JP2006124400A - 抗体作製方法 - Google Patents
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- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
【解決手段】標的抗原と背景抗原を含む免疫原を、背景抗原をコードする遺伝子を導入したトランスジェニック動物に投与する工程を含む、トランスジェニック非ヒト動物および当該トランスジェニック非ヒト動物を用いた抗体の製造方法、および当該抗体を元にして作製した非ヒト動物−ヒトキメラ抗体の提供。
【選択図】なし
Description
・哺乳動物に免疫する抗原の量が少い
・抗原が十分に精製されていない
〔1〕免疫原に含まれている背景抗原に対して免疫寛容を有する非ヒト動物を、標的抗原と背景抗原を含む免疫原で免疫し、標的抗原に対する抗体または抗体をコードする遺伝子を取得する工程を含む標的抗原を認識する抗体の作製方法。
〔2〕免疫寛容を人為的に誘導することを特徴とする〔1〕に記載の方法。
〔3〕非ヒト動物がトランスジェニック非ヒト動物である〔1〕に記載の方法。
〔4〕以下の工程を含む、標的抗原に対する抗体の作製方法。
(a)標的抗原と背景抗原を含む免疫原を調製する工程、
(b)背景抗原をコードする遺伝子を発現可能に保持したトランスジェニック非ヒト動物を作製する工程、
(c)(a)の免疫原を(b)のトランスジェニック非ヒト動物に投与する工程、および
(d)トランスジェニック非ヒト動物から標的抗原に対する抗体を採取する工程
〔5〕免疫原がウイルス粒子、またはその一部である〔4〕に記載の方法。
〔6〕ウイルスがバキュロウイルスである〔5〕に記載の方法。
〔7〕標的抗原が膜蛋白質である〔4〕に記載の方法。
〔8〕背景抗原がgp64である〔6〕に記載の方法。
〔9〕非ヒト動物がマウスである〔4〕に記載の方法。
〔10〕〔1〕〜〔9〕のいずれかに記載の方法により作製された抗体。
〔11〕〔10〕に記載の抗体を元にして作製した非ヒト動物−ヒトキメラ抗体、またはヒト型化抗体。
〔12〕ウイルス由来膜蛋白質をコードする遺伝子が導入されたトランスジェニック非ヒト動物。
〔13〕ウイルスがバキュロウイルスである〔12〕に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
〔14〕ウイルス由来膜蛋白質がgp64である〔13〕に記載の非ヒト動物。
〔15〕非ヒト動物がマウスである〔12〕に記載の非ヒト動物。
〔16〕ウイルス由来蛋白質を含む抗原に対する抗体製造用である〔12〕に記載の非ヒト動物。
〔17〕背景抗原をコードする遺伝子を導入したトランスジェニック非ヒト動物を作製する工程を含む非ヒト免疫動物の製造方法。
〔18〕〔17〕に記載の方法によって製造された、背景抗原を含む標的抗原に対する抗体を得るための非ヒト免疫動物。
〔19〕次の工程を含む、PepT1に対する抗体の製造方法。
a)PepT1またはその断片をコードするDNAを発現可能に保持したバキュロウイルスを調製する工程
b)a)のバキュロウイルスを宿主細胞に感染させ、PepT1またはその断片を発現した出芽ウイルスを得る工程
c)バキュロウイルスの膜蛋白質gp64をコードする遺伝子を発現可能に保持したトランスジェニック非ヒト動物を作製する工程
d)c)のトランスジェニック非ヒト動物にb)の出芽ウイルスまたはPepT1またはその断片を含む分画を免疫する工程、および
e)免疫動物から、PepT1を認識する抗体を回収する工程
本発明の抗体の作製方法は、モノクローナル抗体やポリクローナル抗体の作製に利用することができる。免疫動物から標的抗原に対する抗体を採取することによって、ポリクローナル抗体を得ることができる。あるいは、免疫動物の抗体産生細胞をクローン化することによって、モノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞を得ることもできる。
gp64の塩基配列を配列番号:3に、またgp64遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を配列番号:4に示す(GenBank Acc No.9627742)。gp64の遺伝子配列を鋳型としEcoRI認識配列とKOZAK配列を5'末端に有する5'primer 64F1(配列番号:1)とEcoRI認識配列を5'末端に有する3'primer 64R1(配列番号:2)を用い(図1および図2)、以下の条件でPCRを行った。
94℃ 5min →
(94℃ 15sec, 57℃ 30sec, 72℃ 30sec) x 25 cycles →
72℃ 7min. →
4℃ forever
インジェクション用DNAフラグメントは、次のようにして調製した。まずgp64遺伝子を挿入したpCAGGSベクター(pCAG-gp64;図3)を、SalIおよびPstIで処理した後、gp64遺伝子を含む断片(約3.8kb)を切り出した。この断片(約3.8kb)を、Gel Extraction Kit (QIAGEN)により回収し、3ng/μlになるようにPBS-で希釈してインジェクション用DNAフラグメントとした。
3週齢になった時点でマウスの尾からDNAを、核酸自動分離装置(KURABO)を用い抽出し、サザンブロット法およびPCR法による導入遺伝子の確認を行った。サザンブロット法による導入遺伝子の確認は、15μgのgenome DNAをEcoRI処理、泳動後、ナイロンメンブレンへトランスファーし、EcoRI処理したpCAG-gp64ベクターのgp64を含む約1.5kbの断片をプローブに用い、トランスファーしたDNAとハイブリダイズさせることにより行った。また約100ngのDNAをテンプレートとし、次のプライマーを用いたPCR法によって導入遺伝子を確認した。
センスプライマー64F1(配列番号:1):
GAATTCCACCATGGTAAGCGCTATTGTT
アンチセンスプライマー64R1(配列番号:2):
GAATTCTTAATATTGTCTATTACGGT
94℃ 5min →
(94℃ 15sec, 57℃ 30sec, 72℃ 30sec) x 35 cycles →
72℃ 7min →
4℃ forever
PCR産物を泳動し、約1.5kbのバンドの有無に基づいて導入遺伝子を確認した。
gp64遺伝子の次世代への伝達が確認できたライン30のFounderマウスにおいて、ノーザンブロット法によってgp64遺伝子の発現を確認した。Total RNAを、ISOGEN(ニッポンジーン)を用いて、心臓、脳、小腸、大腿筋の4臓器より回収した。20μgのtotal RNAを電気泳動し、ナイロンメンブレンへトランスファーした。EcoRI処理したpCAG-gp64ベクターのgp64を含む約1.5kbの断片をプローブとした。ベクターコンストラクトから予想されるバンドは1.5k程度である。
結果を図5に示した。少なくとも心臓、脳、大腿筋でその発現が確認できた。バンドが3本見られたが、その原因は不明である。
8週齢になった時点で同系統のマウスとの交配を開始した。
その結果、3匹のF1雌マウスから各2産の産仔、合計で31匹(♀14、♂17)の産仔(F2)が得られた(表3)。得られた産仔のうち、14匹(♀5、♂9)がTgmであった。また、3産目の産仔も得られており、雌Tgmの繁殖能は正常であった。
免疫原として用いる、PepT1発現出芽バキュロウイルスを次のようにして調製した。PepT1は、膜蛋白質であるトランスポーターである。PepT1の構造は公知である(GenBank XM_007063、J.Biol.Chem. 270(12): 6456-6463 (1995))。
Difcoのフロイント完全アジュバントと不完全アジュバントを用いて常法に従ってエマルジョンを作製した免疫原を皮下投与して免疫した。初回免疫量は1mg/miceで、2回免疫量は0.5mg/miceとした。また2回免疫は初回免疫から14日後に行った。初回免疫から17日後に眼窩採血し、血清を採取した。
pepT1-BVを12% Gelを用いて1μg/laneで還元条件下SDS-PAGEを行った。泳動後PVDF膜にエレクトロブロットした。この膜に1/1000希釈した血清を反応させ、順次洗浄を挟み、1/1000希釈Biotin-Anti-Mouse IgG(γ)(Zymed)とStreptavidin-AlkalinPhosphatase(Zymed)を反応させた。発色はアルカリホスファターゼ染色キット(ナカライ)を用いて行った。gp64検出用の陽性コントロール抗体はNOVAGENから購入して用いた。
初回免疫は以下の手順で行った。pepT1-BV 1mg及びpertussis toxin 100ngが入ったPBS 200μLを皮下投与した。2回目以降の免疫はPBSに懸濁したpepT1-BV 0.5mgを皮下投与した。
Claims (19)
- 免疫原に含まれている背景抗原に対して免疫寛容を有する非ヒト動物を、標的抗原と背景抗原を含む免疫原で免疫し、標的抗原に対する抗体または抗体をコードする遺伝子を取得する工程を含む標的抗原を認識する抗体の作製方法。
- 免疫寛容を人為的に誘導することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 非ヒト動物がトランスジェニック非ヒト動物である請求項1に記載の方法。
- 以下の工程を含む、標的抗原に対する抗体の作製方法。
(a)標的抗原と背景抗原を含む免疫原を調製する工程、
(b)背景抗原をコードする遺伝子を発現可能に保持したトランスジェニック非ヒト動物を作製する工程、
(c)(a)の免疫原を(b)のトランスジェニック非ヒト動物に投与する工程、および
(d)トランスジェニック非ヒト動物から標的抗原に対する抗体を採取する工程 - 免疫原がウイルス粒子、またはその一部である請求項4に記載の方法。
- ウイルスがバキュロウイルスである請求項5に記載の方法。
- 標的抗原が膜蛋白質である請求項4に記載の方法。
- 背景抗原がgp64である請求項6に記載の方法。
- 非ヒト動物がマウスである請求項4に記載の方法。
- 請求項1〜9のいずれかに記載の方法により作製された抗体。
- 請求項10に記載の抗体を元にして作製した非ヒト動物−ヒトキメラ抗体、またはヒト型化抗体。
- ウイルス由来膜蛋白質をコードする遺伝子が導入されたトランスジェニック非ヒト動物。
- ウイルスがバキュロウイルスである請求項12に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- ウイルス由来膜蛋白質がgp64である請求項13に記載の非ヒト動物。
- 非ヒト動物がマウスである請求項12に記載の非ヒト動物。
- ウイルス由来蛋白質を含む抗原に対する抗体製造用である、請求項12に記載の非ヒト動物。
- 背景抗原をコードする遺伝子を導入したトランスジェニック非ヒト動物を作製する工程を含む非ヒト免疫動物の製造方法。
- 請求項17に記載の方法によって製造された、背景抗原を含む標的抗原に対する抗体を得るための非ヒト免疫動物。
- 次の工程を含む、PepT1に対する抗体の製造方法。
a)PepT1またはその断片をコードするDNAを発現可能に保持したバキュロウイルスを調製する工程
b)a)のバキュロウイルスを宿主細胞に感染させ、PepT1またはその断片を発現した出芽ウイルスを得る工程
c)バキュロウイルスの膜蛋白質gp64をコードする遺伝子を発現可能に保持したトランスジェニック非ヒト動物を作製する工程
d)c)のトランスジェニック非ヒト動物にb)の出芽ウイルスまたはPepT1またはその断片を含む分画を免疫する工程、および
e)免疫動物から、PepT1を認識する抗体を回収する工程
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