CN103974721A

CN103974721A - 促进抗原消除的抗原结合分子

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Publication number: CN103974721A
Application number: CN201280058920.8A
Authority: CN
Inventors: 井川智之; 前田敦彦; 原谷健太; 岩柳有起; 橘达彦
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2011-09-30
Filing date: 2012-09-28
Publication date: 2014-08-06
Also published as: TW202309079A; CN110639014A; CN108144058A; BR112014007687B1; MX361713B; TW201321412A; RU2014117505A; KR20140076593A; JP6093305B2; JP2017114882A; AU2012317418A1; SG10201610870XA; KR20200051048A; HK1198578A1; US20140335089A1; AU2012317418B2; TWI827333B; JPWO2013047752A1; JP6998748B2; TWI580693B

Abstract

本发明人创作了抗原结合分子，所述抗原结合分子含有：在pH酸性范围条件下具有人FcRn结合活性，且抗原结合分子的抗原结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域；以及，在pH中性范围条件下Fcγ受体结合活性与EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG的Fc区的Fcγ受体结合活性相比高的Fcγ受体结合结构域。

Description

促进抗原消除的抗原结合分子

技术领域

本发明提供：使结合的抗原向细胞内的摄入得到促进的抗原结合分子、使每一分子可结合的抗原数目增加的抗原结合分子、使药代动力学得到改善的抗原结合分子、使在细胞外结合的抗原在细胞内的解离得到促进的抗原结合分子、使在不与抗原结合的状态下向细胞外的释放得到促进的抗原结合分子、具有使血浆中的总抗原浓度或游离抗原浓度减少的功能的抗原结合分子，含有该抗原结合分子的药物组合物，以及它们的制备方法。

背景技术

抗体在血浆中的稳定性高、副作用也少，因而作为医药品受到关注。其中，IgG型的抗体药物有大量上市，现在也正在开发着数量众多的抗体药物(非专利文献1和非专利文献2)。另一方面，作为能适用于第二代抗体药物的技术，开发有各种技术，报道了使效应子功能、抗原结合能力、药代动力学、稳定性提高的技术或者使免疫原性风险降低的技术等(非专利文献3)。通常，抗体药物的给药量非常高，因而作为课题可考虑到难以制作皮下给药制剂，制备成本高等。作为降低抗体药物的给药量的方法，可考虑改善抗体的药代动力学的方法和使抗体与抗原的亲和性提高的方法。

作为改善抗体的药代动力学的方法，报道有恒定区的人工氨基酸取代(非专利文献4和5)。作为增强抗原结合能力、抗原中和能力的技术，报道有亲和性成熟技术(非专利文献6)，通过对可变区的CDR区等的氨基酸导入突变可以增强对抗原的结合活性。通过增强抗原结合能力，可以使体外的生物活性提高，或者降低给药量，进而也可以使体内(机体内)的药效提高(非专利文献7)。

另一方面，每一分子抗体能够中和的抗原量依赖于亲和性，可以通过增强亲和性来以少的抗体量中和抗原，可以通过各种方法增强抗体的亲和性(非专利文献6)。进而，只要可共价地与抗原结合，使亲和性无限大，则可以用一分子的抗体来中和一分子的抗原(二价的情形为二抗原)。但是，迄今为止的方法中，限制是一分子抗体对一分子抗原(二价的情形是二抗原)的化学计量的中和反应，不可能用抗原量以下的抗体量来完全中和抗原。即，在增强亲和性的效果方面存在限制(非专利文献9)。中和抗体的情形中，为了使其中和效果持续一定期间，需要给予机体内在该期间产生的抗原量以上的抗体量，仅通过上述的抗体药代动力学改善或者亲和性成熟技术，在降低必要抗体给药量方面存在限制。因此，为了用抗原量以下的抗体量来使抗原的中和效果持续目标期间，需要用一个抗体来中和多个抗原。作为实现其的新方法，最近报道了pH依赖性地与抗原结合的抗体(专利文献1)。在血浆中的中性条件下与抗原强结合、在内体内的酸性条件下从抗原解离的pH依赖性抗原结合抗体可以在内体内从抗原解离。pH依赖性抗原结合抗体在将抗原解离后，若抗体被FcRn再循环到血浆中，则可以再次与抗原结合，因而可以用一个pH依赖性抗原结合抗体重复与多个抗原结合。

此外，与结合至FcRn而被再循环的抗体相比，抗原的血浆中滞留性非常短。这种血浆中滞留性长的抗体与其抗原结合时，抗体抗原复合体的血浆中滞留性变得与抗体同样地长。因此，抗原通过与抗体结合，不仅血浆中滞留性变长，而且血浆中抗原浓度上升。

如此，pH依赖性抗原结合抗体可以用1个抗体与多个抗原结合，与通常的抗体相比，能促进抗原从血浆中的消除，因此具有通常的抗体所无法实现的作用。然而，迄今为止尚未报道有该pH依赖性抗原结合抗体的可以重复与抗原结合的效果以及使促进抗原从血浆中消除的效果进一步提高的抗体工程技术。

IgG抗体通过与FcRn结合而具有长的血浆中滞留性。IgG和FcRn的结合仅在酸性条件下(pH6.0)被观察到，而在中性条件下(pH7.4)基本观察不到其结合。IgG抗体被非特异性地摄入细胞，但通过在内体内的酸性条件下与内体内的FcRn结合而返回到细胞表面上，在血浆中的中性条件下从FcRn解离。向IgG的Fc区导入突变而使其丧失在pH酸性条件下与FcRn的结合时，变得无法从内体内再循环到血浆中，因而抗体的血浆中滞留性显著受损。作为改善IgG抗体的血浆中滞留性的方法，报道有提高pH酸性范围条件下对FcRn的结合的方法。通过向IgG抗体的Fc区导入氨基酸取代，使pH酸性范围条件下对FcRn的结合提高，从内体内再循环到血浆中的效率提高，结果血浆中滞留性改善。

作为IgG类抗体的效应子功能的抗体依赖性细胞毒活性(以下表示为ADCC)、补体依赖性细胞毒活性(以下表示为CDC)的研究，迄今为止进行了许多，在人IgG类之中，报道了IgG1亚类的抗体具有最高的ADCC活性、CDC活性(非专利文献13)。此外，作为由IgG类抗体介导的靶细胞的吞噬作用的抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)也作为抗体的效应子功能之一而被暗示(非专利文献14、非专利文献15)。IgG1亚类的抗体可能对肿瘤发挥这些效应子功能，因此使用IgG1亚类的抗体作为针对癌抗原的大部分的抗体药物。

为了使IgG抗体介导ADCC、ADCP活性，有必要使IgG抗体的Fc区与存在于杀伤细胞、自然杀伤细胞、活化的巨噬细胞等效应细胞表面上的抗体受体(以下表示为Fcγ受体或FcγR)相结合。作为人的Fcγ受体的蛋白家族，报道有FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、FcγRIIIb的同种型，也报道有各自的同种异型(非专利文献16)。

增强ADCC和ADCP等细胞毒性的效应子功能，作为有望用于增强抗癌抗体的抗肿瘤效果的手段而被关注。以抗体的抗肿瘤效果为目的的由Fcγ受体介导的效应子功能的重要性有使用小鼠模型的报道(非专利文献17、非专利文献18)。此外，在对人的临床效果与FcγRIIIa的高亲和性多态性(V158)和低亲和性多态性(F158)之间观察到了相关性(非专利文献19)。根据这些报道，暗示了：具有优化了与特定Fcγ受体的结合的Fc区的抗体介导更强的效应子功能，由此发挥有效的抗肿瘤效果。抗体对含有FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIIa、FcγRIIIb的活化受体、含有FcγRIIb的抑制受体各自的亲和性的平衡在优化抗体的效应子功能方面是重要的因素。通过增强对活化受体的亲和性，可以对抗体赋予介导更强的效应子功能的性质(非专利文献20)，因此作为使针对抗癌抗原的抗体药物的抗肿瘤活性增强或提高的抗体工程方法，迄今为止有各种的报道。

已显示：关于Fc区与Fcγ受体的结合，抗体的铰链区以及CH2结构域内的数个氨基酸残基以及与CH2结构域结合的EU编号297位的Asn上所附加的糖链是重要的(非专利文献13、非专利文献21、非专利文献22)。围绕该结合位置，迄今为止研究了各种具有Fcγ受体结合特性的Fc区的突变体，得到了对活化Fcγ受体具有更高亲和性的Fc区突变体(专利文献2、专利文献3)。例如，Lazar等人通过将人IgG1的以EU编号表示的239位的Ser、330位的Ala、332位的Ile分别取代成Asp、Leu、Glu，成功地使人IgG1对人FcγRIIIa(V158)的结合增加到约370倍(非专利文献23、专利文献3)。该改变体与天然型相比，对FcγRIIIa和FcγRIIb的结合之比(A/I比)达到约9倍。此外，Shinkawa等人通过使以EU编号表示的297位的Asn所附加的糖链的岩藻糖缺失而成功地使对FcγRIIIa的结合增加到约100倍(非专利文献24)。通过这些方法，与天然型人IgG1比较，可以使人IgG1的ADCC活性大幅度提高。

如此，在以膜型抗原为靶标的抗体中，Fcγ受体结合活性在细胞毒活性中发挥重要的作用，因此，在细胞毒活性必要的情形下，使用FcγR结合活性高的人IgG1的同种型，并且通过增强Fcγ受体结合活性而使细胞毒活性增强的技术为广泛使用的技术。另一方面，在以可溶型抗原为靶标的抗体中，Fcγ受体结合活性所发挥的作用仍属未知，可以认为：Fcγ受体结合活性高的人IgG1和FcγR结合活性低的人IgG2或人IgG4，在效果方面没有差异。因此，迄今为止在以可溶型抗原为靶标的抗体中，就增强Fcγ受体结合活性方面没有进行尝试，而且没有关于该效果的报道。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：WO2009/125825；

专利文献2：WO2000/042072；

专利文献3：WO2006/019447；

非专利文献

非专利文献1：Janice M Reichert,Clark J Rosensweig,Laura B Faden &Matthew C Dewitz,Monoclonal antibody successes in the clinic.,Nat.Biotechnol.(2005)23,1073–1078；

非专利文献2：Pavlou AK,Belsey MJ.,The therapeutic antibodies marketto2008.,Eur J Pharm Biopharm.(2005)59(3),389-396；

非专利文献3：Kim SJ,Park Y,Hong HJ.,Antibody engineering for thedevelopment of therapeutic antibodies.,Mol Cells.(2005)20(1),17-29；

非专利文献4：Hinton PR,Xiong JM,Johlfs MG,Tang MT,Keller S,Tsurushita N.,An engineered human IgG1antibody with longer serum half-life.,J.Immunol.(2006)176(1),346-356；

非专利文献5：Ghetie V,Popov S,Borvak J,Radu C,Matesoi D,MedesanC,Ober RJ,Ward ES.,Increasing the serum persistence of an IgG fragment byrandom mutagenesis.,Nat.Biotechnol.(1997)15(7),637-640；

非专利文献6：Rajpal A,Beyaz N,Haber L,Cappuccilli G,Yee H,BhattRR,Takeuchi T,Lerner RA,Crea R.,A general method for greatly improvingthe affinity of antibodies by using combinatorial libraries.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2005)102(24),8466-8471；

非专利文献7：Wu H,Pfarr DS,Johnson S,Brewah YA,Woods RM,PatelNK,White WI,Young JF,Kiener PA.,Development of Motavizumab,anUltra-potent Antibody for the Prevention of Respiratory Syncytial VirusInfection in the Upper and Lower Respiratory Tract.,J.Mol.Biol.(2007)368,652-665；

非专利文献8：Hanson CV,Nishiyama Y,Paul S.,Catalytic antibodies andtheir applications.,Curr Opin Biotechnol.(2005)16(6),631-636；

非专利文献9：Rathanaswami P,Roalstad S,Roskos L,Su QJ,Lackie S,Babcook J.,Demonstration of an in vivo generated sub-picomolar affinity fullyhuman monoclonal antibody to interleukin-8.,Biochem.Biophys.Res.Commun.(2005)334(4),1004-1013；

非专利文献10：Dall'Acqua WF,Woods RM,Ward ES,Palaszynski SR,Patel NK,Brewah YA,Wu H,Kiener PA,Langermann S.,Increasing the affinityof a human IgG1for the neonatal Fc receptor:biological consequences.,J.Immunol.(2002)169(9),5171-5180；

非专利文献11：Yeung YA,Leabman MK,Marvin JS,Qiu J,Adams CW,Lien S,Starovasnik MA,Lowman HB.,Engineering human IgG1affinity tohuman neonatal Fc receptor:impact of affinity improvement onpharmacokinetics in primates.,J.Immunol.(2009)182(12),7663-7671；

非专利文献12：Datta-Mannan A,Witcher DR,Tang Y,Watkins J,Wroblewski VJ.,Monoclonal antibody clearance.Impact of modulating theinteraction of IgG with the neonatal Fc receptor.,J.Biol.Chem.(2007)282(3),1709-1717；

非专利文献13：Clark,M.,Antibody Engineering IgG EffectorMechanisms.,Chemical Immunology(1997)65,88-110；

非专利文献14：Horton HM,Bernett MJ,Pong E,Peipp M,Karki S,ChuSY,Richards JO,Vostiar I,Joyce PF,Repp R,Desjarlais JR,Zhukovsky EA.,Potent in vitro and in vivo activity of an Fc-engineered anti-CD19monoclonalantibody against lymphoma and leukemia.,Cancer Res.(2008)68,8049-8057；

非专利文献15：Zalevsky J,Leung IW,Karki S,Chu SY,Zhukovsky EA,Desjarlais JR,Carmichael DF,Lawrence CE.,The impact of Fc engineering onan anti-CD19antibody:increased Fcγ receptor affinity enhances B-cell clearingin nonhuman primates.,Blood(2009)113,3735-3743；

非专利文献16：Jefferis R,Lund J.,Interaction sites on human IgG-Fc forFcgammaR:current models.,Immunol.Lett.(2002)82,57-65；

非专利文献17：Clynes,R.,Yoshizumi,T.,Moroi,Y.,Houghton,A.N.,andRavetch,J.V.,Fc Receptors are required for passive and active immunity tomelanoma.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1998)95,652-656；

非专利文献18：Clynes RA,Towers TL,Presta LG,Ravetch JV.,InhibitoryFc receptors modulate in vivo cytoxicity against tumor targets.,Nat.Med.(2000)6,443-446；

非专利文献19：Cartron G,Dacheux L,Salles G,Solal-Celigny P,Bardos P,Colombat P,Watier H.,Therapeutic activity of humanized anti-CD20monoclonal antibody and polymorphism in IgG Fc receptor FcgammaRIIIagene.,Blood(2002)99,754-758；

非专利文献20：Nimmerjahn F,Ravetch JV.,Divergent immunoglobulin gsubclass activity through selective Fc receptor binding.,Science(2005)310,1510-1512；

非专利文献21：Greenwood J,Clark M,Waldmann H.,Structural motifsinvolved in human IgG antibody effector functions.,Eur.J.Immunol.(1993)23,1098-1104；

非专利文献22：Morgan A,Jones ND,Nesbitt AM,Chaplin L,BodmerMW,Emtage JS.,The N-terminal end of the CH2domain of chimeric humanIgG1anti-HLA-DR is necessary for C1q,Fc gamma RI and Fc gamma RIIIbinding.,Immunology(1995)86,319-324；

非专利文献23：Lazar GA,Dang W,Karki S,Vafa O,Peng JS,Hyun L,Chan C,Chung HS,Eivazi A,Yoder SC,Vielmetter J,Carmichael DF,Hayes RJ,Dahiyat BI.,Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function.,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.(2006)103,4005-4010；

非专利文献24：Shinkawa T,Nakamura K,Yamane N,Shoji-Hosaka E,Kanda Y,Sakurada M,Uchida K,Anazawa H,Satoh M,Yamasaki M,Hanai N,Shitara K.,The absence of fucose but not the presence of galactose or bisectingN-acetylglucosamine of human IgG1complex-type oligosaccharides shows thecritical role of enhancing antibody-dependent cellular cytotoxicity.,J.Biol.Chem.(2003)278,3466-3473。

发明内容

发明所要解决的技术问题

本发明基于上述状况而完成，其目的在于提供：使结合的抗原向细胞内的摄入得到促进的抗原结合分子、使每一分子可结合的抗原数目增加的抗原结合分子、使药代动力学得到改善的抗原结合分子、使在细胞外结合的抗原在细胞内的解离得到促进的抗原结合分子、使在不与抗原结合的状态下向细胞外的释放得到促进的抗原结合分子、具有使血浆中的总抗原浓度或游离抗原浓度减少的功能的抗原结合分子，含有该抗原结合分子的药物组合物，以及它们的制备方法。

用于解决技术问题的手段

本发明人为了实现上述目的进行了深入的研究，创作了含有以下组分的抗原结合分子：pH酸性范围条件下具有人FcRn结合活性，且抗原结合分子的抗原结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域；以及，在pH中性范围条件下Fcγ受体结合活性与EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG的Fc区的Fcγ受体结合结构域相比高的Fcγ受体结合结构域。此外，本发明人发现了促进结合的抗原向细胞内摄入的方法、使每一分子的抗原结合分子可结合的抗原数目增加的方法、改善抗原结合分子的药代动力学的方法、促进在细胞外与抗原结合分子结合的抗原在细胞内从抗原结合分子解离的方法、在不与抗原结合的状态下促进向细胞外释放的方法和使血浆中的总抗原浓度或游离抗原浓度减少的方法，这些方法包括使上述的抗原结合分子与表达Fcγ受体的细胞在机体内或机体外进行细胞接触的步骤。此外，本发明人在发现具有上述性质的抗原结合分子的制备方法的同时，还发现含有这样的抗原结合分子或者通过本发明的制备方法制备的抗原结合分子作为有效成分的药物组合物的有用性，从而完成了本发明。

即，更具体而言，本发明提供以下的[1]～[46]。

[1]含有抗原结合分子的药物组合物，其中，该抗原结合分子含有：在pH酸性范围条件下具有人FcRn结合活性，且对抗原的结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域；以及，在pH中性范围条件下Fcγ受体结合活性与EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG的Fc区的Fcγ受体结合活性相比高的Fcγ受体结合结构域。

[2][1]所述的药物组合物，其中，上述抗原为可溶型抗原。

[3][1]或[2]所述的药物组合物，其中，上述离子浓度为钙离子浓度。

[4][3]所述的药物组合物，其中，上述抗原结合结构域为在高钙离子浓度条件下抗原结合活性高于在低钙离子浓度条件下对该抗原的结合活性的抗原结合结构域。

[5][1]或[2]所述的药物组合物，其中，上述离子浓度条件为pH条件。

[6][5]所述的药物组合物，上述抗原结合结构域为在pH中性范围条件下的抗原结合活性高于在pH酸性范围条件下对该抗原的结合活性的抗原结合结构域。

[7][1]～[6]中任一项所述的药物组合物，其中，上述抗原结合分子为具有针对上述抗原的中和活性的抗原结合分子。

[8][1]～[7]中任一项所述的药物组合物，其中，上述Fcγ受体结合结构域含有抗体的Fc区。

[9][8]所述的药物组合物，其中，上述Fc区是在Fc区的以EU编号表示的位点中选自以下的至少一个以上的氨基酸与天然型Fc区的对应位点的氨基酸不同的Fc区：221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、243位、244位、245位、246位、247位、249位、250位、251位、254位、255位、256位、258位、260位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、339位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位和440位。

[10][9]所述的药物组合物，其中，上述Fc区是在Fc区的以EU编号表示的位点中含有选自以下的至少一个以上的氨基酸的Fc区：

221位的氨基酸为Lys或Tyr中的任一个；

222位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个；

223位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Lys中的任一个；

224位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个；

225位的氨基酸为Glu、Lys或Trp中的任一个；

227位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；

228位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；

230位的氨基酸为Ala、Glu、Gly或Tyr中的任一个；

231位的氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一个；

232位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；

233位的氨基酸为Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

234位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

235位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

236位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

237位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

238位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

239位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

240位的氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一个；

241位的氨基酸为Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中的任一个；

243位的氨基酸为Leu、Glu、Leu、Gln、Arg、Trp或Tyr中的任一个；

244位的氨基酸为His；

245位的氨基酸为Ala；

246位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；

247位的氨基酸为Ala、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Thr、Val或Tyr中的任一个；

249位的氨基酸为Glu、His、Gln或Tyr中的任一个；

250位的氨基酸为Glu或Gln中的任一个；

251位的氨基酸为Phe；

254位的氨基酸为Phe、Met或Tyr中的任一个；

255位的氨基酸为Glu、Leu或Tyr中的任一个；

256位的氨基酸为Ala、Met或Pro中的任一个；

258位的氨基酸为Asp、Glu、His、Ser或Tyr中的任一个；

260位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；

262位的氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中的任一个；

263位的氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一个；

264位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中的任一个；

265位的氨基酸为Ala、Leu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

266位的氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一个；

267位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

268位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Trp中的任一个；

269位的氨基酸为Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

270位的氨基酸为Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中的任一个；

271位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

272位的氨基酸为Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

273位的氨基酸为Phe或Ile中的任一个；

274位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

275位的氨基酸为Leu或Trp中的任一个；

276位的氨基酸为、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

278位的氨基酸为Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中的任一个；

279位的氨基酸为Ala；

280位的氨基酸为Ala、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gln、Trp或Tyr中的任一个；

281位的氨基酸为Asp、Lys、Pro或Tyr中的任一个；

282位的氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一个；

283位的氨基酸为Ala、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg或Tyr中的任一个；

284位的氨基酸为Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中的任一个；

285位的氨基酸为Asp、Glu、Lys、Gln、Trp或Tyr中的任一个；

286位的氨基酸为Glu、Gly、Pro或Tyr中的任一个；

288位的氨基酸为Asn、Asp、Glu或Tyr中的任一个；

290位的氨基酸为Asp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、Trp或Tyr中的任一个；

291位的氨基酸为Asp、Glu、Gly、His、Ile、Gln或Thr中的任一个；

292位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中的任一个；

293位的氨基酸为Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

294位的氨基酸为Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

295位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

296位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr或Val中的任一个；

297位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

298位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

299位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中的任一个；

300位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中的任一个；

301位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；

302位的氨基酸为Ile；

303位的氨基酸为Asp、Gly或Tyr中的任一个；

304位的氨基酸为Asp、His、Leu、Asn或Thr中的任一个；

305位的氨基酸为Glu、Ile、Thr或Tyr中的任一个；

311位的氨基酸为Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中的任一个；

313位的氨基酸为Phe；

315位的氨基酸为Leu；

317位的氨基酸为Glu或Gln；

318位的氨基酸为His、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Tyr中的任一个；

320位的氨基酸为Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

322位的氨基酸为Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

323位的氨基酸为Ile；

324位的氨基酸为Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

325位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

326位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

327位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

328位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

329位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

330位的氨基酸为Cys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

331位的氨基酸为Asp、Phe、His、Ile、Leu、Met、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

332位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

333位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Ser、Thr、Val或Tyr中的任一个；

334位的氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile、Leu、Pro或Thr中的任一个；

335位的氨基酸为Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中的任一个；

336位的氨基酸为Glu、Lys或Tyr中的任一个；

337位的氨基酸为Glu、His或Asn中的任一个；

339位的氨基酸为Asp、Phe、Gly、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser或Thr中的任一个；

376位的氨基酸为Ala或Val中的任一个；

377位的氨基酸为Gly或Lys中的任一个；

378位的氨基酸为Asp；

379位的氨基酸为Asn；

380位的氨基酸为Ala、Asn或Ser中的任一个；

382位的氨基酸为Ala或Ile中的任一个；

385位的氨基酸为Glu；

392位的氨基酸为Thr；

396位的氨基酸为Leu；

421位的氨基酸为Lys；

427位的氨基酸为Asn；

428位的氨基酸为Phe或Leu中的任一个；

429位的氨基酸为Met；

434位的氨基酸为Trp；

436位的氨基酸为Ile；和

440位的氨基酸为Gly、His、Ile、Leu或Tyr中的任一个。

[11][1]～[10]中任一项所述的药物组合物，其中，上述EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG的Fc区是：EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG1、天然型人IgG2、天然型人IgG3或天然型人IgG4的任一个的Fc区。

[12][1]～[11]中任一项所述的药物组合物，其中，上述人Fcγ受体为FcγRIa、FcγRIIa(R)、FcγRIIa(H)、FcγRIIb、FcγRIIIa(V)或FcγRIIIa(F)。

[13][1]～[11]中任一项所述的药物组合物，其中，上述人Fcγ受体为FcγRIIb。

[14][8]～[13]中任一项所述的药物组合物，其中，上述Fc区是在Fc区的以EU编号表示的位点中含有以下的至少一个以上的氨基酸的Fc区：

238位的氨基酸为Asp，或

328位的氨基酸为Glu。

[15]以下(i)～(vi)的任一项的方法，该方法包括使抗原结合分子与表达Fcγ受体的细胞在机体内或机体外进行细胞接触的步骤，该抗原结合分子含有：在pH酸性范围条件下具有人FcRn结合活性，且对抗原的结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域；以及，在pH中性范围条件下Fcγ受体结合活性与EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG的Fc区的Fcγ受体结合活性相比高的Fcγ受体结合结构域，

(i)使一分子的抗原结合分子可结合的抗原数目增加的方法；

(ii)使血浆中的抗原消除的方法；

(iii)改善抗原结合分子的药代动力学的方法；

(iv)促进在细胞外与抗原结合分子结合的抗原在细胞内从抗原结合分子解离的方法；

(v)促进不与抗原结合的状态的抗原结合分子向细胞外释放的方法；或

(vi)使血浆中的总抗原浓度或游离抗原浓度减少的方法。

[16][15]所述的方法，其中，上述抗原为可溶型抗原。

[17][15]或[16]所述的方法，其中，上述离子浓度为钙离子浓度。

[18][17]所述的方法，其中，上述抗原结合结构域为在高钙离子浓度条件下的抗原结合活性高于在低钙离子浓度条件下对该抗原的结合活性的抗原结合结构域。

[19][15]或[16]所述的方法，其中，上述离子浓度条件为pH条件。

[20][19]所述的方法，其中，上述抗原结合结构域为在pH中性范围条件下的抗原结合活性高于在pH酸性范围条件下对该抗原的结合活性的抗原结合结构域。

[21][15]～[20]中任一项所述的方法，其中，上述抗原结合分子为具有针对上述抗原的中和活性的抗原结合分子。

[22][15]～[21]中任一项所述的方法，其中，上述Fcγ受体结合结构域含有抗体的Fc区。

[23][22]所述的方法，其中，上述Fc区是在Fc区的以EU编号表示的位点中选自以下的至少一个以上的氨基酸与天然型Fc区的对应位点的氨基酸不同的Fc区：221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、243位、244位、245位、246位、247位、249位、250位、251位、254位、255位、256位、258位、260位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、339位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位和440位。

[24][23]所述的方法，其中，上述Fc区是在Fc区的以EU编号表示的位点中含有选自以下的至少一个以上的氨基酸的Fc区：

221位的氨基酸为Lys或Tyr中的任一个；

222位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个；

223位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Lys中的任一个；

224位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个；

225位的氨基酸为Glu、Lys或Trp中的任一个；

227位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；

228位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；

230位的氨基酸为Ala、Glu、Gly或Tyr中的任一个；

231位的氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一个；

232位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；

240位的氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一个；

241位的氨基酸为Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中的任一个；

243位的氨基酸为Leu、Glu、Leu、Gln、Arg、Trp或Tyr中的任一个；

244位的氨基酸为His；

245位的氨基酸为Ala；

246位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；

249位的氨基酸为Glu、His、Gln或Tyr中的任一个；

250位的氨基酸为Glu或Gln中的任一个；

251位的氨基酸为Phe；

254位的氨基酸为Phe、Met或Tyr中的任一个；

255位的氨基酸为Glu、Leu或Tyr中的任一个；

256位的氨基酸为Ala、Met或Pro中的任一个；

258位的氨基酸为Asp、Glu、His、Ser或Tyr中的任一个；

260位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；

262位的氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中的任一个；

263位的氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一个；

266位的氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一个；

273位的氨基酸为Phe或Ile中的任一个；

275位的氨基酸为Leu或Trp中的任一个；

279位的氨基酸为Ala；

281位的氨基酸为Asp、Lys、Pro或Tyr中的任一个；

282位的氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一个；

284位的氨基酸为Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中的任一个；

285位的氨基酸为Asp、Glu、Lys、Gln、Trp或Tyr中的任一个；

286位的氨基酸为Glu、Gly、Pro或Tyr中的任一个；

288位的氨基酸为Asn、Asp、Glu或Tyr中的任一个；

291位的氨基酸为Asp、Glu、Gly、His、Ile、Gln或Thr中的任一个；

292位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中的任一个；

301位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；

302位的氨基酸为Ile；

303位的氨基酸为Asp、Gly或Tyr中的任一个；

304位的氨基酸为Asp、His、Leu、Asn或Thr中的任一个；

305位的氨基酸为Glu、Ile、Thr或Tyr中的任一个；

311位的氨基酸为Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中的任一个；

313位的氨基酸为Phe；

315位的氨基酸为Leu；

317位的氨基酸为Glu或Gln；

323位的氨基酸为Ile；

334位的氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile、Leu、Pro或Thr中的任一个；

336位的氨基酸为Glu、Lys或Tyr中的任一个；

337位的氨基酸为Glu、His或Asn中的任一个；

376位的氨基酸为Ala或Val中的任一个；

377位的氨基酸为Gly或Lys中的任一个；

378位的氨基酸为Asp；

379位的氨基酸为Asn；

380位的氨基酸为Ala、Asn或Ser中的任一个；

382位的氨基酸为Ala或Ile中的任一个；

385位的氨基酸为Glu；

392位的氨基酸为Thr；

396位的氨基酸为Leu；

421位的氨基酸为Lys；

427位的氨基酸为Asn；

428位的氨基酸为Phe或Leu中的任一个；

429位的氨基酸为Met；

434位的氨基酸为Trp；

436位的氨基酸为Ile；和

440位的氨基酸为Gly、His、Ile、Leu或Tyr中的任一个。

[25][15]～[24]中任一项所述的方法，其中，上述EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG的Fc区是：EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG1、天然型人IgG2、天然型人IgG3或天然型人IgG4的任一个的Fc区。

[26][15]～[25]中任一项所述的方法，其中，上述人Fcγ受体为FcγRIa、FcγRIIa(R)、FcγRIIa(H)、FcγRIIb、FcγRIIIa(V)或FcγRIIIa(F)。

[27][15]～[25]中任一项所述的方法，其中，上述人Fcγ受体为FcγRIIb。

[28][22]～[27]中任一项所述的方法，其中，上述Fc区是在Fc区的以EU编号表示的位点中含有以下的至少一个以上的氨基酸的Fc区：

238位的氨基酸为Asp，或

328位的氨基酸为Glu。

[29]以下(i)～(vii)的任一项所述的方法，该方法包括：使抗原结合分子中的Fcγ受体结合结构域在pH中性范围条件下的Fcγ受体结合活性较EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG的Fc区在pH中性范围条件下的Fcγ受体结合活性增强的步骤，所述抗原结合分子含有在pH酸性范围条件下具有人FcRn结合活性、且对抗原的结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域以及Fcγ受体结合结构域，

(i)使结合的抗原向细胞内的摄入得到促进的抗原结合分子的改变方法；

(ii)使一分子的抗原结合分子可结合的抗原数目增加的方法；

(iii)使抗原结合分子的血浆中抗原消除能力增大的方法；

(iv)改善抗原结合分子的药代动力学的方法；

(v)促进在细胞外与抗原结合分子结合的抗原在细胞内从抗原结合分子解离的方法；

(vi)促进在与抗原结合的状态下摄入到细胞内的抗原结合分子在不与抗原结合的状态下向细胞外释放的方法；或

(vii)可减少血浆中的总抗原浓度或游离抗原浓度的抗原结合分子的改变方法。

[30][29]所述的方法，其中，上述抗原为可溶型抗原。

[31][29]或[30]所述的方法，其中，上述离子浓度为钙离子浓度。

[32][31]所述的方法，其中，上述抗原结合结构域为在高钙离子浓度条件下的抗原结合活性高于在低钙离子浓度条件下对该抗原的结合活性的抗原结合结构域。

[33][29]或[30]所述的方法，其中，上述离子浓度条件为pH条件。

[34][33]所述的方法，上述抗原结合结构域为在pH中性范围条件下的抗原结合活性高于在pH酸性范围条件下对该抗原的结合活性的抗原结合结构域。

[35][29]～[34]中任一项所述的方法，其中，上述抗原结合分子为具有针对上述抗原的中和活性的抗原结合分子。

[36][29]～[35]中任一项所述的方法，其中，上述Fcγ受体结合结构域含有抗体的Fc区。

[37][36]所述的方法，其中，上述Fc区是在Fc区的以EU编号表示的位点中以下的任一个以上的氨基酸与天然型Fc区的对应位点的氨基酸不同的Fc区：221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、243位、244位、245位、246位、247位、249位、250位、251位、254位、255位、256位、258位、260位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、339位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位和440位。

[38][33]所述的方法，其中，上述Fc区是在Fc区的以EU编号表示的位点中含有选自以下的至少一个以上的氨基酸的Fc区：

221位的氨基酸为Lys或Tyr中的任一个；

222位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个；

223位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Lys中的任一个；

224位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个；

225位的氨基酸为Glu、Lys或Trp中的任一个；

227位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；

228位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；

230位的氨基酸为Ala、Glu、Gly或Tyr中的任一个；

231位的氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一个；

232位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；

240位的氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一个；

241位的氨基酸为Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中的任一个；

243位的氨基酸为Leu、Glu、Leu、Gln、Arg、Trp或Tyr中的任一个；

244位的氨基酸为His；

245位的氨基酸为Ala；

246位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；

249位的氨基酸为Glu、His、Gln或Tyr中的任一个；

250位的氨基酸为Glu或Gln中的任一个；

251位的氨基酸为Phe；

254位的氨基酸为Phe、Met或Tyr中的任一个；

255位的氨基酸为Glu、Leu或Tyr中的任一个；

256位的氨基酸为Ala、Met或Pro中的任一个；

258位的氨基酸为Asp、Glu、His、Ser或Tyr中的任一个；

260位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；

262位的氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中的任一个；

263位的氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一个；

266位的氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一个；

273位的氨基酸为Phe或Ile中的任一个；

275位的氨基酸为Leu或Trp中的任一个；

279位的氨基酸为Ala；

281位的氨基酸为Asp、Lys、Pro或Tyr中的任一个；

282位的氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一个；

284位的氨基酸为Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中的任一个；

285位的氨基酸为Asp、Glu、Lys、Gln、Trp或Tyr中的任一个；

286位的氨基酸为Glu、Gly、Pro或Tyr中的任一个；

288位的氨基酸为Asn、Asp、Glu或Tyr中的任一个；

291位的氨基酸为Asp、Glu、Gly、His、Ile、Gln或Thr中的任一个；

292位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中的任一个；

301位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；

302位的氨基酸为Ile；

303位的氨基酸为Asp、Gly或Tyr中的任一个；

304位的氨基酸为Asp、His、Leu、Asn或Thr中的任一个；

305位的氨基酸为Glu、Ile、Thr或Tyr中的任一个；

311位的氨基酸为Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中的任一个；

313位的氨基酸为Phe；

315位的氨基酸为Leu；

317位的氨基酸为Glu或Gln；

323位的氨基酸为Ile；

334位的氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile、Leu、Pro或Thr中的任一个；

336位的氨基酸为Glu、Lys或Tyr中的任一个；

337位的氨基酸为Glu、His或Asn中的任一个；

376位的氨基酸为Ala或Val中的任一个；

377位的氨基酸为Gly或Lys中的任一个；

378位的氨基酸为Asp；

379位的氨基酸为Asn；

380位的氨基酸为Ala、Asn或Ser中的任一个；

382位的氨基酸为Ala或Ile中的任一个；

385位的氨基酸为Glu；

392位的氨基酸为Thr；

396位的氨基酸为Leu；

421位的氨基酸为Lys；

427位的氨基酸为Asn；

428位的氨基酸为Phe或Leu中的任一个；

429位的氨基酸为Met；

434位的氨基酸为Trp；

436位的氨基酸为Ile；和

440位的氨基酸为Gly、His、Ile、Leu或Tyr中的任一个。

[39][29]～[38]中任一项所述的方法，其中，上述EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG的Fc区是：EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG1、天然型人IgG2、天然型人IgG3或天然型人IgG4的任一个的Fc区。

[40][29]～[39]中任一项所述的方法，其中，上述人Fcγ受体为FcγRIa、FcγRIIa(R)、FcγRIIa(H)、FcγRIIb、FcγRIIIa(V)或FcγRIIIa(F)。

[41][29]～[39]中任一项所述的方法，其中，上述人Fcγ受体为FcγRIIb。

[42][36]～[41]中任一项所述的方法，其中，上述Fc区是在Fc区的以EU编号表示的位点中含有以下的至少一个以上的氨基酸的Fc区：

238位的氨基酸为Asp，或

328位的氨基酸为Glu。

[43]抗原结合分子的制备方法，该方法包括以下(a)～(f)的步骤：

(a)获得在高钙离子浓度条件下抗原结合结构域对抗原的结合活性的步骤；

(b)获得在低钙离子浓度条件下抗原结合结构域的抗原结合活性的步骤；

(c)选择在(a)中获得的抗原结合活性高于在(b)中获得的抗原结合活性的抗原结合结构域的步骤；

(d)使编码在(c)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸与编码Fcγ受体结合结构域的多核苷酸连接的步骤，所述Fcγ受体结合结构域是：在pH酸性范围条件下具有人FcRn结合活性，且在pH中性范围条件下Fcγ受体结合活性与EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG的Fc区的Fcγ受体结合活性相比高的Fcγ受体结合结构域；

(e)培养导入了有效连接有在(d)中获得的多核苷酸的载体的细胞的步骤；以及

(f)从在(e)中培养的细胞培养液中回收抗原结合分子的步骤。

[44]抗原结合分子的制备方法，该方法包括以下(a)～(f)的步骤：

(a)获得在高钙离子浓度条件下抗体对抗原的结合活性的步骤；

(b)获得在低钙离子浓度条件下抗体的抗原结合活性的步骤；

(c)选择在(a)中获得的抗原结合活性高于在(b)中获得的抗原结合活性的抗体的步骤；

(d)使编码在(c)中选择的抗体的抗原结合结构域的多核苷酸与编码Fcγ受体结合结构域的多核苷酸连接的步骤，所述Fcγ受体结合结构域是：在pH酸性范围具有人FcRn结合活性，且在pH中性范围条件下Fcγ受体结合活性与EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG的Fc区的Fcγ受体结合活性相比高的Fcγ受体结合结构域；

(f)从在(e)中培养的细胞培养液中回收抗原结合分子的步骤。

[45]抗原结合分子的制备方法，该方法包括以下(a)～(f)的步骤：

(a)获得在pH中性范围条件下抗原结合结构域对抗原的结合活性的步骤；

(b)获得在pH酸性范围条件下抗原结合结构域的抗原结合活性的步骤；

(f)从在(e)中培养的细胞培养液中回收抗原结合分子的步骤。

[46]抗原结合分子的制备方法，该方法包括以下(a)～(f)的步骤：

(a)获得在pH中性范围条件下抗体对抗原的结合活性的步骤；

(b)获得在pH酸性范围条件下抗体对抗原的抗原结合活性的步骤；

(d)使编码在(c)中选择的抗体的抗原结合结构域的多核苷酸与编码Fcγ受体结合结构域的多核苷酸连接的步骤，所述Fcγ受体结合结构域是：在pH酸性范围条件下具有人FcRn结合活性，且在pH中性范围条件下Fcγ受体结合活性与EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG的Fc区的Fcγ受体结合活性相比高的Fcγ受体结合结构域；

(f)从在(e)中培养的细胞培养液中回收抗原结合分子的步骤。

[47][43]～[46]中任一项所述的制备方法，其中，上述抗原为可溶型抗原。

[48][43]～[47]中任一项所述的制备方法，其中，上述Fcγ受体结合结构域含有抗体的Fc区。

[49][48]所述的制备方法，其中，上述Fc区是在Fc区的以EU编号表示的位点中选自以下的至少一个以上的氨基酸与天然型Fc区的对应位点的氨基酸不同的Fc区：221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、243位、244位、245位、246位、247位、249位、250位、251位、254位、255位、256位、258位、260位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、339位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位和440位。

[50][49]所述的制备方法，其中，上述Fc区是在Fc区的以EU编号表示的位点中含有选自以下的至少一个以上的氨基酸的Fc区：

221位的氨基酸为Lys或Tyr中的任一个；

222位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个；

223位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Lys中的任一个；

224位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个；

225位的氨基酸为Glu、Lys或Trp中的任一个；

227位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；

228位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；

230位的氨基酸为Ala、Glu、Gly或Tyr中的任一个；

231位的氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一个；

232位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；

240位的氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一个；

241位的氨基酸为Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中的任一个；

243位的氨基酸为Leu、Glu、Leu、Gln、Arg、Trp或Tyr中的任一个；

244位的氨基酸为His；

245位的氨基酸为Ala；

246位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；

249位的氨基酸为Glu、His、Gln或Tyr中的任一个；

250位的氨基酸为Glu或Gln中的任一个；

251位的氨基酸为Phe；

254位的氨基酸为Phe、Met或Tyr中的任一个；

255位的氨基酸为Glu、Leu或Tyr中的任一个；

256位的氨基酸为Ala、Met或Pro中的任一个；

258位的氨基酸为Asp、Glu、His、Ser或Tyr中的任一个；

260位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；

262位的氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中的任一个；

263位的氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一个；

266位的氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一个；

273位的氨基酸为Phe或Ile中的任一个；

275位的氨基酸为Leu或Trp中的任一个；

276位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

279位的氨基酸为Ala；

281位的氨基酸为Asp、Lys、Pro或Tyr中的任一个；

282位的氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一个；

284位的氨基酸为Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中的任一个；

285位的氨基酸为Asp、Glu、Lys、Gln、Trp或Tyr中的任一个；

286位的氨基酸为Glu、Gly、Pro或Tyr中的任一个；

288位的氨基酸为Asn、Asp、Glu或Tyr中的任一个；

291位的氨基酸为Asp、Glu、Gly、His、Ile、Gln或Thr中的任一个；

292位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中的任一个；

301位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；

302位的氨基酸为Ile；

303位的氨基酸为Asp、Gly或Tyr中的任一个；

304位的氨基酸为Asp、His、Leu、Asn或Thr中的任一个；

305位的氨基酸为Glu、Ile、Thr或Tyr中的任一个；

311位的氨基酸为Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中的任一个；

313位的氨基酸为Phe；

315位的氨基酸为Leu；

317位的氨基酸为Glu或Gln；

323位的氨基酸为Ile；

334位的氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile、Leu、Pro或Thr中的任一个；

336位的氨基酸为Glu、Lys或Tyr中的任一个；

337位的氨基酸为Glu、His或Asn中的任一个；

376位的氨基酸为Ala或Val中的任一个；

377位的氨基酸为Gly或Lys中的任一个；

378位的氨基酸为Asp；

379位的氨基酸为Asn；

380位的氨基酸为Ala、Asn或Ser中的任一个；

382位的氨基酸为Ala或Ile中的任一个；

385位的氨基酸为Glu；

392位的氨基酸为Thr；

396位的氨基酸为Leu；

421位的氨基酸为Lys；

427位的氨基酸为Asn；

428位的氨基酸为Phe或Leu中的任一个；

429位的氨基酸为Met；

434位的氨基酸为Trp；

436位的氨基酸为Ile；以及

440位的氨基酸为Gly、His、Ile、Leu或Tyr中的任一个。

[51][43]～[50]中任一项所述的制备方法，其中，上述Fcγ受体结合结构域是：EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG1、天然型人IgG2、天然型人IgG3或天然型人IgG4的任一个的Fc区。

[52][43]～[51]中任一项所述的制备方法，其中，上述人Fcγ受体为FcγRIa、FcγRIIa(R)、FcγRIIa(H)、FcγRIIb、FcγRIIIa(V)或FcγRIIIa(F)。

[53][43]～[51]中任一项所述的制备方法，其中，上述人Fcγ受体为FcγRIIb。

[54][48]～[53]中任一项所述的制备方法，其中，上述Fc区是在Fc区的以EU编号表示的位点中含有以下的至少一个以上的氨基酸的Fc区：

238位的氨基酸为Asp，或

328位的氨基酸为Glu。

附图说明

[图1]是表示与现有的中和抗体相比，通过给予增强了中性pH下的Fcγ受体结合的的离子浓度依赖性地与抗原结合的抗体，可溶型抗原从血浆中消除的非限定的作用机制的图。

[图2]是显示将H54/L28-IgG1或pH依赖性地与人IL-6受体结合的Fv4-IgG1给予人FcRn转基因小鼠时的该小鼠血浆中的人IL-6受体浓度变化的图。

[图3]是显示将pH依赖性地与人IL-6受体结合的Fv4-IgG1、没有小鼠FcγR结合的Fv4-IgG1的改变体即Fv4-IgG1-F760、增强了小鼠FcγR结合的Fv4-IgG1的改变体即Fv4-IgG1-F1022或Fv4-IgG1的低岩藻糖型抗体即Fv4-IgG1-Fuc给予人FcRn转基因小鼠时的该小鼠血浆中的人IL-6受体浓度变化的图。

[图4]是显示将含有Fv4-IgG1、Fv4-IgG1-F1022和Fv4-IgG1-F1022的改变体即提高了pH酸性范围的FcRn结合的Fv4-IgG1-F1093作为重链的抗原结合分子给予人FcRn转基因小鼠时的该小鼠血浆中的人IL-6受体浓度变化的图。

[图5]是显示将含有Fv4-IgG1、Fv4-IgG1-F1022和Fv4-IgG1-F1022的改变体即提高了pH酸性范围的FcRn结合的Fv4-IgG1-F1093作为重链的抗原结合分子给予人FcRn转基因小鼠时的该小鼠血浆中给予的抗原结合分子的浓度变化的图。

[图6]是显示将Fv4-IgG1、增强了小鼠FcγR结合的(特别是对小鼠FcγRIIb、小鼠FcγRIII的结合得到增强)Fv4-IgG1的改变体即Fv4-IgG1-F1087和增强了小鼠FcγR结合的(特别是对小鼠FcγRI、小鼠FcγRIV的结合得到增强)Fv4-IgG1的改变体即Fv4-IgG1-F1182给予人FcRn转基因小鼠时的该小鼠血浆中的人IL-6受体浓度变化的图。

[图7]是显示将Fv4-IgG1、Fv4-IgG1-F1087和提高了pH酸性范围的FcRn结合的Fv4-IgG1-F1087的改变体即Fv4-IgG1-F1180、Fv4-IgG1-F1412给予人FcRn转基因小鼠时的该小鼠血浆中给予的抗原结合分子的浓度变化的图。

[图8]是显示将Fv4-IgG1、Fv4-IgG1-F1182和提高了pH酸性范围的FcRn结合的Fv4-IgG1-F1182的改变体即Fv4-IgG1-F1181给予人FcRn转基因小鼠时的该小鼠血浆中给予的抗原结合分子的浓度变化的图。

[图9]是显示将Fv4-IgG1、Fv4-IgG1-F1087和提高了pH酸性范围的FcRn结合的Fv4-IgG1-F1087的改变体即Fv4-IgG1-F1180、Fv4-IgG1-F1412给予人FcRn转基因小鼠时的该小鼠血浆中的人IL-6受体浓度变化的图。

[图10]是显示将Fv4-IgG1、Fv4-IgG1-F1182和提高了pH酸性范围的FcRn结合的Fv4-IgG1-F1182的改变体即Fv4-IgG1-F1181给予人FcRn转基因小鼠时的该小鼠血浆中的人IL-6受体浓度变化的图。

[图11]是显示将Fv4-IgG1、Fv4-IgG1-F1782或Fv4-IgG1-F1087给予人FcRn转基因小鼠时的该小鼠血浆中的Fv4-IgG1、Fv4-IgG1-F1782或Fv4-IgG1-F1087的浓度变化结果的图。

[图12]是显示将Fv4-IgG1、Fv4-IgG1-F1782或Fv4-IgG1-F1087给予人FcRn转基因小鼠时的该小鼠血浆中的可溶型人IL-6受体浓度变化结果的图。

[图13]是显示将Fv4-mIgG1、对小鼠FcγRIIb、小鼠FcγRIII的结合增强了的Fv4-mIgG1的改变体即Fv4-mIgG1-mF44和对小鼠FcγRIIb、小鼠FcγRIII的结合进一步增强了的Fv4-mIgG1的改变体即Fv4-mIgG1-mF46给予正常小鼠时的该小鼠血浆中的人IL-6受体浓度变化的图。

[图14]是显示将Fv4-mIgG1、对小鼠FcγRIIb、小鼠FcγRIII的结合增强了的Fv4-mIgG1的改变体即Fv4-mIgG1-mF44和对小鼠FcγRIIb、小鼠FcγRIII的结合进一步增强了的Fv4-mIgG1的改变体即Fv4-mIgG1-mF46给予FcγRIII缺失小鼠时的该小鼠血浆中的人IL-6受体浓度变化的图。

[图15]是显示将Fv4-mIgG1、对小鼠FcγRIIb、小鼠FcγRIII的结合增强了的Fv4-mIgG1的改变体即Fv4-mIgG1-mF44和对小鼠FcγRIIb、小鼠FcγRIII的结合进一步增强了的Fv4-mIgG1的改变体即Fv4-mIgG1-mF46给予Fc受体γ链缺失小鼠时的该小鼠血浆中的人IL-6受体浓度变化的图。

[图16]是显示将Fv4-mIgG1、对小鼠FcγRIIb、小鼠FcγRIII的结合增强了的Fv4-mIgG1的改变体即Fv4-mIgG1-mF44和对小鼠FcγRIIb、小鼠FcγRIII的结合进一步增强了的Fv4-mIgG1的改变体即Fv4-mIgG1-mF46给予FcγRIIb缺失小鼠时的该小鼠血浆中的人IL-6受体浓度变化的图。

[图17]是显示使用具有FcγRIIa多态性(R/H)的来自供体的血小板的血小板聚集测定中奥马珠单抗-G1d-v3/IgE免疫复合体的血小板聚集能力的评价结果的图。

[图18]是显示使用具有FcγRIIa多态性(H/H)的来自供体的血小板的血小板聚集测定中奥马珠单抗-G1d-v3/IgE免疫复合体的血小板聚集能力的评价结果的图。

[图19]是表示评价洗涤血小板的膜表面的CD62p表达的结果的图。用黑色涂覆的图形显示与PBS反应后加入ADP进行刺激时的结果的图，图形的中央未涂覆者显示与免疫复合体反应后用ADP进行刺激时的结果的图。

[图20]是表示评价洗涤血小板的膜表面的活性型整联蛋白表达的结果的图。用黑色涂覆的图形显示与PBS反应后加入ADP进行刺激时的结果的图，图形的中央未涂覆者显示与免疫复合体反应后用ADP进行刺激时的结果的图。

[图21]是显示使用具有FcγRIIa多态性(R/H)的来自供体的血小板的血小板聚集测定中奥马珠单抗-G1d-v3/IgE免疫复合体和奥马珠单抗-BP230/IgE免疫复合体的血小板聚集能力的评价结果的图。

[图22]是表示评价洗涤血小板的膜表面的CD62p表达的结果的图。用灰色涂覆的图形显示与PBS反应后加入ADP进行刺激时的结果的图，实线显示与奥马珠单抗-G1d-v3/IgE免疫复合体、虚线显示与奥马珠单抗-BP230/IgE免疫复合体反应后用ADP进行刺激时的结果。

[图23]是表示评价洗涤血小板的膜表面的活性型整联蛋白表达的结果的图。用灰色涂覆的图形显示与PBS反应后加入ADP进行刺激时的结果的图，实线显示与奥马珠单抗-G1d-v3/IgE免疫复合体、虚线显示与奥马珠单抗-BP230/IgE免疫复合体反应后用ADP进行刺激时的结果。

[图24]横轴表示各PD变体对FcγRIIb的相对结合活性的值，纵轴表示各PD变体对FcγRIIa R型的相对结合活性的值。将各PD变体对各FcγR的结合量的值除以作为对照的导入改变前的抗体IL6R-F652/IL6R-L(IL6R-F652是SEQ ID NO:142规定的含有以EU编号表示的238位的Pro取代成Asp的改变Fc的抗体重链)对各FcγR的结合量的值，进而乘以100倍，将所得的值作为各PD变体对各FcγR的相对结合活性的值。图中的F652点图显示IL6R-F652/IL6R-L的值。

[图25]纵轴显示将各改变导入不具有P238D改变的GpH7-B3(SEQ IDNO:159)/GpL16-k0(SEQ ID NO:160)中而得的改变体对FcγRIIb的相对结合活性的值，横轴显示将各改变导入具有P238D改变的IL6R-F652(SEQ ID NO:142)/IL6R-L中而得的改变体对FcγRIIb的相对结合活性的值。应予说明，将各改变体对FcγRIIb的结合量的值除以导入改变前的抗体对FcγRIIb的结合量的值，进而乘以100倍，将所得的值作为相对结合活性的值。这里，导入到不具有P238D的GpH7-B3/GpL16-k0中的情形、导入到具有P238D的IL6R-F652/IL6R-L中的情形均发挥对FcγRIIb的结合增强效果的改变含有在区A中；在导入到不具有P238D的GpH7-B3/GpL16-k0中的情形发挥对FcγRIIb的结合增强效果，但在导入到具有P238D的IL6R-F652/IL6R-L中的情形不发挥对FcγRIIb的结合增强效果的改变含有在区B中。

[图26]表示Fc(P238D)/FcγRIIb胞外区复合体的晶体结构。

[图27]表示相对于FcγRIIb胞外区以及Fc CH2结构域A，通过基于Cα原子间距的最小二乘法，使Fc(P238D)/FcγRIIb胞外区复合体的晶体结构与Fc(WT)/FcγRIIb胞外区复合体的模型结构叠合的图。

[图28]表示对于Fc(P238D)/FcγRIIb胞外区复合体的晶体结构与Fc(WT)/FcγRIIb胞外区复合体的模型结构，以Fc CH2结构域A以及Fc CH2结构域B各自单独通过基于Cα原子间距的最小二乘法进行叠合，并对P238D附近的详细结构进行比较的图。

[图29]是示出在Fc(P238D)/FcγRIIb胞外区复合体的晶体结构中，在FcCH2结构域A的以EU编号表示的237位的Gly的主链和FcγRIIb的160位的Tyr之间观察到氢键的图。

[图30]是示出在Fc(P238D)/FcγRIIb胞外区复合体的晶体结构中，在FcCH2结构域B的以EU编号表示的270位的Asp和FcγRIIb的131位的Arg之间观察到静电相互作用的图。

[图31]横轴表示各2B变体对FcγRIIb的相对结合活性的值、纵轴表示各2B变体对FcγRIIa R型的相对结合活性的值。将各2B变体对各FcγR的结合量的值除以作为对照的导入改变前的抗体(以EU编号表示的238位的Pro取代成Asp的改变Fc)对各FcγR的结合量的值，进而乘以100倍，将所得的值作为各2B变体对各FcγR的相对结合活性的值。

[图32]是表示Fc(P238D)/FcγRIIb胞外区复合体的晶体结构中Fc链A的以EU编号表示的233位的Glu与FcγRIIb胞外区的其周边残基的图。

[图33]是表示Fc(P238D)/FcγRIIb胞外区复合体的晶体结构中Fc链A的以EU编号表示的330位的Ala与FcγRIIb胞外区的其周边残基的图。

[图34]是示出相对于Fc链B，通过基于Cα原子间距的最小二乘法，使Fc(P238D)/FcγRIIb胞外区复合体和Fc(WT)/FcγRIIIa胞外区复合体的晶体结构叠合，Fc链B的以EU编号表示的271位的Pro的结构的图。

[图35]是通过X射线晶体结构分析确定的Fc(P208)/FcγRIIb胞外区复合体的图。就Fc部分的CH2结构域、CH3结构域各自而言，位于左侧者为结构域A，位于右侧者为结构域B。

[图36]是将通过X射线晶体结构分析确定的Fc(P208)/FcγRIIb胞外区复合体的结构与Fc(WT)/FcγRIIa胞外区复合体的结构(PDB码:3RY6)，在Fc部分CH2结构域A中，通过基于Cα原子间距的最小二乘法进行叠合，并进行了比较的图。图中，用粗线描画的部分为Fc(P208)/FcγRIIb胞外区复合体的结构，用细线描画的部分为Fc(WT)/FcγRIIa胞外区复合体的结构。应予说明，在Fc(WT)/FcγRIIa胞外区复合体的结构中，仅描画了Fc部分的CH2结构域A。

[图37]是显示在Fc(P208)/FcγRIIb胞外区复合体的X射线晶体结构中，与FcγRIIb的160位的Tyr在主链部分形成氢键的Fc部分CH2结构域A的以EU编号表示的237位的Asp附近的详细结构的图。

[图38]是显示在Fc(P208)/FcγRIIb胞外区复合体的X射线晶体结构中，与FcγRIIb的160位的Tyr在主链部分形成氢键的Fc部分CH2结构域A的以EU编号表示的237位的Asp侧链周围的氨基酸残基的结构的图。

[图39]是实施例10中显示的、将Fc(P238D)/FcγRIIb胞外区复合体的X射线晶体结构和Fc(P208)/FcγRIIb胞外区复合体的X射线晶体结构在Fc部分CH2结构域B中通过基于Cα原子间距的最小二乘法进行叠合，对于以EU编号表示的266位～271位的环周边进行比较的图。本环中，Fc(P208)与Fc(P238D)比较，以EU编号表示的268位具有H268D改变，以EU编号表示的271位具有P271G改变。

[图40]是在Fc(P208)/FcγRIIb胞外区复合体的X射线晶体结构中，将Fc部分CH2结构域B的Ser239周边的结构与通过X射线晶体结构分析而得到的作为2Fo-Fc系数的电子密度一起显示的图。

[图41]是将通过X射线晶体结构分析确定的Fc(P208)/FcγRIIaR胞外区复合体的立体结构与Fc(P208)/FcγRIIb胞外区复合体的立体结构，通过基于Cα原子间距的最小二乘法进行叠合，并进行了比较的图。

[图42]是将Fc(P208)/FcγRIIaR胞外区复合体的X射线晶体结构和Fc(P208)/FcγRIIb胞外区复合体的X射线晶体结构，在Fc部分CH2结构域A的以EU编号表示的237位的Asp附近，与通过X射线晶体结构分析而得到的作为2Fo-Fc系数的电子密度一起进行比较的图。

[图43]是将Fc(P208)/FcγRIIaR胞外区复合体的X射线晶体结构和Fc(P208)/FcγRIIb胞外区复合体的X射线晶体结构，在Fc部分CH2结构域B的以EU编号表示的237位的Asp附近，与通过X射线晶体结构分析而得到的作为2Fo-Fc系数的电子密度一起进行比较的图。

[图44]是将G1d和G4d的恒定区序列进行比较的图。图中，用粗框围起来的氨基酸显示在G1d和G4d中为不同的氨基酸残基的位点。

[图45]是显示在正常小鼠中的GA2-IgG1和GA2-F1087的血浆中抗体浓度变化的图。

[图46]是显示给予了GA2-IgG1和GA2-F1087的正常小鼠中的血浆中hIgA浓度变化的图。

[图47]是显示在C57BL/6J小鼠中的278-IgG1和278-F1087的血浆中抗体浓度变化的图。

[图48]是显示给予了278-IgG1和278-F1087的C57BL/6J小鼠中的血浆中hIgE(Asp6)浓度变化的图。

[图49]是表示通过X射线晶体结构分析而确定的6RL#9抗体的Fab片段的重链CDR3的结构的图。(i)显示在钙离子存在的结晶条件下得到的晶体结构的重链CDR3。(ii)显示在钙离子不存在的结晶条件下得到的晶体结构的重链CDR3。

[图50]是显示给予了H54/L28-IgG1抗体、FH4-IgG1抗体和6RL#9-IgG1抗体的正常小鼠的血浆中的各抗体浓度变化的图。

[图51]是显示给予了H54/L28-IgG1抗体、FH4-IgG1抗体和6RL#9-IgG1抗体的正常小鼠的血浆中的可溶型人IL-6受体(hsIL-6R)的浓度变化的图。

[图52]是显示含有人Vk5-2序列的抗体和含有人Vk5-2序列中的糖链附加序列被改变的hVk5-2_L65序列的抗体的离子交换层析图的图。实线表示含有人Vk5-2序列的抗体(重链：CIM_H、SEQ ID NO:67，和轻链：hVk5-2、SEQ ID NO:4)的层析图，虚线表示具有hVk5-2_L65序列的抗体(重链：CIM_H(SEQ ID NO:67)、轻链：hVk5-2_L65(SEQ ID NO:70))的层析图。

[图53A]是含有LfVk1_Ca序列的抗体(重链：GC_H、SEQ ID NO:51，和轻链：LfVk1_Ca、SEQ ID NO:83)和含有LfVk1_Ca序列中的Asp(D)残基改变为Ala(A)残基的序列的抗体在5℃保存后(实线)或50℃保存后(虚线)的离子交换层析图。是将分别在5℃保存后的离子交换层析图的最高峰作为主峰并用主峰进行y轴标准化的图。是显示含有LfVk1_Ca(SEQ ID NO:83)作为轻链的抗体的层析图的图。

[图53B]是显示含有LfVk1_Ca1(SEQ ID NO:85)作为轻链的抗体的层析图的图。

[图53C]是显示含有LfVk1_Ca2(SEQ ID NO:86)作为轻链的抗体的层析图的图。

[图53D]是显示含有LfVk1_Ca3(SEQ ID NO:87)作为轻链的抗体的层析图的图。

[图54A]是含有LfVk1_Ca序列的抗体(重链：GC_H、SEQ ID NO:51，和轻链：LfVk1_Ca、SEQ ID NO:83)和含有LfVk1_Ca序列中的30位(Kabat编号)的Asp(D)残基改变为Ser(S)残基的LfVk1_Ca6序列(重链：GC_H、SEQID NO:51，和轻链：LfVk1_Ca6、SEQ ID NO:88)的抗体在5℃保存后(实线)或50℃保存后(虚线)的离子交换层析图。是将分别在5℃保存后的离子交换层析图的最高峰作为主峰并用主峰进行y轴标准化的图。是显示含有LfVk1_Ca(SEQ ID NO:83)作为轻链的抗体的层析图的图。

[图54B]是显示含有LfVk1_Ca6(SEQ ID NO:88)作为轻链的抗体的层析图的图。

[图55]是显示从导入了Ca依赖性地与抗原结合的抗体基因文库的大肠杆菌中分离的290克隆的序列信息的氨基酸分布(表示为Library)与设计的氨基酸分布(表示为Design)的关系的图。横轴表示以Kabat编号表示的氨基酸的位点。纵轴表示氨基酸分布比例。

[图56]是表示在高钙离子浓度条件(1.2mM)下的抗IL-6R抗体(托珠单抗)、6RC1IgG_010抗体、6RC1IgG_012抗体和6RC1IgG_019抗体的传感图的图。横轴显示时间，纵轴显示RU值。

[图57]是表示在低钙离子浓度条件(3μM)下的抗IL-6R抗体(托珠单抗)、6RC1IgG_010抗体、6RC1IgG_012抗体和6RC1IgG_019抗体的传感图的图。横轴显示时间，纵轴显示RU值。

[图58]是显示从导入了pH依赖性地与抗原结合的抗体基因文库的大肠杆菌中分离的132克隆的序列信息的氨基酸分布(表示为Library)与设计的氨基酸分布(表示为Design)的关系的图。横轴表示以Kabat编号表示的氨基酸的位点。纵轴表示氨基酸分布比例。

[图59]是表示抗IL-6R抗体(托珠单抗)、6RpH#01抗体、6RpH#02抗体和6RpH#03抗体在pH7.4的传感图的图。横轴显示时间，纵轴显示RU值。

[图60]是表示抗IL-6R抗体(托珠单抗)、6RpH#01抗体、6RpH#02抗体和6RpH#03抗体在pH6.0的传感图的图。横轴显示时间，纵轴显示RU值。

[图61A]是表示对于天然型Fc和改变Fc、从15或30个独立的风湿病患者中分离的血清的ECL反应的图表的图。图表分别表示对天然型Fc(图61A)Fv4-YTE(图61B)、Fv4-F1166(＝YTE+Q438R/S440E)(图61C)、Fv4-F1167(＝YTE+S424N)(图61D)、Fv4-LS(图61E)、Fv4-F1170(＝LS+Q438R/S440E)(图61F)、Fv4-F1171(＝LS+S424N)(图61G)、Fv4-N434H(图61H)、Fv4-F1172(＝N434H+Q438R/S440E)(图61I)、Fv4-F1173(＝N434H+S424N)(图61J)的ECL反应的图表。

[图61B]是图61A的续图。

[图61C]是图61B的续图。

[图61D]是图61C的续图。

[图61E]是图61D的续图。

[图61F]是图61E的续图。

[图61G]是图61F的续图。

[图61H]是图61G的续图。

[图61I]是图61H的续图。

[图61J]是图61I的续图。

[图62A]是表示对于改变Fc、从30个独立的风湿病患者中分离的血清的ECL反应的图表的图。图表分别表示对Fv4-LS(图62A)、Fv4-F1380(图62B)、Fv4-F1384(图62C)、Fv4-F1385(图62D)、Fv4-F1386(图62E)、Fv4-F1388(图62F)和Fv4-F1389(图62G)的ECL反应的图表。

[图62B]是图62A的续图。

[图62C]是图62B的续图。

[图62D]是图62C的续图。

[图62E]是图62D的续图。

[图62F]是图62E的续图。

[图62G]是图62F的续图。

具体实施方式

提供以下的定义和详细说明来使本说明书中说明的本发明容易理解。

氨基酸

本说明书中，例如，如Ala/A、Leu/L、Arg/R、Lys/K、Asn/N、Met/M、Asp/D、Phe/F、Cys/C、Pro/P、Gln/Q、Ser/S、Glu/E、Thr/T、Gly/G、Trp/W、His/H、Tyr/Y、Ile/I、Val/V所表示，将氨基酸以单字母密码或三字母密码或者这两者标记。

氨基酸的改变

为了改变抗原结合分子的氨基酸序列中的氨基酸，可适宜采用位点特异性诱变法(Kunkel等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82,488-492))或重叠延伸PCR等公知的方法。通过这些公知的方法可适宜进行氨基酸的添加、缺失和/或取代。取代氨基酸残基是指以通过取代成其它氨基酸残基例如就以下(a)～(c)的方面进行改变为目的：

(a)折叠结构或螺旋结构的区域中的多肽的主链结构；

(b)靶位点中的电荷或疏水性；或

(c)侧链的大小。

氨基酸残基根据其结构所含的侧链的特性被分类为以下的组：

(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；

(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；

(3)酸性：Asp、Glu；

(4)碱性：His、Lys、Arg；

(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；以及

(6)芳族性：Trp、Tyr、Phe。

这些的在各组内的氨基酸残基的取代称为保守取代，而在不同组之间的氨基酸残基的取代称为非保守取代。本发明中的取代可以是保守取代，也可以是非保守取代，还可以是保守保守取代与非保守取代的组合。此外，作为取代成天然氨基酸以外的氨基酸的氨基酸改变方法，也可采用多种公知的方法(Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.(2006)35,225-249、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2003)100(11),6353-6357)。还可适宜使用例如：含有作为终止密码子之一的UAG密码子(琥珀密码子)的互补琥珀抑制基因tRNA上连接有非天然氨基酸而成的tRNA的无细胞翻译系统(Clover Direct(ProteinExpress))等。

此外，作为表示氨基酸改变的表述，可适宜采用：在表示特定位置的数字的前后使用改变前和改变后的氨基酸的单字母密码的表述。例如，在抗体恒定区所含的Fc区中加入氨基酸取代时，所使用的P238D的改变表示以EU编号表示的238位的Pro取代成Asp。即，数字表示以EU编号表示的氨基酸的位置，其之前记载的氨基酸的单字母密码表示取代前的氨基酸，其之后记载的氨基酸的单字母密码表示取代后的氨基酸。

和/或

本说明书中，“和/或”用语的含义是指熟语“和/或”的前后用语的组合，含有“和”与“或”适宜组合的所有组合。具体而言，例如，“326位、328位和/或428位的氨基酸被取代”包括以下的氨基酸的改变的变异：

(a)326位，(b)328位，(c)428位，(d)326位和328位，(e)326位和428位，(f)328位和428位，(g)326位、328位和428位。

抗原

本说明书中，“抗原”只要含有抗原结合结构域所结合的表位，则其结构并不限于特定的结构。换而言之，抗原可以是无机物也可以是有机物，优选以本发明的抗原结合分子可结合的状态存在于机体的体液中的可溶型抗原。作为抗原，可例示如下所述的分子：17-IA、4-1BB、4Dc、6-酮-PGF1a、8-异-PGF2a、8-氧代-dG、A1腺苷受体、A33、ACE、ACE-2、激活素、激活素A、激活素AB、激活素B、激活素C、激活素RIA、激活素RIA ALK-2、激活素RIB ALK-4、激活素RIIA、激活素RIIB、ADAM、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、地址素(Addressins)、aFGF、ALCAM、ALK、ALK-1、ALK-7、α-1-抗胰蛋白酶、α-V/β-1拮抗剂、ANG、Ang、APAF-1、APE、APJ、APP、APRIL、AR、ARC、ART、Artemin、抗Id、ASPARTIC、心房钠尿因子、av/b3整联蛋白、Axl、b2M、B7-1、B7-2、B7-H、B-淋巴细胞刺激因子(BlyS)、BACE、BACE-1、Bad、BAFF、BAFF-R、Bag-1、BAK、Bax、BCA-1、BCAM、Bcl、BCMA、BDNF、b-ECGF、bFGF、BID、Bik、BIM、BLC、BL-CAM、BLK、BMP、BMP-2、BMP-2a、BMP-3、成骨蛋白(Osteogenin)、BMP-4、BMP-2b、BMP-5、BMP-6、Vgr-1、BMP-7(OP-1)、BMP-8(BMP-8a、OP-2)、BMPR、BMPR-IA(ALK-3)、BMPR-IB(ALK-6)、BRK-2、RPK-1、BMPR-II(BRK-3)、BMP、b-NGF、BOK、蛙皮素、骨衍生神经营养因子、BPDE、BPDE-DNA、BTC、补体因子3(C3)、C3a、C4、C5、C5a、C10、CA125、CAD-8、降钙素、cAMP、癌胚抗原(CEA)、癌相关抗原、组织蛋白酶A、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C/DPPI、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶H、组织蛋白酶L、组织蛋白酶O、组织蛋白酶S、组织蛋白酶V、组织蛋白酶X/Z/P、CBL、CCI、CCK2、CCL、CCL1、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9/10、CCR、CCR1、CCR10、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CD1、CD2、CD3、CD3E、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27L、CD28、CD29、CD30、CD30L、CD32、CD33(p67蛋白)、CD34、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD49a、CD52、CD54、CD55、CD56、CD61、CD64、CD66e、CD74、CD80(B7-1)、CD89、CD95、CD123、CD137、CD138、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD152、CD164、CEACAM5、CFTR、cGMP、CINC、肉毒杆菌毒素、产气荚膜梭菌(Clostridium Perfringens)毒素、CKb8-1、CLC、CMV、CMVUL、CNTF、CNTN-1、COX、C-Ret、CRG-2、CT-1、CTACK、CTGF、CTLA-4、CX3CL1、CX3CR1、CXCL、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCR、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、细胞角蛋白肿瘤相关抗原、DAN、DCC、DcR3、DC-SIGN、补体抑制因子(衰变促进因子)、脱(1-3)-IGF-I(脑IGF-1)、Dhh、地高辛、DNAM-1、Dnase、Dpp、DPPIV/CD26、Dtk、ECAD、EDA、EDA-A1、EDA-A2、EDAR、EGF、EGFR(ErbB-1)、EMA、EMMPRIN、ENA、内皮素受体、脑啡肽酶、eNOS、Eot、Eotaxin1、EpCAM、EphrinB2/EphB4、EPO、ERCC、E-选择素、ET-1、因子IIa、因子VII、因子VIIIc、因子IX、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、Fas、FcR1、FEN-1、铁蛋白、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF3、FGF-8、FGFR、FGFR-3、纤维蛋白、FL、FLIP、Flt-3、Flt-4、促卵胞激素、CXXXC趋化因子、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、G250、Gas6、GCP-2、GCSF、GD2、GD3、GDF、GDF-1、GDF-3(Vgr-2)、GDF-5(BMP-14、CDMP-1)、GDF-6(BMP-13、CDMP-2)、GDF-7(BMP-12、CDMP-3)、GDF-8(Myostatin，肌肉生长抑制素)、GDF-9、GDF-15(MIC-1)、GDNF、GDNF、GFAP、GFRa-1、GFR-α1、GFR-α2、GFR-α3、GITR、胰高血糖素、Glut4、糖蛋白IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)、GM-CSF、gp130、gp72、GRO、生长激素释放因子、半抗原(NP-cap或NIP-cap)、HB-EGF、HCC、HCMVgB包膜糖蛋白、HCMVgH包膜糖蛋白、HCMV UL、造血生长因子(HGF)、Hep B gp120、乙酰肝素酶、Her2、Her2/neu(ErbB-2)、Her3(ErbB-3)、Her4(ErbB-4)、单纯疱疹病毒(HSV)gB糖蛋白、HSVgD糖蛋白、HGFA、高分子量黑色素瘤相关抗原(High molecular weight melanoma-associated antigen)(HMW-MAA)、HIVgp120、HIV IIIB gp120V3环、HLA、HLA-DR、HM1.24、HMFG PEM、HRG、Hrk、人心肌球蛋白、人巨细胞病毒(HCMV)、人生长激素(HGH)、HVEM、I-309、IAP、ICAM、ICAM-1、ICAM-3、ICE、ICOS、IFNg、Ig、IgA受体、IgE、IGF、IGF结合蛋白、IGF-1R、IGFBP、IGF-I、IGF-II、IL、IL-1、IL-1R、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-5R、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-18R、IL-23、干扰素(INF)-α、INF-β、INF-γ、抑制素、iNOS、胰岛素A链、胰岛素B链、胰岛素样生长因子1、整联蛋白α2、整联蛋白α3、整联蛋白α4、整联蛋白α4/β1、整联蛋白α4/β7、整联蛋白α5(αV)、整联蛋白α5/β1、整联蛋白α5/β3、整联蛋白α6、整联蛋白β1、整联蛋白β2、干扰素γ、IP-10、I-TAC、JE、激肽释放酶2、激肽释放酶5、激肽释放酶6、激肽释放酶11、激肽释放酶12、激肽释放酶14、激肽释放酶15、激肽释放酶L1、激肽释放酶L2、激肽释放酶L3、激肽释放酶L4、KC、KDR、角质形成细胞生长因子(KGF)、层连蛋白5、LAMP、LAP、LAP(TGF-1)、潜伏型TGF-1、潜伏型TGF-1bp1、LBP、LDGF、LECT2、Lefty、Lewis-Y抗原、Lewis-Y相关抗原、LFA-1、LFA-3、Lfo、LIF、LIGHT、脂蛋白、LIX、LKN、Lptn、L-选择素、LT-a、LT-b、LTB4、LTBP-1、肺表面、促黄体激素、淋巴毒素β受体、Mac-1、MAdCAM、MAG、MAP2、MARC、MCAM、MCAM、MCK-2、MCP、M-CSF、MDC、Mer、金属蛋白酶、MGDF受体、MGMT、MHC(HLA-DR)、MIF、MIG、MIP、MIP-1-α、MK、MMAC1、MMP、MMP-1、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP-24、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MPIF、Mpo、MSK、MSP、粘蛋白(Muc1)、MUC18、缪勒管抑制物质、Mug、MuSK、NAIP、NAP、NCAD、N-C粘附因子、NCA90、NCAM、NCAM、脑啡肽酶、神经营养素-3、神经营养素-4或神经营养素-6、Neurturin、神经生长因子(NGF)、NGFR、NGF-β、nNOS、NO、NOS、Npn、NRG-3、NT、NTN、OB、OGG1、OPG、OPN、OSM、OX40L、OX40R、p150、p95、PADPr、甲状旁腺激素、PARC、PARP、PBR、PBSF、PCAD、P-钙黏蛋白、PCNA、PDGF、PDGF、PDK-1、PECAM、PEM、PF4、PGE、PGF、PGI2、PGJ2、PIN、PLA2、胎盘碱性磷酸酶(PLAP)、PlGF、PLP、PP14、胰岛素原、松弛素原、蛋白C、PS、PSA、PSCA、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、PTEN、PTHrp、Ptk、PTN、R51、RANK、RANKL、RANTES、RANTES、松弛素A链、松弛素B链、肾素、呼吸道合胞体病毒(RSV)F、RSV Fgp、Ret、类风湿因子、RLIP76、RPA2、RSK、S100、SCF/KL、SDF-1、SERINE、血清白蛋白、sFRP-3、Shh、SIGIRR、SK-1、SLAM、SLPI、SMAC、SMDF、SMOH、SOD、SPARC、Stat、STEAP、STEAP-II、TACE、TACI、TAG-72(肿瘤相关糖蛋白-72)、TARC、TCA-3、T细胞受体(例如，T细胞受体α/β)、TdT、TECK、TEM1、TEM5、TEM7、TEM8、TERT、睾丸PLAP样碱性磷酸酶、TfR、TGF、TGF-α、TGF-β、TGF-β泛特异性(TGF-β Pan Specific)、TGF-βRI(ALK-5)、TGF-βRII、TGF-βRIIb、TGF-βRIII、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5、凝血酶、胸腺Ck-1、促甲状腺激素、Tie、TIMP、TIQ、组织因子、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、TNF、TNF-α、TNF-αβ、TNF-β2、TNFc、TNF-RI、TNF-RII、TNFRSF10A(TRAIL R1Apo-2、DR4)、TNFRSF10B(TRAIL R2DR5、KILLER、TRICK-2A、TRICK-B)、TNFRSF10C(TRAIL R3DcR1、LIT、TRID)、TNFRSF10D(TRAIL R4DcR2、TRUNDD)、TNFRSF11A(RANK ODF R、TRANCE R)、TNFRSF11B(OPGOCIF、TR1)、TNFRSF12(TWEAK R FN14)、TNFRSF13B(TACI)、TNFRSF13C(BAFF R)、TNFRSF14(HVEM ATAR、HveA、LIGHT R、TR2)、TNFRSF16(NGFR p75NTR)、TNFRSF17(BCMA)、TNFRSF18(GITR AITR)、TNFRSF19(TROY TAJ、TRADE)、TNFRSF19L(RELT)、TNFRSF1A(TNF RICD120a、p55-60)、TNFRSF1B(TNF RII CD120b、p75-80)、TNFRSF26(TNFRH3)、TNFRSF3(LTbR TNF RIII、TNFC R)、TNFRSF4(OX40ACT35、TXGP1R)、TNFRSF5(CD40p50)、TNFRSF6(Fas Apo-1、APT1、CD95)、TNFRSF6B(DcR3M68、TR6)、TNFRSF7(CD27)、TNFRSF8(CD30)、TNFRSF9(4-1BB CD137、ILA)、TNFRSF21(DR6)、TNFRSF22(DcTRAIL R2TNFRH2)、TNFRST23(DcTRAIL R1TNFRH1)、TNFRSF25(DR3Apo-3、LARD、TR-3、TRAMP、WSL-1)、TNFSF10(TRAIL Apo-2配体、TL2)、TNFSF11(TRANCE/RANK配体ODF、OPG配体)、TNFSF12(TWEAK Apo-3配体、DR3配体)、TNFSF13(APRIL TALL2)、TNFSF13B(BAFF BLYS、TALL1、THANK、TNFSF20)、TNFSF14(LIGHT HVEM配体、LTg)、TNFSF15(TL1A/VEGI)、TNFSF18(GITR配体AITR配体、TL6)、TNFSF1A(TNF-a黏附素(Conectin)、DIF、TNFSF2)、TNFSF1B(TNF-b LTa、TNFSF1)、TNFSF3(LTb TNFC 、p33)、TNFSF4(OX40配体gp34、TXGP1)、TNFSF5(CD40配体CD154、gp39、HIGM1、IMD3、TRAP)、TNFSF6(Fas配体Apo-1配体、APT1配体)、TNFSF7(CD27配体CD70)、TNFSF8(CD30配体CD153)、TNFSF9(4-1BB配体CD137配体)、TP-1、t-PA、Tpo、TRAIL、TRAILR、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRANCE、运铁蛋白受体、TRF、Trk、TROP-2、TSG、TSLP、肿瘤相关抗原CA125、肿瘤相关抗原表达病毒Y相关碳水化物、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、尿激酶、VCAM、VCAM-1、VECAD、VE-钙黏蛋白、VE-钙黏蛋白-2、VEFGR-1(flt-1)、VEGF、VEGFR、VEGFR-3(flt-4)、VEGI、VIM、病毒抗原、VLA、VLA-1、VLA-4、VNR整联蛋白、冯维勒布兰德因子、WIF-1、WNT1、WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16、XCL1、XCL2、XCR1、XCR1、XEDAR、XIAP、XPD、HMGB1、IgA、Aβ、CD81、CD97、CD98、DDR1、DKK1、EREG、Hsp90、IL-17/IL-17R、IL-20/IL-20R、氧化LDL、PCSK9、激肽释放酶原、RON、TMEM16F、SOD1、嗜铬粒蛋白A、嗜铬粒蛋白B、tau、VAP1、高分子激肽原、IL-31、IL-31R、Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3、Nav1.4、Nav1.5、Nav1.6、Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9、EPCR、C1、C1q、C1r、C1s、C2、C2a、C2b、C3、C3a、C3b、C4、C4a、C4b、C5、C5a、C5b、C6、C7、C8、C9、因子B、因子D、因子H、备解素、壳硬蛋白(sclerostin)、血纤蛋白原、血纤蛋白、凝血酶原、凝血酶、组织因子、因子V、因子Va、因子VII、因子VIIa、因子VIII、因子VIIIa、因子IX、因子IXa、因子X、因子Xa、因子XI、因子XIa、因子XII、因子XIIa、因子XIII、因子XIIIa、TFPI、抗凝血酶III、EPCR、血栓调节蛋白、TAPI、tPA、纤溶酶原、纤溶酶、PAI-1、PAI-2、GPC3、多配体蛋白聚糖-1、多配体蛋白聚糖-2、多配体蛋白聚糖-3、多配体蛋白聚糖-4、LPA、S1P、乙酰胆碱受体、AdipoR1、AdipoR2、ADP核糖基环化酶-1、α-4/β-7整联蛋白、α-5/β-1整联蛋白、α-v/β-6整联蛋白、α/β1整联蛋白、血管形成素配体-2、Angptl2、炭疽、钙粘蛋白、碳酸酐酶-IX、CD105、CD155、CD158a、CD37、CD49b、CD51、CD70、CD72、Claudin18、艰难梭菌毒素、CS1、δ-样蛋白配体4、DHICA氧化酶、Dickkopf-1配体、二肽基肽酶IV、EPOR、RSV的F蛋白、因子Ia、FasL、叶酸受体α、胰高血糖素受体、胰高血糖素样肽1受体、谷氨酸羧肽酶II、GMCSFR、丙型肝炎病毒E2糖蛋白、铁调素(Hepcidin)、IL-17受体、IL-22受体、IL-23受体、IL-3受体、Kit酪氨酸激酶、富亮氨酸a-2糖蛋白1(LRG1)、溶鞘脂受体、膜糖蛋白OX2、间皮素(Mesothelin)、MET、MICA、MUC-16、髓鞘相关糖蛋白、神经毡蛋白-1、神经毡蛋白-2、Nogo受体、PLXNA1、PLXNA2、PLXNA3、PLXNA4A、PLXNA4B、PLXNB1、PLXNB2、PLXNB3、PLXNC1、PLXND1、编程性细胞死亡配体1、前蛋白转化酶PC9、P-选择素糖蛋白配体-1、RAGE、Reticulon4、RF、RON-8、SEMA3A、SEMA3B、SEMA3C、SEMA3D、SEMA3E、SEMA3F、SEMA3G、SEMA4A、SEMA4B、SEMA4C、SEMA4D、SEMA4F、SEMA4G、SEMA5A、SEMA5B、SEMA6A、SEMA6B、SEMA6C、SEMA6D、SEMA7A、志贺样毒素II、1-磷酸鞘氨醇受体-1、ST2、葡萄球菌脂膜酸、生腱蛋白、TG2、胸腺基质淋巴细胞生成素(Thymic stromal lymphoprotein)受体、TNF超家族受体12A、跨膜糖蛋白NMB、TREM-1、TREM-2、滋养层糖蛋白、TSH受体、TTR、微管蛋白、ULBP2以及用于激素和生长因子的受体中在机体的体液中不锚定在细胞上而以可溶型存在的分子。在受体中，例如，在细胞表面表达的受体等由于包括蛋白酶的消化等在内的任何机制而存在于机体的体液中的可溶型抗原也适宜作为本发明的可溶型抗原。作为这样的分子的实例，可例示本说明书中记载的可溶型IL-6R分子(J.Immunol.(1994)152,4958-4968)或CD20、CD52(Br.J.Haematol.(2003)123(5),850-857)等。此外，不仅在机体内固有表达的分子，而且利用病毒等的感染性生物或在这些生物上提呈的抗原、或者属于朊蛋白等感染性分子存在于机体的体液中的可溶型抗原也可作为本发明的可溶型抗原例示。作为体液，可适宜举出：血液、血浆、血清、尿、淋巴液、唾液、泪液等的体液等。

表位

表示存在于抗原中的抗原决定簇的表位，意指本说明书中公开的抗原结合分子中的抗原结合结构域所结合的抗原上的位点。所以，例如表位可通过其结构来定义。此外，也可以通过相对于识别该表位的抗原结合分子中的抗原结合活性来定义该表位。抗原为肽或者多肽时，还可以通过构成表位的氨基酸残基来规定表位。此外，表位为糖链时，也可以通过特定的糖链结构来规定表位。

线性表位是下述表位，其含有氨基酸一级序列被识别的表位。线性表位在固有序列中典型地含有至少3个氨基酸，和最普通地含有至少5个、例如约8至约10个、6至20个氨基酸。

与线性表位相对地，立体结构表位是这样的表位，其中，含有表位的氨基酸的一级序列并非是被识别表位的单一规定成分(例如，氨基酸的一级序列不需要被规定表位的抗体所识别的表位)。立体结构表位相对于线性表位可以含有增大数目的氨基酸。关于立体结构表位的识别，抗体识别肽或蛋白质的三维结构。例如，蛋白质分子折叠形成三维结构时，形成立体结构表位的某氨基酸和/或多肽主链变得并排，使得抗体可以识别表位。确定表位的立体结构的方法包括例如：X射线晶体学、二维核磁共振分光学以及位点特异性旋转标记和电子顺磁共振分光学，但并非限定于此。例如，参照Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology(1996)、第66卷、Morris(编)。

结合活性

下述例示了通过含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子来确认对表位的结合的方法，但通过含有针对IL-6R以外的抗原的抗原结合结构域的被测抗原结合分子来确认对表位的结合的方法也可以基于下述例示而适宜实施。

例如，含有针对IL-6R抗原结合结构域的被测抗原结合分子识别存在于IL-6R分子中的线性表位，可通过如下所示操作来确认。为了上述目的，合成了含有构成IL-6R的胞外结构域的氨基酸序列的线性肽。该肽可化学地合成。或者，可以利用IL-6R的cDNA中编码相当于胞外结构域的氨基酸序列的区域，通过基因工程技术得到。其次，对含有构成胞外结构域的氨基酸序列的线性肽和含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子的结合活性进行评价。例如，通过以固定化线性肽作为抗原的ELISA，可以评价该抗原结合分子对该肽的结合活性。或者，基于该抗原结合分子对IL-6R表达细胞的结合中的、线性肽造成的抑制水平，也可以明确对线性肽的结合活性。通过这些试验，可以明确该抗原结合分子对线性肽的结合活性。

此外，含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子识别立体结构表位，这可如下进行确认。为了上述目的，制备了表达IL-6R的细胞。可举出：含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子在与IL-6R表达细胞接触时强烈地与该细胞结合，但该抗原结合分子与经固定化的含有构成IL-6R胞外结构域的氨基酸序列的线性肽实质上不结合的情形等。这里，实质上不结合是指，对人IL-6R表达细胞的结合活性的80％以下、通常50％以下、优选30％以下、特别优选15％以下的结合活性。

作为测定对含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子的IL-6R表达细胞的结合活性的方法，可举出例如：Antibodies A LaboratoryManual记载的方法(Ed Harlow,David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)359-420)。即，可通过以IL-6R表达细胞为抗原的ELISA或FACS(荧光活化细胞分选(fluorescence activated cell sorting))的原理来进行评价。

在ELISA形式中，对含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子的IL-6R表达细胞的结合活性，通过比较由酶反应生成的信号水平而定量地进行评价。即，将被测抗原结合分子添加至固定有IL-6R表达细胞的ELISA板，利用识别被测抗原结合分子的酶标记抗体检测与细胞结合的被测抗原结合分子。或者在FACS中，制作被测抗原结合分子的稀释系列，确定相对于IL-6R表达细胞的抗体结合效价(titer)，由此可以比较被测抗原结合分子对IL-6R表达细胞的结合活性。

被测抗原结合分子与悬浮于缓冲液等中的细胞表面上表达的抗原的结合可以通过流式细胞仪检测。作为流式细胞仪，已知例如如下的装置：

FACSCantoTM II

FACSAriaTM

FACSArrayTM

FACSVantageTM SE

FACSCaliburTM(均为BD Biosciences公司的商品名)

EPICS ALTRA HyPerSort

Cytomics FC500

EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC

Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC(均为Beckman Coulter公司的商品名)。

例如，作为含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子的抗原结合活性的优选测定方法的一例，可举出以下方法。首先，将表达IL-6R的细胞与被测抗原结合分子反应，将其用识别被测抗原结合分子的经FITC标记的二次抗体染色。将被测抗原结合分子用适宜的优选缓冲液稀释，由此将该抗原结合分子制备为所期望的浓度来使用。例如，能够以10μg/ml至10ng/ml之间的任意浓度使用。接着，通过FACSCalibur(BD公司)测定荧光强度和细胞数。抗体对该细胞的结合量被反映为使用CELL QUESTSoftware(BD公司)进行分析而得的荧光强度即几何平均值。即，通过得到该几何平均值，能够测定由被测抗原结合分子的结合量表示的被测抗原结合分子的结合活性。

含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子与某抗原结合分子共有表位，这可通过两者对相同表位的竞争来确认。抗原结合分子间的竞争通过交叉阻断试验等来检测。例如竞争ELISA试验是优选的交叉阻断试验。

具体而言，在交叉阻断试验中，包被微量滴定板的孔上的IL-6R蛋白在候选竞争抗原结合分子的存在下或不存在下经过预培养后，添加被测抗原结合分子。与孔中的IL-6R蛋白结合的被测抗原结合分子的量与竞争结合相同表位的候选竞争抗原结合分子的结合能力间接地相关。即，竞争抗原结合分子对相同表位的亲和性越大，则被测抗原结合分子对包被有IL-6R蛋白的孔的结合活性越降低。

经由IL-6R蛋白而与孔结合的被测抗原结合分子的量可以通过预先标记抗原结合分子来容易地测定。例如，经生物素标记的抗原结合分子通过使用亲和素过氧化酶结合物和合适的底物来测定。利用过氧化酶等酶标记的交叉阻断试验特别被称为竞争ELISA试验。抗原结合分子能够用可检测或可测定的其它标记物质进行标记。具体而言，公知的是放射标记或荧光标记等。

与在候选竞争抗原结合分子的不存在下实施的对照试验中得到的结合活性进行比较，竞争抗原结合分子只要可以阻断至少20％、优选至少20～50％、进一步优选至少50％的含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子的结合，则该被测抗原结合分子是与竞争抗原结合分子实质上结合于相同表位或者竞争结合于相同的表位的抗原结合分子。

在鉴定含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子所结合的表位的结构时，被测抗原结合分子与对照抗原结合分子共有表位，这可通过比较两者的抗原结合分子对在构成该表位的肽中导入氨基酸突变而得的肽的结合活性来进行评价。

作为这种测定结合活性的方法，例如，在前述ELISA形式中，可通过比较被测抗原结合分子和对照抗原结合分子对导入了突变的线性肽的结合活性来测定。作为ELISA以外的方法，通过使被测抗原结合分子与对照抗原结合分子流过该柱后，对洗脱液中洗脱的抗原结合分子进行定量，也可以测定对结合于柱的该突变肽的结合活性。使突变肽作为例如与GST的融合肽的形式而吸附于柱的方法是公知的。

此外，鉴定的表位为立体表位时，被测抗原结合分子与对照抗原结合分子共有表位，这可通过以下方法来评价。首先，制备表达IL-6R的细胞和表达在表位中导入了突变的IL-6R的细胞。将这些细胞悬浮于PBS等适当的缓冲液中，向所得细胞悬浮液中添加被测抗原结合分子和对照抗原结合分子。其次，用合适的缓冲液洗涤，向所得细胞悬浮液中添加能够识别被测抗原结合分子和对照抗原结合分子的经FITC标记的抗体。被标记抗体染色的细胞的荧光强度和细胞数通过FACSCalibur(BD公司)来测定。被测抗原结合分子和对照抗原结合分子的浓度通过合适的缓冲液适当稀释，由此可以制备为所期望的浓度来使用。例如，能够以10μg/ml至10ng/ml之间的任意浓度使用。标记抗体对该细胞的结合量被反映为使用CELL QUESTSoftware(BD公司)进行分析而得的荧光强度即几何平均值。即，通过得到该几何平均值，可以测定由标记抗体的结合量表示的被测抗原结合分子和对照抗原结合分子的结合活性。

本方法中，例如“实质上不与突变IL-6R表达细胞结合”可通过以下方法判断。首先，用标记抗体染色与表达突变IL-6R的细胞结合的被测抗原结合分子和对照抗原结合分子。接着，检测细胞的荧光强度。荧光检测中使用作为流式细胞仪的FACSCalibur时，所得的荧光强度可以使用CELLQUEST Software进行分析。由抗原结合分子存在下和不存在下的几何平均值，根据下述的计算式算出该比较值(ΔGeo-Mean)，由此可以求出抗原结合分子的结合所带来的荧光强度的增加比例。

ΔGeo-Mean＝Geo-Mean(抗原结合分子存在下)/Geo-Mean(抗原结合分子不存在下)

将通过分析得到的、反映被测抗原结合分子对突变IL-6R表达细胞的结合量的几何平均比较值(突变IL-6R分子ΔGeo-Mean值)与反映被测抗原结合分子对IL-6R表达细胞的结合量的ΔGeo-Mean比较值进行比较。此时，计算相对于突变IL-6R表达细胞和IL-6R表达细胞的ΔGeo-Mean比较值时使用的被测抗原结合分子的浓度特别优选制备为相互相同或者实质上相同的浓度。预先确定了识别IL-6R中的表位的抗原结合分子被用作对照抗原结合分子。

被测抗原结合分子相对于突变IL-6R表达细胞的ΔGeo-Mean比较值只要小于被测抗原结合分子相对于IL-6R表达细胞的ΔGeo-Mean比较值的至少80％、优选50％、进一步优选30％、特别优选15％，则认为“实质上不与突变IL-6R表达细胞结合”。求出Geo-Mean值(几何平均)的计算式记载于CELL QUEST Software User’s Guide(BD biosciences公司)。通过对比较值进行比较，只要是能够将其实质上视为相同的程度，则能够评价被测抗原结合分子与对照抗原结合分子的表位相同。

抗原结合结构域

本说明书中，“抗原结合结构域”只要与目标抗原结合，则可以使用任意结构的结构域。作为这类结构域的实例，可优选举出例如：抗体的重链和轻链的可变区、机体内存在的细胞膜蛋白Avimer中所含的35个氨基酸左右的被称为A结构域的组件(WO2004/044011、WO2005/040229)、含有与在细胞膜表达的糖蛋白纤连蛋白中的蛋白结合结构域10Fn3结构域的Adnectin(WO2002/032925)、以构成蛋白A的含有58个氨基酸的3个螺旋束(bundle)的IgG结合结构域为支架的Affibody(WO1995/001937)、具有含33个氨基酸残基的转角和2个反向平行螺旋以及环的亚基重复重叠而成的结构的锚蛋白重复序列(ankyrin repeat：AR)的分子表面露出的区域DARPins(Designed Ankyrin Repeat proteins)(WO2002/020565)、支持嗜中性粒细胞明胶酶结合脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associatedlipocalin(NGAL))等脂质运载蛋白分子中高度保守的8个反向平行链在中央方向扭曲的桶结构的单侧的4个环区即Anticalin等(WO2003/029462)、作为七鳃鳗、八目鳗等无颚类的获得免疫系统且不具有免疫球蛋白结构的可变性淋巴细胞受体(variable lymphocyte receptor(VLR))的富亮氨酸残基的重复(leucine-rich-repeat(LRR))组件重复重叠而成的马蹄铁形的结构内部的平行型片结构的凹陷区域(WO2008/016854)。作为本发明的抗原结合结构域的优选实例，可举出含有抗体的重链和轻链的可变区的抗原结合结构域。作为这种抗原结合结构域的实例，优选可举出“scFv(单链Fv)”、“单链抗体”、“Fv”、“scFv2(单链Fv2)”、“Fab”或“F(ab')2”等。

本发明的抗原结合分子中的抗原结合结构域可以与相同的表位结合。这里，相同的表位可以存在于例如含有SEQ ID NO:1所述的氨基酸序列的蛋白质中。此外，可以存在于含有SEQ ID NO:1所述的氨基酸序列的第20位至第365位氨基酸的蛋白质中。或者，本发明的抗原结合分子中的抗原结合结构域可以与相互不同的表位结合。这里，不同的表位可以存在于例如含有SEQ ID NO:1所述的氨基酸序列的蛋白质中。此外，可以存在于含有SEQ ID NO:1所述的氨基酸序列的第20位至第365位氨基酸的蛋白质中。

特异性

特异性是指特异性地结合的分子的一方的分子对于其一个或多个结合对象分子以外的分子不显示任何显著性结合的状态。此外，也可以用于抗原结合结构域对某抗原中所含的多个表位中特定的表位为特异性的情形。此外，抗原结合结构域所结合的表位含有在多个不同的抗原中时，具有该抗原结合结构域的抗原结合分子可以与含有该表位的各种抗原结合。

抗体

本说明书中，抗体是指天然的免疫球蛋白或者通过部分或完全合成制备得到的免疫球蛋白。抗体可从天然存在其的血浆或血清等天然资源或产生抗体的杂交瘤细胞的培养上清中分离得到，或者通过使用基因重组等方法而部分或完全合成。作为抗体的实例，优选可举出：免疫球蛋白的同种型和这些同种型的亚类。作为人的免疫球蛋白，已知有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgM这9种类型(同种型)。本发明的抗体中可含有这些同种型中的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。IgG的恒定区中也含有由此自然产生的突变体等。作为人IgG1、人IgG2、人IgG3、人IgG4抗体的恒定区，基因多态性所致的多个的同种异型序列记载于Sequences ofproteins of immunological interest,NIH Publication No.91-3242中，本发明可以是其中的任一个序列。特别是作为人IgG1的序列，EU编号356-358位的氨基酸序列可以是DEL也可以是EEM。

制备具有所期望结合活性的抗体的方法对本领域技术人员来说是公知的。以下例示与IL-6R结合的抗体(抗IL-6R抗体)的制作方法。与IL-6R以外的抗原结合的抗体也可以根据下述例示而适宜制作。

抗IL-6R抗体可以使用公知的方法以多克隆或单克隆抗体的形式获得。作为抗IL-6R抗体，可优选制作来源于哺乳动物的单克隆抗体。来源于哺乳动物的单克隆抗体含有：由杂交瘤产生的单克隆抗体和利用基因工程技术通过用含有抗体基因的表达载体转化的宿主细胞产生的单克隆抗体等。应予说明，本申请发明的单克隆抗体包括“人源化抗体”和“嵌合抗体”。

产生单克隆抗体的杂交瘤可以通过使用公知技术，例如如下所示的方法来制作。即，使用IL-6R蛋白作为敏化抗原，按照通常的免疫方法来免疫哺乳动物。通过通常的细胞融合法，将所得免疫细胞与公知的亲本细胞融合。其次，通过通常的筛选方法筛选单克隆抗体产生细胞，由此可以选择出产生抗IL-6R抗体的杂交瘤。

具体而言，单克隆抗体的制作例如如下所示地进行。首先，表达其核苷酸序列公开在SEQ ID NO:2中的IL-6R基因，由此可得到由SEQ ID NO:1表示的IL-6R蛋白，其用作敏化抗原用于抗体制备。即，将编码IL-6R的基因序列插入公知的表达载体，由此转化适当的宿主细胞。以公知的方法从该宿主细胞中或培养上清中纯化所期望的人IL-6R蛋白。为了从培养上清中获得可溶型的IL-6R，代替由SEQ ID NO:1表示的IL-6R蛋白，表达了例如，如Mullberg等(J.Immunol.(1994)152(10),4958-4968)所记载的可溶型IL-6R、即SEQ ID NO:1表示的IL-6R多肽序列中、含有第1位至357位氨基酸的蛋白。此外，纯化的天然IL-6R蛋白也可以同样地用作敏化抗原。

作为用于免疫哺乳动物的敏化抗原，可使用该纯化IL-6R蛋白。此外，IL-6R的部分肽也可以用作敏化抗原。此时，该部分肽也可以根据人IL-6R的氨基酸序列通过化学合成获得。此外，也可以通过将IL-6R基因的一部分整合至表达载体并进行表达来获得。进而，还可以使用蛋白质分解酶分解IL-6R蛋白来获得，用作部分肽的IL-6R肽的区域和大小并不特别限于特定的方案。对于优选的区域，可以从SEQ ID NO:1的氨基酸序列中相当于第20-357位氨基酸的氨基酸序列中选择任意的序列。构成作为敏化抗原的肽的氨基酸的数目优选为至少5个以上、例如6个以上、或7个以上。更具体而言，可以将8～50、优选10～30个残基的肽用作敏化抗原。

此外，也可以将IL-6R蛋白的所期望的部分多肽或肽与不同的多肽进行融合而得的融合蛋白用作敏化抗原。为了制备用作敏化抗原的融合蛋白，例如，可以优选利用抗体的Fc片段或肽标签等。表达融合蛋白的载体可如下制作：将编码所期望的两种或两种以上的多肽片段的基因框内融合，将该融合基因如前所述地插入表达载体。融合蛋白的制作方法记载于Molecular Cloning2nd ed.(Sambrook,J et al.,Molecular Cloning2nd ed.,9.47-9.58(1989)Cold Spring Harbor Lab.press)。用作敏化抗原的IL-6R的获得方法和使用它的免疫方法也具体记载于WO2003/000883、WO2004/022754、WO2006/006693等中。

作为用该敏化抗原免疫的哺乳动物，并不限定于特定的动物，优选考虑与细胞融合中使用的亲本细胞的相容性来选择。通常适宜使用啮齿类的动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠或兔、猴等。

按照公知的方法将上述动物用敏化抗原免疫。例如，作为通常的方法，通过将敏化抗原注射给予至哺乳动物的腹腔内或皮下来实施免疫。具体而言，将用PBS(磷酸缓冲盐水(Phosphate-Buffered Saline))或生理盐水等以适当稀释倍率稀释的敏化抗原根据需要与通常的佐剂、例如弗氏完全佐剂混合，在乳化后将该敏化抗原对哺乳动物每4至21天给予数次。此外，敏化抗原免疫时可以使用适当的载体。特别是将分子量小的部分肽用作敏化抗原时，有时期望将与白蛋白、匙孔血蓝蛋白等载体蛋白质结合的该敏化抗原肽进行免疫。

此外，产生所期望抗体的杂交瘤也可通过使用DNA免疫如下所示来制作。DNA免疫是指下述免疫方法：被给予了以能在免疫动物中表达编码抗原蛋白的基因的方式构建的载体DNA的该免疫动物中，敏化抗原在该免疫动物的机体内表达，由此赋予免疫刺激。与将蛋白质抗原给予免疫动物的通常的免疫方法相比，DNA免疫期待如下优越性：

-能够维持如IL-6R的膜蛋白的结构而赋予免疫刺激

-无需纯化免疫抗原。

为了通过DNA免疫获得本发明的单克隆抗体，首先，对免疫动物给予表达IL-6R蛋白的DNA。编码IL-6R的DNA可通过PCR等公知方法合成。将所得DNA插入适当的表达载体，给予免疫动物。作为表达载体，可优选利用例如pcDNA3.1等市售的表达载体。作为将载体给予机体的方法，可采用通常所使用的方法。例如，将吸附有表达载体的金颗粒用基因枪导入免疫动物个体的细胞内，由此进行DNA免疫。进而，识别IL-6R的抗体的制作也可以采用国际公开WO2003/104453中记载的方法来制作。

如此将哺乳动物免疫，确认到血清中与IL-6R结合的抗体效价的上升后，从哺乳动物采集免疫细胞，进行细胞融合。作为优选的免疫细胞，特别可使用脾细胞。

作为与前述免疫细胞融合的细胞，可使用哺乳动物的骨髓瘤细胞。骨髓瘤细胞优选具备用于筛选的适当的选择标记物。选择标记物是指赋予细胞能够在特定培养条件下存活(或死亡)的性质。选择标记物中，公知的是次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖基转移酶缺失(以下简称为HGPRT缺失)或胸苷激酶缺失(以下简称为TK缺失)等。具有HGPRT、TK缺失的细胞具有次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷敏感性(以下简称为HAT敏感性)。HAT敏感性的细胞不能在HAT选择培养基中进行DNA合成而会死亡，但若与正常细胞发生融合，则可利用正常细胞的补救途径继续DNA的合成，因此在HAT选择培养基中也会生长。

HGPRT缺失、TK缺失的细胞各自可通过含有6-硫代鸟嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤(以下简称为8AG)或5'溴脱氧尿苷的培养基来选择。DNA中整合有这些嘧啶类似物的正常细胞会死亡。而无法整合这些嘧啶类似物的缺乏上述酶的细胞则可以在选择培养基中存活。此外，被称为G418抗性的选择标记物可通过新霉素抗性基因赋予针对2-脱氧链霉胺系抗生素(庆大霉素类似物)的抗性。细胞融合中优选的各种骨髓瘤细胞是公知的。

作为这类骨髓瘤细胞，可适宜使用例如P3(P3x63Ag8.653)(J.Immunol.(1979)123(4),1548-1550)、P3x63Ag8U.1(Current Topics inMicrobiology and Immunology(1978)81,1-7)、NS-1(C.Eur.J.Immunol.(1976)6(7),511-519)、MPC-11(Cell(1976)8(3),405-415)、SP2/0(Nature(1978)276(5685),269-270)、FO(J.Immunol.Methods(1980)35(1-2),1-21)、S194/5.XX0.BU.1(J.Exp.Med.(1978)148(1),313-323)、R210(Nature(1979)277(5692),131-133)等。

基本上，根据公知方法，例如Kohler和Milstein等的方法(MethodsEnzymol.(1981)73,3-46)等，进行前述免疫细胞和骨髓瘤细胞的细胞融合。

更具体而言，例如，可以在细胞融合促进剂的存在下，在通常的营养培养液中实施前述细胞融合。作为融合促进剂，使用例如聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(HVJ)等，进而为了提高融合效率，根据期望添加二甲基亚砜等助剂使用。

免疫细胞和骨髓瘤细胞的使用比例可以任意设定。例如，相对于骨髓瘤细胞，优选使免疫细胞为1至10倍。作为用于前述细胞融合的培养液，使用例如适于前述骨髓瘤细胞株的生长的RPMI1640培养液、MEM培养液、以及用于此种细胞培养的通常的培养液，进而可优选添加胎牛血清(FCS)等血清补液。

对于细胞融合，将规定量的前述免疫细胞和骨髓瘤细胞在前述培养液中充分混合，将预先加热至37℃左右的PEG溶液(例如平均分子量1000至6000左右)通常以30至60％(w/v)的浓度添加。混合液通过缓慢混合而形成所期望的融合细胞(杂交瘤)。其次，依次添加上述列举的适当的培养液，通过重复进行离心除去上清的操作，可以除去对杂交瘤的生长不利的细胞融合剂等。

这样得到的杂交瘤可通过用通常的选择培养液、例如HAT培养液(含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养液)培养来进行选择。使用上述HAT培养液的培养可持续足够所期望的杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死亡的时间(通常，所述足够的时间为数天至数周)。其次，通过通常的有限稀释方法，实施产生所期望抗体的杂交瘤的筛选和单克隆。

如此得到的杂交瘤可通过使用对应于用于细胞融合的骨髓瘤所具有的选择标记物的选择培养液来进行选择。例如，具有HGPRT或TK缺失的细胞可以通过用HAT培养液(含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养液)培养来进行选择。即，在细胞融合中使用HAT敏感性的骨髓瘤细胞时，在HAT培养液中，与正常细胞的细胞融合成功了的细胞可选择性地生长。使用上述HAT培养液的培养可以持续足够所期望的杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死亡的时间。具体而言，通常通过数天至数周的培养，可以选择所期望的杂交瘤。其次，可通过通常的有限稀释方法，实施产生所期望抗体的杂交瘤的筛选和单克隆。

所期望抗体的筛选和单克隆优选可通过公知的基于抗原抗体反应的筛选方法来实施。例如，与IL-6R结合的单克隆抗体可以与细胞表面表达的IL-6R结合。这样的单克隆抗体可通过例如FACS(荧光活化细胞分选)来筛选。FACS是可以通过用激光分析与荧光抗体接触的细胞并测定各细胞发出的荧光来测定抗体对细胞表面的结合的系统。

为了利用FACS来对产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤进行筛选，首先制备表达IL-6R的细胞。优选用于筛选的细胞是强制表达IL-6R的哺乳动物细胞。作为对照，通过使用用作宿主细胞的未转化的哺乳动物细胞，可以选择性地检测抗体对细胞表面的IL-6R的结合活性。即，通过选择产生不与宿主细胞结合、而与IL-6R强制表达细胞结合的抗体的杂交瘤，可以获得产生IL-6R单克隆抗体的杂交瘤。

或者，可以基于ELISA的原理来评价抗体对固定化的IL-6R表达细胞的结合活性。例如，将IL-6R表达细胞固定于ELISA板的孔中。使杂交瘤的培养上清与孔内的固定化细胞接触，检测与固定化细胞结合的抗体。单克隆抗体来源于小鼠时，与细胞结合的抗体可通过抗小鼠免疫球蛋白抗体检测。通过这些筛选选择出的、产生具有抗原结合能力的所期望的抗体的杂交瘤可以通过有限稀释方法等进行克隆。

这样制作的产生单克隆抗体的杂交瘤可以在通常的培养液中传代培养。此外，该杂交瘤可以在液氮中长期保存。

按照通常的方法培养该杂交瘤，可从其培养上清中获得所期望的单克隆抗体。或者，可以将杂交瘤给予和其具有相容性的哺乳动物并使其生长，从其腹水中获得单克隆抗体。前者的方法适于获得高纯度的抗体。

也可以适宜地使用由从该杂交瘤等抗体产生细胞克隆的抗体基因编码的抗体。将克隆的抗体基因整合至适当的载体中，导入宿主，由此表达由该基因所编码的抗体。用于抗体基因的分离、向载体中的导入以及宿主细胞的转化的方法已经由例如Vandamme等确立(Eur.J.Biochem.(1990)192(3),767-775)。此外，如下所述的重组抗体的制备方法也是公知的。

例如，由产生抗IL-6R抗体的杂交瘤细胞获得编码抗IL-6R抗体的可变区(V区)的cDNA。为此，通常首先从杂交瘤提取总RNA。作为用于从细胞提取mRNA的方法，例如可使用如下所述的方法：

-胍超离心法(Biochemistry(1979)18(24),5294-5299)

-AGPC法(Anal.Biochem.(1987)162(1),156-159)。

提取的mRNA可使用mRNA Purification Kit(GE Healthcare Bioscience制)等进行纯化。或者还市售有QuickPrep mRNA Purification Kit(GEHealthcare Bioscience制)等这样的用于从细胞直接提取总mRNA的试剂盒。使用这种试剂盒，可从杂交瘤获得mRNA。可以使用反转录酶由所得mRNA合成编码抗体V区的cDNA。cDNA可通过AMV Reverse TranscriptaseFirst-strand cDNA SynthesisKit(生化学工业社制)等合成。此外，为了cDNA的合成和扩增，可以适宜采用使用了SMART RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech制)和PCR的5’-RACE法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85(23),8998-9002、Nucleic Acids Res.(1989)17(8),2919-2932)。进而，可以在这种cDNA的合成过程中向cDNA的两末端导入后述适合的限制酶位点。

从所得PCR产物纯化出目标cDNA片段，接着与载体DNA连接。如此制作重组载体，并导入大肠杆菌等中，选择菌落后，可以由形成该菌落的大肠杆菌制备所期望的重组载体。而且，对于该重组载体是否具有目标cDNA的碱基序列，可以通过公知的方法例如双脱氧核苷酸链终止法等来确认。

为了获得编码可变区的基因，简便的是利用5’-RACE法，其中使用了可变区基因扩增用的引物。首先，将从杂交瘤细胞提取的RNA作为模板来合成cDNA，获得5’-RACE cDNA文库。5’-RACE cDNA文库的合成中可适宜地使用SMART RACE cDNA扩增试剂盒等市售的试剂盒。

以所得的5’-RACE cDNA文库为模板，通过PCR法扩增抗体基因。基于公知的抗体基因序列，可设计小鼠抗体基因扩增用的引物。这些引物根据免疫球蛋白的亚类而具有不同的碱基序列。因此，理想的是使用Iso Strip小鼠单克隆抗体同种型分型试剂盒(Roche Diagnostics)等市售试剂盒来预先确定亚类。

具体而言，例如为了获得编码小鼠IgG的基因时，可以使用能够扩增编码作为重链的γ1、γ2a、γ2b、γ3、作为轻链的κ链和λ链的基因的引物。为了扩增IgG的可变区基因，通常，3'侧的引物采用会退火到相当于接近可变区的恒定区的部分上的引物。而5'侧的引物则采用5’RACE cDNA文库制作试剂盒所附带的引物。

利用如此扩增得到的PCR产物，可以重构由重链和轻链的组合构成的免疫球蛋白。将经重构的免疫球蛋白针对IL-6R的结合活性作为指标，可筛选所期望的抗体。例如，为了获得针对IL-6R的抗体时，进一步优选抗体对IL-6R的结合是特异性的。与IL-6R结合的抗体可例如如下所述进行筛选：

(1)使含有由杂交瘤获得的cDNA所编码的V区的抗体与IL-6R表达细胞接触的步骤；

(2)检测IL-6R表达细胞与抗体的结合的步骤；以及

(3)选择与IL-6R表达细胞结合的抗体的步骤。

检测抗体和IL-6R表达细胞的结合的方法是公知的。具体而言，通过如前所述的FACS等方法，可检测抗体与IL-6R表达细胞的结合。为了评价抗体的结合活性，可适宜利用IL-6R表达细胞的固定标本。

作为以结合活性为指标的抗体的筛选方法，还可适宜采用淘选法，其利用了噬菌体载体。从多克隆抗体表达细胞群以重链和轻链的亚类的文库的形式获得抗体基因时，有利的是利用噬菌体载体的筛选方法。编码重链和轻链的可变区的基因通过用适当的接头序列连接，可形成单链Fv(scFv)。通过将编码scFv的基因插入噬菌体载体，可以获得在表面表达scFv的噬菌体。该噬菌体与所期望的抗原接触后，回收与抗原结合的噬菌体，从而可以回收编码具有目标结合活性的scFv的DNA。通过根据需要重复该操作，可以浓缩具有所期望结合活性的scFv。

得到编码抗IL-6R抗体的V区的目标cDNA后，通过识别插入在该cDNA的两末端的限制酶位点的限制酶，将该cDNA消化。优选的限制酶会识别并消化在构成抗体基因的碱基序列中出现频率低的碱基序列。进而，为了将1拷贝的消化片段以正确方向插入载体，优选插入能提供粘性末端的限制酶。将如上所述消化的编码抗IL-6R抗体的V区的cDNA插入适当的表达载体，由此可获得抗体表达载体。此时，只要将编码抗体恒定区(C区)的基因和编码前述V区的基因框内融合，则可获得嵌合抗体。这里，嵌合抗体是指恒定区和可变区的来源不同。因此，除了小鼠-人等异种嵌合抗体之外，人-人同种嵌合抗体也含有在本发明的嵌合抗体中。通过在预先具有恒定区的表达载体中插入前述V区基因，可以构建嵌合抗体表达载体。具体而言，例如，可在保持有编码所期望抗体恒定区(C区)的DNA的表达载体的5’侧适宜地配置消化前述V区基因的限制酶的限制酶识别序列。对经相同组合的限制酶消化的两者进行框内融合，由此构建嵌合抗体表达载体。

为了制备抗IL-6R单克隆抗体，以在表达调控区的调控下进行表达的方式，将抗体基因整合至表达载体中。用于表达抗体的表达调控区含有例如增强子和启动子。此外，可以在氨基末端添加合适的信号序列，以使表达的抗体分泌到细胞外。在后述实施例中，作为信号序列使用了具有氨基酸序列MGWSCIILFLVATATGVHS(SEQ ID NO:3)的肽，除此之外也可以添加合适的信号序列。表达的多肽在上述序列的羧基末端部分被切断，被切断的多肽能够以成熟多肽的形式分泌到细胞外。其次，用该表达载体转化适当的宿主细胞，由此可以获得表达编码抗IL-6R抗体的DNA的重组细胞。

为了表达抗体基因，编码抗体重链(H链)和轻链(L链)的DNA被分别整合于不同的表达载体中。通过用整合有H链和L链的载体共转化(co-transfect)相同的宿主细胞，可以表达具备H链和L链的抗体分子。或者，也可以将编码H链和L链的DNA整合于单一表达载体中，并用其转化宿主细胞(参照国际公开WO1994/011523)。

用于将分离的抗体基因导入适当的宿主来制作抗体的宿主细胞和表达载体的多个组合是公知的。这些表达系统均可用于分离本发明的抗原结合结构域。将真核细胞用作宿主细胞时，可适宜使用动物细胞、植物细胞或真菌细胞。具体而言，动物细胞可例示下述细胞。

(1)哺乳类细胞：CHO、COS、骨髓瘤、BHK(幼仓鼠肾)、Hela、Vero、HEK(人胚肾)293、Freestyle^TM293等

(2)两栖类细胞：非洲爪蟾卵母细胞等

(3)昆虫细胞：sf9、sf21、Tn5等。

或者，作为植物细胞，公知有基于来源于烟草(Nicotiana tabacum)等烟草(Nicotiana)属的细胞的抗体基因表达系统。植物细胞的转化中，可以适宜使用进行了愈伤组织培养的细胞。

进而，作为真菌细胞，可以使用如下细胞：

-酵母：酿酒酵母(Saccharomyces serevisiae)等酵母(Saccharomyces)属、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)等毕赤酵母属

-丝状真菌：黑曲霉菌(Aspergillus niger)等曲霉(Aspergillus)属。

此外，利用原核细胞的抗体基因表达系统也是公知的。例如，使用细菌细胞时，可适宜利用大肠杆菌(E.coli)、枯草杆菌等细菌细胞。通过转化向这些细胞中导入含有目标抗体基因的表达载体。通过在体外培养经转化的细胞，可以从该转化细胞的培养物中获得所期望的抗体。

除了上述宿主细胞之外，重组抗体的产生也可以利用转基因动物。即，可以从导入有编码所期望抗体的基因的动物获得该抗体。例如，抗体基因可以通过框内插入编码乳汁中固有产生的蛋白质的基因的内部，而构建为融合基因。作为分泌至乳汁中的蛋白质，可利用例如山羊β酪蛋白等。将含有插入了抗体基因的融合基因的DNA片段注入山羊的胚胎，再将该进行了注入的胚胎导入母山羊。由接受胚胎的山羊生出的转基因山羊(或其后代)产生的乳汁中，能够以与乳汁蛋白的融合蛋白的形式获得所期望的抗体。此外，为了使由转基因山羊产生的含有所期望抗体的乳汁量增加，可以对转基因山羊给予激素(Bio/Technology(1994),12(7),699-702)。

对人给予本说明书中记载的抗原结合分子时，作为该分子中的抗原结合结构域，可以适宜采用来源于基因重组型抗体的抗原结合结构域，该基因重组型抗体为了降低针对人的异源抗原性等目的已进行了人工改变。基因重组型抗体含有例如人源化(Humanized)抗体等。这些改变抗体可使用公知方法适宜制备。

用于制作本说明书中记载的抗原结合分子的抗原结合结构域的抗体可变区通常由被4个框架区域(FR)保持的3个互补决定区(complementarity-determining region；CDR)构成。CDR是实质上决定抗体的结合特异性的区域。CDR的氨基酸序列富有多样性。另一方面，构成FR的氨基酸序列即便是在具有不同结合特异性的抗体之间也多显示高度的同一性。因此，通常认为可以通过CDR的移植来将某抗体的结合特异性移植到其它抗体。

人源化抗体也被称为重构(reshaped)人抗体。具体而言，将人以外的动物例如小鼠抗体的CDR移植到人抗体中的人源化抗体等是公知的。用于获得人源化抗体的通常的基因重组方法也是已知的。具体而言，作为用于将小鼠抗体的CDR移植到人的FR中的方法，公知的是例如重叠延伸PCR。重叠延伸PCR中，用于合成人抗体FR的引物中添加有编码待移植小鼠抗体CDR的碱基序列。针对4个FR分别准备引物。通常，对于将小鼠CDR移植到人FR中，选择与小鼠FR同一性高的人FR，在维持CDR功能方面认为有利。即，通常优选利用下述人FR，其含有与待移植小鼠CDR的相邻FR氨基酸序列的同一性高的氨基酸序列。

此外，连接的碱基序列被设计为相互框内连接。通过各引物单独地合成人FR。结果得到各FR上添加有编码小鼠CDR的DNA的产物。各产物的编码小鼠CDR的碱基序列被设计为相互重叠。接着，使以人抗体基因为模板合成的产物的重叠CDR部分相互退火，进行互补链合成反应。通过该反应，人FR通过小鼠CDR序列而连接。

最终3个CDR和4个FR连接得到的V区基因，通过会与其5'末端和3'末端发生退火并添加有适当的限制酶识别序列的引物而扩增出其全长。将如上所述得到的DNA和编码人抗体C区的DNA以进行框内融合的方式插入表达载体中，由此可以制作人型抗体表达用载体。将该整合载体导入宿主建立重组细胞后，培养该重组细胞，通过表达编码该人源化抗体的DNA，从而在该培养细胞的培养物中产生该人源化抗体(参照欧州专利公开EP239400、国际公开WO1996/002576)。

通过定性或者定量地测定并评价如上所述制作的人源化抗体的抗原结合活性，可以适宜地选择人抗体FR，以便通过CDR连接时该CDR形成良好的抗原结合位点。根据需要，也可以按照重构人抗体CDR形成合适抗原结合位点的方式来取代FR的氨基酸残基。例如，可以应用将小鼠CDR移植到人FR中使用的PCR法，向FR导入氨基酸序列的突变。具体而言，可以向会与FR发生退火的引物中导入部分碱基序列的突变。通过这样的引物合成的FR中导入了碱基序列的突变。通过用上述方法测定并评价进行了氨基酸取代的突变型抗体的抗原结合活性，可以选择具有所期望性质的突变FR序列(Cancer Res.,(1993)53,851-856)。

此外，将具有人抗体基因的全部组成成分的转基因动物(参照国际公开WO1993/012227、WO1992/003918、WO1994/002602、WO1994/025585、WO1996/034096、WO1996/033735)作为免疫动物，可以通过DNA免疫获得所期望的人抗体。

进而，使用人抗体文库通过淘选获得人抗体的技术也是已知的。例如，人抗体的V区以单链抗体(scFv)的形式通过噬菌体展示法表达在噬菌体的表面。可以选择表达与抗原结合的scFv的噬菌体。通过对选择的噬菌体的基因进行分析，可以确定编码与抗原结合的人抗体V区的DNA序列。确定与抗原结合的scFv的DNA序列后，将该V区序列与所期望的人抗体C区序列框内融合后，插入适当的表达载体，由此可以制作表达载体。将该表达载体导入上述列举的适宜表达细胞中，通过使编码该人抗体的基因表达，可以获得该人抗体。这些方法已经公知(参照国际公开WO1992/001047、WO1992/020791、WO1993/006213、WO1993/011236、WO1993/019172、WO1995/001438、WO1995/015388)。

此外，作为获得抗体基因的方法，除了上述之外，还可适宜地使用如Bernasconi等(Science(2002)298,2199-2202)或WO2008/081008中记载的B细胞克隆(各抗体的编码序列的鉴定和克隆、其分离、以及用于制备各抗体(特别是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的表达载体构建用的用途等)的方法。

EU编号和Kabat编号

根据本发明中使用的方法，分配给抗体的CDR和FR的氨基酸位置依照Kabat规定(Sequences of Proteins of Immunological Interest(NationalInstitute of Health,Bethesda,Md.,1987年和1991年)。本说明书中，抗原结合分子为抗体或抗原结合片段时，可变区的氨基酸按照Kabat编号来表示，恒定区的氨基酸按照基于Kabat氨基酸位置的EU编号来表示。

离子浓度条件

金属离子浓度条件

本发明的一个方式中，离子浓度是指金属离子浓度。“金属离子”是指属于除了氢以外的碱金属和铜族等第I族、碱土类金属和锌族等第II族、除了硼之外的第III族、除了碳和硅之外的第IV族、铁族和铂族等第VIII族、V、VI和VII族的各A亚族的元素以及锑、铋、钋等金属元素的离子。金属原子具有释放出原子价电子而形成阳离子的性质，称这为离子化倾向。认为离子化倾向大的金属富有化学活性。

作为本发明中优选的金属离子的实例，可举出钙离子。钙离子参与许多生命现象的调节，钙离子参与骨骼肌、平滑肌和心肌等肌肉的收缩，白细胞的运动和吞噬等的活化，血小板的变形和分泌等的活化，淋巴细胞的活化，组胺的分泌等肥大细胞的活化，儿茶酚胺α受体或乙酰胆碱受体介导的细胞应答，胞吐作用，递质从神经元末端的释放，神经元的轴浆流等。作为细胞内的钙离子受体，已知具有多个钙离子结合位点、且认为在分子进化上来源于共同起源的肌钙蛋白C、钙调蛋白、小白蛋白、肌球蛋白轻链等，其结合模体也大量已知。还熟知例如，钙黏蛋白结构域、钙调蛋白所含的EF手、蛋白激酶C所含的C2结构域、凝血蛋白因子IX所含的Gla结构域、脱唾液酸糖蛋白受体或甘露糖结合受体所含的C型凝集素、LDL受体所含的A结构域、膜联蛋白、血小板反应蛋白3型结构域和EGF样结构域。

本发明中，在金属离子为钙离子时，作为钙离子浓度条件，可举出低钙离子浓度条件和高钙离子浓度条件。结合活性随钙离子浓度条件而变化是指，低钙离子浓度和高钙离子浓度条件的不同导致抗原结合分子的抗原结合活性发生变化。可举出例如，高钙离子浓度条件下的抗原结合分子的抗原结合活性高于低钙离子浓度条件下的抗原结合分子的抗原结合活性的情形。此外还可举出，低钙离子浓度条件下的抗原结合分子的抗原结合活性高于高钙离子浓度条件下的抗原结合分子的抗原结合活性的情形。

本说明书中，高钙离子浓度并不特别限于统一的数值，可以是优选选自100μM至10mM之间的浓度。此外，在其它方案中，可以是选自200μM至5mM之间的浓度。此外，在不同的方案中，可以是选自500μM至2.5mM之间的浓度，在其它的方案中也可以是选自200μM至2mM之间的浓度。进而，还可以是选自400μM至1.5mM之间的浓度。特别优选可举出选自与机体内血浆中(血中)的钙离子浓度接近的500μM至2.5mM之间的浓度。

本说明书中，低钙离子浓度并不特别限于统一的数值，可以是优选选自0.1μM至30μM之间的浓度。此外，在其它方案中，可以是选自0.2μM至20μM之间的浓度。此外，在不同的方案中，可以是选自0.5μM至10μM之间的浓度，在其它的方案中也可以是选自1μM至5μM之间的浓度。进而，还可以是选自2μM至4μM之间的浓度。特别优选可举出选自与机体内的早期内体内的离子化钙浓度接近的1μM至5μM之间的浓度。

本发明中，低钙离子浓度条件的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件的抗原结合活性意指，抗原结合分子在选自0.1μM至30μM之间的钙离子浓度下的抗原结合活性弱于选自100μM至10mM之间的钙离子浓度下的抗原结合活性。优选意指抗原结合分子在选自0.5μM至10μM之间的钙离子浓度下的抗原结合活性弱于在选自200μM至5mM之间的钙离子浓度下的抗原结合活性，特别优选意指机体内的早期内体内的钙离子浓度下的抗原结合活性弱于机体内的血浆中的钙离子浓度下的抗原结合活性，具体意指抗原结合分子在选自1μM至5μM之间的钙离子浓度下的抗原结合活性弱于在选自500μM至2.5mM之间的钙离子浓度下的抗原结合活性。

抗原结合分子的抗原结合活性随金属离子浓度条件而变化与否可以通过使用例如前述结合活性项目中所记载的公知测定方法来确定。例如，为了确认与低钙离子浓度条件下的抗原结合分子的抗原结合活性相比高钙离子浓度条件下的抗原结合分子的抗原结合活性变得更高，对低钙离子浓度和高钙离子浓度条件下的抗原结合分子的抗原结合活性进行比较。

进而，本发明中，“低钙离子浓度条件的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件的抗原结合活性”的表述也可以表述为抗原结合分子的高钙离子浓度条件下的抗原结合活性高于低钙离子浓度条件下的抗原结合活性。应予说明，本发明中有时也将“低钙离子浓度条件的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件的抗原结合活性”记载为“低钙离子浓度条件下的抗原结合能力弱于高钙离子浓度条件下的抗原结合能力”，此外，有时也将“使低钙离子浓度条件的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件的抗原结合活性”记载为“使低钙离子浓度条件下的抗原结合能力弱于高钙离子浓度条件下的抗原结合能力”。

本领域技术人员可以适宜选择测定抗原结合活性时的钙离子浓度以外的条件，没有特别限定。例如，可以在HEPES缓冲液、37℃的条件下进行测定。例如，可以使用Biacore(GE Healthcare)等进行测定。对于抗原结合分子和抗原的结合活性的测定，在抗原为可溶型抗原时，通过对固定有抗原结合分子的芯片流过作为分析物的抗原，由此可以评价对可溶型抗原的结合活性，在抗原为膜型抗原时，通过对固定有抗原的芯片流过作为分析物的抗原结合分子，由此可以评价对膜型抗原的结合活性。

本发明的抗原结合分子中，只要低钙离子浓度条件的抗原结合活性弱于高钙离子浓度条件的抗原结合活性，则低钙离子浓度条件下的抗原结合活性和高钙离子浓度条件下的抗原结合活性之比没有特别限定，优选相对于抗原的低钙离子浓度条件下的KD(Dissociation constant：解离常数)和高钙离子浓度条件的KD之比KD(Ca3μM)/KD(Ca2mM)的值为2以上，进一步优选KD(Ca3μM)/KD(Ca2mM)的值为10以上，进一步优选KD(Ca3μM)/KD(Ca2mM)的值为40以上。KD(Ca3μM)/KD(Ca2mM)的值的上限没有特别限定，只要本领域技术人员的技术可以制作，则可以是400、1000、10000等任意的值。此外，也可以特定KD(Ca3μM)/KD(Ca1.2mM)的值。即，KD(Ca3μM)/KD(Ca1.2mM)的值为2以上，进一步优选KD(Ca3μM)/KD(Ca1.2mM)的值为10以上，进一步优选KD(Ca3μM)/KD(Ca1.2mM)的值为40以上。KD(Ca3μM)/KD(Ca1.2mM)的值的上限没有特别限定，只要本领域技术人员的技术可以制作，则可以是400、1000、10000等任意的值。

作为抗原结合活性的值，在抗原为可溶型抗原时可以使用KD(解离常数)，而在抗原为膜型抗原时可以使用表观KD(Apparent dissociationconstant：表观解离常数)。KD(解离常数)和表观KD(表观解离常数)可通过本领域技术人员公知的方法进行测定，例如可使用Biacore(GE healthcare)、斯卡查德图(Scatchard plot)、流式细胞仪等。

此外，作为示出本发明的抗原结合分子的低钙浓度条件下的抗原结合活性和高钙浓度条件下的抗原结合活性之比的其它指标，还可适宜使用例如解离速率常数即kd(Dissociation rate constant：解离速率常数)。代替KD(解离常数)而使用kd(解离速率常数)来作为示出结合活性之比的指标时，相对于抗原的低钙浓度条件下的kd(解离速率常数)和高钙浓度条件下的kd(解离速率常数)之比即kd(低钙浓度条件)/kd(高钙浓度条件)的值优选为2以上，进一步优选为5以上，进一步优选为10以上，更优选为30以上。kd(低钙浓度条件)/kd(高钙浓度条件)的值的上限没有特别限定，只要本领域技术人员的技术常识可以制作，则可以为50、100、200等任意的值。

作为抗原结合活性的值，在抗原为可溶型抗原时可以使用kd(解离速率常数)，在抗原为膜型抗原时可以使用表观kd(Apparent dissociation rateconstant：表观解离速率常数)。kd(解离速率常数)和表观kd(表观解离速率常数)可通过本领域技术人员公知的方法测定，例如可使用Biacore(GEhealthcare)、流式细胞仪等。应予说明，本发明中，在测定不同钙离子浓度下的抗原结合分子的抗原结合活性时，钙浓度以外的条件优选为相同。

例如，作为本发明提供的一个方案的低钙离子浓度条件的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗体可通过包括以下步骤(a)～(c)的抗原结合结构域或抗体的筛选来获得：

(a)获得低钙浓度条件下的抗原结合结构域或抗体的抗原结合活性的步骤；

(b)获得高钙浓度条件下的抗原结合结构域或抗体的抗原结合活性的步骤；以及

(c)选择低钙浓度条件下的抗原结合活性低于高钙浓度条件下的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗体的步骤。

进而，作为本发明提供的一个方案的低钙离子浓度条件的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗体可通过包括以下步骤(a)～(c)的抗原结合结构域或抗体或其文库的筛选来获得：

(a)在高钙浓度条件下使抗原结合结构域或抗体或其文库与抗原接触的步骤；

(b)将在前述步骤(a)中与抗原结合的抗原结合结构域或抗体置于低钙浓度条件下的步骤；以及

(c)对在前述步骤(b)中解离的抗原结合结构域或抗体进行分离的步骤。

此外，作为本发明提供的一个方案的低钙离子浓度条件的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗体可通过包括以下步骤(a)～(d)的抗原结合结构域或抗体或其文库的筛选来获得：

(a)在低钙浓度条件下使抗原结合结构域或抗体的文库与抗原接触的步骤；

(b)选择在前述步骤(a)中不与抗原结合的抗原结合结构域或抗体的步骤；

(c)使在前述步骤(b)中选择的抗原结合结构域或抗体在高钙浓度条件下与抗原结合的步骤；以及

(d)对在前述步骤(c)中与抗原结合的抗原结合结构域或抗体进行分离的步骤。

进而，作为本发明提供的一个方案的低钙离子浓度条件的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗体可通过包括以下步骤(a)～(c)的筛选方法来获得：

(a)在高钙浓度条件下使抗原结合结构域或抗体的文库与固定有抗原的柱接触的步骤；

(b)将在前述步骤(a)中与柱结合的抗原结合结构域或抗体在低钙浓度条件下从柱洗脱的步骤；以及

(c)对在前述步骤(b)中洗脱的抗原结合结构域或抗体进行分离的步骤。

进而，作为本发明提供的一个方案的低钙离子浓度条件的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗体可通过包括以下步骤(a)～(d)的筛选方法来获得：

(a)在低钙浓度条件下使抗原结合结构域或抗体的文库通过固定有抗原的柱的步骤；

(b)对在前述步骤(a)中不与柱结合而洗脱的抗原结合结构域或抗体进行回收的步骤；

(c)使在前述步骤(b)中回收的抗原结合结构域或抗体在高钙浓度条件下与抗原结合的步骤；以及

(a)在高钙浓度条件下使抗原结合结构域或抗体的文库与抗原接触的步骤；

(b)获得在前述步骤(a)中与抗原结合的抗原结合结构域或抗体的步骤；

(c)将在前述步骤(b)中获得的抗原结合结构域或抗体置于低钙浓度条件下的步骤；以及

(d)对前述步骤(c)中抗原结合活性弱于前述步骤(b)中进行选择的标准的抗原结合结构域或抗体进行分离的步骤。

应予说明，前述步骤可以重复2次以上。所以，根据本发明，可提供通过上述筛选方法中进一步包括将(a)～(c)或(a)～(d)的步骤重复2次以上的步骤的筛选方法而获得的低钙离子浓度条件的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗体。(a)～(c)或(a)～(d)的步骤的重复次数没有特别限定，通常为10次以内。

本发明的筛选方法中，低钙浓度条件下的抗原结合结构域或抗体的抗原结合活性只要是离子化钙浓度为0.1μM～30μM之间的抗原结合活性则没有特别限定，作为优选的离子化钙浓度，可举出0.5μM～10μM之间的抗原结合活性。作为更优选的离子化钙浓度，可举出机体内的早期内体内的离子化钙浓度，具体可举出1μM～5μM下的抗原结合活性。此外，高钙浓度条件下的抗原结合结构域或抗体的抗原结合活性只要是离子化钙浓度为100μM～10mM之间的抗原结合活性则没有特别限定，作为优选的离子化钙浓度，可举出200μM～5mM之间的抗原结合活性。作为更优选的离子化钙浓度，可举出机体内的血浆中的离子化钙浓度，具体可举出0.5mM～2.5mM时的抗原结合活性。

抗原结合结构域或抗体的抗原结合活性可通过本领域技术人员公知的方法测定，对于离子化钙浓度以外的条件，本领域技术人员可以适宜确定。抗原结合结构域或抗体的抗原结合活性可以作为KD(Dissociation constant：解离常数)、表观KD(Apparent dissociation constant：表观解离常数)、解离速率即kd(Dissociation rate：解离速率常数)或表观kd(Apparent dissociation：表观解离速率常数)等来进行评价。它们可以通过本领域技术人员公知的方法来测定，例如可以使用Biacore(GE healthcare)、斯卡查德图、FACS等。

本发明中，选自高钙浓度条件下的抗原结合活性高于低钙浓度条件下的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗体的步骤，与选择低钙浓度条件下的抗原结合活性低于高钙浓度条件下的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗体的步骤含义相同。

只要高钙浓度条件下的抗原结合活性高于低钙浓度条件下的抗原结合活性，则高钙浓度条件下的抗原结合活性与低钙浓度条件下的抗原结合活性之差没有特别限定，优选高钙浓度条件下的抗原结合活性是低钙浓度条件下的抗原结合活性的2倍以上、进一步优选为10倍以上、更优选为40倍以上。

通过前述筛选方法筛选得到的本发明的抗原结合结构域或抗体可以是任意的抗原结合结构域或抗体，例如，可以筛选上述抗原结合结构域或抗体。例如，可以筛选具有天然序列的抗原结合结构域或抗体，也可以筛选氨基酸序列被取代的抗原结合结构域或抗体。

文库

根据一个方案，本发明的抗原结合结构域或抗体可以由文库获得，该文库主要由多种抗原结合分子形成，所述多种抗原结合分子的序列相互不同，并且其抗原结合结构域中含有至少一个使抗原结合分子的抗原结合活性随离子浓度条件而变化的氨基酸残基。作为离子浓度的实例，优选可举出金属离子浓度或氢离子浓度。

本说明书中，“文库”是指多种抗原结合分子或含有抗原结合分子的多种融合多肽、或编码它们的序列的核酸、多核苷酸。文库中所含的多种抗原结合分子或含有抗原结合分子的多种融合多肽的序列并非单一的序列，而是序列相互不同的抗原结合分子或含有抗原结合分子的融合多肽。

本说明书中，序列相互不同的多种抗原结合分子的记载中的“序列相互不同”这一术语意指文库中的各抗原结合分子的序列相互不同。即，文库中的相互不同的序列的数量反映文库中的序列不同的独立克隆的数量，有时也被视为“文库大小”。通常的噬菌体展示文库为10⁶至10¹²，通过使用核糖体展示法等公知的技术，可将文库大小放大至10¹⁴。然而，噬菌体文库的淘选选择时使用的噬菌体颗粒的实际数目通常比文库大小大10至10,000倍。该过量倍数也称为“文库当量数”，表示具有相同氨基酸序列的各克隆能够存在10至10,000个。所以，本发明中的“序列相互不同”这一术语意指文库当量数除外的文库中的各抗原结合分子的序列相互不同，更具体意指序列相互不同的抗原结合分子存在10⁶至10¹⁴个分子、优选10⁷至10¹²个分子、进一步优选10⁸至10¹¹个分子、特别优选10⁸至10¹²个分子。

此外，本发明的主要由多种抗原结合分子形成的文库这一记载中的术语“多种”，对于例如本发明的抗原结合分子、融合多肽、多核苷酸分子、载体或病毒来说，通常是指这些物质的2种以上的集合。例如，只要某2个以上的物质在特定形态方面相互不同，则表示该物质存在2种以上。作为实例，可举出氨基酸序列中的特定氨基酸位置观察到的突变体氨基酸。例如，当除了柔性残基以外或除了露出于表面的超变氨基酸位置的特定突变体氨基酸以外，序列实质上相同、优选相同的本发明的2个以上的抗原结合分子存在时，则本发明的抗原结合分子存在多种。在其它实施例中，当除了编码柔性残基的碱基以外或除了编码露出于表面的超变氨基酸位置的特定突变体氨基酸的碱基以外实质上相同、优选相同的序列的本发明的2个以上的多核苷酸分子存在时，则本发明的多核苷酸分子存在多种。

进而，本发明的主要由多种抗原结合分子形成的文库的记载中的“主要由...形成”的表述反映出文库中的序列不同的独立克隆的数量中抗原结合分子的抗原结合活性随离子浓度条件而不同的抗原结合分子的数量。具体而言，优选表现出这种结合活性的抗原结合分子在文库中至少存在10⁴个分子。此外，更优选本发明的抗原结合结构域可由表现出这种结合活性的抗原结合分子至少存在10⁵个分子的文库中获得。进一步优选本发明的抗原结合结构域可由表现出这种结合活性的抗原结合分子至少存在10⁶个分子的文库中获得。特别优选本发明的抗原结合结构域可由表现出这种结合活性的抗原结合分子至少存在10⁷个分子的文库中获得。还优选本发明的抗原结合结构域可由表现出这种结合活性的抗原结合分子至少存在10⁸个分子的文库中获得。其它表述中，也可适宜地表述为文库中的序列不同的独立克隆的数量中的抗原结合分子的抗原结合活性随离子浓度条件而不同的抗原结合分子的比例。具体而言，本发明的抗原结合结构域可以由表现出这种结合活性的抗原结合分子占文库中序列不同的独立克隆的数量的0.1％至80％、优选0.5％至60％、更优选1％至40％、进一步优选2％至20％、特别优选4％至10％的文库中获得。融合多肽、多核苷酸分子或载体的情形也与上述相同，可以用分子的数量或全部分子中的比例来表述。此外，病毒的情形也与上述相同，可以用病毒个体的数量或全部个体中的比例来表述。

抗原结合结构域的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化的氨基酸

通过前述筛选方法筛选的本发明的抗原结合结构域或抗体可用任意方法制备，例如，在金属离子为钙离子浓度的情形中，可以使用预先存在的抗体、预先存在的文库(噬菌体文库等)、由对动物进行免疫得到的杂交瘤或来自免疫动物的B细胞制得的抗体或文库、向这些抗体或文库导入能螯合钙的氨基酸(例如天冬氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸突变而得的抗体或文库(能螯合钙的氨基酸(例如天冬氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸的含有率提高的文库或者在特定位置导入能够螯合钙的氨基酸(例如天冬氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸突变而得的文库等)等。

如前所述，作为使抗原结合分子的抗原结合活性随离子浓度条件而变化的氨基酸的实例，例如，在金属离子为钙离子时，只要是形成钙结合模体的氨基酸即可，不论其种类如何。钙结合模体是本领域技术人员所周知的，并且有详细记载(例如Springer等(Cell(2000)102,275-277)、Kawasaki和Kretsinger(Protein Prof.(1995)2,305-490)、Moncrief等(J.Mol.Evol.(1990)30,522-562)、Chauvaux等(Biochem.J.(1990)265,261-265)、Bairoch和Cox(FEBS Lett.(1990)269,454-456)、Davis(New Biol.(1990)2,410-419)、Schaefer等(Genomics(1995)25,638～643)、Economou等(EMBO J.(1990)9,349-354)、Wurzburg等(Structure.(2006)14,6,1049-1058))。即，本发明抗原结合分子中可以含有ASGPR,CD23、MBR、DC-SIGN等C型凝集素等任意的公知钙结合模体。作为这种钙结合模体的优选实例，除了上述之外，还可举出SEQ ID NO:62所述的抗原结合结构域中所含的钙结合模体。

此外，作为抗原结合分子的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化的氨基酸的实例，还可适宜使用具有金属螯合作用的氨基酸。作为具有金属螯合作用的氨基酸的实例，优选可举出例如：丝氨酸(Ser(S))、苏氨酸(Thr(T))、天冬酰胺(Asn(N))、谷氨酰胺(Gln(Q))、天冬氨酸(Asp(D))和谷氨酸(Glu(E))等。

含有前述氨基酸的抗原结合结构域的位置并不限于特定的位置，只要是使抗原结合分子的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化，则可以是形成抗原结合结构域的重链可变区或轻链可变区中的任意位置。即，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，该文库主要由重链的抗原结合结构域中含有使抗原结合分子的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化的氨基酸、且序列相互不同的抗原结合分子形成。此外，在其它非限定的方案中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，该文库主要由重链的CDR3中含有该氨基酸、且序列相互不同的抗原结合分子形成。在其它非限定的方案中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，该文库主要由重链的CDR3的以Kabat编号表示的95位、96位、100a位和/或101位含有该氨基酸、且序列相互不同的抗原结合分子形成。

此外，在本发明的非限定的一个方案中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，该文库主要由轻链的抗原结合结构域中含有使抗原结合分子的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化的氨基酸、且序列相互不同的抗原结合分子形成。此外，在其它方案中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，该文库主要由轻链的CDR1中含有该氨基酸、且序列相互不同的抗原结合分子形成。在其它方案中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，该文库主要由轻链的CDR1的以Kabat编号表示的30位、31位和/或32位含有该氨基酸、且序列相互不同的抗原结合分子形成。

此外，在其它非限定的方式中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，该文库主要由轻链的CDR2中含有该氨基酸残基、且序列相互不同的抗原结合分子形成。在其它方案中，提供下述文库，该文库主要由轻链的CDR2的以Kabat编号表示的50位含有该氨基酸残基、且序列相互不同的抗原结合分子形成。

进而，在其它非限定的方案中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，该文库主要由轻链的CDR3中含有该氨基酸残基、且序列相互不同的抗原结合分子形成。在其它方案中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，该文库主要由轻链的CDR3的以Kabat编号表示的92位含有该氨基酸残基、且序列相互不同的抗原结合分子形成。

此外，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库作为本发明的不同方案来获得，该文库主要由选自上述记载的轻链的CDR1、CDR2和CDR3中的2个或3个CDR含有该氨基酸残基、且序列相互不同的抗原结合分子形成。进而，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，该文库主要由轻链的以Kabat编号表示的30位、31位、32位、50位和/或92位中的任一个以上含有该氨基酸残基、且序列相互不同的抗原结合分子形成。

在特别优选的实施方案中，理想的是抗原结合分子的轻链和/或重链可变区的框架序列具有人的种系框架序列。因此，在本发明的一个方案中，若框架序列完全为人的序列，则认为在给予人(例如疾病的治疗)时，本发明的抗原结合分子基本或完全不会引起免疫原性反应。根据上述含义，本发明的“含有种系序列”意指本发明的框架序列的一部分与任意的人的种系框架序列的一部分相同。例如，在本发明的抗原结合分子的重链FR2的序列为多个不同的人的种系框架序列的重链FR2序列组合得到的序列时，也是本发明的“含有种系序列”的抗原结合分子。

作为框架的实例，优选可举出例如：V-Base(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)等网站中所包括的、现在已知的完全人型框架区域的序列。这些框架区域的序列能够适宜用作本发明的抗原结合分子中所含的种系序列。种系序列可基于其相似性来分类(Tomlinson等(J.Mol.Biol.(1992)227,776-798)Williams和Winter(Eur.J.Immunol.(1993)23,1456-1461)和Cox等(Nat.Genetics(1994)7,162-168))。可以从分类为7个亚类的Vκ、分类为10个亚类的Vλ、分类为7个亚类的VH中适宜选择合适的种系序列。

完全人型VH序列并不仅限于下述，可适宜举出例如：VH1亚类(例如，VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH1-24、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1-69)、VH2亚类(例如，VH2-5、VH2-26、VH2-70)、VH3亚类(VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-72、VH3-73、VH3-74)、VH4亚类(VH4-4、VH4-28、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-59、VH4-61)、VH5亚类(VH5-51)、VH6亚类(VH6-1)、VH7亚类(VH7-4、VH7-81)的VH序列等。它们也记载于公知文献(Matsuda等(J.Exp.Med.(1998)188,1973-1975))等中，本领域技术人员可以基于它们的序列信息适宜设计本发明的抗原结合分子。还可适宜使用它们以外的完全人型框架或框架的亚区(sub-region)。

完全人型VK序列并不仅限于下述，可适宜举出例如：分类为Vk1亚类的A20、A30、L1、L4、L5、L8、L9、L11、L12、L14、L15、L18、L19、L22、L23、L24、O2、O4、O8、O12、O14、O18；分类为Vk2亚类的A1、A2、A3、A5、A7、A17、A18、A19、A23、O1、O11；分类为Vk3亚类的A11、A27、L2、L6、L10、L16、L20、L25；分类为Vk4亚类的B3；分类为Vk5亚类的B2(本说明书中也称为Vk5-2)；分类为VK6亚类的A10、A14、A26等(Kawasaki等(Eur.J.Immunol.(2001)31,1017-1028)、Schable和Zachau(Biol.Chem.Hoppe Seyler(1993)374,1001-1022)和Brensing-Kuppers等(Gene(1997)191,173-181))。

完全人型的VL序列并不仅限于下述，可适宜举出例如：分类为VL1亚类的V1-2、V1-3、V1-4、V1-5、V1-7、V1-9、V1-11、V1-13、V1-16、V1-17、V1-18、V1-19、V1-20、V1-22；分类为VL1亚类的V2-1、V2-6、V2-7、V2-8、V2-11、V2-13、V2-14、V2-15、V2-17、V2-19；分类为VL3亚类的V3-2、V3-3、V3-4；分类为VL4亚类的V4-1、V4-2、V4-3、V4-4、V4-6；分类为VL5亚类的V5-1、V5-2、V5-4、V5-6等(Kawasaki等(GenomeRes.(1997)7,250-261))。

通常这些框架序列根据一个或更多个氨基酸残基的区别而相互不同。这些框架序列可以与本发明的“使抗原结合分子的抗原结合活性随离子浓度条件而变化的至少一个氨基酸残基”一起使用。作为与本发明的“使抗原结合分子的抗原结合活性随离子浓度条件而变化的至少一个氨基酸残基”一起使用的完全人型框架的实例，并不仅限于此，此外还可举出：KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY、POM等(例如，前述的Kabat等(1991)和Wu等(J.Exp.Med.(1970)132,211-250))。

本发明并不受特定理论的束缚，认为种系序列的使用有望排除大多数个体中有害免疫反应的一个原因如下所述。通常的免疫反应中产生的亲和性成熟阶段的结果造成免疫球蛋白的可变区频繁地产生体细胞的突变。这些突变主要产生在其序列为超变的CDR的附近，对框架区域的残基也造成影响。这些框架的突变在种系的基因中不存在，而成为患者的免疫原性的可能性也小。其是由于：通常的人类种群暴露于种系的基因所表达的框架序列的大多数，作为免疫耐受性的结果，预测这些种系的框架在患者中的免疫原性低或为非免疫原性。为了使免疫耐受性的可能性最大，编码可变区的基因可以从通常存在的功能性种系基因的集合中选择。

为了制作本发明的、前述框架序列中含有使抗原结合分子的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化的氨基酸的抗原结合分子，可适宜采用位点特异性诱变法(Kunkel等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82,488-492))或重叠延伸PCR等公知方法。

例如，通过将被选择作为预先含有使抗原结合分子的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化的至少一个氨基酸残基的框架序列的轻链可变区、与被制作为随机可变区序列文库的重链可变区组合，由此可以制作含有本发明的多种序列相互不同的抗原结合分子的文库。作为这样的非限定性实例，在离子浓度为钙离子浓度时，可适宜举出例如：将SEQ ID NO:62(Vk5-2)所述的轻链可变区序列所代表的属于Vk5-2家族的轻链可变区序列和被制作作为随机可变区序列文库的重链可变区组合而成的文库。

此外，也可以进行设计，以使前述被选择作为预先含有使抗原结合分子的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化的至少一个氨基酸残基的框架序列的轻链可变区的序列中含有作为该氨基酸残基以外的残基的各种氨基酸。本发明中，这样的残基也被称为柔性残基。本发明的抗原结合分子的抗原结合活性只要随离子浓度条件而变化，则该柔性残基的数目和位置并不限于特定的方案。即，重链和/或轻链的CDR序列和/或FR序列中可以含有一个或更多个的柔性残基。例如，在离子浓度为钙离子浓度时，作为导入SEQ ID NO:62(Vk5-2)所述的轻链可变区序列中的柔性残基的非限定性实例，可举出表1或表2中所述的氨基酸残基。

[表1]

[表2]

本说明书中，柔性残基是指在与公知和/或天然抗体或抗原结合结构域的氨基酸序列进行比较时，具有在该位置上出现的数个不同氨基酸的轻链和重链可变区上的氨基酸为超变的位置上存在的氨基酸残基的变异。超变的位置一般存在于CDR区域。一个方案中，在确定公知和/或天然抗体的超变位置时，Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest(NationalInstitute of Health BethesdaMd.)(1987年和1991年)所提供的数据是有效的。此外，因特网上的多个数据库(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/、http://www.bioinf.org.uk/abs/index.html)中提供有收集的大量人轻链和重链的序列以及其配置，这些序列及其配置的信息对于确定本发明中的超变位置有用。根据本发明，当氨基酸在某位置具有优选约2至约20、优选约3至约19、优选约4至约18、优选5至17、优选6至16、优选7至15、优选8至14、优选9至13、优选10至12个可能的不同的氨基酸残基的多样性时，可以说该位置是超变的。在数个实施方案中，某氨基酸位置可以具有优选至少约2、优选至少约4、优选至少约6、优选至少约8、优选约10、优选约12个可能的不同氨基酸残基的多样性。

此外，通过将前述导入有使抗原结合分子的抗原结合活性随离子浓度条件而变化的至少一个氨基酸残基的轻链可变区和被制作作为随机可变区序列文库的重链可变区组合，也可以制作含有本发明的多种序列相互不同的抗原结合分子的文库。作为这样的非限定性实例，在离子浓度为钙离子浓度时，优选可举出例如：将SEQ ID NO:5(Vk1)、SEQ ID NO:6(Vk2)、SEQ ID NO:7(Vk3)、SEQ ID NO:8(Vk4)等种系的特定残基取代成使抗原结合分子的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化的至少一个氨基酸残基而成的轻链可变区序列和制作作为随机可变区序列文库的重链可变区组合而得的文库。作为该氨基酸残基的非限定性实例，例示有轻链的CDR1中所含的氨基酸残基。此外，作为该氨基酸残基的非限定性实例，例示有轻链CDR2中所含的氨基酸残基。此外，作为该氨基酸残基的非限定性的其它实例，还例示有轻链CDR3中所含的氨基酸残基。

如前所述，作为该氨基酸残基为轻链CDR1中所含的氨基酸残基的非限定性实例，可举出：轻链可变区的CDR1中的以Kabat编号表示的30位、31位和/或32位的氨基酸残基。此外，作为该氨基酸残基为轻链CDR2中所含的氨基酸残基的非限定性实例，可举出：轻链可变区的CDR2中的以Kabat编号表示的50位的氨基酸残基。进而，作为该氨基酸残基为轻链CDR3中所含的氨基酸残基的非限定性实例，可举出：轻链可变区的CDR3中的以Kabat编号表示的92位的氨基酸残基。此外，这些氨基酸残基只要可形成钙结合模体和/或使抗原结合分子的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化，则这些氨基酸残基可单独含有，也可将这些氨基酸二种以上组合含有。此外，已知具有多个钙离子结合位点、且认为在分子进化上来源于共同起源的肌钙蛋白C、钙调蛋白、小白蛋白、肌球蛋白轻链等，也可以以含有该结合模体的方式来设计轻链CDR1、CDR2和/或CDR3。例如，为了上述目的，可以适宜使用钙黏蛋白结构域、钙调蛋白所含的EF手、蛋白激酶C所含的C2结构域、凝血蛋白因子IX所含的Gla结构域、脱唾液酸糖蛋白受体或甘露糖结合受体所含的C型凝集素、LDL受体所含的A结构域、膜联蛋白、血小板反应蛋白3型结构域和EGF样结构域。

在将前述导入有使抗原结合分子的抗原结合活性随离子浓度条件而变化的至少一个氨基酸残基的轻链可变区和制作作为随机可变区序列文库的重链可变区组合时，和前述相同地，也可以进行设计以使该轻链可变区的序列中含有柔性残基。本发明的抗原结合分子的抗原结合活性只要随离子浓度条件而变化，则该柔性残基的数目和位置并不限于特定的方案。即，重链和/或轻链的CDR序列和/或FR序列中可以含有一个或更多个的柔性残基。例如，在离子浓度为钙离子浓度时，作为导入轻链可变区序列中的柔性残基的非限定性实例，可举出表1或表2中所述的氨基酸残基。

作为进行组合的重链可变区的实例，可适宜举出随机可变区文库。随机可变区文库的制作方法适宜组合公知的方法。在本发明的非限定性的一个方案中，基于用特定抗原免疫的动物、感染疾病患者或接种疫苗而使血中抗体效价上升的人、癌患者、自身免疫疾病的淋巴细胞来源的抗体基因构建的免疫文库可适宜用作随机可变区文库。

此外，在本发明的非限定的一个方案中，将基因组DNA中的V基因或重构功能性V基因的CDR序列，用含有适当长度的编码密码子组的序列的合成寡核苷酸组取代而成的合成文库也可优选用作随机可变区文库。此时，由于观察到重链的CDR3的基因序列的多样性，因而也可仅取代CDR3的序列。抗原结合分子的可变区中产生氨基酸的多样性的基准是，抗原结合分子露出于表面的位置的氨基酸残基具有多样性。露出于表面的位置是指，基于抗原结合分子的结构、结构总体和/或模型化结构，判断为可以露出表面和/或可与抗原接触的位置，通常为其CDR。露出于表面的位置优选使用InsightII程序(Accelrys)之类的计算机程序，使用来自抗原结合分子的三维模型的坐标来确定。露出于表面的位置可使用本技术领域公知的算法(例如，Lee和Richards(J.Mol.Biol.(1971)55,379-400)、Connolly(J.Appl.Cryst.(1983)16,548-558))来确定。露出于表面的位置的确定可使用由适于蛋白质建模的软件和抗体得到的三维结构信息来进行。作为可用于上述目的的软件，优选可举出SYBYL Biopolymer Module软件(Tripos Associates)。通常或优选地，在算法需要使用者输入大小参数时，计算中使用的探针的“大小”设定为半径约1.4埃以下。进而，使用个人电脑用软件的露出于表面的区域和面积的确定方法记载于Pacios(Comput.Chem.(1994)18(4),377-386和J.Mol.Model.(1995)1,46-53)中。

进而，在本发明的一个非限定的方案中，由来源于健康人淋巴细胞的抗体基因构建、且其组成成分由不含偏差的抗体序列即天然序列构成的天然文库也可特别适宜用作随机可变区文库(Gejima等(Human Antibodies(2002)11,121-129)和Cardoso等(Scand.J.Immunol.(2000)51,337-344))。本发明中记载的含有天然序列的氨基酸序列是指从上述天然文库中获得的氨基酸序列。

本发明的一个方案中，通过将被选择作为预先含有“使抗原结合分子的抗原结合活性随离子浓度条件而变化的至少一个氨基酸残基”的框架序列的重链可变区、和制作作为随机可变区序列文库的轻链可变区组合，可以由含有本发明的多种序列相互不同的抗原结合分子的文库获得本发明的抗原结合结构域。作为这样的非限定性实例，在离子浓度为钙离子浓度时，可适宜举出例如：将SEQ ID NO:9(6RL#9-IgG1)或SEQ ID NO:10(6KC4-1#85-IgG1)所述的重链可变区序列和制作作为随机可变区序列文库的轻链可变区组合而得的文库。此外，也可以通过代替制作作为随机可变区序列文库的轻链可变区，而从具有种系序列的轻链可变区中适宜选择来制作。可适宜举出例如：将SEQ ID NO:9(6RL#9-IgG1)或SEQ ID NO:10(6KC4-1#85-IgG1)所述的重链可变区序列和具有种系序列的轻链可变区组合而得的文库。

此外，也可以进行设计，以使前述被选择作为预先含有“使抗原结合分子的抗原结合活性随离子浓度条件而变化的至少一个氨基酸残基”的框架序列的重链可变区的序列中含有柔性残基。本发明的抗原结合分子的抗原结合活性只要随离子浓度条件而变化，则该柔性残基的数目和位置并不限于特定的方案。即，重链和/或轻链的CDR序列和/或FR序列中可以含有一个或更多个的柔性残基。例如，在离子浓度为钙离子浓度时，作为导入SEQID NO:9(6RL#9-IgG1)所述的重链可变区序列中的柔性残基的非限定性实例，除了重链CDR1和CDR2的全部氨基酸残基之外，可举出重链CDR3的95位、96位和/或100a位以外的CDR3的氨基酸残基。或者作为导入SEQID NO:10(6KC4-1#85-IgG1)所述的重链可变区序列中的柔性残基的非限定性实例，除了重链CDR1和CDR2的全部氨基酸残基之外，还可举出重链CDR3的95位和/或101位以外的CDR3的氨基酸残基。

此外，通过将前述导入有“使抗原结合分子的抗原结合活性随离子浓度条件而变化的至少一个氨基酸残基”的重链可变区和制作作为随机可变区序列文库的轻链可变区或具有种系序列的轻链可变区组合，也可以制作含有多种序列相互不同的抗原结合分子的文库。作为这样的非限定性实例，在离子浓度为钙离子浓度时，优选可举出例如：将重链可变区的特定残基取代成使抗原结合分子的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化的至少一个氨基酸残基的重链可变区序列和制作作为随机可变区序列文库的轻链可变区或具有种系序列的轻链可变区组合而得的文库。作为该氨基酸残基的非限定性实例，例示有重链的CDR1中所含的氨基酸残基。此外，作为该氨基酸残基的非限定性实例，还例示有重链的CDR2中所含的氨基酸残基。此外，作为该氨基酸残基的其它非限定性实例，还例示有重链的CDR3中所含的氨基酸残基。作为该氨基酸残基为重链的CDR3中所含的氨基酸残基的非限定性实例，可举出重链可变区的CDR3中的以Kabat编号表示的95位、96位、100a位和/或101位的氨基酸。此外，这些氨基酸残基只要可形成钙结合模体和/或使抗原结合分子的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化，则这些氨基酸残基可单独含有，也可将这些氨基酸二个以上组合含有。

在将前述导入有使抗原结合分子的抗原结合活性随离子浓度条件而变化的至少一个氨基酸残基的重链可变区和制作作为随机可变区序列文库的轻链可变区或具有种系序列的轻链可变区组合时，与前述相同地，也可以进行设计以使该重链可变区的序列中含有柔性残基。本发明的抗原结合分子的抗原结合活性只要随离子浓度条件而变化，则该柔性残基的数目和位置并不限于特定的方案。即，重链的CDR序列和/或FR序列中可以含有一个或更多个的柔性残基。此外，作为使抗原结合分子的抗原结合活性随离子浓度条件而变化的氨基酸残基以外的重链可变区的CDR1、CDR2和/或CDR3的氨基酸序列，还可适宜使用随机可变区文库。在使用种系序列作为轻链可变区时，可举出例如SEQ ID NO:5(Vk1)、SEQ ID NO:6(Vk2)、SEQID NO:7(Vk3)、SEQ ID NO:8(Vk4)等种系序列作为非限定性实例。

作为前述使抗原结合分子的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化的氨基酸，只要形成钙结合模体，则任意的氨基酸均可适宜使用，作为这样的氨基酸，具体可举出具有供电子性的氨基酸。作为这种具有供电子性的氨基酸，优选可例示丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸或谷氨酸。

氢离子浓度条件

此外，在本发明的一个方案中，离子浓度条件是指氢离子浓度条件或pH条件。本发明中，将质子即氢原子的原子核的浓度条件与氢指数(pH)的条件视为相同含义。水溶液中的氢离子的活性量用aH+表示时，则pH定义为-log10aH+。水溶液中的离子强度若(例如与10^-3相比)低，则aH+大致与氢离子强度相等。例如25℃、1个大气压下的水的离子积为Kw＝aH+aOH＝10^-14，因而对纯水来说，aH+＝aOH＝10^-7。此时的pH＝7为中性，pH小于7的水溶液为酸性，pH大于7的水溶液为碱性。

本发明中，使用pH条件来作为离子浓度条件时，作为pH条件，可举出高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件与低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件。结合活性随pH条件而变化是指，高氢离子浓度或低pH(pH酸性范围)和低氢离子浓度或高pH(pH中性范围)的条件的不同导致抗原结合分子的抗原结合活性发生变化。可举出例如，pH中性范围条件下抗原结合分子的抗原结合活性高于pH酸性范围条件下抗原结合分子的抗原结合活性的情形。此外还可举出，pH酸性范围条件下抗原结合分子的抗原结合活性高于pH中性范围条件下抗原结合分子的抗原结合活性的情形。

本说明书中，pH中性范围并不特别限于统一的数值，优选可从pH6.7至pH10.0之间选择。此外，在其它方案中，可以从pH6.7至pH9.5之间选择。此外，在不同的方案中，可以从pH7.0至pH9.0之间选择，在其它方案中，可以从pH7.0至pH8.0之间选择。特别优选可举出与机体内血浆中(血中)的pH接近的pH7.4。

本说明书中，pH酸性范围并不特别限于统一的数值，优选可从pH4.0至pH6.5之间选择。此外，在其它方案中，可以从pH4.5至pH6.5之间选择。此外，在不同的方案中，可以从pH5.0至pH6.5之间选择，在其它方案中，可以从pH5.5至pH6.5之间选择。特别优选可举出与机体内的早期内体内的离子化钙浓度接近的pH5.8。

本发明中，抗原结合分子的高氢离子浓度或低pH(pH酸性范围)条件下的抗原结合活性若比低氢离子浓度或高pH(pH中性范围)条件下的抗原结合活性低，则意指抗原结合分子在选自pH4.0至pH6.5之间的pH下的抗原结合活性比在选自pH6.7至pH10.0之间的pH下的抗原结合活性弱。优选意指抗原结合分子在选自pH4.5至pH6.5之间的pH下的抗原结合活性比在选自pH6.7至pH9.5之间的pH下的抗原结合活性弱，更优选意指抗原结合分子在选自pH5.0至pH6.5之间的pH下的抗原结合活性比在选自pH7.0至pH9.0之间的pH下的抗原结合活性弱。此外，优选意指抗原结合分子在选自pH5.5至pH6.5之间的pH下的抗原结合活性比在选自pH7.0至pH8.0之间的pH下的抗原结合活性弱。特别优选意指机体内的早期内体内的pH下的抗原结合活性比机体内的血浆中的pH下的抗原结合活性弱，具体意指抗原结合分子在pH5.8下的抗原结合活性比在pH7.4下的抗原结合活性弱。

抗原结合分子的抗原结合活性随pH条件而变化与否可以使用例如前述结合活性项目中记载的公知测定方法来确定。即，利用该测定方法测定不同pH条件下的结合活性。例如，为了确认与pH酸性范围条件下抗原结合分子的抗原结合活性相比，pH中性范围条件下抗原结合分子的抗原结合活性变高，对pH酸性范围和pH中性范围条件下抗原结合分子的抗原结合活性进行比较。

进而，在本发明中，“高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性比低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合活性低”的表述也可以表述为抗原结合分子的低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合活性比高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性高。应予说明，本发明中有时也将“高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性比低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合活性低”记载为“高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性比低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合能力弱”，此外，有时也将“使高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性比低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合活性低”记载为“使高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性比低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合能力弱”。

本领域技术人员可以适宜选择测定抗原结合活性时的氢离子浓度或pH以外的条件，对此没有特别限定。例如，可以在HEPES缓冲液、37℃的条件下进行测定。例如，可以使用Biacore(GE Healthcare)等进行测定。对于抗原结合分子和抗原的结合活性的测定，在抗原为可溶型抗原时，通过对固定有抗原结合分子的芯片流过作为分析物的抗原，由此可以评价对可溶型抗原的结合活性，在抗原为膜型抗原时，通过对固定有抗原的芯片流过作为分析物的抗原结合分子，由此可以评价对膜型抗原的结合活性。

本发明的抗原结合分子中，只要高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性比低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合活性弱，则高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性与低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合活性之比没有特别限定，优选相对于抗原的高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的KD(Dissociation constant：解离常数)和低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的KD之比KD(pH5.8)/KD(pH7.4)的值为2以上，进一步优选KD(pH5.8)/KD(pH7.4)的值为10以上，进一步优选KD(pH5.8)/KD(pH7.4)的值为40以上。KD(pH5.8)/KD(pH7.4)的值的上限没有特别限定，只要本领域技术人员的技术可以制作，则可以为400、1000、10000等任意的值。

作为抗原结合活性的值，在抗原为可溶型抗原时可以使用KD(解离常数)，而在抗原为膜型抗原时可以使用表观KD(Apparent dissociationconstant：表观解离常数)。KD(解离常数)和表观KD(表观解离常数)可通过本领域技术人员公知的方法进行测定，例如可使用Biacore(GE healthcare)、斯卡查德图、流式细胞仪等。

此外，作为示出本发明的抗原结合分子在高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性与低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合活性之比的其它指标，还可适宜使用例如，解离速率常数kd(Dissociation rate constant：解离速率常数)。代替KD(解离常数)而使用kd(解离速率常数)来作为示出结合活性之比的指标时，相对于抗原的高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的kd(解离速率常数)与低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的kd(解离速率常数)之比kd(pH酸性范围条件下)/kd(pH中性范围条件下)的值优选为2以上、进一步优选为5以上、进一步优选为10以上、更优选为30以上。Kd(pH酸性范围条件下)/kd(pH中性范围条件下)的值的上限没有特别限定，只要本领域技术人员的技术常识可以制作，则可以为50、100、200等任意的值。

作为抗原结合活性的值，在抗原为可溶型抗原时可以使用kd(解离速率常数)，在抗原为膜型抗原时可以使用表观kd(Apparent dissociation rateconstant：表观解离速率常数)。kd(解离速率常数)和表观kd(表观解离速率常数)可通过本领域技术人员公知的方法测定，例如可使用Biacore(GEhealthcare)、流式细胞仪等。应予说明本发明中，在测定不同氢离子浓度即pH下的抗原结合分子的抗原结合活性时，氢离子浓度即pH以外的条件优选为相同。

例如，作为本发明提供的一个方案的高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性比低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合活性低的抗原结合结构域或抗体可以通过包括以下步骤(a)～(c)的抗原结合结构域或抗体的筛选来获得：

(a)获得pH酸性范围条件下抗原结合结构域或抗体的抗原结合活性的步骤；

(b)获得pH中性范围条件下抗原结合结构域或抗体的抗原结合活性的步骤；以及

(c)选择pH酸性范围条件下的抗原结合活性比pH中性范围条件下的抗原结合活性低的抗原结合结构域或抗体的步骤。

进而，作为本发明提供的一个方案的高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性比低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合活性低的抗原结合结构域或抗体可以通过包括以下步骤(a)～(c)的抗原结合结构域或抗体或其文库的筛选来获得：

(a)使pH中性范围条件下抗原结合结构域或抗体或其文库与抗原接触的步骤；

(b)将在前述步骤(a)中与抗原结合的抗原结合结构域或抗体置于pH酸性范围条件的步骤；以及

此外，作为本发明提供的一个方案的高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性比低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合活性低的抗原结合结构域或抗体可以通过包括以下步骤(a)～(d)的抗原结合结构域或抗体或其文库的筛选来获得：

(a)在pH酸性范围条件下使抗原结合结构域或抗体的文库与抗原接触的步骤；

(c)使在前述步骤(b)中选择的抗原结合结构域或抗体在pH中性范围条件下与抗原结合的步骤；以及

进而，作为本发明提供的一个方案的高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性比低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合活性低的抗原结合结构域或抗体可以通过包括以下步骤(a)～(c)的筛选方法来获得：

(a)在pH中性范围条件下使抗原结合结构域或抗体的文库与固定有抗原的柱接触的步骤；

(b)将在前述步骤(a)中与柱结合的抗原结合结构域或抗体在pH酸性范围条件从柱洗脱的步骤；以及

进而，作为本发明提供的一个方案的高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性比低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合活性低的抗原结合结构域或抗体可以通过包括以下步骤(a)～(d)的筛选方法来获得：

(a)在pH酸性范围条件下使抗原结合结构域或抗体的文库通过固定有抗原的柱的步骤；

(c)使在前述步骤(b)中回收的抗原结合结构域或抗体在pH中性范围条件与抗原结合的步骤；以及

(a)在pH中性范围条件下使抗原结合结构域或抗体的文库与抗原接触的步骤；

(c)将在前述步骤(b)中获得的抗原结合结构域或抗体置于pH酸性范围条件下的步骤；以及

(d)对在前述步骤(c)中抗原结合活性弱于前述步骤(b)中选择的标准的抗原结合结构域或抗体进行分离的步骤。

应予说明，前述步骤可以重复2次以上。所以，根据本发明，可提供通过上述筛选方法中进一步包括将(a)～(c)或(a)～(d)的步骤重复2次以上的步骤的筛选方法而获得的pH酸性范围条件下的抗原结合活性低于pH中性范围条件下的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗体。(a)～(c)或(a)～(d)的步骤的重复次数没有特别限定，通常为10次以内。

本发明的筛选方法中，高氢离子浓度条件或低pH即pH酸性范围下的抗原结合结构域或抗体的抗原结合活性只要是pH为4.0～6.5之间的抗原结合活性则没有特别限定，作为优选的pH，可举出pH为4.5～6.6之间的抗原结合活性。作为其它的优选pH，可举出pH为5.0～6.5之间的抗原结合活性，进而可举出pH为5.5～6.5之间的抗原结合活性。作为更优选的pH，可举出机体内的早期内体内的pH，具体可举出pH5.8下的抗原结合活性。此外，低氢离子浓度条件或高pH即pH中性范围下的抗原结合结构域或抗体的抗原结合活性只要是pH为6.7～10之间的抗原结合活性则没有特别限定，作为优选的pH，可举出pH为6.7～9.5之间的抗原结合活性。作为其它的优选pH，可举出pH为7.0～9.5之间的抗原结合活性，进而可举出pH为7.0～8.0之间的抗原结合活性。作为更优选的pH，可举出机体内的血浆中的pH，具体可举出pH为7.4下的抗原结合活性。

抗原结合结构域或抗体的抗原结合活性可通过本领域技术人员公知的方法测定，对于离子化钙浓度以外的条件，本领域技术人员可以适宜确定。抗原结合结构域或抗体的抗原结合活性可以作为KD(Dissociation constant：解离常数)、表观KD(Apparent dissociation constant：表观解离常数)、解离速率kd(Dissociation rate：解离速率常数)或表观kd(Apparent dissociation：表观解离速率常数)等来进行评价。它们可以通过本领域技术人员公知的方法来测定，例如可以使用Biacore(GE healthcare)、斯卡查德图、FACS等。

本发明中，选择低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合活性比高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性高的抗原结合结构域或抗体的步骤，与选择高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性比低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合活性低的抗原结合结构域或抗体的步骤含义相同。

只要低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合活性比高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性高，则低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合活性与高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性之差没有特别限定，优选低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合活性为高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性的2倍以上，进一步优选为10倍以上，更优选为40倍以上。

通过前述筛选方法筛选的本发明的抗原结合结构域或抗体可用任意方法制备，例如，可以使用预先存在的抗体、预先存在的文库(噬菌体文库等)、由对动物进行免疫得到的杂交瘤或来自免疫动物的B细胞制作得到的抗体或文库、向这些抗体或文库导入侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸突变而得的抗体或文库(侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸的含有率提高的文库、在特定位置导入侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸突变而成的文库等)等。

作为从由对动物进行免疫得到的杂交瘤或来自免疫动物的B细胞制作的抗原结合结构域或抗体中获得低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合活性比高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性高的抗原结合结构域或抗体的方法，优选可举出例如：将如WO2009/125825中所记载的抗原结合结构域或抗体中的氨基酸的至少一个取代成侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸突变的抗原结合分子或抗体、或者在抗原结合结构域或抗体中插入侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸的抗原结合分子或抗体。

导入侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸突变的位置没有特别限定，只要与取代或插入前相比，pH酸性范围下的抗原结合活性变得比pH中性范围下的抗原结合活性弱(KD(pH酸性范围)/KD(pH中性范围)的值变大或kd(pH酸性范围)/kd(pH中性范围)的值变大)，则可以是任意位点。例如，在抗原结合分子为抗体时，优选可举出抗体的可变区或CDR等。本领域技术人员可以适宜确定取代成侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸的氨基酸的数目或插入的氨基酸的数目，可以被侧链的pKa为4.0-8.0的1个氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸所取代，可以插入侧链的pKa为4.0-8.0的1个氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸，可以被侧链的pKa为4.0-8.0的2个以上的多个氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸所取代，可以插入侧链的pKa为4.0-8.0的2个以上的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸。此外，除了取代成侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸或插入侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸以外，也可以同时进行其它的氨基酸的缺失、添加、插入和/或取代等。取代成侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸或插入侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸，可以通过本领域技术人员公知的丙氨酸扫描的丙氨酸取代成组氨酸等而成的组氨酸等扫描等方法随机地进行，从随机地导入了侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸的取代或插入的突变的抗原结合结构域或抗体中，可以选着与突变前相比KD(pH酸性范围)/KD(pH中性范围)或kd(pH酸性范围)/kd(pH中性范围)的值变大的抗原结合分子。

如前所述，作为进行了突变为其侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸、并且pH酸性范围下的抗原结合活性比pH中性范围下的抗原结合活性低的抗原结合分子的优选实例，优选可举出例如：突变为其侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸后的pH中性范围下的抗原结合活性与突变为其侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸前的pH中性范围下的抗原结合活性同等的抗原结合分子。本发明中，突变为其侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸后的抗原结合分子具有与突变为其侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸前的抗原结合分子同等的抗原结合活性是指，将突变为其侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸前的抗原结合分子的抗原结合活性作为100％时，突变为其侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸后的抗原结合分子的抗原结合活性为至少10％以上、优选50％以上、进一步优选80％以上、更优选90％以上。突变为其侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸后的pH7.4下的抗原结合活性可以比突变为其侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸前的pH7.4下的抗原结合活性变高。通过取代成或插入其侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸而使抗原结合分子的抗原结合活性变低时，可以通过抗原结合分子中的1个或多个氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入等来使抗原结合活性与其侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸的取代或插入前的抗原结合活性同等。本发明中也包括如上述的侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸的取代或插入后进行1个或多个氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入而使结合活性变得同等的抗原结合分子。

进而，抗原结合分子为含有抗体恒定区的物质时，作为pH酸性范围下的抗原结合活性比pH中性范围下的抗原结合活性低的抗原结合分子的优选的其它方案，可举出改变了抗原结合分子中所含的抗体恒定区的方法。作为改变后的抗体恒定区的具体例，优选可举出例如：SEQ ID NO:11、12、13或14所述的恒定区。

使抗原结合结构域的抗原结合活性随氢离子浓度条件而变化的氨基酸

通过前述筛选方法筛选的本发明的抗原结合结构域或抗体可以用任意方法制备，例如，在离子浓度条件为氢离子浓度条件或pH条件时，可以使用预先存在的抗体、预先存在的文库(噬菌体文库等)、由对动物进行免疫得到的杂交瘤或来自免疫动物的B细胞制得的抗体或文库、向这些抗体或文库导入侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸的突变而得的抗体或文库(侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸的含有率提高的文库或在特定位置导入了侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸的突变而成的文库等)等。

此外，作为本发明的非限定的一个方案，通过将导入有“使抗原结合分子的抗原结合活性随氢离子浓度条件而变化的至少一个氨基酸残基”的轻链可变区和被制作作为随机可变区序列文库的重链可变区组合，也可以制作含有本发明的多种序列相互不同的抗原结合分子的文库。

作为该氨基酸残基的非限定性实例，例示有轻链的CDR1中所含的氨基酸残基。此外，作为该氨基酸残基的非限定性实例，例示有轻链CDR2中所含的氨基酸残基。此外，作为该氨基酸残基的非限定性的其它实例，还例示有轻链CDR3中所含的氨基酸残基。

如前所述，作为该氨基酸残基为轻链CDR1中所含的氨基酸残基的非限定性实例，可举出：轻链可变区的CDR1中的以Kabat编号表示的24位、27位、28位、31位、32位和/或34位的氨基酸残基。此外，作为该氨基酸残基为轻链CDR2中所含氨基酸残基的非限定性实例，可举出：轻链可变区的CDR2中的以Kabat编号表示的50位、51位、52位、53位、54位、55位和/或56位的氨基酸残基。进而，作为该氨基酸残基为轻链CDR3中所含的氨基酸残基的非限定性实例，可举出：轻链可变区的CDR3中的以Kabat编号表示的89位、90位、91位、92位、93位、94位和/或95A位的氨基酸残基。此外，这些氨基酸残基只要可使抗原结合分子的抗原结合活性随氢离子浓度条件而变化，则这些氨基酸残基可单独含有，也可以将这些氨基酸二种以上组合含有。

在将前述导入有“使抗原结合分子的抗原结合活性随氢离子浓度条件而变化的至少一个氨基酸残基”的轻链可变区和制作作为随机可变区序列文库的重链可变区组合时，和前述相同地，也可以进行设计以使该轻链可变区的序列中含有柔性残基。本发明的抗原结合分子的抗原结合活性只要随氢离子浓度条件而变化，则该柔性残基的数目和位置并不限于特定的方案。即，重链和/或轻链的CDR序列和/或FR序列中可以含有一个或更多个的柔性残基。例如，作为导入轻链可变区序列中的柔性残基的非限定性实例，可举出表3或表4中所述的氨基酸残基。此外，作为使抗原结合分子的抗原结合活性随氢离子浓度条件而变化的氨基酸残基和柔性残基以外的轻链可变区的氨基酸序列，作为非限定性实例优选可使用：Vk1(SEQ ID NO:5)、Vk2(SEQ ID NO:6)、Vk3(SEQ ID NO:7)、Vk4(SEQ ID NO:8)等种系序列。

[表3]

(位置表示Kabat编号)。

[表4]

(位置表示Kabat编号)。

作为前述使抗原结合分子的抗原结合活性随氢离子浓度条件而变化的氨基酸残基，还可适宜使用任意的氨基酸残基，作为这种氨基酸残基，具体可举出侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸。作为这种具有供电子性的氨基酸，除了组氨酸或谷氨酸等天然氨基酸之外，优选可例示组氨酸类似物(US20090035836)或m-NO2-Tyr(pKa7.45)、3,5-Br2-Tyr(pKa7.21)或3,5-I2-Tyr(pKa7.38)等非天然氨基酸(Bioorg.Med.Chem.(2003)11(17),3761-2768。此外，作为该氨基酸残基的特别优选的实例，可举出侧链的pKa为6.0-7.0的氨基酸。作为这种具有供电子性的氨基酸，可适宜例示组氨酸。

为了改变抗原结合结构域的氨基酸，可适宜采用位点特异性诱变法(Kunkel等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82,488-492))或重叠延伸PCR等公知的方法。此外，作为取代成天然氨基酸以外的氨基酸的氨基酸改变方法，还可采用多种公知的方法(Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.(2006)35,225-249、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2003)100(11),6353-6357)。还可适宜使用例如：含有作为终止密码子之一的UAG密码子(琥珀密码子)的互补琥珀抑制基因tRNA上连接有非天然氨基酸而成的tRNA的无细胞翻译系统(Clover Direct(Protein Express))等。

作为进行组合的重链可变区的实例，优选可举出随机可变区文库。随机可变区文库的制作方法适宜组合公知的方法。在本发明的非限定性的一个方案中，基于用特定抗原免疫的动物、感染疾病患者或接种疫苗而使血中抗体效价上升的人、癌患者、自身免疫疾病的淋巴细胞来源的抗体基因构建的免疫文库可优选用作随机可变区文库。

此外，在本发明的非限定的一个方案中，与前述相同地，将基因组DNA中的V基因或重构功能性V基因的CDR序列，用含有适当长度的编码密码子组的序列的合成寡核苷酸组取代而成的合成文库也可优选用作随机可变区文库。此时，由于观察到重链的CDR3的基因序列的多样性，因而也可仅取代CDR3的序列。抗原结合分子的可变区中产生氨基酸的多样性的基准是，抗原结合分子的露出于表面的位置的氨基酸残基具有多样性。露出于表面的位置是指，基于抗原结合分子的结构、结构总体和/或模型化结构，判断为可以露出于表面和/或可与抗原接触的位置，通常为其CDR。露出于表面的位置优选使用InsightII程序(Accelrys)之类的计算机程序，使用来自抗原结合分子的三维模型的坐标来确定。露出于表面的位置可使用本技术领域公知的算法(例如，Lee和Richards(J.Mol.Biol.(1971)55,379-400)、Connolly(J.Appl.Cryst.(1983)16,548-558))来确定。露出于表面的位置的确定可使用由适于蛋白质建模的软件和抗体得到的三维结构信息来进行。作为可用于上述目的的软件，优选可举出SYBYL BiopolymerModule软件(Tripos Associates)。通常或优选地，在算法需要使用者输入大小参数时，计算中使用的探针的“大小”设定为半径约1.4埃以下。进而，使用个人电脑用软件的露出于表面的区域和面积的确定方法记载于Pacios(Comput.Chem.(1994)18(4),377-386和J.Mol.Model.(1995)1,46-53)中。

进而，在本发明的非限定的一个方案中，由来源于健康人淋巴细胞的抗体基因构建、且其所有组成成分由不含偏差的抗体序列即天然序列构成的天然文库也可特别适宜用作随机可变区文库(Gejima等(Human Antibodies(2002)11,121-129)和Cardoso等(Scand.J.Immunol.(2000)51,337-344))。

中和活性

在本发明的非限定的一个方案中，提供抗原结合分子和含有该抗原结合分子的药物组合物，所述抗原结合分子含有：pH酸性范围下具有人FcRn结合活性，且抗原结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域；以及，在pH中性范围条件下Fcγ受体结合活性与EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG的Fc区的Fcγ受体结合活性相比高的Fcγ受体结合结构域，具有针对抗原的中和活性。通常，中和活性是指抑制病毒或毒素等对细胞具有生物学活性的配体的该生物学活性的活性。即，具有中和活性的物质是指，与该配体或该配体所结合的受体结合，来抑制该配体与受体的结合的物质。由于中和活性使与配体的结合得到抑制的受体无法发挥通过该受体的生物学活性。抗原结合分子为抗体时，具有这样的中和活性的抗体通常被称为中和抗体。某被测物质的中和活性可通过在该被测物质的存在或不存在下的条件之间对配体存在下的生物学活性进行比较来测定。

例如，作为IL-6R的主要配体而被考虑的物质，可适宜举出：由SEQ IDNO:15表示的IL-6。其氨基末端形成胞外结构域的I型膜蛋白的IL-6R与因IL-6诱导而二聚化的gp130受体一起形成异四聚体(HEINRICH等人(Biochem.J.(1998)334,297-314))。由于该异四聚体的形成，与gp130受体缔合的Jak发生活化。Jak进行自磷酸化和受体的磷酸化。受体和Jak的磷酸化位点对于属于Stat3这样的具有SH2的Stat家族的分子、MAP激酶、PI3/Akt、其它具有SH2的蛋白或衔接头发挥结合位点的功能。接着，与gp130受体结合的Stat通过Jak进行磷酸化。磷酸化的Stat形成二聚体而转移到核内，调节靶基因的转录。Jak或Stat也可以经由其它类的受体而参与信号级联。不受控制的IL-6的信号级联在自身免疫疾病的病态或炎症、多发性骨髓瘤或前列腺癌等的癌症中被观察。可作为癌基因发挥作用的Stat3在多种癌症中稳态性活化。在前列腺癌和多发性骨髓瘤中，源自IL-6R的信号级联和源自上皮生长因子受体(EGFR)家族成员的信号级联之间存在交互作用(Ishikawa等人(J.Clin.Exp.Hematopathol.(2006)46(2),55-66))。

这样的细胞内的信号级联根据每一细胞种而不同，因此可对作为目标的每一靶细胞设定适宜的靶分子，不限定于上述的因子。通过测定机体内信号的活化，可以评价中和活性。此外，以对存在于机体内信号级联下游的靶基因的转录诱导作用作为指标，也可以检测机体内信号的活化。靶基因的转录活性变化可以通过报道基因测定的原理进行检测。具体而言，将GFP(绿色荧光蛋白)或萤光素酶等报道基因配置在靶基因的转录因子或启动子区的下游，通过测定该报道基因活性，可以将转录活性变化作为报道基因活性进行测定。机体内信号的活化的测定试剂盒可适宜使用市售的试剂盒(例如，Mercury Pathway Profiling Luciferase System(Clontech)等)。

进而，通常作为测定作用于在促进细胞生长的方向上发挥功能的信号级联的EGF受体家族等的受体配体的中和活性的方法，可以通过测定作为靶标的细胞的生长活性，来评价中和抗体的中和活性。例如，作为评价或测定对于其生长受例如HB-EGF等EGF家族的生长因子促进的细胞生长的、基于抗HB-EGF抗体的中和活性的抑制效果的方法，可适宜使用以下的方法。作为在试验管内评价或测定该细胞生长抑制活性的方法，可以使用测定活细胞摄入培养基中添加的[3H]标记的胸苷作为DNA复制能力指标的方法。作为更简便的方法，可以使用在显微镜下计测台盼蓝等染料排除到细胞外的能力的染料排除法或MTT法。后者利用了：活细胞具有将四氮唑盐MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑)转换为蓝色的甲(formazan)产物的能力。更具体而言，向被测细胞的培养液中添加配体和被测抗体，经过一定时间后，将MTT溶液加入培养液中静置一定时间，由此MTT被摄入到细胞内。其结果，黄色化合物MTT由于细胞内的线粒体内的琥珀酸脱氢酶而变换为蓝色化合物。使该蓝色生成物溶解、显色后，测定其吸光度，以此作为活细胞数的指标。除了MTT之外，还可适宜使用市售的(nacalai tesque等)MTS、XTT、WST-1、WST-8等试剂。在活性测定时，将作为对照抗体的与抗HB-EGF抗体具有相同同种型的抗体且不具有该细胞生长抑制活性的结合抗体、和抗HB-EGF抗体同样进行使用，抗HB-EGF抗体显示较对照抗体强的细胞生长抑制活性，由此可以判定活性。

作为用于评价活性的细胞，可适宜使用例如作为其生长受HB-EGF促进的细胞的、卵巢癌细胞RMG-1细胞株或者用连接有编码人EGFR胞外结构域与小鼠GCSF受体胞内结构域框内融合而成的融合蛋白hEGFR/mG-CSFR的基因以表达的载体转化的小鼠Ba/F3细胞等。如此，本领域技术人员可以通过适宜选择用于评价活性的细胞，来用于上述的细胞生长活性的测定。

本发明所提供的抗原结合分子，可使抗原从血浆中消除，因此，抗原结合分子自身具有中和活性并不绝对必要。但是进一步优选，在由于Fcγ受体介导的胞吞作用而抗原与抗原结合分子一起被摄入到表达Fcγ受体的细胞内为止的期间，通过对抗原发挥中和活性来阻断存在于血浆中的抗原的功能。

此外，本发明所提供的抗原结合分子，可促进在细胞外与抗原结合分子结合的抗原在细胞内从抗原结合分子解离，因此在细胞内从抗原结合分子解离的抗原在溶酶体中被分解。因此，抗原结合分子自身具有中和活性并不绝对必要。但是进一步优选，在由于Fcγ受体介导的胞吞作用而抗原与抗原结合分子一起被摄入到表达Fcγ受体的细胞内为止的期间，通过对抗原发挥中和活性阻断存在于血浆中的抗原的功能。

进而，本发明所提供的抗原结合分子，可使血浆中的总抗原浓度或游离抗原浓度减少，因此抗原结合分子自身具有中和活性并不绝对必要。但是进一步优选，在由于Fcγ受体介导的胞吞作用而抗原与抗原结合分子一起被摄入到表达Fcγ受体的细胞内为止的期间，通过对抗原发挥中和活性来阻断存在于血浆中的抗原的功能。

Fcγ受体

Fcγ受体(也记载为FcγR)是指可以与IgG1、IgG2、IgG3、IgG4单克隆抗体的Fc区结合的受体，实质上意指Fcγ受体基因所编码的蛋白家族的任一成员。对于人来说，该家族包括：含有同种型FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc的FcγRI(CD64)；含有同种型FcγRIIa(含有同种异型H131和R131)、FcγRIIb(含有FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)和FcγRIIc的FcγRII(CD32)；和含有同种型FcγRIIIa(含有同种异型V158和F158)和FcγRIIIb(含有同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)的FcγRIII(CD16)；以及任意的未发现的人FcγR类或FcγR同种型或同种异型，但并不限定于此。FcγR包括来源于人、小鼠、大鼠、兔和猴的FcγR，但并不限定于此，可来源于任意的生物。小鼠FcγR类中包括：FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)和FcγRIII-2(FcγRIV、CD16-2)以及任意的未发现的小鼠FcγR类或FcγR同种型或同种异型，但并不限定于此。作为这种Fcγ受体的优选实例，可举出：人FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)、FcγRIIb(CD32)、FcγRIIIa(CD16)和/或FcγRIIIb(CD16)。人FcγRI的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于SEQ IDNO:16(NM_000566.3)和17(NP_000557.1)中；人FcγRIIa(同种异型H131)的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于SEQ ID NO:18(BC020823.1)和19(AAH20823.1)(同种异型R131是SEQ ID NO:19的166位的氨基酸被取代成Arg的序列)中；FcγRIIb的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于SEQID NO:20(BC146678.1)和21(AAI46679.1)中；FcγRIIIa的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于SEQ ID NO:22(BC033678.1)和23(AAH33678.1)中；和FcγRIIIb的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于SEQ ID NO:24(BC128562.1)和25(AAI28563.1)中(括号内示出RefSeq登录号)。Fcγ受体对IgG1、IgG2、IgG3、IgG4单克隆抗体的Fc区是否具有结合活性，除了上述记载的FACS或ELISA形式之外，还可通过ALPHA筛选(增强的发光接近均质测定(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay))或利用了表面等离子共振(SPR)现象的BIACORE法等来确认(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11),4005-4010)。

此外，“Fc配体”或“效应配体”意指与抗体的Fc区结合而形成Fc/Fc配体复合体的、来源于任意生物的分子，优选多肽。Fc配体对Fc的结合优选诱发一种或更多种的效应子功能。Fc配体包括：Fc受体、FcγR、FcαR、FcεR、FcRn、C1q、C3、甘露聚糖结合凝集素、甘露糖受体、葡萄球菌的蛋白A、葡萄球菌的蛋白G和病毒的FcγR，但并不限定于此。Fc配体还包括作为与FcγR同源的Fc受体家族的Fc受体同源物(FcRH)(Davis et al.,(2002)Immunological Reviews190,123-136)或FCRL(Annu Rev Immunol,2007；25:525-60)。Fc配体还可包括与Fc结合的未发现的分子。

对于包括FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc的FcγRI(CD64)以及包括同种型FcγRIIIa(含有同种异型V158和F158)和FcγRIIIb(含有同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)的FcγRIII(CD16)，与IgG的Fc部分结合的α链和具有在细胞内传导活化信号的ITAM的共有γ链缔合。另一方面，包括同种型FcγRIIa(含有同种异型H131和R131)和FcγRIIc的FcγRII(CD32)自身的胞质结构域中含有ITAM。这些受体表达于巨噬细胞、肥大细胞、抗原提呈细胞等众多免疫细胞中。通过这些受体与IgG的Fc部分结合而传递的活化信号使得巨噬细胞吞噬能力、炎症性细胞因子的产生、肥大细胞的脱粒、抗原提呈细胞的功能亢进受到促进。如上所述，具有传导活化信号能力的Fcγ受体在本发明中也称为活性型Fcγ受体。

另一方面，FcγRIIb(含有FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)自身的胞质结构域中含有传递抑制型信号的ITIM。B细胞中，通过FcγRIIb和B细胞受体(BCR)的交联而抑制来自BCR的活化信号，结果BCR的抗体产生受到抑制。巨噬细胞中，FcγRIII与FcγRIIb的交联使得吞噬能力和炎症性细胞因子的产生能力受到抑制。如上所述，具有传导抑制信号的能力的Fcγ受体在本发明中也称为抑制型Fcγ受体。

Fcγ受体结合活性

对于本发明的抗原结合分子中所含的FcγR结合结构域的FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa和/或FcγRIIIb的任一个对人Fcγ受体的结合活性，除了上述记载的FACS或ELISA形式之外，还可通过ALPHA筛选(增强的发光接近均质测定)或利用了表面等离子共振(SPR)现象的BIACORE法等来确认(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11),4005-4010)。这些测定中人Fcγ受体的胞外结构域可用作可溶性抗原。

ALPHA筛选是通过使用供体和受体这2种珠的ALPHA技术，基于下述原理来实施的。结合于供体珠的分子和结合于受体珠的分子发生生物学相互作用，仅在2种珠接近的状态时检测到发光信号。由激光激发的供体珠内的光敏剂将周围的氧转换为激发状态的单线态氧。单线态氧扩散至供体珠周围，到达接近的受体珠时，引起珠内的化学发光反应，最终发出光。结合于供体珠的分子和结合于受体珠的分子不发生相互作用时，供体珠产生的单线态氧不会到达受体珠，因而不会引起化学发光反应。

例如，含有经生物素标记的Fc区的抗原结合分子与供体珠结合，经谷胱甘肽S转移酶(GST)标签化的Fcγ受体与受体珠结合。在含有竞争Fc区改变体的抗原结合分子的不存在下，具有天然型Fc区的抗原结合分子和Fcγ受体发生相互作用而产生520-620nm的信号。含有未经标签化的Fc区改变体的抗原结合分子与具有天然型Fc区的抗原结合分子竞争与Fcγ受体间的相互作用。通过对反映竞争结果的荧光的减少进行定量，可以确定相对结合亲和性。使用Sulfo-NHS-生物素等来将抗体等抗原结合分子生物素化是公知的。作为用GST将Fcγ受体标签化的方法，可适宜地采用将编码Fcγ受体的多核苷酸与编码GST的多核苷酸在保持于有效连接有框内融合而成的融合基因的载体的细胞等中表达，并利用谷胱甘肽柱纯化的方法等。所得的信号可以通过使用例如GRAPHPAD PRISM(GraphPad公司、San Diego)等软件，与利用非线性回归分析的单位点竞争(one-site competition)模型拟合而适宜地分析。

将观察相互作用的物质的一方(配体)固定在传感器芯片的金薄膜上，若从传感器芯片的背侧照射光以使在金薄膜和玻璃的界面发生全反射，则反射光的一部分会形成反射强度降低的部分(SPR信号)。将观察相互作用的物质的另一方(分析物)流过传感器芯片的表面，配体和分析物若结合，则固定化配体分子的质量会增加，传感器芯片表面的溶剂的折射率会发生变化。由于该折射率的变化，SPR信号的位置发生移位(相反，若结合发生解离则信号的位置会返回)。Biacore系统将上述移位的量即传感器芯片表面的质量变化作为纵轴，将质量的时间变化作为测定数据表示(传感图)。由传感图的曲线可求出动力学参数：结合速率常数(ka)和解离速率常数(kd)，由该常数之比可求出亲和性(KD)。BIACORE法中还适宜使用抑制测定法。抑制测定法的实例记载在Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11),4005-4010中。

Fcγ受体结合结构域

Fcγ受体结合活性与EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG的Fc区的Fcγ受体结合活性相比高的Fcγ受体结合结构域，可通过改变天然型人IgG的Fc区的氨基酸来制作。此外，Fcγ受体结合结构域也可使用以与Fcγ受体结合为特征的之前记载的抗原结合结构域的任何结构的结构域。该情形下，可以不必导入氨基酸改变来制作，或者还可以通过进一步导入改变来提高对Fcγ受体的亲和性。作为这样的Fcγ受体结合结构域，可举出：记载于Protein Eng Des Sel.2009Mar；22(3):175-88、ProteinEng Des Sel.2008Jan；21(1):1-10.和J Immunol.2002Jul1；169(1):137-44中的与FcγRIIIa结合的Fab片段抗体、来源于骆驼的单结构域抗体和单链Fv抗体、和FASEBJ.2009Feb；23(2):575-85.中记载的FcγRI结合环状肽等。Fcγ受体结合结构域的FcγR结合活性与EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG的Fc区的FcγR结合活性相比是否高，可使用上述的结合活性项目中记载的方法来适宜实施。

本发明中，作为起始Fcγ受体结合结构域的实例，可适宜举出人IgG的Fc区。本发明中，Fc区的“氨基酸的改变”或“氨基酸改变”包括改变成与起始Fc区的氨基酸序列不同的氨基酸序列。起始Fc区的修饰改变体只要在pH中性范围可与人Fcγ受体结合即可，任一个Fc区均可作为起始Fc区使用。此外，将已经施加了改变的Fc区作为起始Fc区再加以进一步改变而成的改变Fc区也可作为本发明的改变Fc区适宜地使用。起始Fc区可以意指多肽本身、含有起始Fc区的组合物或编码起始Fc区的氨基酸序列。起始Fc区可以含有已在抗体项目中概述了的通过重组产生的公知的IgG抗体的Fc区。起始Fc区的起源没有限定，可以由非人动物的任意生物或人获得。优选地，作为任意生物，优选可举出选自小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、猫、兔、狗、山羊、绵羊、牛、马、骆驼和非人灵长类中的生物。在其它方案中，起始Fc区还可由食蟹猴、狨猴、恒河猴、黑猩猩或人中获得。起始Fc区优选可由人IgG1获得，但并不限于IgG的特定类别。这意味着可以适宜使用人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc区作为起始Fc受体结合结构域。同样地，本说明书中也意指可以将来源于前述任意生物的IgG的任意类或亚类的Fc区优选用作起始Fc区。天然存在的IgG的变体或修饰型的实例记载于公知文献(Curr.Opin.Biotechnol.(2009)20(6),685-91、Curr.Opin.Immunol.(2008)20(4),460-470、Protein Eng.Des.Sel.(2010)23(4),195-202、WO2009/086320、WO2008/092117、WO2007/041635和WO2006/105338)中，但并不限定于此。

作为改变的实例，包括一个以上的突变，例如，取代成与起始Fc区的氨基酸不同的氨基酸残基的突变、或对起始Fc区的氨基酸插入一个以上的氨基酸残基或从起始Fc区的氨基酸中缺失一个以上的氨基酸等。优选地，改变后的Fc区的氨基酸序列中含有含非天然产生的Fc区的至少一部分的氨基酸序列。这种变种必然与起始Fc区具有小于100％的序列同一性或相似性。在优选的实施方案中，变种具有与起始Fc区的氨基酸序列为约75％～小于100％的氨基酸序列同一性或相似性、更优选约80％～小于100％、更优选约85％～小于100％、更优选约90％～小于100％、最优选约95％～小于100％的同一性或相似性的氨基酸序列。在本发明的非限定的一个方案中，起始Fc区和本发明的改变Fc区之间具有至少1个氨基酸的差异。起始Fc区和改变Fc区的氨基酸的差异也可以通过特别是前述EU编号规定的氨基酸残基的位置规定的氨基酸的不同而适宜地规定。

为了改变Fc区的氨基酸，可适宜采用位点特异性诱变法(Kunkel等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82,488-492))或重叠延伸PCR等公知的方法。此外，作为取代成天然氨基酸以外的氨基酸的氨基酸突变方法，还可采用多种公知的方法(Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.(2006)35,225-249、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2003)100(11),6353-6357)。还可适宜使用例如：含有作为终止密码子之一的UAG密码子(琥珀密码子)的互补琥珀抑制基因tRNA上连接有非天然氨基酸而成的tRNA的无细胞翻译系统(Clover Direct(Protein Express))等。

本发明的抗原结合分子中所含的pH中性范围下具有Fcγ受体结合活性的Fc区可以通过任意的方法获得，具体而言，可通过改变用作起始Fc区的人IgG型免疫球蛋白的氨基酸来获得在pH中性范围下具有Fcγ受体结合活性的Fc区。作为用于改变的优选的IgG型免疫球蛋白的Fc区，可举出例如人IgG(IgG1、IgG2、IgG3或IgG4以及它们的改变体)的Fc区。在IgG的Fc区中也包括由其天然产生的突变体等。作为人IgG1、人IgG2、人IgG3、人IgG4抗体的Fc区，基因多态性的多数的同种异型序列记载于Sequencesof proteins of immunological interest,NIH Publication No.91-324中，本发明中可以是其中的任一个。特别是作为人IgG1的序列，EU编号356-358位的氨基酸序列可以是DEL也可以是EEM。

改变为其它的氨基酸，只要是pH中性范围下具有Fcγ受体结合活性、或中性范围下提高对Fcγ受体结合的结合活性，就可改变任何位置的氨基酸。抗原结合分子含有人IgG1的Fc区作为人Fc区时，优选含有带来pH中性范围下对Fcγ受体的结合较人IgG1的起始Fc区的结合活性增强的效果的改变。作为用于增强在pH中性范围条件下的Fcγ受体结合活性的氨基酸改变，例如报道在WO2007/024249、WO2007/021841、WO2006/031370、WO2000/042072、WO2004/029207、WO2004/099249、WO2006/105338、WO2007/041635、WO2008/092117、WO2005/070963、WO2006/020114、WO2006/116260和WO2006/023403等中。

作为能实现上述改变的氨基酸，可举出例如以EU编号表示的选自以下的至少一个以上的氨基酸：221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、243位、244位、245位、246位、247位、249位、250位、251位、254位、255位、256位、258位、260位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、339位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位和440位。通过这些氨基酸的改变，IgG型免疫球蛋白的Fc区在pH中性范围条件下对Fcγ受体的结合被增强。

为了在本发明中使用，作为特别优选的改变，可举出例如Fc区的以EU编号表示的选自以下的至少一个以上的氨基酸的改变：

221位的氨基酸为Lys或Tyr中的任一个；

222位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个；

223位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Lys中的任一个；

224位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个；

225位的氨基酸为Glu、Lys或Trp中的任一个；

227位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；

228位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；

230位的氨基酸为Ala、Glu、Gly或Tyr中的任一个；

231位的氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一个；

232位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；

240位的氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一个；

241位的氨基酸为Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中的任一个；

243位的氨基酸为Leu、Glu、Leu、Gln、Arg、Trp或Tyr中的任一个；

244位的氨基酸为His；

245位的氨基酸为Ala；

246位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；

249位的氨基酸为Glu、His、Gln或Tyr中的任一个；

250位的氨基酸为Glu或Gln中的任一个；

251位的氨基酸为Phe；

254位的氨基酸为Phe、Met或Tyr中的任一个；

255位的氨基酸为Glu、Leu或Tyr中的任一个；

256位的氨基酸为Ala、Met或Pro中的任一个；

258位的氨基酸为Asp、Glu、His、Ser或Tyr中的任一个；

260位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；

262位的氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中的任一个；

263位的氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一个；

266位的氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一个；

273位的氨基酸为Phe或Ile中的任一个；

275位的氨基酸为Leu或Trp中的任一个；

279位的氨基酸为Ala；

281位的氨基酸为Asp、Lys、Pro或Tyr中的任一个；

282位的氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一个；

284位的氨基酸为Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中的任一个；

285位的氨基酸为Asp、Glu、Lys、Gln、Trp或Tyr中的任一个；

286位的氨基酸为Glu、Gly、Pro或Tyr中的任一个；

288位的氨基酸为Asn、Asp、Glu或Tyr中的任一个；

291位的氨基酸为Asp、Glu、Gly、His、Ile、Gln或Thr中的任一个；

292位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中的任一个；

301位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；

302位的氨基酸为Ile；

303位的氨基酸为Asp、Gly或Tyr中的任一个；

304位的氨基酸为Asp、His、Leu、Asn或Thr中的任一个；

305位的氨基酸为Glu、Ile、Thr或Tyr中的任一个；

311位的氨基酸为Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中的任一个；

313位的氨基酸为Phe；

315位的氨基酸为Leu；

317位的氨基酸为Glu或Gln；

323位的氨基酸为Ile；

334位的氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile、Leu、Pro或Thr中的任一个；

336位的氨基酸为Glu、Lys或Tyr中的任一个；

337位的氨基酸为Glu、His或Asn中的任一个；

376位的氨基酸为Ala或Val中的任一个；

377位的氨基酸为Gly或Lys中的任一个；

378位的氨基酸为Asp；

379位的氨基酸为Asn；

380位的氨基酸为Ala、Asn或Ser中的任一个；

382位的氨基酸为Ala或Ile中的任一个；

385位的氨基酸为Glu；

392位的氨基酸为Thr；

396位的氨基酸为Leu；

421位的氨基酸为Lys；

427位的氨基酸为Asn；

428位的氨基酸为Phe或Leu中的任一个；

429位的氨基酸为Met；

434位的氨基酸为Trp；

436位的氨基酸为Ile；或者

440位的氨基酸为Gly、His、Ile、Leu或Tyr中的任一个。此外，改变的氨基酸的数目没有特别限定，可以仅改变一个位置的氨基酸，也可以改变二个位置以上的氨基酸。作为二个位置以上的氨基酸的改变的组合，可举出例如表5(表5-1～表5-3)中记载的组合。

[表5-1]

氨基酸的组合	氨基酸的组合
		K370E/P396L/D270E	S239Q/1332Q
Q419H/P396L/D270E	S267D/I332E
		V240A/P396L/D270E	S267E/I332E
R255L/P396L/D270E	S267L/A327S
		R255L/P396L/D270E	S267Q/A327S
R255L/P396L/D270E/R292G	S298A/I332E
		R255L/P396L/D270E	S304T/I332E
R255L/P396L/D270E/Y300L	S324G/I332D
		F243L/D270E/K392N/P396L	S324G/I332E
F243L/R255L/D270E/P396L	S324I/I332D
		F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L	S324I/I332E
F243L/R292P/Y300L/P396L	T260H/I332E
		F243L/R292P/Y300L	T335D/I332E
F243L/R292P/P396L	V240I/V266I
		F243L/R292P/V305I	V264I/I332E
F243L/R292P	D265F/N297E/I332E
		S298A/E333A/K334A	D265Y/N297D/I332E
E380A/T307A	F243L/V262I/V264W
		K326M/E333S	N297D/A330Y/I332E
K326A/E333A	N297D/T299E/I332E
		S317A/K353A	N297D/T299F/I332E
A327D/I332E	N297D/T299H/I332E
		A330L/I332E	N297D/T299I/I332E
A330Y/I332E	N297D/T299L/I332E
		E258H/I332E	N297D/T299V/I332E
E272H/I332E	P230A/E233D/I332E
		E272I/N276D	P244H/P245A/P247V
E272R/I332E	S239D/A330L/I332E
		E283H/I332E	S239D/A330Y/I332E
E293R/I332E	S239D/H268E/A330Y
		F241L/V262I	S239D/I332E/A327A
F241W/F243W	S239D/I332E/A330I

[表5-2]

F243L/V264I	S239D/N297D/I332E
		H268D/A330Y	S239D/S298A/I332E
H268E/A330Y	S239D/V264I/I332E
		K246H/I332E	S239E/N297D/I332E
L234D/I332E	S239E/V264I/I332E
		L234E/I332E	S239N/A330L/I332E
L234G/I332E	S239N/A330Y/I332E
		L234I/I332E	S239N/S298A/I332E
L234I/L235D	S239Q/V264I/I332E
		L234Y/I332E	V264E/N297D/I332E
L235D/I332E	V264I/A330L/I332E
		L235E/I332E	V264I/A330Y/I332E
L235I/I332E	V264I/S298A/I332E
		L235S/I332E	Y296D/N297D/I332E
L328A/I332D	Y296E/N297D/I332E
		L328D/I332D	Y296H/N297D/I332E
L328D/I332E	Y296N/N297D/I332E
		L328E/I332D	Y296Q/N297D/I332E
L328E/I332E	Y296T/N297D/I332E
		L328F/I332D	D265Y/N297D/T299L/I332E
L328F/I332E	F241E/F243Q/V262T/V264E
		L328H/I332E	F241E/F243R/V262E/V264R
L328I/I332D	F241E/F243Y/V262T/V264R
		L328I/I332E	F241L/F243L/V262I/V264I
L328M/I332D	F241R/F243Q/V262T/V264R
		L328M/I332E	F241S/F243H/V262T/V264T
L328N/I332D	F241W/F243W/V262A/V264A
		L328N/I332E	F241Y/F243Y/V262T/V264T
L328Q/I332D	1332E/A330Y/H268E/A327A
		L328Q/I332E	N297D/I332E/S239D/A330L
L328T/I332D	N297D/S298A/A330Y/I332E
		L328T/I332E	S239D/A330Y/I332E/K326E
L328V/I332D	S239D/A330Y/I332E/K326T
		L328V/I332E	S239D/A330Y/I332E/L234I
L328Y/I332D	S239D/A330Y/I332E/L235D

[表5-3]

L328Y/I332E	S239D/A330Y/I332E/V240I
		N297D/I332E	S239D/A330Y/I332E/V264T
N297E/I332E	S239D/A330Y/I332E/V266I
		N297S/I332E	S239D/D265F/N297D/I332E
P227G/I332E	S239D/D265H/N297D/I332E
		P230A/E233D	S239D/D265I/N297D/I332E
Q295E/I332E	S239D/D265L/N297D/I332E
		R255Y/I332E	S239D/D265T/N297D/I332E
S239D/I332D	S239D/D265V/N297D/I332E
		S239D/I332E	S239D/D265Y/N297D/I332E
S239D/I332N	S239D/I332E/A330Y/A327A
		S239D/I332Q	S239D/I332E/H268E/A327A
S239E/D265G	S239D/I332E/H268E/A330Y
		S239E/D265N	S239D/N297D/I332E/A330Y
S239E/D265Q	S239D/N297D/I332E/K326E
		S239E/I332D	S239D/N297D/I332E/L235D
S239E/I332E	S239D/V264I/A330L/I332E
		S239E/I332N	S239D/V264I/S298A/I332E
S239E/I332Q	S239E/V264I/A330Y/I332E
		S239N/I332D	F241E/F243Q/V262T/V264E/I332E
S239N/I332E	F241E/F243R/V262E/V264R/I332E
		S239N/I332N	F241E/F243Y/V262T/V264R/I332E
S239N/I332Q	F241R/F243Q/V262T/V264R/I332E
		S239Q/I332D	S239D/I332E/H268E/A330Y/A327A
S239Q/I332E	S239E/V264I/S298A/A330Y/I332E
		S239Q/I332N	F241Y/F243Y/V262T/V264T/N297D/I332E
S267E/L328F	G236D/S267E
		S239D/S267E

测定本发明的抗原结合分子中所含的Fcγ受体结合结合域和Fcγ受体的结合活性的pH条件可适宜采用pH酸性范围或pH中性范围条件。作为测定本发明的抗原结合分子中所含的Fcγ受体结合结合域和Fcγ受体的结合活性的条件的pH中性范围，通常意指pH6.7～pH10.0。优选为pH7.0～pH8.0的任意的pH值所示的范围，优选从pH7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9和8.0中选择，特别优选为与机体内的血浆中(血中)的pH接近的pH7.4。本发明中，作为本发明的抗原结合分子中所含的Fcγ受体结合结合域与Fcγ受体具有结合活性的条件的pH酸性范围，通常意指pH4.0～pH6.5。优选意指pH5.5～pH6.5，特别优选意指与机体内的早期内体内的pH接近的pH5.8～pH6.0。作为测定条件中使用的温度，Fcγ受体结合结合域与人Fcγ受体的结合亲和性可在10℃～50℃的任意温度下进行评价。优选地，为了确认人Fcγ受体结合结合域与Fcγ受体的结合亲和性，采用15℃～40℃的温度。更优选地，如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34和35℃中的任一温度的20℃至35℃的任意温度也同样地用于确定Fcγ受体结合结合域与Fcγ受体的结合亲和性。25℃的温度是本发明的方案的非限定性的一例。

本说明书中，Fcγ受体结合结合域的Fcγ受体结合活性比天然型Fc区Fcγ受体结合活性高是指，Fcγ受体结合结合域对FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa和/或FcγRIIIb中的任一个的人Fcγ受体的结合活性比天然型Fcγ受体结合结合域对这些人Fcγ受体的结合活性高。例如，是指基于上述分析方法，与含有作为对照的天然型人IgG的Fc区的抗原结合分子的结合活性相比，含有Fcγ受体结合结合域的抗原结合分子的结合活性显示为105％以上、优选110％以上、115％以上、120％以上、125％以上、特别优选130％以上、135％以上、140％以上、145％以上、150％以上、155％以上、160％以上、165％以上、170％以上、175％以上、180％以上、185％以上、190％以上、195％以上、2倍以上、2.5倍以上、3倍以上、3.5倍以上、4倍以上、4.5倍以上、5倍以上、7.5倍以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、100倍以上的结合活性。作为天然型Fcγ受体结合结合域，可以使用起始Fcγ受体结合结合域，也可以使用相同亚类的天然型抗体的Fcγ受体结合结合域。

本发明中，特别是作为对照的天然型人IgG的Fc区，适宜使用以EU编号表示的297位的氨基酸连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG的Fc区。以EU编号表示的297位的氨基酸连接的糖链是否为含岩藻糖糖链，这可使用非专利文献24中记载的方法。例如，通过下述的方法，可以判定与天然型人IgG的Fc区连接的糖链是否为含岩藻糖糖链。通过使N-糖苷酶F(Roche diagnostics)与被测天然型人IgG反应，糖链自被测天然型人IgG上游离出来(Weitzhandler等人(J.Pharma.Sciences(1994)83,12,1670-1675)。接着，使乙醇反应以去除蛋白的反应液(Schenk等人(J.Clin.Investigation(2001)108(11)1687-1695)的浓缩干燥物通过2-氨基吡啶进行荧光标记(Bigge等人(Anal.Biochem.(1995)230(2)229-238)。通过使用纤维素柱的固相萃取而除去试剂，荧光标记的2-AB化糖链通过正相层析进行分析。通过观察要检测的层析峰，可以判定与天然型人IgG的Fc区连接的糖链是否为含岩藻糖糖链。作为与这类以EU编号表示的297位的氨基酸连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG的Fc区的非限定性实例，可举出：将编码含有天然型人IgG的Fc区的抗体的基因在CHO-K1(American Type CultureCollection,ATCC No.CRL-61)、DXB11(American Type Culture Collection,ATCC No.CRL-11397)等的CHO细胞中表达而得到的抗体中所含的Fc区。将这些抗体中所含的Fc区的Fcγ受体结合活性作为对照，通过与本发明的Fc区的Fcγ受体结合活性进行比较，可以确认本发明的Fcγ受体结合结构域的Fcγ受体结合活性是否与EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG的Fc区的Fcγ受体结合活性相比高。此外，通过使用上述等的方法测定与这些抗体中所含的Fc区连接的糖链的岩藻糖含量和与本发明的Fc区连接的糖链的岩藻糖含量，还可以比较与待比较的Fc区中所含的糖链连接的岩藻糖含量。

作为含有作为对照的相同亚类的天然型抗体的Fc区的抗原结合分子，可适宜使用具有IgG单克隆抗体的Fc区的抗原结合分子。该Fc区的结构记载于：SEQ ID NO:11(RefSeq登录号AAC82527.1的N末端添加有A)、12(RefSeq登录号AAB59393.1的N末端添加有A)、13(RefSeq登录号CAA27268.1)和14(RefSeq登录号AAB59394.1的N末端添加有A)中。此外，将含有某特定同种型的抗体的Fc区的抗原结合分子用作被测物质时，通过将具有该特定同种型的IgG单克隆抗体的Fc区的抗原结合分子用作对照，可验证含有被测Fc区的抗原结合分子的Fcγ受体结合活性的效果。如上所述，适宜选择含有Fcγ受体结合活性被验证为高的Fc区的抗原结合分子。

此外，作为在本发明中适宜使用的Fcγ受体结合结构域的实例，还适宜举出：具有对特定Fcγ受体的结合活性高于对其它Fcγ受体的结合活性的性质的Fcγ受体结合结构域(具有选择性的Fcγ受体结合活性的Fcγ受体结合结构域)。在使用抗体(作为Fcγ受体结合结构域的Fc区)作为抗原结合分子时，一分子的抗体仅结合一分子的Fcγ受体，因此，一分子的抗原结合分子在与抑制型Fcγ受体结合的状态下不能与其它活性型FcγR结合，或者在与活性型Fcγ受体结合的状态下不能与其它活性型Fcγ受体或抑制型Fcγ受体结合。

如上所述，作为活性型Fcγ受体，可适宜举出：含有FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc的FcγRI(CD64)以及含有同种型FcγRIIIa(含有同种异型V158和F158)和FcγRIIIb(含有同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)的FcγRIII(CD16)。此外，可举出FcγRIIb(含有FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)作为抑制型Fcγ受体的适宜实例。

对Fcγ受体具有选择性结合活性的FcγR结合结构域

本发明的FcγR结合结构域是否具有选择性结合活性，这可通过比较由上述的Fcγ受体结合活性项目中记载的方法确定的对各Fcγ受体的结合活性来确认。作为由本发明提供的抗原结合分子中所含的选择性FcγR结合结构域，可使用对抑制型Fcγ受体的结合活性高于对活性型Fcγ受体的结合活性的FcγR结合结构域。在非限定的一个方案中，作为由本发明提供的抗原结合分子中所含的选择性FcγR结合结构域，可使用对FcγRIIb(含有FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)的结合活性高于对选自含有FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc的FcγRI(CD64)、含有同种型FcγRIIIa(含有同种异型V158和F158)和FcγRIIIb(含有同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)的FcγRIII(CD16)、以及含有同种型FcγRIIa(含有同种异型H131和R131)和FcγRIIc的FcγRII(CD32)的任一个的活性型Fcγ受体的结合活性的FcγR结合结构域。并且，在本发明的非限定的一个方案中，作为由本发明提供的抗原结合分子中所含的选择性FcγR结合结构域，可使用对FcγRIIb-1和/或FcγRIIb-2的结合活性高于对FcγRIa、FcγRIb、FcγRIc、含有同种异型V158的FcγRIIIa、含有同种异型F158的FcγRIIIa、含有同种异型FcγRIIIb-NA1的FcγRIIIb、含有同种异型FcγRIIIb-NA2的FcγRIIIb、含有同种异型H131的FcγRIIa、含有同种异型R131的FcγRIIa和/或FcγRIIc的结合活性的FcγR结合结构域。被测对象的FcγR结合结构域是否为对Fcγ受体具有选择性结合活性的FcγR结合结构域，这可通过比较下述的FcγR选择性指数来判断，所述FcγR选择性指数为：例如，用由上述的Fcγ受体结合活性项目中记载的方法确定的FcγR结合结构域对FcγRIa、FcγRIb、FcγRIc、含有同种异型V158的FcγRIIIa、含有同种异型F158的FcγRIIIa、含有同种异型FcγRIIIb-NA1的FcγRIIIb、含有同种异型FcγRIIIb-NA2的FcγRIIIb、含有同种异型H131的FcγRIIa、含有同种异型R131的FcγRIIa和/或FcγRIIc的KD值除以对FcγRIIb-1和/或FcγRIIb-2的KD值而得到的值(比)，即以式1表示的FcγR选择性指数。

[式1]

FcγR选择性指数＝对活性型FcγR的KD值/对抑制型FcγR的KD值

上述式1中，活性型FcγR是指FcγRIa、FcγRIb、FcγRIc、含有同种异型V158的FcγRIIIa、含有同种异型F158的FcγRIIIa、含有同种异型FcγRIIIb-NA1的FcγRIIIb、含有同种异型FcγRIIIb-NA2的FcγRIIIb、含有同种异型H131的FcγRIIa、含有同种异型R131的FcγRIIa和/或FcγRIIc，抑制型FcγR是指FcγRIIb-1和/或FcγRIIb-2，KD值的测定中使用的活性型FcγR和抑制型FcγR可选自任意的组合，但作为非限定的一个方案，可使用对含有同种异型H131的FcγRIIa的KD值除以对FcγRIIb-1和/或FcγRIIb-2的KD值而得到的值(比)。

作为FcγR选择性指数，例如可举出：1.2以上、1.3以上、1.4以上、1.5以上、1.6以上、1.7以上、1.8以上、1.9以上、2以上、3以上、5以上、6以上、7以上、8以上、9以上、10以上、15以上、20以上、25以上、30以上、35以上、40以上、45以上、50以上、55以上、60以上、65以上、70以上、75以上、80以上、85以上、90以上、95以上、100以上、110以上、120以上、130以上、140以上、150以上、160以上、170以上、180以上、190以上、200以上、210以上、220以上、230以上、240以上、250以上、260以上、270以上、280以上、290以上、300以上、310以上、320以上、330以上、340以上、350以上、360以上、370以上、380以上、390以上、400以上、410以上、420以上、430以上、440以上、450以上、460以上、470以上、480以上、490以上、500以上、520以上、540以上、560以上、580以上、600以上、620以上、640以上、660以上、680以上、700以上、720以上、740以上、760以上、780以上、800以上、820以上、840以上、860以上、880以上、900以上、920以上、940以上、960以上、980以上、1000以上、1500以上、2000以上、2500以上、3000以上、3500以上、4000以上、4500以上、5000以上、5500以上、6000以上、6500以上、7000以上、7500以上、8000以上、8500以上、9000以上、9500以上、10000以上、100000以上。

作为本发明的抗原结合分子中所含的选择性FcγR结合结构域的非限定的一个方案，可例示：构成以人IgG1(SEQ ID NO:14)、IgG2(SEQ ID NO:15)、IgG3(SEQ ID NO:16)或IgG4(SEQ ID NO:17)表示的恒定区的一部分的Fc区(IgG类的Fc区是指以EU编号表示的例如从226位的半胱氨酸到C末端或者从230位的脯氨酸到C末端，但不限于此)中所含的FcγR结合结构域发生改变的Fc区。作为该改变Fc区的制作方法，可例示上述的氨基酸的改变项目中所记载的方法。作为这样的改变Fc区的实例，可例示：人IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)的以EU编号表示的238位的氨基酸为Asp的Fc区或以EU编号表示的328位的氨基酸为Glu的Fc区。人IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)的以EU编号表示的238位的氨基酸为Asp的Fc区或以EU编号表示的328位的氨基酸为Glu的Fc区和含有该Fc区的抗原结合分子，对FcγRIIb-1和/或FcγRIIb-2的结合活性高于对FcγRIa、FcγRIb、FcγRIc、含有同种异型V158的FcγRIIIa、含有同种异型F158的FcγRIIIa、含有同种异型FcγRIIIb-NA1的FcγRIIIb、含有同种异型FcγRIIIb-NA2的FcγRIIIb、含有同种异型H131的FcγRIIa、含有同种异型R131的FcγRIIa和/或FcγRIIc的结合活性。

本发明的抗原结合分子中所含的含有选择性FcγR结合结构域的恒定区和含有该恒定区的抗原结合分子还可以是：与构成人IgG1(SEQ ID NO:14)、IgG2(SEQ ID NO:15)、IgG3(SEQ ID NO:16)或IgG4(SEQ ID NO:17)的一部分的Fc区(IgG类的Fc区是指以EU编号表示的例如从226位的半胱氨酸到C末端或者从230位的脯氨酸到C末端，但不限于此)(以下，统称为野生型Fc区)和含有该野生型Fc区的抗原结合分子比较，维持或降低了对活性型FcγR(FcγRIa、FcγRIb、FcγRIc、含有同种异型V158的FcγRIIIa、含有同种异型F158的FcγRIIIa、含有同种异型FcγRIIIb-NA1的FcγRIIIb、含有同种异型FcγRIIIb-NA2的FcγRIIIb、含有同种异型H131的FcγRIIa、含有同种异型R131的FcγRIIa和/或FcγRIIc)的结合活性的Fc区和含有该Fc区的抗原结合分子。

作为与野生型Fc区和含有野生型Fc区的抗原结合分子进行比较、本发明的抗原结合分子中所含的含有选择性FcγR结合结构域的Fc区和含有该Fc区的抗原结合分子对上述活性型FcγR的结合活性降低的程度，例如可举出：99％以下、98％以下、97％以下、96％以下、95％以下、94％以下、93％以下、92％以下、91％以下、90％以下、88％以下、86％以下、84％以下、82％以下、80％以下、78％以下、76％以下、74％以下、72％以下、70％以下、68％以下、66％以下、64％以下、62％以下、60％以下、58％以下、56％以下、54％以下、52％以下、50％以下、45％以下、40％以下、35％以下、30％以下、25％以下、20％以下、15％以下、10％以下、5％以下、4％以下、3％以下、2％以下、1％以下、0.5％以下、0.4％以下、0.3％以下、0.2％以下、0.1％以下、0.05％以下、0.01％以下、0.005％以下。

本发明的抗原结合分子中所含的含有选择性FcγR结合结构域的Fc区、含有该Fc区的恒定区和含有该恒定区的抗原结合分子还可以是：与构成以人IgG1(SEQ ID NO:14)、IgG2(SEQ ID NO:15)、IgG3(SEQ ID NO:16)、或IgG4(SEQ ID NO:17)表示的恒定区的一部分的Fc区(IgG类的Fc区是指以EU编号表示的例如从226位的半胱氨酸到C末端或者从230位的脯氨酸到C末端，但不限于此)(以下，统称为野生型Fc区)和含有该野生型Fc区的抗原结合分子比较，增强了对抑制型FcγR(FcγRIIb-1和/或FcγRIIb-2)的结合活性的Fc区和含有该Fc区的抗原结合分子。

作为与野生型Fc区和含有野生型Fc区的抗原结合分子进行比较、本发明的抗原结合分子中所含的含有选择性FcγR结合结构域的Fc区和含有该Fc区的抗原结合分子对上述抑制型FcγR的结合活性增强的程度，例如可举出：101％以上、102％以上、103％以上、104％以上、105％以上、106％以上、107％以上、108％以上、109％以上、110％以上、112％以上、114％以上、116％以上、118％以上、120％以上、122％以上、124％以上、126％以上、128％以上、130％以上、132％以上、134％以上、136％以上、138％以上、140％以上、142％以上、144％以上、146％以上、148％以上、150％以上、155％以上、160％以上、165％以上、170％以上、175％以上、180％以上、185％以上、190％以上、195％以上、2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、100倍以上、200倍以上、300倍以上、400倍以上、500倍以上、600倍以上、700倍以上、800倍以上、900倍以上、1000倍以上、10000倍以上、100000倍以上。

此外，本发明的抗原结合分子中所含的含有选择性FcγR结合结构域的Fc区和含有该Fc区的抗原结合分子还可以是：与构成以人IgG1(SEQ ID NO:14)、IgG2(SEQ ID NO:15)、IgG3(SEQ ID NO:16)或IgG4(SEQ ID NO:17)表示的恒定区的一部分的Fc区(IgG类的Fc区是指以EU编号表示的例如从226位的半胱氨酸到C末端或者从230位的脯氨酸到C末端，但不限于此)(以下，统称为野生型Fc区)和含有该野生型Fc区的抗原结合分子进行比较，维持或降低了对活性型FcγR(FcγRIa、FcγRIb、FcγRIc、含有同种异型V158的FcγRIIIa、含有同种异型F158的FcγRIIIa、含有同种异型FcγRIIIb-NA1的FcγRIIIb、含有同种异型FcγRIIIb-NA2的FcγRIIIb、含有同种异型H131的FcγRIIa、含有同种异型R131的FcγRIIa和/或FcγRIIc)的结合活性，且与构成以人IgG1(SEQ ID NO:14)、IgG2(SEQ ID NO:15)、IgG3(SEQ ID NO:16)或IgG4(SEQ ID NO:17)表示的恒定区的一部分的Fc区(IgG类的Fc区是指以EU编号表示的例如从226位的半胱氨酸到C末端或者从230位的脯氨酸到C末端，但不限于此)(以下，统称为野生型Fc区)和含有该野生型Fc区的抗原结合分子进行比较，增强了对抑制型FcγR(FcγRIIb-1和/或FcγRIIb-2)的结合活性的Fc区和含有该Fc区的抗原结合分子。

此外，本发明的抗原结合分子中所含的含有选择性FcγR结合结构域的Fc区和含有该Fc区的抗原结合分子还可以是：与构成以人IgG1(SEQ IDNO:14)、IgG2(SEQ ID NO:15)、IgG3(SEQ ID NO:16)或IgG4(SEQ ID NO:17)表示的恒定区的一部分的Fc区(IgG类的Fc区是指以EU编号表示的例如从226位的半胱氨酸到C末端或者从230位的脯氨酸到C末端，但不限于此)(以下，统称为野生型Fc区)和含有该野生型Fc区的抗原结合分子进行比较，相比对活性型Fcγ受体(FcγRIa、FcγRIb、FcγRIc、含有同种异型V158的FcγRIIIa、含有同种异型F158的FcγRIIIa、含有同种异型FcγRIIIb-NA1的FcγRIIIb、含有同种异型FcγRIIIb-NA2的FcγRIIIb、含有同种异型H131的FcγRIIa、含有同种异型R131的FcγRIIa)的结合活性的增强程度，对抑制型Fcγ受体(FcγRIIb-1和/或FcγRIIb-2)的结合活性的增强程度高的Fc区和含有该Fc区的抗原结合分子。

本发明可利用上述氨基酸的改变项目中说明的方案等，对于以EU编号表示的238位的氨基酸为Asp的Fc区或以EU编号表示的328位的氨基酸为Glu的Fc区，可进一步加入另外至少一个的对Fc区的改变。此外，除了这些改变之外，可以含有进一步添加的改变。添加的改变可选自例如氨基酸的取代、缺失或修饰中的任一个，或它们的组合。例如，可以加入增强对FcγRIIb的结合活性、且维持或降低对FcγRIIa(H型)和FcγRIIa(R型)的结合活性的改变。通过加入这样的改变，相比FcγRIIa对FcγRII的结合选择性提高。

这些中，优选与FcγRIIa(R型)相比对FcγRIIb的结合选择性提高的改变，进一步优选与FcγRIIa(H型)相比对FcγRIIb的结合选择性提高的改变。作为这样的改变的优选的氨基酸取代，例如可举出：以EU编号237位表示的Gly取代成Trp的改变、以EU编号237位表示的Gly取代成Phe的改变、以EU编号238位表示的Pro取代成Phe的改变、以EU编号325位表示的Asn取代成Met的改变、以EU编号267位表示的Ser取代成Ile的改变、以EU编号328位表示的Leu取代成Asp的改变、以EU编号267位表示的Ser取代成Val的改变、以EU编号328位表示的Leu取代成Trp的改变、以EU编号267位表示的Ser取代成Gln的改变、以EU编号267位表示的Ser取代成Met的改变、以EU编号236位表示的Gly取代成Asp的改变、以EU编号327位表示的Ala取代成Asn的改变、以EU编号325位表示的Asn取代成Ser的改变、以EU编号235位表示的Leu取代成Tyr的改变、以EU编号266位表示的Val取代成Met的改变、以EU编号328位表示的Leu取代成Tyr的改变、以EU编号235位表示的Leu取代成Trp的改变、以EU编号235位表示的Leu取代成Phe的改变、以EU编号239位表示的Ser取代成Gly的改变、以EU编号327位表示的Ala取代成Glu的改变、以EU编号327位表示的Ala取代成Gly的改变、以EU编号238位表示的Pro取代成Leu的改变、以EU编号239位表示的Ser取代成Leu的改变、以EU编号328位表示的Leu取代成Thr的改变、以EU编号328位表示的Leu取代成Ser的改变、以EU编号328位表示的Leu取代成Met的改变、以EU编号331位表示的Pro取代成Trp的改变、以EU编号331位表示的Pro取代成Tyr的改变、以EU编号331位表示的Pro取代成Phe的改变、以EU编号327位表示的Ala取代成Asp的改变、以EU编号328位表示的Leu取代成Phe的改变、以EU编号271位表示的Pro取代成Leu的改变、以EU编号267位表示的Ser取代成Glu的改变、以EU编号328位表示的Leu取代成Ala的改变、以EU编号328位表示的Leu取代成Ile的改变、以EU编号328位表示的Leu取代成Gln的改变、以EU编号328位表示的Leu取代成Val的改变、以EU编号326位表示的Lys取代成Trp的改变、以EU编号334位表示的Lys取代成Arg的改变、以EU编号268位表示的His取代成Gly的改变、以EU编号268位表示的His取代成Asn的改变、以EU编号324位表示的Ser取代成Val的改变、以EU编号266位表示的Val取代成Leu的改变、以EU编号271位表示的Pro取代成Gly的改变、以EU编号332位表示的Ile取代成Phe的改变、以EU编号324位表示的Ser取代成Ile的改变、以EU编号333位表示的Glu取代成Pro的改变、以EU编号300位表示的Tyr取代成Asp的改变、以EU编号337位表示的Ser取代成Asp的改变、以EU编号300位表示的Tyr取代成Gln的改变、以EU编号335位表示的Thr取代成Asp的改变、以EU编号239位表示的Ser取代成Asn的改变、以EU编号326位表示的Lys取代成Leu的改变、以EU编号326位表示的Lys取代成Ile的改变、以EU编号239位表示的Ser取代成Glu的改变、以EU编号326位表示的Lys取代成Phe的改变、以EU编号326位表示的Lys取代成Val的改变、以EU编号326位表示的Lys取代成Tyr的改变、以EU编号267位表示的Ser取代成Asp的改变、以EU编号326位表示的Lys取代成Pro的改变、以EU编号326位表示的Lys取代成His的改变、以EU编号334位表示的Lys取代成Ala的改变、以EU编号334位表示的Lys取代成Trp的改变、以EU编号268位表示的His取代成Gln的改变、以EU编号326位表示的Lys取代成Gln的改变、以EU编号326位表示的Lys取代成Glu的改变、以EU编号326位表示的Lys取代成Met的改变、以EU编号266位表示的Val取代成Ile的改变、以EU编号334位表示的Lys取代成Glu的改变、以EU编号300位表示的Tyr取代成Glu的改变、以EU编号334位表示的Lys取代成Met的改变、以EU编号334位表示的Lys取代成Val的改变、以EU编号334位表示的Lys取代成Thr的改变、以EU编号334位表示的Lys取代成Ser的改变、以EU编号334位表示的Lys取代成His的改变、以EU编号334位表示的Lys取代成Phe的改变、以EU编号334位表示的Lys取代成Gln的改变、以EU编号334位表示的Lys取代成Pro的改变、以EU编号334位表示的Lys取代成Tyr的改变、以EU编号334位表示的Lys取代成Ile的改变、以EU编号295位表示的Gln取代成Leu的改变、以EU编号334位表示的Lys取代成Leu的改变、以EU编号334位表示的Lys取代成Asn的改变、以EU编号268位表示的His取代成Ala的改变、以EU编号239位表示的Ser取代成Asp的改变、以EU编号267位表示的Ser取代成Ala的改变、以EU编号234位表示的Leu取代成Trp的改变、以EU编号234位表示的Leu取代成Tyr的改变、以EU编号237位表示的Gly取代成Ala的改变、以EU编号237位表示的Gly取代成Asp的改变、以EU编号237位表示的Gly取代成Glu的改变、以EU编号237位表示的Gly取代成Leu的改变、以EU编号237位表示的Gly取代成Met的改变、以EU编号237位表示的Gly取代成Tyr的改变、以EU编号330位表示的Ala取代成Lys的改变、以EU编号330位表示的Ala取代成Arg的改变、以EU编号233位表示的Glu取代成Asp的改变、以EU编号268位表示的His取代成Asp的改变、以EU编号268位表示的His取代成Glu的改变、以EU编号326位表示的Lys取代成Asp的改变、以EU编号326位表示的Lys取代成Ser的改变、以EU编号326位表示的Lys取代成Thr的改变、以EU编号323位表示的Val取代成Ile的改变、以EU编号323位表示的Val取代成Leu的改变、以EU编号323位表示的Val取代成Met的改变、以EU编号296位表示的Tyr取代成Asp的改变、以EU编号326位表示的Lys取代成Ala的改变、以EU编号326位表示的Lys取代成Asn的改变、以EU编号330位表示的Ala取代成Met的改变。

并且，这些改变中优选的氨基酸取代，例如可举出：以EU编号237位表示的Gly取代成Trp的改变、以EU编号237位表示的Gly取代成Phe的改变、以EU编号267位表示的Ser取代成Val的改变、以EU编号267位表示的Ser取代成Gln的改变、以EU编号268位表示的His取代成Asn的改变、以EU编号271位表示的Pro取代成Gly的改变、以EU编号326位表示的Lys取代成Leu的改变、以EU编号326位表示的Lys取代成Gln的改变、以EU编号326位表示的Lys取代成Glu的改变、以EU编号326位表示的Lys取代成Met的改变、以EU编号239位表示的Ser取代成Asp的改变、以EU编号267位表示的Ser取代成Ala的改变、以EU编号234位表示的Leu取代成Trp的改变、以EU编号234位表示的Leu取代成Tyr的改变、以EU编号237位表示的Gly取代成Ala的改变、以EU编号237位表示的Gly取代成Asp的改变、以EU编号237位表示的Gly取代成Glu的改变、以EU编号237位表示的Gly取代成Leu的改变、以EU编号237位表示的Gly取代成Met的改变、以EU编号237位表示的Gly取代成Tyr的改变、以EU编号330位表示的Ala取代成Lys的改变、以EU编号330位表示的Ala取代成Arg的改变、以EU编号233位表示的Glu取代成Asp的改变、以EU编号268位表示的His取代成Asp的改变、以EU编号268位表示的His取代成Glu的改变、以EU编号326位表示的Lys取代成Asp的改变、以EU编号326位表示的Lys取代成Ser的改变、以EU编号326位表示的Lys取代成Thr的改变、以EU编号323位表示的Val取代成Ile的改变、以EU编号323位表示的Val取代成Leu的改变、以EU编号323位表示的Val取代成Met的改变、以EU编号296位表示的Tyr取代成Asp的改变、以EU编号326位表示的Lys取代成Ala的改变、以EU编号326位表示的Lys取代成Asn的改变、以EU编号330位表示的Ala取代成Met的改变。

上述的改变可以是一个位置、也可以是二个位置以上的组合。作为这些改变中优选的实例，可举出表14～15、表17～24、表26～28中记载的改变。

作为本发明的抗原结合分子中所含的选择性FcγR结合结构域的另一非限定性方案，可例示：以人IgG1(SEQ ID NO:14)、IgG2(SEQ ID NO:15)、IgG3(SEQ ID NO:16)或IgG4(SEQ ID NO:17)表示的Fc区中所含的FcγR结合结构域发生改变的Fc区。作为该改变Fc区的制作方法，可例示上述的氨基酸的改变项目中记载的方法。作为这种改变Fc区的实例，可例示：人IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)的以EU编号表示的238位的氨基酸为Asp和以EU编号表示的271位的氨基酸为Gly的Fc区。人IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)的以EU编号表示的238位的氨基酸为Asp和以EU编号表示的271位的氨基酸为Gly的Fc区以及含有该Fc区的抗原结合分子是：相比FcγRIa、FcγRIb、FcγRIc、含有同种异型V158的FcγRIIIa、含有同种异型F158的FcγRIIIa、含有同种异型FcγRIIIb-NA1的FcγRIIIb、含有同种异型FcγRIIIb-NA2的FcγRIIIb、含有同种异型H131的FcγRIIa、含有同种异型R131的FcγRIIa和/或FcγRIIc，对FcγRIIb-1和/或FcγRIIb-2的结合活性高。

本发明可利用上述氨基酸的改变项目中说明的方案等，对于以EU编号表示的238位的氨基酸为Asp和以EU编号表示的271位的氨基酸为Gly的Fc区，可进一步加入另外至少一个的对Fc区的改变。此外，除了这些改变之外，可含有进一步添加的的改变。添加的改变可选自例如氨基酸的取代、缺失或修饰中的任一个或者它们的组合。例如，可加入维持或降低对活性型Fcγ受体(FcγRIa、FcγRIb、FcγRIc、含有同种异型V158的FcγRIIIa、含有同种异型F158的FcγRIIIa、含有同种异型FcγRIIIb-NA1的FcγRIIIb、含有同种异型FcγRIIIb-NA2的FcγRIIIb、含有同种异型H131的FcγRIIa、含有同种异型R131的FcγRIIa)的结合活性的改变。可加入增强对抑制型Fcγ受体(FcγRIIb-1和/或FcγRIIb-2)的结合活性，且维持或降低对FcγRIIa(H型)和FcγRIIa(R型)的结合活性的改变。此外，还可加入：相比对活性型Fcγ受体(FcγRIa、FcγRIb、FcγRIc、含有同种异型V158的FcγRIIIa、含有同种异型F158的FcγRIIIa、含有同种异型FcγRIIIb-NA1的FcγRIIIb、含有同种异型FcγRIIIb-NA2的FcγRIIIb、含有同种异型H131的FcγRIIa、含有同种异型R131的FcγRIIa)的结合活性的增强程度，对抑制型Fcγ受体(FcγRIIb-1和/或FcγRIIb-2)的结合活性的增强程度高的改变。通过加入这种改变，与FcγRIIa相比对FcγRIIb的结合选择性提高。

作为含有选择性FcγR结合结构域的改变Fc区的实例，人IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)的以EU编号表示的238位的氨基酸为Asp和以EU编号表示的271位的氨基酸为Gly的Fc区的、以EU编号表示的233位、234位、237位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、272位、296位、326位、327位、330位、331位、332位、333位、396位的任一个以上被取代的改变Fc区可以作为非限定的一个方案而例示。

而且，作为含有选择性FcγR结合结构域的改变Fc区的非限定的一个方案，可例示人IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)的238位的氨基酸为Asp和以EU编号表示的271位的氨基酸为Gly的Fc区的、以EU编号表示的以下的任一个以上的改变Fc区：

233位的氨基酸为Asp；

234位的氨基酸为Tyr；

237位的氨基酸为Asp；

264位的氨基酸为Ile；

265位的氨基酸为Glu；

266位的氨基酸为Phe、Met或Leu中的任一个；

267位的氨基酸为Ala、Glu、Gly或Gln中的任一个；

268位的氨基酸为Asp或Glu中的任一个；

269位的氨基酸为Asp；

272位的氨基酸为Asp、Phe、Ile、Met、Asn或Gln中的任一个；

296位的氨基酸为Asp；

326位的氨基酸为Ala或Asp中的任一个；

327位的氨基酸为Gly；

330位的氨基酸为Lys或Arg中的任一个；

331位的氨基酸为Ser；

332位的氨基酸为Thr；

333位的氨基酸为Thr、Lys或Arg中的任一个；

396位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、Ile、Lys、Leu、Met、Gln、Arg或Tyr中的任一个。

作为上述的含有进一步另外至少一个对Fc区的改变、进一步添加的改变的Fc区的非限定的一个方案，可例示表6-1～表6-7中所记载的Fc区：

[表6-1]

(表6-2为表6-1的续表)

[表6-2]

(表6-3为表6-2的续表)

[表6-3]

(表6-4为表6-3的续表)

[表6-4]

(表6-5为表6-4的续表)

[表6-5]

(表6-6为表6-5的续表)

[表6-6]

(表6-7为表6-6的续表)

[表6-7]

就小鼠而言，迄今为止发现了FcγRI、FcγRIIb、FcγRIII、FcγRIV这4种的FcγR。就人而言，作为对应于这些的FcγR，发现了FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、FcγRIIIa、FcγRIIIb。这些FcγR中，认为是唯一的抑制型的FcγRIIb在人和小鼠中均是保守的。其它的FcγR，除了FcγRIIIb之外，经由免疫受体酪氨酸活化模体(Immunoreceptor tyriosine-based activatingmotif，ITAM)来传递活化信号，而FcγRIIb则经由细胞内具有的免疫受体酪氨酸抑制模体(imunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM)来传递抑制信号(Nat.Rev.Immunol.(2008)8,34-47)。

作为FcγRIIb的剪接变体，报道了FcγRIIb1和FcγRIIb2。在人和小鼠的任一者中，FcγRIIb1相比FcγRIIb2具有长的胞内结构域，确认FcγRIIb1在B细胞中表达，FcγRIIb2在巨噬细胞、肥大细胞、树突细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞中表达(J.Clin.Immunol.(2005)25(1),1-18)。

迄今为止，就人而言，报道了FcγRIIb的功能不全、表达降低与自身免疫疾病的发病相关。例如，报道了：在SLE患者中，由于位于FcγRIIb的表达启动子区的基因多态性的影响，转录活化因子的结合变弱，FcγRIIb的表达降低的实例(Hum.Genet.(2005)117,220-227、J.Immunol.(2004)172,7192-7199、J.Immunol.(2004)172,7186-7191)。此外，报道了SLE患者中FcγRIIb的233位的氨基酸为Ile或Thr的2种的基因多态性。据报道：该位点存在于FcγRIIb的跨膜区，233位的氨基酸为Thr时，与为Ile时相比，FcγRIIb难以在脂筏上存在，结果FcγRIIb的信号传递功能降低(Nat.Med.(2005)11,1056-1058、Hum.Mol.Genet.,(2005)14,2881-2892)。就小鼠而言，也报道了：C57BL/6小鼠的FcγRIIb基因被破坏的敲除小鼠呈现出自身抗体的产生或肾小球肾炎等SLE样的症状(Immunity13(2000)277-285、J.Exp.Med.(2002)195,1167-1174)。此外报道了，迄今为止认为是SLE的自然发病模型的小鼠中，FcγRIIb的表达量也降低等(Immunogenetics(2000)51,429-435、Int.Immunol.(1999)11,1685-1691、Curr.Biol.(2000)10,227-230、J.Immunol.(2002)169,4340-4346)。根据这些报道，可以认为在小鼠中也与人同样，FcγRIIb控制体液免疫。

本发明的具有Fc的抗体在经由FcγRIIb使抗原消除时，FcγRIIb的功能中，认为FcγRIIb的胞吞作用的功能作出最重要的贡献。如上所述，FcγRIIb1和FcγRIIb2作为FcγRIIb的剪接变体而存在，但据报道，后者主要参与抗体和抗原的免疫复合体的胞吞作用(J.Immunol.(1994),152574-585、Science(1992)256,1808-1812、Cell(1989)58,317-327)。迄今为止，报道了小鼠的FcγRIIb2被摄入披网格蛋白的小窝，引起胞吞作用(Cell(1989)58,317-327)。此外，据报道在FcγRIIb2介导的胞吞作用中双亮氨酸模体(dileucine motif)是必要的，在人和小鼠的任一个中双亮氨酸模体均保守(EMBO J.(1994)13(13),2963-2969)。根据上述报道，也可以认为在人中也与小鼠同样，FcγRIIb2具有胞吞作用能力。

另一方面，据报道FcγRIIb1与FcγRIIb2不同，不引起胞吞作用。FcγRIIb1中存在FcγRIIb2中见不到的胞内结构域中的插入序列。认为该序列抑制FcγRIIb1摄入被网格蛋白的小窝中，其结果抑制了胞吞作用(J.Cell.Biol.(1992)116,875-888、J.Cell.Biol.(1989)109,3291-3302)。在人中也与小鼠同样，FcγRIIb1中在与FcγRIIb2相似的部分存在插入序列，因此预测以类似的机制产生FcγRIIb1与FcγRIIb2的胞吞作用能力的不同。此外，据报道无论是在人还是在小鼠中，在20分钟期间细胞表面上的约40％的免疫复合体被摄入到细胞内(Mol.Immunol.(2011)49,329-337、Science(1992)256,1808-1812)。根据这些报道，可以预测在人中也与小鼠同样，FcγRIIb2以与小鼠类似的速率使免疫复合体摄入到细胞内。

FcγR家族中，FcγRIIb无论在人还是在小鼠中是唯一在细胞内具有ITIM、表达细胞的分布也相同，因此可推测在免疫控制中的功能也同样。此外，若考虑无论在人还是在小鼠中都以同样的速率使免疫复合体摄入到细胞内这一事实，可以认为：通过使用小鼠，可预测在人中的FcγRIIb介导的抗体带来的抗原消除效果。实际上，在实施例5中，与具有pH依赖性地结合于可溶性抗原的性质的抗原结合分子mIgG1进行比较，当将具有pH依赖性地结合于可溶性抗原的性质且对小鼠FcγRIIb和FcγRIII的亲和性已增强的抗原结合分子mF44和mF46给予正常小鼠时，与给予mIgG1时相比，显示出增加抗原的清除率。

此外，在后述的实施例6中，使用Fc受体γ链缺失小鼠实施了同样的实验。小鼠的情形，报道了FcγRIIb以外的FcγR仅在γ链的共存下表达，因此Fc受体γ链缺失小鼠中仅表达FcγRIIb。通过对Fc受体γ链缺失小鼠给予具有pH依赖性地结合于可溶性抗原的性质的抗原结合分子mF44、mF46，可考察增强FcγRIIb选择性结合时加速抗原消除的效果。根据实施例6的结果，Fc受体γ链缺失小鼠中给予的具有pH依赖性地结合于可溶性抗原的性质的抗原结合分子mF44和mF46，与同一小鼠中给予的具有pH依赖性地结合于可溶性抗原的性质的抗原结合分子mIgG1相比，显示增加抗原的清除率。此外，根据实施例6的结果，明确了mF44和mF46给予Fc受体γ链缺失小鼠的情形与给予正常小鼠的情形几乎同程度地使抗原消除。

在实施例6中，使用FcγRIII缺失小鼠实施了同样的实验。由于mIgG1和mF44、mF46仅与mFcγR中的FcγRIIb和FcγRIII结合，因此通过对FcγRIII缺失小鼠给予这些抗体，可考察增强FcγRIIb选择性结合时加速抗原消除的效果。根据实施例6的结果，FcγRIII缺失小鼠中给予的mF44和mF46，与同一小鼠中给予的mIgG1相比，显示增加抗原的清除率。此外，根据实施例6的结果，明确了mF44和mF46给予FcγRIII缺失小鼠的情形、给予正常小鼠的情形和给予Fc受体γ链缺失小鼠的情形几乎同程度地使抗原消除。

根据这些结果，明确了可不必增强对活性型FcγR的结合，而通过仅增强对FcγRIIb的选择性结合，来加速抗原的消除。

除了之前考察的迄今为止的文献报道之外，根据使用上述小鼠的验证结果认为：在人的机体中也与小鼠同样，FcγRIIb介导免疫复合体摄入到细胞内，其结果，具有增强了对人FcγRIIb的选择性结合的Fc的抗体可加速该抗原的消除。此外，如之前的考察，由于认为在小鼠和人中以同程度的速度产生FcγRIIb介导的免疫复合体摄入到细胞内，因此可以认为：通过使用同程度地增强对人FcγRIIb的亲和性的Fc，在人的机体内也能达成与具有增强了对小鼠FcγRIIb的亲和性的Fc的抗体加速抗原消除的效果同程度的效果。

如WO2009/125825中所记载，显示出：同时给予了Fv4-IgG1(在可变区赋予了人源化抗IL-6受体抗体H54/L28-IgG1的抗原结合活性随pH条件而变化(即在pH7.4下与抗原结合，在pH5.8下解离抗原)的改变而得到)与作为抗原的可溶型人IL-6受体的小鼠中的可溶型人IL-6受体的消除，与同时给予了H54/L28-IgG1和该抗原的小鼠中的可溶型人IL-6受体的消除相比，大幅度加速。应予说明，在本说明书中，H54/L28-IgG1中所含的重链H54-IgG1和轻链L28-CK分别以SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37表示，Fv4-IgG1中所含的重链VH3-IgG1和轻链VL3-CK分别以SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39表示。

与可溶型人IL-6受体结合的抗体H54/L28-IgG1所结合的可溶型人IL-6受体，和抗体一起通过FcRn再循环到血浆中，相对于此，pH依赖性地与可溶型人IL-6受体结合的抗体Fv4-IgG1，在内体内的酸性条件下将抗体所结合的可溶型人IL-6受体解离。解离了的可溶型人IL-6受体被溶酶体分解，因此可以大幅度加速可溶型人IL-6受体的消除，进而pH依赖性地与可溶型人IL-6受体结合的抗体Fv4-IgG1在内体内与FcRn结合后，被再循环到血浆中。经再循环的该抗体可以再次与可溶型人IL-6受体结合，因此对抗原(可溶型人IL-6受体)的结合和通过FcRn在血浆中的再循环重复进行。其结果，认为一个的抗体分子可以多次重复与可溶型人IL-6受体结合(WO2009/125825)。

另一方面，如本发明中所公开的那样，发现了：通过给予含有抗原结合活性随pH等离子浓度条件而变化的抗原结合结构域、在pH酸性范围条件下具有FcRn结合活性的FcRn结合结构域和Fcγ受体结合结构域的抗原结合分子中所含的Fcγ受体结合结构域的FcγR结合活性增强的抗原结合分子，可以大幅度降低可溶型抗原的血浆中浓度。

不受特定理论的束缚，通过给予增强了FcγR结合的、含有抗原结合活性随pH等离子浓度条件而变化的抗原结合结构域、在pH酸性范围条件下具有FcRn结合活性的FcRn结合结构域的抗原结合分子所观察到的预想之外的血浆中可溶型抗原浓度的降低，也可以如下所述进行说明。

如上所述，Fv4-IgG1等的含有抗原结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子，虽然认为可多次重复与抗原结合，但在内体内将可溶型抗原解离，加快从其从血浆中消除的效果，认为依赖于抗原与抗原结合分子的复合体被摄入到内体内的速度。增强了与各种FcγR的结合活性的、含有抗原结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子，通过与表达在细胞膜上的各种FcγR结合，主动地被摄入到细胞内，通过该分子中所含的在pH酸性范围条件下具有FcRn结合活性的FcRn结合结构域与FcRn的结合介导的再循环，可以再度循环到血浆中。即，在血浆中与可溶型抗原形成了复合体的上述抗原结合分子，经由表达在细胞膜上的FcγR，主动地被摄入到细胞内，因此认为，加快血浆中的可溶型抗原的消除的效果与未增强与各种FcγR的结合活性的抗原结合分子相比更为显著。

与膜型抗原结合的抗体的FcγR结合活性对于该抗体的细胞毒活性发挥重要的作用。因此，当用作药物的抗体需要细胞毒活性时，可以使用FcγR结合活性高的人IgG1的同种型，并且通过将该抗体的FcγR结合活性增强来使该抗体的细胞毒活性增强的技术也被广泛使用。另一方面，用作药物、与可溶型抗原结合的抗体的FcγR结合活性所发挥的作用迄今为止仍属未知，对于FcγR结合活性高的人IgG1和FcγR结合活性低的人IgG2或人IgG4的FcγR结合活性的区别赋予给予了该抗体的机体的生理效果的不同，迄今为止未进行充分的研究。实际上，如在本实施例中后述的那样，确认到：在给予了使FcγR结合活性缺失的抗体的个体的血浆中未对可溶型抗原的浓度变化产生影响。另一方面，本发明中，发现了：在给予了FcγR结合活性增强、含有可溶型抗原结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子的个体的血浆中，可溶型抗原的浓度大幅度地降低。即，可以说首次发现了：通过组合以可溶型抗原作为靶标的抗原结合分子中所含的在pH酸性范围条件下具有FcRn结合活性的FcRn结合结构域和可溶型抗原结合随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域，使对FcγR的结合增强的优点。

抗原结合分子

本发明中，抗原结合分子以表示在pH酸性范围具有人FcRn结合活性、含有抗原结合结构域和Fcγ受体结合结构域的分子的最为广泛的含义使用，具体而言，只要其显示抗原结合活性，则包括各种分子类型。例如，作为抗原结合结构域与Fc区结合的分子的实例，可举出抗体。抗体可包括单一的单克隆抗体(含有激动抗体和拮抗抗体)、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体等。此外在以抗体片段的形式使用时，优选可举出抗原结合结构域和抗原结合片段(例如，Fab、F(ab')2、scFv和Fv)。将现有的稳定的α/β桶蛋白结构等立体结构用作支架(scaffold)，仅将其一部分结构进行文库化用于构建抗原结合结构域的支架分子也可以含有在本发明的抗原结合分子中。

本发明的抗原结合分子可以含有介导对FcRn的结合和对Fcγ受体的结合的Fc区的至少一部分。例如，在非限定的一个方案中，抗原结合分子可以是抗体或Fc融合蛋白。融合蛋白是指含有多肽的嵌合多肽，该多肽含有与具有天然中其无法自然连接的第二氨基酸序列的多肽连接的第一氨基酸序列。例如，融合蛋白可含有：编码Fc区的至少一部分(例如，赋予对FcRn的结合的Fc区的部分或者赋予对Fcγ受体的结合的Fc区的部分)的氨基酸序列、和含有例如编码受体的配体结合结构域或配体的受体结合结构域的氨基酸序列的非免疫球蛋白多肽。氨基酸序列可以存在于一起运送至融合蛋白的各个蛋白中、或它们通常可存在于同一蛋白中，参加融合多肽中的新的重组。融合蛋白可通过例如化学合成制得，或者可通过制作肽区域以所期望的关系被编码的多核苷酸并将其表达的基因重组方法制得。

本发明的各结构域可通过多肽键直接连接，也可通过接头连接。作为接头，可使用能通过基因工程导入的任意的肽接头或合成化合物接头(例如，Protein Engineering(1996)9(3),299-305)中公开的接头等，本发明中优选肽接头。肽接头的长度没有特别限定，本领域技术人员可根据目的适宜选择，优选的长度为5个氨基酸以上(上限没有特别限定，通常为30个氨基酸以下、优选20个氨基酸以下)，特别优选为15个氨基酸。

例如，肽接头的情形优选可举出：

Ser

Gly·Ser

Gly·Gly·Ser

Ser·Gly·Gly

Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO:26)

Ser·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO:27)

Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO:28)

Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO:29)

Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO:30)

Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO:31)

Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO:32)

Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO:33)

(Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO:28))n

(Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO:29))n

[n为1以上的整数]等。其中，本领域技术人员可根据目的适宜选择肽接头的长度或序列。

合成化学物接头(化学交联剂)是肽的交联中通常所用的交联剂，例如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)、辛二酸双(磺基琥珀酰亚胺基)酯(BS3)、二硫代双(丙酸琥珀酰亚胺酯)(DSP)、二硫代双(丙酸磺基琥珀酰亚胺酯)(DTSSP)、乙二醇双(琥珀酸琥珀酰亚胺酯)(EGS)、乙二醇双(琥珀酸磺基琥珀酰亚胺酯)(磺基-EGS)、酒石酸二琥珀酰亚胺酯(DST)、酒石酸二磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-DST)、双[2-(琥珀酰亚胺氧基羰基氧基)乙基]砜(BSOCOES)、双[2-(磺基琥珀酰亚胺氧基羰基氧基)乙基]砜(磺基-BSOCOES)等，这些交联剂有市售。

连接各结构域的接头使用多个时，可以全部使用同种类的接头，也可以使用不同种类的接头。

此外，除了上述记载所例示的接头之外，还可适宜使用具有例如His标签、HA标签、myc标签、FLAG标签等肽标签的接头。此外，也可适宜利用氢键、二硫键、共价键、离子性相互作用或通过它们的组合而相互结合的性质。例如，可利用抗体的CH1与CL间的亲和性，或者在异源Fc区的缔合时利用来源于前述双特异性抗体的Fc区。进而，还可适宜地利用形成于结构域间的二硫键。

为了将各结构域用肽键连接，将编码该结构域的多核苷酸框内连接。作为将多核苷酸框内连接的方法，公知有限制片段的连接、融合PCR、重叠PCR等方法，本发明的抗原结合分子的制作中也可以适宜将这些方法单独或组合使用。本发明中，术语“被连接”、“被融合”、“连接”或“融合”可以相互交换使用。这些术语是指通过包括上述化学结合手段或重组方法的所有手段将二个以上的多肽等组分或成分连接以形成一个结构。在二个以上的组分或成分是多肽时，框内融合是指二个以上的阅读框的单元的连接，用于形成以维持该多肽的正确阅读框的方式连接得到的更长的阅读框。二分子的Fab用作抗原结合结构域时，该抗原结合结构域和Fc区不通过接头而通过肽键进行框内连接的作为本发明的抗原结合分子的抗体可以作为本申请的优选抗原结合分子来使用。

FcRn

与属于免疫球蛋白超家族的Fcγ受体不同，FcRn特别是人FcRn在结构上与主要组织相容性复合体(MHC)I类的多肽结构类似，与I类的MHC分子具有22至29％的序列同一性(Ghetie等，Immunol.Today(1997)18(12),592-598)。FcRn表达为异二聚体，其由与可溶性β或轻链(β2微球蛋白)复合而成的跨膜α或重链构成。如MHC那样，FcRn的α链含有3个胞外结构域(α1，α2，α3)，短的胞质结构域将蛋白质锚定于细胞表面。α1和α2结构域与抗体的Fc区中的FcRn结合结构域相互作用(Raghavan等(Immunity(1994)1,303-315)。

FcRn在哺乳动物的母体胎盘或卵黄囊中表达，其参与IgG从母体向胎儿的转移。此外，表达有FcRn的啮齿类新生动物的小肠中，FcRn参与母体IgG从所摄取的初乳或乳中穿过刷状边缘上皮的移动。FcRn在大量种类的大量的其它组织以及各种内皮细胞系中表达。其也在人成年血管内皮、肌肉血管系和肝窦毛细血管中有表达。认为FcRn与IgG结合，将其再循环到血清中，由此起到维持IgG的血浆中浓度的作用。通常，FcRn对IgG分子的结合严格地为pH依赖性，最佳结合在小于7.0的pH酸性范围内观察到。

以含有SEQ ID NO:34所示信号序列的多肽作为前体的人FcRn在机体内(SEQ ID NO:35中记载了含有信号序列的该多肽)与人β2-微球蛋白形成复合体。如以下参考实施例所示，与β2-微球蛋白形成复合体的可溶型人FcRn是通过使用通常的重组表达方法来制备的。可以评价本发明的FcRn结合结构域对这种与β2-微球蛋白形成复合体的可溶型人FcRn的结合活性。本发明中，若无特别记载，人FcRn是指能够与本发明的FcRn结合结构域结合的形态，作为实例，可举出人FcRn与人β2-微球蛋白的复合体。

本发明的抗原结合分子具有FcRn结合结构域。FcRn结合结构域，只要抗原结合分子在pH酸性范围具有FcRn结合活性即可，没有特别限定，此外，可以是直接或间接地具有FcRn结合活性的结构域。作为这种结构域，例如，可适宜举出：直接地具有FcRn结合活性的IgG型免疫球蛋白的Fc区、白蛋白、白蛋白结构域3、抗FcRn抗体、抗FcRn肽、抗FcRn支架(Scaffold)分子等，或者间接地与具有FcRn结合活性的IgG或白蛋白结合的分子等。本发明中，优选在pH酸性范围和pH中性范围具有FcRn结合活性的结构域。该结构域若是预先在pH酸性范围具有FcRn结合活性的结构域，则可直接适宜使用。该结构域在pH酸性范围对FcRn没有结合活性或该活性弱时，可通过改变抗原结合分子中的氨基酸来赋予对FcRn的结合活性。此外，通过改变预先在pH酸性范围具有FcRn结合活性的结构域中的氨基酸，也可提高FcRn结合活性。对于FcRn结合结构域的氨基酸的改变，可以通过比较氨基酸改变前和改变后的pH酸性范围下的FcRn结合活性来发现目标改变。

FcRn结合结构域优选为直接与FcRn结合的区。作为FcRn结合结构域的优选实例，可举出抗体的Fc区。但是，与白蛋白或IgG等具有FcRn结合活性的多肽结合的区可经由白蛋白或IgG等间接地与FcRn结合。因此，作为本发明中的FcRn结合区，可适宜使用与具有FcRn结合活性的多肽结合的区。Fc区含有来源于抗体重链的恒定区的氨基酸序列。Fc区是以EU编号表示的大约216位氨基酸处作为木瓜蛋白酶酶切位点的铰链区的N末端起、含有该铰链、CH2和CH3结构域的抗体的重链恒定区的部分。

FcRn结合结构域或含有该结构域的抗原结合分子对FcRn特别是人 FcRn的结合活性

本发明中的FcRn结合结构域对FcRn特别是人FcRn的结合活性如前述结合活性项目中所述，可以通过本领域技术人员公知的方法来测定，对于pH以外的条件，本领域技术人员可以适宜确定。抗原结合分子的抗原结合活性和人FcRn结合活性可以作为KD(Dissociation constant：解离常数)、表观KD(Apparent dissociation constant：表观解离常数)、解离速率kd(Dissociation rate：解离速率)或表观kd(Apparent dissociation：表观解离速率)等来评价。它们可通过本领域技术人员公知的方法测定。可以使用例如Biacore(GE healthcare)、斯卡查德图、流式细胞仪等。

对于测定FcRn结合结构域对FcRn的结合活性时的pH以外的条件，本领域技术人员可以适宜选择，没有特别限定。例如，可以如WO2009/125825中所述，在MES缓冲液、37℃的条件下进行测定。此外，本发明的FcRn结合结构域对FcRn的结合活性的测定可通过本领域技术人员公知的方法来进行，例如，可使用Biacore(GE Healthcare)等来进行测定。对于FcRn结合结构域与FcRn的结合活性的测定，通过使FcRn或者FcRn结合结构域或含有FcRn结合结构域的本发明的抗原结合分子分别作为分析物流过固定有FcRn结合结构域或含有FcRn结合结构域的本发明的抗原结合分子或者FcRn的芯片，可以进行评价。

作为本发明的抗原结合分子中所含的FcRn结合结构域与FcRn具有结合活性的条件的pH酸性范围通常意指pH4.0～pH6.5。优选意指pH5.5～pH6.5，特别优选意指与机体内的早期内体内的pH接近的pH5.8～pH6.0。作为本发明的抗原结合分子中所含的FcRn结合结构域与FcRn具有结合活性的条件的pH中性范围通常意指pH6.7～pH10.0。pH中性范围优选为pH7.0～pH8.0的任意的pH值所示的范围，优选从pH7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9和8.0中选择，特别优选为与机体内的血浆中(血中)的pH接近的pH7.4。pH7.4下的人FcRn结合结构域或含有该结构域的抗原结合分子与人FcRn的结合亲和性低，因而在难以评价该结合亲和性时，可代替pH7.4而采用pH7.0。作为测定条件中使用的温度，FcRn结合结构域与FcRn的结合亲和性可以在10℃～50℃的任意温度下进行评价。优选地，为确定FcRn结合结构域与人FcRn的结合亲和性而采用15℃～40℃的温度。更优选地，如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34和35℃中的任一温度的20℃至35℃的任意温度也同样地用于确定FcRn结合结构域与FcRn的结合亲和性。25℃的温度是本发明的方案的非限定性的一例。

根据Yeung等人(J.Immunol.(2009)182:7663-7671)，天然型人IgG1对人FcRn的结合活性在pH酸性范围(pH6.0)下为KD1.7μM，在pH中性范围下基本检测不到活性。所以，在优选的方案中，可以使用在pH酸性范围条件下具有人FcRn结合活性的本发明的抗原结合分子，包括在pH酸性范围条件下对人FcRn的结合活性为KD20μM或更强、在pH中性范围条件下对人FcRn的结合活性与天然型人IgG同等的抗原结合分子。在更优选的方案中，可以使用本发明的抗原结合分子，包括在pH酸性范围条件下人FcRn结合活性为KD2.0μM或更强的抗原结合分子。在进一步更优选的方案中，可以使用在pH酸性范围条件下人FcRn结合活性为KD0.5μM或更强的抗原结合分子。上述KD值通过The Journal of Immunology(2009)182:7663-7671中记载的方法(将抗原结合分子固定于芯片并流过作为分析物的人FcRn)来确定。

本发明中，在pH酸性范围条件下具有FcRn结合活性的Fc区是优选的。该结构域只要是预先在pH酸性范围条件下具有FcRn结合活性的Fc区，则可以直接使用。该结构域在pH酸性范围条件下没有FcRn结合活性或者该活性弱时，可以通过改变抗原结合分子中的氨基酸来获得具有所期望的FcRn结合活性的Fc区，但通过改变Fc区中的氨基酸也可以适宜地获得在pH酸性范围条件下具有或增强所期望的FcRn结合活性的Fc区。这种带来所期望的结合活性的Fc区的氨基酸改变可通过对氨基酸改变前和改变后的pH酸性范围条件下的FcRn结合活性进行比较来发现。本领域技术人员可以使用与上述的用于改变Fcγ受体结合活性的方法同样的公知的方法实施合适的氨基酸改变。

本发明的抗原结合分子中所含的在pH酸性范围条件下具有FcRn结合活性的Fc区可以通过任意的方法获得，具体而言，可通过改变用作起始Fc区的人IgG型免疫球蛋白的氨基酸来获得在pH酸性范围条件下具有或增强FcRn结合活性的FcRn结合结构域。作为用于改变的优选的IgG型免疫球蛋白的Fc区，可举出例如：人IgG(IgG1、IgG2、IgG3或IgG4以及它们的改变体)的Fc区。对于改变为其它的氨基酸，只要在pH酸性范围条件下具有FcRn结合活性或者在酸性范围条件下可提高人FcRn结合活性，则任意位置的氨基酸均可改变。在抗原结合分子含有人IgG1的Fc区作为Fc区时，优选含有带来在pH酸性范围条件下对FcRn的结合较人IgG1的起始Fc区的结合活性增强的效果的改变。作为能实现上述改变的氨基酸，可适宜举出例如：如WO2000/042072中所记载，以EU编号表示的238位、252位、253位、254位、255位、256位、265位、272位、286位、288位、303位、305位、307位、309位、311位、312位、317位、340位、356位、360位、362位、376位、378位、380位、382位、386位、388位、400位、413位、415位、424位、433位、434位、435位、436位、439位和/或447位的氨基酸。同样，作为能实现上述改变的氨基酸，也可适宜举出例如：如WO2002/060919中所记载，以EU编号表示的251位、252位、254位、255位、256位、308位、309位、311位、312位、385位、386位、387位、389位、428位、433位、434位和/或436位的氨基酸。并且，作为能实现上述改变的氨基酸，也可举出：如WO2004/092219中所记载，以EU编号表示的250位、314位和428位的氨基酸。此外，作为能实现上述改变的氨基酸，也可适宜举出例如：如WO2010/045193中所记载，以EU编号表示的251位、252位、307位、308位、378位、428位、430位、434位和/或436位的氨基酸。通过这些氨基酸的改变，IgG型免疫球蛋白的Fc区在pH酸性范围条件下对FcRn的结合被增强。

本发明中，优选在pH酸性范围条件下具有FcRn结合活性的Fc区。该结构域只要是预先在pH酸性范围条件下具有FcRn结合活性的Fc区，则可以直接使用。该结构域在pH酸性范围条件下没有FcRn结合活性或者该活性弱时，可以通过改变抗原结合分子中的氨基酸来获得具有所期望的FcRn结合活性的Fc区，但通过改变Fc区中的氨基酸也可以适宜地获得在pH酸性范围条件下具有所期望的FcRn结合活性的Fc区。这种带来所期望的结合活性的Fc区的氨基酸改变可通过对氨基酸改变前和改变后的pH酸性范围条件下的FcRn结合活性进行比较来发现。本领域技术人员可以使用与上述的用于改变Fcγ受体结合活性的方法相同的公知的方法实施合适的氨基酸改变。

本发明的抗原结合分子中所含的在pH酸性范围条件下具有FcRn结合活性的Fc区可以通过任意的方法获得，具体而言，可通过改变用作起始Fc区的人IgG型免疫球蛋白的氨基酸来获得在pH酸性范围条件下具有或增强FcRn结合活性的FcRn结合结构域。作为用于改变的优选的IgG型免疫球蛋白的Fc区，可举出例如人IgG(IgG1、IgG2、IgG3或IgG4以及它们的改变体)的Fc区。对于改变为其它的氨基酸，只要在pH酸性范围条件下具有FcRn结合活性或者在pH酸性范围条件下可提高人FcRn结合活性，则任意位置的氨基酸均可改变。在抗原结合分子含有人IgG1的Fc区作为Fc区时，优选含有带来在pH酸性范围条件下对FcRn的结合较人IgG1的起始Fc区的结合活性增强的效果的改变。作为能实现上述改变的氨基酸，可举出例如，如国际公开WO1997/034631中所记载，以EU编号表示的252位、254位、256位、309位、311位、315位、433位和/或434位以及组合这些氨基酸的253位、310位、435位和/或426位的氨基酸。可适合举出，如国际公开WO2000/042072中所记载，以EU编号表示的238位、252位、253位、254位、255位、256位、265位、272位、286位、288位、303位、305位、307位、309位、311位、312位、317位、340位、356位、360位、362位、376位、378位、380位、382位、386位、388位、400位、413位、415位、424位、433位、434位、435位、436位、439位和/或447位的氨基酸。同样，作为能实现上述改变的氨基酸，也可适合举出例如，如国际公开WO2002/060919中所记载，以EU编号表示的251位、252位、254位、255位、256位、308位、309位、311位、312位、385位、386位、387位、389位、428位、433位、434位和/或436位的氨基酸。并且，作为能实现上述改变的氨基酸，也可举出，如国际公开WO2004/092219中所记载，以EU编号表示的250位、314位和428位的氨基酸。此外，作为能实现上述改变的氨基酸，也可适合举出例如，如国际公开WO2006/020114中所记载，238位、244位、245位、249位、252位、256位、257位、258位、260位、262位、270位、272位、279位、283位、285位、286位、288位、293位、307位、311位、312位、316位、317位、318位、332位、339位、341位、343位、375位、376位、377位、378位、380位、382位、423位、427位、430位、431位、434位、436位、438位、440位和/或442位的氨基酸。而且，作为能实现上述改变的氨基酸，也可适合举出例如，如国际公开WO2010/045193中所记载，以EU编号表示的251位、252位、307位、308位、378位、428位、430位、434位和/或436位的氨基酸。通过改变这些氨基酸，可以增强IgG型免疫球蛋白的Fc区在pH酸性范围条件下对FcRn的结合。

在含有人IgG1的Fc区作为Fc区时，在带来在pH酸性范围条件下对FcRn的结合较人IgG1的起始Fc区的结合活性增强的效果的改变的非限定的一个方案中，可举出：以EU编号表示的选自以下的至少1个以上的氨基酸的改变：

251位的氨基酸为Arg或Leu中的任一个；

252位的氨基酸为Phe、Ser、Thr或Tyr中的任一个；

254位的氨基酸为Ser或Thr中的任一个；

255位的氨基酸为Arg、Gly、Ile或Leu中的任一个；

256位的氨基酸为Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu或Thr中的任一个；

308位的氨基酸为Ile或Thr中的任一个；

309位的氨基酸为Pro；

311位的氨基酸为Glu、Leu或Ser中的任一个；

312位的氨基酸为Ala或Asp中的任一个；

314位的氨基酸为Ala或Leu中的任一个；

385位的氨基酸为Ala、Arg、Asp、Gly、His、Lys、Ser或Thr中的任一个；

386位的氨基酸为Arg、Asp、Ile、Lys、Met、Pro、Ser或Thr中的任一个；

387位的氨基酸为Ala、Arg、His、Pro、Ser或Thr中的任一个；

389位的氨基酸为Asn、Pro或Ser中的任一个；

428位的氨基酸为Leu、Met、Phe、Ser或Thr中的任一个；

433位的氨基酸为Arg、Gln、His、Ile、Lys、Pro或Ser中的任一个；

434位的氨基酸为His、Phe或Tyr中的任一个；或者

436位的氨基酸为Arg、Asn、His、Lys、Met或Thr中的任一个。此外，进行改变的氨基酸的数目没有特别限定，可以仅改变一个位置的氨基酸，也可以改变二个位置以上的氨基酸。

在含有人IgG1的Fc区作为Fc区时，带来在pH酸性范围条件下对FcRn的结合较人IgG1的起始Fc区的结合活性增强的效果的改变的非限定的一个方案可为含有以下的改变：以EU编号表示的308位的、氨基酸为Ile、309位的氨基酸为Pro、和/或311位的氨基酸为Glu。而且，该改变的另一非限定的一个方案可为含有以下的改变：308位的氨基酸为Thr、309位的氨基酸为Pro、311位的氨基酸为Leu、312位的氨基酸为Ala、和/或314位的氨基酸为Ala。并且，该改变的另一非限定的一个方案可为含有以下的改变：308位的氨基酸为Ile或Thr、309位的氨基酸为Pro、311位的氨基酸为Glu、Leu或Ser、312位的氨基酸为Ala、和/或314位的氨基酸为Ala或Leu。该改变的一个不同的非限定方案可为含有以下的改变：308位的氨基酸为Thr、309位的氨基酸为Pro、311位的氨基酸为Ser、312位的氨基酸为Asp、和/或314位的氨基酸为Leu。

在含有人IgG1的Fc区作为Fc区时，带来在pH酸性范围条件下对FcRn的结合较人IgG1的起始Fc区的结合活性增强的效果的改变的非限定的一个方案可为含有以下的改变：以EU编号表示的、251位的氨基酸为Leu、252位的氨基酸为Tyr、254位的氨基酸为Ser或Thr、255位的氨基酸为Arg、和/或256位的氨基酸为Glu。

在含有人IgG1的Fc区作为Fc区时，带来在pH酸性范围条件下对FcRn的结合较人IgG1的起始Fc区的结合活性增强的效果的改变的非限定的一个方案可为含有以下的改变：以EU编号表示的、428位的氨基酸为Leu、Met、Phe、Ser或Thr中的任一个；433位的氨基酸为Arg、Gln、His、Ile、Lys、Pro或Ser中的任一个；434位的氨基酸为His、Phe或Tyr中的任一个；和/或436位的氨基酸为Arg、Asn、His、Lys、Met或Thr中的任一个。而且，该改变的另一非限定的一个方案可为含有以下的改变：428位的氨基酸为His或Met、和/或434位的氨基酸为His或Met。

在含有人IgG1的Fc区作为Fc区时，带来在pH酸性范围条件下对FcRn的结合较人IgG1的起始Fc区的结合活性增强的效果的改变的非限定的一个方案可为含有以下的改变：以EU编号表示的、385位的氨基酸为Arg、386位的氨基酸为Thr、387位的氨基酸为Arg、和/或389位的氨基酸为Pro。而且，该改变的另一非限定的一个方案可为含有以下的改变：385位的氨基酸为Asp、386位的氨基酸为Pro和/或389位的氨基酸为Ser。

并且，在含有人IgG1的Fc区作为Fc区时，在带来在pH酸性范围条件下对FcRn的结合较人IgG1的起始Fc区的结合活性增强的效果的改变的非限定的一个方案中，可举出以EU编号表示的选自以下的至少1个以上的氨基酸的改变：

250位的氨基酸为Gln或Glu中的任一个；或者

428位的氨基酸为Leu或Phe中的任一个。此外，进行改变的氨基酸的数目没有特别限定，可以仅改变一个位置的氨基酸，也可以改变二个位置的氨基酸。

在含有人IgG1的Fc区作为Fc区时，带来在pH酸性范围条件下对FcRn的结合较人IgG1的起始Fc区的结合活性增强的效果的改变的非限定的一个方案可为含有以下的改变：以EU编号表示的、250位的氨基酸为Gln、和/或428位的氨基酸为Leu或Phe中的任一个。而且，该改变的另一非限定的一个方案可为含有以下的改变：250位的氨基酸为Glu、和/或428位的氨基酸为Leu或Phe中的任一个。

在含有人IgG1的Fc区作为Fc区时，在带来在pH酸性范围条件下对FcRn的结合较人IgG1的起始Fc区的结合活性增强的效果的改变的非限定的一个方案中，可举出以EU编号表示的选自以下的至少2个以上的氨基酸的改变：

251位的氨基酸为Asp或Glu中的任一个；

252位的氨基酸为Tyr；

307位的氨基酸为Gln；

308位的氨基酸为Pro；

378位的氨基酸为Val；

380位的氨基酸为Ala；

428位的氨基酸为Leu；

430位的氨基酸为Ala或Lys中的任一个；

434位的氨基酸为Ala、His、Ser或Tyr中的任一个；或者

436位的氨基酸为Ile。此外，进行改变的氨基酸的数目没有特别限定，可以仅改变二个位置的氨基酸，也可以改变三个位置以上的氨基酸。

在含有人IgG1的Fc区作为Fc区时，带来在pH酸性范围条件下对FcRn的结合较人IgG1的起始Fc区的结合活性增强的效果的改变的非限定的一个方案可为含有以下的改变：以EU编号表示的、307位的氨基酸为Gln、和434位的氨基酸为Ala或Ser中的任一个。而且，该改变的另一非限定的一个方案可为含有以下的改变：308位的氨基酸为Pro、和434位的氨基酸为Ala。并且，该改变的另一非限定的一个方案可为含有以下的改变：252位的氨基酸为Tyr、和434位的氨基酸为Ala。该改变的不同的非限定的一个方案可为含有以下的改变：378位的氨基酸为Val、和434位的氨基酸为Ala。该改变的另一不同的非限定的一个方案可为含有以下的改变：428位的氨基酸为Leu、和434位的氨基酸为Ala。并且，该改变的另一不同的非限定的一个方案可为含有以下的改变：434位的氨基酸为Ala、和436位的氨基酸为Ile。此外，该改变的另一非限定的一个方案可为含有以下的改变：308位的氨基酸为Pro、和434位的氨基酸为Tyr。并且，该改变的另一非限定的一个方案可为含有以下的改变：307位的氨基酸为Gln、和436位的氨基酸为Ile。

在含有人IgG1的Fc区作为Fc区时，带来在pH酸性范围条件下对FcRn的结合较人IgG1的起始Fc区的结合活性增强的效果的改变的非限定的一个方案可为含有以下的改变：以EU编号表示的、307位的氨基酸为Gln、380位的氨基酸为Ala、和434位的氨基酸为Ser中的任一个。而且，该改变的另一非限定的一个方案可为含有以下的改变：307位的氨基酸为Gln、380位的氨基酸为Ala、和434位的氨基酸为Ala。并且，该改变的另一非限定的一个方案可为含有以下的改变：252位的氨基酸为Tyr、308位的氨基酸为Pro、和434位的氨基酸为Tyr。该改变的不同的非限定的一个方案可为含有以下的改变：251位的氨基酸为Asp、307位的氨基酸为Gln、和434位的氨基酸为His。

238位的氨基酸为Leu；

244位的氨基酸为Leu；

245位的氨基酸为Arg；

249位的氨基酸为Pro；

252位的氨基酸为Tyr；

256位的氨基酸为Pro；

257位的氨基酸为Ala、Ile、Met、Asn、Ser或Val中的任一个；

258位的氨基酸为Asp；

260位的氨基酸为Ser；

262位的氨基酸为Leu；

270位的氨基酸为Lys；

272位的氨基酸为Leu或Arg中的任一个；

279位的氨基酸为Ala、Asp、Gly、His、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中的任一个；

283位的氨基酸为Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中的任一个；

285位的氨基酸为Asn；

286位的氨基酸为Phe；

288位的氨基酸为Asn或Pro中的任一个；

293位的氨基酸为Val；

307位的氨基酸为Ala、Glu或Met中的任一个；

311位的氨基酸为Ala、Ile、Lys、Leu、Met、Val或Trp中的任一个；

312位的氨基酸为Pro；

316位的氨基酸为Lys；

317位的氨基酸为Pro；

318位的氨基酸为Asn或Thr中的任一个；

332位的氨基酸为Phe、His、Lys、Leu、Met、Arg、Ser或Trp中的任一个；

339位的氨基酸为Asn、Thr或Trp中的任一个；

341位的氨基酸为Pro；

343位的氨基酸为Glu、His、Lys、Gln、Arg、Thr或Tyr中的任一个；

375位的氨基酸为Arg；

376位的氨基酸为Gly、Ile、Met、Pro、Thr或Val中的任一个；

377位的氨基酸为Lys；

378位的氨基酸为Asp或Asn中的任一个；

380位的氨基酸为Asn、Ser或Thr中的任一个；

382位的氨基酸为Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

423位的氨基酸为Asn；

427位的氨基酸为Asn；

430位的氨基酸为Ala、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Tyr中的任一个；

431位的氨基酸为His或Asn中的任一个；

434位的氨基酸为Phe、Gly、His、Trp或Tyr中的任一个；

436位的氨基酸为Ile、Leu或Thr中的任一个；

438位的氨基酸为Lys、Leu、Thr或Trp中的任一个；

440位的氨基酸为Lys；或者

442位的氨基酸为Lys。此外，进行改变的氨基酸的数目没有特别限定，可以仅改变二个位置的氨基酸，也可以改变三个位置以上的氨基酸。

在含有人IgG1的Fc区作为Fc区时，带来在pH酸性范围条件下对FcRn的结合较人IgG1的起始Fc区的结合活性增强的效果的改变的非限定的一个方案可为含有以下的改变：以EU编号表示的、257位的氨基酸为Ile、和311位的氨基酸为Ile。而且，该改变的另一非限定的一个方案可为含有以下的改变：257位的氨基酸为Ile、和434位的氨基酸为His。并且，该改变的另一非限定的一个方案可为含有以下的改变：376位的氨基酸为Val、和434位的氨基酸为His。

此外，如后所述，作为本发明的抗原结合分子中所含的FcRn结合结构域，也可适宜使用在pH中性范围条件下具有FcRn结合活性的Fc区。根据上述的pH酸性范围条件下具有FcRn结合活性的Fc区的获取方法，这些Fc区也可通过任意的方法获取，具体而言，可通过改变用作起始Fc区的人IgG型免疫球蛋白的氨基酸来获得在pH中性范围条件下具有或增强FcRn结合活性的FcRn结合结构域。作为用于改变的优选的IgG型免疫球蛋白的Fc区，可举出例如人IgG(IgG1、IgG2、IgG3或IgG4以及它们的改变体)的Fc区。对于改变为其它的氨基酸，只要在pH中性范围条件下具有FcRn结合活性或者在酸性范围条件下可提高人FcRn结合活性，则任意位置的氨基酸均可改变。在抗原结合分子含有人IgG1的Fc区作为Fc区时，优选含有带来在pH中性范围条件下对FcRn的结合较人IgG1的起始Fc区的结合活性增强的效果的改变。作为能实现这种改变的Fc区，可适宜举出：例如，人FcRn结合结构域是，在起始Fc区的以EU编号表示的位点中，选自237位、238位、239位、248位、250位、252位、254位、255位、256位、257位、258位、265位、270位、286位、289位、297位、298位、303位、305位、307位、308位、309位、311位、312位、314位、315位、317位、325位、332位、334位、360位、376位、380位、382位、384位、385位、386位、387位、389位、424位、428位、433位、434位和436位的至少一个以上的氨基酸与天然型Fc区的对应氨基酸不同的Fc区。

此外，作为能实现这种改变的Fc区，可适宜举出例如含有Fc区的以EU编号表示的选自以下的至少一个以上的氨基酸的Fc区，

237位的氨基酸为Met；

238位的氨基酸为Ala；

239位的氨基酸为Lys；

248位的氨基酸为Ile；

250位的氨基酸为Ala、Phe、Ile、Met、Gln、Ser、Val、Trp或Tyr中的任一个；

252位的氨基酸为Phe、Trp或Tyr中的任一个；

254位的氨基酸为Thr；

255位的氨基酸为Glu；

256位的氨基酸为Asp、Glu或Gln中的任一个；

257位的氨基酸为Ala、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Ser、Thr或Val中的任一个；

258位的氨基酸为His；

265位的氨基酸为Ala；

270位的氨基酸为Phe；

286位的氨基酸为Ala或Glu中的任一个；

289位的氨基酸为His；

297位的氨基酸为Ala；

298位的氨基酸为Gly；

303位的氨基酸为Ala；

305位的氨基酸为Ala；

307位的氨基酸为Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中的任一个；

308位的氨基酸为Ala、Phe、Ile、Leu、Met、Pro、Gln或Thr中的任一个；

309位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Pro或Arg中的任一个；

311位的氨基酸为Ala、His或Ile中的任一个；

312位的氨基酸为Ala或His中的任一个；

314位的氨基酸为Lys或Arg中的任一个；

315位的氨基酸为Ala或His中的任一个；

317位的氨基酸为Ala；

325位的氨基酸为Gly；

332位的氨基酸为Val；

334位的氨基酸为Leu；

360位的氨基酸为His；

376位的氨基酸为Ala；

380位的氨基酸为Ala；

382位的氨基酸为Ala；

384位的氨基酸为Ala；

385位的氨基酸为Asp或His中的任一个；

386位的氨基酸为Pro；

387位的氨基酸为Glu；

389位的氨基酸为Ala或Ser中的任一个；

424位的氨基酸为Ala；

428位的氨基酸为Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

433位的氨基酸为Lys；

434位的氨基酸为Ala、Phe、His、Ser、Trp或Tyr中的任一个；以及

436位的氨基酸为His。

例如，通过将这些氨基酸的改变单独使用或多个组合使用，可增强IgG的Fc区在pH酸性范围和/或中性范围下对FcRn的结合，对导入的氨基酸改变没有特别限定，只要能带来改善血浆中滞留性的效果，则可以导入任意的氨基酸改变。

药物组合物

若给予针对可溶型抗原的现有中和抗体，则预测通过抗原与抗体结合而提高血浆中的持续性。抗体通常具有长的半寿期(1周～3周)，而抗原通常具有短的半寿期(1天以下)。因此，在血浆中与抗体结合的抗原，与抗原单独存在时相比，变得具有显著更长的半寿期。结果，通过给予现有的中和抗体引起血浆中抗原浓度的上升。这样的事例对于以各种可溶型抗原为靶标的中和抗体已有报道，若列举一例，则有IL-6(J.Immunotoxicol.(2005)3,131-139)、β-淀粉样蛋白(mAbs(2010)2(5),1-13)、MCP-1(ARTHRITIS &RHEUMATISM(2006)54,2387-2392)、铁调素(AAPS J.(2010)4,646-657)、sIL-6受体(Blood(2008)112(10),3959-64)等。据报道，通过给予现有的中和抗体，有从基线至大约10倍～1000倍左右(上升的程度随抗原而不同)的血浆中总抗原浓度的上升。这里，血浆中总抗原浓度意指作为存在于血浆中的抗原的总量的浓度，即以抗体结合型和抗体非结合型的抗原浓度之和的形式表示。对于这种以可溶型抗原为靶标的抗体药物，引起血浆中总抗原浓度的上升并不优选。其原因是，为了中和可溶型抗原，至少需要高于血浆中总抗原浓度的血浆中抗体浓度。即，对于血浆中总抗原浓度上升10倍～1000倍，作为用于对其进行中和的血浆中抗体浓度(即抗体给予量)，意味着也需要相比于血浆中总抗原浓度未发生上升时的10倍～1000倍。另一方面，与现有的中和抗体相比，若可将血浆中总抗原浓度降低10～1000倍，则也可以将抗体的给予量降低至相同程度。这样，可以使可溶型抗原从血浆中消除、使血浆中总抗原浓度降低的抗体与现有的中和抗体相比，有用性显著更高。

本发明不受特定理论的束缚，例如，将含有以在pH酸性范围条件下的抗原结合活性比在pH中性范围条件下的抗原结合活性低的的方式使抗原结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域、以及在pH中性范围条件下具有人Fcγ受体结合活性的抗体恒定区等FcRn结合结构域的抗原结合分子给予机体时，机体中向细胞中的摄入受到促进使得一分子的抗原结合分子可结合的抗原的数目增加的原因、以及血浆中抗原浓度的消除得到促进的原因，例如，可以如下所述进行说明。

例如，在将与膜抗原结合的抗体给予机体内时，该抗体与抗原结合后，在与抗原结合的状态下和抗原一起通过内化而被摄入细胞内的内体中。然后，在与抗原结合的状态下转移至溶酶体的抗体与抗原一起被溶酶体分解。内化介导的血浆中的消除被称为抗原依赖性消除，对于多数的抗体分子均有报道(Drug Discov Today(2006)11(1-2),81-88)。一分子的IgG抗体以二价的形式与抗原结合时，一分子的抗体在与二分子抗原结合的状态下被内化，并直接在溶酶体中分解。因此，为通常的抗体时，一分子的IgG抗体无法与三分子以上的抗原结合。例如，在具有中和活性的一分子IgG抗体的情形中，无法中和三分子以上的抗原。

IgG分子的血浆中滞留性较长(消除缓慢)的原因在于，已知为IgG分子的补救受体的FcRn在起作用。通过胞饮作用摄入内体的IgG分子在内体内的酸性条件下与在内体内表达的FcRn结合。无法与FcRn结合的IgG分子在之后转移到溶酶体内被分解。另一方面，与FcRn结合的IgG分子转移至细胞表面。由于在血浆中的中性条件下IgG分子会从FcRn解离，因而该IgG分子被再次循环到血浆中。

此外，抗原结合分子为与可溶型抗原结合的抗体时，给予至机体内的抗体与抗原结合，然后抗体在与抗原结合的状态下被摄入细胞内。被摄入细胞内的抗体大多在内体内与FcRn结合后转移至细胞表面。由于在血浆中的中性条件下抗体会从FcRn解离，因而被释放到细胞外。但是，含有抗原结合活性不随pH等离子浓度条件而变化的通常的抗原结合结构域的抗体由于在与抗原结合的状态下被释放到细胞外，因而无法再次与抗原结合。所以，与结合于膜抗原的抗体相同，抗原结合活性不随pH等离子浓度条件而变化的通常的一分子的IgG抗体无法与三分子以上的抗原结合。

在血浆中的pH中性范围条件下与抗原强结合、在内体内的pH酸性范围条件下从抗原解离的pH依赖性地与抗原结合的抗体(在pH中性范围条件下与抗原结合、在pH酸性范围条件下解离的抗体)，或者在血浆中的高钙离子浓度条件下与抗原强结合、在内体内的低钙离子浓度条件下从抗原解离的钙离子浓度依赖性地与抗原结合的抗体(在高钙离子浓度条件下与抗原结合、在低钙离子浓度条件下解离的抗体)，在内体内可以从抗原解离。pH依赖性地与抗原结合的抗体或钙离子浓度依赖性地与抗原结合的抗体若在解离抗原后通过FcRn再循环到血浆中，则可以再次与抗原结合。因此，一分子的抗体可以重复结合多个抗原分子。此外，与抗原结合分子结合的抗原由于在内体内从抗体解离，因而不会被再循环到血浆中而在溶酶体内被分解。通过对机体给予这类抗原结合分子，可以使抗原向细胞内的摄取得到促进、使血浆中的抗原浓度降低。

通过对以下抗体赋予或增强pH中性范围条件下(pH7.4)的FcRn结合能力，抗原结合分子所结合的抗原向细胞内的摄入进一步得到促进：在血浆中的pH中性范围条件下与抗原强结合、在内体内的pH酸性范围条件下从抗原解离的pH依赖性地与抗原结合的抗体(在pH中性范围条件下与抗原结合、在pH酸性范围条件下解离的抗体)，或者在血浆中的高钙离子浓度条件下与抗原强结合、在内体内的低钙离子浓度条件下从抗原解离的钙离子浓度依赖性地与抗原结合的抗体(在高钙离子浓度条件下与抗原结合、在低钙离子浓度条件下解离的抗体)。即，通过对机体给予这类抗原结合分子，可以促进抗原的消除、使血浆中的抗原浓度降低。不具有pH依赖性抗原结合能力或钙离子浓度依赖性抗原结合能力的通常的抗体和其抗体-抗原复合体通过非特异性的胞吞作用而被摄入细胞中，在内体内的酸性条件下与FcRn结合，从而被输送至细胞表面，通过在细胞表面的中性条件下从FcRn解离，而被再循环到血浆中。因此，充分pH依赖性地与抗原结合(在pH中性范围条件下结合、在pH酸性范围条件下解离)的、或充分钙离子浓度依赖性地与抗原结合(在高钙离子浓度条件下结合、在低钙离子浓度条件下解离)的抗体在血浆中与抗原结合、并在内体内将结合的抗原解离时，认为抗原的消除速度会变得与利用非特异性胞吞作用的抗体和其抗体-抗原复合体向细胞中的摄入速度相等。抗体和抗原间的结合的pH依赖性或钙离子浓度依赖性不充分时，在内体内不从抗体解离的抗原也与抗体一起被再循环到血浆中，但在pH依赖性充分时，抗原的消除速度将变得限制利用非特异性胞吞作用的向细胞中的摄入速度。此外，由于FcRn将抗体从内体内输送至细胞表面，因而认为FcRn的一部分也存在于细胞表面。

本发明人认为，在pH中性范围条件下具有Fcγ受体结合活性、或者增强该结合活性的IgG型免疫球蛋白可以与存在于细胞表面的Fcγ受体结合，通过与存在于细胞表面的Fcγ受体结合，该IgG型免疫球蛋白被Fcγ受体依赖性地摄入细胞中。Fcγ受体介导的向细胞中摄入的速度比利用非特异性胞吞作用向细胞中摄入的速度快。因此，通过增强在pH中性范围条件下与Fcγ受体结合的能力，认为可以进一步加快抗原结合分子的抗原消除速度。即，在pH中性范围条件下具有Fcγ受体结合能力的抗原结合分子比通常的(天然型人)IgG型免疫球蛋白更快地将抗原送至细胞内，在内体内与FcRn结合而将抗原解离后，再次被再循环到血浆中，并在此再次与抗原结合，并通过Fcγ受体被摄入细胞内。通过提高pH中性范围条件下的Fcγ受体结合能力，可以加快该循环的循环速度，因而从血浆中消除抗原的速度变快。进而，通过使抗原结合分子在pH酸性范围条件下的抗原结合活性低于pH中性范围条件下的抗原结合活性，可以进一步提高从血浆中消除抗原的速度。此外，由于该循环的循环速度加快使得其循环的数目增大，因而认为一分子的抗原结合分子可结合的抗原的分子数也变多。本发明的抗原结合分子含有抗原结合结构域和Fcγ受体结合结构域，由于Fcγ受体结合结构域不会对抗原结合造成影响，并且根据上述机制，认为，不依赖于抗原的种类，通过使抗原结合分子在pH酸性范围或低钙离子浓度条件等离子浓度条件下的抗原结合活性(结合能力)低于pH中性范围或高钙离子浓度条件等离子浓度条件下的抗原结合活性(结合能力)，和/或使血浆中的pH下的Fcγ受体结合活性增大，可以促进利用抗原结合分子的抗原向细胞内的摄入、加快抗原的消除速度。所以认为，本发明的抗原结合分子在降低抗原带来的副作用、提高抗体的给予量、改善抗体在机体内的动力学等方面，与现有的治疗用抗体相比发挥了更优异的效果。

图1表示通过给予与现有的中和抗体相比中性pH下对Fcγ受体的结合增强了的离子浓度依赖性抗原结合抗体，来从血浆中消除可溶型抗原的机制。以下，作为离子浓度依赖性抗原结合抗体的一例，举例说明氢离子浓度(即pH)依赖性抗原结合抗体，但该机制不限于氢离子浓度。认为，不具有pH依赖性抗原结合能力的现有中和抗体在血浆中与可溶型抗原结合后，主要通过与细胞的非特异性相互作用而被缓慢摄入。被摄入细胞内的中和抗体和可溶型抗原的复合体转移到酸性的内体中，被FcRn再循环到血浆中。另一方面，认为，增强了中性条件下的Fcγ受体结合的pH依赖性抗原结合抗体在血浆中与可溶型抗原结合后，除了非特异性相互作用以外，经由与Fcγ受体的相互作用，被快速摄入细胞膜上表达Fcγ受体的细胞中。这里，与pH依赖性抗原结合抗体结合的可溶型抗原在酸性的内体中由于pH依赖性结合能力而从抗体解离。然后，从抗体解离的可溶型抗原转移至溶酶体，由于蛋白分解活性而受到分解。另一方面，解离了可溶型抗原的抗体在酸性的内体中与FcRn结合后，通过FcRn再循环到细胞膜上，被再次释放到血浆中。如此经再循环而游离的抗体可以与其它的可溶型抗原再次结合。通过重复进行这种Fcγ受体介导的向细胞内的摄入、可溶型抗原的解离和分解、抗体的再循环等的循环，这种增强了中性条件下的Fcγ受体结合的pH依赖性抗原结合抗体可以使大量的可溶型抗原转移至溶酶体，使血浆中总抗原浓度降低。

即，本发明还涉及含有本发明的抗原结合分子、由本发明的改变方法制作的抗原结合分子或由本发明的制备方法制备的抗原结合分子的药物组合物。通过给予本发明的抗原结合分子或由本发明的制备方法制备的抗原结合分子，与通常的抗原结合分子相比，由于使血浆中的抗原浓度降低的作用高，而且被给予的机体的免疫应答和该机体中的药代动力学等改变，因而作为药物组合物有用。本发明的药物组合物中可含有药学上可接受的载体。

本发明中，药物组合物通常是指用于疾病的治疗或预防、或检查·诊断的药剂。

本发明的药物组合物可使用本领域技术人员公知的方法来进行配制。例如，可以以与水或其它药学上可接受的液体的无菌性溶液或悬浮液剂的注射剂形式非口服地使用。例如，可以适宜组合药理学上可接受的载体或介质，具体而言，适宜组合无菌水或生理盐水、植物油、乳化剂、助悬剂、表面活性剂、稳定剂、香味剂、赋形剂、溶媒、防腐剂、粘合剂等，以通常所认可的制药实践所要求的单位用量形式进行混和，由此进行制剂。设定这些制剂中的有效成分量，以便可得到指示范围的适当容量。

用于注射的无菌组合物可以使用注射用蒸馏水之类的溶媒按照通常的制剂实践来进行配制。作为注射用水溶液，可举出例如生理盐水、含有葡萄糖或其它佐剂(例如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化钠)的等渗液。可以与适当的溶解助剂、例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇、聚乙二醇等)、非离子性表面活性剂(聚山梨醇酯80(TM)、HCO-50等)并用。

油性液可举出芝麻油、大豆油，还可以并用苯甲酸苄酯和/或苯甲醇作为溶解助剂。此外，还可以与缓冲剂(例如，磷酸盐缓冲液和乙酸钠缓冲液)、止痛剂(例如，盐酸普鲁卡因)、稳定剂(例如，苯甲醇和苯酚)、抗氧化剂配合。所制备的注射液通常填充于适当的安瓿中。

本发明的药物组合物优选通过非口服给药来给予。给予例如注射剂型、经鼻给予剂型、经肺给予剂型、经皮给予型的组合物。通过例如静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等可全身或局部给予。

给予方法可根据患者的年龄、症状而适宜选择。含有抗原结合分子的药物组合物的给予量可设定为：例如，0.0001mg～1000mg/kg体重/次的范围。或者可设定：例如，每个患者为0.001～100000mg的给予量，但本发明并受上述数值的限制。给予量和给予方法根据患者的体重、年龄、症状等而改变，本领域技术人员可以考虑这些条件设定适当的给予量和给予方法。

应予说明，本发明所记载的氨基酸序列中所含的氨基酸有时也可在翻译后受到修饰(例如，N末端的谷氨酰胺通过焦谷氨酰基化而修饰成为焦谷氨酸是本领域技术人员熟知的修饰)，这种氨基酸经翻译后修饰的情形自然也含有在本发明所记载的氨基酸序列中。

使用本发明的抗原结合分子的方法

此外，本发明还提供以下(i)～(vi)的任一项所述的方法，该方法包括使抗原结合分子与表达Fcγ受体的细胞在机体内或机体外进行细胞接触，所述抗原结合分子含有：在pH酸性范围条件下具有人FcRn结合活性，且抗原结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域；以及，在pH中性范围条件下Fcγ受体结合活性与EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型Fcγ受体结合结构域的Fcγ受体结合活性相比高的Fcγ受体结合结构域，

(i)使一分子的抗原结合分子可结合的抗原数目增加的方法；

(ii)使血浆中的抗原消除的方法；

(iii)改善抗原结合分子的药代动力学的方法；

(vi)使血浆中的总抗原浓度或游离抗原浓度减少的方法。

本发明还提供以下(i)～(vii)的任一项所述的方法，该方法包括：使含有在pH酸性范围条件下具有人FcRn结合活性、且抗原结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域以及Fcγ受体结合结构域的抗原结合分子中的Fcγ受体结合结构域在pH中性范围条件下的Fcγ受体结合活性较EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型Fcγ受体结合结构域在pH中性范围条件下的Fcγ受体结合活性增强，

(ii)使一分子的抗原结合分子可结合的抗原数目增加的方法；

(iii)使抗原结合分子的血浆中抗原消除能力增大的方法；

(iv)改善抗原结合分子的药代动力学的方法；

作为使抗原结合分子与表达Fcγ受体的细胞在机体内或机体外进行细胞接触的方法，可举出：例如，(1)将含有抗原结合分子和与抗原结合分子结合的抗原的血浆暂时取出到机体外之后，与表达Fcγ受体的细胞进行接触，经过一定时间，将含有再循环到细胞外(也称再分泌或再循环)的未结合抗原的抗原结合分子的血浆返回到机体内的所谓的离体(ex vivo)的方法；或者(2)将抗原结合分子给予到机体内的方法。此外，在(1)的方法中，也可利用：将含有与抗原结合分子结合的抗原的血浆暂时取出到机体外之后，使抗原结合分子和表达Fcγ受体的细胞进行接触，将经过了一定时间的血浆返回到机体内的方法。

本发明中，表达Fcγ受体的细胞只要是表达所期望的Fcγ受体的细胞则可使用任意的细胞，不限于特定的细胞。为了特定表达所期望的Fcγ受体的细胞，可使用人类蛋白质表达图集(Human ProteinAtlas)(http://www.proteinatlas.org/)等公知的数据库。此外，通过确认编码所期望的Fcγ受体的基因表达的方法，以及通过使用与所期望的Fcγ受体结合的抗体的免疫学的方法，可以确认用于与本发明抗原结合分子接触的细胞是否表达该受体。这类方法也已公知。表达Fcγ受体的细胞与抗原结合分子和与该抗原结合分子结合的抗原的接触可在机体内进行，因此，本发明中，使抗原结合分子与表达Fcγ受体的细胞接触包括将抗原结合分子给予机体。接触的时间可适宜采用例如在1分钟～数周、30分钟～1周、1小时～3天、2小时～1天的期间的适合时间，即抗原结合分子或与该抗原结合分子结合的抗原由于Fcγ受体介导的胞吞作用而被摄入到细胞内所需要的时间。例如，作为表达Fcγ受体的细胞可使用各种的免疫细胞。

将Fcγ受体结合结构域在pH中性范围条件下的Fcγ受体结合活性较EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型Fcγ受体结合结构域在pH中性范围条件下的Fcγ受体结合活性增强的方法，记载于后述的本发明抗原结合分子的制备方法项目中。

使抗原结合分子所结合的抗原向细胞内的摄入得到促进的抗原结合分子的改变方法

本发明提供使抗原结合分子所结合的抗原向细胞内的摄入得到促进的抗原结合分子的改变方法，该方法包括：使含有在pH酸性范围条件下具有人FcRn结合活性，且抗原结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域和Fcγ受体结合结构域的抗原结合分子中的Fcγ受体结合结构域在pH中性范围条件下的Fcγ受体结合活性较EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型Fcγ受体结合结构域在pH中性范围条件下的Fcγ受体结合活性增强。

本发明中，利用抗原结合分子的“抗原向细胞内的摄入”意指抗原通过Fcγ受体介导的胞吞作用、内化而被摄入到细胞内。此外，本发明中“促进向细胞内的摄入”意指在血浆中与抗原结合的抗原结合分子被摄入到细胞内的速度得到促进和/或被摄入的抗原再循环到血浆中的量减少，除了抗原结合分子在pH中性范围的Fcγ受体结合活性的增大之外，与使抗原结合分子在pH酸性范围或低钙离子浓度等离子浓度条件下的抗原结合活性(结合能力)相比pH中性范围或高钙离子浓度等离子浓度条件下的抗原结合活性降低之前的抗原结合分子进行比较，向细胞内的摄入速度得到促进即可，优选相比EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型的人IgG得到促进，特别优选相比天然型的人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的任一个得到促进。因此，本发明中，利用抗原结合分子的抗原向细胞内的摄入得到促进与否可以通过抗原向细胞内摄入的速度是否增大来进行判断。抗原向细胞内摄入的速度可以通过例如在含有Fcγ受体表达细胞的培养液中添加抗原结合分子和抗原，并经时测定抗原的培养液中浓度的减少或经时测定摄入Fcγ受体表达细胞内的抗原的量来算出。通过利用本发明的抗原结合分子促进抗原向细胞内摄入的速度的方法，例如，通过给予抗原结合分子，可以促进血浆中抗原的消除速度。因此，利用抗原结合分子的抗原向细胞内的摄入是否得到促进也可以通过测定例如血浆中存在的抗原的消除速度是否得到加速或血浆中的总抗原浓度是否因给予抗原结合分子而降低来确认。

本发明中，“血浆中总抗原浓度”意指抗原结合分子结合的抗原和非结合抗原的总浓度，或作为抗原结合分子未结合的抗原浓度的“血浆中游离抗原浓度”。用于测定“血浆中总抗原浓度”或“血浆中游离抗原浓度”的各种方法如本说明书中以下记载所述，在本技术领域中是周知的。

本发明中，“天然型的人IgG”意指非修饰人IgG，并不限于IgG的特定类别。此外，对于“天然型的人IgG”，优选EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链。这意味着只要人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4在pH酸性范围下可与人FcRn结合，则可以作为“天然型的人IgG”使用。优选“天然型的人IgG”可以是人IgG1。

使一分子的抗原结合分子可结合的抗原的数目增加的方法

本发明提供使一分子的抗原结合分子可结合的抗原的数目增加的方法，该方法包括使抗原结合分子与表达Fcγ受体的细胞在机体内或机体外进行细胞接触，所述抗原结合分子含有：在pH酸性范围条件下具有人FcRn结合活性，且抗原结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域；以及，在pH中性范围条件下的Fcγ受体结合活性与EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型Fcγ受体结合结构域的Fcγ受体结合活性相比高的Fcγ受体结合结构域。

此外，本发明提供使一分子的抗原结合分子可结合的抗原的数目增加的方法，该方法包括：使含有在pH酸性范围条件下具有人FcRn结合活性、且抗原结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域和Fcγ受体结合结构域的抗原结合分子中的Fcγ受体结合结构域在pH中性范围条件下的Fcγ受体结合活性较EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型Fcγ受体结合结构域在pH中性范围条件下的Fcγ受体结合活性增强。

本发明中的“一分子的抗原结合分子可结合的抗原的数目”意指抗原结合分子被分解而消除为止的期间可结合的抗原的数目。本发明中的“使一分子的抗原结合分子可结合的抗原的数目增加”是指使与抗原结合分子结合的抗原分子解离、再度与抗原分子结合的次数增加。与抗原结合分子结合的抗原分子可以是两分子存在的反应系中存在的同一抗原分子，也可以是不同的分子。即，换句话说，该反应系中表示抗原结合分子与抗原结合的累计回数。在其它的表述中，将与抗原结合的抗原结合分子被摄入到细胞内、在内体内解离抗原后、抗原结合分子返回到细胞外假定为一个循环时，是指抗原结合分子被分解而消除为止的期间可重复的该循环的数目增加。在pH中性范围下对Fcγ受体具有结合活性的本发明的抗原结合分子与Fcγ受体结合后，由于胞吞作用被摄入到表达该Fcγ受体的细胞的细胞内。在pH酸性范围或低钙离子浓度等离子浓度条件中从Fcγ受体游离的本发明的抗原结合分子通过在pH酸性范围条件下与FcRn结合，可再度循环到细胞外。在pH酸性范围或低钙离子浓度等的离子浓度条件下抗原从抗原结合分子解离之后，被循环到细胞外的本发明的抗原结合分子可与抗原再度结合。因此，循环数目是否增加可通过有否前述的“促进向细胞内的摄入”或有否后述的“提高药代动力学”来判断。

使血浆中抗原消除的方法或使抗原结合分子的血浆中抗原的消除能力增大的方法

本发明提供使血浆中抗原消除的方法，该方法包括使抗原结合分子与表达Fcγ受体的细胞在机体内或机体外进行细胞接触，所述抗原结合分子含有：在pH酸性范围条件下具有人FcRn结合活性、且抗原结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域；以及，在pH中性范围条件下的Fcγ受体结合活性与EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型Fcγ受体结合结构域的Fcγ受体结合活性相比高的Fcγ受体结合结构域。

此外，本发明提供使抗原结合分子的血浆中抗原的消除能力增大的方法，该方法包括：使含有在pH酸性范围条件下具有人FcRn结合活性、且抗原结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域和Fcγ受体结合结构域的抗原结合分子中的Fcγ受体结合结构域在pH中性范围条件下的Fcγ受体结合活性较EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型Fcγ受体结合结构域在pH中性范围条件下的Fcγ受体结合活性增强。

本发明中，“使血浆中抗原消除能力增加的方法”与“使抗原从血浆中消除的抗原结合分子的能力增加的方法”同义。

本发明中，“血浆中抗原消除能力”是指将抗原结合分子给予至机体内或抗原结合分子在机体内分泌时，使血浆中存在的抗原从血浆中消除的能力。因此，本发明中，对于“抗原结合分子的血浆中抗原消除能力增加”，在给予抗原结合分子时，除了使抗原结合分子在pH中性范围下的Fcγ受体结合活性增大之外，与使pH酸性范围或低钙离子浓度等离子浓度条件下的抗原结合活性相比pH中性范围或高钙离子浓度下的抗原结合活性降低之前相比，抗原从血浆中消除的速度变快即可。抗原结合分子的血浆中抗原消除能力增加与否可通过例如将可溶型抗原和抗原结合分子给予至机体内，并测定给予后的可溶型抗原的血浆中浓度来判断。通过使抗原结合分子在pH中性范围条件下的Fcγ受体结合活性增大，或者，除了对该Fcγ受体的结合活性增大之外，还使pH酸性范围或低钙离子浓度等离子浓度条件下的抗原结合活性相比pH中性范围或高钙离子浓度等离子浓度条件下的抗原结合活性降低，给予可溶型抗原和抗原结合分子后血浆中的可溶型抗原的浓度降低时，可以判断抗原结合分子的血浆中抗原消除能力增加。可溶型抗原可以是抗原结合分子已结合的抗原(处于抗原-抗原结合分子复合体的状态的抗原)或抗原结合分子未结合的抗原，其浓度可分别确定为“血浆中抗原结合分子结合的抗原浓度”和“血浆中抗原结合分子未结合的抗原浓度”(后者与“血浆中游离抗原浓度”同义)。“血浆中总抗原浓度”意指抗原结合分子结合的抗原和抗原结合分子未结合的抗原的总浓度，或作为抗原结合分子未结合的抗原浓度的“血浆中游离抗原浓度”，因而可溶型抗原浓度可确定为“血浆中总抗原浓度”。测定“血浆中总抗原浓度”或“血浆中游离抗原浓度”的各种方法如本说明书中以下记载所述，在本技术领域中是周知的。

改善抗原结合分子的药代动力学的方法

本发明提供改善抗原结合分子的药代动力学的方法，该方法包括使抗原结合分子与表达Fcγ受体的细胞在机体内或机体外进行细胞接触，所述抗原结合分子含有：在pH酸性范围条件下具有人FcRn结合活性、且抗原结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域；以及，在pH中性范围条件下Fcγ受体结合活性与EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型Fcγ受体结合结构域的Fcγ受体结合活性相比高的Fcγ受体结合结构域。

此外，本发明提供改善抗原结合分子的药代动力学的方法，该方法包括：使含有在pH酸性范围条件下具有人FcRn结合活性、且抗原结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域和Fcγ受体结合结构域的抗原结合分子中的Fcγ受体结合结构域在pH中性范围条件下的Fcγ受体结合活性较EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型Fcγ受体结合结构域在pH中性范围条件下的Fcγ受体结合活性增强。

本发明中，“药代动力学的提高”、“药代动力学的改善”和“优异的药代动力学”换言之可以是“血浆中(血中)滞留性的提高”、“血浆中(血中)滞留性的改善”、“优异的血浆中(血中)滞留性”、“血浆中(血中)滞留性变长”，这些语句以相同的含义使用。

本发明中“药代动力学改善”不仅包括对人或小鼠、大鼠、猴、兔、狗等非人动物给予抗原结合分子后直至从血浆中消除为止(例如，直至在细胞内被分解等抗原结合分子无法返回血浆中的状态)的时间变长，也包括抗原结合分子在被给予后直至被分解消除为止期间以能够与抗原结合的状态(例如，抗原结合分子未与抗原结合的状态)滞留于血浆中的时间变长。天然型人IgG可以与来源于非人动物的FcRn结合。例如，天然型人IgG与人FcRn相比可以更强地与小鼠FcRn结合(Int.Immunol.(2001)13(12),1551-1559)，因而为了确认本发明的抗原结合分子的特性，可优选使用小鼠来进行给药。作为其它的实例，小鼠原本的FcRn基因缺失、且具有并表达与人FcRn基因相关的转基因的小鼠(Methods Mol.Biol.(2010)602,93-104)也可用作进行给药的对象，以确认以下所述的本发明的抗原结合分子的特性。具体而言，“药代动力学改善”还包括不与抗原结合的抗原结合分子(抗原非结合型抗原结合分子)直至被分解消除的时间变长。抗原结合分子即使存在于血浆中，在该抗原结合分子上已经结合有抗原时，该抗原结合分子无法与新抗原结合。因此，抗原结合分子未与抗原结合的时间越长，则可与新抗原结合的时间越长(可与新抗原结合的机会越多)，可以使抗原在机体内未与抗原结合分子结合的时间减少，可以使抗原与抗原结合分子结合的时间变长。只要通过给予抗原结合分子可加速抗原从血浆中的消除，则抗原非结合型抗原结合分子的血浆中浓度增加，此外，抗原与抗原结合分子结合的时间变长。即，本发明中的“抗原结合分子的药代动力学的改善”包括：抗原非结合型抗原结合分子的任一药代动力学参数的改善(血浆中半寿期的增加、平均血浆中滞留时间的增加、血浆中清除率的降低中的任一个)、或在给予抗原结合分子后抗原与抗原结合分子结合的时间的延长、或利用抗原结合分子的抗原从血浆中的消除得到加速。可通过测定抗原结合分子或抗原非结合型抗原结合分子的血浆中半寿期、平均血浆中滞留时间、血浆中清除率等中的任一参数(ファーマコキネティクス演習による理解(南山堂))来判断。例如，将抗原结合分子给予小鼠、大鼠、猴、兔、狗、人等后，测定抗原结合分子或抗原非结合型抗原结合分子的血浆中浓度，计算各参数，在血浆中半寿期变长或平均血浆中滞留时间变长的情形等中，可以说抗原结合分子的药代动力学得到改善。这些参数可通过本领域技术人员公知的方法测定，例如，使用药代动力学分析软件WinNonlin(Pharsight)，按照附带的说明书进行非房室(Noncompartmental)分析，由此可以进行适宜评价。未与抗原结合的抗原结合分子的血浆中浓度的测定可通过本领域技术人员公知的方法来实施，例如可以使用公知的方法(Clin.Pharmacol.(2008)48(4),406-417)中的测定方法。

本发明中“药代动力学改善”包括在给予抗原结合分子后抗原与抗原结合分子结合的时间延长。给予抗原结合分子后抗原与抗原结合分子结合的时间延长与否，可以测定游离抗原的血浆中浓度，通过游离抗原的血浆中浓度或游离抗原浓度相对于总抗原浓度的比例出现上升为止的时间来判断。

未与抗原结合分子结合的游离抗原的血浆中浓度或游离抗原浓度相对于总抗原浓度的比例可通过本领域技术人员公知的方法来实施，可以使用例如Pharm.Res.(2006)23(1),95-103中测定的方法。此外，抗原在机体内显示某种功能时，抗原与中和抗原功能的抗原结合分子(拮抗剂分子)结合与否也可以通过评价该抗原的功能是否被中和来进行判断。抗原的功能被中和与否可通过测定反映抗原功能的某种机体内标记物来进行评价。抗原是否与活化抗原功能的抗原结合分子(激动剂分子)结合可通过测定反映抗原功能的某种机体内标记物来进行评价。

游离抗原的血浆中浓度的测定、血浆中游离抗原量相对于血浆中总抗原量的比例的测定、机体内标记物的测定等测定没有特别限定，优选从给予抗原结合分子起经过一定时间后进行。本发明中，“从给予抗原结合分子起经过一定时间后”没有特别限定，本领域技术人员可根据给予的抗原结合分子的性质等适时确定，可举出：例如，从给予抗原结合分子起经过1天后、从给予抗原结合分子起经过3天后、从给予抗原结合分子起经过7天后、从给予抗原结合分子起经过14天后、从给予抗原结合分子起经过28天后等。本发明中，“血浆中抗原浓度”意指抗原结合分子结合的抗原和抗原结合分子未结合的抗原的总浓度即“血浆中总抗原浓度”或抗原结合分子未结合的抗原浓度即“血浆中游离抗原浓度”的任一个。

与给予含有EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgGFc区作为Fcγ受体结合结构域的参照抗原结合分子的情形相比，或与不给予含有本发明的抗原结合结构域的抗原结合分子的情形相比，通过给予本发明的抗原结合分子，血浆中总抗原浓度可降低2、5、10、20、50、100、200、500、1000或降低更多。

抗原/抗原结合分子摩尔比可如下所述进行计算：

A值＝各时刻的抗原摩尔浓度

B值＝各时刻的抗原结合分子摩尔浓度

C值＝各时刻每抗原结合分子摩尔浓度的抗原摩尔浓度(抗原/抗原结合分子摩尔比)

C＝A/B。

C值较小时，每抗原结合分子的抗原消除效率显示较高，C值较大时，每抗原结合分子的抗原消除效率显示较低。

抗原/抗原结合分子摩尔比可如上所述进行计算。

与给予含有天然型人IgG Fc区作为人Fcγ受体结合结构域的参照抗原结合分子的情形相比，通过给予本发明的抗原结合分子，抗原/抗原结合分子摩尔比可以降低2、5、10、20、50、100、200、500、1000倍或降低更多。

本发明中，优选将天然型人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4用作天然型人IgG，以用于在Fcγ受体结合活性或机体内的活性方面与抗原结合分子进行比较的参照天然型人IgG的用途。优选可适宜使用含有与目标抗原结合分子相同的抗原结合结构域和作为Fcγ受体结合结构域的天然型人IgG Fc区的参照抗原结合分子。更优选将天然型人IgG1用于在Fcγ受体结合活性或机体内的活性方面与抗原结合分子进行比较的参照天然型人IgG的用途。此外，本发明中，作为与本发明的抗原结合分子进行比较的参照抗原结合分子，根据其目的也可适宜使用：含有抗原结合活性不随离子浓度而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子、含有在pH酸性范围条件下的FcRn结合活性未增强的FcRn结合结构域的抗原结合分子或含有对Fcγ受体不具有选择性结合活性的Fcγ受体结合结构域的抗原结合分子等。

血浆中总抗原浓度或抗原/抗体摩尔比的减少可以如实施例6、8和13中的记载所述进行评价。更具体而言，在抗原结合分子与小鼠对应抗原不发生交叉反应时，可以使用人FcRn转基因小鼠品系32或品系276(JacksonLaboratories,Methods Mol.Biol.2010；602:93-104)，通过抗原抗体同时给予模型或稳态抗原注入模型中的任一个来进行评价。在抗原结合分子与小鼠对应抗原发生交叉反应时，可以通过向人FcRn转基因小鼠品系32或品系276(Jackson Laboratories)仅给予抗原结合分子来进行评价。在同时给予模型中，将抗原结合分子和抗原的混合物给予小鼠。在稳态抗原注入模型中，对小鼠植入填充有抗原溶液的注入泵以实现恒定的血浆中抗原浓度，然后对小鼠给予抗原结合分子。将试验抗原结合分子以相同的用量给予。使用本领域技术人员公知的方法在合适的时刻测定血浆中总抗原浓度、血浆中游离抗原浓度和血浆中抗原结合分子浓度。

在评价对Fcγ受体具有选择性结合活性的Fcγ受体结合结构域的影响时，血浆中总抗原浓度或抗原/抗体摩尔比的减少，在抗原结合分子与小鼠对应抗原不发生交叉反应时，可以使用通常所用的C57BL/6J小鼠(CharlesRiver Japan)，通过抗原抗体同时注射模型或稳态抗原注入模型的任一个来进行评价。在抗原结合分子与小鼠对应抗原发生交叉反应时，可以通过向通常所用的C57BL/6J小鼠(Charles River Japan)仅注射抗原结合分子来进行评价。

在给予2天后、4天后、7天后、14天后、28天后、56天后或84天后，测定血浆中的总抗原浓度或游离抗原浓度和抗原/抗原结合分子摩尔比，可以评价本发明的长期效果。换言之，为了评价本发明抗原结合分子的特性，通过在给予抗原结合分子2天后、4天后、7天后、14天后、28天后、56天后或84天后测定血浆中的总抗原浓度或游离抗原浓度和抗原/抗原结合分子摩尔比来确定长期的血浆中抗原浓度。是否通过本发明中记载的抗原结合分子实现血浆中抗原浓度或抗原/抗原结合分子摩尔比的减少，可通过在之前记载的任意1个或多个时刻评价该减少来确定。

在给予15分钟后、1小时后、2小时后、4小时后、8小时后、12小时后或24小时后测定血浆中的总抗原浓度或游离抗原浓度和抗原/抗原结合分子摩尔比，可评价本发明的短期效果。换言之，为了评价本发明的抗原结合分子的特性，通过在给予抗原结合分子15分钟后、1小时后、2小时后、4小时后、8小时后、12小时后或24小时后测定血浆中的总抗原浓度或游离抗原浓度和抗原/抗原结合分子摩尔比来确定短期的血浆中抗原浓度。

本发明的抗原结合分子的给予途径可从皮内注射、静脉内注射、玻璃体内注射、皮下注射、腹腔内注射、非口服注射和肌肉内注射中选择。

本发明中，人的药代动力学改善是优选的。难以测定人的血浆中滞留性时，可以基于小鼠(例如正常小鼠、人抗原表达转基因小鼠、人FcRn表达转基因小鼠等)或猴(例如食蟹猴等)的血浆中滞留性来预测人的血浆中滞留性。

促进在细胞外与抗原结合分子结合的抗原在细胞内从抗原结合分子解离的方法

本发明提供促进在细胞外与抗原结合分子结合的抗原在细胞内从抗原结合分子解离的方法，该方法包括使抗原结合分子与表达Fcγ受体的细胞在机体内或机体外进行细胞接触，所述抗原结合分子含有：在pH酸性范围条件下具有人FcRn结合活性、且抗原结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域；以及，在pH中性范围条件下Fcγ受体结合活性与EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型Fcγ受体结合结构域的Fcγ受体结合活性相比高的Fcγ受体结合结构域。

本发明提供促进在细胞外与抗原结合分子结合的抗原在细胞内从抗原结合分子解离的方法，该方法包括：使含有在pH酸性范围条件下具有人FcRn结合活性、且抗原结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域和Fcγ受体结合结构域的抗原结合分子中的Fcγ受体结合结构域在pH中性范围条件下的Fcγ受体结合活性较EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型Fcγ受体结合结构域在pH中性范围条件下的Fcγ受体结合活性增强。

本发明中，抗原从抗原结合分子解离的位点只要是在细胞内则可以是任意位点，但优选在早期内体内。本发明中，“在细胞外与抗原结合分子结合的抗原在细胞内从抗原结合分子解离”是指，不必要使与抗原结合分子结合而被摄入到细胞内的所有抗原在细胞内从抗原结合分子均解离，只要是抗原结合分子在pH酸性范围或低钙离子浓度等离子浓度条件下的抗原结合活性相比在pH中性范围或高钙离子浓度等离子浓度条件下的抗原结合活性降低，且与在pH中性范围下Fcγ受体结合活性提高之前进行比较，在细胞内从抗原结合分子解离的抗原比例增高即可。此外，使在细胞外与抗原结合分子结合的抗原在细胞内从抗原结合分子的解离得到促进的方法也可以说是对抗原结合分子赋予使与抗原结合的抗原结合分子向细胞内的摄入容易得到促进、抗原在细胞内从抗原结合分子的解离容易得到促进的性质的方法。

促进不与抗原结合的状态的抗原结合分子向细胞外释放的方法

本发明提供促进不与抗原结合的状态的抗原结合分子向细胞外释放的方法，该方法包括使抗原结合分子与表达Fcγ受体的细胞在机体内或机体外进行细胞接触，所述抗原结合分子含有：在pH酸性范围条件下具有人FcRn结合活性、且抗原结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域；以及，在pH中性范围条件下的Fcγ受体结合活性与EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型Fcγ受体结合结构域的Fcγ受体结合活性相比高的Fcγ受体结合结构域。

此外，本发明提供促进在与抗原结合的状态下被摄入到细胞内的抗原结合分子在不与抗原结合的状态下向细胞外释放的方法，该方法包括：使含有在pH酸性范围条件下具有人FcRn结合活性、且抗原结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域和Fcγ受体结合结构域的抗原结合分子中的Fcγ受体结合结构域在pH中性范围条件下的Fcγ受体结合活性较EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型Fcγ受体结合结构域在pH中性范围条件下的Fcγ受体结合活性增强。

本发明中，对于“在与抗原结合的状态下被摄入到细胞内的抗原结合分子在不与抗原结合的状态下向细胞外的释放”，不必要使在与抗原结合的状态下被摄入到细胞内的所有抗原结合分子在不与抗原结合的状态下均被释放到细胞外，只要是使抗原结合分子在pH酸性范围或低钙离子浓度等离子浓度条件下的抗原结合活性相比在pH中性范围或高钙离子浓度等离子浓度条件下的抗原结合活性降低，与在pH中性范围下的Fcγ受体结合活性提高之前进行比较，在不与抗原结合的状态下被释放到细胞外的抗原结合分子的比例增高即可。优选被释放到细胞外的抗原结合分子维持抗原结合活性。此外，使在与抗原结合的状态下被摄入到细胞内的抗原结合分子在不与抗原结合的状态下向细胞外的释放得到促进的方法也可以说是对抗原结合分子赋予使与抗原结合的抗原结合分子向细胞内的摄入容易得到促进、抗原结合分子在不与抗原结合的状态下向细胞外的释放容易得到促进的性质的方法。

使血浆中的总抗原浓度或游离抗原浓度减少的方法或可减少血浆中的总抗原浓度或游离抗原浓度的抗原结合分子的改变方法

本发明提供使血浆中的总抗原浓度或游离抗原浓度减少的方法，该方法包括使抗原结合分子与表达Fcγ受体的细胞在机体内或机体外进行细胞接触，所述抗原结合分子含有：在pH酸性范围条件下具有人FcRn结合活性、且抗原结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域；以及，在pH中性范围条件下Fcγ受体结合活性与EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型Fcγ受体结合结构域的Fcγ受体结合活性相比高的Fcγ受体结合结构域。

此外，本发明提供可减少血浆中的总抗原浓度或游离抗原浓度的抗原结合分子的改变方法，该方法包括：使含有在pH酸性范围条件下具有人FcRn结合活性、且抗原结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域和Fcγ受体结合结构域的抗原结合分子中的Fcγ受体结合结构域在pH中性范围条件下的Fcγ受体结合活性较EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型Fcγ受体结合结构域在pH中性范围条件下的Fcγ受体结合活性增强。

评价血浆中的总抗原浓度或游离抗原浓度的减少的方法记载于上述的改善抗原结合分子的药代动力学的方法项目中。

用于使该抗原从血浆中消除的离体的方法

作为由本发明提供的抗原结合分子在用于使该抗原从血浆中消除的方法中的使用的非限定的一个方案，也可例示该抗原结合分子在以下方法中的使用：用于使该抗原从血浆中消除的所谓离体方法，该方法包括使从对象分离的血浆和本发明的抗原结合分子接触而形成的免疫复合体与表达FcRn和Fcγ受体的细胞进行接触。代替将抗原结合分子给予机体内的方法或与之组合，通过将含有抗原结合分子和与抗原结合分子结合的抗原的血浆暂时取出到机体外之后，与表达FcRn和Fcγ受体的细胞进行接触，经过一定时间，将含有再循环到细胞外(也称再分泌或再循环)的未结合抗原的抗原结合分子的血浆返回到机体内的所谓离体的方法，也可促进血浆中抗原的消除速度。

此外，作为由本发明提供的、抗原结合分子在用于使该抗原从血浆中消除的方法中的使用的非限定的一个方案，也可例示该抗原结合分子在以下方法中的使用：用于使该抗原从血浆中消除的所谓离体的方法，该方法包括使从给予了本发明的抗原结合分子的对象分离的血浆中存在的免疫复合体与表达FcRn和Fcγ受体的细胞进行接触。

该抗原从血浆中消除与否，这可如下进行确认：代替本发明的抗原结合分子，将含有抗原结合活性不随离子浓度而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子、含有在pH酸性范围条件下的FcRn结合活性未增强的FcRn结合结构域的抗原结合分子或含有对Fcγ受体不具有选择性结合活性的Fcγ受体结合结构域的抗原结合分子作为对照进行比较时，评价前述的血浆中的抗原的消除速度是否得到促进等。

抗原结合分子的制备方法

此外，本发明提供抗原结合分子的制备方法，所述抗原结合分子含有：在pH酸性范围条件下具有人FcRn结合活性、且抗原结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域；以及，在pH中性范围条件下Fcγ受体结合活性与EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型Fcγ受体结合结构域的Fcγ受体结合活性相比高的Fcγ受体结合结构域。

即，本发明提供抗原结合分子的制备方法，该方法包括以下(a)～(f)的步骤：

(a)获得在高钙离子浓度条件下抗原结合结构域的抗原结合活性的步骤；

(d)使编码在(c)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸与编码Fcγ受体结合结构域的多核苷酸连接的步骤，所述Fcγ受体结合结构域是：在pH酸性范围条件下具有人FcRn结合活性，且在pH中性范围条件下Fcγ受体结合活性与EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型Fcγ受体结合结构域的Fcγ受体结合活性相比高的Fcγ受体结合结构域；

(f)从在(e)中培养的细胞培养液中回收抗原结合分子的步骤。

此外，本发明提供抗原结合分子的制备方法，该方法包括以下(a)～(f)的步骤：

(a)获得在高钙离子浓度条件下抗体的抗原结合活性的步骤；

(b)获得在低钙离子浓度条件下抗体的抗原结合活性的步骤；

(d)使编码在(c)中选择的抗体的抗原结合结构域的多核苷酸与编码Fcγ受体结合结构域的多核苷酸连接的步骤，所述Fcγ受体结合结构域是：在pH酸性范围下具有人FcRn结合活性，且在pH中性范围条件下Fcγ受体结合活性与EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型Fcγ受体结合结构域的Fcγ受体结合活性相比高的Fcγ受体结合结构域；

(f)从在(e)中培养的细胞培养液中回收抗原结合分子的步骤。

并且，本发明提供抗原结合分子的制备方法，该方法包括以下(a)～(f)的步骤：

(a)获得在pH中性范围条件下抗原结合结构域的抗原结合活性的步骤；

(d)使编码在(c)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸与编码Fcγ受体结合结构域的多核苷酸连接的步骤，所述Fcγ受体结合结构域是：在pH酸性范围下具有人FcRn结合活性，且在pH中性范围条件下Fcγ受体结合活性与EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型Fcγ受体结合结构域的Fcγ受体结合活性相比高的Fcγ受体结合结构域；

(f)从在(e)中培养的细胞培养液中回收抗原结合分子的步骤。

而且，本发明提供抗原结合分子的制备方法，该方法包括以下(a)～(f)的步骤：

(a)获得在pH中性范围条件下抗体的抗原结合活性的步骤；

(f)从在(e)中培养的细胞培养液中回收抗原结合分子的步骤。

“细胞”、“细胞系”和“细胞培养”在本说明书中以同义使用，这类称呼中可含有细胞或细胞系的所有后代。如此，例如“转化体”和“转化细胞”这样的用语与传代数无关，包括来源于它们的原代对象细胞和培养物。此外，还可以理解的是，由于故意或偶发的突变，所有后代中DNA的内容不会准确地相同。还可包括如在当初的转化细胞中筛选的、实质上具有相同功能或生物学活性的突变体的后代。对于意在不同称谓的记载的情形，根据该记载的前后关系，这样的意图应是明白的。

谈到表达编码序列时的调控序列是指为了在特定的宿主生物中表达有效连接的编码序列所需要的DNA碱基序列。例如，适合于原核生物的调控序列包括启动子、视情况而定的操纵基因序列、核糖体结合位点以及可能未被充分理解的其它序列。在真核细胞中，为了表达编码序列，利用启动子、多聚腺苷酸化信号和增强子是公知的。

与核酸有关的“有效连接”是指该核酸存在与其它核酸序列的功能关系。例如，前序列(presequence)或分泌前导肽的DNA在作为与某多肽的分泌相关的前体蛋白表达的情况下，与该多肽的DNA有效连接。启动子或增强子在其影响某编码序列的转录的情况下与该序列有效连接。或者，核糖体结合位点在其位于使翻译容易的位置的情况下与编码序列有效连接。通常，“有效连接”是指连接的DNA序列连续，在分泌前导肽的情况下指连续位于阅读框内。然而，增强子没有连续的必要。连接是在合适的限制性位点通过连接作用实现。在这样的位点不存在的情况下，合成寡核苷酸衔接头或接头根据历来的惯例使用。还可通过前述重叠延伸PCR方法制作连接的核酸。

“连接”是在两个核酸片段间形成磷酸二酯键的方法。为了连接两个片段，必须使片段末端相互配对。视情形而定，该末端在内切核酸酶消化后即具有配对性。然而，为了适合连接，首先，需要将通常在内切核酸酶消化后形成的粘末端转变成平头末端。为了形成平头末端，将DNA在合适的缓冲液中于15℃、在4种脱氧核糖核苷三磷酸存在下用约10单位的DNA聚合酶I或T4DNA聚合酶的Klenow片段处理至少15分钟。接着，对DNA进行苯酚氯仿提取和乙醇沉淀、或硅纯化(silica purification)从而纯化。将待连接的DNA片段以等摩尔量加入溶液中。该溶液中，除了ATP、连接酶缓冲剂之外，T4DNA连接酶这样的连接酶包含每0.5μgDNA约10单位。在将DNA连接到载体上时，载体首先通过适当的限制性内切核酸酶的消化作用而成线状。通过将线状化的片段接着用细菌碱性磷酸酶或小牛肠道的磷酸酶处理，预防连接步骤期间该片段的自我连接。

本发明的制备方法中，分离通过上述的“离子浓度条件”项目中说明的方法选择的在高钙离子浓度条件下的抗原结合活性相比在低钙离子浓度条件下的抗原结合活性高的抗原结合结构域或抗体。此外，分离通过上述的“离子浓度条件”项目中说明的方法选择的与在pH酸性范围条件下的抗原结合活性相比在pH中性范围条件下的抗原结合活性高的抗原结合结构域或抗体。例如，从文库中选择如此分离的抗原结合结构域时，如后述的实施例所记载，编码该抗原结合结构域的多核苷酸从噬菌体等病毒中通过通常的基因扩增进行分离。此外，如此分离的抗原结合结构域或抗体从杂交瘤等的细胞培养液中选择时，如上述的抗体项目中所示，通过通常的基因扩增从该细胞中分离抗体基因等。

接着，将编码如上述记载而分离的抗原结合结构域的多核苷酸与编码Fcγ受体结合结构域的多核苷酸框内连接，所述Fcγ受体结合结构域是：在pH酸性范围下具有人FcRn结合活性，且在pH中性范围条件下Fcγ受体结合活性与EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型Fcγ受体结合结构域的Fcγ受体结合活性相比高的Fcγ受体结合结构域。如上述的Fcγ受体结合结构域项目中所记载，作为Fcγ受体结合结构域的适宜实例，可举出抗体的Fc区。此外，作为Fcγ受体，可举出FcγRIa、FcγRIIa(R)、FcγRIIa(H)、FcγRIIb或FcγRIIIa(V)、FcγRIIIa(F)的任一个。

作为抗体的Fc区，可适宜举出Fc区的以EU编号表示的位点中选自以下的至少一个以上的氨基酸与天然型Fc区对应位点的氨基酸不同的Fc区：221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、243位、244位、245位、246位、247位、249位、250位、251位、254位、255位、256位、258位、260位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、339位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位和440位。作为天然型Fc区，可适宜举出：IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的任一个的Fc区。

此外，在非限定的一个方案中，作为抗体的Fc区，可适宜举出含有Fc区的以EU编号表示的选自以下的至少一个以上的氨基酸的Fc区：

221位的氨基酸为Lys或Tyr中的任一个；

222位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个；

223位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Lys中的任一个；

224位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个；

225位的氨基酸为Glu、Lys或Trp中的任一个；

227位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；

228位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；

230位的氨基酸为Ala、Glu、Gly或Tyr中的任一个；

231位的氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一个；

232位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；

240位的氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一个；

241位的氨基酸为Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中的任一个；

243位的氨基酸为Leu、Glu、Leu、Gln、Arg、Trp或Tyr中的任一个；

244位的氨基酸为His；

245位的氨基酸为Ala；

246位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；

249位的氨基酸为Glu、His、Gln或Tyr中的任一个；

250位的氨基酸为Glu或Gln中的任一个；

251位的氨基酸为Phe；

254位的氨基酸为Phe、Met或Tyr中的任一个；

255位的氨基酸为Glu、Leu或Tyr中的任一个；

256位的氨基酸为Ala、Met或Pro中的任一个；

258位的氨基酸为Asp、Glu、His、Ser或Tyr中的任一个；

260位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；

262位的氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中的任一个；

263位的氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一个；

266位的氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一个；

273位的氨基酸为Phe或Ile中的任一个；

275位的氨基酸为Leu或Trp中的任一个；

279位的氨基酸为Ala；

281位的氨基酸为Asp、Lys、Pro或Tyr中的任一个；

282位的氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一个；

284位的氨基酸为Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中的任一个；

285位的氨基酸为Asp、Glu、Lys、Gln、Trp或Tyr中的任一个；

286位的氨基酸为Glu、Gly、Pro或Tyr中的任一个；

288位的氨基酸为Asn、Asp、Glu或Tyr中的任一个；

291位的氨基酸为Asp、Glu、Gly、His、Ile、Gln或Thr中的任一个；

292位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中的任一个；

301位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；

302位的氨基酸为Ile；

303位的氨基酸为Asp、Gly或Tyr中的任一个；

304位的氨基酸为Asp、His、Leu、Asn或Thr中的任一个；

305位的氨基酸为Glu、Ile、Thr或Tyr中的任一个；

311位的氨基酸为Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中的任一个；

313位的氨基酸为Phe；

315位的氨基酸为Leu；

317位的氨基酸为Glu或Gln；

323位的氨基酸为Ile；

334位的氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile、Leu、Pro或Thr中的任一个；

336位的氨基酸为Glu、Lys或Tyr中的任一个；

337位的氨基酸为Glu、His或Asn中的任一个；

376位的氨基酸为Ala或Val中的任一个；

377位的氨基酸为Gly或Lys中的任一个；

378位的氨基酸为Asp；

379位的氨基酸为Asn；

380位的氨基酸为Ala、Asn或Ser中的任一个；

382位的氨基酸为Ala或Ile中的任一个；

385位的氨基酸为Glu；

392位的氨基酸为Thr；

396位的氨基酸为Leu；

421位的氨基酸为Lys；

427位的氨基酸为Asn；

428位的氨基酸为Phe或Leu中的任一个；

429位的氨基酸为Met；

434位的氨基酸为Trp；

436位的氨基酸为Ile；以及

440位的氨基酸为Gly、His、Ile、Leu或Tyr中的任一个。

此外，本发明的Fc区还可适宜使用在pH酸性范围条件下具有FcRn结合活性或者增强了FcRn结合活性的Fc区。作为这种Fc区，可举出IgG型免疫球蛋白的Fc区，例如人IgG(IgG1、IgG2、IgG3或IgG4以及它们的改变体)的Fc区。对于改变为其它氨基酸的改变体，只要在pH酸性范围下具有FcRn结合活性或者在pH酸性范围条件下提高人FcRn结合活性，就可使用任意位置的氨基酸被改变的Fc区，在抗原结合分子含有人IgG1的Fc区作为Fc区时，优选含有带来在pH酸性范围条件下对FcRn的结合较人IgG1的起始Fc区的结合活性增强的效果的改变。作为能实现上述改变的氨基酸，可适宜举出例如：如WO2000/042072中所记载，以EU编号表示的238位、252位、253位、254位、255位、256位、265位、272位、286位、288位、303位、305位、307位、309位、311位、312位、317位、340位、356位、360位、362位、376位、378位、380位、382位、386位、388位、400位、413位、415位、424位、433位、434位、435位、436位、439位和/或447位的氨基酸。同样，作为能实现上述改变的氨基酸，也可适宜举出例如：如WO2002/060919中所记载，以EU编号表示的251位、252位、254位、255位、256位、308位、309位、311位、312位、385位、386位、387位、389位、428位、433位、434位和/或436位的氨基酸。进而，作为能实现上述改变的氨基酸，也可举出：如WO2004/092219中所记载，以EU编号表示的250位、314位和428位的氨基酸。此外，作为能实现上述改变的氨基酸，也可适宜举出例如：如WO2010/045193所记载，以EU编号表示的251位、252位、307位、308位、378位、428位、430位、434位和/或436位的氨基酸。通过这些氨基酸的改变，IgG型免疫球蛋白的Fc区在pH酸性范围下对FcRn的结合增强的Fc区可在本发明的制备方法中使用。

此外，如后所述，作为本发明的抗原结合分子中所含的Fc区，也可适宜使用在pH中性范围下具有FcRn结合活性的Fc区。基于上述的在pH酸性范围下具有FcRn结合活性的Fc区的获得方法，这样的Fc区可通过任意的方法获得，具体而言，通过改变用作起始Fc区的人IgG型免疫球蛋白的Fc区的氨基酸可以获得含有在pH中性范围下具有FcRn结合活性或者增强了FcRn结合活性的FcRn结合结构域的Fc区。作为用于改变的优选的IgG型免疫球蛋白的Fc区，可举出例如人IgG(IgG1、IgG2、IgG3或IgG4以及它们的改变体)的Fc区。对于改变为其它氨基酸，只要在pH中性范围下具有FcRn结合活性或者在中性范围下提高人FcRn结合活性，就可使用任意位置的氨基酸被改变的Fc区。在抗原结合分子含有人IgG1的Fc区作为Fc区时，优选含有带来在pH中性范围下对FcRn的结合较人IgG1的起始Fc区的结合活性增强的效果的改变。作为能实现这种改变的Fc区，可适宜举出例如：起始Fc区的以EU编号表示的位点中选自以下的至少一个以上的氨基酸与天然型Fc区的对应氨基酸不同的人Fc区：237位、238位、239位、248位、250位、252位、254位、255位、256位、257位、258位、265位、270位、286位、289位、297位、298位、303位、305位、307位、308位、309位、311位、312位、314位、315位、317位、325位、332位、334位、360位、376位、380位、382位、384位、385位、386位、387位、389位、424位、428位、433位、434位和436位。

此外，作为能实现这种改变的Fc区，可适宜举出例如含有Fc区的以EU编号表示的选自以下的至少一个的氨基酸的Fc区：

237位的氨基酸为Met；

238位的氨基酸为Ala；

239位的氨基酸为Lys；

248位的氨基酸为Ile；

252位的氨基酸为Phe、Trp或Tyr中的任一个；

254位的氨基酸为Thr；

255位的氨基酸为Glu；

256位的氨基酸为Asp、Glu或Gln中的任一个；

258位的氨基酸为His；

265位的氨基酸为Ala；

270位的氨基酸为Phe；

286位的氨基酸为Ala或Glu中的任一个；

289位的氨基酸为His；

297位的氨基酸为Ala；

298位的氨基酸为Gly；

303位的氨基酸为Ala；

305位的氨基酸为Ala；

309位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Pro或Arg中的任一个；

311位的氨基酸为Ala、His或Ile中的任一个；

312位的氨基酸为Ala或His中的任一个；

314位的氨基酸为Lys或Arg中的任一个；

315位的氨基酸为Ala或His中的任一个；

317位的氨基酸为Ala；

325位的氨基酸为Gly；

332位的氨基酸为Val；

334位的氨基酸为Leu；

360位的氨基酸为His；

376位的氨基酸为Ala；

380位的氨基酸为Ala；

382位的氨基酸为Ala；

384位的氨基酸为Ala；

385位的氨基酸为Asp或His中的任一个；

386位的氨基酸为Pro；

387位的氨基酸为Glu；

389位的氨基酸为Ala或Ser中的任一个；

424位的氨基酸为Ala；

433位的氨基酸为Lys；

434位的氨基酸为Ala、Phe、His、Ser、Trp或Tyr中的任一个；

436位的氨基酸为His。

例如，通过将这些氨基酸的改变单独或多个组合使用，可增强IgG的Fc区在pH酸性范围和/或中性范围下对FcRn的结合，对导入的氨基酸改变没有特别限定，只要可带来改善血浆中滞留性的效果，则可导入任何的氨基酸改变。

可从所期望的表达载体转化的细胞培养液中分离本发明的抗原结合分子，该所期望的表达载体有效连接有通过如上记载所连接的编码抗原结合结构域的多核苷酸和编码Fcγ受体结合结构域的多核苷酸，该Fcγ受体结合结构域是：在pH酸性范围下具有人FcRn结合活性，且在pH中性范围条件下Fcγ受体结合活性与EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型Fcγ受体结合结构域的Fcγ受体结合活性相比高的Fcγ受体结合结构域。使用基于上述抗体项目中记载的抗体的制备方法的方法，可制备本发明的抗原结合分子。

应予说明，本说明书中引用的所有现有技术文献均作为参照结合到本说明书中。

以下，通过实施例更具体地说明本发明，但本发明并不受这些实施例的限制。

实施例

(实施例1)在pH中性范围条件下对小鼠FcγR的结合活性高于天然型人IgG的Fc区的结合活性的抗原结合分子的制作

(1-1)关于pH依赖性人IL-6受体结合抗体

WO2009/125825中记载的包含H54-IgG1(SEQ ID NO:36)和L28-CK(SEQ ID NO:37)的H54/L28-IgG1是人源化抗IL-6受体抗体，包含VH3-IgG1(SEQ ID NO:38)和VL3-CK(SEQ ID NO:39)的Fv4-IgG1是对H54/L28-IgG1赋予了与可溶型人IL-6受体pH依赖性地结合的特性(在pH7.4下结合，在pH5.8下解离)的人源化抗IL-6受体抗体。在WO2009/125825中记载的小鼠的体内试验中，与给予了H54/L28-IgG1和抗原可溶型人IL-6受体的混合物的组进行比较，在给予了Fv4-IgG1和抗原可溶型人IL-6受体的混合物的组中，显示出：可溶型人IL-6受体从血浆中的消除大幅度加速。

与可溶型人IL-6受体结合的抗体H54/L28-IgG1所结合的可溶型人IL-6受体和抗体一起通过FcRn再循环到血浆中，相对于此，pH依赖性地与可溶型人IL-6受体结合的抗体Fv4-IgG1在内体内的酸性条件下将与抗体结合的可溶型人IL-6受体解离。解离了的可溶型人IL-6受体被溶酶体分解，因此可以大幅度加速可溶型人IL-6受体的消除，并且pH依赖性地与可溶型人IL-6受体结合的抗体Fv4-IgG1在内体内与FcRn结合后，被再循环到血浆中。再循环的该抗体可以再次与可溶型人IL-6受体结合，因此对抗原(可溶型人IL-6受体)的结合和通过FcRn在血浆中的再循环重复进行。其结果，认为一个的抗体分子可多次重复与可溶型人IL-6受体结合(WO2009/125825)。

(1-2)对小鼠FcγR的结合增强的抗人IL-6受体抗体和不具有小鼠FcγR 结合的抗人IL-6受体抗体的制作

作为与小鼠FcγR的结合增强的抗原结合分子，制作了VH3-IgG1的以EU编号表示的326位的Lys取代成Asp、以EU编号表示的328位的Leu取代成Tyr的VH3-IgG1-F1022(SEQ ID NO:40)。使用参考实施例2的方法，制作了含有VH3-IgG1-F1022作为重链、含有VL3-CK作为轻链的Fv4-IgG1-F1022。

另一方面，作为不具有小鼠FcγR结合的抗原结合分子，制作了VH3-IgG1的以EU编号表示的235位的Leu取代成Arg、239位的Ser取代成Lys的VH3-IgG1-F760(SEQ ID NO:41)。使用参考实施例2的方法，制作了含有VH3-IgG1-F760作为重链、含有VL3-CK作为轻链的Fv4-IgG1-F760。

(1-3)对小鼠FcγR的结合活性的确认

利用参考实施例2的方法制作了含有VH3-IgG1、VH3-IgG1-F1022和VH3-IgG1-F760作为重链、含有L(WT)-CK(SEQ ID NO:42)作为轻链的VH3/L(WT)-IgG1、VH3/L(WT)-IgG1-F1022和VH3/L(WT)-IgG1-F760。如下所示，动力学分析了这些抗体对小鼠FcγR的结合。

(1-4)对小鼠FcγR的结合的动力学分析

使用BiacoreT100或T200(GEHealthcare)，动力学分析了小鼠FcγRI、FcγRIIb、FcγRIII、FcγRIV(在参考实施例26中制备)(以下称为小鼠FcγRs)与抗体的结合。在传感器芯片CM4(GE Healthcare)上，通过胺偶联法将适当量的蛋白L(ACTIGEN)固定化，并在其上捕获目标抗体。接着，通过注入小鼠FcγRs的稀释液和作为空白的运行缓冲液，使小鼠FcγRs与传感器芯片上捕获的抗体相互作用。作为运行缓冲液使用20mmol/L ACES、150mmol/L NaCl、0.05％(w/v)Tween20、pH7.4，小鼠FcγRs的稀释也使用该缓冲液。传感器芯片的再生使用10mmol/L甘氨酸-HCl,pH1.5。测定均在25℃下实施。由测定得到的传感图算出作为动力学参数的结合速率常数ka(1/Ms)和解离速率常数kd(1/s)。基于这些值算出各抗体对人FcγR的K_D(M)。各参数的计算中使用BiacoreT100或T200Evaluation Software(GEHealthcare)。

其结果，得到了表7所示的测定结果。显示出：与VH3/L(WT)-IgG1进行比较，VH3/L(WT)-IgG1-F1022对mFcγRI、mFcγRIIb和mFcγRIII的结合活性增强。另一方面，由于未检测VH3/L(WT)-IgG1-F760对各种小鼠FcγR的结合，因此显示出：VH3/L(WT)-IgG1-F760对各种小鼠FcγR的结合活性缺失。

[表7]

(1-5)低岩藻糖型抗体的制作

作为使抗体的FcγR结合活性增强的方法，除了向抗体的Fc区导入氨基酸改变的方法之外，还已知有使与抗体连接的糖链为低岩藻糖型糖链的方法(J.Biol.Chem.(2003)278,3466-3473)。按照参考实施例4的方法，通过使用使岩藻糖转运蛋白基因缺失的CHO细胞(WO2006067913)作为宿主细胞，来表达Fv4-IgG1，制作了低岩藻糖型Fv4-IgG1(以下，表示为Fv4-IgG1-Fuc)。据报道：低岩藻糖型抗体对mFcγR(小鼠Fcγ受体)中的FcγRIV的结合活性选择性地提高(Science(2005)310(5753)1510-1512)。

(实施例2)FcγR结合活性高于天然型人IgG的Fc区的结合活性的抗原结合分子从血浆中消除抗原的效果

(2-1)H54/L28-IgG1和Fv4-IgG1从血浆中消除抗原的效果

利用参考实施例1的方法制作了抗人IL-6受体抗体H54/L28-IgG1和具有pH依赖性地与人IL-6受体结合的性质的Fv4-IgG1。利用下述的方法实施使用制作的H54/L28-IgG1和Fv4-IgG1的体内注入(in vivo infusion)试验。

(2-1-1)使用人FcRn转基因小鼠的体内注入试验

在人FcRn转基因小鼠(B6.mFcRn-/-.hFcRnTg系32+/+小鼠、JacksonLaboratories、Methods Mol Biol.(2010)602,93-104)的背部皮下植入填充有可溶型人IL-6受体的注入泵(MINI-OSMOTIC PUMP MODEL2004、alzet)，由此制作了血浆中可溶型人IL-6受体浓度维持于稳态的动物模型。针对该动物模型，给予抗人IL-6受体抗体，对给予后的体内动力学进行了评价。为了抑制抗可溶型人IL-6受体的中和抗体的产生，将(利用公知的方法获得的)单克隆抗小鼠CD4抗体以20mg/kg单次给予尾静脉。然后，将填充有92.8μg/mL可溶型人IL-6受体的注入泵植入小鼠背部皮下。在注入泵植入的3天后，将抗人IL-6受体抗体以1mg/kg单次给予尾静脉。在抗人IL-6受体抗体给予后经过15分钟、7小时、1天、2天、4天、7天后自该小鼠采血。将采集的血液立即在4℃、15,000rpm下进行15分钟离心，由此得到血浆。分离的血浆直到实施测定为止保存在设定为-20℃以下的冰箱中。

(2-1-2)通过电化学发光法测定血浆中人IL-6受体(hsIL-6R)浓度

小鼠的血浆中人IL-6受体浓度通过电化学发光法进行测定。将制备为2000、1000、500、250、125、62.5、31.25pg/mL的hsIL-6R校准曲线试样和经50倍以上稀释的小鼠血浆测定试样，与用SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)进行了钌标记的单克隆抗人IL-6R抗体(R&D)和生物素化抗人IL-6R抗体(R&D)和托珠单抗混合，在37℃下反应一夜。托珠单抗的终浓度制备为333μg/mL。然后，将反应液分注到MA400PR链霉亲和素板(Meso Scale Discovery)中。进而在室温下反应1小时，将所得反应液洗涤后，分注读数缓冲液T(×4)(Meso Scale Discovery)。然后立即用SECTORPR400reader(Meso Scale Discovery)进行测定。人IL-6受体浓度使用分析软件SOFTmax PRO(Molecular Devices)，根据校准曲线的响应算出。

所测定的人IL-6受体浓度变化示于图2。和H54/L28-IgG1进行比较，与人IL-6受体pH依赖性地结合的Fv4-IgG1可以降低人IL-6受体浓度，但人IL-6受体浓度未能低于未给予抗体时的基线。即，与抗原pH依赖性地结合的抗体不能通过给予抗体使血浆中的抗原浓度相比给予抗体前降低。

(2-2)使FcγR结合活性增强或降低的抗体从血浆中消除抗原的效果

对于pH依赖性人IL-6受体结合抗体Fv4-IgG1，通过使FcγR结合活性增强或降低，对人IL-6受体浓度变化带来的影响通过下述的方法进行评价。通过下述的方法实施使用实施例1中制作的Fv4-IgG1、Fv4-IgG1-F760、Fv4-IgG1-F1022、Fv4-IgG1-Fuc的体内注入试验。

(2-2-1)使用人FcRn转基因小鼠的体内注入试验

在人FcRn转基因小鼠(B6.mFcRn-/-.hFcRnTg系32+/+小鼠、JacksonLaboratories、Methods Mol Biol.(2010),602,93-104)的背部皮下植入填充有可溶型人IL-6受体的注入泵(MINI-OSMOTIC PUMP MODEL2004、alzet)，由此制作了血浆中可溶型人IL-6受体浓度维持于稳态的动物模型。针对该动物模型，与人免疫球蛋白制剂Sanglopor(CSL Behring)同时给予抗人IL-6受体抗体，对给予后的可溶型人IL-6受体的体内动力学进行了评价。为了抑制抗可溶型人IL-6受体的中和抗体的产生，将(利用公知的方法获得的)单克隆抗-小鼠CD4抗体以20mg/kg单次给予尾静脉。然后，将填充有92.8μg/mL可溶型人IL-6受体的注入泵植入小鼠背部皮下。在注入泵植入的3天后，将抗人IL-6受体抗体以1mg/kg、将Sanglopor以1000mg/kg单次给予尾静脉。在抗人IL-6受体抗体给予后经过15分钟、7小时、1天、2天、4天、7天后自该小鼠采血。在抗人IL-6受体抗体给予后经过15分钟、7小时、1天、2天、3天、7天后自该小鼠采血。将采集的血液立即在4℃、15,000rpm下进行15分钟离心，由此得到血浆。分离的血浆直到实施测定为止保存在设定为-20℃以下的冰箱中。

(2-2-2)通过电化学发光法测定血浆中可溶型人IL-6受体(hsIL-6R)浓度

与(2-1-2)中记载的方法同样，小鼠的血浆中hsIL-6R浓度通过电化学发光法进行测定。

其结果示于图3。确认到：给予了使Fv4-IgG1与小鼠FcγR的结合缺失的Fv4-IgG1-F760的小鼠的血浆中的人IL-6受体浓度变化和给予了Fv4-IgG1的小鼠的血浆中的人IL-6受体浓度变化同等。已知：对膜型抗原的细胞毒活性依赖于对FcγR的结合，因此若使对FcγR的结合缺失则没有细胞毒活性。另一方面，即使给予使抗可溶型抗原人IL-6受体的抗体对小鼠FcγR的结合缺失的抗体，对所给予的小鼠的血浆中的人IL-6受体浓度的变化也没有影响，因此认为对于给予了抗可溶型抗原的抗体的小鼠的血浆中的抗原浓度的变化，也无助于抗体对FcγR的结合。

但是，意想不到的是，确认到：与给予了Fv4-IgG1的小鼠的血浆中的人IL-6受体浓度进行比较，给予了对小鼠FcγR的结合增强的Fv4-IgG1-F1022的小鼠的血浆中的人IL-6受体浓度大幅度地降低，对于该降低的程度，低于作为未给予抗体时的人IL-6受体浓度的基线。特别是，自给予了Fv4-IgG1-F1022的3天后，所给予的小鼠的血浆中人IL-6受体浓度，与给予了Fv4-IgG1时进行比较，降低到约百分之一。因此，通过给予pH依赖性地与人IL-6受体结合、并且与FcγR的结合增强的抗体，显示出：被给予的小鼠的血浆中人IL-6受体浓度大幅度地降低，对于该降低的程度，可使血浆中的抗原浓度低于抗体给予前。

此外，显示出：与给予了Fv4-IgG1的小鼠进行比较，给予了具有低岩藻糖型的糖链且对小鼠FcγRIV的结合活性增强的Fv4-IgG1-Fuc的小鼠的血浆中人IL-6受体浓度也降低。特别是，自给予了Fv4-IgG1-Fuc的7天后，被给予的小鼠的血浆中的人IL-6受体浓度与给予了Fv4-IgG1时进行比较，降低到约二分之一。因此，显示出：通过给予pH依赖性地与人IL-6受体结合、并且对FcγR的结合增强的pH依赖性抗原结合分子，可使被给予的小鼠的血浆中的可溶型抗原的浓度降低，此时，作为用于增强对FcγR的结合的方法，对导入氨基酸改变没有特别限定，例如通过使用EU编号297位连接的糖链为低岩藻糖型糖链的人IgG的Fc区也可达成。但是，作为使抗原浓度降低的效果，明确了：与Fv4-F1022相比，Fv4-IgG1-Fuc效果小。根据该结果，也可认为：在存在多种的FcγR(小鼠中为FcγRI、II、III、IV)中，Fv4-IgG1-Fuc中使结合增强的mFcγIV，作为FcγR使抗原浓度降低的贡献不大。

如此，发现了：通过给予pH依赖性地与可溶型抗原结合的抗体对FcγR的结合增强了的抗体，可使所给予的个体中存在的可溶型抗原的血浆中浓度大幅度地降低。

不受特定理论的束缚，通过给予与FcγR的结合增强了的含有抗原结合活性随pH等离子浓度条件而变化的抗原结合结构域、在pH酸性范围条件下具有FcRn结合活性的FcRn结合结构域的抗原结合分子，所观察到的预想之外的血浆中可溶型抗原浓度的降低也可以如下所述进行说明。

非特异性地被摄入到细胞内的IgG抗体，通过在内体内的酸性条件下与内体内的FcRn结合而返回到细胞表面上，在血浆中的中性条件下从FcRn解离。这里，在向在血浆中可溶型抗原维持于一定浓度的小鼠给予通过与可溶型抗原结合来中和其功能的抗体时，血浆中的可溶型抗原与所给予的抗体形成复合体。以形成了该复合体的状态被摄入到细胞内的可溶型抗原，由于抗体的Fc区在内体内的酸性条件下与内体内的FcRn结合，因此认为其以与抗体结合的状态和抗体一起被再循环到血浆中。

另一方面，抗可溶型抗原的抗体为pH依赖性地与抗原结合的抗体(即，在内体内的酸性条件下将可溶型抗原解离的抗体)时，以与抗体形成了复合体的状态非特异性地被摄入到细胞内可溶型抗原在内体内从抗体解离，在细胞内溶酶体内被分解，不能被再循环到血浆中。也就是说，可以认为：以与可溶型抗原形成了复合体的状态被摄入到细胞内的Fv4-IgG1在内体内将可溶型抗原解离，可加速其消除。

如上所述，对于Fv4-IgG1等的含有抗原结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子，虽然认为可多次重复与抗原结合，但是，在内体内将可溶型抗原解离、加快其从血浆中消除的效果，认为依赖于抗原与抗原结合分子的复合体被摄入到内体内的速度。增强了与各种FcγR的结合活性的、含有抗原结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子通过与表达在细胞膜上的各种FcγR结合，主动地被摄入到细胞内，通过该分子中所含的在pH酸性范围条件下具有FcRn结合活性的FcRn结合结构域与FcRn的结合介导的再循环，可以再度循环到血浆中。即，在血浆中与可溶型抗原形成了复合体的上述抗原结合分子经由表达在细胞膜上的FcγR主动地被摄入到细胞内，因此认为，加快血浆中的可溶型抗原的消除的效果相较于未增强与各种FcγR的结合活性的抗原结合分子更为显著。

在机体内，各种FcγR表达在免疫细胞的细胞膜上，担负着其多种的功能，但在用于将抗体摄入到细胞内时，认为可以使用任一个的FcγR。也就是说，就人而言，已知存在有作为活性型FcγR的FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa或抑制型FcγRIIb等，可以经由它们中的任一个而摄入。这些FcγR中，可以经由任一个的FcγR而摄入，也可以经由所有的FcγR而摄入。并且，可以是仅经由各种活性型FcγR而摄入的状态，或者可以是仅经由抑制型FcγRIIb而摄入的状态。

进而，为了实现上述的目的，对于抗原结合分子的FcγR结合结构域，可以使用用于使与FcγR的结合活性增强的任意方法。例如，如实施例1所示，对于抗原结合分子的FcγR结合结构域，可以导入用于使FcγR结合活性增强的氨基酸突变或者可以使用低岩藻糖型抗体。此外，通过这些的方法得到的FcγR结合活性增强的效果可以是对任一个的FcγR的结合增强的效果。也就是说，可以对任意的一个FcγR的结合活性增强，可以对几个的FcγR的结合活性增强，也可以对所有的FcγR的结合活性增强。并且，可以仅对各种活性型FcγR的结合活性增强或可以仅对抑制型FcγRIIb的结合活性增强。

与膜型抗原结合的抗体的FcγR结合活性，对于该抗体的细胞毒活性发挥重要的作用。因此，当细胞毒活性对用作药物的抗体必要时，可以使用FcγR结合活性高的人IgG1的同种型，并且通过将该抗体的FcγR结合活性增强来使该抗体的细胞毒活性增强的技术也被广泛使用。

另一方面，用作药物、与可溶型抗原结合的抗体的FcγR结合活性所发挥的作用迄今为止仍属未知，对于FcγR结合活性高的人IgG1和FcγR结合活性低的人IgG2或人IgG4的FcγR结合活性的区别赋予的给予了该抗体的机体的效果的不同，迄今为止未进行充分的研究。实际上，在本实施例中，也确认到：在给予了使FcγR结合活性缺失的抗体的个体的血浆中未对可溶型抗原的浓度变化产生影响。另一方面，本发明中，发现了：在给予了FcγR结合活性增强、含有可溶型抗原结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子的个体的血浆中，可溶型抗原的浓度大幅度地降低。即，可以说首次发现了：通过组合以可溶型抗原为靶标的抗原结合分子中所含的在pH酸性范围条件下具有FcRn结合活性的FcRn结合结构域和对可溶型抗原的结合随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域，使对FcγR的结合增强的优点。

(实施例3)FcγR结合活性高于天然型人IgG的Fc区的结合活性、增强了在pH酸性范围条件下的人FcRn结合活性的抗原结合分子从血浆中消除抗原的效果

(3-1)FcγR结合活性高于天然型人IgG的Fc区的结合活性、增强了在 pH酸性范围条件下的人FcRn结合活性的抗原结合分子的制作

作为改善IgG抗体的血浆中滞留性的方法，报道了在pH酸性范围条件下对FcRn的结合提高的方法。认为通过向IgG抗体的Fc区导入氨基酸取代、提高在pH酸性范围条件下对FcRn的结合，使从内体内向血浆中的再循环效率得以提高，其结果，改善该IgG抗体的血浆中滞留性。

作为用于通过提高在pH酸性范围条件下的人FcRn结合活性而改善血浆中滞留性的氨基酸改变的一例，有IgG抗体的以EU编号表示的428位的Met取代成Leu、434位的Asn取代成Ser的方法(Nat.Biotechnol,,(2010)28:,157-159.)、434位的Asn取代成Ala的方法(Drug.Metab.Dispos.(2010)38(4),600-605)、252位的Met取代成Tyr、254位的Ser取代成Thr、256位的Thr取代成Glu的方法(J.Biol.Chem.(2006)281,23514-23524)、250位的Thr取代成Gln、428位的Met取代成Leu的方法(J.Immunol.(2006)176(1)346-356)、434位的Asn取代成His的方法(Clin.Pharm.&Ther.(2011)89(2)283-290.)以及WO2010/106180、WO2010/045193、WO2009/086320、WO2009/058492、WO2008/022152、WO2006/050166、WO2006/053301、WO2006/031370、WO2005/123780、WO2005/047327、WO2005/037867、WO2004/035752、WO2002/060919等许多的报道。

在实施例2中，以通过该给予来使显示出显著地降低可溶型抗原的血浆中浓度的效果的Fv4-IgG1-F1022的药代动力学提高为目的，制作了VH3-IgG1-F1022的以EU编号表示的428位的Met取代成Leu、434位的Asn取代成Ser的VH3-IgG1-F1093(SEQ ID NO:43)。使用参考实施例2的方法，制作了含有VH3-IgG1-F1093作为重链、含有VL3-CK作为轻链的Fv4-IgG1-F1093。

(3-2)FcγR结合活性高于天然型人IgG的Fc区的结合活性、增强了在 pH酸性范围条件下的人FcRn结合活性的抗原结合分子从血浆中消除抗原的效果

使用血浆中可溶型人IL-6受体浓度维持于稳态的人FcRn转基因小鼠，与实施例(2-1-1)的方法同样，进行了Fv4-IgG1-F1093的体内注入试验。该小鼠血浆中的可溶型人IL-6受体浓度利用实施例(2-1-2)的方法进行测定。其结果示于图4。

(3-2-1)通过ELISA法测定血浆中抗人IL-6受体抗体浓度

小鼠血浆中的抗人IL-6受体抗体浓度通过ELISA法进行测定。首先，将抗Fv4独特型抗体分注到Nunc-Immuno Plate,MaxiSoup(Nalge nuncInternational)中，在4℃下静置一夜，由此制作了抗Fv4独特型抗体固定化板。该独特型抗体如下得到：将Fv4-M73(WO2009/125825)免疫兔而得到的血清利用离子交换树脂进行纯化后，用固定化有Fv4-M73的柱进行亲和纯化，然后，用人固定化柱吸收。制备了含有血浆中浓度为0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125μg/mL的抗人IL-6受体抗体的校准曲线试样以及经100倍以上稀释的小鼠血浆测定试样。在100μL的这些校准曲线试样和血浆测定试样中加入200μL的20ng/mL可溶型人IL-6受体，将所得混合液在室温下静置1小时。然后，将各孔中分注有该混合液的抗Fv4独特型抗体固定化板进一步在室温下静置1小时。然后，与生物素化抗人IL-6R抗体(R&D)在室温下反应1小时，进而与链霉亲和素-PolyHRP80(StereospecificDetection Technologies)在室温下反应1小时，使用TMB One Component HRPMicrowell Substrate(BioFX Laboratories)作为底物来进行所得反应液的显色反应。通过添加1N-硫酸(Showa Chemical)来终止反应，用酶标仪测定各孔的反应液的450nm吸光度。小鼠血浆中的抗体浓度是使用分析软件SOFTmax PRO(Molecular Devices)，根据校准曲线的吸光度算出。

其结果示于图5。

(3-3)通过增强pH酸性范围条件下的人FcRn结合活性来改善药代动力学

如图5所示，确认到：在给予了Fv4-IgG1的在pH中性范围条件下FcγR结合活性得到增强的Fv4-IgG1-F1022组中，与给予了Fv4-IgG1的组相比，所给予的抗体的血浆中滞留性降低。另一方面，确认到：在给予了Fv4-IgG1-F1022的在pH酸性范围条件下对人FcRn的结合活性得到增强的Fv4-IgG1-F1093的组中，与给予了Fv4-IgG1-F1022的组相比，所给予的抗体的血浆中滞留性大幅度改善。

进而，如图4所示，对于血浆中的可溶型人IL-6受体浓度，在Fv4-IgG1-F1022给予组和Fv4-IgG1-F1093给予组中，至抗体给予后的第3天为止，均显示出同等的变化。在给予后的第3天，与Fv4-IgG1给予组比较，Fv4-IgG1-F1022和Fv4-IgG1-F1093中任一个的给予组中均看出：血浆中的可溶型人IL-6受体浓度显著降低(降低约100倍)。但是，在抗体给予后的第7天，Fv4-IgG1-F1022给予组中血浆中的可溶型人IL-6受体浓度与给予后的第3天相比，观察到上升，而Fv4-IgG1-F1093给予组中血浆中的可溶型人IL-6受体浓度未观察到上升，显示出：该给予组使可溶型人IL-6受体浓度降低的效果持续。

即，显示出：与Fv4-IgG1相比，Fv4-IgG1-F1093的给予可使被给予的个体的血浆中的可溶型人IL-6受体浓度降低至约百分之一，而且可以长期维持该状态，是非常优异的抗原结合分子。不受特定理论的束缚，在此看到的现象也可以如下所述进行说明。Fv4-IgG1的在pH中性范围条件下FcγR结合活性得到增强的Fv4-IgG1-F1022，认为可以主要以大量被摄入到在细胞膜上表达FcγR的免疫细胞中。摄入后移行到内体中的抗体通过在内体内与FcRn结合而被再循环到血浆中。在内体内的酸性pH条件下，抗体对FcRn的结合活性不充分时，认为被摄入到内体中的抗体不能充分地再循环。即，作为Fv4-IgG1-F1022与Fv4-IgG1相比血浆中滞留性降低的原因，认为在于：被摄入到内体内的抗体经由与FcRn的结合越充分地被再循环到血浆中时，在pH酸性范围条件下对FcRn的结合活性越不充分，所以未被再循环的抗体在溶酶体中受到分解。

另一方面，认为：Fv4-IgG1-F1022的在pH酸性范围条件下对人FcRn的结合活性得到增强的Fv4-IgG1-F1093，与Fv4-IgG1-F1022同样，主要以大量被摄入到在细胞膜上表达FcγR的免疫细胞中。摄入后移行到内体中的抗体，通过在内体内与FcRn结合而被再循环到血浆中，但由于Fv4-IgG1-F1093在pH酸性范围条件下对人FcRn的结合活性得到增强，因此认为在内体内对FcRn具有充分的结合活性。因此，Fv4-IgG1-F1093被摄入到细胞内后，也大多被再循环到血浆中。因此，也认为：与Fv4-IgG1-F1022相比，Fv4-IgG1-F1093在被给予的个体的血浆中的滞留性提高。

另一方面，迄今为止还已知：在pH酸性范围条件下，通过使对FcRn的结合活性提高，通常的抗体的血浆中滞留性提高。但是，若抗体的血浆中滞留性提高，则与抗体结合的抗原的血浆中滞留性也提高，因此认为：由此会导致抗原的血浆中浓度也增高。实际上，如WO2010/088444中所记载，向抗IL-6的人IgG1抗体Antibody18导入了在pH酸性范围条件下使对FcRn的结合活性提高的YTE改变而得到的Antibody18E，在食蟹猴中，虽然抗体的血浆中滞留性提高，但同时作为抗原的IL-6的血浆中浓度也增高。

但是，意想不到的是，对于与抗原pH依赖性地结合、且增强了FcγR结合活性的Fv4-F1022，导入与YTE改变同样的在pH酸性范围条件下提高FcRn结合活性的改变而得到的Fv4-IgG1-F1093，在给予了Fv4-IgG1-F1093的情形下，尽管被给予的个体中大幅度提高抗体的血浆中滞留性，但该个体中作为抗原的可溶型人IL-6受体浓度并不增高，反而在给予抗体的第7天，与给予了Fv4-F1022的个体相比，给予了Fv4-IgG1-F1093的个体的可溶型人IL-6受体浓度维持在较低水平。

不受特定理论的束缚，在此看到的现象也可以如下所述进行说明。将对抗原不显示pH依赖性结合的抗体给予机体后，该抗体被非特异性地摄入到细胞内，与该抗体呈结合状态的抗原与抗体相同程度地被再循环到血浆中。另一方面，在pH酸性范围条件下对FcRn的结合活性得到增强的抗体，被再循环到被给予的机体的血浆中的程度相比对FcRn的结合活性未增强的抗体上升，因此与该抗原呈结合状态的抗原被再循环到该机体的血浆中的程度也上升。因此，认为：通过提高所给予的抗体在被给予的机体中的血浆中滞留性，也使该抗体所结合的抗原在该机体的血浆中浓度上升。

另一方面，将对抗原pH依赖性地结合、且FcγR结合活性得到增强的抗体给予机体时，该抗体主要被摄入到在细胞膜上表达FcγR的免疫细胞中，由此使其血浆中滞留性降低。另一方面，与该抗体结合的抗原也被摄入到该细胞中后，在内体内从该抗体解离后，在溶酶体中被分解，由此该机体的血浆中的抗原浓度也降低。在pH酸性范围条件下使对FcRn的结合活性提高时，通过使FcγR结合活性增强而变差的抗体的血浆中滞留性，可通过提高基于FcRn的再循环率而得以改善。这里，对抗原pH依赖性地结合的抗体所结合的抗原在内体内从该抗体解离，直接被溶酶体分解，因此认为抗原的血浆中浓度不上升。进而，通过提高给予到机体中的抗体的血浆中滞留性，该抗体的抗原消除效果持续，认为可以更长时间以低浓度维持抗原浓度。

综上所述，在给予了FcγR结合活性高于天然型人IgG的Fc区的结合活性的抗原结合分子的、增强了在pH酸性范围条件下的人FcRn结合活性的抗体的机体中，显示出：所给予的抗体的血浆中滞留性提高。此外，显示出：在该情形下即使抗体的血浆中滞留性提高，抗原消除效果也不减弱。

[实施例4]FcγR结合活性高于天然型人IgG的Fc区的结合活性、增强了在pH酸性范围条件下的人FcRn结合活性的抗原结合分子从血浆中消除抗原的效果的进一步验证

(4-1)给予了FcγR结合活性高于天然型人IgG的Fc区的结合活性、增强了在pH酸性范围条件下的人FcRn结合活性的抗体在机体中的抗原消除效果

实施例2中，显示出：在给予了对小鼠FcγR的结合得到增强的Fv4-IgG1-F1022的组中，血浆中的抗原浓度大幅度降低。此外，实施例3中，显示出：Fv4-IgG1-F1022的给予组中的血浆中滞留性的降低，通过增强Fv4-IgG1-F1022的在pH酸性范围条件下对人FcRn的结合活性，可以大幅度得以改善。接着，增强对小鼠FcγR的结合所致的血浆中可溶型抗原的消除效果，和增强在pH酸性范围条件下对人FcRn的结合活性所致的在给予抗体的机体中该抗体的血浆中滞留性的提高效果，进一步如下所述进行了验证。

(4-2)制作对小鼠FcγR的结合得以增强的抗人IL-6受体抗体

作为对小鼠FcγR的结合得到增强的抗原结合分子，制作了VH3-IgG1的以EU编号表示的326位的Lys取代成Asp的VH3-IgG1-F1087(SEQ IDNO:123)和VH3-IgG1的以EU编号表示的239位的Ser取代成Asp、332位的Ile取代成Glu的VH3-IgG1-F1182(SEQ ID NO:124)。使用参考实施例2的方法，制作了含有VH3-IgG1-F1087作为重链、含有VL3-CK作为轻链的Fv4-IgG1-F1087和含有VH3-IgG1-F1182作为重链、含有VL3-CK作为轻链的Fv4-IgG1-F1182。

(4-3)确认对小鼠FcγR的结合活性

利用参考实施例2的方法制作了含有VH3-IgG1-F1087和VH3-IgG1-F1182作为重链、含有L(WT)-CK(SEQ ID NO:42)作为轻链的VH3/L(WT)-IgG1-F1087和VH3/L(WT)-IgG1-F1182。利用参考实施例2的方法评价了这些抗体和VH3/L(WT)-IgG1-F1022对小鼠FcγR的结合活性。其结果示于表8。此外，将各改变体对小鼠FcγR的结合活性与加入改变前的IgG1比较增强了几倍的结果示于表9。

[表8]

[表9]

如表9所示，显示出：F1087和F1022对小鼠FcγRI、小鼠FcγRIIb和小鼠FcγRIII的结合活性与IgG1相比增强，但对小鼠FcγRIV的结合活性未增强。此外，显示出：与F1022比较，F1087对小鼠FcγRI、小鼠FcγRIIb、小鼠FcγRIII和小鼠FcγRIV的结合活性的增强程度较弱。另一方面，显示出：F1182对小鼠FcγRI和小鼠FcγRIV的结合活性大幅度增强，而其对FcγRIIb和FcγRIII的结合活性，与F1022和F1087比较，其增强的程度较弱。如此，显示出：这3种的改变体均显示出对小鼠FcγR的结合的增强效果，但对哪种FcγR的选择性结合活性增强及其增强的程度根据改变体而不同。

(4-4)给予了Fv4-IgG1-F1087和Fv4-IgG1-F1182的机体的从血浆中消除抗原的效果

使用人FcRn转基因小鼠的体内注入试验与实施例2的方法同样进行实施，测定了该小鼠血浆中的可溶型IL-6受体的浓度。其结果示于图6。

在机体内给予了对小鼠FcγR的结合活性与Fv4-IgG1相比得以增强的Fv4-IgG1-F1087和Fv4-IgG1-F1182的组中，与给予了Fv4-IgG1的组相比，机体中的血浆中可溶型人IL-6受体的浓度均降低。对于上述的血浆中可溶型人IL-6受体的浓度降低的效果，特别是给予了对小鼠FcγRII和小鼠FcγRIII的结合得以增强的Fv4-IgG1-F1087的组中较大。另一方面，在机体内给予了对小鼠FcγRI和小鼠FcγRIV的结合活性大幅度得以提高的(对小鼠FcγRII和小鼠FcγRIII的结合也增强了数倍)F1182的组中，F1182的给予所致的血浆中可溶型人IL-6受体的浓度降低效果较小。根据这些结果，认为：更有助于使给予了pH依赖性抗原结合抗体的小鼠的血浆中的抗原浓度有效地降低的效果的小鼠FcγR是小鼠FcγRII和/或小鼠FcγRIII。即，认为：通过将对小鼠FcγRII和/或小鼠FcγRIII的结合增强了的pH依赖性抗原结合抗体给予机体内，可以更有效地降低机体内的抗原的血浆中浓度。

(4-5)FcγR结合活性高于天然型人IgG的Fc区的结合活性、增强了在 pH酸性范围条件下的人FcRn结合活性的抗原结合分子的制作

实施例3中，显示出：在给予了对小鼠FcγR的结合活性得以增强的Fv4-IgG1-F1022的增强了在pH酸性范围条件下的人FcRn结合活性的Fv4-IgG1-F1093的人FcRn转基因小鼠中，与给予了Fv4-IgG1-F1022的人FcRn转基因小鼠比较，所给予的抗体的血浆中滞留性大幅度提高。该效果在给予了Fv4-IgG1-F1087和Fv4-IgG1-F1182的人FcRn转基因小鼠中是否也显示，以及在给予了加入与实施例3中验证的改变不同的改变、增强了在pH酸性范围条件下对人FcRn的结合活性的改变体的小鼠中是否也显示同样的效果，如下所述进行了验证。

为了增强Fv4-IgG1-F1087和Fv4-IgG1-F1182在pH酸性范围条件下对人FcRn的结合活性，制作了作为各重链的VH3-IgG1-F1087和VH3-IgG1-F1182的以EU编号表示的428位的Met取代成Leu、434位的Asn取代成Ser的VH3-IgG1-F1180(SEQ ID NO:125)和VH3-IgG1-F1181(SEQ ID NO:126)。此外，为了增强Fv4-IgG1-F1087在pH酸性范围条件下对人FcRn的结合活性，制作了作为重链的VH3-IgG1-F1087的以EU编号表示的434位的Asn取代成Ala的VH3-IgG1-F1412(SEQ IDNO:127)。使用参考实施例2的方法，制作了含有这些作为重链、含有VL3-CK作为轻链的Fv4-IgG1-F1180、Fv4-IgG1-F1181和Fv4-IgG1-F1412。

(4-6)增强了在pH酸性范围条件下的人FcRn结合活性的抗体的药代动力学的改善

向人FcRn转基因小鼠分别给予Fv4-IgG1-F1180、Fv4-IgG1-F1181和Fv4-IgG1-F1412的体内注入试验与实施例2的方法同样进行实施，测定了该小鼠组的血浆中可溶型IL-6受体的浓度。给予了Fv4-IgG1-F1087、Fv4-IgG1-F1180、Fv4-IgG1-F1412、Fv4-IgG1的小鼠组的血浆中抗体浓度的结果示于图7，给予了Fv4-IgG1-F1182、Fv4-IgG1-F1181、Fv4-IgG1的小鼠的血浆中抗体浓度的结果示于图8。此外，利用实施例3的方法测定了该小鼠组中的血浆中抗体浓度。该小鼠组中的Fv4-IgG1-F1087、Fv4-IgG1-F1180、Fv4-IgG1-F1412、Fv4-IgG1的血浆中可溶型IL-6受体浓度的结果示于图9，Fv4-IgG1-F1182、Fv4-IgG1-F1181、Fv4-IgG1的血浆中可溶型IL-6受体浓度的结果示于图10。

在给予了Fv4-IgG1-F1182的在pH酸性范围下对人FcRn的结合活性得到增强的Fv4-IgG1-F1181的小鼠组中，与给予了Fv4-IgG1-F1182的小鼠组相比，所给予的抗体的血浆中滞留性的提高得到确认。另一方面，给予了Fv4-IgG1-F1181的小鼠组的血浆中可溶型IL-6受体浓度与给予了Fv4-IgG1-F1182的小鼠组同等，与给予了Fv4-IgG1的小鼠组相比，血浆中可溶型IL-6受体浓度均降低。

另一方面，在给予了Fv4-IgG1-F1087的在pH酸性范围下对人FcRn的结合活性得到增强的Fv4-IgG1-F1180和Fv4-IgG1-F1412的小鼠组中，与给予了Fv4-IgG1-F1087的小鼠组比较，所给予的抗体的血浆中滞留性均提高，意想不到的是，改善至与给予了Fv4-IgG1的小鼠组的血浆中滞留性相同的程度。此外，伴随抗体的血浆中滞留性的改善，被给予的小鼠组的血浆中可溶型IL-6受体的浓度的降低效果的持续性也得到改善。即，自给予Fv4-IgG1-F1180和Fv4-IgG1-F1412的14天后和21天后，接受该给予的小鼠组的血浆中可溶型IL-6受体的浓度，与自给予Fv4-IgG1-F1087的14天后和21天后的情形比较，显著地降低。

综上所述，通过给予增强了FcγR结合活性高于天然型人IgG的Fc区的结合活性的抗原结合分子的在pH酸性范围条件下的人FcRn结合活性的抗体，可以提高接受该给予的机体的血浆中滞留性，这显示在给予了Fv4-IgG1-F1093、Fv4-IgG1-F1181、Fv4-IgG1-F1180和Fv4-IgG1-F1412这4例抗体的小鼠组中。进而，显示出：给予了抗原结合分子的机体的血浆中滞留性即使提高，该机体中的抗原消除效果也不减弱，不如说可使抗原消除效果持续。

(4-7)增强在pH酸性范围条件下的人FcRn结合活性、抑制与类风湿因子的结合的抗原结合分子的制作

近年报道了：为了增强人源化抗CD4抗体在pH酸性范围条件下对人FcRn的结合活性，使血浆中滞留性提高，以EU编号表示的434位的Asn取代成His的抗体分子与类风湿因子(Rheumatiod factor、RF)结合(Clin.Pharmacol.Ther.(2011)89(2),283-290)。显示出：该抗体具有人IgG1的Fc区，位于FcRn结合位点的以EU编号表示的434位的Asn取代成His，但结合识别该取代位点的类风湿因子。

如实施例(4-6)所示，显示出：在向人FcRn转基因小鼠给予了增强了对小鼠FcγR的结合活性得以增强的Fv4-IgG1-F1087的在pH酸性范围条件下对人FcRn的结合活性的Fv4-IgG1-F1180的情形中，与给予了Fv4-IgG1-F1087的情形比较，血浆中滞留性提高。作为用于增强在pH酸性范围条件下对人FcRn的结合活性的改变有各种各样的报道，在那些改变中，重链的以EU编号表示的428位的Met取代成Leu、434位的Asn取代成Ser的改变体被报道增强与类风湿因子的结合。

但是，除了这些以EU编号表示的428位和434位的取代之外以EU编号表示的436位的Tyr取代成Thr的改变体，在pH酸性范围条件下对人FcRn的结合活性被增强，但与类风湿因子的结合显著地降低。

即，通过将在pH酸性范围条件下对FcRn的结合活性不降低、仅降低对类风湿因子的结合活性的改变导入Fc区的该位点，可以制作对类风湿因子不具有结合性、在pH酸性范围条件下对人FcRn的结合活性得以增强的抗原结合分子。

作为这类使对类风湿因子的结合活性降低的改变，使用以EU编号表示的248-257、305-314、342-352、380-386、388、414-421、423、425-437、439、441-444位的改变。优选使用以EU编号表示的387、422、424、426、433、436、438、440位的改变。特别优选使用以EU编号表示的422位的Val取代成Glu或Ser的改变、424位的Ser取代成Arg的改变、433位的His取代成Asp的改变、436位的Tyr取代成Thr的改变、438位的Gln取代成Arg或Lys的改变、440位的Ser取代成Glu或Asp的改变。这些改变可以单独使用也可以将多个位置组合使用。

或者，为了使对类风湿因子的结合活性降低，可以导入N型糖链的附加序列。具体而言，作为N型糖链附加序列已知有Asn-Xxx-Ser/Thr(Xxx是除Pro外的任意氨基酸)，通过将该序列导入Fc区而附加N型糖链，通过N型糖链的空间位阻可以抑制与RF的结合。作为用于附加N型糖链的改变，优选使用以EU编号表示的248位的Lys取代成Asn的改变、424位的Ser取代成Asn的改变、436位的Tyr取代成Asn而438位的Gln取代成Thr的改变、438位的Qln取代成Asn的改变。特别优选使用以EU编号表示的424位的Ser取代成Asn的改变。

(4-8)验证在pH酸性范围条件下的人FcRn结合活性得到增强、与类风湿因子的结合降低的抗原结合分子的药代动力学的改善效果

为了验证含有上述的使对类风湿因子的结合活性降低的改变的抗体的效果，对于Fv4-IgG1-F1087的重链，使用参考实施例2的方法制作了以EU编号表示的428位的Met取代成Leu、434位的Asn取代成Ser、并且436位的Tyr取代成Thr的Fv4-IgG1-F1782。如实施例(4-7)所述，与天然型人IgG1比较，Fv4-IgG1-F1782是对小鼠FcγR的结合活性得到增强、在酸性pH条件下的人FcRn结合活性得到增强，而对类风湿因子的结合性不增强的抗体。为了验证Fv4-IgG1-F1782与Fv4-IgG1-F1087比较是否提高血浆中滞留性，与实施例2的方法同样，对给予了这些抗体的人FcRn转基因小鼠的血浆中的该抗体的药代动力学进行了评价。血浆中可溶型人IL-6受体的浓度利用实施例(2-1-2)所述的方法进行了测定，血浆中抗体浓度利用实施例(3-2-1)所述的方法进行了测定。

血浆中抗体浓度变化的结果示于图11，血浆中可溶型人IL-6受体浓度变化的结果示于图12。显示出：与Fv4-IgG1-F1087比较，Fv4-IgG1-F1782提高了抗体的血浆中滞留性。另一方面，与给予了Fv4-IgG1的组比较，给予了上述抗体的组的血浆中可溶型人IL-6受体浓度显著地降低。

不受特定理论的束缚，关于这些结果，可以如下所述进行解释。由实施例3和4的结果显示出：通过给予增强了FcγR结合活性高于天然型人IgG的Fc区的结合活性的抗原结合分子的在pH酸性范围条件下的人FcRn结合活性的抗体，可以提高接受该给予的机体的血浆中滞留性。进而，显示出：即使给予了抗原结合分子的机体的血浆中滞留性提高，该机体中的抗原消除效果也不减弱，反而可以持续抗原消除效果。

但是，担心这些导入有用于使在pH酸性范围条件下的人FcRn结合活性增强的改变的抗原结合分子会增强对类风湿因子的结合性。于是，通过向该结合分子中导入在pH酸性范围条件下的人FcRn结合活性维持不变而使对类风湿因子的结合性降低的突变，可以在不使对类风湿因子的结合性增加的情形下，使血浆中滞留性提高。

换言之，在机体内给予了具有pH依赖性地与抗原结合的性质、FcγR结合活性高于天然型人IgG的Fc区的结合活性、在pH酸性范围条件下的人FcRn结合活性得到增强、并且对类风湿因子的结合性降低了的抗原结合分子的情形下，明确了该抗原结合分子所具有的使该机体内的可溶型抗原的浓度有效地降低、不增加该抗原结合分子对类风湿因子的结合性而使血浆中滞留性提高这样的优异性质。

[实施例5]给予了FcγR结合活性高于天然型小鼠IgG的Fc区的结合活性的抗原结合分子的机体的从血浆中消除抗原的效果

(5-1)给予了已增强FcγR结合活性的小鼠抗体的机体的从血浆中消除抗原的效果

在实施例1～4中，确认到：在给予了具有人抗体的Fc区、具有pH依赖性地与人IL-6受体结合的性质的抗原结合分子的对小鼠FcγR的结合活性增强的抗原结合分子的人FcRn转基因小鼠组中，该小鼠的血浆中可溶型人IL-6受体的消除加速。该效果在具有小鼠FcRn的正常小鼠中，给予了具有小鼠抗体的Fc区、具有pH依赖性地与人IL-6受体结合的性质的抗原结合分子的具有小鼠FcRn的正常小鼠中是否也显示，如以下所示进行了验证。

(5-2)FcγR结合活性得到增强的小鼠抗体的制作

使用参考实施例2的方法制作了具有pH依赖性地与人IL-6受体结合的性质的小鼠IgG1抗体的重链VH3-mIgG1(SEQ ID NO:128)、轻链VL3-mk1(SEQ ID NO:129)。此外，为了增强VH3-mIgG1对小鼠FcγR的结合活性，制作了以EU编号表示的327位的Ala取代成Asp的VH3-mIgG1-mF44(SEQ ID NO:130)。同样，制作了VH3-mIgG1的以EU编号表示的239位的Ser取代成Asp、327位的Ala取代成Asp的VH3-mIgG1-mF46(SEQ ID NO:131)。使用参考实施例2的方法制作了含有VH3-mIgG1、VH3-mIgG1-mF44或VH3-mIgG1-mF46作为重链、含有VL3-mk1作为轻链的Fv4-mIgG1、Fv4-mIgG1-mF44或Fv4-mIgG1-mF46。

(5-3)FcγR结合活性得到增强的小鼠抗体对小鼠FcγR的结合活性的确认

利用参考实施例2的方法制作了含有VH3-mIgG1、VH3-mIgG1-mF44或VH3-mIgG1-mF46作为重链、含有L(WT)-CK(SEQ ID NO:42)作为轻链的VH3/L(WT)-mIgG1、VH3/L(WT)-mIgG1-mF44或VH3/L(WT)-mIgG1-mF46。利用参考实施例25的方法评价了这些抗体对小鼠FcγR的结合活性。其结果示于表10。此外，将各改变体对小鼠FcγR的结合活性与加入改变前的mIgG1比较增强了几倍的结果示于表11。

[表10]

[表11]

根据具有天然型小鼠IgG1抗体的Fc区的VH3/L(WT)-mIgG1与小鼠FcγRI和小鼠FcγRIV不显示结合、仅与小鼠FcγRIIb和小鼠FcγRIII显示结合的实施例4的研究结果，暗示对于使抗原浓度降低而言重要的小鼠FcγR是小鼠FcγRII和/或小鼠FcγRIII。此外，显示出：导入了认为增强VH3/L(WT)-mIgG1的FcγR结合活性的改变的VH3/L(WT)-mIgG-mF44和VH3/L(WT)-mIgG1-mF46，对小鼠FcγRIIb和小鼠FcγRIII的结合活性均增强。

(5-4)正常小鼠的血浆中可溶型IL-6受体浓度的降低效果的确认

给予了作为抗人IL-6受体抗体的Fv4-mIgG1、Fv4-mIgG1-mF44或Fv4-mIgG1mF46的正常小鼠的血浆中可溶型IL-6受体的消除效果如以下所述进行了验证。

在正常小鼠(C57BL/6J小鼠、Charles River Japan)的背部皮下植入填充有可溶型人IL-6受体的注入泵(MINI-OSMOTIC PUMP MODEL2004、alzet)，由此制作了血浆中可溶型人IL-6受体浓度维持于稳态的动物模型。针对该动物模型，对将抗人IL-6受体抗体给予后的可溶型人IL-6受体的体内动力学进行了评价。为了抑制抗可溶型人IL-6受体的抗体的产生，将单克隆抗小鼠CD4抗体以20mg/kg单次给予尾静脉。然后，将填充有92.8μg/mL可溶型人IL-6受体的注入泵植入小鼠背部皮下。在注入泵植入的3天后，将抗人IL-6受体抗体以1mg/kg单次给予尾静脉。在抗人IL-6受体抗体给予后经过15分钟、7小时、1天、2天、4天、7天、14天(或15天)、21天(或22天)后自该小鼠采血。将采集的血液立即在4℃、15,000rpm下进行15分钟离心，由此得到血浆。分离的血浆直到实施测定为止保存在设定为-20℃以下的冰箱中。

血浆中的可溶型人IL-6受体浓度利用实施例(2-1-2)的方法进行了测定。其结果示于图13。

意想不到的是，在给予了导入有增强mIgG1(天然型小鼠IgG1)对小鼠FcγRIIb和小鼠FcγRIII的结合活性的改变的mF44和mF46的小鼠中，与给予了mIgG1的小鼠比较，均确认到血浆中IL-6受体浓度的显著降低。特别是，即使在给予mF44后的第21天，mF44给予组的血浆中IL-6受体浓度，与抗体非给予组的血浆中IL-6受体浓度相比降低约6倍，与mIgG1给予组比较降低约10倍。另一方面，在给予mF46后的第7天，mF46给予组的血浆中IL-6受体浓度，与抗体非给予组的血浆中IL-6受体浓度相比显著地降低约30倍，与mIgG1给予组比较显著地降低约50倍。

由以上内容显示，与具有人IgG1抗体的Fc区的抗原结合分子对小鼠FcγR的结合活性得以增强的抗体同样，在给予了具有小鼠IgG1抗体的Fc区的抗原结合分子对小鼠FcγR的结合活性得以增强的抗体的小鼠中，血浆中可溶型IL-6受体的消除加速。不受特定理论的束缚，在此看到的现象也可以如下所述进行说明。

将pH依赖性地与可溶型抗原结合、且FcγR结合活性得以增强的抗体给予小鼠时，该抗体主要被主动地摄入到在细胞膜上表达FcγR的细胞中。所摄入的抗体在内体内的酸性pH条件下将可溶型抗原解离后，经由FcRn被再循环到血浆中。因此，作为这类抗体带来的使血浆中的可溶型抗原消除的效果的要素之一，可举出该抗体的FcγR结合活性的强度。即，认为：FcγR结合活性越强，则越被主动地摄入FcγR表达细胞中，使血浆中的可溶型抗原迅速消除。此外，认为：这类效果，无论抗体中所含的Fc区的来源是人IgG1还是小鼠IgG1，只要FcγR结合活性增强，则可以同样地进行验证。也就是说，可以是人IgG1、人IgG2、人IgG3、人IgG4、小鼠IgG1、小鼠IgG2a、小鼠IgG2b、小鼠IgG3、大鼠IgG、猴IgG、兔IgG等任意动物种的Fc区，只要所给予的动物种的FcγR结合活性增强，则可使用任一个进行验证。

[实施例6]增强了FcγRIIb选择性结合的抗体的抗原消除效果

(6-1)对FcγRIIb的结合活性选择性地增强的抗体的抗原消除效果

FcγRIII缺失小鼠(B6.129P2-FcgrFcγR3tm1Sjv/J小鼠,JacksonLaboratories)是表达小鼠FcγRI、小鼠FcγRIIb、小鼠FcγRIV、不表达小鼠FcγRIII的小鼠。另一方面，Fc受体γ链缺失小鼠(Fcer1g小鼠,Taconic,Cell(1994)76,519-529)是仅表达小鼠FcγRIIb、不表达小鼠FcγRI、小鼠FcγRIII、小鼠FcγRIV的小鼠。

实施例5中，显示出：对于天然型小鼠IgG1使FcγR结合活性增强了的mF44和mF46对于小鼠FcγRIIb和小鼠FcγRIII的选择性结合得以增强。认为：利用该选择性地增强的抗体的结合活性，通过将mF44和mF46给予不表达小鼠FcγRIII的小鼠FcγRIII缺失小鼠或Fc受体γ链缺失小鼠，可以模拟给予对小鼠FcγRIIb的结合选择性地增强的抗体的状况。

(6-2)使用FcγRIII缺失小鼠验证给予了对小鼠FcγRIIb的结合选择性地增强的抗体的机体中的抗原消除效果

给予了作为抗人IL-6受体抗体的Fv4-mIgG1、Fv4-mIgG1-mF44或Fv4-mIgG1-mF46的FcγRIII缺失小鼠的血浆中可溶型IL-6受体的消除效果，与实施例5的方法同样进行了验证。该小鼠血浆中的可溶型人IL-6受体浓度利用实施例(2-1-2)的方法进行了测定。其结果示于图14。

意想不到的是，给予了模拟mIgG1(天然型小鼠IgG1)对小鼠FcγRIIb的结合活性选择性地增强的状况的mF44和mF46的FcγRIII缺失小鼠的血浆中IL-6受体浓度，与给予了mIgG1的小鼠的血浆中IL-6受体浓度比较，均确认到显著地降低。特别是，与mIgG1给予组比较，mF44给予组的血浆中IL-6受体浓度降低约3倍左右，由于给予抗体而引起的抗原浓度的蓄积得到抑制。另一方面，mF46给予组的血浆中IL-6受体浓度在给予后的第3天显著地降低，与抗体非给予组的血浆中IL-6受体浓度相比降低约6倍，与mIgG1给予组的血浆中IL-6受体浓度比较时降低约25倍。该结果显示出：pH依赖性地与抗原结合的抗人IL-6受体抗体对小鼠FcγRIIb的结合活性越高，则给予该抗体时，可使小鼠的血浆中IL-6受体浓度更加降低。

(6-3)使用Fc受体γ链缺失小鼠验证给予了对小鼠FcγRIIb的结合选择性地增强的抗体的机体的血浆中的抗原消除效果

给予了作为抗人IL-6受体抗体的Fv4-mIgG1、Fv4-mIgG1-mF44或Fv4-mIgG1mF46的Fc受体γ链缺失小鼠的血浆中可溶型IL-6受体的消除效果，与实施例5的方法同样进行了验证。该小鼠血浆中的可溶型人IL-6受体浓度利用实施例(2-1-2)的方法进行了测定。其结果示于图15。

与对FcγRIII缺失小鼠给予了mF44和mF46的情形同样，给予了模拟对于mIgG1(天然型小鼠IgG1)仅对小鼠FcγRIIb的结合活性选择性地增强的状况的mF44和mF46的Fc受体γ链缺失小鼠的血浆中IL-6受体浓度，与给予了mIgG1的Fc受体γ链缺失小鼠的血浆中IL-6受体浓度比较，均确认到显著地降低。特别是，mF44给予组的血浆中IL-6受体浓度，与mIgG1给予组的血浆中IL-6受体浓度比较，降低约3倍左右，由于给予抗体而引起的抗原浓度的蓄积得到抑制。另一方面，mF46给予组的血浆中IL-6受体浓度在给予后的第3天显著地降低，与抗体非给予组的血浆中IL-6受体浓度相比降低约5倍，与mIgG1给予组的血浆中IL-6受体浓度比较时降低约15倍。

实施例(6-2)和(6-3)的结果显示出：给予了pH依赖性地与可溶型抗原结合、对小鼠FcγRIIb的结合活性选择性地增强的抗体的组的血浆中的可溶型抗原浓度可大幅度降低。

[实施例7]对FcγRIII的结合选择性地增强的抗体的抗原消除效果

(7-1)给予了对FcγRIII的结合活性选择性地增强的抗体的机体的血浆中的抗原消除效果

FcγRIIb缺失小鼠(FcgrFcγR2b(FcγRII)小鼠,Taconic)(Nature(1996)379(6563),346-349)是表达小鼠FcγRI、小鼠FcγRIII、小鼠FcγRIV但不表达小鼠FcγRIIb的小鼠。实施例5中，显示出：使天然型小鼠IgG1的FcγR结合活性增强的mF44和mF46，对于小鼠FcγRIIb和小鼠FcγRIII的选择性结合得以增强。认为：利用该选择性地增强的抗体的结合活性，通过将mF44和mF46给予不表达小鼠FcγRIIb的小鼠FcγRIIb缺失小鼠，可模拟给予对小鼠FcγRIII的结合选择性地增强的抗体的状况。

实施例6中，显示出：模拟给予了对小鼠FcγRIIb的结合活性选择性地增强的抗体的状况的FcγRIII缺失小鼠的血浆中的可溶型抗原浓度降低。另一方面，模拟给予了对小鼠FcγRIII的结合活性选择性增强的抗体的状况的FcγRIIb缺失小鼠的血浆中的可溶型抗原浓度是否降低，通过以下的试验进行了确认。

(7-2)使用FcγRIIb缺失小鼠验证小鼠FcγRIII选择性结合增强所致的抗原消除效果

对FcγRIIb缺失小鼠给予了作为抗人IL-6受体抗体的Fv4-mIgG1、Fv4-mIgG1-mF44或Fv4-mIgG1mF46的FcγRIIb缺失小鼠的血浆中可溶型IL-6受体的消除效果，与实施例5的方法同样进行了验证。血浆中的可溶型人IL-6受体浓度，利用实施例(2-1-2)的方法进行了测定。其结果示于图16。

意想不到的是，在模拟mIgG1(天然型小鼠IgG1)对小鼠FcγRIII的结合活性选择性增强的mF44和mF46的给予组中，血浆中IL-6受体浓度虽然有降低但没有确认到实施例6所示程度的降低。

不受特定理论的束缚，根据实施例5、6和7的结果还可如下进行研究。确认到：给予了mIgG1(天然型小鼠IgG1)对小鼠FcγRIIb和小鼠FcγRIII的结合活性选择性地增强的mF44和mF46的表达小鼠FcγRIIb和小鼠FcγRIII二者的正常小鼠的血浆中可溶型IL-6受体的消除显著地加速。此外，确认到：即使是将mF44和mF46给予表达小鼠FcγRIIb但不表达小鼠FcγRIII的小鼠(FcγRIII缺失小鼠和Fc受体γ链缺失小鼠)的情形该小鼠的血浆中可溶型IL-6受体的消除也显著地加速。另一方面，将mF44和mF46给予表达小鼠FcγRIII但不表达小鼠FcγRIIb的小鼠(FcγRII缺失小鼠)的情形，该小鼠的血浆中可溶型IL-6受体的消除未加速到对FcγRIII缺失小鼠和Fc受体γ链缺失小鼠给予时的程度。

综上所述，认为：mIgG1(天然型小鼠IgG1)对小鼠FcγRIIb和小鼠FcγRIII的结合活性选择性地增强的抗体mF44和mF46，主要经由小鼠FcγRIIb被摄入到表达FcγR的细胞中，由此与该抗体结合的血浆中的可溶型抗原得以消除。另一方面，认为：FcγRIII介导的抗体抗原复合体向FcγR表达细胞中的摄入，对血浆中的可溶型抗原的消除贡献不大。

此外，如实施例4所示，特别是给予了对小鼠FcγRIIb和小鼠FcγRIII的结合活性得以提高的Fv4-IgG1-F1087的小鼠的血浆中可溶型IL-6受体浓度显著地降低，另一方面，特别是给予了对小鼠FcγRI和小鼠FcγRIV的结合活性得以提高的Fv4-IgG1-F1182的小鼠的血浆中可溶型IL-6受体的消除效果，与Fv4-IgG1-F1087的情形比较，较小。

进而，实施例2中，给予了因具有低岩藻糖型糖链而使对小鼠FcγRIV的结合活性大幅度增强的(Science(2005)310(5753)1510-1512)Fv4-IgG1-Fuc的小鼠的血浆中可溶型IL-6受体浓度，与给予了Fv4-IgG1的小鼠的血浆中可溶型IL-6受体浓度比较，尽管有所降低，但其降低的效果为2倍左右，较小。因此，认为：小鼠FcγRIV介导的抗体向FcγR表达细胞中的摄入，对血浆中的可溶型抗原的消除贡献不大。

根据如上所述发现了：在小鼠中，抗体向FcγR表达细胞中的摄入，在多个小鼠FcγR中，小鼠FcγRIIb和小鼠FcγIII、特别是小鼠FcγRIIb发挥主要作用。因此，不进行特别限定，作为导入到小鼠FcγR结合结构域的突变，可优选对小鼠FcγRIIb和小鼠FcγIII的结合增强、特别是对小鼠FcγRIIb的结合增强的突变。

通过本研究，显示出：在小鼠中，为了通过给予pH依赖性地与可溶型抗原结合、FcγR结合活性得到增强的抗原结合分子而使所给予的机体的血浆中的可溶型抗原消除加速，更优选所给予的抗体对小鼠FcγRIIb和小鼠FcγIII的结合活性、特别是对FcγRIIb的结合活性增强。也就是说，明确了：使pH依赖性地与可溶型抗原结合、对小鼠FcγRIIb和小鼠FcγIII的结合活性、特别是对FcγRIIb的结合活性增强的抗原结合分子，在给予机体内时，血浆中的可溶型抗原的消除加速，可有效地降低血浆中的可溶型抗原浓度，显示极其有效的作用。

[实施例8]含有加入有增强FcγRIIb结合的现有改变的Fc区的抗体的血小板聚集能力的评价

(8-1)含有加入有增强FcγRIIb结合的现有改变的Fc区的抗体的制作

如实施例7所述，通过将对FcγRIIb的选择性结合活性得到增强的抗体给予机体，可使抗原从该机体的血浆中有效地消除。此外认为，从就给予抗体的机体而言的安全性、副作用的角度考虑，也优选给予含有对FcγRIIb的结合活性选择性地增强的Fc区的抗体。

但是，mF44或mF46对小鼠FcγRIIb和小鼠FcγRIII二者的结合增强、对小鼠FcγRIIb的选择性结合不增强。认为：其原因在于，由于小鼠FcγRIIb和小鼠FcγRIII的同源性高，因此难以发现识别二者且增强对小鼠FcγRIIb的选择性结合的改变。此外，迄今为止未报道：对小鼠FcγRIIb的选择性结合得到增强的Fc区。同样，已知人FcγRIIb和人FcγRIIa(131Arg和131His的两同种异型)的同源性也高。此外，迄今为止也未报道：含有识别二者且对人FcγRIIb的选择性结合得到增强的改变的Fc区(Seung等(Mol.Immunol.(2008)45,3926-3933)；Greenwood等(Eur.J.Immunol.(1993)23(5),1098-1104))。此外，迄今为止报道了：对FcγRIIa的结合对于抗体对血小板的凝集活性发挥重要的作用(Meyer等(J.Thromb.Haemost.(2009),7(1),171-181)、Robles-Carrillo等(J.Immunol.(2010),185(3),1577-1583))。根据这些报道，给予了对FcγRIIa的结合得到增强的抗体的机体，有提高血栓病发病风险的可能性。因此，抗体对FcγRIIa的结合得到增强的抗体是否增强血小板聚集活性，如以下所述进行了验证。

(8-2)含有加入有增强FcγRIIb结合的现有改变的Fc区的抗体对人 FcγR的结合活性的评价

含有加入有增强人FcγRIIb结合的现有改变的Fc区的抗体对人FcγRIa、FcγRIIa的R型和H型、FcγRIIb、FcγRIIIa的亲和性，如下所述进行分析。制作了含有WO2009/125825中公开的抗人IL-6受体的抗体的可变区即IL6R-H(SEQ ID NO:132)作为抗体H链可变区、含有具有除去了人IgG1的C末端的Gly和Lys的G1d的IL6R-G1d(SEQ ID NO:133)作为抗体H链恒定区的H链。接着，制作了IL6R-G1d的Fc区通过Seung等(Mol.Immunol.(2008)45,3926-3933)中记载的改变即以EU编号267位表示的Ser取代成Glu、以EU编号328位表示的Leu取代成Phe而改变的IL6R-G1d-v3(SEQ IDNO:138)。作为抗体L链，共同使用抗人IL6受体的抗体的L链即IL6R-L(SEQ ID NO:135)，与各H链一起，按照参考实施例1的方法进行表达，纯化所表达的抗体。含有IL6R-G1d、IL6R-G1d-v3作为重链的抗体，以下分别称为IgG1、IgG1-v3。

接着，使用BiacoreT100(GE Healthcare)动力学分析了这些抗体与FcγR的相互作用。使用HBS-EP+(GE Healthcare)作为运行缓冲液，该相互作用在25℃的温度下进行测定。使用在S系列传感器芯片CM5(GE Healthcare)上通过胺偶联法固定化有蛋白A的芯片。使捕获在该芯片上的目标抗体与用运行缓冲液稀释的各FcγR相互作用，测定各FcγR与抗体的结合。测定后，通过使10mM甘氨酸-HCl、pH1.5与芯片反应，对芯片上捕获的抗体进行洗涤，由此经再生的芯片可以重复使用。使用Biacore Evaluation Software，通过用1:1朗缪耳结合模型分析作为测定结果而得到的传感图，根据由此算出的结合速率常数ka(L/mol/s)、解离速率常数kd(1/s)的值，计算出解离常数KD(mol/L)。IgG1、IgG1-v3对各FcγR的KD值示于表12(各抗体对各FcγR的KD值)，此外IgG1对各FcγR的KD值除以IgG1-v3对各FcγR的KD值而得的IgG1-v3的相对性KD值示于表13。

[表12]

[表13]

	FcγRIa	FcγRIIaR	FcγRIIaH	FcγRIIb	FcγRIIIa
						KD值比	1.8	522	0.51	408	0.35

(8-3)血小板聚集能力的评价

接着，使用FcγRIIa的H型、R型的来自供体的血小板验证了：含有IgG1的Fc区中的以EU编号表示的267位的Ser取代成Glu、328位的Leu取代成Phe的Fc区的抗体对FcγRIIa的亲和性的强弱是否改变血小板聚集能力。使用参考实施例2的方法，制作了含有含与IgE结合的hIgG1抗体(人IgG1恒定区)的重链可变区和G1d重链恒定区的重链奥马珠单抗_VH-G1d(SEQ ID NO:136)、作为轻链的奥马珠单抗_VL-CK(SEQ ID NO:137)的抗体。此外，制作了奥马珠单抗_VH-G1d的以EU编号表示的267位的Ser取代成Glu、328位的Leu取代成Phe的奥马珠单抗_VH-G1d-v3(SEQ ID NO:138)。使用参考实施例2的方法，制作了含有奥马珠单抗_VH-G1d-v3作为重链、含有奥马珠单抗_VL-CK作为轻链的奥马珠单抗-G1d-v3。对该抗体的血小板聚集能力进行了评价。

血小板聚集使用血小板聚集能力测定装置HEMA TRACER712(LMSCo.)进行测定。首先，将在含有0.5mL的3.8％枸橼酸钠的4.5mL真空采血管中按相同的一定份量采集到的约50mL全血以200g离心15分钟，所回收的上清用作富血小板血浆(PRP)。使用缓冲液A(137mM NaCl、2.7mM KCl、12mM NaHCO₃、0.42mM NaH₂PO₄、2mM MgCl₂、5mM HEPES、5.55mM葡萄糖、1.5U/mL腺苷三磷酸双磷酸酶、0.35％BSA)洗涤PRP，进而置换为缓冲液B(137mM NaCl、2.7mM KCl、12mM NaHCO₃、0.42mM NaH₂PO₄、2mM MgCl₂、5mM HEPES、5.55mM葡萄糖、2mM CaCl₂、0.35％BSA)。其结果，制备了约300,000/μL的密度的洗涤血小板。将156μL洗涤血小板分注在设置于血小板聚集能力测定装置上的带有搅拌棒的测定用比色皿(cuvette)中。在该装置内维持于37.0℃的比色皿内，将血小板通过搅拌棒以1000rpm进行搅拌。向其中加入制备成最终浓度分别为600μg/mL和686μg/mL的摩尔比1:1的奥马珠单抗-G1d-v3与IgE的免疫复合体44μL，使血小板与该免疫复合体反应5分钟。进而，向反应液中加入不引起二次凝集的浓度的二磷酸腺苷(ADP、SIGMA)，确认是否可增强凝集。

该测定中得到的FcγRIIa的基因多态性(R/H或H/H)的各供体的血小板聚集的结果分别示于图17和18。根据图17的结果，向具有FcγRIIa多态性(R/H)的供体的血小板中添加免疫复合体时，观察到血小板聚集。另一方面，如图18所示，向具有FcγRIIa多态性(H/H)的供体的血小板中添加免疫复合体时，未观察到血小板聚集。

接着，使用活化标记物来评价血小板的活化。血小板的活化可通过CD62p(p-选择素)或活性型整联蛋白这样的活化标记物在血小板膜表面的表达增加来测定。向通过上述方法制备的7.7μL洗涤血小板的洗涤血小板中添加2.3μL免疫复合体，在室温下反应5分钟后，进而添加最终浓度为30μM的ADP引起活化，确认通过免疫复合体是否可增强ADP所致的活化。阴性对照使用添加磷酸缓冲液(pH7.4)(Gibco)的样品代替免疫复合体。通过向反应后的各样品中加入PE标记抗CD62抗体(BECTON DICKINSON)、PerCP标记抗CD61抗体、FITC标记PAC-1抗体(BD bioscience)进行染色。各染色的荧光强度使用流式细胞仪(FACS CantoII、BD bioscience)进行测定。

该分析法中得到的CD62p表达的结果示于图19，活化整联蛋白表达的结果示于图20。作为洗涤血小板，使用了从FcγRIIa多态性为R/H的一名健康人得到的洗涤血小板。通过ADP刺激而诱导的在血小板膜表面表达的CD62p和活性型整联蛋白的表达量，在免疫复合体存在下均增加。

根据这些结果，明确了：含有加入有IgG1的Fc区的以EU编号表示的267位的Ser取代成Glu、328位的Leu取代成Phe的增强人FcγRIIb结合的现有改变的Fc区的抗体，与表达FcγRIIa的基因多态性中131位的氨基酸为H的FcγRIIa的血小板相比，促进表达131位的氨基酸为R的FcγRIIa的血小板的聚集。即，暗示了：将现有的含有加入有增强人FcγRIIb结合的现有改变的Fc区的抗体给予至少一方的等位基因上具有FcγRIIa R型的人时，由于血小板聚集而引起的血栓病发病的风险有提高的危险性。含有更增强对FcγRIIb的选择性结合的本发明的Fc区的抗原结合分子，不仅可改善抗原的血浆中滞留性，还显示出可以克服上述的问题，因此本发明的抗原结合分子的有效性是明确的。

(8-4)含有对FcγRIIb的结合选择性地增强的Fc的抗体(BP230)和含有现有的对FcγRIIb的结合选择性地增强的Fc的抗体的血小板聚集能力的比较

(8-4-1)对FcγRIIb的结合选择性地增强的抗体的制作

如实施例(8-3)所述，显示出：对FcγRIIa的结合得到增强的抗体，其血小板聚集能力和血小板活化能力得到增强，给予人时，有提高血栓病发病风险的可能性。另一方面，若考虑血小板上表达的FcγR仅为FcγRIIa，则认为对FcγRIIb的结合选择性地增强的抗体，其血小板聚集能力和活化能力不增强，即使给予人，也没有提高血栓病发病的风险。为了确认这一点，实际验证了对FcγRIIb的结合选择性地增强的抗体的血小板聚集能力、血小板活化能力。

具体而言，使用参考实施例2的方法，制作了作为与IgE结合的hIgG1抗体(人IgG1恒定区)的重链的奥马珠单抗_VH-G1d(SEQ ID NO:136)、作为轻链的奥马珠单抗_VL-CK(SEQ ID NO:137)。接着，对于奥马珠单抗_VH-G1d，为了选择性增强对人FcγRIIb的结合活性，制作了以EU编号表示的233位的Glu取代成Asp、237位的Gly取代成Asp、238位的Pro取代成Asp、268位的His取代成Asp、271位的Pro取代成Gly、296位的Tyr取代成Asp、330位的Ala取代成Arg、439位的Lys取代成Glu的奥马珠单抗_VH-BP230(SEQ ID NO:140)。同样，为了增强奥马珠单抗_VH-G1d对人FcγRIIb和FcγRIIa R的结合活性，制作了以EU编号表示的267位的Ser取代成Glu、328位的Leu取代成Phe的奥马珠单抗_VH-G1d-v3(SEQ IDNO:138)。

使用参考实施例2的方法，制作了含有奥马珠单抗_VH-BP230(SEQ IDNO:140)作为重链、含有奥马珠单抗_VL-CK(SEQ ID NO:137)作为轻链的奥马珠单抗-BP230，并制作了含有奥马珠单抗_VH-G1d-v3(SEQ ID NO:138)作为重链、含有奥马珠单抗_VL-CK(SEQ ID NO:137)作为轻链的奥马珠单抗-G1d-v3。对这些抗体的血小板聚集能力和血小板活化能力进行了评价。

(8-4-2)奥马珠单抗-BP230和奥马珠单抗-G1d-v3对人FcγR的结合活性的评价

对作为现有抗体的奥马珠单抗对人FcγRIIb的结合得到增强的奥马珠单抗-G1d-v3的Fc区和各人FcγR的亲和性分析的结果如实施例(8-2)所示。对于奥马珠单抗-BP230的Fc区和各人FcγR的亲和性也同样进行了分析，其结果示于表22。

(8-4-3)血小板聚集能力的评价

接着，实施例(8-4-1)中制作的奥马珠单抗-BP230和奥马珠单抗-G1d-v3的结合通过使用来自FcγRIIa的基因多态性为R/H型的供体的血小板进行测定，根据该测定结果，验证了对FcγRIIa的亲和性的强弱是否改变血小板聚集能力。

血小板聚集使用血小板聚集能力测定装置HEMA TRACER712(LMSCo.)进行测定。首先，将向含有0.5mL的3.8％枸橼酸钠的4.5mL真空采血管中按相同的一定份量采集到的约50mL全血以200g离心15分钟，所回收的上清用作富血小板血浆(PRP)。使用缓冲液A(137mM NaCl、2.7mM KCl、12mM NaHCO₃、0.42mM NaH₂PO₄、2mM MgCl₂、5mM HEPES、5.55mM葡萄糖、1.5U/mL腺苷三磷酸双磷酸酶、0.35％BSA)洗涤PRP，进而置换为缓冲液B(137mM NaCl、2.7mM KCl、12mM NaHCO₃、0.42mM NaH₂PO₄、2mM MgCl₂、5mM HEPES、5.55mM葡萄糖、2mM CaCl₂、0.35％BSA)。其结果，制备了每1μL约300,000/μL的密度的洗涤血小板。将150.2μL洗涤血小板分注在设置于血小板聚集能力测定装置上的带有搅拌棒的测定用比色皿中。在该装置内维持于37.0℃的比色皿内，将血小板通过搅拌棒以1000rpm进行搅拌。向其中加入制备成最终浓度分别为600μg/mL的24.3μL的奥马珠单抗-G1d-v3或奥马珠单抗-BP230，反应1分钟后，加入制备成与抗体的摩尔比为1:1的IgE25.4μL，使混合液反应5分钟。进而，向反应液中加入不引起二次凝集的浓度的二磷酸腺苷(ADP、SIGMA)，确认是否可增强凝集。作为洗涤血小板，使用了从FcγRIIa的多态性为R/H的一名健康人得到的洗涤血小板。

上述测定法中得到的结果示于图21。根据图21所示的结果，在加入含有奥马珠单抗-G1d-v3的免疫复合体时，观察到强的血小板聚集，而另一方面，在加入含有奥马珠单抗-BP230的免疫复合体时，与加入PBS时比较，未观察到有血小板聚集的差异。

接着，测定了基于奥马珠单抗-G1d-v3和奥马珠单抗-BP230的血小板的活化。血小板的活化可通过CD62p(p-选择素)或活性型整联蛋白这样的活化标记物在血小板膜表面的表达增加来测定。向通过上述方法制备的7.51μL洗涤血小板中添加制备成最终浓度为600μg/mL的1.22μL的奥马珠单抗-G1d-v3或奥马珠单抗-BP230，在室温下反应5分钟。然后，加入制备成与抗体的摩尔比为1:1的IgE1.27μL，进而在室温下反应5分钟后，确认是否可诱导血小板的活化。阴性对照使用添加磷酸缓冲液(pH7.4、Gibco)的样品代替免疫复合体。反应后的各样品使用PE标记抗CD62抗体(BECTON DICKINSON)、PerCP标记抗CD61抗体、FITC标记PAC-1抗体(BD bioscience)进行荧光染色，所得的各荧光强度使用流式细胞仪(FACSCantoII、BDbioscience)进行测定。作为洗涤血小板，使用了从FcγRIIa的多态性为R/H的一名健康人得到的洗涤血小板。

上述分析法中得到的结果示于图22和图23。血小板膜表面的CD62p和活性型整联蛋白的表达，通过添加含有奥马珠单抗-G1d-v3的免疫复合体均增加。另一方面，添加了奥马珠单抗-BP230的免疫复合体的血小板膜表面的这些分子的表达，与添加了磷酸缓冲液的血小板膜表面的表达为同等程度。

根据这些结果，明确了：含有IgG1的Fc区的以EU编号表示的267位的Ser取代成Glu、328位的Leu取代成Phe的现有的改变Fc区、对人FcγRIIb的结合增强、对人FcγRIIa R的结合也增强的抗体，与含有以EU编号表示的233位的Glu取代成Asp、237位的Gly取代成Asp、238位的Pro取代成Asp、268位的His取代成Asp、271位的Pro取代成Gly、296位的Tyr取代成Asp、330位的Ala取代成Arg、439位的Lys取代成Glu的Fc区、对人FcγRIIb的结合选择性地增强的抗体相比，促进FcγRIIa的基因多态性中至少一方的等位基因的131位的氨基酸为Arg的血小板的凝集和活化。即，暗示了下述问题点：含有现有的增强了人FcγRIIb结合的Fc区改变体的抗体，在具有FcγRIIa R的等位基因的人中，可能会提高由于血小板聚集而引起的血栓病发病的风险，且明确了：对FcγRIIb的结合选择性地增强的Fc区改变体可以克服上述的问题点。

[实施例9]除了P238D改变之外还导入了铰链部分的改变的改变体对FcγRIIb的结合的综合性分析

相对于对于人天然型IgG1以EU编号表示的238位的Pro取代成Asp而成的Fc，即使组合根据天然型抗体的分析预测为进一步提高FcγRIIb结合的其它改变，也得不到期待的组合效果。因此，对于以EU编号表示的238位的Pro取代成Asp的改变Fc导入综合性改变，由此尝试发现进一步增强FcγRIIb结合的改变体。制作了导入有作为抗体H链使用的IL6R-G1d(SEQ ID NO:133)的以EU编号表示的252位的Met取代成Tyr的改变、以EU编号表示的434位的Asn取代成Tyr的改变的IL6R-F11(SEQ IDNO:141)。进而，制作了对于IL6R-F11导入有以EU编号表示的238位的Pro取代成Asp的改变的IL6R-F652(SEQ ID NO:142)。分别制备了含有对于L6R-F652以EU编号表示的238位的残基附近的区(以EU编号表示的234位至237位、239位)分别取代成除了原本的氨基酸和半胱氨酸之外的18种氨基酸而成的抗体H链序列的表达质粒。作为抗体L链使用了IL6R-L(SEQ ID NO:135)。利用与参考实施例2同样的方法，表达、纯化这些改变体。这些Fc突变体被称为PD变体。利用与参考实施例25同样的方法，综合地评价了各PD变体对FcγRIIa R型和FcγRIIb的相互作用。

按照以下的方法，制作了表示与各FcγR的相互作用分析结果的图。将各PD变体对各FcγR的结合量的值除以作为对照的改变导入前的抗体(以EU编号表示的238位的Pro取代成Asp的改变即IL6R-F652/IL6R-L)对各FcγR的结合量的值，进而乘以100倍，将所得的值作为各PD变体对各FcγR的相对结合活性的值来表示。横轴表示各PD变体对FcγRIIb的相对结合活性的值，纵轴表示各PD变体对FcγRIIa R型的相对结合活性的值(图24)。

其结果发现，11种改变体对FcγRIIb的结合与导入该各改变前的抗体比较增强，具有维持或增强对FcγRIIa R型的结合的效果。将汇总这11种改变体对FcγRIIb和FcγRIIa R的结合活性的结果示于表14。应予说明，表中的序列编号表示评价的改变体的H链的序列编号，此外，改变表示对IL6R-F11(SEQ ID NO:141)导入的改变。

[表14]

对于导入有P238D的改变体将前述11种改变进一步组合并导入而成的改变体对FcγRIIb的相对结合活性的值、以及对不含P238D的Fc导入该改变而成的改变体对FcγRIIb的相对结合活性的值示于图25。这11种的改变，若进一步导入P238D改变体中，则与导入前相比，对FcγRIIb的结合量增强。另一方面，将除了G237F、G237W和S239D之外的8种改变导入不含P238D的改变体时，显示了降低FcγRIIb结合的效果(数据未显示)。

根据该结果明确了：基于对于天然型IgG1导入的改变的效果，难以预测对于含有P238D改变的改变体组合并导入相同改变时的效果。换言之，本次发现的8种改变是若不进行对于含有P238D改变的改变体组合并导入相同改变的本研究则不可能发现的改变。

表14所示的改变体对FcγRIa、FcγRIIaR、FcγRIIaH、FcγRIIb、FcγRIIIaV的KD值，通过与参考实施例25同样的方法进行测定，所得测定结果示于表15。应予说明，表中的改变表示对于IL6R-F11(SEQ ID NO:141)导入的改变。其中，对于作为制作IL6R-F11时的模板的IL6R-G1d/IL6R-L，以*来表示。此外，表中的KD(IIaR)/KD(IIb)和KD(IIaH)/KD(IIb)分别表示各改变体对FcγRIIaR的KD值除以各改变体对FcγRIIb的KD值而得的值，各改变体对FcγRIIaH的KD值除以各改变体对FcγRIIb的KD值而得的值。亲本多肽的KD(IIb)/改变体的KD(IIb)是指亲本多肽对FcγRIIb的KD值除以各改变体对FcγRIIb的KD值而得的值。

除此之外，各改变体对FcγRIIaR和FcγRIIaH的结合活性中较强一方的KD值/亲本多肽对FcγRIIaR和FcγRIIaH的结合活性中较强一方的KD值示于表15。这里，亲本多肽是指具有IL6R-F11(SEQ ID NO:141)作为H链的改变体。应予说明，由于判断FcγR对IgG的结合微弱，不可能在动力学分析中进行正确分析，因而表15中用灰色涂覆的单元格是利用参考实施例25中记载的式2算出的值：

[式2]

KD＝C·R_max/(R_eq-RI)-C。

如表15所示，任意的改变体与IL6R-F11比较，FcγRIIb亲和性均提高，该提高的幅度为1.9倍至5.0倍。各改变体对FcγRIIaR的KD值/各改变体对FcγRIIb的KD值之比、和各改变体对FcγRIIaH的KD值/各改变体对FcγRIIb的KD值之比表示相对于FcγRIIaR和FcγRIIaH的结合活性的相对FcγRIIb结合活性。即，该值是表示各改变体对FcγRIIb的结合选择性的大小的值，该值越大则对FcγRIIb的结合选择性越高。作为亲本多肽的IL6R-F11/IL6R-L对FcγRIIaR的KD值/对FcγRIIb的KD值之比、和对FcγRIIaH的KD值/对FcγRIIb的KD值之比均为0.7，因而表15中任一改变体与亲本多肽相比，对FcγRIIb的结合选择性均提高。改变体对FcγRIIaR和FcγRIIaH的结合活性中较强的一方的KD值/亲本多肽对FcγRIIaR和FcγRIIaH的结合活性中较强的一方的KD值若为1以上，则表示该改变体对FcγRIIaR和FcγRIIaH的结合活性中较强的一方的结合等同于或低于亲本多肽对FcγRIIaR和FcγRIIaH的结合活性中较强的一方的结合。本次所得的改变体中，该值为0.7至5.0，因而可以说本次所得的改变体对FcγRIIaR和FcγRIIaH的结合活性中较强的一方的结合与亲本多肽对FcγRIIaR和FcγRIIaH的结合活性中较强的一方的结合相比，是大致等同的或较其降低。根据这些结果明确了：对本次所得的改变体来说，与亲本多肽相比，维持或降低了对FcγRIIa R型和H型的结合活性，同时增强了对FcγRIIb的结合活性，对FcγRIIb的选择性提高。此外，与IL6R-F11比较，任意改变体对FcγRIa和FcγRIIIaV的亲和性均降低。

[表15]

[实施例10]含有P238D的Fc与FcγRIIb胞外区的复合体的X射线晶体结构分析

如上述实施例9所示，即使对于含有P238D的Fc导入根据天然型IgG1抗体的分析预测为提高FcγRIIb结合活性或提高FcγRIIb选择性的改变，FcγRIIb结合活性也被发现减弱，其原因认为是Fc和FcγRIIb的相互作用界面的结构由于导入P238D而发生变化的缘故。因此，为了探寻该现象的原因，通过X射线晶体结构分析来阐明具有P238D突变的IgG1的Fc(以下，称为Fc(P238D))和FcγRIIb胞外区的复合体的立体结构，通过对天然型IgG1的Fc(以下，称为Fc(WT))和FcγRIIb胞外区的复合体的立体结构进行对比，比较它们的结合模式。应予说明，关于Fc和FcγR胞外区的复合体的立体结构已有多个报道，已经分析了Fc(WT)/FcγRIIIb胞外区复合体(Nature,2000,400,267-273；J.Biol.Chem.2011,276,16469-16477)、Fc(WT)/FcγRIIIa胞外区复合体(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2011,108,12669-126674)和Fc(WT)/FcγRIIa胞外区复合体(J.Imunol.2011,187,3208-3217)的立体结构。迄今为止，Fc(WT)/FcγRIIb胞外区复合体的立体结构尚未被分析，对于与Fc(WT)的复合体的立体结构已知的FcγRIIa和FcγRIIb来说，在胞外区中，氨基酸序列的93％一致，具有非常高的同源性，因而通过基于Fc(WT)/FcγRIIa胞外区复合体的晶体结构的建模来推测Fc(WT)/FcγRIIb胞外区复合体的立体结构。

对于Fc(P238D)/FcγRIIb胞外区复合体，通过X射线晶体结构分析以分辨率来确定立体结构。该分析结果的结构示于图26。FcγRIIb胞外区以夹在2个Fc CH2结构域之间的方式结合，这与迄今为止分析的Fc(WT)和FcγRIIIa、FcγRIIIb、FcγRIIa的各胞外区的复合体的立体结构类似。接着为了详细比较，相比对FcγRIIb胞外区以及Fc CH2结构域A，通过基于Cα原子间距的最小二乘法使Fc(P238D)/FcγRIIb胞外区复合体的晶体结构和Fc(WT)/FcγRIIb胞外区复合体的模型结构叠合(图27)。此时，可知Fc CH2结构域B彼此的重叠程度并不良好，在该部分存在立体结构差异。进而，使用Fc(P238D)/FcγRIIb胞外区复合体的晶体结构以及Fc(WT)/FcγRIIb胞外区复合体的模型结构，通过对提取的在FcγRIIb胞外区和Fc CH2结构域B之间其距离为以下的原子对进行比较，以对FcγRIIb和Fc(WT)CH2结构域B之间的原子间相互作用与FcγRIIb和Fc(P238D)CH2结构域B之间的原子间相互作用进行比较。如表16所示，Fc(P238D)和Fc(WT)中，FcCH2结构域B和FcγRIIb之间的原子间相互作用不一致。

[表16]

进而，以Fc CH2结构域A以及Fc CH2结构域B各自单独通过基于Cα原子间距的最小二乘法，将Fc(P238D)/FcγRIIb胞外区复合体的X射线晶体结构与Fc(WT)/FcγRIIb胞外区复合体的模型结构叠合，由此对P238D附近的详细结构进行比较。可知，作为Fc(P238D)突变导入位置的以EU编号表示的238位的氨基酸残基的位置与Fc(WT)不同，与之相伴，铰链区之后的238位的氨基酸残基附近的环结构在Fc(P238D)和Fc(WT)中也发生变化(图28)。原本在Fc(WT)中以EU编号表示的238位的Pro位于Fc的内侧，与238位附近的残基形成疏水性核心。但以EU编号表示的238位的Pro改变为带有电荷的非常亲水性的Asp时，改变的Asp残基直接存在于疏水性核心中在去溶剂化方面是能量上不利的。因此，认为在Fc(P238D)中，为了消除该能量上的不利，以EU编号表示的238位的氨基酸残基会改变为向溶剂侧取向的形式，从而带来238位的氨基酸残基附近的环结构的变化。进而，该环与通过S-S键交联的铰链区在距离上并不远，因而该结构变化并不限于局部变化，还会影响Fc CH2结构域A与结构域B的相对配置，其结果推测会对FcγRIIb和Fc CH2结构域B之间的原子间相互作用带来变化。因此认为，即使向已具有P238D改变的Fc中组合在天然型IgG中提高FcγRIIb选择性、结合活性的改变，也得不到预测的效果。

此外，P238D的导入导致的结构变化的结果是，在Fc CH2结构域A中，在与导入有突变的P238D邻接的以EU编号表示的237位的Gly的主链和FcγRIIb的160位的Tyr之间观察到了氢键(图29)。相当于该Tyr160的残基在FcγRIIa中为Phe，在与FcγRIIa结合时，不会形成该氢键。若同时考虑到160位的氨基酸是在与Fc的相互作用界面处的FcγRIIa与FcγRIIb之间的少数不同之一，则推测FcγRIIb所特有的该氢键的有无将导致Fc(P238D)对FcγRIIb的结合活性的提高、对FcγRIIa的结合活性的降低，并成为选择性提高的原因。此外，对于Fc CH2结构域B，在以EU编号表示的270位的Asp和FcγRIIb的131位的Arg之间观察到静电相互作用(图30)。作为FcγRIIa的同种异型之一的FcγRIIa H型中，与FcγRIIb的131位的Arg对应的残基是His，该静电相互作用无法形成。由此可以说明，与FcγRIIa R型比较，FcγRIIa H型中Fc(P238D)结合活性降低的原因。根据上述基于X射线晶体结构分析结果的考察明确了：P238D的导入导致的其附近的环结构的变化和与之相伴的结构域配置的相对变化使得形成在天然型IgG和FcγR的结合中观察不到的新的相互作用，有可能与P238D改变体的FcγRIIb选择结合概况相关。

[Fc(P238D)的表达纯化]

含有P238D改变的Fc的制备如下所述进行。首先，将hIL6R-IgG1-v1(SEQ ID NO:143)的以EU编号表示的220位的Cys取代成Ser，将以EU编号表示的236位的Glu至其C末端用PCR进行克隆，将所得基因序列Fc(P238D)通过与参考实施例1和2中记载的方法相同的方法来进行表达载体的制作、表达、纯化。应予说明，以EU编号表示的220位的Cys在通常的IgG1中会与L链的Cys形成二硫键，但是在仅制备Fc时不会共表达L链，因而为了避免形成不需要的二硫键，将该Cys残基取代成Ser。

[FcγRIIb胞外区的表达纯化]

FcγRIIb胞外区按照参考实施例25的方法进行制备。

[Fc(P238D)/FcγRIIb胞外区复合体的纯化]

向为了在结晶中使用而获得的FcγRIIb胞外区样品2mg中，加入作为与谷胱甘肽S-转移酶的融合蛋白的通过大肠杆菌表达纯化得到的EndoF1(Protein Science1996,5,2617-2622)0.29mg，在0.1M Bis-Tris pH6.5的缓冲条件下，在室温下静置3天，由此将与FcγRIIb胞外区的Asn直接结合的N-乙酰葡糖胺以外的N型糖链切断。接着，将由5000MWCO的超滤膜浓缩的实施了糖链切断处理的FcγRIIb胞外区样品，通过用20mM HEPS pH7.5,0.05M NaCl进行了平衡的凝胶过滤柱层析(Superdex20010/300)进行纯化。进而，在所得的糖链切断FcγRIIb胞外区流分中混合以摩尔比计FcγRIIb胞外区稍微过量的Fc(P238D)。将由10000MWCO的超滤膜浓缩的前述混合液使用以20mM HEPS pH7.5、0.05M NaCl进行了平衡的凝胶过滤柱层析(Superdex20010/300)进行纯化，由此得到Fc(P238D)/FcγRIIb胞外区复合体的样品。

[Fc(P238D)/FcγRIIb胞外区复合体的结晶]

使用由10000MWCO的超滤膜浓缩至约10mg/ml的前述Fc(P238D)/FcγRIIb胞外区复合体的试样，通过坐滴蒸汽扩散法(sitting dropvapor diffusion method)将该复合体结晶。结晶使用Hydra II Plus One(MATRIX)，相对于100mM Bis-Tris pH6.5、17％PEG3350、0.2M乙酸铵、和2.7％(w/v)D-半乳糖的贮液，将贮液：结晶样品以0.2μl：0.2μl进行混合，制作晶滴。经密封的该晶滴在20℃静置，由此得到薄板状的结晶。

[由Fc(P238D)/FcγRIIb胞外区复合体结晶测定X射线衍射数据]

将所得的Fc(P238D)/FcγRIIb胞外区复合体的一个单晶浸渍于100mMBis-Tris pH6.5、20％PEG3350、乙酸铵、2.7％(w/v)D-半乳糖、乙二醇22.5％(v/v)的溶液后，将使用带有微小尼龙环的针除去溶液的单晶在液氮中冷冻。通过高能加速器研究机构的放射光线设施Photon FactoryBL-1A来测定该结晶的X射线衍射数据。应予说明，测定中通过不时置于-178℃的氮气流中来维持冷冻状态，通过光束线上设置的CCD探测器Quantum270(ADSC)，将结晶以每次0.8°进行旋转的同时，收集总计225幅的X射线衍射图像。基于所得衍射图像的晶格常数的确定、衍射斑索引编辑(diffraction spot indexing)、以及衍射数据的处理中，使用程序Xia2(CCP4Software Suite)、XDS Package(Walfgang Kabsch)以及Scala(CCP4SoftwareSuite)，最终得到直至分辨率的该结晶的衍射强度数据。本结晶属于空间群P21，晶格常数α＝90°、β＝100.70°、γ＝90°。

[Fc(P238D)/FcγRIIb胞外区复合体的X射线晶体结构分析]

Fc(P238D)/FcγRIIb胞外区复合体的晶体结构确定通过使用程序Phaser(CCP4Software Suite)的分子置换法来进行。根据所得晶格的大小和Fc(P238D)/FcγRIIb胞外区复合体的分子量，预测非对称单元中的复合体的数目为一个。从Fc(WT)/FcγRIIIa胞外区复合体的晶体结构即PDB码:3SGJ的结构坐标中，将A链239-340位以及B链239-340位的氨基酸残基部分作为不同的坐标取出，分别设定为Fc CH2结构域的考察用模型。同样地从PDB码:3SGJ的结构坐标中，将A链341-444位和B链341-443位的氨基酸残基部分作为一个坐标取出，设定为FcCH3结构域的考察用模型。最后，从FcγRIIb胞外区的晶体结构即PDB码:2FCB的结构坐标中，将A链6-178位的氨基酸残基部分取出，设定为FcγRIIb胞外区的考察用模型。依照FcCH3结构域、FcγRIIb胞外区、Fc CH2结构域的顺序，由旋转函数和平移函数确定各考察用模型的晶格内的取向和位置，由此得到Fc(P238D)/FcγRIIb胞外区复合体晶体结构的初始模型。相对于所得的初始模型，进行使2个Fc CH2结构域、2个Fc CH3结构域以及FcγRIIb胞外区运动的刚体精修，此时，相对于的衍射强度数据，结晶学可信度因子R值为40.4％、自由R值为41.9％。进而，使用程序Refmac5(CCP4SoftwareSuite)的结构精修、和参照以基于实验性确定的结构因子Fo和由模型计算得到的结构因子Fc以及由模型计算得到的相位进行计算得到的2Fo-Fc、Fo-Fc为系数的电子密度图的模型修正，通过程序Coot(Paul Emsley)来进行。通过重复上述操作来进行模型的精修。最后，基于以2Fo-Fc、Fo-Fc为系数的电子密度图，将水分子整合至模型，通过进行精修，最终使用分辨率的24291个衍射强度数据，相对于含有4846个非氢原子的模型，结晶学可信度因子R值为23.7％、自由R值为27.6％。

[制作Fc(WT)/FcγRIIb胞外区复合体的模型结构]

以Fc(WT)/FcγRIIa胞外区复合体的晶体结构，即PDB码:3RY6的结构坐标为基础，使用程序Disovery Studio3.1(Accelrys)的Build Mutants功能，以与FcγRIIb的氨基酸序列一致的方式，向结构坐标中的FcγRIIa导入突变。此时，将优化水平(Optimization Level)设为高(High)，将切割半径(Cut Radius)设为4.5，使之产生5个模型，采用其中能量评分最好的模型，设定为Fc(WT)/FcγRIIb胞外区复合体的模型结构。

[实施例11]基于晶体结构确定了改变位置的Fc改变体的FcγR结合的分析

基于实施例10中所得的Fc(P238D)和FcγRIIb胞外区的复合体的X射线晶体结构分析结果，向以EU编号表示的238位的Pro取代成Asp的改变Fc中被预测会影响与FcγRIIb的相互作用的位点(以EU编号表示的233位、240位、241位、263位、265位、266位、267位、268位、271位、273位、295位、296位、298位、300位、323位、325位、326位、327位、328位、330位、332位、334位的残基)导入综合性改变来构建改变体，由此研究是否可以得到除了P238D改变之外进一步增强FcγRIIb结合的改变的组合。

制作了对于IL6R-G1d(SEQ ID NO:134)将以EU编号表示的439位的Lys取代成Glu的IL6R-B3(SEQ ID NO:144)。接着，制作了IL6R-B3的、以EU编号表示的238位的Pro取代成Asp的IL6R-BF648。作为抗体L链，共同使用IL6R-L(SEQ ID NO:135)。按照与参考实施例2同样的方法，对所表达的这些抗体的改变体进行了纯化。通过参考实施例25的方法，综合性评价了这些抗体改变体对各FcγR(FcγRIa、FcγRIIa H型、FcγRIIa R型、FcγRIIb、FcγRIIIa V型)的结合。

按照以下的方法，制作了表示与各FcγR的相互作用分析结果的图。将各改变体对各FcγR的结合量的值除以作为对照的改变导入前的抗体(以EU编号表示的238位的Pro取代成Asp的改变即IL6R-BF648/IL6R-L)对各FcγR的结合量的值，进而乘以100倍，将所得的值作为各改变体对各FcγR的相对结合活性的值来表示。横轴表示各改变体对FcγRIIb的相对结合活性的值，纵轴表示各改变体对FcγRIIa R型的相对结合活性的值(图31)。

其结果如图31所示，发现了在全部改变中有24种改变体与导入改变前的抗体比较维持或增强了FcγRIIb结合。这些改变体对各FcγR的结合示于表17。应予说明，表中的改变表示对于IL6R-B3(SEQ ID NO:144)导入的改变。其中，对于作为制作IL6R-B3时的模板的IL6R-G1d/IL6R-L，以*来表示。

[表17]

表17示出的改变体对FcγRIa、FcγRIIaR、FcγRIIaH、FcγRIIb、FcγRIIIaV型的KD值通过参考实施例25的方法测定，结果汇总于表18。表中的改变表示对于IL6R-B3(SEQ ID NO:144)导入的改变。其中，对于作为制作IL6R-B3时的模板的IL6R-G1d/IL6R-L，以*来表示。此外，表中的KD(IIaR)/KD(IIb)和KD(IIaH)/KD(IIb)分别表示各改变体对FcγRIIaR的KD值除以各改变体对FcγRIIb的KD值而得的值、各改变体对FcγRIIaH的KD值除以各改变体对FcγRIIb的KD值而得的值。亲本多肽的KD(IIb)/改变多肽的KD(IIb)是指亲本多肽对FcγRIIb的KD值除以各改变体对FcγRIIb的KD值而得的值。除此之外，各改变体对FcγRIIaR和FcγRIIaH的结合活性中较强一方的KD值/亲本多肽对FcγRIIaR和FcγRIIaH的结合活性中较强一方的KD值示于表18。这里，亲本多肽是指具有IL6R-B3(SEQ ID NO:144)作为H链的改变体。应予说明，由于判断FcγR对IgG的结合微弱，不可能在动力学分析中进行正确分析，因而表18中用灰色涂覆的单元格是利用参考实施例25中记载的式2算出的值：

[式2]

KD＝C·R_max/(R_eq-RI)-C。

[表18]

根据表18，任一的改变体与IL6R-B3比较，对FcγRIIb亲和性均提高，该提高的幅度为2.1倍至9.7倍。各改变体对FcγRIIaR的KD值/各改变体对FcγRIIb的KD值之比、和各改变体对FcγRIIaH的KD值/各改变体对FcγRIIb的KD值之比表示相对于FcγRIIaR和FcγRIIaH结合活性的相对FcγRIIb结合活性。即，该值是表示各改变体对FcγRIIb的结合选择性的大小的值，该值越大则对FcγRIIb的结合选择性越高。亲本多肽IL6R-B3/IL6R-L对FcγRIIaR的KD值/对FcγRIIb的KD值之比、和对FcγRIIaH的KD值/对FcγRIIb的KD值之比分别为0.3、0.2，因而表18中任一的改变体与亲本多肽相比，对FcγRIIb的结合选择性均提高。改变体对FcγRIIaR和FcγRIIaH的结合活性中较强的一方的KD值/亲本多肽对FcγRIIaR和FcγRIIaH的结合活性中较强的一方的KD值若为1以上，则表示该改变体对FcγRIIaR和FcγRIIaH的结合活性中较强的一方的结合等同于或低于亲本多肽对FcγRIIaR和FcγRIIaH的结合活性中较强的一方的结合。本次所得的改变体中，该值为4.6至34.0，因而可以说本次所得的改变体对FcγRIIaR和FcγRIIaH的结合活性中较强的一方的结合与亲本多肽对FcγRIIaR和FcγRIIaH的结合活性中较强的一方的结合相比是降低的。根据上述结果明确了：对本次所得的改变体来说，与亲本多肽相比，维持或降低了对FcγRIIa R型和H型的结合活性，同时增强了对FcγRIIb的结合活性，提高了对FcγRIIb的选择性。此外，与IL6R-B3相比，任一的改变体对FcγRIa和FcγRIIIaV的亲和性均降低。

对于所得组合改变体之中有希望的改变体，由晶体结构考察引起其效果的因素。图32示出了Fc(P238D)/FcγRIIb胞外区复合体的晶体结构。其中，将位于左侧的H链作为Fc链A、将位于右侧的H链作为Fc链B。这里，可知Fc链A中的以EU编号表示的233位的位点位于FcγRIIb的113位Lys的附近。但是在本晶体结构中，E233的侧链处于运动性极高的状态，其电子密度无法良好地观察。因此，将以EU编号表示的233位的Glu取代成Asp的改变由于将侧链缩短1个碳程度而使侧链的自由度变小，其结果，与FcγRIIb的113位的Lys的相互作用形成时的熵损失降低，结果推测有助于结合自由能的提高。

图33中相同地示出了Fc(P238D)/FcγRIIb胞外区复合体的结构中以EU编号表示的330位的位点附近的环境。由该图可知，Fc(P238D)的Fc链A的以EU编号表示的330位的位点附近是由FcγRIIb的85位的Ser、86位的Glu、163位的Lys等构成的亲水性环境。因此，将以EU编号表示的330位的Ala取代成Lys或取代成Arg的改变推测有助于与FcγRIIb的85位的Ser或86位的Glu的相互作用强化。

图34中示出了使Fc(P238D)/FcγRIIb胞外区复合体和Fc(WT)/FcγRIIIa胞外区复合体的晶体结构，相对于Fc链B而通过基于Cα原子间距的最小二乘法进行叠合时以EU编号表示的271位Pro的结构。这两个结构虽然极为一致，但在以EU编号表示的271位的Pro的位点却是不同的立体结构。此外，在Fc(P238D)/FcγRIIb胞外区复合体晶体结构中，结合考虑其周边的电子密度弱时，则在Fc(P238D)/FcγRIIb中，通过使以EU编号表示的271位为Pro，对结构上造成大负荷，由此暗示了该环结构可能不能呈现最佳结构。因此推测：将以EU编号表示的271位的Pro取代成Gly的改变通过对该环结构赋予柔软性、并减轻获得最适于与FcγRIIb相互作用的结构时的能量阻碍，由此有助于结合增强。

[实施例12]通过与P238D组合而增强FcγRIIb结合的改变的组合效果的验证

在实施例9和11中所得的改变中，验证了观察到增强FcγRIIb结合的效果或维持FcγRIIb结合、抑制其它FcγR结合的效果的改变彼此组合所引起的效果。

与实施例11的方法相同地，将选自表14和18中的特别优异的改变导入抗体H链IL6R-BF648。作为抗体L链，共同使用了IL6R-L，按照与参考实施例1同样的方法，对表达的抗体进行了纯化。通过与参考实施例25同样的方法，综合性地评价了对各FcγR(FcγRIa、FcγRIIa H型、FcγRIIa R型、FcγRIIb、FcγRIIIa V型)的结合。

按照以下的方法，对于与各FcγR的相互作用分析结果，计算出相对结合活性。将各改变体对各FcγR的结合量的值除以作为对照的改变导入前的抗体(以EU编号表示的238位的Pro取代成Asp的IL6R-BF648/IL6R-L)对各FcγR的结合量的值，进而乘以100倍，将所得的值作为各改变体对各FcγR的相对结合活性的值来表示(表19)。应予说明，表中的改变表示对于IL6R-B3(SEQ ID NO:144)导入的改变。其中，对于作为制作IL6R-B3时的模板的IL6R-G1d/IL6R-L，以*来表示。

[表19-1]

表19-2是表19-1的续表：

[表19-2]

表19示出的改变体对FcγRIa、FcγRIIaR、FcγRIIaH、FcγRIIb、FcγRIIIaV型的KD值通过参考实施例25的方法测定，结果汇总于表20-1和20-2。表中的改变表示对于IL6R-B3(SEQID NO:144)导入的改变。其中，对于作为制作IL6R-B3时的模板的IL6R-G1d/IL6R-L，以*来表示。此外，表中的KD(IIaR)/KD(IIb)和KD(IIaH)/KD(IIb)分别表示各改变体对FcγRIIaR的KD值除以各改变体对FcγRIIb的KD值而得的值、各改变体对FcγRIIaH的KD值除以各改变体对FcγRIIb的KD值而得的值。亲本多肽的KD(IIb)/改变多肽的KD(IIb)是指亲本多肽对FcγRIIb的KD值除以各改变体对FcγRIIb的KD值而得的值。除此之外，各改变体对FcγRIIaR和FcγRIIaH的结合活性中较强一方的KD值/亲本多肽对FcγRIIaR和FcγRIIaH的结合活性中较强一方的KD值示于表20-1和20-2。这里，亲本多肽是指具有IL6R-B3(SEQID NO:144)作为H链的改变体。应予说明，由于判断FcγR对IgG的结合微弱，不可能在动力学分析中进行正确分析，因而表20-1和20-2中用灰色涂覆的单元格是利用参考实施例25中记载的式2算出的值：

[式2]

KD＝C·R_max/(R_eq-RI)-C。

根据表20-1和20-2，任一的改变体与IL6R-B3比较，对FcγRIIb的亲和性均提高，该提高的幅度为3.0倍至99.0倍。各改变体对FcγRIIaR的KD值/各改变体对FcγRIIb的KD值之比、和各改变体对FcγRIIaH的KD值/各改变体对FcγRIIb的KD值之比表示相对于FcγRIIaR和FcγRIIaH结合活性的相对FcγRIIb结合活性。即，该值是表示各改变体对FcγRIIb的结合选择性的大小的值，该值越大则对FcγRIIb的结合选择性越高。作为亲本多肽的IL6R-B3/IL6R-L对FcγRIIaR的KD值/对FcγRIIb的KD值之比、和对FcγRIIaH的KD值/对FcγRIIb的KD值之比分别为0.3、0.2，因而表20-1和20-2中任一的改变体与亲本多肽相比，对FcγRIIb的结合选择性均提高。改变体对FcγRIIaR和FcγRIIaH的结合活性中较强的一方的KD值/亲本多肽对FcγRIIaR和FcγRIIaH的结合活性中较强的一方的KD值若为1以上，则表示该改变体对FcγRIIaR和FcγRIIaH的结合活性中较强的一方的结合等同于或低于亲本多肽对FcγRIIaR和FcγRIIaH的结合活性中较强的一方的结合。本次所得的改变体中，该值为0.7至29.9，因而可以说本次所得的改变体对FcγRIIaR和FcγRIIaH的结合活性中较强的一方的结合与亲本多肽对FcγRIIaR和FcγRIIaH的结合活性中较强的一方的结合相比，是大致等同的或较其降低。根据这些结果明确了：对本次所得的改变体来说，与亲本多肽相比，维持或降低了对FcγRIIa R型和H型的结合活性，同时增强了对FcγRIIb的结合活性，提高了对FcγRIIb的选择性。此外，与IL6R-B3相比，任一的改变体对FcγRIa和FcγRIIIaV的亲和性均降低。

[表20-1]

表20-2是表20-1的续表：

[表20-2]

[实施例13]制作与FcγRIIb的结合得到增强的改变体

如实施例8所示，在增强与FcγRIIb的结合时，优选在尽可能地抑制对其它活性型FcγR的结合的基础上，增强与FcγRIIb的结合。因此，制作了将具有增强与FcγRIIb的结合或提高选择性的效果的改变相互组合，进而使与FcγRIIb的结合得到增强或选择性得到提高的改变体。具体而言，以在增强与FcγRIIb的结合、提高选择性方面显示优异效果的P238D的改变为基础，进一步相互组合在实施例9、实施例11、实施例12中通过与P238D的改变组合而观察到效果的改变。

制作了向IL6R-G1d(SEQ ID NO:133)、IL6R-B3(SEQ ID NO:144)的Fc区组合在实施例9、实施例11、实施例12中与P238D的改变组合观察到效果的改变即E233D、L234Y、G237D、S267Q、H268D、P271G、Y296D、K326D、K326A、A330R、A330K而得的改变体。作为抗体L链使用IL6R-L(SEQID NO:135)，按照参考实施例1和2的方法，对在重链上含有这些改变体的抗体进行了表达、纯化。利用参考实施例25的方法评价了各改变体对各FcγR(FcγRIa、FcγRIIaH、FcγRIIaR、FcγRIIb、FcγRIIIaV)的结合。

各改变体对各FcγR的KD示于表21。应予说明，改变表示对于IL6R-B3(SEQ ID NO:144)导入的改变。其中，作为制作各改变体时的模板的IL6R-B3/IL6R-L，以*来表示。表中的“KD(IIaR)/KD(IIb)”表示各改变体对FcγRIIaR的KD除以各改变体对FcγRIIb的KD而得的值，该值越大则表示对FcγRIIb的选择性越高。“亲本多肽的KD(IIb)/改变多肽的KD(IIb)”是指IL6R-B3/IL6R-L对FcγRIIb的KD值除以各改变体对FcγRIIb的KD值而得的值。此外，“亲本多肽的KD(IIaR)/改变多肽的KD(IIaR)”是指IL6R-B3/IL6R-L对FcγR IIaR的KD值除以各改变体对FcγR IIaR的KD值而得的值。应予说明，由于判断FcγR对IgG的结合微弱，不可能在动力学分析中进行正确分析，因而表21中用灰色涂覆的单元格是利用参考实施例25中记载的式2算出的值：

[式2]

KD＝C·R_max/(R_eq-RI)-C。

[表21]

当以向含有人天然型IgG1的序列的IL6R-G1d/IL6R-L的H链导入有K439E的改变的IL6R-B3/IL6R-L对各FcγR的结合为1时，IL6R-G1d/IL6R-L与FcγRIa的结合为1.3倍、与FcγRIIaR的结合为1.1倍、与FcγRIIaH的结合为1.1倍、与FcγRIIb的结合为1.2倍、与FcγRIIIaV的结合为0.9倍，IL6R-G1d/IL6R-L和IL6R-B3/IL6R-L对所有这些FcγR的结合为同等。因此，认为各改变体与各FcγR的结合比较该改变导入前的IL6R-B3/IL6R-L与各FcγR的结合、和各改变体与各FcγR的结合比较含有人天然型IgG1的序列的IL6R-G1d/IL6R-L与各FcγR的结合为同等。因此，在以下的实施例中，将各改变体与各FcγR的结合活性和该改变导入前的IL6R-B3/IL6R-L与各FcγR的结合活性进行了比较。根据表21可知，与改变导入前的IL6R-B3比较，各改变体与FcγRIIb的结合活性均提高，最低的IL6R-BF648/IL6R-L的结合活性提高了2.6倍、最高的IL6R-BP230/IL6R-L的结合活性提高了147.6倍。此外，显示选择性的KD(IIaR)/KD(IIb)的数值，最低的IL6R-BP234/IL6R-L为10.0、最高的IL6R-BP231/IL6R-L为32.2，各改变体的该数值与改变导入前的IL6R-B3/IL6R-L的0.3比较均提高了选择性。应予说明，各改变体与FcγRIa、FcγRIIaH、FcγRIIIaV的结合活性相比改变导入前的IL6R-B3/IL6R-L与FcγRIa、FcγRIIaH、FcγRIIIaV的结合活性均降低。

[实施例14]增强了FcγRIIb结合的Fc区与FcγRIIb胞外区的复合体和与FcγRIIaR胞外区的复合体的X射线晶体结构分析

实施例13中，与FcγRIIb的结合最增强的改变体IL6R-BP230/IL6R-L与FcγRIIb的结合，与改变导入前的IL6R-B3/IL6R-L比较，增强至约150倍，与FcγRIIaR的结合也被控制在1.9倍左右的增强。因此，IL6R-BP230/IL6R-L是与FcγRIIb的结合、选择性同时优异的改变体，但摸索了制作尽可能抑制与FcγRIIaR的结合的基础上进一步增强与FcγRIIb的结合的更优选的改变体的可能性。

如实施例10的图30所示，在含有P238D的改变的Fc区中，CH2结构域B的以EU编号270位表示的Asp与FcγRIIb的131位的Arg之间形成牢固的静电相互作用，但该131位的氨基酸残基在FcγRIIIa和FcγRIIaH中为His，相对于此在FcγRIIaR中与FcγRIIb相同为Arg。其结果，在FcγRIIaR与FcγRIIb之间，131位的氨基酸残基与CH2结构域B的以EU编号270位表示的Asp的相互作用不产生差异。认为这是成为Fc区与FcγRIIb的结合和与FcγRIIaR的结合的选择性难以发生的原因。

另一方面，FcγRIIa和FcγRIIb胞外区的氨基酸序列，其93％为相同，具有非常高的同源性。根据天然型IgG1的Fc区(以下Fc(WT))和FcγRIIaR的胞外区复合体的晶体结构(J.Imunol.(2011)187,3208-3217)的分析，在二者的相互作用的界面附近，FcγRIIaR与FcγRIIb之间仅发现3个氨基酸(Gln127、Leu132、Phe160)的不同，预想在Fc区与FcγRIIb的结合和与FcγRIIaR的结合的选择性的改善方面，相当困难。

因此，为了谋求进一步增强Fc区对FcγRIIb的结合活性、以及提高Fc区对FcγRIIb的结合和与FcγRIIaR的结合的选择性，不仅分析了对FcγRIIb的结合得到增强的Fc区与FcγRIIb胞外区的复合体的立体结构，还结合分析了增强FcγRIIb结合的Fc区与FcγRIIaR胞外区的复合体的立体结构，认为明确该Fc区与FcγRIIb的相互作用和该Fc区与FcγRIIaR的相互作用的微妙差异是重要的。因此，分析了从作为最初在IL6R-BP230/IL6R-L的制作中成为基础的改变体的实施例12中制作的IL6R-BP208/IL6R-L的Fc区中除去了K439E的改变的Fc(P208)与FcγRIIb胞外区或与FcγRIIaR胞外区的复合体的X射线晶体结构。

(14-1)Fc(P208)与FcγRIIb胞外区的复合体的X射线晶体结构分析

[Fc(P208)的表达纯化]

Fc(P208)如下所述进行制备。首先，制作了将IL6R-BP208的以EU编号表示的439位的Glu取代成作为天然型人IgG1的序列的Lys的IL6R-P208。接着，以编码以EU编号表示的220位的Cys取代成Ser的改变体的DNA为模板，克隆从以EU编号表示的216位的Glu至其C末端通过PCR进行克隆而得的基因序列Fc(P208)。按照参考实施例1和2所述的方法，进行表达载体的制作、表达、纯化。应予说明，通常的IgG1的以EU编号表示的220位的Cys与存在于L链上的Cys形成二硫键，但在仅制备Fc区时不会共表达L链，因而为了避免形成不需要的二硫键，将该220位的Cys取代成Ser。

[FcγRIIb胞外区的表达纯化]

FcγRIIb胞外区按照参考实施例25的方法进行制备。

[Fc(P208)FcγRIIb胞外区复合体的纯化]

向用于结晶而获得的FcγRIIb胞外区样品1.5mg中，加入作为与谷胱甘肽S-转移酶的融合蛋白的在大肠杆菌内表达的Endo F1(Protein Science(1996),5,2617-2622)的纯化产物0.15mg，将其在0.1M Bis-Tris pH6.5的缓冲液中，在室温下静置3天，由此将该FcγRIIb胞外区样品中的Asn直接连接的N-乙酰葡糖胺以外的N型糖链切断。接着，将由5000MWCO的超滤膜浓缩的实施了上述的糖链切断处理的FcγRIIb胞外区样品，通过用20mMHEPS pH7.5,0.1M NaCl进行了平衡的凝胶过滤柱层析(Superdex20010/300)进行纯化。进而，在上述的糖链切断FcγRIIb胞外区的纯化流分中加入以摩尔比计FcγRIIb胞外区稍微过量的Fc(P208D)，将其经由10000MWCO的超滤膜浓缩，然后，通过以25mM HEPS pH7.5、0.1M NaCl进行了平衡的凝胶过滤柱层析(Superdex20010/300)进行纯化。将如上所述而得到的纯化流分作为Fc(P208D)/FcγRIIb胞外区复合体的样品用于以后的研究。

[Fc(P208)/FcγRIIb复合体胞外区复合体的结晶]

由10000MWCO的超滤膜浓缩至约10mg/ml的Fc(P208)/FcγRIIb胞外区复合体的样品，通过悬滴蒸汽扩散法结合使用引晶(Seeding)法进行结晶。结晶中使用VDXm板(Hampton Research)，相对于0.1M Bis-Tris pH6.5、19％(w/v)PEG3350、0.2M磷酸氢二钾的贮液，以贮液：结晶样品＝0.85μl：0.85μl进行混合，制作晶滴，向其中添加由使用Seed Bead(Hampton Research)将在同样条件下得到的相同复合体的结晶破碎而得的晶种溶液制作的稀释溶液0.15μl，密封贮液的入孔，在20℃下进行静置，由此得到板状的结晶。

[由Fc(P208)/FcγRIIb胞外区复合体结晶测定X射线衍射数据]

将如上所述而得到的Fc(P208)/FcγRIIb胞外区复合体的一个单晶浸渍于0.1MBis-TrispH6.5、24％(w/v)PEG3350、0.2M磷酸氢二钾、20％(v/v)乙二醇的溶液中后，使用带有微小尼龙环的针除去溶液，在液氮中冷冻得到该单晶，来自该单晶的X射线衍射数据通过Spring-8的BL32XU测定。应予说明，测定中通过不时置于-178℃的氮气流中来维持冷冻状态，通过光束线上设置的CCD探测器MX-225HE(RAYONIX)，将该单晶以每次0.6°进行旋转的同时，收集了总计300幅的该单晶的X射线衍射图像。基于所得衍射图像的晶格常数的确定、衍射斑索引编辑以及衍射数据的处理中使用程序Xia2(J.Appl.Cryst.(2010)43,186-190)、XDS Package(Acta Cryst.(2010)D66,125-132)以及Scala(Acta Cryst.(2006)D62,72-82)，最终得到了直至分辨率的该单晶的衍射强度数据。本结晶属于空间群C2221，晶格常数α＝90°、β＝90°、γ＝90°。

[Fc(P208)/FcγRIIb胞外区复合体的X射线晶体结构分析]

Fc(P208)/FcγRIIb胞外区复合体的结构通过使用程序Phaser(J.Appl.Cryst.(2007)40,658-674)的分子置换法进行确定。根据所得晶格的大小和Fc(P208)/FcγRIIb胞外区复合体的分子量，预测非对称单元中的复合体的数目为一个。从Fc(WT)/FcγRIIIa胞外区复合体的晶体结构即PDB码:3SGJ的结构坐标中，将A链239-340位以及B链239-340位的氨基酸残基部分作为不同的坐标取出，用作Fc区的CH2结构域的考察用模型。同样地从PDB码:3SGJ的结构坐标中，将A链341-444位和B链341-443位的氨基酸残基部分作为一个坐标取出，用作Fc区的CH3结构域的考察用模型。最后，从FcγRIIb胞外区的晶体结构即PDB码:2FCB的结构坐标中，将A链6-178位的氨基酸残基部分取出，用作Fc(P208)的考察用模型。将Fc区的CH3结构域、FcγRIIb胞外区、Fc区的CH2结构域的各考察用模型在晶格内的取向和位置由旋转函数和平移函数确定时，CH2结构域的一个位置没有顺利地得到确定。因此，参照Fc(WT)/FcγRIIIa胞外区复合体的晶体结构，根据基于由剩下的3个部分计算得到的相位进行计算而得到的电子密度图，确定了最后的CH2结构域A的位置，得到了Fc(P208)/FcγRIIb胞外区复合体晶体结构的初始模型。相对于所得的初始模型，进行使2个Fc区的CH2结构域、2个Fc区的CH3结构域以及FcγRIIb胞外区运动的刚体精修时，在刚体精修进行的时间点，使用的衍射强度数据的结构模型的结晶学可信度因子R值为42.6％、自由R值为43.7％。进而，使用程序REFMAC5(Acta Cryst.(2011)D67,355-367)的结构精修、和参照以基于实验性确定的结构因子Fo和由结构模型计算得到的结构因子Fc区以及由结构模型计算得到的相位进行计算得到的2Fo-Fc、Fo-Fc为系数的电子密度图，通过重复使用程序Coot(Acta Cryst.(2010)D66,486-501)修正结构模型的操作来进行结构模型的精修。进而，基于以2Fo-Fc、Fo-Fc为系数的电子密度图，将水分子整合至结构模型，通过进行精修，最终使用分辨率的27259个衍射强度数据，相对于含有4786个非氢原子的结构模型，结晶学可信度因子R值为24.5％、自由R值为28.2％。

结构分析的结果，Fc(P208)/FcγRIIb胞外区复合体的立体结构以分辨率确定。该分析的结果、获得的结构示于图35。FcγRIIb胞外区以夹在2个Fc区的CH2结构域之间的方式结合，这与迄今为止分析的天然型IgG的Fc即Fc(WT)与FcγRIIIa(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2011)108,12669-126674)、FcγRIIIb(Nature(2000)400,267-273、J.Biol.Chem.(2011)276,16469-16477)和FcγRIIa(J.Immunol.(2011)187(6),3208-3217)的各胞外区的复合体的立体结构类似。

观察细节，在Fc(P208)/FcγRIIb胞外区的复合体中，由于导入G237D以及P238D的改变的影响，与Fc(WT)/FcγRIIaR胞外区的复合体比较，从Fc区的CH2结构域A的铰链区开始持续的以EU编号表示的233位至239位的环结构发生了变化(图36)。该结果确认到：Fc(P208)的以EU编号表示的237位的Asp主链与FcγRIIb的160位的Tyr侧链之间形成牢固的氢键(图37)。该160位的氨基酸残基在FcγRIIaH和FcγRIIaR中均为Phe，由于不可能形成氢键，因此还认为：本氢键对于获得提高Fc(P208)对FcγRIIb的结合活性以及降低对FcγRIIa的结合活性这样的Fc(P208)与FcγRIIb结合和与FcγRIIa结合的选择性作出重要的贡献。

另一方面，Fc(P208)的以EU编号表示的237位的Asp的侧链自身与FcγRIIb结合之际，不特别形成显著的相互作用，也未见与Fc区内部的其它残基的相互作用。在该以EU编号表示的237位的Asp的周围，Fc区内的以EU编号表示的332位的Ile、333位的Glu、334位的Lys位于附近(图38)。如果通过将这些位点的氨基酸残基取代成亲水性残基，可使与Fc(P208)的以EU编号表示的237位的Asp侧链形成相互作用，使环结构稳定化，则还认为与减轻该Fc区和FcγRIIb的160位的Tyr的氢键形成所伴随的熵的能量损失相关，可能与结合自由能的增加、即结合活性的提高相关。

将实施例10中所示的含有P238D的改变的Fc(P238D)与FcγRIIb胞外区的复合体的X射线晶体结构和Fc(P208)与FcγRIIb胞外区的复合体的X射线晶体结构进行比较，Fc(P208)和Fc(P238D)比较，含有5个新的突变，其大多限于侧链水平的改变。其中，在Fc区的CH2结构域B中，通过将以EU编号表示的271位的Pro改变成Gly，可见在主链水平的位置改变的同时，还引起了以EU编号表示的266-270位的环的结构变化(图39)。如实施例11所示，在Fc(P238D)的以EU编号表示的270位的Asp与FcγRIIb的131位的Arg形成牢固的静电相互作用时，暗示该以EU编号表示的271位的Pro部分可能遭受立体化学的应激。本次通过改变以EU编号表示的271位的氨基酸为Gly而观察到的结构变化，认为是解除了改变前的Pro所承受的结构形变的结果，可推测该解除的份和改善与FcγRIIb的结合自由能、即提高结合活性相关联。

进而，确认到：由于该以EU编号表示的266-271位的环的结构变化，以EU编号表示的292位的Arg以2个状态发生结构改变。此时，认为由该以EU编号表示的292位的Arg与Fc(P208)中的一个改变残基即以EU编号表示的268位的Asp形成的静电相互作用(图39)可能贡献于该环结构的稳定化。由于本环中的由以EU编号表示的270位的Asp与FcγRIIb的131位的Arg形成的静电相互作用对Fc(P208)与FcγRIIb的结合活性贡献较大，因此通过该环结构使结合时的构象稳定化，使结合所伴随的熵的能量损失得以减轻，本改变可能与增加结合自由能即提高结合活性相关联。

此外，基于本结构分析结果，详查了可进一步提高活性的改变，发现了作为改变导入位点的一个候选的以EU编号表示的239位的Ser。如图40所示，该CH2结构域B的以EU编号表示的239位的Ser位于FcγRIIb的117位的Lys从结构上看以最自然的形态伸展的方向上。不过，在本次分析中，未观察到FcγRIIb的117位的Lys的电子密度，因此未获得一定的结构，认为现状是在与Fc(P208)的相互作用中该Lys117的参与是有限的。将该CH2结构域B的以EU编号表示的239位的Ser改变成具有负电荷的Asp或Glu时，与带有正电荷的FcγRIIb的117位的Lys之间可期待静电相互作用，作为其结果期待提高与FcγRIIb的结合活性。

另一方面，若观察CH2结构域A中的以EU编号表示的239位的Ser的结构，则认为本氨基酸侧链与以EU编号表示的236位的Gly的主链形成氢键，使从铰链区开始持续的、含有与FcγRIIb的160位的Tyr的侧链形成氢键的以EU编号表示的237位的Asp的233位至239位上的环结构稳定化(图37)。使该环结构稳定为结合时的构象，这减轻结合所伴随的熵的能量损失，作为结果，与增加结合自由能即提高结合活性相关联。另一方面，将该CH2结构域A中的以EU编号表示的239位的Ser改变成Asp或Glu时，失去与以EU编号表示的236位的Gly的主链间的氢键，也可能与环结构的不稳定化相关联。进而，还认为也可能导致与存在于最近位点的以EU编号表示的265位的Asp的静电排斥，进一步引起环结构的不稳定化。该不稳定化的份的能量，对减少与FcγRIIb的结合自由能发挥作用，因此作为结果也可能导致结合活性的降低。

(14-2)Fc(P208)与FcγRIIaR胞外区的复合体的X射线晶体结构分析

[FcγRIIaR胞外区的表达纯化]

FcγRIIaR胞外区按照参考实施例2的方法进行制备。

[Fc(P208)/FcγRIIaR型胞外区复合体的纯化]

向1.5mg纯化的FcγRIIaR的胞外区样品中，加入作为与S-转移酶的融合蛋白的在大肠杆菌内表达的Endo F1(Protein Science(1996),5,2617-2622)的纯化产物0.15mg、20μl的5U/ml浓度的EndoF2(QA-bio)和20μl的5U/ml浓度的Endo F3(QA-bio)，在0.1M乙酸钠(pH4.5)的缓冲液中，在室温下静置9天后，进而，追加0.07mg的上述EndoF1、7.5μl的上述EndoF2和7.5μl的上述Endo F3后，静置3天，由此将与该FcγRIIaR胞外区样品中的Asn直接连接的N-乙酰葡糖胺以外的N型糖链切断。接着，将由10000MWCO的超滤膜浓缩的实施了上述的糖链切断处理的FcγRIIaR胞外区样品，通过用25mM HEPS pH7.5、0.1M NaCl进行了平衡的凝胶过滤柱层析(Superdex20010/300)进行纯化。进而，在上述的糖链切断FcγRIIaR胞外区的纯化流分中加入以摩尔比计FcγRIIaR胞外区稍微过量的Fc(P208)，将其由10000MWCO的超滤膜浓缩后，通过以25mM HEPES pH7、0.1M NaCl进行了平衡的凝胶过滤柱层析(Superdex20010/300)进行纯化。将如上所述而得到的纯化流分作为Fc(P208)/FcγRIIaR型胞外区复合体的样品用于以后的研究。

[Fc(P208)/FcγRIIaR型胞外区复合体的结晶]

由10000MWCO的超滤膜浓缩至约10mg/ml的Fc(P208)/FcγRIIa R型胞外区复合体的样品，通过坐滴蒸汽扩散法进行结晶。相对于0.1M Bis-TrispH7.5、26％(w/v)PEG3350、0.2M硫酸铵的贮液，以贮液：结晶样品＝0.8μl：1.0μl进行混合，制作晶滴，将所得晶滴用密封件密封，在20℃下进行静置，由此得到板状的结晶。

[由Fc(P208)/FcγRIIaR胞外区复合体结晶测定X射线衍射数据]

将如上所述而得到的Fc(P208)/FcγRIIaR胞外区复合体的一个单晶浸渍于0.1MBis-TrispH7.5、27.5％(w/v)PEG3350、0.2M硫酸铵、20％(v/v)甘油的溶液中后，使用带有微小尼龙环的针除去溶液，在液氮中冷冻该单晶，来自该单晶的X射线衍射数据使用高能加速器研究机构的放射光线设施Photon Factory BL-17A进行测定。应予说明，测定中通过不时置于-178℃的氮气流中来维持冷冻状态，通过光束线上设置的CCD探测器Quantum315r(ADSC)，将该单晶以每次0.6°进行旋转的同时，收集了总计225幅的该单晶的X射线衍射图像。基于所得衍射图像的晶格常数的确定、衍射斑索引编辑以及衍射数据的处理中，使用程序Xia2(J.Appl.Cryst.(2010)43,186-190)、XDS Package(Acta Cryst.(2010)D66,125-132)以及Scala(ActaCryst.(2006)D62,72-82)，最终得到了直至分辨率的衍射强度数据。本结晶属于空间群C2221，晶格常数 α＝90°、β＝90°、γ＝90°。

[Fc(P208)/FcγRIIaR型胞外区复合体的X射线晶体结构分析]

Fc(P208)/FcγRIIaR型胞外区复合体的结构通过使用程序Phaser(J.Appl.Cryst.(2007)40,658-674)的分子置换法进行确定。根据所得晶格的大小和Fc(P208)/FcγRIIaR胞外区复合体的分子量，预测非对称单元中的复合体的数目为一个。使用实施例(14-1)中得到的Fc(P208)/FcγRIIb胞外区复合体的晶体结构作为考察用模型，由旋转函数和平移函数确定Fc(P208)/FcγRIIaR胞外区复合体在晶格内的取向和位置。进而，相对于所得的初始结构模型，进行使2个Fc区的CH2结构域、2个Fc区的CH3结构域以及FcγRIIaR胞外区独立运动的刚体精修，在刚体精修结束的时间点，使用的衍射强度数据的结构模型的结晶学可信度因子R值为38.4％、自由R值为30.0％。进而，使用程序REFMAC5(Acta Cryst.(2011)D67,355-367)的结构精修、和参照以基于实验性确定的结构因子Fo和由模型计算得到的结构因子Fc区以及由模型计算得到的相位进行计算得到的2Fo-Fc、Fo-Fc为系数的电子密度图，通过重复使用程序Coot(Acta Cryst.(2010)D66,486-501)修正该结构模型的操作来进行结构模型的精修。最后，基于以2Fo-Fc、Fo-Fc为系数的电子密度图，将水分子整合至模型，通过进行精修，最终使用分辨率的24838个衍射强度数据，相对于含有4758个非氢原子的结构模型，结晶学可信度因子R值为26.3％、自由R值为38.0％。

结构分析的结果，Fc(P208)/FcγRIIaR胞外区复合体的立体结构以分辨率确定。将Fc(P208)/FcγRIIaR型胞外区复合体的晶体结构与实施例(14-1)中所示的Fc(P208)/FcγRIIb胞外区复合体的晶体结构比较时，两Fcγ受体间反映出非常高的氨基酸同源性，根据全体结构所把握的水平上几乎未见差异(图41)。

但是，在电子密度水平详细观察结构时，发现了有可能引起Fc区与FcγRIIb的结合和与FcγRIIaR的结合的选择性的改善的差异。FcγRIIaR的160位的氨基酸残基不是Tyr而是Phe，如图42所示，含有P238D的改变的Fc区与FcγRIIb结合之际，存在的Fc区CH2结构域A的以EU编号表示的237位的氨基酸残基的主链与FcγRIIb的160位Tyr之间的氢键，认为在含有P238D的改变的Fc区与FcγRIIb的结合中不形成。该氢键的不形成，认为是导入了P238D的改变的Fc区与FcγRIIb的结合和与FcγRIIaR的结合的选择性改善的主要原因，进而，在电子密度水平进行比较观察时，在该Fc区与FcγRIIb的复合体中，以EU编号表示的235位的Leu、和以EU编号表示的234位的Leu的侧链的电子密度可明确地确认，相对于此，在该Fc区与FcγRIIaR的复合体中，这些侧链的电子密度不明确，认为以EU编号表示的237位附近的环伴随降低与其附近的FcγRIIaR的相互作用而动摇。另一方面，将该Fc区的CH2结构域B的相同区的结构进行比较(图43)，在该Fc区与FcγRIIb的复合体结构中可以确认直至以EU编号表示的237位的Asp的电子密度，相对于此，在该Fc区与FcγRIIaR的复合体中，位于以EU编号表示的237位的Asp前边的3残基、即直至以EU编号表示的234位的Leu左右可确认电子密度，和与FcγRIIb的结合进行比较，考虑使用更广的区形成相互作用。根据以上所述，暗示：在该Fc区与FcγRIIb的结合中，从以EU编号表示的234位至238位的区中的Fc区的CH2结构域A侧的贡献可能较大，在该Fc区与FcγRIIaR的结合中，从以EU编号表示的234位至238位的区中的Fc区的CH2结构域B侧的贡献可能较大。

[实施例15]基于晶体结构确定了改变位点的Fc改变体

实施例14中，在与FcγRIIb的结合得到增强的改变体(P208)的结构域B内，作为伴随导入P271G改变的周围结构变化的结果，暗示了以EU编号表示的268位的Asp与以EU编号表示的292位的Arg进行静电相互作用(图39)。认为该相互作用的形成对从以EU编号表示的266位至271位的环结构的稳定化发挥作用，作为结果可贡献于增强与FcγRIIb的结合。因此，通过将该改变体的以EU编号表示的268位的Asp取代成Glu，上述的静电相互作用得到强化，通过使该改变体的环结构进一步稳定化，研究了是否可以增强与FcγRIIb的结合。此外，如图38所示，FcγRIIb的以EU编号表示的160位的Tyr与P208的结构域A的以EU编号表示的237位的Asp的主链进行相互作用。另一方面，以EU编号表示的237位的Asp的侧链位于分子内的以EU编号表示的332位的Ile、333位的Glu、334位的Lys的附近，未特别形成显著的相互作用。因此，通过将这些位点取代成亲水性氨基酸残基，强化与以EU编号表示的237位的Asp的侧链的相互作用，通过将从以EU编号表示的266位至271位的环结构稳定化，一并验证了是否增强与FcγRIIb的160位的Tyr的相互作用。

以对于实施例13中制作的对FcγRIIb显示优异的选择性的IL6R-BP230/IL6R-L为模板，制作了分别导入有根据结构信息发现的H268E、I332T、I332S、I332E、I332K、E333K、E333R、E333S、E333T、K334S、K334T、K334E的改变的改变体。作为抗体L链使用了IL6R-L(SEQID NO:135)。按照参考实施例1和2的方法，纯化了表达的、含有上述重链的改变体和IL6R-L的轻链的抗体。所纯化的抗体对各FcγR(FcγRIa、FcγRIIaH、FcγRIIaR、FcγRIIb、FcγRIIIaV)的结合，通过参考实施例25的方法进行了评价。

各改变体对各FcγR的KD示于表22。应予说明，表中的改变表示对于IL6R-B3(SEQ ID NO:144)导入的改变。其中，作为制作IL6R-BP230时的模板使用的IL6R-B3/IL6R-L，以*来表示。此外，表中的亲本多肽的KD(IIb)/改变多肽的KD(IIb)是指IL6R-B3/IL6R-L对FcγRIIb的KD值除以各改变体对FcγRIIb的ＫD值而得的值。此外，亲本多肽的KD(IIaR)/改变多肽的KD(IIaR)是指IL6R-B3/IL6R-L对FcγR IIaR的KD值除以各改变体对FcγRIIaR的KD值而得的值。KD(IIaR)/KD(IIb)是指各改变体对FcγRIIaR的KD除以该改变体对FcγRIIb的KD而得的值，该值越大则表示对FcγRIIb的选择性越高。应予说明，由于判断FcγR对IgG的结合微弱，不可能在动力学分析中进行正确分析，因而表22中用灰色涂覆的单元格的数值是利用参考实施例25中记载的式2算出的数值：

[式2]

KD＝C·R_max/(R_eq-RI)-C。

[表22]

对于IL6R-BP230/IL6R-L导入有H268E改变的IL6R-BP264/IL6R-L、导入有E333K改变的IL6R-BP465/IL6R-L、导入有E333R改变的IL6R-BP466/IL6R-L、导入有E333T改变的IL6R-BP470与FcγRIIb的结合活性、和FcγRIIb的选择性，与IL6R-BP230/IL6R-L比较均得以提高。此外，导入有I332T改变的IL6R-BP391/IL6R-L的FcγRIIb的选择性，与IL6R-BP230/IL6R-L进行比较，降低，但与FcγRIIb的结合活性提高。

[实施例16]向以EU编号表示的271位的周边的氨基酸残基综合性导入改变

在Fc(P208)与FcγRIIb的结构和Fc(P238D)/FcγRIIb的结构的比较中所看到的最大不同是，Fc区的CH2结构域B的以EU编号表示的271位的附近的结构(图39)。如实施例11所示，在Fc(P238D)中以EU编号表示的270位的Asp与FcγRIIb的131位的Arg形成牢固的静电相互作用时，暗示以EU编号表示的271位的Pro部分可能遭受立体化学应激。认为：在Fc(P208)/FcγRIIb的结构中通过将以EU编号表示的271位的Pro取代成Gly，为了使该结构的形变解除而在主链水平发生位置变化，其结果，271位的附近的结构发生了较大变化。还认为：如果能使该变化的271位的附近的结构进一步稳定化，可以进一步减轻与FcγRIIb的131位的Arg形成静电相互作用的结合所伴随的熵的能量损失。因此，通过综合性地导入对以EU编号表示的271位的周边的氨基酸残基的改变，可以探讨显示Fc区对FcγRIIb的结合增强或选择性提高的改变。

作为综合性地导入改变的模板，制作了对于IL6R-B3(SEQ ID NO:144)、导入有E233D、G237D、P238D、H268E、P271G的改变的IL6R-BP267。作为抗体L链使用了IL6R-L(SEQ ID NO:135)。按照参考实施例1和2的方法，纯化了表达的、含有上述重链的改变体和IL6R-L轻链的抗体。所纯化的抗体对各FcγR(FcγRIa、FcγRIIaH、FcγRIIaR、FcγRIIb、FcγRIIIaV)的结合，通过参考实施例25的方法进行了评价。IL6R-BP267的以EU编号表示的264位、265位、266位、267位、269位、272位的氨基酸分别取代成除了取代前的氨基酸和Cys之外的18种的氨基酸。作为抗体L链使用了IL6R-L(SEQ ID NO:135)。按照参考实施例1和2的方法，纯化了表达的、含有上述重链的改变体和IL6R-L轻链的抗体。通过参考实施例25的方法纯化的抗体对各FcγR(FcγRIa、FcγRIIaH、FcγRIIaR、FcγRIIb、FcγRIIIaV))的结合，通过参考实施例25的方法进行了评价。所得的改变体中，和导入改变前的IL6R-BP267/IL6R-L与FcγRIIb的结合或FcγIIb的选择性进行比较，与FcγRIIb的结合得到增强的改变体或对FcγRIIb的选择性提高的改变体示于表23。

[表23]

各改变体对各FcγR的KD示于表23。应予说明，表中的改变表示对于作为模板的IL6R-BP267导入的改变。其中，作为制作IL6R-B3时的模板使用的IL6R-B3/IL6R-L，以*来表示。此外，表中的亲本多肽的KD(IIb)/改变多肽的KD(IIb)是指IL6R-B3/IL6R-L对FcγRIIb的KD值除以各改变体对FcγRIIb的KD值而得的值。此外，亲本多肽的KD(IIaR)/改变多肽的KD(IIaR)是指IL6R-B3/IL6R-L对FcγR IIaR的KD值除以各改变体对FcγR IIaR的KD值而得的值。KD(IIaR)/KD(IIb)是指各改变体对FcγRIIaR的KD除以该改变体对FcγRIIb的KD而得的值，该值越大表示对FcγRIIb的选择性越高。应予说明，由于判断FcγR对IgG的结合微弱，不可能在动力学分析中进行正确分析，因而表23中用灰色涂覆的单元格的数值是利用参考实施例25中记载的式2算出的数值：

[式2]

KD＝C·R_max/(R_eq-RI)-C。

表23所示的改变体与FcγRIa、FcγRIIaH、FcγRIIIaV的结合活性，和IL6R-B3/IL6R-L与上述受体的结合活性进行比较，均维持或减少。此外，对于IL6R-BP267/IL6R-L分别加入有S267A、V264I、E269D、S267E、V266F、S267G、V266M的改变的改变体与FcγRIIb的结合活性，和加入改变前的IL6R-BP267/IL6R-L与FcγRIIb的结合活性进行比较，得到增强。此外，对于IL6R-BP267/IL6R-L分别加入有S267A、S267G、E272M、E272Q、D265E、E272D、E272N、V266L、E272I、E272F的改变的改变体的KD(IIaR)/KD(IIb)的值，与加入改变前的IL6R-BP267/IL6R-L的上述值进行比较，增加，明确了S267A、S267G、E272M、E272Q、D265E、E272D、E272N、V266L、E272I、E272F的改变显示提高对FcγRIIb的选择性的效果。

[实施例17]通过向CH3区导入改变来增强与FcγRIIb的结合

据报道：将以EU编号表示的396位的Pro取代成Leu的改变增强与FcγRIIb的结合(CancerRes.(2007)67,8882-8890)。还认为：以EU编号表示的396位的氨基酸，在与FcγR的相互作用中是不直接参与的位点，但通过改变抗体的结构，对与FcγR的相互作用产生影响。因此，通过向Fc区的以EU编号表示的396位的氨基酸综合性地导入改变，对Fc区与FcγRIIb的结合或选择性是否提高进行了验证。

作为综合性地导入改变的模板，制作了对于IL6R-B3(SEQ ID NO:144)导入有E233D、G237D、P238D、S267A、H268E、P271G、A330R的改变的IL6R-BP423。制作了IL6R-BP423的以EU编号表示的396位的氨基酸取代成除了取代前的氨基酸和半胱氨酸之外的18种氨基酸的改变体。作为抗体L链使用了IL6R-L(SEQ ID NO:135)。按照参考实施例1的方法，纯化了表达的、含有上述重链的改变体和IL6R-L轻链的抗体。所纯化的抗体对各FcγR(FcγRIa、FcγRIIaH、FcγRIIaR、FcγRIIb、FcγRIIIaV)的结合，通过参考实施例25的方法进行了评价。所得改变体与各FcγR的结合示于表24。

[表24]

应予说明，表中的“对IL6R-BP423加入的改变”表示对于作为模板的IL6R-BP423导入的改变。其中，作为制作IL6R-BP423时的模板使用的IL6R-B3/IL6R-L，以*来表示。此外，表中的亲本多肽的KD(IIb)/改变多肽的KD(IIb)是指IL6R-B3/IL6R-L对FcγRIIb的KD值除以各改变体对FcγRIIb的KD值而得的值。此外，亲本多肽的KD(IIaR)/改变多肽的KD(IIaR)是指IL6R-B3/IL6R-L对FcγR IIaR的KD值除以各改变体对FcγR IIaR的KD值而得的值。KD(IIaR)/KD(IIb)是指各改变体对FcγRIIaR的KD除以该改变体对FcγRIIb的KD而得的值，该值越大表示对FcγRIIb的选择性越高。应予说明，由于判断FcγR对IgG的结合微弱，不可能在动力学分析中进行正确分析，因而表24中用灰色涂覆的单元格的数值是利用参考实施例25中记载的式2算出的数值：

[式2]

KD＝C·R_max/(R_eq-RI)-C。

根据表24的结果，对于IL6R-BP423/IL6R-L导入有P396M改变的IL6R-BP456/IL6R-L、导入有P396L改变的IL6R-BP455/IL6R-L、导入有P396Y改变的IL6R-BP464/IL6R-L、导入有P396F改变的IL6R-BP450/IL6R-L、导入有P396D改变的IL6R-BP448/IL6R-L、导入有P396Q改变的IL6R-BP458/IL6R-L、导入有P396I改变的IL6R-BP453/IL6R-L、导入有P396E改变的IL6R-BP449/IL6R-L、导入有P396K改变的IL6R-BP454/IL6R-L、导入有P396R改变的IL6R-BP459/IL6R-L与FcγRIIb的结合活性，和导入改变前的IL6R-BP423/IL6R-L与FcγRIIb的结合活性进行比较，均得以提高。此外，对于IL6R-BP423/IL6R-L导入有P396M改变的IL6R-BP456/IL6R-L的KD(IIaR)/KD(IIb)的值，与导入改变前的IL6R-BP423/IL6R-L的上述值进行比较增大，对FcγRIIb的选择性得以提高。表24中制作的改变体与FcγRIa、FcγRIIaH、FcγRIIIaV的结合活性，相比作为亲本多肽的IL6R-B3/IL6R-L与上述受体的结合活性，均降低。

[实施例18]通过亚类序列的利用来制作与FcγRIIb的结合得到增强的改变体

与FcγR的结合概况随人IgG中存在的亚类而不同。对IgG1和IgG4与各FcγR的结合活性的差异是否可以用于与FcγRIIb的结合活性增强和/或选择性提高进行了验证。首先，分析了IgG1和IgG4与各FcγR的结合活性。作为抗体H链，制作了含有人IgG4的以EU编号表示的228位的Ser取代成Pro、去除了C末端的Gly和Lys的Fc区即G4d的IL6R-G4d(SEQ IDNO:164)作为抗体H链。作为抗体L链使用了IL6R-L(SEQ ID NO:135)。按照参考实施例1和2的方法，纯化了表达的、含有IL6R-L轻链和IL6R-G1d/IL6R-L或IL6R-G4d/IL6R-L的抗体。所纯化的抗体对各FcγR(FcγRIa、FcγRIIaH、FcγRIIaR、FcγRIIb、FcγRIIIaV)的结合，通过参考实施例25的方法进行了评价。所得改变体与各FcγR的结合汇总于表25。

[表25]

显示出：IL6R-G4d/IL6R-L与FcγRIIb的结合，和IL6R-G1d/IL6R-L与FcγRIIb的结合比较，为1.5倍强，相对于此，IL6R-G4d/IL6R-L与FcγRIIaR的结合，和IL6R-G1d/IL6R-L与FcγRIIaR的结合比较，减弱2.2倍。此外，IL6R-G4d/IL6R-L与FcγRIa、FcγRIIaH、FcγRIIIaV的结合活性，和IL6R-G1d/IL6R-L与上述受体的结合活性比较，较弱。根据以上的结果明确了：IL6R-G4d与FcγRIIb的结合活性、选择性，与IL6R-G1d比较，均具有优选的性质。

图44是显示比较G1d和G4d的从CH1至C末端的序列(以EU编号表示的118位至445位)的比对。图44中的用粗框围起来的氨基酸显示在G1d和G4d中是不同的氨基酸残基。从这些不同的氨基酸中，选择几个预想与FcγR的相互作用有关的位点，通过将在与FcγRIIb的结合活性、选择性的角度均赋予优选性质的G4d的序列中的至少一个以上氨基酸残基移植到与FcγRIIb的结合得到增强的改变体，验证了是否可进一步使与FcγRIIb的结合进一步增强和/或选择性进一步提高。

具体而言，制作了对于IL6R-BP230导入有A327G改变的IL6R-BP473、导入有A330S改变的IL6R-BP472、导入有P331S改变的IL6R-BP471、导入有A330S和P331S改变的IL6R-BP474、导入有A327G和A330S改变的IL6R-BP475、导入有A327G、A330S和P331S改变的IL6R-BP476、导入有A327G和P331S改变的IL6R-BP477。此外，制作了将IL6R-BP230的以EU编号表示的118位的Ala至225位的Thr的氨基酸取代成由以EU编号表示的118位的Ala至222位的Pro构成的G4d的序列的氨基酸的IL6R-BP478。作为抗体L链使用了IL6R-L(SEQ ID NO:135)。按照参考实施例1和2的方法，纯化了含有上述重链的改变体和IL6R-L轻链的抗体。所纯化的抗体对各FcγR(FcγRIa、FcγRIIaH、FcγRIIaR、FcγRIIb、FcγRIIIaV)的结合，通过参考实施例25的方法进行了评价。

各改变体对各FcγR的KD示于表26。应予说明，表中的“亲本多肽的KD(IIb)/改变多肽的KD(IIb)”是指IL6R-B3/IL6R-L对FcγRIIb的KD值除以各改变体对FcγRIIb的KD值而得的值。表中的“对IL6R-BP230加入的改变”表示对于IL6R-BP230导入的改变。其中，作为制作IL6R-BP230时的模板的IL6R-B3/IL6R-L，以*1来表示。此外，从IL6R-BP230的以EU编号表示的118位的Ala至225位的Thr被取代成由从以EU编号表示的118位的Ala至222位的Pro构成的G4d序列的IL6R-BP478，以*2来表示。“亲本多肽的KD(IIaR)/改变多肽的KD(IIaR)”是指IL6R-B3/IL6R-L对FcγRIIaR的KD值除以该改变体对FcγR IIaR的KD值而得的值。KD(IIaR)/KD(IIb)是指各改变体对FcγRIIaR的KD除以该改变体对FcγRIIb的KD而得的值，该值越大表示对FcγRIIb的选择性越高。应予说明，由于判断FcγR对IgG的结合微弱，不可能在动力学分析中进行正确分析，因而表26中用灰色涂覆的单元格的数值是利用参考实施例25中记载的式2算出的数值：

[式2]

KD＝C·R_max/(R_eq-RI)-C。

[表26]

在表26记载的改变体中，导入有A327G改变的IL6R-BP473/IL6R-L与FcγRIIb的结合，和IL6R-BP230/IL6R-L与FcγRIIb的结合比较，增强了1.2倍。此外，将IL6R-BP230的以EU编号表示的118位的Ala至225位的Thr的氨基酸取代成由以EU编号表示的118位的Ala至222位的Pro构成的G4d的序列的氨基酸的IL6R-BP478/IL6R-L与FcγRIIb和FcγRIIaR的结合，和IL6R-BP230/IL6R-L与FcγRIIb和FcγRIIaR的结合比较，均增强了1.1倍。各改变体与FcγRIa、FcγRIIaH、FcγRIIIaV的结合活性均低于作为亲本多肽的IL6R-B3/IL6R-L与FcγRIa、FcγRIIaH、FcγRIIIaV的结合活性。

对图44所示的其它位点的改变体也进行了进一步验证。具体而言，制作了对于抗体H链的IL6R-BP230、导入有K274Q的IL6R-BP541、导入有Y296F的IL6R-BP542、导入有H268Q的IL6R-BP543、导入有R355Q的IL6R-BP544、导入有D356E的IL6R-BP545、导入有L358M的IL6R-BP546、导入有K409R的IL6R-BP547、导入有Q419E的IL6R-BP548。作为抗体L链共同使用了IL6R-L。按照参考实施例1和2的方法，纯化了含有上述重链的改变体和IL6R-L的轻链的抗体。所纯化的抗体对各FcγR(FcγRIa、FcγRIIaH、FcγRIIaR、FcγRIIb、FcγRIIIaV)的结合，通过参考实施例25的方法进行了评价。

各改变体对各FcγR的KD示于表27。应予说明，表中的“亲本多肽的KD(IIb)/改变多肽的KD(IIb)”是指IL6R-B3/IL6R-L对FcγRIIb的KD值除以各改变体对FcγRIIb的KD值而得的值。表中的“对IL6R-BP230加入的改变”表示对于IL6R-BP230导入的改变。其中，作为制作IL6R-BP230时的模板的IL6R-B3/IL6R-L，以*1来表示。“亲本多肽的KD(IIaR)/改变多肽的KD(IIaR)”是指IL6R-B3/IL6R-L对FcγR IIaR的KD值除以该改变体对FcγRIIaR的KD值而得的值。KD(IIaR)/KD(IIb)是指各改变体对FcγRIIaR的KD除以该改变体对FcγRIIb的KD而得的值，该值越大表示对FcγRIIb的选择性越高。应予说明，由于判断FcγR对IgG的结合微弱，不可能在动力学分析中进行正确分析，因而表27中用灰色涂覆的单元格的数值是利用参考实施例25中记载的式2算出的数值：

[式2]

KD＝C·R_max/(R_eq-RI)-C。

如表27所示，对于IL6R-BP230/IL6R-L、导入有K274Q的IL6R-BP541/IL6R-L、导入有R355Q的IL6R-BP544/IL6R-L、导入有D356E的IL6R-BP545/IL6R-L、导入有L358M的IL6R-BP546/IL6R-L，与改变导入前的IL6R-BP230/IL6R-L比较，与FcγRIIb的结合得到增强。此外，其中显示出：对于IL6R-BP230/IL6R-L、导入有R355Q的IL6R-BP544/IL6R-L、导入有D356E的IL6R-BP545/IL6R-L、导入有L358M的IL6R-BP546/IL6R-L，与改变导入前的IL6R-BP230/IL6R-L比较，KD(IIaR)/KD(IIb)的值增加，也是对FcγRIIb的选择性提高的改变。

[表27]

[实施例19]带来与FcγRIIb的结合增强、选择性的提高的改变的组合的研究

直至实施例18为止的实施例中，从与FcγRIIb的结合增强或选择性提高的角度，研究了观察到效果的改变的进一步组合。具体而言，对于IL6R-B3(SEQ ID NO:144)导入了在迄今为止的研究中带来了与FcγRIIb的结合增强和/或选择性提高的改变的组合。此外，作为比较对照，制作了将作为现有的增强FcγRIIb结合的改变(Seung等人(Mol.Immunol.(2008)45,3926-3933))的S267E和L328F改变导入到IL6R-B3的IL6R-BP253。作为抗体L链使用了IL6R-L(SEQ ID NO:135)。按照参考实施例1和2的方法，纯化了表达的、含有上述重链的改变体和IL6R-L轻链的抗体。所纯化的抗体对各FcγR(FcγRIa、FcγRIIaH、FcγRIIaR、FcγRIIb、FcγRIIIaV)的结合，通过参考实施例25的方法进行了评价。

各改变体对各FcγR的KD示于表28。应予说明，表中的改变表示对于IL6R-B3(SEQ ID NO:144)导入的改变。其中，作为制作各改变体时的模板的IL6R-B3/IL6R-L，以*来表示。亲本多肽的KD(IIb)/改变多肽的KD(IIb)是指IL6R-B3/IL6R-L对FcγRIIb的KD值除以各改变体对FcγRIIb的KD值而得的值。此外，亲本多肽的KD(IIaR)/改变多肽的KD(IIaR)是指IL6R-B3/IL6R-L对FcγR IIaR的KD值除以该改变体对FcγR IIaR的KD而得的值。KD(IIaR)/KD(IIb)是指各改变体对FcγRIIaR的KD除以该改变体对FcγRIIb的KD而得的值，该值越大表示与FcγRIIaR比较对FcγRIIb的选择性越高。此外，KD(IIaH)/KD(IIb)是指各改变体对FcγRIIaH的KD除以该改变体对FcγRIIb的KD而得的值，该值越大表示与FcγRIIaH比较对FcγRIIb的选择性越高。应予说明，由于判断FcγR对IgG的结合微弱，不可能在动力学分析中进行正确分析，因而表28中用灰色涂覆的单元格的数值是利用参考实施例25中记载的式2算出的数值：

[式2]

KD＝C·R_max/(R_eq-RI)-C。

[表28-1]

表28-2是表28-1的续表：

[表28-2]

表28-3是表28-2的续表：

[表28-3]

在表28记载的改变体中，加入有增强FcγRIIb结合的现有改变的IL6R-BP253/IL6R-L对FcγRIIb和FcγRIIaR的结合活性，与改变导入前的IL6R-B3/IL6R-L对FcγRIIb和FcγRIIaR的结合活性比较，分别增强了277倍和529倍。此外，IL6R-BP253/IL6R-L与FcγRIa的结合活性，相比IL6R-B3/IL6R-L与FcγRIa的结合活性，也增强。另一方面，IL6R-BP253/IL6R-L与FcγRIIaH和FcγRIIIaV的结合，相比IL6R-B3/IL6R-L与FcγRIIaH和FcγRIIIaV的结合，减弱。在其它的改变体中，IL6R-BP436/IL6R-L和IL6R-BP438/IL6R-L与FcγRIa的结合，和改变导入前的IL6R-B3/IL6R-L与FcγRIa的结合比较，略微增强，但除此以外的改变体与FcγRIa的结合均减弱。此外，各改变体与FcγRIIaH和FcγRIIIaV的结合，相比IL6R-B3/IL6R-L与FcγRIIaH和FcγRIIIaV的结合，减弱。

将本研究中制作的改变体和现有的增强FcγRIIb结合的改变体IL6R-BP253/IL6R-L进行比较时，对于KD(IIaH)/KD(IIb)的值，最低的IL6R-BP480/IL6R-L为107.7、最高的IL6R-BP426/IL6R-L为8362，各改变体与IL6R-BP253/IL6R-L的107.1比较均较高。此外，对于KD(IIaR)/KD(IIb)的值，最低的IL6R-BP479/IL6R-L为16.1、最高的IL6R-BP559/IL6R-L为58.4，各改变体与IL6R-BP253/IL6R-L的0.2比较均较高。根据这些结果，显示出：表28所示的改变体对FcγRIIb的选择性，与加入有现有的增强FcγRIIb结合的改变的改变体对FcγRIIb的选择性比较，对FcγRIIb的选择性均提高。特别是，IL6R-BP559/IL6R-L、IL6R-BP493/IL6R-L、IL6R-BP557/IL6R-L、IL6R-BP492/IL6R-L、和IL6R-BP500/IL6R-L与FcγRIIaR的结合，相比IL6R-B3/IL6R-L，均维持在1.5倍以下，而与FcγRIIb的结合活性增强了100倍以上，因此期待着避免由于增强FcγRIIaR结合而产生的副作用，同时显示增强FcγRIIb结合的效果。

此外，IL6R-BP489/IL6R-L、IL6R-BP487/IL6R-L、IL6R-BP499/IL6R-L、IL6R-BP498/IL6R-L、IL6R-BP503/IL6R-L、IL6R-BP488/IL6R-L、IL6R-BP490/IL6R-L、IL6R-BP445/IL6R-L、IL6R-BP552/IL6R-L、IL6R-BP507/IL6R-L、IL6R-BP536/IL6R-L、IL6R-BP534/IL6R-L、IL6R-491/IL6R-L、IL6R-BP553/IL6R-L、IL6R-BP532/IL6R-L、IL6R-BP506/IL6R-L、IL6R-BP511/IL6R-L、IL6R-BP502/IL6R-L、IL6R-BP531/IL6R-L、IL6R-BP510/IL6R-L、IL6R-BP535/IL6R-L、IL6R-BP497/IL6R-L、IL6R-BP533/IL6R-L、IL6R-BP555/IL6R-L、IL6R-BP554/IL6R-L、IL6R-BP436/IL6R-L、IL6R-BP423/IL6R-L、IL6R-BP440/IL6R-L、IL6R-BP538/IL6R-L、IL6R-BP429/IL6R-L、IL6R-BP438/IL6R-L、IL6R-BP565/IL6R-L、IL6R-BP540/IL6R-L、BP426/IL6R-L、IL6R-BP437/IL6R-L、IL6R-BP439/IL6R-L、IL6R-BP551/IL6R-L、IL6R-BP494/IL6R-L、IL6R-BP537/IL6R-L、IL6R-BP550/IL6R-L、IL6R-BP556/IL6R-L、IL6R-BP539/IL6R-L、IL6R-BP558/IL6R-L、IL6R-BP425/IL6R-L、IL6R-BP495/IL6R-L与FcγRIIb的结合，和加入有增强FcγRIIb结合的现有改变的IL6R-BP253/IL6R-L与FcγRIIb的结合进行比较，均提高。这些中，从与FcγRIIb结合最低的IL6R-BP495/IL6R-L到最高的IL6R-BP489/IL6R-L的增强幅度，当以IL6R-B3/IL6R-L的结合作为1时，是从321倍至3100倍。因此，可以说这些改变体在与FcγRIIb的结合活性增强的程度和选择性的两方面是相比现有技术均优异的改变体。

[实施例20]钙依赖性地与人IgA结合的抗体的制备

(20-1)人IgA(hIgA)的制备

在实施例2至4中，显示出：对小鼠FcγR的结合得到增强的、pH依赖性地与作为抗原的人IL-6受体结合的分子可使血浆中的抗原浓度大幅度降低。接着，为了进一步验证给予了与人IL-6受体以外的抗原pH依赖性地结合、对小鼠FcγR的结合得到增强的抗体的机体的血浆中的可溶型抗原消除的效果是否同样地被观察到，重新实施了使用以人IgA作为抗原的抗体的试验。作为抗原的人IgA(以下也称为hIgA)(可变区为抗人IL6R抗体)使用如下的重组技术进行制备。通过培养包含含有H(WT)-IgA1(SEQ IDNO:145)和L(WT)(SEQ ID NO:42)的重组载体的宿主细胞而表达的hIgA，利用本领域技术人员公知的方法，使用离子交换层析和凝胶过滤层析进行了纯化。

(20-2)与hIgA结合的抗体的表达和纯化

GA2-IgG1(重链SEQ ID NO:146、轻链SEQ ID NO:147)是与hIgA结合的抗体。将编码GA2-IgG1(重链SEQ ID NO:146、轻链SEQ ID NO:147)的DNA序列利用本领域技术人员公知的方法整合到动物细胞表达用质粒中。抗体使用以下的方法进行表达和纯化。将来源于人胎儿肾细胞的FreeStyle293-F株(Invitrogen)悬浮于FreeStyle293Expression Medium培养基(Invitrogen)中，将所得细胞悬浮液以1.33×10⁶个/mL的细胞密度向6孔板的各孔中各接种3mL。接着，将制备的质粒通过脂质转染法导入细胞。该细胞在CO₂培养箱(37℃、8％CO2、90rpm)中进行4天培养，使用rProtein ASepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)，利用本领域技术人员公知的方法从分离的该培养上清中纯化抗体。使用分光光度计测定纯化的抗体溶液的吸光度(波长：280nm)。通过PACE法算出吸光系数，使用该吸光系数由所得测定值计算抗体浓度(Protein Science(1995)4,2411-2423)。

(20-3)获得的抗体对hIgA的钙依赖性结合能力的评价

使用Biacore T200(GE Healthcare)，对实施例(20-2)中分离的抗体的hIgA结合活性(解离常数KD(M))进行了评价。作为运行缓冲液使用含有3μM或1.2mM CaCl2的0.05％tween20、20mmol/LACES、150mmol/LNaCl(pH7.4或pH5.8)，对该结合活性进行了测定。在用胺偶联法固定化有适当量的重组型蛋白A/G(Thermo Scientific)的传感器芯片CM5(GE Healthcare)上，使抗体结合。接着，作为分析物，通过注入适当浓度的hIgA(记载于(A1-1)中)，使hIgA与传感器芯片上的抗体进行相互作用。测定在37℃下进行。测定后，通过注入10mmol/L甘氨酸-HCl、pH1.5，由此使传感器芯片再生。使用BiacoreT200Evaluation Software(GE Healthcare)，通过基于曲线拟合的分析和平衡值分析，由测定结果算出解离常数KD(M)。其结果示于表29。显示出：GA2-IgG1在Ca²⁺浓度为1.2mM的条件下与hIgA强结合，但在Ca²⁺浓度为3μM的条件下与hIgA弱结合。此外，显示出：GA2-IgG1在Ca²⁺浓度为1.2mM的条件下、在pH7.4下与人IgA强结合，但在pH5.8下与人IgA弱结合。即，明确了GA2-IgG1与人IgA pH依赖性和钙依赖性地结合。

[表29]

[实施例21]钙依赖性地与hIgA结合的抗体的改变体的制备

接着，以进一步增大从血浆中消除抗原(hIgA)为目的，制作了对于钙依赖性地与hIgA结合的GA2-IgG1、为增强对小鼠FcγR的结合而将GA2-IgG1的以EU编号表示的326位的Lys取代成Asp的GA2-F1087(重链SEQ IDNO:148)。使用通过本领域技术人员公知的方法整合有编码GA2-F1087(重链SEQ ID NO:148、轻链SEQ ID NO:147)的DNA序列的动物表达用质粒，利用上述的方法表达的这些抗体改变体的浓度，纯化后进行测定。含有该改变的抗体，如实施例(4-3)所示，对小鼠FcγR的结合大幅度增强。

[实施例22]给予了Ca依赖性hIgA结合抗体的正常小鼠中的抗原的血浆中滞留性的影响的评价

(22-1)使用正常小鼠的体内试验

对于正常小鼠(C57BL/6J小鼠、Charles River Japan)，单独给予hIgA(人IgA，实施例(20-1)中制作)或同时给予hIgA和抗hIgA抗体，然后评价hIgA和抗hIgA抗体的体内动力学。将hIgA溶液(80μg/mL)或hIgA和抗hIgA抗体的混合溶液自尾静脉以10mL/kg的用量单次给予。作为抗hIgA抗体，使用上述的GA2-IgG1和GA2-F1087。

混合溶液中的hIgA浓度均为80μg/mL，抗hIgA抗体浓度为2.69mg/mL。此时，相对于hIgA，由于抗hIgA抗体充分过量地存在，因此认为大部分的hIgA与抗体结合。在给予了GA-IgG1的组中，在给予后5分钟、7小时、1天、2天、3天、7天自小鼠进行采血。此外，在给予了GA-F1087的组中，在给予后5分钟、30分钟、1小时、2小时、1天、3天、7天自小鼠进行采血。将所采集的血液立即在4℃、12,000rpm下离心15分钟，由此获得血浆。分离的血浆直到实施测定为止保存在设定为-20℃以下的冰箱中。

(22-2)通过ELISA法测定正常小鼠血浆中的抗hIgA抗体浓度

小鼠血浆中的抗hIgA抗体浓度通过ELISA法测定。首先，将抗人IgG(γ链特异性)F(ab')2抗体片段(SIGMA)分注于Nunc-Immuno Plate,MaxiSorp(Nalge nunc International)的各孔中，在4℃静置一夜，由此制作抗人IgG固定化板。将制备成作为血浆中浓度的标准液的0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.01563、0.007813μg/mL的抗hIgA抗体的校准曲线试样和经100倍以上稀释的小鼠血浆测定试样分注于上述的抗人IgG固定化板中后，将该板在25℃下孵育1小时。然后，将山羊抗人IgG(γ链特异性)生物素(BIOT)缀合物(Southern Biotechnology Associats Inc.)分注于上述板的各孔中后，该板在25℃下反应1小时。进而，将链霉亲和素-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)分注于上述板的各孔中后，该板在25℃下反应1小时。使用TMB One Component HRP MicrowellSubstrate(BioFX Laboratories)作为底物的显色反应，用1N-硫酸(ShowaChemical)使其停止后，使用酶标仪测定各孔的反应液在450nm下的吸光度。使用分析软件SOFTmax PRO(Molecular Devices)，以校准曲线的吸光度为基准，算出小鼠血浆中的抗hIgA抗体浓度。通过该方法测定的静脉内给予后的正常小鼠中的GA2-IgG1和GA2-F1087的血浆中抗体浓度变化示于图45。其结果确认到：与hIgA具有强的pH依赖性结合活性的克隆GA2-IgG1即使增强与FcγR的结合，其血浆中抗体浓度也未显著降低。

(22-3)通过ELISA法测定血浆中的hIgA浓度

小鼠的血浆中hIgA浓度通过ELISA法测定。首先，将山羊抗人IgA抗体(BETHYL)分注于Nunc-Immuno Plate,MaxiSoup(Nalge nuncInternational)的各孔中，在4℃静置一夜，由此制作抗人IgA固定化板。作为血浆中浓度的标准液使用制备成0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625μg/mL的hIgA的校准曲线试样。相对于校准曲线试样和经100倍以上稀释的小鼠血浆测定试样的各100μL，加入200μL的500ng/mLhsL6R进行混合，在室温下静置1小时。然后，将分注有混合溶液100μL的上述的抗人IgA固定化板在室温下静置1小时。接着，将生物素化抗人IL-6R抗体(R&D)分注于上述板的各孔中后，该板在室温下反应1小时。进而，将链霉亲和素-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)分注于上述板的各孔中后，该板在室温下反应1小时。使用TMB One Component HRPMicrowell Substrate(BioFX Laboratories)作为底物的显色反应，用1N-硫酸(Showa Chemical)使其停止后，使用酶标仪测定各孔的反应液在450nm下的吸光度。使用分析软件SOFTmax PRO(Molecular Devices)，根据校准曲线的吸光度，算出小鼠血浆中浓度。通过该方法测定的静脉内给予后的正常小鼠中的血浆中hIgA浓度变化示于图46。

其结果，相对于单独hIgA的消除，在同时给予了与hIgA具有100倍以上的Ca依赖性结合活性的GA2-IgG1的小鼠中，hIgA的消除与单独hIgA比较，得以加速。进而，在给予了hIgA和对FcγR的结合得到增强的GA2-F1087的小鼠的血浆中，给予一天后，相比测定范围(0.006μg/mL以上)，hIgA的浓度降低，与给予了GA-IgG1的小鼠的血浆中相比，大幅度加速了hIgA的消除。由以上结果明确了：在实施例2至实施例7中，在给予了IL6R和抗IL6R抗体的小鼠中，显示出通过对FcγR的结合得到增强的抗体增强抗原的除去效果，抗原在给予了hIgA和抗hIgA抗体的小鼠中也显示出同样的效果。

[实施例23]pH依赖性抗IgE抗体的获得

(23-1)抗人IgE抗体的获得

为了获得pH依赖性抗人IgE抗体，将作为抗原的人IgE(重链SEQ IDNO:149、轻链SEQ ID NO:150)(可变区由抗人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体构成)用FreeStyle293(Life Technologies)表达。表达的人IgE通过本领域技术人员公知的一般的柱层析法进行纯化、制备。从所获得的多个抗体中，挑选与人IgE pH依赖性地结合的抗体。使用整合有使所挑选的抗人IgE抗体的重链和轻链的可变区与人IgG1重链恒定区和人轻链恒定区进行融合而得的抗体基因的载体，表达重组抗人IgE抗体并纯化。所制作的抗体被命名为克隆278(以下表示为278-IgG1、重链SEQ ID NO:151、轻链SEQ ID NO:152)。

(23-2)抗人IgE抗体对人IgE的结合活性和pH依赖性结合活性的评价

在内体内可解离抗原的抗体，也可以通过不仅与抗原pH依赖性地结合，而且还Ca依赖性地与所要结合的抗原结合而产生。因此，评价了278-IgG1和作为对照的不具有pH/Ca依赖性IgE结合能力的人IgG1抗体即Xolair(奥马珠单抗,Novartis)对人IgE(hIgE)的pH依赖性结合能力和pH/Ca依赖性结合能力。即，使用BiacoreT200(GE Healthcare)，评价了278-IgG1和Xolair对hIgE的结合活性(解离常数KD(M))。作为运行缓冲液使用以下3种进行测定。

·1.2mmol/l CaCl₂/0.05％tween20,20mmol/l ACES,150mmol/l NaCl,pH7.4

·1.2mmol/l CaCl₂/0.05％tween20,20mmol/l ACES,150mmol/l NaCl,pH5.8

·3μmol/l CaCl₂/0.05％tween20,20mmol/l ACES,150mmol/l NaCl,pH5.8

将在适当量的化学合成的来源于人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3蛋白的序列(SEQ ID NO:153)的C末端存在的Lys上添加生物素而得到的肽(以下记载为“生物素化GPC3肽”)添加到传感器芯片SA(GE Healthcare)上，利用链霉亲和素与生物素的亲和性，使其固定化在同一传感器芯片SA上。注入适当浓度的人IgE，捕获生物素化GPC3肽，由此使人IgE固定化在芯片上。作为分析物，注入适当浓度的278-IgG1，与传感器芯片上的人IgE进行相互作用。然后，注入10mmol/L甘氨酸-HCl,pH1.5，由此使传感器芯片再生。相互作用均在37℃下测定。使用Biacore T200Evaluation Software(GEHealthcare)，利用基于曲线拟合的测定结果的分析，算出结合速率常数ka(1/Ms)和解离速率常数kd(1/s)。根据这些常数算出解离常数KD(M)。进而，在pH5.8,1.2mM Ca条件和pH7.4,1.2mM Ca条件的下，算出各抗体的KD比，评价pH依赖性结合，在pH5.8,3μM Ca条件和pH7.4,1.2mM Ca条件的下，算出各抗体的KD比，评价pH/Ca依赖性结合。其结果示于表30。

[表30]

[实施例24]pH依赖性地与人IgE结合的抗体的改变体的制备

接着，以进一步增大从血浆中消除抗原(人IgE)为目的，将编码对于pH依赖性地与人IgE结合的278-IgG1、为增强对小鼠FcγR的结合而将278-IgG1的以EU编号表示的326位的Lys取代成Asp的278-F1087(重链SEQ ID NO:154、轻链SEQ ID NO:152)的DNA序列利用本领域技术人员公知的方法整合到动物表达用质粒中。使用导入有该质粒的动物细胞通过上述的方法表达的这些抗体改变体的浓度，对其纯化后进行测定。

[实施例25]278-IgG1的体内评价

(25-1)体内评价用的人IgE(hIgE(Asp6))的制备

由重链(SEQ ID NO:155)和轻链(SEQ ID NO:150)构成的体内评价用的人IgE即hIgE(Asp6)(可变区为抗人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体)，通过与实施例(23-1)同样的方法进行制备。hIgE(Asp6)是，为了使人IgE的N型糖链的异质性不受作为抗原的人IgE的血浆中浓度变化的影响，而将人IgE的6个位置的N型糖链结合位点的天冬酰胺改变成天冬氨酸的分子。

(25-2)给予了克隆278的正常小鼠的血浆中的人IgE的消除加速效果的验证

在实施例2至4和22中，显示出：给予了pH依赖性地与作为抗原的人IL-6受体和人IgA结合、对小鼠FcγR的结合得到增强的分子的小鼠的血浆中的抗原浓度大幅度降低。为了进一步验证：对小鼠FcγR的结合得以增强时，给予了与人IL-6受体和人IgA以外抗原pH依赖性地结合、对小鼠FcγR的结合得到增强的抗体的机体的血浆中的可溶型抗原的消除效果是否同样地被观察到，重新实施了使用以人IgE作为抗原的抗体的试验。

评价了对C57BL/6J小鼠(Charles river Japan)单独给予hIgE(Asp6)或者同时给予hIgE(Asp6)和抗hIgE抗体(278-IgG1和278-F1087)后的hIgE(Asp6)和抗人IgE抗体的体内动力学。hIgE(Asp6)(20μg/mL)或hIgE(Asp6)和抗人IgE抗体的混合溶液(浓度如表31中所记载，各抗体均制备成相同的浓度)自尾静脉以10mL/kg单次给予。此时，相对于hIgE(Asp6)，由于各抗体充分过量地存在，因此认为几乎所有的hIgE(Asp6)与抗体结合。在给予了克隆278(278-IgG1)的组中，在给予后5分钟、2小时、7小时、1天、2天、4天、5天、7天、14天、21天自该小鼠采取血液。在给予了278-F1087的组中，在5分钟、30分钟、1小时、2小时、1天、3天、7天、14天、21天自该小鼠采取血液。此外，将所采集的血液立即在4℃、15,000rpm下离心5分钟，由此获得血浆。分离的血浆直到实施测定为止保存在设定为-20℃以下的冰箱中。

[表31]

(25-3)正常小鼠的血浆中的抗人IgE抗体浓度的测定

小鼠血浆中的抗hIgE抗体浓度用ELISA法测定。制备了血浆中浓度为0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625μg/mL的校准曲线试样。为了使hIgE(Asp6)和抗hIgE抗体的免疫复合体均匀，在校准曲线和小鼠血浆测定试样中，添加hIgE(Asp6)使达到1μg/mL，278-hIgG1给予组和对应的校准曲线试样在室温下静置30分钟。此外，278-F1087给予组和对应的校准曲线试样在37℃下搅拌一夜。静置或搅拌后的校准曲线和小鼠血浆测定试样分注到固定化有抗人κ轻链抗体(Bethyl Laboratories)的IMMUNOPLATE(Nunc-Immuno Plate,MaxiSorp(Nalge nunc International))中，在室温下静置或搅拌2小时(278-F1087给予组的试样和278-F1087的校准曲线试样)或者在4℃下静置一夜(278-hIgG1给予组的试样和278-hIgG1的校准曲线试样)。然后，使其分别依次与兔抗人IgG(Fc)第二抗体、生物素缀合物(PierceBiotechnology)和链霉亲和素-Poly HRP80(Stereospecific DetectionTechnologies)反应1小时。使用TMB One Component HRP MicrowellSubstrate(BioFX Laboratories)作为底物的显色反应，通过1N-硫酸(ShowaChemical)使反应停止后，通过使用酶标仪测定该显色在450nm下的吸光度的方法，对小鼠血浆中浓度进行了测定。小鼠血浆中浓度使用分析软件SOFTmax PRO(Molecular Devices)，根据校准曲线的吸光度算出。通过该方法测定的静脉内给予后的血浆中抗体浓度变化示于图47。其结果确认到：在给予了对于人IgE具有强的pH依赖性结合活性的278-IgG1与FcγR的结合得到增强的改变体的小鼠中，该小鼠的血浆中的抗体浓度与278-IgG1比较也未显著降低。

(25-4)正常小鼠的血浆中的hIgE(Asp6)浓度的测定

小鼠血浆中hIgE(Asp6)浓度用ELISA法测定。制备了血浆中浓度为192、96、48、24、12、6、3ng/mL的校准曲线试样。为了使hIgE(Asp6)和抗hIgE抗体的免疫复合体均匀，在校准曲线和小鼠血浆测定试样中，在给予了278-hIgG1的组中添加Xolair(Novartis)使达到10μg/mL，在室温下静置30分钟。在给予278-F1087的组中添加278-F1022(重链SEQ ID NO:156、轻链SEQ ID NO:152、与实施例24同样制备)或278-F760(重链SEQ ID NO:157、轻链SEQ ID NO:152、与实施例24同样制备)使达到20μg/mL，在37℃下搅拌60小时。将小鼠血浆测定试样分注到固定化有抗人IgE的IMMUNO PLATE(MABTECH)或固定化有抗人IgE(克隆107、MABTECH)的IMMUNO PLATE(NuncF96Micro Well Plate(Nalge nunc International))上，在室温下静置或搅拌2小时或者在4℃下静置一夜。然后，使其分别依次与人GPC3核心蛋白(SEQ ID NO:158)、用NHS-PEG4-生物素(Thermo FisherScientific)生物素化的抗GPC3抗体(公司内部制备)、链霉亲和素-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)反应1小时。使用TMBOne Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)作为底物的显色反应，通过1N-硫酸(Showa Chemical)使反应停止后，通过使用酶标仪测定该显色在450nm的吸光度的方法，或者进行将SuperSignal(r)ELISA PicoChemiluminescent Substrate(Thermo Fisher Scientific)作为底物的发光反应，通过使用酶标仪测定发光强度的方法，对小鼠血浆中浓度进行了测定。使用分析软件SOFTmax PRO(Molecular Devices)由校准曲线的吸光度或发光强度算出小鼠血浆中浓度。通过该方法测定的静脉内给予后的血浆中hIgE(Asp6)浓度变化示于图48。

其结果，对于人IgE单独的消除，在同时给予了具有强的pH依赖性结合活性的278-IgG1和人IgE的小鼠中，与人IgE单独比较，加速了人IgE的消除。进而确认到：在给予了对于278-IgG1使与FcγR的结合得到增强的278-F1087和人IgE的小鼠中，与人IgE单独、以及与给予了278-IgG1和人IgE的小鼠相比，人IgE的消除也大幅度加速。即，显示出：不仅是在给予了迄今为止阐明的与FcγR的结合得到增强的抗IL6R抗体或抗IgA抗体的小鼠中，而且在给予了与FcγR的结合得到增强的抗IgE抗体的小鼠中也使抗原的消除得以加速。

(参考实施例1)氨基酸经取代的IgG抗体的表达载体的构建

使用QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)，通过所附说明书记载的方法制作突变体，将含有突变体的质粒片段插入到动物细胞表达载体中，由此制作目标H链表达载体和L链表达载体。所得表达载体的碱基序列通过本领域技术人员公知的方法确定。

(参考实施例2)IgG抗体的表达和纯化

抗体的表达使用以下方法来进行。将来源于人胎儿肾癌细胞的HEK293H细胞株(Invitrogen)悬浮于含有10％胎牛血清(Invitrogen)的DMEM培养基(Invitrogen)中，以5～6×10⁵细胞/mL的细胞密度向贴壁细胞用培养皿(直径10cm,CORNING)的各皿中各接种10mL，在CO₂培养箱(37℃、5％CO₂)内培养一昼夜后，吸除培养基，添加CHO-S-SFM-II(Invitrogen)培养基6.9mL。将制备的质粒通过脂质转染法导入细胞。回收所得培养上清后，进行离心(约2000g、5分钟、室温)除去细胞，进而通过0.22μm过滤器MILLEX(R)-GV(Millipore)进行灭菌，得到培养上清。使用rProtein ASepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)，通过本领域技术人员公知的方法，从所得培养上清中进行纯化。纯化抗体浓度使用分光光度计测定280nm下的吸光度。使用通过Protein Science1995；4:2411-2423中记载的方法算出的吸光系数，由所得的值计算抗体浓度。

(参考实施例3)可溶型人IL-6受体(hsIL-6R)的制备

作为抗原的人IL-6受体的重组人IL-6受体如下所述制备。通过本领域技术人员公知的方法构建J.Immunol.(1994)152,4958-4968中报道的包含N末端侧1位至357位的氨基酸序列的可溶型人IL-6受体(以下，也称为hsIL-6R)的稳定表达CHO细胞株。通过培养该CHO细胞株来使可溶型人IL-6受体表达。通过Blue Sepharose6FF柱层析、凝胶过滤柱层析这两个步骤，从所得的该CHO细胞株的培养上清中纯化可溶型人IL-6受体。将最终步骤中作为主峰洗脱出的流分作为最终纯化品使用。

(参考实施例4)低岩藻糖抗体的制备

低岩藻糖抗体的表达使用以下的方法来进行。将悬浮于含有10％胎牛血清(CCB)的α-MEM培养基(Invitrogen)中的CHO细胞岩藻糖转运蛋白缺失株(专利文献WO2006/067913)以2E+6个/10mL的浓度接种于贴壁细胞用培养皿(直径10cm,CORNING)中。在CO₂培养箱(37℃、5％CO₂)内培养一昼夜，吸除该培养基后，添加CHO-S-SFM-II(Invitrogen)培养基7mL。向另外制备的通过脂质转染法导入有质粒的细胞中添加CHO-S-SFM-II(Invitrogen)培养基7mL。72小时后，利用离心(约2000g、5分钟、室温)回收的培养上清进而通过0.22μm过滤器MILLEX(R)-GV(Millipore)进行灭菌。使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)，通过本领域技术人员公知的方法，从所得培养上清中纯化抗体。使用分光光度计测定280nm下的吸光度，使用通过Protein Science1995；4:2411-2423中记载的方法算出的吸光系数，由该吸光度的值计算纯化抗体浓度。

(参考实施例5)使用噬菌体展示技术从人抗体文库获得Ca依赖性地与IL-6受体结合的抗体

(5-1)天然人抗体噬菌体展示文库的制作

将由人PBMC制作的多腺苷酸化RNA或市售的人多腺苷酸化RNA等作为模板，按照本领域技术人员公知的方法，构建由展示相互不同的人抗体序列的Fab结构域的多个噬菌体构成的人抗体噬菌体展示文库。

(5-2)通过珠淘选从文库获得Ca依赖性地与抗原结合的抗体片段

从构建的天然人抗体噬菌体展示文库中进行的最初的挑选如下实施：仅浓缩具有抗原(IL-6受体)结合能力的抗体片段或以Ca浓度依赖性抗原(IL-6受体)结合能力为指标的抗体片段的浓缩。以Ca浓度依赖性抗原(IL-6受体)结合能力为指标的抗体片段的浓缩如下实施：使用会螯合Ca离子的EDTA，从在Ca离子存在下与IL-6受体结合的噬菌体文库中洗脱噬菌体。作为抗原，使用经生物素标记的IL-6受体。

由携带构建的噬菌体展示用噬粒的大肠杆菌进行了噬菌体产生。在进行了噬菌体产生的大肠杆菌的培养液中添加2.5M NaCl/10％PEG，并将由此沉淀的噬菌体的群体用TBS稀释，从而得到噬菌体文库液。接着，在噬菌体文库液中添加BSA和CaCl₂，以使终浓度为4％BSA和1.2mM钙离子浓度。作为淘选方法，参考了作为常规方法的使用固定化于磁珠的抗原的淘选方法(J.Immunol.Methods.(2008)332(1-2),2-9、J.Immunol.Methods.(2001)247(1-2),191-203、Biotechnol.Prog.(2002)18(2)212-20、Mol.CellProteomics(2003)2(2),61-9)。作为磁珠，使用涂布有中和亲和素的珠(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或涂布有链霉亲和素的珠(DynabeadsM-280Streptavidin)。

具体而言，制备的噬菌体文库液中加入250pmol的生物素标记抗原，由此使该噬菌体文库液在室温与抗原接触60分钟。加入用BSA封闭的磁珠，使抗原和噬菌体的复合体与磁珠在室温下结合15分钟。将珠用1mL的1.2mM CaCl₂/TBS(含有1.2mM CaCl₂的TBS)洗涤1次。然后，在浓缩具有IL-6受体结合能力的抗体片段时，通过利用常规方法的洗脱，在以Ca浓度依赖性的IL-6受体结合能力作为指标来浓缩抗体片段时，通过由悬浮于2mM EDTA/TBS(含有2mM EDTA的TBS)中的珠的洗脱，来回收噬菌体溶液。将回收的噬菌体溶液添加至对数生长期(OD600为0.4-0.7)的10mL大肠杆菌菌株TG1中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225mm×225mm的板上。接着，从接种的大肠杆菌的培养液中回收噬菌体，由此制备噬菌体文库液。

第2次以后的淘选中，以Ca依赖性结合能力为指标进行噬菌体的浓缩。具体而言，在制备的噬菌体文库液中加入40pmol的生物素标记抗原，由此使噬菌体文库在室温与抗原接触60分钟。加入用BSA封闭的磁珠，使抗原和噬菌体的复合体与磁珠在室温结合15分钟。将珠用1mL的1.2mMCaCl₂/TBST和1.2mM CaCl₂/TBS洗涤。然后将加入有0.1mL的2mMEDTA/TBS的珠在室温悬浮后，立即使用磁力架将珠分离，回收噬菌体溶液。将回收的噬菌体溶液添加至对数生长期(OD600为0.4-0.7)的10mL大肠杆菌菌株TG1中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225mm×225mm的板上。接着，从接种的大肠杆菌的培养液中回收噬菌体，由此回收噬菌体文库液。以Ca依赖性结合能力为指标的淘选重复进行数次。

(5-3)基于噬菌体ELISA的评价

通过由上述的方法得到的大肠杆菌的单克隆，按照常法(Methods Mol.Biol.(2002)178,133-145)，回收含有噬菌体的培养上清。在含有噬菌体的培养上清中加入BSA和CaCl₂，以使终浓度为4％BSA和1.2mM钙离子浓度，按照以下步骤进行ELISA。将StreptaWell96微量滴定板(Roche)用含有生物素标记抗原的100μL PBS包被一夜。用PBST洗涤该板的各孔，由此将抗原除去后，将该孔用250μL的4％BSA-TBS封闭1小时以上。在除去了4％BSA-TBS的各孔中，加入制备的培养上清，将该板在37℃静置1小时，由此使噬菌体展示抗体与各孔中存在的抗原结合。在用1.2mM CaCl₂/TBST进行了洗涤的各孔中，加入1.2mM CaCl₂/TBS或1mM EDTA/TBS，将该板在37℃静置30分钟，进行孵育。在用1.2mM CaCl₂/TBST进行洗涤后，将通过终浓度4％的BSA和离子化钙浓度为1.2mM的TBS进行了稀释的HRP结合抗M13抗体(Amersham Pharmacia Biotech)添加至各孔中，将板孵育1小时。用1.2mM CaCl₂/TBST洗涤后，添加TMB single溶液(ZYMED)，各孔中的溶液的显色反应通过添加硫酸而停止后，通过450nm的吸光度测定该显色。

作为上述噬菌体ELISA的结果，将被判断具有Ca依赖性抗原结合能力的抗体片段作为模板，利用特异性引物进行扩增，并对所扩增的基因的碱基序列进行分析。

(5-4)抗体的表达和纯化

将噬菌体ELISA的结果判断为具有Ca依赖性抗原结合能力的克隆导入动物细胞表达用质粒中。抗体的表达使用以下的方法进行。将来源于人胎儿肾细胞的FreeStyle293-F细胞株(Invitrogen)悬浮于FreeStyle293Expression Medium培养基(Invitrogen)中，以1.33×10⁶细胞/mL的细胞密度向6孔板的各孔中各接种3mL。将制备的质粒通过脂质转染法导入细胞。在CO₂培养箱(37度、8％CO₂、90rpm)中进行4天培养。使用rProtein ASepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)，用本领域技术人员公知的方法从上述中所得培养上清中纯化抗体。使用分光光度计测定纯化的抗体溶液在280nm下的吸光度。通过PACE法算出吸光系数，使用该吸光系数由所得测定值计算抗体浓度(Protein Science(1995)4,2411-2423)。

(参考实施例6)获得的抗体对人IL-6受体的Ca依赖性结合能力的评价

为了判断参考实施例5中获得的抗体6RL#9-IgG1(重链(SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:9上连接有来源于IgG1的恒定区的序列)、轻链(SEQ ID NO:45))和FH4-IgG1(重链(SEQ ID NO:46)、轻链(SEQ ID NO:47))对人IL-6受体的结合活性是否为Ca依赖性的，使用BiacoreT100(GE Healthcare)来进行这些抗体和人IL-6受体的抗原抗体反应的动力学分析。作为对人IL-6受体不具有Ca依赖性结合活性的对照抗体，使用WO2009125825中记载的H54/L28-IgG1(重链SEQ ID NO:36、轻链SEQ ID NO:37)。作为高钙离子浓度和低钙离子浓度条件，分别在2mM和3μM的钙离子浓度的溶液中进行抗原抗体反应的动力学分析。在用胺偶联法固定化有适当量的蛋白A(Invitrogen)的传感器芯片CM4(GE Healthcare)上，捕获目标抗体。运行缓冲液使用10mM ACES、150mM NaCl、0.05％(w/v)Tween20、2mMCaCl₂(pH7.4)或10mM ACES、150mM NaCl、0.05％(w/v)Tween20、3μmol/LCaCl₂(pH7.4)这2种缓冲液。人IL-6受体的稀释中也使用各自的缓冲液。测定均在37℃下实施。

在使用了H54L28-IgG1抗体的抗原抗体反应的动力学分析之际，以流速20μL/分钟注入IL-6受体的稀释液和作为空白的运行缓冲液3分钟，由此使捕获于传感器芯片上的H54L28-IgG1抗体与IL-6受体发生相互作用。然后，以流速20μL/分钟流过10分钟运行缓冲液，观察到IL-6受体的解离后，以流速30μL/分钟注入10mM甘氨酸-HCl(pH1.5)30秒钟，由此将传感器芯片再生。根据测定所得的传感图，计算作为动力学参数的结合速率常数ka(1/Ms)和解离速率常数kd(1/s)。使用这些值，计算H54L28-IgG1抗体对人IL-6受体的解离常数KD(M)。各参数的计算中使用了Biacore T100Evaluation Software(GE Healthcare)。

在使用了FH4-IgG1抗体和6RL#9-IgG1抗体的抗原抗体反应的动力学分析之际，以流速5μL/分钟注入IL-6受体的稀释液和作为空白的运行缓冲液15分钟，由此使捕获于传感器芯片上的FH4-IgG1抗体或6RL#9-IgG1抗体与IL-6受体发生相互作用。然后，以流速30μL/分钟注入10mM甘氨酸-HCl(pH1.5)30秒钟，由此将传感器芯片再生。根据测定所得的传感图，使用稳态亲和性模型计算解离常数KD(M)。各参数的计算中使用了BiacoreT100Evaluation Software(GE Healthcare)。

通过该方法确定的2mM CaCl₂存在下的各抗体与IL-6受体的解离常数KD示于表32。

[表32]

抗体	H54/L28-IgG1	FH4-IgG1	6RL#9-IgG1
				kD(M)	1.9E-9	5.9E-7	2.6E-7

对于Ca浓度为3μM的条件下的H54/L28-IgG1抗体的KD，可以用与2mM Ca浓度存在下相同的方法来计算。Ca浓度为3μM的条件下，FH4-IgG1抗体和6RL#9-IgG1抗体基本未观察到对IL-6受体的结合，因而难以通过上述方法来计算KD。但通过使用下述的式3(BiacoreT100SoftwareHandbook,BR-1006-48,AE01/2007)，可以预测Ca浓度为3μM的条件下的这些抗体的KD：

(式3)

Req＝C×Rmax/(KD+C)+RI

上述(式3)中的各项的含义如下所示：

Req(RU)：稳态结合水平(Steady state binding levels)

Rmax(RU)：分析物的表面结合能力(Analyte binding capacity of thesurface)

RI(RU)：试样中的体积折射率贡献(Bulk refractive index contribution inthe sample)

C(M)：分析物浓度(Analyte concentration)

KD(M)：平衡解离常数(Equilibrium dissociation constant)。

使用了上述(式3)的、Ca浓度为3μ mol/L时的各抗体与IL-6受体的解离常数KD的预测估算结果示于表33。表33中的Req、Rmax、RI、C是基于测定结果估计的值。

[表33]

抗体	H54/L28-IgG1	FH4-IgG1	6RL#9-IgG1
				Req(RU)		5	10
Rmax(RU)		39	72
				RI(RU)		0	0
C(M)		5E-06	5E-06
				KD(M)	2.2E-9	3.4E-05	3.1E-05

由上述结果预测：对于FH4-IgG1抗体和6RL#9-IgG1抗体，通过将缓冲液中的CaCl₂浓度从2mM减少至3μM，对IL-6受体的KD将分别提高约60倍、约120倍(亲和性降低60倍、120倍以上)。

表34中概括了H54/L28-IgG1、FH4-IgG1、6RL#9-IgG1这3种抗体在2mM CaCl₂存在下和3μM CaCl₂存在下的KD值、和KD值的Ca依赖性。

[表34]

抗体	H54/L28-IgG1	FH4-IgG1	6RL#9-IgG1
				KD(M)(2mM CaCl₂)	1.9E-9	5.9E-7	2.6E-7
KD(M)(3μM CaCl₂)	2.2E-9	3.4E-5以上	3.1E-5以上
				Ca依赖性	约1倍	约60倍以上	约120倍以上

未观察到Ca浓度的不同所致的H54/L28-IgG1抗体对IL-6受体的结合的不同。另一方面，在低浓度的Ca条件下，观察到FH4-IgG1抗体和6RL#9-IgG1抗体对IL-6受体的结合的显著减弱(表34)

(参考实施例7)所得抗体的钙离子结合评价

接着，作为抗体的钙离子结合的评价指标，通过差示扫描型热量测定(DSC)测定了热变性中间温度(Tm值)(MicroCal VP-Capillary DSC、MicroCal)。热变性中间温度(Tm值)是稳定性的指标，通过钙离子结合而使蛋白质稳定化时，热变性中间温度(Tm值)与未结合钙离子时相比变高(J.Biol.Chem.(2008)283,37,25140-25149)。通过评价对应于抗体溶液中钙离子浓度变化的抗体Tm值的变化，对抗体的钙离子结合活性进行评价。将经纯化的抗体用于以20mM Tris-HCl、150mM NaCl、2mM CaCl₂(pH7.4)或20mM Tris-HCl、150mM NaCl,3μM CaCl₂(pH7.4)的溶液作为外部溶液的透析(EasySEP、TOMY)处理。将使用可用于透析的溶液制备为大致0.1mg/mL的抗体溶液作为被测物质，从20℃至115℃以240℃/小时的升温速度进行DSC测定。基于所得DSC的变性曲线，计算各抗体的Fab结构域的热变性中间温度(Tm值)，将其示于表35。

[表35]

由表35的结果表明：显示钙依赖性结合能力的FH4-IgG1抗体和6RL#9-IgG1抗体的Fab的Tm值随钙离子浓度变化而变化，未显示钙依赖性结合能力的H54/L28-IgG1抗体的Fab的Tm值不随钙离子浓度变化而变化。FH4-IgG1抗体和6RL#9-IgG1抗体的Fab的Tm值的改变表明：钙离子与这些抗体结合，Fab部分发生稳定化。上述结果表明，钙离子与FH4-IgG1抗体和6RL#9-IgG1抗体结合，而H54/L28-IgG1抗体未与钙离子结合。

(参考实施例8)通过X射线晶体结构分析鉴定6RL#9抗体的钙离子结合位点

(8-1)X射线晶体结构分析

如参考实施例7所示，热变性温度Tm值的测定暗示了6RL#9抗体与钙离子结合。但是，6RL#9抗体的哪个位点与钙离子结合却无法预测，因而通过使用X射线晶体结构分析的方法来确定与钙离子相互作用的6RL#9抗体的序列中的残基。

(8-2)6RL#9抗体的表达和纯化

对用于X射线晶体结构分析而表达的6RL#9抗体进行纯化。具体而言，将以可以分别表达6RL#9抗体的重链(SEQ ID NO:44)和轻链(SEQ ID NO:45)的方式制备的动物表达用质粒瞬时地导入动物细胞。在以最终细胞密度为1×10⁶细胞/mL的方式悬浮于FreeStyle293Expression Medium培养基(Invitrogen)中的800mL来源于人胎儿肾细胞的FreeStyle293-F细胞株(Invitrogen)中，通过脂质转染法导入制备的质粒。将导入了质粒的细胞在CO₂培养箱(37℃、8％CO₂、90rpm)中培养5天。根据使用了rProtein ASepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)的本领域技术人员公知的方法，从如上所述得到的培养上清中纯化抗体。使用分光光度计测定纯化的抗体溶液在280nm下的吸光度。通过PACE法算出吸光系数，使用该吸光系数由测定值计算抗体浓度(ProteinScience(1995)4,2411-2423)。

(8-3)从6RL#9抗体纯化Fab片段

使用分子量截留大小为10000MWCO的超滤膜，将6RL#9抗体浓缩至21mg/mL。使用L-Cystein4mM、EDTA5mM、20mM磷酸钠缓冲液(pH6.5)，制备稀释至5mg/mL的2.5mL的该抗体的试样。加入0.125mg的木瓜蛋白酶(Roche Applied Science)，将进行了搅拌的该试样在35℃静置2小时。静置后，进一步向该试样加入溶解有Protease Inhibitor Cocktail Mini、不含EDTA(Roche Applied Science)1片的10mL的25mM MES缓冲液(pH6)，在冰中静置，由此终止木瓜蛋白酶的蛋白酶反应。接着，将该试样添加至用25mM MES缓冲液pH6进行了平衡的1mL大小的阳离子交换柱HiTrap SPHP(GE Healthcare)，该阳离子交换柱在下游串联连接有1mL大小的蛋白A载体柱HiTrap MabSelect Sure(GE Healthcare)。通过在同一缓冲液中线性地使NaCl浓度提高至300mM进行洗脱，可得到6RL#9抗体的Fab片段的纯化流分。接着，将所得纯化流分通过5000MWCO的超滤膜浓缩至0.8mL左右。向用含有50mM NaCl的100mM HEPES缓冲液(pH8)进行了平衡的凝胶过滤柱Superdex20010/300GL(GE Healthcare)中添加浓缩液。结晶用的纯化6RL#9抗体的Fab片段使用相同缓冲液从柱上洗脱。应予说明，上述全部柱操作均在6至7.5℃的低温下实施。

(8-4)6RL#9抗体的Fab片段在Ca存在下的结晶

预先在常规条件设定下得到6RL#9Fab片段的晶种。接着，将以达到5mM的方式加入有CaCl₂的纯化6RL#9抗体的Fab片段使用5000MWCO的超滤膜浓缩至12mg/mL。接着，通过悬滴蒸汽扩散法，实施如前所述浓缩的试样的结晶。作为贮液，使用含有20-29％的PEG4000的100mM HEPES缓冲液(pH7.5)。在载玻片上，相对于0.8μl的贮液和0.8μl的前述浓缩试样的混合液，加入在含有29％PEG4000和5mM CaCl₂的100mM HEPES缓冲液(pH7.5)中进行了破碎的前述晶种被稀释到100-10000倍的稀释系列溶液0.2μl，由此制备晶滴(crystallization drop)。将该晶滴在20℃静置2天至3天，对由此得到的薄板状的结晶测定X射线衍射数据。

(8-5)6RL#9抗体的Fab片段在Ca不存在下的结晶

纯化6RL#9抗体的Fab片段使用5000MWCO的超滤膜浓缩至15mg/ml。接着，通过悬滴蒸汽扩散法，实施如前所述浓缩的试样的结晶。作为贮液，使用含有18-25％的PEG4000的100mM HEPES缓冲液(pH7.5)。在载玻片上，相对于0.8μl的贮液和0.8μl的前述浓缩试样的混合液，加入在含有25％PEG4000的100mM HEPES缓冲液(pH7.5)中进行了破碎的在Ca存在下所得的6RL#9抗体的Fab片段的结晶被稀释至100-10000倍的稀释系列溶液0.2μl，由此制备晶滴。将该晶滴在20℃静置2天至3天，对由此得到的薄板状的结晶测定X射线衍射数据。

(8-6)6RL#9抗体的Fab片段在Ca存在下的结晶的X射线衍射数据的测定

将浸渍于含有35％PEG4000和5mM CaCl₂的100mM HEPES缓冲液(pH7.5)溶液中的6RL#9抗体的Fab片段的在Ca存在下所得的一个单晶，通过使用带有微小尼龙环的针除去外部溶液，由此将该单晶在液氮中冷冻。使用高能加速器研究机构的放射光线设施Photon Factory的光束线BL-17A，测定前述冷冻结晶的X射线衍射数据。应予说明，测定中通过时常将冷冻结晶置于-178℃的氮气流中而维持冷冻状态。使用安装于光束线上的CCD探测器Quantum315r(ADSC)，将结晶以每次1°进行旋转的同时，收集总计180幅衍射图像。晶格常数的确定、衍射斑索引编辑(diffraction spot indexing)和衍射数据的处理通过程序Xia2(CCP4Software Suite)、XDSPackage(Walfgang Kabsch)以及Scala(CCP4Software Suite)来进行。最终得到直至分辨率的衍射强度数据。本结晶属于空间群P212121，晶格常数α＝90°、β＝90°、γ＝90°。

(8-7)6RL#9抗体的Fab片段在Ca不存在下的结晶的X射线衍射数据的测定

将浸渍于含有35％PEG4000的100mM HEPES缓冲液(pH7.5)的溶液中的、6RL#9抗体的Fab片段的在Ca不存在下得到的一个单晶，使用带有微小尼龙环的针除去外部溶液，从而将该单晶在液氮中冷冻。使用高能量加速器研究机构的放射光线设施Photon Factory的光束线BL-5A，测定前述冷冻结晶的X射线衍射数据。应予说明，测定中通过时常将冷冻结晶置于-178℃的氮气流中而维持冷冻状态。使用安装于光束线上的CCD探测器Quantum210r(ADSC)，将结晶以每次1°进行旋转的同时，收集总计180幅衍射图像。晶格常数的确定、衍射斑索引编辑和衍射数据的处理通过程序Xia2(CCP4Software Suite)、XDS Package(Walfgang Kabsch)以及Scala(CCP4Software Suite)来进行。最终得到直至分辨率的衍射强度数据。本结晶属于空间群P212121，晶格常数α＝90°、β＝90°、γ＝90°，与Ca存在下的结晶是同型。

(8-8)6RL#9抗体的Fab片段在Ca存在下的结晶的结构分析

通过使用程序Phaser(CCP4Software Suite)的分子置换法，确定6RL#9抗体的Fab片段在Ca存在下的结晶的结构。基于所得晶格的大小和6RL#9抗体的Fab片段的分子量，预测非对称单元中的分子数目是一个。基于一级序列上的同源性，将从PDB码:1ZA6的结构坐标中取出的A链112-220位和B链116-218位的氨基酸残基部分作为CL和CH1区的考察用模型分子。接着，将从PDB码:1ZA6的结构坐标中取出的B链1-115位的氨基酸残基部分作为VH区的考察用模型分子。最后，将从PDB码2A9M的结构坐标中取出的轻链3-147位的氨基酸残基作为VL区的考察用模型分子。按照该顺序，由旋转函数和平移函数确定各考察用模型分子的晶格内的取向和位置，由此得到6RL#9抗体的Fab片段的初期结构模型。通过进行相对于该初期结构模型使VH、VL、CH1、CL的各结构域运动的刚体精修(rigidbody refinement)，相对于的反射数据的晶体学可信度因子R值为46.9％、自由R值为48.6％。进而，通过使用程序Refmac5(CCP4Software Suite)的结构精修、和参照以使用实验性确定的结构因子Fo和由模型计算得到的结构因子Fc和相位计算得到的2Fo-Fc、Fo-Fc为系数的电子密度图的同时重复模型修正而在程序Coot(Paul Emsley)上进行，由此进行模型的精修。最后，基于以2Fo-Fc、Fo-Fc为系数的电子密度图，将Ca离子和水分子整合至模型中，由此使用程序Refmac5(CCP4Software Suite)进行精修。通过使用分辨率的21020个反射数据，最终相对于3440个原子的模型的晶体学可信度因子R值为20.0％、自由R值为27.9％。

(8-9)6RL#9抗体的Fab片段在Ca不存在下的结晶的X射线衍射数据的测定

6RL#9抗体的Fab片段在Ca不存在下的结晶的结构使用作为同型的Ca存在下结晶的结构来确定。从6RL#9抗体的Fab片段在Ca存在下的结晶的结构坐标中除去水分子和Ca离子分子，进行使VH、VL、CH1、CL的各结构域运动的刚体精修。相对于的反射数据的晶体学可信度因子R值为30.3％、自由R值为31.7％。进而，通过使用程序Refmac5(CCP4Software Suite)的结构精修、和参照以使用实验性确定的结构因子Fo和由模型计算得到的结构因子Fc和相位计算得到的2Fo-Fc、Fo-Fc为系数的电子密度图的同时重复模型修正而在程序Coot(Paul Emsley)上进行，由此进行模型的精修。最后，基于以2Fo-Fc、Fo-Fc为系数的电子密度图，将水分子整合至模型中，由此使用程序Refmac5(CCP4Software Suite)进行精修。通过使用分辨率的18357个反射数据，最终相对于3351个原子的模型的晶体学可信度因子R值为20.9％、自由R值为27.7％。

(8-10)6RL#9抗体的Fab片段在Ca存在或不存在下的结晶的X射线衍射数据的比较

对6RL#9抗体的Fab片段在Ca存在下的结晶和Ca不存在下的结晶的结构进行比较时，在重链CDR3观察到大的变化。通过X射线晶体结构分析确定的6RL#9抗体的Fab片段的重链CDR3的结构示于图49。具体而言，在Ca存在下的6RL#9抗体的Fab片段的结晶中，重链CDR3环部分的中心部分存在有钙离子。认为钙离子与重链CDR3的95位、96位和100a位(Kabat编号)发生相互作用。认为在Ca存在下，对于与抗原结合重要的重链CDR3环通过与钙结合而稳定化，成为最适于与抗原结合的结构。钙与抗体的重链CDR3结合的实例迄今尚未有报道，钙与抗体的重链CDR3结合的结构是新结构。

由6RL#9抗体的Fab片段的结构表明的存在于重链CDR3中的钙结合模体，能够成为获得本发明的抗原结合分子中所含的随离子浓度而与抗原结合的抗原结合结构域时所使用的Ca文库的设计的新要素。在后述的参考实施例18和19中，尽管在轻链可变区导入有钙结合模体，但是，例如，可考虑含有6RL#9抗体的重链CDR3、且在包括轻链的其它CDR中含有柔性残基的文库。

(参考实施例9)使用噬菌体展示技术从人抗体文库获得Ca依赖性地与IL-6结合的抗体

(9-1)天然人抗体噬菌体展示文库的制作

(9-2)通过珠淘选从文库获得Ca依赖性地与抗原结合的抗体片段

从构建的天然人抗体噬菌体展示文库的最初的挑选如下实施：仅浓缩对抗原(IL-6)具有结合能力的抗体片段。抗原使用生物素标记的IL-6。

由携带有构建的噬菌体展示用噬粒的大肠杆菌进行了噬菌体产生。在进行了噬菌体产生的大肠杆菌的培养液中添加2.5MNaCl/10％PEG，并将由此沉淀的噬菌体的群体用TBS稀释，从而得到噬菌体文库液。接着，向噬菌体文库液中添加BSA和CaCl₂以使终浓度为4％BSA和1.2mM钙离子浓度。作为淘选方法，参考了作为常规方法的使用固定化于磁珠的抗原的淘选方法(J.Immunol.Methods.(2008)332(1-2),2-9、J.Immunol.Methods.(2001)247(1-2),191-203、Biotechnol.Prog.(2002)18(2)212-20、Mol.CellProteomics(2003)2(2),61-9)。作为磁珠，使用涂布有中和亲和素的珠(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或涂布有链霉亲和素的珠(DynabeadsM-280Streptavidin)。

具体而言，制备的噬菌体文库液中加入250pmol的生物素标记抗原，由此使该噬菌体文库液在室温与抗原接触60分钟。加入用BSA封闭的磁珠，使抗原和噬菌体的复合体与磁珠在室温下结合15分钟。珠用1.2mMCaCl₂/TBST(含有1.2mM CaCl₂的TBST)洗涤3次后，进一步用1mL的1.2mM CaCl₂/TBS(含有1.2mM CaCl₂的TBS)洗涤2次。然后，加入有0.5mL的1mg/mL胰蛋白酶的珠在室温下悬浮15分钟后，立即使用磁力架将珠分离，回收噬菌体溶液。所回收的噬菌体溶液添加至对数生长期(OD600为0.4-0.7)的10mL大肠杆菌菌株TG1中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225mm×225mm的板上。接着，从接种的大肠杆菌的培养液中回收噬菌体，由此制备噬菌体文库液。

第2次以后的淘选中，以Ca依赖性结合能力为指标进行噬菌体的浓缩。具体而言，在制备的噬菌体文库液中加入40pmol的生物素标记抗原，由此使噬菌体文库在室温与抗原接触60分钟。加入用BSA封闭的磁珠，使抗原和噬菌体的复合体与磁珠在室温结合15分钟。将珠用1mL的1.2mMCaCl₂/TBST与1.2mM CaCl₂/TBS洗涤。然后将加入有0.1mL的2mMEDTA/TBS的珠在室温悬浮后，立即使用磁力架将珠分离，回收噬菌体溶液。回收的噬菌体溶液中加入100mg/mL胰蛋白酶5μL，由此将未展示Fab的噬菌体的pIII蛋白质(来源于辅助噬菌体的pIII蛋白质)切断，使未展示Fab的噬菌体丧失对大肠杆菌的感染能力。从经胰蛋白酶処理的噬菌体溶液回收的噬菌体添加至对数生长期(OD600为0.4-0.7)的10mL大肠杆菌菌株TG1中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225mm×225mm的板上。接着，从接种的大肠杆菌的培养液中回收噬菌体，由此回收噬菌体文库液。以Ca依赖性结合能力为指标的淘选重复3次。

(9-3)基于噬菌体ELISA的评价

通过由上述的方法得到的大肠杆菌的单克隆，按照常法(Methods Mol.Biol.(2002)178,133-145)，回收含有噬菌体的培养上清。

含有以终浓度4％BSA和1.2mM钙离子浓度的方式加入有BSA和CaCl₂的噬菌体的培养上清通过以下步骤进行ELISA。将StreptaWell96微量滴定板(Roche)用含有生物素标记抗原的100μL的PBS包被一夜。将该板的各孔用PBST洗涤从而除去抗原后，将该孔用250μL的4％BSA-TBS进行1小时以上的封闭。在除去了4％BSA-TBS的各孔中，加入制备的培养上清，将该板在37℃静置1小时，由此使噬菌体展示抗体与各孔中存在的抗原结合。在用1.2mM CaCl₂/TBST进行了洗涤的各孔中，加入1.2mM CaCl₂/TBS或1mM EDTA/TBS，将该板在37℃静置30分钟，进行孵育。在用1.2mMCaCl₂/TBST进行洗涤后，将通过终浓度4％的BSA和离子化钙浓度为1.2mM的TBS进行了稀释的HRP结合抗M13抗体(Amersham PharmaciaBiotech)添加至各孔中，将板孵育1小时。用1.2mM CaCl₂/TBST洗涤后，添加TMB single溶液(ZYMED)，各孔中的溶液的显色反应通过添加硫酸而停止后，通过450nm的吸光度测定该显色。

使用分离的96个克隆进行噬菌体ELISA，由此得到对IL-6具有Ca依赖性结合能力的6KC4-1#85抗体。作为上述噬菌体ELISA的结果，将被判断具有Ca依赖性抗原结合能力的抗体片段作为模板，利用特异性引物进行扩增，并对所扩增的基因的碱基序列进行分析。6KC4-1#85抗体的重链可变区的序列记载于SEQ ID NO:10，轻链可变区的序列记载于SEQ ID NO:48。编码6KC4-1#85抗体的重链可变区(SEQ ID NO:10)的多核苷酸通过PCR法，与编码来源于IgG1的序列的多核苷酸连接，将连接得到的DNA片段整合至动物细胞表达用载体中，构建表达SEQ ID NO:49所示重链的载体。编码6KC4-1#85抗体的轻链可变区(SEQ ID NO:48)的多核苷酸通过PCR法，与编码天然型κ链的恒定区(SEQ ID NO:50)的多核苷酸连接，将所得DNA片段整合至动物细胞表达用载体中。制作的改变体的序列通过本领域技术人员公知的方法确认。制作的改变体的序列通过本领域技术人员公知的方法确认。

(9-4)抗体的表达和纯化

将噬菌体ELISA的结果判断为对抗原具有Ca依赖性结合能力的克隆6KC4-1#85导入动物细胞表达用质粒中。抗体的表达使用以下的方法进行。将来源于人胎儿肾细胞的FreeStyle293-F细胞株(Invitrogen)悬浮于FreeStyle293Expression Medium培养基(Invitrogen)中，以1.33×10⁶细胞/mL的细胞密度向6孔板的各孔中各接种3mL。将制备的质粒通过脂质转染法导入细胞。在CO₂培养箱(37度、8％CO₂、90rpm)中进行4天培养。使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)，用本领域技术人员公知的方法从上述中所得培养上清中纯化抗体。使用分光光度计测定纯化的抗体溶液在280nm下的吸光度。通过PACE法算出吸光系数，使用该吸光系数由所得测定值计算抗体浓度(Protein Science(1995)4,2411-2423)。

(参考实施例10)6KC4-1#85抗体的钙离子结合评价

评价从人抗体文库获得的钙依赖性抗原结合抗体6KC4-1#85抗体是否与钙结合。在离子化钙浓度不同的条件下，测定的Tm值是否发生变化按照参考实施例7中所述的方法来评价。

6KC4-1#85抗体的Fab结构域的Tm值示于表36。如表36所示，6KC4-1#85抗体的Fab结构域的Tm值随钙离子浓度而变化，因而可知6KC4-1#85抗体与钙结合。

[表36]

(参考实施例11)6KC4-1#85抗体的钙离子结合位点的鉴定

如参考实施例10所示，显示了6KC4-1#85抗体与钙离子结合，但6KC4-1#85不具有由hVk5-2序列的研究所明确的钙结合模体。因此，为了确认钙离子是与6KC4-1#85抗体的重链结合、与轻链结合、还是与二者结合，对于和不与钙离子结合的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体(重链序列GC_H(SEQ ID NO:51)、轻链序列GC_L(SEQ ID NO:52))的重链和轻链分别交换的改变抗体，评价了钙离子的结合。按照参考实施例7所示的方法测定的改变抗体的Tm值示于表37。其结果，具有6KC4-1#85抗体的重链的改变抗体的Tm值随钙离子浓度而变化，因此考虑以6KC4-1#85抗体的重链与钙结合。

[表37]

因此，为了进一步鉴定6KC4-1#85抗体的重链的哪个残基与钙离子进行结合，将存在于6KC4-1#85抗体的CDR中的Asp(D)残基取代成无法参与钙离子的结合或螯合的Ala(A)残基，制得改变重链(6_H1-11(SEQ ID NO:53)、6_H1-12(SEQ ID NO:54)、6_H1-13(SEQ ID NO:55)、6_H1-14(SEQ IDNO:56)、6_H1-15(SEQ ID NO:57))或改变轻链(6_L1-5(SEQ ID NO:58)和6_L1-6(SEQ ID NO:59))。从导入了含有改变抗体基因的表达载体的动物细胞的培养液中，按照参考实施例9所述的方法纯化改变抗体。所纯化的改变抗体的钙结合按照参考实施例7所述的方法进行测定。测定结果示于表38。如表38所示，通过将6KC4-1#85抗体的重链CDR3的95位或101位(Kabat编号)取代成Ala残基，6KC4-1#85抗体丧失钙结合能力，因而认为该残基对于和钙结合是重要的。由6KC4-1#85抗体的改变抗体的钙结合性所表明的6KC4-1#85抗体的重链CDR3的环根部附近存在的钙结合模体能够成为获得本发明的抗原结合分子中所含的随离子浓度与抗原结合的抗原结合结合域时所使用的Ca文库的设计的新要素。在后述的参考实施例18和19中，尽管在轻链可变区中导入有钙结合模体，但可考虑例如含有6KC4-1#85抗体的重链CDR3、且在含有轻链的其它CDR中含有柔性残基的文库。

[表38]

(参考实施例12)使用正常小鼠的Ca依赖性结合抗体对抗原的血浆中滞留性的影响的评价

(12-1)使用正常小鼠的体内试验

对于正常小鼠(C57BL/6J小鼠、Charles River Japan)，单独给予hsIL-6R(可溶型人IL-6受体：参考实施例3中制作)或同时给予hsIL-6R和抗人IL-6受体抗体，然后评价hsIL-6R和抗人IL-6受体抗体的体内动力学。将hsIL-6R溶液(5μg/mL)或者hsIL-6R与抗人IL-6受体抗体的混合溶液自尾静脉以10mL/kg单次给予。作为抗人IL-6受体抗体，使用前述的H54/L28-IgG1、6RL#9-IgG1、FH4-IgG1。

混合溶液中的可溶型hsIL-6R浓度均为5μg/mL，但抗人IL-6受体抗体浓度根据每个抗体而不同，H54/L28-IgG1为0.1mg/mL、6RL#9-IgG1和FH4-IgG1为10mg/mL，此时，相对于hsIL-6R，由于抗人IL-6受体抗体充分量或过量地存在，因而认为hsIL-6R大部分与抗体结合。在给予后15分钟、7小时、1天、2天、4天、7天、14天、21天、28天时进行采血。将采集的血液立即在4℃、12000rpm下进行15分钟离心，由此得到血浆。分离的血浆直至实施测定为止，保存在设定为-20℃以下的冰箱中。

(12-2)通过ELISA法测定正常小鼠血浆中的抗人IL-6受体抗体浓度

小鼠血浆中的抗人IL-6受体抗体浓度通过ELISA法测定。首先，将抗人IgG(γ-链特异性)F(ab')2抗体片段(SIGMA)分配于Nunc-Immuno Plate,MaxiSoup(Nalge nunc International)，在4℃静置一夜，由此制作抗人IgG固定化板。将血浆中浓度为0.64、0.32、0.16、0.08、0.04、0.02、0.01μg/mL的校准曲线试样和经100倍以上稀释的小鼠血浆测定试样各自分配于抗人IgG固定化板中，将该板在25℃孵育1小时。然后，与生物素化抗人IL-6R抗体(R&D)在25℃反应1小时后，与链霉亲和素-PolyHRP80(StereospecificDetection Technologies)在25℃反应0.5小时。使用TMB One Component HRPMicrowell Substrate(BioFX Laboratories)作为底物，进行显色反应。通过1N-硫酸(Showa Chemical)将显色反应终止后，使用酶标仪测定显色液在450nm下的吸光度。使用分析软件SOFTmax PRO(Molecular Devices)，以校准曲线的吸光度为基准，算出小鼠血浆中浓度。通过该方法测定的静脉内给予后的正常小鼠中的H54/L28-IgG1、6RL#9-IgG1、FH4-IgG1的血浆中抗体浓度的变化示于图50。

(12-3)通过电化学发光法测定血浆中的hsIL-6R浓度

小鼠的血浆中hsIL-6R浓度通过电化学发光法测定。将调整为2000、1000、500、250、125、62.5、31.25pg/mL的hsIL-6R校准曲线试样和经50倍以上稀释的小鼠血浆测定试样、与用SULFO-TAG NHS Ester(Meso ScaleDiscovery)进行了钌标记的单克隆抗人IL-6R抗体(R&D)和生物素化抗人IL-6R抗体(R&D)以及托珠单抗(重链SEQ ID NO:60、轻链SEQ ID NO:61)溶液的混合液在4℃下反应一夜。为了使样品中的游离Ca浓度降低，使样品中基本全部的hsIL-6R从6RL#9-IgG1或FH4-IgG1解离，并成为与添加的托珠单抗结合的状态，此时的试验缓冲液中含有10mM EDTA。然后，将该反应液分配于MA400PR链霉亲和素板(Meso Scale Discovery)中。进而将在25℃反应1小时的板的各孔洗涤后，在各孔中分配读数缓冲液T(×4)(Meso Scale Discovery)。立即使用SECTOR PR400reader(Meso ScaleDiscovery)对反应液进行测定。hsIL-6R浓度是使用分析软件SOFTmaxPRO(Molecular Devices)，根据校准曲线的响应算出。通过前述方法测定的静脉内给予后的正常小鼠中的血浆中hsIL-6R的浓度变化示于图51。

其结果，hsIL-6R单独给予显示出非常快的消除，与之相对，同时给予与hsIL-6R不存在Ca依赖性结合的普通抗体H54/L28-IgG1时，hsIL-6R的消除大幅变慢。与之相对，同时给予与hsIL-6R具有100倍以上的Ca依赖性结合的6RL#9-IgG1或FH4-IgG1时，hsIL-6R的消除大幅加速。与同时给予H54/L28-IgG1时相比，同时给予6RL#9-IgG1和FH4-IgG1的情形中，一天后的血浆中的hsIL-6R浓度分别降低39倍和2倍。由此确认到：钙依赖性结合抗体可以加速抗原从血浆中的消除。

(参考实施例13)与钙离子结合的人种系序列的考察

(13-1)钙依赖性地与抗原结合的抗体

钙依赖性地与抗原结合的抗体(钙依赖性抗原结合抗体)是随钙浓度而改变与抗原的相互作用的抗体。由于认为钙依赖性抗原结合抗体是经由钙离子与抗原结合，因而形成抗原侧的表位的氨基酸是：能够螯合钙离子的带负电荷的氨基酸或能够成为氢键受体的氨基酸。根据这种形成表位的氨基酸的性质，变得可以靶向通过导入组氨酸而制作的pH依赖性地与抗原结合的结合分子以外的表位。并且，认为通过使用兼具钙依赖性和pH依赖性抗原结合性质的抗原结合分子，可以制作能够分别靶向具有广阔性质的各种表位的抗原结合分子。因此认为，只要构建含有钙结合模体的分子的集合(Ca文库)、并由该分子的群体获得抗原结合分子，则可有效地获得钙依赖性抗原结合抗体。

(13-2)人种系序列的获得

作为含有钙结合模体的分子的集合的实例，可考虑该分子为抗体的实例。换言之，可考虑含有钙结合模体的抗体文库为Ca文库的情形。

迄今为止尚未报道用含有人种系序列的抗体与钙离子结合。因此，为了判断含有人种系序列的抗体是否与钙离子结合，以由Human Fetal SpleenPoly RNA(Clontech)制备的cDNA为模板，克隆了含有人种系序列的抗体的种系序列。将克隆的DNA片段插入动物细胞表达载体。所得表达载体的碱基序列通过本领域技术人员公知的方法确定，其序列编号示于表39。编码SEQ ID NO:5(Vk1)、SEQ ID NO:6(Vk2)、SEQ ID NO:7(Vk3)、SEQ ID NO:8(Vk4)以及SEQ ID NO:62(Vk5-2)的多核苷酸通过PCR法，与编码天然型κ链的恒定区(SEQ ID NO:50)的多核苷酸连接，将连接得到的DNA片段整合至动物细胞表达用载体中。此外，编码SEQ ID NO:63(Vk1)、SEQ ID NO:64(Vk2)、SEQ ID NO:65(Vk3)以及SEQ ID NO:66(Vk4)的重链可变区的多核苷酸，通过PCR法与编码(天然型序列的C末端2氨基酸缺失)SEQ ID NO:163所示的IgG1的多核苷酸连接，将连接得到的DNA片段整合至动物细胞表达用载体中。制作的改变体的序列通过本领域技术人员公知的方法确认。

[表39]

轻链种系序列	重链(可变区)序列编号	轻链可变区序列编号
			Vk1	63	5
Vk2	64	6
			Vk3	65	7
Vk4	66	8
			Vk5	67	62

(13-3)抗体的表达和纯化

将获得的5种的插入了含有人种系序列的DNA片段的动物细胞表达载体导入动物细胞。抗体的表达使用以下的方法进行。将来源于人胎儿肾细胞的FreeStyle293-F细胞株(Invitrogen)悬浮于FreeStyle293ExpressionMedium培养基(Invitrogen)中，以1.33×10⁶细胞/mL的细胞密度向6孔板的各孔中各接种3mL。将制备的质粒通过脂质转染法导入细胞。在CO₂培养箱(37度、8％CO₂、90rpm)中进行4天培养。使用rProtein A SepharoseTM FastFlow(Amersham Biosciences)，用本领域技术人员公知的方法从上述中所得培养上清中纯化抗体。使用分光光度计测定纯化的抗体溶液在280nm下的吸光度。通过PACE法算出吸光系数，使用该吸光系数由所得测定值计算抗体浓度(ProteinScience(1995)4,2411-2423)。

(13-4)含有人种系序列的抗体的钙离子结合活性的评价

对纯化的抗体的钙离子结合活性进行评价。作为评价钙离子对抗体的结合的指标，通过差示扫描型热量测定(DSC)测定了热变性中间温度(Tm值)(MicroCal VP-Capillary DSC、MicroCal)。热变性中间温度(Tm值)是稳定性的指标，通过钙离子结合而使蛋白质稳定化时，热变性中间温度(Tm值)与未结合钙离子时相比变高(J.Biol.Chem.(2008)283,37,25140-25149)。通过评价对应于抗体溶液中钙离子浓度变化的抗体Tm值的变化，对抗体的钙离子结合活性进行评价。将经纯化的抗体进行以20mM Tris-HCl、150mMNaCl、2mM CaCl₂(pH7.4)或20mM Tris-HCl、150mM NaCl,3μMCaCl₂(pH7.4)的溶液作为外部溶液的透析(EasySEP、TOMY)处理。将使用可用于透析的溶液制备为大致0.1mg/mL的抗体溶液作为被测物质，从20℃至115℃以240℃/小时的升温速度进行DSC测定。基于所得DSC的变性曲线，计算各抗体的Fab结构域的热变性中间温度(Tm值)，将其示于表40。

[表40]

其结果，含有hVk1、hVk2、hVk3、hVk4序列的抗体的Fab结构域的Tm值不随含有该Fab结构域的溶液中的钙离子浓度而变化。而含有hVk5序列的抗体的Fab结构域的Tm值却随含有该Fab结构域的抗体溶液中的钙离子浓度而变化，因此表明hVk5序列与钙离子结合。

(13-5)hVk5-2序列的钙结合评价

在参考实施例5的(5-2)中，除了Vk5-2(SEQ ID NO: 4)之外，得到了分类为Vk5-2的Vk5-2变体1(SEQ ID NO: 68)和Vk5-2变体2(SEQ ID NO: 69)。对这些变体也进行了钙结合评价。Vk5-2、Vk5-2变体1和Vk5-2变体2的DNA片段分别被整合到动物细胞用表达载体中。所得表达载体的碱基序列利用本领域技术人员公知的方法进行确定。分别整合有Vk5-2、Vk5-2变体1和Vk5-2变体2的DNA片段的动物细胞用表达载体，与按作为重链表达CIM_H(SEQ ID NO: 67)的方式整合得到的动物表达用载体一起，通过参考实施例12的(12-3)中记载的方法，一起导入到动物细胞中，纯化抗体。评价所纯化的抗体的钙离子结合活性。将所纯化的抗体进行以20mMTris-HCl、150mM NaCl、2mM CaCl2(pH7.5)或20mM Tris-HCl、150mMNaCl(pH7.5)的溶液(表41中表示为钙离子浓度0mM)作为外部溶液的透析(EasySEP、TOMY)处理。将使用可用于透析的溶液制备成大致0.1mg/mL的抗体溶液作为被测物质，从20℃至115℃以240℃/小时的升温速度进行DSC测定。基于所得DSC的変性曲线，算出的各抗体的Fab结构域的热变性中间温度(Tm值)示于表41。

[表41]

其结果，含有Vk5-2、Vk5-2变体1和Vk5-2变体2的序列的抗体的Fab结构域的Tm值，随含有该Fab结构域的抗体溶液中的钙离子浓度而变化，因此显示出：具有分类为Vk5-2的序列的抗体与钙离子结合。

(参考实施例14)人Vk5(hVk5)序列的评价

(14-1)hVk5序列

Kabat数据库中作为hVk5序列仅登录有hVk5-2序列。在本说明书中，hVk5和hVk5-2以同义地使用。WO2010/136598中，hVk5-2序列在种系序列中的存在比被记载为0.4％。在其它报道中，hVk5-2序列在种系序列中的存在比也记载为0～0.06％(J.Mol.Biol.(2000)296,57-86、Proc.Natl.Acad.Sci.(2009)106,48,20216-20221)。如上所述，hVk5-2序列是在种系序列中出现频率低的序列，因而认为从由人种系序列构成的抗体文库或从由对表达人抗体的小鼠进行免疫而得的B细胞来获得与钙结合的抗体是没有效率的。因此，虽然可考虑设计含有人hVk5-2序列的Ca文库的可能性，但被报道的合成抗体文库(WO2010/105256或WO2010/136598)中不含有hVk5-2序列。并且，hVk5-2序列的物性没有报道，其实现的可能性是未知的。

(14-2)糖链非添加型hVk5-2序列的构建、表达和纯化

hVk5-2序列具有在20位(Kabat编号)的氨基酸添加N型糖链的序列。蛋白质中添加的糖链存在异质性，因而从物质的均一性观点出发，期望不添加糖链。因此，制作将20位(Kabat编号)的Asn(N)残基取代成Thr(T)残基的改变体hVk5-2_L65(SEQ ID NO:70)。氨基酸的取代通过使用QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)的本领域技术人员公知的方法进行。将编码改变体hVk5-2_L65的DNA整合到动物表达用载体中。整合有所制作的改变体hVk5-2_L65的DNA的动物表达用载体，与按作为重链表达CIM_H(SEQ ID NO:67)的方式整合得到的动物表达用载体一起，通过参考实施例5中记载的方法，一同导入到动物细胞中。所导入的动物细胞中表达的含有hVk5-2_L65和CIM_H的抗体通过参考实施例13所述的方法进行纯化。

(14-3)含有糖链非添加型hVk5-2序列的抗体的物性评价

获得的含有改变序列hVk5-2_L65的抗体与含有改变之前的hVk5-2序列的抗体相比，其异质性减少与否使用离子交换层析法进行分析。离子交换层析法的方法示于表42。分析的结果显示出：如图52所示，糖链附加位点被改变的hVk5-2_L65，与原本的hVk5-2序列相比，异质性减少。

[表42]

接着，含有异质性减少的hVk5-2_L65序列的抗体与钙离子结合与否通过使用参考实施例13中记载的方法来评价。其结果，如表43所示，含有糖链附加位点被改变的hVk5-2_L65的抗体的Fab结构域的Tm值也随抗体溶液中的钙离子浓度变化而变化。即，表明含有糖链附加位点被改变的hVk5-2_L65的抗体的Fab结构域与钙离子结合。

[表43]

(参考实施例15)钙离子与含有hVk5-2序列的CDR序列的抗体分子的结合活性的评价

(15-1)含有hVk5-2序列的CDR序列的改变抗体的制作、表达和纯化

hVk5-2_L65序列是存在于人Vk5-2序列的框架中的糖链附加位点的氨基酸被改变了的序列。参考实施例14表明即使改变糖链附加位点也结合钙离子，但从免疫原性观点出发，通常期望框架序列是种系序列。因此，研究了是否可以在维持该抗体的钙离子结合活性的同时，将抗体的框架序列取代为不附加糖链的种系序列的框架序列。

编码化学合成的hVk5-2序列的框架序列被改变为hVk1、hVk2、hVk3和hVk4序列的序列(分别为CaVk1(SEQ ID NO:71)、CaVk2(SEQ ID NO:72)、CaVk3(SEQ ID NO:73)、CaVk4(SEQ ID NO:74)的多核苷酸通过PCR法，与编码天然型κ链的恒定区(SEQ ID NO:50)的多核苷酸连接，将连接得到的DNA片段整合至动物细胞表达用载体中。制作的改变体的序列通过本领域技术人员公知的方法确认。如上所述制作的各质粒、与整合有编码CIM_H(SEQ ID NO:67)的多核苷酸的质粒一起通过参考实施例13所述的方法导入到动物细胞中。从如上所述导入的动物细胞的培养液中纯化表达的所期望的抗体分子。

(15-2)含有hVk5-2序列的CDR序列的改变抗体的钙离子结合活性的评价

钙离子与含有hVk5-2序列以外的种系序列(hVk1、hVk2、hVk3、hVk4)的框架序列和hVk5-2序列的CDR序列的改变抗体结合与否，通过参考实施例5所述的方法进行评价。评价结果示于表44。表明各改变抗体的Fab结构域的Tm值随抗体溶液中的钙离子浓度变化而变化。所以，表明含有hVk5-2序列的框架序列以外的框架序列的抗体也与钙离子结合。

[表44]

进而，以含有hVk5-2序列以外的种系序列(hVk1、hVk2、hVk3、hVk4)的框架序列和hVk5-2序列的CDR序列的方式进行改变的各抗体的Fab结构域的热稳定性的指标，即热变性温度(Tm值)与含有改变前的hVk5-2序列的抗体的Fab结构域的Tm值相比，显示有所增加。由该结果发现：含有hVk1、hVk2、hVk3、hVk4的框架序列和hVk5-2序列的CDR序列的抗体不仅具有与钙离子结合的性质，而且在热稳定性的观点上也是优异的分子。

(参考实施例16)人种系hVk5-2序列中存在的钙离子结合位点的鉴定

(16-1)hVk5-2序列的CDR序列中的突变位点的设计

如参考实施例15所述，含有将hVk5-2序列的CDR部分导入其它种系的框架序列中而得的轻链的抗体也显示与钙离子结合。该结果暗示hVk5-2中存在的钙离子结合位点存在于CDR中。作为与钙离子结合、即、螯合钙离子的氨基酸，可举出带负电的氨基酸或能够成为氢键受体的氨基酸。因此，评价含有hVk5-2序列的CDR序列中存在的Asp(D)残基或Glu(E)残基被取代成Ala(A)残基的突变hVk5-2序列的抗体是否与钙离子结合。

(16-2)hVk5-2序列的Ala取代体的制作以及抗体的表达和纯化

制作含有轻链的抗体分子，该轻链中，hVk5-2序列的CDR序列中存在的Asp和/或Glu残基被改变为Ala残基。如参考实施例14所述，不添加糖链的改变体hVk5-2_L65维持了钙离子结合，因而从钙离子结合性的观点出发，认为与hVk5-2序列等同。本实施例中，以hVk5-2_L65为模板序列进行氨基酸取代。制作的改变体示于表45。氨基酸的取代通过QuikChangeSite-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)、PCR或In fusion Advantage PCRcloning kit(TAKARA)等本领域技术人员公知的方法来进行，构建氨基酸被取代的改变轻链的表达载体。

[表45]

轻链改变体名	改变位点(Kabat编号)	序列编号
			hVk5-2_L65	野生型	70
hVk5-2_L66	30	75
			hVk5-2_L67	31	76
hVk5-2_L68	32	77
			hVk5-2_L69	50	78
hVk5-2_L70	30，32	79
			hVk5-2_L71	30，50	80
hVk5-2_L72	30，32，50	81
			hVk5-2_L73	92	82

所得表达载体的碱基序列通过本领域技术人员公知的方法确定。将制得的改变轻链的表达载体，与重链CIM_H(SEQ ID NO：67)的表达载体一起瞬时地导入来源于人胎儿肾癌细胞的HEK293H细胞株(Invitrogen)或FreeStyle293细胞(Invitrogen)中，由此表达抗体。从所得培养上清中，使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(GE Healthcare)，通过本领域技术人员公知方法纯化出抗体。使用分光光度计，测定纯化得到的抗体溶液的280nm下的吸光度。通过PACE法算出吸光系数，使用该吸光系数由所得测定值计算抗体浓度(Protein Science(1995)4，2411-2423)。

(16-3)含有hVk5-2序列的Ala取代体的抗体的钙离子结合活性评价

所得纯化抗体是否与钙离子结合通过参考实施例13中记载的方法进行判定。其结果示于表46。通过将hVk5-2序列的CDR序列中存在的Asp或Glu残基取代成无法参与钙离子的结合或螯合的Ala残基，存在其Fab结构域的Tm值不会随抗体溶液的钙离子浓度变化而改变的抗体。Tm值不因Ala取代而变化的取代位点(32位和92位(Kabat编号))显示对于钙离子和抗体的结合特别重要。

[表46]

(参考实施例17)包含具有钙离子结合模体的hVk1序列的抗体的评价

(17-1)具有钙离子结合模体的hVk1序列的制作以及抗体的表达和纯化

参考实施例16中记载的Ala取代体的钙结合活性的结果表明，hVk5-2序列的CDR序列中，Asp或Glu残基对于钙结合是重要的。因此，评价仅将30位、31位、32位、50位和92位(Kabat编号)的残基导入其它种系的可变区序列是否也能够与钙离子结合。具体而言，将人种系序列hVk1序列的30位、31位、32位、50位和92位(Kabat编号)的残基取代为hVk5-2序列的30位、31位、32位、50位和92位(Kabat编号)的残基，制作改变体LfVk1_Ca(SEQ ID NO:83)。即，判断含有仅导入了hVk5-2序列中的上述5个残基的hVk1序列的抗体能否与钙结合。改变体制作与参考实施例16相同地进行。使所得轻链改变体LfVk1_Ca和含有轻链hVk1序列的LfVk1(SEQ ID NO:84)与重链CIM_H(SEQ ID NO:67)一起表达。抗体的表达和纯化通过与参考实施例16相同的方法实施。

(17-2)含有具有钙离子结合模体的人hVk1序列的抗体的钙离子结合活性的评价

如上所述得到的纯化抗体是否与钙离子结合通过参考实施例13所述的方法来判断。其结果示于表47。含有具有hVk1序列的LfVk1的抗体的Fab结构域的Tm值不随抗体溶液中的钙浓度变化而变化，而含有LfVk1_Ca的抗体序列的Tm值随抗体溶液中的钙浓度变化而变化1℃以上，因而表明含有LfVk1_Ca的抗体与钙结合。上述结果表明，钙离子的结合中，hVk5-2的全部CDR序列并不是必须的，仅构建LfVk1_Ca序列时导入的残基即足够。

[表47]

(17-3)分解抑制型LfVk1_Ca序列的构建、表达和纯化

在参考实施例17的(17-1)中制作了作为人种系序列的hVk1序列的30位、31位、32位、50位和92位(Kabat编号)的残基取代成hVk5-2序列的30位、31位、32位、50位和92位(Kabat编号)的残基的改变体LfVk1_Ca(SEQID NO:66)，显示出其与钙离子结合。因此，考虑设计含有LfVk1_Ca序列的Ca文库的可能性，但LfVk1_Ca序列的物性没有报道，该实现的可能性是未知的。LfVk1_Ca序列在30位、31位和32位(Kabat编号)存在Asp，被报道在酸性条件下分解的Asp-Asp序列存在于CDR1序列中(J.Pharm.Biomed.Anal.(2008)47(1),23-30)。从保存稳定性的角度考虑，优选避免在酸性条件下的分解。因此，制作了将具有分解可能性的Asp(D)残基取代成Ala(A)残基的改变体LfVk1_Ca1(SEQ ID NO:85)、LfVk1_Ca2(SEQ ID NO:86)和LfVk1_Ca3(SEQ ID NO:87)。氨基酸的取代通过使用QuikChangeSite-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)的本领域技术人员公知的方法进行。编码改变体的DNA被整合到动物表达用载体中。整合有所制作的改变体的DNA的动物表达用载体，与按作为重链表达GC_H(SEQ ID NO:51)的方式整合得到的动物表达用载体一起，通过参考实施例13中记载的方法，一同导入到动物细胞中。在所导入的动物细胞中表达的抗体通过参考实施例13中记载的方法进行纯化。

(17-4)含有分解抑制型LfVk1_Ca序列的抗体的稳定性评价

参考实施例17的(17-3)中获得的抗体，相比含有用于改变的原本LfVk1_Ca序列的抗体，在pH6.0溶液中的分解是否得以抑制可通过比较热加速后的各抗体的异质性进行评价。各抗体于20mM Histidine-HCl、150mMNaCl、pH6.0的溶液中在4℃条件下透析一夜。经透析的抗体制备成0.5mg/mL，在5℃或50℃下保存3天。保存后的各抗体通过参考实施例14中记载的方法进行离子交换层析。分析的结果如图53所示，显示出：分解位点得到改变的LfVk1_Ca1相比原本LfVk1_Ca序列，异质性减少，基于热加速的分解显著得以抑制。即，显示出存在于LfVk1_Ca序列中的30位的Asp(D)残基分解，且显示出通过氨基酸改变可以避免。

(17-5)轻链30位Asp残基分解抑制型LVk1_Ca序列的制作以及抗体的表达和纯化

根据参考实施例17的(17-4)中记载的Ala取代体的分解抑制的结果显示出：LfVk1_Ca序列的CDR序列之中30位(Kabat编号)的Asp(D)残基在酸性条件下分解，通过将30位(Kabat编号)取代成其它氨基酸((17-4)中，取代成Ala(A)残基)可以抑制分解。因此，对将30位(Kabat编号)的残基取代为能够螯合钙离子的残基的代表的Ser(S)残基的序列(称为LfVk1_Ca6。SEQID NO:88)，也评价了分解是否被抑制。改变体的制作与参考实施例9同样地进行。使所得的轻链改变体LfVk1_Ca6和轻链LfVk1_Ca序列与重链GC_H(SEQ ID NO:51)一同表达。抗体的表达和纯化通过与参考实施例16同样的方法进行实施。

(17-6)轻链30位Asp残基分解抑制型LVk1_Ca序列的评价

如上所述获得的纯化抗体在酸性条件下的保存稳定性通过参考实施例17的(17-4)中记载的方法进行判定。其结果，如图54所示，显示出：含有LfVk1_Ca6序列的抗体，相比含有原本LfVk1_Ca序列的抗体，分解得以抑制。

进而，通过参考实施例13中记载的方法判定了含有LfVk1_Ca序列的抗体和含有LfVk1_Ca6序列的抗体是否与钙离子结合。其结果示于表48。含有LfVk1_Ca序列的抗体和含有作为分解抑制型的LfVk1_Ca6序列的抗体的Fab结构域的Tm值，随各自的抗体溶液中的钙浓度变化而变化1℃以上。

[表48]

(参考实施例18)设计可变区导入有钙离子结合模体的抗体分子的群体(Ca文库)以便可高效地获得Ca浓度依赖性地与抗原结合的结合抗体

作为钙结合模体，可适宜举出例如：hVk5-2序列和其CDR序列、以及残基30位、31位、32位、50位、92位(Kabat编号)。另外，与钙结合的蛋白所具有的EF手模体(钙调蛋白等)或C型凝集素(ASGPR等)也相当于钙结合模体。

Ca文库由重链可变区和轻链可变区构成。重链可变区使用人抗体序列，轻链可变区导入有钙结合模体。作为导入有钙结合模体的轻链可变区的模板序列，选择hVk1序列。包含向hVk1序列中导入作为钙结合模体之一的hVk5-2的CDR序列而成的LfVk1_Ca序列的抗体，如参考实施例16所示，显示与钙离子结合。使多个氨基酸在模板序列中出现，以提高构成文库的抗原结合分子的多样性。对于使多个氨基酸出现的位置，选择与抗原相互作用的可能性高的露出于可变区的表面的位置。具体而言，选择30位、31位、32位、34位、50位、53位、91位、92位、93位、94位和96位(Kabat编号)来作为这种柔性残基。

接着，设定出现的氨基酸残基的种类及其出现频率。对登录于Kabat数据库(KABAT,E.A.ET AL.:'Sequences of proteins of immunologicalinterest',vol.91,1991,NIH PUBLICATION)的hVk1和hVk3的序列中的柔性残基的氨基酸的出现频率进行分析。基于分析结果，从在各位置出现频率高的氨基酸中选择要在Ca文库出现的氨基酸的种类。此时，为了避免氨基酸的性质有偏向，也选择在分析结果中判定为出现频率少的的氨基酸。此外，选择的氨基酸的出现频率参考Kabat数据库的分析结果进行设定。

通过考虑如上所述设定的氨基酸和出现频率，作为Ca文库，设计含有钙结合模体、且重视了在该模体以外的各残基处含有多个氨基酸的序列多样性的Ca文库。表1和2中示出Ca文库的详细设计(各表中的位置表示Kabat编号)。此外，对于表1和2中记载的氨基酸的出现频率，在以Kabat编号表示的92位为Asn(N)时，94位可以不为Ser(S)而为Leu(L)。

(参考实施例19)Ca文库的制作

以由人PBMC制得的多腺苷酸化RNA或市售的人多腺苷酸化RNA等作为模板，通过PCR法扩增抗体重链可变区的基因文库。对于抗体轻链可变区部分，如参考实施例18所述，设计维持钙结合模体并提高了可钙浓度依赖性地与抗原结合的抗体的出现频率的抗体可变区轻链部分。此外，柔性残基中，作为导入有钙结合模体的残基以外的氨基酸残基，参考天然人抗体中的氨基酸出现频率的信息((KABAT,E.A.ET AL.:'Sequences ofproteins of immunological interest',vol.91,1991,NIH PUBLICATION)，设计了使天然人抗体的序列中出现频率高的氨基酸均等分布的抗体轻链可变区的文库。将如此制作的抗体重链可变区的基因文库和抗体轻链可变区的基因文库的组合插入噬粒载体，构建展示由人抗体序列构成的Fab结构域的人抗体噬菌体展示文库(Methods Mol Biol.(2002)178,87-100)。

按照后述的参考实施例23中记载的方法，对从导入有抗体基因文库的大肠杆菌分离的抗体基因部分的序列进行了确认。所得290种的克隆的序列的氨基酸分布和设计的氨基酸分布示于图55。

(参考实施例20)Ca文库中所含分子的钙离子结合活性的评价

(20-1)Ca文库中所含分子的钙离子结合活性

如参考实施例14所示，显示与钙离子结合的hVk5-2序列是在种系序列中出现频率低的序列，因而认为从由人种系序列构成的抗体文库或从由对表达人抗体的小鼠进行免疫而得的B细胞来获得与钙结合的抗体是没有效率的。因此，构建了Ca文库。对构建的Ca文库中是否存在显示钙结合的克隆进行评价。

(20-2)抗体的表达和纯化

将Ca文库中所含的克隆导入动物细胞表达用质粒中。抗体的表达使用以下方法进行。将来源于人胎儿肾细胞的FreeStyle293-F细胞株(Invitrogen)在FreeStyle293Expression Medium培养基(Invitrogen)中悬浮，以1.33×10⁶细胞/mL的细胞密度接种于6孔板的各孔各3mL。将制备的质粒通过脂质转染法导入细胞。在CO₂培养箱(37度、8％CO₂、90rpm)中进行4天培养。使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)，用本领域技术人员公知的方法从上述中所得培养上清中纯化抗体。使用分光光度计测定纯化的抗体溶液在280nm下的吸光度。通过PACE法算出吸光系数，使用该吸光系数由所得测定值计算抗体浓度(Protein Science(1995)4,2411-2423)。

(20-3)钙离子对所得抗体的结合评价

如上所述获得的纯化抗体是否与钙离子结合，通过参考实施例6中记载的方法进行了判定。其结果示于表49。Ca文库中所含的多个抗体的Fab结构域的Tm随钙离子浓度而变化，显示出含有与钙离子结合的分子。

[表49]

(参考实施例21)Ca依赖性地与IL-6受体结合的抗体的获得

(21-1)通过珠淘选从文库获得Ca依赖性地与抗原结合的抗体片段

从构建的Ca依赖性地与IL-6受体结合的抗体文库中进行的最初的挑选如下实施：仅浓缩具有抗原(IL-6受体)结合能力的抗体片段。

由携带构建的噬菌体展示用噬粒的大肠杆菌进行了噬菌体产生。在进行了噬菌体产生的大肠杆菌的培养液中添加2.5M NaCl/10％PEG，并将由此沉淀的噬菌体的群体用TBS稀释，从而得到噬菌体文库液。接着，在噬菌体文库液中添加BSA和CaCl₂，制备成终浓度为4％BSA和1.2mM钙离子浓度。作为淘选方法，参考了作为常规方法的使用固定化于磁珠的抗原的淘选方法(J.Immunol.Methods.(2008)332(1-2),2-9、J.Immunol.Methods.(2001)247(1-2),191-203、Biotechnol.Prog.(2002)18(2)212-20、Mol.CellProteomics(2003)2(2),61-9)。作为磁珠，使用涂布有中和亲和素的珠(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或涂布有链霉亲和素的珠(Dynabeads M-280Streptavidin)。

具体而言，制备的噬菌体文库液中加入250pmol的生物素标记抗原，由此使该噬菌体文库液在室温与抗原接触60分钟。加入用BSA封闭的磁珠，使抗原和噬菌体的复合体与磁珠在室温下结合15分钟。将珠用1mL的1.2mM CaCl₂/TBST(含有1.2mM CaCl₂的TBST)洗涤3次后，用1mL的1.2mM CaCl₂/TBS(含有1.2mM CaCl₂的TBS)洗涤2次。然后，加入有0.5mL的1mg/mL胰蛋白酶的珠在室温下悬浮15分钟后，立即使用磁力架将珠分离，回收噬菌体溶液。所回收的噬菌体溶液添加至对数生长期(OD600为0.4-0.7)的10mL大肠杆菌菌株ER2738中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225mm×225mm的板上。接着，从接种的大肠杆菌的培养液中回收噬菌体，由此制备噬菌体文库液。

在第2次的淘选中，以抗原结合能力或Ca依赖性结合能力为指标进行噬菌体的浓缩。

具体而言，以抗原结合能力为指标进行浓缩时，制备的噬菌体文库液中加入40pmol的生物素标记抗原，由此使该噬菌体文库液在室温与抗原接触60分钟。加入用BSA封闭的磁珠，使抗原和噬菌体的复合体与磁珠在室温下结合15分钟。珠用1mL的1.2mM CaCl₂/TBST洗涤3次、用1mL的1.2mM CaCl₂/TBS洗涤2次。然后，加入有0.5mL的1mg/mL胰蛋白酶的珠在室温下悬浮15分钟后，立即使用磁力架将珠分离，回收噬菌体溶液。所回收的噬菌体溶液中加入100mg/mL胰蛋白酶5μL，由此将未展示Fab的噬菌体的pIII蛋白质(来源于辅助噬菌体的pIII蛋白质)切断，未展示Fab的噬菌体丧失对大肠杆菌的感染能力。所回收的噬菌体溶液添加至对数生长期(OD600为0.4-0.7)的10mL大肠杆菌菌株ER2738中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225mm×225mm的板上。接着，从接种的大肠杆菌的培养液中回收噬菌体，由此制备噬菌体文库液。

以Ca依赖性结合能力为指标进行浓缩时，在制备的噬菌体文库液中加入40pmol的生物素标记抗原，由此使噬菌体文库在室温与抗原接触60分钟。加入用BSA封闭的磁珠，使抗原和噬菌体的复合体与磁珠在室温结合15分钟。将珠用1mL的1.2mM CaCl₂/TBST和1.2mM CaCl₂/TBS洗涤。然后将加入有0.1mL的2mM EDTA/TBS(含有2mM EDTA的TBS)的珠在室温悬浮后，立即使用磁力架将珠分离，回收噬菌体溶液。所回收的噬菌体溶液中加入100mg/mL胰蛋白酶5μL，由此将未展示Fab的噬菌体的pIII蛋白质(来源于辅助噬菌体的pIII蛋白质)切断，未展示Fab的噬菌体丧失对大肠杆菌的感染能力。所回收的噬菌体溶液添加至对数生长期(OD600为0.4-0.7)的10mL大肠杆菌菌株ER2738中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225mm×225mm的板上。接着，从接种的大肠杆菌的培养液中回收噬菌体，由此回收噬菌体

(21-2)基于噬菌体ELISA的评价

通过由上述的方法获得的大肠杆菌的单菌落，按照常法(Methods Mol.Biol.(2002)178,133-145)，回收含有噬菌体的培养上清。

将含有加入有BSA和CaCl₂的噬菌体的培养上清，按照以下步骤进行ELISA。将StreptaWell96微量滴定板(Roche)用含有生物素标记抗原的100μLPBS包被一夜。用PBST洗涤该板的各孔，由此将抗原除去后，将该孔用250μL的4％BSA-TBS封闭1小时以上。在除去了4％BSA-TBS的各孔中，加入制备的培养上清，将该板在37℃静置1小时，由此使噬菌体展示的抗体与各孔中存在的抗原结合。在用1.2mM CaCl₂/TBST进行了洗涤的各孔中，加入1.2mM CaCl₂/TBS或1mM EDTA/TBS，将该板在37℃静置30分钟，进行孵育。在用1.2mM CaCl₂/TBST进行洗涤后，将通过离子化钙浓度为1.2mM的TBS进行了稀释的HRP结合抗M13抗体(AmershamPharmacia Biotech)添加至各孔中，将板孵育1小时。用1.2mM CaCl₂/TBST洗涤后，添加TMB single溶液(ZYMED)，各孔中的溶液的显色反应通过添加硫酸而停止后，通过450nm的吸光度测定该显色。

对于实施了上述噬菌体ELISA的克隆，使用特异性引物进行扩增，并对所扩增的基因进行了碱基序列分析。

噬菌体ELISA、序列分析的结果示于以下的表50。

[表50]

文库	Ca文库	Ca文库
			浓缩指标	抗原结合能力	依赖性抗原结合能力
淘选次数	2	2
			试验的克隆数	85	86
ELISA阳性	77	75
			ELISA阳性克隆序列种类	74	72
Ca依赖性结合克隆序列种类	13	47

(21-3)抗体的表达和纯化

将噬菌体ELISA的结果判断为具有Ca依赖性抗原结合能力的克隆导入到动物细胞表达用质粒中。抗体的表达使用以下的方法进行。将来源于人胎儿肾细胞的FreeStyle293-F细胞株(Invitrogen)悬浮于FreeStyle293Expression Medium培养基(Invitrogen)中，以1.33×10⁶细胞/mL的细胞密度向6孔板的各孔中各接种3mL。将所制备的质粒通过脂质转染法导入到细胞中。在CO₂培养箱(37度、8％CO₂、90rpm)中进行4天培养。使用rProteinA SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)，用本领域技术人员公知的方法从上述所得的培养上清中纯化抗体。使用分光光度计测定纯化的抗体溶液在280nm下的吸光度。通过使用PACE法算出的吸光系数，由所得的测定值计算抗体浓度(Protein Science(1995)4,2411-2423)。

(21-4)获得的抗体对人IL-6受体的Ca依赖性结合能力的评价

为了判断如上所述获得的抗体6RC1IgG_010(重链SEQ ID NO:111、轻链SEQ ID NO:112)、6RC1IgG_012(重链SEQ ID NO:113、轻链SEQ ID NO:114)和6RC1IgG_019(重链SEQ ID NO:115、轻链SEQ ID NO:116)对人IL-6受体的结合活性是否为Ca依赖性的，使用BiacoreT100(GE Healthcare)进行了这些抗体和人IL-6受体的相互作用分析。作为对人IL-6受体不具有Ca依赖性结合活性的对照抗体，使用了托珠单抗(重链SEQ ID NO:60、轻链SEQ ID NO:61)。作为高钙离子浓度和低钙离子浓度条件，分别在1.2mM和3μM的钙离子浓度的溶液中进行相互作用分析。在用胺偶联法固定化有适当量的蛋白A/G(Invitrogen)的传感器芯片CM5(GE Healthcare)上，捕获目标抗体。运行缓冲液使用20mM ACES、150mM NaCl、0.05％(w/v)Tween20、1.2mM CaCl₂(pH7.4)或20mM ACES、150mM NaCl、0.05％(w/v)Tween20、3μM CaCl₂(pH7.4)这2种缓冲液。人IL-6受体的稀释中也使用各自的缓冲液。测定均在37℃下实施。

在使用作为对照抗体的托珠单抗抗体、6RC1IgG_010抗体和6RC1IgG_012抗体和6RC1IgG_019抗体进行抗原抗体反应的相互作用分析之际，以流速5μL/分钟注入IL-6受体的稀释液和作为空白的运行缓冲液3分钟，由此使IL-6受体与捕获于传感器芯片上的托珠单抗抗体、6RC1IgG_010抗体和6RC1IgG_012抗体和6RC1IgG_019抗体相互作用。然后，以流速30μL/分钟注入10mM甘氨酸-HCl(pH1.5)30秒钟，由此使传感器芯片再生。

通过该方法测定的高钙离子浓度下的传感图示于图56。

关于在低钙离子浓度条件下的托珠单抗抗体、6RC1IgG_010抗体和6RC1IgG_012抗体和6RC1IgG_019抗体的传感图也通过同样的方法获得。低钙离子浓度下的传感图示于图57。

根据上述的结果观察到：6RC1IgG_010抗体和6RC1IgG_012抗体和6RC1IgG_019抗体，通过使缓冲液中的钙离子浓度由1.2mM到3μM，大幅度降低对IL6受体的结合能力。

(参考实施例22)pH依赖性结合抗体文库的设计

(22-1)pH依赖性结合抗体的获得方法

WO2009/125825中，通过向抗原结合分子导入组氨酸，公开了性质在pH中性区域和pH酸性区域发生变化的pH依赖性抗原结合抗体。公开的pH依赖性结合抗体通过将所期望的抗原结合分子的氨基酸序列的一部分取代为组氨酸的改变来获得。为了不用预先获得欲改变的对象抗原结合分子而更有效地获得pH依赖性结合抗体，考虑从组氨酸导入到可变区(更优选为可能与抗原结合相关的位置)的抗原结合分子的群体(称为His文库)中获得与所期望的抗原结合的抗原结合分子的方法。从His文库得到的抗原结合分子与从普通抗体文库得到的相比，组氨酸高频率地出现，因而认为可有效地获得具有所期望性质的抗原结合分子。

(22-2)以能够有效地获得pH依赖性地与抗原结合的结合抗体的方式，设计组氨酸残基导入到可变区的抗体分子的群体(His文库)

首先，在His文库中选择导入组氨酸的位置。WO2009/125825中公开了：通过将IL-6受体抗体、IL-6抗体和IL-31受体抗体的序列中的氨基酸残基取代为组氨酸，来制作pH依赖性抗原结合抗体。进而，通过将抗原结合分子的氨基酸序列取代为组氨酸，制作了具有pH依赖性抗原结合能力的抗蛋白溶菌酶抗体(FEBS Letter11483,309,1,85-88)和抗铁调素抗体(WO2009/139822)。在IL-6受体抗体、IL-6抗体、IL-31受体抗体、蛋白溶菌酶抗体和铁调素抗体中导入组氨酸的位置示于表51。表51所示的位置可被列举为能够控制抗原和抗体的结合的候补位置。进而，除了表51中所示的位置以外，认为与抗原接触的可能性高的位置也适合作为导入组氨酸的位置。

[表51]

在由重链可变区和轻链可变区构成的His文库中，重链可变区使用人抗体序列，轻链可变区中导入有组氨酸。作为在His文库中导入组氨酸的位置，选择上述列举的位置以及可能参与抗原结合的位置、即轻链的30位、32位、50位、53位、91位、92位和93位(Kabat编号，Kabat EA et al.1991.Sequenceof Proteins of Immunological Interest.NIH)。另外，作为导入组氨酸的轻链可变区的模板序列，选择Vk1序列。使多个氨基酸在模板序列中出现，以提高构成文库的抗原结合分子的多样性。对于使多个氨基酸出现的位置，选择与抗原相互作用的可能性高的露出于可变区的表面的位置。具体而言，选择轻链的30位、31位、32位、34位、50位、53位、91位、92位、93位、94位和96位(Kabat编号，Kabat EA et al.1991.Sequence of Proteins ofImmunological Interest.NIH)来作为这种柔性残基。

接着，设定出现的氨基酸残基的种类及其出现频率。对登录于Kabat数据库(KABAT,E.A.ET AL.:'Sequences of proteins of immunologicalinterest',vol.91,1991,NIH PUBLICATION)的hVk1和hVk3的序列中的柔性残基的氨基酸的出现频率进行分析。基于分析结果，从在各位置出现频率高的氨基酸中选择要在His文库出现的氨基酸的种类。此时，为了避免氨基酸的性质有偏向，也选择在分析结果中判定为出现频率少的的氨基酸。此外，所选择的氨基酸的出现频率参考Kabat数据库的分析结果进行设定。

通过考虑如上所述设定的氨基酸和出现频率，作为His文库，设计了以各CDR中必须包含1个组氨酸的方式固定的His文库1与较His文库1更重视序列多样性的His文库2。His文库1和His文库2的详细设计示于表3和表4(各表中的位置表示Kabat编号)。此外，对于表3和表4中记载的氨基酸的出现频率，在以Kabat编号表示的92位为Asn(N)时，94位可以排除Ser(S)。

(参考实施例23)制作用于获得pH依赖性地与抗原结合的抗体的人抗体噬菌体展示文库(His文库1)

以由人PBMC制得的多腺苷酸化RNA或市售的人多腺苷酸化RNA等作为模板，通过PCR法扩增抗体重链可变区的基因文库。设计作为实施例22中记载的His文库1的抗体轻链可变区的基因文库使用PCR法进行扩增。将如此制作的抗体重链可变区的基因文库和抗体轻链可变区的基因文库的组合插入噬粒载体，构建展示由人抗体序列构成的Fab结构域的人抗体噬菌体展示文库。作为构建方法，参考了(Methods Mol Biol.(2002)178,87-100)。在构建上述文库时，使用了连接噬粒的Fab和噬菌体pIII蛋白的接头部分、以及在辅助噬菌体pIII蛋白基因的N2结构域和CT结构域之间插入有胰蛋白酶切断序列的噬菌体展示文库的序列。对从导入有抗体基因文库的大肠杆菌分离得到的抗体基因部分的序列进行确认，得到132个克隆的序列信息。设计的氨基酸分布和确认得到的序列中氨基酸的分布示于图58。构建了包含与设计的氨基酸分布对应的多种序列的文库。

(参考实施例24)pH依赖性地与IL-6R结合的抗体的获得

(24-1)通过珠淘选从文库获得pH依赖性地与抗原结合的抗体片段

从构建的His文库1中进行的最初的挑选如下实施：仅浓缩具有抗原(IL-6R)结合能力的抗体片段。

由携带构建的噬菌体展示用噬粒的大肠杆菌进行了噬菌体产生。在进行了噬菌体产生的大肠杆菌的培养液中添加2.5MNaCl/10％PEG，并将由此沉淀的噬菌体的群体用TBS稀释，从而得到噬菌体文库液。接着，在噬菌体文库液中添加BSA和CaCl₂，以使终浓度为4％BSA和1.2mM钙离子浓度。作为淘选方法，参考了作为常规方法的使用固定化于磁珠的抗原的淘选方法(J.Immunol.Methods.(2008)332(1-2),2-9、J.Immunol.Methods.(2001)247(1-2),191-203、Biotechnol.Prog.(2002)18(2)212-20、Mol.CellProteomics(2003)2(2),61-9)。作为磁珠，使用涂布有中和亲和素的珠(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或涂布有链霉亲和素的珠(DynabeadsM-280Streptavidin)。

具体而言，制备的噬菌体文库液中加入250pmol的生物素标记抗原，由此使该噬菌体文库液在室温与抗原接触60分钟。加入用BSA封闭的磁珠，使抗原和噬菌体的复合体与磁珠在室温下结合15分钟。珠用1mL的1.2mM CaCl₂/TBST(含有1.2mM CaCl₂、0.1％Tween20的TBS)洗涤3次后，进一步用1mL的1.2mM CaCl₂/TBS(pH7.6)洗涤2次。然后，加入有0.5mL的1mg/mL胰蛋白酶的珠在室温下悬浮15分钟后，立即使用磁力架将珠分离，回收噬菌体溶液。所回收的噬菌体溶液添加至对数生长期(OD600为0.4-0.7)的10mL大肠杆菌菌株ER2738中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225mm×225mm的板上。接着，从接种的大肠杆菌的培养液中回收噬菌体，由此制备噬菌体文库液。

第2次以后的淘选中，以抗原结合能力或pH依赖性结合能力为指标进行噬菌体的浓缩。具体而言，在制备的噬菌体文库液中加入40pmol的生物素标记抗原，由此使噬菌体文库在室温与抗原接触60分钟。加入用BSA封闭的磁珠，使抗原和噬菌体的复合体与磁珠在室温结合15分钟。将珠用1mL的1.2mM CaCl₂/TBST和1.2mM CaCl₂/TBS洗涤多次。然后，以抗原结合能力为指标进行浓缩时，加入有0.5mL的1mg/mL胰蛋白酶的珠在室温下悬浮15分钟后，立即使用磁力架将珠分离，回收噬菌体溶液。以pH依赖性结合能力为指标进行浓缩时，加入有0.1mL的50mM MES/1.2mMCaCl₂/150mM NaCl(pH5.5)的珠在室温下悬浮后，立即使用磁力架将珠分离，所回收的噬菌体溶液中加入100mg/mL胰蛋白酶5μL，由此将未展示Fab的噬菌体的pIII蛋白质(来源于辅助噬菌体的pIII蛋白质)切断，使未展示Fab的噬菌体丧失对大肠杆菌的感染能力。所回收的噬菌体溶液添加至对数生长期(OD600为0.4-0.7)的10mL大肠杆菌菌株ER2738中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225mm×225mm的板上。接着，从接种的大肠杆菌的培养液中回收噬菌体，由此制备噬菌体文库液。以抗原结合能力或pH依赖性结合能力为指标的淘选重复进行2次。

(24-2)基于噬菌体ELISA的评价

通过由上述的方法得到的大肠杆菌的单菌落，按照常法(Methods Mol.Biol.(2002)178,133-145)，回收含有噬菌体的培养上清。

在含有噬菌体的培养上清中加入BSA和CaCl₂，以使终浓度为4％BSA和1.2mM钙离子浓度，按照以下步骤进行ELISA。将StreptaWell96微量滴定板(Roche)用含有生物素标记抗原的100μL PBS包被一夜。用PBST(含有0.1％Tween20的PBS)洗涤该板的各孔，由此将抗原除去后，将该孔用250μL的4％BSA-TBS封闭1小时以上。在除去了4％BSA-TBS的各孔中，加入制备的培养上清，将该板在37℃静置1小时，由此使噬菌体展示的抗体与各孔中存在的抗原结合。在用1.2mMCaCl₂/TBST进行了洗涤的各孔中，加入1.2mM CaCl₂/TBS(pH7.6)或1.2mM CaCl₂/TBS(pH5.5)，将该板在37℃静置30分钟，进行孵育。在用1.2mM CaCl₂/TBST进行洗涤后，将通过4％BSA和离子化钙浓度为1.2mM的TBS进行了稀释的HRP结合抗M13抗体(Amersham Pharmacia Biotech)添加至各孔中，将板孵育1小时。用1.2mM CaCl₂/TBST洗涤后，添加TMB single溶液(ZYMED)，各孔中的溶液的显色反应通过添加硫酸而停止后，通过450nm的吸光度测定该显色。

以抗原结合能力为指标进行浓缩时，对于实施了2次淘选的所得物，实施了噬菌体ELISA，抗原特异性地呈现ELISA阳性者在96克隆中有17克隆，因此对实施了3次淘选的所得物进行了分析。另一方面，以pH依赖性抗原结合能力为指标进行浓缩时，对于实施了2次淘选的所得物，实施了噬菌体ELISA，呈现ELISA阳性者在94克隆中有70克隆，因此对实施了2次淘选的所得物进行了分析。

对于上述实施了噬菌体ELISA的克隆，使用特异性引物进行扩增，并对已扩增的基因的碱基序列进行了分析。

噬菌体ELISA和序列分析的结果示于以下的表52。

[表52]

文库	His文库1	His文库1
			浓缩指标	抗原结合能力	pH依赖性抗原结合能力
淘选次数	3	2
			试验的克隆数	80	94
ELISA阳性	76	70
			ELISA阳性克隆序列种类	30	67
pH依赖性结合克隆序列种类	22	47

利用同样的方法，从天然人抗体噬菌体展示文库中进行了具有pH依赖性抗原结合能力的抗体获得。以抗原结合能力为指标进行浓缩时，在评价的88克隆中获得了13种的pH依赖性结合抗体。此外，以pH依赖性抗原结合能力为指标进行浓缩时，在评价的83克隆中获得了27种的pH依赖性结合抗体。

根据以上的结果确认到：与天然人抗体噬菌体展示文库比较，His文库1所得的具有pH依赖性抗原结合能力的克隆的变种较多。

(24-3)抗体的表达和纯化

将噬菌体ELISA的结果判断为具有pH依赖性抗原结合能力的克隆导入到动物细胞表达用质粒中。抗体的表达使用以下的方法进行。将来源于人胎儿肾细胞的FreeStyle293-F细胞株(Invitrogen)悬浮于FreeStyle293Expression Medium培养基(Invitrogen)中，以1.33×10⁶细胞/mL的细胞密度向6孔板的各孔中各接种3mL。将所制备的质粒通过脂质转染法导入到细胞中。在CO₂培养箱(37度、8％CO₂、90rpm)中进行4天培养。使用rProteinA SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)，用本领域技术人员公知的方法从上述所得的培养上清中纯化抗体。使用分光光度计测定纯化的抗体溶液在280nm下的吸光度。通过使用PACE法算出的吸光系数，由所得的测定值计算抗体浓度(Protein Science(1995)4,2411-2423)。

(24-4)所获得的抗体对人IL-6受体的pH依赖性结合能力的评价

为了判断(24-3)中获得的抗体6RpH#01(重链SEQ ID NO:117、轻链SEQID NO:118)、6RpH#02(重链SEQ ID NO:119、轻链SEQ ID NO:120)、和6RpH#03(重链SEQ ID NO:121、轻链SEQ ID NO:122)对人IL-6受体的结合活性是否为pH依赖性的，使用Biacore T100(GE Healthcare)分析了这些抗体和人IL-6受体的相互作用。作为对人IL-6受体不具有pH依赖性结合活性的对照抗体，使用了托珠单抗(重链SEQ ID NO:60、轻链SEQ ID NO:61)。作为中性范围pH和酸性范围pH条件，分别在pH7.4和pH6.0的溶液中分析了抗原抗体反应的相互作用。在用胺偶联法固定化有适当量的蛋白A/G(Invitrogen)的传感器芯片CM5(GE Healthcare)上，分别以300RU左右捕获目标抗体。运行缓冲液使用20mM ACES、150mM NaCl、0.05％(w/v)Tween20、1.2mM CaCl₂(pH7.4)或20mM ACES、150mM NaCl、0.05％(w/v)Tween20、1.2mM CaCl₂(pH6.0)这2种缓冲液。人IL-6受体的稀释中也使用各自的缓冲液。测定均在37℃下实施。

使用作为对照抗体的托珠单抗抗体、6RpH#01抗体、6RpH#02抗体和6RpH#03抗体进行抗原抗体反应的相互作用分析之际，以流速5μL/分钟注入IL-6受体的稀释液和作为空白的运行缓冲液3分钟，由此使IL-6受体与捕获于传感器芯片上的托珠单抗抗体、6RpH#01抗体、6RpH#02抗体和6RpH#03抗体相互作用。然后，以流速30μL/分钟注入10mM甘氨酸-HCl(pH1.5)30秒钟，由此使传感器芯片再生。

通过上述方法测定的pH7.4下的传感图示于图59。而且通过同样的方法获得的pH6.0的条件下的传感图示于图60。

根据上述的结果观察到：6RpH#01抗体、6RpH#02抗体和6RpH#03抗体，通过使缓冲液中的pH由pH7.4到pH6.0，大幅度降低对IL6受体的结合能力。

(参考实施例25)人FcγR的制备方法和改变抗体与人FcγR的相互作用分析方法

人FcγR的胞外结构域通过以下的方法进行制备。首先，FcγR的胞外结构域的基因通过本领域技术人员公知的方法进行合成。此时，作为各FcγR的序列，基于登录于NCBI的信息制作该基因。具体而言，FcγRI基于NCBI的检索号NM_000566(Version编号NM_000566.3)的序列、FcγRIIa基于NCBI的检索号NM_001136219(Version编号NM_001136219.1)的序列、FcγRIIb基于NCBI的检索号NM_004001(Version编号NM_004001.3)的序列、FcγRIIIa基于NCBI的检索号NM_001127593(Version编号NM_001127593.1)的序列、FcγRIIIb基于NCBI的检索号NM_000570(Version编号NM_000570.3)的序列，在其C末端添加组氨酸标签(His-tag)进行制作。此外，已知FcγRIIa、FcγRIIIa、FcγRIIIb存在着多态性，FcγRIIa的多态性位点参考Warmerdam等(J.Exp.Med.(1990)172,19-25)、FcγRIIIa的多态性位点参考Wu等(J.Clin.Invest.(1997)100(5),1059-1070)、FcγRIIIb的多态性位点参考Ory等(J.Clin.Invest.(1989)84,1688-1691)进行制作。

制作了将所得基因片段插入到动物细胞表达载体的表达载体。将所制作的表达载体瞬时地导入到来源于人胎儿肾癌细胞的FreeStyle293细胞(Invitrogen公司)中，使目标蛋白表达。应予说明，用于晶体结构分析用的FcγRIIb，在终浓度为10μg/mL的Kifunesine存在下使目标蛋白表达，由此使添加到FcγRIIb上的糖链为高甘露糖型。将从上述的瞬时地导入的细胞培养液中得到的培养上清通过0.22μm过滤器而得的制备液，原则上通过以下4个步骤进行纯化。第1步骤通过阳离子交换柱层析(SP Sepharose FF)、第2步骤通过组氨酸标签亲和柱层析(HisTrap HP)、第3步骤通过凝胶过滤柱层析(Superdex200)、第4步骤通过无菌过滤，进行纯化。其中，在纯化FcγRI之际，第1步骤中使用了利用Q sepharose FF的阴离子交换柱层析。所纯化的蛋白在280nm下的吸光度使用分光光度计进行测定，使用通过PACE等的方法算出的吸光系数，由所得测定值计算出纯化蛋白的浓度(ProteinScience(1995)4,2411-2423)。

使用Biacore T100(GE Healthcare)、Biacore T200(GE Healthcare)、BiacoreA100、Biacore4000，分析了各改变抗体与上述制备的Fcγ受体的相互作用。在运行缓冲液中，使用HBS-EP+(GE Healthcare)的测定温度设定为25℃。使用在S系列传感器芯片CM5(GE Healthcare)或S系列传感器芯片CM4(GEHealthcare)上通过胺偶联法将抗原肽、蛋白A(Thermo Scientific)、蛋白A/G(Thermo Scientific)、蛋白L(ACTIGEN或Bio Vision)固定化而成的芯片，或者预先生物素化的抗原肽与S系列传感器芯片SA(certified)(GEHealthcare)相互作用使该肽固定化而得的芯片。

在这些传感器芯片上捕获目标抗体，并与用运行缓冲液稀释的Fcγ受体相互作用，测定抗体结合量，该测定值在抗体间进行比较。其中，Fcγ受体的结合量依赖于捕获的抗体的量，因而比较用各抗体的捕获量除Fcγ受体的结合量而得的修正值。此外，通过与10mM甘氨酸-HCl、pH1.5反应，对传感器芯片上捕获的抗体进行洗涤，使传感器芯片再生而重复使用。

此外，各改变抗体对FcγR的KD值按照以下的方法进行动力学分析。首先，在上述的传感器芯片上捕获目标抗体，使其与用运行缓冲液稀释的Fcγ受体相互作用，对于所得传感图，使用Biacore Evaluation Software，将测定结果用1:1朗缪耳结合模型(Langmuir binding model)进行全局拟合，根据由此算出的结合速率常数ka(L/mol/s)和解离速率常数kd(1/s)的值，计算出解离常数KD(mol/L)

此外，被判断为各改变抗体与FcγR的相互作用微弱、通过上述的动力学分析无法进行正确分析时，利用Biacore T100Software HandbookBR1006-48Edition AE中记载的以下的1:1结合模型式来计算KD。

1:1结合模型中相互作用的分子在Biacore上的行为可通过下式4来表示：

[式4]

Req＝C×Rmax/(KD+C)+RI

Req:稳态结合水平对分析物浓度的绘图；

C:浓度；

RI:试样中的体积折射率贡献(Bulk refractive index contribution in thesample)；

Rmax:分析物的表面结合能力(Analyte binding capacity of the surface)。

若将该式变形，则KD可以以下的式2的形式来表示：

[式2]

KD＝C·R_max/(R_eq-RI)-C。

通过向该式代入Rmax、RI、C的值可以计算KD。RI和C根据测定结果的传感图、测定条件求出。Rmax按照以下的方法计算。将用上述的1:1朗缪耳结合模型进行全局拟合时得到的、在该次测定中同时评价的作为比较对象使用的相互作用充分强的抗体的Rmax值，除以比较对象的抗体在传感器芯片上的捕获量，再乘以要评价的改变抗体的捕获量而得的值，使用该值作为Rmax。

(参考实施例26)mFcγR的制备方法

小鼠的FcγR的胞外结构域通过以下的方法进行制备。首先，FcγR的胞外结构域的基因通过本领域技术人员公知的方法进行合成。此时，作为各FcγR的序列，基于登录于NCBI的信息制作该基因。具体而言，mFcγRI基于NCBI Reference Sequence(RefSeq):NP_034316.1、mFcγRII基于NCBIReference Sequence:NP_034317.1、mFcγRIII基于NCBI Reference Sequence:NP_034318.2、mFcγRIV基于NCBI Reference Sequence:NP_653142.2的序列制作，在其C末端上添加组氨酸标签进行制作。

将从上述的瞬时地导入的细胞培养液中得到的培养上清通过0.22μm过滤器而得的制备液，原则上通过以下4个步骤进行纯化。第1步骤通过阳离子交换柱层析(SP Sepharose FF)、第2步骤通过组氨酸标签亲和柱层析(HisTrap HP)、第3步骤通过凝胶过滤柱层析(Superdex200)、第4步骤通过无菌过滤，进行纯化。其中，在纯化FcγRI之际，第1步骤中使用了利用Qsepharose FF的阴离子交换柱层析。所纯化的蛋白在280nm下的吸光度使用分光光度计进行测定，使用通过PACE等的方法算出的吸光系数，由所得测定值计算出纯化蛋白的浓度(Protein Science(1995)4,2411-2423)。

制作了所得基因片段插入到动物细胞表达载体中的表达载体。将所制作的表达载体瞬时地导入到来源于人胎儿肾癌细胞的FreeStyle293细胞(Invitrogen公司)中，使目标蛋白表达。将从上述的瞬时地导入的细胞培养液中得到的培养上清通过0.22μm过滤器而得的制备液，原则上通过以下4个步骤进行纯化。第1步骤通过离子交换柱层析、第2步骤通过组氨酸标签亲和柱层析(HisTrap HP)、第3步骤通过凝胶过滤柱层析(Superdex200)、第4步骤通过无菌过滤，进行纯化。其中，作为第1步骤的离子交换柱层析，在纯化mFcγRI之际使用Q Sepharose HP、在纯化mFcγRII和mFcγRIV之际使用SP Sepharose FF、在纯化mFcγRIII之际使用SP Sepharose HP。此外，在第3步骤以后，作为溶剂使用D-PBS(-)，但在纯化mFcγRIII之际，作为同溶剂使用含有0.1M精氨酸的D-PBS(-)。所纯化的蛋白在280nm下的吸光度使用分光光度计进行测定，使用通过PACE等的方法算出的吸光系数，由所得测定值计算出纯化蛋白的浓度(Protein Science(1995)4:2411-2423)。

(参考实施例27)抑制与类风湿因子的结合的改变

(27-1)抑制Fv4-YTE、Fv4-N434H和LS改变体与类风湿因子的结合

为了抑制在pH酸性范围下与FcRn的结合得到改善且血浆中滞留性提高的Fv4-YTE、Fv4-N434H和LS改变体与类风湿因子的结合，对于这些改变体导入了Q438R/S440E改变或S424N改变。具体而言，制作了表53所示的新型的Fc改变体。首先，对这些改变体在pH6.0下与FcRn的结合亲和性进行了评价。其结果示于表53。

[表53]

改变体名	KD(M)	改变
			IgG1	2.4E-06	无
YTE	2.1E-07	M252Y/S254T/T256E
			F1166	2.1E-07	M252Y/S254T/T256E/Q438R/S440E
F1167	2.5E-07	M252Y/S254T/T256E/S424N
			LS	1.6E-07	M428L/N434S
F1170	1.5E-07	M428L/N434S/Q438R/S440E
			F1171	2.4E-07	S424N/M428L/N434S
N434H	4.3E-07	N434H
			F1172	4.0E-07	N434H/Q438R/S440E
F1173	5.3E-07	S424N/N434H

接着，评价了这些改变体(Fv4-F1166、F1167、F1172、F1173、F1170和F1171)对类风湿因子的结合。对类风湿因子的结合分析在pH7.4下通过电化学发光法(electrochemiluminescene、ECL)来实施。本分析中，使用了15或30名类风湿病患者的血清(Protogenex)。将50倍稀释的血清试样、生物素标记的被测抗体(1μg/mL)、SULFO-TAG NHS酯标记的被测抗体(1μg/mL)的混合液在室温下孵育3小时。接着，该混合液分注于用链霉亲和素包被的MULTI-ARRAY96孔板(Meso Scale Discovery)的各孔中，在室温下孵育2小时后，洗涤该各孔。将各孔中分注有读数缓冲液(x4)的该板安装在SECTOR imager2400Reader(Meso Scale Discovery)上。对各孔的化学发光进行了测定。

其结果示于图61。与对90216S和90214S供体的血清中的类风湿因子显示强的结合活性的YTE改变体比较，F1166(Q438R/S440E)和F1167(S424N)改变体强烈抑制了对类风湿因子的结合。并且，含有S424N改变的F1173和F1171改变体也强烈抑制了由于N434H和LS改变体而分别带来的类风湿因子的结合。但是，通过Q438R/S440E改变没有完全抑制由于N434H和LS改变体而分别带来的类风湿因子的结合，与1或2的供体的血清中的类风湿因子结合。

(27-2)抑制LS改变体与类风湿因子的结合

如表54所示制作了在Fv4-LS中导入了一个新型改变的Fc改变体。其中，维持在pH6.0下的FcRn结合的改变体(Fv4-F1380、F1384-F1386、F1388和F1389)对类风湿因子的结合按照实施例(27-1)中记载的方法进行评价。其结果示于图62。这些改变体强烈抑制了对供体的血清中的类风湿因子的结合。特别是含有Y436T的Fv4-F1389显示了与天然IgG1同程度的对类风湿因子的结合。

[表54]

改变体名	KD(M)	改变
			F22(LS)	7.1E-08	M428L/N434S
F1380	7.3E-08	S426D/M428L/N434S
			F1381	8.6E-08	S426E/M428L/N434S
F1382	1.3E-07	S426K/M428L/N434S
			F1383	1.6E-07	S426R/M428L/N434S
F1384	8.6E-08	S426A/M428L/N434S
			F1385	7.7E-08	S426Q/M428L/N434S
F1386	1.6E-07	S426Y/M428L/N434S
			F1387	1.5E-07	M428L/N434S/Y436M
F1388	8.0E-08	M428L/N434S/Y436F
			F1389	6.8E-08	M428L/N434S/Y436T
F1390	4.0E-07	M428L/N434S/Y436H
			F1391	4.2E-07	M428L/N434S/Y436N
F1392	2.7E-07	M428L/N434S/Y436K

如上所述，通过将在pH酸性范围条件下对FcRn的结合活性不降低、仅降低对类风湿因子的结合活性的改变导入Fc区的该位点，可以制作对类风湿因子不具有结合性、在pH酸性范围条件下对人FcRn的结合活性得以增强的抗原结合分子。

作为这类使对类风湿因子的结合活性降低的改变，使用以EU编号表示的248-257、305-314、342-352、380-386、388、414-421、423、425-437、439、441-444位的改变。优选使用以EU编号表示的387、422、424、426、433、436、438、440位的改变。特别优选使用以EU编号表示的422位的Val取代成Glu或Ser的改变、424位的Ser取代成Arg的改变、433位的His取代成Asp的改变、436位的Tyr取代成Thr的改变、438位的Gln取代成Arg或Lys的改变、440位的Ser取代成Glu或Asp的改变。这些改变可以单独使用、也可以将多个位置组合使用。

或者，为了使对类风湿因子的结合活性降低，可以导入N型糖链的附加序列。具体而言，作为N型糖链附加序列已知有Asn-Xxx-Ser/Thr(Xxx是除外Pro的任意的氨基酸)，通过将该序列导入Fc区，而使N型糖链附加，由于N型糖链的空间位阻可以抑制与RF的结合。作为用于添加N型糖链的改变，优选使用以EU编号表示的248位的Lys取代成Asn的改变、424位的Ser取代成Asn的改变、436位的Tyr取代成Asn而438位的Gln取代成Thr的改变、438位的Qln取代成Asn的改变。特别优选使用以EU编号表示的424位的Ser取代成Asn的改变。

产业实用性

根据本发明提供：基于抗原结合分子使抗原向细胞内的摄入得到促进的方法、使一分子的抗原结合分子可结合的抗原数目增加的方法、通过其给予使血浆中的抗原浓度减少促进的方法。通过基于抗原结合分子使抗原向细胞内的摄入得以促进，可以通过给予抗原结合分子使抗原的血浆中的抗原浓度减少促进，同时可以改善抗原结合分子的药代动力学，可以使1分子的抗原结合分子可结合的抗原数目增加，在体内相比通常的抗原结合分子也可以发挥优异的效果。

Claims

1. 含有抗原结合分子的药物组合物，其中，所述抗原结合分子含有：在pH酸性范围条件下具有人FcRn结合活性，且对抗原的结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域；以及，在pH中性范围条件下Fcγ受体结合活性与EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG的Fc区的Fcγ受体结合活性相比高的Fcγ受体结合结构域。

2. 权利要求1所述的药物组合物，其中，上述抗原为可溶型抗原。

3. 权利要求1或2所述的药物组合物，其中，上述离子浓度为钙离子浓度。

4. 权利要求3所述的药物组合物，其中，上述抗原结合结构域为在高钙离子浓度条件下抗原结合活性高于在低钙离子浓度条件下对该抗原的结合活性的抗原结合结构域。

5. 权利要求1或2所述的药物组合物，其中，上述离子浓度条件为pH条件。

6. 权利要求5所述的药物组合物，其中，上述抗原结合结构域为在pH中性范围条件下抗原结合活性高于在pH酸性范围条件下对该抗原的结合活性的抗原结合结构域。

7. 权利要求1~6中任一项所述的药物组合物，其中，上述抗原结合分子为具有针对上述抗原的中和活性的抗原结合分子。

8. 权利要求1~7中任一项所述的药物组合物，其中，上述Fcγ受体结合结构域含有抗体的Fc区。

9. 权利要求8所述的药物组合物，其中，上述Fc区是在Fc区的以EU编号表示的位点中选自以下的至少一个以上的氨基酸与天然型Fc区的对应位点的氨基酸不同的Fc区：221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、243位、244位、245位、246位、247位、249位、250位、251位、254位、255位、256位、258位、260位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、339位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位和440位。

10. 权利要求9所述的药物组合物，其中，上述Fc区是在Fc区的以EU编号表示的位点中含有选自以下的至少一个以上的氨基酸的Fc区：

221位的氨基酸为Lys或Tyr中的任一个；

222位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个；

223位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Lys中的任一个；

224位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个；

225位的氨基酸为Glu、Lys或Trp中的任一个；

227位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；

228位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；

230位的氨基酸为Ala、Glu、Gly或Tyr中的任一个；

231位的氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一个；

232位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；

240位的氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一个；

241位的氨基酸为Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中的任一个；

243位的氨基酸为Leu、Glu、Leu、Gln、Arg、Trp或Tyr中的任一个；

244位的氨基酸为His；

245位的氨基酸为Ala；

246位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；

249位的氨基酸为Glu、His、Gln或Tyr中的任一个；

250位的氨基酸为Glu或Gln中的任一个；

251位的氨基酸为Phe；

254位的氨基酸为Phe、Met或Tyr中的任一个；

255位的氨基酸为Glu、Leu或Tyr中的任一个；

256位的氨基酸为Ala、Met或Pro中的任一个；

258位的氨基酸为Asp、Glu、His、Ser或Tyr中的任一个；

260位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；

262位的氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中的任一个；

263位的氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一个；

266位的氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一个；

273位的氨基酸为Phe或Ile中的任一个；

275位的氨基酸为Leu或Trp中的任一个；

279位的氨基酸为Ala；

281位的氨基酸为Asp、Lys、Pro或Tyr中的任一个；

282位的氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一个；

284位的氨基酸为Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中的任一个；

285位的氨基酸为Asp、Glu、Lys、Gln、Trp或Tyr中的任一个；

286位的氨基酸为Glu、Gly、Pro或Tyr中的任一个；

288位的氨基酸为Asn、Asp、Glu或Tyr中的任一个；

291位的氨基酸为Asp、Glu、Gly、His、Ile、Gln或Thr中的任一个；

292位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中的任一个；

301位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；

302位的氨基酸为Ile；

303位的氨基酸为Asp、Gly或Tyr中的任一个；

304位的氨基酸为Asp、His、Leu、Asn或Thr中的任一个；

305位的氨基酸为Glu、Ile、Thr或Tyr中的任一个；

311位的氨基酸为Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中的任一个；

313位的氨基酸为Phe；

315位的氨基酸为Leu；

317位的氨基酸为Glu或Gln；

323位的氨基酸为Ile；

334位的氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile、Leu、Pro或Thr中的任一个；

336位的氨基酸为Glu、Lys或Tyr中的任一个；

337位的氨基酸为Glu、His或Asn中的任一个；

376位的氨基酸为Ala或Val中的任一个；

377位的氨基酸为Gly或Lys中的任一个；

378位的氨基酸为Asp；

379位的氨基酸为Asn；

380位的氨基酸为Ala、Asn或Ser中的任一个；

382位的氨基酸为Ala或Ile中的任一个；

385位的氨基酸为Glu；

392位的氨基酸为Thr；

396位的氨基酸为Leu；

421位的氨基酸为Lys；

427位的氨基酸为Asn；

428位的氨基酸为Phe或Leu中的任一个；

429位的氨基酸为Met；

434位的氨基酸为Trp；

436位的氨基酸为Ile；以及

440位的氨基酸为Gly、His、Ile、Leu或Tyr中的任一个。

11. 权利要求1~10中任一项所述的药物组合物，其中，上述EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG的Fc区是：EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG1、天然型人IgG2、天然型人IgG3或天然型人IgG4的任一个的Fc区。

12. 权利要求1~11中任一项所述的药物组合物，其中，上述人Fcγ受体为FcγRIa、FcγRIIa(R)、FcγRIIa(H)、FcγRIIb、FcγRIIIa(V)或FcγRIIIa(F)。

13. 权利要求1~11中任一项所述的药物组合物，其中，上述人Fcγ受体为FcγRIIb。

14. 权利要求8~13中任一项所述的药物组合物，其中，上述Fc区是在Fc区的以EU编号表示的位点中含有以下的至少一个以上的氨基酸的Fc区：

238位的氨基酸为Asp，或

328位的氨基酸为Glu。

15. 以下(i)~(vi)中任一项的方法，该方法包括使抗原结合分子与表达Fcγ受体的细胞在机体内或机体外进行细胞接触的步骤，所述抗原结合分子含有：在pH酸性范围条件下具有人FcRn结合活性，且对抗原的结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域；以及，在pH中性范围条件下Fcγ受体结合活性与EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG的Fc区的Fcγ受体结合活性相比高的Fcγ受体结合结构域，

(i) 使一分子的抗原结合分子可结合的抗原数目增加的方法；

(ii) 使血浆中的抗原消除的方法；

(iii) 改善抗原结合分子的药代动力学的方法；

(iv) 促进在细胞外与抗原结合分子结合的抗原在细胞内从抗原结合分子解离的方法；

(v) 促进不与抗原结合的状态的抗原结合分子向细胞外释放的方法；或

(vi) 使血浆中的总抗原浓度或游离抗原浓度减少的方法。

16. 权利要求15所述的方法，其中，上述抗原为可溶型抗原。

17. 权利要求15或16所述的方法，其中，上述离子浓度为钙离子浓度。

18. 权利要求17所述的方法，其中，上述抗原结合结构域为在高钙离子浓度条件下的抗原结合活性高于在低钙离子浓度条件下对该抗原的结合活性的抗原结合结构域。

19. 权利要求15或16所述的方法，其中，上述离子浓度条件为pH条件。

20. 权利要求19所述的方法，其中，上述抗原结合结构域为在pH中性范围条件下的抗原结合活性高于在pH酸性范围条件下对该抗原的结合活性的抗原结合结构域。

21. 权利要求15~20中任一项所述的方法，其中，上述抗原结合分子为具有针对上述抗原的中和活性的抗原结合分子。

22. 权利要求15~21中任一项所述的方法，其中，上述Fcγ受体结合结构域含有抗体的Fc区。

23. 权利要求22所述的方法，其中，上述Fc区是在Fc区的以EU编号表示的位点中选自以下的至少一个以上的氨基酸与天然型Fc区的对应位点的氨基酸不同的Fc区：221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、243位、244位、245位、246位、247位、249位、250位、251位、254位、255位、256位、258位、260位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、339位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位和440位。

24. 权利要求23所述的方法，其中，上述Fc区是在Fc区的以EU编号表示的位点中含有选自以下的至少一个以上的氨基酸的Fc区：

221位的氨基酸为Lys或Tyr中的任一个；

222位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个；

223位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Lys中的任一个；

224位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个；

225位的氨基酸为Glu、Lys或Trp中的任一个；

227位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；

228位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；

230位的氨基酸为Ala、Glu、Gly或Tyr中的任一个；

231位的氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一个；

232位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；

240位的氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一个；

241位的氨基酸为Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中的任一个；

243位的氨基酸为Leu、Glu、Leu、Gln、Arg、Trp或Tyr中的任一个；

244位的氨基酸为His；

245位的氨基酸为Ala；

246位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；

249位的氨基酸为Glu、His、Gln或Tyr中的任一个；

250位的氨基酸为Glu或Gln中的任一个；

251位的氨基酸为Phe；

254位的氨基酸为Phe、Met或Tyr中的任一个；

255位的氨基酸为Glu、Leu或Tyr中的任一个；

256位的氨基酸为Ala、Met或Pro中的任一个；

258位的氨基酸为Asp、Glu、His、Ser或Tyr中的任一个；

260位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；

262位的氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中的任一个；

263位的氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一个；

266位的氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一个；

273位的氨基酸为Phe或Ile中的任一个；

275位的氨基酸为Leu或Trp中的任一个；

279位的氨基酸为Ala；

281位的氨基酸为Asp、Lys、Pro或Tyr中的任一个；

282位的氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一个；

284位的氨基酸为Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中的任一个；

285位的氨基酸为Asp、Glu、Lys、Gln、Trp或Tyr中的任一个；

286位的氨基酸为Glu、Gly、Pro或Tyr中的任一个；

288位的氨基酸为Asn、Asp、Glu或Tyr中的任一个；

291位的氨基酸为Asp、Glu、Gly、His、Ile、Gln或Thr中的任一个；

292位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中的任一个；

301位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；

302位的氨基酸为Ile；

303位的氨基酸为Asp、Gly或Tyr中的任一个；

304位的氨基酸为Asp、His、Leu、Asn或Thr中的任一个；

305位的氨基酸为Glu、Ile、Thr或Tyr中的任一个；

311位的氨基酸为Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中的任一个；

313位的氨基酸为Phe；

315位的氨基酸为Leu；

317位的氨基酸为Glu或Gln；

323位的氨基酸为Ile；

334位的氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile、Leu、Pro或Thr中的任一个；

336位的氨基酸为Glu、Lys或Tyr中的任一个；

337位的氨基酸为Glu、His或Asn中的任一个；

376位的氨基酸为Ala或Val中的任一个；

377位的氨基酸为Gly或Lys中的任一个；

378位的氨基酸为Asp；

379位的氨基酸为Asn；

380位的氨基酸为Ala、Asn或Ser中的任一个；

382位的氨基酸为Ala或Ile中的任一个；

385位的氨基酸为Glu；

392位的氨基酸为Thr；

396位的氨基酸为Leu；

421位的氨基酸为Lys；

427位的氨基酸为Asn；

428位的氨基酸为Phe或Leu中的任一个；

429位的氨基酸为Met；

434位的氨基酸为Trp；

436位的氨基酸为Ile；以及

440位的氨基酸为Gly、His、Ile、Leu或Tyr中的任一个。

25. 权利要求15~24中任一项所述的方法，其中，上述EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG的Fc区是：EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG1、天然型人IgG2、天然型人IgG3或天然型人IgG4的任一个的Fc区。

26. 权利要求15~25中任一项所述的方法，其中，上述人Fcγ受体为FcγRIa、FcγRIIa(R)、FcγRIIa(H)、FcγRIIb、FcγRIIIa(V)或FcγRIIIa(F)。

27. 权利要求15~25中任一项所述的方法，其中，上述人Fcγ受体为FcγRIIb。

28. 权利要求22~27中任一项所述的方法，其中，上述Fc区是在Fc区的以EU编号表示的位点中含有以下的至少一个以上的氨基酸的Fc区：

238位的氨基酸为Asp，或

328位的氨基酸为Glu。

29. 以下(i)~(vii)的任一项所述的方法，该方法包括：使抗原结合分子中的Fcγ受体结合结构域在pH中性范围条件下的Fcγ受体结合活性较EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG的Fc区在pH中性范围条件下的Fcγ受体结合活性增强的步骤，所述抗原结合分子含有在pH酸性范围条件下具有人FcRn结合活性、且对抗原的结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域以及Fcγ受体结合结构域，

(i) 使结合的抗原向细胞内的摄入得到促进的抗原结合分子的改变方法；

(ii) 使一分子的抗原结合分子可结合的抗原数目增加的方法；

(iii) 使抗原结合分子的血浆中抗原消除能力增大的方法；

(iv) 改善抗原结合分子的药代动力学的方法；

(v) 促进在细胞外与抗原结合分子结合的抗原在细胞内从抗原结合分子解离的方法；

(vi) 促进在与抗原结合的状态下摄入到细胞内的抗原结合分子在不与抗原结合的状态下向细胞外释放的方法；或

(vii) 可减少血浆中的总抗原浓度或游离抗原浓度的抗原结合分子的改变方法。

30. 权利要求29所述的方法，其中，上述抗原为可溶型抗原。

31. 权利要求29或30所述的方法，其中，上述离子浓度为钙离子浓度。

32. 权利要求31所述的方法，其中，上述抗原结合结构域为在高钙离子浓度条件下的抗原结合活性高于在低钙离子浓度条件下对该抗原的结合活性的抗原结合结构域。

33. 权利要求29或30所述的方法，其中，上述离子浓度条件为pH条件。

34. 权利要求33所述的方法，其中，上述抗原结合结构域为在pH中性范围条件下的抗原结合活性高于在pH酸性范围条件下对该抗原的结合活性的抗原结合结构域。

35. 权利要求29~34中任一项所述的方法，其中，上述抗原结合分子为具有针对上述抗原的中和活性的抗原结合分子。

36. 权利要求29~35中任一项所述的方法，其中，上述Fcγ受体结合结构域含有抗体的Fc区。

37. 权利要求36所述的方法，其中，上述Fc区是在Fc区的以EU编号表示的位点中以下的任一个以上的氨基酸与天然型Fc区的对应位点的氨基酸不同的Fc区：221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、243位、244位、245位、246位、247位、249位、250位、251位、254位、255位、256位、258位、260位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、339位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位和440位。

38. 权利要求37所述的方法，其中，上述Fc区是在Fc区的以EU编号表示的位点中含有选自以下的至少一个以上的氨基酸的Fc区：

221位的氨基酸为Lys或Tyr中的任一个；

222位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个；

223位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Lys中的任一个；

224位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个；

225位的氨基酸为Glu、Lys或Trp中的任一个；

227位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；

228位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；

230位的氨基酸为Ala、Glu、Gly或Tyr中的任一个；

231位的氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一个；

232位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；

240位的氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一个；

241位的氨基酸为Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中的任一个；

243位的氨基酸为Leu、Glu、Leu、Gln、Arg、Trp或Tyr中的任一个；

244位的氨基酸为His；

245位的氨基酸为Ala；

246位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；

249位的氨基酸为Glu、His、Gln或Tyr中的任一个；

250位的氨基酸为Glu或Gln中的任一个；

251位的氨基酸为Phe；

254位的氨基酸为Phe、Met或Tyr中的任一个；

255位的氨基酸为Glu、Leu或Tyr中的任一个；

256位的氨基酸为Ala、Met或Pro中的任一个；

258位的氨基酸为Asp、Glu、His、Ser或Tyr中的任一个；

260位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；

262位的氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中的任一个；

263位的氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一个；

266位的氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一个；

273位的氨基酸为Phe或Ile中的任一个；

275位的氨基酸为Leu或Trp中的任一个；

279位的氨基酸为Ala；

281位的氨基酸为Asp、Lys、Pro或Tyr中的任一个；

282位的氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一个；

284位的氨基酸为Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中的任一个；

285位的氨基酸为Asp、Glu、Lys、Gln、Trp或Tyr中的任一个；

286位的氨基酸为Glu、Gly、Pro或Tyr中的任一个；

288位的氨基酸为Asn、Asp、Glu或Tyr中的任一个；

291位的氨基酸为Asp、Glu、Gly、His、Ile、Gln或Thr中的任一个；

292位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中的任一个；

301位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；

302位的氨基酸为Ile；

303位的氨基酸为Asp、Gly或Tyr中的任一个；

304位的氨基酸为Asp、His、Leu、Asn或Thr中的任一个；

305位的氨基酸为Glu、Ile、Thr或Tyr中的任一个；

311位的氨基酸为Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中的任一个；

313位的氨基酸为Phe；

315位的氨基酸为Leu；

317位的氨基酸为Glu或Gln；

323位的氨基酸为Ile；

334位的氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile、Leu、Pro或Thr中的任一个；

336位的氨基酸为Glu、Lys或Tyr中的任一个；

337位的氨基酸为Glu、His或Asn中的任一个；

376位的氨基酸为Ala或Val中的任一个；

377位的氨基酸为Gly或Lys中的任一个；

378位的氨基酸为Asp；

379位的氨基酸为Asn；

380位的氨基酸为Ala、Asn或Ser中的任一个；

382位的氨基酸为Ala或Ile中的任一个；

385位的氨基酸为Glu；

392位的氨基酸为Thr；

396位的氨基酸为Leu；

421位的氨基酸为Lys；

427位的氨基酸为Asn；

428位的氨基酸为Phe或Leu中的任一个；

429位的氨基酸为Met；

434位的氨基酸为Trp；

436位的氨基酸为Ile；以及

440位的氨基酸为Gly、His、Ile、Leu或Tyr中的任一个。

39. 权利要求29~38中任一项所述的方法，其中，上述EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG的Fc区是：EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG1、天然型人IgG2、天然型人IgG3或天然型人IgG4的任一个的Fc区。

40. 权利要求29~39中任一项所述的方法，其中，上述人Fcγ受体为FcγRIa、FcγRIIa(R)、FcγRIIa(H)、FcγRIIb、FcγRIIIa(V)或FcγRIIIa(F)。

41. 权利要求29~39中任一项所述的方法，其中，上述人Fcγ受体为FcγRIIb。

42. 权利要求36~41中任一项所述的方法，上述Fc区是在Fc区的以EU编号表示的位点中含有以下的至少一个以上的氨基酸的Fc区：

238位的氨基酸为Asp，或

328位的氨基酸为Glu。

43. 抗原结合分子的制备方法，该方法包括以下(a)~(f)的步骤：

(a) 获得在高钙离子浓度条件下抗原结合结构域对抗原的结合活性的步骤；

(b) 获得在低钙离子浓度条件下抗原结合结构域的抗原结合活性的步骤；

(c) 选择在(a)中获得的抗原结合活性高于在(b)中获得的抗原结合活性的抗原结合结构域的步骤；

(d) 使编码在(c)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸与编码Fcγ受体结合结构域的多核苷酸连接的步骤，所述Fcγ受体结合结构域是：在pH酸性范围条件下具有人FcRn结合活性，且在pH中性范围条件下Fcγ受体结合活性与EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG的Fc区的Fcγ受体结合活性相比高的Fcγ受体结合结构域；

(e) 培养导入了有效连接有在(d)中获得的多核苷酸的载体的细胞的步骤；以及

(f) 从在(e)中培养的细胞培养液中回收抗原结合分子的步骤。

44. 抗原结合分子的制备方法，该方法包括以下(a)~(f)的步骤：

(a) 获得在高钙离子浓度条件下抗体对抗原的结合活性的步骤；

(b) 获得在低钙离子浓度条件下抗体的抗原结合活性的步骤；

(c) 选择在(a)中获得的抗原结合活性高于在(b)中获得的抗原结合活性的抗体的步骤；

(d) 使编码在(c)中选择的抗体的抗原结合结构域的多核苷酸与编码Fcγ受体结合结构域的多核苷酸连接的步骤，所述Fcγ受体结合结构域是：在pH酸性范围具有人FcRn结合活性，且在pH中性范围条件下Fcγ受体结合活性与EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG的Fc区的Fcγ受体结合活性相比高的Fcγ受体结合结构域；

(f) 从在(e)中培养的细胞培养液中回收抗原结合分子的步骤。

45. 抗原结合分子的制备方法，该方法包括以下(a)~(f)的步骤：

(a) 获得在pH中性范围条件下抗原结合结构域对抗原的结合活性的步骤；

(b) 获得在pH酸性范围条件下抗原结合结构域的抗原结合活性的步骤；

(f) 从在(e)中培养的细胞培养液中回收抗原结合分子的步骤。

46. 抗原结合分子的制备方法，该方法包括以下(a)~(f)的步骤：

(a) 获得在pH中性范围条件下抗体对抗原的结合活性的步骤；

(b) 获得在pH酸性范围条件下抗体对抗原的抗原结合活性的步骤；

(d) 使编码在(c)中选择的抗体的抗原结合结构域的多核苷酸与编码Fcγ受体结合结构域的多核苷酸连接的步骤，所述Fcγ受体结合结构域是：在pH酸性范围条件下具有人FcRn结合活性，且在pH中性范围条件下Fcγ受体结合活性与EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG的Fc区的Fcγ受体结合活性相比高的Fcγ受体结合结构域；

(f) 从在(e)中培养的细胞培养液中回收抗原结合分子的步骤。

47. 权利要求43~46中任一项所述的制备方法，其中，上述抗原为可溶型抗原。

48. 权利要求43~47中任一项所述的制备方法，其中，上述Fcγ受体结合结构域含有抗体的Fc区。

49. 权利要求48所述的制备方法，其中，上述Fc区是在Fc区的以EU编号表示的位点中选自以下的至少一个以上的氨基酸与天然型Fc区的对应位点的氨基酸不同的Fc区：221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、243位、244位、245位、246位、247位、249位、250位、251位、254位、255位、256位、258位、260位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、339位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位和440位。

50. 权利要求49所述的制备方法，其中，上述Fc区是在Fc区的以EU编号表示的位点中含有选自以下的至少一个以上的氨基酸的Fc区：

221位的氨基酸为Lys或Tyr中的任一个；

222位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个；

223位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Lys中的任一个；

224位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个；

225位的氨基酸为Glu、Lys或Trp中的任一个；

227位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；

228位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；

230位的氨基酸为Ala、Glu、Gly或Tyr中的任一个；

231位的氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一个；

232位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；

240位的氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一个；

241位的氨基酸为Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中的任一个；

243位的氨基酸为Leu、Glu、Leu、Gln、Arg、Trp或Tyr中的任一个；

244位的氨基酸为His；

245位的氨基酸为Ala；

246位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；

249位的氨基酸为Glu、His、Gln或Tyr中的任一个；

250位的氨基酸为Glu或Gln中的任一个；

251位的氨基酸为Phe；

254位的氨基酸为Phe、Met或Tyr中的任一个；

255位的氨基酸为Glu、Leu或Tyr中的任一个；

256位的氨基酸为Ala、Met或Pro中的任一个；

258位的氨基酸为Asp、Glu、His、Ser或Tyr中的任一个；

260位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；

262位的氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中的任一个；

263位的氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一个；

266位的氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一个；

273位的氨基酸为Phe或Ile中的任一个；

275位的氨基酸为Leu或Trp中的任一个；

279位的氨基酸为Ala；

281位的氨基酸为Asp、Lys、Pro或Tyr中的任一个；

282位的氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一个；

284位的氨基酸为Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中的任一个；

285位的氨基酸为Asp、Glu、Lys、Gln、Trp或Tyr中的任一个；

286位的氨基酸为Glu、Gly、Pro或Tyr中的任一个；

288位的氨基酸为Asn、Asp、Glu或Tyr中的任一个；

291位的氨基酸为Asp、Glu、Gly、His、Ile、Gln或Thr中的任一个；

292位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中的任一个；

301位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；

302位的氨基酸为Ile；

303位的氨基酸为Asp、Gly或Tyr中的任一个；

304位的氨基酸为Asp、His、Leu、Asn或Thr中的任一个；

305位的氨基酸为Glu、Ile、Thr或Tyr中的任一个；

311位的氨基酸为Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中的任一个；

313位的氨基酸为Phe；

315位的氨基酸为Leu；

317位的氨基酸为Glu或Gln；

323位的氨基酸为Ile；

334位的氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile、Leu、Pro或Thr中的任一个；

336位的氨基酸为Glu、Lys或Tyr中的任一个；

337位的氨基酸为Glu、His或Asn中的任一个；

376位的氨基酸为Ala或Val中的任一个；

377位的氨基酸为Gly或Lys中的任一个；

378位的氨基酸为Asp；

379位的氨基酸为Asn；

380位的氨基酸为Ala、Asn或Ser中的任一个；

382位的氨基酸为Ala或Ile中的任一个；

385位的氨基酸为Glu；

392位的氨基酸为Thr；

396位的氨基酸为Leu；

421位的氨基酸为Lys；

427位的氨基酸为Asn；

428位的氨基酸为Phe或Leu中的任一个；

429位的氨基酸为Met；

434位的氨基酸为Trp；

436位的氨基酸为Ile；以及

440位的氨基酸为Gly、His、Ile、Leu或Tyr中的任一个。

51. 权利要求43~50中任一项所述的制备方法，其中，上述EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG的Fc区是：EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG1、天然型人IgG2、天然型人IgG3或天然型人IgG4的任一个的Fc区。

52. 权利要求43~51中任一项所述的制备方法，其中，上述人Fcγ受体为FcγRIa、FcγRIIa(R)、FcγRIIa(H)、FcγRIIb、FcγRIIIa(V)或FcγRIIIa(F)。

53. 权利要求43~51中任一项所述的制备方法，其中，上述人Fcγ受体为FcγRIIb。

54. 权利要求48~53中任一项所述的制备方法，其中，上述Fc区是在Fc区的以EU编号表示的位点中含有以下的至少一个以上的氨基酸的Fc区：

238位的氨基酸为Asp，或

328位的氨基酸为Glu。