcRn有結合活性，且依離子濃度之條件對於抗原之結合活性會變化；及Fc γ受體結合分域，其於pH中性域之條件下對於Fc γ受體之結合活性高於結合於EU編號297位之糖鏈係含岩藻糖 之糖鏈的天然型人類IgG之Fc區對於Fc γ受體之結合活性，其中在該抗原結合分域中，對於抗原在鈣離子濃度為3μM之條件下的KD與在鈣離子濃度為2mM之條件下的KD之比，即KD(Ca 3μM)/KD(Ca 2mM)之值為2以上，且對於抗原在pH5.8的條件下的KD與在pH7.4的條件下的KD之比，即KD(pH5.8)/KD(pH7.4)之值為2以上。
  12. 如申請專利範圍第11項之方法，其中，該抗原為可溶型抗原。
  13. 如申請專利範圍第11項之方法，其中，該抗原結合分子，對於該抗原有中和活性。
  14. 如申請專利範圍第11項之方法，其中，該Fc γ受體結合分域包含抗體之Fc區。
  15. 如申請專利範圍第14項之方法，其中，該Fc區，在Fc區之以EU編號表示之部位當中，選自於221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、243位、244位、245位、246位、247位、249位、250位、251位、254位、255位、256位、258位、260位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304 位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、339位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位及440位之群中至少1個以上之胺基酸，與天然型Fc區之對應部位之胺基酸不同。
  16. 如申請專利範圍第15項之方法，其中，該Fc區，包含選自於Fc區之以EU編號表示之部位當中：221位之胺基酸為Lys或Tyr中之任一者、222位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中之任一者、223位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Lys中之任一者、224位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中之任一者、225位之胺基酸為Glu、Lys或Trp中之任一者、227位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、228位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、230位之胺基酸為Ala、Glu、Gly或Tyr中之任一者、231位之胺基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中之任一者、232位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、233位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、234位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、 Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、235位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、236位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、237位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、238位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、239位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、240位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、241位之胺基酸為Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中之任一者、243位之胺基酸為Leu、Glu、Leu、Gln、Arg、Trp或Tyr中之任一者、244位之胺基酸為His、245位之胺基酸為Ala、 246位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、247位之胺基酸為Ala、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Thr、Val或Tyr中之任一者、249位之胺基酸為Glu、His、Gln或Tyr中之任一者、250位之胺基酸為Glu或Gln中之任一者、251位之胺基酸為Phe、254位之胺基酸為Phe、Met或Tyr中之任一者、255位之胺基酸為Glu、Leu或Tyr中之任一者、256位之胺基酸為Ala、Met或Pro中之任一者、258位之胺基酸為Asp、Glu、His、Ser或Tyr中之任一者、260位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、262位之胺基酸為Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中之任一者、263位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、264位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、265位之胺基酸為Ala、Leu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、266位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、267位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、268位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、 Met、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Trp中之任一者、269位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、270位之胺基酸為Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、271位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、272位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、273位之胺基酸為Phe或Ile中之任一者、274位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、275位之胺基酸為Leu或Trp中之任一者、276位之胺基酸為、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、278位之胺基酸為Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中之任一者、279位之胺基酸為Ala、280位之胺基酸為Ala、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gln、Trp或Tyr中之任一者、281位之胺基酸為Asp、Lys、Pro或Tyr中之任一者、 282位之胺基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中之任一者、283位之胺基酸為Ala、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg或Tyr中之任一者、284位之胺基酸為Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中之任一者、285位之胺基酸為Asp、Glu、Lys、Gln、Trp或Tyr中之任一者、286位之胺基酸為Glu、Gly、Pro或Tyr中之任一者、288位之胺基酸為Asn、Asp、Glu或Tyr中之任一者、290位之胺基酸為Asp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、291位之胺基酸為Asp、Glu、Gly、His、Ile、Gln或Thr中之任一者、292位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中之任一者、293位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、294位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、295位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、296位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr或Val中之任一者、297位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、 Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、298位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、299位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中之任一者、300位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中之任一者、301位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、302位之胺基酸為Ile、303位之胺基酸為Asp、Gly或Tyr中之任一者、304位之胺基酸為Asp、His、Leu、Asn或Thr中之任一者、305位之胺基酸為Glu、Ile、Thr或Tyr中之任一者、311位之胺基酸為Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中之任一者、313位之胺基酸為Phe、315位之胺基酸為Leu、317位之胺基酸為Glu或Gln、318位之胺基酸為His、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Tyr中之任一者、320位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、 322位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、323位之胺基酸為Ile、324位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、325位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、326位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、327位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、328位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、329位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、330位之胺基酸為Cys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、331位之胺基酸為Asp、Phe、His、Ile、Leu、Met、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、 332位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、333位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Ser、Thr、Val或Tyr中之任一者、334位之胺基酸為Ala、Glu、Phe、Ile、Leu、Pro或Thr中之任一者、335位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中之任一者、336位之胺基酸為Glu、Lys或Tyr中之任一者、337位之胺基酸為Glu、His或Asn中之任一者、339位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser或Thr中之任一者、376位之胺基酸為Ala或Val中之任一者、377位之胺基酸為Gly或Lys中之任一者、378位之胺基酸為Asp、379位之胺基酸為Asn、380位之胺基酸為Ala、Asn或Ser中之任一者、382位之胺基酸為Ala或Ile中之任一者、385位之胺基酸為Glu、392位之胺基酸為Thr、396位之胺基酸為Leu、421位之胺基酸為Lys、427位之胺基酸為Asn、 428位之胺基酸為Phe或Leu中之任一者、429位之胺基酸為Met、434位之胺基酸為Trp、436位之胺基酸為Ile、及440位之胺基酸為Gly、His、Ile、Leu或Tyr中之任一者之群中至少1個以上的胺基酸。
  17. 如申請專利範圍第11項之方法，其中，該結合於EU編號297位之糖鏈係含岩藻糖之糖鏈之天然型人類IgG之Fc區，為結合於EU編號297位之糖鏈係含岩藻糖之糖鏈的天然型人類IgG1、天然型人類IgG2、天然型人類IgG3或天然型人類IgG4中之任一者之Fc區。
  18. 如申請專利範圍第11項之方法，其中，該人類Fc γ受體，為Fc γ RIa、Fc γ RIIa(R)、Fc γ RIIa(H)、Fc γ RIIb、Fc γ RIIIa(V)、或Fc γ RIIIa(F)。
  19. 如申請專利範圍第11項之方法，其中，該人類Fc γ受體為Fc γ RIIb。
  20. 如申請專利範圍第14項之方法，其中，該Fc區，含有Fc區之以EU編號表示之部位中：238位之胺基酸為Asp、或328位之胺基酸為Glu中之至少1個以上的胺基酸。
  21. 一種以下(i)~(vii)中之任一者之方法；(i)促進結合的抗原攝入細胞內之抗原結合分子之改變方法， (ii)使一分子抗原結合分子能結合之抗原之數目增加之方法，(iii)使抗原結合分子在血漿中之抗原消失能力增大之方法，(iv)改善抗原結合分子之藥物動態之方法，(v)促進於細胞外結合於抗原結合分子之抗原在細胞內從抗原結合分子解離之方法，(vi)促進以結合於抗原之狀態攝入細胞內的抗原結合分子以未與抗原結合之狀態釋放到細胞外之方法，或(vii)能減少血漿中之總抗原濃度或游離抗原濃度之抗原結合分子之改變方法，其係包含以下步驟：使包含於pH酸性域條件下對於人類FcRn有結合活性且依離子濃度之條件對於抗原之結合活性會變化之抗原結合分域及Fc γ受體結合分域的抗原結合分子，其Fc γ受體結合分域在pH中性域條件下對於Fc γ受體之結合活性比起結合於EU編號297位之糖鏈係含岩藻糖之糖鏈的天然型人類IgG之Fc區在pH中性域條件下對於Fc γ受體之結合活性更為增強，其中在該抗原結合分域中，對於抗原在鈣離子濃度為3μM之條件下的KD與在鈣離子濃度為2mM之條件下的KD之比，即KD(Ca 3μM)/KD(Ca 2mM)之值為2以上，且對於抗原在pH5.8的條件下的KD與在pH7.4的條件下的KD之比，即KD(pH5.8)/KD(pH7.4)之值為2以上。
  22. 如申請專利範圍第21項之方法，其中，該抗原為 可溶型抗原。
  23. 如申請專利範圍第21項之方法，其中，該抗原結合分子係對於該抗原有中和活性之抗原結合分子。
  24. 如申請專利範圍第21項之方法，其中，該Fc γ受體結合分域包含抗體之Fc區。
  25. 如申請專利範圍第24項之方法，其中，該Fc區，在Fc區之以EU編號表示之部位中，221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、243位、244位、245位、246位、247位、249位、250位、251位、254位、255位、256位、258位、260位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、339位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位及440位之群中1個以上之胺基酸，與天然型Fc區之對應部位之胺基酸不同。
  26. 如申請專利範圍第25項之方法，其中，該Fc區，含有從Fc區之以EU編號表示之部位當中：221位之胺基酸為Lys或Tyr中之任一者、222位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中之任一者、223位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Lys中之任一者、224位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中之任一者、225位之胺基酸為Glu、Lys或Trp中之任一者、227位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、228位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、230位之胺基酸為Ala、Glu、Gly或Tyr中之任一者、231位之胺基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中之任一者、232位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、233位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、234位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、235位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、236位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、 237位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、238位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、239位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、240位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、241位之胺基酸為Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中之任一者、243位之胺基酸為Leu、Glu、Leu、Gln、Arg、Trp或Tyr中之任一者、244位之胺基酸為His、245位之胺基酸為Ala、246位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、247位之胺基酸為Ala、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Thr、Val或Tyr中之任一者、249位之胺基酸為Glu、His、Gln或Tyr中之任一者、250位之胺基酸為Glu或Gln中之任一者、251位之胺基酸為Phe、254位之胺基酸為Phe、Met或Tyr中之任一者、255位之胺基酸為Glu、Leu或Tyr中之任一者、 256位之胺基酸為Ala、Met或Pro中之任一者、258位之胺基酸為Asp、Glu、His、Ser或Tyr中之任一者、260位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、262位之胺基酸為Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中之任一者、263位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、264位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、265位之胺基酸為Ala、Leu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、266位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、267位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、268位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Trp中之任一者、269位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、270位之胺基酸為Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、271位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、 272位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、273位之胺基酸為Phe或Ile中之任一者、274位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、275位之胺基酸為Leu或Trp中之任一者、276位之胺基酸為、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、278位之胺基酸為Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中之任一者、279位之胺基酸為Ala、280位之胺基酸為Ala、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gln、Trp或Tyr中之任一者、281位之胺基酸為Asp、Lys、Pro或Tyr中之任一者、282位之胺基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中之任一者、283位之胺基酸為Ala、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg或Tyr中之任一者、284位之胺基酸為Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中之任一者、285位之胺基酸為Asp、Glu、Lys、Gln、Trp或Tyr中之任一者、286位之胺基酸為Glu、Gly、Pro或Tyr中之任一者、 288位之胺基酸為Asn、Asp、Glu或Tyr中之任一者、290位之胺基酸為Asp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、291位之胺基酸為Asp、Glu、Gly、His、Ile、Gln或Thr中之任一者、292位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中之任一者、293位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、294位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、295位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、296位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr或Val中之任一者、297位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、298位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、299位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中之任一者、300位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、 Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中之任一者、301位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、302位之胺基酸為Ile、303位之胺基酸為Asp、Gly或Tyr中之任一者、304位之胺基酸為Asp、His、Leu、Asn或Thr中之任一者、305位之胺基酸為Glu、Ile、Thr或Tyr中之任一者、311位之胺基酸為Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中之任一者、313位之胺基酸為Phe、315位之胺基酸為Leu、317位之胺基酸為Glu或Gln、318位之胺基酸為His、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Tyr中之任一者、320位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、322位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、323位之胺基酸為Ile、324位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、325位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、 326位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、327位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、328位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、329位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、330位之胺基酸為Cys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、331位之胺基酸為Asp、Phe、His、Ile、Leu、Met、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、332位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、333位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Ser、Thr、Val或Tyr中之任一者、334位之胺基酸為Ala、Glu、Phe、Ile、Leu、Pro或Thr中之任一者、335位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、 Asn、Pro、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中之任一者、336位之胺基酸為Glu、Lys或Tyr中之任一者、337位之胺基酸為Glu、His或Asn中之任一者、339位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser或Thr中之任一者、376位之胺基酸為Ala或Val中之任一者、377位之胺基酸為Gly或Lys中之任一者、378位之胺基酸為Asp、379位之胺基酸為Asn、380位之胺基酸為Ala、Asn或Ser中之任一者、382位之胺基酸為Ala或Ile中之任一者、385位之胺基酸為Glu、392位之胺基酸為Thr、396位之胺基酸為Leu、421位之胺基酸為Lys、427位之胺基酸為Asn、428位之胺基酸為Phe或Leu中之任一者、429位之胺基酸為Met、434位之胺基酸為Trp、436位之胺基酸為Ile、及440位之胺基酸為Gly、His、Ile、Leu或Tyr中之任一者、之群中選出之至少1個以上的胺基酸。
  27. 如申請專利範圍第21項之方法，其中，該結合於EU編號297位之糖鏈係含岩藻糖之糖鏈的天然型人類IgG 之Fc區，係結合於EU編號297位之糖鏈為含岩藻糖之糖鏈的天然型人類IgG1、天然型人類IgG2、天然型人類IgG3或天然型人類IgG4中之任一者之Fc區。
  28. 如申請專利範圍第21項之方法，其中，該人類Fc γ受體，係Fc γ RIa、Fc γ RIIa(R)、Fc γ RIIa(H)、Fc γ RIIb、Fc γ RIIIa(V)、或Fc γ RIIIa(F)。
  29. 如申請專利範圍第21項之方法，其中，該人類Fc γ受體為Fc γ RIIb。
  30. 如申請專利範圍第24項之方法，其中，該Fc區，在Fc區之以EU編號表示之部位當中含有：238位之胺基酸為Asp、或328位之胺基酸為Glu、中之至少1個以上的胺基酸。
  31. 一種抗原結合分子之製造方法，包含以下(a)~(f)之步驟：(a)獲得在鈣離子濃度為2mM之條件下抗原結合分域對於抗原之KD的步驟；(b)獲得在鈣離子濃度為3μM之條件下抗原結合分域對於抗原之KD的步驟；(c)選擇在(a)獲得之KD與在(b)獲得之KD的比，即KD(Ca 3μM)/KD(Ca 2mM)之值為2以上的抗原結合分域的步驟；(d)將編碼為於(c)選擇之抗原結合分域之聚核苷酸，連結於編碼為於pH酸性域條件下對於人類FcRn有結合活性且於pH中性域條件下對於Fc γ受體之結合活性比起結合於 EU編號297位之糖鏈為含岩藻糖之糖鏈之天然型人類IgG之Fc區對於Fc γ受體之結合活性為高之Fc γ受體結合分域的聚核苷酸的步驟；(e)培養導入有於(d)獲得之聚核苷酸以能作用地連結的載體的細胞的步驟；及(f)從於(e)培養之細胞之培養液回收抗原結合分子的步驟。
  32. 一種抗原結合分子之製造方法，包含以下(a)~(f)之步驟：(a)獲得在鈣離子濃度為2mM之條件下抗體對於抗原之KD的步驟；(b)獲得在鈣離子濃度為3μM之條件下抗體對於抗原之KD的步驟；(c)選擇在(a)獲得之KD與在(b)獲得之KD的比，即KD(Ca 3μM)/KD(Ca 2mM)之值為2以上的抗體的步驟；(d)將編碼為於(c)選擇之抗體之抗原結合分域之聚核苷酸，連結於編碼為於pH酸性域條件下對於人類FcRn有結合活性且於pH中性域條件下對於Fc γ受體之結合活性比起結合於EU編號297位之糖鏈為含岩藻糖之糖鏈之天然型人類IgG之Fc區對於Fc γ受體之結合活性為高之Fc γ受體結合分域的聚核苷酸的步驟；(e)培養導入有於(d)獲得之聚核苷酸以能作用地連結的載體的細胞的步驟；及(f)從於(e)培養之細胞之培養液回收抗原結合分子的步 驟。
  33. 一種抗原結合分子之製造方法，包含以下(a)~(f)之步驟：(a)獲得於pH7.4之條件下抗原結合分域對於抗原之KD的步驟；(b)獲得於pH5.8之條件下抗原結合分域對於抗原之KD的步驟；(c)選擇在(a)獲得之KD與在(b)獲得之KD的比，即KD(pH5.8)/KD(pH7.4)之值為2以上的抗原結合分域的步驟；(d)將編碼為於(c)選擇之抗原結合分域之聚核苷酸，連結於編碼為於pH酸性域條件下對於人類FcRn有結合活性且於pH中性域條件下對於Fc γ受體之結合活性比起結合於EU編號297位之糖鏈為含岩藻糖之糖鏈之天然型人類IgG之Fc區對於Fc γ受體之結合活性為高之Fc γ受體結合分域的聚核苷酸的步驟；(e)培養導入有於(d)獲得之聚核苷酸以能作用地連結的載體的細胞的步驟；及(f)從於(e)培養之細胞之培養液回收抗原結合分子的步驟。
  34. 一種抗原結合分子之製造方法，包含以下(a)~(f)之步驟：(a)獲得於pH7.4中性域之條件下抗體對於抗原之KD的步驟；(b)獲得於pH5.8之條件下抗體對於抗原之KD的步驟； (c)選擇在(a)獲得之KD與在(b)獲得之KD的比，即KD(pH5.8)/KD(pH7.4)之值為2以上的抗體的步驟；(d)將編碼為於(c)選擇之抗體之抗原結合分域之聚核苷酸，連結於編碼為於pH酸性域條件下對於人類FcRn有結合活性且於pH中性域條件下對於Fc γ受體之結合活性比起結合於EU編號297位之糖鏈為含岩藻糖之糖鏈之天然型人類IgG之Fc區對於Fc γ受體之結合活性為高之Fc γ受體結合分域的聚核苷酸的步驟；(e)培養導入有於(d)獲得之聚核苷酸以能作用地連結的載體的細胞的步驟；及(f)從於(e)培養之細胞之培養液回收抗原結合分子的步驟。
  35. 如申請專利範圍第31至34項中任一項之抗原結合分子之製造方法，其中，該抗原為可溶型抗原。
  36. 如申請專利範圍第31至34項中任一項之抗原結合分子之製造方法，其中，該Fc γ受體結合分域，包含抗體之Fc區。
  37. 如申請專利範圍第36項之抗原結合分子之製造方法，其中，該Fc區，在Fc區之以EU編號表示之部位當中，選自於221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、243位、244位、245位、246位、247位、249位、250位、251位、254位、255位、256位、258位、260位、262位、263 位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、339位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位及440位之群中至少1個以上之胺基酸，與天然型Fc區之對應部位之胺基酸不同。
  38. 如申請專利範圍第37項之抗原結合分子之製造方法，其中，該Fc區，包含選自於在Fc區之EU編號表示之部位當中：221位之胺基酸為Lys或Tyr中之任一者、222位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中之任一者、223位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Lys中之任一者、224位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中之任一者、225位之胺基酸為Glu、Lys或Trp中之任一者、227位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、228位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、230位之胺基酸為Ala、Glu、Gly或Tyr中之任一者、 231位之胺基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中之任一者、232位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、233位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、234位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、235位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、236位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、237位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、238位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、239位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、240位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、 241位之胺基酸為Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中之任一者、243位之胺基酸為Leu、Glu、Leu、Gln、Arg、Trp或Tyr中之任一者、244位之胺基酸為His、245位之胺基酸為Ala、246位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、247位之胺基酸為Ala、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Thr、Val或Tyr中之任一者、249位之胺基酸為Glu、His、Gln或Tyr中之任一者、250位之胺基酸為Glu或Gln中之任一者、251位之胺基酸為Phe、254位之胺基酸為Phe、Met或Tyr中之任一者、255位之胺基酸為Glu、Leu或Tyr中之任一者、256位之胺基酸為Ala、Met或Pro中之任一者、258位之胺基酸為Asp、Glu、His、Ser或Tyr中之任一者、260位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、262位之胺基酸為Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中之任一者、263位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、264位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、265位之胺基酸為Ala、Leu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或 Tyr中之任一者、266位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、267位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、268位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Trp中之任一者、269位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、270位之胺基酸為Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、271位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、272位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、273位之胺基酸為Phe或Ile中之任一者、274位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、275位之胺基酸為Leu或Trp中之任一者、276位之胺基酸為、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、278位之胺基酸為Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、 Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中之任一者、279位之胺基酸為Ala、280位之胺基酸為Ala、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gln、Trp或Tyr中之任一者、281位之胺基酸為Asp、Lys、Pro或Tyr中之任一者、282位之胺基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中之任一者、283位之胺基酸為Ala、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg或Tyr中之任一者、284位之胺基酸為Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中之任一者、285位之胺基酸為Asp、Glu、Lys、Gln、Trp或Tyr中之任一者、286位之胺基酸為Glu、Gly、Pro或Tyr中之任一者、288位之胺基酸為Asn、Asp、Glu或Tyr中之任一者、290位之胺基酸為Asp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、291位之胺基酸為Asp、Glu、Gly、His、Ile、Gln或Thr中之任一者、292位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中之任一者、293位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、294位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、 295位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、296位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr或Val中之任一者、297位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、298位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、299位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中之任一者、300位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中之任一者、301位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、302位之胺基酸為Ile、303位之胺基酸為Asp、Gly或Tyr中之任一者、304位之胺基酸為Asp、His、Leu、Asn或Thr中之任一者、305位之胺基酸為Glu、Ile、Thr或Tyr中之任一者、311位之胺基酸為Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中之任一者、313位之胺基酸為Phe、 315位之胺基酸為Leu、317位之胺基酸為Glu或Gln、318位之胺基酸為His、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Tyr中之任一者、320位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、322位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、323位之胺基酸為Ile、324位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、325位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、326位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、327位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、328位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、329位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr 中之任一者、330位之胺基酸為Cys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、331位之胺基酸為Asp、Phe、His、Ile、Leu、Met、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、332位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、333位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Ser、Thr、Val或Tyr中之任一者、334位之胺基酸為Ala、Glu、Phe、Ile、Leu、Pro或Thr中之任一者、335位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中之任一者、336位之胺基酸為Glu、Lys或Tyr中之任一者、337位之胺基酸為Glu、His或Asn中之任一者、339位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser或Thr中之任一者、376位之胺基酸為Ala或Val中之任一者、377位之胺基酸為Gly或Lys中之任一者、378位之胺基酸為Asp、379位之胺基酸為Asn、380位之胺基酸為Ala、Asn或Ser中之任一者、 382位之胺基酸為Ala或Ile中之任一者、385位之胺基酸為Glu、392位之胺基酸為Thr、396位之胺基酸為Leu、421位之胺基酸為Lys、427位之胺基酸為Asn、428位之胺基酸為Phe或Leu中之任一者、429位之胺基酸為Met、434位之胺基酸為Trp、436位之胺基酸為Ile、及440位之胺基酸為Gly、His、Ile、Leu或Tyr中之任一者、之群中至少1個以上的胺基酸。
  39. 如申請專利範圍第31至34項中任一項之抗原結合分子之製造方法，其中，該結合於EU編號297位之糖鏈係含岩藻糖之糖鏈之天然型人類IgG之Fc區，為結合於EU編號297位之糖鏈係含岩藻糖之糖鏈之天然型人類IgG1、天然型人類IgG2、天然型人類IgG3或天然型人類IgG4中之任一者之Fc區。
  40. 如申請專利範圍第31至34項中任一項之抗原結合分子之製造方法，其中，該人類Fc γ受體，為Fc γ RIa、Fc γ RIIa(R)、Fc γ RIIa(H)、Fc γ RIIb、Fc γ RIIIa(V)、或Fc γ RIIIa(F)。
  41. 如申請專利範圍第31至34項中任一項之抗原結合分子之製造方法，其中，該人類Fc γ受體為Fc γ RIIb。
  42. 如申請專利範圍第36項之抗原結合分子之製造方法，其中，該Fc區，含有在Fc區之以EU編號表示之部位當中：238位之胺基酸為Asp、或328位之胺基酸為Glu、中之至少1個以上的胺塞酸。
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