JP2013512916A - 免疫原としてのＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｄｉｆｆｉｃｉｌｅの無毒の組換えホロトキシン - Google Patents

免疫原としてのＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｄｉｆｆｉｃｉｌｅの無毒の組換えホロトキシン Download PDF

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Abstract

無毒のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素タンパク質は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染（ＣＤＩ）の発生および重症度を減少させるワクチンを開発するために、エンドトキシンを含まないＢａｃｉｌｌｕｓ系において発現された。可能性のあるワクチン候補として評価された免疫原は、変異した毒素Ａ（ＴｃｄＡによってコード化された）および毒素Ｂ（ＴｃｄＢ）、並びに受容体結合ドメインがＴｃｄＡの受容体結合ドメインと置換されることを除いて、完全長ＴｃｄＢタンパク質を含む、合理的に設計されたキメラタンパク質である。膜貫通ドメインの小さな欠失（９７のアミノ酸）が毒性を低減または除去するために使用された。
【選択図】 図８

Description

（関連出願）
本出願は、２００９年１２月２日に出願された米国仮出願第６１／２６５，８９４号の利益を主張し、本明細書によって、その全体が参照によって組み込まれる。
本発明は、概して、無毒の組換えＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（クロストリジウム・ディフィシル）毒素タンパク質に由来する免疫原のワクチン組成物、およびそのための作製する方法および使用する方法に関する。
（政府支援）
本発明は、部分的に、国立衛生研究所からの許可Ｋ０１ＤＫ０７６５４９、Ｎ０１ＡＩ３００５０、Ｒ０１ＡＩ０８８７４８およびＲ０１ＤＫ０８４５０９のもとなされた。
政府は本発明に一定の権利を有している。政府は、本発明にある権利を有する。
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（グラム陽性芽胞形成嫌気性バチルス）は、病院の抗生物質に関連する下痢の最も一般的な原因および偽膜性大腸炎の原因微生物である（Ｃｌｏｕｄ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．２００７ Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ ２３：４−９）。その疾患は、軽症の下痢から生命を脅かす電撃性大腸炎まで及ぶ（Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｊ．Ｇ．２００２ Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４６：３３４−３３９；Ｂｏｒｒｉｅｌｌｏ，Ｓ．Ｐ．１９９８ Ｊ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ４１ Ｓｕｐｐｌ Ｃ：１３−１９４）。
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染（ＣＤＩ）は、細菌またはこの株の細胞の芽胞の経口摂取によってかかる（Ｄｕｂｂｅｒｋｅ，Ｅ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．２００７ Ａｍ Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｃｏｎｔｒｏｌ ３５：３１５−３１８；Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．２００８ ＢＭＣ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ８：７）。芽胞は、胃液酸度へ接触しても生き延びて、結腸で発芽する。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは、院内感染性および抗生物質関連下痢（ＡＡＤ）の最も一般的な原因（２５％までの）であり、および偽膜性大腸炎のほとんどすべての症例である（Ｃｌｏｕｄ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．２００７ Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ ２３：４−９）。
高齢および入院と同じく、抗生物質処置はその疾患に対する重要な危険因子である（Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｊ．Ｇ．２００６ Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ １４５：７５８−７６４）。抗生物質の使用によって、ほとんどの抗生物質に耐性のあるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは、抗生物質の投与時に、栄養を求めて正常細菌叢と競合する必要がないため、増殖し、毒素を生ずることが可能となる（Ｏｗｅｎｓ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．２００８ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ４６：Ｓ１９−Ｓ３１）。毒素ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢは、疾患の主要な原因である。
プロバイオティクス、毒素吸収ポリマーおよびトキソイドワクチンの投与を含む介入は、ＣＤＩの増加する発生率および重症度を予防も処置もしない（Ｇｅｒｄｉｎｇ，Ｄ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．２００８ Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ４６ Ｓｕｐｐｌ １：Ｓ３２−４２）。さらなる懸念は、抗生物質に耐性のある強毒性の（ｈｙｐｅｒｖｉｒｕｌｅｎ）株が最近出現していることである。
感染の発生率は、着実に増加している（Ａｒｃｈｉｂａｌｄ，Ｌ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．２００４ Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １８９：１５８５−１５８９）。北アメリカにこの数年に生じた、高い罹患率および死亡率を伴うＣＤＩのいくつかの院内発生は、広域抗生物質の広範囲の使用が原因であった。新しく、より有毒なＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株の出現はまた、疾患の増加した発生および重症度の原因となった（Ｌｏｏ，Ｖ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．２００５ Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５３：２４４２−２４４９；ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｌ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．２００５ Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５３：２４３３−２４４１）。発生と重症度の急増のため、ＣＤＩは、いまや、重大な新たな疾患と考えられる。
米国医療品質研究調査機構（ＡＨＲＱ）によると、ＣＤＩに感染した病院患者の発生率は、１９９３年から２０００年までの７４％の増加に続いて、２０００年から２００５年まで２００％急増した。発生率のそのような急速な増加は、広域抗生物質の使用及び／又は新しい強毒性のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株の出現に起因すると考えられる。さらに、感染のほとんどの場合が、抗生物質が関連する大腸炎に対する危険因子を持った患者に生じ、増加する割合の患者は標準的な危険因子を有さず、患者は、妊婦、臓器移植患者、ヘルスケア職員、および生活共同体で暮らす以前健康な人々さえも含む（Ｓｅｖｅｒｅ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ ａｔ ｌｏｗ ｒｉｓｋ−−ｆｏｕｒ ｓｔａｔｅｓ．２００５．ＭＭＭＷＲ ５４：１２０１−１２０５）。
標準的治療は、バンコマイシンまたはメトロニダゾールでの処置を含むが、そのどちらも十分に有効でない（Ｚａｒ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．２００７ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ４５：３０２−３０７）。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに感染した者のおおよそ１５−３５％が、処置の後再発する（Ｂａｒｂｕｔ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．２０００ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３８：２３８６−２３８８；Ｔｏｎｎａ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．２００５ Ｐｏｓｔｇｒａｄ Ｍｅｄ Ｊ ８１：３６７−３６９）。
ＣＤＩの管理は、毎年、合衆国保健医療（ｔｈｅ ＵＳ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ｓｙｓｔｅｍ）の１１憶ドル（＄１．１Ｂ）を要すると推測されている（Ｋｕｉｊｐｅｒ， Ｅ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．２００６ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｎｆｅｃｔ １２ Ｓｕｐｐｌ ６：２−１８）。ＣＤＩの割合の増加はまた、従来より、高まった重症度、および高い％の結腸切除（１０．３％）およびより高い死亡率（およそ２５％）の増加した割合に関係している（Ｄａｌｌａｌ，Ｒ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．２００２ Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｓｕｒｇｅｒｙ ２３５：３６３−３７２）。
ＣＤＩ感染の臨床所見は、無症候性の保因から軽症の自己制御式下痢まで、より重症の生命を脅かす偽膜性大腸炎まで、非常に変わりやすい。最も一般的な症状は下痢である。他の一般の臨床症状は、腹痛、痙攣、高い体温および白血球の増加を含む。ＣＤＩの軽度の場合では、抗生物質の退薬と経口的水分補給がしばしば有効である。より重篤なＣＤＩの場合については、標準的治療はメトロニダゾールの経口投与であり、またはバンコマイシンが推奨されるが、そのどちらも十分に有効でない（Ｚａｒ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．２００７ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ４５：３０２−３０７）。この処置も、５５％もの高い再発率に関係している（Ｂａｒｂｕｔ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．２０００ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３８：２３８６−２３８８；Ｗａｌｔｅｒｓ，Ｂ．Ａ．ｅｔ ａｌ．１９８３ Ｇｕｔ ２４：２０６−２１２）。あいにく、再発性ＣＤＩに対する一次処置の選択肢は、メトロニダゾールまたはバンコマイシンのままである。現在臨床的な開発における実験的処置は、毒素吸収ポリマー、いくつかの抗生物質およびモノクローナル抗体を含む（Ａｎｔｏｎ，Ｐ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．２００４ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ４８：３９７５−３９７９；Ｈｉｎｋｓｏｎ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．２００８ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ５２：２１９０−２１９５；ＭｃＶａｙ，Ｃ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．２０００ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ４４：２２５４−２２５８）。
ＣＤＩを予防するために、および重症度を低下させ、進行中の慢性病を排除し、およびどうにかして再発を予防するために、容易に生成され、強い全身性免疫および粘膜免疫を誘発するＴｃｄＡおよびＴｃｄＢを標的とするワクチンに対する必要性がある。
（実施形態の要約）
本明細書で提供される本発明の実施形態は、感染に対して被験体を免疫化するための無毒の組換えクロストリジウム毒素タンパク質を含むワクチン組成物であり、そのタンパク質は、Ｃ末端に配置されたタンパク質精製タグに操作可能に連結される（ｌｉｎｋｅｄ）、グルコシルトランスフェラーゼドメイン（ＧＴ）、システインプロテイナーゼドメイン（ＣＰＤ）、膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）および受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を有する。組成物は被験体を免疫化するのに有効である。組成物のタンパク質は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ宿主において組換え技術で産生される。例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓは、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓなどである。例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃ．ｓｏｒｄｅｌｌｉｉ、Ｃ．ｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ｃ．ｔｅｒｔｉｕｍ、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍなどの群の少なくとも１つから選択される。
関連する実施形態におけるタンパク質は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのＴｃｄＡタンパク質およびＴｃｄＢタンパク質の群から選択される少なくとも１つの毒素タンパク質に、少なくとも１つの変異を含み、その結果、変異は、毒性を減少させ、かつ天然のタンパク質構造を保持する。様々な実施形態において、変異は、少なくとも約１０倍から約１，０００倍まで毒性を減少させる。例えば、変異は、少なくとも約１０，０００倍から、約１０００万倍まで毒性を減少させる。代替的な実施形態において、変異は、ＴｃｄＡタンパク質およびＴｃｄＢタンパク質の少なくとも１つのＧＴドメインに位置する。変異はアミノ酸置換またはアミノ酸欠失を含む。例えば、置換は、トリプトファンのアラニンでの置換またはアスパラギン酸のアスパラギンでの置換を含む。様々な実施形態におけるタンパク質は、複数の変異を含む。
代替的な実施形態における組成物は、ＴｃｄＡタンパク質に由来する第１アミノ酸配列およびＴｃｄＢタンパク質に由来する第２アミノ酸配列を有するキメラ融合ｃＴｘＡＢであるタンパク質を含む。例えば、第１アミノ酸配列は、ＴｃｄＡ ＲＢＤドメインを含み、および第２アミノ酸配列はＴｃｄＢ ＧＴ、ＣＰＤおよびＴＭＤドメインを含む。タンパク質ドメインは、精製タグに操作可能に連結され、タンパク質は、さらに、タグを除去するためのプロテアーゼ切断部位を含む。関連する実施形態における精製タグは、以下の群から選択される少なくとも１つである：Ａｒｇ−タグ、カルモデュリン−結合ペプチド、セルロース−結合ドメイン、ＤｓｂＡ、ｃ−ｍｙｃ−タグ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ＦＬＡＧ−タグ、ＨＡＴ−タグ、Ｈｉｓ−タグ、マルトース−結合タンパク質、ＮｕｓＡ、Ｓ−タグ、ＳＢＰ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−タグおよびチオレドキシン。関連する実施形態における組成物は、欠失変異を含む。例えば、欠失は、ＴＭＤドメインに少なくとも１つのアスパラギン酸を含む。
１つの実施形態は、有効量で組成物を提供する。関連する実施形態における組成物は、アジュバント、及び／又は薬学的に許容可能な担体を含む。
代替的な実施形態において、組成物は、細菌ベクタ―に操作可能に連結されるタンパク質をコードする核酸を含む。
代替的な実施形態において、組成物は、ＴｃｄＡタンパク質かＴｃｄＢタンパク質のいずれか、または両方を含み、そのタンパク質は、別々に組換え技術で産生される。
別の実施形態における本発明は、単位用量の上記の実施形態のいずれかに係る組成物、容器、および使用のための指示書を含むキットを提供する。
本明細書の本発明の実施形態は、被験体において、クロストリジウム−ディフィシーレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素に特異的な免疫反応を誘発する方法であり、その方法は：タンパク質がグルコシルトランスフェラーゼドメイン（ＧＴ）、システインプロテイナーゼドメイン（ＣＰＤ）、膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）およびＣ末端に配置された精製タグを含むように、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素タンパク質組成物の無毒の変異をコード化する核酸を設計する工程；Ｂａｃｉｌｌｕｓ細胞にタンパク質を発現し、そのタンパク質を精製し、および精製タグを取り除く工程；および組成物を調剤し、被検体を組成物と接触させ、それによって、被験体に、そのタンパク質に特異的な、少なくとも１つの体液性免疫反応および細胞媒介性免疫反応を誘発する工程。
関連する実施形態における設計工程は、ＴｃｄＡタンパク質に由来するアミノ酸配列をコード化する第１核酸配列、およびＴｃｄＢタンパク質に由来するアミノ酸配列をコード化する第２核酸配列の少なくとも１つに変異を得る工程を含む。例えば、変異は、ＴｃｄＡタンパク質およびＴｃｄＢタンパク質の少なくとも１つのＧＴドメインにある。関連する実施形態における変異を設計する工程は、アミノ酸置換またはアミノ酸欠失を導入する工程を含む。例えば、置換変異は、トリプトファンをアラニンに置換する工程、およびアスパラギン酸をアスパラギンに置換する工程の少なくとも１つを含む。１つの実施形態におけるタンパク質を設計する工程は、少なくとも１つの変異、例えば、複数の変異を導入する工程を含む。関連する実施形態における方法は、ＴＭＤドメインの少なくとも１つのアスパラギン酸を欠失させる工程を含む。
本明細書の方法において使用される組成物は、ＴｃｄＡタンパク質に由来する第１アミノ酸配列、およびＴｃｄＢタンパク質に由来する第２アミノ酸配列を有する無毒のキメラタンパク質ｃＴｘＡＢを含む。従って、アミノ酸配列の実施形態を設計する工程は、タンパク質ドメインがＣ末端にある精製タグ、およびタグの除去のためのプロテアーゼ切断部位に操作可能に連結されるように、ＴｃｄＡタンパク質からのＲＢＤドメインをコード化する核酸を、ＴｃｄＢタンパク質のＧＴ、ＣＰＤおよびＴＭＤドメインのアミノ酸配列をコード化する核酸と組換え技術で連結する工程を含む。
一般に、被験体は、ヒト、研究動物、高価値の動物園動物および農業動物（ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｉｍａｌ）の群の少なくとも１つから選択される。
関連する実施形態における方法は、被験体と接触し、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮内、粘膜、皮下、舌下、鼻腔内および経口からなる群の少なくとも１つから選択される経路によって組成物を投与する工程をさらに含む。
その方法の実施形態は、被験体の血清中の抗体力価を分析する工程、および免疫反応が被験体において誘発されたという指標として、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ抗原を特異的に結合する抗体の増加を、接触していない対照の被験体の増加と比較して観察する工程をさらに含む。
本発明の実施形態は、本明細書において、Ｂａｃｉｌｌｕｓ宿主において、組換え変異型Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ毒素タンパク質を産生する方法を提供し、その方法は、以下の工程を含む：タンパク質はグルコシルトランスフェラーゼドメイン（ＧＴ）、システインプロテイナーゼドメイン（ＣＰＤ）、膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含み、遺伝子は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ細胞に又は選択可能なマーカーに、およびＣ末端に位置された精製タグに、遺伝子を発現するための調節シグナルに操作可能に連結されるように、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｕｍタンパク質に関して遺伝子をコード化する核酸ベクターを構築する工程；Ｂａｃｉｌｌｕｓ細胞の原形質体をベクタ―と接触させる工程；および選択可能なマーカーを有し、形質転換体の細胞に組換えタンパク質を発現する形質転換体を選択する工程。
一般に、Ｂａｃｉｌｌｕｓは、以下の群から選択される：ｂａｃｉｌｌｉの他の種類も想定されるが、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、およびＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ。
方法の関連する実施形態において、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍタンパク質遺伝子は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃ．ｓｏｒｄｅｌｌｉｉ、Ｃ．ｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ｃ．ｔｅｒｔｉｕｍ、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍなどの群からの少なくとも１つから得られる。
関連する実施形態における核酸ベクタ―を構築する工程は、無毒の変異型Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのＴｃｄＡタンパク質をコード化する第１核酸配列、および無毒の変異型Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのＴｃｄＢタンパク質をコード化する第２核酸配列を、（例えば）第１と第２の核酸を結紮して組み合わせる工程を含む。
方法の１つの実施形態におけるタンパク質は、少なくとも１つの変異を含む。例えば、少なくとも１つの変異は、少なくとも１つのアミノ酸の置換または欠失を含む。例えば、少なくとも１つの変異は、ＧＴドメインに位置する。例えば、少なくとも１つの変異は、トリプトファンのアラニンとの置換またはアスパラギン酸のアスパラギンとの置換を含む。関連する実施形態において、タンパク質は複数の変異を含む。
方法の１つの実施形態において、組換えキメラｃＴｘＡＢタンパク質をコード化する遺伝子は、ＴｃｄＢタンパク質に由来する第１アミノ酸配列、およびＴｃｄＡタンパク質に由来する第２アミノ酸配列を含む。例えば、タンパク質ドメインが、タグの除去のためのプロテアーゼ切断部位を有する精製タグに操作可能に連結されように、ＴｃｄＢタンパク質アミノ酸配列は、ＧＴドメインを含み、ＴｃｄＡタンパク質アミノ酸配列は、ＲＢＤ、ＣＰＤおよびＴＭＤドメインを含む。
方法の実施形態において、組換えキメラＴｘＢ−Ａｒタンパク質をコード化する遺伝子は、ＴｃｄＡタンパク質に由来する第１アミノ酸配列、およびＴｃｄＢタンパク質に由来する第２アミノ酸配列を含む。例えば、タンパク質ドメインが、タグの除去のためのプロテアーゼ切断部位を有する精製タグに操作可能に連結されように、ＴｃｄＡタンパク質アミノ酸配列は、ＲＢＤドメインを含み、ＴｃｄＢタンパク質アミノ酸配列は、ＧＴ、ＣＰＤおよびＴＭＤのドメインを含む。
図１は、免疫感作および経口細菌のチャレンジのための実験計画を示す。Ｃ５７ＢＬ／ｃマウスは、−３７、−２３および−９日目に、３回免疫化された（マイナスは、チャレンジ前の日数を示す）。−６日目に、マウスを、３日間の抗生物質カクテル処置によって、その後、−１日目に、１回のクリンダマイシンの腹腔内の（ＩＰ）の投薬によって、腸の微生物叢を枯渇させた。０日目に、マウスは、１０４または１０５のＣＰＵのＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅでチャレンジされた。疾患と死亡の推移がモニタリングされた。 図２は、野生型と変異型の組換え毒素を示す１セットの図面である。 図２のパネルＡは、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍにおいて発現された野生型ＴｃｄＡ（長さ２７１０個のアミノ酸）およびＴｃｄＢ（長さ２３６６個のアミノ酸）を示す。両方の毒素は機能ドメイン：ＧＴ（グルコシルトランスフェラーゼドメイン）、ＣＰＤ（システインプロテイナーゼドメイン）、ＴＭＤ（膜貫通ドメイン）およびＲＢＤ（受容体結合ドメイン）を含む。６−アミノ酸ヒスチジンタグは、両方の毒素のＣ末端に導入された（Ｔｅｒｐｅ，Ｋ Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００３）６０：５２３−５３３）。領域基質（ＵＤＰ−グルコース）中の毒素のＧＴドメインのアミノ酸ＷおよびＤＸＤが示される。ＴｃｄＢ活性にとって重大な意味を持つことが認識されている（アミノ酸１７５４〜１８５１までの）Ｄ９７は、白いバンドとして示される。 図２のパネルＢは変異型ホロトキシンまたは毒素キメラタンパク質を示す。Ａ１、Ａ２およびａＴｃｄＡは、それぞれ、単一変異（Ｄ２７８Ｎ）、二重変異（Ｗ１０１ＡとＤ２７８Ｎ）および三重変異（Ｗ１０１Ａ、Ｄ２７８ＮおよびＷ５１９Ａ）を有するＴｃｄＡ毒素を表わす。表記ａＴｃｄＢは、ＧＴドメインの中に２つの変異（Ｗ１０２ＡとＤ２７８Ｎ）を有する変異型ＴｃｄＢを示す。ｃＴｘＡＢは、ＴｃｄＡのＲＢＤと置換されたＲＢＤを有するＴｃｄＢである。Ｄ９７は、このキメラタンパクにおいて欠失され、その結果、完全に無毒なｃＴｘＡＢを生じる。Ｈｉｓ（６）タグに加えて、Ｓｔｒｅｐタグが加えられ、高い親和性でアビジン様タンパク質に結合する８−アミノ酸タグが、Ｈｉｓ−タグのＮ末端に導入された。トロンビンプロテアーゼ切断部位はタグと毒素タンパク質の間で融合され、両方のタグの除去を適切にすることを可能とした。 図３は、毒素の変異型の毒性および細胞の結合を示す１セットの免疫ブロット、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットおよび写真である。 図３のパネルＡおよびＢは、それぞれ、ＣＴ２６またはＨＴ２９の細胞の免疫ブロットを示す。細胞は、示された時間の間、示された濃度の野生型のＴｃｄＢまたはａＴｃｄＢにより処理され、回収され、溶解され、グルコシル化されていないＲａｃ１にのみ結合するモノクローナル抗体（Ｃｌｏｎｅ １０２）を使用して、イムノブロッティングによって分析された。β−アクチンは、等しいサンプル充填を制御するために使用された。 図３のパネルＣは、ＰＢＳ１００μｌ中で腹腔内に投与された５０または１００ｎｇの野生型ＴｃｄＢで、またははるかに高い投与量１００μｇの変異型ａＴｃｄＢでＩＰチャレンジされたＢａｌｂ／ｃマウスの生存を示す１セットのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットである。マウス生存はモニタリングされ、時間の関数として図示された。 図３のパネルＤは、３７℃で３０分間、培地、ＴｃｄＡまたはｃＴｘＡＢに接触されたマウス白血病の単球ＲＡＷ ２６４．７細胞を示す１セットの写真である。細胞は回収され蛍光色素結合抗体（ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）により染色され、画像は蛍光顕微鏡を使用して得られた。 図４は、変異型組換えホロトキシンおよびキメラタンパク質の構造を示す１セットの図である。 図４のパネルＡおよびＢは、それぞれ、変異型ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢの構造を示す図である。パネルＡに示されたａＴｃｄＡは、ＧＴドメインに三重変異（Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７ＮおよびＷ５１９Ａ）を有する変異型ＴｃｄＡを表し、パネルＢに示されたａＴｃｄＢは、ＧＴドメインに二重変異（Ｗ１０２ＡとＤ２８８Ｎ）を有する変異型ＴｃｄＢを表わす。 図４のパネルＣは、そのＲＢＤをＴｃｄＡのＲＢＤで交換されたＴｃｄＢである変異型ＴｘＢ−Ａｒを示す。 図４のパネルＤは変異型ｃＴｘＡＢを示し、それはそのＧＴドメインに二重変異（Ｗ１０２ＡとＤ２８８Ｎ）を有するＴｘＢＡｒである。ＧＴ：グルコシルトランスフェラーゼドメイン；ＣＰＤ：システインプロテイナーゼドメイン；ＴＭＤ：膜貫通ドメイン；ＲＢＤ：受容体結合ドメイン；Ｈｉｓ（６）：６−ヒスチジンタグ。数は、アミノ酸残基の位置を示す。 図５は、野生型と変異型の毒素の円偏光二色性（ＣＤ）構造分析の結果を示す１セットの折れ線グラフおよび表である。 図５のパネルＡおよびＢは、野生型と変異型のＴｃｄＡ（パネルＡ）およびＴｃｄＢ（パネルＢ）の二次構造分析を示す。遠紫外線ＣＤスペクトルは２２℃で記録された。この構造分析によって、ＣＤスペクトルが実際に同定されるので、野生型と変異型のＧＴ毒素が機構的に類似していることが証明された。 図５のパネルＣは、ＴｃｄＡタンパク質（上部）およびＴｃｄＢタンパク質（下部）の二次構造の組成物の構成要素の表である。 図６は、変異型毒素のグルコシルトランスフェラーゼ活性を示す免疫ブロットの１セットの写真である。ベロ細胞溶解物は、１時間または２時間の間、１μｇ／ｍｌの野生型または変異型の毒素タンパク質と接触された。Ｒａｃ１グリコシル化は、グルコシル化されていないＲａｃ１にのみ結合するモノクローナル抗体（Ｃｌｏｎｅ １０２）を用いるイムノブロッティングによって分析された。β−アクチンは、等しい充填制御のために使用された。 図７は、変異型毒素の細胞毒性を示す１セットの折れ線グラフである。結腸癌ＣＴ２６細胞は、７２時間の間、異なる濃度で野生型または変異型の毒素と接触された。毒性は、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム臭化物、黄色テトラゾール）を用いてアッセイされ、細胞の生存率は、毒素処理のない細胞と比較して、生存する細胞の百分率として表示された。アッセイは３回行なわれ、データは平均±ｓ．ｅ．ｍを表わす。 図７のパネルＡは、ａＴｃｄＡ（黒丸）またはＴｃｄＡ（黒三角）と接触された９６ウェルプレート中のＣＴ２６細胞のパーセント生存率を示す。データは、１０００ｎｇ／ｍｌでさえ、ａＴｃｄＡの非毒性を示す。 図７のパネルＢは、ａＴｃｄＢ（黒丸）またはＴｃｄＢ（黒三角）と接触されたＣＴ２６細胞のパーセント生存率を示す。データは、１００００ｎｇ／ｍｌでさえ、ａＴｃｄＢの非毒性を示す。 図８は、時間とインビボでの毒性の関数として、マウスの生存を示す１セットのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットである。Ｂａｌｂ／ｃマウスは、１００ｎｇ／マウスの野生型（実線）のＴｃｄＡ（暗灰色の線）またはＴｃｄＢ（薄灰色の線）、または１００μｇ／マウスの変異型（点線）のａＴｃｄＡ（暗灰色の線）またはａＴｃｄＢ（薄灰色の線）のいずれかによりＩＰチャレンジされた。マウス生存は、モニタリングされ、データは、ａＴｃｄＡ（１００μｇ）およびａＴｃｄＢ（１００μｇ）の生存を示し、野生型ＴｃｄＡ（１００ｎｇ）およびＴｃｄＢ（１００ｎｇ）が毒性であったことを示す。 図９は、キメラ毒素タンパク質の細胞毒性を示す折れ線グラフである。９６ウェルプレート中のＣＴ２６細胞は、７２時間の間、異なる濃度でＴｃｄＢ−Ａｒ（黒三角）またはｃＴｘＡＢ（黒丸）と接触された。ＭＴＴアッセイが行なわれ、細胞の生存率が、毒素処置のない細胞と比較して、生存する細胞の百分率として表示された。アッセイは３回行なわれ、データは平均±ｓ．ｅ．ｍを表わす。 図１０は、精製の２つの工程の後に組換え毒素調製物中のＴＬＲ２リガンドの不存在を示す１セットの棒グラフである。ヒトＴＬＲ２を発現するモノクローナルＨＥＫ２９３細胞は、Ｎｉ−アフィニティークロマトグラフィーによって、さらに、パネルＡ上に示されるＴｃｄＡのためのチログロブリンカラムで、またはパネルＢ上に示されるＴｃｄＢのためのＱ−カラムで精製された、示された濃度の組換え毒素タンパク質と共に、２４時間インキュベートされた。ＴＬＲ２シグナル伝達は、ＮＦ−κＢプロモータの制御下で、レポーター遺伝子（分泌型アルカリフォスファターゼ、ＳＥＡＰ）の発現によってモニタリングされた。培地中へ分泌されたＳＥＡＰの量は、ＳＥＡＰ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ（Ｃａｔ＃ｒｅｐ−ｓａｐ，Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）によって測定された。ｍＴｃｄＡは、ｒＴｃｄＡの変異型形態（Ａ１）を表わす。Ｌｍ（加熱殺菌リステリア菌）は、アッセイのための陽性対照として役立った。データは、高度に精製された組換え毒素調製物は、ＴＬＲ２リガンドをほとんど、またはまったく含まないことを示す。 図１１は、ＴｃｄＡ特異的モノクローナル抗体（ＭＡｂ）の反応性を示す免疫ブロットの１セットの写真である。 図１１のパネルＡは、ニトロセルロース膜上に見つけられた、示された量での天然の精製されたＴｃｄＡを示す。 図１１のパネルＢは、ｐｒｅ−ｃａｓｔ ｇｅｌを用いて分離され、ニトロセルロース膜上に移された、組換え型の全長および切断型のＴｃｄＡペプチドフラグメントＦ３（アミノ酸１１８５〜１８３８）およびＦ４（Ｃ末端に対してアミノ酸１８３９）を示す。膜は示された抗ＴｃｄＡ ＭＡｂｓにより調べられ、タンパク質のスポットまたはバンドは、化学発光基質を使用して視覚化された。ＢＩＤ−５５５はＭａｒｉｄｉａｎ Ｌｉｆe Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．から購入された。 図１２は、ＭｙＤ８８−／−マウスにおけるＴｃｄＡ媒介性腸炎症を示す棒グラフおよび組織学の１セットの写真である。ＭｙＤ８８−／−マウスは、麻酔をかけられ、各４ｃｍの回腸ループは結紮され（ｌｉｇａｔｅｄ）、５０μｇの組換えＴｃｄＡまたは同量の対照ＰＢＳとともに注入された。その後の組織学の分析のために、回腸ループは４時間後に取り除かれた。 図１２のパネルＡは、ループ長さ（ｃｍ）に対するループ重量（ｍｇ）の割合によって測定された腸液蓄積を示す棒グラフである。ＴｃｄＡは、重量の２倍以上の増加を引き起こした。 図１２のパネルＢは、ＴｃｄＡまたは対照ＰＢＳで処置された腸からの切片のヘマトキシリン−エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色を用いた組織学切片の１セットの写真である。 図１２のパネルＣは、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）に特異的な抗体を用いた免疫組織化学染色を示す。 図１３は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを接種されたノトバイオートの子ブタからの組織の１セットの検死画像である。 図１３のパネルＡは、毒素非産生株ＣＤ３７を接種された子ブタからの腸管を示す。大腸は、メソ結腸（ｍｅｓｏｃｏｌｏｎｉｃ）浮腫または炎症（画像の前面の螺旋状の結腸）がなく正常に見えた。 図１３のパネルＢは、毒素産生菌ＵＫ６を接種され、２週の持続時間の慢性下痢になった子ブタからの腸管を示す。螺旋状の結腸（画像の前面）は中程度のメソ結腸（ｍｅｓｏｃｏｌｏｎｉｃ）浮腫および炎症を示した。 図１４は、中和力価および毒素チャレンジに対する被験体の保護を示す１セットの棒グラフおよびＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットである。 図１４のパネルＡは、中和力価を示す１セットの棒グラフである。各免疫化されたマウスからの血清は、２倍に希釈され、ＴｃｄＢ（終末濃度０．２５ｎｇ／ｍｌ）と混合され、ＣＴ２６細胞にパルス化された（ｐｕｌｓｅｄ）。細胞球状化（ｃｅｌｌ ｒｏｕｎｄｉｎｇ）は２４時間後にモニタリングされ、中和力価は、血清が活性を失い、ＴｃｄＢによって引き起こされた細胞球状化を妨げる希釈度の逆数として定義された。（ｎ＝５、データは独立Ｔ検定およびｐ＝０．００８によって分析された）。 図１４のパネルＢおよびＣは、マウス生存を示すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットである。トキソイド、ａＴｃｄＢまたはＰＢＳ対照を用いた３回の免疫感作の後、マウスは、１００ｎｇのＴｃｄＢ（パネルＢ）または２００ｎｇのＴｃｄＡ（パネルＣ）のいずれかで腹腔内に（ＩＰ）チャレンジされた。生存はモニタリングされ、データはＧｅｈａｎ−Ｂｒｅｓｌｏｗ−Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定によって分析された。 図１５は、ｃＴｘＡＢ免疫感作がＴｃｄＡとＴｃｄＢの両方に対する抗体および保護反応を誘発することを示す１セットの棒グラフおよびＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットである。Ｂａｌｂ／ｃマウスは、０日目、１０日目および２０日目にアジュバントとしてミョウバンを含むｃＴｘＡＢで腹腔内に免疫化された。 図１５のパネルＡは、ｃＴｘＡＢによるマウスの免疫感作は、ＴｃｄＡとＴｃｄＢの両方に対するＩｇＧ抗体を誘発したことを示す１セットの棒グラフである。各免疫感作７日後の前血清（ｐｒｅｓｅｒａ）および血清が集められ、ＴｃｄＡとＴｃｄＢに対するＩｇＧ抗体が、精製された天然の毒素をコーティングされたマイクロプレートを使用して、ＥＬＩＳＡによって測定された。ｎ＝１０、統計分析二元配置分散分析が用いられ、試験後のために、免疫化された血清群を前血清と比較するために、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ ｐｏｓｔ−ｔｅｓｔが使用された。 図１５のパネルＢは、マウス生存を時間の関数として示すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットである。ｃＴｘＡＢを免疫化されたマウスは、２００ｎｇまたは１００ｎｇのいずれかのＴｃｄＡで腹腔内にチャレンジされ；ＰＢＳ免疫化された群は、１００ｎｇのＴｃｄＡでチャレンジされた。ｃＴｘＡＢで免疫化されたマウスは、１００ｎｇのＴｃｄＡでチャレンジを残らず生き残った。 図１５のパネルＣは、マウス生存を時間の関数として示す。ｃＴｘＡＢとＰＢＳで免疫化されたマウスの群は、１００ｎｇのＴｃｄＢでＩＰチャレンジされた。マウスの生存はモニタリングされ、データは、Ｇｅｈａｎ−Ｂｒｅｓｌｏｗ−Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定によって分析された。ｃＴｘＡＢで免疫化されたマウスは残らずチャレンジを生き残った。 図１６は、ＴｃｄＡとａＴｃｄＡの結合および内在化を示す１セットの顕微鏡画像である。ＲＡＷ ２６４．７細胞は、３７℃で３０分間、野生型ＴｃｄＡ（左のパネル）、または変異型ａＴｃｄＡ（右のパネル）に接触された。細胞は回収され、蛍光色素結合抗体およびＤＡＰＩで染色された。毒素タンパク質分子の局在化は、共焦点顕微鏡によって分析された。 図１７は、免疫化されたマウスにおける抗ＴｃｄＢ ＩｇＧサブタイプを示す１セットの棒グラフである。Ｂａｌｂ／ｃマウスは、３回の５μｇ／注入のホルマリン不活性化ＴｃｄＢ（トキソイド）またはａＴｃｄＢでＩＰ免疫化された。マウス血清サンプルは、３回目の免疫感作の７日後に集められた。 図１７のパネルＡは、ＨＲＰ結合抗ネズミＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃおよびＩｇＧ３の二次抗体を使用して測定された４０５ｎｍ（ＯＤ）での光学濃度としてのＩｇＧサブクラスの量を示す。各々の群からのプール血清は、１００または１０００倍希釈する。データは、本質的により多くのＩｇＧがトキソイドよりａＴｃｄＢによって引き起こされることを示す。２より大きな割合（線によって示された）は、陽性と考えられた。 図１７のパネルＢは、背景と比較したＯＤの比率を示す。ａＴｃｄＢで免疫化された群からの等しい数の血清サンプルからなるプールは、１：５００の希釈度から連続的に２倍希釈された。 図１８は、ａＴｃｄＢ免疫感作は、トキソイドより多くの迅速なＩｇＧ反応を誘発したことを示す棒グラフである。Ｂａｌｂ／ｃマウスは、０日目、７日目、および２１日目に、５μｇ／注入のホルマリン不活性化ＴｃｄＢ（トキソイド）で、または突然変異体ａＴｃｄＢで腹腔内に免疫化された。マウス前血清（免疫感作の前の）および血清のサンプルは、各免疫感作の１週間後に集められ、抗ＴｃｄＢ ＩｇＧは、標準ＥＬＩＳＡによって測定された。データは、ａＴｃｄＢが２回目の免疫感作の後に強力なＩｇＧ反応を誘発したことを示す（ｎ＝５）。 図１９は、毒素の一次構造の全長にわたるエピトープのａＴｃｄＢ免疫感作に誘発された抗体による認識を示す免疫ブロットの写真である。ａＴｃｄＢ免疫化されたマウスからの血清は、ＴｃｄＢおよび重複しないＴｃｄＢのフラグメント（Ｎ末端からＣ末端まで、Ｆ１からＦ４）の各々をイムノブロッティングするために使用された。Ｈｉｓタグに特異的なあり得る抗体を取り除くために、血清は、無関係のＨｉｓタグ化組換えタンパク質で予めインキュベートされた。 図２０は、ＩｇＧ反応を誘発するａＴｃｄＢとトキソイドの免疫感作の能力を比較する棒グラフである。Ｂａｌｂ／ｃマウスは、５μｇ／注入のホルマリンで不活性化されたＴｃｄＢ（トキソイド）またはａＴｃｄＢで３回腹腔内に免疫化された。３回目の免疫感作の７日後にマウス血清サンプルが集められ、抗ＴｃｄＢ ＩｇＧが標準ＥＬＩＳＡによって測定された。データは、ａＴｃｄＢがトキソイドより著しく大きなＩｇＧ反応を誘発したことを示す。データは二元配置分散分析により分析され、星印は群間（ｎ＝５）の有意性を示す。 図２１は、キメラｃＴｘＡＢ免疫感作が、毒素ＡとＢの両方に特異的な強力な中和抗体、およびＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ実験室株での経口チャレンジに対する保護を誘発したことを示す、１セットの棒グラフ、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットおよび折れ線グラフである。パネルＡ、ＢおよびＣは、同様の結果を伴って少なくとも３回行なわれたアッセイを示す。エラーバーは、平均±ｓ．ｅ．ｍを示す。 図２１のパネルＡは、ｃＴｘＡＢ免疫感作の後の、血清の抗ＴｃｄＡ（白棒）ＩｇＧ力価および抗ＴｃｄＢ（灰色棒）ＩｇＧ力価を示す棒グラフである。 図２１のパネルＢは、ｃＴｘＡＢ免疫感作の後の、血清の抗ＴｃｄＡ（白棒）中和力価および抗ＴｃｄＢ（灰色棒）中和力価を示す棒グラフである。 図２１のパネルＣは、ＰＢＳで処置された対照マウス（実線）、またはｃＴｘＡＢで免疫化されたマウス（点線）の生存を示すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットである。免疫化されたマウスは、２つの群に分けられ、それぞれ、致死量（１００ｎｇ／マウス）の野生型ＴｃｄＡ（薄灰色線）またはＴｃｄＢ（暗灰色線）によりチャレンジされた。データは、免疫化されたマウスの完全な生存率を示す。 図２１のパネルＤ−Ｉは、マウス生存率（パネルＤおよびＧ）、重量（パネルＥおよびＨ）および症状（下痢、パネルＦおよびＩ）を示すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロット（Ｐ＜０．０１）、折れ線グラフ、および棒グラフのセットである。３回目の免疫感作ｃＴｘＡＢ（灰色線）または対照ＰＢＳ（黒線）の１０日後（パネルＤ−Ｆ）または３か月後（パネルＧ−Ｉ）。マウスは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅＶＰＩ１０４６３栄養細胞（１０５ｃｆｕ／マウス）でチャレンジされた。マウスはモニタリングされ、データは集められ、分析された。 図２２は、トキソイドと比較した、変異型ホロトキシンでの免疫感作後の抗体反応および保護を示す１セットの棒グラフ、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットおよび折れ線グラフである。 図２２のパネルＡは、ａＴｃｄＢ（灰色棒）での各免疫感作またはトキソイド（白棒）免疫感作の後の抗体力価を示す１セットの棒グラフである。（＊Ｐ＜０．０５）。データは、トキソイドよりａＴｃｄＢによって誘発された、より高い力価を示す。 図２２のパネルＢは、中和力価を示す１セットの棒グラフである。各免疫化されたマウスからの血清は、連続的に２倍希釈され、野生型ＴｃｄＢと混合され、サンプルはＣＴ２６細胞へパルス化された（ｐｕｌｓｅｄ）。細胞球状化は２４時間後モニタリングされ、血清が、ＴｃｄＢによって引き起こされた細胞球状化を妨げる活性を失う時の希釈度の逆数として定義された各々のサンプルの中和力価が測定された。（ｐ＝０．００８）。 図２２のパネルＣおよびＤは、トキソイドＢ（暗灰色線）、ａＴｃｄＢ（薄灰色線）での３回目の免疫感作、または対照ＰＢＳ（黒線）による処置の１０日後の生存率を示す１セットのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットである。マウスは、１００ｎｇ／マウスの致死量の野生型ＴｃｄＢ（パネルＣ）またはＴｃｄＡ（パネルＤ）でチャレンジされ、生存率はモニタリングされ、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線によって分析された。 図２２のパネルＥおよびＦは、それぞれ、ＴｃｄＡまたはＴｃｄＢに関する血清の中和力価を示す１セットの棒グラフである。マウスは、ａＴｃｄＡ、ａＴｃｄＢ、またはａＴｃｄＡとａＴｃｄＢの混合物で免疫化され、血清の中和力価が測定された。 図２２のパネルＧおよびＨは、マウス生存率（パネルＧ）および下痢の発生（パネルＨ）を示す１セットのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロット、および棒グラフである。マウスの群は、３回、ａＴｃｄＡ（暗灰色線）、ａＴｃｄＢ（灰色線の淡い影）、ａＴｃｄＡとａＴｃｄＢの混合物（薄灰色線）で免疫化され、または対照ＰＢＳ（黒線）によって処置され、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌ＶＰＩ１０４６３株（１０５ＣＦＵ／マウス）で経口的にチャレンジされた。 図２２のパネルＩおよびＪは、それぞれ、生存率と重量を示す。マウスの群は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞（ＵＫ１株、１０６芽胞／マウス）接種の４時間後に、ＴｃｄＡ（抗Ａ、暗灰色線）、ＴｃｄＢ（抗Ｂ、灰色線の淡い影）またはＴｃｄＡとＴｃｄＢの混合物（抗Ａおよび抗Ｂ、薄灰色線；各々５０μｌまたは一緒に）に対するアルパカ抗血清を腹腔内注入された。対照マウスは、１００μｌの前血清（ＣＲＴ、黒線）を注入された。マウスの生存率（パネルＩ）および重量（パネルＪ）がモニタリングされた。データは、２つのアッセイ（星印は、抗Ａ＋抗ＢおよびＣＲＴの群間の有意性を示す）からプールされた。データは同様の結果をもたらす３つの独立した繰り返しの代表である。エラーバーは、平均±ｓ．ｅ．ｍを示す。 図２３は、ｃＴｘＡＢ免疫感作が強力な中和活性によって抗体を誘発したことを示す棒グラフである。マウスは、１０日の間隔に４回ＩＰ免疫化された。また、血清サンプルは第４の免疫感作の７日後に集められた。血清の中和力価は本明細書に記載されているものとしてＣＴ２６細胞を使用して測定された。ＴｃｄＡ（１２，８００）またはＴｃｄＢ（２，６００）に対する平均（ｎ＝４）の中和力価が示される。 図２４は、ｃＴｘＡＢワクチン接種が強毒性の（ｈｙｐｅｒｖｉｒｕｌｅｎｔ）株によって誘発された一次の（ｐｒｉｍａｒｙ）再発性ＣＤＩを減少または除去することを示す１セットのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線、折れ線グラフ、棒グラフ、写真および略図である。 図２４のパネルＡ−Ｃは、マウス生存率（パネルＡ）、重量（パネルＢ）および疾患症状（下痢、パネルＣ）を示すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロット、折れ線グラフ、および棒グラフである。３回の免疫感作の後、マウスは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株ＵＫ１芽胞（１０６／マウス；灰色線：ｃＴｘＡＢ；黒の実線：ＰＢＳ；黒の破線：芽胞のチャレンジのない抗生物質カクテル処置）によりチャレンジされた。 図２４のパネルＤ−Ｇは、対照ＰＢＳによって処置されたマウス（パネルＤおよびＦ）、またはｃＴｘＡＢにより免疫化されたマウス（パネルＥおよびＧ）からの腸の剖検および盲腸の組織学を示す写真である。 図２４のパネルＨおよびＩは、ＣＤＩ再発（ｒｅｌａｐｓｅ／ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ）モデルのための免疫感作およびチャレンジのスケジュールを示す１セットの図面である。 図２４のパネルＪ−Ｌは、パネルＨに示されたスケジュールによる再チャレンジ（ｒｅｃｈａｌｌｅｎｇｅ）の後の１セットのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロット、折れ線グラフ、およびマウス再発性疾患の程度（パネルＪ、生存曲線；パネルＫ、重量；およびパネルＬ、下痢）を示す棒グラフである。 図２４のパネルＭ−Ｑは、パネルＩで示されたスケジュールによる、最初のチャレンジおよび再チャレンジの後の、マウスの一次ＣＤＩ（パネルＭ、生存曲線；パネルＮ、重量減少）および再発性疾患（パネルＯ、生存曲線；パネルＰ、重量減少；およびパネルＱ、下痢）に関する１セットのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロット、折れ線グラフおよび棒グラフである。アッセイは、少なくとも３回行われ、同様の結果が得られた。エラーバーは、平均±ｓ．ｅ．ｍを示す。 図２５は、ｃＴｘＡＢまたは対照ＰＢＳにより免疫化されたマウスにおける感染の後の毒素排出（ｔｏｘｉｎ ｓｈｅｄｄｉｎｇ）を示す表である。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる１回目および２回目のチャレンジの後にｃＴｘＡＢまたはＰＢＳにより免疫化されたマウスから糞便のサンプルが集められ、毒素活性がＣＴ２６細胞を用いる標準細胞毒性アッセイによって測定された。一晩の培養後に細胞の１００％で球状化を引き起こした陽性のサンプル、抗毒素ポリ血清によって中和された活性。データは、陽性のマウスの百分率を示す。 図２６は、ａＴｃｄＢでｍｐ舌下腺（ＳＬ）免疫感作の子ブタ血清抗体反応を示す１セットの棒グラフである。子ブタは、一週おきに２５μｇのＴｃｄＢで４回免疫化され（子ブタ＃１および＃２）、またはアジュバントとしてｍＬＴを有する、または有さない（子ブタ＃３および＃４）により、４回免疫化されたＳＬであった。免疫感作の２週間後、血清サンプルが集められ、精製された天然のＴｃｄＢをコーティングされたプレートを用いるＥＬＩＳＡによって抗ＴｃｄＢ抗体反応が測定された。 図２７はポリ−ラクチド−コ−グリコシド（ＰＬＧ）ナノ粒子の調製を示す図である。ＤＮＡの水溶液は、ナノ粒子を形成するためにＣＨ２Ｃｌ２中でのポリマーの溶液に加えられ；粒子は油中水型エマルジョンに移され、せん断型ミキサーで混ぜ合わさられ；エマルジョンは、ＰＶＡ水溶液中へ注がれ、水中油中水型エマルジョン中の形成をもたらした。ＣＨ２Ｃｌ２を蒸発させた後、粒子は使用のために集められた。
強毒性の耐性菌の地球規模の出現、およびクロストリジウムディフィシレ感染（ＣＤＩ）の発生率の急増は、主要な公衆衛生の関心事を表わす（Ｋｅｌｌｙ，ＣＰ ｅｔ ａｌ．２００８ Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５９：１９３２；Ｒｕｐｎｉｋ，Ｍ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．２００９ Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ７：５２６）。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは、２つの同族のグリコシル化する外毒素ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢ（これは、両方とも病原性である）を分泌し（Ｌｙｒａｓ Ｄ ｅｔ ａｌ．２００９，Ｎａｔｕｒｅ ４５８：１１７６；Ｋｕｅｈｎｅ，ＳＡ ｅｔ ａｌ．２０１０ Ｎａｔｕｒｅ）、従って、疾患の発症を防ぐためには中和が必要である。本明細書における実施例は、非経口のワクチンを含むワクチンを提供し、それは両方の毒素に特異的で、マウスにおいて一次の、再発性ＣＤＩに対する充分な保護を提供する強力な中和抗体を誘発する。非病原性のＢａｃｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ発現系を用いて（Ｖａｒｙ ＰＳ ｅｔ ａｌ． ２００７ Ａｐｐｌｉｅｄ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７６：９５７；Ｙａｎｇ，Ｇ ｅｔ ａｌ．２００８ ＢＭＣ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ８：１９２）、グリコシルトランスフェラーゼ（ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｆｅｒａｓｅ）（ＧＴ）−欠損ホロトキシンが生成され、毒性が無いことが立証された。無毒のホロトキシンの天然の形態は、相応するトキソイドより著しく強力な抗毒素中和抗体を誘発した。ＴｃｄＡとＴｃｄＢの間にクロス免疫性（ｃｒｏｓｓ−ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）はほとんどなかった。両方の毒素に対する抗体を誘発するために、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ毒素様のキメラタンパク質は、ＴｃｄＢの受容体結合ドメインをＴｃｄＡの受容体結合ドメインで置換することにより設計され、ＧＴ欠損形態が作られ、ｃＴｘＡＢと名付けられた。この単一の抗原ｃＴｘＡＢでの非経口の免疫感作は、本明細書における実施例において、ＴｃｄＡとＴｃｄＢの両方に特異的な迅速で強力な中和抗体を誘発し、実験室および強毒性の株の両方のＣＤＩに対する完全な保護を与えたことが観察された。このワクチンが、一次と再発性の両方のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染に対して迅速な保護を与えたことを示したネズミＣＤＩ再発モデルが確立され、それにより、ＣＤＩを進行させる高いリスクのある個体に適切な見込みのある予防的なワクチンを提供した。
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（クロストリジウムディフィシレ）ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢは、主要な毒性因子の原因となる宿主Ｒｈｏファミリータンパク質を修飾する能力を有するグルコシルトランスフェラーゼ（ＧＴ）である。２つの毒素に特異的な血清抗体は、患者における保護に関係する（Ｋｙｎｅ，Ｌ ｅｔ ａｌ．２００１ Ｌａｎｃｅｔ ３５７：１８９；Ｂ．Ａ．Ｌｅａｖ，ＢＡ ｅｔ ａｌ．２００９ Ｖａｃｃｉｎｅ ２８：９６５）。ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢの各々に特異的なヒトモノクローナル抗体は、ＣＤＩの患者を再発から保護する（Ｌｏｗｙ Ｉ ｅｔ ａｌ．２０１０ Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６２：１９７）。それ故、その毒素に対する中和抗体を誘発するワクチンは、疾患を予防し、またはその重症度を低下させるのにおそらく有用である。
またＣＤＩの保持に寄与し得る他の毒性特質が存在すると知られているが、ＣＤＩに対する保護は、２つの毒素に対する全身性および粘膜の抗体によって媒介される（Ａｂｏｕｄｏｌａ，Ｓ． ｅｔ ａｌ．２００３ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７１：１６０８−１６１０）。ＴｃｄＡに対する中和モノクローナル抗体は、マウスの腸ループ中の体液分泌を阻害し、全身感染からマウスを保護する（Ｃｏｒｔｈｉｅｒ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．１９９１ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ５９：１１９２−１１９５）。抗ＴｃｄＡおよび抗ＴｃｄＢ抗体の両方の同時投与は、それほどストリンジェントでない再発モデルにおいてのみでなく、一次疾患ハムスターモデルにおいても、死亡率を著しく引き下げる（Ｂａｂｃｏｃｋ，Ｇ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．２００６ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７４：６３３９−６３４７）。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対する抗体は、２歳より大きな個体の一般人口の中に存在し、およびより高いレベルの血清または粘膜の抗体反応が、あまり重篤でない疾患およびそれほど頻繁でない再発に関連している（Ｂａｂｃｏｃｋ，Ｇ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．２００６ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７４：６３３９−６３４７；Ｋｅｌｌｙ，Ｃ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．１９９６ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ４０：３７３−３７９；Ｋｙｎｅ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．２０００ Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４２：３９０−３９７）。毒素に対するヒト化モノクローナル抗体は、ＣＤＡＤを患う患者の処置のための臨床試験の下にある。しかしながら、血清抗体が腸管毒性および粘膜の損傷を予防する機構は完全には理解されておらず、抗体は腸内での分解を受けやすく、それ故、有効性は損なわれる。研究は、全身に投与されたヒトモノクローナルＩｇＧ抗体が急性のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染からハムスターを保護することを示したが、これらの抗体が慢性病に対して防御することができるかどうかは知られていない。
トキソイドワクチンはホルムアルデヒド処理によって作られ、アジュバントとしてミョウバンを含む筋肉注入によって投与された（Ｋｏｔｌｏｆｆ，Ｋ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．２００１ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６９：９８８−９９５；Ｓｏｕｇｉｏｕｌｔｚｉｓ，Ｓ． ｅｔ ａｌ．２００５ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １２８：７６４−７７０）。トキソイドは、ホルムアルデヒド処置の結果、粘膜表面に結合することができないので（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｇ． Ｒ. ｅｔ ａｌ．１９８１ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ３４：３−１３）、化学的に無毒化されたトキソイドは、粘膜表面上の受容体を標的とする分子より乏しい粘膜反応を誘発する（Ｃｒｏｐｌｅｙ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．１９９５ Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１６４３−１６４８；Ｔｏｒｒｅｓ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．１９９５ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６３：４６１９−４６２７）。ＴｃｄＡとＴｃｄＢの両方を標的とし、ＣＤＩを予防するために強い全身性免疫と粘膜免疫を誘発するワクチンは、重症度を低下させ、進行中の慢性病を除去するために必要である。
ａＴｘＡＢまたはｃＴｘＡＢの免疫原は、トキソイドまたはそのフラグメントより優れていることが本明細書に示される。完全長タンパク質は、正確なフォールディングを有する天然の形態を模倣し、あらゆる範囲の（ａ ｆｕｌｌ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ）中和全身性抗体および粘膜抗体を発生させることが観察された。ＴｃｄＡのごく一部を含む化学的に無毒化されたトキソイドまたはフラグメントと異なり、本明細書に提供される点突然変異を有する無毒のホロトキシンは、天然の毒素が有するのと同じアジュバント活性、抗原性および粘膜上皮への親和性を維持し；従って、トキソイドより大きな防御免疫を誘発し、フラグメントより幅広い抗体を発生させる。ＴｃｄＡとＴｃｄＢの両方による致死のチャレンジに対する、マウスにおける強力な保護を誘発するために、キメラｃＴｘＡＢでの免疫感作は、本明細書の実施例において観察された。
（疾患の症状発現と治療上の手法）
ＣＤＩは増殖型の生物体または芽胞の経口摂取によって獲得され、最もありそうなのは、後者である（Ｄｕｂｂｅｒｋｅ，Ｅ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．２００７ Ａｍ Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｃｏｎｔｒｏｌ ３５：３１５−３１８；Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．２００８ ＢＭＣ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ８：７）。芽胞は、胃液酸度への接触を生き残り、腸において発芽する。抗生物質処置は、その疾患に対する最も重要な危険因子である（Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｊ．Ｇ．２００６ Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ １４５：７５８−７６４）。ＣＤＩの臨床所見は、非常に変わり易く、無症候性から軽症の自己制御式の下痢まで、より重篤な偽膜性大腸炎までの範囲である。最も一般的な症状は下痢である。他の一般の臨床症状は、腹痛および痙攣、高い体温および白血球増加症を含む。ＣＤＩの軽度の場合では、経口的水分補給および抗生物質の退薬はしばしば有効である。より多くの重篤なＣＤＩの場合は、メトロニダゾールまたはバンコマイシンの経口投与により処置される。
しかしながら、この処置は５５％もの再発率に関係し（Ｂａｒｂｕｔ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．２０００ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３８：２３８６−２３８８；Ｗａｌｔｅｒｓ，Ｂ．Ａ．ｅｔ ａｌ．１９８３ Ｇｕｔ ２４：２０６−２１２）、および再発性ＣＤＩに対する一次処置の選択肢は、メトロニダゾールまたはバンコマイシンのままである。プロバイオティクスと陰イオン交換樹脂などの他の選択肢は、有効性を限定しており、潜在的に有害である（Ｇｅｒｄｉｎｇ，Ｄ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．２００８ Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ４６ Ｓｕｐｐｌ １：Ｓ３２−４２）。臨床開発における実験の処置は、毒素吸収ポリマー、抗生物質および毒素特異的ヒトモノクローナル抗体を含んでいる（Ａｎｔｏｎ，Ｐ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．２００４ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ４８：３９７５−３９７９；Ｈｉｎｋｓｏｎ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．２００８ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ５２：２１９０−２１９５；ＭｃＶａｙ，Ｃ．Ｓ．ｅｔ ａｌ． ２０００ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ４４：２２５４−２２５８）。臨床試験におけるホルムアルデヒド不活性化トキソイドワクチンは、筋肉内に投与される（Ｋｏｔｌｏｆｆ，Ｋ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．２００１ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６９：９８８−９９５；Ｓｏｕｇｉｏｕｌｔｚｉｓ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．２００５ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １２８：７６４−７７０）。
（毒性因子）
ＣＤＩは、主として毒素媒介性疾患である。２つの広範囲に研究された外毒素、毒素Ａ（ＴｃｄＡ）および毒素Ｂ（ＴｃｄＢ）は、主要な毒性因子であると考えられ、両方の毒素遺伝子を欠くＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株は、ヒトおよび動物の両方にとって非病原性である（Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．２００７ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ Ｊ ３７：５６１−５６８；Ｋｅｌｌｙ，Ｃ．Ｐ．１９９６ Ｅｕｒ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ ８：１０４８−１０５３；Ｖｏｔｈ，Ｄ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．２００５ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ １８：２４７−２６３）。動物における結紮された腸ループの研究で測定されるように、精製されたＴｃｄＡは強力な腸毒性および炎症促進活性を有する（Ｋｕｒｔｚ，Ｃ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．２００１ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ４５：２３４０−２３４７）。ＴｃｄＡは、ナノグラムの量で培養細胞に対して細胞傷害性である。ＴｃｄＢは、純粋なタンパク質として投与された時動物に腸毒性の活性（ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を示さないことが報告されている（Ｌｙｅｒｌｙ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．１９８２ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３５：１１４７−１１５０；Ｌｙｅｒｌｙ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．１９８５ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ４７：３４９−３５２）。各毒素を欠損している同質遺伝子系統は、ＴｃｄＢがハムスターの重要な毒性因子であることを実証した（Ｌｙｒａｓ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．２００９ Ｎａｔｕｒｅ ４５８：１１７６−１１７９）。ＴｃｄＢの腸毒性および炎症誘発性の活性は、免疫不全の（ＳＣＩＤ）マウスにおけるヒト腸の異種移植片に関して観察された（Ｓａｖｉｄｇｅ，Ｔ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．２００３ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １２５：４１３−４２０）。ＴｃｄＡＢ＋Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株は、何人かの患者において偽膜性大腸炎に関係する（Ｓｈｉｎ，Ｂ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．２００７ Ｄｉａｇｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ． ５９：３３−３７）。少数のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ分離株は、ＡＤＰリボース転移酵素活性を示す、二元毒素（ＣＤＴ）を産生する（Ｂｌｏｓｓｏｍ，Ｄ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．２００７ Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ４５：２２２−２２７；Ｃａｒｔｅｒ，Ｇ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．２００７ Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８９：７２９０−７３０１；ＭｃＭａｓｔｅｒ−Ｂａｘｔｅｒ，Ｎ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．２００７ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ ２７：１０２９−１０３９）。ヒト疾患の進行におけるＣＤＴの役割はあまり理解されていない（Ｓｔａｒｅ，Ｂ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．２００７ Ｊ Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５６：３２９−３３５）。毒素に加えて、他のいくつかの要因は、疾患の症状発現に役割を果たすことがあり、これは、付着、カプセル生成および加水分解酵素分泌を促進するフィンブリアおよび他の分子を含む（Ｂｏｒｒｉｅｌｌｏ，Ｓ．Ｐ．１９９８ Ｊ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ４１ Ｓｕｐｐｌ Ｃ：１３−１９）。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの表層タンパク質は、細菌コロニー化に関係する。また、これらのタンパク質に特異的な抗体は部分的に保護的である（Ｃａｌａｂｉ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．２００２ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７０：５７７０−５７７８；Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｊ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．２００５ ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ ２４６：１９９−２０５）。
（ＴｃｄＡとＴｃｄＢのドメイン）
ＴｃｄＡ（３０８ｋＤ）およびＴｃｄＢ（２６９ｋＤ）は、大きなクロストリディウム細胞毒素（ＬＣＴ）ファミリーに属し、４９％のアミノ酸同一性を有する（Ｊｕｓｔ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．２００４ Ｒｅｖ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １５２：２３−４７）。遺伝子ｔｃｄＡおよびｔｃｄＢ並びに３つのアクセサリー遺伝子が細菌染色体上に位置付けられ、１９．６ｋｂの病原性遺伝子座（ＰａＬｏｃ） （１４２）を形成する。ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢは構造上互いに類似しており（ｖｏｎ Ｅｉｃｈｅｌ−Ｓｔｒｅｉｂｅｒ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．１９９６Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４：３７５−３８２）、少なくとも３つの機能ドメインから成る。Ｃ末端は受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含み、β−ソレノイド構造を有し、受容体結合に含まれる（Ｈｏ，Ｊ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．２００５ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０２：１８３７３−１８３７）。毒素の一次構造の中心部分は、潜在的に標的細胞への毒素の転座に関係し、Ｎ末端は、グルコシルトランスフェラーゼ活性を有する触媒ドメインである（Ｈｏｆｍａｎｎ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．１９９７ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２：１１０７４−１１０７８）。３つのドメインの境界は、文献（Ｇｉｅｓｅｍａｎｎ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．２００８ Ｊ Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５７：６９０−６９６）に規定されている。ＧＴドメインは、アミノ末端をコード化するＤＮＡに由来する組換えタンパク質の発現によって規定された（Ｈｏｆｍａｎｎ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．１９９７ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２：１１０７４−１１０７８）。さらに、ＧＴドメインは、細胞質ゾルの送達の後に再生され（ｒｅｃｏｖｅｒ）、Ｎ末端アミノ酸が決定された（Ｐｆｅｉｆｅｒ，Ｇ．ｅｔ ａｌ． ２００３ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：４４５３５−４４５４１）。ＴｃｄＡのＲＢＤの結晶構造は、ソレノイドのような構造を明らかにした。両方の毒素中のＲＢＤの境界は、アミノ酸１８５０の近くである。Ｃ末端と宿主細胞受容体との間の相互作用は、受容体依存性エンドサイトーシスを開始すると考えられる（Ｆｌｏｒｉｎ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．１９８３ Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ７６３：３８３−３９２；Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｋ．Ａ．１９９５ Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ ５：６２２−６３５；Ｔｕｃｋｅｒ，Ｋ．Ｄ．ｅｔ ａｌ． １９９１ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ５９：７３−７８）。
細胞内の作用様式は不明瞭なままであるが、毒素がエンドソームのコンパートメントの低いｐＨで構造変化を受け、膜挿入およびチャンネル形成に繋がることが提案されてきた（Ｇｉｅｓｅｍａｎｎ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．２００６ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８１：１０８０８−１０８１５；Ｑａ’Ｄａｎ，Ｍ ｅｔ ａｌ．２０００ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６８：２４７０−２４７４）。宿主補助因子は、自触媒作用の開裂（ｃｌｅａｖａｇｅ）および細胞質ゾルへの触媒ドメインの放出を伴う第２の構造変化を引き起こす（Ｐｆｅｉｆｅｒ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．２００３ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：４４５３５−４４５４１；Ｒｅｉｎｅｋｅ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．２００７ Ｎａｔｕｒｅ ４４６：４１５−４１９）。細胞質ゾルにおいて、毒素モノ−Ｏの触媒ドメインは、Ｒｈｏ、ＲａｃおよびＣＤＣ４２を含むＲｈｏファミリーの低分子量ＧＴＰａｓｅをグリコシル化する（Ｊｕｓｔ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．１９９５ Ｎａｔｕｒｅ ３７５：５００−５０３）。Ｒｈｏタンパク質のグリコシル化は、分子スイッチ機能を阻害し、腸の上皮細胞中のＲｈｏのＧＴＰアーゼ依存性シグナル伝達を遮断し、アクチン細胞骨格の変質、大量の液体分泌、急性炎症および結腸の粘膜の壊死につながる（Ｊｕｓｔ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．１９９５ Ｎａｔｕｒｅ ３７５：５００−５０３；Ｐｏｔｈｏｕｌａｋｉｓ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．２００１ Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２８０：Ｇ１７８−１８３）。
（疫学と診断）
健康な成体におけるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの発生率は、３−５％であり、健康な新生児および幼児においては６０％と高い（Ｌａｒｓｏｎ，Ｈ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．１９８２ Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １４６：７２７−７３３；Ｖｉｓｃｉｄｉ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．１９８１ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８１：５−９）。新生児における高い保菌率にもかかわらず、症候性疾患はめったにない（ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｌ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．２０００ Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｎｕｔｒ ３１：２２０−２３１）。抗生物質使用と入院を伴う成体において、コロニー形成の割合は、事実上２０−４０％まで増加する（Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｊ．Ｇ．２００６ Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ １４５：７５８−７６４）。感染のための標準試験は、便中のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素の検出である。アッセイは、糞便サンプル中のＴｃｄＡ及び／又はＴｃｄＢを検出するための、細胞培養ベースの細胞毒性アッセイ（Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｊ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．１９７８ Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２９８：５３１−５３４）および酵素免疫定量法（ＥＩＡ；Ｒｕｓｓｍａｎｎ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．２００７ Ｅｕｒ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ２６：１１５−１１９；Ｓｔａｎｅｃｋ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．１９９６ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３４：２７１８−２７２１）を含む。代替的な検出方法は、細菌の嫌気培養および細菌抗原グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）の検出を含む。
（医薬組成物）
本発明の１つの態様は、医薬組成物を提供し、これらの組成物は、Ｃ．ｄｉｆｉｃｉｌｅの毒素に由来する抗原を含み、およびさらにアジュバントを随意に含み、さらに薬学的に許容可能な担体を随意に含む。
特定の実施形態において、これらの組成物は、随意に、１以上のさらなる治療薬をさらに含む。特定の実施形態において、さらなる治療薬または薬剤は、抗生物質、特に抗菌性化合物、抗ウイルス化合物、抗真菌剤、から成る群から選択され、成長因子、抗炎症剤、昇圧薬、コラゲナーゼ阻害剤、局所用ステロイド、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤、アスコルビン酸塩、アンジオテンシンＩＩ、アンジオテンシンＩＩＩ、カルレチクリン、テトラサイクリン、フィブロネクチン、コラーゲン、トロンボスポンジン、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、インシュリン様増殖因子（ＩＧＦ）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）およびヒアルロン酸の１以上を含む。
本明細書で使用されるように、用語「薬学的に許容可能な担体」は、所望の特定の剤形に適するように、任意または全ての溶媒、賦形剤または他の液状ビヒクル、分散または懸濁の補助剤（ａｉｄ）、表面活性剤、等張剤、増粘剤 または乳化剤、防腐剤、固体の結合剤、滑沢剤などを含む。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｅｄ．ｂｙ Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９５は、医薬組成物を調剤する際に用いられる様々な担体およびその調製のための既知の技術を開示する。例えば、ＩＰ（腹腔内）、ＩＶ（静脈内）、皮下、粘膜、舌下腺、吸入、鼻腔内の投与の他の形態を含む任意の投与経路、または投与の他の経路の後の滞在時間を延長するために、担体は選択される。
薬学的に許容可能な担体として役立つことができる物質のいくつかの例は、限定されないが、グルコースなどの糖およびショ糖；トウモロコシデンプンとジャガイモデンプンなどのデンプン；セルロースおよびカルボキシルメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのその誘導体；トラガント粉末；麦芽；ゼラチン；滑石；ココアバターおよび坐薬のワックスなどの賦形剤；落花生油、綿実油、サフラワー油、胡麻油、オリーブオイル、トウモロコシ油および大豆油などの油；プロピレングリコールなどのグリコール；オレイン酸エチルおよびエチルラウリン酸などのエステル；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；発熱物質を含まない水；等張の食塩水；リンガー溶液；エチルアルコール、およびリン酸緩衝液と同様、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなどの他の無毒な適合性の滑沢剤、着色剤、解除剤、コーティング剤、甘味料、香味剤および芳香剤、防腐剤および抗酸化剤を含み、これらはまた、調合する人の判断によって組成物中に存在し得る。
さらなる別の態様において、本発明の治療法によると、本明細書に記載されるように、免疫感作は被験体を医薬組成物と接触させることによって促進される。従って、本発明は、ＴｃｄＡとＴｃｄＢの少なくとも１つに関係する抗原決定基があるＣ．ｄｉｆｉｃｉｌｅの免疫原の毒素タンパク質を含む活性剤を含む治療上有効な量の医薬組成物を、所望の結果を達成するのに必要であるような量で、およびそのような時間の間、それを必要とする被験体に投与する工程を含む免疫感作のための方法を提供する。これは、（特に栄養的にチャレンジされる人々のような易感染性の患者において、または高齢者または幼児のようなリスク患者で）Ｃ．ｄｉｆｉｃｉｌｅによる感染に対する免疫を促進するために、免疫の緩速現像に関係する合併症を最小限にするために、予防的または治療上の対策として、本明細書に記載のような創造性のあるワクチンを投与する工程を含むことが理解される。
本発明の特定の実施形態において、医薬組成物の「治療上有効な量」は、Ｃ．ｄｉｆｉｃｉｌｅの毒素に特異的な血清中の抗体の出現、または糞便中の、体液、または他の分泌された生成物中の抗原若しくは毒素の量または細菌細胞などの疾患症状の消失を促進するのに有効な量である。組成物は、本発明の方法によると、抗体反応を生じさせるのに有効な任意の量および任意の投与経路を使用して投与され得る。従って、本明細書に使用されるように、表現「免疫を促進するのに有効な量」は、抗体産生またはＣ．ｄｉｆｉｃｉｌｅによる感染に特徴的な疾患症状改善を結果として生じるのに十分な量の組成物を指す。
正確な投薬は、処置される患者を考慮して個々の医師によって選択される。用法および用量、十分なレベルの活性剤を提供し、または所望の効果を維持するように調節される。考慮に入れられてもよいさらなる要因は、疾患状態の重症度（例えば、過去か可能性のある将来における伝染因子への接触）；患者の年齢、体重および性別；食事、投与の時間および頻度；複合薬；反応感受性；および治療に対する耐性／反応を含む。長時間作用型の医薬組成物は、特定の組成物の半減期およびクリアランス率に依存して、３〜４日ごと、毎週、または２週ごとに投与され得る。
本発明の活性剤は、好ましくは、投与のし易さおよび投薬の均一性のために投薬ユニット形態で調剤される。本明細書に使用されるように、表現「投薬ユニット形態」は、処置される患者に投与されるべき１回分に適切な活性剤の物理的に別々の単位を指す。しかしながら、本発明の組成物の合計の毎日の使用は、安全な医学上の判断の範囲内で主治医によって決定されることが理解される。任意の活性剤については、治療上有効な投与量は、細胞培養アッセイにおいて、または動物モデル（通常、マウス、ウサギ、イヌまたはブタまたは、子ブタ、あるいは他の適切な動物）においてのいずれかで最初に推測することができる。Ｃ．ｄｉｆｉｃｉｌｅによる慢性または再発する感染の動物モデルを含む本明細書に記載の動物モデルはまた、望ましい濃度範囲および投与経路を達成するために使用される。その後、そのような情報はヒトにおける投与のための有用な投与量および経路を決定するために使用することができる。
治療上有効な量は、少なくとも１つの徴候または症状を改善する活性剤の量を指す。活性剤の治療上の有効性および毒性、例えばＥＤ５０（その用量は、個体群の５０％に治療上有効である）、およびＬＤ５０（その用量は個体群の５０％が死に至る）は、細胞培養または実験動物において標準の製薬の手順によって測定され得る。毒性の治療効果に対する用量比は、治療指数であり、比率ＬＤ５０／ＥＤ５０として表され得る。大規模な治療指数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイから及び動物研究から得られたデータは、ヒトの使用のために様々な範囲の投与量を調剤するのに使用され得る。
投与量は、免疫の技術分野における当業者に公知のように、被験体の年齢、健康状態、以前の感染の病歴、および免疫状態に多かれ少なかれ依存し得るが、本明細書の実施例において示された治療量は、被験体の体重１ｋｇ当たり精製された毒素ワクチン、少なくとも１ｋｇ当たり１μｇ、少なくとも１ｋｇ当たり約５、１０、５０、１００、５００μｇ、少なくとも約１ｍｇ／ｋｇ、５、１０、５０または１００ｍｇ／ｋｇ体重である。用量は、１日当たり分割されることもあり、または単一のこともあり、および一回投与されることもあり、または適切な間隔で繰り返されることもある。
（医薬組成物の投与）
所望の投薬内に適切な薬学的に許容可能な担体と共に製剤した後、本発明の医薬組成物は、予防または治療の目的および既存の感染の重症度および性質に依存して、ヒトおよび他の哺乳動物に、（粉末剤、軟膏、またはドロップなどによって）局所的に、経口で、直腸に、粘膜に、舌下に、非経口的に、大槽内に、膣内に、腹腔内に、口腔内に、舌下に、眼内にまたは鼻腔内に投与され得る。
本明細書における本発明の様々な実施形態において、改変された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）無毒の毒素タンパク質の投与の後に、Ｃ．ｄｉｆｉｃｉｌｅ毒素の致死量に対する保護に十分な高い力価の抗体が産生されたことが観察された。経口投与のための液体の剤形は、限定されないが、薬学的に許容可能なエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ剤およびエリキシル剤を含む。活性剤に加えて、液体の剤形は、例えば、水または他の溶媒、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿の実、落花生類、トウモロコシ、胚、オリーブ、カスターおよび胡麻油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステルなどの可溶化剤および乳化剤などの当該技術分野で一般的に使用される不活性の賦形剤、およびそれらの組み合わせを含み得る。不活性の賦形剤に加えて、経口組成物はまた、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味料、調味料および芳香剤などのアジュバントを含み得る。
創造性のある医薬組成物の局所または経皮投与のための剤形は、軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、粉末剤、溶液、スプレー、吸入剤または貼付剤を含む。活性剤は、薬学的に許容可能な担体、および必要とされる場合、任意の必要な防腐剤または緩衝液と共に無菌条件下で混合される。投与は、治療上であることもあり、または予防的であることもある。
注射可能な製剤、例えば、無菌の注射可能な水溶性または油性の懸濁液は、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を使用して、既知の技術に従って調剤されてもよい。無菌の注射可能な製剤はまた、無毒な非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒中の無菌の注射可能な溶液、懸濁液またはエマルジョン、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液として、であり得る。使用し得る許容可能なビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンガー溶液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．および等張食塩水がある。さらに、無菌の不揮発性油は、溶媒または懸濁溶媒として従来使用される。この目的のために、合成のモノグリセリド、またはジグリセリドを含む任意の穏やかな不揮発性油が使用され得る。さらに、オレイン酸などの脂肪酸は注射剤の調製において使用される。注射可能な製剤は、例えば、細菌保持フィルターによるろ過によって、または使用前に滅菌水または他の無菌注射剤培地に溶かされるか分散することができる無菌の固体の組成物の形態中に滅菌剤を組み入れることによって、芽胞の付加前に消毒することができる。活性剤の効果を延長するために、皮下または筋肉注射から薬剤の吸収を遅くすることはしばしば望ましい。非経口的に投与された活性剤の遅らせた吸収は、油型ビヒクル中に薬剤を溶解するまたは懸濁することにより達成され得る。注射可能なデポー剤の形態は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性高分子中に薬剤のマイクロカプセルマトリックスを形成することにより作られる。活性剤のポリマーに対する比率および使用された特定のポリマーの性質によって、活性剤の放出速度を制御することができる。他の生分解性高分子の例は、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）を含む。デポー剤の注射可能な製剤も、体内組織と適合性のあるリポソームまたはマイクロエマルジョン中の薬剤を封入することによって調製される。
直腸または膣の投与のための組成物は、好ましくは、周囲温度では固体であるが、体温では液体であり、それ故、直腸または鞘状腔で溶けて、活性剤を放出するココアバター、ポリエチレングリコールまたは坐薬ワックスなどの適切な非刺激性の賦形剤または担体と、本発明の活性剤を混合することにより調製することができる坐剤である。
経口、粘膜または舌下の投与のための固体の剤形は、カプセル剤、錠剤、丸剤、粉末剤および果粒剤を含む。そのような固体の剤形において、活性剤は、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウムなどの少なくとも１つの不活性な薬学的に許容可能な賦形剤または担体、及び／又はａ）デンプン、ショ糖、グルコース、マンニトールおよびケイ酸などの充填材または希釈剤、ｂ）例えばカルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン、ショ糖およびアラビアゴムなどの結合剤、ｃ）グリセロールなど湿潤剤、ｄ）寒天などの崩壊剤、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸塩、また炭酸ナトリウム、ｅ）パラフィンなどの溶液遅延剤（ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｒｅｔａｒｄｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、ｆ）第四アンモニウム化合物などの吸収促進剤、ｇ）例えば、セチルアルコールおよびグリセロールモノステアレートなどの湿潤剤、ｈ）カオリンおよびベントナイト粘土などの吸収剤、およびｉ）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体のポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムなどの滑沢剤、およびそれらの混合物と混合される。
同様のタイプの固体の組成物も、高分子量ポリエチレングリコールなどと同様に、乳糖のような賦形剤を使用して、柔い、または固い充填ゼラチンカプセル中の充填材として使用され得る。錠剤、ドラゼー、カプセル剤、丸剤および果粒剤の固体の剤形は、腸溶コーティング、放出制御コーティング、および製薬調剤技術において周知の他のコーティングなどのコーティングおよびシェルにより調製することができる。そのような固体の剤形において、活性剤は、ショ糖またはデンプンなどの少なくとも１つの不活性の希釈剤と混合され得る。通常の方式であるように、そのような剤形は、不活性の賦形剤以外のさらなる物質、例えば、タブレットにする滑沢剤およびステアリン酸マグネシウムおよび微結晶性セルロースなどの他のタブレットにする補助剤を含み得る。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合には、剤形はまた緩衝剤を含み得る。それらは、随意に乳白剤を含み、それらが活性剤のみを、または優先的に、あるいは胃管の一定の部分で、随意に遅延した様式で、放出する組成物であり得る。使用することができる組成物を組み込む例は、高分子物質とワックスを含む。
（免疫感作の経路の確認）
全身性抗体および粘膜抗体、並びに保護反応を誘発するために適切な経路は、経口の免疫感作レジメン、鼻腔内の（ＩＮ）免疫感作レジメン、または舌下腺（ＳＬ）免疫感作レジメンの比較により、粘膜の保護のみでなく、ＩＰ免疫感作と類似する、またはＩＰ免疫感作より優れた全身性の保護レベルを確立することをめざして確認される。
ル、ラウリル硫酸ナトリウムなどの滑沢剤、およびそれらの混合物と混合される。
ａＴｘＡＢとｃＴｘＡＢの両方は、天然の毒素のインタクトな（ｉｎｔａｃｔ）受容体結合ドメインを含み、野生型毒素が有するように、おそらく、上皮細胞への同様の親和性を有するだろう。従って、粘膜免疫は、これらの免疫原への粘膜表面（経口、ＩＮ、またはＳＬ）の接触によって誘発される。粘膜の免疫感作のいくつかの経路は比較され、全身性および粘膜の抗体反応の誘発が評価される。粘膜のアジュバントの使用法も評価される。
本明細書中の実施例に記載のように確立された至適用量から始めて、マウスの群は、３回、ａＴｘＡＢまたはｃＴｘＡＢで、（粘膜のアジュバントとともに、またはなしで）ＩＮまたはＳＬで、または経口で（カプセル化されて）免疫化される。血清と糞便の抗体反応は各免疫感作の後に測定される。最後の免疫感作の１週間後に、マウスは、確立された相当するＬＤ５０ｉ毒素でＩＰチャレンジされ、毒素および全身性のチャレンジに対する保護反応は、ＩＰで免疫化された群およびプラセボ群と比較される。糞便および腸内容物中の毒素に対する血清と分泌型のＩｇＡおよびＩｇＧの全身性抗体が測定され、細胞培養物中の細胞毒性を遮断するための中和力価が測定される。粘膜保護は、毒素を直接注入された、免疫化されたマウスの結紮された回腸ループで評価される。抗体のレベルおよび保護反応が、非経口の免疫感作によって達成されたもの未満であるとき、及び／又は、粘膜抗体および保護反応が低いと考えられるとき、代替の粘膜アジュバントと組み合わせた免疫原の投与量最適化が続く。これらのアッセイは、粘膜の免疫感作がＩＰ免疫感作として抗体および保護反応に関して効率的か否か、および保護粘膜免疫が粘膜の免疫感作によって誘発されるか否かを確証する。
（アジュバントとしてのミョウバン）
アジュバントとしてミョウバンを用いるａＴｃｄＢまたはｃＴｘＡＢでの腹腔内の（ＩＰ）免疫感作は、強力なＩｇＧ反応および全身性の保護を誘発することが示された。重要なことには、ミョウバンはヒトワクチン接種のためにＦＤＡに認可されたアジュバントであることであろう。それ故、非経口の免疫感作は、プラセボを含むアジュバントとしてミョウバンを含んだ。
（粘膜アジュバント）
コレラ菌由来の細菌腸毒素コレラ毒素（ＣＴ）およびＥ．ｃｏｌｉ由来の易熱性毒素（ＬＴ）は、おそらく、最も一般に使用される粘膜のアジュバントであり、経口または鼻の経路によって同時投与された無関係な抗原に対する免疫反応を促進する（Ｒａｐｐｕｏｌｉ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．１９９９ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ ２０：４９３−５００）。しかしながら、これらの腸溶性毒素の野生型は有毒であり、それ故、ＣＴとＬＴの毒性を、それらのアジュバント活性を保持しつつ減少させるために、広範囲な研究がなされている（Ｐｉｚｚａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．２００１ Ｖａｃｃｉｎｅ １９：２５３４−２５４１）。１例は、タンパク質の分解を抑制し、タンパク質の毒性を弱めるアミノ酸１９２でＡサブユニットのタンパク質分解部位に変異を有する変異型ＬＴ（ｍＬＴ）である（Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｂ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．１９９５ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６３：１６１７−１６２３）。これらのアジュバントは粘膜免疫反応を促進するために重要であるが、ａＴｘＡＢおよびｃＴｘＡＢの両方は、ＴｃｄＡのインタクトなＴＢＤを含み、これは、鼻腔内の投与後にＣＴまたはＬＴくらい強力なアジュバント活性を有する（Ｃａｖａｌｃａｎｔｅ，Ｉ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．２００６ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７４：２６０６−２６１２）。さらに、両方の毒素は、上皮細胞に高い親和性を有し、従って、これらの免疫原の至適用量は、外来のアジュバントなしで、強力な中和ＩｇＧおよびＩｇＡ反応を誘発するのに十分であり得る。
比較は、アジュバントを欠く、または変異型ＬＴ（ｍＬＴ）または変異型ＣｐＧを含む免疫原により免疫化された動物の群の間でなされた。ｍＬＴは、動物研究において、およびヒトの研究において使用されている（Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｂ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．１９９５ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６３：１６１７−１６２３；Ｕｄｄｏｗｌａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．２００７ Ｖａｃｃｉｎｅ ２５：７９８４−７９９３）。ｍＬＴは、Ａ１をＡ２から分離するＡサブユニットのジスルフィド境界領域（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅｓ ｓｕｂｔｅｎｄｅｄ ｒｅｇｉｏｎ）内に一つのアミノ酸置換を引き起こすために、部位特異的変異誘発を使用して構築された（Ｄｕｂｂｅｒｋｅ，Ｅ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．２００７ Ａｍ Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｃｏｎｔｒｏｌ ３５：３１５−３１８）。この一つのアミノ酸の変化は、この領域内にタンパク質分解性に感受性のある部位を変更し、トリプシン活性化に対して非感受性な変異をもたらす。５μｇまたは１０μｇのｍＬＴと混合された各免疫原の免疫感作の結果が比較され、結果が本明細書中の実施例に提示される。
本明細書に使用されるＣｐＧｓ（Ｋｉｎｄｒａｃｈｕｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．２００９ Ｖａｃｃｉｎｅ ２７：４６６２−４６７１）の免疫修飾物質の性質は、多くの見込みのある医療用途に役立つ性質を含み：様々な悪性腫瘍の処置のための抗アレルゲンとして、および、特に、免疫反応が不十分な個体においてワクチン接種の有効性を促進するためのアジュバントとして、生来の免疫反応を準備する。アジュバント製剤中のＣｐＧｓの使用は、Ｔｈ１−バイアスへのワクチン誘発性免疫反応を歪めることが以前に立証されたが実際は、これらの分子は、ヒト、ネズミおよびブタの新生仔の免疫反応を増強することが立証されている（Ｇａｒｌａｐａｔｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．２００９ Ｖｅｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ １２８：１８４−１９１）。Ｔｈ１とＴｈ２の寄与の調節は、保護と免疫病理の間のバランスに影響を及ぼすので、ワクチンアジュバントの文脈では、バランスのとれたＴｈ１／Ｔｈ２反応が望ましい（Ｓｉｎｇｈ，Ｖ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．１９９９ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ ２０：１４７−１６１）。
（鼻腔内の（ＩＮ）免疫感作）
免疫感作の粘膜の鼻の経路は、マウスにおける、およびヒトの腸における全身性及び／又は粘膜の抗体反応を結果として生じる免疫反応を誘発する（Ｋｏｚｌｏｗｓｋｉ，Ｐ．Ａ．ｅｔ ａｌ．２００２ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６９：５６６−５７４；Ｒｕｄｉｎ，Ａ． ｅｔ ａｌ． １９９９ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６７：２８８４−２８９０）。鼻の経路は、消化管におけるタンパク質の消化および分解を回避し、経口経路よりはるかにより少ない抗原が送達されることを可能にする（Ｋｏｚｌｏｗｓｋｉ，Ｐ．Ａ．ｅｔ ａｌ．２００２ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６９：５６６−５７４）。それ故、免疫感作の鼻の経路は、大きな可能性を有することが本明細書中で考慮される（Ｎｅｕｔｒａ，Ｍ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．２００６ Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６：１４８−１５８）。
免疫感作の鼻腔内の経路に関して、アジュバントと共に、またはアジュバントなしで、ａＴｘＡＢまたはｃＴｘＡＢを含むＰＢＳ５μｌが、各々の鼻孔へ送達される（１匹のマウス当たり合計１０μｌ）。１つの鼻孔当たり５μｌの量は、免疫原がすべて鼻腔の内部に分散されることを確実にする。３０μｌなどのより高い容量は、鼻／肺の免疫感作に繋がり得る（Ｓｏｕｔｈａｍ，Ｄ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．２００２ Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２８２：Ｌ８３３−８３９）。鼻の上皮への免疫原の結合が評価される。アジュバントとしてＬＴを使用することは、鼻道の抗原輸送（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）を変える。抗原のこのアジュバント依存性転送（ｒｅｄｉｒｅｃｔｉｏｎ）がＡＤＰリボース転移酵素活性に依存するので、これはｍＬＴではなく野生型ＬＴの場合である（ｖａｎ Ｇｉｎｋｅｌ，Ｆ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．２００５ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７３：６８９２−６９０２）。
（舌下の（ＳＬ）免疫感作）
ＳＬ経路は、血流低分子量薬物を送達するために（Ｚｈａｎｇ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．２００２ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ ４１：６６１−６８０）に、およびアレルゲンに対する免疫療法のために（Ｏ’Ｈｅｈｉｒ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．２００７ Ｃｕｒｒ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ １４：２２３５−２２４４）、長年使用されている。ワクチン接種のこの経路は、送達がし易い可能性、および広範囲の全身性および粘膜の免疫反応を誘発する可能性がある（Ｃｕｂｕｒｕ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．２００７ Ｖａｃｃｉｎｅ ２５：８５９８−８６１０）。ＳＬ免疫感作は、腸溶性の病原体による感染に対する腸の粘膜免疫を誘発する（Ｈｕａｎｇ，Ｃ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．２００８ Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｎｕｔｒ ４６：２６２−２７１）。アジュバントとして変異型ＬＴを用いる、ａＴｃｄＢで免疫化されたノトバイオートの子ブタは、本明細書中の実施例において示されるように、ａＴｃｄＢ単独より高い、循環中の抗ＴｃｄＢ ＩｇＧのレベルを誘発した。これらのすべての理由のために、免疫感作のＳＬ経路は評価のために包含された。
舌下の粘膜は、舌の腹側の側面および口底を含む。ＳＬ免疫感作のために、マウスにケタミン／キシラジンで麻酔をかけ、アジュバントと共に、またはアジュバントなしで、ａＴｘＡＢまたはｃＴｘＡＢ５μｌが、舌の腹側に送達され、口底の方へ向けられる。動物は、３０分間、頭を前屈に置いて（ｗｉｔｈ ｈｅａｄｓ ｐｌａｃｅｄ ｉｎ ａｎｔｅｆｌｅｘｉｏｎ）維持する。
（経口免疫）
腸粘膜を直接刺激することは、腸管感染症に対する効果的な保護を誘発する。粒子状物質、タンパク質またはＤＮＡの不活性化されたまたはサブユニットのワクチンを送達する試みが、雑多な結果を伴って多くの群によって試みられた。経口のワクチン接種は、感染から腸を保護するための安全で、かつ有効な方法である。それはまた、タンパク質分解消化酵素または加水分解消化酵素、胆汁酸塩および極端なｐＨと同様に、内容物の急速な移動のために、当てにならない経路であり、粘膜の壁に対するアクセスをしばしば制限する。
ＰＬＧポリマーは、カプセル化に使用されるポリマーが非免疫原であり、安全性の既知の記録があるので、本明細書中の実施例で使用するために選択された。これは、ドラッグデリバリーにおける、および外科縫合材料におけるような他の目的のためのそれらの使用で示されている。ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）は、２つの自然発生の物質、乳酸およびグリコール酸、にインビボで加水分解される。
（医薬組成物の使用）
上論され、および実施例においてより詳細に記載されるように、Ｃ．ｄｉｆｉｃｉｌｅの毒素に対する抗体産生を誘発する際に、および疾患症状、感染および死を防止するために有効な改変された毒素タンパク質が本明細書中に提供される。一般に、これらのワクチンは、ＣＤＩに対する抵抗性のために、被験体を免疫化する際に臨床的に役立つと信じられている。本明細書中のワクチンは、易感染性の患者、特に、例えば、ステロイド、放射線治療、非ステロイド抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、抗腫瘍性の薬物および抗代謝物質での全身療法に関係する免疫抑制および合併症を含む治療を予期する患者を処置するのに有用である。腸内菌叢を除去する、または減少させることが知られている抗生物質治療の多量の日常の投与量を受け取る患者（例えば外科患者、事故または争いの場の傷から生じるようなトラウマを経験する患者）は、競合する正常細菌叢が存在せずＣ．ｄｉｆｉｃｉｌｅが増殖するので、ＣＤＩの発生を予防するために免疫化され得る個体群である。ＣＤＩの予防のために、特に地震および洪水などの大災害の後に、学齢の子供達または軍隊のメンバーなどの全人口を免疫化するために、本明細書中のワクチンが予防的に使用され得ることがまた、想定される。
（ＣＤＩからの保護における全身性および粘膜の抗体）
全身性免疫と粘膜免疫の両方は、毒素などの腸溶性の病原体および病原性の生成物に対する保護を提供する（Ｈｕａｎｇ，Ｃ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．２００８ Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｎｕｔｒ ４６：２６２−２７１；Ｐｅｒｅｚ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．２００９ Ｖａｃｃｉｎｅ ２７：２０５−２１２）。ＴｃｄＡとＴｃｄＢがＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの重要な病原性因子であるので、抗毒素調製物は動物において経口のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅチャレンジからの十分な保護を伝えることができる（Ｋｉｎｋ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．１９９８ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６６：２０１８−２０２５；Ｌｙｅｒｌｙ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．１９９１ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ５９：２２１５−２２１８）。ＴｃｄＡまたはＴｃｄＢ単独に対する抗体ではなく、両方の毒素に対する抗体は、ハムスターモデルにおける毒素産生性のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染を予防する（Ｆｅｒｎｉｅ，Ｄ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．１９８３ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ｓｔａｎｄ ５３：３２５−３３２；Ｋｉｍ，Ｐ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．１９８７ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ５５：２９８４−２９９２；Ｌｉｂｂｙ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．１９８２ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ３６：８２２−８２９）。致死の疾患および下痢の両方を予防することを評価するハムスターにおけるトキソイドワクチンの送達の経路の評価によって、粘膜と親の免疫感作の組み合わせは、下痢と死亡からの完全な保護を提供したことが分かり、このことは、全身性免疫と粘膜免疫の両方の誘発が最適な保護には必要であることを示した（Ｔｏｒｒｅｓ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．１９９５ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６３：４６１９−４６２７）。全身的に投与されたヒトモノクローナルＩｇＧ抗体は、急性ＣＤＩおよび死からハムスターを保護した（Ｂａｂｃｏｃｋ，Ｇ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．２００６ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７４：６３３９−６３４７）。これらの抗体が成人病を防ぐか否かは知られていない。これらは全身的に投与され、受動的に獲得される抗体であるので、保護の期間は制限されており、費用がかかる。
ヒトにおいて、高レベルの血清中の抗毒素抗体は、より重篤でない疾患およびそれほど頻繁でない再発に関係する（Ｋｙｎｅ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．２０００ Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４２：３９０−３９７）。徴候的な感染の後に、ほとんどの個体は、血清中の２つの毒素に対する抗体を生じさせ（Ａｒｏｎｓｓｏｎ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．１９８５ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ １３：９７−１０１；Ｖｉｓｃｉｄｉ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．１９８３ Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １４８：９３−１００）、これは、血清および便中の毒素中和ＩｇＡを含む（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．１９９５ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６３：３１６６−３１７３）。全身性と粘膜の抗体反応は、後の感染からの保護に関係すると考えられる。疾患進行と再発は、循環における抗体の異なるサブセットに関係すると考えられ（Ｋａｔｃｈａｒ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．２００７ Ｃｌｉｎ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ ５：７０７−７１３）、およびこの観察の背後にある正確な理由は不明である。ＴｃｄＡに特異的な抗体は、Ｈｅ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．２００９ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎｅ ７７：２２９４−２３０３（これは、その全体が、参照として本明細書に組み込まれる）に示されるように、本質的にＦｃガンマレセプターＩ−媒介性エンドサイトーシスを介してマクロファージまたは単球上でＴｃｄＡの細胞毒性活性を増強した。
（ワクチン開発）
高い毒素産生菌株によってコロニー形成された動物を保護するために、両方の毒素に特異的な抗体が必要とされる（Ｂａｂｃｏｃｋ， Ｇ． Ｊ． ｅｔ ａｌ． ２００６ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７４：６３３９−６３４７）。修飾されないＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素の毒性は、ワクチンとして直接の使用を妨げ；それ故、ホルムアルデヒド架橋によって発生したトキソイド、又は触媒ドメインを欠く毒素フラグメントは、候補ワクチンとして利用されてきた（Ｇｈｏｓｅ， Ｃ． ｅｔ ａｌ． ２００７ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７５：２８２６−２８３２； Ｔｏｒｒｅｓ， Ｊ． Ｆ． ｅｔ ａｌ． １９９５ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６３：４６１９−４６２７； Ｗａｒｄ， Ｓ． Ｊ． ｅｔ ａｌ． １９９９ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６７：５１２４−５１３２）。
親のトキソイド免疫感作は、急性ハムスター疾患モデルにおけるＣＤＩに対する部分的な保護のみを提供し、ヒトのボランティアにおいて血清ＩｇＧ反応を誘発する（Ｋｏｔｌｏｆｆ， Ｋ． Ｌ． ｅｔ ａｌ． ２００１ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６９：９８８−９９５； Ｔｏｒｒｅｓ， Ｊ． Ｆ． ｅｔ ａｌ． １９９５ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６３：４６１９−４６２７）。しかしながら、ワクチン接種のこのレジメンが、慢性病に有効であり、粘膜保護を提供するかどうかは不明瞭である。腸内感染の性質により、 Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素に対する全身性及び粘膜の抗体反応を発生させることができるワクチン接種の粘膜経路が望ましい。従って、免疫感作の粘膜経路は、粘膜アジュバントのコレラ毒素（ＣＴ）を有するトキソイドを使用して検査されてきた。鼻腔内及び腹腔内の免疫感作の組み合わせは、 Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの経口チャレンジの後にハムスターにおいて致死的な疾患及び下痢の両方からの十分な保護を提供した（Ｔｏｒｒｅｓ， Ｊ． Ｆ． ｅｔ ａｌ． １９９５ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６３：４６１９−４６２７）。トキソイド免疫感作の経皮経路は、アジュバントとしてＣＴとともに粘膜のＩｇＡ反応を引き起こした（Ｇｈｏｓｅ， Ｃ． ｅｔ ａｌ． ２００７ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７５：２８２６−２８３２）。化学的に解毒されたトキソイドは、粘膜表面上の受容体を標的にし得る分子より弱い粘膜反応を誘発する（Ｃｒｏｐｌｅｙ， Ｉ． ｅｔ ａｌ． １９９５ Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１６４３−１６４８； Ｔｏｒｒｅｓ， Ｊ． Ｆ． ｅｔ ａｌ． １９９５ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６３：４６１９−４６２７）。なぜなら、トキソイドは、ホルムアルデヒド処理の性質により、粘膜表面に結合することができないからである（Ｋｕｎｋｅｌ， Ｇ． Ｒ． ｅｔ ａｌ． １９８１ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ３４：３−１３）。そのため、ＣＴ又はＥ．ｃｏｌｉの易熱性毒素（ＬＴ）などの、強力な粘膜アジュバントは、粘膜免疫の誘発に必要である。
ＣＤＩのための実験ワクチンの別の形態は、ＧＴドメインを欠き、それ故無毒である組換え発現された毒素フラグメントである。ＴｃｄＢは、ＣＤＩにおける疾患の病因においてＴｃｄＡより重要であり得るが（Ｌｙｒａｓ， Ｄ．， ｅｔ ａｌ． ２００９ Ｎａｔｕｒｅ ４５８：１１７６−１１７９）、ＴｃｄＡの受容体結合ドメインの一部分を含むフラグメントのみが、候補ワクチンとして検査されてきた（Ｓａｕｅｒｂｏｒｎ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． １９９７ ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ １５５：４５−５４； Ｗａｒｄ， Ｓ． Ｊ． ｅｔ ａｌ． １９９９ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６７：５１２４−５１３２）。組換え発現された毒素フラグメントは、大量で生成するのが比較的容易である。ホロトキシンの重要な部分の欠失は、全体的な受容体結合及び上皮による毒素フラグメントの吸収に影響を与え得る。さらに、毒素の大部分の欠失が、フラグメントの立体組成に影響を与える可能性がある。従って、フラグメントは、欠失された部分に対する及びステレオタイプ的に（ｓｔｅｒｅｏｔｙｐｉｃａｌｌｙ）重要なホロトキシンのエピトープに対する抗体を誘発する能力を失い、それらの抗原性をかなり減少させた。ホロトキシンは対照的に、全毒素にわたってエピトープに特異的な抗体を誘発する（Ｂａｂｃｏｃｋ， Ｇ． Ｊ． ｅｔ ａｌ． ２００６ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７４：６３３９−６３４７）。
ＴｃｄＡのＣ末端受容体結合ドメインを発現するＤＮＡベクターでの筋肉内の免疫感作は、そのフラグメントに対する全身性のＩｇＧ反応を誘発すると示され、免疫化したマウスは、野生型ＴｃｄＡでのチャレンジから生存した（Ｇａｒｄｉｎｅｒ， Ｄ． Ｆ． ｅｔ ａｌ． ２００９． Ｖａｃｃｉｎｅ ２７：３５９８−３６０４）。ＤＮＡワクチンは、粘膜の免疫反応を生じさせると示されてきた（ｖａｎ Ｇｉｎｋｅｌ， Ｆ． Ｗ． ｅｔ ａｌ． ２０００ Ｅｍｅｒｇ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ６：１２３−１３２）。Ｂ型肝炎ウイルス、単純性疱疹ウイルス、ＨＩＶ、マラリア、及びインフルエンザを含む、いくつかの病原体に対する、全身性の抗体及びＣＴＬを誘発するために、プラスミドＤＮＡが、臨床試験において使用されたが、これらの場合において粘膜コンパートメントにおける十分な反応を誘発しなかった（ｖａｎ Ｇｉｎｋｅｌ， Ｆ． Ｗ． ｅｔ ａｌ． ２０００ Ｅｍｅｒｇ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ６：１２３−１３２）。両方のホロトキシンは、大きなサイズを有し、それ故、哺乳動物細胞において発現されるような２０以上のＯ−糖鎖付加部位及びＮ−糖鎖付加部位を有することが予期され、これらの部位は、グリコシル化によって、タンパク質の立体組成の重要な変化のない哺乳動物細胞中の毒素遺伝子の全体又は大部分さえも発現する際の困難性を与える。ＤＮＡを使用して発現された少量の毒素フラグメントは、抗原性を減少させた。
ＣＤＩを予防及び処置するための選択肢が急速に減っているために、特に、最近出現した超高病原性Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株に対して、新しい方策が必要とされる。トキソイド、毒素フラグメント、又はフラグメントを発現するＤＮＡベクタ―を使用する現在のワクチンは、上に議論される様々な欠点を有する。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅホロトキシンを発現する以前の試みは制限されていた（Ｐａｒｋ， Ｅ． Ｊ． ｅｔ ａｌ． １９９９ Ｅｘｐ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ３１：１０１−１０７； Ｐｉｚｚａ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． １９９４ Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８０：２１４７−２１５３）。
これらの問題は、本明細書の実施例において扱われ、その中で、野生型及びＧＴ欠損のホロトキシンタンパク質は、高い発現の収率を有してエンドトキシンを含まないＢ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ系において発現された。これらの変異型毒素タンパク質は、インタクトなＣ末端の領域及び構成を有し、且つ野生型毒素として、等価なアジュバント活性、抗原性、及び粘膜上皮に対する親和性を維持すると見出された。無毒のホロトキシンタンパク質によるマウスの免疫感作は、対応するトキソイドによる免疫感作よりも強力な抗体反応及び防御免疫を誘発し、毒素フラグメントによる免疫感作よりも広いスペクトル抗体反応を誘発したことが本明細書において観察されている。さらに、ＴｃｄＡ及びＴｃｄＢ（ｃＴｘＡＢ）両方からの成分を含む、特別に設計されたキメラタンパク質によるマウスのワクチン接種は、両方の毒素に対して特異的な抗体を誘発し、両方の毒素による致死的チャレンジからマウスを保護した。それ故、本明細書の実施例における無毒の毒素タンパク質（ａＴｘＡＢ）及びキメラタンパク質（ｃＴｘＡＢ）の各々は、様々な経路及び免疫感作のレジメンによって投与されるときの、安全性、免疫性、及び有効性の評価に対するワクチン候補として本明細書で評価される。
２つの免疫原（ａＴｘＡＢ及びｃＴｘＡＢ）は、構築され、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによって経口チャレンジに対する強力な粘膜及び／又は全身性の保護を誘発することの相対的効力に関して評価された。全身性及び粘膜のチャレンジの野生型毒素に対する保護を誘発するように設計された、粘膜の免疫感作の幾つかのレジメン（経口、鼻腔内及び舌下）は、有効性に関して評価された。粘膜の免疫感作は、複数の追加免疫を受けることで恩恵を受ける患者に投与するのが適切である。本明細書に分析される様々な免疫感作レジメンの予防効果は、マウス急性感染症モデルを使用して評価された。マウス感染研究を行って得られたデータによって効果的なものとして評価された免疫感作方法は、その後、ＣＤＩの慢性ノトバイオートの子ブタモデルにおいて評価された。経口的に感染した子ブタは、ＣＤＩを有するヒトにおいて観察される幾つかの重要な特徴を示す。年齢及び感染量によって、これらは、下痢の急性疾患、拒食症及び起こり得る死の症状；又は、持続する間欠性の下痢、不健康、及び重量減少を発症する、典型的な偽膜性大腸炎、炎症及び深刻な粘膜損傷を有する慢性病を含む。
２つの免疫原（ａＴｘＡＢ及びｃＴｘＡＢ）の安全性及び免疫性は、本明細書において観察され、これは、これらのタンパク質が、同時に、病気の胃腸及び全身性の発症から患者を保護する、有効な、無針の、耐熱性のワクチン候補の開発に適していることを示している。鼻腔内及び舌下の免疫感作のためのｍＬＴ及びＣｐＧなどの粘膜アジュバント、及び経口免疫のためのＣＴ（修飾されたコレラ毒素）マイクロカプセル化が調べられた。
（動物疾患モデル）
ＣＤＩが、ハムスター、モルモット、ウサギ、及び無菌性マウス及びラットを含む、多くの動物種において研究されてきた（Ａｂｒａｍｓ， Ｇ． Ｄ． ｅｔ ａｌ． １９８０ Ｇｕｔ ２１：４９３−４９９； Ｃｚｕｐｒｙｎｓｋｉ， Ｃ． Ｊ． ｅｔ ａｌ． １９８３ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ３９：１３６８−１３７６； Ｆｅｋｅｔｙ， Ｒ． ｅｔ ａｌ． １９７９ Ｒｅｖ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １：３８６−３９７； Ｋｎｏｏｐ， Ｆ． Ｃ． １９７９ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ２３：３１−３３）。最も広く使用されたモデルはハムスターであり、その中でＣＤＩは、抗生物質で処置された動物の毒素産生のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染によって誘発される。ハムスターにおける疾患は、主として、回腸にいくらか関係する盲腸に影響を与え、動物は、重度の全腸炎が原因で致命的となる下痢を発症する。ハムスターにおける致死的疾患は、ヒトにおけるＣＤＩの通常の経過及びスペクトルを表わしていない。ハムスターモデルは、疾患の治療及び機構を研究するために、３０年間使用されてきた。ヒトＣＤＩにより酷似している動物モデルが開発され（Ｃｈｅｎ， Ｘ． ｅｔ ａｌ． ２００８ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １３５：１９８４−１９９２； １２９）、それは、３日間の抗生物質の混合物への接触の後に、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに感染し易いＣ５７ＢＬ／６マウスモデルを含む（Ｃｈｅｎ， Ｘ． ｅｔ ａｌ． ２００８ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １３５：１９８４−１９９２）。マウスは下痢を発症し、体重が減少した。重症度は、チャレンジ用量によって劇症から最小まで変化した。ＣＤＩの典型的な組織学的特徴は明白であった。
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅはまた、ブタにおける自然発生の下痢に関連する疾患を、最も典型的には、寿命の最初の７日間の間に引き起こす（Ｓｏｎｇｅｒ， Ｊ． Ｇ． ｅｔ ａｌ． ２００６ Ａｎａｅｒｏｂｅ １２：１−４； Ｓｏｎｇｅｒ， Ｊ． Ｇ． ｅｔ ａｌ． ２０００ Ｓｗｉｎｅ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ８：１８５−１８９； Ｓｏｎｇｅｒ， Ｊ． Ｇ． ｅｔ ａｌ． ２００５ Ｊ Ｖｅｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔ １７：５２８−５３６）。ＣＤＩは、新生仔ブタにおける腸炎の最も一般的な診断であり（Ｓｏｎｇｅｒ， Ｊ． Ｇ． ｅｔ ａｌ． ２００６ Ａｎａｅｒｏｂｅ １２：１−４）、それは恐らく、消化路の解剖学及び生理学における類似性、食事の性質、及び要因のそのような組み合わせに起因する関係する腸ミクロフローラが原因である。これによって、子ブタはＣＤＩのためのポテンシャルモデルとなる。無菌又はノトバイオートの（ＧＢ）子ブタは、腸を殺菌するための抗生物質の処置を必要としない、よく特徴づけられた、制御された、最適化された、標準化されたモデルであるという点で、さらなる利点を提供する。子ブタを超高病原性株０２７／ＢＩ／ＮＡＰ１でチャレンジすることによって、一貫した結果をもたらし、その結果は、接種の４８時間以内の１００％のコロニー形成、１００％の罹患率、及び接種時の用量及び年齢に依存する疾患の重症度及び死亡率を有した（Ｓｔｅｅｌｅ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． ２０１０ Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ２０１：４２８）。さらに、子ブタモデルは、制御された研究室の下で容易に操作され得る強度及び持続時間を備える特徴的な偽膜性大腸炎を有する、急性及び致死的な下痢から慢性下痢までの様々な疾患スペクトルを提供する。全身性の結果を含む臨床症状の範囲は、ヒトの場合において観察されるものと類似しており、これは、ＧＢ子ブタを、ワクチン候補及び治療薬の症状発現前の評価を行なうための魅力的なモデルにしている。
（ａＴｘＡＢ及び／又はｃＴｘＡＢの免疫原の有効性を評価するための動物モデルの使用）
ａＴｘＡＢ及び／又はｃＴｘＡＢの免疫原は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染のノトバイオートの子ブタモデル、及びマウスＣＤＩモデルを使用して、急性又は慢性のＣＤＩと一致する、下痢及び／又は全身性の中毒の症状の進行を予防する際の有効性のために評価される。
インビボの免疫反応及び毒素接種の結果として生じた病理学的結果を模倣することができる利用可能なインビトロの技術はない。感染のネズミモデルは、操作の容易性、遺伝的に近交系の株の存在及び豊富な免疫学的試薬が原因である、自然発生の宿主免疫反応を分析するための有用なモデルである。全身性のチャレンジモデルは、非経口又は粘膜の免疫感作によって生じた保護を評価するために使用される。回腸のループアッセイは、微環境に接種される毒素の用量の正確な対照、及びそれ故に、免疫感作の粘膜経路によって生じた粘膜の保護の解析及び定義を含む。伝統的に、ハムスターは、ＣＤＩの広く使用される動物モデルである。このモデルは、ＣＤＩ研究に広範囲に使用されており、ハムスターは感染に対して極端に感受性がある。死亡率は、しばしば、毒性株による感染の４８時間以内に１００％に近づき、死病が、たった１つのコロニー形成単位ｃｆｕから発症し得る（Ｋｅｅｌ， Ｍ． Ｋ． ｅｔ ａｌ． ２００６ Ｖｅｔ Ｐａｔｈｏｌ ４３：２２５−２４０）。ハムスターの急性発症には、ヒトにおける疾患と比較して、病因における事象の検査のための時間がほとんど残されていない。これらの理由のために、研究者は、ヒトの疾患の原因に酷似している動物モデルを積極的に求める。マウス感染モデルは、その疾患のヒトの経過に酷似している（Ｃｈｅｎ， Ｘ． ｅｔ ａｌ． ２００８ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １３５：１９８４−１９９２）。２つの動物モデルを使用することで、ヒトにおけるＣＤＩの制御又は処置への適用前に不可欠な候補ワクチンの安全性の評価が可能となる。マウス及び子ブタのＣＤＩモデルの両方が、ヒトボランティアにおける第Ｉ相試験につながるＰＤＰに必要な症状発現前のワクチン評価データを生むために、本明細書の実施例において使用された。
全身性及び／又は粘膜の免疫感作のトップランクのレジメンの有効性は、 Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによって経口的にチャレンジされた動物モデルによって誘発される急性及び慢性のＣＤＩに対する動物の保護に関して評価される。（軽度の下痢、偽膜性大腸炎から、劇症の疾患及び再発及び多発性再発までの）ＣＤＩの発症の複雑さを考えれば、２つの動物ＣＤＩモデルが、潜在的な候補ワクチンとして、それらのうちの１つに対する症状発現前の評価を行う目的で、免疫原の有効性を十分に評価するために必要とされる。上記の結果に基づいて、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによって経口的にチャレンジされた動物がＣＤＩを進行させるのを免疫感作が予防することができるかどうかを評価するために、マウス及びノトバイオートの（ＧＢ）子ブタモデルの両方が使用される。さらに、子ブタ感染モデルにおけるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ媒介性、進行性、慢性の疾患の評価に関するワクチン接種の縮小又は排除が実行される。抗毒素抗体の持続性及び大きさが、数か月間にわたって測定され、評価は、子ブタにおけるＣＤＩの再発（ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ ｏｒ ｒｅｌａｐｓｅ）を予防するための少なくとも１つのさらなる追加免疫を必要とする。
全身性及び／又は粘膜の免疫感作のトップランクのレジメンの有効性は、 Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅでの経口チャレンジによって誘発された急性ＣＤＩからマウスを保護する能力に関して最初に検査され、その後、慢性ＣＤＩの子ブタモデルにおける選択されたレジメンの有効性が検査された。
子ブタモデルにおいて、子ブタの２つの群は、特異血清及び分泌抗体のレベルをモニタリングするために、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅでの経口チャレンジ後にさらに３か月間維持され、その後、再発（ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ／ｒｅｌａｐｓｅ）からの保護を評価するために、再びＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによってチャレンジされ；もし特異抗体レベルが低いと見なされると、第２のチャレンジ前に追加免疫が与えられる。そのようなワクチンの有効性は、子ブタモデルのために確立された、徴候的、病理的及び免疫学的パラメーターを使用して評価される。候補の有効性の包括的な症状発現前の評価は、ワクチンのための基準として、アジュバントを含んで又は含まずに様々な経路を使用して、ａＴｘＡＢ又はｃＴｘＡＢを使用して行われる。最良の候補ワクチンは、臨床評価のために選択される。本明細書の例は、再発からの保護の持続時間を記載して得られたデータ、及び追加免疫の恩恵を示す。
（マウスに関する処置計画）
変異体ホロトキシン及びｃＴｘＡＢの毒性の欠如は、全身的にチャレンジされたマウスにおいて細胞毒性及びインビボの毒性のアッセイによって測定される。
免疫感作は、アジュバントとしてミョウバンを有する５又は１０μｇの精製された抗原の腹腔内（ＩＰ）注射によって行われる。抗体力価は、標準ＥＬＩＳＡによって測定される。血清中和力価は、マウスの腸上皮株ＣＴ２６細胞上の野生型毒素の細胞毒性を遮断することによって測定される。
全身性の毒素からのワクチン接種の保護を評価するために、免疫化したマウスは、野生型ＴｃｄＡ又はＴｃｄＢのいずれかの致死量によってＩＰでチャレンジされ、マウスの疾患及び死亡率がモニタリングされる。
ＣＤＩに対する防御免疫を評価するために、免疫化したマウスは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの栄養細胞又は芽胞によって経口でチャレンジされ、下痢、重量減少、及びマウス生存などの症状の進行がモニタリングされる。腸の炎症及び組織損傷は、組織病理学的分析によって評価される。
再発性ＣＤＩに対するｃＴｘＡＢワクチン接種による保護を評価するために、免疫化したマウスは、抗生物質のカクテルによって処置され、その後、最初のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのチャレンジの３０日後にＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞によって経口で再チャレンジされる。マウス生存及びその疾患の症状がモニタリングされる。
マウスは、６〜８週齢の、１０匹のＣ５７ＢＬ／６又はＢａｌｂ／ｃマウスの群において処置される。各々の一連の処置は、陽性対照（トキソイド）及び陰性対照（ビヒクル、適切な場合はアジュバントを加える）を含む。動物は、２週間毎の間隔で３回ワクチン接種を受け、最後の免疫感作の１週間後にマウスは、関連する野生型毒素によってさらにチャレンジされる。マウスは、最後の免疫感作後及び実験室株ＶＰＩ １０４６３、超高病原性Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株０２７、又は対照（ｔｃｄＡ−ｔｃｄＢ−無毒性）株ＣＤ３７による経口チャレンジ前に抗生物質によって処置される。毒素又は細菌による各々の免疫感作又はチャレンジの前に、血清及び糞便のサンプルが集められ、ＥＬＩＳＡ及び細胞毒性アッセイによる特異的な抗体アイソタイプに関して分析される。毒素又は細菌によるチャレンジの後に、マウスは、動きたがらない（ｒｅｌｕｃｔａｎｃｅ ｔｏ ｍｏｖｅ）、拒食症、丸まった背中（ａｒｃｈｅｄ ｂａｃｋ）、嗜眠、体重の減少、粥状便、ひだ状の被膜（ｒｕｆｆｌｅｄ ｃｏａｔ）、及び横臥を含む病気の症状のために厳密にモニタリングされる。重病の動物は安楽死させられる。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによって経口でチャレンジされた動物において、糞便中の細菌の排泄が定量化され、内臓は、本明細書の実施例に示されるように、ホルマリン固定され、異常性に関して組織学的に検査される。血液中（毒素によってチャレンジされた動物）、又は血液中及び糞便中（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによって経口でチャレンジされた動物）で循環する毒素の存在は、記載されるような超高感度アッセイを使用して定量化される（Ｈｅ， Ｘ． ｅｔ ａｌ． ２００９ Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ７８：９７−１００、その全体が引用によって本明細書に組み込まれる）。
Ｂａｌｂ／ｃ又はＣ５７ＢＬ／ｃマウスは、抗生物質のカクテル（カナマイシン、ゲンタマイシン、コリスチン、メトロニダゾール、及びバンコマイシンの混合物）によって処置され、その後、以前に記載されたようにＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの経口接種が続けられた（Ｃｈｅｎ， Ｘ ｅｔ ａｌ． ２００８ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １３５： １９８４）。３回目の免疫感作の１０日後に、マウスは、胃管栄養法を使用して、１０５ＣＦＵの栄養型細菌（実験室ＶＰＩ１０４６３株）を与えられた。長期的な免疫を評価するために、マウスは、３回目の免疫感作の３か月後に１０５ＣＦＵの栄養型細菌によって経口的にチャレンジされた。いくつかの実施例において、免疫化したマウスは、ＵＫ１（０２７／Ｂ１／ＮＡＰ１株， ＶＡ Ｃｈｉｃａｇｏ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ Ｓｙｓｔｅｍ）の１０６芽胞によってチャレンジされた。再発性ＣＤＩを誘発するために、生存するマウスは、抗生物質のカクテル処置が与えられ、一次感染の３０日後に経口Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞（１０６／マウス）の接種が続けられた。二次チャレンジは、一次ＣＤＩとして類似した臨床症状及び腸の組織病理を誘発する。再発性疾患及び死亡がモニタリングされた。
（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅチャレンジ後の毒素排出）
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞による一次及び二次チャレンジの後に、マウスの糞便は、集められ、プロテアーゼのカクテルを含む等しい量（ｗ／ｖ）のＰＢＳ中に分散され、及び上清は、遠心分離によって集められ、使用するまで−８０℃で保存された。糞便サンプルの毒素媒介性の細胞毒性を測定するために、上清は、希釈され（最終１００Ｘ）、ＣＴ２６細胞単層に加える前にろ過された。細胞球状化は、位相差顕微鏡を使用して観察された。ヤギの抗ＴｃｄＡ及び抗ＴｃｄＢのポリ血清（ｐｏｌｙｓｅｒａ）（Ｔｅｃｈｌａｂ Ｉｎｃ．， Ｂｌａｃｋｓｂｕｒｇ， ＶＡ）は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素の特異的活性を測定するために使用された。
（サイトカイン測定）
サイトカイン濃度は、１週当たり３回、糞便において、及び市販で入手可能なブタのサイトカインＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ａｎｄ Ｒ＆Ｄ）を使用する、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β、及びＩＦＮ−γに関する大腸の内容物からの剖検で測定される。サンプルは、使用するまで−２０℃で保存される。糞便サンプル及び大腸の内容物は、サンプルの一致性に依存して、無菌のＰＢＳによって１：２から１：１０で希釈され、ボルテックスを使用して徹底的に混合され、その後、遠心分離にかけられ、上清は、アッセイにおいて試薬のウェルに加えられる。アッセイは、製造業者の指示に従って行われ、サイトカイン濃度は、標準曲線に基づいて測定される（Ｓｔｅｅｌｅ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． ２０１０ Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ２０１：４２８）。
（抗体力価及びインビトロの中和アッセイ）
血清、洗腸液、及び糞便サンプルのためのＴｃｄＡ及びＴｃｄＢに関する中和力価が測定される。ａＴｘＡＢ、ｃＴｘＡＢ、又はトキソイドの適量での最後の免疫感作の１週間後に、各々の免疫化したマウスからの血清が集められる。各群から血清はプールされ、ＴｃｄＡ又はＴｃｄＢのいずれかの細胞毒性の中和が測定される。非経口の免疫感作のための中和力価及び免疫原の適量が測定される。計算されたＬＤ５０ｉ毒素チャレンジ用量が、各免疫原によって誘発された保護のレベルを測定するために使用される。保護レベルは、血清中和力価と相互関連しており、ａＴｘＡＢ及びｃＴｘＡＢの両方は、トキソイドよりも著しく高いＬＤ５０ｉ及び中和力価を有する。ＬＤ５０ｉ及び中和力価は、参照として使用される。
マウスモデルにおいて、免疫感作の１日前及び以前の免疫感作の７日後に、各々の免疫化したマウスからの血清サンプルが集められ、ＩｇＧ力価が、精製された個々の天然又は組換え野生型のホロトキシンに対する標準ＥＬＩＳＡを使用して測定された。いくつかの処置において、ＩｇＧ力価は、ＥＬＩＳＡプレートをコーティングするための天然の毒素を使用することによって、我々の組換え毒素を使用するＩｇＧ力価と比較され、その結果は本質的に同様であり、それは、Ｈｉｓ（６）−タグに対する抗体力価が無視できるものであったということを示した。いくつかの処置において、血清抗毒素ＩｇＭ及びＩｇＡ、及び糞便ＩｇＧ及びＩｇＡは、ＥＬＩＳＡによって評価された。血清サンプルのインビトロの中和活性を評価するために、ＴｃｄＡ及びＴｃｄＢの両方に感受性のあるマウスの腸の上皮細胞株ＣＴ２６が使用された。中和力価は、標準濃度の毒素によって誘発された細胞球状化を妨げない血清の最大希釈の逆数として定義される。この濃度は、本質的にすべてのＣＴ２６細胞が、毒素に対する２４時間の接触後に球状化するのを引き起こす毒素の最小量の４倍の濃度である。１．２５ｎｇ／ｍｌでの野生型のＴｃｄＡ又は０．０６２５ｎｇ／ｍｌでのＴｃｄＢは、毒素処置の２４時間後に１００％のＣＴ２６細胞球状化を引き起こす。それ故、６ｎｇ／ｍｌでのＴｃｄＡ又は０．２５ｎｇ／ｍｌでのＴｃｄＢは、その後、ＣＴ２６細胞に適用される連続的に希釈される血清サンプルの各々と混合された。細胞球状化は、インキュベーションの２４時間後に、位相差顕微鏡を使用して観察された。
（超高感度免疫細胞毒性アッセイ）
細胞毒素Ｂアッセイ、抗体ベースの免疫アッセイ、ＧＤＨアッセイなどのＣＤＩを診断するための現在利用可能なアッセイには、重大な制限がある。超高感度の、組織培養ベースのアッセイが、最近の結果に基づいて開発され、免疫細胞毒性アッセイとして本明細書に言及される（Ｈｅ， Ｘ． ｅｔ ａｌ． ２００９ａ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７７：２２９４−２３０３； Ｈｅ， Ｘ． ｅｔ ａｌ． ２００９ｂ Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ７８：９７−１００； Ｈｅｒｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．、２０１０年１月１４日に公開された国際特許出願公開番号 ＷＯ ２０１０／００６３２６（その全体が引用によって本明細書に組み込まれる））。このアッセイは、４時間以内に生体サンプル中の１ｐｇ／ｍｌ未満の毒素の存在を検出する（Ｈｅ， Ｘ． ｅｔ ａｌ． ２００９ Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ７８：９７−１００、引用によって本明細書に組み込まれる）。このアッセイは、急性マウス及び子ブタモデルにおける全身性の毒素及び毒素を減少させるか又は除去する抗毒素の効果を評価するために使用された。
候補ワクチン（ａＴｘＡＢ及びｃＴｘＡＢ）の非経口の免疫感作の有効性が評価され、免疫感作の適量は、保護反応を誘発する最大の抗体を誘発するように決定される。
（用量最適化）
最初の処置は、免疫原の１回の注入当たり５μｇの総タンパク質を使用した。ａＴｘＡＢ及びｃＴｘＡＢ及びトキソイドの用量最適化は、非経口の免疫感作のための２倍及び半分を最適化した用量を使用して測定することによって決定された。アジュバント、例えば、ｍＬＴが使用されると、同じ量のアジュバントは、注入前に免疫原と一緒に混合される。各々の用量及び免疫感作の経路に関しては、全身性及び粘膜の両方のＩｇＧ及びＩｇＡ反応がモニタリングされ、中和力価が測定された。各免疫原に対する最も高いレベルの血清及び／又は粘膜の抗体反応を誘発するのに必要な抗原の最低量が確立された。
（ＬＤ５０ｉのチャレンジ用量の確立）
ａＴｘＡＢ、ｃＴｘＡＢ、又はトキソイドの適量での３回目の免疫感作の１週間後に、マウスは、２倍の用量のＬＤ５０ｎによってチャレンジされ、これは、野生型毒素によってナイーブマウス（ｎａｉｖｅ ｍｉｃｅ）の５０％の死亡を引き起こす用量と称される。免疫化したマウスの５０％の死亡を引き起こす用量が決定され、ＬＤ５０ｉと称された。各免疫原に対する各毒素のＬＤ５０ｉが決定され、ａＴｘＡＢのＬＤ５０ｉは、ｃＴｘＡＢのそれに類似しており、その両方は、トキソイドのものより著しく高かった。
＜マウス、細胞株、及び毒素＞
６〜１２週齢のＢＡＬＢ／ｃ、ＣＤ１及びＣ５７ＢＬ／６のマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ， ＭＥ）から購入され、専用の病原体を含まない設備に収容された。マウスは、プロトコルＧ９５０−０７、Ｇ８８９−０７、及びＧ７９５−０６の下の、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ （ＩＡＣＵＣ）のガイドラインに従って扱われ、注意を払われた。全身性のワクチン接種を評価するために、１つの群当たり１０匹のマウス（合計４つの群）が使用され、５匹のマウスが、各毒素又は免疫感作の２つの経路と各処置の３つの複製による毒素の組み合わせによるＩＰチャレンジに使用され、これは安全性評価を有していた。
ネズミの結腸上皮細胞株ＣＴ２６、ヒトの結腸上皮細胞株ＨＴ−２９及びｈＣＴ−８、及びサル腎培養細胞株Ｖｅｒｏは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ； Ｒｏｃｋｗｉｌｌｅ， ＭＩ）から得られた。細胞は、１０％のウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン及び１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを含む、ダルベッコ改変イーグル培地において保持された。天然のＴｃｄＡ及びＴｃｄＢ毒素は、以前に記載されたように、毒素産生のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株ＶＰＩ １０４６３の培養上清から精製された（Ｙａｎｇ， Ｇ ｅｔ ａｌ． ２００８ ＢＭＣ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ８： １９２、引用によって本明細書に組み込まれる）。完全長野生型組換えＴｃｄＡ及びＴｃｄＢタンパク質は、以前に記載されたように、Ｂａｃｉｌｌｉｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍの合計の粗抽出液から精製された（Ｙａｎｇ， Ｇ ｅｔ ａｌ． ２００８ ＢＭＣ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ８： １９２）。組換えホロトキシンの生物活性は、それらの天然の形態と同一であった（Ｙａｎｇ， Ｇ ｅｔ ａｌ． ２００８ ＢＭＣ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ８： １９２）。高度に精製された組換え毒素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に単一バンドとして現われ、バイオアッセイによって測定されるように、検知可能なＴＬＲ２及びＴＬＲ４のリガンド活性を欠いており（Ｈｅ， Ｘ ｅｔ ａｌ． ２００９ａ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７７： ２２９４； Ｓｕｎ， Ｘ ｅｔ ａｌ． ２００９ Ｍｉｃｒｏｂ Ｐａｔｈｏｇ ４６： ２９８、その各々は、その全体が引用によって本明細書に組み込まれる）、別段の定めがない限り、本明細書の実施例において使用された。
Ｂａｌｂ／Ｃ又はＣ５７ＢＬ／６マウスは、各注入のためのアジュバントとしてミョウバンを含むＰＢＳ中の５μｇの精製された変異体毒素によって腹腔内で（ＩＰ）免疫化された。対照マウスは、ミョウバンを含むＰＢＳを注入された。免疫原としてａＴｃｄＢ（各々５μｇ）又はｃＴｘＡＢと混合されたａＴｃｄＡを使用して、１回の注入当たり合計１０μｇのタンパク質が投与され、マウスは、１０〜１４日の間隔で３回の免疫感作が与えられた。
全身性の毒素チャレンジ：Ｂａｌｂ／ｃマウス（４〜６週齢）は、野生型のＴｃｄＡ又はＴｃｄＢ（１００ｎｇ／マウス）、ａＴｃｄＡ（１００μｇ）、又はａＴｃｄＢ（１００μｇ／ｍｌ）をＩＰで注入された。マウスは、疾患の徴候に関して厳密に観察され、瀕死になった時に安楽死させられた。
（粘膜上皮への免疫原の結合の評価）
粘膜の抗原送達が直面する問題は、粘膜による抗原の非効率的な吸収である。受容体は定義されていないが、両方のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）は、上皮細胞に対する高親和性を有する複数の細胞壁結合の繰り返しを含む。ａＴｘＡＢ及びｃＴｘＡＢの両方は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素のインタクトなＲＢＤを含み、従って、最も起こり得るのは、両方の免疫原が高親和性を有する上皮細胞に結合し得ることである。上皮細胞へのａＴｘＡＢ及びｃＴｘＡＢの結合を評価するために、タンパク質は、Ｋｅｅｌ ａｎｄ Ｓｏｎｇｅｒ（Ｋｅｅｌ， Ｍ． Ｋ． ｅｔ ａｌ． ２００７ Ｖｅｔ Ｐａｔｈｏｌ ４４：８１４−８２２）によって記載されるビオチン化のための方法を使用してマウスに投与する前にビオチン化され、その中で、毒素の活性も上皮へのそれらの結合も影響を受けない。ビオチン化されたａＴｘＡＢ又はｃＴｘＡＢの粘膜の（ＩＮ、ＳＬ、及び経口での）投与の６時間後に、マウスは犠牲にされ、組織部分が免疫組織化学染色のために準備される。舌下粘膜を採取するために、舌と一緒の口底は、薄い曲剪刀でひとまとめにして下顎から切除される。鼻粘膜は、Ｅｒｉｋｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ （Ｅｒｉｋｓｓｏｎ， Ａ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． ２００４ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７３：３３１０−３３１９）によって詳しく記載される方法に従って解剖される。経口投与後のＧＩトラックに対する免疫原の結合を評価するために、免疫化したマウスからの胃の洞領域及び腸の部分が集められる。標本は、パラホルムアルデヒドによって固定され、パラフィンで埋め込まれる。免疫組織化学染色のために、脱パラフィンされた６μｍの厚さの部分は、本明細書の実施例に記載されるように、ＨＲＰ共役のアビジンで染色される前に、ビオチン遮断キットによって前処置される。
（血清及び粘膜の（腸及び糞便の）抗体反応）
血清抗体反応が、本明細の実施例に記載されるように分析される。粘膜の抗体反応を検査するために、洗腸液（ＩＬ）が集められ、マウス及び毒素に特異的なＩｇＧ及びＩｇＡからの糞便サンプルが測定される。
各免疫感作の１日前及び最後の免疫感作の１週間後に、糞便及びＩＬのサンプルが集められる（Ｅｌｓｏｎ， Ｃ． Ｏ． ｅｔ ａｌ． １９８４ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ６７：１０１−１０８）。簡潔に言うと、各マウスは、１ｍｌのプロテアーゼインヒビターカクテルを含むプラスチックペトリ皿の上に置かれた、１５ｃｍ×１５ｃｍのワイヤーメッシュ上で飼育される。マウスは、ワイヤーメッシュの上部のガラスビーカー内に監置される。腸の内容物の放出を誘発するために、０．５ｍｌの洗浄溶液の４回の投与量（２５ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＮａ２ＳＯ４、１０ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＮａＨＣＯ３、及び４８．５ｍＭ（１６２ｇ／ｌ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（平均のＭｗ ３３５０））が、胃管栄養法を使用して、１５分間隔で与えられる。洗浄溶液の最後の投与の３０分後に、マウスは、０．１ｍｇのピロカルピンを腹腔内で与えられる。次の２０分間で放出された腸の内容物（０．５ｍｌ以内）は、プラスチック管に集められ、使用するまで−７０℃での冷凍を維持された。洗腸手順を開始する直前に、２つの新たに排泄された糞便は、１．５ｍｌのあらかじめ量られた微小遠心管へ集められる。糞便は、プロテアーゼインヒビターカクテルを含む２倍量のＰＢＳを加える前に量られる。固形物は、広範囲なボルテックスにより懸濁され、その後、１０分間１６，０００×ｇで遠心分離にかけられ、及び澄んだ上清は、アッセイされるまで、−７０℃で保存される。
ＴｃｄＡ、ＴｃｄＢ ＩｇＧ、及びＩｇＡに特異的な抗体の力価は、ＥＬＩＳＡによって測定される。精製された天然のＴｃｄＡ又はＴｃｄＢは、プレートをコーティングするために使用され、それによって、Ｈｉｓ６タグ又は免疫原中のあり得る汚染物質に対する交差反応を最小限にすることが可能とする。抗毒素ＩｇＡ又はＩｇＧの検出限界が、最低の希釈を有するウェルにおける背景を超えるＯＤ４０５の２倍として設定された。
（組織病理学的分析）
毒素によって誘発された粘膜の損傷及び炎症を評価するために、組織病理学的分析が行われた。切除された結腸又は盲腸の組織は、ＰＢＳによって緩衝された４％のホルムアルデヒド中で固定され、その後、パラフィンで埋め込まれた。脱パラフィンされた６μｍの厚さの部分は、組織学的分析のためにヘマトキシリン及びエオジン（Ｈ＆Ｅ）によって染色された。
（毒素による粘膜チャレンジからの保護）
ＴｃｄＡに特異的なラビット抗血清は、マウスの回腸ループモデルにおいて示されるように、ＴｃｄＡに誘発された腸の炎症及び組織損傷を遮断するために観察された。毒素に対する、粘膜のＩｇＡ及びＩｇＧ抗体が生み出され、粘膜の毒素媒介性の破壊からマウスを保護する能力が検査される。純粋なＴｃｄＢが腸管毒性を有さず、マウスにおいて粘膜炎症及び組織破壊を誘発しないため、ＴｃｄＡからの粘膜保護だけが、回腸ループモデルを使用して検査される。経口でチャレンジされたＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅマウス及び子ブタ感染モデルにおいて、ＴｃｄＢから及びＴｃｄＡからの粘膜保護を誘発する、ａＴｘＡＢ又はｃＴｘＡＢの粘膜免疫感作の能力も検査される。
回腸ループモデルは、３回目の免疫感作の１週間後に使用される。正常なＢａｌｂ／ｃマウスにおいて、野生型ＴｃｄＡの５０μｇの高用量は、かなりの液体貯留及び粘膜損傷を引き起こすことが観察され、一方で、ＴｃｄＡの１０μｇのより低い用量は、毒素処理の４時間以内に軽度の粘膜破壊しか引き起こさなかった。それ故、これらの２つの用量が使用される。３つの３ｃｍのループが、各マウスにおいて結紮され、１０又は５０μｇの野生のＴｃｄＡ、又は等しい量のＰＢＳ（１００μｌ）とともに注入される。対照プラセボで処置されたマウスにおいて同じ処置が行われる。毒素に誘発された液体貯留の量が計られ、一元配置分散分析を使用してデータが分析される。群間のＰ値は、ボンフェローニの多重比較試験を使用して決定される。
液体貯留の評価に加えて、好中球の浸潤及び柔突起損傷などの、病的徴候が組織学的に評価され、群間で比較される。組織病理学的及び好中球のミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性アッセイが、粘膜損傷及び好中球の浸潤を評価するために行われる。ループが集められ、切除された腸は、ＰＢＳによって緩衝された４％のホルムアルデヒド中で固定され、その後、パラフィンで埋め込まれる。脱パラフィンされた６μｍの厚さの部分は、組織学的分析のためにヘマトキシリン及びエオジン（Ｈ＆Ｅ）によって染色され、組織傷害が、組織学者によって盲検で採点される。使用される組織学的グレーディング基準は以下のとおりである：０、リンパ球、プラズマ細胞、及び好酸球の最小の浸潤；１＋、リンパ球、プラズマ細胞、好中球、及び好酸球の軽度の浸潤、及び腸関連リンパ系組織の過形成を有する又は有さない粘膜の軽度のうっ血；２＋、杯状細胞過形成、個々の表面細胞の壊死又は空胞化、及び腺窩拡張を有する又は有さない、混合した炎症細胞の中程度の浸潤、中程度のうっ血及び基底膜の浮腫；３＋、粘膜における、重度の炎症、うっ血、浮腫、及び出血、表面細胞壊死、あるいは侵食又は潰瘍の悪化（Ｔｏｒｒｅｓ， Ｊ． Ｆ． ｅｔ ａｌ． １９９５ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６３：４６１９−４６２７）。サンプル中のＭＰＯ活性を測定するために、切除された回腸の部分は、冷凍乾燥され、０．５％のヘキサデシルトリメチル臭化アンモニウム及び５ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、１ｍｌ中で均質化される。組織は、超音波処理及び結氷融解サイクルによって破砕され、遠心分離される。上清中のＭＰＯ活性は、０．０５％のＨ２Ｏ２中の基質ｏ−フェニレンジアミンを使用して測定され、吸光度は、プレートリーダーを使用して、４９０ｎｍで測定される。
粘膜のワクチン接種は、腸内のＴｃｄＡチャレンジからの保護が期待される。ＴＮＦ−αは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素に誘発された腸の炎症に重大な役割を果たすことが観察された。ＴｃｄＡは、野生型マウスにおいて、絨毛の完全な破壊及び免疫細胞の大規模な浸潤を誘発し、ＴＮＦＲ ＫＯマウスは、ＴｃｄＡに反応して腸絨毛の軽度の損傷及び免疫細胞の中程度の浸潤を示した。
（子ブタモデルの統計分析）
子ブタモデルにおいて、処置から得られたデータは、ＳｉｇｍａＳｔａｔ ｖ．３．１ （Ｓｙｓｔａｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｉｎｃ．）を使用する分散分析に従って、ノンパラメトリック検定法（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ分析）を使用して分析される。対照群を含む４つの群に関して、０．８の累乗（ａ ｐｏｗｅｒ ｏｆ ０．８）及びアルファ＝０．０５のために、所望されるＴ２のレベルに依存して５〜１１８のサンプルの大きさが必要とされる。７匹の動物／群（ｎ＝７）が、ワクチン候補の評価を含むチャレンジ研究に使用された。生存曲線は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、Ｌｏｇ−ｒａｎｋ（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）Ｔｅｓｔ又はＧｅｈａｎ−Ｂｒｅｓｌｏｗ−Ｗｉｌｃｏｘｏｎ Ｔｅｓｔによって比較され、分析される。
これらのデータは、Ｇｒｏｕｐ Ｐａｉｒ−Ｗｉｓｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ （Ｌｅｖｅｎｅ’ｓ／ＡＮＯＶＡ−Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ／Ｗｅｌｃｈ’ｓ）によって補足される。Ｌｅｖｅｎｅの試験は、各々の指定されたエンドポイント及びすべての収集間隔に関して群分散の均一性を評価するために使用される。Ｌｅｖｅｎｅの試験が有意でないとき（ｐ＞０．０１）、分散の統合した推定値（平均平方誤差又はＭＳＥ）は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）から計算され、各処置群の２つの対照群とのＤｕｎｎｅｔｔの比較によって利用される。Ｌｅｖｅｎｅの試験が有意であるとき（ｐ＜０．０１）、対照群との比較は、ボンフェローニの補正を有するウェルチのｔ検定を使用して行われる。対での比較の結果は、０．０５及び０．０１の有意水準で報告される。エンドポイントは、他に明記のない限り、両側検定を使用して分析される。
（技術的な利点）
全身性及び粘膜の免疫性の両方は、毒素などの腸溶性の病原体及び病原性の生成物からの保護を提供する（Ｂｙｒｄ， Ｗ． ｅｔ ａｌ ２００６ ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４６：２６２−２６８； Ｈｕａｎｇ， Ｃ． Ｆ． ｅｔ ａｌ． ２００８ Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｎｕｔｒ ４６：２６２−２７１； Ｌｕｃａｓ， Ｍ． Ｅ． ｅｔ ａｌ． ２００５ Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５２：７５７−７６７； Ｐｅｒｅｚ， Ｊ． Ｌ． ｅｔ ａｌ． ２００９ Ｖａｃｃｉｎｅ ２７：２０５−２１２）。ＴｃｄＡ及びＴｃｄＢがＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの有毒な因子であるため、抗毒素抗体製剤は、動物において経口のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅチャレンジからの十分な保護を与えることができる（Ｋｉｎｋ， Ｊ． Ａ． ｅｔ ａｌ． １９９８ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６６：２０１８−２０２５； Ｌｙｅｒｌｙ， Ｄ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． １９９１ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ５９：２２１５−２２１８）。ＴｃｄＡ又はＴｃｄＢ、単独に対するものではないが、両方の毒素に対する抗体は、ハムスターモデルにおける毒素産生のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染を保護する（Ｆｅｒｎｉｅ， Ｄ． Ｓ． ｅｔ ａｌ． １９８３ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ｓｔａｎｄ ５３：３２５−３３２； Ｋｉｍ， Ｐ． Ｈ． ｅｔ ａｌ． １９８７ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ５５：２９８４−２９９２； Ｌｉｂｂｙ， Ｊ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． １９８２ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ３６：８２２−８２９）。致死的疾患及び下痢の両方からの保護を評価するハムスターにおけるトキソイドワクチンの送達の経路の評価によって、粘膜及び親の免疫感作の組み合わせが、死亡及び下痢からの完全な保護を提供したことを発見し、それは、全身性及び粘膜の免疫性の両方の誘発が、最適な保護のために必要であることを示唆した（Ｔｏｒｒｅｓ， Ｊ． Ｆ． ｅｔ ａｌ． １９９５ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６３：４６１９−４６２７）。
ヒトにおいて、血清中の抗毒素のより高いレベルは、それほどひどくない疾患及びそれほど頻繁ではない再発に関係する（Ｋｙｎｅ， Ｌ． ｅｔ ａｌ． ２０００ Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４２：３９０−３９７）。徴候的な感染の後に、ほとんどの個体は、便中と同様に血清中の毒素中和ＩｇＡを含む（Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． １９９５ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６３：３１６６−３１７３）、血清中の抗ＴｃｄＡ及び抗ＴｃｄＢ抗体を進行させ（Ａｒｏｎｓｓｏｎ， Ｂ． ｅｔ ａｌ． １９８５ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ １３：９７−１０１； Ｖｉｓｃｉｄｉ， Ｒ． ｅｔ ａｌ． １９８３ Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １４８：９３−１００）、この全身性及び粘膜の抗体反応は、後の感染からの保護に関係するように見える。
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに関連する下痢及び腸溶性の炎症性疾患は、主として２つの分泌毒素によって引き起こされる。エンドトキシンを含まないＢａｃｉｌｌｉｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ系における最近発現された無毒のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素タンパク質を使用して、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染（ＣＤＩ）の発生率および重症度を減少させるために、本明細書にワクチン（粘膜の及び／又は非経口の送達）が提案される。その技術は、完全長の、生物学的に活性な、組換えホロトキシン、ｒＴｃｄＡ及びｒＴｃｄＢを製造するために、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ発現系を使用する、以前に実証された成功した方法論の延長である（Ｙａｎｇ， Ｇ． ｅｔ ａｌ． ２００８ ＢＭＣ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ８：１９２、引用によって本明細書に組み込まれる）。結果として生じるｒＴｃｄＡ及びｒＴｃｄＢは、分子量及び生物活性の測定を含む広範囲な調査後に、それらの天然の対応物（ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔｓ）に類似していることが見出された（Ｙａｎｇ， Ｇ． ｅｔ ａｌ． ２００８ ＢＭＣ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ８：１９２、引用によって本明細書に組み込まれる）。Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ発現系は、５０年間以上使用されており、他の系を超えるいくつかの利点を有する。
２つの候補ワクチンがここで評価される：点変異によって生じた、無毒の完全長のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａ及びＢの混合物（ａＴｘＡＢと称される）、及び他の場合には完全長ＴｃｄＢを含むが、ＴｃｄＡの受容体結合ドメインに置換されたＴｃｄＢの受容体結合ドメインは含まない、良く設計されたキメラタンパク質（ｃＴｘＡＢと称される）。ｃＴｘＡＢは、膜貫通ドメイン中に小さな欠失（９７のアミノ酸）を有するため、無毒である。
ＣＤＩの発症の一因にもなり得る他の毒性特質が存在すると知られているが、ＣＤＩからの保護が、２つの重要な毒素に対する全身性及び粘膜の抗体を介して媒介されることが示されてきた。
焦点は、強力な全身性及び粘膜の免疫性を誘発するために、ＴｃｄＡ及びＴｃｄＢの両方をターゲットとするワクチンを設計することに向けられた。ａＴｘＡＢ又はｃＴｘＡＢは、トキソイド又はそのフラグメントよりも優れていることが見出された。任意の理論又は作用様式に限定されることなく、本明細書の実施例は、そのような大きな分子の正確なフォールディングを有する天然の形態を模倣する完全長タンパク質が、中和抗体の十分なスペクトルを発生させるのに有用であることを示した。ＴｃｄＡのほんの一部を含む、化学物質に解毒されたトキソイド、又はフラグメントとは異なり、点変異によって生じたこれらの無毒のホロトキシンは、天然の毒素がそうであるように、同じアジュバント活性、抗原性、及び粘膜上皮に対する親和性を維持し、それ故、トキソイドより優れた防御免疫及びフラグメントより広い抗体のスペクトルを誘発する。
無毒のＴｃｄＢワクチン接種は、広域スペクトルのエピトープに対する抗体反応及びトキソイドより優れた強力な防御免疫を誘発すると示され；ｃＴｘＡＢ免疫感作は、毒素に対する抗体及び保護反応を誘発した。さらに、ａＴｃｄＢの免疫感作は、急速なＩｇＧ反応を誘発する。抗生物質での処置下にある及び／又は入院下にあるような、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染の高いリスクを有する人々は、ワクチン接種の論理上の標的である。急速な防御免疫を誘発することができるワクチンは、特に入院患者において非常に望ましい。ａＴｃｄＢワクチン接種は、急速な抗体反応を誘発することができる。ａＴｃｄＢでのマウスの免疫感作が、２回目の免疫感作後に強力なＩｇＧ反応を生じさせことが示された一方で、トキソイド免疫感作は、３回目の免疫感作後に（初回抗原刺激後の２８日目に）だけ検知可能なＩｇＧ反応を生じさせた。キメラｃＴｘＡＢワクチン接種は、ＴｃｄＡ及びＴｃｄＢの両方での致死的チャレンジからのマウスにおける強力な保護を誘発する。
非経口で免疫感作され、その後野生型毒素でチャレンジされた後の、防御抗体反応を誘発するために、これらの無毒の組換えタンパク質の能力が評価され、その後、全身性及び粘膜のチャレンジからの保護を誘発するように設計された、粘膜の免疫感作（経口で、鼻腔内及び舌下の）のいくつかのレジメンの評価が続いた。開発した様々な免疫感作レジメンの予防効果が、マウス急性感染症モデルにおいて検査され、マウス感染研究から結果として生じる最も効率的な免疫感作方法は、ＣＤＩの慢性子ブタモデルにおいて症状発現前の評価を受ける。
これらの実施例は、安全で、環境上の、エンドトキシンを含まない細菌宿主、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍにおいて生産的に発現される、新しいＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ候補ワクチンが開発されたことを示す（Ｖａｒｙ ＰＳ ｅｔ ａｌ． ２００７ Ａｐｐｌｉｅｄ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７６： ９５７； Ｙａｎｇ， Ｇ ｅｔ ａｌ． ２００８ ＢＭＣ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ８： １９２）。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ培養物から精製された天然の毒素と比較して、組換えｃＴｘＡＢは、大量で精製するのが著しくより簡単でより安い。それは、毒素のような構成を維持し、両方の毒素に対する強力な中和抗体を誘発することができる、単一の抗原である。この候補ワクチンは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに関連する罹患及び死亡からの十分且つ永続的な保護を誘発するだけではなく、一次及び再発性のＣＤＩからの急速な保護も誘発する。本明細書の実施例は、一次及び再発性のＣＤＩが、非経口のワクチン接種を介して全身性の抗体によって予防され得ることを示す。
＜実施例１．マウスモデルにおけるＣＤＩからの保護＞
マウスＣＤＩモデルを、Ｃｈｅｎによって記載される方法に従って確立した。候補ワクチンでのマウスの免疫感作が、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染に対する防御免疫を誘発するかどうかを決定するために、このモデルを本明細書で使用する。免疫感作及びチャレンジのスキームを図１に示す。
抗生物質での処置後、９０％以上の野生型ナイーブマウスは、１０５ＣＦＵのＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅチャレンジの後に瀕死状態になり、１０４ＣＦＵのＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅチャレンジは、５０％未満のマウス死亡につながる。免疫原での免疫感作は、１０５又は１０４のいずれかのＣＦＵのＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅチャレンジからマウスを保護し、マウスはどれも、疾患又は重量減少の徴候を示さない。さらに、チャレンジ用量に関する細菌の量を少なくし、低用量の細菌によって誘発された、より慢性であるような疾患からの保護を検査する。これらのすべての場合において、糞便中の分泌された毒素の生物活性を、超高感度の、免疫細胞毒性アッセイを使用して測定する（Ｈｅ， Ｘ． ｅｔ ａｌ． ２００９ Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ７８：９７−１００、その全体が引用によって本明細書に組み込まれる）。
免疫化したマウスは、１０５又は１０４のいずれかのＣＦＵのＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅチャレンジから十分に保護される。生存するマウスを、３か月までの間、抗毒素抗体力価をモニタリングするために飼育する。血清サンプルを、半月毎に集め、抗毒素ＩｇＧ及びＩｇＡ抗体力価を測定する。３か月後、マウスを抗生物質で処置し、その後、経口の１０５ＣＦＵのＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅチャレンジで処置する。抗毒素抗体の持続性と細菌の再チャレンジからの保護の間の相関性を確立する。ａＴｃｄＢ免疫感作は、永続的な防御免疫を誘発することが予期される。免疫化したマウスは、致死的ＴｃｄＢチャレンジから十分に保護されることが予期される。それ故、最適化されたレジメン下でａＴｘＡＢ又はｃＴｘＡＢによって免疫化されたマウスは、永続的な防御免疫を誘発することが予期される。ＣＤＩ患者がしばしば再発に苦しむという事実を考えると、これは重要である。防御免疫が永続的でないならば、さらなる追加免疫を投与する。免疫感作及び抗生物質の処置後、マウスの群（１つの群当たり５匹）を、１０５ＣＦＵから始まる、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌の漸増用量で経口でチャレンジする。最適化されたレジメン下で免疫原によって免疫化されるマウスの罹病性は、アジュバントを含む又は含まない、免疫感作の特定の経路によって誘発された保護の有効性を評価することを可能にする。
＜実施例２．統計分析＞
被験体の処置から集められたデータを、本明細書において、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存率分析、分散分析によって、及びｔ試験又はＰｒｉｓｍ統計ソフトウェアプログラムを使用する一元配置分散分析によって分析した。他に明記のない限り、結果を平均±標準誤差として表した。
＜実施例３．Ｂａｃｉｌｌｉｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ発現系及び組換えホロトキシンの生成＞
タンパク質の大きなサイズ及び乏しい安定性が原因で、組換えＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅホロトキシンは生成するのが難しかった。Ｂａｃｉｌｌｉｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、土食から魚食及び乾燥食までの広く多様な生育地において見出される、グラム陽性、好気性の芽胞を形成する細菌は、細胞外酵素生成のための容量が高いために、５０年以上産業上で使用されてきた。それは、組換えタンパク質の生成のための望ましいクローンを作る宿主であり、遺伝的手段は、強力な誘導可能なプロモーター及びアフィニティータグを運ぶシャトルベクターによって利用可能である。Ｅ．ｃｏｌｉ系と比較した、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ発現系の利点は、アルカリ性プロテアーゼ及び安定して維持するプラスミドベクタ―の欠如、エンドトキシンＬＰＳの欠如、及び発現された異種タンパク質を培地へ分泌する能力を含み（Ｍａｌｔｅｎ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． ２００６ Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ７２：１６７７−１６７９； Ｖａｒｙ， Ｐ． Ｓ． ｅｔ ａｌ． ２００７ Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ７６：９５７−９６７）、それが、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍを、完全長及び生物活性の組換えＴｃｄＡ及びＴｃｄＢタンパク質を発現するための魅力的な系にしている。
完全長組換えＴｃｄＡ及びＴｃｄＢは、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ系においてクローン化され、１０ｍｇ／Ｌの毒素タンパク質に達する発現レベルでクローン化された（Ｙａｎｇ， Ｇ． ｅｔ ａｌ． ２００８ ＢＭＣ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ８：１９２、その全体が引用によって本明細書に組み込まれる）。精製を促進するために６−アミノ酸ＨｉｓタグがＣ末端に付けられる毒素の最初のアミノ酸から発現される、組換えＴｃｄＡ及びＴｃｄＢの図面を、図２のパネルＡに示す。細胞毒性アッセイ、Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅｓのグルコシル化、及び上皮細胞の密着結合の破壊によって測定されるように、組換えホロトキシンの生物活性は、天然の対応物と同一であると観察された（Ｙａｎｇ， Ｇ． ｅｔ ａｌ． ２００８ ＢＭＣ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ８：１９２、その全体が引用によって本明細書に組み込まれる）。ｒＴｃｄＢではなく、ｒＴｃｄＡが、結紮されたマウスの回腸ループにおける用量依存性の液体貯留を誘発し、組織学的変化が、Ｃａｖａｌｃａｎｔｅら（Ｃａｖａｌｃａｎｔｅ， Ｉ． Ｃ． ｅｔ ａｌ． ２００６ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７４：２６０６−２６１２）によって記載されるようなものであったことが観察された。
＜実施例４．変異体ホロトキシン及びキメラタンパク質の生成＞
天然の毒素のホルマリン不活性化によって生じるトキソイドは、現在、臨床試験におけるただ一つのＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ候補ワクチンである（Ｓｏｕｇｉｏｕｌｔｚｉｓ， Ｓ ｅｔ ａｌ ２００５ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １２８： ７６４）。ＴｃｄＡ及びＴｃｄＢが複雑な構造及び構成を有する大きなクロストリジウム毒素であるため（Ｐｒｕｉｔｔ ＲＮ ｅｔ ａｌ． ２０１０ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０７： １３４６７； Ｊａｎｋ Ｔ ｅｔ ａｌ． ２００８ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １６： ２２２）、ホルマリン交差結合は、立体構造エピトープを変更し、免疫性を減少させる。ホロトキシンを、グルコシルトランスフェラーゼの基質結合に関係するＴｃｄＡ及びＴｃｄＢのそれらのアミノ酸における２つ又は３つの点変異によって生成した（Ｊａｎｋ， Ｔ ｅｔ ａｌ． ２００７ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８２： ３５２２２）。
毒素のＧＴドメインがＴｃｄＡ及びＴｃｄＢの両方の毒性に関係するため、ＧＴ活性において欠乏しているホロトキシンを、毒素及び疾患の病因に対する宿主免疫反応を分析するために使用した。ＧＴ欠損のホロトキシンを、基質結合において役割を果たすと知られる重要なアミノ酸の点変異によって生成した。ＴｃｄＢ（ａＴｃｄＢとして設計される、図２のパネルＢ）における２つの点変異（Ｗ１０２Ａ及びＤ２８７Ｎ）は、５ｌｏｇまでＧＴ活性を減少させた。
非常に高い１０μｇ／ｍｌの用量のａＴｃｄＢであっても、２４時間の処置の後に、高感度のＣＴ２６細胞においてＲａｃ１の部分的なグルコシル化のみを誘発する（図３のパネルＡ）。対照的に、野生型ＴｃｄＢは、１ｎｇ／ｍｌの用量でＲｈｏ ＧＴＰａｓｅｓタンパク質の完全なグルコシル化を誘発する。１０μｇ／ｍｌでのａＴｃｄＢは、それほど感度のないＨＴ２９細胞上で活性を示さない（図３のパネルＢ）。重要なことに、ａＴｃｄＢは、インビトロの細胞毒性アッセイ及びインビボのマウスチャレンジ処置によって測定されるように、その毒性を失った（図３のパネルＣ）。マウスへの１００ｎｇの野生型ＴｃｄＢの注入は、結果として４時間以内に敗血症のような症状につながり、マウスの９０％以上が２４時間以内に死亡し、一方で、マウスはどれも、ａＴｃｄＢの非常に高い用量（１００μｇ）のＩＰ注入の後に、疾患を発症する又は瀕死状態になることはなかった（図３のパネルＣ）。ＴｃｄＡにおける同様の保存アミノ酸での変異も、ＴｃｄＡのＧＴ活性を本質的に減少させた。毒性の完全な損失を確かにするために、さらなる変異（Ｗ５１９Ａ、図２のパネルＢ）を、ＴｃｄＡにおける基質結合（Ｊａｎｋ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． ２００７ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８２：３５２２２−３５２３）にとってまた重要である保存アミノ酸で導入し、その変異は、ａＴｃｄＡ（ＧＴドメインにおける三重変異）と称される。ＧＴで変異されたＴｃｄＡを利用することによって、ＧＴ活性の役割を、マクロファージ中の毒素媒介性のＴＮＦ−α生成において実証した（Ｓｕｎ， Ｘ． ｅｔ ａｌ． ２００９ Ｍｉｃｒｏｂ Ｐａｔｈｇ ４６：２９８−３０５）。
ＴｃｄＢのＴＭＤのＣ末端（Ｄ９７と称される、約１００のアミノ酸）は、ＴｃｄＢの細胞毒性に必要である。Ｄ９７が削除された組換えＴｃｄＢは、培養細胞上のその毒性を欠失した。
ＴｃｄＡの受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）が強力なアジュバント活性を有するため（Ｃａｓｔａｇｌｉｕｏｌｏ， Ｉ． ｅｔ ａｌ． ２００４ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７２：２８２７−２８３６； Ｙｅｈ， Ｃ． Ｙ． ｅｔ ａｌ． ２００８ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７６：１１７０−１１７８）、ＴｃｄＢのＲＢＤをＴｃｄＡのＲＢＤと置換し、キメラタンパク質を作り出した（ｃＴｘＡＢと称される、図２のパネルＢ）。ｃＴｘＡＢはＤ９７を含まず、この理由のために、培養細胞及び動物に対して無毒である。それは、野生型ＴｃｄＡと同じくらい効果的に培養細胞に結合し（図３のパネルＤ）、そのため、これらのタンパク質は両方とも、受容体結合ドメインを含む。単一のタンパク質ｃＴｘＡＢは、ＴｃｄＡ（ＲＢＤ）の免疫優勢及び免疫刺激のドメイン、及びＴｃｄＢのほとんどの特徴を含み、それ故、評価するには恐らく有効なワクチン候補である。
精製を促進し、精製されたバージョンを検査するために、さらなるアフィニティータグ（８−アミノ酸Ｓｔｒｅｐタグ）を、Ｈｉｓ６タグの上流に設置した（図２のパネルＢ）。トロンビンプロテアーゼ切断部位を設置し（図２のパネルＢ）、それによって、必要に応じた、Ｓｔｒｅｐタグ及びＨｉｓ６タグの両方の除去を可能にし、これは結果的に、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素からのアミノ酸配列のみを含むキメラタンパク質を生じる。
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ変異体ホロトキシン（ａＴｃｄＡ及びａＴｃｄＢ）を、野生型組換え毒素を使用して生成した（Ｙａｎｇ， Ｇ ｅｔ ａｌ． ２００８ ＢＭＣ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ８： １９２、その全体が引用によって本明細書に組み込まれる）。
点変異を含む変異体ＧＴドメイン遺伝子（ＴｃｄＢに関するＷ１０２Ａ及びＤ２８８Ｎ；及びＴｃｄＡに関するＷ１０１Ａ、Ｄ２８７Ｎ、及びＷ５１９Ａ）を合成し、各野生型毒素遺伝子において対応するＧＴドメイン遺伝子を置換するために操作した。ＴｃｄＢのＲＢＤをＴｃｄＡのＲＢＤと置換することによって、ＴｘＢ−Ａｒを作り出した。ＧＴドメインをａＴｃｄＢのドメインと置換することによって、ｃＴｘＡＢを生成した。
完全長ＴｃｄＡ及びＴｃｄＢ遺伝子を、シャトルベクターｐＨｉｓ１５２２へクローン化し（それぞれ、ｐＨｉｓ−ＴｃｄＡ及びｐＨｉｓ−ＴｃｄＢ）、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍにおいて組換えホロトキシンを発現した（Ｙａｎｇ， Ｇ ｅｔ ａｌ． ２００８ ＢＭＣ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ８： １９２）。点変異を、基質ウリジン二燐酸グルコース（ＵＤＰ−Ｇｌｃ）結合に関係する保存アミノ酸へ導入し、ＧＴ欠損のホロトキシンを生成した。ＧＴ変異体ホロトキシンＡを生成するために、特有な制限酵素（ＢａｍＨＩ）部位を、オーバーラップＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ＰＣＲ）を使用して、ＧＴをコード化する配列とＣＰＤドメインの間で設置した。使用される主要なセットは次のとおりである：
ｐＨｉｓ−Ｆ，５’−ＴＴＴＧＴＴＴＡＴＣＣＡＣＣＧＡＡＣＴＡＡＧ−３’（配列番号１）、
Ｂａｍ−Ｒ，５’−ＴＣＴＴＣＡＧＡＡＡＧＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＧ−３’（配列番号２）、
Ｂａｍ−Ｆ，５’−ＴＧＧＴＧＧＡＴＣＣＣＴＴＴＣＴＧＡＡＧＡＣ−３’（配列番号３）、及び
Ｂｐｕ−Ｒ，５’−ＡＣＴＧＣＴＣＣＡＧＴＴＴＣＣＣＡＣ−３’（配列番号４）。
最終的なＰＣＲ生成物はＢｓｒＧＩとＢｐｕ１０Ｉによって消化され（ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｗｉｔｈ）、ｐＨｉｓ−ＴｃｄＡ内での対応する配列を交換するために使用された。結果として生じるプラスミドを、ｐＨ−ＴｘＡ−ｂと称した。ＧＴにおける三重変異（Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ｎ、及びＷ５１９Ａ）をコード化する配列を、Ｇｅｎｅａｒｔ（Ｇｅｒｍａｎｙ）によって合成し、ＢｓｒＧＩ／ＢａｍＨＩ消化（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）を介してｐＨ−ＴｘＡ−ｂへクローン化した。変異体ホロトキシンＢの構成物を生成するために、２つの点変異（Ｗ１０２Ａ及びＤ２８８Ｎ）を含む、ＢｓｒＧＩとＮｈｅＩの間の配列を合成し、同じ制限酵素部位でｐＨｉｓ−ＴｃｄＢに挿入し、結果的にプラスミドｐＨ−ａＴｃｄＢを生じた。
キメラＴｘＢＡｒを生成するために，特有なＲＥ Ａｇｅ Ｉ部位を、ｐＨｉｓ−ＴｃｄＢにおけるアミノ酸の配列を変えることなく、ＴＭＤ及びＲＢＤの間の位置で作り出した。その後、ＴｃｄＡのＲＢＤをコード化する遺伝子を、プライマー：
ＴｘＡ−Ａｒ−Ｆ：５’−ＡＡＴＴＡＣＣＧＧＴＴＴＴＡＡＣＴＴＡＧＴＡＡＣＴＧＧＡＴＧＧＣ−３’（配列番号５）及び
ＴｘＡ−Ａｒ−Ｒ：５’−ＡＡＴＴＧＣＡＴＧＣＴＧＧＴＡＣＣＣＴＣＣＡＴＡＴＡＴＣＣＣＡＧＧＧＧＣＴＴＴＴＡＣＴＣＣ−３’（配列番号６）、
を使用して増幅させ、及びＴｃｄＢのＲＢＤ配列を、ＡｇｅＩ／ＫｐｎＩ消化を介してＴｃｄＡのＲＢＤ配列と置換し、プラスミド（ｐＨ−ＴｘＢ−Ａｒ）を生成した。キメラｃＴｘＡＢを生成するために、ｐＨ−ＴｘＢ−ＡｒにおけるＸｈｏＩ／Ｂｐｕ１０Ｉフラグメントを、フラグメントを運ぶｐＨ−ａＴｃｄＢからのＷ１０２Ａ及びＤ２８８Ｎ変異によって置換した。
完全長変異体毒素及びキメラ遺伝子を運ぶ、結果として生じる構築物を、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍを形質転換するために使用し、変異体ホロトキシン（図４）を、以前に記載されたのと同じ方法を使用して、発現させ精製した（Ｙａｎｇ， Ｇ ｅｔ ａｌ． ２００８ ＢＭＣ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ８： １９２、引用によって本明細書に組み込まれる）。
これらの変異タンパク質を、それぞれ、ａＴｃｄＡ、及びａＴｃｄＢと称した（図４のパネルＡ及びＢ）。ＴｃｄＡ及びａＴｃｄＢは、それらの天然の構造を維持することが観察され（図５のパネルＡ、Ｂ及びＣ）、両方の変異タンパク質は、事実上すべてのグルコシルトランスフェラーゼ活性（図６）、細胞毒性（図７のパネルＡ及びＢ）及びインビボの毒性（図８）を失ったことが見出された。従って、本明細書のＧＴ欠損のホロトキシンは、本質的に無毒であると考えられた。
ＴｃｄＡ及びＴｃｄＢの両方に対する抗毒素が、ＣＤＩからの十分な保護に必要であるため、両方の毒素に対する強力な中和抗体を誘発することができる単一の抗原を作り出した。ＴｃｄＡの受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）は、毒素の免疫優勢ドメインであり、そのレクチンのような構造により強力なアジュバント活性を調べる（ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）（Ｃａｓｔａｇｌｉｕｏｌｏ， Ｉ ｅｔ ａｌ． ２００４ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７２： ２８２７）。それ故、ＴｃｄＢのＲＢＤを、ＴｃｄＡのＲＢＤと置換し、結果的に、ＴｘＢＡｒと称されるキメラ毒素を生じた（図４のパネルＣ）。驚いたことに、ＴｘＢ−Ａｒは、グルコシル化活性（図６）、強力な細胞毒性（図９）、及び示される強力な炎症誘発性活性を保持し、それにより、クロストリディウムのグルコシル化毒素の特性を保持した。ＧＴ変異体を操作するために、２つの点変異（Ｗ１０１Ａ及びＤ２８８Ｎ）を導入し、結果として生じるキメラタンパク質を、ｃＴｘＡＢと称した（図４のパネルＤ）。ａＴｃｄＢが構造上その野生型に類似しているため（図５のパネルＢ及びＣ）、２つの変異がこのキメラタンパク質の全体的な構成を変更しそうにはなく、従って、ｃＴｘＡＢは、毒素のような構成を有するが、無毒なままである（図９）。
＜実施例５．免疫原の安全性＞
野生型ＴｃｄＢは、一般に、ＴｃｄＡよりもさらに多くの細胞毒性がある。ＧＴドメインにおける２つの点変異は、５ｌｏｇまでグルコシルトランスフェラーゼ活性を減少させ、結果として生じるａＴｃｄＢは、マウスに対して無毒であった。ａＴｃｄＢのＬＤ１００用量の１０００倍（免疫感作に使用される用量の約１００倍）でチャレンジしたマウスは、疾患の徴候を示さず、どれも死ななかった（図３のパネルＣ）。毒性の全損失を確かなものにするために、さらなる点変異を、ａＴｃｄＡに導入した。ｃＴｘＡＢは、Ｄ９７ドメインを欠失しており、従って無毒である。それ故、ａＴｘＡＢ及びｃＴｘＡＢの両方は、非常に安全な免疫原である。候補ワクチンを設計し評価するときに安全性が重要な問題であるため、ａＴｘＡＢ及びｃＴｘＡＢの両方の安全性を、マウスにこれらのタンパク質の高用量を腹腔内に投与する（これによって、これらの組換えタンパク質の急速な吸収が可能となる）ことによってさらに評価した。マウスに、ａＴｘＡＢ又はｃＴｘＡＢの確立された最適な免疫感作の用量の少なくとも１００倍を注入し、各免疫原を、１０匹のマウスの群において確認した。マウスを、対照動物と比較して、任意の異常性に関してモニタリングした。これは、食欲不振、嗜眠、体重の減少などを含む。ａＴｘＡＢ又はｃＴｘＡＢの最適な免疫感作の用量の少なくとも１０倍である安全域を確立した。
＜実施例６．検出可能なエンドトキシン及びＴＬＲリガンドを欠いているＢ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍからの精製された組換え毒素＞
ワクチンとして組換えタンパク質を使用するために、細菌からのエンドトキシン及び他の汚染物質を含まない純粋なタンパク質を得ることが重要である。Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ発現系を使用する利点の１つは、それがエンドトキシン（ＬＰＳ）を含まないということである。しかしながら、グラム陽性細菌は、組換えタンパク質調製物を汚染し得るＴＬＲ２リガンドが豊富にある。それ故、精製スキームを本明細書で発展させ、銀染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の任意の目に見える汚染物質タンパク質バンドを欠いた高純度の組換え毒素タンパク質を得た（Ｙａｎｇ， Ｇ． ｅｔ ａｌ． ２００８ ＢＭＣ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ８：１９２）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で目に見えないＴＬＲリガンド汚染物を、高感度のバイオアッセイによって評価した。操作されたモノクローナルのｈＴ２Ｙ細胞は、ＮＦ−κＢプロモーター下でヒトＴＬＲ２及び分泌性のアルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を発現する。ＴＬＲ２の活性化で、細胞は、ホスファターゼ基質を使用して容易に測定され得るＳＥＡＰを発現する。Ｈｉｓ−タグアフィニティー精製の１つの工程は、ＴＬＲ２リガンド汚染物質の除去に失敗した（図１０のパネルＡ及びＢ）。さらなる精製（ＴｃｄＡ及びＴｃｄＢに関する、それぞれ、チログロブリンアフィニティー及びイオン交換クロマトグラフィー）は、結果的に、ＳＥＡＰ生成を刺激しない高度に精製された毒素を生じた。陽性対照Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは、ＳＥＡＰの生成を明らかに誘発した（図１０のパネルＡ及びＢ）。
Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ培養は、時に、エンドトキシンＬＰＳの豊富なソースである、Ｅ．ｃｏｌｉなどの他の細菌に汚染される。それ故、ＴＬＲ４汚染を、類似したバイオアッセイをまた使用して検査した。組換え毒素調製物において検出可能なＴＬＲ４リガンドがなかったことを結果は示した。
従って、高度に精製された組換え毒素は、ＴＬＲ２又はＴＬＲ４のいずれに関しても検出可能なリガンドを含んでいなかった。ヒトにおいて敗血症性ショックを引き起こす、ＬＰＳなどの、ＴＬＲリガンドの欠如は、本明細書に使用される毒素タンパク質が、純粋であり、汚染物を欠いていることを示す。
＜実施例７．毒素のグルコシルトランスフェラーゼ活性＞
変異体毒素のＧＴ活性欠乏を、無細胞のアッセイにおいてＲｈｏ ＧＴＰａｓｅ Ｒａｃ１をグルコシル化するそれらの能力の欠如によって評価した。Ｖｅｒｏ細胞（モドリザルの腎臓上皮細胞）のペレット剤を、グルコシル化した緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｎＣｌ２及び２ｍＭのＭｇＣｌ２）中に再懸濁し、注射器（２５Ｇ、注射針を介する４０回の挿入）によって溶解した。遠心分離（１６７，０００ｇ、３分）後、上清の後核（ｐｏｓｔｎｕｃｌｅａｒ）細胞溶解物を得た。グルコシル化アッセイを行なうために、細胞溶解物を、３７℃で示された時間、ＴｃｄＡ、ＴｃｄＢ、又はそれらの変異タンパク質（毒素の終末濃度は１μｇ／ｍｌであった）によってインキュベートした。反応を、ＳＤＳ−サンプル緩衝液中で１００℃で５分間加熱することによって終了した。Ｒａｃ１グルコシル化の程度を測定するために、溶解物を、１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、ニトロセルロース膜上に移動させた。Ｒａｃ１のグルコシル化されていない形態を明確に認識する抗体（クローン１０２、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、又は対照抗βアクチン（クローンＡＣ−４０、Ｓｉｇｍａ）、及びＨＲＰ共役の抗マウスＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、それぞれ、一次及び二次抗体として使用した。
＜実施例８．野生型及び変異体の毒素の円偏光二色性（ＣＤ）分光法＞
２２℃での１ｃｍの石英セル（ｑｕａｒｔｚ ｃｅｌｌ）における１．０ｎｍの帯域幅、及び０．１ｃｍの路程を使用する０．５ｎｍの走査工程とともに、１９０〜２６０ｎｍの波長領域におけるＡｖｉｖ ６２分光旋光計上でＣＤスペクトルを記録した。タンパク質濃度は、５０〜２００μｇ／ｍｌの範囲にあった。各々の場合において、少なくとも５つのスペクトルを、溶質の寄与に関して、蓄積し、滑らかにし、平均化し、修正した。
＜実施例９．細胞変性及び細胞毒性のアッセイ＞
毒素の細胞変性及び細胞毒性の活性を、以前に記載されたようにアッセイした（Ｈｅ， Ｘ ｅｔ ａｌ． ２００９ａ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７７：２９４）。９６ウェルのプレート中に接種されたＣＴ−２６細胞（１０３／ウェル）を、野生型又は変異体の毒素によって処置した。細胞に対する毒素の細胞変性効果を評価するために、細胞の形態学的変異を、位相差顕微鏡を使用して観察した。ＭＴＴアッセイを、毒素の細胞毒性活性を測定するために行った。７２時間のインキュベーション後、１０μｌのＭＴＴ（５ｍｇ／ｍｌ）を、各ウェルに加え、プレートを、３７℃でさらに２時間インキュベートした。フォルマザンを、酸性イソプロパノールによって可溶化し（無水イソプロパノール中の０．４ＮのＨＣｌ）、５７０ｎｍでの吸光率を、９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して測定した。細胞の生存率を、治療されていない対照ウェルと比較した生存のパーセンテージとして表した。その処置を３回繰り返し、三つ組のウェルを、各処置における細胞変性の変化及び細胞毒性に関して評価した。
＜実施例１０．ＴｃｄＡ及びＴｃｄＢに対する抗体の生成＞
ＴｃｄＡに特異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）を生成し、それは、Ａ１Ｈ３、ＩｇＧ２ａアイソタイプ、またＡ１Ｂ１及びＡ１Ｅ６、ＩｇＧ１アイソタイプを含んだ。これらの抗体は、天然のＴｃｄＡを認識し（図１１のパネルＡ）、ＴｃｄＢと交差反応しなかった。
これらの抗体の結合エピトープを位置付けるために、ｔｃｄＡ及びｔｃｄＢの両方の完全長を覆う非重複遺伝子のフラグメントを、ｐＥＴ３２ａベクターへクローン化した。ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロットは、Ａ１Ｂ１及びＡ１Ｈ３が、ＴｃｄＡ Ｃ末端フラグメントＦ４（アミノ酸１８３９から最後まで）を認識し、Ａ１Ｅ６が、フラグメントＦ３（アミノ酸１１８５から１８３８まで）及びＦ４を認識したことを示した（図１１のパネルＢ）。Ａ１Ｈ３は、ＦｃγＲＩ発現細胞上のＴｃｄＡ細胞毒性を本質的に増強することができ、ここで、Ａ１Ｅ６及びＡ１Ｂ１は、そのような活性を有さない（Ｈｅ， Ｘ． ｅｔ ａｌ． ２００９ａ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７７：２２９４−２３０３、その全体が引用によって本明細書に組み込まれる）。
ＴｃｄＢに対するいくつかのＩｇＧ及びＩｇＭのｍＡｂｓを生成し、ウサギ抗毒素多クローン性抗体を、ＴｃｄＡ又はＴｃｄＢのいずれかに対抗するように生成した。これらの抗体を生成するために使用される抗原は、高度に精製されたｒＴｃｄＡ又はｒＴｃｄＢであった。多クローン性抗体は、天然の毒素に対して特異的に結合し、それらの細胞毒性活性を中和する（Ｈｅ， Ｘ． ｅｔ ａｌ． ２００９ａ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７７：２２９４−２３０３、その全体が引用によって本明細書に組み込まれる）。これらのモノクローナル及び多クローン性抗体を、本明細書の実施例において示される様々なアッセイに使用した。
＜実施例１１．ＴｃｄＡに誘発された全腸炎を分析するためのマウスの回腸ループモデル＞
胃内に投与されるＴｃｄＡは、動物において重度の全腸炎を誘発し、ＴｃｄＢは、動物において腸管毒性を有さない（Ｌｙｅｒｌｙ， Ｄ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． １９８５ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ４７：３４９−３５２）。ＴｃｄＡに誘発された全腸炎を分析するために、マウスの回腸ループモデルを、以前に報告された方法に従って、確立した（Ｃａｖａｌｃａｎｔｅ， Ｉ． Ｃ． ｅｔ ａｌ． ２００６ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７４：２６０６−２６１２）。
ＴｃｄＡは、異なるマウス株の間の可変的な感受性を有する、ＣＤ１、１２９ＳＶ、ＮＩＨ Ｓｗｉｓｓ、Ｂａｌｂ／ｃ、及びＣ５７ＢＬ／ｃマウス中の結紮されたマウスの回腸ループにおける液体貯留及び組織学的変化を誘発した。ＴｃｄＢは、マウスにおいて腸管毒性を有さず、結紮されたループにおいて炎症又は組織損傷を誘発しない。
腸のＴＬＲリガンドが炎症反応の一因であるかどうかを決定するために、最良のＴＬＲシグナル伝達に反応しない骨髄分化因子８８（ＭｙＤ８８）のノックアウトマウスを利用した（Ｄｕｎｎｅ， Ａ． ｅｔ ａｌ． ２００３ Ｓｃｉ ＳＴＫＥ ２００３：ｒｅ３）。ＭｙＤ８８ノックアウトマウスは、ＴｃｄＡに誘発された腸炎に対する野生型（Ｃ５７ＢＬ／６）と同じくらい感受性があることが見出された。５０μｇの組換えＴｃｄＡのＭｙＤ８８ノックアウトマウスの結紮された回腸ループへの注入は、腸における炎症反応を誘発した（図１２）。かなりの液体貯留が、ＰＢＳ対照ではなく、ＴｃｄＡを注入された回腸ループにおいて見られた（図１２のパネルＡ）。病理組織検査は、ＰＢＳ注入ではなく、ＴｃｄＡ後に、損傷を受けた絨毛及び免疫細胞の流入（図１２のパネルＢ）及び（図１２のパネルＣで矢印によって示された）幾つかが腸管腔へ移動する好中球を示した。腸液貯留、炎症、及び粘膜の損傷を、ＴｃｄＡに対するウサギ抗血清によって完全に遮断した。これらのデータは、ＭｙＤ８８アダプタータンパク質が、マウスにおけるＴｃｄＡ媒介性の腸炎において役割を果たさないことを示す。
＜実施例１２．ヒトにおけるＣＤＩの症状に似たＧＢ子ブタモデルにおける疾患の発症＞
大腸炎に関係するＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの粘膜の異常性を密接に反映するノトバイオートの子ブタモデルを確立した（Ｓｔｅｅｌｅ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． ２０１０ Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ２０１：４２８）。１０６の芽胞又は１０８の栄養細胞によって日齢２日目に（ａｔ ｔｗｏ ｄａｙｓ ｏｆ ａｇｅ）チャレンジされた子ブタは、回結腸の接合から直腸まで伸びる結腸間膜の浮腫の劇的な病変を伴って、２〜３日以内に急性下痢を進行させ、螺旋状の結腸は、しばしば膨張し、粘膜の巣状壊死を伴って出血した。より低い用量によって日齢５〜７日目にチャレンジされた動物は、典型的な偽膜性大腸炎、炎症及び深刻な粘膜損傷を伴う、より慢性的な疾患を進行させ、間欠性の下痢及び重量減少を発症した。これらの疾患の発症の特性は、ヒトＣＤＩの症状に似ていた。従って、子ブタは、慢性疾患からの候補ワクチンの粘膜保護を評価するための有用なモデルを示す（図１３のパネルＡ及びＢ）。
＜実施例１３．全身性の毒素チャレンジからの保護＞
全身性の毒素チャレンジからの保護を行った。各免疫原に対する粘膜の免疫感作によって誘発された全身性の毒素チャレンジからの保護のレベルを評価するための、本明細書の実施例において確立された標準チャレンジ用量としてＬＤ５０ｉを使用した。
粘膜の免疫感作は、非経口の免疫感作のような類似したレベルの保護を誘発することが観察され、その中で、５０％のマウスが、ＬＤ５０ｉ用量の各野生型毒素、又は一緒に与えられた２つの毒素のチャレンジから生存した。５０％以上のマウスが死亡することが観察されると、用量最適化を行った。
ａＴｘＡＢ又はｃＴｘＡＢで免疫化されたマウス（約２０ｇの体重）が、最後の免疫感作の１週間後に、野生型のＴｃｄＡ、ＴｃｄＢ、又はＴｃｄＡとＴｃｄＢの混合物のいずれかの致死量（各毒素に対して１００ｎｇ）によってＩＰでチャレンジされた後に、野生型毒素の致死量でのチャレンジからマウスを保護する強力な抗体反応を生成した。ａＴｃｄＢで免疫化されたマウスは、ＴｃｄＡではなく、野生型ＴｃｄＢの致死量のチャレンジから十分に保護されることが観察された（図１４のパネルＢ及びＣ）。さらに、ｃＴｘＡＢでのワクチン接種は、いずれかの毒素によって致死的チャレンジからマウスを保護することが観察された（図１５のパネルＢ及びＣ）。ａＴｃｄＡとａＴｃｄＢの混合物によって免疫化されたマウスは、本明細書のデータに基づいて、両方の毒素の活性から十分に保護されることが予期され、毒素の各々のチャレンジからのこの保護が、インビボで観察された。
＜実施例１４．ａＴｃｄＢ免疫感作から結果として生じる血清中和力価及びインビボの保護＞
ａＴｃｄＢで免疫化されたマウスからの血清が、培養細胞においてＴｃｄＢの細胞毒性を中和することができるかどうかを評価するために、ＴｃｄＢに対して高感度であるマウスの腸の上皮細胞株ＣＴ２６を使用した。中和力価を、所望の濃度で毒素によって誘発される細胞球状化の遮断に失敗する血清の最大希釈の逆数として定義する。この濃度は、すべてのＣＴ２６細胞が、２４時間のＴｃｄＢ処置後に球状化するのを引き起こす、毒素の最小用量の４倍の濃度である。２４時間の毒素処置後に１００％のＣＴ２６細胞の球状を引き起こすＴｃｄＢのこの最小量（０．０６２５ｎｇ／ｍｌ）を確認した。それ故、ＴｃｄＢの最小量（０．２５ｎｇ／ｍｌ）の４倍である量を、その後、ＣＴ２６細胞に適用した２倍希釈した血清サンプルと混合した。
２４時間のインキュベーション後に得られたデータは、ａＴｃｄＢで免疫化されたマウスからの血清が、平均（ｎ＝５）で１対６０８に希釈されるように、遮断活性を失った。それ故、ａＴｃｄＢで免疫化されたマウスからの血清の計算した中和力価は、６０８であった。対照的に、トキソイドで免疫化されたマウスからの血清の計算した中和力価は、２４であった（図１４のパネルＡ）。従って、ａＴｃｄＢ免疫感作によって誘発された抗体の中和活性は、トキソイドによって誘発された中和活性より著しく高かった。
さらに、ａＴｃｄＢによって免疫化されたマウスを、野生型ＴｃｄＢでの致死的ＩＰチャレンジから完全に保護した（図１４のパネルＢ）。マウスが最後の免疫感作の２か月後でさえＴｃｄＢでの再チャレンジから生き残ったため、この抗ＴｃｄＢ免疫は永続的であることが観察された。免疫化されたマウスが、ＴｃｄＡの致死量でのチャレンジから生き残らなかったため、この防御免疫は、特異的であることが観察された（図１４のパネルＣ）。トキソイド免疫感作は、ａＴｃｄＢ免疫感作よりもかなり低い保護を提供した。トキソイドで免疫化されたマウスは、対照ＰＢＳで処置された免疫化されていないマウスより長く生き残ったが、すべてのマウスが２４時間以内に死んだ（図１４のパネルＢ）。これらのデータはまた、ＴｃｄＡ及びＴｃｄＢが、アミノ酸配列及びドメイン構造の両方において非常に類似しているが、それらの間にほとんど交差反応がなく、抗原性的に異なることを示す。それ故、両方の毒素に対する抗体を誘発するワクチンが、十分な保護を提供するために必要である。
＜実施例１５．ＴｃｄＡ及びＴｃｄＢの両方に特異的な抗体及び保護反応を誘発するｃＴｘＡＢ免疫感作＞
ＴｃｄＡの受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）は、複数のレクチン結合の繰り返しを含み、強力な免疫刺激及びアジュバントの活性を有する（Ｃａｓｔａｇｌｉｕｏｌｏ， Ｉ． ｅｔ ａｌ． ２００４ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７２：２８２７−２８３６； Ｙｅｈ， Ｃ． Ｙ． ｅｔ ａｌ． ２００８ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７６：１１７０−１１７８）。ＴｃｄＢは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの有毒な因子である。これらの理由で、ＴｃｄＢのＲＢＤをＴｃｄＡのＲＢＤと置換することによって、キメラ毒素タンパク質を設計した（図２のパネルＢ）。さらに、ＴＭＤのＣ末端における小さな欠失（ＴｃｄＢの毒性にとって不可欠である９７のアミノ酸）を作り出し、それ故、結果として生じるｃＴｘＡＢは無毒である（図２のパネルＢ）。
ｃＴｘＡＢでのマウスの免疫感作は、ＴｃｄＡ及びＴｃｄＢの両方に対するＩｇＧ抗体反応を誘発することが観察された（図１５）。相当量の抗ＴｃｄＡ及び抗ＴｃｄＢが、最初の追加免疫後に誘発され、第２の追加免疫は、ＴｃｄＡ又はＴｃｄＢのいずれかに対する抗体反応の規模を増大させなかった（図１５のパネルＡ）。驚いたことに、ｃＴｘＡＢでのマウスの免疫感作は、ＴｃｄＡ又はＴｃｄＢのいずれかによる致死的な全身性のチャレンジからの十分な保護を提供した。ｃＴｘＡＢで免疫化されたマウスはすべて、１００ｎｇのＴｃｄＡ又はＴｃｄＢのいずれかのＩＰチャレンジから生き残り、プラセボで免疫化されたマウスはすべて死んだ（図１５のパネルＢ及びＣ）。ＴｃｄＡのチャレンジ用量を２００ｎｇに増加させることによって、ｃＴｘＡＢで免疫化されたマウスの死亡につながったが、これらのマウスは、１００ｎｇのＴｃｄＡでチャレンジされた対照マウスと比較して、かなり長く生き残った（ｐ＝０．００８９）（図１５のパネルＢ）。
＜実施例１６．ＧＴ欠損のホロトキシン（ａＴｃｄＡ及びａＴｃｄＢ）は、野生型毒素と同様に細胞内に結合し侵入する＞
ａＴｃｄＡ及びａＴｃｄＢが、ＧＴドメインに位置する２又は３点のアミノ酸変化しか有さず、受容体結合ドメインがインタクトであり、不変であるため、これらのタンパク質は、野生型タンパク質に類似した細胞表面に対する親和性を有する。蛍光免疫染色によって測定されるように、４℃で、ａＴｃｄＡは、野生型ＴｃｄＡと同様にＲＡＷ２６４．７細胞へ結合することが観察された。共焦点顕微鏡検査分析に従う特異的なモノクローナル抗体（Ａ１Ｈ３）染色によって測定されるように、エンドサイトーシスを可能にする温度である、３７℃で３０分間ＲＡＷ２６４．７細胞に毒素を晒し、結果として、ａＴｃｄＡ及びＴｃｄＡの各々が、比較的ＲＡＷ２６４．７細胞へと内在化されるようになる（図１６）。これらのデータは、ＧＴドメインでの点変異が、ホロトキシンの細胞結合及び内在化に影響を与えないことを示す。キメラ毒素ｃＴｘＡＢは、ＴｃｄＡのインタクトなＲＢＤを有し、従って、それは野生型ＴｃｄＡと同様に細胞を培養するために結合する（図３のパネルＤ）。
＜実施例１７．非経口の免疫感作及び抗体反応＞
マウスの群を、アジュバントとしてのミョウバンを含む、ａＴｘＡＢ、ｃＴｘＡＢ、又はトキソイド（ＴｃｄＡとＴｃｄＢの混合物）の用量によってＩＰで免疫化する。ＩＰ免疫感作及び皮下の免疫感作を、それぞれ実行し、類似した結果がこれらの経路から得られることが予期される。トキソイド及びａＴｘＡＢの両方は、等しい量の各々の毒素タンパク質を含み、初回量は、１回の注入当たり総タンパク質の５μｇであり、これは、前の免疫感作で使用された用量に従う。血清サンプルを集め、抗毒素（ＴｃｄＡ及びＴｃｄＢの両方）の反応を、本明細書の実施例に記載されるような標準ＥＬＩＳＡを使用して測定する。いくつかのパラメーターを以下の群の中で評価する：抗体反応の速度及び規模、ＩｇＧサブタイプ及びＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比率。ａＴｃｄＢ免疫感作は、主としてＩｇＧ１反応を誘発した（図１７）。任意の特定の理論又は作用の機構に限定されずに、ａＴｘＡＢ又はｃＴｘＡＢのいずれかでの免疫感作は、ＩｇＧ１反応を優勢に誘発することが予期される。Ｈｉｓ６タグ及びＳｔｒｅｐタグに対する起こり得る抗体反応の分析を行う。両方のタグは、非常に小さい大きさであり、それ故、それほど免疫優勢ではないようである。精製された天然のＴｃｄＡ及びＴｃｄＢを使用して、毒素に特異的な抗体を、タグに特異的な抗体と区別する。タグを有する、関連性がない組換え抗原も、２つの間の区別の助けとなる。トロンビン認識部位が、ｃＴｘＡＢに設置されたため、タグもトロンビンプロテアーゼによって取り除かれ得る（図３のパネルＢ）。トロンビン認識配列が、必要に応じて、ａＴｃｄＡ及びａＴｃｄＢへと同様に設置され得る。
＜実施例１８．ａＴｃｄＢ免疫感作によって誘発されたＩｇＧサブクラス＞
ａＴｃｄＢ又はトキソイドの免疫感作によって誘発されたＩｇＧサブクラスを測定した。ａＴｃｄＢ又はトキソイドのいずれかでのマウスの免疫感作は、著しい抗ＴｃｄＢ ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ｂ反応を誘発した。対照的に、抗ＴｃｄＢ ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｃ、及びＩｇＧ３などの、他のＩｇＧサブタイプの反応は低かった（図１７のパネルＡ）。ａＴｃｄＢで免疫化されたマウスからの血清の連続希釈は、結果的に、１：３２，０００の希釈での抗ＴｃｄＢ ＩｇＧ１の力価の損失につながり、抗ＴｃｄＢ ＩｇＧ２ａは、１：２０００まで下がっただけであった。これらのデータは、ＩＰで与えられた免疫原ａＴｃｄＢが、主としてＴＨ−２型反応を誘発したことを示す。
＜実施例１９．急速なＩｇＧ反応を誘発した、ａＴｃｄＢでのマウスの免疫感作＞
抗生物質での処置及び／又は入院の下など、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染の高いリスクを有する人々は、ワクチン接種対象の被験体である。急速な防御免疫を誘発することができるワクチンが、特に入院患者において望まれる。ａＴｃｄＢでのワクチン接種を、急速な抗体反応を誘発する能力に関して検査した。図１８は、ａＴｃｄＢでのマウスの免疫感作が、２回目の免疫感作後に強力なＩｇＧ反応を生じさせたことを示す。対照的に、トキソイド免疫感作は、３回目の免疫感作後（初回抗原刺激の２８日後）にだけ検出可能なＩｇＧ反応を生じさせた。
＜実施例２０．ａＴｃｄＢ免疫感作によって生じた抗体は、ホロトキシンのＮ末端及びＣ末端の両方に反応する＞
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素の大きなサイズ及び毒性のために、ＧＴドメインを欠き、それ故無毒である組換え毒素フラグメントは、潜在的なワクチン候補となりそうである。ＴｃｄＡの完全又は部分的な受容体結合ドメインを含むＣ末端フラグメントは、免疫優勢であることが報告され、それ故、抗毒素抗体反応を誘発するために免疫原として使用されてきた（Ｋｉｎｋ， Ｊ． Ａ． ｅｔ ａｌ． １９９８ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６６：２０１８−２０２５； Ｓａｕｅｒｂｏｒｎ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． １９９７ ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ １５５：４５−５４； Ｗａｒｄ， Ｓ． Ｊ． ｅｔ ａｌ． １９９９ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６７：５１２４−５１３２）。しかしながら、酵素ドメインを有するそれらのホロトキシンのＮ末端はまた、中和抗体を誘発することができる（Ｂａｂｃｏｃｋ， Ｇ． Ｊ． ｅｔ ａｌ． ２００６ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７４：６３３９−６３４７）。ａＴｃｄＢでのマウスの免疫感作は、ホロトキシンの全体にわたって見出されるＦ１からＦ４のフラグメントに特異的なエピトープを有する抗体を生じさせた（図１９）。従って、マウスのａＴｃｄＢのワクチン接種は、抗体反応の広域スペクトルを誘発した。
＜実施例２１．ａＴｘＡＢ又はｃＴｘＡＢによって免疫化されたマウスの抗体及び保護反応＞
ａＴｘＡＢ又はｃＴｘＡＢによって非経口的に免疫化されたマウスの抗体及び保護反応を調べ、ホルマリンで不活性化された野生型ＴｃｄＡ及びＴｃｄＢ（トキソイド）と比較した。マウスの群を、アジュバントとしてミョウバンと混合された、ａＴｘＡＢ、ｃＴｘＡＢ、又はトキソイドの所望の用量で３回、腹腔内（ＩＰ）又は皮下で（ＳＣ）免疫化する。血清抗体反応を、各々の免疫感作の後に測定する。最後の免疫感作の１週間後に、マウスを、野生型毒素によってＩＰでチャレンジし、チャレンジに対する保護反応を、プラセボ（ビヒクルにアジュバントを加える）で免疫化した群と比較する。免疫原の用量最適化を実行し、その後、マウスに与えられた投与量を２倍及び半分にし、各々の免疫原の血清抗体反応の最も高いレベルを誘発するのに必要な最も少ない量の抗原を確立する。２つの免疫原の安全性を、用量最適化の後に確立された最適な免疫感作用量の１０〜１００倍によってマウスをチャレンジすることによって評価し、致死率を含む、毒性徴候及び他の異常性に関してモニタリングする。免疫化したマウスを、野生型毒素によってチャレンジし、各毒素及び２つの組み合わせに対する対応するＬＤ５０ｉを確立する。細胞毒性アッセイを、各々の野生型毒素に対する抗体の中和力価を測定するために行った。これらのアッセイは、全身性の免疫感作によって達成された最適な免疫感作用量、及び保護のこのレベルに必要な計算されたＬＤ５０ｉ毒素チャレンジ用量を確立し；無毒の形態は、トキソイドより効果的である［と予期される？］。
＜実施例２２．ａＴｃｄＢでの免疫感作は、トキソイドより大きなＩｇＧ反応を誘発した＞
ホルムアルデヒドで不活性化された毒素（トキソイド）が、ワクチンとして使用され、動物モデルにおいてＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ関連疾患に対して有効であると分かった（Ｓｏｕｇｉｏｕｌｔｚｉｓ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． ２００５ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １２８：７６４−７７０； Ｔｏｒｒｅｓ， Ｊ． Ｆ． ｅｔ ａｌ． １９９５ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６３：４６１９−４６２７）。任意の特定の理論又は作用の機構に限定されることなく、本明細書のデータは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素のトキソイド形態が、天然のホロトキシンと比較して、立体構造の抗原を欠き、同様に無毒のホロトキシンと比較しても、立体構造の抗原を欠くことを示す。
トキソイドＴｃｄＢとａＴｃｄＢは、抗体反応を誘発するそれらの能力に関して比較された。アジュバントとしてミョウバンを含む、等しい量（１回の注入当たり５μｇ）のトキソイド又はａＴｃｄＢによって、マウスを免疫化した。３回の免疫感作後に、抗ＴｃｄＢ ＩｇＧのＥＬＩＳＡ結果（図２０）は、ａＴｃｄＢが、トキソイドよりも著しく高い量の毒素に特異的なＩｇＧを誘発したことを示す。
研究は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの主要な毒性因子としてＴｃｄＢの重要性を強調した。ａＴｃｄＢの免疫原性を、トキソイドＴｃｄＢ（トキソイドＢ）の免疫原性と比較した。ａＴｃｄＢでの全身性の免疫感作は、トキソイドＢよりも強力なＩｇＧ反応及び本質的に高い中和活性を誘発した（図２１のパネルＡ及びＢ）。ａＴｃｄＢで免疫化されたマウスを、致死的な野生型ＴｃｄＢのチャレンジから十分に保護し、一方、トキソイドＢで免疫化されたマウスはすべて、全身感染の徴候を示し、マウスの７０％は４８時間以内に死んだ（図２２のパネルＣ）。従って、ａＴｃｄＢ免疫感作は、トキソイドＢよりも全身性の毒素チャレンジから有意により保護を誘発した（ｐ＝０．００１４）。
ａＴｃｄＢの高い免疫性及び毒素ＴｃｄＡとＴｃｄＢの間のかなりの相同性のために、ａＴｃｄＢ免疫感作によって生じた抗体を、ＴｃｄＡに対する交差防御に関して検査した。驚いたことに、ａＴｃｄＢ免疫感作によって生じた抗体は、ＴｃｄＡの細胞毒性に対する中和活性をほとんど有しておらず、致死的なＴｃｄＡチャレンジからのマウスの保護に失敗した（図２２のパネルＤ及びＥ）。ａＴｃｄＡでの免疫感作はまた、ＴｃｄＢに対する中和抗体反応をほとんど誘発しなかった（図２２のパネルＦ）。しかしながら、ａＴｃｄＡとａＴｃｄＢの混合物によって免疫化されたマウスは、両方の毒素に対する強力な中和抗体を生じさせた（図２２のパネルＥ及びＦ）。これらのマウスは、ＴｃｄＡ又はＴｃｄＢのいずれかでの致死的な全身性のチャレンジから十分に保護された。さらに、ａＴｃｄＡ又はａＴｃｄＢのいずれか単独でのマウスの免疫感作は、経口でのＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのバクテリアに誘発されたＣＤＩからマウスを部分的に保護した。ａＴｃｄＡ及びａＴｃｄＢは、共に免疫原として、ＣＤＩの致死性及び下痢からの十分な保護を誘発した（図２２のパネルＧ及びＨ）。両方の毒素に対するポリ血清抗毒素の腹腔内投与によるマウスの受動免疫化は、部分的しか保護しない各毒素単独に対するポリ血清と比較して、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに誘発された死亡率及び重量減少からの著しい保護／治療を提供した（図２２のパネルＩ及びＪ）。
＜実施例２３．マウスのｃＴｘＡＢの非経口の免疫感作は、ＴｃｄＡ及びＴｃｄＢ両方の細胞毒性を遮断する優れた中和活性を誘発した＞
ワクチンとしてのｃＴｘＡＢが、非経口の免疫感作後に中和抗体を誘発するかどうかを検査するために、マウスを、アジュバントとしてミョウバンとともに４回（１０日ごと）ＩＰで免疫化した。最後の免疫感作の７日後に、血清サンプルを集め、中和力価を測定した。ｃＴｘＡＢで免疫化されたマウスからの血清は、ＴｃｄＡ及びＴｃｄＢの両方に対して優れた中和活性を有することが観察された。非常に高い希釈でさえ、血清は中和活性を依然として実証した（図２３）。
培養細胞におけるＴｃｄＡに対する中和活性は、ＴｃｄＢに対する中和活性よりもはるかに大きいことが観察された（図２３）。任意の特定の理論又は作用の機構に限定されることなく、これは、ＴｃｄＡの受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を遮断することができる抗体を誘発するｃＴｘＡＢ免疫感作能力が原因であり得、これは、毒素を培養細胞に結合するために及び後の毒性のために必要である（ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｎｅｅｄｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｔｈｅ ｔｏｘｉｎｓ ｔｏ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｃｅｌｌｓ）。データは、ｃＴｘＡＢによって誘発された抗体が、インビボで両方の毒素の毒性を遮断する強力な能力を有していたことを示す。
ｃＴｘＡＢ候補ワクチンを、超高病原性株でのチャレンジからの保護を誘発する能力に関して評価した。ｃＴｘＡＢでの３回の免疫感作の後、マウスを、ＵＫ１株、患者から分離された０２７／Ｂ１／ＮＡＰ１株のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞によってチャレンジした（Ｓｔｅｅｌｅ， Ｊ ｅｔ ａｌ． ２０１０ Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ２０１： ４２８）。対照ＰＢＳで免疫化されなかったマウスは、１日目に疾患の徴候（ひだ状の被膜、嗜眠、食欲不振、衰弱など）を示し始め、感染の２日後に重度の下痢を発症し、マウスの約４０％が死んだ（図２４のパネルＡ、Ｂ及びＣ）。対照的に、ｃＴｘＡＢで免疫化されたマウスは、十分に保護され、感染の数か月後でさえ疾患の徴候を示さなかった（図２４のパネルＡ、Ｂ及びＣ）。
ｃＴｘＡＢでのマウスの免疫感作は、ＴｃｄＡ及びＴｃｄＢの両方に対する強力な全身性の抗体反応を誘発することが観察された（図２１のパネルＡ）。著しいＩｇＧ反応が、単一の免疫感作の後に生じ（図２１のパネルＡ）、結果は、ａＴｃｄＢが単一の免疫感作の後に測定可能な抗体反応を誘発しなかったため、ＴｃｄＡのＲＢＤの免疫刺激効果に起因し得る（図２２のパネルＡ）。強力な全身性の抗体反応にもかかわらず、ｃＴｘＡＢでのマウスの免疫感作は、結果的に、免疫化したマウスの糞便において測定される低い腸の抗毒素ＩｇＧ及びＩｇＡの力価につながる。ｃＴｘＡＢでの３回の免疫感作の後、ＴｃｄＡ及びＴｃｄＢに対する血清中和力価は、それぞれ４５６０及び３４４０であることが観察された（図２１のパネルＢ）。これらのラウンド後の免疫化したマウスを、野生型ＴｃｄＡ又はＴｃｄＢのいずれかでの致死的な全身性のチャレンジから十分に保護した（図２１のパネルＣ）。
キメラタンパク質が、両方の毒素に対する強力な中和抗体を誘発することができることが見出されたため、ＣＤＩに対する保護反応を誘発するｃＴｘＡＢワクチン接種の能力を、本明細書において検査した。マウスを、免疫感作の３回のラウンド及び実験室Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株ＶＰＩ１０４６３の栄養細胞によって経口でチャレンジにさらし、ビヒクルのＰＢＳで免疫化されたマウスは、典型的な下痢を発症し、重量減少を示し、及びマウスの約６０％が死んだ（Ｃｈｅｎ， Ｘ ｅｔ ａｌ． ２００８ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １３５： １９８４）（図２１のパネルＤ及びＥ）。しかしながら、わずかな重量減少は観察されたが、ｃＴｘＡＢによって免疫化されたマウスはどれも、疾患の症状を進行させなかった（図２１のパネルＤ及びＥ）。ｃＴｘＡＢで免疫化されたマウスはどれも、下痢を発症しなかった。対照的に、ＰＢＳ対照を投与されたすべてのマウスは、感染後の３〜４日以内に重度の下痢を発症し（図２１のパネルＦ）、一週間以内に徐々に回復した。ｃＴｘＡＢワクチン接種によって誘発された保護は永続的であり、免疫化したマウスを、３回目の免疫感作から３か月間も細菌でのＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのチャレンジから十分に保護した（図２１のパネルＧ、Ｈ及びＩ）。
ｃＴｘＡＢで免疫化されたマウスは、ＣＤＩの徴候を示さず、これらのマウスは、ＰＢＳで処置された対照マウスに類似したレベルで、１週間、検出可能な量の両方の毒素を排出した（図２５）。マウスを、毒素によって引き起こされた任意の腸の病変又は損傷に関してさらに検査した。剖検データは、ＰＢＳで処置された対照マウスからの盲腸及び結腸が、著しく拡大し膨れたことを示し（図２４のパネルＤ）、ｃＴｘＡＢで免疫化されたマウスからのそれらの臓器は、正常であるように見えた（図２４のパネルＥ）。ＰＢＳ対照マウスからの盲腸の薄片は、著しい上皮の損傷、浮腫、及び免疫細胞の浸潤を示し（図２４のパネルＦ）、一方で、ｃＴｘＡＢで免疫化されたマウスは、粘膜の損傷又は炎症の証拠を示さなかった（図２４のパネルＧ）。好中球の浸潤は、感染していないマウスと比較して、ＭＰＯ活性によって測定されるように、ＰＢＳで処置されたマウスにおいて著しく高められ、ｃＴｘＡＢで免疫化されたマウスからの腸において著しい好中球の浸潤を検出することはできなかった。従って、データは、ｃＴｘＡＢ免疫感作によって誘発された抗体が、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素に誘発された粘膜の損傷及び大腸炎からマウスを保護したことを示す。
再発の高い割合という結果となる現在の抗生物質処置の無効性が原因で、ＣＤＩはいくぶんか管理するのがますます難しくなっている（Ｋｅｌｌｙ， ＣＰ ｅｔ ａｌ． ２００８ Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５９： １９３２； Ｒｕｐｎｉｋ， Ｍ． Ｈ． ｅｔ ａｌ． ２００９ Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ７： ５２６）。再発を予防する際に本明細書での候補ワクチンの有効性を評価するために、マウスにおけるＣＤＩ再発モデルを確立した。免疫感作及び疾患誘発のスキームを、図２４のパネルＨに示す。一次感染の後、ＰＢＳで処置された対照群から生存するマウスは、一次ＣＤＩの疾患に類似した重症度を有する疾患を発症した。これらのマウスは、重度の下痢及び重量減少を引き起こし、マウスの４０％は瀕死状態になった（図２４のパネルＪ、Ｋ及びＬ）。ｃＴｘＡＢ免疫感作は、対照的に、再発からマウスを保護した。これらのマウスはどれも、疾患の徴候を進行させず、第２のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅチャレンジ後に１００％の生存が観察された（図２４のパネルＪ、Ｋ及びＬ）。この保護は、ｃＴｘＡＢで免疫化されたマウスにおいて見られる永続的な免疫にさらに関係した（図２１のパネルＪ、Ｈ及びＩ）。
腸ミクロフローラを破壊させ、それ故、入院患者をＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染の高いリスクにさらす、処置を受ける入院患者において、ＣＤＩに対してワクチンが急速な保護を誘発することが望ましい。ｃＴｘＡＢでのマウスの単一の免疫感作は、両方の毒素に対する測定可能な抗体反応を誘発し（図２１のパネルＡ）、この抗体反応を、ＣＤＩからマウスを保護するための十分な効能に関して評価した。マウスを、抗生物質処置と同じ日に免疫化し、６日後に、１０６のＵＫ１芽胞によってチャレンジした。データは、９０％のｃＴｘＡＢで免疫化されたマウスが生き残ったことを示す。対照的に、ＰＢＳ対照マウスのほぼ半分は、瀕死状態になった（ｐ＜０．０５、図２４のパネルＭ）。両方の群からの生存するマウスは、類似した程度の下痢及び重量減少を経験した（図２４のパネルＮ）。それ故、ｃＴｘＡＢでのマウスの単一の免疫感作は、下痢又は重量減少ではなく、重度の疾患及び死亡からの著しい保護を提供した。
その後、急速なワクチン接種スキームを、これらの症状に対する、及び再発からの保護のために評価した。最初の免疫感作及びＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ芽胞のチャレンジの後に、両方の群から生存するマウスを、ＵＫ１芽胞での再チャレンジ前に、再び、ｃＴｘＡＢによって２回免疫化した（図２４パネルＩ）。ｃＴｘＡＢで免疫化されたマウスはどれも、死んだり、再発性疾患を発症させることはなく、ＰＢＳで処置されたマウスは、死亡したり急な重量減少に苦しみ、９０％が下痢を進行させた（図２４のパネルＯ、Ｐ及びＱ）。
＜実施例２４．ｍＬＴを含む及び含まない、ａＴｃｄＢでの子ブタの舌下の免疫感作＞
２週齢のノトバイオートの（ＧＢ）子ブタを、１０μｇのｍＬＴと混合した２５μｇのａＴｃｄＢ（ブタ＃１及び＃２）、又は２５μｇのａＴｃｄＢのみ（ブタ＃３及び＃４）のどちらかによって２週ごとに３回舌下で（ＳＬ）免疫化した。ｍＬＴを含むａＴｃｄＢを受けた１匹の動物（ブタ＃１）を、無関係な病気が原因で安楽死させた。図２６は、ｍＬＴを含む（ブタ＃２）又はｍＬＴを含まない（ブタ＃３及び＃４）、ａＴｃｄＢによって免疫化した３匹の残りの子ブタの血清抗体反応を示す。
アジュバントとしてｍＬＴと混合したａＴｃｄＢによる子ブタのＳＬ免疫感作が、全身性の抗ＴｃｄＢ ＩｇＧ反応を誘発したことが観察された（図２６）。これらのデータは、ＳＬ免疫感作が投与の有効な経路であり、粘膜のアジュバントとしてのｍＬＴの包含が、この免疫原に対する免疫反応を高めることを示す。
＜実施例２５．ノトバイオートの（ＧＢ）子ブタモデル＞
最適な免疫反応及び細菌のチャレンジからの１００％の保護を刺激するための有効な免疫感作レジメンを、ＧＢ子ブタモデルにおいて評価する。このモデルは、ＦＤＡによって必要とされる２つの動物規則を満たすのに有用である；慢性ＣＤＩの既存の処置への免疫感作の影響を受けそうな子ブタモデル；ＣＤＩの慢性疾患の確立からの保護；再発からの保護；候補の安全性及び最適化の症状発現前の評価が、ヒトに対して等しく有効でありそうな最良のワクチン及び免疫感作のレジメンを識別し確認するためになされ得るモデル。
マウス感染研究の後に選択されたワクチンを評価するために、ＧＢ子ブタを第２の動物モデルとして使用する。これらの動物を、研究の全体にわたって微生物学の隔離飼育器に日常的に収容し、それらに６週間赤ん坊の調乳を与え、次に、本明細書の実施例に示されるように、より長く飼育された時にそれらを乳離れさせ離乳食を与え、これらを、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのＩＡＣＵＣプロトコルＧ８６１−０６の下で行った。
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによって経口で感染したノトバイオートの子ブタは、下痢を示し、弱くなり、脱水状態になり、瀕死状態になることが予期される。子ブタを、処置の期間中、少なくとも１日当たり４回（午前９時ごろ、正午ごろ、午後４時ごろ、及び午後８時と午前１２時の間に１回）モニタリングする。嗜眠性であるか、動くことができないか、又は５％を超えて脱水すると観察された子ブタは、液体電解液及びグルコースの非経口投与によって水分補給される。重病が観察されるとき、少なくとも１回のさらなる検査を、嗜眠、動けないこと、５％を超える脱水についての観察の後の、標準チェックポイントの各々の間に行う。いかなる時も瀕死状態であるように見える動物を安楽死させる。
子ブタモデルは、制御された研究室の下で操作される強度及び持続時間を伴う、特徴的な偽膜性大腸炎を有する、極めて急性及び致死的な下痢から慢性下痢までの、疾患内の症状及び重症度の範囲スペクトルを提供する。全身性の結果を含む臨床症状のスペクトルは、ヒトの場合において観察されるものと類似しており、これは、ワクチン候補及び治療薬の症状発現前の評価を行なうために、子ブタを魅力的なモデルにしている。これらは、結果的に重度の疾患及び死病にさえなる、腹水、胸水、心肺機能停止、肝膿瘍、及び多臓器機能障害症候群などの、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染のさまざまな全身性の結果を含む。免疫反応は、重症度において役割を果たし、これらの例において、サイトカインレベルを、大腸の内容物において分析する。特にＩＬ−８濃度は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによってチャレンジされた子ブタにおいて著しく高められた（Ｓｔｅｅｌｅ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． ２０１０ Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ２０１：４２８）。
慢性ＣＤＩの子ブタモデルにおける免疫感作レジメンの有効性に関する症状発現前の評価を、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅでの経口チャレンジに抵抗する免疫化された子ブタの能力を評価するために行う。子ブタを、帝王切開によって得、処置の間に無菌の隔離飼育器の内部で保持した。それらは乳飼料を与えられ、処理され、モニタリングされ、定期的にサンプリングされた（ＭｃＭａｓｔｅｒ−Ｂａｘｔｅｒ， Ｎ． Ｌ． ｅｔ ａｌ． ２００７ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ ２７：１０２９−１０３９）。
表１のプラセボ群は、もし含まれていれば、ビヒクルに加えて、アジュバントを受ける。対照群を、試験ワクチン群として免疫化するが、対照株によってチャレンジし、それに対抗して、株０２７によってチャレンジされた群を比較し測定する。２つ以上の試験ワクチンを、対照及びプラセボの群が共有され得るため、比較する目的で平行して、及びこれらの処置に使用される子ブタの数を保存するために検査する。
症状発現前の評価を、感染を取り除き及び／又はＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに感染した子ブタの症状の重症度を低下させる、上記の免疫感作レジメンの任意の能力に関して行う。
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅでの経口のチャレンジの後にさらに３か月間、子ブタを保持し、特異血清及び分泌抗体のレベルをモニタリングし、その後、再発からの保護を評価するために、子ブタを、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅで再びチャレンジし；もし特異抗体レベルが低いと見なされると、第２のチャレンジ前に追加免疫を与える。
子ブタを、０〜３にランク付けされる症状に関して少なくとも１日に２回観察する：０は、下痢なしを示す；１は、軽度の下痢を示す；２は、中程度の下痢を示す；３は、重度の下痢を示す。以下の症状をモニタリングする：下痢−水様性、間欠性、ペースト状；肌弾性及び全体的な外観によって測定された脱水症；健康状態を反映する、１週当たり３回測定される、体重、減少又は増加；拒食症、飲みたいという切望、１日当たりのミルクの摂取量、敏捷性、うつ、動きたがらない、猫背、持ち上げられるとキーキーと声を上げる（ｓｑｕｅａｌｉｎｇ ｗｈｅｎ ｐｉｃｋｅｄ ｕｐ）；一般的な外観、ひだ状の被膜、汚れた会陰部；及び遠隔測定のモニタリング、生命徴候及び体温変動の図で示された記録、呼吸数及び心拍数（畜産下での以下を参照）。
重大な脱水症の場合において、水分補給が完了するまで、１日に２回、ＩＰで５％のＤｅｘ Ｉｎｊ ＮＴＲＭＸと組み合わせたＡｍｉｎｏｓｙｎ ＩＩ ３．５％ Ｍを使用して、子ブタに水を与えた（２０〜３０ｍｌ／注入）。各４つの群内の各々の個体の、臨床的な、組織学的な、細菌数の、及び炎症（サイトカインレベル）の反応を、それぞれ個々の動物に対する重症度に従って、０〜３までランク付けし（０は効果を示さない）、観察記録をデータベースに入力した。
４つの群の間の比較は、細菌チャレンジの後の臨床徴候の経過に対するワクチン接種の影響を反映し、剖検での粘膜病変の分析を含む。１〜３のランク付けを各臓器に割り当て、そこで変化を肉眼で又は微視的に観察し、０は、正常、又は群４で測定されるパラメーターの変化がないことを示す。データを数値に変換することによって、臨床観察及び剖検結果のための適切な統計分析で処理されるスコアリングシステムを展開させる。臨床観察は、下痢、拒食症、脱水症、敏捷性、遠隔測定及び体重など６つのパラメーターを含む。このカテゴリーの毎日のスコアは、０から最大で１８（３ｘ６）まで変化する。剖検結果は以下のパラメーターを含む：腸病変、炎症、細菌数、全身性の毒血症、内臓の異常性、臨床病理。このカテゴリーのスコアは、０〜１８（３ｘ６）まで変化する。このスコアリングシステムによると、理想的な対照群４のスコアは０であり；プラセボ群４のスコアは、臨床観察に関して１８、及び剖検結果に関して１８に近づく。群１及び２に関するスコアの大きさを、保護パラメーターを確立するために使用する。従って、１８により近いスコアは、乏しい有効性を示し、０により近いスコアは、大きな有効性を反映する。
上に記載された数値のスコアリングシステムに加えて、肉眼的及び微視的な観察の包括的及び具体的な記載を記録し、さらに別々に分析される付加的でより多くの詳細情報を提供するデータベースに入力した。
＜実施例２６．経口免疫のためのＰＬＧポリマー＞
ａＴｘＡＢ及びｃＴｘＡＢのタンパク質を、図２７に示される方法によってＰＬＧにおいてカプセル化する。Ｍｅｄｉｓｏｒｂ ＰＬＧポリマー（Ａｌｋｅｒｍｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ， ＯＨ）を本明細書の方法に使用し、図６におけるワクチンを調製するための基本手順によって、水中油型エマルションとして調製し、Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎ Ｍａｃｈｉｎｅｓ， Ｅａｓｔ Ｌｏｎｇｍｅａｄｏｗ， ＭＡによって製造されるような、せん断型ミキサーによって混ぜ合わせる（Ｈｅｒｒｍａｎｎ， Ｊ． Ｅ． ｅｔ ａｌ． １９９９ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２５９：１４８−１５３）。この方法によって生成される粒子は、一般に、５μｍ未満の大きさである。手順を操作することによって、一貫して１００ｎｍから２５０ｎｍの範囲のナノ粒子も生成する。ナノ粒子は、２つの粘膜経路、鼻腔内及び経口の経路の各々によって投与される、カプセル化されたワクチンの吸収を増加させる。ＰＬＧナノ粒子の吸収に関する研究は、マウスへの経口投与の後に、ＰＬＧナノ粒子１μｍから１０μｍが、腸関連リンパ系組織のパイエル集腺へ吸収されたことを示している。吸収された約５μｍより大きい又は等しい大きさの粒子は、３５日まで局在化されたままであり、約５μｍより小さい粒子は、マクロファージ、腸間膜リンパ節、血液循環、及びひ臓内に広がった（Ｅｌｄｒｉｄｇｅ， Ｊ． Ｈ． ｅｔ ａｌ． １９８９ Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４６：５９−６６； Ｅｌｄｒｉｄｇｅ， Ｊ． Ｈ． ｅｔ ａｌ． １９８９ Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ ２５１：１９１−２０２）。ＰＬＧ微粒子は、Ｍ細胞に選択的に標的化されないが、Ｍ細胞への非特異的結合及び後のトランスサイトーシスが、ウサギにおいて示された（Ｊｅｐｓｏｎ， Ｍ． Ａ． ｅｔ ａｌ． １９９６ Ｐｆｌｕｇｅｒｓ Ａｒｃｈ ４３２：２２５−２３３； Ｊｅｐｓｏｎ， Ｍ． Ａ． ｅｔ ａｌ． １９９３ Ｊ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔ １：２４５−２４９）。
抗原を含むＰＬＧナノ粒子が、空のＰＬＧ微粒子によって見られるのと類似した方法で、Ｍ細胞に結合し、Ｍ細胞によって輸送されることが示された（Ｏ’Ｈａｇａｎ， Ｄ． Ｔ． １９９６ Ｊ Ａｎａｔ １８９ （ Ｐｔ ３）：４７７−４８２）。パイエル集腺によってＰＬＧナノ粒子においてカプセル化されたウシ血清アルブミンの吸収は、ラットモデルにおいて示された（Ｄｅｓａｉ， Ｍ． Ｐ． ｅｔ ａｌ． １９９６ Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ １３：１８３８−１８４５）。カプセル化されたａＴｘＡＢ又はｃＴｘＡＢを、胃管栄養法を使用して投与した。以下の請求項は単に例示的であり、さらに限定するものとして解釈されるべきではない。当業者は、実施例及び請求項から、本明細書中の本発明の範囲内にある多数の同等物を容易に判断するであろう。

Claims (48)

  1. 感染に対して被験体を免疫化するための無毒の組換えＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ毒素タンパク質を含むワクチン組成物であって、前記タンパク質が、Ｃ末端に配置されたタンパク質精製タグに操作可能に連結される、グルコシルトランスフェラーゼドメイン（ＧＴ）、システインプロテイナーゼドメイン（ＣＰＤ）、膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）および受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を有し、前記組成物のタンパク質が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ宿主において組換え技術で産生され、および前記組成物は被験体を免疫化するのに有効であることを特徴とするワクチン組成物。
  2. 前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃ．ｓｏｒｄｅｌｌｉｉ、Ｃ．ｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ｃ．ｔｅｒｔｉｕｍ、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍなどの群の少なくとも１つから選択されることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
  3. 前記タンパク質が、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのＴｃｄＡタンパク質およびＴｃｄＢタンパク質の群から選択される少なくとも１つに少なくとも１つの変異を含み、前記変異は、毒性を減少させ、かつ天然のタンパク質構造を保持することを特徴とする請求項２に記載の組成物。
  4. 前記変異が、少なくとも約１０倍から約１，０００倍までで毒性を減少させることを特徴とする請求項３に記載の組成物。
  5. 前記変異が、少なくとも約１０，０００倍から、約１０００万倍までで毒性を減少させることを特徴とする請求項３に記載の組成物。
  6. 前記変異が、ＴｃｄＡタンパク質およびＴｃｄＢタンパク質の少なくとも１つのＧＴドメインに位置することを特徴とする請求項３に記載の組成物。
  7. 前記少なくとも１つの変異が、アミノ酸置換またはアミノ酸欠失を含むことを特徴とする請求項６に記載の組成物。
  8. 前記置換が、トリプトファンのアラニンでの置換またはアスパラギン酸のアスパラギンでの置換を含むことを特徴とする請求項７に記載の組成物。
  9. 前記タンパク質が、複数の変異を含むことを特徴とする請求項３に記載の組成物。
  10. 前記タンパク質が、ＴｃｄＡタンパク質に由来する第１アミノ酸配列およびＴｃｄＢタンパク質に由来する第２アミノ酸配列を有するキメラ融合ｃＴｘＡＢを含むことを特徴とする請求項３に記載の組成物。
  11. 前記第１アミノ酸配列が、ＴｃｄＡ ＲＢＤドメインを含み、および前記第２アミノ酸配列が、ＴｃｄＢ ＧＴ、ＣＰＤおよびＴＭＤドメインを含み、前記タンパク質ドメインが、精製タグに操作可能に連結され、前記タンパク質が、さらに、前記タグを除去するためのプロテアーゼ切断部位を含むことを特徴とする請求項１０に記載の組成物。
  12. 前記精製タグが、Ａｒｇ−タグ、カルモデュリン−結合ペプチド、セルロース−結合ドメイン、ＤｓｂＡ、ｃ−ｍｙｃ−タグ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ＦＬＡＧ−タグ、ＨＡＴ−タグ、Ｈｉｓ−タグ、マルトース−結合タンパク質、ＮｕｓＡ、Ｓ−タグ、ＳＢＰ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−タグおよびチオレドキシンの群から選択される少なくとも１つであることを特徴とする請求項１１に記載の組成物。
  13. 前記組成物が、欠失変異をさらに含むことを特徴とする請求項１１に記載の組成物。
  14. 前記欠失が、ＴＭＤドメインに少なくとも１つのアスパラギン酸を含むことを特徴とする請求項１３に記載の組成物。
  15. 前記Ｂａｃｉｌｌｕｓが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍであることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
  16. 有効量での請求項１に記載の組成物。
  17. アジュバントをさらに含む請求項１に記載の組成物。
  18. 薬学的に許容可能な担体をさらに含む請求項１に記載の組成物。
  19. 前記組成物が、前記タンパク質をコードする核酸を含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
  20. 前記核酸が、細菌ベクタ―に操作可能に連結されることを特徴とする請求項１９に記載の組成物。
  21. 前記ＴｃｄＡタンパク質および前記ＴｃｄＢタンパク質が、別々に産生されることを特徴とする請求項３に記載の組成物。
  22. 容器および請求項１乃至２１のいずれかに記載の組成物を含むキット。
  23. 使用のための指示書をさらに含む請求項２２に記載のキット。
  24. 被験体において、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素に特異的な免疫反応を誘発する方法であって、前記方法は、
    タンパク質がグルコシルトランスフェラーゼドメイン（ＧＴ）、システインプロテイナーゼドメイン（ＣＰＤ）、膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）およびＣ末端に配置された精製タグを含むように、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素タンパク質組成物の無毒の変異をコード化する核酸を設計する工程、
    Ｂａｃｉｌｌｕｓ細胞にタンパク質を発現し、前記タンパク質を精製し、および前記精製タグを取り除く工程、および
    組成物を調剤し、被検体を組成物と接触させ、それによって、被験体に、前記タンパク質に特異的な、少なくとも１つの体液性免疫反応および細胞媒介性免疫反応を誘発する工程、
    を含むことを特徴とする方法。
  25. 前記設計工程が、ＴｃｄＡタンパク質に由来するアミノ酸配列をコード化する第１核酸配列、およびＴｃｄＢタンパク質に由来するアミノ酸配列をコード化する第２核酸配列の少なくとも１つに変異を得る工程をさらに含むことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
  26. 前記変異が、前記ＴｃｄＡタンパク質および前記ＴｃｄＢタンパク質の少なくとも１つのＧＴドメインにあることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
  27. 前記変異を設計する工程が、アミノ酸置換またはアミノ酸欠失を導入する工程を含むことを特徴とする請求項２６に記載の方法。
  28. 前記置換変異が、トリプトファンをアラニンに置換する工程、およびアスパラギン酸をアスパラギンに置換する工程の少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項２７に記載の方法。
  29. 前記タンパク質を設計する工程が、複数の変異を導入する工程を含むことを特徴とする請求項２８に記載の方法。
  30. 前記組成物が、ＴｃｄＡタンパク質に由来する第１アミノ酸配列、およびＴｃｄＢタンパク質に由来する第２アミノ酸配列を有する無毒のキメラタンパク質ｃＴｘＡＢを含むことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
  31. 前記アミノ酸配列を設計する工程が、ＴｃｄＡタンパク質からのＲＢＤドメインをコード化する核酸を、ＴｃｄＢタンパク質のＧＴ、ＣＰＤおよびＴＭＤドメインのアミノ酸配列をコード化する核酸と組換え技術で連結する工程を含み、前記タンパク質ドメインが、Ｃ末端にある精製タグ、およびタグの除去のためのプロテアーゼ切断部位に操作可能に連結されることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
  32. 前記ＴＭＤドメインを設計する工程が、少なくとも１つのアスパラギン酸を欠失させる工程を含むことを特徴とする請求項３１に記載の方法。
  33. 前記被験体が、ヒト、研究動物、高価値の動物園動物および農業動物の群の少なくとも１つから選択されることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
  34. 前記被験体を接触させる工程が、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮内、粘膜、皮下、舌下、鼻腔内および経口からなる群の少なくとも１つから選択される経路によって組成物を投与する工程をさらに含むことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
  35. 被験体の血清中の抗体力価を分析する工程、および免疫反応が被験体において誘発されたという指標として、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ抗体を特異的に結合する抗体の増加を、接触していない対照の被験体の増加と比較して観察する工程をさらに含む請求項２４に記載の方法。
  36. Ｂａｃｉｌｌｕｓ宿主において、組換え変異型Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ毒素タンパク質を産生する方法であって、前記方法は、
    前記タンパク質が、グルコシルトランスフェラーゼドメイン（ＧＴ）、システインプロテイナーゼドメイン（ＣＰＤ）、膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含み、遺伝子が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ細胞に又は選択可能なマーカーに、およびＣ末端に位置された精製タグに、遺伝子を発現するための調節シグナルに操作可能に連結されるように、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｕｍタンパク質に関して遺伝子をコード化する核酸ベクターを構築する工程、
    Ｂａｃｉｌｌｕｓ細胞の原形質体をベクタ―と接触させる工程、および
    選択可能なマーカーを有し、形質転換体の細胞に組換えタンパク質を発現する形質転換体を選択する工程、
    を含むことを特徴とする方法。
  37. 前記Ｂａｃｉｌｌｕｓが、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、およびＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓの群から選択されることを特徴とする請求項３６に記載の方法。
  38. 前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍが、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃ．ｓｏｒｄｅｌｌｉｉ、Ｃ．ｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ｃ．ｔｅｒｔｉｕｍ、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍなどの群から少なくとも１つ選択されることを特徴とする請求項３６に記載の方法。
  39. 前記核酸ベクタ―を構築する工程が、無毒の変異型Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのＴｃｄＡタンパク質をコード化する第１核酸配列、および無毒の変異型Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのＴｃｄＢタンパク質をコード化する第２核酸配列を組み合わせる工程を含むことを特徴とする請求項３６に記載の方法。
  40. 前記タンパク質が、少なくとも１つの変異を含むことを特徴とする請求項３９に記載の方法。
  41. 前記少なくとも１つの変異が、少なくとも１つのアミノ酸の置換または欠失を含むことを特徴とする請求項４０に記載の方法。
  42. 前記少なくとも１つの変異が、ＧＴドメインに位置することを特徴とする請求項４１に記載の方法。
  43. 前記少なくとも１つの変異が、トリプトファンのアラニンとの置換またはアスパラギン酸のアスパラギンとの置換を含むことを特徴とする請求項４２に記載の方法。
  44. 前記タンパク質が複数の変異を含むことを特徴とする請求項４０に記載の方法。
  45. 前記遺伝子が、ＴｃｄＢタンパク質に由来する第１アミノ酸配列、およびＴｃｄＡタンパク質に由来する第２アミノ酸配列を含む組換えキメラｃＴｘＡＢタンパク質をコード化することを特徴とする請求項３６に記載の方法。
  46. 前記ＴｃｄＢタンパク質アミノ酸配列が、ＧＴドメインを含み、および前記ＴｃｄＡタンパク質アミノ酸配列が、ＲＢＤ、ＣＰＤおよびＴＭＤドメインを含み、前記タンパク質ドメインが、タグの除去のためのプロテアーゼ切断部位を有する精製タグに操作可能に連結されることを特徴とする請求項４５に記載の方法。
  47. 前記遺伝子が、ＴｃｄＡタンパク質に由来する第１アミノ酸配列、およびＴｃｄＢタンパク質に由来する第２アミノ酸配列を含む組換えキメラＴｘＢ−Ａｒタンパク質をコード化することを特徴とする請求項３６に記載の方法。
  48. 前記ＴｃｄＡタンパク質アミノ酸配列が、ＲＢＤドメインを含み、および前記ＴｃｄＢタンパク質アミノ酸配列が、ＧＴ、ＣＰＤおよびＴＭＤのドメインを含み、前記タンパク質ドメインが、タグの除去のためのプロテアーゼ切断部位を有する精製タグに操作可能に連結されることを特徴とする請求項４７に記載の方法。
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