JP5917682B2

JP5917682B2 - 変異体クロストリジウム・ディフィシル毒素に関する組成物およびその方法

Info

Publication number: JP5917682B2
Application number: JP2014505775A
Authority: JP
Inventors: アンダーソン，アナリーザ・シビル; ドナルド，ロバート・ジー・ケイ; フリント，マイケル・ジェームズ; ヤンゼン，カトリン・ウーテ; カリヤーン，ナレンダー・ケイ; ミニンニ，テリ・エル; モラン，ジャスティン・キース; ルッペン，マーク・イー; シドゥ，マニンダー・ケイ
Original assignee: ワイス・エルエルシー
Priority date: 2011-04-22
Filing date: 2012-04-20
Publication date: 2016-05-18
Anticipated expiration: 2032-04-20
Also published as: JP2021130692A; MX2013012344A; SI2699587T1; AU2016202903B2; KR20130140206A; US10774117B2; NZ616035A; DK2699587T3; US20130244307A1; CO6801643A2; ZA201307818B; FI3549949T3; AR086199A1; TW202320843A; RU2013145170A; DK3549949T3; AU2017261465B2; US20190202873A1; CN103619871B; HUE047085T2

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１１年４月２２に出願された米国仮特許出願第６１／４７８，４７４号、および２０１１年４月２５日に出願された米国仮特許出願第６１／４７８，８９９号の利益を主張する。前記の出願の全内容は参照により本明細書にそのまま援用される。

本発明は、変異体クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素に関する組成物およびその方法に関する。

クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ディフィシル）は、ヒトにおける胃腸疾患と関係しているグラム陽性嫌気性細菌である。Ｃ．ディフィシルのコロニー形成は、通常は結腸において天然の腸管内菌叢が抗生物質による処置により減少した場合に起こる。感染は、グルコシル化毒素である毒素Ａおよび毒素Ｂ（それぞれ３０８および２７０ｋＤａ）の分泌により抗生物質関連下痢および時として偽膜性大腸炎につながる可能性があり、それはＣ．ディフィシルの主な病毒性因子である。

毒素Ａおよび毒素Ｂは、１９ｋｂの病原性遺伝子座（ＰａＬｏｃ）内でそれぞれ遺伝子ｔｃｄＡおよびｔｃｄＢによりコードされている。Ｃ．ディフィシルの非病原性株は、代わりの１１５塩基対の配列により置き換えられたこの遺伝子座を有する。

毒素Ａおよび毒素Ｂは両方とも強力な細胞毒である。これらのタンパク質は、Ｒｈｏ／Ｒａｃ／Ｒａｓファミリーの低分子量ＧＴＰアーゼを不活性化する相同性のグルコシルトランスフェラーゼである。結果として起こるシグナル伝達の崩壊は、細胞間結合の喪失、アクチン細胞骨格の調節不全、および／またはアポトーシスを引き起こし、結果としてクロストリジウム・ディフィシル感染（ＣＤＩ）と関係する重度の分泌性下痢をもたらす。

過去１０年で、病院、養護ホーム、および他の長期療養施設におけるＣ．ディフィシルの大流行の数および重症度は劇的に増大した。この増大における重要な要因には、高病毒性（ｈｙｐｅｒｖｉｒｕｌｅｎｔ）病原性株の出現、増大した抗生物質の使用、向上した検出法、および健康管理施設における空気伝染性の芽胞への曝露の増大が含まれる。

メトロニダゾールおよびバンコマイシンは、Ｃ．ディフィシル関連疾患（ＣＤＡＤ）の抗生物質処置に関するケアの現在受け入れられている標準である。しかし、そのような処置を受ける患者の約２０％はＣＤＩの第１エピソードの後に感染の再発を経験し、それらの患者の約５０％に至るまでが追加の再発に苦しむ。再発の処置は非常に重要な課題であり、再発の大部分は通常は前のエピソードの１ヶ月以内に起こる。

従って、Ｃ．ディフィシルに向けられた免疫原性および／または療法組成物ならびにその方法に関する必要性が存在する。

これらのおよび他の目的が本明細書における発明により提供される。
１側面において、本発明は、変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ａが含まれる免疫原性組成物に関する。その変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ａには、対応する野生型のＣ．ディフィシル毒素Ａと比較して少なくとも１個の変異を有するグルコシルトランスフェラーゼドメインおよび少なくとも１個の変異を有するシステインプロテアーゼドメインが含まれる。１態様において、その変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ａの少なくとも１個のアミノ酸が化学的に架橋されている。

１側面において、本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：４で示されるアミノ酸配列が含まれる単離されたポリペプチドに関し、ここで１位のメチオニン残基は場合により存在せず、ここでそのポリペプチドには１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）により化学的に修飾された少なくとも１個のアミノ酸側鎖が含まれる。

１態様において、その変異体Ｃ．ディフィシル毒素の少なくとも１個のアミノ酸が化学的に架橋されている。
１態様において、その少なくとも１個のアミノ酸はホルムアルデヒド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシネート、またはＥＤＣおよびＮＨＳの組み合わせにより化学的に架橋される。

１態様において、その免疫原性組成物はそれぞれの抗毒素中和抗体またはその結合断片により認識される。
１態様において、その免疫原性組成物は、対応する野生型のＣ．ディフィシル毒素と比較して減少した細胞毒性を示す。

別の側面において、本発明は変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ａが含まれる免疫原性組成物に関し、それには対応する野生型のＣ．ディフィシル毒素Ａと比較して２８５位および２８７位においてアミノ酸置換を有するＳＥＱＩＤＮＯ：２９を有するグルコシルトランスフェラーゼドメインならびに１５８位においてアミノ酸置換を有するＳＥＱＩＤＮＯ：３２を有するシステインプロテアーゼドメインが含まれ、ここでその変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ａの少なくとも１個のアミノ酸が化学的に架橋されている。

さらなる側面において、本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：４が含まれる変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ａが含まれる免疫原性組成物に関し、ここでその変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ａの少なくとも１個のアミノ酸が化学的に架橋されている。

さらに別の側面において、本発明は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４、ＳＥＱＩＤＮＯ：５、ＳＥＱＩＤＮＯ：６、ＳＥＱＩＤＮＯ：７、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８が含まれる免疫原性組成物に関する。

１側面において、本発明は変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ｂが含まれる免疫原性組成物に関する。その変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ｂには、対応する野生型のＣ．ディフィシル毒素Ｂと比較して少なくとも１個の変異を有するグルコシルトランスフェラーゼドメインおよび少なくとも１個の変異を有するシステインプロテアーゼドメインが含まれる。

別の側面において、本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：６で示されるアミノ酸配列が含まれる単離されたポリペプチドに関し、ここで１位のメチオニン残基は場合により存在せず、ここでそのポリペプチドには１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）により化学的に修飾されたアミノ酸側鎖が含まれる。

別の側面において、本発明は変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ｂが含まれる免疫原性組成物に関し、それには対応する野生型のＣ．ディフィシル毒素Ｂと比較して２８６位および２８８位においてアミノ酸置換を有するＳＥＱＩＤＮＯ：３１を有するグルコシルトランスフェラーゼドメインならびに１５５位においてアミノ酸置換を有するＳＥＱＩＤＮＯ：３３を有するシステインプロテアーゼドメインが含まれ、ここでその変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ｂの少なくとも１個のアミノ酸が化学的に架橋されている。

さらなる側面において、本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：６が含まれる変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ｂが含まれる免疫原性組成物に関し、ここでその変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ｂの少なくとも１個のアミノ酸が化学的に架橋されている。

１側面において、本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：４が含まれる変異体Ｃ．ディフィシル毒素ＡおよびＳＥＱＩＤＮＯ：６が含まれる変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ｂが含まれる免疫原性組成物に関し、ここでその変異体Ｃ．ディフィシル毒素のそれぞれの少なくとも１個のアミノ酸が化学的に架橋されている。

さらなる側面において、本発明は前述の変異体Ｃ．ディフィシル毒素のいずれかをコードするポリヌクレオチドが含まれる組み換え細胞またはその子孫に関し、ここでその細胞は毒素をコードする内在性のポリヌクレオチドを欠いている。

別の側面において、本発明は、変異体Ｃ．ディフィシル毒素が含まれる免疫原性組成物に特異的な抗体またはその抗体結合断片に関する。
１側面において、本発明は、哺乳類においてＣ．ディフィシル感染症を処置する方法に関する。その方法には、その哺乳類にＳＥＱＩＤＮＯ：４が含まれる変異体Ｃ．ディフィシル毒素ＡおよびＳＥＱＩＤＮＯ：６が含まれる変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ｂが含まれる免疫原性組成物を投与することが含まれ、ここでその変異体Ｃ．ディフィシル毒素のそれぞれの少なくとも１個のアミノ酸がホルムアルデヒドにより架橋されている。

別の側面において、その哺乳類においてＣ．ディフィシル感染症を処置する方法には、その哺乳類にＳＥＱＩＤＮＯ：４が含まれる変異体Ｃ．ディフィシル毒素ＡおよびＳＥＱＩＤＮＯ：６が含まれる変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ｂが含まれる免疫原性組成物を投与することが含まれ、ここでその変異体Ｃ．ディフィシル毒素のそれぞれの少なくとも１個のアミノ酸が１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドおよび／またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）により架橋されている。

１側面において、本発明は哺乳類においてＣ．ディフィシル感染症に対する免疫応答を誘導する方法に関する。その方法には、その哺乳類にＳＥＱＩＤＮＯ：４が含まれる変異体Ｃ．ディフィシル毒素ＡおよびＳＥＱＩＤＮＯ：６が含まれる変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ｂが含まれる免疫原性組成物を投与することが含まれ、ここでその変異体Ｃ．ディフィシル毒素のそれぞれの少なくとも１個のアミノ酸がホルムアルデヒドにより架橋されている。

別の側面において、哺乳類においてＣ．ディフィシル感染症に対する免疫応答を誘導する方法には、その哺乳類にＳＥＱＩＤＮＯ：４が含まれる変異体Ｃ．ディフィシル毒素ＡおよびＳＥＱＩＤＮＯ：６が含まれる変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ｂが含まれる免疫原性組成物を投与することが含まれ、ここでその変異体Ｃ．ディフィシル毒素のそれぞれの少なくとも１個のアミノ酸が１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドおよび／またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）により架橋されている。

１態様において、その処置の方法または免疫応答を誘導する方法は、それを必要とする哺乳類においてである。
１態様において、その処置の方法または免疫応答を誘導する方法には、再発性Ｃ．ディフィシル感染症を有していた哺乳類が含まれる。

１態様において、その処置の方法または免疫応答を誘導する方法には、その組成物を非経口投与することが含まれる。
１態様において、その処置の方法または免疫応答を誘導する方法には、さらにアジュバントが含まれる免疫原性組成物が含まれる。

１態様において、そのアジュバントには水酸化アルミニウムゲルおよびＣｐＧオリゴヌクレオチドが含まれる。別の態様において、そのアジュバントにはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸが含まれる。

１態様において、その単離されたポリペプチドには、グリシンにより化学的に修飾されているそのポリペプチドのアスパラギン酸残基の少なくとも１個の側鎖またはそのポリペプチドのグルタミン酸残基の少なくとも１個の側鎖が含まれる。

１態様において、その単離されたポリペプチドには、そのポリペプチドのアスパラギン酸残基の側鎖およびそのポリペプチドのリシン残基の側鎖の間の少なくとも１個の架橋；ならびにそのポリペプチドのグルタミン酸残基の側鎖およびそのポリペプチドのリシン残基の側鎖の間の少なくとも１個の架橋が含まれる。

１態様において、その単離されたポリペプチドには、そのポリペプチドの少なくとも１個のリシン残基の側鎖に連結されたベータ−アラニン部分が含まれる。
１態様において、その単離されたポリペプチドには、そのポリペプチドのアスパラギン酸残基の側鎖に、またはそのポリペプチドのグルタミン酸残基の側鎖に連結されたグリシン部分が含まれる。

１態様において、その単離されたポリペプチドにはＳＥＱＩＤＮＯ：４で示されるアミノ酸配列が含まれ、ここで１位のメチオニン残基は場合により存在せず、ここでそのポリペプチドの少なくとも１個のリシン残基の側鎖はベータ−アラニン部分に連結されている。

１態様において、その単離されたポリペプチドにはＳＥＱＩＤＮＯ：６で示されるアミノ酸配列が含まれ、ここで１位のメチオニン残基は場合により存在せず、ここでそのポリペプチドの少なくとも１個のリシン残基の側鎖はベータ−アラニン部分に連結されている。

１態様において、その単離されたポリペプチドには、アスパラギン酸残基の側鎖に、またはグルタミン酸残基の側鎖に連結された、そのポリペプチドの第２のリシン残基の側鎖が含まれる。

１態様において、その単離されたポリペプチドには、グリシン部分に連結されたそのポリペプチドのアスパラギン酸残基の側鎖またはグルタミン酸残基の側鎖が含まれる。
１態様において、その単離されたポリペプチドは少なくとも約１００μｇ／ｍｌのＥＣ_５０を有する。

１側面において、その免疫原性組成物にはＳＥＱＩＤＮＯ：４で示されるアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチド（ここで１位のメチオニン残基は場合により存在しない）およびＳＥＱＩＤＮＯ：６で示されるアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチド（ここで１位のメチオニン残基は場合により存在しない）が含まれ、ここでそのポリペプチドは１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）により化学的に修飾された少なくとも１個のアミノ酸側鎖を有する。

１態様において、そのポリペプチドには以下のいずれかの少なくとも１つが含まれる：ａ）ａ）そのポリペプチドのリシン残基の側鎖に連結された少なくとも１個のベータ−アラニン部分；ｂ）そのポリペプチドのリシン残基の側鎖およびアスパラギン酸残基の側鎖の間の少なくとも１個の架橋；ならびにｃ）そのポリペプチドのリシン残基の側鎖およびグルタミン酸残基の側鎖の間の少なくとも１個の架橋。

１態様において、その単離されたポリペプチドは少なくとも約１００μｇ／ｍｌのＥＣ_５０を有する。
１側面において、その免疫原性組成物にはＳＥＱＩＤＮＯ：４で示されるアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチド（ここで１位のメチオニン残基は場合により存在しない）およびＳＥＱＩＤＮＯ：６で示されるアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチド（ここで１位のメチオニン残基は場合により存在しない）が含まれ、ａ）ここでＳＥＱＩＤＮＯ：４の少なくとも１個のリシン残基の側鎖はベータ−アラニン部分に連結されており、そしてｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６の少なくとも１個のリシン残基の側鎖はベータ−アラニン部分に連結されている。

１態様において、その免疫原性組成物には、アスパラギン酸残基の側鎖に、またはグルタミン酸残基の側鎖に連結されているＳＥＱＩＤＮＯ：４の第２のリシン残基の側鎖が含まれ、ここでＳＥＱＩＤＮＯ：６の第２のリシン残基はアスパラギン酸残基の側鎖に、またはグルタミン酸残基の側鎖に連結されている。

１態様において、その免疫原性組成物には、グリシン部分に連結されているＳＥＱＩＤＮＯ：４で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドのアスパラギン酸残基の側鎖またはグルタミン酸残基の側鎖が含まれ、ここで１位のメチオニン残基は場合により存在しない。

１態様において、その免疫原性組成物には、グリシン部分に連結されているＳＥＱＩＤＮＯ：６で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドのアスパラギン酸残基の側鎖またはグルタミン酸残基の側鎖が含まれ、ここで１位のメチオニン残基は場合により存在しない。

１態様において、その単離されたポリペプチドは少なくとも約１００μｇ／ｍｌのＥＣ_５０を有する。
１側面において、そのその免疫原性組成物には、ＳＥＱＩＤＮＯ：８４で示されるアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドおよびＳＥＱＩＤＮＯ：８６で示されるアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドが含まれ、ここでそれぞれのポリペプチドには以下：ａ）そのポリペプチドのアスパラギン酸残基の側鎖およびそのポリペプチドのリシン酸残基の側鎖の間の少なくとも１個の架橋；ｂ）そのポリペプチドのグルタミン酸残基の側鎖およびそのポリペプチドのリシン酸残基の側鎖の間の少なくとも１個の架橋；ｃ）そのポリペプチドの少なくとも１個のリシン残基の側鎖に連結されたベータ−アラニン部分；ならびにｄ）そのポリペプチドの少なくとも１個のアスパラギン酸残基の側鎖に、またはそのポリペプチドの少なくとも１個のグルタミン酸残基の側鎖に連結されたグリシン部分が含まれる。

図１：ＣＬＵＳＴＡＬＷアラインメント、初期設定のパラメーターを用いた、株６３０、ＶＰＩ１０４６３、Ｒ２０２９１、ＣＤ１９６からの野生型Ｃ．ディフィシル毒素Ａ、およびＳＥＱＩＤＮＯ：４を有する変異体毒素Ａの配列アラインメント。図２：ＣＬＵＳＴＡＬＷアラインメント、初期設定のパラメーターを用いた、株６３０、ＶＰＩ１０４６３、Ｒ２０２９１、ＣＤ１９６からの野生型Ｃ．ディフィシル毒素Ｂ、およびＳＥＱＩＤＮＯ：６を有する変異体毒素Ｂの配列アラインメント。図３：野生型毒素陰性Ｃ．ディフィシル株の同定を示すグラフ。１３のＣ．ディフィシル株の培養液を毒素Ａに関するＥＬＩＳＡにより試験した。図説されているように、７つの株が毒素Ａを発現しており、６つの株（株１３５１、３２３２、７３２２、５０３６、４８１１およびＶＰＩ１１１８６）は発現していなかった。図４ＡおよびＢ：三重変異体Ａ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）、二重変異体Ｂ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）、および三重変異体Ｂ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）はＵＤＰ−^１４Ｃ−グルコースを用いるインビトログルコシル化アッセイにおいてＲａｃ１またはＲｈｏＡＧＴＰアーゼをグルコシル化せず；一方で１０μｇ〜１ｎｇの野生型毒素ＢはＲａｃ１をグルコシル化することを説明するＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果。図５：野生型毒素ＡおよびＢ（それぞれＳＥＱＩＤＮＯ：１および２）の切断された断片の観察と比較した、変異体毒素ＡおよびＢ（それぞれＳＥＱＩＤＮＯ：４および６）におけるシステインプロテアーゼ活性の抑止（ａｂｒｏｇａｔｉｏｎ）を示すウェスタンブロット。実施例１３参照。図６：三重変異体毒素ＡおよびＢ（それぞれＳＥＱＩＤＮＯ：４および６）はＩＭＲ−９０細胞におけるインビトロ細胞毒性アッセイにより高濃度（例えば約１００μｇ／ｍｌ）で試験した際に残存する細胞毒性を示すことを示すグラフ。図７：三重変異体毒素Ｂ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）および七重変異体毒素Ｂ（ＳＥＱＩＤＮＯ：８）に関してＥＣ_５０値が類似していることを示すグラフ。図８：ＡＴＰレベル（ＲＬＵ）を三重変異体ＴｃｄＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）（上のパネル）および三重変異体ＴｃｄＢ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）（下のパネル）の増大する濃度に対してプロットした、インビトロ細胞毒性試験からの結果を表すグラフ。変異体毒素ＡおよびＢの残存する細胞毒性は、変異体毒素Ａに特異的な中和抗体（上のパネル−ｐＡｂＡおよびｍＡｂＡ３−２５＋Ａ６０−２２）および変異体毒素Ｂに特異的な中和抗体（下のパネル−ｐＡｂＢ）により完全に抑止され得る。図９：処理の７２時間後におけるＩＭＲ−９０細胞の形態の画像。パネルＡはモック処理した対照細胞を示す。パネルＢはホルマリンで不活性化した変異体ＴｃｄＢ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）による処理後の細胞の形態を示す。パネルＣはＥＤＣで不活性化した変異体ＴｃｄＢ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）による処理後の細胞の形態を示す。パネルＤは野生型毒素Ｂ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）による処理後の細胞の形態を示す。パネルＥは三重変異体ＴｃｄＢ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）による処理後の細胞の形態を示す。類似の結果がＴｃｄＡ処理に関して観察された。図１０：実施例２５（試験ｍｕＣｄｉｆｆ２０１０−０６）で記述されるような中和抗体の力価を示すグラフ。図１１：実施例２６（試験ｍｕＣｄｉｆｆ２０１０−０７）で記述されるような中和抗体の力価を示すグラフ。図１２：実施例２７（試験ｈａｍＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ２０１０−０２）で記述されるようなハムスターにおける４回の免疫処置後の毒素ＡおよびＢに対する中和抗体応答を示すグラフ。図１３：実施例２７（試験ｈａｍＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ２０１０−０２）で記述されるような、ハムスターにおける化学的に不活性化された遺伝子変異体毒素およびＬｉｓｔＢｉｏｌｏｇｉｃａｌトキソイドによるワクチン接種後の中和抗体応答を示すグラフ。図１４：実施例２８（試験ｈａｍＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ２０１０−０２、続き）で記述される、免疫処置されていない対照と比較した３つの免疫処置されたハムスターの群に関する生存曲線。図１５：実施例２９で記述されるような、ハムスターにおけるＣ．ディフィシル変異体毒素の異なる配合物に対する相対的中和抗体応答を示すグラフ（試験ｈａｍＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ２０１０−０３）。図１６Ａ〜Ｂ：実施例３０で記述されるような、カニクイザル・マカク（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓｍａｃａｑｕｅｓ）における化学的に不活性化された遺伝子変異体毒素ＡおよびＢ（それぞれＳＥＱＩＤＮＯ：４および６）に対する強い相対的中和抗体応答を示すグラフ。図１６Ａ〜Ｂ：実施例３０で記述されるような、カニクイザル・マカク（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓｍａｃａｑｕｅｓ）における化学的に不活性化された遺伝子変異体毒素ＡおよびＢ（それぞれＳＥＱＩＤＮＯ：４および６）に対する強い相対的中和抗体応答を示すグラフ。図１７：Ａ３−２５ｍＡｂＩｇＥの軽（ＶＬ）および重（ＨＬ）鎖の可変領域のアミノ酸配列。シグナルペプチドは強調され；ＣＤＲはイタリック体にされて下線が引かれ；定常領域は太字にされて下線が引かれている（完全な配列は示されていない）。図１８：細胞生存度の指標として（相対光単位−ＲＬＵにより定量化される）ＡＴＰレベルを用いる毒素中和アッセイにおける個々の毒素Ａモノクローナル抗体の力価測定を示すグラフ。毒素（４×ＥＣ_５０）対照と比較して、ｍＡｂＡ８０−２９、Ａ６５−３３、Ａ６０−２２およびＡ３−２５は濃度と共に増大する毒素Ａへの中和作用を有していたが、陽性ウサギ抗毒素Ａ対照のレベルまでではなかった。ｍＡｂＡ５０−１０、Ａ５６−３３、およびＡ５８−４６は毒素Ａを中和しなかった。細胞のみの対照は１〜１．５×１０^６ＲＬＵであった。図１９：毒素ＢｍＡｂの８個のエピトープの群のＢｉａＣｏｒｅによるマッピング。図２０Ａ〜Ｃ：毒素ＡｍＡｂの組み合わせの相乗的中和活性：異なる希釈度の中和抗体Ａ６０−２２、Ａ６５−３３、およびＡ８０−２９の、増大する濃度のＡ３−２５ｍＡｂへの添加は、その希釈度に関わらず毒素Ａの中和を相乗的に増大させた。毒素Ａのみ（４×ＥＣ_５０）の対照のＲＬＵが図説されており（０．３×１０^６未満）、図２０Ｂおよび図２０Ｃで示されているグラフにおいて表されているように、細胞のみの対照は２〜２．５×１０^６ＲＬＵであった。図２０Ａ〜Ｃ：毒素ＡｍＡｂの組み合わせの相乗的中和活性：異なる希釈度の中和抗体Ａ６０−２２、Ａ６５−３３、およびＡ８０−２９の、増大する濃度のＡ３−２５ｍＡｂへの添加は、その希釈度に関わらず毒素Ａの中和を相乗的に増大させた。毒素Ａのみ（４×ＥＣ_５０）の対照のＲＬＵが図説されており（０．３×１０^６未満）、図２０Ｂおよび図２０Ｃで示されているグラフにおいて表されているように、細胞のみの対照は２〜２．５×１０^６ＲＬＵであった。図２０Ａ〜Ｃ：毒素ＡｍＡｂの組み合わせの相乗的中和活性：異なる希釈度の中和抗体Ａ６０−２２、Ａ６５−３３、およびＡ８０−２９の、増大する濃度のＡ３−２５ｍＡｂへの添加は、その希釈度に関わらず毒素Ａの中和を相乗的に増大させた。毒素Ａのみ（４×ＥＣ_５０）の対照のＲＬＵが図説されており（０．３×１０^６未満）、図２０Ｂおよび図２０Ｃで示されているグラフにおいて表されているように、細胞のみの対照は２〜２．５×１０^６ＲＬＵであった。図２１：毒素ＢｍＡｂの相乗的中和活性：ｍＡｂ８−２６、Ｂ６０−２およびＢ５９−３による毒素Ｂの中和を図２１Ａにおいて図説する。毒素Ｂの中和は、Ｂ８−２６をＢ５９−３の希釈物と組み合わせた後に相乗的に増大する（図２１Ｂ）。図２１：毒素ＢｍＡｂの相乗的中和活性：ｍＡｂ８−２６、Ｂ６０−２およびＢ５９−３による毒素Ｂの中和を図２１Ａにおいて図説する。毒素Ｂの中和は、Ｂ８−２６をＢ５９−３の希釈物と組み合わせた後に相乗的に増大する（図２１Ｂ）。図２２：Ｒａｃ１ＧＴＰアーゼの発現は遺伝子変異体毒素Ｂ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）抽出物において２４時間から９６時間まで低減しているが、野生型毒素Ｂ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）で処理した抽出物では低減していないことを示すウェスタンブロット。そのブロットは、Ｒａｃ１が毒素Ｂで処理した抽出物においてグルコシル化されているが、遺伝子変異体毒素Ｂで処理した抽出物ではグルコシル化されていないことも示している。図２３Ａ〜Ｋ：ＡＴＰレベル（ＲＬＵ）をＣ．ディフィシル培養液およびハムスター血清のプール（■）；それぞれの株からの粗製の毒素（培養回収物）およびハムスター血清のプール（●）；精製された毒素（ＬｉｓｔＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから得た市販の毒素）およびハムスター血清のプール（▲）；粗製の毒素（▼）、対照；ならびに精製された毒素（◆）、対照の増大する濃度に対してプロットした、インビトロ細胞毒性試験からの結果を表すグラフ。それぞれの株からの毒素を４×ＥＣ_５０値で細胞に添加した。図２３は、変異体ＴｃｄＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）および変異体ＴｃｄＢ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）（ここでその変異体毒素は例えば本明細書で記述される実施例２９、表１５に従ってＥＤＣにより不活性化された）が含まれる免疫原性組成物が、少なくとも以下の１６種類の異なるＣ．ディフィシルのＣＤＣ株からの毒素に対してそれぞれの毒素のみの対照と比較して中和活性を示す中和抗体を誘導したことを示す：２００７８８６（図２３Ａ）；２００６０１７（図２３Ｂ）；２００７０７０（図２３Ｃ）；２００７３０２（図２３Ｄ）；２００７８３８（図２３Ｅ）；２００７８８６（図２３Ｆ）；２００９２９２（図２３Ｇ）；２００４０１３（図２３Ｈ）；２００９１４１（図２３Ｉ）；２００５０２２（図２３Ｊ）；２００６３７６（図２３Ｋ）。図２３Ａ〜Ｋ：ＡＴＰレベル（ＲＬＵ）をＣ．ディフィシル培養液およびハムスター血清のプール（■）；それぞれの株からの粗製の毒素（培養回収物）およびハムスター血清のプール（●）；精製された毒素（ＬｉｓｔＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから得た市販の毒素）およびハムスター血清のプール（▲）；粗製の毒素（▼）、対照；ならびに精製された毒素（◆）、対照の増大する濃度に対してプロットした、インビトロ細胞毒性試験からの結果を表すグラフ。それぞれの株からの毒素を４×ＥＣ_５０値で細胞に添加した。図２３は、変異体ＴｃｄＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）および変異体ＴｃｄＢ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）（ここでその変異体毒素は例えば本明細書で記述される実施例２９、表１５に従ってＥＤＣにより不活性化された）が含まれる免疫原性組成物が、少なくとも以下の１６種類の異なるＣ．ディフィシルのＣＤＣ株からの毒素に対してそれぞれの毒素のみの対照と比較して中和活性を示す中和抗体を誘導したことを示す：２００７８８６（図２３Ａ）；２００６０１７（図２３Ｂ）；２００７０７０（図２３Ｃ）；２００７３０２（図２３Ｄ）；２００７８３８（図２３Ｅ）；２００７８８６（図２３Ｆ）；２００９２９２（図２３Ｇ）；２００４０１３（図２３Ｈ）；２００９１４１（図２３Ｉ）；２００５０２２（図２３Ｊ）；２００６３７６（図２３Ｋ）。図２３Ａ〜Ｋ：ＡＴＰレベル（ＲＬＵ）をＣ．ディフィシル培養液およびハムスター血清のプール（■）；それぞれの株からの粗製の毒素（培養回収物）およびハムスター血清のプール（●）；精製された毒素（ＬｉｓｔＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから得た市販の毒素）およびハムスター血清のプール（▲）；粗製の毒素（▼）、対照；ならびに精製された毒素（◆）、対照の増大する濃度に対してプロットした、インビトロ細胞毒性試験からの結果を表すグラフ。それぞれの株からの毒素を４×ＥＣ_５０値で細胞に添加した。図２３は、変異体ＴｃｄＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）および変異体ＴｃｄＢ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）（ここでその変異体毒素は例えば本明細書で記述される実施例２９、表１５に従ってＥＤＣにより不活性化された）が含まれる免疫原性組成物が、少なくとも以下の１６種類の異なるＣ．ディフィシルのＣＤＣ株からの毒素に対してそれぞれの毒素のみの対照と比較して中和活性を示す中和抗体を誘導したことを示す：２００７８８６（図２３Ａ）；２００６０１７（図２３Ｂ）；２００７０７０（図２３Ｃ）；２００７３０２（図２３Ｄ）；２００７８３８（図２３Ｅ）；２００７８８６（図２３Ｆ）；２００９２９２（図２３Ｇ）；２００４０１３（図２３Ｈ）；２００９１４１（図２３Ｉ）；２００５０２２（図２３Ｊ）；２００６３７６（図２３Ｋ）。図２３Ａ〜Ｋ：ＡＴＰレベル（ＲＬＵ）をＣ．ディフィシル培養液およびハムスター血清のプール（■）；それぞれの株からの粗製の毒素（培養回収物）およびハムスター血清のプール（●）；精製された毒素（ＬｉｓｔＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから得た市販の毒素）およびハムスター血清のプール（▲）；粗製の毒素（▼）、対照；ならびに精製された毒素（◆）、対照の増大する濃度に対してプロットした、インビトロ細胞毒性試験からの結果を表すグラフ。それぞれの株からの毒素を４×ＥＣ_５０値で細胞に添加した。図２３は、変異体ＴｃｄＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）および変異体ＴｃｄＢ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）（ここでその変異体毒素は例えば本明細書で記述される実施例２９、表１５に従ってＥＤＣにより不活性化された）が含まれる免疫原性組成物が、少なくとも以下の１６種類の異なるＣ．ディフィシルのＣＤＣ株からの毒素に対してそれぞれの毒素のみの対照と比較して中和活性を示す中和抗体を誘導したことを示す：２００７８８６（図２３Ａ）；２００６０１７（図２３Ｂ）；２００７０７０（図２３Ｃ）；２００７３０２（図２３Ｄ）；２００７８３８（図２３Ｅ）；２００７８８６（図２３Ｆ）；２００９２９２（図２３Ｇ）；２００４０１３（図２３Ｈ）；２００９１４１（図２３Ｉ）；２００５０２２（図２３Ｊ）；２００６３７６（図２３Ｋ）。図２３Ａ〜Ｋ：ＡＴＰレベル（ＲＬＵ）をＣ．ディフィシル培養液およびハムスター血清のプール（■）；それぞれの株からの粗製の毒素（培養回収物）およびハムスター血清のプール（●）；精製された毒素（ＬｉｓｔＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから得た市販の毒素）およびハムスター血清のプール（▲）；粗製の毒素（▼）、対照；ならびに精製された毒素（◆）、対照の増大する濃度に対してプロットした、インビトロ細胞毒性試験からの結果を表すグラフ。それぞれの株からの毒素を４×ＥＣ_５０値で細胞に添加した。図２３は、変異体ＴｃｄＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）および変異体ＴｃｄＢ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）（ここでその変異体毒素は例えば本明細書で記述される実施例２９、表１５に従ってＥＤＣにより不活性化された）が含まれる免疫原性組成物が、少なくとも以下の１６種類の異なるＣ．ディフィシルのＣＤＣ株からの毒素に対してそれぞれの毒素のみの対照と比較して中和活性を示す中和抗体を誘導したことを示す：２００７８８６（図２３Ａ）；２００６０１７（図２３Ｂ）；２００７０７０（図２３Ｃ）；２００７３０２（図２３Ｄ）；２００７８３８（図２３Ｅ）；２００７８８６（図２３Ｆ）；２００９２９２（図２３Ｇ）；２００４０１３（図２３Ｈ）；２００９１４１（図２３Ｉ）；２００５０２２（図２３Ｊ）；２００６３７６（図２３Ｋ）。図２３Ａ〜Ｋ：ＡＴＰレベル（ＲＬＵ）をＣ．ディフィシル培養液およびハムスター血清のプール（■）；それぞれの株からの粗製の毒素（培養回収物）およびハムスター血清のプール（●）；精製された毒素（ＬｉｓｔＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから得た市販の毒素）およびハムスター血清のプール（▲）；粗製の毒素（▼）、対照；ならびに精製された毒素（◆）、対照の増大する濃度に対してプロットした、インビトロ細胞毒性試験からの結果を表すグラフ。それぞれの株からの毒素を４×ＥＣ_５０値で細胞に添加した。図２３は、変異体ＴｃｄＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）および変異体ＴｃｄＢ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）（ここでその変異体毒素は例えば本明細書で記述される実施例２９、表１５に従ってＥＤＣにより不活性化された）が含まれる免疫原性組成物が、少なくとも以下の１６種類の異なるＣ．ディフィシルのＣＤＣ株からの毒素に対してそれぞれの毒素のみの対照と比較して中和活性を示す中和抗体を誘導したことを示す：２００７８８６（図２３Ａ）；２００６０１７（図２３Ｂ）；２００７０７０（図２３Ｃ）；２００７３０２（図２３Ｄ）；２００７８３８（図２３Ｅ）；２００７８８６（図２３Ｆ）；２００９２９２（図２３Ｇ）；２００４０１３（図２３Ｈ）；２００９１４１（図２３Ｉ）；２００５０２２（図２３Ｊ）；２００６３７６（図２３Ｋ）。図２３Ａ〜Ｋ：ＡＴＰレベル（ＲＬＵ）をＣ．ディフィシル培養液およびハムスター血清のプール（■）；それぞれの株からの粗製の毒素（培養回収物）およびハムスター血清のプール（●）；精製された毒素（ＬｉｓｔＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから得た市販の毒素）およびハムスター血清のプール（▲）；粗製の毒素（▼）、対照；ならびに精製された毒素（◆）、対照の増大する濃度に対してプロットした、インビトロ細胞毒性試験からの結果を表すグラフ。それぞれの株からの毒素を４×ＥＣ_５０値で細胞に添加した。図２３は、変異体ＴｃｄＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）および変異体ＴｃｄＢ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）（ここでその変異体毒素は例えば本明細書で記述される実施例２９、表１５に従ってＥＤＣにより不活性化された）が含まれる免疫原性組成物が、少なくとも以下の１６種類の異なるＣ．ディフィシルのＣＤＣ株からの毒素に対してそれぞれの毒素のみの対照と比較して中和活性を示す中和抗体を誘導したことを示す：２００７８８６（図２３Ａ）；２００６０１７（図２３Ｂ）；２００７０７０（図２３Ｃ）；２００７３０２（図２３Ｄ）；２００７８３８（図２３Ｅ）；２００７８８６（図２３Ｆ）；２００９２９２（図２３Ｇ）；２００４０１３（図２３Ｈ）；２００９１４１（図２３Ｉ）；２００５０２２（図２３Ｊ）；２００６３７６（図２３Ｋ）。図２３Ａ〜Ｋ：ＡＴＰレベル（ＲＬＵ）をＣ．ディフィシル培養液およびハムスター血清のプール（■）；それぞれの株からの粗製の毒素（培養回収物）およびハムスター血清のプール（●）；精製された毒素（ＬｉｓｔＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから得た市販の毒素）およびハムスター血清のプール（▲）；粗製の毒素（▼）、対照；ならびに精製された毒素（◆）、対照の増大する濃度に対してプロットした、インビトロ細胞毒性試験からの結果を表すグラフ。それぞれの株からの毒素を４×ＥＣ_５０値で細胞に添加した。図２３は、変異体ＴｃｄＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）および変異体ＴｃｄＢ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）（ここでその変異体毒素は例えば本明細書で記述される実施例２９、表１５に従ってＥＤＣにより不活性化された）が含まれる免疫原性組成物が、少なくとも以下の１６種類の異なるＣ．ディフィシルのＣＤＣ株からの毒素に対してそれぞれの毒素のみの対照と比較して中和活性を示す中和抗体を誘導したことを示す：２００７８８６（図２３Ａ）；２００６０１７（図２３Ｂ）；２００７０７０（図２３Ｃ）；２００７３０２（図２３Ｄ）；２００７８３８（図２３Ｅ）；２００７８８６（図２３Ｆ）；２００９２９２（図２３Ｇ）；２００４０１３（図２３Ｈ）；２００９１４１（図２３Ｉ）；２００５０２２（図２３Ｊ）；２００６３７６（図２３Ｋ）。図２３Ａ〜Ｋ：ＡＴＰレベル（ＲＬＵ）をＣ．ディフィシル培養液およびハムスター血清のプール（■）；それぞれの株からの粗製の毒素（培養回収物）およびハムスター血清のプール（●）；精製された毒素（ＬｉｓｔＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから得た市販の毒素）およびハムスター血清のプール（▲）；粗製の毒素（▼）、対照；ならびに精製された毒素（◆）、対照の増大する濃度に対してプロットした、インビトロ細胞毒性試験からの結果を表すグラフ。それぞれの株からの毒素を４×ＥＣ_５０値で細胞に添加した。図２３は、変異体ＴｃｄＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）および変異体ＴｃｄＢ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）（ここでその変異体毒素は例えば本明細書で記述される実施例２９、表１５に従ってＥＤＣにより不活性化された）が含まれる免疫原性組成物が、少なくとも以下の１６種類の異なるＣ．ディフィシルのＣＤＣ株からの毒素に対してそれぞれの毒素のみの対照と比較して中和活性を示す中和抗体を誘導したことを示す：２００７８８６（図２３Ａ）；２００６０１７（図２３Ｂ）；２００７０７０（図２３Ｃ）；２００７３０２（図２３Ｄ）；２００７８３８（図２３Ｅ）；２００７８８６（図２３Ｆ）；２００９２９２（図２３Ｇ）；２００４０１３（図２３Ｈ）；２００９１４１（図２３Ｉ）；２００５０２２（図２３Ｊ）；２００６３７６（図２３Ｋ）。図２３Ａ〜Ｋ：ＡＴＰレベル（ＲＬＵ）をＣ．ディフィシル培養液およびハムスター血清のプール（■）；それぞれの株からの粗製の毒素（培養回収物）およびハムスター血清のプール（●）；精製された毒素（ＬｉｓｔＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから得た市販の毒素）およびハムスター血清のプール（▲）；粗製の毒素（▼）、対照；ならびに精製された毒素（◆）、対照の増大する濃度に対してプロットした、インビトロ細胞毒性試験からの結果を表すグラフ。それぞれの株からの毒素を４×ＥＣ_５０値で細胞に添加した。図２３は、変異体ＴｃｄＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）および変異体ＴｃｄＢ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）（ここでその変異体毒素は例えば本明細書で記述される実施例２９、表１５に従ってＥＤＣにより不活性化された）が含まれる免疫原性組成物が、少なくとも以下の１６種類の異なるＣ．ディフィシルのＣＤＣ株からの毒素に対してそれぞれの毒素のみの対照と比較して中和活性を示す中和抗体を誘導したことを示す：２００７８８６（図２３Ａ）；２００６０１７（図２３Ｂ）；２００７０７０（図２３Ｃ）；２００７３０２（図２３Ｄ）；２００７８３８（図２３Ｅ）；２００７８８６（図２３Ｆ）；２００９２９２（図２３Ｇ）；２００４０１３（図２３Ｈ）；２００９１４１（図２３Ｉ）；２００５０２２（図２３Ｊ）；２００６３７６（図２３Ｋ）。図２３Ａ〜Ｋ：ＡＴＰレベル（ＲＬＵ）をＣ．ディフィシル培養液およびハムスター血清のプール（■）；それぞれの株からの粗製の毒素（培養回収物）およびハムスター血清のプール（●）；精製された毒素（ＬｉｓｔＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから得た市販の毒素）およびハムスター血清のプール（▲）；粗製の毒素（▼）、対照；ならびに精製された毒素（◆）、対照の増大する濃度に対してプロットした、インビトロ細胞毒性試験からの結果を表すグラフ。それぞれの株からの毒素を４×ＥＣ_５０値で細胞に添加した。図２３は、変異体ＴｃｄＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）および変異体ＴｃｄＢ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）（ここでその変異体毒素は例えば本明細書で記述される実施例２９、表１５に従ってＥＤＣにより不活性化された）が含まれる免疫原性組成物が、少なくとも以下の１６種類の異なるＣ．ディフィシルのＣＤＣ株からの毒素に対してそれぞれの毒素のみの対照と比較して中和活性を示す中和抗体を誘導したことを示す：２００７８８６（図２３Ａ）；２００６０１７（図２３Ｂ）；２００７０７０（図２３Ｃ）；２００７３０２（図２３Ｄ）；２００７８３８（図２３Ｅ）；２００７８８６（図２３Ｆ）；２００９２９２（図２３Ｇ）；２００４０１３（図２３Ｈ）；２００９１４１（図２３Ｉ）；２００５０２２（図２３Ｊ）；２００６３７６（図２３Ｋ）。図２４：結果として少なくとも３種類の可能性のあるタイプの修飾：架橋、グリシン付加体、およびベータ−アラニン付加体をもたらす、変異体Ｃ．ディフィシル毒素の典型的なＥＤＣ／ＮＨＳ不活性化の図説。パネルＡは架橋を図説する。三重変異体毒素のカルボキシル残基がＥＤＣおよびＮＨＳの付加により活性化される。その活性化されたエステルが第１級アミンと反応して安定なアミド結合を形成し、結果として分子内および分子間架橋をもたらす。パネルＢはグリシン付加体の形成を図説する。不活性化後、残存する活性化されたエステルはグリシンが付加されて安定なアミド結合を形成することにより急冷される（ｑｕｅｎｃｈｅｄ）。パネルＣはベータ−アラニン付加体の形成を図説する。３モルのＮＨＳが１モルのＥＤＣと反応して活性化されたベータ−アラニンを形成することができる。次いでこれが第１級アミンと反応して安定なアミド結合を形成する。図２５：結果として以下のタイプの修飾：（Ａ）架橋、（Ｂ）グリシン付加体、および（Ｃ）ベータ−アラニン付加体の少なくとも１種類をもたらす、変異体Ｃ．ディフィシル毒素の典型的なＥＤＣ／ＮＨＳ不活性化の図説。

配列の簡潔な記述
ＳＥＱＩＤＮＯ：１は、野生型Ｃ．ディフィシル６３０毒素Ａ（ＴｃｄＡ）に関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：２は、野生型Ｃ．ディフィシル６３０毒素Ｂ（ＴｃｄＢ）に関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：３は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１と比較して２８５および２８７位において変異を有する変異体ＴｃｄＡに関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：４は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１と比較して２８５、２８７、および７００位において変異を有する変異体ＴｃｄＡに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：５は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２と比較して２８６および２８８位において変異を有する変異体ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：６は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２と比較して２８６、２８８、および６９８位において変異を有する変異体ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：７は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１と比較して２６９、２７２、２８５、２８７、４６０、４６２、および７００位において変異を有する変異体ＴｃｄＡに関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：８は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２と比較して２７０、２７３、２８６、２８８、４６１、４６３、および６９８位において変異を有する変異体ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：９は、野生型Ｃ．ディフィシル６３０毒素Ａ（ＴｃｄＡ）をコードするＤＮＡ配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：１０は、野生型Ｃ．ディフィシル６３０毒素Ｂ（ＴｃｄＢ）をコードするＤＮＡ配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：１１は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３をコードするＤＮＡ配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：１２は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４をコードするＤＮＡ配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：１３は、ＳＥＱＩＤＮＯ：５をコードするＤＮＡ配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：１４は、ＳＥＱＩＤＮＯ：６をコードするＤＮＡ配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：１５は、野生型Ｃ．ディフィシルＲ２０２９１ＴｃｄＡに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：１６は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５をコードするＤＮＡ配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：１７は、野生型Ｃ．ディフィシルＣＤ１９６ＴｃｄＡに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：１８は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７をコードするＤＮＡ配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：１９は、野生型Ｃ．ディフィシルＶＰＩ１０４６３ＴｃｄＡに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：２０は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１９をコードするＤＮＡ配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：２１は、野生型Ｃ．ディフィシルＲ２０２９１ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：２２は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２１をコードするＤＮＡ配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：２３は、野生型Ｃ．ディフィシルＣＤ１９６ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：２４は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２３をコードするＤＮＡ配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：２５は、野生型Ｃ．ディフィシルＶＰＩ１０４６３ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：２６は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２５をコードするＤＮＡ配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：２７は、野生型Ｃ．ディフィシルＶＰＩ１０４６３の病原性遺伝子座のＤＮＡ配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：２８は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１の残基１０１〜２９３に関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：２９は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１の残基１〜５４２に関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：３０は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２の残基１０１〜２９３に関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：３１は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２の残基１〜５４３に関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：３２は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１の残基５４３〜８０９に関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：３３は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２の残基５４４〜７６７に関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：３４は変異体ＴｃｄＡに関するアミノ酸配列を示し、ここで残基１０１、２６９、２７２、２８５、２８７、４６０、４６２、５４１、５４２、５４３、５８９、６５５、および７００はあらゆるアミノ酸であることができる。

ＳＥＱＩＤＮＯ：３５は変異体ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示し、ここで１０２、２７０、２７３、２８６、２８８、３８４、４６１、４６３、５２０、５４３、５４４、５８７、６００、６５３、６９８、および７５１はあらゆるアミノ酸であることができる。

ＳＥＱＩＤＮＯ：３６は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡの中和抗体（Ａ３−２５ｍＡｂ）の可変軽鎖に関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：３７は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡの中和抗体（Ａ３−２５ｍＡｂ）の可変重鎖に関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：３８は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡの中和抗体（Ａ３−２５ｍＡｂ）の可変軽鎖のＣＤＲ１に関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：３９は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡの中和抗体（Ａ３−２５ｍＡｂ）の可変軽鎖のＣＤＲ２に関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：４０は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡの中和抗体（Ａ３−２５ｍＡｂ）の可変軽鎖のＣＤＲ３に関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：４１は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡの中和抗体（Ａ３−２５ｍＡｂ）の可変重鎖のＣＤＲ１に関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：４２は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡの中和抗体（Ａ３−２５ｍＡｂ）の可変重鎖のＣＤＲ２に関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：４３は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡの中和抗体（Ａ３−２５ｍＡｂ）の可変重鎖のＣＤＲ３に関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：４４は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３をコードするＤＮＡ配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：４５は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４をコードするＤＮＡ配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：４６は、ＳＥＱＩＤＮＯ：５をコードするＤＮＡ配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：４７は、ＳＥＱＩＤＮＯ：６をコードするＤＮＡ配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：４８は、免疫刺激オリゴヌクレオチドＯＤＮＣｐＧ２４５５５のヌクレオチド配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：４９は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ８−２６ｍＡｂ）の可変重鎖に関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：５０は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ８−２６ｍＡｂ）の可変重鎖のシグナルペプチドに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：５１は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ８−２６ｍＡｂ）の可変重鎖のＣＤＲ１に関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：５２は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ８−２６ｍＡｂ）の可変重鎖のＣＤＲ２に関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：５３は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ８−２６ｍＡｂ）の可変重鎖のＣＤＲ３に関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：５４は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ８−２６ｍＡｂ）の可変重鎖の定常領域に関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：５５は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ８−２６ｍＡｂ）の可変軽鎖に関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：５６は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ８−２６ｍＡｂ）の可変軽鎖のシグナルペプチドに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：５７は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ８−２６ｍＡｂ）の可変軽鎖のＣＤＲ１に関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：５８は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ８−２６ｍＡｂ）の可変軽鎖のＣＤＲ２に関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：５９は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ８−２６ｍＡｂ）の可変軽鎖のＣＤＲ３に関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：６０は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ５９−３ｍＡｂ）の可変重鎖に関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：６１は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ５９−３ｍＡｂ）の可変重鎖のシグナルペプチドに関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：６２は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ５９−３ｍＡｂ）の可変重鎖のＣＤＲ１に関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：６３は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ５９−３ｍＡｂ）の可変重鎖のＣＤＲ２に関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：６４は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ５９−３ｍＡｂ）の可変重鎖のＣＤＲ３に関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：６５は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ５９−３ｍＡｂ）の可変重鎖の定常領域に関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：６６は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ５９−３ｍＡｂ）の可変軽鎖に関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：６７は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ５９−３ｍＡｂ）の可変軽鎖のシグナルペプチドに関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：６８は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ５９−３ｍＡｂ）の可変軽鎖のＣＤＲ１に関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：６９は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ５９−３ｍＡｂ）の可変軽鎖のＣＤＲ２に関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：７０は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ５９−３ｍＡｂ）の可変軽鎖のＣＤＲ３に関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：７１は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ９−３０ｍＡｂ）の可変重鎖に関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：７２は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ９−３０ｍＡｂ）の可変重鎖のシグナルペプチドに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：７３は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ９−３０ｍＡｂ）の可変重鎖のＣＤＲ１に関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：７４は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ９−３０ｍＡｂ）の可変重鎖のＣＤＲ２に関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：７５は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ９−３０ｍＡｂ）の可変重鎖のＣＤＲ３に関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：７６は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ９−３０ｍＡｂ）の可変重鎖の定常領域に関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：７７は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ９−３０ｍＡｂ）の可変軽鎖に関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：７８は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ９−３０ｍＡｂ）の可変軽鎖のシグナルペプチドに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：７９は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ９−３０ｍＡｂ）の可変軽鎖のＣＤＲ１に関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：８０は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ９−３０ｍＡｂ）の可変軽鎖のＣＤＲ２に関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：８１は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ９−３０ｍＡｂ）の可変軽鎖のＣＤＲ３に関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：８２は変異体ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示し、ここで１０２、２７０、２７３、２８６、２８８、３８４、４６１、４６３、５２０、５４３、５４４、５８７、６００、６５３、６９８、および７５１位の残基はあらゆるアミノ酸であることができる。

ＳＥＱＩＤＮＯ：８３は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１と比較して２６９、２７２、２８５、２８７、４６０、４６２、および７００位において変異を有する変異体ＴｃｄＡに関するアミノ酸配列を示し、ここで１位のメチオニンは存在しない。

ＳＥＱＩＤＮＯ：８４は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１と比較して２８５、２８７、および７００位において変異を有する変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ａに関するアミノ酸配列を示し、ここで１位のメチオニンは存在しない。

ＳＥＱＩＤＮＯ：８５は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２と比較して２７０、２７３、２８６、２８８、４６１、４６３、および６９８位において変異を有する変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ｂに関するアミノ酸配列を示し、ここで１位のメチオニンは存在しない。

ＳＥＱＩＤＮＯ：８６は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２と比較して２８６、２８８、および６９８位において変異を有する変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ｂに関するアミノ酸配列を示し、ここで１位のメチオニンは存在しない。

ＳＥＱＩＤＮＯ：８７は野生型Ｃ．ディフィシル２００４０１３ＴｃｄＡに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：８８は野生型Ｃ．ディフィシル２００４１１１ＴｃｄＡに関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：８９は野生型Ｃ．ディフィシル２００４１１８ＴｃｄＡに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：９０は野生型Ｃ．ディフィシル２００４２０５ＴｃｄＡに関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：９１は野生型Ｃ．ディフィシル２００４２０６ＴｃｄＡに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：９２は野生型Ｃ．ディフィシル２００５０２２ＴｃｄＡに関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：９３は野生型Ｃ．ディフィシル２００５０８８ＴｃｄＡに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：９４は野生型Ｃ．ディフィシル２００５２８３ＴｃｄＡに関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：９５は野生型Ｃ．ディフィシル２００５３２５ＴｃｄＡに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：９６は野生型Ｃ．ディフィシル２００５３５９ＴｃｄＡに関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：９７は野生型Ｃ．ディフィシル２００６０１７ＴｃｄＡに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：９８は野生型Ｃ．ディフィシル２００７０７０ＴｃｄＡに関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：９９は野生型Ｃ．ディフィシル２００７２１７ＴｃｄＡに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：１００は野生型Ｃ．ディフィシル２００７３０２ＴｃｄＡに関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：１０１は野生型Ｃ．ディフィシル２００７８１６ＴｃｄＡに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：１０２は野生型Ｃ．ディフィシル２００７８３８ＴｃｄＡに関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：１０３は野生型Ｃ．ディフィシル２００７８５８ＴｃｄＡに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：１０４は野生型Ｃ．ディフィシル２００７８８６ＴｃｄＡに関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：１０５は野生型Ｃ．ディフィシル２００８２２２ＴｃｄＡに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：１０６は野生型Ｃ．ディフィシル２００９０７８ＴｃｄＡに関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：１０７は野生型Ｃ．ディフィシル２００９０８７ＴｃｄＡに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：１０８は野生型Ｃ．ディフィシル２００９１４１ＴｃｄＡに関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：１０９は野生型Ｃ．ディフィシル２００９２９２ＴｃｄＡに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：１１０は野生型Ｃ．ディフィシル２００４０１３ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：１１１は野生型Ｃ．ディフィシル２００４１１１ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：１１２は野生型Ｃ．ディフィシル２００４１１８ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：１１３は野生型Ｃ．ディフィシル２００４２０５ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：１１４は野生型Ｃ．ディフィシル２００４２０６ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：１１５は野生型Ｃ．ディフィシル２００５０２２ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：１１６は野生型Ｃ．ディフィシル２００５０８８ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：１１７は野生型Ｃ．ディフィシル２００５２８３ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：１１８は野生型Ｃ．ディフィシル２００５３２５ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：１１９は野生型Ｃ．ディフィシル２００５３５９ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：１２０は野生型Ｃ．ディフィシル２００６０１７ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：１２１は野生型Ｃ．ディフィシル２００６３７６ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：１２２は野生型Ｃ．ディフィシル２００７０７０ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：１２３は野生型Ｃ．ディフィシル２００７２１７ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：１２４は野生型Ｃ．ディフィシル２００７３０２ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：１２５は野生型Ｃ．ディフィシル２００７８１６ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：１２６は野生型Ｃ．ディフィシル２００７８３８ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：１２７は野生型Ｃ．ディフィシル２００７８５８ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：１２８は野生型Ｃ．ディフィシル２００７８８６ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：１２９は野生型Ｃ．ディフィシル２００８２２２ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：１３０は野生型Ｃ．ディフィシル２００９０７８ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：１３１は野生型Ｃ．ディフィシル２００９０８７ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：１３２は野生型Ｃ．ディフィシル２００９１４１ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：１３３は野生型Ｃ．ディフィシル２００９２９２ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：１３４は野生型Ｃ．ディフィシル０１４ＴｃｄＡに関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：１３５は野生型Ｃ．ディフィシル０１５ＴｃｄＡに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：１３６は野生型Ｃ．ディフィシル０２０ＴｃｄＡに関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：１３７は野生型Ｃ．ディフィシル０２３ＴｃｄＡに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：１３８は野生型Ｃ．ディフィシル０２７ＴｃｄＡに関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：１３９は野生型Ｃ．ディフィシル０２９ＴｃｄＡに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：１４０は野生型Ｃ．ディフィシル０４６ＴｃｄＡに関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：１４１は野生型Ｃ．ディフィシル０１４ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：１４２は野生型Ｃ．ディフィシル０１５ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：１４３は野生型Ｃ．ディフィシル０２０ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：１４４は野生型Ｃ．ディフィシル０２３ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：１４５は野生型Ｃ．ディフィシル０２７ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：１４６は野生型Ｃ．ディフィシル０２９ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：１４７は野生型Ｃ．ディフィシル０４６ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：１４８は野生型Ｃ．ディフィシル００１ＴｃｄＡに関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：１４９は野生型Ｃ．ディフィシル００２ＴｃｄＡに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：１５０は野生型Ｃ．ディフィシル００３ＴｃｄＡに関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：１５１は野生型Ｃ．ディフィシル００４ＴｃｄＡに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：１５２は野生型Ｃ．ディフィシル０７０ＴｃｄＡに関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：１５３は野生型Ｃ．ディフィシル０７５ＴｃｄＡに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：１５４は野生型Ｃ．ディフィシル０７７ＴｃｄＡに関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：１５５は野生型Ｃ．ディフィシル０８１ＴｃｄＡに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：１５６は野生型Ｃ．ディフィシル１１７ＴｃｄＡに関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：１５７は野生型Ｃ．ディフィシル１３１ＴｃｄＡに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：１５８は野生型Ｃ．ディフィシル００１ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：１５９は野生型Ｃ．ディフィシル００２ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：１６０は野生型Ｃ．ディフィシル００３ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：１６１は野生型Ｃ．ディフィシル００４ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：１６２は野生型Ｃ．ディフィシル０７０ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：１６３は野生型Ｃ．ディフィシル０７５ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：１６４は野生型Ｃ．ディフィシル０７７ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：１６５は野生型Ｃ．ディフィシル０８１ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：１６６は野生型Ｃ．ディフィシル１１７ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：１６７は野生型Ｃ．ディフィシル１３１ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：１６８は野生型Ｃ．ディフィシル０５３ＴｃｄＡに関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：１６９は野生型Ｃ．ディフィシル０７８ＴｃｄＡに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：１７０は野生型Ｃ．ディフィシル０８７ＴｃｄＡに関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：１７１は野生型Ｃ．ディフィシル０９５ＴｃｄＡに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：１７２は野生型Ｃ．ディフィシル１２６ＴｃｄＡに関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：１７３は野生型Ｃ．ディフィシル０５３ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：１７４は野生型Ｃ．ディフィシル０７８ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：１７５は野生型Ｃ．ディフィシル０８７ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱＩＤＮＯ：１７６は野生型Ｃ．ディフィシル０９５ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示す。

ＳＥＱＩＤＮＯ：１７７は野生型Ｃ．ディフィシル１２６ＴｃｄＢに関するアミノ酸配列を示す。
本発明者らは、驚くべきことに、数ある中でも、変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ａおよび毒素Ｂならびにその方法を発見した。その変異体は、部分的に、免疫原性であり、且つそれぞれの毒素の野生型の形態と比較して低減した細胞毒性を示すことを特徴とする。本発明は、その免疫原性部分、その生物学的均等物、および前記のもののいずれかをコードする核酸配列が含まれる単離されたポリヌクレオチドにも関する。

本明細書で記述される免疫原性組成物は意外にもＣ．ディフィシル毒素に対する新規の中和抗体を誘発する能力を示し、それらはＣ．ディフィシルの攻撃に対する能動的および／または受動的防御を与える能力を有する可能性がある。その新規の抗体は、毒素Ａおよび毒素Ｂの様々なエピトープに対して向けられている。本発明者らはさらに、その中和モノクローナル抗体の少なくとも２種類の組み合わせは毒素Ａおよび毒素Ｂのそれぞれのインビトロでの中和において意外にも相乗作用を示し得ることを発見した。

本明細書で記述される本発明の組成物は、哺乳類において、その組成物を投与されなかった哺乳類と比較して、Ｃ．ディフィシル感染症、Ｃ．ディフィシル関連疾患（ＣＤＡＤ）、症候群、病気、症状、および／またはそれらの合併症を処置する、予防する、それらの危険性を低下させる、それらの発生率を低下させる、それらの重症度を低下させる、および／またはそれらの発症を遅らせるために用いることができる。

さらに、本発明者らは、その変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ａおよび毒素Ｂを安定して発現することができる組み換え無芽胞性Ｃ．ディフィシル細胞ならびにその同じものを生成するための新規の方法を発見した。

免疫原性組成物
１側面において、本発明は変異体Ｃ．ディフィシル毒素が含まれる免疫原性組成物に関する。その変異体Ｃ．ディフィシル毒素には、対応する野生型Ｃ．ディフィシル毒素と比較してグルコシルトランスフェラーゼドメインにおいて少なくとも１個の変異およびシステインプロテアーゼドメインにおいて少なくとも１個の変異を有するアミノ酸配列が含まれる。

用語“野生型”は、本明細書で用いられる際、天然にある形態を指す。例えば、野生型のポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然の源から単離することができ、人の操作により意図的に改変されていない、生物中に存在する配列である。本発明は、前記のもののいずれかをコードする核酸配列が含まれる単離されたポリヌクレオチドにも関する。加えて、本発明は、哺乳類において、その組成物を投与されなかった哺乳類と比較して、Ｃ．ディフィシル感染症、Ｃ．ディフィシル関連疾患、症候群、病気、症状、および／またはそれらの合併症を処置する、予防する、それらの危険性を低下させる、それらの重症度を低下させる、それらの発生率を低下させる、および／またはそれらの発症を遅らせるための前記の組成物のいずれかの使用、ならびに前記の組成物を調製するための方法に関する。

本明細書で用いられる際、“免疫原性組成物”または“免疫原”は、その組成物が投与された哺乳類において免疫応答を誘発する組成物を指す。
“免疫応答”は、受容患者におけるＣ．ディフィシル毒素に対して向けられた有益な体液性（抗体に媒介される）および／または細胞性（抗原特異的Ｔ細胞またはそれらの分泌産物により媒介される）応答の発現を指す。免疫応答は、体液性、細胞性、または両方であってよい。

その免疫応答は、免疫原性組成物、免疫原の投与により誘導される能動的な応答であることができる。あるいは、その免疫応答は抗体または抗原刺激された（ｐｒｉｍｅｄ）Ｔ細胞の投与により誘導される受動的な応答であることができる。

体液性（抗体に媒介される）免疫応答の存在は、例えば当該技術で既知の細胞に基づくアッセイ、例えば中和抗体アッセイ、ＥＬＩＳＡ等により決定することができる。
細胞性免疫応答は、典型的にはクラスＩまたはクラスＩＩＭＨＣ分子と会合したポリペプチドエピトープを提示して抗原特異的ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞および／またはＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞を活性化することにより誘発される。その応答には、単球、マクロファージ、ＮＫ細胞、好塩基球、樹状細胞、星状細胞、小神経膠細胞、好酸球または先天免疫の他の構成要素も含まれ得る。細胞に媒介される免疫学的応答の存在は、当該技術で既知の増殖アッセイ（ＣＤ４＋Ｔ細胞）またはＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）アッセイにより決定することができる。

１態様において、免疫原性組成物はワクチン組成物である。本明細書で用いられる際、“ワクチン組成物”は、その組成物が投与された哺乳類において免疫応答を誘発する組成物である。そのワクチン組成物は、免疫された哺乳類をその後の免疫因子または免疫学的に交差反応性の因子による負荷に対して保護することができる。保護は、同じ条件下でワクチン接種していない哺乳類と比較した場合に症状または感染における低減に関して完全または部分的であり得る。

本明細書で記述される免疫原性組成物は交差反応性であり、それはその組成物が由来する株と異なる別のＣ．ディフィシル株により産生される毒素に対して有効な免疫応答（例えば体液性免疫応答）を誘発することができる特徴を有することを意味する。例えば、本明細書で記述される（例えばＣ．ディフィシル６３０に由来する）免疫原性組成物は、Ｃ．ディフィシルの多数の株により産生される毒素（例えばＣ．ディフィシルＲ２０２９１およびＶＰＩ１０４６３により産生される毒素）に結合することができる交差反応性抗体を誘発することができる。例えば実施例３７を参照。交差反応性は細菌性免疫原の交差防御能力を示しており、逆もまた同様である。

用語“交差防御”は、本明細書で用いられる際、免疫原性組成物により誘導される免疫応答の、同じ属の異なる細菌株または種による感染を予防する、または弱める能力を指す。例えば、本明細書で記述される（例えばＣ．ディフィシル６３０に由来する）免疫原性組成物は、哺乳類において６３０以外の株（例えばＣ．ディフィシルＲ２０２９１）により引き起こされるＣ．ディフィシル感染症を弱めるように、および／またはＣ．ディフィシル疾患を弱めるように、哺乳類において有効な免疫応答を誘導することができる。

その免疫原性組成物または免疫原が免疫応答を誘発する典型的な哺乳類には、あらゆる哺乳類、例えばマウス、ハムスター、霊長類、およびヒトのような哺乳類が含まれる。好ましい態様において、その免疫原性組成物または免疫原は、その組成物が投与されたヒトにおいて免疫応答を誘発する。

上記で記述したように、毒素Ａ（ＴｃｄＡ）および毒素Ｂ（ＴｃｄＢ）はＲｈｏ／Ｒａｃ／Ｒａｓファミリーの低分子量ＧＴＰアーゼを不活性化する相同性のグルコシルトランスフェラーゼである。ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢの哺乳類標的細胞への作用は、ＧＴＰアーゼの受容体に媒介されるエンドサイトーシス、膜移行、自己タンパク質分解性プロセシング、およびモノグルコシル化の多段階機構に依存する。これらの機能活性の多くはその毒素の一次配列内の別個の領域に帰せられており、その毒素は画像化されて（ｉｍａｇｅｄ）これらの分子が構造において類似していることが示されている。

ＴｃｄＡに関する野生型遺伝子は、約３０８ｋＤａの推定分子量を有し、約２７１０アミノ酸を有するタンパク質をコードする約８１３０ヌクレオチドを有する。本明細書で用いられる際、野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡにはあらゆる野生型Ｃ．ディフィシル株からのＣ．ディフィシルＴｃｄＡが含まれる。野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡには、例えばＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴプログラムにより初期設定のギャップウェイト（ｇａｐｗｅｉｇｈｔｓ）を用いて最適に整列させた際にＳＥＱＩＤＮＯ：１（完全長）に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、好ましくは約９８％、より好ましくは約９９％、または最も好ましくは約１００％の同一性を有する野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡのアミノ酸配列が含まれてよい。

好ましい態様において、野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡにはＳＥＱＩＤＮＯ：１で示されるアミノ酸配列が含まれ、それはＣ．ディフィシル株６３０からのＴｃｄＡに関する野生型アミノ酸配列を記述している（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＹＰ＿００１０８７１３７．１および／またはＣＡＪ６７４９４．１においても開示されている）。Ｃ．ディフィシル株６３０は当該技術においてＰＣＲ−リボタイプ０１２株であるものとして知られている。ＳＥＱＩＤＮＯ：９はＣ．ディフィシル株６３０からのＴｃｄＡに関する野生型遺伝子を記述しており、それはＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＣ＿００９０８９．１においても開示されている。

野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡの別の例には、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５で示されるアミノ酸配列が含まれ、それはＣ．ディフィシル株Ｒ２０２９１からのＴｃｄＡに関する野生型アミノ酸配列を記述している（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＹＰ＿００３２１７０８８．１においても開示されている）。Ｃ．ディフィシル株Ｒ２０２９１は当該技術において高病毒性株およびＰＣＲ−リボタイプ０２７株であるものとして知られている。Ｃ．ディフィシル株Ｒ２０２９１からのＴｃｄＡに関するアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１に対して約９８％の同一性を有する。ＳＥＱＩＤＮＯ：１６はＣ．ディフィシル株Ｒ２０２９１からのＴｃｄＡに関する野生型遺伝子を記述しており、それはＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＣ＿０１３３１６．１においても開示されている。

野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡの追加の例には、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７で示されるアミノ酸配列が含まれ、それはＣ．ディフィシル株ＣＤ１９６からのＴｃｄＡに関する野生型アミノ酸配列を記述している（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＣＢＡ６１１５６．１においても開示されている）。ＣＤ１９６は最近のカナダでの大流行からの株であり、それは当該技術においてＰＣＲ−リボタイプ０２７株として知られている。Ｃ．ディフィシル株ＣＤ１９６からのＴｃｄＡに関するアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１に対して約９８％の同一性を有し、Ｃ．ディフィシル株Ｒ２０２９１からのＴｃｄＡに対して約１００％の同一性を有する。ＳＥＱＩＤＮＯ：１８はＣ．ディフィシル株ＣＤ１９６からのＴｃｄＡに関する野生型遺伝子を記述しており、それはＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＦＮ５３８９７０．１においても開示されている。

野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡに関するアミノ酸配列のさらなる例にはＳＥＱＩＤＮＯ：１９が含まれ、それはＣ．ディフィシル株ＶＰＩ１０４６３からのＴｃｄＡに関する野生型アミノ酸配列を記述している（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＣＡＡ６３５６４．１においても開示されている）。Ｃ．ディフィシル株ＶＰＩ１０４６３からのＴｃｄＡに関するアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１に対して約１００％（９９．８％）の同一性を有する。ＳＥＱＩＤＮＯ：２０はＣ．ディフィシル株ＶＰＩ１０４６３からのＴｃｄＡに関する野生型遺伝子を記述しており、それはＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｘ９２９８２．１においても開示されている。

野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡの追加の例には、疾病管理予防センター（ＣＤＣ、ジョージア州アトランタ）から得ることができる野生型Ｃ．ディフィシル株からのＴｃｄＡが含まれる。本発明者らは、ＣＤＣから得ることが出来る野生型Ｃ．ディフィシル株からのＴｃｄＡのアミノ酸配列には、最適に整列させた際に、ＳＥＱＩＤＮＯ：１（Ｃ．ディフィシル６３０からのＴｃｄＡ）のアミノ酸残基１〜８２１に対して少なくとも約９９．３〜１００％の同一性が含まれることを発見した。表１参照。

本発明者らは、野生型Ｃ．ディフィシル株からのＴｃｄＡのアミノ酸配列には、最適に整列させた際に（例えば完全長配列を最適に整列させた際に）、ＳＥＱＩＤＮＯ：１に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、約１００％までの同一性が含まれ得ることも発見した。

表１：ＣＤＣから得られた野生型Ｃ．ディフィシル株および最適に整列させた際のそれぞれの野生型Ｃ．ディフィシル株からのＴｃｄＡのアミノ酸残基１〜８２１のＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸残基１〜８２１に対するパーセント同一性。

従って、１態様において、その野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡのアミノ酸配列には、例えばＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴプログラムにより初期設定のギャップウェイトを用いて最適に整列させた際にＳＥＱＩＤＮＯ：１の残基１〜９００の間の等しい長さの配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、好ましくは約９８％、より好ましくは約９９％、または最も好ましくは約１００％の同一性を有する、少なくとも約５００、６００、７００、または８００個の連続した残基の配列が含まれる。例には、上記で記述された株（例えばＲ２０２９１、ＣＤ１９６等）および表１において列挙された株が含まれる。

別の態様において、その野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡのアミノ酸配列には、最適に整列させた際にＳＥＱＩＤＮＯ：８７〜１０９から選択されるいずれかの配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、好ましくは約９７％、好ましくは約９８％、より好ましくは約９９％、または最も好ましくは約１００％の同一性を有する配列が含まれる。表１−ａ参照。

ＴｃｄＢに関する野生型遺伝子は、約２７０ｋＤａの推定分子量を有し、約２３６６アミノ酸を有するタンパク質をコードする約７０９８ヌクレオチドを有する。本明細書で用いられる際、野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢにはあらゆる野生型Ｃ．ディフィシル株からのＣ．ディフィシルＴｃｄＢが含まれる。野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢには、例えばＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴプログラムにより初期設定のギャップウェイトを用いて最適に整列させた際にＳＥＱＩＤＮＯ：２に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、好ましくは約９８％、より好ましくは約９９％、または最も好ましくは約１００％の同一性を有する野生型のアミノ酸配列が含まれてよい。好ましい態様において、野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢにはＳＥＱＩＤＮＯ：２で示されるアミノ酸配列が含まれ、それはＣ．ディフィシル株６３０からのＴｃｄＢに関する野生型アミノ酸配列を記述している（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＹＰ＿００１０８７１３５．１および／またはＣＡＪ６７４９２においても開示されている）。ＳＥＱＩＤＮＯ：１０はＣ．ディフィシル株６３０からのＴｃｄＢに関する野生型遺伝子を記述しており、それはＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＣ＿００９０８９．１においても開示されている。

野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢの別の例には、ＳＥＱＩＤＮＯ：２１で示されるアミノ酸配列が含まれ、それはＣ．ディフィシル株Ｒ２０２９１からのＴｃｄＢに関する野生型アミノ酸配列を記述している（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＹＰ＿００３２１７０８６．１および／またはＣＢＥ０２４７９．１においても開示されている）。Ｃ．ディフィシル株Ｒ２０２９１からのＴｃｄＢに関するアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に対して約９２％の同一性を有する。ＳＥＱＩＤＮＯ：２２はＣ．ディフィシル株Ｒ２０２９１からのＴｃｄＢに関する野生型遺伝子を記述しており、それはＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＣ＿０１３３１６．１においても開示されている。

野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢの追加の例には、ＳＥＱＩＤＮＯ：２３で示されるアミノ酸配列が含まれ、それはＣ．ディフィシル株ＣＤ１９６からのＴｃｄＢに関する野生型アミノ酸配列を記述している（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＹＰ＿００３２１３６３９．１および／またはＣＢＡ６１１５３．１においても開示されている）。ＳＥＱＩＤＮＯ：２４はＣ．ディフィシル株ＣＤ１９６からのＴｃｄＢに関する野生型遺伝子を記述しており、それはＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＣ＿０１３３１５．１においても開示されている。Ｃ．ディフィシル株ＣＤ１９６からのＴｃｄＢに関するアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に対して約９２％の同一性を有する。

野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢに関するアミノ酸配列のさらなる例にはＳＥＱＩＤＮＯ：２５が含まれ、それはＣ．ディフィシル株ＶＰＩ１０４６３からのＴｃｄＢに関する野生型アミノ酸配列を記述している（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｐ１８１７７および／またはＣＡＡ３７２９８においても開示されている）。Ｃ．ディフィシル株ＶＰＩ１０４６３からのＴｃｄＢに関するアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に対して１００％の同一性を有する。ＳＥＱＩＤＮＯ：２６はＣ．ディフィシル株ＶＰＩ１０４６３からのＴｃｄＢに関する野生型遺伝子を記述しており、それはＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｘ５３１３８．１においても開示されている。

野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢの追加の例には、疾病管理予防センター（ＣＤＣ、ジョージア州アトランタ）から得ることができる野生型Ｃ．ディフィシル株からのＴｃｄＢが含まれる。本発明者らは、ＣＤＣから得ることが出来る野生型Ｃ．ディフィシル株からのＴｃｄＢのアミノ酸配列には、最適に整列させた際に、ＳＥＱＩＤＮＯ：２（Ｃ．ディフィシル６３０からのＴｃｄＢ）のアミノ酸残基１〜８２１に対して少なくとも約９６〜１００％の同一性が含まれることを発見した。表２参照。

表２：ＣＤＣから得られた野生型Ｃ．ディフィシル株および最適に整列させた際のそれぞれの野生型Ｃ．ディフィシル株からのＴｃｄＢのアミノ酸残基１〜８２１のＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸残基１〜８２１に対するパーセント同一性。

従って、１態様において、野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢのアミノ酸配列には、例えばＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴプログラムにより初期設定のギャップウェイトを用いて最適に整列させた際にＳＥＱＩＤＮＯ：２の残基１〜９００の間の等しい長さの配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、好ましくは約９７％、好ましくは約９８％、より好ましくは約９９％、または最も好ましくは約１００％の同一性を有する、少なくとも約５００、６００、７００、または８００個の連続した残基の配列が含まれる。例には、上記で記述された株（例えばＲ２０２９１、ＣＤ１９６等）および表２において列挙された株が含まれる。

別の態様において、その野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢのアミノ酸配列には、最適に整列させた際にＳＥＱＩＤＮＯ：１１０〜１３３から選択されるいずれかの配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、好ましくは約９７％、好ましくは約９８％、より好ましくは約９９％、または最も好ましくは約１００％の同一性を有する配列が含まれる。表２−ａ参照。

毒素ＡおよびＢに関する遺伝子（ｔｃｄＡおよびｔｃｄＢ）は３個の追加の小さいオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であるｔｃｄＤ、ｔｃｄＥ、およびｔｃｄＣが含まる１９．６ｋｂの遺伝子座（病原性遺伝子座、ＰａＬｏｃ）の一部であり、病毒性の役に立っていると考えることができる。ＰａＬｏｃは毒素産生株において安定且つ保存されていることが知られている。それは現在までに分析されている全ての毒素産生株において同じ染色体組込み部位に存在する。非毒素産生株ではその病原性遺伝子座（ＰａＬｏｃ）は存在しない。従って、本明細書で記述される野生型Ｃ．ディフィシル株の１つの特徴は、病原性遺伝子座の存在である。本明細書で記述される野生型Ｃ．ディフィシル株の別の好ましい特徴は、ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢ両方の産生である。

１態様において、その野生型Ｃ．ディフィシル株は、Ｃ．ディフィシル６３０またはＶＰＩ１０４６３の病原性遺伝子座に少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、好ましくは約９８％、より好ましくは約９９％、または最も好ましくは約１００％同一である病原性遺伝子座を有する株である。Ｃ．ディフィシルＶＰＩ１０４６３の全病原性遺伝子座配列は、ＥＭＢＬデータベースにおいて配列アクセス番号Ｘ９２９８２で登録されており、ＳＥＱＩＤＮＯ：２６においても示されている。ＰａＬｏｃが参照株ＶＰＩ１０４６３のＰａＬｏｃと同一である株は、毒素タイプ（ｔｏｘｉｎｏｔｙｐｅ）０と呼ばれる。毒素タイプＩ〜ＶＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩ〜ＸＶ、およびＸＶＩＩＩ〜ＸＸＩＶの株は、それらの毒素遺伝子における変動にも関わらず、ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢ両方を産生する。

その毒素のＮ末端に、グルコシルトランスフェラーゼドメインが位置する。その毒素のグルコシルトランスフェラーゼ活性はその毒素の細胞毒性機能と関係している。機序または理論により束縛されるわけではないが、両方の毒素におけるグルコシルトランスフェラーゼ活性は、Ｒｈｏ／Ｒａｃ／Ｒａｓスーパーファミリーの低分子量ＧＴＰ結合タンパク質のモノグルコシル化を触媒すると信じられている。これらのＧＴＰ結合タンパク質のグルコシル化後、細胞生理は劇的に修正され、結果としてその毒素に感染した宿主細胞の構造的完全性の喪失および必須のシグナル伝達経路の崩壊がもたらされる。マンガン、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、およびグルコース結合に関わるＡｓｐ−Ｘａａ−Ａｓｐ（ＤＸＤ）モチーフは、そのグルコシルトランスフェラーゼドメインの典型的な特徴である。機序または理論により束縛されるわけではないが、触媒活性に重要な残基、例えばＤＸＤモチーフは、既知の“歴史上の”株、例えば６３０からのＴｃｄＢおよび高病毒性株、例えばＲ２０２９１からのＴｃｄＢの間で異なっていないと信じられる。そのＤＸＤモチーフは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１の番号付けに従う野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡの残基２８５〜２８７に、およびＳＥＱＩＤＮＯ：２の番号付けに従う野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢの残基２８６〜２８８に位置している。

グローバルアラインメントアルゴリズム（例えば配列分析プログラム）は当該技術において既知であり、２個以上のアミノ酸毒素配列を最適に整列させてその毒素に特定のシグナチャーモチーフ（ｓｉｇｎａｔｕｒｅｍｏｔｉｆ）（例えばグルコシルトランスフェラーゼドメイン中のＤＸＤ、下記で記述されるシステインプロテアーゼドメイン中のＤＨＣ等）が含まれるかどうかを決定するために用いることができる。最適に整列させた配列（単数または複数）を、それぞれの参照配列（例えばＴｃｄＡに関するＳＥＱＩＤＮＯ：１またはＴｃｄＢに関するＳＥＱＩＤＮＯ：２）に対して比較して、そのシグナチャーモチーフの存在を決定する。“最適なアラインメント”は、最も高いパーセント同一性の点数を与えるアラインメントを指す。そのようなアラインメントは、既知の配列分析プログラムを用いて実施することができる。１態様において、初期設定のパラメーターの下でのＣＬＵＳＴＡＬアラインメント（例えばＣＬＵＳＴＡＬＷ）がクエリ配列を参照配列に対して比較することにより適切な野生型毒素を同定するために用いられる。保存されたアミノ酸残基の相対的番号付けは、その整列させた配列内の小さい挿入または欠失（例えば５個アミノ酸以下）を説明するため、その参照アミノ酸配列の残基の番号付けに基づく。

本明細書で用いられる際、用語“の番号付けに従い”は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列を参照配列と比較する際の参照配列の残基の番号付けを指す。言い換えれば、所与のポリマーの数または残基の位置は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列内のその残基の実際の数値的位置によるのではなく、その参照配列に関して示される。

例えば、所与のアミノ酸配列、例えば高病毒性野生型Ｃ．ディフィシル株のアミノ酸配列を、２つの配列の間の残基の一致を最適化するために必要に応じてギャップを導入することにより参照配列（例えば歴史上の野生型Ｃ．ディフィシル株、例えば６３０の配列）に対して整列させることができる。これらの場合では、そのギャップが存在するが、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列中の残基の番号付けはそれを整列させた参照配列に関してなされる。本明細書で用いられる際、“参照配列”は、配列比較に関する基準として用いられる定められた配列を指す。

別途記載しない限り、本明細書におけるＴｃｄＡのアミノ酸位置に対する全ての言及は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１の番号付けを指す。別途記載しない限り、本明細書におけるＴｃｄＢのアミノ酸位置に対する全ての言及は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２の番号付けを指す。

ＴｃｄＡのグルコシルトランスフェラーゼドメインは、本明細書で用いられる際、野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡ、例えばＳＥＱＩＤＮＯ：１の典型的な残基１、１０１、または１０２で開始してよく、典型的な残基５４２、５１６、または２９３で終了してよい。ＤＸＤモチーフ領域が含まれる限り、ＴｃｄＡの残基１〜５４２のあらゆる最小の残基の位置を最大の残基の位置と組み合わせてグルコシルトランスフェラーゼドメインに関する配列を定めることができる。例えば、１態様において、ＴｃｄＡのグルコシルトランスフェラーゼドメインにはＳＥＱＩＤＮＯ：２７が含まれ、それはＳＥＱＩＤＮＯ：１の残基１０１〜２９３と同一であり、それにはＤＸＤモチーフ領域が含まれる。別の態様において、ＴｃｄＡのグルコシルトランスフェラーゼドメインにはＳＥＱＩＤＮＯ：２８が含まれ、それはＳＥＱＩＤＮＯ：１の残基１〜５４２と同一である。

ＴｃｄＢのグルコシルトランスフェラーゼドメインは、本明細書で用いられる際、野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ、例えばＳＥＱＩＤＮＯ：２の典型的な残基１、１０１、または１０２で開始してよく、典型的な残基５４３、５１６、または２９３で終了してよい。ＤＸＤモチーフ領域が含まれる限り、ＴｃｄＢの残基１〜５４３のあらゆる最小の残基の位置を最大の残基の位置と組み合わせてグルコシルトランスフェラーゼドメインに関する配列を定めることができる。例えば、１態様において、ＴｃｄＢのグルコシルトランスフェラーゼドメインにはＳＥＱＩＤＮＯ：２９が含まれ、それはＳＥＱＩＤＮＯ：２の残基１０１〜２９３と同一であり、それにはＤＸＤモチーフ領域が含まれる。別の態様において、ＴｃｄＢのグルコシルトランスフェラーゼドメインにはＳＥＱＩＤＮＯ：３０が含まれ、それはＳＥＱＩＤＮＯ：２の残基１〜５４３と同一である。

理論または機序により束縛されるわけではないが、ＴｃｄＡおよび／またはＴｃｄＢのＮ末端がそのグルコシルトランスフェラーゼドメインに関する自己タンパク質分解性プロセスにより切断されて移行し、宿主細胞の細胞質ゾル中に放出され、そこでそれはＲａｃ／Ｒａｓ／ＲｈｏＧＴＰアーゼと相互作用することができると信じられている。野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡはＬ５４２およびＳ５４３の間で切断されることが示されている。野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢはＬ５４３およびＧ５４４の間で切断されることが示されている。

システインプロテアーゼドメインはその毒素の自己触媒的タンパク質分解活性と関係している。システインプロテアーゼドメインはグルコシルトランスフェラーゼドメインの下流に位置しており、触媒三つ組（ｃａｔａｌｙｔｉｃｔｒｉａｄ）アスパラギン酸、ヒスチジン、およびシステイン（ＤＨＣ）、例えば野生型ＴｃｄＡのＤ５８９、Ｈ６５５、およびＣ７００、ならびに野生型ＴｃｄＢのＤ５８７、Ｈ６５３、およびＣ６９８を特徴とし得る。機序または理論により束縛されるわけではないが、その触媒三つ組は“歴史上の”株、例えば６３０からの毒素および高病毒性株、例えばＲ２０２９１からのＴｃｄＢの間で保存されていると信じられている。

ＴｃｄＡのシステインプロテアーゼドメインは、本明細書で用いられる際、野生型ＴｃｄＡ、例えばＳＥＱＩＤＮＯ：１の典型的な残基５４３で開始してよく、典型的な残基８０９、７６９、７６８、または７６７で終了してよい。触媒三つ組ＤＨＣモチーフ領域が含まれる限り、野生型ＴｃｄＡの５４３〜８０９のあらゆる最小の残基の位置を最大の残基の位置と組み合わせてシステインプロテアーゼドメインに関する配列を定めることができる。例えば、１態様において、ＴｃｄＡのシステインプロテアーゼドメインにはＳＥＱＩＤＮＯ：３２が含まれ、それはＳＥＱＩＤＮＯ：３２の残基４７、１１３、および１５８に位置するＤＨＣモチーフ領域を有し、それはそれぞれＳＥＱＩＤＮＯ：１の番号付けに従う野生型ＴｃｄＡのＤ５８９、Ｈ６５５、およびＣ７００に対応する。ＳＥＱＩＤＮＯ：３２はＳＥＱＩＤＮＯ：１、ＴｃｄＡの残基５４３〜８０９と同一である。

ＴｃｄＢのシステインプロテアーゼドメインは、本明細書で用いられる際、野生型ＴｃｄＢ、例えばＳＥＱＩＤＮＯ：２の典型的な残基５４４で開始してよく、典型的な残基８０１、７６７、７５５、または７００で終了してよい。触媒三つ組ＤＨＣモチーフ領域が含まれる限り、野生型ＴｃｄＢの５４４〜８０１のあらゆる最小の残基の位置を最大の残基の位置と組み合わせてシステインプロテアーゼドメインに関する配列を定めることができる。例えば、１態様において、ＴｃｄＢのシステインプロテアーゼドメインにはＳＥＱＩＤＮＯ：３３が含まれ、それにはＳＥＱＩＤＮＯ：３３の残基４４、１１０、および１１５に位置するＤＨＣモチーフ領域が含まれ、それはそれぞれＳＥＱＩＤＮＯ：２の番号付けに従う野生型ＴｃｄＢのＤ５８７、Ｈ６５３、およびＣ６９８に対応する。ＳＥＱＩＤＮＯ：３３はＳＥＱＩＤＮＯ：２、ＴｃｄＢの残基５４４〜７６７と同一である。別の態様において、ＴｃｄＢのシステインプロテアーゼドメインにはＳＥＱＩＤＮＯ：２、ＴｃｄＢの残基５４４〜８０１が含まれる。

本発明において、その免疫原性組成物には変異体Ｃ．ディフィシル毒素が含まれる。用語“変異体”は、本明細書で用いられる際、対応する野生型の構造または配列と、その対応する野生型の構造と比較して架橋を有することにより、および／または例えばＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴプログラムにより初期設定のギャップウェイトを用いて最適に整列させた際に対応する野生型の配列と比較して少なくとも１個の変異を有することにより異なる構造または配列を示す分子を指す。用語“変異体”には、本明細書で用いられる際、さらに対応する野生型分子と異なる機能的特性（例えば抑止されたグルコシルトランスフェラーゼおよび／または抑止されたシステインプロテアーゼ活性）を示す分子が含まれる。

上記で記述された野生型株のいずれかからのＣ．ディフィシル毒素を、それから変異体Ｃ．ディフィシル毒素を生成する源として用いることができる。好ましくは、Ｃ．ディフィシル６３０がそれから変異体Ｃ．ディフィシル毒素を生成する源である。

その変異は、通常はその位置に位置する野生型アミノ酸残基の置換、欠失、切り詰め（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）または修飾を含んでよい。好ましくは、その変異は非保存的アミノ酸置換である。本発明は、本明細書で記述される変異体毒素のいずれかをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドも意図している。

“非保存的”アミノ酸置換は、本明細書で用いられる際、次の表３に従うあるクラスからのアミノ酸の別のクラスからのアミノ酸との交換を指す：

非保存的アミノ酸置換の例には、アスパラギン酸残基（Ａｓｐ、Ｄ）がアラニン残基（Ａｌａ、Ａ）により置き換えられる置換が含まれる。他の例には、アスパラギン酸残基（Ａｓｐ、Ｄ）のアスパラギン残基（Ａｓｎ、Ｎ）による置き換え；アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）、および／またはヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）残基のアラニン残基（Ａｌａ、Ａ）による置き換えが含まれる。

保存的置換は、例えば表３に従う同じクラスからのアミノ酸の間での交換を指す。
本発明の変異体毒素は、例えば部位特異的変異誘発、変異原（例えば紫外線）を用いる変異誘発等のような、変異を調製するための当該技術で既知の技法により調製することができる。好ましくは、部位特異的変異誘発が用いられる。あるいは、目的配列を有する核酸分子を直接合成することができる。そのような化学合成法は、当該技術で既知である。

本発明において、その変異体Ｃ．ディフィシル毒素には、対応する野生型Ｃ．ディフィシル毒素と比較してグルコシルトランスフェラーゼドメイン中に少なくとも１個の変異が含まれる。１態様において、そのグルコシルトランスフェラーゼドメインには少なくとも２個の変異が含まれる。好ましくは、その変異はその毒素のグルコシルトランスフェラーゼ酵素活性を対応する野生型Ｃ．ディフィシル毒素のグルコシルトランスフェラーゼ酵素活性と比較して低下させる、または抑止する。

変異を起こすことができるＴｃｄＡのグルコシルトランスフェラーゼドメイン中の典型的なアミノ酸残基には、野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡと比較して、ＳＥＱＩＤＮＯ：１の番号付けに従って、以下の少なくとも１個またはそれらのあらゆる組み合わせが含まれる：Ｗ１０１、Ｄ２６９、Ｒ２７２、Ｄ２８５、Ｄ２８７、Ｅ４６０、Ｒ４６２、Ｓ５４１、およびＬ５４２。

ＴｃｄＡのグルコシルトランスフェラーゼドメインにおける典型的な変異には、野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡと比較して、以下の少なくとも１種類またはそれらのあらゆる組み合わせが含まれる：Ｗ１０１Ａ、Ｄ２６９Ａ、Ｒ２７２Ａ、Ｄ２８５Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ４６０Ａ、Ｒ４６２Ａ、Ｓ５４１Ａ、およびＬ５４２Ｇ。好ましい態様において、ＴｃｄＡのグルコシルトランスフェラーゼドメインには、野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡと比較して、Ｌ５４２Ｇ変異が含まれる。別の好ましい態様において、ＴｃｄＡのグルコシルトランスフェラーゼドメインには、野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡと比較して、Ｄ２８５ＡおよびＤ２８７Ａ変異が含まれる。

変異を起こすことができるＴｃｄＢのグルコシルトランスフェラーゼドメイン中の典型的なアミノ酸残基には、野生型Ｃ．ディフィシル毒素Ｂと比較して、ＳＥＱＩＤＮＯ：２の番号付けに従って、以下の少なくとも１個またはそれらのあらゆる組み合わせが含まれる：Ｗ１０２、Ｄ２７０、Ｒ２７３、Ｄ２８６、Ｄ２８８、Ｎ３８４、Ｄ４６１、Ｋ４６３、Ｗ５２０、およびＬ５４３。

ＴｃｄＢのグルコシルトランスフェラーゼドメインにおける典型的な変異には、野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢと比較して、以下の少なくとも１種類またはそれらのあらゆる組み合わせが含まれる：Ｗ１０２Ａ、Ｄ２７０Ａ、Ｄ２７０Ｎ、Ｒ２７３Ａ、Ｄ２８６Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｎ３８４Ａ、Ｄ４６１Ａ、Ｄ４６１Ｒ、Ｋ４６３Ａ、Ｋ４６３Ｅ、Ｗ５２０Ａ、およびＬ５４３Ａ。好ましい態様において、ＴｃｄＢのグルコシルトランスフェラーゼドメインには、野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢと比較して、Ｌ５４３Ａが含まれる。別の好ましい態様において、ＴｃｄＢのグルコシルトランスフェラーゼドメインには、野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢと比較して、Ｄ２８６ＡおよびＤ２８８Ａ変異が含まれる。

本明細書において上記で記述された変異のいずれも、システインプロテアーゼドメインにおける変異と組み合わせることができる。本発明において、その変異体Ｃ．ディフィシル毒素には、対応する野生型Ｃ．ディフィシル毒素と比較してシステインプロテアーゼドメイン中に少なくとも１個の変異が含まれる。好ましくは、その変異はその毒素のシステインプロテアーゼ活性を対応する野生型Ｃ．ディフィシル毒素のシステインプロテアーゼ活性と比較して低下させる、または抑止する。

変異を起こすことができるＴｃｄＡのシステインプロテアーゼドメイン中の典型的なアミノ酸残基には、野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡと比較して、ＳＥＱＩＤＮＯ：１の番号付けに従って、以下の少なくとも１個またはそれらのあらゆる組み合わせが含まれる：Ｓ５４３、Ｄ５８９、Ｈ６５５、およびＣ７００。ＴｃｄＡのグルコシルトランスフェラーゼドメインにおける典型的な変異には、野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡと比較して、以下の少なくとも１種類またはそれらのあらゆる組み合わせが含まれる：Ｓ５４３Ａ、Ｄ５８９Ａ、Ｄ５８９Ｎ、Ｈ６５５Ａ、Ｃ７００Ａ。好ましい態様において、ＴｃｄＡのシステインプロテアーゼドメインには、野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡと比較して、Ｃ７００Ａ変異が含まれる。

変異を起こすことができるＴｃｄＢのシステインプロテアーゼドメイン中の典型的なアミノ酸残基には、野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢと比較して、ＳＥＱＩＤＮＯ：２の番号付けに従って、以下の少なくとも１個またはそれらのあらゆる組み合わせが含まれる：Ｇ５４４、Ｄ５８７、Ｈ６５３、およびＣ６９８。ＴｃｄＢのグルコシルトランスフェラーゼドメインにおける典型的な変異には、野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢと比較して、以下の少なくとも１種類またはそれらのあらゆる組み合わせが含まれる：Ｇ５４４Ａ、Ｄ５８７Ａ、Ｄ５８７Ｎ、Ｈ６５３Ａ、Ｃ６９８Ａ。好ましい態様において、ＴｃｄＢのシステインプロテアーゼドメインには、野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢと比較して、Ｃ６９８Ａ変異が含まれる。変異を起こすことができるＴｃｄＢのシステインプロテアーゼドメイン中の追加のアミノ酸残基には、野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢと比較して、Ｋ６００および／またはＲ７５１が含まれる。典型的な変異には、Ｋ６００Ｅおよび／またはＲ７５１Ｅが含まれる。

従って、本発明の変異体Ｃ．ディフィシル毒素には、対応する野生型Ｃ．ディフィシル毒素と比較して変異を有するグルコシルトランスフェラーゼドメインおよび変異を有するシステインプロテアーゼドメインが含まれる。

典型的な変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡには、対応する野生型Ｃ．ディフィシル毒素Ａと比較して２８５位および２８７位においてアミノ酸置換を有するＳＥＱＩＤＮＯ：２９が含まれるグルコシルトランスフェラーゼドメインならびに１５８位においてアミノ酸置換を有するＳＥＱＩＤＮＯ：３２を含むシステインプロテアーゼドメインが含まれる。例えば、そのような変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡにはＳＥＱＩＤＮＯ：４で示されるアミノ酸配列が含まれ、ここで最初のメチオニンは場合により存在しない。別の態様において、その変異体Ｃ．ディフィシル毒素ＡにはＳＥＱＩＤＮＯ：８４で示されるアミノ酸配列が含まれる。

変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ａのさらなる例にはＳＥＱＩＤＮＯ：７で示されるアミノ酸配列が含まれ、それはＳＥＱＩＤＮＯ：１と比較してＤ２６９Ａ、Ｒ２７２Ａ、Ｄ２８５Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ４６０Ａ、Ｒ４６２Ａ、およびＣ７００Ａ変異を有し、ここで最初のメチオニンは場合により存在しない。別の態様において、その変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ａには、ＳＥＱＩＤＮＯ：８３で示されるアミノ酸配列が含まれる。

別の典型的な変異体ＴｃｄＡにはＳＥＱＩＤＮＯ：３４が含まれ、ここで１０１、２６９、２７２、２８５、２８７、４６０、４６２、５４１、５４２、５４３、５８９、６５５、および７００位の残基はあらゆるアミノ酸であってよい。

一部の態様において、その変異体Ｃ．ディフィシル毒素は対応する野生型Ｃ．ディフィシル毒素と比較して低下した、または抑止された自己タンパク質分解性プロセシングを示す。例えば、変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡには、対応する野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡと比較して、以下の残基：Ｓ５４１、Ｌ５４２および／またはＳ５４３の１個における変異またはそれらのあらゆる組み合わせが含まれていてよい。好ましくは、その変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡには、対応する野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡと比較して、以下の変異：Ｓ５４１Ａ、Ｌ５４２Ｇ、およびＳ５４３Ａの少なくとも１種類またはそれらのあらゆる組み合わせが含まれる。

別の典型的な変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡには、対応する野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡと比較して、Ｓ５４１Ａ、Ｌ５４２、Ｓ５４３およびＣ７００変異が含まれる。
典型的な変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢには、対応する野生型Ｃ．ディフィシル毒素Ｂと比較して２８６位および２８８位においてアミノ酸置換を有するＳＥＱＩＤＮＯ：３１を含むグルコシルトランスフェラーゼドメインならびに１５５位においてアミノ酸置換を有するＳＥＱＩＤＮＯ：３３を含むシステインプロテアーゼドメインが含まれる。例えば、そのような変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢにはＳＥＱＩＤＮＯ：６で示されるアミノ酸配列が含まれ、ここで最初のメチオニンは場合により存在しない。別の態様において、その変異体Ｃ．ディフィシル毒素ＡにはＳＥＱＩＤＮＯ：８６で示されるアミノ酸配列が含まれる。

変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ｂのさらなる例にはＳＥＱＩＤＮＯ：８で示されるアミノ酸配列が含まれ、それはＳＥＱＩＤＮＯ：２、ＳＥＱＩＤＮＯ：８と比較してＤ２７０Ａ、Ｒ２７３Ａ、Ｄ２８６Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｄ４６１Ａ、Ｋ４６３Ａ、およびＣ６９８Ａ変異を有し、ここで最初のメチオニンは場合により存在しない。別の態様において、その変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ａには、ＳＥＱＩＤＮＯ：８５で示されるアミノ酸配列が含まれる。

別の典型的な変異体ＴｃｄＢにはＳＥＱＩＤＮＯ：３５が含まれ、ここで１０１、２６９、２７２、２８５、２８７、４６０、４６２、５４１、５４２、５４３、５８９、６５５、および７００位の残基はあらゆるアミノ酸であってよい。

別の例として、変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢには、対応する野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢと比較して５４３および／または５４４位における変異が含まれていてよい。好ましくは、その変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢには、対応する野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢと比較して、Ｌ５４３および／またはＧ５４４変異が含まれる。より好ましくは、その変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢには、対応する野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢと比較して、Ｌ５４３Ａおよび／またはＧ５４４Ａ変異が含まれる。

別の典型的な変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢには、対応する野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢと比較してＬ５４３Ｇ、Ｇ５４４ＡおよびＣ６９８変異が含まれる。
１側面において、本発明は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２の番号付けに従うアミノ酸残基１〜１５００からのいずれかの位置において変異を有し、典型的な変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ｂを定める、単離されたポリペプチドに関する。例えば、１態様において、その単離されたポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸残基８３０〜９９０に変異を含む。変異に関する典型的な位置には、ＳＥＱＩＤＮＯ：２の番号付けに従う９７０位および９７６位が含まれる。好ましくは、その残基８３０〜９９０の変異は置換である。１態様において、その変異は非保存的置換であり、ここでＡｓｐ（Ｄ）および／またはＧｌｕ（Ｅ）アミノ酸残基が例えばリシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、およびヒスチジン（Ｈ）のような酸性化の際に中和されないアミノ酸残基により置き換えられている。典型的な変異にはＳＥＱＩＤＮＯ：２のＥ９７０Ｋ、Ｅ９７０Ｒ、Ｅ９７０Ｈ、Ｅ９７６Ｋ、Ｅ９７６Ｒ、Ｅ９７６Ｈが含まれ、変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ｂが定められる。

別の側面において、本発明は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１の番号付けに従うアミノ酸残基１〜１５００からのいずれかの位置において変異を有し、典型的な変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ａを定める、単離されたポリペプチドに関する。例えば、１態様において、その単離されたポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸残基８３２〜９９２に変異を含む。変異に関する典型的な位置には、ＳＥＱＩＤＮＯ：１の番号付けに従う９７２および９７８位が含まれる。好ましくは、その残基８３２〜９９２の変異は置換である。１態様において、その変異は非保存的置換であり、ここでＡｓｐ（Ｄ）および／またはＧｌｕ（Ｅ）アミノ酸残基が例えばリシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、およびヒスチジン（Ｈ）のような酸性化の際に中和されないアミノ酸残基により置き換えられている。典型的な変異にはＳＥＱＩＤＮＯ：１のＤ９７２Ｋ、Ｄ９７２Ｒ、Ｄ９７２Ｈ、Ｄ９７８Ｋ、Ｄ９７８Ｒ、Ｄ９７８Ｈが含まれ、変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ａが定められる。

本発明のポリペプチドには、一部の場合において宿主細胞に媒介されるプロセスの結果として最初のメチオニン残基が含まれていてよい。例えば組み換え生成手順において用いられる宿主細胞および／またはその宿主細胞の発酵もしくは増殖条件に依存して、翻訳開始コドンによりコードされるＮ末端のメチオニンは細胞中で翻訳後にポリペプチドから除去され得る、またはそのＮ末端のメチオニンはその単離されたポリペプチドにおいて存在するままであり得ることが当該技術において知られている。

従って、１側面において、本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：４で示されるアミノ酸配列が含まれる単離されたポリペプチドに関し、ここで（１位における）最初のメチオニンは場合により存在しない。１態様において、ＳＥＱＩＤＮＯ：４の最初のメチオニンは存在しない。１側面において、本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：８４で示されるアミノ酸配列が含まれる単離されたポリペプチドに関し、それは最初のメチオニンの非存在を除いてＳＥＱＩＤＮＯ：４と同一である。

別の側面において、その単離されたポリペプチドにはＳＥＱＩＤＮＯ：６で示されるアミノ酸配列が含まれ、ここで（１位における）最初のメチオニンは場合により存在しない。１態様において、ＳＥＱＩＤＮＯ：６の最初のメチオニンは存在しない。１側面において、本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：８６で示されるアミノ酸配列が含まれる単離されたポリペプチドに関し、それは最初のメチオニンの非存在を除いてＳＥＱＩＤＮＯ：６と同一である。

さらなる側面において、その単離されたポリペプチドにはＳＥＱＩＤＮＯ：７で示されるアミノ酸配列が含まれ、ここで（１位における）最初のメチオニンは場合により存在しない。１態様において、本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：８３で示されるアミノ酸配列が含まれる単離されたポリペプチドに関し、それは最初のメチオニンの非存在を除いてＳＥＱＩＤＮＯ：７と同一である。さらに別の側面において、その単離されたポリペプチドにはＳＥＱＩＤＮＯ：８で示されるアミノ酸配列が含まれ、ここで（１位における）最初のメチオニンは場合により存在しない。１態様において、その単離されたポリペプチドにはＳＥＱＩＤＮＯ：８５で示されるアミノ酸配列が含まれ、それは最初のメチオニンの非存在を除いてＳＥＱＩＤＮＯ：８と同一である。

１側面において、本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：４が含まれる免疫原性組成物に関し、ここで（１位における）最初のメチオニンは場合により存在しない。別の側面において、本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：６が含まれる免疫原性組成物に関し、ここで（１位における）最初のメチオニンは場合により存在しない。さらなる側面において、本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：７が含まれる免疫原性組成物に関し、ここで（１位における）最初のメチオニンは場合により存在しない。さらに別の側面において、本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：８が含まれる免疫原性組成物に関し、ここで（１位における）最初のメチオニンは場合により存在しない。

別の側面において、本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：８３が含まれる免疫原性組成物に関する。１側面において、本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：８４が含まれる免疫原性組成物に関する。１側面において、本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：８５が含まれる免疫原性組成物に関する。別の側面において、本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：８６が含まれる免疫原性組成物に関する。

哺乳類における免疫応答の生成に加えて、本明細書で記述される免疫原性組成物はまた、対応する野生型Ｃ．ディフィシル毒素と比較して低減した細胞毒性を有する。好ましくは、その免疫原性組成物は安全であり、且つ哺乳類における投与に関してそれぞれの野生型毒素の細胞毒性と比較して最小限（例えば約６〜８ｌｏｇ_１０の低減）の細胞毒性を有する〜細胞毒性を有しない。

本明細書で用いられる際、細胞毒性という用語は当該技術において理解されている用語であり、アポトーシス性の細胞死および／または細胞の１種類以上の通常の生化学的または生物学的機能がその細胞毒性薬剤の非存在を除いて同一の条件下の同一の細胞と比較して異常に弱められている（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ）状態を指す。毒性は、例えば細胞において、または哺乳類において、５０％の細胞死を誘導するのに必要な薬剤の量（すなわちそれぞれＥＣ_５０またはＥＤ_５０）として、または当該技術で既知の他の方法により定量化することができる。

細胞毒性を示すためのアッセイは当該技術において既知であり、例えば細胞円形化アッセイ（ｃｅｌｌｒｏｕｎｄｉｎｇａｓｓａｙｓ）である（例えばKuehne et al. Nature. 2010 Oct 7;467(7316):711-3を参照）。ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢの作用は細胞の円形化（例えば形態の喪失）および死を引き起こし、そのような現象は光学顕微鏡により見ることができる。例えば図９を参照。

当該技術で既知の追加の典型的な細胞毒性アッセイには、（Busch et al., J Biol Chem. 1998 Jul 31;273(31):19566-72において記述されているような）[^１４Ｃ]グルコースで標識されたＲａｓの蛍光体画像化に関するグルコシル化アッセイ、および好ましくは下記の実施例において記述されるインビトロ細胞毒性アッセイが含まれ、ここでＥＣ_５０は細胞、好ましくはヒト二倍体線維芽細胞（例えばＩＭＲ９０細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ−１８６（商標）））においてその毒素の非存在下で同一の条件下で同一の細胞と比較して少なくとも約５０％の細胞変性作用（ＣＰＥ）を示す免疫原性組成物の濃度を指してよい。そのインビトロ細胞毒性アッセイは、細胞、好ましくはヒト二倍体線維芽細胞（例えばＩＭＲ９０細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ−１８６（商標）））においてその毒素の非存在下で同一の条件下で同一の細胞と比較して野生型Ｃ．ディフィシル毒素に誘導される細胞変性作用（ＣＰＥ）の少なくとも約５０％を阻害する組成物の濃度を評価するために用いられてもよい。追加の典型的な細胞毒性アッセイには、Doern et al., J Clin Microbiol. 1992 Aug;30(8):2042-6において記述されている細胞毒性アッセイが含まれる。細胞毒性は、毒素で処理した細胞においてＡＴＰレベルを測定することにより決定することもできる。例えば、ルシフェラーゼに基づく基質、例えばＣＥＬＬＴＩＴＥＲＧＬＯ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いることができ、それは相対光単位（ＲＬＵ）として測定される発光を放射する。そのようなアッセイにおいて、細胞生存度はその細胞中のＡＴＰの量またはＲＬＵ値に正比例し得る。

１態様において、その免疫原性組成物の細胞毒性は、対応する野生型Ｃ．ディフィシル毒素と比較して少なくとも約１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１１０００、１２０００、１３０００倍、１４０００倍、１５０００倍、またはより多く低減されている。例えば表２０を参照。

別の態様において、その免疫原性組成物の細胞毒性は、対応する野生型毒素と同一条件下で比較して少なくとも約２−ｌｏｇ_１０、より好ましくは約３−ｌｏｇ_１０、そして最も好ましくは約４−ｌｏｇ_１０以上低減されている。例えば、変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢは、標準的な細胞変性作用アッセイ（ＣＰＥ）で測定した際に、少なくとも約１０^−１２ｇ／ｍｌのＥＣ_５０値を有し得る典型的な野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢと比較して、約１０^−９ｇ／ｍｌのＥＣ_５０値を有し得る。例えば下記の実施例の節中の表７Ａ、７Ｂ、８Ａおよび８Ｂを参照。

さらに別の態様において、その変異体Ｃ．ディフィシル毒素の細胞毒性は、例えばインビトロ細胞毒性アッセイ、例えば本明細書で記述されるインビトロ細胞毒性アッセイにより測定した際に、少なくとも約５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、７００μｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌ、９００μｇ／ｍｌ、１０００μｇ／ｍｌ、またはより大きいＥＣ_５０を有する。従って、好ましい態様において、その免疫原性組成物および変異体毒素は哺乳類への投与に関して生物学的に安全である。

機序または理論により束縛されるわけではないが、野生型ＴｃｄＡと比較してＤ２８５およびＤ２８７変異を有するＴｃｄＡ、ならびに野生型ＴｃｄＢと比較してＤ２８６およびＤ２８８変異を有するＴｃｄＢはグルコシルトランスフェラーゼ活性において欠陥があり、従って細胞変性作用の誘導において欠陥があると予想された。加えて、ＤＨＣモチーフ中に変異を有する毒素は自己触媒的プロセシングにおいて欠陥があり、従って細胞毒性作用を一切有しないと予想された。

しかし、本発明者らは、驚くべきことに、数ある中でも、ＳＥＱＩＤＮＯ：４を有する典型的な変異体ＴｃｄＡおよびＳＥＱＩＤＮＯ：６を有する典型的な変異体ＴｃｄＢは、機能不全のグルコシルトランスフェラーゼ活性および機能不全のシステインプロテアーゼ活性を示すにも関わらず、（野生型Ｃ．ディフィシル６３０毒素から著しく低減してはいたが）意外にも細胞毒性を示すことを発見した。機序または理論により束縛されるわけではないが、その変異体毒素は新規の機序により細胞毒性をもたしていると信じられる。それでもなお、ＳＥＱＩＤＮＯ：４を有する典型的な変異体ＴｃｄＡおよびＳＥＱＩＤＮＯ：６を有する典型的な変異体ＴｃｄＢは、驚くほど免疫原性であった。下記の実施例を参照。

野生型毒素の化学的架橋はその毒素の不活性化に失敗する可能性を有するが、本発明者らはさらに、変異体毒素の少なくとも１個のアミノ酸において化学的に架橋することはその変異体毒素の細胞毒性を化学的架橋を欠く同一の変異体毒素と比較して、そして対応する野生型毒素と比較してさらに低減することを発見した。好ましくは、その変異体毒素はその化学的架橋剤との接触の前に精製される。

さらに、化学的架橋剤が有用なエピトープを変化させる可能性にも関わらず、本発明者らは驚くべきことに、化学的に架橋された少なくとも１個のアミノ酸を有する遺伝学的に改変された変異体Ｃ．ディフィシル毒素は結果として多数の中和抗体またはその結合断片を引き出す免疫原性組成物をもたらすことを発見した。従って、中和抗体分子と関係するエピトープは意外にも以下の化学的架橋を保持していた。

架橋（本明細書において“化学的不活性化”または“不活性化”とも呼ばれる）は、２個以上の分子を共有結合により化学的に連結するプロセスである。用語“架橋試薬”、“架橋剤”、および“クロスリンカー”は、ペプチド、ポリペプチド、および／またはタンパク質上の特定の官能基（第１級アミン類、スルヒドリル類（ｓｕｌｈｙｄｒｙｌｓ）、カルボキシル類、カルボニル類等）と反応する、および／またはそれに化学的に付着することができる分子を指す。１態様において、その分子はペプチド、ポリペプチド、および／またはタンパク質上の特定の官能基（第１級アミン類、スルヒドリル類（ｓｕｌｈｙｄｒｙｌｓ）、カルボキシル類、カルボニル類等）と反応する、および／またはそれに化学的に付着することができる２個以上の反応性末端を含有していてよい。好ましくは、その化学的架橋剤は水溶性である。別の好ましい態様において、その化学的架橋剤はヘテロ二官能性クロスリンカーである。別の態様において、その化学的架橋剤は二官能性クロスリンカーではない。化学的架橋剤は当該技術で既知である。

好ましい態様において、その架橋剤はゼロ長（ｚｅｒｏ−ｌｅｎｇｔｈ）架橋剤である。“ゼロ長”クロスリンカーは、２個の分子の官能基の間の直接の架橋を媒介または生成するであろう架橋剤を指す。例えば、２個のポリペプチドの架橋において、ゼロ長クロスリンカーは結果として外来の要素を組み込むことなく橋、または１つのポリペプチドのアミノ酸側鎖からのカルボキシル基および別のポリペプチドのアミノ基の間の架橋の形成をもたらすであろう。ゼロ長架橋剤は、例えばヒドロキシルおよびカルボキシル部分の間のエステル結合の形成、および／またはカルボキシルおよび第１級アミノ部分の間のアミド結合の形成を触媒することができる。

典型的な適切な化学的架橋剤には、ホルムアルデヒド；ホルマリン；アセトアルデヒド；プロピオンアルデヒド；１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−（４−エチル）カルボジイミドメト−ｐ−トルエンスルホネート（ＣＭＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、およびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、およびそれらの誘導体が含まれる、水溶性カルボジイミド類（ＲＮ＝Ｃ＝ＮＲ’）；ならびにＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）；フェニルグリオキサール；および／またはＵＤＰ−ジアルデヒドが含まれる。

好ましくは、その架橋剤はＥＤＣである。変異体Ｃ．ディフィシル毒素ポリペプチドがＥＤＣにより（例えばそのポリペプチドをＥＤＣと接触させることにより）化学的に修飾される場合、１態様において、そのポリペプチドには（ａ）そのポリペプチドのアスパラギン酸残基の側鎖およびそのポリペプチドのリシン酸残基の側鎖の間の少なくとも１個の架橋が含まれる。１態様において、そのポリペプチドには（ｂ）そのポリペプチドのグルタミン酸残基の側鎖およびそのポリペプチドのリシン酸残基の側鎖の間の少なくとも１個の架橋が含まれる。１態様において、そのポリペプチドには（ｃ）そのポリペプチドのＣ末端のカルボキシル基およびそのポリペプチドのＮ末端のアミノ基の間の少なくとも１個の架橋が含まれる。１態様において、そのポリペプチドには（ｄ）そのポリペプチドのＣ末端のカルボキシル基およびそのポリペプチドのリシン酸残基の側鎖の間の少なくとも１個の架橋が含まれる。１態様において、そのポリペプチドには（ｅ）そのポリペプチドのアスパラギン酸残基の側鎖および第２の単離されたポリペプチドのリシン酸残基の側鎖の間の少なくとも１個の架橋が含まれる。１態様において、そのポリペプチドには（ｆ）そのポリペプチドのグルタミン酸残基の側鎖および第２の単離されたポリペプチドのリシン酸残基の側鎖の間の少なくとも１個の架橋が含まれる。１態様において、そのポリペプチドには（ｇ）そのポリペプチドのＣ末端のカルボキシル基および第２の単離されたポリペプチドのＮ末端のアミノ基の間の少なくとも１個の架橋が含まれる。１態様において、そのポリペプチドには（ｈ）そのポリペプチドのＣ末端のカルボキシル基および第２の単離されたポリペプチドのリシン酸残基の側鎖の間の少なくとも１個の架橋が含まれる。例えば、図２４および図２５を参照。

“第２の単離されたポリペプチド”は、ＥＤＣとの反応の間に存在するあらゆる単離されたポリペプチドを指す。１態様において、第２の単離されたポリペプチドは、第１の単離されたポリペプチドと同一の配列を有する変異体Ｃ．ディフィシル毒素ポリペプチドである。別の態様において、第２の単離されたポリペプチドは、第１の単離されたポリペプチドと異なる配列を有する変異体Ｃ．ディフィシル毒素ポリペプチドである。

１態様において、そのポリペプチドには（ａ）〜（ｄ）の修飾から選択される少なくとも２個の修飾が含まれる。典型的な態様において、そのポリペプチドには（ａ）そのポリペプチドのアスパラギン酸残基の側鎖およびそのポリペプチドのリシン酸残基の側鎖の間の少なくとも１個の架橋ならびに（ｂ）そのポリペプチドのグルタミン酸残基の側鎖およびそのポリペプチドのリシン酸残基の側鎖の間の少なくとも１個の架橋が含まれる。さらなる態様において、そのポリペプチドには（ａ）〜（ｄ）の修飾から選択される少なくとも３個の修飾が含まれる。さらに別の態様において、そのポリペプチドには（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）の修飾が含まれる。

１より多くの変異体ポリペプチドがＥＤＣによる化学修飾の間に存在する場合、１態様において、その結果として生じる組成物には（ａ）〜（ｈ）の修飾のいずれかの少なくとも１個が含まれる。１態様において、その組成物には（ａ）〜（ｈ）の修飾から選択される少なくとも２個の修飾が含まれる。さらなる態様において、その組成物には（ａ）〜（ｈ）の修飾から選択される少なくとも３個の修飾が含まれる。さらに別の態様において、その組成物には（ａ）〜（ｈ）の修飾から選択される少なくとも４個の修飾が含まれる。別の態様において、その組成物には（ａ）〜（ｈ）の修飾のそれぞれの少なくとも１個が含まれる。

典型的な態様において、その結果として生じる組成物には（ａ）そのポリペプチドのアスパラギン酸残基の側鎖およびそのポリペプチドのリシン酸残基の側鎖の間の少なくとも１個の架橋；ならびに（ｂ）そのポリペプチドのグルタミン酸残基の側鎖およびそのポリペプチドのリシン酸残基の側鎖の間の少なくとも１個の架橋が含まれる。１態様において、その組成物にはさらに（ｃ）そのポリペプチドのＣ末端のカルボキシル基およびそのポリペプチドのＮ末端のアミノ基の間の少なくとも１個の架橋；ならびに（ｄ）そのポリペプチドのＣ末端のカルボキシル基およびそのポリペプチドのリシン酸残基の側鎖の間の少なくとも１個の架橋が含まれる。

別の典型的な態様において、その結果として生じる組成物には（ｅ）そのポリペプチドのアスパラギン酸残基の側鎖および第２の単離されたポリペプチドのリシン酸残基の側鎖の間の少なくとも１個の架橋；（ｆ）そのポリペプチドのグルタミン酸残基の側鎖および第２の単離されたポリペプチドのリシン酸残基の側鎖の間の少なくとも１個の架橋；（ｇ）そのポリペプチドのＣ末端のカルボキシル基および第２の単離されたポリペプチドのＮ末端のアミノ基の間の少なくとも１個の架橋；ならびに（ｈ）そのポリペプチドのＣ末端のカルボキシル基および第２の単離されたポリペプチドのリシン酸残基の側鎖の間の少なくとも１個の架橋が含まれる。

さらなる典型的な態様において、その結果として生じる組成物には（ａ）そのポリペプチドのアスパラギン酸残基の側鎖およびそのポリペプチドのリシン酸残基の側鎖の間の少なくとも１個の架橋；（ｂ）そのポリペプチドのグルタミン酸残基の側鎖およびそのポリペプチドのリシン酸残基の側鎖の間の少なくとも１個の架橋；（ｅ）そのポリペプチドのアスパラギン酸残基の側鎖および第２の単離されたポリペプチドのリシン酸残基の側鎖の間の少なくとも１個の架橋；ならびに（ｆ）そのポリペプチドのグルタミン酸残基の側鎖および第２の単離されたポリペプチドのリシン酸残基の側鎖の間の少なくとも１個の架橋が含まれる。

好ましい態様において、その化学的架橋剤にはホルムアルデヒドが含まれ、より好ましくはリシンの非存在下でホルムアルデヒドが含まれる薬剤が含まれる。グリシンまたは他の適切な第１級アミンを有する化合物を、架橋反応における失活剤（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）として用いることができる。従って、別の好ましい態様において、その化学的薬剤にはホルムアルデヒドおよびグリシンの使用が含まれる。

さらに別の好ましい態様において、その化学的架橋剤にはＥＤＣおよびＮＨＳが含まれる。当該技術で既知であるように、ＮＨＳをＥＤＣのカップリングプロトコル中に含めることができる。しかし、本発明者らは、驚くべきことに、ＮＨＳはその変異体Ｃ．ディフィシル毒素の、対応する野生型毒素と比較した場合の、遺伝学的に変異させた毒素と比較した場合の、そしてＥＤＣにより化学的に架橋されている遺伝学的に変異させた毒素と比較した場合の細胞毒性のさらなる低下を促進することができることを発見した。例えば実施例２２を参照。従って、機序または理論により束縛されるわけではないが、（例えば変異体毒素ポリペプチド、ＥＤＣ、およびＮＨＳの反応の結果として生じる）そのポリペプチドの少なくとも１個のリシン残基の側鎖に連結されたベータ−アラニン部分を有する変異体毒素ポリペプチドは、例えばベータ−アラニン部分が存在しないＣ．ディフィシル毒素（野生型または変異体）と比較して、その変異体毒素の細胞毒性のさらなる低下を促進し得る。

ＥＤＣおよび／またはＮＨＳの使用には、グリシンまたは他の適切な第１級アミンを有する化合物の失活剤としての使用も含まれてよい。例えばグリシンメチルエステルおよびアラニンのような、第１級アミンを有するあらゆる化合物を失活剤として用いることができる。好ましい態様において、その失活剤化合物は非重合体性親水性第１級アミンである。非重合体性親水性第１級アミンの例には、例えばアミノ糖類、アミノアルコール類、およびアミノポリオール類が含まれる。非重合体性親水性第１級アミンの具体的な例には、グリシン、エタノールアミン、グルカミン、アミン官能性を持たせた（ａｍｉｎｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ）ポリエチレングリコール、およびアミン官能性を持たせたエチレングリコールオリゴマー類が含まれる。

１側面において、本発明は、ＥＤＣおよび非重合体性親水性第１級アミン、好ましくはグリシンにより化学修飾された少なくとも１個のアミノ酸側鎖を有する変異体Ｃ．ディフィシル毒素ポリペプチドに関する。（例えばＥＤＣ、ＮＨＳで処理し、グリシンで失活させた（ｑｕｅｎｃｈｅｄ）三重変異体毒素の反応の）結果として生じるグリシン付加物は、対応する野生型毒素と比較してその変異体毒素の細胞毒性の低下を促進し得る。

１態様において、変異体Ｃ．ディフィシル毒素ポリペプチドがＥＤＣおよびグリシンにより化学修飾される場合、そのポリペプチドには、そのポリペプチドがＥＤＣにより修飾される際の少なくとも１個の修飾（例えば上記で記述された（ａ）〜（ｈ）の修飾のいずれかの少なくとも１個）、ならびに以下の典型的な修飾の少なくとも１個が含まれる：（ｉ）そのポリペプチドのＣ末端のカルボキシル基に連結されたグリシン部分；（ｊ）そのポリペプチドの少なくとも１個のアスパラギン酸残基の側鎖に連結されたグリシン部分；および（ｋ）そのポリペプチドの少なくとも１個のグルタミン酸残基の側鎖に連結されたグリシン部分。例えば、図２４および図２５を参照。

１態様において、変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡの少なくとも１個のアミノ酸は化学的に架橋されており、および／または変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢの少なくとも１個のアミノ酸は化学的に架橋されている。別の態様において、ＳＥＱＩＤＮＯ：４、ＳＥＱＩＤＮＯ：６、ＳＥＱＩＤＮＯ：７、および／またはＳＥＱＩＤＮＯ：８の少なくとも１個のアミノ酸は化学的に架橋されている。例えば、その少なくとも１個のアミノ酸は、カルボジイミドが含まれる薬剤、例えばＥＤＣにより化学的に架橋することができる。カルボジイミド類は、（例えばアスパラギン酸および／またはグルタミン酸の側鎖からの）遊離のカルボキシルおよび（例えばリシン残基の側鎖中の）アミノ基の間で共有結合を形成して安定なアミド結合を形成することができる。

別の例として、その少なくとも１個のアミノ酸は、ＮＨＳが含まれる薬剤により化学的に架橋することができる。ＮＨＳエステルで活性化されたクロスリンカーは、（例えばそれぞれのポリペプチド鎖のＮ末端の、および／またはリシン残基の側鎖中の）第１級アミンと反応してアミド結合を生じることができる。

別の態様において、その少なくとも１個のアミノ酸は、ＥＤＣおよびＮＨＳが含まれる薬剤により化学的に架橋することができる。例えば、１態様において、本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：４で示されるアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドに関し、ここで１位のメチオニン残基は場合により存在せず、ここでそのポリペプチドにはＥＤＣおよびＮＨＳにより化学的に修飾された少なくとも１個のアミノ酸側鎖が含まれる。別の態様において、本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：６で示されるアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドに関し、ここで１位のメチオニン残基は場合により存在せず、ここでそのポリペプチドにはＥＤＣおよびＮＨＳにより化学的に修飾された少なくとも１個のアミノ酸側鎖が含まれる。さらに別の態様において、本発明は、ＳＥＱＩＤＮＯ：８４、ＳＥＱＩＤＮＯ：８６、ＳＥＱＩＤＮＯ：８３、ＳＥＱＩＤＮＯ：８５、ＳＥＱＩＤＮＯ：７、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８で示されるアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドに関する。そのポリペプチドは、そのポリペプチドをＥＤＣおよびＮＨＳと接触させることにより修飾される。例えば図２４および図２５を参照。

変異体Ｃ．ディフィシル毒素ポリペプチドがＥＤＣおよびＮＨＳにより（例えば接触により）化学的に修飾される場合、１態様において、そのポリペプチドにはそのポリペプチドがＥＤＣにより修飾される際の少なくとも１個の修飾（例えば上記で記述された（ａ）〜（ｈ）の修飾のいずれかの少なくとも１個）、および（ｌ）そのポリペプチドの少なくとも１個のリシン残基の側鎖に連結されたベータ−アラニン部分が含まれる。

別の側面において、本発明は変異体Ｃ．ディフィシル毒素ポリペプチドに関し、ここでそのポリペプチドにはＥＤＣ、ＮＨＳ、および非重合体性親水性第１級アミン、好ましくはグリシンにより化学修飾された少なくとも１個のアミノ酸側鎖が含まれる。１態様において、そのポリペプチドにはそのポリペプチドがＥＤＣにより修飾される際の少なくとも１個の修飾（例えば上記で記述された（ａ）〜（ｈ）の修飾のいずれかの少なくとも１個）、そのポリペプチドがグリシンにより修飾される際の少なくとも１個の修飾（例えば上記で記述された（ｉ）〜（ｋ）の修飾のいずれかの少なくとも１個）、および（ｌ）そのポリペプチドの少なくとも１個のリシン残基の側鎖に連結されたベータ−アラニン部分が含まれる。例えば、図２４および図２５を参照。

１側面において、本発明は変異体Ｃ．ディフィシル毒素ポリペプチドに関し、ここでそのポリペプチドの少なくとも１個のリシン残基の側鎖はベータ−アラニン部分に連結されている。１態様において、そのポリペプチドの第２のリシン残基の側鎖はアスパラギン酸残基の側鎖に、および／またはグルタミン酸残基の側鎖に連結されている。そのポリペプチドの“第２の”リシン残基には、ベータ−アラニン部分に連結されていないそのポリペプチドのリシン残基が含まれる。その第２のリシン残基が連結されているアスパラギン酸の側鎖および／またはグルタミン酸の側鎖は、そのポリペプチドのアスパラギン酸の側鎖および／またはグルタミン酸の側鎖であって分子内架橋を形成していてよく、または第２のポリペプチドのアスパラギン酸の側鎖および／またはグルタミン酸の側鎖であって分子間架橋を形成していてよい。別の態様において、そのポリペプチドの少なくとも１個のアスパラギン酸残基の側鎖および／または少なくとも１個のグルタミン酸残基の側鎖はグリシン部分に連結されている。そのグリシン部分に連結されているアスパラギン酸残基および／またはグルタミン酸残基は、リシン残基には連結されていない。

化学的に架橋された変異体Ｃ．ディフィシル毒素ポリペプチドのさらに別の例として、少なくとも１個のアミノ酸をホルムアルデヒドが含まれる薬剤により化学的に架橋することができる。ホルムアルデヒドはＮ末端のアミノ酸残基のアミノ基ならびにアルギニン、システイン、ヒスチジン、およびリシンの側鎖と反応することができる。ホルムアルデヒドおよびグリシンはシッフ塩基付加物を形成することができ、それは第１級Ｎ末端アミノ基、アルギニン、およびチロシン残基、ならびにより低い程度でアスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、およびトリプトファン残基に付着することができる。

化学的架橋剤は、その処理された毒素が、例えばインビトロ細胞毒性アッセイにより、または動物毒性により測定した際に同一の条件下で未処理の毒素よりも低い毒性（例えば約１００％、９９％、９５％、９０％、８０％、７５％、６０％、５０％、２５％、または１０％低い毒性）を有する場合、毒素の細胞毒性を低減すると言われる。

好ましくは、その化学的架橋剤は、その変異体Ｃ．ディフィシル毒素の細胞毒性を、同一の条件下であるがその化学的架橋剤の非存在下でのその変異体毒素と比較して、少なくとも約２−ｌｏｇ_１０の低減、より好ましくは約３−ｌｏｇ_１０の低減、そして最も好ましくは約４−ｌｏｇ_１０以上低減する。野生型毒素と比較した場合、その化学的架橋剤は好ましくはその変異体毒素の細胞毒性を少なくとも約５−ｌｏｇ_１０の低減、約６−ｌｏｇ_１０の低減、約７−ｌｏｇ_１０の低減、約８−ｌｏｇ_１０の低減、またはより大きく低減する。

別の好ましい態様において、その化学的に不活性化された変異体Ｃ．ディフィシル毒素は、例えばインビトロ細胞毒性アッセイ、例えば本明細書で記述されるインビトロ細胞毒性アッセイにより測定した際に、少なくとも約５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、７００μｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌ、９００μｇ／ｍｌ、１０００μｇ／ｍｌ以上のＥＣ_５０値、またはより大きいＥＣ_５０値を示す。

その変異体毒素を化学的架橋剤と接触させるための反応条件は当業者の専門知識の範囲内であり、その条件は用いられる薬剤に応じて異なってよい。しかし、本発明者らは、驚くべきことに、変異体Ｃ．ディフィシル毒素ポリペプチドを化学的架橋剤と接触させ、一方でその変異体毒素の機能性エピトープを維持し、且つ細胞毒性を対応する野生型毒素と比較して低下させるための最適な反応条件を発見した。

好ましくは、その反応条件は変異体毒素を架橋剤と接触させるために選択され、ここでその変異体毒素は約０．５、０．７５、１．０、１．２５、１．５、１．７５、２．０ｍｇ／ｍｌの最小濃度〜約３．０、２．５、２．０、１．５、または１．２５ｍｇ／ｍｌの最大濃度を有する。あらゆる最小値をあらゆる最大値と組み合わせてその反応に関する変異体毒素の適切な濃度の範囲を定めることができる。最も好ましくは、その変異体毒素はその反応に関して約１．０〜１．２５ｍｇ／ｍｌの濃度を有する。

１態様において、その反応において用いられる薬剤は、約１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、または５０ｍＭの最小濃度および約１００ｍＭ、９０ｍＭ、８０ｍＭ、７０ｍＭ、６０ｍＭ、または５０ｍＭの最大濃度を有する。あらゆる最小値をあらゆる最大値と組み合わせてその反応に関する化学薬剤の適切な濃度の範囲を定めることができる。

その薬剤にホルムアルデヒドが含まれる好ましい態様において、用いられる濃度は好ましくは約２ｍＭ〜８０ｍＭのあらゆる濃度、最も好ましくは約４０ｍＭである。その薬剤にＥＤＣが含まれる別の好ましい態様において、用いられる濃度は好ましくは約１．３ｍＭ〜約１３ｍＭ、より好ましくは約２ｍＭ〜３ｍＭのあらゆる濃度、最も好ましくは約２．６ｍＭである。

その変異体毒素をその化学的架橋剤と接触させる典型的な反応時間には、約０．５、１、２、３、４、５、６、１２、２４、３６、４８、または６０時間の最小値、および約１４日間、１２日間、１０日間、７日間、５日間、３日間、２日間、１日間、または１２時間の最大値が含まれる。あらゆる最小値をあらゆる最大値と組み合わせて適切な反応時間の範囲を定めることができる。

好ましい態様において、その変異体毒素をその化学的架橋剤と接触させる工程は、その変異体Ｃ．ディフィシル毒素の細胞毒性を、適切なヒト細胞、例えばＩＭＲ−９０細胞において、標準的なインビトロ細胞毒性アッセイにおいて、その架橋剤の非存在下での同一の変異体毒素と比較して、少なくとも約１０００μｇ／ｍｌのＥＣ_５０値まで低減するのに十分な期間の間行われる。より好ましくは、その反応工程は、その変異体毒素の細胞毒性を適切なヒト細胞において少なくとも約１０００μｇ／ｍｌのＥＣ_５０値まで低減するのに十分な期間の少なくとも２倍の長さ、最も好ましくは少なくとも３倍以上の長さの時間の間行われる。１態様において、その反応時間は約１６８時間（または７日間）を超えない。

例えば、その薬剤にホルムアルデヒドが含まれる１態様において、その変異体毒素をその薬剤と好ましくは約１２時間接触させ、それはその変異体Ｃ．ディフィシル毒素の細胞毒性を、適切なヒト細胞、例えばＩＭＲ−９０細胞において、標準的なインビトロ細胞毒性アッセイにおいて、その架橋剤の非存在下での同一の変異体毒素と比較して、少なくとも約１０００μｇ／ｍｌのＥＣ_５０値まで低減するのに十分である典型的な期間であることが示された。より好ましい態様において、その反応は約４８時間実施され、それはその反応に関する十分な期間の少なくとも約３倍の長さである。そのような態様において、その反応時間は好ましくは約７２時間より長くない。

その薬剤にＥＤＣが含まれる別の態様において、その変異体毒素をその薬剤と好ましくは約０．５時間、より好ましくは少なくとも約１時間、または最も好ましくは約２時間接触させる。そのような態様において、その反応時間は好ましくは約６時間より長くない。

その変異体毒素をその化学的架橋剤と接触させる典型的なｐＨには、約ｐＨ５．５、６．０、６．５、７．０、または７．５の最小値、および約ｐＨ８．５、８．０、７．５、７．０、または６．５の最大値が含まれる。あらゆる最小値をあらゆる最大値と組み合わせて適切なｐＨの範囲を定めることができる。好ましくは、その反応はｐＨ６．５〜７．５で、好ましくはｐＨ７．０で行われる。

その変異体毒素をその化学的架橋剤と接触させる典型的な温度には、約２℃、４℃、１０℃、２０℃、２５℃、または３７℃の最小温度、および約４０℃、３７℃、３０℃、２７℃、２５℃、または２０℃の最大温度が含まれる。あらゆる最小値をあらゆる最大値と組み合わせて適切な反応温度を定めることができる。好ましくは、その反応は約２０℃〜３０℃で、最も好ましくは約２５℃で行われる。

上記で記述された免疫原性組成物には、１種類の変異体Ｃ．ディフィシル毒素（ＡまたはＢ）が含まれていてよい。従って、その免疫原性組成物は、製剤またはキット中で別個のバイアル（例えば変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ａが含まれる組成物に関する別個のバイアルおよび変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ｂが含まれる組成物に関する別個のバイアル）を占めることができる。その免疫原性組成物は、同時、順次、または別々の使用を意図されていてよい。

別の態様において、上記で記述される免疫原性組成物には変異体Ｃ．ディフィシル毒素（ＡおよびＢ）の両方が含まれていてよい。記述された変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ａおよび変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ｂのあらゆる組み合わせを、免疫原性組成物に関して組み合わせてよい。従って、その免疫原性組成物は、単一のバイアル（例えば変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡが含まれる組成物および変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢが含まれる組成物の両方を含有する単一のバイアル）中で組み合わせることができる。好ましくは、その免疫原性組成物には変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡおよび変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢが含まれる。

例えば、１態様において、その免疫原性組成物にはＳＥＱＩＤＮＯ：４およびＳＥＱＩＤＮＯ：６が含まれ、ここでＳＥＱＩＤＮＯ：４およびＳＥＱＩＤＮＯ：６のそれぞれの少なくとも１個のアミノ酸は化学的に架橋されている。別の態様において、その免疫原性組成物には、ＳＥＱＩＤＮＯ：４またはＳＥＱＩＤＮＯ：７が含まれる変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ａ、およびＳＥＱＩＤＮＯ：６またはＳＥＱＩＤＮＯ：８を含む変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ｂが含まれ、ここでその変異体Ｃ．ディフィシル毒素のそれぞれの少なくとも１個のアミノ酸は化学的に架橋されている。

別の態様において、その免疫原性組成物には、ＳＥＱＩＤＮＯ：４、ＳＥＱＩＤＮＯ：８４、およびＳＥＱＩＤＮＯ：８３から選択されるあらゆる配列、ならびにＳＥＱＩＤＮＯ：６、ＳＥＱＩＤＮＯ：８６、およびＳＥＱＩＤＮＯ：８５から選択されるあらゆる配列が含まれる。別の態様において、その免疫原性組成物には、ＳＥＱＩＤＮＯ：８４およびＳＥＱＩＤＮＯ：８６が含まれる免疫原性組成物が含まれる。別の態様において、その免疫原性組成物には、ＳＥＱＩＤＮＯ：８３およびＳＥＱＩＤＮＯ：８５が含まれる免疫原性組成物が含まれる。別の態様において、その免疫原性組成物には、ＳＥＱＩＤＮＯ：８４、ＳＥＱＩＤＮＯ：８３、ＳＥＱＩＤＮＯ：８６、およびＳＥＱＩＤＮＯ：８５が含まれる。

本発明の組成物、例えば変異体毒素Ａおよび／または変異体毒素Ｂが含まれる免疫原性組成物のいずれも、療法的作用に関して異なる比率または量で組み合わせることができることが理解されている。例えば、その変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡおよび変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢは、免疫原性組成物中に０．１：１０〜１０：０．１、Ａ：Ｂの範囲の比率で存在することができる。別の態様において、例えば、その変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢおよび変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡは、免疫原性組成物中に０．１：１０〜１０：０．１、Ｂ：Ａの範囲の比率で存在することができる。１つの好ましい態様において、その比率は、その組成物に変異体ＴｃｄＡの総量よりも大きな変異体ＴｃｄＢの総量が含まれるような比率である。

１側面において、免疫原性組成物は中和抗体またはその結合断片に結合することができる。好ましくは、その中和抗体またはその結合断片は本明細書において下記で記述される中和抗体またはその結合断片である。１つの典型的な態様において、免疫原性組成物は抗毒素Ａ抗体またはその結合断片に結合することができ、ここでその抗毒素Ａ抗体またはその結合断片にはＳＥＱＩＤＮＯ：３６のアミノ酸配列を有する可変軽鎖およびＳＥＱＩＤＮＯ：３７のアミノ酸配列を有する可変重鎖が含まれる。例えば、その免疫原性組成物には変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡ、ＳＥＱＩＤＮＯ：４、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７が含まれていてよい。別の例として、その免疫原性組成物にはＳＥＱＩＤＮＯ：８４またはＳＥＱＩＤＮＯ：８３が含まれていてよい。

別の典型的な態様において、免疫原性組成物は抗毒素Ｂ抗体またはその結合断片に結合することができ、ここでその抗毒素Ｂ抗体またはその結合断片にはＢ８−２６の可変軽鎖およびＢ８−２６の可変重鎖が含まれる。例えば、その免疫原性組成物には変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ、ＳＥＱＩＤＮＯ：６、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８が含まれていてよい。別の例として、その免疫原性組成物にはＳＥＱＩＤＮＯ：８６またはＳＥＱＩＤＮＯ：８５が含まれていてよい。

組み換え細胞
別の側面において、本発明は、組み換え細胞またはその子孫に関する。１態様において、その細胞またはその子孫には変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡおよび／または変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢをコードするポリヌクレオチドが含まれる。

別の態様において、その組み換え細胞またはその子孫には、例えばＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴプログラムにより初期設定のギャップウェイトを用いて最適に整列させた際に、ＳＥＱＩＤＮＯ：４、ＳＥＱＩＤＮＯ：６、ＳＥＱＩＤＮＯ：７、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８のいずれかに対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、好ましくは約９８％、より好ましくは約９９％、または最も好ましくは約１００％の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列が含まれる。

別の態様において、その組み換え細胞またはその子孫には、例えばＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴプログラムにより初期設定のギャップウェイトを用いて最適に整列させた際に、ＳＥＱＩＤＮＯ：８４、ＳＥＱＩＤＮＯ：８６、ＳＥＱＩＤＮＯ：８３、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８５のいずれかに対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、好ましくは約９８％、より好ましくは約９９％、または最も好ましくは約１００％の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列が含まれる。

追加の態様において、その組み換え細胞またはその子孫には、例えばＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴプログラムにより初期設定のギャップウェイトを用いて最適に整列させた際に、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４、ＳＥＱＩＤＮＯ：４４、ＳＥＱＩＤＮＯ：４５、ＳＥＱＩＤＮＯ：４６、またはＳＥＱＩＤＮＯ：４７のいずれかに対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、好ましくは約９８％、より好ましくは約９９％、または最も好ましくは約１００％の同一性を有する核酸配列が含まれる。

その組み換え細胞は、本発明のポリペプチドの組み換え生成において有用なあらゆる細胞、例えば原核細胞または真核細胞に由来してよい。好ましくは、その組み換え細胞は、約５０００、６０００、好ましくは約７０００、そしてより好ましくは約８０００ヌクレオチド以上より大きい異種核酸配列を発現するのに適したあらゆる細胞に由来する。その原核宿主細胞は、あらゆるグラム陰性またはグラム陽性細菌であってよい。典型的な態様において、その原核宿主細胞は毒素および／または芽胞をコードする内在性ポリヌクレオチドを欠いている。

グラム陰性細菌には、カンピロバクター、大腸菌、フラボバクテリウム、フゾバクテリウム、ヘリコバクター、イリオバクター（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、シュードモナス、サルモネラ、およびウレアプラズマ（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）が含まれるが、それらに限定されない。例えば、その組み換え細胞は、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１００１３７６２号、段落［０２０１］〜［０２３０］において記述されているようなシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）細胞に由来してよい。

グラム陽性細菌には、バシラス、クロストリジウム、エンテロコッカス、ゲオバシラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、オセアノバシラス（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフィロコッカス、ストレプトコッカス、およびストレプトマイセスが含まれるが、それらに限定されない。好ましくは、その細胞はＣ．ディフィシル細胞に由来する。

本発明者らは、Ｃ．ディフィシル毒素をコードする内在性のポリヌクレオチドを欠いている野生型Ｃ．ディフィシルの株を同定した。その内在性の毒素Ａおよび毒素Ｂ遺伝子を欠いている株には以下の株が含まれ、それはアメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）（バージニア州マナサス）を通して入手可能である：Ｃ．ディフィシル１３５１（ＡＴＣＣ４３５９３（商標））、Ｃ．ディフィシル３２３２（ＡＴＣＣＢＡＡ−１８０１（商標））、Ｃ．ディフィシル７３２２（ＡＴＣＣ４３６０１（商標））、Ｃ．ディフィシル５０３６（ＡＴＣＣ４３６０３（商標））、Ｃ．ディフィシル４８１１（ＡＴＣＣ４３６０２（商標））、およびＣ．ディフィシルＶＰＩ１１１８６（ＡＴＣＣ７０００５７（商標））。

従って、１態様において、その組み換えＣ．ディフィシル細胞は本明細書で記述される株に由来する。好ましくは、その組み換えＣ．ディフィシル細胞またはその子孫は、Ｃ．ディフィシル１３５１、Ｃ．ディフィシル５０３６、およびＣ．ディフィシルＶＰＩ１１１８６からなる群に由来する。より好ましくは、その組み換えＣ．ディフィシル細胞またはその子孫は、Ｃ．ディフィシルＶＰＩ１１１８６細胞に由来する。

好ましい態様において、その組み換えＣ．ディフィシル細胞またはその子孫の芽胞形成遺伝子は不活性化されている。芽胞は感染性、高度に耐性である可能性があり、Ｃ．ディフィシルのその宿主の外部の好気性環境における存続を促進する可能性がある。芽胞は抗微生物療法の間のＣ．ディフィシルの宿主内部での生存にも寄与する可能性がある。従って、芽胞形成遺伝子を欠くＣ．ディフィシル細胞は、哺乳類への投与のための安全な免疫原性組成物を生産するために有用である。加えて、そのような細胞の使用は、製造の間の安全性、例えばその施設、将来の製品、およびスタッフを保護するための安全性を促進する。

標的化された不活性化のための芽胞形成遺伝子の例には、ｉｎｔｅｒａｌｉａ、ｓｐｏ０Ａ、ｓｐｏＩＩＥ、σ^Ｅ、σ^Ｇ、およびσ^Ｋが含まれる。好ましくは、ｓｐｏ０Ａ遺伝子が不活性化される。

Ｃ．ディフィシルの芽胞形成遺伝子を不活性化する方法は、当該技術で既知である。例えば、芽胞形成遺伝子は、選択可能なマーカー、例えば抗生物質耐性マーカーの標的化された挿入により不活性化することができる。例えば、Heap et al., J Microbiol Methods. 2010 Jan;80(1):49-55; Heap et al., J. Microbiol. Methods, 2007 Sept; 70(3):452-464;およびUnderwood et al., J Bacteriol. 2009 Dec;191(23):7296-305を参照。例えば、参照により３３〜６６ページから本明細書にそのまま援用される、“DNA Molecules and Methods”と題されたMintonらの国際公開第２００７／１４８０９１号、または対応する米国公開ＵＳ２０１１０１２４１０９Ａ１、段落［００１３７］〜［０２２７］も参照。

変異体Ｃ．ディフィシル毒素を生成する方法
１側面において、本発明は、変異体Ｃ．ディフィシル毒素を生成する方法に関する。１態様において、その方法には上記で記述されたいずれかの組み換え細胞またはその子孫をポリペプチドを発現するための適切な条件下で培養することが含まれる。

別の態様において、その方法には組み換え細胞またはその子孫を変異体Ｃ．ディフィシル毒素をコードするポリヌクレオチドを発現するための適切な条件下で培養することが含まれ、ここでその細胞には変異体Ｃ．ディフィシル毒素をコードするポリヌクレオチドが含まれ、ここでその変異体には対応する野生型クロストリジウム・ディフィシル毒素と比較して少なくとも１個の変異を有するグルコシルトランスフェラーゼドメインおよび少なくとも１個の変異を有するシステインプロテアーゼドメインが含まれる。１態様において、その細胞は毒素をコードする内在性ポリヌクレオチドを欠いている。

さらなる態様において、その方法には組み換えＣ．ディフィシル細胞またはその子孫を変異体Ｃ．ディフィシル毒素をコードするポリヌクレオチドを発現するための適切な条件下で培養することが含まれ、ここでその細胞には変異体Ｃ．ディフィシル毒素をコードするポリヌクレオチドが含まれ、且つその細胞はＣ．ディフィシル毒素をコードする内在性ポリヌクレオチドを欠いている。

別の側面において、本発明は、変異体Ｃ．ディフィシル毒素を生成する方法に関する。その方法には以下の工程が含まれる：（ａ）Ｃ．ディフィシル細胞を組み換え大腸菌細胞と接触させ、ここでそのＣ．ディフィシル細胞はＣ．ディフィシル毒素をコードする内在性ポリヌクレオチドを欠いており、その大腸菌細胞には変異体Ｃ．ディフィシル毒素をコードするポリヌクレオチドが含まれ；（ｂ）そのＣ．ディフィシル細胞および大腸菌細胞を、そのポリヌクレオチドを大腸菌細胞からＣ．ディフィシル細胞に移すための適切な条件下で培養し；（ｃ）その変異体Ｃ．ディフィシル毒素をコードするポリヌクレオチドを含むＣ．ディフィシル細胞を選択し；（ｄ）工程（ｃ）のＣ．ディフィシル細胞をそのポリヌクレオチドを発現するための適切な条件下で培養し；そして（ｅ）その変異体Ｃ．ディフィシル毒素を単離する。

本発明の方法において、その組み換え大腸菌細胞には本明細書で記述される変異体Ｃ．ディフィシル毒素をコードする異種ポリヌクレオチドが含まれる。そのポリヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡであってよい。１つの典型的な態様において、その変異体Ｃ．ディフィシル毒素をコードするポリヌクレオチドは、大腸菌のコドン使用頻度に関してコドン最適化されている。ポリヌクレオチドをコドン最適化するための方法は当該技術において既知である。

１態様において、そのポリヌクレオチドには上記で記述したような変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡをコードするポリヌクレオチドに少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である核酸配列が含まれる。変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ａをコードする典型的なポリヌクレオチドには、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２、ＳＥＱＩＤＮＯ：４４、およびＳＥＱＩＤＮＯ：４５が含まれる。

別の態様において、そのポリヌクレオチドには上記で記述したような変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢをコードするポリヌクレオチドに少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である核酸配列が含まれる。変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ｂをコードする典型的なポリヌクレオチドには、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４、ＳＥＱＩＤＮＯ：４６、およびＳＥＱＩＤＮＯ：４７が含まれる。別の態様において、そのポリヌクレオチドはＳＥＱＩＤＮＯ：８３、ＳＥＱＩＤＮＯ：８４、ＳＥＱＩＤＮＯ：８５、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８６をコードしている。

１態様において、その異種ポリヌクレオチドが含まれる大腸菌細胞はその変異体Ｃ．ディフィシル毒素をコードする異種ポリヌクレオチドの安定な宿主となる（ｓｔａｂｌｙｈｏｓｔｓ）大腸菌細胞である。典型的な大腸菌細胞には、ＭＡＸＥｆｆｉｃｉｅｎｃｙ（登録商標）Ｓｔｂｌ２（商標）大腸菌コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）、ＯｎｅＳｈｏｔ（登録商標）Ｓｔｂｌ３（商標）化学的コンピテント大腸菌（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）、ＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ（商標）Ｓｔｂｌ４（商標）大腸菌コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および大腸菌ＣＡ４３４からなる群から選択される細胞が含まれる。好ましい態様において、その大腸菌クローニング宿主細胞はＤＨ５αではない。より好ましくは、その大腸菌クローニング宿主細胞はＭＡＸＥｆｆｉｃｉｅｎｃｙ（登録商標）Ｓｔｂｌ２（商標）大腸菌コンピテント細胞である。

本発明の方法にはさらに、Ｃ．ディフィシル細胞および大腸菌細胞をそのポリヌクレオチドを大腸菌細胞からＣ．ディフィシル細胞に移すための適切な条件下で培養し、結果として組み換えＣ．ディフィシル細胞をもたらす工程が含まれる。好ましい態様において、その培養条件は、そのポリヌクレオチドをその大腸菌細胞（供与細胞）からＣ．ディフィシル細胞（受容細胞）中に移し、結果として遺伝的に安定な継承（ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ）をもたらすのに適している。

最も好ましくは、その培養条件は当該技術で既知である細菌の接合に適している。“接合”は、ポリヌクレオチドの（例えば細菌プラスミドからの）一方向性の移動が１つの細菌細胞（すなわち“供与者”）から別の細菌細胞（すなわち“受容者”）に対して起こる、ポリヌクレオチドの移動の特定のプロセスを指す。接合プロセスには供与細胞の受容細胞に対する接触が含まれる。好ましくは、供与大腸菌細胞は大腸菌ＣＡ４３４細胞である。

大腸菌細胞からＣ．ディフィシル細胞へのポリヌクレオチドの移動のための典型的な適切な（接合）条件には、Ｃ．ディフィシルのブレインハートインフュージョンブロス（ＢＨＩ；Ｏｘｏｉｄ）またはシェドラー嫌気ブロス（Ｓｃｈａｅｄｌｅｒｓａｎａｅｒｏｂｉｃｂｒｏｔｈ）（ＳＡＢ；Ｏｘｏｉｄ）中での増殖液体培養が含まれる。別の態様において、固体Ｃ．ディフィシル培養物を新鮮な血液寒天（ＦＢＡ）またはＢＨＩ寒天上で増殖させることができる。好ましくは、Ｃ．ディフィシルを嫌気性環境（例えば、８０％Ｎ_２、１０％ＣＯ_２、および１０％Ｈ_２[体積／体積]）中で３７℃で増殖させる。１態様において、その適切な条件には、大腸菌をルリア−ベルターニ（ＬＢ）ブロス上で、またはＬＢ寒天上で３７℃で好気的に増殖させることが含まれる。Ｃ．ディフィシルへの接合性移動に関して、典型的な適切な条件には、大腸菌をＦＢＡ上で嫌気的に増殖させることが含まれる。抗生物質が当該技術で既知であるように液体および固体培地中に含まれていてよい。そのような抗生物質の例には、サイクロセリン（２５０μｇ／ｍｌ）、セフォキシチン（８μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（１２．５μｇ／ｍｌ）、チアンフェニコール（１５μｇ／ｍｌ）、およびエリスロマイシン（５μｇ／ｍｌ）が含まれる。

本発明の方法にはさらに、結果として得られた変異体Ｃ．ディフィシル毒素をコードするポリヌクレオチドが含まれる組み換えＣ．ディフィシル細胞を選択する工程が含まれる。典型的な態様において、その組み換えＣ．ディフィシル細胞は、その変異体Ｃ．ディフィシル毒素をコードするポリヌクレオチドの組み換え大腸菌細胞からの接合を介した受容者である。

本発明の方法には、その組み換え細胞またはその子孫を、その変異体Ｃ．ディフィシル毒素をコードするポリヌクレオチドを発現し、結果として変異体Ｃ．ディフィシル毒素の産生をもたらすための適切な条件下で培養する工程が含まれる。組み換え細胞がそのポリヌクレオチドを発現するための適切な条件には、Ｃ．ディフィシル細胞を増殖させるのに適した培養条件が含まれ、それは当該技術で既知である。例えば、適切な条件には、そのＣ．ディフィシル形質転換体をブレインハートインフュージョンブロス（ＢＨＩ；Ｏｘｏｉｄ）またはシェドラー嫌気ブロス（ＳＡＢ；Ｏｘｏｉｄ）中で培養することが含まれてよい。別の態様において、固体Ｃ．ディフィシル培養物をＦＢＡまたはＢＨＩ寒天上で増殖させることができる。好ましくは、そのＣ．ディフィシルを嫌気性環境（例えば、８０％Ｎ_２、１０％ＣＯ_２、および１０％Ｈ_２[体積／体積]）中で３７℃で増殖させる。

１態様において、本発明の方法には、結果として生じる変異体Ｃ．ディフィシル毒素を単離する工程が含まれる。タンパク質をＣ．ディフィシルから単離する方法は、当該技術で既知である。

別の態様において、その方法には、結果として生じる変異体Ｃ．ディフィシル毒素を精製する工程が含まれる。ポリペプチドを精製する方法、例えばクロマトグラフィーは、当該技術で既知である。

典型的な態様において、その方法にはさらにその単離された変異体クロストリジウム・ディフィシル毒素を上記で記述した化学的架橋剤と接触させる工程が含まれる。好ましくは、その薬剤にはホルムアルデヒド、エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、またはＥＤＣおよびＮＨＳの組み合わせが含まれる。典型的な反応条件は、上記で、および下記の実施例の節で記述されている。

別の側面において、本発明は、あらゆる方法により、好ましくは上記で記述される方法のいずれかにより生成された、本明細書で記述される変異体Ｃ．ディフィシル毒素が含まれる免疫原性組成物に関する。

抗体
驚くべきことに、上記で記述された本発明の免疫原性組成物はインビボで新規の抗体を引き出し、これはその免疫原性組成物にはそれぞれの野生型Ｃ．ディフィシル毒素の保存された天然の構造（例えば保存された抗原エピトープ）が含まれることおよびその免疫原性組成物にはエピトープが含まれることを示唆している。Ｃ．ディフィシルの１つの株からの毒素に対して産生された抗体は、Ｃ．ディフィシルの別の株により産生された対応する毒素に結合することができる可能性がある。すなわち、その抗体およびその結合断片は“交差反応性”である可能性があり、それは多数のＣ．ディフィシル株から産生された毒素上の類似の抗原部位と反応する能力を指す。交差反応性には、抗体の、その産生を刺激しなかった抗原と反応または結合する能力、すなわち、抗原および異なるが類似の抗原に対して生成された抗体の間の反応も含まれる。

１側面において、本発明者らは、驚くべきことに、複数のＣ．ディフィシル毒素に対して中和作用を有するモノクローナル抗体およびその同じものを生成する方法を発見した。本発明の抗体は、インビトロでＣ．ディフィシル毒素の細胞毒性を中和することができ、哺乳類細胞へのＣ．ディフィシル毒素の結合を阻害することができ、および／またはインビボでＣ．ディフィシル毒素の腸管毒性を中和することができる。本発明は、前記のもののいずれかをコードする核酸配列が含まれる単離されたポリペプチドにも関する。加えて、本発明は、その組成物を投与されなかった哺乳類と比較して、哺乳類においてＣ．ディフィシル感染症、Ｃ．ディフィシル関連疾患、症候群、病気、症状、および／またはそれらの合併症を処置する、予防する、それらの危険性を低下させる、それらの重症度を低下させる、それらの発生率を低下させる、および／またはそれらの発症を遅らせるための前記の組成物のいずれかの使用、ならびに前記の組成物を調製するための方法に関する。

本発明者らはさらに、その中和モノクローナル抗体の少なくとも２種類の組み合わせはＴｃｄＡまたはＴｃｄＢのそれぞれの中和において意外にも相乗作用を示すことができることを発見した。抗毒素抗体またはその結合断片は、Ｃ．ディフィシル感染症の抑制において有用であり得る。

“抗体”は、少なくとも１または２個の重（Ｈ）鎖可変領域（本明細書においてＶＨと略される）、および少なくとも１または２個の軽（Ｌ）鎖可変領域（本明細書においてＶＬと略される）が含まれるタンパク質である。そのＶＨおよびＶＬ領域は、さらに“相補性決定領域”（“ＣＤＲ”）と呼ばれる超可変性の領域へと細分することができ、“フレームワーク領域”（ＦＲ）と呼ばれるより保存されている領域がその間に挟まっている。フレームワーク領域およびＣＤＲの範囲は正確に定義されている（Kabat, E. A., et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest , 第５版, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 1991、およびChothia, C. et al., J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987を参照）。用語“抗体”にはＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ型（ならびにその亜型）の完全な免疫グロブリンが含まれ、ここでその免疫グロブリンの軽鎖はカッパまたはラムダ型であってよい。

その抗体分子は完全長（例えばＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体）であることができる。その抗体は、以下のアイソタイプ：ＩｇＧ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、またはＩｇＥが含まれる様々なアイソタイプの抗体であることができる。１つの好ましい態様において、その抗体はＩｇＧアイソタイプ、例えばＩｇＧ１である。別の好ましい態様において、その抗体はＩｇＥ抗体である。

別の態様において、その抗体分子には“抗原結合断片”または“結合断片”が含まれ、本明細書で用いられる際、それはＣ．ディフィシルの毒素（例えば毒素Ａ）に特異的に結合する抗体の部分を指す。その結合断片は、例えば、１個以上の免疫グロブリン鎖が完全長ではないが毒素に特異的に結合する分子である。

抗体の“結合断片”という用語の範囲内に含まれる結合部分の例には、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価の断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域においてジスルフィド結合により連結された２個のＦａｂ断片を含む二価の断片であるＦ（ａｂ’）_２断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一の腕のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ward et al., Nature 341:544-546, 1989）；ならびに（ｖｉ）特異的に結合するために十分な枠組みを有する単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、例えば可変領域の抗原結合部分が含まれる。

軽鎖可変領域の結合断片および重鎖可変領域の結合断片、例えばＦｖ断片の２個のドメインであるＶＬおよびＶＨは、組み換え的方法を用いて、それらが単一のタンパク質鎖として作られることを可能にする合成リンカーにより連結することができ、ここでそのＶＬおよびＶＨ領域は対になって一価の分子を形成する（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えばBird et al. (1988) Science 242:423-426;およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照）。そのような単鎖抗体も、抗体の“結合断片”という用語の範囲内に含まれる。これらの抗体部分は当該技術で既知の技法を用いて得られ、その部分は完全な抗体と同じ方法で有用性に関してスクリーニングされる。

本明細書で用いられる際、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド上のエピトープに“特異的に結合する”、またはそれに“特異的である”抗体は、その特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド上のエピトープに、いずれの他のポリペプチドまたはポリペプチドエピトープにも実質的に結合することなく結合する抗体である。例えば、標的に“特異的に結合する”生体分子（例えばタンパク質、核酸、抗体等）に言及する際、その生体分子は、指定された条件（例えば抗体の場合は免疫アッセイ条件）下で測定した際に、その標的が含まれる不均質な分子の集団中でその標的分子に結合し、且つ他の分子には有意な量では結合しない。その抗体およびその標的の間の結合反応は、不均質な分子の集団中のその標的の存在の決定的なものである。例えば、“特異的結合”または“特異的に結合する”は、Ｃ．ディフィシルの野生型および／または変異体毒素に対して非特異的抗原に関するその親和性よりも少なくとも２倍大きい親和性で結合する抗体またはその結合断片の能力を指す。

典型的な態様において、その抗体はキメラ抗体である。キメラ抗体は、当該技術で既知の組み換えＤＮＡ技法により生成することができる。例えば、マウス（または他の種の）モノクローナル抗体分子のＦｃ定常領域をコードする遺伝子を制限酵素で消化してそのマウスのＦｃをコードする領域を除去し、ヒトのＦｃ定常領域をコードする遺伝子の均等な部分で置き換えることができる。キメラ抗体は組み換えＤＮＡ技法により作成することもでき、ここでマウスの可変領域をコードするＤＮＡをヒトの定常領域をコードするＤＮＡにライゲーションすることができる。

別の典型的な態様において、その抗体またはその結合断片は、当該技術で既知の方法によりヒト化される。例えば、一度マウスの抗体を得たら、その抗体のＣＤＲをヒトのＣＤＲの少なくとも一部で置き換えることができる。ヒト化抗体は、抗原結合に直接関わっていないマウスのＦｖ可変領域の配列をヒトのＦｖ可変領域からの均等な配列で置き換えることにより生成することもできる。ヒト化抗体を生成するための一般的な方法は当該技術で既知である。

例えば、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡまたはＣ．ディフィシルＴｃｄＢに対して向けられたモノクローナル抗体は、標準的な技法、例えばハイブリドーマ技法により生成することもできる（例えばKohler and Milstein, 1975, Nature, 256: 495-497を参照）。簡潔には、不死の細胞株をＣ．ディフィシルＴｃｄＡ、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ、または本明細書で記述される変異体Ｃ．ディフィシル毒素で免疫した哺乳類からのリンパ球と融合させ、結果として得られたハイブリドーマ細胞の培養上清をスクリーニングして、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡまたはＣ．ディフィシルＴｃｄＢに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定する。典型的には、その不死の細胞株は、そのリンパ球と同じ哺乳類種に由来する。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、そのハイブリドーマの培養上清をＥＬＩＳＡのようなアッセイを用いてＣ．ディフィシルＴｃｄＡまたはＣ．ディフィシルＴｃｄＢに結合する抗体に関してスクリーニングするこにより検出される。ヒトのハイブリドーマを類似の方法で調製することができる。

免疫処置および選択による抗体の生成に対する代替手段として、本発明の抗体は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡ、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢ、または本明細書で記述される変異体Ｃ．ディフィシル毒素を用いて組み換え組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ）免疫グロブリンライブラリーをスクリーニングすることにより同定することもできる。その組み換え抗体ライブラリーは、例えばｓｃＦｖライブラリーまたはＦａｂライブラリーであってよい。さらに、本明細書で記述される本発明の抗体を競合結合試験において用いて追加の抗ＴｃｄＡまたは抗ＴｃｄＢ抗体およびその結合断片を同定することができる。例えば、追加の抗ＴｃｄＡまたは抗ＴｃｄＢ抗体およびその結合断片は、ヒト抗体ライブラリーをスクリーニングして競合結合アッセイにおいて本明細書で記述される本発明の抗体と競合するそのライブラリー内の分子を同定することにより同定することができる。

加えて、本発明に含まれる抗体には、当該技術で既知のファージディスプレイ法を用いることにより生成することができる組み換え抗体が含まれる。ファージディスプレイ法では、ファージを用いてレパートリーまたは抗体ライブラリー（例えばヒトまたはマウス）から発現される抗原結合ドメインを提示することができる。本明細書で記述される免疫原（例えば変異体Ｃ．ディフィシル毒素）に結合する抗原結合ドメインを発現するファージを、例えば標識された抗原を用いて選択または同定することができる。

特定のアミノ酸が置換されている、欠失している、または付加されている抗体およびその結合断片も、本発明の範囲内である。特に、好ましい抗体はフレームワーク領域中に、例えば抗原への結合を向上させるようなアミノ酸置換を有する。例えば、その免疫グロブリン鎖の選択された少数の受容者のフレームワーク残基を対応する供与者のアミノ酸で置き換えることができる。その置換の好ましい位置には、ＣＤＲに隣接する、またはＣＤＲと相互作用することができるアミノ酸残基が含まれる。供与者からのアミノ酸の選択に関する基準が米国特許第５，５８５，０８９号（例えば段１２〜１６）において記述されている。その受容者のフレームワークは、成熟したヒト抗体のフレームワーク配列またはコンセンサス配列であることができる。

本明細書で用いられる際、“中和抗体またはその結合断片”は、哺乳類において、および／または細胞培養において、病原体（例えばＣ．ディフィシルＴｃｄＡまたはＴｃｄＢ）に結合してその病原体の感染性および／または活性をその中和抗体またはその結合断片の非存在下での同一の条件下でのその病原体と比較して低減する（例えば細胞毒性を低減する）それぞれの抗体またはその結合断片を指す。１態様において、その中和抗体またはその結合断片は、その中和抗体またはその結合断片の非存在下での同一の条件下でのその病原体の生物学的活性と比較して、その病原体の生物学的活性の少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはより多くを中和することができる。

本明細書で用いられる際、用語“抗毒素抗体またはその結合断片”は、それぞれのＣ．ディフィシル毒素（例えばＣ．ディフィシル毒素Ａまたは毒素Ｂ）に結合する抗体またはその結合断片を指す。例えば、抗毒素Ａ抗体またはその結合断片は、ＴｃｄＡに結合する抗体またはその結合断片を指す。

本明細書で記述される抗体またはその結合断片は、例えばマウス、ヒト、ウサギ、およびヤギが含まれる、野生型および／またはトランスジェニックのあらゆる動物において産生させることができる。

上記で記述される免疫原性組成物が、以前に例えばワクチン接種のために集団に投与されている免疫原性組成物である場合、その対象において生じた抗体応答を、同じ株からの、およびその抗体の産生を刺激しなかった株からの毒素を中和するために用いることができる。例えば、免疫原性組成物により生成される６３０株および様々な野生型Ｃ．ディフィシル株からの毒素の間の交差反応性に関する試験を示す実施例３７を参照。

１側面において、本発明は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡに特異的な抗体またはその結合断片に関する。ＴｃｄＡに特異的に結合するモノクローナル抗体には、Ａ６５−３３；Ａ６０−２２；Ａ８０−２９および／または、好ましくはＡ３−２５が含まれる。

１側面において、本発明は、あらゆる野生型Ｃ．ディフィシル株、例えば上記で記述された野生型Ｃ．ディフィシル株からのＴｃｄＡに、例えばＳＥＱＩＤＮＯ：１に特異的な抗体またはその結合断片に関する。別の側面において、本発明は、上記で記述された免疫原性組成物に特異的な抗体またはその結合断片に関する。例えば、１態様において、その抗体またはその結合断片は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４またはＳＥＱＩＤＮＯ：７が含まれる免疫原性組成物に特異的である。別の態様において、その抗体またはその結合断片はＳＥＱＩＤＮＯ：４またはＳＥＱＩＤＮＯ：７が含まれる免疫原性組成物に特異的であり、ここでＳＥＱＩＤＮＯ：４またはＳＥＱＩＤＮＯ：７の少なくとも１個のアミノ酸はホルムアルデヒド、ＥＤＣ、ＮＨＳ、またはＥＤＣおよびＮＨＳの組み合わせにより架橋されている。別の態様において、その抗体またはその結合断片は、ＳＥＱＩＤＮＯ：８４またはＳＥＱＩＤＮＯ：８３が含まれる免疫原性組成物に特異的である。

Ａ６５−３３；Ａ６０−２２；Ａ８０−２９および／または、好ましくはＡ３−２５の可変重鎖および軽鎖領域に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、好ましくは約９８％、より好ましくは約９９％、または最も好ましくは約１００％同一である可変重鎖および可変軽鎖領域を有する抗体またはその結合断片も、ＴｃｄＡに結合することができる。

１態様において、その抗体またはその抗原結合断片には、ＳＥＱＩＤＮＯ：３７で示されるようなＡ３−２５の可変重鎖領域のアミノ酸配列に対して少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列が含まれる可変重鎖領域が含まれる。

別の態様において、その抗体またはその抗原結合断片には、ＳＥＱＩＤＮＯ：３６で示されるようなＡ３−２５の可変軽鎖領域のアミノ酸配列に対して少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列が含まれる可変軽鎖領域が含まれる。

さらに別の側面において、その抗体またはその抗原結合断片には、ＳＥＱＩＤＮＯ：３７で示される可変重鎖領域のアミノ酸配列に対して少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列が含まれる可変重鎖領域、およびＳＥＱＩＤＮＯ：３６で示される可変軽鎖領域のアミノ酸配列に対して少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列が含まれる可変軽鎖領域が含まれる。

別の態様において、Ａ６５−３３；Ａ６０−２２；Ａ８０−２９および／または、好ましくはＡ３−２５の可変重鎖および／または可変軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する抗体またはその結合断片は、ＴｃｄＡにも結合することができる。Ａ３−２５の可変重鎖領域のＣＤＲを下記の表４において示す。

Ａ３−２５の可変軽鎖領域のＣＤＲを下記の表５において示す。

１態様において、その抗体またはその結合断片には、ＳＥＱＩＤＮＯ：４１（ＣＤＲＨ１）、４２（ＣＤＲＨ２）および４３（ＣＤＲＨ３）で示されるような重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列、および／またはＳＥＱＩＤＮＯ：３８（ＣＤＲＬ１）、３９（ＣＤＲＬ２）および４０（ＣＤＲＬ３）で示されるような軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列が含まれる。

１つの典型的な態様において、Ｃ．ディフィシル毒素Ａに特異的な抗体またはその結合断片は、ＴｃｄＡのＮ末端領域内のエピトープ、例えばＳＥＱＩＤＮＯ：１の番号付けに従うＴｃｄＡのアミノ酸１〜１２５６のエピトープに特異的に結合する。

好ましい態様において、Ｃ．ディフィシル毒素Ａに特異的な抗体またはその結合断片は、毒素ＡのＣ末端領域内のエピトープ、例えばＳＥＱＩＤＮＯ：１の番号付けに従うＴｃｄＡのアミノ酸１８３２〜２７１０のエピトープに特異的に結合する。例にはＡ３−２５；Ａ６５−３３；Ａ６０−２２；Ａ８０−２９が含まれる。

さらに別の態様において、Ｃ．ディフィシル毒素Ａに特異的な抗体またはその結合断片はＣ．ディフィシル毒素Ａの“移行”領域内のエピトープ、例えば好ましくはＳＥＱＩＤＮＯ：１の番号付けに従うＴｃｄＡの残基９５６〜１１２８が含まれるエピトープ、例えばＳＥＱＩＤＮＯ：１の番号付けに従うＴｃｄＡのアミノ酸６５９〜１８３２のエピトープに特異的に結合する。

別の側面において、本発明は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢに特異的な抗体またはその結合断片に関する。例えば、その抗体またはその結合断片は、あらゆる野生型Ｃ．ディフィシル株、例えば上記で記述された野生型Ｃ．ディフィシル株からのＴｃｄＢに、例えばＳＥＱＩＤＮＯ：２に特異的であってよい。別の側面において、本発明は、上記で記述された免疫原性組成物に特異的な抗体またはその結合断片に関する。例えば、１態様において、その抗体またはその結合断片は、ＳＥＱＩＤＮＯ：６またはＳＥＱＩＤＮＯ：８が含まれる免疫原性組成物に特異的である。

別の態様において、その抗体またはその結合断片はＳＥＱＩＤＮＯ：６またはＳＥＱＩＤＮＯ：８が含まれる免疫原性組成物に特異的であり、ここでＳＥＱＩＤＮＯ：６またはＳＥＱＩＤＮＯ：８の少なくとも１個のアミノ酸はホルムアルデヒド、ＥＤＣ、ＮＨＳ、またはＥＤＣおよびＮＨＳの組み合わせにより架橋されている。別の態様において、その抗体またはその結合断片は、ＳＥＱＩＤＮＯ：８６またはＳＥＱＩＤＮＯ：８５が含まれる免疫原性組成物に特異的である。

ＴｃｄＢに特異的に結合するモノクローナル抗体には、本明細書で記述されるＢ２−３１；Ｂ５−４０、Ｂ７０−２；Ｂ６−３０；Ｂ９−３０；Ｂ５９−３；Ｂ６０−２；Ｂ５６−６；および／または、好ましくはＢ８−２６クローンにより産生される抗体が含まれる。

ＴｃｄＢにも結合することができる抗体またはその結合断片には、Ｂ２−３１；Ｂ５−４０、Ｂ７０−２；Ｂ６−３０；Ｂ９−３０；Ｂ５９−３；Ｂ６０−２；Ｂ５６−６、好ましくはＢ８−２６、Ｂ５９−３、および／またはＢ９−３０の可変重および軽鎖領域に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、好ましくは約９８％、より好ましくは約９９％、または最も好ましくは約１００％同一である可変重鎖および可変軽鎖領域を有する抗体またはその結合断片が含まれる。

１態様において、その抗体またはその抗原結合断片には、ＳＥＱＩＤＮＯ：４９で示されるようなＡ３−２５の可変重鎖領域のアミノ酸配列に対して少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列が含まれる可変重鎖領域が含まれる。

１態様において、その抗体またはその抗原結合断片には、ＳＥＱＩＤＮＯ：６０で示されるようなＡ３−２５の可変重鎖領域のアミノ酸配列に対して少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列が含まれる可変重鎖領域が含まれる。

１態様において、その抗体またはその抗原結合断片には、ＳＥＱＩＤＮＯ：７１で示されるようなＡ３−２５の可変重鎖領域のアミノ酸配列に対して少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列が含まれる可変重鎖領域が含まれる。

別の態様において、その抗体またはその抗原結合断片には、ＳＥＱＩＤＮＯ：５５で示されるようなＡ３−２５の可変軽鎖領域のアミノ酸配列に対して少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列が含まれる可変軽鎖領域が含まれる。

別の態様において、その抗体またはその抗原結合断片には、ＳＥＱＩＤＮＯ：６６で示されるようなＡ３−２５の可変軽鎖領域のアミノ酸配列に対して少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列が含まれる可変軽鎖領域が含まれる。

別の態様において、その抗体またはその抗原結合断片には、ＳＥＱＩＤＮＯ：７７で示されるようなＡ３−２５の可変軽鎖領域のアミノ酸配列に対して少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列が含まれる可変軽鎖領域が含まれる。

Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢの中和抗体（Ｂ８−２６ｍＡｂ）の可変重鎖に関するアミノ酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ：４９において示されている。表２５−ａ参照。

Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢの中和抗体（Ｂ８−２６ｍＡｂ）の可変軽鎖に関するアミノ酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ：５５において示されている。表２５−ｂ参照。

１態様において、その抗体またはその結合断片には、ＳＥＱＩＤＮＯ：５１（ＣＤＲＨ１）、５２（ＣＤＲＨ２）および５３（ＣＤＲＨ３）において示されるような重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列および／またはＳＥＱＩＤＮＯ：５７（ＣＤＲＬ１）、５８（ＣＤＲＬ２）および５９（ＣＤＲＬ３）において示されるような軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列が含まれる。

Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢの中和抗体（Ｂ５９−３ｍＡｂ）の可変重鎖に関するアミノ酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ：６０において示されている。表２６−ａ参照。

Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢの中和抗体（Ｂ５９−３ｍＡｂ）の可変軽鎖に関するアミノ酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ：６６において示されている。表２６−ｂ参照。

１態様において、その抗体またはその結合断片には、ＳＥＱＩＤＮＯ：６２（ＣＤＲＨ１）、６３（ＣＤＲＨ２）および６４（ＣＤＲＨ３）において示されるような重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列および／またはＳＥＱＩＤＮＯ：６８（ＣＤＲＬ１）、６９（ＣＤＲＬ２）および７０（ＣＤＲＬ３）において示されるような軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列が含まれる。

Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢの中和抗体（Ｂ９−３０ｍＡｂ）の可変重鎖に関するアミノ酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ：７１において示されている。表２７−ａ参照。

Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢの中和抗体（Ｂ９−３０ｍＡｂ）の可変軽鎖に関するアミノ酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ：７７において示されている。表２７−ｂ参照。

１態様において、その抗体またはその結合断片には、ＳＥＱＩＤＮＯ：７３（ＣＤＲＨ１）、７４（ＣＤＲＨ２）および７５（ＣＤＲＨ３）において示されるような重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列および／またはＳＥＱＩＤＮＯ：７９（ＣＤＲＬ１）、８０（ＣＤＲＬ２）および８１（ＣＤＲＬ３）において示されるような軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列が含まれる。

１側面において、本発明は、あらゆるＣ．ディフィシル株、例えば上記で記述されたＣ．ディフィシル株からの野生型Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢに、例えばＳＥＱＩＤＮＯ：２に特異的な抗体またはその結合断片に関する。別の側面において、本発明は、上記で記述された免疫原性組成物に特異的な抗体またはその結合断片に関する。例えば、１態様において、その抗体またはその結合断片は、ＳＥＱＩＤＮＯ：６またはＳＥＱＩＤＮＯ：８が含まれる免疫原性組成物に特異的である。別の態様において、その抗体またはその結合断片はＳＥＱＩＤＮＯ：６またはＳＥＱＩＤＮＯ：８が含まれる免疫原性組成物に特異的であり、ここでＳＥＱＩＤＮＯ：６またはＳＥＱＩＤＮＯ：８の少なくとも１個のアミノ酸はホルムアルデヒド、ＥＤＣ、ＮＨＳ、またはＥＤＣおよびＮＨＳの組み合わせにより架橋されている。

Ｂ２−３１；Ｂ５−４０、Ｂ７０−２；Ｂ６−３０；Ｂ９−３０；Ｂ５９−３；Ｂ６０−２；Ｂ５６−６；および／または、好ましくはＢ８−２６の可変重および軽鎖領域に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、好ましくは約９８％、より好ましくは約９９％、または最も好ましくは約１００％同一である可変重鎖および可変軽鎖領域を有する抗体またはその結合断片も、ＴｃｄＢに結合することができる。

１態様において、その抗体またはその抗原結合断片には、Ｂ８−２６の可変重鎖領域のアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９）に対して少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列が含まれる可変重鎖領域が含まれる。

別の態様において、その抗体またはその抗原結合断片には、Ｂ８−２６の可変軽鎖領域のアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５）に対して少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列が含まれる可変軽鎖領域が含まれる。

さらに別の側面において、その抗体またはその抗原結合断片には、Ｂ８−２６の可変重鎖領域のアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９）に対して少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列が含まれる可変重鎖領域およびＢ８−２６の可変軽鎖領域のアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５）に対して少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列が含まれる可変軽鎖領域が含まれる。

別の態様において、Ｂ２−３１；Ｂ５−４０、Ｂ７０−２；Ｂ６−３０；Ｂ９−３０；Ｂ５９−３；Ｂ６０−２；Ｂ５６−６；および／または、好ましくはＢ８−２６の可変重鎖および／または可変軽鎖のＣＤＲを有する抗体またはその結合断片も、ＴｃｄＢに結合することができる。

１態様において、その抗体またはその結合断片には、Ｂ８−２６の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列および／またはＢ８−２６の軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列が含まれる。

好ましい態様において、Ｃ．ディフィシル毒素Ｂに特異的な抗体またはその結合断片は、毒素ＢのＮ末端領域内のエピトープ、例えばＳＥＱＩＤＮＯ：２の番号付けに従うＴｃｄＢのアミノ酸１〜１２５６のエピトープに特異的に結合する。例にはＢ２−３１；Ｂ５−４０；Ｂ８−２６；Ｂ７０−２；Ｂ６−３０；およびＢ９−３０が含まれる。

典型的な態様において、Ｃ．ディフィシル毒素Ｂに特異的な抗体またはその結合断片は、毒素ＢのＣ末端領域内のエピトープ、例えばＳＥＱＩＤＮＯ：２の番号付けに従うＴｃｄＢのアミノ酸１８３２〜２７１０のエピトープに特異的に結合する。

さらに別の態様において、Ｃ．ディフィシル毒素Ｂに特異的な抗体またはその結合断片はＣ．ディフィシル毒素Ｂの“移行”領域内のエピトープ、例えば好ましくはＳＥＱＩＤＮＯ：２の番号付けに従うＴｃｄＢの残基９５６〜１１２８が含まれるエピトープ、例えばＴｃｄＢのアミノ酸６５９〜１８３２のエピトープに特異的に結合する。例にはＢ５９−３；Ｂ６０−２；およびＢ５６−６が含まれる。

抗体の組み合わせ
その抗毒素抗体またはその結合断片は、他の抗Ｃ．ディフィシル毒素抗体（例えば他のモノクローナル抗体、ポリクローナルガンマグロブリン）またはその結合断片との組み合わせで投与することができる。用いることができる組み合わせには、抗毒素Ａ抗体またはその結合断片および抗毒素Ｂ抗体またはその結合断片が含まれる。

別の態様において、組み合わせには抗毒素Ａ抗体またはその結合断片および別の抗毒素Ａ抗体またはその結合断片が含まれる。好ましくは、その組み合わせには中和性抗毒素Ａモノクローナル抗体またはその結合断片および別の中和性抗毒素Ａモノクローナル抗体またはその結合断片が含まれる。驚くべきことに、本発明者らは、そのような組み合わせは結果として毒素Ａの細胞毒性の中和において相乗作用をもたらすことを発見した。例えば、その組み合わせには、以下の中和性抗毒素Ａモノクローナル抗体：Ａ３−２５；Ａ６５−３３；Ａ６０−２２；およびＡ８０−２９の少なくとも２種類の組み合わせが含まれる。より好ましくは、その組み合わせにはＡ３−２５抗体ならびに以下の中和性抗毒素Ａモノクローナル抗体：Ａ６５−３３；Ａ６０−２２；およびＡ８０−２９の少なくとも１種類が含まれる。最も好ましくは、その組み合わせには４種類の抗体：Ａ３−２５；Ａ６５−３３；Ａ６０−２２；およびＡ８０−２９の全てが含まれる。

さらなる態様において、組み合わせには抗毒素Ｂ抗体またはその結合断片および別の抗毒素Ｂ抗体またはその結合断片が含まれる。好ましくは、その組み合わせには中和性抗毒素Ｂモノクローナル抗体またはその結合断片および別の中和性抗毒素Ｂモノクローナル抗体またはその結合断片が含まれる。驚くべきことに、本発明者らは、そのような組み合わせは結果として毒素Ｂの細胞毒性の中和において相乗作用をもたらすことを発見した。より好ましくは、その組み合わせには以下の中和性抗毒素Ｂモノクローナル抗体：Ｂ８−２６；Ｂ９−３０およびＢ５９−３の少なくとも２種類の組み合わせが含まれる。最も好ましくは、その組み合わせには３種類の抗体：Ｂ８−２６；Ｂ９−３０およびＢ５９−３の全てが含まれる。

さらに別の態様において、組み合わせには抗毒素Ｂ抗体またはその結合断片および別の抗毒素Ｂ抗体またはその結合断片が含まれる。前に述べたように、本発明者らは、中和性モノクローナル抗体の少なくとも２種類の組み合わせは意外にも毒素Ａおよび毒素Ｂのそれぞれの中和において相乗作用を示し得ることを発見した。

別の態様において、本発明の薬剤は混合物として配合することができ、またはそれにより結果として抗毒素Ａおよび抗毒素Ｂ結合特性の両方を有する共有結合的に連結された抗体（または共有結合的に連結された抗体断片）がもたらされる当該技術で認識されている技法を用いて化学的もしくは遺伝学的に連結することができる。その組み合わせ配合は、その薬剤の単独または別の薬剤との組み合わせでの親和性、結合活性、または生物学的有効性のような１個以上のパラメーターの決定により導かれてよい。

そのような併用療法は、好ましくは、例えばＣ．ディフィシル関連疾患または障害の抑制、（例えば再発の）予防、および／または処置におけるそれらの療法的活性において相加的および／または相乗的である。そのような併用療法を施すことは、所望の作用を達成するために必要なその療法剤（例えば抗体もしくは抗体断片の混合物、または架橋された、もしくは遺伝学的に融合した二重特異性抗体もしくは抗体断片）の投与量を減少させることができる。

本発明の組成物、例えば抗毒素Ａおよび／または抗毒素Ｂ抗体またはそれらの結合断片のいずれも、療法的作用に関して異なる比率または量で組み合わせることができることが理解されている。例えば、その抗毒素Ａおよび抗毒素Ｂ抗体またはそれらのそれぞれの結合断片は、組成物中に０．１：１０〜１０：０．１、Ａ：Ｂの範囲の比率で存在することができる。別の態様において、その抗毒素Ａおよび抗毒素Ｂ抗体またはそれらのそれぞれの結合断片は、組成物中に０．１：１０〜１０：０．１、Ｂ：Ａの範囲の比率で存在することができる。

別の側面において、本発明は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡに対する中和抗体を生成する方法に関する。その方法には、上記で記述したような免疫原性組成物を哺乳類に投与し、その哺乳類から抗体を回収することが含まれる。好ましい態様において、その免疫原性組成物にはＳＥＱＩＤＮＯ：４を有する変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡが含まれ、ここでその変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡの少なくとも１個のアミノ酸は、好ましくはホルムアルデヒドまたは１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドにより化学的に架橋されている。生成することができるＴｃｄＡに対する典型的な中和抗体には、Ａ６５−３３；Ａ６０−２２；Ａ８０−２９および／またはＡ３−２５が含まれる。
さらに別の側面において、本発明は、Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢに対する中和抗体を生成する方法に関する。その方法には、上記で記述したような免疫原性組成物を哺乳類に投与し、その哺乳類から抗体を回収することが含まれる。好ましい態様において、その免疫原性組成物にはＳＥＱＩＤＮＯ：６を有する変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢが含まれ、ここでその変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢの少なくとも１個のアミノ酸は、好ましくはホルムアルデヒドまたは１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドにより化学的に架橋されている。生成することができるＴｃｄＢに対する典型的な中和抗体には、Ｂ２−３１；Ｂ５−４０、Ｂ７０−２；Ｂ６−３０；Ｂ９−３０；Ｂ５９−３；Ｂ６０−２；Ｂ５６−６；および／またはＢ８−２６が含まれる。

配合物
（例えば本明細書で記述される変異体Ｃ．ディフィシル毒素、免疫原性組成物、抗体および／またはその抗体結合断片が含まれる組成物のような）本発明の組成物は、様々な形態であってよい。これらには、例えば半固体および固体剤形、坐剤、液体形態、例えば液体溶液（例えば注射可能な溶液および不融性の（ｉｎｆｕｓｉｂｌｅ）溶液）、分散液または懸濁液、リポソーム類、および／または例えば凍結乾燥された（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）粉末の形態、凍結乾燥された（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ）形態、噴霧乾燥された形態、および／または発泡乾燥された（ｆｏａｍ−ｄｒｉｅｄ）形態のような乾燥した形態が含まれる。座剤に関して、結合剤およびキャリヤーには例えばポリアルキレングリコール類またはトリグリセリド類が含まれ、そのような座剤は本発明の組成物を含有する混合物から形成することができる。典型的な態様において、その組成物は注射前の液体のビヒクル中での溶解または懸濁に適した形態である。別の典型的な態様において、その組成物はリポソームまたは微粒子、例えばポリラクチド、ポリグリコライド（ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｄｅ）、またはコポリマー中で乳化または封入されている（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ）。

好ましい態様において、その組成物は凍結乾燥されており、使用前にその場で再構成される。
１側面において、本発明は、薬学的に許容可能なキャリヤーと一緒に配合された、（例えば本明細書で記述される変異体Ｃ．ディフィシル毒素、免疫原性組成物、抗体および／またはその抗体結合断片が含まれる組成物のような）本明細書で記述される組成物のいずれかが含まれる医薬組成物に関する。“薬学的に許容可能なキャリヤー”には、生理的に適切であるあらゆる溶媒、分散媒、安定剤、希釈剤、および／または緩衝剤が含まれる。

典型的な安定剤には、炭水化物、例えばソルビトール、マンニトール、デンプン、デキストラン、スクロース、トレハロース、ラクトース、および／またはグルコース；不活性なタンパク質、例えばアルブミンおよび／またはカゼイン；および／または他の大きなゆっくりと代謝される高分子、例えば多糖類、例えばキトサン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸およびコポリマー（例えばラテックスで官能性を持たせたＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）アガロース、アガロース、セルロース等）、アミノ酸、重合体性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、ならびに脂質凝集体（例えば油滴またはリポソーム）が含まれる。加えて、これらのキャリヤーは免疫刺激剤（すなわちアジュバント）として機能することができる。

好ましくは、その組成物にはトレハロースが含まれる。トレハロースの好ましい量（重量％）には、約１％、２％、３％、または４％の最小値から約１０％、９％、８％、７％、６％、または５％の最大値までが含まれる。あらゆる最小値をあらゆる最大値と組み合わせて適切な範囲を定めることができる。１態様において、その組成物には、例えば０．５ｍＬの用量あたり約３％〜６％のトレハロース、最も好ましくは４．５％のトレハロースが含まれる。

適切な希釈剤の例には、蒸留水、生理食塩水、生理的リン酸緩衝生理食塩水、グリセロール、アルコール（例えばエタノール）、リンガー溶液、デキストロース溶液、ハンクス平衡塩類溶液、および／または凍結乾燥賦形剤が含まれる。

典型的な緩衝剤には、リン酸塩（例えばリン酸カリウム、リン酸ナトリウム）；酢酸塩（例えば酢酸ナトリウム）；コハク酸塩（例えばコハク酸ナトリウム）；グリシン；ヒスチジン；炭酸塩、トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、および／または重炭酸塩（例えば重炭酸アンモニウム）緩衝剤が含まれる。好ましくは、その組成物にはトリス緩衝剤が含まれる。トリス緩衝剤の好ましい量には、約１ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭの最小値から約１００ｍＭ、５０ｍＭ、２０ｍＭ，１９ｍＭ、１８ｍＭ、１７ｍＭ、１６ｍＭ、１５ｍＭ、１４ｍＭ、１３ｍＭ、１２ｍＭ、または１１ｍＭの最大値までが含まれる。あらゆる最小値をあらゆる最大値と組み合わせて適切な範囲を定めることができる。１態様において、その組成物には、例えば０．５ｍＬの用量あたり約８ｍＭ〜１２ｍＭのトリス緩衝剤、最も好ましくは１０ｍＭのトリス緩衝剤が含まれる。

別の好ましい態様において、その組成物にはヒスチジン緩衝剤が含まれる。ヒスチジン緩衝剤の好ましい量には、約１ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭの最小値から約１００ｍＭ、５０ｍＭ、２０ｍＭ，１９ｍＭ、１８ｍＭ、１７ｍＭ、１６ｍＭ、１５ｍＭ、１４ｍＭ、１３ｍＭ、１２ｍＭ、または１１ｍＭの最大値までが含まれる。あらゆる最小値をあらゆる最大値と組み合わせて適切な範囲を定めることができる。１態様において、その組成物には、例えば０．５ｍＬの用量あたり約８ｍＭ〜１２ｍＭのヒスチジン緩衝剤、最も好ましくは１０ｍＭのヒスチジン緩衝剤が含まれる。

別の好ましい態様において、その組成物にはリン酸緩衝剤が含まれる。リン酸緩衝剤の好ましい量には、約１ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭの最小値から約１００ｍＭ、５０ｍＭ、２０ｍＭ，１９ｍＭ、１８ｍＭ、１７ｍＭ、１６ｍＭ、１５ｍＭ、１４ｍＭ、１３ｍＭ、１２ｍＭ、または１１ｍＭの最大値までが含まれる。あらゆる最小値をあらゆる最大値と組み合わせて適切な範囲を定めることができる。１態様において、その組成物には、例えば０．５ｍＬの用量あたり約８ｍＭ〜１２ｍＭのリン酸緩衝剤、最も好ましくは１０ｍＭのリン酸緩衝剤が含まれる。

その緩衝剤のｐＨは一般に、選択される有効物質を安定化するように選択されると考えられ、当業者はそれを既知の方法により確かめることができる。好ましくは、その緩衝剤のｐＨは生理的ｐＨの範囲内であろう。従って、好ましいｐＨの範囲は約３から約８まで、より好ましくは約６．０から約８．０まで；さらにもっと好ましくは約６．５から約７．５まで；そして最も好ましくは約７．０〜約７．２である。

一部の態様において、その医薬組成物には界面活性剤が含まれていてよい。それが両性、非イオン性、陽イオン性または陰イオン性であれ、あらゆる界面活性剤が適切である。典型的な界面活性剤には、ポリオキシエチレンソルビタンエステル類界面活性剤（例えばＴＷＥＥＮ（登録商標））、例えばポリソルベート２０および／またはポリソルベート８０；ラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコール類に由来するポリオキシエチレン脂肪エーテル類（Ｂｒｉｊ界面活性剤として知られる）、例えばトリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ３０）；トリトンＸ１００、またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール；ならびにソルビタンエステル類（一般にＳＰＡＮ類として知られる）、例えばソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ８５）およびソルビタンモノラウレート、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。好ましい界面活性剤にはポリソルベート８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）が含まれる。

ポリソルベート８０の好ましい量（重量％）には、約０．００１％、０．００５％、または０．０１％の最小値から約０．０１０％、０．０１５％、０．０２５％、または１．０％の最大値までが含まれる。あらゆる最小値をあらゆる最大値と組み合わせて適切な範囲を定めることができる。１態様において、その組成物には約０．００５％〜０．００１５％のポリソルベート８０、最も好ましくは０．０１％のポリソルベート８０が含まれる。

典型的な態様において、その免疫原性組成物にはトレハロースおよびホスフェート８０が含まれる。別の典型的な態様において、その免疫原性組成物にはトリス緩衝剤およびポリソルベート８０が含まれる。別の典型的な態様において、その免疫原性組成物にはヒスチジン緩衝剤およびポリソルベート８０が含まれる。さらに別の典型的な態様において、その免疫原性組成物にはリン酸緩衝剤およびポリソルベート８０が含まれる。

１つの典型的な態様において、その免疫原性組成物にはトレハロース、トリス緩衝剤およびポリソルベート８０が含まれる。別の典型的な態様において、その免疫原性組成物にはトレハロース、ヒスチジン緩衝剤およびポリソルベート８０が含まれる。さらに別の典型的な態様において、その免疫原性組成物にはトレハロース、リン酸緩衝剤およびポリソルベート８０が含まれる。

本明細書で記述される組成物には、さらに石油、動物、植物、または合成由来の構成要素、例えば落花生油、大豆油、および／または鉱油が含まれていてよい。例には、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールのようなグリコール類が含まれる。

一部の態様において、その医薬組成物にはさらにホルムアルデヒドが含まれる。例えば、好ましい態様において、さらにホルムアルデヒドが含まれる医薬組成物は免疫原性組成物を有し、ここでその免疫原性組成物の変異体Ｃ．ディフィシル毒素はホルムアルデヒドが含まれる化学的架橋剤と接触させてある。その医薬組成物中に存在するホルムアルデヒドの量は、約０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％、０．００９％、０．０１０％、０．０１３％、または０．０１５％の最小値から約０．０２０％、０．０１９％、０．０１８％、０．０１７％、０．０１６％、０．０１５％、０．０１４％、０．０１３％、０．０１２％、０．０１１％または０．０１０％の最大値まで様々であってよい。あらゆる最小値をあらゆる最大値と組み合わせて適切な範囲を定めることができる。１態様において、その医薬組成物には約０．０１０％ホルムアルデヒドが含まれる。

一部の代わりの態様において、本明細書で記述される医薬組成物にはホルムアルデヒドが含まれない。例えば、好ましい態様において、ホルムアルデヒドが含まれない医薬組成物は免疫原性組成物を有し、ここでその変異体Ｃ．ディフィシル毒素の少なくとも１個のアミノ酸はＥＤＣが含まれる薬剤により化学的に架橋されている。より好ましくは、そのような態様において、その変異体Ｃ．ディフィシル毒素はホルムアルデヒドが含まれる化学的架橋剤と接触させていない。別の典型的な態様において、凍結乾燥された形態である医薬組成物にはホルムアルデヒドは含まれない。

別の態様において、本明細書で記述される組成物には下記で記述されるようなアジュバントが含まれていてよい。好ましいアジュバントは、免疫原への内因性免疫応答を、その免疫応答の質的形態に影響を及ぼし得るその免疫原における立体構造変化を引き起こすことなく増強する。

典型的なアジュバントには、３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ（商標））（ＧＢ２２２０２１１（ＧＳＫ）参照）；水酸化アルミニウムゲル、例えばＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（商標）（ＢｒｅｎｎｔａｇＢｉｏｓｅｃｔｏｒ、デンマーク）；アルミニウム塩類（例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム）が含まれ、それは免疫刺激剤、例えばＭＰＬまたは３−ＤＭＰ、ＱＳ−２１、重合体性または単量体性アミノ酸、例えばポリグルタミン酸またはポリリシンと共に、またはそれらなしで用いることができる。

さらに別の典型的なアジュバントは、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、例えばＣｐＧオリゴヌクレオチド（例えば国際公開第１９９８／０４０１００号、国際公開第２０１０／０６７２６２号を参照）、またはサポニンおよび免疫刺激性オリゴヌクレオチド、例えばＣｐＧオリゴヌクレオチド（例えば国際公開第００／０６２８００号を参照）である。好ましい態様において、そのアジュバントはＣｐＧオリゴヌクレオチド、最も好ましくはＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧＯＤＮ）である。好ましいＣｐＧＯＤＮは、Ｂ細胞を優先的に活性化するＢクラスのＣｐＧＯＤＮである。本発明の側面において、そのＣｐＧＯＤＮは核酸配列５’ Ｔ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｔ^＊Ｔ^＊Ｔ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｔ^＊Ｔ^＊Ｔ^＊Ｔ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：４８）を有し、ここで^＊はホスホロチオエート結合を示す。この配列のＣｐＧＯＤＮはＣｐＧ２４５５５として知られており、それは国際公開第２０１０／０６７２６２号において記述されている。好ましい態様において、ＣｐＧ２４５５５は水酸化アルミニウム塩、例えばＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌと一緒に用いられる。

さらなるクラスの典型的なアジュバントには、サポニンアジュバント類、例えばＳｔｉｍｕｌｏｎ（商標）（ＱＳ−２１、それはトリテルペングリコシドまたはサポニンである；Ａｑｕｉｌａ、マサチューセッツ州フレーミングハム）またはそれから生成される粒子、例えばＩＳＣＯＭ類（免疫刺激複合体）およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）アジュバントが含まれる。従って、本発明の組成物は、ＩＳＣＯＭ類、ＣＴＢを含有するＩＳＣＯＭＳ、リポソームの形態で送達されてよく、またはアクリレート類もしくはポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコシド）のような化合物中に封入されて吸着に適した大きさのマイクロスフィアを形成していてよい。典型的には、用語“ＩＳＣＯＭ”は、グリコシド類、例えばトリテルペノイドサポニン類（特にＱｕｉｌＡ）、および疎水性領域を含有する抗原の間で形成された免疫原性複合体を指す。好ましい態様において、そのアジュバントはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸアジュバントである。

他の典型的なアジュバントには、ＲＣ−５２９、ＧＭ−ＣＳＦおよび完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）が含まれる。
さらに別のクラスの典型的なアジュバントは、Ｎ−グリコシルアミド類、Ｎ−グリコシル尿素類およびＮ−グリコシルカルバメート類が含まれる糖脂質類似体であり、そのそれぞれが糖残基においてアミノ酸で置換されている。

場合により、その医薬組成物には２種類以上の異なるアジュバントが含まれる。アジュバントの好ましい組み合わせには、例えば以下のアジュバントの少なくとも２種類が含まれるアジュバントのあらゆる組み合わせが含まれる：ミョウバン、ＭＰＬ、ＱＳ−２１、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、ＣｐＧ、およびＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ。典型的なアジュバントの組み合わせには、ＣｐＧおよびＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌの組み合わせが含まれる。

あるいは、１態様において、その組成物はその哺乳類にアジュバントの非存在下で投与される。
本明細書で記述される組成物は、予防および／または療法的適用に関して、例えば非経口、局所、静脈内、粘膜、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、髄腔内、腹腔内、鼻腔内、筋内、皮内、注入、直腸、および／または経皮経路のようなあらゆる投与経路により投与することができる。好ましい態様において、その組成物の投与経路は非経口投与であり、より好ましくは筋内投与である。典型的な筋内投与は腕または脚の筋肉において実施される。

本明細書で記述される組成物は、Ｃ．ディフィシル感染症の予防および／または処置において少なくとも部分的に有効である療法との組み合わせで投与することができる。例えば、本発明の組成物は、生物療法；生菌療法；便移植（ｓｔｏｏｌｉｍｐｌａｎｔｓ）；免疫療法（例えば静脈内免疫グロブリン）；および／またはＣ．ディフィシル関連疾患（ＣＤＡＤ）の抗生物質処置に関するケアの受け入れられている標準、例えばメトロニダゾールおよびバンコマイシンの前に、それらと同時に、またはそれらの後に投与することができる。

毒素Ａおよび毒素Ｂに関する本発明の組成物は、その哺乳類にあらゆる組み合わせで投与することができる。例えば、変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡが含まれる免疫原性組成物は、その哺乳類に、変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢが含まれる免疫原性組成物の投与の前に、それと同時に、またはその後に投与することができる。逆に、変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢが含まれる免疫原性組成物は、その哺乳類に、変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡが含まれる免疫原性組成物の投与の前に、それと同時に、またはその後に投与することができる。

別の態様において、抗毒素Ａ抗体またはその結合断片が含まれる組成物は、その哺乳類に、抗毒素Ｂ抗体またはその結合断片が含まれる組成物の投与の前に、それと同時に、またはその後に投与することができる。逆に、抗毒素Ｂ抗体またはその結合断片が含まれる組成物は、その哺乳類に、抗毒素Ａ抗体またはその結合断片が含まれる組成物の投与の前に、それと同時に、またはその後に投与することができる。

さらなる態様において、本発明の組成物は、その哺乳類に、薬学的に許容可能なキャリヤーの投与の前に、それと同時に、またはその後に投与することができる。例えば、アジュバントは変異体Ｃ．ディフィシル毒素が含まれる組成物の投与の前に、それと同時に、またはその後に投与することができる。従って、本発明の組成物および薬学的に許容可能なキャリヤーは同じバイアル中に包装することができ、またはそれらを別々のバイアル中に包装して使用前に混合することができる。その組成物は、１回量投与および／または多数回用量投与（ｍｕｌｔｉｐｌｅｄｏｓｅａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）のために配合することができる。

哺乳類においてＣ．ディフィシル感染を防御および／または処置する方法
１側面において、本発明は、哺乳類においてＣ．ディフィシル毒素に対する免疫応答を誘導する方法に関する。その方法には、有効量の本明細書で記述される組成物をその哺乳類に投与することが含まれる。例えば、その方法には、その哺乳類においてそれぞれのＣ．ディフィシル毒素に対する免疫応答を生じさせるために有効な量を投与することが含まれてよい。

典型的な態様において、本発明は、哺乳類においてＣ．ディフィシルＴｃｄＡに対する免疫応答を誘導する方法に関する。その方法には、有効量の変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡが含まれる免疫原性組成物をその哺乳類に投与することが含まれる。別の典型的な態様において、本発明は、哺乳類においてＣ．ディフィシルＴｃｄＢに対する免疫応答を誘導する方法に関する。その方法には、有効量の変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢが含まれる免疫原性組成物をその哺乳類に投与することが含まれる。

さらなる態様において、その方法には、有効量の変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＡが含まれる免疫原性組成物および有効量の変異体Ｃ．ディフィシルＴｃｄＢが含まれる免疫原性組成物をその哺乳類に投与することが含まれる。追加の側面において、本明細書で記述される組成物は、哺乳類において、その組成物を投与されなかった哺乳類と比較して、Ｃ．ディフィシル感染症、Ｃ．ディフィシル関連疾患、症候群、病気、症状、および／またはそれらの合併症を処置する、予防する、それらの危険性を低下させる、それらの重症度を低下させる、それらの発生率を低下させる、および／またはそれらの発症を遅らせるために用いることができる。その方法には、有効量のその組成物をその哺乳類に投与することが含まれる。

感染の重症度に基づいて、Ｃ．ディフィシル感染により引き起こされる３種類の臨床症候群が認められている。最も重度の形態は偽膜性大腸炎（ＰＭＣ）であり、それは大量の下痢、腹痛、疾患の全身的徴候、および結腸の特徴的な内視鏡的外観を特徴とする。

抗生物質関連大腸炎（ＡＡＣ）も大量の下痢、腹痛および圧痛、全身的徴候（例えば発熱）、ならびに白血球増加を特徴とする。ＡＡＣにおける腸管損傷はＰＭＣにおける腸管損傷よりも重症度が低く、ＰＭＣにおける結腸の特徴的な内視鏡的外観は存在せず、死亡率は低い。

最後に、抗生物質関連下痢（ＡＡＤ、それはＣ．ディフィシル関連下痢（ＣＤＡＤ）としても知られている）は比較的軽度な症候群であり、軽度〜中程度の下痢を特徴とし、（例えば腹痛および圧痛を特徴とするような）大きな腸の炎症および感染の全身的徴候（例えば発熱）の両方を欠いている。

これらの３種類の別個の症候群は、典型的には順に増大する頻度で起こる。すなわち、ＰＭＣは典型的にはＡＡＣより低い頻度で起こり、ＡＡＤは典型的にはＣ．ディフィシル疾患の最も頻繁な臨床像である。

Ｃ．ディフィシル感染症の頻繁な厄介な問題は疾患の再発または再燃であり、それはＣ．ディフィシル疾患から回復した全ての患者の２０％に至るまでにおいて起こる。再燃は臨床的にＡＡＤ、ＡＡＣ、またはＰＭＣとみなすことができる。一度再燃した患者は、再度再燃する可能性がより高い。

本明細書で用いられる際、Ｃ．ディフィシル感染症の状態には、例えば軽度、軽度〜中程度、中程度、および重度のＣ．ディフィシル感染症が含まれる。Ｃ．ディフィシル感染症の状態は、その感染症の症状の存在および／または重症度に依存して変動してよい。

Ｃ．ディフィシル感染症の症状には、例えば下痢；大腸炎；痙攣、発熱、便中の白血球、および大腸生検における炎症を伴う大腸炎；偽膜性大腸炎；低アルブミン血症；全身水腫；白血球増加；敗血症；腹痛；無症候性保菌；および／または合併症およびその感染症の発現の間に存在する中間的な病理学的表現型、ならびにそれらの組み合わせ等のような、生理的、生化学的、組織学的および／または行動学的症状が含まれ得る。従って、例えば、有効量の本明細書で記述される組成物の投与は、例えば、その組成物を投与されなかった哺乳類と比較して、下痢；腹痛、痙攣、発熱、大腸生検における炎症、低アルブミン血症、全身水腫、白血球増加、敗血症、および／または無症候性保菌等を処置する、予防する、それらの危険性を低下させる、それらの重症度を低下させる、それらの発生率を低下させる、および／またはそれらの発症を遅らせることができる。

Ｃ．ディフィシル感染症の危険因子には、例えば以下の危険因子が含まれ得る：現在または近い将来の抗微生物薬（例えば正常な結腸微生物叢の崩壊を引き起こす抗生物質、例えばクリンダマイシン、セファロスポリン類、メトロニダゾール、バンコマイシン、フルオロキノロン類（レボフロキサシン、モキシフロキサシン、ガチフロキサシン、およびシプロフロキサシンが含まれる）、リネゾリド等が含まれる、嫌気性細菌に対する抗細菌スペクトルおよび／または活性を有するあらゆる抗微生物剤が含まれる）の使用；現在または近い将来の処方されたメトロニダゾールまたはバンコマイシンの退薬：現在または近い将来の健康管理施設（例えば病院、長期療養施設等）および健康管理従事者への入院（ａｄｍｉｓｓｉｏｎ）；現在または近い将来のプロトンポンプ阻害剤、Ｈ２拮抗薬、および／またはメトトレキセート、またはそれらの組み合わせによる処置；現在の胃腸疾患、例えば炎症性腸疾患、またはその危険性；その哺乳類に対する過去、現在または近い将来の胃腸手術または胃腸手技；過去または現在のＣ．ディフィシル感染症および／またはＣＤＡＤの再発、例えばＣ．ディフィシル感染症および／またはＣＤＡＤを一度または一度より多く有したことがある患者；ならびに少なくとも約６５歳以上の年齢のヒト。

本明細書で記述される方法において、その哺乳類は例えばマウス、ハムスター、霊長類、およびヒトのようなあらゆる哺乳類であってよい。好ましい態様において、その哺乳類はヒトである。本発明によれば、そのヒトにはＣ．ディフィシル感染症、Ｃ．ディフィシル関連疾患、症候群、病気、症状、および／またはそれらの合併症を示したことがある人；現在Ｃ．ディフィシル感染症、Ｃ．ディフィシル関連疾患、症候群、病気、症状、および／またはそれらの合併症を示している人；ならびにＣ．ディフィシル感染症、Ｃ．ディフィシル関連疾患、症候群、病気、症状、および／またはそれらの合併症の危険にさらされている人が含まれてよい。

Ｃ．ディフィシル感染の症状を示したことがある人の例には、上記で記述した症状を示したことがある、または示している人；Ｃ．ディフィシル感染症および／またはＣ．ディフィシル関連疾患（ＣＤＡＤ）を有したことがある、または有している人；ならびにＣ．ディフィシル感染症および／またはＣＤＡＤの再発を有する人が含まれる。

Ｃ．ディフィシル感染の危険にさらされている患者の例には、以下の人が含まれる：計画された抗微生物薬の使用の危険にさらされている、または現在それを経験している人；処方されたメトロニダゾールまたはバンコマイシンの退薬の危険にさらされている、または現在それを経験している人；計画された健康管理施設（例えば病院、長期療養施設等）および健康管理従事者への入院の危険にさらされている、または現在それを経験している人；および／または計画されたプロトンポンプ阻害剤、Ｈ２拮抗薬、および／またはメトトレキセート、またはそれらの組み合わせによる処置の危険にさらされている、または現在それを受けている人；胃腸疾患、例えば炎症性腸疾患を有したことがある、または経験している人；胃腸手術または胃腸手技を受けたことがある、または受けている人；ならびにＣ．ディフィシル感染症および／またはＣＤＡＤの再発を有したことがある、または有している人、例えばＣ．ディフィシル感染症および／またはＣＤＡＤを一度、または一度より多く有したことがある患者；約６５歳以上である人。そのような危険にさらされている患者は現在Ｃ．ディフィシル感染症の症状を示している可能性があり、または示していない可能性もある。

無症候性の患者において、予防および／または処置はあらゆる年齢において（例えば約１０、２０、または３０歳において）開始することができる。しかし、１態様において、患者が少なくとも約４５、５５、６５、７５、または８５歳に達するまでは処置を開始する必要はない。例えば、本明細書で記述される組成物は、５０〜８５歳の無症候性のヒトに投与されてよい。

１態様において、哺乳類においてＣ．ディフィシル感染症、Ｃ．ディフィシル関連疾患、症候群、病気、症状、および／またはそれらの合併症を予防する、それらの危険性を低下させる、それらの重症度を低下させる、それらの発生率を低下させる、および／またはそれらの発症を遅らせる方法には、有効量の本明細書で記述される組成物をそれを必要とする哺乳類、Ｃ．ディフィシル感染症の危険にさらされている哺乳類、および／またはＣ．ディフィシル感染症にかかりやすい哺乳類に投与することが含まれる。有効量には、例えば、哺乳類において、その組成物を投与されなかった哺乳類と比較して、Ｃ．ディフィシル感染症、Ｃ．ディフィシル関連疾患、症候群、病気、症状、および／またはそれらの合併症を予防する、それらの危険性を低下させる、それらの重症度を低下させる、それらの発生率を低下させる、および／またはそれらの発症を遅らせるのに十分な量が含まれる。有効量の本明細書で記述される組成物の投与は、例えば下痢；腹痛、痙攣、発熱、大腸生検における炎症、低アルブミン血症、全身水腫、白血球増加、敗血症、および／または無症候性保菌等を予防する、それらの危険性を低下させる、それらの重症度を低下させる、それらの発生率を低下させる、および／またはそれらの発症を遅らせることができる。好ましい態様において、その方法には有効量の本明細書で記述される免疫原性組成物をそれを必要とする哺乳類、Ｃ．ディフィシル感染症の危険にさらされている哺乳類、および／またはＣ．ディフィシル感染症にかかりやすい哺乳類に投与することが含まれる。

追加の態様において、哺乳類においてＣ．ディフィシル感染症、Ｃ．ディフィシル関連疾患、症候群、病気、症状、および／またはそれらの合併症を処置する、それらの重症度を低下させる、および／またはそれらの発症を遅らせる方法には、有効量の本明細書で記述される組成物をＣ．ディフィシル感染症の疑いがある、または現在それを患っている哺乳類に投与することが含まれる。有効量には、例えば、哺乳類において、その組成物を投与されなかった哺乳類と比較して、Ｃ．ディフィシル感染症、Ｃ．ディフィシル関連疾患、症候群、病気、症状、および／またはそれらの合併症を処置する、それらの重症度を低下させる、および／またはそれらの発症を遅らせるのに十分な量が含まれる。

有効量のその組成物の投与は、その対象においてＣ．ディフィシル感染の少なくとも１種類の徴候または症状、例えば下記で記述される徴候または症状を改善することができる。有効量の本明細書で記述される組成物の投与は、例えば、その組成物を投与されなかった哺乳類と比較して、下痢の重症度を低下させる、および／または発生率を低下させる；腹痛、痙攣、発熱、大腸生検における炎症、低アルブミン血症、全身水腫、白血球増加、敗血症、および／または無症候性保菌等の重症度を低下させる、および／または発生率を低下させることができる。場合により、感染症の症状、徴候、および／または危険因子の存在は、処置を開始する前に決定される。好ましい態様において、その方法には有効量の本明細書で記述される抗体および／またはその結合断片をＣ．ディフィシル感染症の疑いがある、または現在それを患っている哺乳類に投与することが含まれる。

従って、その組成物の有効量は、本発明の方法において所望の作用（例えば予防的および／または療法的作用）を達成するのに十分な量を指す。例えば、投与に関する免疫原の量は、注射あたり約１μｇ、５μｇ、２５μｇ、５０μｇ、７５μｇ、１００μｇ、２００μｇ、５００μｇ、または１ｍｇの最小値から約２ｍｇ、１ｍｇ、５００μｇ、２００μｇの最大値まで様々であってよい。あらゆる最小値をあらゆる最大値と組み合わせて適切な範囲を定めることができる。典型的には、免疫原あたり約１０、２０、５０または１００μｇがそれぞれのヒトへの注射に関して用いられる。

対象に投与される本発明の組成物の量は、その感染症のタイプおよび重症度に、および／またはその人の特徴、例えば全身の健康状態、年齢、性別、体重および薬物への耐性に依存してよい。それは疾患の程度、重症度、およびタイプにも依存してよい。有効量はまた、投与経路、標的部位、その患者の生理状態、その患者の年齢、その患者がヒトか動物か、施された他の療法、および処置が予防的か療法的かのような要因に応じて異なってよい。当業者は、これらおよび他の要因に応じて適切な量を決定することができるであろう。

有効量には、本明細書における方法での使用に関して１回有効用量（ｏｎｅｅｆｆｅｃｔｉｖｅｄｏｓｅ）または（例えば２、３、４回用量、またはより多くの用量のような）多数回有効用量（ｍｕｌｔｉｐｌｅｅｆｆｅｃｔｉｖｅｄｏｓｅｓ）が含まれてよい。有効投与量は、安全性および有効性を最適化するように用量設定される必要がある可能性がある。

予防的および／または療法的使用を成し遂げるために適切な投与の量および頻度の組み合わせは、予防的に、または療法的に有効な計画と定義される。予防および／または療法計画において、その組成物は典型的には十分な免疫応答が達成されるまで１回より多くの投与量で投与される。典型的には、その免疫応答を監視し、その免疫応答が衰え始めたら反復投与量を与える。

その組成物は、ある期間にわたって多数回の投与量で投与することができる。処置は、その療法剤（例えば変異体Ｃ．ディフィシル毒素が含まれる免疫原性組成物）に対する抗体または活性化されたＴ細胞もしくはＢ細胞応答をアッセイすることにより時間にわたって監視することができる。その応答が減少した場合、それは追加免疫投与量が必要であることを示している。

実施例１：毒素陰性Ｃ．ディフィシル株の同定
毒素（ＡおよびＢ）遺伝子および毒素発現を欠くＣ．ディフィシル株を同定するため、１３のＣ．ディフィシル株を試験した。１３のＣ．ディフィシル株の培養液を、毒素Ａに関するＥＬＩＳＡにより試験した。７つの株は毒素Ａを発現していた：Ｃ．ディフィシル１４７９７−２、Ｃ．ディフィシル６３０、Ｃ．ディフィシルＢＤＭＳ、Ｃ．ディフィシルＷ１１９４、Ｃ．ディフィシル８７０、Ｃ．ディフィシル１２５３、およびＣ．ディフィシル２１４９。図３参照。

６つの株は毒素Ａを発現しておらず、病原性遺伝子座全体を欠いていた：Ｃ．ディフィシル１３５１（ＡＴＣＣ４３５９３（商標））、Ｃ．ディフィシル３２３２（ＡＴＣＣＢＡＡ−１８０１（商標））、Ｃ．ディフィシル７３２２（ＡＴＣＣ４３６０１（商標））、Ｃ．ディフィシル５０３６（ＡＴＣＣ４３６０３（商標））、Ｃ．ディフィシル４８１１（４ＡＴＣＣ３６０２（商標））、およびＣ．ディフィシルＶＰＩ１１１８６（ＡＴＣＣ７０００５７（商標））。ＶＰＩ１１１８６を、接合によるプラスミドＤＮＡの取り込みに対するその有効性に基づいて選択した。

その同じ１３の株を、その病原性遺伝子座（ＰａＬｏｃ; Braun et al., Gene. 1996 Nov 28;181(1-2):29-38.）の外側のプライマーを用いる多重ＰＣＲアッセイで試験した。そのＰＣＲの結果は、ＥＬＩＳＡによる６つの毒素Ａ陰性株からのＤＮＡはＰａＬｏｃからのいずれの遺伝子（ｔｃｄＡ〜ｔｃｄＥ）も増幅しないことを示した。ＰａＬｏｃに隣接する配列（ｃｄｄ３およびｃｄｕ２）は存在していた（データは示していない）。

実施例２：Ｃ．ディフィシルＶＰＩ１１１８６における芽胞形成経路の不活性化
Ｃ．ディフィシル産生株（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｓｔｒａｉｎ）の芽胞形成機能のノックアウトは、安全な製造環境における大規模発酵を容易にする。非芽胞形成性Ｃ．ディフィシル株を作り出すためにＣｌｏｓＴｒｏｎシステムを用いた。Heap et al., J Microbiol Methods. 2009 Jul;78(1):79-85を参照。ＣｌｏｓＴｒｏｎシステムは、部位特異的な挿入によるｓｐｏ０Ａ１クロストリジウム遺伝子の不活性化のためにグループＩＩイントロンを用いて標的化された遺伝子不活性化を可能にする。その毒素マイナス産生株ＶＰＩ１１１８６に対してそのＣｌｏｓＴｒｏｎ技術による芽胞形成不活性化を施した。エリスロマイシン耐性変異体を選択し、挿入カセットの存在をＰＣＲにより確かめた（示していない）。２個の独立したクローンが芽胞を形成できないことを確かめた。

実施例３：細胞毒性機能を不活性化するための毒素ＡおよびＢ遺伝子の遺伝子改変
株６３０Δのゲノム配列に基づく完全長変異体毒素ＡおよびＢのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、ＢｌｕｅＨｅｒｏｎＢｉｏｔｅｃｈでのカスタム合成のために設計した。例えばＳＥＱＩＤＮＯ：９〜１４を参照。細胞毒性の原因であるグルコシルトランスフェラーゼ活性に関する活性部位を、２個の対立遺伝子置換：毒素Ａに関してＤ２８５Ａ／Ｄ２８７Ａ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３参照）、および毒素Ｂに関してＤ２８６Ａ／Ｄ２８８Ａ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５参照）により変化させた。２つのヌクレオチドを、それぞれのアスパラギン酸（Ｄ）コドンにおいて変異させてアラニン（Ａ）に関するコドンを作り出した。例えばＳＥＱＩＤＮＯ：９〜１４を参照。加えて、システイン残基を欠く変異体毒素を発現する一対のベクターを、ＢｌｕｅＨｅｒｏｎＢｉｏｔｅｃｈでのカスタム合成後に構築した。変異体毒素Ａからの７個のシステイン残基および変異体毒素Ｂからの９個のシステイン残基をアラニンで置き換えた。その置換には、ＡおよびＢ毒素の自己触媒的プロテアーゼの触媒的システインが含まれる。また、ベクター構築に関して用いられる制限酵素部位を削除するために必要である場合、サイレント変異を導入した。

実施例４：ｐＭＴＬ８４１２１ｆｄｘ発現ベクター
Ｃ．ディフィシル変異体毒素抗原発現のために用いられたプラスミドシャトルベクターは、Ｍｉｎｔｏｎ研究室により開発されたｐＭＴＬ８０００シリーズモジュラーシステムから選択された（Heap et al., J Microbiol Methods. 2009 Jul;78(1):79-85を参照）。選択されたベクターｐＭＴＬ８４１２１ｆｄｘは、Ｃ．ディフィシルプラスミドｐＣＤ６Ｇｒａｍ＋レプリコン、ｃａｔＰ（クロラムフェニコール／チアンフェニコール）選択用マーカー、ｐ１５ａＧｒａｍ−レプリコンおよびｔｒａ機能、ならびにＣ．スポロゲネス（Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）フェレドキシンプロモーター（ｆｄｘ）および遠位の（ｄｉｓｔａｌ）マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を含有する。実験によるデータは、低コピー数のｐ１５ａレプリコンは代替案であるＣｏｌＥ１よりも大腸菌中での大きな安定性を与えることを示唆した。ｆｄｘプロモーターは、それがＣＡＴレポーターコンストラクト（例えばｔｃｄＡ、ｔｃｄＢ；または異種のｔｅｔＲまたはｘｙｌＲ）を用いた実験において試験された他のプロモーターよりも高い発現をもたらしたために選択された（データは示していない）。

実施例５：改変された毒素ＯＲＦのｐＭＴＬ８４１２１ｆｄｘ中へのクローニング
株６３０Δのゲノム配列に基づく完全長変異体毒素ＡおよびＢのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、ｐＭＴＬ８４１２１ｆｄｘベクターのマルチクローニングＮｄｅＩおよびＢｇｌＩＩ部位を用いて、標準的な分子生物学の技法を用いてサブクローニングした。クローニングを容易にするため、そのＯＲＦに開始コドンを含有する近位のＮｄｅＩ部位およびその停止コドンのすぐ下流のＢｇｌＩＩ部位を隣接させた。

実施例６：三重変異体を作り出すためのＴｃｄＡの部位特異的変異誘発
自己触媒的プロテアーゼドメインの触媒的システイン残基を、ＳＥＱＩＤＮＯ：３および５、すなわち“二重変異体”のそれぞれにおいて置換した（すなわち、ＴｃｄＡに関してＣ７００ＡおよびＴｃｄＢに関してＣ６９８Ａ）。変異体毒素Ａの変異誘発に関して、ＴｃｄＡＤ２８５Ａ／Ｄ２８７Ａ発現プラスミドからの２．４８ｋｂのＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＵＣ１９（同じもので切断した）中にサブクローニングし、この鋳型に対して部位特異的変異誘発を実施した。一度その新しい対立遺伝子をＤＮＡ配列分析により確認し、その改変されたＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を発現ベクターｐＭＴＬ８４１２１ｆｄｘ中に再導入して“三重変異体”、すなわちＳＥＱＩＤＮＯ：４およびＳＥＱＩＤＮＯ：６を作り出した。

実施例７：三重変異体を作り出すためのＴｃｄＢの部位特異的変異誘発
変異体毒素Ｂの変異誘発のため、変異体毒素Ｂプラスミドからの３．２９ｋｂのＮｄｅＩ−ＥｃｏＮＩ断片を改変して再導入した。ＥｃｏＮＩ部位は入手可能なクローニングベクター中に存在しないため、わずかに大きい３．５ｋｂのＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＶ断片をｐＵＣ１９（ＮｄｅＩ−ＳｍａＩにより調製された）中にサブクローニングした。変異誘発後、その改変された内部の３．３ｋｂのＮｄｅＩ−ＥｃｏＮＩ断片を切り出し、それを用いて対応する変異体毒素Ｂ発現ベクターｐＭＴＬ８４１２１ｆｄｘの断片を置き換えた。この方向の（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ）計画のクローニング効率は極めて低いことが分かったため、１．５ｋｂのＤｒａＩＩＩの置き換えを含む、Ｃ６９８Ａ対立遺伝子を導入するための代替計画を並行して試みた。両方の計画が独立して所望の組み換え体をもたらした。

実施例８：部位特異的変異誘発による追加の変異体毒素変種の作製
少なくとも１２の異なるＣ．ディフィシル変異体毒素変種を構築した。対立遺伝子置換をＮ末端の変異体毒素遺伝子断片中に部位特異的変異誘発（Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ（登録商標）キット）により導入した。生物学的活性において野生型Ｃ．ディフィシル株から精製された天然の毒素に対して定量的に均等なタンパク質を生成するこのプラスミドに基づく系の能力を評価するための参照対照としての組み換え毒素も設計した。この場合、本来のグルコシルトランスフェラーゼの置換を元に戻すように対立遺伝子置換を導入した。加えて、一対のシステインを含まない変異体毒素ベクターを、ＢｌｕｅＨｅｒｏｎＢｉｏｔｅｃｈでのカスタム合成後に構築した。

その１２の毒素の変種には、（１）Ｄ２８５Ａ／Ｄ２８７Ａ変異を有する変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ａ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）；（２）Ｄ２８６Ａ／Ｄ２８８Ａ変異を有する変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ｂ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）；（３）Ｄ２８５Ａ／Ｄ２８７Ａ、Ｃ７００Ａ変異を有する変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ａ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）；（４）Ｄ２８６Ａ／Ｄ２８８Ａ、Ｃ６９８Ａ変異を有する変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ｂ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）；（５）ＳＥＱＩＤＮＯ：１を有する組み換え毒素Ａ；（６）ＳＥＱＩＤＮＯ：２を有する組み換え毒素Ｂ；（７）Ｃ７００Ａ変異を有する変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ａ；（８）Ｃ６９８Ａ変異を有する変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ｂ；（９）Ｃ７００Ａ、Ｃ５９７Ｓ、Ｃ１１６９Ｓ、Ｃ１４０７Ｓ、Ｃ１６２３Ｓ、Ｃ２０２３Ｓ、およびＣ２２３６Ｓ変異を有する変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ａ；（１０）Ｃ６９８Ａ、Ｃ３９５Ｓ、Ｃ５９５Ｓ、Ｃ８２４Ｓ、Ｃ８７０Ｓ、Ｃ１１６７Ｓ、Ｃ１６２５Ｓ、Ｃ１６８７Ｓ、およびＣ２２３２Ｓ変異を有する変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ｂ；（１１）Ｄ２８５Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｃ７００Ａ、Ｄ２６９Ａ、Ｒ２７２Ａ、Ｅ４６０Ａ、およびＲ４６２Ａ変異を有する変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ａ（ＳＥＱＩＤＮＯ：７）；ならびに（１２）Ｄ２７０Ａ、Ｒ２７３Ａ、Ｄ２８６Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｄ４６１Ａ、Ｋ４６３Ａ、およびＣ６９８Ａ変異を有する変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ｂ（ＳＥＱＩＤＮＯ：８）が含まれる。

実施例９：形質転換体の安定性
一般的に用いられるＤＨ５α大腸菌研究室株を用いると、再編成されたプラスミドが得られた。対照的に、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＳｔｂｌ２（商標）大腸菌宿主を用いた形質転換は、ＬＢクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）プレート上での３０℃における３日間の増殖の後、増殖の遅い完全長変異体毒素組み換え体をもたらした。関連するＳｔｂｌ３（商標）およびＳｔｂｌ４（商標）大腸菌株を用いるとより低いクローニング効率が得られたが、これらの系統はプラスミドの維持に関して安定であることが分かった。続いて形質転換体を寒天において、または液体培養中で、クロラムフェニコール選択下で３０℃において増殖させた。（Ｍｉｌｌｅｒの）ＬＢ培地は動物由来物質を含まないトリプトン−大豆に基づく培地と比較して形質転換体の回収率および増殖を向上させることも分かった。

実施例１０：Ｃ．ディフィシルの野生型または遺伝子変異体毒素遺伝子をコードするｐＭＴＬ８４１２１ｆｄｘによる形質転換
Ｃ．ディフィシルの大腸菌接合伝達による形質転換を、本質的にHeap et al., Journal of Microbiological Methods, 2009. 78(1): p. 79-85において記述されているように行った。大腸菌宿主ＣＡ４３４を、野生型または様々な変異体毒素遺伝子をコードするｐＭＴＬ８４１２１ｆｄｘを用いて形質転換した。大腸菌宿主ＣＡ４３４は、発現プラスミドをＣ．ディフィシル産生株ＶＰＩ１１１８６ｓｐｏ０Ａ１中に移動させるための中間体である。ＣＡ４３４は大腸菌ＨＢ１０１の派生株である。この株はＴｒａ＋Ｍｏｂ＋Ｒ７０２接合性プラスミドを有し、それはＫｍ、Ｔｃ、Ｓｕ、Ｓｍ／Ｓｐｅ、およびＨｇ（Ｔｎ１８３１による）に対する耐性を与える。化学的コンピテントまたはエレクトロコンピテント細胞ＣＡ４３４細胞を調製し、発現ベクター形質転換体をＭｉｌｌｅｒのＬＢＣＡＭプレート上で３０℃において選択した。３日後に見えてくる増殖の遅いコロニーを選んで３ｍＬＬＢクロラムフェニコール培養において対数期中期まで増殖させた（３０℃において約２４時間、２２５ｒｐｍ、オービタルシェーカー）。壊れた線毛を避けるために大腸菌培養物を低速（５，０００ｇ）遠心分離により回収し、細胞のペレットを１ｍＬＰＢＳ中で大孔径のホールピペットを用いて穏やかに再懸濁した。細胞を低速遠心分離により濃縮した。逆さにしてＰＢＳの大部分を除去し、排水した（ｄｒａｉｎｅｄ）ペレットを嫌気室中に移して０．２ｍＬのＣ．ディフィシル培養物と共に再懸濁し、ＢＨＩＳ寒天プレート上にスポットし、８時間または一夜増殖させた。変異体毒素Ａ形質転換体の場合、一夜の接合でよりよい結果が達成された。細胞のパッチを０．５ｍＬのＰＢＳ中にかき集め、０．１ｍＬを大腸菌供与細胞を殺すために１５μｇ／ｍＬチアンフェニコール（クロラムフェニコールのより強力な類似体）およびＤ−サイクロセリン／セホキシチンを補ったＢＨＩＳ選択培地上に蒔いた。１６〜２４時間後に見えてきた形質転換体を、新しい（補助物質を加えた）ＢＨＩＳプレート上に再度画線することにより純化し、その後の培養物を組み換え毒素または変異体毒素の発現に関して試験した。優れた発現を示しているクローンからグリセロールパーマネント（Ｇｌｙｃｅｒｏｌｐｅｒｍａｎｅｎｔｓ）およびシードストック（ｓｅｅｄｓｔｏｃｋｓ）を調製した。また、２ｍＬの培養液からプラスミドのミニプレップを、細胞をリゾチームにより前処理する（必須ではない）改変されたＱｉａｇｅｎキットの手順を用いて調製した。そのＣ．ディフィシルミニプレップＤＮＡを、クローンの完全性を確かめるためのＰＣＲ配列決定のための鋳型として用いた。あるいは、プラスミドミニプレップＤＮＡを大腸菌Ｓｔｂｌ２（商標）形質転換体から調製し、配列決定した。

実施例１１：毒素ＡおよびＢの三重変異体（それぞれＳＥＱＩＤＮＯ：４および６）および七重Ｂ変異体（ＳＥＱＩＤＮＯ：８）のＣ．ディフィシル発現分析
形質転換体を２ｍＬ培養（型にはまった分析のため）で、または通気穴に蓋をしたフラスコ中（時間経過実験のため）でのどちらかで増殖させた。試料（２ｍＬ）を短時間遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０秒間）して細胞を濃縮し：上清をデカントして１０倍濃縮し（Ａｍｉｃｏｎ−ｕｌｔｒａ３０ｋ）；ペレットを排水して−８０℃で凍結させた。細胞のペレットを氷上で解かし、１ｍＬの溶解緩衝液（トリス−ＨＣｌｐＨ７．５；１ｍＭＥＤＴＡ、１５％グリセロール）中で再懸濁し、超音波処理（微小チップを用いた１×２０秒のバースト（ｂｕｒｓｔ））した。その溶解物を４℃で遠心分離し、上清を５倍濃縮した。上清および溶解物の試料を試料緩衝液と合わせて熱処理（１０分間、８０℃）した後、２通りの（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）３〜８％トリス−酢酸ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に装填した（ｌｏａｄｉｎｇ）。１枚のゲルをクーマシーで染色し、２枚目のゲルをウェスタン分析のためにエレクトロブロットした。毒素Ａ特異的および毒素Ｂ特異的ウサギ抗血清（Ｆｉｔｇｅｒａｌｄ；Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ）を用いて変異体毒素ＡおよびＢの変種を検出した。七重変異体毒素Ｂ（ＳＥＱＩＤＮＯ：８）の発現も、ウェスタンブロットハイブリダイゼーションにより確認した。

実施例１２：変異体毒素のグルコシルトランスフェラーゼ活性の抑止
遺伝子二重変異体（ＤＭ）毒素ＡおよびＢ（それぞれＳＥＱＩＤＮＯ：３および５）および三重変異体（ＴＭ）毒素ＡおよびＢ（それぞれＳＥＱＩＤＮＯ：４および６）は、ＵＤＰ−^１４Ｃ−グルコース［３０μＭ］、５０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２、１００ｍＭＫＣｌ、４ｍＭＭｇＣｌ_２、２ｍＭＭｎＣｌ_２、１ｍＭＤＴＴ、および０．１μｇ／μＬＢＳＡの存在下でのインビトログルコシル化アッセイにおいて、^１４Ｃ−グルコースを１０μｇのＲｈｏＡ、Ｒａｃ１およびＣｄｃ４２ＧＴＰアーゼに移さなかった。しかし、野生型ＡおよびＢ毒素対照（それぞれＳＥＱＩＤＮＯ：１および２を有する）は、それぞれ１０および１ｎｇの低い用量（およびより低い用量、データは示していない）において（図４Ａおよび４Ｂ）、１００μｇの変異体毒素の存在下においてさえも（図４Ｂ）、^１４Ｃ−グルコースをＧＴＰアーゼに効率的に移し、これはそれぞれの野生型毒素と比較して少なくとも１００，０００倍の低減を示している。類似の結果がＣｄｃ４２ＧＴＰアーゼに関して検出された（データは示していない）。

具体的には、図４Ｂにおいて、野生型毒素Ａおよび毒素Ｂ（１ｎｇ）または三重変異体毒素Ａおよび三重変異体毒素Ｂ（１００μｇ）をＵＤＰ−^１４Ｃ−グルコースの存在下でＲｈｏＡＧＴＰアーゼと共に３０℃で２時間保温した。説明したように、１ｎｇの野生型ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢは^１４Ｃ−グルコースをＲｈｏＡに移したが、１００μｇの三重変異体毒素Ａおよび三重変異体毒素Ｂは移さなかった。１ｎｇの野生型ＴｃｄＡまたはＴｃｄＢをそれぞれ１００μｇの三重変異体毒素Ａまたは三重変異体毒素Ｂによる反応中に添加した場合、ＲｈｏＡのグルコシル化が検出され、これはグルコシル化阻害剤がないことを示している。グルコシル化活性に関する検出の感度は、１００μｇの変異体毒素のバックグラウンド中の１ｎｇの野生型毒素（１：１００，０００の比率）であることが確かめられた。その結果は、三重変異体毒素Ａおよび三重変異体毒素Ｂ中のグルコシルトランスフェラーゼの活性部位における変異があらゆる測定可能なグルコシルトランスフェラーゼ活性を低減した（それぞれの野生型毒素の活性と比較して１００，０００倍低い活性よりも低い）ことを示している。グルコシル化されたＧＴＰアーゼのＴＣＡ沈殿によりグルコシルトランスフェラーゼ活性を定量化するための類似のアッセイも開発した。

実施例１３：自己触媒的システインプロテアーゼ活性の抑止
自己触媒的切断の機能は、三重遺伝子変異体ＡおよびＢ（ＴＭ）（それぞれＳＥＱＩＤＮＯ：４および６）において、そのシステインプロテアーゼ切断部位を変異させた場合、抑止された。図５において図説されているように、野生型（ｗｔ）毒素ＡおよびＢ（それぞれＳＥＱＩＤＮＯ：３および５）はイノシトール−６−リン酸の存在下で切断される。二重変異体毒素ＡおよびＢ（それぞれＳＥＱＩＤＮＯ：３および５）も、野生型に関する切断と同様に、イノシトール−６−リン酸の存在下で切断される（データは示していない）。毒素Ａ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）は３０８ｋＤａから２４５および６０ｋＤａの２個の断片へと切断される。毒素Ｂ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）は２７０ｋＤａから２０７および６３ｋＤａの２個の断片へと切断される。三重変異体毒素ＡおよびＢ（ＴＭ）（それぞれＳＥＱＩＤＮＯ：４および６）は、イノシトール−６−リン酸の存在下においてさえも、それぞれ３０８および２０７ｋＤａにおいて影響を受けないままである。図５参照。従って、そのシステインプロテアーゼ活性は遺伝子改変により不活性化された。

より具体的には、図５において、１μｇの三重変異体Ａおよび三重変異体Ｂを、ＬｉｓｔＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓからの野生型ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢと並行して室温（２１±５℃）で９０分間保温した。その切断反応は、２０μＬの量で、トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２ｍＭＤＴＴ中で、イノシトール−６−リン酸（ＴｃｄＡに関して１０ｍＭおよびＴｃｄＢに関して０．１ｍＭ）の存在下または非存在下で実施された。次いで全反応量を３〜８％ＳＤＳ／ＰＡＧＥ上に装填し；タンパク質のバンドを銀染色により可視化した。説明したように、ｗｔＴｃｄＡおよびＴｃｄＢはイノシトール−６−リン酸の存在下で切断されてそれぞれ２４５ｋＤおよび６０ｋＤならびに２０７ｋＤおよび６３ｋＤの２個のタンパク質のバンドになった。三重変異体毒素Ａおよび三重変異体毒素Ｂは切断されず、従って三重変異体毒素ＡにおけるＣ７００Ａ変異および三重変異体毒素ＢにおけるＣ６９８Ａ変異は切断を妨げることが確認された。

実施例１４：三重変異体毒素ＡおよびＢ（それぞれＳＥＱＩＤＮＯ：４および６）の残存する細胞毒性
その遺伝子変異体毒素を、ヒト二倍体肺線維芽細胞株であるＩＭＲ９０細胞におけるインビトロ細胞毒性アッセイによりそれらの細胞毒性に関して評価した。これらの細胞は毒素ＡおよびＢの両方に対して感受性である。代わりの好ましい態様として、ミドリザル（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓａｅｔｈｉｏｐｓ）からのベロ正常腎臓細胞を、それらは毒素ＡおよびＢに対する適度な感受性を有することが観察されたため、その細胞毒性アッセイにおいて用いることができる。好ましくは、ＨＴ−２９ヒト結腸直腸腺癌細胞は、それらはその毒素に対してベロおよびＩＭＲ９０細胞株と比較して著しく減少した感受性を示したため、その細胞毒性アッセイにおいて用いられない。例えば下記の表６を参照。

系列希釈した遺伝子変異体毒素またはｗｔ毒素の試料を、９６ウェル組織培養プレート中で増殖した細胞単層に添加した。３７℃で７２時間保温した後、そのプレートを、相対発光単位（ＲＬＵ）として表される発光を生じる、ルシフェラーゼに基づくＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）の添加により細胞のＡＴＰレベルを測定することにより、代謝的に活性な細胞に関して評価した。高いＲＬＵはその細胞が生存可能であることを示し、低いＲＬＵはその細胞が代謝的に活性ではなく瀕死であることを示す。ＥＣ_５０として表される細胞毒性のレベルは、細胞培養対照におけるレベルと比較してＲＬＵにおける５０％の低減を引き出すｗｔ毒素または遺伝子変異体毒素の量として定義される（このアッセイの詳細を下記で提供する）。図６、表７Ａ、および表８Ａにおいて示されるように、ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢのＥＣ_５０値はそれぞれ約０．９２ｎｇ／ｍＬおよび０．００９ｎｇ／ｍＬであった。三重変異体毒素Ａおよび三重変異体毒素ＢのＥＣ_５０値はそれぞれ約８６００ｎｇ／ｍＬおよび７４ｎｇ／ｍＬであった。ｗｔ毒素と比較した細胞毒性におけるおおよそ１０，０００倍の低減にも関わらず、両方の遺伝子変異体毒素はなお細胞毒性の低い残存レベルを示した。この残存する細胞毒性は中和性抗毒素モノクローナル抗体により遮断することができ、これは、それはその三重変異体毒素に特異的であるがそのｗｔ毒素の既知の酵素活性（グルコシル化または自己タンパク質分解）にはおそらく関連していないことを示している。

両方のｗｔ毒素は強力なインビトロでの細胞毒性を示し、少量のその毒素は哺乳類細胞に対して例えば細胞の円形化（細胞変性作用またはＣＰＥ）および（ＡＴＰレベルにより測定されるような）代謝活性の欠如のような様々な作用を引き起こすのに十分である。従って、その変異体毒素原薬（ｄｒｕｇｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ）中に残存する細胞毒性が残っていないことを確かめるために、２種類のインビトロアッセイ（ＣＰＥまたは細胞円形化アッセイおよびＡＴＰアッセイ）が開発された。その結果はＥＣ_５０として表され、それは１）その細胞の５０％のＣＰＥの発現、または２）相対光単位として測定されるようなＡＴＰレベルにおける５０％の低減を引き起こす毒素または変異体毒素の量である。

ＣＰＥアッセイにおいて、試料または原薬を系列希釈し、ＩＭＲ９０細胞と共に保温し、それを可能性のある細胞変性作用に関して観察する。そのＣＰＥアッセイは、０（正常な細胞）〜４（約１００％の細胞が円形化している）の尺度上で採点され、２の点数（約５０％の細胞が円形化している）がその試験試料のＥＣ_５０値として定義される。この方法は１０００μｇ／ｍＬの濃度での変異体毒素原薬の試験のために用いられ、それはこのアッセイにおいてマトリックス干渉（ｍａｔｒｉｘｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）なしで試験することができる最大許容可能濃度である。従って、検出可能な細胞毒性がない場合はＥＣ_５０＞１０００μｇ／ｍＬとして報告される。

ＡＴＰアッセイはＡＴＰから生成される発光シグナルの量の測定に基づき、それは代謝的に活性な細胞の数に比例する。このアッセイにおいてアッセイ干渉なしで試験することができる最大許容可能濃度は、約２００μｇ／ｍＬである。従って、このアッセイにおいて検出可能な細胞毒性がない場合はＥＣ_５０＞２００μｇ／ｍＬとして報告される。

異なる濃度の変異体毒素ＡおよびＢを、毒素対照と並行して細胞に添加した。そのアッセイのエンドポイントは、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いる細胞ＡＴＰレベルにより決定される細胞生存度であった。発光の程度はＡＴＰレベルまたは生存可能な細胞の数に比例している。

野生型（ｗｔ）毒素Ａのインビトロ細胞毒性（ＥＣ_５０）は９２０ｐｇ／ｍＬであり、毒素Ｂに関しては９ｐｇ／ｍＬであった。変異体毒素Ａ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）のインビトロ細胞毒性（ＥＣ_５０）は８６００ｎｇ／ｍＬであり、変異体毒素Ｂ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）に関しては７４ｎｇ／ｍＬであった。これらの値はそれぞれ９３４８および８２２２倍の低減を表しているが、両方の変異体毒素において残存する細胞毒性が検出された。

言い換えると、三重変異体毒素ＡおよびＢ（それぞれＳＥＱＩＤＮＯ：４および６）の細胞毒性はＩＭＲ−９０細胞におけるインビトロ細胞毒性アッセイにおいてｗｔ毒素ＡおよびＢ（それぞれＳＥＱＩＤＮＯ：１および２）と比較して著しく低減した。図６において図説されるように、両方の三重変異体毒素はｗｔ毒素と比較して細胞毒性における著しい低減（１０^４倍）を示したが、両方の三重変異体毒素のより高い濃度において残存する細胞毒性が観察された。

さらに、それぞれの三重変異体毒素の残存する細胞毒性は、その毒素に特異的な抗体により完全に中和することができた（例えば、野生型毒素の毒性と比較して、毒性における少なくとも６〜８ｌｏｇ_１０の低減）。下記の実施例１６を参照。

細胞培養アッセイは、細胞毒性の検出に関してインビボの動物モデルよりも高感度である。マウス致死負荷モデルにおいて腹腔内または静脈内経路のどちらかにより送達された際、ｗｔＴｃｄＡはマウスあたり約５０ｎｇのＬＤ_５０を有し、一方でｗｔＴｃｄＢはより強力でマウスあたり約５ｎｇのＬＤ_５０を有する。対照的に、上記で記述された細胞培養に基づくインビトロアッセイは、ｗｔＴｃｄＡに関してウェルあたり１００ｐｇおよびｗｔＴｃｄＢに関してウェルあたり２ｐｇのＥＣ_５０値を有する。

実施例１５：遺伝子七重変異体毒素Ｂ（ＳＥＱＩＤＮＯ：８）の残存する細胞毒性
図７で図説されるように、ＥＣ_５０値は三重変異体毒素Ｂ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）（２０．７８ｎｇ／ｍＬ）および七重変異体毒素Ｂ（ＳＥＱＩＤＮＯ：８）（３５．９ｎｇ／ｍＬ）変異体に関して類似しており、これはそのグルコシルトランスフェラーゼ活性部位およびＧＴＰアーゼ基質結合部位をさらに改変するための４個の追加の変異はその遺伝子変異体毒素の細胞毒性をそれ以上低減しなかったことを示している。そのＥＣ_５０値は、二重変異体毒素Ｂ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）に関しても三重および七重変異体毒素に関するＥＣ_５０値と類似していた（データは示していない）。この観察は、その変異体毒素の細胞毒性に関する機序は驚くべきことにグルコシルトランスフェラーゼおよび基質認識機序と無関係であることを示唆している。

実施例１６：三重変異体毒素ＡおよびＢ（それぞれＳＥＱＩＤＮＯ：４および６）の残存する細胞毒性
その残存する細胞毒性の性質をさらに評価するため、その変異体毒素（ＳＥＱＩＤＮＯ：４および６）をそれらのそれぞれの中和抗体と混合して保温した後、その混合物をＩＭＲ９０細胞の単層に添加した。

その結果（図８）は、変異体毒素ＡおよびＢ（それぞれＳＥＱＩＤＮＯ：４および６）の残存する細胞毒性は変異体毒素Ａ（上のパネル、図８）および変異体毒素Ｂ（下のパネル、図８）に特異的な中和抗体を用いて完全に抑止され得ることを示した。増大する濃度の変異体毒素Ａ（上のパネル）およびＢ（下のパネル）を、ウサギ抗毒素ポリクローナル（ｐＡｂ、１：１０希釈）またはマウスモノクローナル抗体（３．０ｍｇＩｇＧ／ｍＬを含有するストックから１：５０希釈）と共に保温した後、ＩＭＲ９０細胞に添加した。ＩＭＲ９０細胞との３７℃における７２時間の処理（保温）後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）基質を添加し、相対光単位（ＲＬＵ）を分光光度計においてＡＴＰレベルを測定するための発光プログラムを用いて測定した。ＡＴＰレベルがより低いほど、毒性がより高い。対照にはそれらの対応するＥＣ_５０値の４倍で添加されたＴｃｄＡおよびＴｃｄＢが含まれていた。

公開された報告は、その毒素のグルコシルトランスフェラーゼまたは自己触媒的プロテアーゼドメインにおける変異は結果としてその毒性の完全な不活性化をもたらすことを示唆している。しかし、我々のデータはこれらの公開された報告とは一致せず、これは公開された報告における粗製の培養物の溶解物に対して我々の研究で試験された高度に精製された変異体毒素の増大した濃度；１２時間未満でなされた観察に対して変異体毒素で処理した細胞の細胞円形化が観察された時点の増大（例えば２４時間、４８時間、７２時間、または９６時間）；公開された報告で開示された細胞毒性アッセイにおけるＨＴ−２９ヒト結腸直腸腺癌細胞に対して、本細胞毒性アッセイにおける毒素に対して著しく高い感受性を示す細胞株の使用；および／またはその変異体毒素の残存する毒性を駆動している可能性のあるグルコシル化以外の未知の活性もしくはプロセスに起因する可能性がある。

実施例１７：遺伝子変異体毒素の細胞毒性の新規の機序
遺伝子変異体毒素の残存する細胞毒性の機序を調べるため、ＩＭＲ−９０細胞をｗｔ毒素Ｂ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）または遺伝子変異体毒素Ｂ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）で処理し、Ｒａｃ１ＧＴＰアーゼのグルコシル化を処理の時間で試験した。試料を２４時間から９６時間までにおいて収集し、細胞抽出物を調製した。グルコシル化されたＲａｃ１をグルコシル化されていないＲａｃ１から、Ｒａｃ１に対する２種類の抗体を用いたウェスタンブロットにより識別する。一方の抗体はＲａｃ１の両方の形態を認識し（２３Ａ８）、他方（１０２）はグルコシル化されていないＲａｃ１のみを認識する。図２２で図説されるように、毒素Ｂに関して、総Ｒａｃ１レベルは時間が経過しても変化しないままであり、Ｒａｃ１の大部分はグルコシル化されていた。一方で遺伝子変異体毒素Ｂ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）を用いた処理は結果として総Ｒａｃ１の有意な低減をもたらしたが、そのＲａｃ１は全ての時点においてグルコシル化されていなかった。これは、Ｒａｃ１レベルは遺伝子変異体毒素を用いた処理により負の影響を受けるが、ｗｔ毒素によっては影響を受けないことを示している。図２２で図説されるように、アクチンのレベルは示した時点において毒素および遺伝子変異体毒素Ｂで処理した細胞において類似しており、モック処理した細胞と類似していた。これは、その遺伝子変異体毒素は野生型毒素に駆動されるグルコシル化経路とは異なる機序により細胞毒性を発揮することを示した。

実施例１８：遺伝子変異体毒素の化学的処理
細胞毒性活性において４ｌｏｇの低減を示した遺伝学的に改変された変異体毒素は好ましいが、細胞毒性におけるさらなる低減（２〜４ｌｏｇ）が考えられた。２つの化学的不活性化計画が評価されてきた。

第１の方法は、その変異体毒素を不活性化するためにホルムアルデヒドおよびグリシンを用いる。ホルムアルデヒドでの不活性化は、ホルムアルデヒドおよびそのタンパク質上の第１級アミンの間でシッフ塩基（イミン）を形成することにより起こる。次いでそのシッフ塩基はいくつかのアミノ酸残基（Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ）と反応して分子内架橋または分子間架橋のどちらかを形成することができる。この架橋はそのタンパク質の構造を固定させてそれを不活性にする。加えて、ホルムアルデヒドはグリシンと反応してシッフ塩基を形成することができる。次いでそのグリシルシッフ塩基はアミノ酸残基と反応して分子間タンパク質−グリシン架橋を形成することができる。ホルムアルデヒドは、その遺伝子変異体毒素の細胞毒性活性を検出可能な限界より下まで低減した（細胞毒性における低減は、三重変異体Ｂ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）に関して８ｌｏｇ_１０より大きく、三重変異体Ａ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）に関して６ｌｏｇ_１０より大きい）。しかし、そのホルムアルデヒドで不活性化された（ＦＩ）三重変異体毒素を２５℃で保温した際に、時間の経過に伴い復帰が観察された。その細胞毒性の復帰は、低量のホルムアルデヒド（０．０１〜０．０２％）をＦＩ−三重変異体毒素の保管溶液中に添加することにより防ぐことができる。実施例２３参照。

別の方法は、不活性化された変異体毒素を生成するために１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）処理を用いる。この方法において、ＥＤＣ／ＮＨＳはタンパク質上のカルボキシル基と反応して活性化されたエステルを形成する。次いでその活性化されたエステルはそのタンパク質上の第１級アミンと反応して安定なアミド結合を形成することができる。ホルムアルデヒド反応と同様に、この反応は結果として分子内および分子間架橋をもたらす。ＥＤＣ／ＮＨＳを用いた処理により形成されたアミド結合は、ホルマリン不活性化により形成された不安定なイミン結合よりも安定であり、不可逆的である。活性化されたエステルのそのポリペプチド上の第１級アミンとの反応により形成される架橋に加えて、グリシンおよびベータ−アラニン付加物の両方が形成され得る。機序または理論により束縛されるわけではないが、グリシンが未反応の活性化されたエステルを失活させるために添加される際、グリシン付加物が生成される。グリシンのアミンがそのポリペプチド上の活性化されたエステルと反応して安定なアミド結合を形成する。機序または理論により束縛されるわけではないが、ベータ−アラニン付加物は活性化されたベータ−アラニンのそのポリペプチド上の第１級アミンとの反応により形成される。この反応は、結果として安定なアミド結合をもたらす。活性化されたベータ−アラニンは、３モルのＮＨＳの１モルのＥＤＣとの反応により生成される。

細胞毒性活性の遺伝学的に改変された変異体毒素と比較して２〜４ｌｏｇ（天然の毒素と比較して６〜８ｌｏｇ）の低減を達成するため、その化学的に不活性化された変異体毒素は１０００μｇ／ｍＬ以上のＥＣ_５０値を有するべきである。細胞毒性活性における低減に加えて、ドットブロット分析により決定されるような重要なエピトープを保持することは好都合であろう。現在までに、細胞毒性の低減およびエピトープ認識基準の両方を満たすいくつかの反応条件が同定されている。数バッチの不活性化された変異体毒素が動物試験のために調製されており、少数の代表的なバッチからの分析データを表７Ａおよび７Ｂ、表８Ａおよび８Ｂにおいて示す。

実施例１９：精製
発酵の終了時に、発酵槽を冷却する。細胞のスラリーを連続遠心分離により回収し、適切な緩衝液中で再懸濁する。細胞懸濁液の溶解は高圧ホモジナイゼーションにより達成される。変異体毒素Ａに関して、そのホモジネートを凝集させ（ｆｌｏｃｃｕｌａｔｅｄ）、その凝集した溶液に対して連続遠心分離を行う。この溶液を濾過し、次いで下流の処理のために移す。変異体毒素Ｂに関して、そのホモジネートを連続遠心分離により透明にし、次いで下流の処理のために移す。

変異体毒素Ａ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）を２つのクロマトグラフィー工程を用いて精製し、続いて最終緩衝液交換を行う。その透明になった溶解液を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラム上に装填し、結合した変異体毒素をクエン酸ナトリウム勾配を用いて溶離する。次いでそのＨＩＣカラムからの生成物のプールを陽イオン交換（ＣＥＸ）カラム上にロードし、結合した変異体毒素Ａを塩化ナトリウム勾配を用いて溶離する。精製された変異体毒素Ａを含有するＣＥＸのプールを、透析濾過により最終緩衝液中に交換する（ｅｘｃｈａｎｇｅｄｉｎｔｏ）。その精製された変異体毒素Ａを、透析濾過により最終原薬中間緩衝液中に交換する。透析濾過の後、保持液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を０．２ミクロンフィルターを通して濾過した後、化学的に不活性化して最終的な原薬とする。そのタンパク質濃度は１〜３ｍｇ／ｍＬを目標とする。

変異体毒素Ｂ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）を２つのクロマトグラフィー工程を用いて精製し、続いて最終緩衝液交換を行う。その透明になった溶解液を陰イオン交換（ＡＥＸ）カラム上に装填し、結合した変異体毒素を塩化ナトリウム勾配を用いて溶離する。ＡＥＸカラムからの生成物のプールにクエン酸ナトリウムを添加し、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラム上に装填する。結合した変異体毒素をクエン酸ナトリウム勾配を用いて溶離する。精製された変異体毒素ポリペプチド（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）を含有するＨＩＣのプールを、透析濾過により最終緩衝液中に交換する。その精製された変異体毒素Ｂを、透析濾過により最終原薬中間緩衝液中に交換する。透析濾過の後、保持液を０．２ミクロンフィルターを通して濾過した後、化学的に不活性化して最終的な原薬とする。そのタンパク質濃度は１〜３ｍｇ／ｍＬを目標とする。

実施例２０：ホルムアルデヒド／グリシン不活性化
精製後、その遺伝子変異体毒素ＡおよびＢ（それぞれＳＥＱＩＤＮＯ：４および６）を４０ｍＭ（１．２ｍｇ／ｍｌ）のホルムアルデヒドを用いて２５℃で４８時間不活性化する。その不活性化は、４０ｍＭ（３ｍｇ／ｍｌ）グリシンを含有する１０ｍＭホスフェート、１５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液中でｐＨ７．０±０．５で実施される。その不活性化の期間は、ＩＭＲ９０細胞でのＥＣ_５０における１０００ｕｇ／ｍＬより大きい濃度までの低減に必要な期間の３倍を超えるように設定される。４８時間後、その生物学的活性は天然の毒素と比較して７〜８ｌｏｇ_１０低減される。４８時間の保温の後、その不活性化された変異体毒素を透析濾過により最終原薬緩衝液中に交換する。例えば、１００ｋＤ再生セルロースアセテート限外濾過カセットを用いて、その不活性化された毒素を１〜２ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、緩衝液交換する。

実施例２１：Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）不活性化
精製後、その遺伝子変異体毒素（ＳＥＱＩＤＮＯ：４およびＳＥＱＩＤＮＯ：６）を、１ｍｇの精製された遺伝子変異体毒素ＡおよびＢ（それぞれおおよそ２．６ｍＭおよび４．４ｍＭ）あたり０．５ｍｇのＥＤＣおよび０．５ｍｇのＮＨＳを用いて２５℃で２時間不活性化する。その反応を１００ｍＭの終濃度までのグリシンの添加により停止し、反応物を２５℃でさらに２時間保温する。その不活性化は、１０ｍＭホスフェート、１５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液中でｐＨ７．０±０．５で実施される。その不活性化の期間は、ＩＭＲ９０細胞でのＥＣ_５０における１０００ｕｇ／ｍＬより大きい濃度までの低減に必要な期間の３倍を超えるように設定される。２時間後、その生物学的活性は天然の毒素と比較して７〜８ｌｏｇ_１０低減される。４時間の保温の後、その不活性化された変異体毒素を透析濾過により最終原薬緩衝液中に交換する。例えば、１００ｋＤ再生セルロースアセテート限外濾過カセットを用いて、その不活性化された毒素を１〜２ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、緩衝液交換する。

別途記載しない限り、以下の用語は、実施例の節において用いられる際、実施例２１における本記述に従って生成された組成物を指す：“ＥＤＣ／ＮＨＳで処理された三重変異体”；“ＥＤＣで不活性化された変異体毒素”；“変異体毒素［Ａ／Ｂ］原薬”；“ＥＩ−変異体毒素”；“ＥＤＣ／ＮＨＳ−三重変異体毒素”。例えば、以下の用語は同義である：“ＥＤＣ／ＮＨＳで処理された三重変異体毒素Ａ”；“ＥＤＣで不活性化された変異体毒素Ａ”；“変異体毒素Ａ原薬”；“ＥＩ−変異体毒素Ａ”；“ＥＤＣ／ＮＨＳ−三重変異体毒素Ａ”。別の例として、以下の用語は同義である：“ＥＤＣ／ＮＨＳで処理された三重変異体毒素Ｂ”；“ＥＤＣで不活性化された変異体毒素Ｂ”；“変異体毒素Ｂ原薬”；“ＥＩ−変異体毒素Ｂ”；“ＥＤＣ／ＮＨＳ−三重変異体毒素Ｂ”。

変異体毒素Ａ原薬および変異体毒素Ｂ原薬は、それぞれバッチプロセスを用いて製造され、それには以下の工程が含まれる：（１）それぞれの遺伝子三重変異体毒素ポリペプチドをコードするプラスミドを含有する毒素陰性Ｃ．ディフィシル株（ＶＰＩ１１１８６）の（大豆加水分解物、酵母抽出物ＨＴＹＥＳＴ（商標）４１２（ＳｈｅｆｆｉｅｌｄＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、グルコース、およびチアンフェニコール中での）発酵、（２）その遺伝子変異体毒素（“原薬中間体”）の、無細胞溶解物からの、イオン交換および疎水性相互作用クロマトグラフィー手順を用いた、少なくとも９５％より大きい純度までの精製、（３）ＥＤＣ／ＮＨＳを用いた処理、続いてグリシンを用いた失活／キャッピングによる化学的不活性化、ならびに（４）最終緩衝液マトリックス中への交換。

実施例２２：不活性化および配合の条件を支持する研究
遺伝子変異体毒素の化学的不活性化を最適化するため、統計学的実験計画（ＤＯＥ）を実施した。ＤＯＥにおいて調べられた要素には、温度、ホルムアルデヒド／グリシンの濃度、ＥＤＣ／ＮＨＳの濃度および時間が含まれていた（表９および１０）。生物学的活性の喪失を監視するため、ＩＭＲ９０細胞におけるＥＣ_５０値を決定した。加えて、処理後の様々な時点におけるＩＭＲ−９０細胞の細胞形態も観察した。処理後７２時間における形態を示す図９を参照。タンパク質構造への作用を決定するため、その毒素の異なるドメインに対して産生させたモノクローナル抗体の一団（ｐａｎｅｌ）を用いるドットブロット分析を用いてエピトープ認識を監視した。

Ｃ．ディフィシル変異体毒素のホルムアルデヒド／グリシン不活性化において、最終的な反応条件は、細胞毒性活性における所望のレベルの低減（７〜８ｌｏｇ_１０）が達成される一方でエピトープ認識を最大化するように選択された。上記の実施例２０を参照。

Ｃ．ディフィシル変異体毒素のＥＤＣ／ＮＨＳ不活性化において、最終的な反応条件は、細胞毒性活性における所望のレベルの低減（７〜８ｌｏｇ_１０）が達成される一方でエピトープ認識を最大化するように選択された。上記の実施例２１を参照。

代わりの態様において、そのＥＤＣ−ＮＨＳ反応はアラニンの添加により停止され、それはその反応を十分に停止する。アラニンの使用は結果として、その反応をグリシンにより停止した場合の修飾に類似した変異体毒素タンパク質上の修飾をもたらし得る。例えば、アラニンを添加することによる停止は、結果としてその変異体毒素のグルタミン酸および／またはアスパラギン酸残基の側鎖上のアラニン部分をもたらす可能性がある。別の代わりの態様において、そのＥＤＣ−ＮＨＳ反応はグリシンメチルエステルの添加により停止され、それはその反応を十分に停止する。

最適な条件下での化学的に不活性な三重変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ａおよび毒素Ｂの生成は、結果として残存する細胞毒性の検出不能なレベル（＞１０００μｇ／ｍＬ−ＣＰＥアッセイにより試験される最も高い濃度）までのさらなる低減をもたらしたが、毒素特異的中和抗体へのそれらの反応性により測定されるように、抗原性を維持している。表２８において示される結果は、ｗｔ毒素からＥＤＣ／ＮＨＳで処理された三重変異体毒素まで通した細胞毒性における段階的な低減を実証している。免疫蛍光標識は三重変異体毒素（ＳＥＱＩＤＮＯ：４および６）および変異体毒素原薬がＩＭＲ−９０細胞に対する比較可能な結合を示すことを確証し、これはその細胞毒性の喪失がその細胞への低減した結合によるものではなかったことを示唆している（データは示していない）。変異体毒素Ａ原薬と比較して、変異体毒素Ｂ原薬は細胞毒性においてより高い倍率の低減を達成し、それは観察されたＴｃｄＡと比較したＴｃｄＢの約６００倍高い作用強度と一致している。

ＥＤＣのみにより、またはＥＤＣおよびスルホ−ＮＨＳにより修飾された変異体毒素Ｂに関する細胞毒性アッセイの結果も評価した。表２９参照。

条件：三重変異体毒素Ｂ（“ＴＭＴｃｄＢ”）（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）を、変異体毒素Ｂ：ＥＤＣ：スルホ−ＮＨＳ＝１：０．５：０．９４の重量比で修飾した。この比率は、実施例２１で記述されたような標準的なＥＤＣ／ＮＨＳ反応とモル的に均等である（スルホ−ＮＨＳのより高いＭＷに関して補正した）。スルホ−ＮＨＳの作用を決定するため、そのスルホ−ＮＨＳの比率を標準的な比率の０．５倍から２倍まで変動させた。１×ＰＢＳｐＨ７．０中で２５℃において２通りの反応を実施し、ＥＤＣ溶液の添加により開始した。２時間後、反応を１ＭグリシンｐＨ７．０（終濃度０．１Ｍ）の添加により停止し、さらに２時間保温した。停止した反応物を脱塩し、変異体毒素Ｂ原薬（“ＴＭＴｃｄＢ−ＥＤＣ”）をＶｉｖａｓｐｉｎ２０装置を用いて濃縮し、無菌のバイアル中に濾過滅菌し、それを用いて細胞毒性アッセイにおける評価を行った。

同じモル比において、スルホ−ＮＨＳはＥＣ_５０をＮＨＳに関する＞１０００ｕｇ／ｍＬと比較して約２５０ｕｇ／ｍＬまで低減した。２倍のモル比においてさえも、スルホ−ＮＨＳは細胞毒性の低下においてＮＨＳほど有効ではないようであった。表３０参照。

修飾の数およびタイプを決定するため、ＥＤＣ／ＮＨＳおよびＥＤＣ／スルホ−ＮＨＳで不活性化された三重変異体毒素Ｂ試料の両方に対してペプチドマッピングを実施した。両方の試料において類似の量のグリシン付加物、架橋およびデヒドロアラニン修飾が観察された。しかし、スルホ−ＮＨＳ試料ではベータ−アラニンは観察されなかった。

野生型毒素Ｂ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）を、標準的なプロトコル（実施例２１参照）を用いて不活性化し；毒素Ｂ：ＥＤＣ：ＮＨＳ１：０．５：０．５、１×ＰＢＳｐＨ７．０中で２５℃において２時間、次いで１Ｍグリシン（終濃度０．１Ｍ）により停止し、さらに２時間保温した。その試料を脱塩し、濃縮し、それを用いて細胞毒性アッセイを行った。この試料に関するＥＣ_５０は２４４ｎｇ／ｍＬ未満であった。

実施例２３：復帰試験
ホルムアルデヒド／グリシンまたはＥＤＣ／ＮＨＳで不活性化されたＣ．ディフィシル変異体毒素のどちらかに関して復帰が起こるかどうかを決定するため、不活性化された変異体毒素の試料（１ｍｇ／ｍＬ）を２５℃で５〜６週間保温した。分割量（Ａｌｉｑｕｏｔｓ）を毎週取り出し、ＩＭＲ９０細胞におけるＥＣ_５０値を決定した。１つのホルムアルデヒド／グリシンで不活性化された試料はホルムアルデヒドを含有せず、１つの試料は０．０１％ホルムアルデヒドを含有していた。ＥＣ_５０をＣＰＥアッセイにより測定した。

２５℃において、残留するホルムアルデヒドの非存在下では、部分的な復帰が観察される（表１１）。５週間後、その細胞毒性活性はおおよそ３倍まで増大した。その細胞毒性活性は増大したが、５週間後、なお天然の毒素と比較して７ｌｏｇ_１０の低減があった。復帰はホルマリンを０．０１０％の濃度で含ませることにより完全に防がれた。ＥＤＣ／ＮＨＳで不活性化された試料では復帰は観察されなかった。ＥＤＣ／ＮＨＳで処理された三重変異体毒素Ａ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）およびＥＤＣ／ＮＨＳで処理された三重変異体毒素Ｂ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）の両方の４つのロット全てに関して、その６週間の保温全体を通してＥＣ_５０値は＞１０００μｇ／ｍＬの出発レベルに留まっていた。対照的に、ＦＩで処理された三重変異体毒素Ａ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）およびＦＩで処理された三重変異体毒素Ｂ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）のＥＣ_５０値は安定せず、許容できないほど低いＥＣ_５０値まで低下し、これは細胞毒性における増大または不活性化の復帰を示している。表１１参照。

細胞毒性を検出不能なレベル（ＣＰＥアッセイにより測定した際に＞１０００μｇ／ｍＬ）まで安定して低減することに加えて、ＥＤＣ／ＮＨＳを用いて不活性化された変異体毒素は毒素中和性ｍＡｂの標的である重要なエピトープを保持していた。表３１参照。ＦＩ変異体毒素は同じ抗原決定基の喪失を示した。

実施例２４：前臨床免疫原性試験
重要な前臨床目標には、Ｃ．ディフィシル変異体毒素ＡおよびＢが含まれる組成物を小動物および非ヒト霊長類（ＮＨＰ）において試験することが含まれる。マウスおよびハムスターを、とりわけそのＣ．ディフィシル組成物がその変異体毒素ＡおよびＢに対する中和抗体を引き出すことができるかどうかを決定するために免疫した。その抗原を、マウス、ハムスター、およびカニクイザル・マカクにおける一連の免疫処置の後、血清中和抗体応答の誘導に関して試験した。遺伝子変異体毒素および／または化学的に不活性化された変異体毒素を、中性緩衝液、リン酸アルミニウム緩衝液、または一部の態様においてＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸをアジュバントとして含有する緩衝液中で配合した。中和抗体応答は一般に、それぞれの追加免疫または最終投与の約２〜４週間後に試験された。

その毒素中和アッセイは抗血清のＣ．ディフィシルＴｃｄＡまたはＴｃｄＢにより媒介される細胞毒性作用を中和する能力を実証し、従って試料中に存在する抗体の機能活性を測定することができる。毒素中和アッセイを、ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢの両方に感受性であるヒト肺線維芽細胞株のＩＭＲ−９０に対して実施した。簡潔には、９６ウェルマイクロタイタープレートに、毒素に媒介される細胞毒性の標的の役目を果たすＩＭＲ−９０細胞を蒔いた。それぞれの試験血清試料を、ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢを中和する能力に関して別々に分析した。試験抗血清の適切な系列希釈物を一定濃度のＴｃｄＡまたはＴｃｄＢと混合し、加湿した恒温器（３７℃／５％ＣＯ_２）中で３７℃において９０分間保温してその毒素の中和を起こさせた。品質管理のため、全てのプレートには既知の力価の抗毒素抗体が含まれる参照標準および対照が含まれていた。９０分後、その毒素−抗血清混合物をＩＭＲ−９０細胞の単層に添加し、そのプレートをさらに７２時間保温した。続いて、代謝的に活性な細胞中に存在するアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）レベルを決定するためにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）基質をそのアッセイプレートに添加し、それを相対光単位（ＲＬＵ）として測定した。大きいＡＴＰレベルは高い細胞生存度を示し、レベルはその試料中に存在する抗体によるその毒素の中和の量に正比例する。前臨床データに関して、そのＲＬＵデータをその試験抗血清試料の希釈値に対してプロットして４パラメーターロジスティック（４−ＰＬ）回帰反応当てはめ曲線を生成した。その中和力価を、細胞毒性における５０％の低減を示す試料希釈値として表した。

実施例２５：マウス免疫原性試験：ｍｕＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ２０１０−０６
この試験の目的は、それぞれが異なる方法により化学的に不活性化された変異体Ｃ．ディフィシル毒素Ｂ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）の２種類の形態の免疫原性を評価することであった。この試験において、未処理の変異体毒素Ｂ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）（遺伝学的に不活性化されているが化学的に不活性化されていない）を、アジュバントと共に、またはアジュバントなしで、対照として用いた。

１０匹のマウスの群を、１０μｇの表１２に従う免疫原を用いて筋内に免疫した。

結果：そのマウスにおいて、そのワクチン候補のそれぞれの投与後に有害事象はなかった。図１０で図説されるように、それぞれの群中のマウスはそれぞれの変異体毒素の３回目の投与の後に著しい強い抗毒素Ｂ中和抗体を発現した。

１２週目の力価に基づいて、マウスにおいてＥＤＣで不活性化された変異体毒素Ｂ（群２）およびホルマリンで不活性化された変異体毒素（群１）は強力な中和応答を生じさせたようである。

化学的不活性化の非存在下では、その遺伝子変異体毒素Ｂ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）は２回の投与後に中和応答を生じさせ（群３〜４、８週目）、それは３回目の投与後にブーストされた（群３〜４、１２週目）。

実施例２６：マウス免疫原性試験：ｍｕＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ２０１０−０７：
この試験の目的は、化学的に不活性化されたＣ．ディフィシル変異体毒素ＡおよびＢ（それぞれＳＥＱＩＤＮＯ：４および６）の、単独または組み合わせのどちらかでの免疫原性を評価することであった。全ての群に関して、免疫原はリン酸アルミニウムをアジュバントとして用いて配合された。

５匹のマウスの群を、１０μｇの表１３に従う免疫原を用いて筋内に免疫した。

結果：そのマウスにおいて、そのワクチン候補のそれぞれの投与後に有害事象はなかった。図１１で図説されるように、化学的に不活性化された遺伝子変異体毒素の２回の投与後に、抗毒素Ａ中和抗体（群３〜５）は３〜４ｌｏｇ_１０の力価までブーストされ、一方で抗毒素Ｂ中和抗体（群１〜２、５）は低〜検出不能のままであり、それは上記で記述されたマウス試験からのデータ（図１０）と一致している。抗毒素Ｂ中和抗体は群１、２、および５において３回目の投与後に２〜３ｌｏｇ_１０までブーストされ（１２週目の力価）、４回目の投与の２週間後にそれらのピークに達した（１４週目の力価）。群３〜５における抗毒素Ａ中和抗体の力価は３回目（１２週目の力価）および４回目の免疫処置（１４週目の力価）後にわずかに増大した。

実施例２７：ハムスター免疫原性試験：ｈａｍＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ２０１０−０２：
この試験の目的は、Ｃ．ディフィシル三重変異体および化学的に不活性化された変異体毒素ＡおよびＢの免疫原性および保護能力をシリアンゴールデンハムスターモデルにおいて評価することであった。シリアンゴールデンハムスターモデルは、ヒトのＣＤＡＤを模擬実験するための最高の利用可能な負荷モデルである。マウス試験ｍｕＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ２０１０−０７において用いられたバッチと同じバッチの変異体毒素ＡおよびＢを、この試験において用いた。対照として、１つの群にアルミニウム含有アジュバントなしで変異体毒素を与えた。

５匹のシリアンゴールデンハムスターの群を、１０μｇの表１４に従う免疫原を用いて筋内に免疫した。

結果：その変異体毒素による免疫処置後に有害事象は観察されなかった。図１２で図説されるように、変異体毒素の１回投与後、抗毒素Ａ中和応答はホルマリンで不活性化された変異体毒素（群１〜２）に関して２〜３ｌｏｇ_１０であり、ＥＤＣで不活性化された変異体毒素（群３）に関して３〜４ｌｏｇ_１０であった。２回目の投与後、３つの群全てにおいて抗毒素Ａ抗体がブーストされた。３つの群全てにおいて抗毒素Ａ抗体は３回目の投与後には増大したように見えなかった。類似の結果が４回目の免疫処置後に観察され、ここで力価における増大はアルミニウムアジュバントを含有しないホルマリンで不活性化された群（群２）において観察された。

抗毒素Ｂ中和応答は、１回投与後はホルマリンで不活性化された変異体毒素の群（群１〜２）では検出不能であり、ＥＤＣで不活性化された変異体毒素（群３）に関しては２ｌｏｇ_１０をちょうど超えていた。２回目の投与後、２個のホルマリンで不活性化された群（群１〜２）における抗毒素Ｂ中和抗体力価は３〜４ｌｏｇ_１０まで増大し、一方でＥＤＣで不活性化された群（群３）における抗毒素Ｂ中和抗体力価は４〜５ｌｏｇ_１０まで増大した。３つの群全てに関して、３回目および／または４回目の投与後に抗毒素Ｂ中和抗体力価における増大が観察され、全ての群が１６週目（最後の投与後）にピーク力価に達した。図１２参照。

図１３において、化学的に不活性化された遺伝子変異体毒素に対する中和抗体応答のレベル（図１２）を、ＬｉｓｔＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州キャンベル）（本明細書において“ＬｉｓｔＢｉｏ”または“ＬｉｓｔＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ”とも呼ばれる）のトキソイド（すなわち、ＬｉｓｔＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入したトキソイドを野生型毒素のホルマリン不活性化により調製した；ハムスター負荷モデルを確立するために用いられた対照試薬）により引き出された中和抗体応答のレベルと比較した。

本明細書で用いられる際、図および表中の“ＦＩ”は、別途記載しない限りその毒素の２５℃において２日間のホルマリン／グリシン処理を指す。本明細書で用いられる際、図および表中の“ＥＩ”は、別途記載しない限り３０℃において４時間のＥＤＣ／ＮＨＳ処理を指す。図１３において、５匹のハムスター動物をそれぞれの変異体毒素組成物で処置し、一方で１１匹のハムスター動物をＬｉｓｔＢｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入したトキソイドで処置した。

図１３におけるデータは、表１４に従って投与されたハムスターにおいて、ＥＤＣで不活性化された変異体毒素が含まれる免疫原性組成物により誘導された、２回投与後の毒素Ａ（図１３Ａ）および毒素Ｂ（図１３Ｂ）に対するそれぞれの中和抗体力価は、ＬｉｓｔＢｉｏｌｏｇｉｃａｌのトキソイドにより引き出されたそれぞれの中和抗体力価よりも高いことを示している。

実施例２８：ハムスター免疫原性試験：Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅｈａｍ２０１０−０２（続き）
変異体毒素の保護的有効性を評価するため、免疫したハムスターに、免疫しなかった動物の１つの対照群と共に、まず正常な腸内細菌叢を崩壊させるためにクリンダマイシン抗生物質の経口用量（３０ｍｇ／ｋｇ）を与えた。５日後、そのハムスターに野生型Ｃ．ディフィシルの芽胞（６３０株、動物あたり１００ｃｆｕ）の経口用量で負荷を与えた。動物を負荷後１１日間毎日ＣＤＡＤの徴候に関して監視し、それはハムスターでは濡れた尻尾（ｗｅｔｔａｉｌ）として知られている。いくつかの異なるパラメーターを臨床的に採点するシステムを用いて、重症のＣＤＡＤを有すると決定された動物を安楽死させた。そのパラメーターには、刺激後の活動性、脱水症状、排泄物、温度、および体重等が含まれており、それらは当該技術で既知である。

１１日目において、その試験を終了し、全ての生存している動物を安楽死させた。図１４は、免疫しなかった対照と比較した、３つの免疫した群（群１〜３、表１４に従う）のそれぞれに関する生存曲線を示す。見て分かるように、免疫しなかった動物は全て重症のＣＤＡＤを発現し、負荷後１〜３日目に安楽死を必要とした（０％生存）。ホルマリンで不活性化された変異体毒素を投与された両方の群は６０％生存曲線を有し、動物は３日目（群１）または４日目（群２）まで安楽死を必要としなかった。ＥＤＣで不活性化された変異体毒素を投与された群は８０％生存曲線を有し、（５匹中の）１匹の動物が７日目に安楽死を必要とした。従って、そのハムスターはＣ．ディフィシルの芽胞による致死的負荷から保護された。

実施例２９：ハムスター免疫原性試験：ｈａｍＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ２０１０−０３：遺伝子的および化学的に不活性化されたＣ．ディフィシル変異体毒素の免疫原性
この試験の目的は、アジュバントを加えないＣ．ディフィシル三重変異体および化学的に不活性化された変異体毒素ＡおよびＢ（それぞれＳＥＱＩＤＮＯ：４および６）の免疫原性をシリアンゴールデンハムスターモデルにおいて評価することであった。マウス試験ｍｕＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ２０１０−０７において用いられたバッチと同じバッチの変異体毒素ＡおよびＢ（それぞれＳＥＱＩＤＮＯ：４および６）を、この試験において用いた。対照として、１つの群（群１）にリン酸緩衝生理食塩水をプラセボとして与えた。

５または１０匹のシリアンゴールデンハムスターの群を、表１５に従う免疫原を用いて免疫した。動物は３回の投与を受けた。加えて、動物は２週ごとに投与された。

結果：図１５参照。プラセボ対照群では抗毒素ＡまたはＢ抗体は観察されなかった。１回投与後、抗毒素Ａ中和抗体がホルマリンで不活性化された群（群２）および遺伝子変異体毒素群（群４）に関して２〜３ｌｏｇ_１０で、ＥＤＣで不活性化された群（群３）に関して３〜４ｌｏｇ_１０で観察された。抗毒素Ａ中和抗体は、これらの群（２〜４）のそれぞれにおいて関連する変異体毒素による２回目の免疫処置後に増大した（図１５における２週目の力価を３週目の力価と比較）。変異体毒素の３回目の投与（４週目に与えられた）後、群２〜４における抗毒素Ａ中和抗体力価はそれらの４週目の力価と比較して増大した。

抗毒素Ｂ中和抗体は２回目の投与後に検出可能であり、ここでホルマリンで不活性化された（群２）およびＥＤＣで不活性化された（群３）抗毒素Ｂ中和抗体は３〜４ｌｏｇ_１０まで増大し、遺伝子三重変異体（群４）に関して２〜３ｌｏｇ_１０まで増大した。３回目の免疫処置（４週目）後、その抗毒素Ｂ中和抗体力価はホルマリンで不活性化された変異体毒素（群２）および遺伝子変異体毒素（群４）に関して３〜４ｌｏｇ_１０、ＥＤＣで不活性化された変異体毒素（群３）に関して４〜５ｌｏｇ_１０までブーストされた。

抗毒素Ａおよび抗毒素Ｂ中和抗体の両方に関して、ピーク力価は全てのワクチン接種された群（群２〜４）に関して６週目（３回目の投与後）に観察された。
Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ／ＣｐＧまたはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸで抗原性補強した免疫原性組成物の評価
Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、またはＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ／ＣｐＧ２４５５５（Ａｌｈ／ＣｐＧ）と共に配合された化学的に不活性化された変異体毒素が含まれる免疫原性組成物で免疫されたハムスターは、強い中和性抗毒素抗血清を発現した。ピークの抗毒素Ａおよび抗毒素Ｂ応答は、Ａｌｈ／ＣｐＧまたはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ中で配合された変異体毒素で免疫された群において、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌのみと共に配合されたワクチンと比較した場合に２〜３倍高く、統計的に有意であった。５０％中和力価を示す表３２を参照。ハムスター（ｎ＝１０／群）を、０、２、および４週目に、１００μｇのＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ、または２００μｇのＣｐＧ２４５５５＋１００μｇのＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ、または１０ＵのＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸと共に配合された各１０μｇの変異体毒素Ａ原薬および変異体毒素Ｂ原薬を用いてＩＭで免疫した。それぞれの時点において血清を収集し、機能的抗毒素活性に関して毒素中和アッセイで分析した。幾何平均力価を表３２において提供する。アスタリスク（^＊）は、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ群における力価と比較した場合の統計的有意性（ｐ＜０．０５）を示す。

これらのアジュバントと共に配合された変異体毒素原薬が含まれる免疫原性組成物の保護的有効性を試験した。ハムスターを免疫し、経口クリンダマイシン（３０ｍｇ／ｋｇ）を５週目に与え、上記で記述された方法に従って負荷を与えた。免疫されないハムスターの１つの群（ｎ＝５）が対照として含まれた。Ａｌｈ／ＣｐＧまたはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸのどちらかで抗原性補強された変異体毒素原薬で免疫されたハムスター（１００％生存）において、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌのみ（７０％生存）と比較して増大した有効性が観察された。従って、そのハムスターはＣ．ディフィシルの芽胞による致死的負荷から保護された。

実施例３０：カニクイザル・マカクにおけるクロストリジウム・ディフィシルワクチン接種
この試験の目的は、低および高用量のＥＤＣで不活性化された、およびホルマリンで不活性化されたＣ．ディフィシル変異体毒素のカニクイザル・マカクにおける免疫原性を試験することであった。抗原性補強されない対照の役目を果たす１つの群（群５）を除いて、全ての変異体毒素をアジュバントとしてのＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）中で配合した。

結果：図１６は、０、２、３、４、６、８、および１２週目におけるこれらの動物における抗毒素中和抗体応答を示す。抗毒素Ａ力価は５つの群全てに関して１回投与後に２〜３ｌｏｇ_１０であった（２週目の力価）。これらの力価は、それぞれの群に関してそれぞれのそれに続く投与の後にブーストされた。これらの動物において、３および４週目の間に力価の低下はなかった。全ての群に関して、ピーク力価は４〜５ｌｏｇ_１０であった。全ての時点において、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸアジュバントなしの群（群５）は最も低い力価を有し、これは免疫応答のブーストにおけるＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸの有用性を示している。アジュバントなしの対照群（群５）は１２週目にピーク力価に達し、高用量のＥＤＣで不活性化された変異体毒素で免疫された群（群４）も同様であり；全ての他の群は最後の投与の２週間後である６週目にピーク力価に達した。全ての群における力価は２回目の投与後にブーストされた（３週目の時点）。抗毒素Ａ応答と同様に、抗毒素Ｂ応答は３週目から４週目までで低下しなかった。３回目の投与後（６週目の時点）、全ての群における抗毒素Ｂ中和抗体力価は、低用量のホルマリンで不活性化された群（群１）および高用量のＥＤＣで不活性化された群（群４）（その両方がちょうど４ｌｏｇ_１０より大きい力価を有していた）を除き、３〜４ｌｏｇ_１０であった。ピーク力価は、８週目にピーク力価を有していた低用量のＥＤＣで不活性化された群（群３）を除き、全ての群に関して１２週目に観察された。全ての群が４ｌｏｇ_１０より大きいピーク力価を有していた。

実施例３１：モノクローナル抗体の生成
毒素ＡおよびＢは多くの構造的相同性を共有しているが、その抗体の中和活性は毒素特異的であることが分かった。この発明において、個々の毒素に特異的であり、様々なエピトープおよび機能ドメインに向けられ、そして天然の毒素に対して高い親和性および強力な中和活性を有するいくつかの抗体が同定された。毒素ＡおよびＢｍＡｂを生成するため、商業的に入手可能なホルマリンで不活性化された（ＦＩ）変異体毒素またはその触媒部位中に特異的な変異を導入することにより非毒性にされた組み換えホロ変異体毒素（ＳＥＱＩＤＮＯ：４および６）のどちらかで免疫されたマウスからそれぞれ抗体を単離した。その抗体のエピトープマッピングは、毒素Ａに対するｍＡｂの大部分（５２種類の内の４９種類）はその毒素の非触媒性Ｃ末端ドメインに向けられていることを示した。

毒素Ｂに対するモノクローナル抗体は、そのタンパク質の３個のドメインを標的としていた。合計１７種類の毒素Ｂ特異的ｍＡｂの内で、６種類はＮ末端（例えば６３０のような野生型Ｃ．ディフィシルのＴｃｄＢのアミノ酸１〜５４３）に、６種類はＣ末端（例えば６３０のような野生型Ｃ．ディフィシルのＴｃｄＢのアミノ酸１８３４〜２３６６）に、そして５種類は中央の移行ドメイン（例えば６３０のような野生型Ｃ．ディフィシルのＴｃｄＢのアミノ酸７９９〜１８３３）に特異的であった。従って、変異体Ｃ．ディフィシル毒素（例えばＳＥＱＩＤＮＯ：４および６）を免疫抗原として用いるアプローチは、その変異体毒素の抗原構造に悪影響を及ぼす傾向があるホルマリン不活性化プロセスと比較して、全てではないとしてもほとんどの抗原エピトープを提示する重要な利点を与える。

実施例３２：ＳＥＱＩＤＮＯ：３６のアミノ酸配列を有する可変軽鎖およびＳＥＱＩＤＮＯ：３７のアミノ酸配列を有する可変重鎖が含まれる毒素ＡｍＡｂＡ３−２５の特性付け。

ｍＡｂＡ３−２５は、この抗体は一般的に利用可能なＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡに関するアイソタイプ判別キットを用いてその免疫グロブリン（Ｉｇ）アイソタイプを明らかにする全ての試みを拒絶したため、特に興味深かった。ＩｇＨ鎖特異的抗血清を用いたウェスタンブロットによるさらなる分析は、Ａ３−２５がＩｇＥアイソタイプのものであることを示し、これはｍＡｂ生成において稀な出来事であった。これはＡ３−２５のハイブリドーマ細胞から単離されたｍＲＮＡのヌクレオチド配列決定によりさらに確証された。Ａ３−２５のＨおよびＬ鎖の可変領域のヌクレオチド配列から推定されたアミノ酸配列が図１７において示されている。

Ａ３−２５ｍＡｂをＣ．ディフィシル感染および疾患に関する動物モデルにおいてさらに評価するため、公開された方法に従うそのεＨ鎖の可変領域のマウスγ重鎖上への分子移植（ｍｏｌｅｃｕｌａｒｇｒａｆｔｉｎｇ）により、そのＩｇアイソタイプをマウスＩｇＧ１に変更した。

実施例３３：毒素特異的抗体の中和能力およびエピトープマッピング
さらに、機能性／中和抗体を同定する試みにおいて、全てのモノクローナル抗体を、標準的な細胞変性作用（ＣＰＥ）アッセイにおいて、または細胞生存度の指標としてのＡＴＰの測定に基づくよりストリンジェント且つ定量的なアッセイにおいて、野生型毒素を中和する能力に関して評価した。

合計５２種類の毒素Ａ特異的抗体の内で、４種類のｍＡｂ（Ａ３−２５、Ａ６５−３３、Ａ６０−２２およびＡ８０−２９）（表１７および図１８）は様々なレベルの中和活性を示した。その抗体のエピトープをマッピングするため、ＢｉａＣｏｒｅ競合結合アッセイおよび血球凝集阻止（ＨＩ）アッセイを実施した。結果は、これらの抗体は毒素Ａタンパク質の異なるエピトープを標的としている可能性があることを示した（表１７）。そのタンパク質上の結合部位の位置をさらに同定するため、その抗体を既知の配列の毒素断片を用いるウェスタンブロットまたはドットブロットアッセイにおいて個々に評価した。４種類の中和性ｍＡｂは全てその毒素のＣ末端領域に向けられていることが分かった。

合計１７種類の毒素Ｂ特異的抗体から、９種類が中和性であることが分かった。９種類の中和性ｍＡｂの内で、それらの６種類はＮ末端に、その他の３種類はＢ毒素の移行ドメインに向けられていた（表１８）。ＢｉａＣｏｒｅ競合結合アッセイに基づいて、その９種類の中和性モノクローナル抗体抗体を、図１９で示されるように４つのエピトープ群に分類した。

実施例３４：著しく高められた中和活性を有する新規の毒素Ａ抗体の組み合わせの同定：
４種類の毒素ＡｍＡｂ（Ａ３−２５、Ａ６５−３３、Ａ６０−２２およびＡ８０−２９）は、個々にＡＴＰに基づく中和アッセイにおいて試験した際、毒素Ａの不完全または部分的な中和を示した。ｍＡｂＡ３−２５は最も強力な抗体であり、その他の３種類は中和性がより低く、Ａ８０−２９はバックグラウンドよりかろうじて上であった（図１８）。しかし、Ａ３−２５をその他の３種類のｍＡｂのいずれか１種類と組み合わせた場合、図２０Ａ〜Ｃにおいて示されるように、３つの組み合わせ全てにおいて中和における相乗作用が観察され、それは個々の抗体の中和の総和よりもはるかに大きかった。加えて、３つの組み合わせは全て、通常抗毒素Ａポリクローナル抗体を用いて観察される完全な中和能力を示した。

実施例３５：著しく高められた中和活性を示す新規の毒素Ｂ抗体の組み合わせの同定：
我々は、ＢｉａＣｏｒｅ分析により同定された異なるエピトープ群からの毒素ＢｍＡｂによる相乗的中和も観察した。群１の最も優勢なｍＡｂである毒素ＢｍＡｂＢ８−２６を、群３からの多数のｍＡｂと組み合わせた。その組み合わせを毒素Ｂ特異的中和アッセイにおいて評価し、その結果を図２１および表１９において示す。

Ｂ８−２６をエピトープ群３のｍＡｂと組み合わせた場合、相乗的中和作用が観察されたが、他のｍＡｂでは一切観察されなかった（データは示していない）。
実施例３６：安全且つ有効な変異体毒素組成物に関するｍＡｂによるインビトロスクリーニング：
遺伝子工学により生成されたＣ．ディフィシルの遺伝子変異体毒素ＡおよびＢ（例えばＳＥＱＩＤＮＯ：４および６）は、インビトロ細胞毒性アッセイを用いて残存する細胞毒性を示した。我々はそれぞれの変異体毒素Ｃ．ディフィシル毒素に関して細胞毒性における約４ｌｏｇの低減を達成した（表２０）が、例えばホルマリン処理によるその変異体毒素のさらなる化学的不活性化が好ましかった。しかし、化学的不活性処理は過酷である可能性があり、これらの毒素または変異体毒素の重要な抗原エピトープに悪影響を及ぼす可能性がある。

バイオプロセスの最適化のため、三重変異体ＴｃｄＡおよびＢ（１ｍｇ／ｍＬ）のホルマリンおよびＥＤＣ／ＮＨＳ処理を用いた化学的不活性化に関して統計学的実験計画（ＤＯＥ）を実施した。三重変異体ＴｃｄＡのホルマリン不活性化を最適化するため、我々はホルマリン／グリシンの濃度（２０〜４０ｍＭ）、ｐＨ（６．５〜７．５）、および温度（２５〜４０℃）を変動させた。三重変異体ＴｃｄＢに関して、我々はホルマリン／グリシン濃度を２から８０ｍＭまで変動させ、温度およびｐＨはそれぞれ２５℃および７．０であった。全てのホルマリン処理に関する保温時間は２４時間であった。ホルマリン不活性化に関して、表２１および２３中の“４０／４０”はその反応において用いられたホルマリンおよびグリシンの濃度を表す。ＥＤＣ／ＮＨＳ処理に関して、我々はＥＤＣ／ＮＨＳの濃度を０．２５から２．５ｍｇ／三重変異体ＴｃｄＡのｍｇまで、および０．１２５から２．５ｍｇ／三重変異体ＴｃｄＢのｍｇまで変動させ、２５℃で４時間保温した。反応の終了時に、全ての試料を１０ｍＭホスフェート、ｐＨ７．０中で脱塩した。精製後、処理されたＴｃｄを残存する細胞毒性に関して、そしてドットブロット分析によりエピトープのｍＡｂ認識に関して分析した。目標は、中和性ｍＡｂの一団により認識されるエピトープに負の影響を及ぼすことなく（＋＋＋＋または＋＋＋）細胞毒性を所望のレベル（ＥＣ_５０＞１０００μｇ／ｍＬ）まで低減する処理条件を同定することであった。その処理条件（表２１〜２４中でチェックマーク“u”を付けてある）は、少なくとも４種類の中和性ｍＡｂに対する反応性を保持する一方で細胞毒性においてそれぞれの野生型毒素の細胞毒性と比較して６〜８ｌｏｇ_１０の低減を示す、潜在的に安全且つ有効な免疫原性組成物をもたらした。選ばれた結果を表２１〜２４において説明する。三重変異体毒素に対する処理条件の変動からの追加のデータおよびインビトロ細胞毒性および毒性中和アッセイからのデータを、表３３および表３４において示す。例えば、その変異体毒素の好ましい架橋処理条件に関するさらなる詳細を提供する上記の実施例２０および２１も参照。

表３３において参照された三重変異体毒素Ａ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）の試料に関する化学架橋反応条件
試料１〜４をＥＤＣ／ＮＨＳにより修飾した。条件：３０℃、２０ｍＭＭＥＳ／１５０ｍＭＮａＣｌｐＨ６．５。反応をＥＤＣの添加により開始した。２時間の反応後、試料Ａ、Ｂ、およびＣに１Ｍグリシンを５０ｍＭのグリシンの終濃度まで添加した。試料Ｄにはグリシンを添加しなかった。その反応は、下記で示されるように異なる変異体毒素Ａ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）：ＥＤＣ：ＮＨＳの重量比を有するように設定された。

１Ｌ４４１６６−１５７Ａ１：０．２５：０．２５ｗ：ｗ：ｗ
２Ｌ４４１６６−１５７Ｂ１：１．２５：１．２５
３Ｌ４４１６６−１５７Ｃ１：２．５：２．５
４Ｌ４４１６６−１５７Ｄ１：２．５：２．５
試料５Ｌ４４９０５−１６０Ａ８０ｍＭＨＣＨＯ、８０ｍＭグリシン、８０ｍＭＮａＰＯ４ｐＨ７、１ｍｇ／ｍＬ変異体毒素Ａ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）タンパク質、２５℃において４８時間の反応。

試料６Ｌ４４１６６−１６６変異体毒素Ａ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）の２５℃における２０ｍＭＭＥＳ／１５０ｍＭＮａＣｌｐＨ６．５中でのＥＤＣ／ＮＨＳ修飾。変異体毒素Ａ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）：ＥＤＣ：ＮＨＳ＝１：０．５：０．５。反応をＥＤＣの添加により開始した。２時間の反応後、１Ｍグリシンを０．１Ｍのグリシンの終濃度まで添加し、さらに２時間保温した。この時間の後、反応緩衝液をＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５上で１×ＰＢＳに交換した。

試料７Ｌ４４９０５−１７０Ａ８０ｍＭＨＣＨＯ、８０ｍＭグリシン、８０ｍＭＮａＰＯ_４ｐＨ７、１ｍｇ／ｍＬ変異体毒素Ａ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）タンパク質、３５℃において４８時間の反応。このホルマリン反応は、抗原結合が重度に減少するであろうような過度の架橋を生成することに向けられた。

試料８Ｌ４４８９７−６１３２ｍＭＨＣＨＯ／８０ｍＭグリシン、２５℃において７２時間の反応。
試料９Ｌ４４８９７−６３８０ｍＭＨＣＨＯ／８０ｍＭグリシン、２５℃において７２時間の反応。

以下の反応は全て２４時間の反応時間を有していた。
試料１０Ｌ４４８９７−７２チューブ番号１２５℃、８０ｍＭＮａＰｉｐＨ６．５、２０ｍＭＨＣＨＯ／２０ｍＭグリシン
試料１１Ｌ４４８９７−７２チューブ番号２２５℃、８０ｍＭＮａＰｉｐＨ６．５、４０ｍＭＨＣＨＯ／４０ｍＭグリシン
試料１２Ｌ４４８９７−７２チューブ番号３３２．５℃、８０ｍＭＮａＰｉｐＨ７．０、３０ｍＭＨＣＨＯ／３０ｍＭグリシン
試料１３Ｌ４４８９７−７２チューブ番号４３２．５℃、８０ｍＭＮａＰｉｐＨ７．０、３０ｍＭＨＣＨＯ／３０ｍＭグリシン
試料１４Ｌ４４８９７−７２チューブ番号５３２．５℃、８０ｍＭＮａＰｉｐＨ７．０、３０ｍＭＨＣＨＯ／３０ｍＭグリシン
試料１５Ｌ４４８９７−７５チューブ番号６２５℃、８０ｍＭＮａＰｉｐＨ７．５、２０ｍＭＨＣＨＯ／２０ｍＭグリシン
試料１６Ｌ４４８９７−７５チューブ番号７２５℃、８０ｍＭＮａＰｉｐＨ７．５、４０ｍＭＨＣＨＯ／４０ｍＭグリシン
試料１７Ｌ４４８９７−７５チューブ番号８４０℃、８０ｍＭＮａＰｉｐＨ６．５、２０ｍＭＨＣＨＯ／２０ｍＭグリシン
試料１８Ｌ４４８９７−７５チューブ番号９４０℃、８０ｍＭＮａＰｉｐＨ６．５、４０ｍＭＨＣＨＯ／４０ｍＭグリシン
試料１９Ｌ４４８９７−７５チューブ番号１０４０℃、８０ｍＭＮａＰｉｐＨ７．５、２０ｍＭＨＣＨＯ／２０ｍＭグリシン
試料２０Ｌ４４８９７−７５チューブ番号１１４０℃、８０ｍＭＮａＰｉｐＨ７．５、４０ｍＭＨＣＨＯ／４０ｍＭグリシン
以下の８個の試料は、７８ｍＭＨＣＨＯおよび７６ｍＭグリシンを含有する８０ｍＭＮａＰｉｐＨ７．０中で２５℃において示された時間の間反応させた。

試料２１Ｌ４４８９７−１０１（前修飾（ｐｒｅ−ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ））ＴｘＡ対照、時間ゼロ、対照試料、修飾されていない、またはＨＣＨＯ／グリシンに曝露していない
試料２２Ｌ４４８９７−１０１、２時間
試料２３Ｌ４４８９７−１０１、４時間
試料２４Ｌ４４８９７−１０１、６時間
試料２５Ｌ４４８９７１０２、２４時間
試料２６Ｌ４４８９７−１０３、５１時間
試料２７Ｌ４４８９７−１０４、７４時間
試料２８Ｌ４４８９７−１０５、１２０時間
試料２９（Ｌ４４９８０−００４）は、ＥＤＣ／ＮＨＳ修飾された変異体毒素Ａ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）（三重変異体毒素Ａ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）−ＥＤＣ）であった。反応条件は２５℃であり、緩衝液は２０ｍＭＭＥＳ／１５０ｍＭＮａＣｌｐＨ６．６であった。三重変異体毒素Ａ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）：ＥＤＣ：ＮＨＳ＝１：０．５：０．５ｗ：ｗ：ｗ。反応をＥＤＣの添加により開始した。２時間の反応後、グリシンを０．１Ｍの終濃度まで添加し、２５Ｃでさらに２時間反応させた。反応をＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５上での脱塩により終了させた。

以下の１２個の試料および２個の対照は復帰実験であり、ここで試料を２５℃および３７℃で保温した。
反応１＝２５℃、８０ｍＭＮａＰｉｐＨ７．０、４０ｍＭＨＣＨＯのみ（グリシンなし）、２４時間の反応。

反応２＝２５℃、８０ｍＭＮａＰｉｐＨ７．０、４０ｍＭＨＣＨＯ／４０ｍＭグリシン、２４時間の反応
試料反応
３０反応番号１０週目、２５℃
３１反応番号１１週目、２５℃
３２反応番号１２週目、２５℃
３３反応番号１３週目、２５℃
３４反応番号１４週目、２５℃
３５反応番号１３週目、３７℃
３６反応番号２０週目、２５℃
３７反応番号２１週目、２５℃
３８反応番号２２週目、２５℃
３９反応番号２３週目、２５℃
４０反応番号２４週目、２５℃
４１反応番号２３週目、３７℃
４２ＴｘＡ対照３週目、２５℃
４３ＴｘＡ対照３週目、３７℃
次の４個の試料は、８０ｍＭＮａＰｉｐＨ７．０、４０ｍＭＨＣＨＯ／４０ｍＭグリシン中での２５℃における示された時間の間の反応により生成された。

４４Ｌ４４８９７−１１６−６２９．５時間
４５Ｌ４４８９７−１１６−７５７．５時間
４６Ｌ４４８９７−１１６ −８７９．５時間
４７Ｌ４４８９７−１１６−９１２３．５時間
試料４８Ｌ４４８９７−１３９２５℃、８０ｍＭＮａＰｉｐＨ７．０、４０ｍＭＨＣＨＯ／４０ｍＭグリシンにおける４８時間の反応。

試料４９Ｌ４４１６６−２０４変異体毒素Ａ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）のＥＤＣ／ＮＨＳ修飾。２５Ｃ、緩衝液１×ＰＢＳｐＨ７．０。変異体毒素Ａ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）：ＥＤＣ：ＮＨＳ＝１：０．５：０．５ｗ：ｗ：ｗ。ＥＤＣ／ＮＨＳとの２時間の反応、次いで１Ｍグリシンを０．１Ｍの終濃度まで添加し、さらに２時間反応。緩衝液をＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５上で２０ｍＭＬ−ヒスチジン／１００ｍＭＮａＣｌｐＨ６．５に交換した。

表３４において参照された変異体毒素Ｂの試料に関する化学架橋反応条件
三重変異体毒素Ｂ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）を化学的に架橋し、以下の反応条件に従って試験した。Ｌ４４９０５−８６試料を、３種類のホルマリン反応のバリエーションおよび２種類の保温温度を含む実験において試験した。合計１８個の試料に関して、それぞれの日に６個の試料を得た。リスト中の最初の試料は未処理の対照である（それにより合計１９個の試料となる）。その未処理の対照には、未処理の三重変異体毒素Ｂポリペプチド（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）が含まれていた。

反応１（“Ｒｘｎ１”）＝８０ｍＭＨＣＨＯ、８０ｍＭグリシン、８０ｍＭＮａＰＯ４ｐＨ７、１ｍｇ／ｍＬ三重変異体毒素Ｂ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）タンパク質
反応２（“Ｒｘｎ２”）＝８０ｍＭＨＣＨＯ、グリシンなし、８０ｍＭＮａＰＯ４ｐＨ７、１ｍｇ／ｍＬ三重変異体毒素Ｂ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）タンパク質
反応３（“Ｒｘｎ３”）＝８０ｍＭＨＣＨＯ、グリシンなし、８０ｍＭＮａＰＯ４ｐＨ７、１ｍｇ／ｍＬ三重変異体毒素Ｂ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）タンパク質＋シアノボロヒドリドキャッピング。

シアノボロヒドリドキャッピングは、８０ｍＭＣＮＢｒＨ_４の脱塩された最終反応物への添加および３６℃で２４時間の保温を含んでいた。
試料Ｌ３４３４６−３０Ａに関して、１グラムの三重変異体毒素Ｂ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）あたり０．５ｇのＥＤＣおよびＮＨＳ、２０ｍＭＭＥＳ、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ６．５中で３０℃において４時間。

試料Ｌ３４３４６−３０Ｂに関して、１グラムの三重変異体毒素Ｂ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）あたり０．５ｇのＥＤＣおよびＮＨＳ、２０ｍＭＭＥＳ、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ６．５中で３０℃において２時間、続いてグリシンの添加（ｇ／Ｌの終濃度）および３０℃においてさらに２時間の保温。Ｌ３４３４６−３０ＡおよびＬ３４３４６−３０Ｂに関する２つの反応の間の唯一の違いは、反応Ｌ３４３４６−３０Ｂへのグリシンの添加である。

実施例３７：免疫原性組成物により誘導される抗体は、様々なＣ．ディフィシル株からの毒素を中和することができる。
その変異体毒素原薬が含まれる免疫原性組成物により誘導された抗体が広いスペクトルの多様な毒素配列を中和することができるかどうかを評価するため、多様なリボタイプおよび毒素タイプを代表する株を配列決定して、変異体毒素原薬と比較した様々な株の間の遺伝的多様性の程度を確認した。次いで、様々な株からの分泌された毒素を含有する培養上清を、免疫されたハムスターからの血清を用いたインビトロ中和アッセイにおいて試験し、その免疫原性組成物の適用範囲（ｃｏｖｅｒａｇｅ）を決定し、その免疫原性組成物の循環している臨床株からの多様な毒素に対して保護する能力を決定した。

ＨＴ−２９細胞（結腸癌細胞株）およびＩＭＲ−９０細胞の両方を用いて、ＣＤＣ株から発現された毒素の中和を試験した。ＨＴ−２９細胞はＴｃｄＡに対してより感受性であり；これらの細胞における精製されたＴｃｄＡのＥＣ_５０は、ＴｃｄＢに関する３．３ｎｇ／ｍＬと比較して１００ｐｇ／ｍＬである。一方で、ＩＭＲ−９０細胞はＴｃｄＢに対してより感受性であり；これらの細胞における精製されたＴｃｄＢのＥＣ_５０は、ＴｃｄＡに関する０．９２〜１．５ｎｇ／ｍＬと比較して９〜３０ｐｇ／ｍＬの範囲である。これらの細胞株におけるＴｃｄＡおよびＴｃｄＢ両方に関するそのアッセイの特異性を、ポリクローナルおよびモノクローナル毒素特異的抗体両方を用いることにより確かめた。アッセイの標準化のため、２４種類のＣＤＣ分離株の培養濾液をそれらのそれぞれのＥＣ_５０値の４倍の濃度で試験した。その株の３種類は、その中和アッセイでの試験に関して低すぎる毒素レベルを有していた。

米国およびカナダにおけるＣ．ディフィシルの循環している株の９５％より大きい割合を含む多様なアイソタイプ／毒素タイプを代表する２４種類の株を、ＣＤＣから得た。これらの分離株の中には、リボタイプ０２７、００１および０７８を代表する株、米国、カナダおよび英国におけるＣＤＡＤの３種類の流行株があった。株２００４０１３および２００４１１８はリボタイプ０２７を代表し；株２００４１１１はリボタイプ００１を代表し、株２００５０８８、２００５３２５および２００７８１６はリボタイプ０７８を代表していた。疾患を引き起こす臨床分離株および６３０株の間の遺伝的多様性の程度を確認するため、これらの臨床株からの毒素遺伝子（ｔｃｄＡおよびｔｃｄＢ）を完全に配列決定した。表３５参照。その毒素のアミノ酸配列を、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（商標）プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ（登録商標）Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ（登録商標））中のＣｌｕｓｔａｌＷを用いて整列させ、配列の同一性に関して分析した。ｔｃｄＡに関して、ゲノムアラインメント分析は、その臨床分離株の全ておよび株６３０が全体で約９８〜１００％のアミノ酸配列の同一性を共有していることを示した。ｔｃｄＡ遺伝子のＣ末端部分はわずかにより大きく分岐していた。同じ分析をｔｃｄＢ遺伝子に関して実施し、それはより大きな配列の分岐を示した。特に、株２００７８３８／ＮＡＰ７／１２６および２００７８５８／ＮＡＰ１／ｕｎｋ５はＮ末端（９７〜１００％）およびＣ末端ドメイン（８８〜１００％；データは示していない）において６３０株からの最も大きな分岐パターンを示した。

ハムスター血清プール（ＨＳ）を、変異体ＴｃｄＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）および変異体ＴｃｄＢ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）が含まれる免疫原で免疫されたシリアンゴールデンハムスターから収集し、ここでその変異体毒素は例えば上記で記述された実施例２９、表１５に従ってＥＤＣにより不活性化され、リン酸アルミニウムと共に配合された。表３５における結果は、少なくともそれぞれの培養上清からの毒素Ｂがインビトロ中和アッセイにおいてその免疫されたハムスターからの血清により中和されたことを示している。

図２３は、ＩＭＲ−９０細胞における様々なＣ．ディフィシル株からの毒素調製物を用いた中和アッセイの結果を示す。そのデータは、ハムスター抗血清中のＴｃｄＢ中和抗体が、高病毒性株およびＴｃｄＡ陰性、ＴｃｄＢ陽性株を含め、試験した２１種類の分離株全てからの毒素を中和することができたことを示している。Ｃ．ディフィシルの少なくとも１６種類の異なる株をＣＤＣ（ジョージア州アトランタ）（前述）から得て、当該技術において既知であるような、および上記で記述したような適切な条件の下で、Ｃ．ディフィシル培地中で培養した。分泌された毒素を含有する培養上清を分析してそれらのＩＭＲ−９０単層に対する細胞毒性（ＥＣ_５０）を決定し、続いてリン酸アルミニウムと共に配合された変異体毒素Ａ原薬および変異体毒素Ｂ原薬で免疫されたハムスターからの様々な希釈度の血清を用いて、そのＥＣ_５０の４倍での標準的なインビトロ中和アッセイで試験した。それぞれの株の培養上清から得られた粗製の毒素および精製された毒素（ＬｉｓｔＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから得た市販の毒素）（それぞれの上清から精製されたものではない）を、上記で記述されたインビトロ細胞毒性アッセイを用いて、ＩＭＲ−９０細胞に対する細胞毒性に関して試験した。

図２３Ａ〜Ｋにおいて、そのグラフはインビトロ細胞毒性試験（前述）からの結果を示し、ここでＡＴＰレベル（ＲＬＵ）を以下：Ｃ．ディフィシル培養液およびハムスター血清のプール（■）；粗製の毒素およびハムスター血清のプール（●）；精製された毒素およびハムスター血清のプール（▲）；粗製の毒素（▼）、対照；ならびに精製された毒素（◆）、対照の増大する濃度に対してプロットした。それぞれの株からの毒素はその細胞に４×ＥＣ_５０値で添加された。

図２３Ａ〜Ｋで示されるように、記述された免疫原を与えられたハムスターは、驚くべきことに、少なくとも以下の１６種類の異なるＣ．ディフィシルのＣＤＣ株からの毒素に対してそれぞれの毒素のみの対照と比較して中和活性を示す中和抗体を発現した：２００７８８６（図２３Ａ）；２００６０１７（図２３Ｂ）；２００７０７０（図２３Ｃ）；２００７３０２（図２３Ｄ）；２００７８３８（図２３Ｅ）；２００７８８６（図２３Ｆ）；２００９２９２（図２３Ｇ）；２００４０１３（図２３Ｈ）；２００９１４１（図２３Ｉ）；２００５０２２（図２３Ｊ）；２００６３７６（図２３Ｋ）。それからの毒素が試験され、それがリン酸アルミニウム中で配合された変異体毒素Ａ原薬および変異体毒素Ｂ原薬が含まれる免疫原性組成物により中和された追加のＣ．ディフィシル株に関して、表３５も参照。

別の試験において、（ＣＤＣから、および英国のＬｅｅｄｓ病院から得た）様々なＣ．ディフィシル株からの分泌された毒素を含有する培養上清を、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌと共に配合された変異体毒素Ａ原薬および変異体毒素Ｂ原薬を投与されたハムスターからの血清を用いたインビトロ中和アッセイにおいて試験した。実験設計に関して表３６を参照。その結果を表３７および表３８において示す。

実施例３８：ＥＤＣ／ＮＨＳ三重変異体毒素のペプチドマッピング
ＥＤＣ／ＮＨＳで不活性化された三重変異体毒素を特性付けるため、ＥＤＣ／ＮＨＳで処理された三重変異体毒素Ａ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）の４ロットおよびＥＤＣ／ＮＨＳで処理された三重変異体毒素Ｂ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）の４ロットに対してペプチドマッピング実験を実施した。その変異体毒素をトリプシンで消化した後、結果として生じたペプチド断片を逆相ＨＰＬＣを用いて分離した。質量スペクトル分析を用いて、その不活性化プロセスの結果として起こった修飾を同定した。変異体毒素Ａ原薬および変異体毒素Ｂ原薬両方に関して、理論上のトリプシン消化ペプチド（ｔｒｙｐｔｉｃｐｅｐｔｉｄｅｓ）の９５％より多くが同定された。架橋およびグリシン付加物（グリシンはキャッピング剤として用いられた）が同定された。変異体毒素Ａ原薬および変異体毒素Ｂ原薬両方において、ベータ−アラニン付加物も観察された。機序または理論により束縛されるわけではないが、そのベータ−アラニン付加物は３モルのＮＨＳの１モルのＥＤＣとの反応の結果であるようであり、それはＮＨＳで活性化されたベータ−アラニンを形成する。次いでこの分子はリシン基と反応してベータ−アラニン付加物（＋７０Ｄａ）を形成することができる。ＥＤＣ／ＮＨＳで処理された三重変異体毒素Ｂの試料において、低レベル（０．０７モル／モルタンパク質）のデヒドロアラニン（−３４Ｄａ）も観察された。デヒドロアラニンはシステイン残基の脱スルホン化の結果である。同じタイプおよび程度の修飾がそれぞれの変異体毒素の４つのバッチ全てにおいて観察され、これはそのプロセスが一貫した生成物を生成することを示している。（９５％より大きい配列包括度での）ペプチドマッピングは、その修飾が存在することを確証している。その修飾の要約を表３９において示す。図２４〜２５も参照。加えて、その三重変異体毒素Ａ原薬の、および三重変異体毒素Ｂ原薬の大きさおよび電荷の不均一性は、化学的不活性化の非存在下でのそれぞれの三重変異体毒素Ａおよび三重変異体毒素Ｂの大きさおよび電荷の不均一性と比較して増大していた。結果として、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）および陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）のプロフィールは比較的広いピークを有していた（データは示していない）。

実施例３９：製剤の製造
Ｃ．ディフィシル免疫原性組成物（製剤）は、２種類の有効な医薬成分（変異体毒素Ａ原薬および変異体毒素Ｂ原薬）を含有する。典型的な製剤は、変異体毒素Ａ原薬および変異体毒素Ｂ原薬のそれぞれが含まれる、１０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７．４、４．５％（ｗ／ｗ）トレハロース二水和物、および０．０１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０を含有する凍結乾燥された配合物である。その免疫原性組成物は、その凍結乾燥されたワクチンを希釈剤を用いて、またはＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌを含有する希釈剤を用いてのどちらかで再懸濁することにより、注射用に調製される。プラセボには注射用の滅菌通常生理食塩水溶液（０．９％塩化ナトリウム）が含まれるであろう。

緩衝液の調製
注射用水（ＷＦＩ）を調剤容器に入れる。混合しながら賦形剤を添加して溶液になるまで溶解させる。そのｐＨを測定する。必要であれば、ｐＨをＨＣｌを用いて７．４±０．１に調節する。その溶液をＷＦＩにより最終重量まで希釈し、次いで０．２２μｍＭｉｌｌｉｐｏｒｅＥｘｐｒｅｓｓＳＨＣＸＬ１５０フィルターを用いて濾過する。濾過前の（ｐｒｅ−ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）生物負荷低減試料を濾過の前に得る。その濾過された緩衝液を、モル浸透圧濃度およびｐＨに関して試料採取する。

配合物の調製
解凍した変異体毒素原薬を、以下の操作の順序で予め計算した量に基づいて配合容器中にプールする：０．６ｍｇ／ｍＬを達成するための目標希釈緩衝液量の５０％をまずその容器に入れ、続いて変異体毒素Ａ原薬を添加し、１００ｒｐｍで５分間混合する。次いで変異体毒素Ｂ原薬をその容器に添加し、その溶液を０．６ｍｇ／ｍＬの希釈点までさらに希釈し、次いで１００ｒｐｍでさらに５分間混合する。試料を取り出し、総変異体毒素濃度に関して試験する。その溶液をプロセス中の変異体毒素濃度の値に基づいて１００パーセントの量まで希釈し、次いで１００ｒｐｍで１５分間混合する。配合された製剤を、濾過前の（ｐｒｅ−ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）ｐＨおよび生物負荷に関して試料採取する。次いで配合された製剤を一夜貯蔵に関してＭｉｌｌｉｐｏｒｅＥｘｐｒｅｓｓＳＨＣＸＬ１５０を用いて濾過し、または濾過滅菌のために充填ラインへと運ぶ。

その配合されたバルクを充填エリアへと運び、生物負荷に関して試料採取し、次いで２個の直列のＭｉｌｌｉｐｏｒｅＥｘｐｒｅｓｓＳＨＣＸＬ１５０フィルターで濾過滅菌する。その配合されたバルクを、発熱物質を除去されたガラスバイアル中に、０．７３ｍＬの目標充填量で充填する。その充填されたバイアルに部分的に栓をして、次いで凍結乾燥機中に装填する。凍結乾燥サイクルを表４１で示したように実施する。サイクルの完了時に、凍結乾燥チャンバーに窒素を０．８ａｔｍまで戻し充填し（ｂａｃｋ−ｆｉｌｌｅｄ）、次いで栓を完全に締める（ｓｅａｔｅｄ）。チャンバーから取り出し、そのバイアルにフリップオフ式の封を用いて蓋をする。

製剤の安定性のデータを表４２において要約する。そのデータは、その製剤が２〜８℃で少なくとも３ヶ月間または２５℃もしくは４０℃で少なくとも１ヶ月間の貯蔵の間、物理的および化学的に安定であることを示唆している。両方の貯蔵条件下で、試験した最近の時点まで、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により検出される不純物のレベルは変化せず、インビトロ抗原性における変化もなかった。

実施例４０；ワクチン希釈剤
生理食塩水に関して、再構成の際の等張溶液を確実にするため、６０ｍＭＮａＣｌがアジュバントを一切含まない凍結乾燥された製剤に関する希釈剤として用いられる。

Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ：Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ“８５”２％（Ｂｒｅｎｎｔａｇ）は、水酸化アルミニウムの八面体結晶シートからなる商業的に入手可能な適正製造基準（ＧＭＰ）グレードの製品である。典型的なＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ希釈剤配合物を、表４３において示す。その典型的な配合は、上記で記述された製剤との組み合わせで用いることができる。

Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌアジュバントを用いた試験は、ｐＨ６．０から７．５までにおいて、変異体毒素Ａ原薬および変異体毒素Ｂ原薬の１ｍｇＡｌ／ｍＬＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌへの１００％の結合を示す。両方の原薬の最大結合は、試験した最も高いタンパク質濃度（それぞれ３００μｇ／ｍＬ）において見られた。

タンパク質のＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌへの結合を、２００μｇ／ｍＬのそれぞれの原薬および０．２５から１．５ｍｇ／ｍＬまでの範囲のＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌを含有する凍結乾燥された製剤配合物によっても試験した。その製剤を様々な濃度のＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌを含有する希釈剤を用いて再構成し、結合したそれぞれの変異体毒素のパーセントを測定した。Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌの全ての試験した濃度は、その抗原の１００％の結合を示した。

変異体毒素Ａ原薬および変異体毒素Ｂ原薬（それぞれ２００μｇ／ｍＬ）の目標用量におけるタンパク質のＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌへの結合速度論も評価した。その結果は、その変異体毒素原薬の１００％が２４時間のＲＴでの時間経過全体を通してＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌに結合していたことを示している。

ＣｐＧ２４５５５およびＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ：ＣｐＧ２４５５５は、配列５−ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴ−３（ＳＥＱＩＤＮＯ：４８）を有する合成２１塩基長オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である。ＣｐＧ２４５５５およびＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ希釈剤の組み合わせに関する典型的な配合を表４４において示す。その典型的な配合は、上記で記述された製剤との組み合わせで用いることができる。

ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）：ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）アジュバントは、当該技術で既知のサポニンに基づくアジュバントである。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）アジュバント配合物に関する典型的な配合を表４５において示す。その典型的な配合は、上記で記述された製剤との組み合わせで用いることができる。

実施例４１：ＮＨＰモデルにおけるＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌで抗原性補強した変異体毒素原薬組成物の免疫原性および前臨床概念実証
ＮＨＰ、特にカニクイザル・マカクにおけるＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌで抗原性補強した変異体毒素Ａ原薬および変異体毒素Ｂ原薬組成物の免疫原性を評価した。２週間間隔（０、２、４週目）で投与あたり１０μｇのそれぞれの変異体毒素Ａ原薬および変異体毒素Ｂ原薬組成物（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌと共に配合）で免疫されたＮＨＰは、強い中和抗毒素応答を発現した。表４６参照。抗毒素Ａおよび抗毒素Ｂ中和応答の両方が３回目の免疫処置後に保護範囲に達し、少なくとも３３週目（試験した最後の時点）を通して保護範囲内またはその上に留まっていた。

カニクイザル・マカク（ｎ＝８）を、０、２および４週目において、２５０μｇのＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ中で配合されたそれぞれ１０μｇの変異体毒素Ａ原薬および変異体毒素Ｂ原薬でＩＭで免疫した。それぞれの時点において血清を収集し、機能的抗毒素活性に関して毒素中和アッセイにおいて分析した。ＧＭＴを表４６において提供する。その表で提供されている保護力価範囲は中和抗体力価範囲を表しており、それはＭｅｒｃｋモノクローナル抗体療法試験におけるＣ．ディフィシル感染の再発における有意な低減と相関している。

ＭｅｒｃｋｍＡｂ療法試験からのヒト保護抗体力価の、ＮＨＰにおけるＰｆｉｚｅｒのワクチン候補により誘導された力価に対する相関
Ｍｅｒｃｋ／ＭｅｄａｒｅｘｍＡｂによる第２相有効性試験(Lowy et al., N Engl J Med. 2010 Jan 21;362(3):197-205)は、血清中の中和性抗毒素ｍＡｂのレベルおよびＣＤＡＤの再発の予防の間の相関を実証しているようである。その毒素特異的ｍＡｂのヒトへの投与の後、ヒトの受容者における１０〜１００μｇ／ｍＬの範囲の血清抗体レベルは再発に対して保護するようである（ＣＤＡＤの再発における７０％の低減）。

変異体毒素原薬が含まれる免疫原性組成物を、その免疫原性組成物がヒトにおいて潜在的に有効な中和抗体応答を誘導することができるかどうかを評価するため、Ｍｅｒｃｋ／Ｍｅｄａｒｅｘ第２相試験からの公開されたデータをＮＨＰモデルにおいてその免疫原性組成物により誘導された抗体のレベルと比較することにより試験した。これは、Ｍｅｒｃｋ／ＭｅｄａｒｅｘｍＡｂの以前に公開された特徴を利用して再発の徴候を示さない対象から得られた血清中のこれらのｍＡｂの範囲（１０〜１００μｇ／ｍＬ）を５０％中和力価に変換し、これらの力価（“保護力価範囲”）を本明細書で記述される前臨床モデルにおいて観察された力価と比較することにより成し遂げられた。表４６で示されるように、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌで抗原性補強された変異体毒素Ａ原薬および変異体毒素Ｂ原薬が含まれる免疫原性組成物はＮＨＰにおいて免疫応答を生じさせ、それは３回目の投与後に“保護範囲”に達し、３３週目を通してこの範囲内またはその上に留まっていた。ＮＨＰにおいて本発明のＣ．ディフィシル免疫原性組成物により誘導された毒素中和抗体のレベルは、ＣＤＡＤの再発から保護されたようであったＭｅｒｃｋ／Ｍｅｄａｒｅｘ試験の対象における血清抗体レベルに匹敵する。

実施例４２：ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸまたはＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ／ＣｐＧ２４５５５（Ａｌｈ／ＣｐＧ）で抗原性補強された変異体毒素原薬組成物のＮＨＰモデルにおける免疫原性
ＮＨＰにおいて、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸおよびＡｌｈ／ＣｐＧは両方とも、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌのみと共に投与されたワクチンと比較した場合に、抗毒素ＡおよびＢの中和力価を統計的に有意に高めた（表４７）。バックグラウンドより上の抗毒素応答は、Ａｌｈ／ＣｐＧまたはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸのどちらかと共に投与されたワクチンにより、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌのみ（４〜６週目）と比較してより早い時点で誘発され（２〜４週目）、それはヒトにおけるＣＤＡＤの再発からの保護に対して重要な作用を有する可能性がある。Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌと比較して、Ａｌｈ／ＣｐＧにより、またはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸにより抗原性補強された免疫原性組成物は保護範囲（実施例４１も参照）に達する抗毒素中和力価をより迅速に生成し、それはこの範囲内またはこの範囲より上に３３週目を通して留まっている。

表４７において示されるように、カニクイザル・マカクを、０、２、および４週目において、２５０μｇのＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（ｎ＝８）、または５００μＭのＣｐＧ＋２５０μｇのＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（ｎ＝１０）、または４５ＵのＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（ｎ＝１０）中で配合されたそれぞれ１０μｇの変異体毒素Ａ原薬および変異体毒素Ｂ原薬で、ＩＭで免疫した。それぞれの時点において血清を収集し、機能的抗毒素活性に関して上記で記述された毒素中和アッセイで分析した。ＧＭＴを表中に列挙する。アスタリスク（^＊）は、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ群における力価と比較した場合の統計的有意性（ｐ＜０．０５）を示す。保護力価範囲は、Ｍｅｒｃｋ／ＭｅｄａｒｅｘｍＡｂ療法試験に従うＣ．ディフィシル感染の再発における有意な低減と相関する中和抗体力価範囲を表す。

ＮＨＰにおいて生成された中和抗毒素抗体力価に対する、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸまたはＡｌｈ／ＣｐＧアジュバントの存在下で投与された変異体毒素Ａ原薬および変異体毒素Ｂ原薬の用量も評価した。１つの試験において、ＮＨＰにＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ中で配合された低（１０μｇ）または高（１００μｇ）用量のそれぞれの変異体毒素原薬を投与した。応答を免疫処置後のそれぞれの時点において比較した。表４８で示されるように、抗毒素中和力価は両方の処置群において強かった。抗毒素Ａ力価はほとんどの時点において低用量群および高用量群の間でほぼ同等であり、一方で抗毒素Ｂ力価に関しては高用量群においてより高い傾向があった。

表４８で示されるように、カニクイザル・マカク（ｎ＝５）を、０、２、および４週目において、４５ＵのＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸと共に配合されたそれぞれ１０μｇまたは１００μｇの変異体毒素Ａ原薬および変異体毒素Ｂ原薬で、ＩＭで免疫した。それぞれの時点において血清を収集し、機能的抗毒素活性に関して毒素中和アッセイで分析した。ＧＭＴを表中に列挙する。保護力価範囲は、Ｍｅｒｃｋ／ＭｅｄａｒｅｘｍＡｂ療法試験でのＣ．ディフィシル感染の再発における有意な低減と相関する中和抗体力価範囲を表す。

抗毒素Ｂ応答の速度論を高めるための試みにおいて、ＮＨＰを、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸまたはＡｌｈ／ＣｐＧアジュバントの存在下で増大する容量の変異体毒素Ｂ原薬（１０、５０、または１００μｇ）と混合した一定用量の変異体毒素Ａ原薬（１０μｇ）で免疫した。アジュバントに関わらず、より高い用量の変異体毒素Ｂ原薬（５０または１００μｇのどちらか）を与えられた群に関して、１０μｇ用量の変異体毒素Ｂ薬物と比較してより高い抗毒素Ｂ中和応答を誘導する傾向があった（表５０、統計的に有意な増大を示すため、^＊の印を付けた）。この傾向は、最後の免疫処置後のほとんどの時点において観察された。しかし、いくつかの場合において、抗毒素Ａ中和応答は変異体毒素Ｂの量が増大した際に統計的に有意な減少を示した（表４９において＾の印を付けた）。

表４９および表５０で示されるように、ＮＨＰ（群あたり１０匹）を、０、２、および４週目において、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（投与あたり４５Ｕ）と共に、またはＡｌｈ／ＣｐＧ（投与あたり２５０μｇ／５００μｇ）と共に配合された異なる比率の変異体毒素Ａ原薬および変異体毒素Ｂ原薬（１０μｇの変異体毒素Ａ原薬に加えて１０、５０、または１００μｇいずれかの変異体毒素Ｂ原薬；表４９および表５０においてそれぞれ１０Ａ：１０Ｂ、１０Ａ：５０Ｂおよび１０Ａ：１００Ｂと表されている）で、ＩＭで免疫した。表４９は抗毒素Ａ力価を示す。表５０は抗毒素Ｂ力価を示す。ＧＭＴを表中に列挙する。保護力価範囲は、ＭｅｒｃｋｍＡｂ療法試験でのＣ．ディフィシル感染の再発における有意な低減と相関する中和抗体力価範囲を表す。記号＾は、中和力価における１０Ａ：１０Ｂ群と比較した統計的に有意な減少（ｐ＜０．０５）を表す。アスタリスクの記号^＊は、中和力価における１０Ａ：１０Ｂ群と比較した統計的に有意な増大（ｐ＜０．０５）を表す。

実施例４３：カニクイザルにおける免疫原性組成物による４週間の回復期間を有する５週反復投与ＩＭ毒性試験
カニクイザルにおけるＰＦ−０６４２５０９５（水酸化アルミニウムおよびＣｐＧ２４５５５アジュバントとの組み合わせでの三重変異体毒素Ａ原薬および三重変異体毒素Ｂ原薬が含まれる免疫原性組成物）を用いた５週ＩＭ反復投与毒性試験を、水酸化アルミニウムおよびＣｐＧ２４５５５アジュバントとの組み合わせでのＣ．ディフィシル三重変異体毒素Ａ原薬および三重変異体毒素Ｂ原薬（ＰＦ−０６４２５０９５）の可能性のある毒性および免疫原性を評価するために実施した。０．２または０．４ｍｇ／投与でのＰＦ−０６４２５０９５、三重変異体毒素Ａ原薬および三重変異体毒素Ｂ原薬（それぞれ低および高用量の免疫原性組成物群）、水酸化アルミニウムとして０．５ｍｇのアルミニウム、および１ｍｇのＣｐＧ２４５５５ならびにアジュバントの組み合わせのみ（水酸化アルミニウム＋ＣｐＧ２４５５５；ＰＦ−０６３７６９１５）をカニクイザル（６匹／性別／群）にＩＭで予備刺激投与（ｐｒｉｍｅｄｏｓｅ）として投与し、続いて３回の追加免疫投与を行った（１、８、２２、および３６日目）。別個の群の動物（６匹／性別）に、おおよそ７．０のｐＨの０．９％等張生理食塩水を与えた。その免疫原性組成物のビヒクルは、ｐＨ７．４の１０ｍＭトリス緩衝液、４．５％トレハロース二水和物、および０．１％ポリソルベート８０で構成されていた。アジュバント対照のビヒクルは、６０ｎＭＮａＣｌを含むｐＨ６．５の１０ｍＭヒスチジン緩衝液で構成されていた。総投与量は注射あたり０．５ｍＬであった。全ての用量は左および／または右四頭筋（ｑｕａｒｄｒｉｃｅｐｓｍｕｓｃｌｅ）中に投与された。選択された動物は、その試験の投与期の間に観察されるあらゆる作用の可逆性を評価するため、４週間の投与なしの観察期間を経た。

この試験において、不都合な所見はなかった。ＰＦ−０６４２５０９５は十分に耐容され、全身毒性の証拠なしで局所的な炎症反応のみをもたらした。投与期の間、４および３８日目においてフィブリノーゲン（２３．１％〜２．３倍）、ならびに４（２．１倍〜２７．５倍）および３８（２．３倍〜１０１．５倍）日目においてＣ反応性タンパク質、ならびに３６および／または３８日目においてグロブリン（１１．１％〜２４．１％）における事前調査からの用量依存性の増大が免疫原性組成物で処置された群において見られ、それは抗原性補強された免疫原性組成物の投与に対する予想された炎症反応と一致していた。

４日目に気付かれたフィブリノーゲンおよびＣ反応性タンパク質における増大は、高用量免疫原性組成物群においてのみ、フィブリノーゲン（２５．６％〜６５．５％）およびＣ反応性タンパク質（４．５倍および５．６倍）における増大により、８日目までに部分的に回復した。インターロイキン（ＩＬ）−６における増大は、低および高用量免疫原性組成物群において、１日目、３時間目（８．３倍〜１２７．２倍の個々の値、１日目、０時間目、用量応答）および３６日目、３時間目（９．４倍〜３９．５倍の個々の値、３６日目、０時間目）において観察された。他のサイトカイン類（ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、インターフェロン誘導性タンパク質（ＩＰ−１０）および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）では変化は観察されなかった。これらの急性期タンパク質およびサイトカインにおける増大は、外来抗原の投与に対する予想された正常な生理的応答の一部であった。これらの臨床病理パラメーターにおけるＰＦ−０６４２５０９５に関連する、またはアジュバントに関連する変化は、回復期には存在しなかった（サイトカイン類は回復期の間は評価されなかった）。加えて、注射部位において局在性の変化が存在し、それはアジュバント対照群ならびに低および高用量免疫原性組成物群において類似の発生率および重症度であり；従ってそれらはＰＦ−０６４２５０９５に直接関連していなかった。投与期の間、その変化にはマクロファージの浸潤による筋線維の分離を特徴とする最小限〜中程度の慢性活動性炎症が含まれ、それはしばしば好塩基性粒状物質（アルミニウム含有アジュバントと解釈される）、リンパ球、形質細胞、好中球、好酸球、壊死性残屑、および浮腫を含有していた。その好塩基性粒状物質は、これらの慢性活動性炎症の病巣内で細胞外にも存在していた。回復期の終了時に、最小限〜中程度の慢性炎症および単核細胞の浸潤、ならびに最小限の線維化が存在していた。これらの注射部位の所見は、そのアジュバントに対する局所的な炎症反応を表す。他の顕微鏡的変化には、腸骨（流入領域）リンパ節における最小限〜中程度の増大したリンパ系細胞充実度および脾臓中の胚中心における最小限の増大した細胞充実度が含まれ、それはアジュバント対照群ならびに低および高用量免疫原性組成物群において投与期の間に気付かれた。回復期の終了時に、これらの顕微鏡的所見はより低い重症度であった。これらの作用は抗原刺激に対する免疫応答を表しており、アジュバントまたはＰＦ−０６４２５０９５に対する薬理学的応答であった。抗ＤＮＡ抗体における試験物に関連する増大はなかった。

不都合な所見の非存在に基づいて、この試験における最大無毒性量（ＮＯＡＥＬ）は、４回の投与に関して２回の０．５ｍＬの注射として投与された高用量免疫原性組成物群（０．４ｍｇのＰＦ−０６４２５０９５としての三重変異体毒素Ａ原薬および三重変異体毒素Ｂ原薬／投与）である。

実施例４４：ハムスターに受動的に移された血清陽性ＮＨＰの有効性
５匹のシリアンゴールデンハムスターの群に、正常な腸内細菌叢を崩壊させるためにクリンダマイシン抗生物質の経口用量（３０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。５日後、そのハムスターに野生型Ｃ．ディフィシルの芽胞（６３０株、動物あたり１００ｃｆｕ）の経口用量で負荷を与え、表５１に従うＮＨＰ血清を腹腔内（ＩＰ）投与した。機序または理論により束縛されるわけではないが、その芽胞による負荷後の疾患症状は典型的には負荷の約３０〜４８時間後に開始を示す。

そのハムスターに投与されたＮＨＰ血清は、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸと共に配合された変異体毒素Ａ原薬および変異体毒素Ｂ原薬（１０：１０、１０：５０、および１０：１００Ａ：Ｂの比率）による３回の免疫処置後に最も高い力価を示しているＮＨＰ血清試料（抗毒素Ａ血清および抗毒素Ｂ血清）からプールされた（実施例４２、表４９、および表５０を参照）。そのＮＨＰ血清は、実施例４２において記述されたように、５、６、および８週目の時点（免疫処置は０、２、および４週目に行われた）から収集された。結果を下記の表５２〜５４において示す。記号“＋”は、不応答動物である３番の動物を含まない幾何平均（ＧＭ）を（）中に示す。“^＊ＴＢ”は最後の採血を表し、その日にその動物を安楽死させ、それは全ての動物に関して同じではない。

別の試験において、シリアンゴールデンハムスターに正常な腸内細菌叢を崩壊させるためにクリンダマイシン抗生物質の経口用量（３０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。５日後、そのハムスターに野生型Ｃ．ディフィシルの芽胞（６３０株、動物あたり１００ｃｆｕ）の経口用量で負荷を与え、表５５に従うＮＨＰ血清を腹腔内（ＩＰ）投与した。機序または理論により束縛されるわけではないが、その芽胞による負荷後の疾患症状は典型的には負荷の約３０〜４８時間後に開始を示す。

そのハムスターに投与されたＮＨＰ血清は、ＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌおよびＣｐＧ２４５５５と共に配合された変異体毒素Ａ原薬および変異体毒素Ｂ原薬（１０：１０、１０：５０、および１０：１００Ａ：Ｂの比率）による３回の免疫処置後にＮＨＰから収集された試料からプールされた（実施例４２、表４９、および表５０を参照）。そのＮＨＰ血清は、実施例４２において記述されたように、５、６、８、および１２週目の時点（ＮＨＰは０、２、および４週目に免疫された）から収集された。結果を下記の表５６〜５９において示す。ハムスターからの血清を阻止濃度（ＩＣ_５０）の値を決定するためにさらに調べ、それは上記で記述された毒素中和アッセイを用いて決定された。ハムスターにおいて本発明のＣ．ディフィシル免疫原性組成物により誘導された毒素中和抗体のレベルは、ＣＤＡＤの再発から保護されたようであったＭｅｒｃｋ／Ｍｅｄａｒｅｘ試験の対象における血清抗体レベルに匹敵する。

実施例４５：変異体毒素原薬の特性付け
三重変異体毒素Ａの一次構造をＳＥＱＩＤＮＯ：４において示す。ＳＥＱＩＤＮＯ：４の１位におけるＮＨ_２末端Ｍｅｔ残基はＳＥＱＩＤＮＯ：１２の開始コドンに由来し、単離されたタンパク質には存在しない（例えばＳＥＱＩＤＮＯ：８４を参照）。従って、実施例１２〜実施例４５において、“ＳＥＱＩＤＮＯ：４”は最初の（１位の）メチオニンが存在しないＳＥＱＩＤＮＯ：４を指す。精製された三重変異体毒素Ａ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）（原薬中間体−ロットＬ４４９９３−１３２）およびＥＤＣ／ＮＨＳ処理された三重変異体毒素Ａ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）（“変異体毒素Ａ原薬”−ロットＬ４４８９８−０１２）は両方ともＳＬＩＳＫＥＥＬＩＫＬＡＹＳＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４の２〜１６位）で開始する単一のＮＨ_２末端配列を示した。

三重変異体毒素Ｂの一次構造をＳＥＱＩＤＮＯ：６において示す。ＳＥＱＩＤＮＯ：６の１位におけるＮＨ_２末端Ｍｅｔ残基は開始コドンに由来し、単離されたタンパク質には存在しない（例えばＳＥＱＩＤＮＯ：８６を参照）。従って、実施例１２〜実施例４５において、“ＳＥＱＩＤＮＯ：６”は最初の（１位の）メチオニンが存在しないＳＥＱＩＤＮＯ：６を指す。精製された三重変異体毒素Ｂ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）（原薬中間体−ロット０１０）およびＥＤＣ／ＮＨＳ処理された三重変異体毒素Ｂ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）（“変異体毒素Ｂ原薬”−ロットＬ４４９０６−１５３）は両方ともＳＬＶＮＲＫＱＬＥＫＭＡＮＶＲ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６の２〜１６位）で開始する単一のＮＨ_２末端配列を示した。

円二色性（ＣＤ）分光法を用いて、三重変異体Ａ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）および変異体毒素Ａ原薬の二次および三次構造を評価した。ＣＤ分光法を用いて、三重変異体Ｂ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）および変異体毒素Ｂ原薬の二次および三次構造も評価した。ＣＤ分光法を用いて、ｐＨの構造に対する可能性のある作用も評価した。ＥＤＣ処理の三重変異体毒素Ａへの作用を、変異体毒素Ａ原薬に関して得られたＣＤデータを三重変異体毒素Ａに関して得られたデータと比較することにより分析した。ＥＤＣ処理の三重変異体毒素Ｂ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）への作用を、変異体毒素Ｂ原薬に関して得られたＣＤデータを三重変異体毒素Ｂに関して得られたデータと比較することにより分析した。

変異体毒素Ａ原薬の遠紫外ＣＤデータを様々なｐＨにおいて得た。ｐＨ５．０〜７．０で記録されたスペクトルはその二次構造中のαヘリックスの高い割合を示しており、これはそのタンパク質のポリペプチド主鎖がαヘリックスに支配される十分に定められた（ｗｅｌｌ−ｄｅｆｉｎｅｄ）立体構造をとっていることを示唆している。

変異体毒素Ａ原薬の近紫外ＣＤスペクトルも得た。２６０〜３００ｎｍの強い負の楕円率は、芳香族側鎖が唯一の固定した環境中にあること、すなわち変異体毒素Ａ原薬が三次構造を有していることを示すものである。実際、個々の芳香族側鎖のタイプに起因する特徴的な特徴をそのスペクトル内で識別することができる：約２９０ｎｍにおける肩および約２８３ｎｍにおける最も大きな負のピークは規則正しいトリプトファン側鎖による偏光の吸収によるものであり、２７６ｎｍにおける負のピークはチロシン側鎖からのものであり、２６２および２６８ｎｍにおける小さい肩は三次接触に参加しているフェニルアラニン残基を示している。遠および近紫外の結果は、変異体毒素Ａ原薬が生理的ｐＨにおいてコンパクトに折りたたまれた構造を保持している証拠を提供する。ｐＨ５．０〜７．０において観察されたほぼ同一の遠および近紫外ＣＤスペクトルは、このｐＨ範囲内では検出可能な構造変化は起こっていないことを示している。ＣＤデータはｐＨ３．０および４．０では収集することができず、これはそのタンパク質がこれらのｐＨ点では不溶性であったためである。変異体毒素Ａ原薬の遠および近紫外ＣＤスペクトルの三重変異体毒素Ａの遠および近紫外ＣＤスペクトルとの比較において、両方のタンパク質のスペクトルは試験した実験条件の全ての下で本質的に同一であり、これはＥＤＣ処理が三重変異体毒素Ａの二次および三次構造に検出可能な作用を有しなかったことを示している。この発見は、それぞれストークス半径および沈降／摩擦係数において検出可能な変化を示さないゲル濾過および分析用超遠心法の結果と一致している。

変異体毒素Ａ原薬（ならびに三重変異体毒素Ａ）は２５個のトリプトファン残基を含有し、それは一次配列全体にわたって分布しており、便利な内在性蛍光プローブの役目を果たすことができる。温度の関数としての変異体毒素Ａ原薬の３００〜４００ｎｍの蛍光発光スペクトルを得た。６．８℃において、変異体毒素Ａ原薬は２８０ｎｍでの励起の際に特徴的なトリプトファン蛍光発光スペクトルを示す。蛍光発光最大値は約３３５ｎｍにおいて観察され、これはトリプトファン残基が極性の水性環境ではなくタンパク質内部に典型的な非極性の環境中にあることを示している。その蛍光発光スペクトルの結果は、この報告で提供されるＣＤ実験の結果と合わせて、変異体毒素Ａ原薬がコンパクトに折りたたまれた構造を保持していることを確証している。

外来のプローブである８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸（８−ａｎｉｌｉｎｏ−１−ｎａｐｈｔａｌｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ）（ＡＮＳ）の蛍光を用いて、ｐＨにおける変化の際の変異体毒素Ａ原薬および三重変異体毒素Ａにおける可能性のある立体構造変化を特性付けた。その結果から分かるように、変異体毒素Ａ原薬または三重変異体毒素ＡのどちらをｐＨ７．０においてそのプローブで滴定した（ｔｉｔｒａｔｅｄ）際にもＡＮＳ蛍光強度における増大は本質的に存在せず、これはこれらの条件下ではそのタンパク質上に疎水性表面は露出していないことを示唆している。ｐＨを２．６に変えることは、プローブの濃度における増大の際のＡＮＳ蛍光量子収率における、蛍光量子収率が見かけ上の飽和に達するまでの劇的な増大をもたらす。このＡＮＳ蛍光量子収率における増大は、低いｐＨ（２．６）において、変異体毒素Ａ原薬および三重変異体毒素Ａの両方が疎水性表面を露出させるｐＨに誘導される立体構造変化を起こすことを示している。そのような立体構造変化は、三重変異体毒素ＡのＥＤＣに誘導される修飾および不活性化は変異体毒素Ａ原薬（ＤＳ）の立体構造の柔軟性を制限しなかったことを示している。

ＥＤＣ処理の三重変異体毒素Ａの水力学的特性への作用を、Ｇ４０００ＳＷＸＬカラム上でのサイズ排除クロマトグラフィーを用いて評価した。変異体毒素Ａ原薬および三重変異体毒素Ａを、ｐＨ７．０、６．０、および５．０で平衡化したＧ４０００ＳＷＸＬカラム上に注入した。そのデータは、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて変異体毒素Ａ原薬および三重変異体毒素Ａのストークス半径における違いを検出することができなかったことを示している。従って、ＥＤＣ処理は三重変異体毒素Ａの水力学的特性およびそれに対応して全体的な分子の形状に劇的には影響を及ぼさなかった。

三重変異体毒素Ａおよび変異体毒素Ａ原薬のさらなる分析を、多角度レーザー光散乱（ＭＡＬＬＳ）技法を用いて実施した。三重変異体毒素ＡのＥＤＣによる処理は、結果として様々な多量体および単量体の種からなる不均質な混合物の生成をもたらした。そのような不均質性は、そのタンパク質のカルボキシルおよび第１級アミンの間の多数のＥＤＣに誘導される分子間および分子内共有結合の導入を反映している。

得られたデータは、三重変異体毒素Ａおよび変異体毒素Ａ原薬（ＥＤＣで処理された三重変異体毒素Ａ）の物理的および化学的特徴を提供し、それらの一次、二次、および三次構造の重要な特徴を記述している。生成されたデータは、三重変異体毒素ＡのＥＤＣによる処理は結果としてそのポリペプチド鎖の共有結合性修飾をもたらしたが、そのタンパク質の二次および三次構造には影響を及ぼさなかったことを実証している。ＥＤＣによる処理は分子内および分子間架橋をもたらす。変異体毒素Ａ原薬（ならびに三重変異体毒素Ａ）に関して得られた生化学的および生物物理学的パラメーターを表６０において提供する。

変異体毒素Ｂ原薬の遠紫外ＣＤデータを様々なｐＨにおいて得た。ｐＨ５．０〜７．０で記録されたスペクトルはその二次構造中のαヘリックスの高い割合を示しており、これはそのタンパク質のポリペプチド主鎖がαヘリックスに支配される十分に定められた（ｗｅｌｌ−ｄｅｆｉｎｅｄ）立体構造をとっていることを示唆している。

変異体毒素Ｂ原薬の近紫外ＣＤスペクトルも得た。２６０〜３００ｎｍの強い負の楕円率は、芳香族側鎖が唯一の固定した環境中にあること、すなわち変異体毒素Ｂ原薬が三次構造を有していることを示すものである。実際、個々の芳香族側鎖のタイプに起因する特徴的な特徴をそのスペクトル内で識別することができる：約２９０ｎｍにおける肩および約２８３ｎｍにおける最も大きな負のピークは規則正しいトリプトファン側鎖による偏光の吸収によるものであり、２７６ｎｍにおける負のピークはチロシン側鎖からのものであり、２６２および２６８ｎｍにおける小さい肩は三次接触に参加しているフェニルアラニン残基を示している。遠および近紫外ＣＤスペクトルは、変異体毒素Ｂ原薬が生理的ｐＨにおいてコンパクトに折りたたまれた構造を保持している証拠を提供する。ｐＨ５．０〜７．０において観察された非常に類似した遠および近紫外ＣＤスペクトルは、このｐＨ範囲内では検出可能な二次または三次の構造変化は起こっていないことを示している。ＣＤデータはｐＨ３．０および４．０では収集することができず、これはそのタンパク質がこれらのｐＨ点では不溶性であったためである。

変異体毒素Ｂ原薬の遠および近紫外ＣＤスペクトルの三重変異体毒素Ｂの遠および近紫外ＣＤスペクトルとの比較において、両方のタンパク質のスペクトルはｐＨ５．０〜７．０において非常に類似しており、これはＥＤＣ処理がそのタンパク質の二次および三次構造に検出可能な作用を有しなかったことを示している。

三重変異体毒素Ｂは１６個のトリプトファン残基を含有し、それは一次配列全体にわたって分布しており、便利な内在性蛍光プローブの役目を果たすことができる。温度の関数としての変異体毒素Ｂ原薬の３００〜４００ｎｍの蛍光発光スペクトルを得た。７℃において、変異体毒素Ｂ原薬は２８０ｎｍでの励起の際に特徴的なトリプトファン蛍光発光スペクトルを示す。蛍光発光最大値は約３３５ｎｍにおいて観察され、これはトリプトファン残基が極性の水性環境ではなくタンパク質内部に典型的な非極性の環境中にあることを示している。この結果は、ＣＤ実験の結果（上記参照）と合わせて、変異体毒素Ｂ原薬がコンパクトに折りたたまれた構造を保持していることを確証している。

外来のプローブである８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸（８−ａｎｉｌｉｎｏ−１−ｎａｐｈｔａｌｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ）（ＡＮＳ）の蛍光を用いて、ｐＨにおける変化の際の変異体毒素Ｂ原薬および三重変異体毒素Ｂにおける可能性のある立体構造変化を特性付けた。その結果から分かるように、変異体毒素Ｂ原薬または三重変異体毒素ＢのどちらをｐＨ７．０においてそのプローブで滴定した（ｔｉｔｒａｔｅｄ）際にもＡＮＳ蛍光強度における増大は本質的に存在せず、これはこれらの条件下ではそのタンパク質上に疎水性表面は露出していないことを示唆している。ｐＨを２．６に変えることは、変異体毒素Ｂ原薬の存在下でのプローブの濃度における増大の際のＡＮＳ蛍光量子収率における、蛍光量子収率が見かけ上の飽和に達するまでの劇的な増大をもたらす。このＡＮＳ蛍光量子収率における増大は、低いｐＨ（２．６）において、変異体毒素Ｂ原薬が疎水性表面を露出させるｐＨに誘導される立体構造変化を起こすことを示している。そのような立体構造変化は、三重変異体毒素ＢのＥＤＣに誘導される修飾および不活性化は変異体毒素Ｂ原薬（ＤＳ）の立体構造の柔軟性を制限しなかったことを示している。

ＥＤＣ処理の三重変異体毒素Ｂの水力学的特性への作用を、Ｇ４０００ＳＷＸＬカラム上でのサイズ排除クロマトグラフィーを用いて評価した。変異体毒素Ｂ原薬および三重変異体毒素Ｂを、ｐＨ７．０、６．０、５．０で平衡化したＧ４０００ＳＷＸＬカラム上に注入した。そのデータは、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて変異体毒素Ｂ原薬および三重変異体毒素Ｂのストークス半径における違いを検出することができなかったことを示しており、従って、ＥＤＣ処理はそのタンパク質の水力学的特性およびそれに対応して全体的な分子の形状に劇的には影響を及ぼさなかった。

三重変異体毒素Ｂおよび変異体毒素Ｂ原薬のさらなる分析を、多角度レーザー光散乱（ＭＡＬＬＳ）技法を用いて実施した。三重変異体毒素ＢのＥＤＣによる処理は、結果として様々な多量体および単量体の種からなるより不均質な混合物の生成をもたらした。そのような不均質性は、そのタンパク質のカルボキシルおよび第１級アミンの間の多数のＥＤＣに誘導される分子間および分子内共有結合の導入を反映している。

得られたデータは、三重変異体毒素Ｂおよび変異体毒素Ｂ原薬（ＥＤＣで処理された三重変異体毒素Ｂ）の物理的および化学的特徴を提供し、それらの一次、二次、および三次構造の重要な特徴を記述している。生成されたデータは、三重変異体毒素ＢのＥＤＣによる処理は結果としてそのポリペプチド鎖の共有結合性修飾をもたらしたが、そのタンパク質の二次および三次構造には影響を及ぼさなかったことを実証している。ＥＤＣによる処理は分子内および分子間架橋をもたらす。変異体毒素Ｂ原薬（ならびに三重変異体毒素Ｂ）に関して得られた主要な生化学的および生物物理学的パラメーターを表６１において提供する。

本発明の側面
以下の条項は、本発明の追加の態様を記述する：
Ｃ１．ＳＥＱＩＤＮＯ：４で示されるアミノ酸配列が含まれる単離されたポリペプチドであって、１位のメチオニン残基が場合により存在せず、且つ該ポリペプチドに１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）により化学的に修飾された少なくとも１個のアミノ酸側鎖が含まれる、前記単離されたポリペプチド。

Ｃ２．ＳＥＱＩＤＮＯ：６で示されるアミノ酸配列が含まれる単離されたポリペプチドであって、１位のメチオニン残基が場合により存在せず、且つ該ポリペプチドに１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）により化学的に修飾されたアミノ酸側鎖が含まれる、前記単離されたポリペプチド。

Ｃ３．ポリペプチドのアスパラギン酸残基の少なくとも１個の側鎖またはポリペプチドのグルタミン酸残基の少なくとも１個の側鎖がグリシンにより化学的に修飾されている、条項Ｃ１またはＣ２に記載の単離されたポリペプチド。

Ｃ４．ポリペプチドに以下：
ａ）ポリペプチドのアスパラギン酸残基の側鎖およびポリペプチドのリシン酸残基の側鎖の間の少なくとも１個の架橋；ならびに
ｂ）ポリペプチドのグルタミン酸残基の側鎖およびポリペプチドのリシン酸残基の側鎖の間の少なくとも１個の架橋
が含まれる、条項Ｃ１〜Ｃ３のいずれかに記載の単離されたポリペプチド。

Ｃ５．ポリペプチドに該ポリペプチドの少なくとも１個のリシン残基の側鎖に連結されたベータ−アラニン部分が含まれる、条項Ｃ１〜Ｃ４のいずれかに記載の単離されたポリペプチド。

Ｃ６．ポリペプチドに該ポリペプチドのアスパラギン酸残基の側鎖に、または該ポリペプチドのグルタミン酸残基の側鎖に連結されたグリシン部分が含まれる、条項Ｃ４に記載の単離されたポリペプチド。

Ｃ７．ＳＥＱＩＤＮＯ：４で示されるアミノ酸配列が含まれる単離されたポリペプチドであって、１位のメチオニン残基が場合により存在せず、且つ該ポリペプチドの少なくとも１個のリシン残基の側鎖がベータ−アラニン部分に連結されている、前記単離されたポリペプチド。

Ｃ８．ＳＥＱＩＤＮＯ：６で示されるアミノ酸配列が含まれる単離されたポリペプチドであって、１位のメチオニン残基が場合により存在せず、且つ該ポリペプチドの少なくとも１個のリシン残基の側鎖がベータ−アラニン部分に連結されている、前記単離されたポリペプチド。

Ｃ９．ポリペプチドの第２のリシン残基の側鎖がアスパラギン酸残基の側鎖に、またはグルタミン酸残基の側鎖に連結されている、条項Ｃ７またはＣ８に記載の単離されたポリペプチド。

Ｃ１０．ポリペプチドのアスパラギン酸の側鎖またはグルタミン酸の側鎖がグリシン部分に連結されている、条項Ｃ７〜Ｃ９のいずれかに記載の単離されたポリペプチド。
Ｃ１１．ポリペプチドが少なくとも約１００μｇ／ｍｌのＥＣ５０を有する、条項Ｃ１〜Ｃ１０のいずれかに記載の単離されたポリペプチド。

Ｃ１２．１位のメチオニン残基が場合により存在しない、ＳＥＱＩＤＮＯ：４で示されるアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチド、および１位のメチオニン残基が場合により存在しない、ＳＥＱＩＤＮＯ：６で示されるアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドが含まれる免疫原性組成物であって、該ポリペプチドが１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）により化学的に修飾された少なくとも１個のアミノ酸側鎖を有する、前記免疫原性組成物。

Ｃ１３．ポリペプチドに以下：
ａ）該ポリペプチドのリシン残基の側鎖に連結された少なくとも１個のベータ−アラニン部分；
ｂ）該ポリペプチドのリシン残基の側鎖およびアスパラギン酸残基の側鎖の間の少なくとも１個の架橋；ならびに
ｃ）該ポリペプチドのリシン残基の側鎖およびグルタミン酸残基の側鎖の間の少なくとも１個の架橋
のいずれかの少なくとも１が含まれる、条項Ｃ１２に記載の免疫原性組成物。

Ｃ１４．ポリペプチドが少なくとも約１００μｇ／ｍｌのＥＣ５０を有する、条項Ｃ１２に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１５．１位のメチオニン残基が場合により存在しない、ＳＥＱＩＤＮＯ：４で示されるアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチド、および１位のメチオニン残基が場合により存在しない、ＳＥＱＩＤＮＯ：６で示されるアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドが含まれる免疫原性組成物であって、且つ
ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４の少なくとも１個のリシン残基の側鎖がベータ−アラニン部分に連結されており、且つ
ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６の少なくとも１個のリシン残基の側鎖がベータ−アラニン部分に連結されている、
前記免疫原性組成物。

Ｃ１６．ＳＥＱＩＤＮＯ：４の第２のリシン残基の側鎖がアスパラギン酸残基の側鎖に、またはグルタミン酸残基の側鎖に連結されており、且つＳＥＱＩＤＮＯ：６の第２のリシン残基がアスパラギン酸残基の側鎖に、またはグルタミン酸残基の側鎖に連結されている、条項Ｃ１５に記載の免疫原性組成物。

Ｃ１７．ＳＥＱＩＤＮＯ：４で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドのアスパラギン酸残基の側鎖またはグルタミン酸残基の側鎖がグリシン部分に連結されており、１位のメチオニン残基が場合により存在しない、条項Ｃ１２〜Ｃ１６のいずれかに記載の免疫原性組成物。

Ｃ１８．ＳＥＱＩＤＮＯ：６で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドのアスパラギン酸残基の側鎖またはグルタミン酸残基の側鎖がグリシン部分に連結されており、１位のメチオニン残基が場合により存在しない、条項Ｃ１２〜Ｃ１６のいずれかに記載の免疫原性組成物。

Ｃ１９．ポリペプチドが少なくとも約１００μｇ／ｍｌのＥＣ５０を有する、条項Ｃ１２〜Ｃ１８のいずれかに記載の免疫原性組成物。
Ｃ２０．ＳＥＱＩＤＮＯ：８４で示されるアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドおよびＳＥＱＩＤＮＯ：８６で示されるアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドが含まれる免疫原性組成物であって、それぞれのポリペプチドに以下：
ａ）該ポリペプチドのアスパラギン酸残基の側鎖および該ポリペプチドのリシン酸残基の側鎖の間の少なくとも１個の架橋；
ｂ）該ポリペプチドのグルタミン酸残基の側鎖および該ポリペプチドのリシン酸残基の側鎖の間の少なくとも１個の架橋；
ｃ）該ポリペプチドの少なくとも１個のリシン残基の側鎖に連結されたベータ−アラニン部分；ならびに
ｄ）該ポリペプチドの少なくとも１個のアスパラギン酸残基の側鎖に、または該ポリペプチドの少なくとも１個のグルタミン酸残基の側鎖に連結されたグリシン部分
が含まれる、前記免疫原性組成物。

Ｃ２１．対応する野生型クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａと比較して少なくとも１個の変異を有するグルコシルトランスフェラーゼドメイン、および少なくとも１個の変異を有するシステインプロテアーゼドメインが含まれる、変異体クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａが含まれる免疫原性組成物。

Ｃ２２．変異が非保存的アミノ酸置換である、条項Ｃ２１に記載の組成物。
Ｃ２３．置換にアラニン置換が含まれる、条項Ｃ２２に記載の組成物。
Ｃ２４．野生型クロストリジウム・ディフィシル毒素ＡにＳＥＱＩＤＮＯ：１に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列が含まれる、条項Ｃ２１〜Ｃ２３のいずれかに記載の組成物。

Ｃ２５．野生型クロストリジウム・ディフィシル毒素ＡにＳＥＱＩＤＮＯ：１に対して少なくとも９８％の同一性を有する配列が含まれる、条項Ｃ２４に記載の組成物。
Ｃ２６．野生型クロストリジウム・ディフィシル毒素ＡにＳＥＱＩＤＮＯ：１が含まれる、条項Ｃ２５に記載の組成物。

Ｃ２７．グルコシルトランスフェラーゼドメインに少なくとも２個の変異が含まれる、条項Ｃ２１〜Ｃ２６のいずれかに記載の組成物。
Ｃ２８．少なくとも２個の変異がＳＥＱＩＤＮＯ：１の番号付けに従うアミノ酸位置１０１、２６９、２７２、２８５、２８７、２６９、２７２、４６０、４６２、５４１、または５４２に存在する、条項Ｃ２７に記載の組成物。

Ｃ２９．グルコシルトランスフェラーゼドメインにＳＥＱＩＤＮＯ：２９が含まれる、条項Ｃ２１〜Ｃ２６のいずれかに記載の組成物。
Ｃ３０．グルコシルトランスフェラーゼドメインにＳＥＱＩＤＮＯ：２９のアミノ酸位置１０１、２６９、２７２、２８５、２８７、２６９、２７２、４６０、４６２、５４１、または５４２、またはそれらのあらゆる組み合わせに存在する少なくとも２個の非保存的変異が含まれる、条項Ｃ２９に記載の組成物。

Ｃ３１．システインプロテアーゼドメインにＳＥＱＩＤＮＯ：１の番号付けに従う７００、５８９、６５５、５４３位、またはそれらのあらゆる組み合わせに存在する変異が含まれる、条項Ｃ２１〜Ｃ２６のいずれかに記載の組成物。

Ｃ３２．システインプロテアーゼドメインにＳＥＱＩＤＮＯ：３２が含まれる、条項Ｃ２１〜Ｃ２６のいずれかに記載の組成物。
Ｃ３３．システインプロテアーゼドメインにＳＥＱＩＤＮＯ：３２の１、４７、１１３、１５８、またはそれらのあらゆる組み合わせに存在する非保存的変異が含まれる、条項Ｃ３２に記載の組成物。

Ｃ３４．変異体クロストリジウム・ディフィシル毒素ＡにＳＥＱＩＤＮＯ：４が含まれる、条項Ｃ２１に記載の組成物。
Ｃ３５．変異体クロストリジウム・ディフィシル毒素ＡにＳＥＱＩＤＮＯ：８４が含まれる、条項Ｃ２１に記載の組成物。

Ｃ３６．変異体クロストリジウム・ディフィシル毒素ＡにＳＥＱＩＤＮＯ：７が含まれる、条項Ｃ２１に記載の組成物。
Ｃ３７．変異体クロストリジウム・ディフィシル毒素ＡにＳＥＱＩＤＮＯ：８３が含まれる、条項Ｃ２１に記載の組成物。

Ｃ３８．変異体クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａの少なくとも１個のアミノ酸が化学的に架橋されている、条項Ｃ２１〜Ｃ３３のいずれかに記載の組成物。
Ｃ３９．アミノ酸がホルムアルデヒドにより化学的に架橋されている、条項Ｃ３８に記載の組成物。

Ｃ４０．アミノ酸が１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドにより化学的に架橋されている、条項Ｃ３８に記載の組成物。
Ｃ４１．アミノ酸がＮ−ヒドロキシスクシンイミドにより化学的に架橋されている、条項Ｃ３８またはＣ４０に記載の組成物。

Ｃ４２．組成物が抗毒素Ａ中和抗体またはその結合断片により認識される、条項Ｃ２１〜Ｃ４１のいずれかに記載の組成物。
Ｃ４３．対応する野生型のクロストリジウム・ディフィシル毒素Ａと比較して２８５位および２８７位においてアミノ酸置換を有するＳＥＱＩＤＮＯ：２９が含まれるグルコシルトランスフェラーゼドメインならびに１５８位においてアミノ酸置換を有するＳＥＱＩＤＮＯ：３２が含まれるシステインプロテアーゼドメインが含まれる変異体クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａが含まれる免疫原性組成物であって、該変異体クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａの少なくとも１個のアミノ酸が化学的に架橋されている、前記免疫原性組成物。

Ｃ４４．ＳＥＱＩＤＮＯ：４またはＳＥＱＩＤＮＯ：７が含まれる免疫原性組成物であって、ＳＥＱＩＤＮＯ：４またはＳＥＱＩＤＮＯ：７の少なくとも１個のアミノ酸が化学的に架橋されている、前記免疫原性組成物。

Ｃ４５．少なくとも１個のアミノ酸がホルムアルデヒドにより架橋されている、条項Ｃ４３またはＣ４４に記載の組成物。
Ｃ４６．少なくとも１個のアミノ酸が１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドにより架橋されている、条項Ｃ４３またはＣ４４に記載の組成物。

Ｃ４７．少なくとも１個のアミノ酸がＮ−ヒドロキシスクシンイミドにより架橋されている、条項Ｃ４３、Ｃ４４、またはＣ４６に記載の組成物。
Ｃ４８．組成物が抗毒素Ａ中和抗体またはその結合断片により認識される、条項Ｃ４３またはＣ４４に記載の組成物。

Ｃ４９．ＳＥＱＩＤＮＯ：４が含まれる免疫原性組成物。
Ｃ５０．ＳＥＱＩＤＮＯ：８４が含まれる免疫原性組成物。
Ｃ５１．ＳＥＱＩＤＮＯ：７が含まれる免疫原性組成物。

Ｃ５２．ＳＥＱＩＤＮＯ：８３が含まれる免疫原性組成物。
Ｃ５３．少なくとも１個のアミノ酸が化学的に架橋されている、条項Ｃ４９〜Ｃ５２のいずれかに記載の組成物。

Ｃ５４．組成物が対応する野生型クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａと比較して減少した細胞毒性を示す、条項Ｃ２１〜Ｃ５１のいずれかに記載の組成物。
Ｃ５５．ＳＥＱＩＤＮＯ：８４が含まれる単離されたポリペプチド。

Ｃ５６．ＳＥＱＩＤＮＯ：８６が含まれる単離されたポリペプチド。
Ｃ５７．ＳＥＱＩＤＮＯ：８３が含まれる単離されたポリペプチド。
Ｃ５８．ＳＥＱＩＤＮＯ：８５が含まれる単離されたポリペプチド。

Ｃ５９．対応する野生型クロストリジウム・ディフィシル毒素Ｂと比較して少なくとも１個の変異を有するグルコシルトランスフェラーゼドメインおよび少なくとも１個の変異を有するシステインプロテアーゼドメインが含まれる変異体クロストリジウム・ディフィシル毒素Ｂが含まれる免疫原性組成物。

Ｃ６０．変異が非保存的アミノ酸置換である、条項Ｃ５９に記載の組成物。
Ｃ６１．置換にアラニン置換が含まれる、条項Ｃ６０に記載の組成物。
Ｃ６２．野生型クロストリジウム・ディフィシル毒素ＢにＳＥＱＩＤＮＯ：２に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列が含まれる、条項Ｃ５９〜Ｃ６１のいずれかに記載の組成物。

Ｃ６３．野生型クロストリジウム・ディフィシル毒素ＢにＳＥＱＩＤＮＯ：２に対して少なくとも９８％の同一性を有する配列が含まれる、条項Ｃ６２に記載の組成物。
Ｃ６４．野生型クロストリジウム・ディフィシル毒素ＢにＳＥＱＩＤＮＯ：２が含まれる、条項Ｃ６３に記載の組成物。

Ｃ６５．グルコシルトランスフェラーゼドメインに少なくとも２個の変異が含まれる、条項Ｃ５９〜Ｃ６４のいずれかに記載の組成物。
Ｃ６６．少なくとも２個の変異がＳＥＱＩＤＮＯ：２の番号付けに従うアミノ酸位置１０２、２８６、２８８、２７０、２７３、３８４、４６１、４６３、５２０、または５４３に存在する、条項Ｃ６５に記載の組成物。

Ｃ６７．グルコシルトランスフェラーゼドメインにＳＥＱＩＤＮＯ：３１が含まれる、条項Ｃ５９〜Ｃ６４のいずれかに記載の組成物。
Ｃ６８．グルコシルトランスフェラーゼドメインにＳＥＱＩＤＮＯ：３１のアミノ酸位置１０２、２８６、２８８、２７０、２７３、３８４、４６１、４６３、５２０、または５４３に存在する少なくとも２個の非保存的変異が含まれる、条項Ｃ６７に記載の組成物。

Ｃ６９．システインプロテアーゼドメインにＳＥＱＩＤＮＯ：２の番号付けに従う６９８、６５３、５８７、５４４位、またはそれらのあらゆる組み合わせに存在する変異が含まれる、条項Ｃ５９〜Ｃ６４のいずれかに記載の組成物。

Ｃ７０．システインプロテアーゼドメインにＳＥＱＩＤＮＯ：３３が含まれる、条項Ｃ５９〜Ｃ６４のいずれかに記載の組成物。
Ｃ７１．システインプロテアーゼドメインにＳＥＱＩＤＮＯ：３３の１、４４、１１０、１５５位、またはそれらのあらゆる組み合わせに存在する非保存的変異が含まれる、条項Ｃ７０に記載の組成物。

Ｃ７２．変異体クロストリジウム・ディフィシル毒素ＢにＳＥＱＩＤＮＯ：６が含まれる、条項Ｃ５９に記載の組成物。
Ｃ７３．変異体クロストリジウム・ディフィシル毒素ＢにＳＥＱＩＤＮＯ：８６が含まれる、条項Ｃ５９に記載の組成物。

Ｃ７４．変異体クロストリジウム・ディフィシル毒素ＢにＳＥＱＩＤＮＯ：８が含まれる、条項Ｃ５９に記載の組成物。
Ｃ７５．変異体クロストリジウム・ディフィシル毒素ＢにＳＥＱＩＤＮＯ：８５が含まれる、条項Ｃ５９に記載の組成物。

Ｃ７６．変異体クロストリジウム・ディフィシル毒素Ｂの少なくとも１個のアミノ酸が化学的に架橋されている、条項Ｃ５９〜Ｃ７１のいずれかに記載の組成物。
Ｃ７７．アミノ酸がホルムアルデヒドにより化学的に架橋されている、条項Ｃ７６に記載の組成物。

Ｃ７８．アミノ酸が１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドにより化学的に架橋されている、条項Ｃ７６に記載の組成物。
Ｃ７９．少なくとも１個のアミノ酸がＮ−ヒドロキシスクシンイミドにより架橋されている、条項Ｃ７６またはＣ７８に記載の組成物。

Ｃ８０．組成物が抗毒素Ｂ中和抗体またはその結合断片により認識される、条項Ｃ５９〜Ｃ７９のいずれかに記載の組成物。
Ｃ８１．対応する野生型のクロストリジウム・ディフィシル毒素Ｂと比較して２８６位および２８８位においてアミノ酸置換を有するＳＥＱＩＤＮＯ：３１が含まれるグルコシルトランスフェラーゼドメインならびに１５５位においてアミノ酸置換を有するＳＥＱＩＤＮＯ：３３が含まれるシステインプロテアーゼドメインが含まれる変異体クロストリジウム・ディフィシル毒素Ｂが含まれる免疫原性組成物であって、該変異体クロストリジウム・ディフィシル毒素Ｂの少なくとも１個のアミノ酸が化学的に架橋されている、前記免疫原性組成物。

Ｃ８２．ＳＥＱＩＤＮＯ：６またはＳＥＱＩＤＮＯ：８が含まれる免疫原性組成物であって、ＳＥＱＩＤＮＯ：６またはＳＥＱＩＤＮＯ：８の少なくとも１個のアミノ酸が化学的に架橋されている、前記免疫原性組成物。

Ｃ８３．少なくとも１個のアミノ酸がホルムアルデヒドにより架橋されている、条項Ｃ８１またはＣ８２に記載の組成物。
Ｃ８４．少なくとも１個のアミノ酸が１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドにより架橋されている、条項Ｃ８１またはＣ８２に記載の組成物。

Ｃ８５．少なくとも１個のアミノ酸がＮ−ヒドロキシスクシンイミドにより架橋されている、条項Ｃ８１、Ｃ８２、またはＣ８４に記載の組成物。
Ｃ８６．組成物が抗毒素Ｂ中和抗体またはその結合断片により認識される、条項Ｃ８１またはＣ８２に記載の組成物。

Ｃ８７．ＳＥＱＩＤＮＯ：６が含まれる免疫原性組成物。
Ｃ８８．ＳＥＱＩＤＮＯ：８６が含まれる免疫原性組成物。
Ｃ８９．ＳＥＱＩＤＮＯ：８が含まれる免疫原性組成物。

Ｃ９０．ＳＥＱＩＤＮＯ：８５が含まれる免疫原性組成物。
Ｃ９１．組成物が対応する野生型クロストリジウム・ディフィシル毒素Ｂと比較して減少した細胞毒性を示す、条項Ｃ５９〜Ｃ８９のいずれかに記載の組成物。

Ｃ９２．ＳＥＱＩＤＮＯ：４が含まれる免疫原性組成物およびＳＥＱＩＤＮＯ：６が含まれる免疫原性組成物であって、ＳＥＱＩＤＮＯ：４および６のそれぞれの少なくとも１個のアミノ酸が化学的に架橋されている、前記免疫原性組成物。

Ｃ９３．ＳＥＱＩＤＮＯ：８４が含まれる免疫原性組成物およびＳＥＱＩＤＮＯ：８６が含まれる免疫原性組成物であって、ＳＥＱＩＤＮＯ：８４および８６のそれぞれの少なくとも１個のアミノ酸が化学的に架橋されている、前記免疫原性組成物。

Ｃ９４．少なくとも１個のアミノ酸がホルムアルデヒドにより架橋されている、条項Ｃ９２またはＣ９３に記載の組成物。
Ｃ９５．少なくとも１個のアミノ酸が１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドにより架橋されている、条項Ｃ９２またはＣ９３に記載の組成物。

Ｃ９６．少なくとも１個のアミノ酸がＮ−ヒドロキシスクシンイミドにより架橋されている、条項Ｃ９２、Ｃ９３、またはＣ９５に記載の組成物。
Ｃ９７．ＳＥＱＩＤＮＯ：１１、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４、ＳＥＱＩＤＮＯ：４４、ＳＥＱＩＤＮＯ：４５、ＳＥＱＩＤＮＯ：４６、またはＳＥＱＩＤＮＯ：４７が含まれる、組み換え細胞またはその子孫。

Ｃ９８．ＳＥＱＩＤＮＯ：４、ＳＥＱＩＤＮＯ：６、ＳＥＱＩＤＮＯ：７、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８をコードする核酸配列が含まれる、組み換え細胞またはその子孫。

Ｃ９９．ＳＥＱＩＤＮＯ：８４をコードする核酸配列が含まれる、組み換え細胞またはその子孫。
Ｃ１００．ＳＥＱＩＤＮＯ：８６をコードする核酸配列が含まれる、組み換え細胞またはその子孫。

Ｃ１０１．ＳＥＱＩＤＮＯ：８３をコードする核酸配列が含まれる、組み換え細胞またはその子孫。
Ｃ１０２．ＳＥＱＩＤＮＯ：８５をコードする核酸配列が含まれる、組み換え細胞またはその子孫。

Ｃ１０３．前記の細胞がグラム陽性細菌細胞に由来する、条項Ｃ９７またはＣ９８に記載の組み換え細胞。
Ｃ１０４．細胞がクロストリジウム・ディフィシル細胞に由来する、条項Ｃ９７、Ｃ９８、またはＣ９９に記載の組み換え細胞。

Ｃ１０５．細胞が毒素をコードする内在性ポリヌクレオチドを欠いている、条項Ｃ９７〜Ｃ１０４のいずれかに記載の組み換え細胞。
Ｃ１０６．細胞がクロストリジウム・ディフィシル１３５１、クロストリジウム・ディフィシル３２３２、クロストリジウム・ディフィシル７３２２、クロストリジウム・ディフィシル５０３６、クロストリジウム・ディフィシル４８１１、およびクロストリジウム・ディフィシルＶＰＩ１１１８６からなる群から選択されるクロストリジウム・ディフィシル細胞に由来する、条項Ｃ１０４またはＣ１０５のいずれかに記載の細胞。

Ｃ１０７．細胞がクロストリジウム・ディフィシルＶＰＩ１１１８６細胞である、条項Ｃ１０６に記載の細胞。
Ｃ１０８．クロストリジウム・ディフィシル細胞の芽胞形成遺伝子が不活性化されている、条項Ｃ１０６またはＣ１０７に記載の細胞。

Ｃ１０９．芽胞形成遺伝子にｓｐｏ０Ａ遺伝子またはｓｐｏＩＩＥ遺伝子が含まれる、条項Ｃ１０８に記載の細胞。
Ｃ１１０．組み換え細胞またはその子孫を変異体クロストリジウム・ディフィシル毒素をコードするポリヌクレオチドを発現するための適切な条件下で培養することが含まれる、変異体クロストリジウム・ディフィシル毒素を生成する方法であって、該細胞に該変異体クロストリジウム・ディフィシル毒素をコードするポリヌクレオチドが含まれ、且つ該変異体に対応する野生型クロストリジウム・ディフィシル毒素と比較して少なくとも１個の変異を有するグルコシルトランスフェラーゼドメインおよび少なくとも１個の変異を有するシステインプロテアーゼドメインが含まれる、前記方法。

Ｃ１１１．細胞が毒素をコードする内在性ポリヌクレオチドを欠いている、条項Ｃ１１０に記載の方法。
Ｃ１１２．組み換え細胞またはその子孫に条項Ｃ９７〜Ｃ１１１のいずれかに記載の細胞が含まれる、条項Ｃ１１０に記載の方法。

Ｃ１１３．さらに変異体クロストリジウム・ディフィシル毒素を単離することが含まれる、条項Ｃ１１０に記載の方法。
Ｃ１１４．さらに単離された変異体クロストリジウム・ディフィシル毒素をホルムアルデヒドと接触させることが含まれる、条項Ｃ１１３に記載の方法。

Ｃ１１５．接触が最大で１４日間行われる、条項Ｃ１１４に記載の方法。
Ｃ１１６．接触が最大で４８時間行われる、条項Ｃ１１５に記載の方法。
Ｃ１１７．接触が約２５℃で行われる、条項Ｃ１１４に記載の方法。

Ｃ１１８．さらに単離された変異体クロストリジウム・ディフィシル毒素をエチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドと接触させることが含まれる、条項Ｃ１１３に記載の方法。

Ｃ１１９．接触が最大で２４時間行われる、条項Ｃ１１８に記載の方法。
Ｃ１２０．接触が最大で４時間行われる、条項Ｃ１２０に記載の方法。
Ｃ１２１．接触が約２５℃で行われる、条項Ｃ１１８に記載の方法。

Ｃ１２２．さらに単離された変異体クロストリジウム・ディフィシル毒素をＮ−ヒドロキシスクシンイミドと接触させることが含まれる、条項Ｃ１１８に記載の方法。
Ｃ１２３．条項Ｃ１１０〜Ｃ１２２のいずれかに記載の方法により生成された免疫原性組成物。

Ｃ１２４．免疫原性組成物を哺乳類に投与することおよび該哺乳類から抗体を回収することが含まれる、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａに対する中和抗体を生成する方法であって、前記の免疫原性組成物にＳＥＱＩＤＮＯ：４が含まれ、１位のメチオニン残基が場合により存在せず、ＳＥＱＩＤＮＯ：４の少なくとも１個のアミノ酸がホルムアルデヒド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、または１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドの組み合わせにより架橋されている、前記方法。

Ｃ１２５．免疫原性組成物を哺乳類に投与することおよび該哺乳類から抗体を回収することが含まれる、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａに対する中和抗体を生成する方法であって、前記の免疫原性組成物にＳＥＱＩＤＮＯ：８４が含まれ、ＳＥＱＩＤＮＯ：８４の少なくとも１個のアミノ酸がホルムアルデヒド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、または１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドの組み合わせにより架橋されている、前記方法。

Ｃ１２６．免疫原性組成物を哺乳類に投与することおよび該哺乳類から抗体を回収することが含まれる、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ｂに対する中和抗体を生成する方法であって、前記の免疫原性組成物にＳＥＱＩＤＮＯ：６が含まれ、１位のメチオニン残基が場合により存在せず、ＳＥＱＩＤＮＯ：６の少なくとも１個のアミノ酸がホルムアルデヒド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、または１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドの組み合わせにより架橋されている、前記方法。

Ｃ１２７．免疫原性組成物を哺乳類に投与することおよび該哺乳類から抗体を回収することが含まれる、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａに対する中和抗体を生成する方法であって、前記の免疫原性組成物にＳＥＱＩＤＮＯ：８６が含まれ、ＳＥＱＩＤＮＯ：８６の少なくとも１個のアミノ酸がホルムアルデヒド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、または１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドの組み合わせにより架橋されている、前記方法。

Ｃ１２８．免疫原性組成物に特異的な抗体またはその抗体結合断片であって、前記の免疫原性組成物に１位のメチオニン残基が場合により存在しないＳＥＱＩＤＮＯ：４または１位のメチオニン残基が場合により存在しないＳＥＱＩＤＮＯ：７が含まれる、前記抗体またはその抗体結合断片。

Ｃ１２９．条項Ｃ１２８に記載の抗体またはその抗体結合断片であって、１位のメチオニン残基が場合により存在しないＳＥＱＩＤＮＯ：４または１位のメチオニン残基が場合により存在しないＳＥＱＩＤＮＯ：７の少なくとも１個のアミノ酸がホルムアルデヒド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、または１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドの組み合わせにより架橋されている、前記抗体またはその抗体結合断片。

Ｃ１３０．ＳＥＱＩＤＮＯ：４１（ＣＤＲＨ１）、ＳＥＱＩＤＮＯ：４２（ＣＤＲＨ２）およびＳＥＱＩＤＮＯ：４３（ＣＤＲＨ３）で示される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列、ならびにＳＥＱＩＤＮＯ：３８（ＣＤＲＬ１）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３９（ＣＤＲＬ２）およびＳＥＱＩＤＮＯ：４０（ＣＤＲＬ３）で示される軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列が含まれる、抗体またはその抗体結合断片。

Ｃ１３１．抗体またはその抗体結合断片にＳＥＱＩＤＮＯ：３７で示されるアミノ酸配列が含まれる重鎖およびＳＥＱＩＤＮＯ：３６で示されるアミノ酸配列が含まれる軽鎖が含まれる、条項Ｃ１２８、Ｃ１２９、またはＣ１３０に記載の抗体またはその抗体結合断片。

Ｃ１３２．条項Ｃ１２８〜Ｃ１３１のいずれかに記載のいずれかから選択される２以上の抗体またはその抗体結合断片の組み合わせが含まれる組成物。
Ｃ１３３．免疫原性組成物に特異的な抗体またはその抗体結合断片であって、前記の免疫原性組成物に１位のメチオニン残基が場合により存在しないＳＥＱＩＤＮＯ：６または１位のメチオニン残基が場合により存在しないＳＥＱＩＤＮＯ：８が含まれる、前記抗体またはその抗体結合断片。

Ｃ１３４．条項Ｃ１２３に記載の抗体またはその抗体結合断片であって、１位のメチオニン残基が場合により存在しないＳＥＱＩＤＮＯ：６または１位のメチオニン残基が場合により存在しないＳＥＱＩＤＮＯ：８の少なくとも１個のアミノ酸がホルムアルデヒド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、または１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドの組み合わせにより架橋されている、前記抗体またはその抗体結合断片。

Ｃ１３５．ＳＥＱＩＤＮＯ：５１（ＣＤＲＨ１）、ＳＥＱＩＤＮＯ：５２（ＣＤＲＨ２）およびＳＥＱＩＤＮＯ：５３（ＣＤＲＨ３）において示される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列、ならびにＳＥＱＩＤＮＯ：５７（ＣＤＲＬ１）、ＳＥＱＩＤＮＯ：５８（ＣＤＲＬ２）およびＳＥＱＩＤＮＯ：５９（ＣＤＲＬ３）において示される軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列が含まれる、抗体またはその抗体結合断片。

Ｃ１３６．ＳＥＱＩＤＮＯ：６１（ＣＤＲＨ１）、ＳＥＱＩＤＮＯ：６２（ＣＤＲＨ２）およびＳＥＱＩＤＮＯ：６３（ＣＤＲＨ３）において示される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列、ならびにＳＥＱＩＤＮＯ：６８（ＣＤＲＬ１）、ＳＥＱＩＤＮＯ：６９（ＣＤＲＬ２）およびＳＥＱＩＤＮＯ：７０（ＣＤＲＬ３）において示される軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列が含まれる、抗体またはその抗体結合断片。

Ｃ１３７．ＳＥＱＩＤＮＯ：７３（ＣＤＲＨ１）、ＳＥＱＩＤＮＯ：７４（ＣＤＲＨ２）およびＳＥＱＩＤＮＯ：７５（ＣＤＲＨ３）において示される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列、ならびにＳＥＱＩＤＮＯ：７９（ＣＤＲＬ１）、ＳＥＱＩＤＮＯ：８０（ＣＤＲＬ２）およびＳＥＱＩＤＮＯ：８１（ＣＤＲＬ３）において示される軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列が含まれる、抗体またはその抗体結合断片。

Ｃ１３８．条項Ｃ１３３〜Ｃ１３７のいずれかから選択される２以上の抗体またはその抗体結合断片の組み合わせが含まれる組成物。
Ｃ１３９．哺乳類においてクロストリジウム・ディフィシル感染症を処置する方法であって、該哺乳類に１位のメチオニン残基が場合により存在しないＳＥＱＩＤＮＯ：４が含まれる免疫原性組成物および１位のメチオニン残基が場合により存在しないＳＥＱＩＤＮＯ：６が含まれる免疫原性組成物を投与することが含まれ、ＳＥＱＩＤＮＯ：４および６のそれぞれの少なくとも１個のアミノ酸がホルムアルデヒドにより架橋されている、前記方法。

Ｃ１４０．哺乳類においてクロストリジウム・ディフィシル感染症を処置する方法であって、該哺乳類に１位のメチオニン残基が場合により存在しないＳＥＱＩＤＮＯ：４が含まれる免疫原性組成物および１位のメチオニン残基が場合により存在しないＳＥＱＩＤＮＯ：６が含まれる免疫原性組成物を投与することが含まれ、ＳＥＱＩＤＮＯ：４およびＳＥＱＩＤＮＯ：６のそれぞれの少なくとも１個のアミノ酸が１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、または１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドの組み合わせにより架橋されている、前記方法。

Ｃ１４１．哺乳類においてクロストリジウム・ディフィシル感染症を処置する方法であって、該哺乳類にＳＥＱＩＤＮＯ：８４が含まれる免疫原性組成物およびＳＥＱＩＤＮＯ：８６が含まれる免疫原性組成物を投与することが含まれ、ＳＥＱＩＤＮＯ：８４およびＳＥＱＩＤＮＯ：８６のそれぞれの少なくとも１個のアミノ酸が１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドにより架橋されている、前記方法。

Ｃ１４２．哺乳類においてクロストリジウム・ディフィシルに対する免疫応答を誘導する方法であって、該哺乳類に１位のメチオニン残基が場合により存在しないＳＥＱＩＤＮＯ：４が含まれる免疫原性組成物および１位のメチオニン残基が場合により存在しないＳＥＱＩＤＮＯ：６が含まれる免疫原性組成物を投与することが含まれ、ＳＥＱＩＤＮＯ：４およびＳＥＱＩＤＮＯ：６のそれぞれの少なくとも１個のアミノ酸がホルムアルデヒドにより架橋されている、前記方法。

Ｃ１４３．哺乳類においてクロストリジウム・ディフィシルに対する免疫応答を誘導する方法であって、該哺乳類に１位のメチオニン残基が場合により存在しないＳＥＱＩＤＮＯ：４が含まれる免疫原性組成物および１位のメチオニン残基が場合により存在しないＳＥＱＩＤＮＯ：６が含まれる免疫原性組成物を投与することが含まれ、ＳＥＱＩＤＮＯ：４およびＳＥＱＩＤＮＯ：６のそれぞれの少なくとも１個のアミノ酸が１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、または１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドの組み合わせにより架橋されている、前記方法。

Ｃ１４４．哺乳類においてクロストリジウム・ディフィシルに対する免疫応答を誘導する方法であって、該哺乳類にＳＥＱＩＤＮＯ：８４が含まれる免疫原性組成物およびＳＥＱＩＤＮＯ：８６が含まれる免疫原性組成物を投与することが含まれ、ＳＥＱＩＤＮＯ：８４およびＳＥＱＩＤＮＯ：８６のそれぞれの少なくとも１個のアミノ酸が１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドにより架橋されている、前記方法。

Ｃ１４５．哺乳類がそれを必要とする哺乳類である、条項Ｃ１３９〜Ｃ１４４のいずれかに記載の方法。
Ｃ１４６．哺乳類が再発性クロストリジウム・ディフィシル感染症を有する、条項Ｃ１３９〜Ｃ１４４のいずれかに記載の方法。

Ｃ１４７．組成物が非経口投与される、条項Ｃ１３９〜Ｃ１４４のいずれかに記載の方法。
Ｃ１４８．組成物にさらにアジュバントが含まれる、条項Ｃ１３９〜Ｃ１４４のいずれかに記載の方法。

Ｃ１４９．アジュバントにアルミニウムが含まれる、条項Ｃ１４８に記載の方法。
Ｃ１５０．アジュバントに水酸化アルミニウムゲルおよびＣｐＧオリゴヌクレオチドが含まれる、条項Ｃ１４８に記載の方法。

Ｃ１５１．アジュバントにＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）が含まれる、条項Ｃ１４８に記載の方法。

Claims

１位のメチオニン残基が場合により存在しないＳＥＱＩＤＮＯ：４で示されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドのリシン残基の側鎖がベータ−アラニン部分に架橋している、前記単離されたポリペプチド。
ポリペプチドが、該ポリペプチドのアスパラギン酸残基の側鎖に、または該ポリペプチドのグルタミン酸残基の側鎖に架橋されたグリシン部分をさらに含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
ポリペプチドが、該ポリペプチドの第２のリシン残基と該ポリペプチドのアスパラギン酸残基の側鎖との架橋をさらに含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
ポリペプチドが、該ポリペプチドの第２のリシン残基と該ポリペプチドのグルタミン酸残基の側鎖との架橋をさらに含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
ポリペプチドが、インビトロ細胞毒性アッセイによる測定で、少なくとも１００μｇ／ｍｌのＥＣ_５０を有する、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
ポリペプチドが、インビトロ細胞毒性アッセイによる測定で、少なくとも１０００μｇ／ｍｌのＥＣ_５０を有する、請求項５に記載の単離されたポリペプチド。
１位のメチオニン残基が場合により存在しないＳＥＱＩＤＮＯ：４で示されるアミノ酸配列を有する第１の単離されたポリペプチドを含む免疫原性組成物であって、ここで第１の単離されたポリペプチドのリシン残基の側鎖がベータ−アラニン部分に架橋している、免疫原性組成物。
ＳＥＱＩＤＮＯ：６で示されるアミノ酸配列を有する第２の単離されたポリペプチドをさらに含む請求項７に記載の免疫原性組成物であって、ＳＥＱＩＤＮＯ：６の１位のメチオニン残基が場合により存在せず、ここで第２の単離されたポリペプチドのリシン残基の側鎖がベータ−アラニン部分に架橋している、免疫原性組成物。
第１のポリペプチドの第２のリシン残基の側鎖とアスパラギン酸残基の側鎖との架橋をさらに含む、請求項７に記載の免疫原性組成物。
第２のポリペプチドの第２のリシン残基の側鎖とアスパラギン酸残基の側鎖との架橋をさらに含む、請求項８に記載の免疫原性組成物。
第１のポリペプチドの第２のリシン残基の側鎖とグルタミン酸残基の側鎖との架橋をさらに含む、請求項７に記載の免疫原性組成物。
第２のポリペプチドの第２のリシン残基の側鎖とグルタミン酸残基の側鎖との架橋をさらに含む、請求項８に記載の免疫原性組成物。
第１のポリペプチドのアスパラギン酸残基の側鎖とグリシン部分との架橋をさらに含む、請求項７に記載の免疫原性組成物。
第２のポリペプチドのアスパラギン酸残基の側鎖とグリシン部分との架橋をさらに含む、請求項８に記載の免疫原性組成物。
第１のポリペプチドのグルタミン酸残基の側鎖とグリシン部分との架橋をさらに含む、請求項７に記載の免疫原性組成物。
第２のポリペプチドのグルタミン酸残基の側鎖とグリシン部分との架橋をさらに含む、請求項８に記載の免疫原性組成物。
各ポリペプチドが、インビトロ細胞毒性アッセイによる測定で、少なくとも１０００μｇ／ｍｌのＥＣ_５０を有する、請求項７に記載の免疫原性組成物。
アジュバントをさらに含む、請求項７に記載の免疫原性組成物。
１位のメチオニン残基が場合により存在しないＳＥＱＩＤＮＯ：４を含むポリペプチドを発現する、組み換え細胞またはその子孫。
ポリペプチドがＳＥＱＩＤＮＯ：４を含む、請求項１９に記載の組み換え細胞またはその子孫。
ＳＥＱＩＤＮＯ：１２を含む、核酸配列を含む、請求項１９に記載の組み換え細胞またはその子孫。
ＳＥＱＩＤＮＯ：４５を含む、核酸配列を含む、請求項２１に記載の組み換え細胞またはその子孫。
前記の細胞がグラム陽性細菌細胞に由来する、請求項１９に記載の組み換え細胞またはその子孫。
細胞がクロストリジウム・ディフィシル細胞である、請求項１９に記載の組み換え細胞またはその子孫。
不活性化されている芽胞形成遺伝子をさらに含む、請求項２４に記載の組み換え細胞またはその子孫。
細胞がクロストリジウム・ディフィシル毒素をコードする内在性ポリヌクレオチドを欠いている、請求項２４に記載の組み換え細胞またはその子孫。
細胞がクロストリジウム・ディフィシル１３５１（ＡＴＣＣ４３５９３（商標））、Ｃ．ディフィシル３２３２（ＡＴＣＣＢＡＡ−１８０１（商標））、Ｃ．ディフィシル７３２２（ＡＴＣＣ４３６０１（商標））、Ｃ．ディフィシル５０３６（ＡＴＣＣ４３６０３（商標））、Ｃ．ディフィシル４８１１（ＡＴＣＣ４３６０２（商標））、およびＣ．ディフィシルＶＰＩ１１１８６（ＡＴＣＣ７０００５７（商標））からなる群に由来する、請求項２４に記載の組み換え細胞またはその子孫。
細胞がクロストリジウム・ディフィシルＶＰＩ１１１８６細胞（ＡＴＣＣ７０００５７（商標））である、請求項２４に記載の組み換え細胞またはその子孫。
さらに追加の組み換えヌクレオチド配列を含む、請求項１９に記載の組み換え細胞またはその子孫。
組み換えヌクレオチド配列が変異クロストリジウム・ディフィシル毒素をコードする、請求項２９に記載の組み換え細胞またはその子孫。
組み換えヌクレオチド配列が変異クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａをコードする、請求項２９に記載の組み換え細胞またはその子孫。
組み換えヌクレオチド配列が変異クロストリジウム・ディフィシル毒素Ｂをコードする、請求項２９に記載の組み換え細胞またはその子孫。
組み換えヌクレオチド配列が、１位のメチオニン残基が場合により存在しないＳＥＱＩＤＮＯ：６を含むポリペプチドをコードする、請求項２９に記載の組み換え細胞またはその子孫。
ポリペプチドがＳＥＱＩＤＮＯ：６を含む、請求項３３に記載の組み換え細胞またはその子孫。
組み換えヌクレオチド配列がＳＥＱＩＤＮＯ：８２を含むポリペプチドをコードする、請求項２９に記載の組み換え細胞またはその子孫。
組み換えヌクレオチド配列がＳＥＱＩＤＮＯ：１４を含む、請求項２９に記載の組み換え細胞またはその子孫。
組み換えヌクレオチド配列がＳＥＱＩＤＮＯ：４７を含む、請求項２９に記載の組み換え細胞またはその子孫。
１位のメチオニン残基が場合により存在しないＳＥＱＩＤＮＯ：４を含むポリペプチドを含む組成物。
ポリペプチドがＳＥＱＩＤＮＯ：４を含む、請求項３８に記載の組成物。
Ｔｒｉｓ緩衝剤をさらに含み、ポリペプチドが該ポリペプチドのリシン残基の側鎖が架橋しているベータ−アラニン部分をさらに含む、請求項３８に記載の組成物。
ポリペプチドが、該ポリペプチドの第２のリシン残基の側鎖と該ポリペプチドのアスパラギン酸残基の側鎖との架橋をさらに含む、請求項４０に記載の組成物。
ポリペプチドが、該ポリペプチドの第２のリシン残基と該ポリペプチドのグルタミン酸残基の側鎖との架橋をさらに含む、請求項４０に記載の組成物。
ポリペプチドが、該ポリペプチドのリシン残基の側鎖と該ポリペプチドのアスパラギン酸残基の側鎖との架橋をさらに含む、請求項３８に記載の組成物。
ポリペプチドが、該ポリペプチドのリシン残基と該ポリペプチドのグルタミン酸残基の側鎖との架橋をさらに含む、請求項３８に記載の組成物。
ポリペプチドが、該ポリペプチドのアスパラギン酸残基の側鎖に架橋したグリシン部分をさらに含む、請求項３８に記載の組成物。
ポリペプチドが、該ポリペプチドのグルタミン酸残基の側鎖に架橋したグリシン部分をさらに含む、請求項３８に記載の組成物。
１位のメチオニン残基が場合により存在しないＳＥＱＩＤＮＯ：６を含む第２のポリペプチドをさらに含む、請求項３８に記載の組成物。
第２のポリペプチドがＳＥＱＩＤＮＯ：６を含む、請求項４７に記載の組成物。
Ｔｒｉｓ緩衝剤をさらに含み、第２のポリペプチドが該第２のポリペプチドのリシン残基の側鎖に架橋しているベータ−アラニン部分をさらに含む、請求項４７に記載の組成物。
第２のポリペプチドが、該ポリペプチドの第２のリシン残基の側鎖と該第２のポリペプチドのアスパラギン酸残基の側鎖との架橋をさらに含む、請求項４９に記載の組成物。
第２のポリペプチドが、該ポリペプチドの第２のリシン残基と該第２のポリペプチドのグルタミン酸残基の側鎖との架橋をさらに含む、請求項４９に記載の組成物。
第２のポリペプチドが、該ポリペプチドのリシン残基の側鎖と該第２のポリペプチドのアスパラギン酸残基の側鎖との架橋をさらに含む、請求項４７に記載の組成物。
第２のポリペプチドが、該ポリペプチドのリシン残基と該第２のポリペプチドのグルタミン酸残基の側鎖との架橋をさらに含む、請求項４７に記載の組成物。
第２のポリペプチドが、該第２のポリペプチドのアスパラギン酸残基の側鎖に架橋したグリシン部分をさらに含む、請求項４７に記載の組成物。
第２のポリペプチドが、該第２のポリペプチドのグルタミン酸残基の側鎖に架橋したグリシン部分をさらに含む、請求項４７に記載の組成物。
各ポリペプチドが、インビトロ細胞毒性アッセイによる測定で、少なくとも１００μｇ／ｍｌのＥＣ_５０を有する、請求項４７に記載の組成物。
各ポリペプチドが、インビトロ細胞毒性アッセイによる測定で、少なくとも１０００μｇ／ｍｌのＥＣ_５０を有する、請求項４７に記載の組成物。
緩衝剤をさらに含む、請求項３８に記載の組成物。
安定化剤をさらに含む、請求項３８に記載の組成物。
トレハロース二水和物をさらに含む、請求項３８に記載の組成物。
界面活性剤をさらに含む、請求項３８に記載の組成物。
ポリソルベート８０をさらに含む、請求項３８に記載の組成物。
組成物が凍結乾燥されている、請求項３８に記載の組成物。
組成物が免疫原性である、請求項３８に記載の組成物。
ホルムアルデヒドを含まない、請求項３８に記載の組成物。
アジュバントをさらに含む、請求項３８に記載の組成物。
アジュバントを含まない、請求項３８に記載の組成物。
塩化ナトリウムをさらに含む、請求項３８に記載の組成物。
水をさらに含む、請求項３８に記載の組成物。
Ｔｒｉｓ緩衝剤、トレハロース二水和物、ポリソルベート８０、１位のメチオニン残基が場合により存在しないＳＥＱＩＤＮＯ：４を含む第１のポリペプチド、および１位のメチオニン残基が場合により存在しないＳＥＱＩＤＮＯ：６を含む第２のポリペプチドを含む組成物であって、ここで第１のポリペプチドと第２のポリペプチドがさらにそれぞれのポリペプチドのリシン残基の側鎖に架橋したベータ−アラニン部分を含み、ここで第１のポリペプチドと第２のポリペプチドがさらにそれぞれのポリペプチドの第２のリシン残基の側鎖に架橋したグリシン部分を含む、組成物。
各ポリペプチドが、インビトロ細胞毒性アッセイによる測定で、少なくとも１０００μｇ／ｍｌのＥＣ_５０を有する、請求項７０に記載の組成物。
凍結乾燥されている、請求項７０に記載の組成物。
免疫原性である、請求項７０に記載の組成物。
ホルムアルデヒドを含まない、請求項７０に記載の組成物。
アジュバントをさらに含む、請求項７０に記載の組成物。
アジュバントを含まない、請求項７０に記載の組成物。
（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４に示されるアミノ酸配列を含み、ここでＳＥＱＩＤＮＯ：４の１位のメチオニン残基が存在せず、ここで第１のポリペプチドのリシン残基の側鎖がベータ−アラニン部分に架橋しており、ここで第１のポリペプチドは、第１のポリペプチドのアスパラギン酸残基の側鎖とグリシン部分との架橋、および第１のポリペプチドのグルタミン酸残基の側鎖とグリシン部分との架橋をさらにふくむ、第１のポリペプチド；
（ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６に示されるアミノ酸配列を含み、ここでＳＥＱＩＤＮＯ：６の１位のメチオニン残基が存在せず、ここで第２のポリペプチドのリシン残基の側鎖がベータ−アラニン部分に架橋しており、ここで第２のポリペプチドは、第２のポリペプチドのアスパラギン酸残基の側鎖とグリシン部分との架橋および第２のポリペプチドのグルタミン酸残基の側鎖とグリシン部分との架橋とをふくむ、第２のポリペプチド；
を含む組成物。
第２のポリペプチドがデヒドロアラニン部分をさらに含む、請求項７７に記載の組成物。
免疫原性である、請求項７７に記載の組成物。
免疫学的に有効な量の第１のポリペプチドおよび免疫学的に有効な量の第２のポリペプチドを含む、請求項７７に記載の組成物。
凍結乾燥されている、請求項７７に記載の組成物。
アジュバントをさらに含む、請求項７７に記載の組成物。
水酸化アルミニウムをさらに含む、請求項７７に記載の組成物。
さらにアジュバントを含まない、請求項７７に記載の組成物。
トレハロースをさらに含む、請求項７７に記載の組成物。
ポリソルベート８０をさらに含む、請求項７７に記載の組成物。
（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４に示されるアミノ酸配列を含み、ここでＳＥＱＩＤＮＯ：４の１位のメチオニン残基が存在せず、ここで第１のポリペプチドのリシン残基の側鎖がベータ−アラニン部分に架橋しており、ここで第１のポリペプチドの第２のリシン残基が第１のポリペプチドのアスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基に架橋している、第１のポリペプチド；および
（ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６に示されるアミノ酸配列を含み、ここでＳＥＱＩＤＮＯ：６の１位のメチオニン残基が存在せず、ここで第２のポリペプチドのリシン残基の側鎖がベータ−アラニン部分に架橋しており、ここで第２のポリペプチドの第２のリシン残基が第２のポリペプチドのアスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基に架橋している、第２のポリペプチド；
を含む組成物。
第２のポリペプチドがデヒドロアラニン部分をさらに含む、請求項８７に記載の組成物。
免疫原性である、請求項８７に記載の組成物。
免疫学的に有効な量の第１のポリペプチドおよび免疫学的に有効な量の第２のポリペプチドを含む、請求項８７に記載の組成物。
凍結乾燥されている、請求項８７に記載の組成物。
アジュバントをさらに含む、請求項８７に記載の組成物。
水酸化アルミニウムをさらに含む、請求項８７に記載の組成物。
さらにアジュバントを含まない、請求項８７に記載の組成物。
トレハロースをさらに含む、請求項８７に記載の組成物。
ポリソルベート８０をさらに含む、請求項８７に記載の組成物。