JP3991280B2 - 抗体作製方法 - Google Patents

Description

技術分野
本発明は、抗体の作製方法に関する。また本発明は、本発明の抗体作製方法により得られた抗体に関する。さらに本発明は、本発明の抗体作製に有用な、トランスジェニック非ヒト動物に関する。
背景技術
抗体は様々な疾患の治療薬、診断薬、あるいは試薬などとして有用である。現在までに多くの抗体が取得されてきた。抗体を作製するための一般的な方法としては、抗原をマウスなどの哺乳動物に投与して、該動物の血清から抗体を取得する方法が用いられている。抗体の作製において、たとえば次のような場合には、目的とする抗体を効率的に得られないことがある。
・哺乳動物に免疫する抗原の量が少い
・抗原が十分に精製されていない
したがって、免疫に当たっては、十分に精製された多量の抗原を用意することが望ましい。しかし現実には、抗原の中には精製が困難なものや、十分な量を用意することが困難なものも多い。つまり抗原の調製工程が、しばしば抗体作製における障害となっていた。
免疫原の調製が困難な抗原の一つとして、膜蛋白質を示すことができる。一般に、膜蛋白質を大量に発現させることや十分に精製することは困難な場合が多い。このことが膜蛋白質に対する抗体の取得における障害となっていた。
膜蛋白質を大量に発現させる方法として、バキュロウイルスを利用する方法が注目されている。目的の膜蛋白質をコードする遺伝子をバキュロウイルスゲノムに導入することによって、出芽バキュロウイルスの膜上に目的の膜蛋白質が発現される（ＷＯ９８／４６７７７、特開２００１−３３３７７３）。これらの方法を用いるとバキュロウイルスの膜上に目的とする膜蛋白質を大量に発現させることができる。
ところが、こうして得られるバキュロウイルスの膜上には、外来性の膜蛋白質以外にもバキュロウイルス由来の膜蛋白質が発現している。そのため、出芽バキュロウイルスを免疫原として抗体を作製した場合には、バキュロウイルス由来の膜蛋白質に対する抗体も産生される。その結果、公知の免疫方法によって効率よく目的の膜蛋白質に対する抗体を作製することは困難であった。
たとえば、出芽バキュロウイルスによる免疫は、しばしばｇｐ６４を認識する抗体を誘導する。ｇｐ６４は、バキュロウイルスの膜蛋白質に大量に含まれている。加えて、ｇｐ６４は、抗原性が高いため免疫動物において非自己と認識されやすい。結果的に、出芽バキュロウイルスは、抗ｇｐ６４抗体を優先的に誘導すると考えられる。
したがって、バキュロウイルス膜上に発現した目的の膜蛋白質を抗原として使用するためには、該膜蛋白質を十分に精製する必要がある。ところが、一般に出芽バキュロウイルスから外来性の膜蛋白質を精製することは難しい。したがって、免疫に十分な量の、高度に精製された膜蛋白質を得ることは、現実にはできないといってよい。このような精製が困難な抗原については、通常の方法によって目的とする抗体を得ることは困難であった。
発明の開示
本発明は上記の問題点を解決することを目的とする。すなわち本発明は、目的とする抗体を容易に得ることができる抗体の製造方法の提供を課題とする。また本発明は、目的とする抗体を効率良く産生するトランスジェニック非ヒト動物の提供を課題とする。
本発明者らは上記課題を解決するために、免疫原に含まれる目的とする抗体の取得を妨げる抗原の存在に着目した。そして、この種の抗原に対する免疫応答を抑制した免疫動物を用いることによって、目的とする抗体を容易に得ることができると考えた。更に、目的とする抗体の取得を妨げる抗原に対する免疫寛容を利用して免疫動物の免疫応答を調節すれば、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成した。
すなわち本発明は、以下の抗体作製方法、該方法に有用なトランスジェニック非ヒト動物、並びに該非ヒト動物の製造方法に関する。
〔１〕免疫原に含まれている背景抗原に対して免疫寛容を有する非ヒト動物を、標的抗原と背景抗原を含む免疫原で免疫し、標的抗原に対する抗体または抗体をコードする遺伝子を取得する工程を含む標的抗原を認識する抗体の作製方法。
〔２〕免疫寛容を人為的に誘導することを特徴とする〔１〕に記載の方法。
〔３〕非ヒト動物がトランスジェニック非ヒト動物である〔１〕に記載の方法。
〔４〕以下の工程を含む、標的抗原に対する抗体の作製方法。
（ａ）標的抗原と背景抗原を含む免疫原を調製する工程、
（ｂ）背景抗原をコードする遺伝子を発現可能に保持したトランスジェニック非ヒト動物を作製する工程、
（ｃ）（ａ）の免疫原を（ｂ）のトランスジェニック非ヒト動物に投与する工程、および
（ｄ）トランスジェニック非ヒト動物から標的抗原に対する抗体を採取する工程
〔５〕免疫原がウイルス粒子、またはその一部である〔４〕に記載の方法。
〔６〕ウイルスがバキュロウイルスである〔５〕に記載の方法。
〔７〕標的抗原が膜蛋白質である〔４〕に記載の方法。
〔８〕背景抗原がｇｐ６４である〔６〕に記載の方法。
〔９〕非ヒト動物がマウスである〔４〕に記載の方法。
〔１０〕〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の方法により作製された抗体。
〔１１〕〔１０〕に記載の抗体を元にして作製した非ヒト動物−ヒトキメラ抗体、またはヒト型化抗体。
〔１２〕ウイルス由来膜蛋白質をコードする遺伝子が導入されたトランスジェニック非ヒト動物。
〔１３〕ウイルスがバキュロウイルスである〔１２〕に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
〔１４〕ウイルス由来膜蛋白質がｇｐ６４である〔１３〕に記載の非ヒト動物。
〔１５〕非ヒト動物がマウスである〔１２〕に記載の非ヒト動物。
〔１６〕ウイルス由来蛋白質を含む抗原に対する抗体製造用である〔１２〕に記載の非ヒト動物。
〔１７〕背景抗原をコードする遺伝子を導入したトランスジェニック非ヒト動物を作製する工程を含む非ヒト免疫動物の製造方法。
〔１８〕〔１７〕に記載の方法によって製造された、背景抗原を含む標的抗原に対する抗体を得るための非ヒト免疫動物。
〔１９〕次の工程を含む、ＰｅｐＴ１に対する抗体の製造方法。
ａ）ＰｅｐＴ１またはその断片をコードするＤＮＡを発現可能に保持したバキュロウイルスを調製する工程
ｂ）ａ）のバキュロウイルスを宿主細胞に感染させ、ＰｅｐＴ１またはその断片を発現した出芽ウイルスを得る工程
ｃ）バキュロウイルスの膜蛋白質ｇｐ６４をコードする遺伝子を発現可能に保持したトランスジェニック非ヒト動物を作製する工程
ｄ）ｃ）のトランスジェニック非ヒト動物にｂ）の出芽ウイルスまたはＰｅｐＴ１またはその断片を含む分画を免疫する工程、および
ｅ）免疫動物から、ＰｅｐＴ１を認識する抗体を回収する工程
本発明は、免疫原に含まれている背景抗原に対して免疫寛容を有する非ヒト動物を、標的抗原と背景抗原を含む免疫原で免疫する工程を含む標的抗原を認識する抗体の作製方法に関する。
本発明において、標的抗原とは、目的とする抗体が認識する抗原を言う。標的抗原は、抗原性を有する任意の物質から選択することができる。具体的には、蛋白質、糖鎖、脂質、あるいは無機物質などが抗原性を示す物質として知られている。標的抗原は、天然に存在するものであることもできるし、人工的に合成されたものであっても良い。人工的に合成されたものには、遺伝子工学技術を利用して作製された組み換え蛋白質や、化学的に合成された様々な有機物質が含まれる。
一方、本発明において、背景抗原（ｂａｃｋ ｇｒｏｕｎｄ ａｎｔｉｇｅｎｓ）とは、抗体の産生を希望しない抗原決定基を有する物質、またはその抗原決定基そのものを言う。たとえば、標的抗原に混在する標的抗原以外の抗原性物質は、背景抗原である。代表的な背景抗原は、粗精製状態の標的抗原に混在する蛋白質である。より具体的には、組み換え蛋白質に含まれる宿主に由来する蛋白質を、背景抗原として示すことができる。背景抗原とは、目的とする抗体産生を誘導するための免疫原に含まれ、目的としない抗体の産生を誘導する原因となる抗原と定義することもできる。
一般に、背景抗原とは、標的抗原以外の抗原性物質である。しかし本発明においては、標的抗原と同じ分子上に存在する抗原決定基を背景抗原と言う場合もある。たとえば標的抗原と同じ分子上に抗体の産生を希望しない抗原決定基がある場合、該抗原決定基は背景抗原である。あるいは背景抗原である抗原決定基を含み、かつ標的抗原を含まない物質は、本発明における背景抗原に含まれる。
本発明における好ましい背景抗原として、蛋白質、ペプチド、糖、あるいは糖タンパク質を示すことができる。中でも、蛋白質あるいはペプチドは、本発明における特に好ましい背景抗原である。ペプチドとは、たとえば１００以下のアミノ酸残基からなるポリペプチドを言う。ペプチドは蛋白質に含まれる。
本発明において免疫寛容（ｉｍｍｕｎｏｔｏｌｅｒａｎｃｅ）とは、免疫寛容の対象となる抗原（寛容原；ｉｍｍｕｎｏｔｏｌｅｒａｎｃｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ）に対して特異的に免疫応答が失われるか、または低下することを言う。正常な免疫動物の寛容原に対する免疫応答に対して、ある個体の同じ寛容原に対する免疫応答が低下しているとき、この個体は寛容原に対する免疫寛容を有すると言う。たとえば寛容原を投与した場合に産生される寛容原に対する抗体の量が減少していれば、免疫応答が低下していると見なすことができる。免疫寛容のレベルは制限されない。
なお寛容原とは、その個体の免疫応答が低下している抗原性物質を言う。また本発明において寛容原に対して特異的な免疫応答の低下とは、他の抗原に対する免疫応答と比較して、寛容原に対する免疫応答の低下のレベルが大きいことを言う。したがって、寛容原以外の抗原に対する免疫応答が低下していても、その低下のレベルが寛容原に対する免疫応答のレベルよりも小さい場合には、免疫寛容が成立している。また本発明における免疫寛容は、背景抗原以外の抗原性物質に対する免疫寛容を伴っている場合も含む。複数の抗原に対する免疫寛容を有する場合であっても、標的抗原に対する免疫応答を有する限り本発明に利用することができる。一方、免疫応答そのものが低下している免疫不全状態は、標的抗原に対する抗体の産生が期待できないので望ましくない。
本発明は、背景抗原に対して免疫寛容を有する非ヒト動物を免疫動物として利用する。本発明における免疫寛容を有する非ヒト動物は、人為的に免疫寛容を誘導されていることが好ましい。免疫寛容を有する非ヒト動物は、たとえば次のようにして作製することができる。
まず、背景抗原をコードする遺伝子を非ヒト動物に導入し、背景抗原遺伝子トランスジェニック動物を作製することができる。トランスジェニック動物は、導入された遺伝子の発現産物（背景抗原）に対して免疫寛容となる。また、胎児期ないし生後間もない非ヒト動物に寛容原（背景抗原）を複数回投与することにより、免疫寛容を誘導することもできる。
胎児期または生後間もない非ヒト動物に寛容原となる抗原を投与する方法としては、抗原となる物質そのものを非ヒト動物に投与する方法を示すことができる。その他、寛容原を間接的に投与することもできる。例えば、生体内で寛容原をコードする遺伝子を発現させることによって、目的とする寛容原を投与することもできる。このような方法の例としては、抗原をコードするＤＮＡを直接投与する方法（ｎａｋｅｄ ＤＮＡ ｍｅｔｈｏｄ）や、抗原を発現する細胞を非ヒト動物に移植する方法、ウイルスベクターを用いる方法、ＤＮＡワクチンを用いる方法などを挙げることができる。
これらの方法の中でも、寛容原をコードする遺伝子を発現可能な状態で保持したトランスジェニック非ヒト動物は、本発明における免疫寛容を有する非ヒト動物として好ましい。トランスジェニック動物は、免疫機能が成熟する前に、本来は外来性の蛋白質である寛容原を生体内に有している。そのため、免疫機能は、寛容原を完全に自己と見なす可能性が非常に高い。したがって、本発明における免疫寛容を誘導する方法としては、トランスジェニック非ヒト動物を利用することは有利である。寛容原を導入したトランスジェニック動物において、寛容原に対する抗体がほとんど産生されないことは、実施例においても示したとおりである。
またトランスジェニック動物は、免疫寛容の形質を子孫に伝えることができる。したがって、本発明のためのトランスジェニック非ヒト動物が樹立されれば、同様の形質を有する免疫動物を安定して供給することができる。
本発明はまた、ウイルス由来蛋白質を含む抗原に対する抗体製造用の、ウイルス由来膜蛋白質をコードする遺伝子が導入されたトランスジェニック非ヒト動物に関する。あるいは本発明は、ウイルス由来膜蛋白質をコードする遺伝子発現可能に保持したトランスジェニック非ヒト動物の、ウイルス由来蛋白質を含む抗原に対する抗体を製造するための免疫動物としての使用に関する。更に本発明は、背景抗原をコードする遺伝子を導入したトランスジェニック非ヒト動物を作製する工程を含む非ヒト免疫動物の製造方法に関する。
様々な遺伝子が導入されたトランスジェニック非ヒト動物が公知である。しかし背景抗原をコードする外来性遺伝子を導入した動物が、背景抗原を含む標的抗原の免疫動物として有用であることは知られていない。
標的抗原蛋白を欠失させた遺伝子欠損動物（いわゆるノックアウト動物）は、標的抗原を先天的に保有していないため、この遺伝子欠損動物に、標的抗原を投与することにより、抗原と投与される動物のそれとの相同性の高い蛋白であっても、標的抗原に対する抗体を得ることができる。この標的抗原欠損動物と当該トランスジェニック動物との交配で標的抗原蛋白欠損・寛容原発現動物も作出可能である。
また、胎児期あるいは生後間もない非ヒト動物に、ｎａｋｅｄ ＤＮＡ法やＤＮＡワクチン、あるいは背景抗原を発現している細胞を移植する方法などにより胎児期以降に遺伝子を導入することも可能である。上記のように作製された非ヒト動物も本発明のトランスジェニック非ヒト動物に含まれる。
本発明に用いる免疫寛容を有する非ヒト動物において、免疫寛容を誘導するための背景抗原の数は限定されない。すなわち、少なくとも１つの背景抗原に対して、免疫寛容が誘導された非ヒト動物を本発明の抗体作製方法に利用することができる。あるいは複数種の背景抗原に対して免疫寛容が誘導された非ヒト動物を免疫動物とすることもできる。
免疫動物において、免疫原に含まれる可能性のある、全ての背景抗原に対して、抗体の産生が抑制されることは必ずしも重要ではない。標的抗原に対する抗体の産生と取得が妨げられない範囲であれば、背景抗原を認識する抗体の産生は許容される。したがって、たとえば、主要な背景抗原に対してのみ免疫寛容が誘導された免疫動物であっても、本発明の好ましい免疫動物として利用することができる。
本発明において、非ヒト動物としては、例えば、サル、ブタ、イヌ、ラット、マウス、ウサギ、などを挙げることができる。たとえば、ラット、マウス、ハムスターなどのげっ歯類は、好ましい非ヒト動物である。トランスジェニック動物とすることで免疫寛容を誘導するには、げっ歯類のような、成熟が早く、遺伝子操作の手法が確立されている非ヒト動物が有利である。特にマウスは、これらの条件を高い水準で満たすことができる非ヒト動物である。
本発明は、ウイルス由来の膜蛋白質をコードする遺伝子を導入したトランスジェニック非ヒト動物に関する。本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、ウイルスの膜蛋白質が混在する標的抗原の免疫に有用である。本発明におけるウイルスの膜蛋白質とは、通常、出芽ウイルスの外披を構成する蛋白質を言う。バキュロウイルスであれば、たとえば、ｇｐ６４と呼ばれる蛋白質が膜蛋白質に相当する。
たとえば、バキュロウイルスのｇｐ６４に対する免疫寛容を有するトランスジェニック非ヒト動物は、バキュロウイルス発現系で製造した免疫原の免疫動物として有用である。バキュロウイルス発現系は、様々な蛋白質を製造することができる。したがって、このトランスジェニック動物とバキュロウイルス発現系を組み合せて利用することによって、様々な蛋白質抗原を標的抗原として、容易に目的とする抗体を得ることができる。
本発明における免疫原は、標的抗原と背景抗原を含む。既に述べたとおり、標的抗原や背景抗原を構成する物質は特に制限されない。免疫寛容を有する免疫動物を、背景抗原をコードする遺伝子の導入によって得る場合には、背景抗原は蛋白質である。免疫原は、標的抗原と背景抗原以外の物質を含むことができる。
また本発明において、免疫原に含まれる背景抗原の種類は制限されない。したがって、標的抗原に対する抗体の産生を妨げる背景抗原が複数種含まれた免疫原を本発明に用いることもできる。免疫動物が各背景抗原に対していずれも免疫寛容を有していれば、これらの背景抗原の存在は問題とならない。あるいは、標的抗原に対する抗体の取得を実質的に妨げることがない背景抗原については、免疫動物の免疫寛容の有無に関わらず、免疫原に含まれることが許される。
一般に、標的抗原は生物材料に由来する物質からなる。生物材料は、様々な成分を含む複雑な混合物である。したがって、標的抗原は、通常、多様な混合物を原料として調製されている。その結果、標的抗原を高度に精製することは困難である。言いかえれば、標的抗原を大量に、かつ高度に精製するには、多くの手間と時間を要する。つまり、免疫原が、標的抗原以外の物質を含むことは、事実上、避けられないといって良い。
具体的には、本発明の免疫原として、細胞、細胞培養液、細胞溶解物、ウイルス、あるいは未精製の抗原などを挙げることができる。細胞やウイルスなどは、その全体のみならず、その一部分のみを免疫原として用いることもできる。例えば、細胞膜やウイルスエンベロープ部分のみを免疫原として用いることも可能である。細胞やウイルスを用いる場合には、目的の抗原をコードする遺伝子を遺伝子組み換え技術により細胞やウイルスに導入して、目的の抗原を人為的に発現させたものを用いることができる。
本発明における望ましい免疫原の一つに、ウイルス粒子、またはその一部を示すことができる。ウイルスは、核酸と、限られた蛋白質や糖等の比較的単純な成分で構成されている。したがって、標的抗原の取得を妨害する背景抗原の種類も限られる。つまり、より少ない背景抗原についてのみ、免疫動物の免疫寛容を誘導すれば、本発明に基づく抗体の作製方法を実施することができる。
本発明において、免疫原として用いることができるウイルスの中では、たとえばバキュロウイルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）が好ましい。バキュロウイルスは、２本鎖ＤＮＡからなるゲノムがキャプシド蛋白質に覆われた構造を有する昆虫ウイルスである。中でもバキュロウイルスの一種である核多角体病ウイルス（ＮＰＶ）を利用した発現系は、外来性遺伝子の発現システムとして有用である。ＮＰＶは強力なプロモーター活性を有している。したがって、ＮＰＶのゲノムに外来性の遺伝子を組み込むことで、任意の蛋白質を大量に生産させることができる。具体的には、ポリヘドリンと呼ばれる蛋白質をコードする遺伝子を、任意の遺伝子に組み換えることによって、外来性の遺伝子の強力な発現が誘導される。
一方、バキュロウイルスに導入する外来性遺伝子には、任意の遺伝子を用いることができる。外来性遺伝子として、たとえば膜蛋白質をコードする遺伝子を用いることもできる。
バキュロウイルスを用いることによって、ウイルスの膜蛋白質とともに目的の膜蛋白質を、その構造を維持した状態で発現させることができる。また、発現生成物を出芽ウイルスとして容易に回収できることも、バキュロウイルス発現系の大きな利点である。
膜蛋白質には、受容体やトランスポーターなどの、生物学的に重要な分子が多い。しかし、多くの膜蛋白質は、細胞膜に存在することによってその構造を維持している。また、糖鎖や脂質による翻訳後修飾を伴うことも多い。そのため膜蛋白質は、大腸菌などの原核生物を用いた発現系では、しばしば本来の構造を再現できない場合がある。
膜蛋白質等の外来性蛋白質のウイルス膜上への発現方法としては、例えば、ＷＯ９８／４６７７７及びＬｏｉｓｅｌら（Ｔ．Ｐ．Ｌｏｉｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：１３００−１３０４（１９９７））の出芽バキュロウイルスを用いた膜タンパク質の発現方法を挙げることができる。より詳細には、外来性蛋白質をコードする遺伝子を含む昆虫細胞用の組換えベクターを作製し、バキュロウイルスＤＮＡと共にＳｆ９等の昆虫細胞へ導入する。すると、組換えベクターにコードされる外来性蛋白質は、感染細胞が死滅する前に感染細胞より細胞外に放出される成熟ウイルス粒子（ビリオン）上に発現され、外来性蛋白質を発現する組換えウイルスを得ることができる。
本発明において、出芽ウイルスとは出芽（ｂｕｄｄｉｎｇ）により感染細胞から放出されるウイルスのことである。一般に細胞膜を被ったウイルスは細胞が破壊されていない状態でも当該ウイルスに感染した細胞から発芽し、継続的に放出されるのに対し、膜を被らないアデノウイルスや、核膜を被ったヘルペスウイルスは細胞が破壊された時に一斉に放出される。本発明においては、特に出芽ウイルスが好ましい。また、本発明において組換えウイルスを感染させる宿主は、当業者であれば、用いるウイルスの種類に応じて、ウイルスの増殖を可能ならしめる宿主を適宜選択することができる。例えば、バキュロウイルスを用いる場合、Ｓｆ９等の昆虫細胞の使用が考えられる。一般に、バキュロウイルス−昆虫細胞を用いたタンパク質発現系は、哺乳動物細胞と同様に脂肪酸アセチル化及び糖鎖付加等の翻訳と同時または翻訳後の修飾が行われること、並びに、哺乳動物細胞系よりも異種タンパク質の発現レベルが高いこと（Ｌｕｃｋｏｗ Ｖ．Ａ．ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ Ｍ．Ｄ．，Ｖｉｒｏｌ．１６７：５６（１９８８））から有利な系であると考えられている。
外来性蛋白質を発現しているウイルスは、例えば、外来性蛋白質をコードする遺伝子を含む組換えウイルスを感染させた宿主を培養することによって得ることができる。または、上述のＷＯ９８／４６７７７及びＬｏｉｓｅｌら（Ｔ．Ｐ．Ｌｏｉｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：１３００−１３０４（１９９７））の方法の様に、外来性蛋白質をコードする組換えベクターをバキュロウイルスと共に昆虫細胞に導入することにより、細胞外へ放出されるバキュロウイルスの膜上に外来性蛋白質を発現させることもできる。また、Ｓｔｒｅｈｌｏｗら（Ｄ．Ｓｔｒｅｈｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９７：４２０９−４２１４（２０００））の方法のように、外来性蛋白質をコードする遺伝子を導入したＭｏｌｏｎｅｙウイルス由来ベクターより作製した組換えウイルスをＰＡ３１７等のパッケージング細胞に感染させることにより、細胞外へ放出されるＭｏｌｏｎｅｙ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａウイルスの膜上に外来性蛋白質を発現させることができる。しかしながら、本発明の免疫原に用いることができる外来性蛋白質を発現しているウイルスは、これらの方法により調製されたものに限定されない。
上述のようにして調製された組換えウイルスは、公知の手法により精製することができる。例えば、増加密度勾配遠心法（ａｕｇｍｅｎｔ ｄｅｎｓｉｔｙｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）（Ａｌｂｒｅｃｈｔｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８：２４５−２５６（１９９０）；Ｈｅｗｉｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ７：２２３−２２８（１９８３））、サイズ排除（ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）クロマトグラフィー（Ｈｊｏｒｔｈ ａｎｄ Ｍｅｒｅｎｏ−Ｌｏｐｅｚ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ５：１５１−１５８（１９８２）；Ｃｒｏｏｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．５０２：５９−６８（１９９０）；Ｍｅｎｔｏ Ｓ．Ｊ．（Ｖｉａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．）１９９４ Ｗｉｌｌｉａｍｓｂｕｒｇ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ）、モノクローナル抗体及びフコース硫酸含有多糖類等を利用したアフィニティークロマトグラフィー（Ｎａｊａｙｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３２：６７−７７（１９９１）；Ｄｉａｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６７：３４５−３５１（１９８６）；Ｆｏｗｌｅｒ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １１：５９−７４（１９８６）；特再表９７／０３２０１０）、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー（Ｈａｒｕｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １３：２６４−２６７（１９６１））等がウイルスを精製する方法として知られている。したがって、上述の方法、または、これらの方法を組み合せて精製しても良い。
本発明において、免疫動物を免疫寛容とするための寛容原となる背景抗原は、特に制限されない。免疫原中に含有量の多い物質や抗原性の強い物質などを寛容原とすることが好ましい。例えば、バキュロウイルスを免疫原として用いる場合には、ｇｐ６４を寛容原とすることが好ましい。ｇｐ６４は、ウイルス膜上に大量に発現しており、かつ免疫動物によって非自己と認識されやすい主要な背景抗原である。
バキュロウイルスは、外来性蛋白質の発現系としては望ましい特徴を有している。しかし一方で、発現産物を免疫原として用いる場合には、背景抗原の産生を伴うという問題点を有しているといえる。特に免疫原に用いるための膜蛋白質をバキュロウイルス発現系によって作製した場合には、ｇｐ６４の存在が大きな問題となる。ｇｐ６４はウイルスの膜蛋白質に大量に含まれている。そのため、外来性の膜蛋白質には、ｇｐ６４の混入が避けられない。
本発明の抗体作製方法によれば、背景抗原による標的抗原に対する抗体取得の妨害作用を抑制することができる。したがって、本発明を用いれば、バキュロウイルス発現系の外来性蛋白質の発現システムとしての利点を、免疫原の作製においても十分に生かすことが可能となる。
本発明において、天然のウイルスやその部分を免疫原とすることもできる。天然のウイルスにおいても、ウイルスの特異的な検出や、感染の予防または治療において、特定の抗原決定基を認識する抗体は、重要である。そして、主要な抗原に対する抗体が生成されやすいのに対して、特定の抗原決定基を認識する抗体を得ることがしばしば困難であることも、先に述べたバキュロウイルス発現産物を免疫原に利用する場合と共通している。
天然のウイルスを本発明の免疫原として用いる場合には、ウイルスを構成する蛋白質のうち、背景抗原として作用する蛋白質をコードする遺伝子を非ヒト動物に導入してトランスジェニック動物とする。一方、免疫原としては、ウイルス粒子そのもの、あるいは標的抗原を含むウイルスの部分を用いる。こうして、標的抗原を認識する抗体を、効率的に得ることができる。
たとえばインフルエンザウイルスの表面抗原は、ウイルスの株を決定する重要な抗原である。インフルエンザの株ごとに、その株に固有の表面抗原を認識する抗体を容易に得ることができれば、ウイルスの同定や、感染の予防または治療に有用である。しかしウイルス粒子をそのまま免疫原とした場合には、ウイルスに共通する構造を認識する抗体も多く産生される。
本発明を利用して、インフルエンザウイルスに共通するエンベローブ蛋白質に対して免疫寛容としたトランスジェニック非ヒト動物を利用すれば、各株に固有の表面抗原を認識する抗体を効率的に得ることができる。すなわち、ウイルス株に固有の表面抗原を標的抗原とし、ウイルスに共通の構造を背景抗原として、本発明を応用することができる。
本発明の抗体作製方法の好ましい態様を次に述べる。この態様においては、膜蛋白質を標的抗原として用いる。膜蛋白質としては、ヒト由来の膜蛋白質などを用いることができる。
まず標的蛋白質をバキュロウイルス膜上に発現させ、該バキュロウイルスを免疫原として用いる。バキュロウイルスを用いた膜蛋白質の発現方法としては、例えば、ＷＯ９８／４６７７７、特開２００１−３３３７７３及びＬｏｉｓｅｌら（Ｔ．Ｐ．Ｌｏｉｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：１３００−１３０４（１９９７））の出芽バキュロウイルスを用いた膜蛋白質の発現方法を利用することができる。
より詳細には、膜蛋白質をコードする遺伝子を含む昆虫細胞用の組換えベクターを作製し、バキュロウイルスＤＮＡと共に昆虫細胞へ導入する。昆虫細胞には、Ｓｆ９細胞等が利用される。組換えベクターにコードされる膜蛋白質は、感染細胞が死滅する前に感染細胞より細胞外に放出される成熟ウイルス粒子（ビリオン）上に発現される。したがって成熟ウイルス粒子の回収によって、膜蛋白質（標的抗原）を発現している出芽バキュロウイルスを得ることができる。培養細胞から出芽バキュロウイルスを回収する方法も公知である。このようにして得た膜蛋白質（標的抗原）を発現している出芽バキュロウイルスを本発明における免疫原として用いる。
バキュロウイルス膜上には膜蛋白質（標的抗原）以外にもバキュロウイルス由来の膜蛋白質が発現していることは既に述べたとおりである。特にｇｐ６４はバキュロウイルス膜上に大量に発現しており、かつ抗原性が高い。したがって出芽バキュロウイルスを免疫すると抗ｇｐ６４抗体が産生されてしまい、膜蛋白質（標的抗原）に対する抗体を効率よく取得できない。
そこで本発明においては、免疫動物として、ｇｐ６４を発現する動物を用いる。具体的には、ｇｐ６４をコードする遺伝子を含むベクターの導入によってｇｐ６４を発現するトランスジェニック動物を作製する。トランスジェニック動物としては、非ヒト動物が用いられる。たとえば、ｇｐ６４遺伝子を導入したトランスジェニックマウスが本発明における免疫動物に用いられる。
本発明においては、該トランスジェニックマウスが、先に取得した出芽バキュロウイルスで免疫される。ｇｐ６４発現トランスジェニックマウスはｇｐ６４をＥｎｄｏｇｅｎｏｕｓに発現するので、背景抗原であるｇｐ６４に対して免疫寛容になっている。つまり出芽バキュロウイルスで免疫したときの、抗ｇｐ６４抗体の産生が抑制される。その結果、標的抗原である膜蛋白質に対する抗体を効率よく産生することができる。
トランスジェニックマウスの作製方法は公知である。例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：７３８０−７３８４（１９８０）に記載の方法により、トランスジェニックマウスを得ることができる。具体的には、目的の遺伝子を哺乳動物の全能細胞に導入し、この細胞を個体へと発生させる。得られた個体のうち、体細胞および生殖細胞中に導入遺伝子が組み込まれてた個体を選別することによって、目的とするトランスジェニックマウスを作製することができる。遺伝子を導入する全能細胞としては、受精卵や初期胚のほか、多分化能を有するＥＳ細胞のような培養細胞などが挙げられる。
より具体的には、たとえば後で述べる実施例の方法により作製できる。
本発明の抗体の作製方法は、モノクローナル抗体やポリクローナル抗体の作製に利用することができる。免疫動物から標的抗原に対する抗体を採取することによって、ポリクローナル抗体を得ることができる。あるいは、免疫動物の抗体産生細胞をクローン化することによって、モノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞を得ることもできる。
更に、マウスなどの免疫動物に由来する抗体、あるいはその遺伝子を利用して、免疫動物とヒトのキメラ抗体や、ヒト型化抗体を得ることもできる。これらの改変された構造を有する抗体の作製方法も公知である。
更に本発明は、本発明の方法によって得ることができる抗体に関する。本発明の抗体は、上記のような方法を含む工程によって得ることができるあらゆる抗体を含む。したがって、たとえばモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、免疫動物とヒトのキメラ抗体、ヒト型化抗体、あるいはヒト抗体は、いずれも本発明に含まれる。たとえば、免疫システムをヒトの免疫システムに置換されたトランスジェニックマウスが公知である。このようなマウスに免疫することによって得ることができる抗体は、ヒト抗体である。
本発明における好ましい抗体として、ヒト膜蛋白質を認識する抗体を示すことができる。膜蛋白質は、創薬ターゲットとして重要なものが多く含まれる。一方で、精製が困難なために、特異的な抗体を得ることが難しいとされていた。しかし本発明によって、遺伝子組み換えによって作製された、背景抗原と共存した状態にある膜蛋白質であっても、目的とする抗体を効率良く得ることが可能となった。膜蛋白質としては、たとえばＰｅｐＴ１は重要な分子である。ＰｅｐＴ１の塩基配列、アミノ酸配列は既に知られている（ヒトＰｅｐＴ１：ＧｅｎＢａｎｋ ＸＭ＿００７０６３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（１２）：６４５６−６４６３（１９９５）；マウスＰｅｐＴ１：ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ２０５５４０、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１４９２：１４５−１５４（２０００））。
ＰｅｐＴ１に対する抗体の中でも、ＰｅｐＴ１の細胞外領域に結合する抗体は有用である。特にＰｅｐＴ１の細胞外領域に特異的に結合する抗体は、本発明による望ましい抗体である。本発明において、細胞外領域に対する特異的な結合とは、ＰｅｐＴ１の細胞外領域とそれ以外の領域を免疫学的に識別しうることを言う。より具体的には、細胞外領域には結合するが、細胞内領域等や膜貫通ドメインとは結合しない抗体を、ＰｅｐＴ１の細胞外領域に特異的に結合する抗体と言うことができる。本発明において、好ましいＰｅｐＴ１は、ヒトＰｅｐＴ１である。ヒトＰｅｐＴ１は、ヒトに由来のみならず、ヒトＰｅｐＴ１をバキュロウイルス発現系で発現させて得ることができる組み換え体であることもできる。
免疫原に用いられるヒトＰｅｐＴ１は、標的抗原の構造を維持していれば、必ずしも完全な分子である必要はない。たとえば、ＰｅｐＴ１の細胞外領域を含む断片を免疫原とすることもできる。本発明における免疫原として好ましいＰｅｐＴ１は、トランスポート活性を有するヒトＰｅｐＴ１、または全長ヒトＰｅｐＴ１である。中でも、トランスポート活性を有する全長ヒトＰｅｐＴ１は特に好ましい。ヒトＰｅｐＴ１のトランスポート活性は、基質を細胞内に取り込む作用を指標として検知することができる。ＰｅｐＴ１はグリシルザルコシン等を基質として取りこむことが知られている。グリシルザルコシンの取りこみは、［^１４Ｃ］グリシルザルコシン等を利用することにより評価することができる。
ヒトＰｅｐＴ１は膜上（例えば、ウイルス膜や細胞膜など）に発現していることが好ましい。ウイルス膜上に発現させたＰｅｐＴ１のトランスポート活性は、ウイルス溶液と基質とを接触させ、ウイルスによる基質の取りこみを観察することによって検出することができる。
免疫から抗体取得までの方法は公知の方法を用いることができる。免疫原による動物の免疫は、公知の方法にしたがって行われる。一般的方法としては、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は皮下に注射する。具体的には、免疫原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに対し、所望により通常のアジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に投与する。アジュバントには、たとえばフロイント完全アジュバントが用いられる。さらに、その後、フロイント不完全アジュバントに適量混合した免疫原を、４〜２１日毎に数回投与することが好ましい。
また、免疫原の免疫時に適当な担体を使用することができる。このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを常法により確認する。
目的の抗体を得るためには、血清中の所望の抗体レベルが上昇したことを確認した後、免疫した動物の血液を採取する。そして採取した血液から公知の方法により血清を分離する。ポリクローナル抗体としては、ポリクローナル抗体を含む血清を使用してもよいし、必要に応じこの血清からポリクローナル抗体を含む画分をさらに単離して、これを使用してもよい。
例えば、目的の抗原をカップリングさせたアフィニティーカラムを用いて、目的の抗原のみを認識する画分を得て、さらにこの画分をプロテインＡあるいはプロテインＧカラムを利用して精製することにより、免疫グロブリンＧあるいはＭを調製することができる。
モノクローナル抗体を得るには、上記抗原を感作した哺乳動物の血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から抗体産生細胞を採取してクローニングする。抗体産生細胞としては、たとえば脾細胞を用いることができる。抗体産生細胞のクローニングには、細胞融合法を用いることができる。前記抗体産生細胞と融合される他方の親細胞としては、たとえば哺乳動物のミエローマ細胞が用いられる。より好ましくは、融合細胞（ハイブリドーマ）の選択マーカーとなる、特殊な栄養要求性や薬剤耐性を有するミエローマ細胞が挙げられる。
前記抗体産生細胞とミエローマ細胞は、基本的には公知の方法に準じて細胞融合させることができる。細胞融合を利用したモノクローナル抗体の作製方法は、たとえばミルステインらによって確立されている（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３，３−４６）。
細胞融合により得られたハイブリドーマは、選択培養液で培養することにより選択される。選択培養液は、細胞融合に用いたミエローマ細胞の特性などに応じて選択される。選択培養液としては、たとえば、ＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）が用いられる。ハイブリドーマは、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、当該ＨＡＴ培養液で培養される。通常、数日〜数週間培養を継続することにより、ハイブリドーマを選択することができる。次いで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよびクローニングを行う。
次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスの腹水としてモノクローナル抗体を回収することができる。腹水からモノクローナル抗体を精製することもできる。モノクローナル抗体の精製には、例えば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、目的の抗原をカップリングしたアフィニティーカラムなどを利用することができる。
ハイブリドーマを用いて抗体を産生する以外に、抗体を産生する感作リンパ球等の抗体産生細胞を癌遺伝子（ｏｎｃｏｇｅｎｅ）やウイルスなどを用いること等により不死化させた細胞を用いることもできる。細胞を不死化するためのウイルスとしては、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）などを用いることができる。
このように得られたモノクローナル抗体はまた、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体とすることができる（例えば、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｃ．Ａ．Ｋ．ａｎｄ Ｌａｒｒｉｃｋ，Ｊ．Ｗ．，ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ ｂｙ ＭＡＣＭＩＬＬＡＮ ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ ＬＴＤ，１９９０参照）。組換え型抗体は、それをコードするＤＮＡをハイブリドーマ、または抗体を産生する感作リンパ球等の抗体産生細胞からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させる。本発明は、この組換え型抗体を包含する。
さらに、本発明の方法により得られた抗体は、その抗体断片や抗体修飾物であってよい。たとえば、抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ又は重鎖と軽鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，５８７９−５８８３）が挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させることによって、抗体断片を得ることができる。または、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６；Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．ａｎｄ Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４７６−４９６；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４９７−５１５；Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６５２−６６３；Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６６３−６６９；Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，Ｂ．Ｗ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，（１９９１）９，１３２−１３７参照）。
抗体修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。本発明の「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野において既に確立されている。
また、ヒト抗体の取得方法も知られている。ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を目的の抗原で免疫することで目的のヒト抗体を取得することができる（国際特許出願公開番号ＷＯ ９３／１２２２７，ＷＯ ９２／０３９１８，ＷＯ ９４／０２６０２，ＷＯ ９４／２５５８５，ＷＯ ９６／３４０９６，ＷＯ ９６／３３７３５参照）。
また、本発明の方法により得られた抗体は、免疫動物に由来する非ヒト抗体由来の可変領域とヒト抗体由来の定常領域からなるキメラ抗体とすることができる。また免疫動物に由来する非ヒト抗体のＣＤＲ（相補性決定領域）とヒト抗体由来のＦＲ（フレームワーク領域）および定常領域からなるヒト型化抗体とすることもできる。
これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。具体的には、たとえばキメラ抗体は、免疫動物の抗体の重鎖、および軽鎖の可変領域と、ヒト抗体の重鎖および軽鎖の定常領域からなる抗体である。免疫動物由来の抗体の可変領域をコードするＤＮＡを、ヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることによって、キメラ抗体を得ることができる。
ヒト型化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称される改変抗体である。ヒト型化抗体は、免疫動物由来の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）を、ヒト抗体の相補性決定領域へ移植することによって構築される。その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。
具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡをヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることによりヒト型化抗体を得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ ２３９４００、国際特許出願公開番号ＷＯ ９６／０２５７６参照）。ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９３）５３，８５１−８５６）。
更に、免疫動物の抗体産生細胞から、抗体をコードする遺伝子を取得することができる。抗体をコードする遺伝子を取得する方法は、制限されない。たとえば、可変領域やＣＤＲをコードする遺伝子を鋳型として、ＰＣＲ法によって当該遺伝子を増幅することによって抗体をコードする遺伝子を得ることができる。抗体遺伝子をＰＣＲ法によって増幅するためのプライマーが公知である。得られた遺伝子を適当な発現系を用いて発現させることによって、目的とする抗体を製造することができる。あるいは、本発明によって得られた遺伝子を、先に述べた種々の改変抗体を製造するために利用することもできる。
前記のように得られた抗体は、均一なイムノグロブリン分子にまで精製することができる。精製方法は、特に限定されない。本発明で使用される抗体の分離、精製は通常のポリペプチドで使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えば、アフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、イムノグロブリンを分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）。上記で得られた抗体の濃度は、吸光度の測定、または酵素結合免疫吸着検定法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ；ＥＬＩＳＡ）等により測定することができる。
アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。例えば、プロテインＡを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ Ｄ，ＰＯＲＯＳ，Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等が挙げられる。
アフィニティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ Ｄａｎｉｅｌ Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９６）。これらのクロマトグラフィーはＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
１） ｇｐ６４トランスジェニックベクターの構築
ｇｐ６４の塩基配列を配列番号：３に、またｇｐ６４遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を配列番号：４に示す（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ Ｎｏ．９６２７７４２）。ｇｐ６４の遺伝子配列を鋳型としＥｃｏＲＩ認識配列とＫＯＺＡＫ配列を５’末端に有する５’ｐｒｉｍｅｒ ６４Ｆ１（配列番号：１）とＥｃｏＲＩ認識配列を５’末端に有する３’ｐｒｉｍｅｒ ６４Ｒ１（配列番号：２）を用い（図１および図２）、以下の条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲ反応溶液の組成は、ｘ１０ ＥｘＴａｑ ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ，ＥｘＴａｑ付属ｄＮＴＰ ４μＬ，１０μｍｏｌｅ／Ｌ ６４Ｆ１ １μＬ，１０μｍｏｌｅ／Ｌ ６４Ｒ１ １μＬ，５００ｐｇ／μＬ ｐＢａｃ−Ｎ−ｂｌｕｅ １μＬ，５ｕｎｉｔ／μＬ ＥｘＴａｑ ０．５μＬ，ｄｉｗ ３７．５μＬとした。反応シーケンスは次のとおりである。
９４℃ ５ｍｉｎ→
（９４℃ １５ｓｅｃ，５７℃ ３０ｓｅｃ，７２℃ ３０ｓｅｃ）ｘ２５ ｃｙｃｌｅｓ→
７２℃ ７ｍｉｎ．→
４℃ ｆｏｒｅｖｅｒ
増幅されたバンドをｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙにサブクローニング後、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αをトランスフォームした。Ｔ７およびＳＰ６プライマーを用いてｃｏｌｏｎｙ ＰＣＲを行い、インサートが確認されたクローンを用いてＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ３７７ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒとＢｉｇＤｙｅ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｋｉｔとＴ７プライマーあるいはＳＰ６プライマーにより塩基配列を解析し目的の遺伝子を含むクローンを確認した。このクローンから塩基配列に変異が入っていないことを確認したｇｐ６４を含む断片をＥｃｏＲＩにより切り出し、同じくＥｃｏＲＩカットしたｐＣＡＧＧＳ１に挿入し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αをトランスフォームした。設計通りのクローンを２５０ｍＬのＬＢ培地を用い３７℃で一晩培養し、Ｅｎｄｏｆｒｅｅ ＭＡＸＩ ｋｉｔを用いて精製し５８１．６μｇのプラスミドを得た。
２） 遺伝子の導入
インジェクション用ＤＮＡフラグメントは、次のようにして調製した。まずｇｐ６４遺伝子を挿入したｐＣＡＧＧＳベクター（ｐＣＡＧ−ｇｐ６４；図３）を、ＳａｌＩおよびＰｓｔＩで処理した後、ｇｐ６４遺伝子を含む断片（約３．８ｋｂ）を切り出した。この断片（約３．８ｋｂ）を、Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）により回収し、３ｎｇ／μｌになるようにＰＢＳ⁻で希釈してインジェクション用ＤＮＡフラグメントとした。
ＤＮＡフラグメントを注入するマウス前核期卵は、次のようにして回収した。すなわち、まずＢＡＬＢ／ｃ系雌マウス（日本クレア）に５ｉ．ｕのＰＭＳＧを腹腔内投与、さらに４８時間後５ｉ．ｕのｈＣＧを腹腔内投与することによって、過排卵処理した。この雌マウスを同系統の雄マウスと交配させた。交配の翌朝、プラグを確認したマウスの卵管を潅流してマウス前核期卵を回収した。
インジェクション用ＤＮＡフラグメントは、マイクロマニピュレーターを用いて前核期卵へ注入した（ジーンターゲティングの最新技術（羊土社）、１９０−２０７ ２０００）。ＤＮＡフラグメントを３７３個のＢＡＬＢ／ｃ胚へ注入し、翌日、２細胞期に発生していた胚２１６個を、偽妊娠１日目の受容雌の卵管に片側当たり１０個前後（１匹あたり２０個前後）を移植した。
分娩予定日に至っても産仔を娩出しなかった受容雌については、帝王切開を施し里親に哺育させた。結果を表１にまとめた。５０例の産仔が得られ、そのうちの４例がｇｐ６４遺伝子が導入されたトランスジェニックマウス（以下、Ｔｇｍと記載する）であった。以下、最初に得られたマウスをＦｏｕｎｄｅｒと記載する。

Ｆｏｕｎｄｅｒは全て雄マウスで、これら４ラインの内２ライン（Ｎｏ．３０，Ｎｏ．３１）から、それぞれ４匹、２０匹の産仔（Ｆ１マウス）が得られた。得られたＦ１マウスの遺伝子型解析を行ったところ、ライン３０ではＴｇｍが３例存在しており、ｇｐ６４遺伝子の次世代への伝達を確認した。しかしながら、ライン３１では２０例全例においてｇｐ６４遺伝子が確認されない野生型のマウス（ｎｏｎ−Ｔｇｍ）であったことから、ライン３１のＦｏｕｎｄｅｒマウスはｇｐ６４遺伝子がモザイク状態で挿入されたマウスであったと思われた。また、ライン３４、４６のＦｏｕｎｄｅｒマウスは繁殖能がなく、全く産仔が得られなかった。ライン３０のＦｏｕｎｄｅｒマウスについても、交配開始直後の１腹分のみ相手雌を妊娠させることができたが、これ以降全く産仔が得られなくなってしまった（表２）。

そこで、体外受精を行うため、ライン３０、３４、４６のＦｏｕｎｄｅｒマウスの精子採取を試みたが、これら３例とも精巣が異常に小さく（図４）、精巣上体尾部には精子が存在せず、体外受精を行うことはできなかった。以上の結果から、ｇｐ６４蛋白質が、マウス造精能に影響を与えることが発見された。従ってｇｐ６４は避妊等に応用できる可能性があると考えられる。
３） 導入遺伝子の確認
３週齢になった時点でマウスの尾からＤＮＡを、核酸自動分離装置（ＫＵＲＡＢＯ）を用い抽出し、サザンブロット法およびＰＣＲ法による導入遺伝子の確認を行った。サザンブロット法による導入遺伝子の確認は、１５μｇのｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡをＥｃｏＲＩ処理、泳動後、ナイロンメンブレンへトランスファーし、ＥｃｏＲＩ処理したｐＣＡＧ−ｇｐ６４ベクターのｇｐ６４を含む約１．５ｋｂの断片をプローブに用い、トランスファーしたＤＮＡとハイブリダイズさせることにより行った。また約１００ｎｇのＤＮＡをテンプレートとし、次のプライマーを用いたＰＣＲ法によって導入遺伝子を確認した。

ＰＣＲの反応シーケンスは次のとおりである。
９４℃ ５ｍｉｎ→
（９４℃ １５ｓｅｃ，５７℃ ３０ｓｅｃ，７２℃ ３０ｓｅｃ）ｘ ３５ ｃｙｃｌｅｓ→
７２℃ ７ｍｉｎ→
４℃ ｆｏｒｅｖｅｒ
ＰＣＲ産物を泳動し、約１．５ｋｂのバンドの有無に基づいて導入遺伝子を確認した。
４） ｇｐ６４Ｔｇｍにおけるｇｐ６４遺伝子の発現確認
ｇｐ６４遺伝子の次世代への伝達が確認できたライン３０のＦｏｕｎｄｅｒマウスにおいて、ノーザンブロット法によってｇｐ６４遺伝子の発現を確認した。Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）を用いて、心臓、脳、小腸、大腿筋の４臓器より回収した。２０μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡを電気泳動し、ナイロンメンブレンへトランスファーした。ＥｃｏＲＩ処理したｐＣＡＧ−ｇｐ６４ベクターのｇｐ６４を含む約１．５ｋｂの断片をプローブとした。ベクターコンストラクトから予想されるバンドは１．５ｋ程度である。
結果を図５に示した。少なくとも心臓、脳、大腿筋でその発現が確認できた。バンドが３本見られたが、その原因は不明である。
５） ライン３０雌Ｔｇｍの繁殖能（マウスの交配）
８週齢になった時点で同系統のマウスとの交配を開始した。
その結果、３匹のＦ１雌マウスから各２産の産仔、合計で３１匹（♀１４、♂１７）の産仔（Ｆ２）が得られた（表３）。得られた産仔のうち、１４匹（♀５、♂９）がＴｇｍであった。また、３産目の産仔も得られており、雌Ｔｇｍの繁殖能は正常であった。

６） ＰｅｐＴ１発現出芽バキュロウイルスの調製
免疫原として用いる、ＰｅｐＴ１発現出芽バキュロウイルスを次のようにして調製した。ＰｅｐＴ１は、膜蛋白質であるトランスポーターである。ＰｅｐＴ１の構造は公知である（ＧｅｎＢａｎｋ ＸＭ＿００７０６３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（１２）：６４５６−６４６３（１９９５））。
ヒト腎臓ライブラリーからＰＣＲを用いて完全長のＰｅｐＴ１遺伝子を単離した。完全長のヒトＰｅｐＴ１遺伝子をｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入することでトランスファーベクターｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ−ＰｅｐＴ１を作製した後、Ｂａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＢａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ ＤＮＡと共にトランスファーベクターをＳｆ９細胞に導入することでヒトＰｅｐＴ１発現用組換えウイルスを調製した。即ち、４μｇのｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ−ＰｅｐＴ１をＢａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ ＤＮＡに加え、さらに１ｍＬのＧｒａｃｅ’ｓ培地（ＧＩＢＣＯ）２０μＬのＣｅｌｌ ＦＥＣＴＩＮ試薬を加え、混和し、室温で１５分間静置した後、Ｇｒａｃｅ’ｓ培地で１回洗浄した２×１０^６個のＳｆ９細胞に滴下した。室温で４時間静置した後、さらに２ｍＬの完全培地（１０％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ社製）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬのペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）を含むＧｒａｃｅ’ｓ培地）を加え、２７℃で培養した。相同組換えにより作製されたヒトＰｅｐＴ１発現用組換えウイルスはキット添付の指示書に従い二度の純化を行った後、組換えウイルスのウイルスストックを得た。
ヒトＰｅｐＴ１を発現する出芽型ウイルスの調製は以下のようにして行った。すなわち、上記により調製した組換えウイルスをＭＯＩ＝５となるように５００ｍＬのＳｆ９細胞（２×１０^６／ｍＬ）に感染させた。２７℃で３日間培養した後、培養液を８００×ｇで１５分間遠心分離し、細胞ならびに細胞破砕物を除去した。遠心分離により回収した上清は４５，０００×ｇで３０分間遠心した後、沈殿物をＰＢＳに懸濁し、さらに８００×ｇで１５分遠心することで細胞成分を除去した。上清は再度４５，０００×ｇで３０分間遠心した後、沈澱物をＰＢＳに再懸濁したものを出芽型ウイルス画分とした。ウイルスならびにＳｆ−９細胞膜上でのＰｅｐＴ１発現は抗Ｈｉｓ抗体を用いたウエスタン解析で確認した。また、タンパク質濃度はＤｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用い、ＢＳＡを標準物として測定した。
７） マウスの免疫
Ｄｉｆｃｏのフロイント完全アジュバントと不完全アジュバントを用いて常法に従ってエマルジョンを作製した免疫原を皮下投与して免疫した。初回免疫量は１ｍｇ／ｍｉｃｅで、２回免疫量は０．５ｍｇ／ｍｉｃｅとした。また２回免疫は初回免疫から１４日後に行った。初回免疫から１７日後に眼窩採血し、血清を採取した。
８） Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔによるｇｐ６４に対するトレランスの確認
ｐｅｐＴ１−ＢＶを１２％Ｇｅｌを用いて１μｇ／ｌａｎｅで還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。泳動後ＰＶＤＦ膜にエレクトロブロットした。この膜に１／１０００希釈した血清を反応させ、順次洗浄を挟み、１／１０００希釈Ｂｉｏｔｉｎ−Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（γ）（Ｚｙｍｅｄ）とＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＡｌｋａｌｉｎＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｚｙｍｅｄ）を反応させた。発色はアルカリホスファターゼ染色キット（ナカライ）を用いて行った。ｇｐ６４検出用の陽性コントロール抗体はＮＯＶＡＧＥＮから購入して用いた。
結果を図６に示す。Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧによる染色ではｎｏｎ−トランスジェニックマウスでは２匹とも強く染色されていた。一方ｇｐ６４トランスジェニックマウスでは３匹ともｇｐ６４が染まるものの染色の度合いは弱く、抗ｇｐ６４抗体量がｎｏｎ−トランスジェニックマウスに比べ相当少ないことが確認された。Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ ＩｇＭによる染色ではｎｏｎ−トランスジェニックマウスが２匹とも弱く染色されているのに対し、ｇｐ６４トランスジェニックマウスでは非常に弱いか全く染色されないことが確認された（図７）。
８） ｇｐ６４ＴｇＭによる抗ｐｅｐＴ１抗体作製
初回免疫は以下の手順で行った。ｐｅｐＴ１−ＢＶ １ｍｇ及びｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ｔｏｘｉｎ １００ｎｇが入ったＰＢＳ ２００μＬを皮下投与した。２回目以降の免疫はＰＢＳに懸濁したｐｅｐＴ１−ＢＶ ０．５ｍｇを皮下投与した。
細胞表面にｐｅｐＴ１を発現しているＢａ／Ｆ３細胞（以後Ｂａ／Ｆ３−ｐｅｐＴ１とする）とＢａ／Ｆ３細胞をＰＢＳで２回洗浄した。それぞれの細胞１０^６個にＰＢＳで２２０倍に希釈したマウス血清１００μＬを加え、ｏｎ ｉｃｅで３０分間反応させた。５００μＬのＰＢＳで１回洗浄後、ＰＢＳで２００倍に希釈したＦＩＴＣ−抗マウスＩｇＧを１００μＬ加え、ｏｎ ｉｃｅで３０分間反応させた。遠心後回収した細胞を５００μＬのＰＢＳに懸濁し、ＦＡＣＳにより解析した。５回免疫後のＦＡＣＳによる解析の結果を図８および図９に示す。図中、Ｂａ／Ｆ３細胞の結果を実線で、Ｂａ／Ｆ３−ｐｅｐＴ１細胞の結果を点線で示した。
以上の結果より、ｐｅｐＴ１−ＢＶを免疫したマウスの血清中のｐｅｐＴ１特異的に反応する抗体の抗体価が上昇している事が確認された。
産業上の利用の可能性
本発明によって、背景抗原をともなった標的抗原を用いて、標的抗原に対する抗体を効率的に得ることができる。本発明の抗体作製方法は、背景抗原の混入を避けることができない免疫原を用いた抗体作製において有用である。
たとえばバキュロウイルス発現系として知られる外来遺伝子発現システムは、組み換え蛋白質を容易に、かつ大量に得るための方法として有用である。特に膜蛋白質に応用した場合には、バキュロウイルス発現系は、膜蛋白質とウイルス粒子の膜蛋白質とともに、構造を維持した状態で回収することができる優れた発現システムである。しかし一方でその発現産物を免疫原として用いる場合には、ｇｐ６４が背景蛋白質となって標的蛋白質に対する抗体の取得を妨げるという問題点を伴っていた。
本発明の抗体製造方法を利用すれば、バキュロウイルス発現系によって得られた蛋白質における背景抗原の影響を効果的に抑制することができる。その結果、バキュロウイルス発現系によって大量に得ることができる膜蛋白質抗原を標的抗原に用いて、効率的に抗膜蛋白質抗体を製造することができる。
膜蛋白質には、受容体、あるいは細胞接着因子等の、機能的に重要な蛋白質が多い。したがって膜蛋白質を認識する抗体は、その機能解析、局在の解析、定量、診断、あるいは膜蛋白質の活性を制御する治療剤開発において、重要な役割が期待される。
一方で、免疫原として利用可能な膜蛋白質を得ることは一般に難しいとされていた。しかし本発明を利用すれば、バキュロウイルス発現系などによって作製された大量の膜蛋白質を、背景抗原を伴ったまま免疫原として利用することができる。その結果、これまで作製が困難とさてきた、様々な膜蛋白質の抗体を容易に、しかも効率的に得ることができる。
本発明の抗体作製方法は、抗体を用いた膜蛋白質の機能解析や診断、膜蛋白質の活性の制御に基づく医薬品の開発に貢献する。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
図１および図２は、構築したｇｐ６４遺伝子の塩基配列を表す図である。
図３は、実施例において構築したｐＣＡＧ−ｇｐ６４ベクターの構造を表す図である。
図４は、Ｆｏｕｎｄｅｒマウスの精巣を示す写真である。
図５は、ノーザンブロット法によるｍＲＮＡ発現解析の結果を示す写真である。図中のＨは心臓、Ｂは脳、Ｉは腸、Ｍは筋肉を表す。
図６は、Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧによるウェスタンブロット解析の結果を示す写真である。図中、ｐｒｅは免疫前採血、２ｎｄは２回免疫後採血を表す。
ｇｐ６４ＴｇＭ：トランスジェニックマウス、ｗｔＢＡＬＢ／ｃ：ｎｏｎ−トランスジェニックマウス
図７は、Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ ＩｇＭによるウェスタンブロット解析の結果を示す写真である。
ｇｐ６４ＴｇＭ：トランスジェニックマウス、ｗｔＢＡＬＢ／ｃ：ｎｏｎ−トランスジェニックマウス
図８は、マウス血清中のｐｅｐＴ１特異的抗体の抗体価をＦＡＣＳによって解析した結果を表す図である。図中、縦軸は細胞数（対数）を、また横軸は蛍光強度を示す。
（上）マウス＃１、（下）マウス＃２
図９は、図８と同じ実験の結果を表す図である。（上）マウス＃３、（下）抗体なし

Claims (7)

1. gp64をコードする遺伝子を発現可能に保持し、gp64に対して免疫寛容となったトランスジェニックマウスを、標的抗原とgp64を含むウイルス粒子、またはその標的抗原を含む一部で免疫し、標的抗原に対する抗体または抗体をコードする遺伝子を取得する工程を含む標的抗原を認識する抗体の作製方法。
2. 以下の工程を含む、標的抗原に対する抗体の作製方法；
   (a)標的抗原とgp64を含むウイルス粒子、またはその標的抗原を含む一部を調製する工程、
   (b)gp64をコードする遺伝子を発現可能に保持し、gp64に対して免疫寛容となったトランスジェニックマウスを作製する工程、
   (c)(a)のウイルス粒子、またはその標的抗原を含む一部を(b)のトランスジェニックマウスに投与する工程、および
   (d)トランスジェニックマウスから標的抗原に対する抗体を採取する工程。
3. 以下の工程を含む、標的抗原に対する抗体の作製方法；
   (a)標的抗原とgp64を含むウイルス粒子、またはその標的抗原を含む一部を調製する工程、
   (b)gp64をコードする遺伝子を発現可能に保持し、gp64に対して免疫寛容となったトランスジェニックマウスを作製する工程、
   (c)(a)のウイルス粒子、またはその標的抗原を含む一部を(b)のトランスジェニックマウスに投与する工程、
   (d)トランスジェニックマウスから標的抗原に対する抗体をコードする遺伝子を取得する工程、および
   (e)該抗体遺伝子を適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させる工程。
4. ウイルスがバキュロウイルスである請求項１〜3のいずれかに記載の方法。
5. 標的抗原が膜蛋白質である請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
6. gp64をコードする遺伝子が導入された、標的抗原を発現したバキュロウイルス粒子、またはその標的抗原を含む一部で免疫するためのgp64 に対して免疫寛容となったトランスジェニックマウス。
7. 次の工程を含む、PepT1に対する抗体の製造方法；
   a)PepT1またはその抗原性断片をコードするDNAを発現可能に保持したバキュロウイルスを調製する工程
   b)a)のバキュロウイルスを宿主細胞に感染させ、PepT1またはその断片を発現した出芽ウイルスを得る工程
   c)バキュロウイルスの膜蛋白質gp64をコードする遺伝子を発現可能に保持し、gp64に対して免疫寛容となったトランスジェニック非ヒト動物を作製する工程
   d)c)のトランスジェニック非ヒト動物にb)の出芽ウイルスまたはPepT1またはその抗原性断片を含む分画を免疫する工程、および
   e)免疫動物から、PepT1を認識する抗体を回収する工程。

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