ES2969952T3

ES2969952T3 - Composiciones relacionadas con una toxina mutante de Clostridium difficile y sus procedimientos

Info

Publication number: ES2969952T3
Application number: ES19167276T
Authority: ES
Inventors: Maninder K Sidhu; Annaliesa Anderson; Robert Donald; Kathrin Jansen; Narender Kalyan; Terri Mininni; Justin Moran; Mark Ruppen; Michael Flint
Original assignee: Wyeth LLC
Current assignee: Wyeth LLC
Priority date: 2011-04-22
Filing date: 2012-04-20
Publication date: 2024-05-23
Anticipated expiration: 2032-04-20
Also published as: JP2022126822A; CO6801643A2; IL255345A0; SI3505531T1; NZ616035A; ES2742823T3; JP2018135345A; RU2015154443A; US10597428B2; PE20181334A1; AU2020230248B2; US20190202873A1; IL265510A; SI2699587T1; EP3505531B1; CN107022532B; AU2019246878B2; USRE48863E1; US20120269841A1; US20150125927A1

Abstract

En un aspecto, la invención se refiere a una composición inmunogénica que incluye una toxina mutante A y/o una toxina mutante B. Cada toxina mutante incluye un dominio de glucosiltransferasa que tiene al menos una mutación y un dominio de cisteína proteasa que tiene al menos una mutación, con respecto a la correspondiente. toxina.de.tipo.salvaje. Las toxinas mutantes pueden incluir además al menos un aminoácido que esté químicamente entrecruzado. En otro aspecto, la invención se refiere a anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos que se unen a dichas composiciones inmunogénicas. En aspectos adicionales, la invención se refiere a secuencias de nucleótidos aisladas que codifican cualquiera de las composiciones anteriores y a métodos de uso de cualquiera de las composiciones anteriores. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones relacionadas con una toxina mutante deClostridium difficiley sus procedimientos

Campo

La presente invención está dirigida a composiciones relacionadas con toxinas mutantes deClostridium difficiley sus procedimientos.

Antecedentes

Clostridium difficile (C. difficile)es una bacteria anaerobia grampositiva que está asociada con enfermedades gastrointestinales en los seres humanos. La colonización deC. difficilegeneralmente se produce en el colon si la flora intestinal natural está disminuida por tratamiento con antibióticos. Una infección puede provocar diarrea asociada con antibióticos y, algunas veces, colitis seudomembranosa mediante la secreción de las toxinas glucosilantes, toxina A y toxina B (308 y 270 kDa, respectivamente), que son los principales factores de virulencia deC. difficile.

La toxina A y la toxina B están codificadas dentro del locus de patogenicidad de 19 kb (PaLoc) por los genestcdAytcdB,respectivamente. Las cepas no patógenas deC. difficiletienen este locus reemplazado por una secuencia alternativa de 115 pares de bases.

Tanto la toxina A como la toxina B son potentes citotoxinas. Estas proteínas son glucosiltransferasas homólogas que inactivan GTPasas pequeñas de la familia Rho/Rac/Ras. La interrupción resultante de la señalización causa una pérdida de uniones célula-célula, desregulación del citoesqueleto de actina y/o apoptosis, dando como resultado la diarrea secretora profunda que está asociada con infecciones porClostridium difficile(CDI).

En la última década, el número y la gravedad de brotes deC. difficileen los hospitales, residencias de ancianos y otros centros de cuidados médicos prolongados han aumentado de forma espectacular. Los factores clave de este aumento incluyen la aparición de cepas patógenas hipervirulentas, un mayor uso de antibióticos, mejores procedimientos de detección y mayor exposición a esporas transportadas por el aire en los centros de salud.

El metronidazol y la vancomicina representan la norma asistencial aceptada actualmente para el tratamiento con antibióticos de la enfermedad asociada aC. difficile(CDAD). Sin embargo, aproximadamente el 20% de los pacientes que reciben este tratamiento experimentan una recurrencia de la infección después de un primer episodio de CDI, y hasta aproximadamente el 50% de esos pacientes sufren recurrencias adicionales. El tratamiento de las recurrencias representa un desafío muy significativo, y la mayoría de las recurrencias generalmente se producen dentro del mes siguiente al episodio anterior.

En consecuencia, existe la necesidad de composiciones inmunogénicas y/o terapéuticas y de procedimientos de las mismas dirigidos aC. difficile.

El documento WO2010/094970 divulga anticuerpos ovinos, para su uso en la prevención o tratamiento de la infección porC. difficileen la que los anticuerpos se unen a una toxina deC. difficile.El documento US2011/053244 divulga una construcción para generar células madre que pueden incluir una toxina deC. difficile.El documento US2011/053244 divulga en el párrafo [0034] que la actividad de la toxina B (TcdB) puede eliminarse mediante sustituciones de aminoácidos en su secuencia. Egerer et al. (The Journal of Biological Chemistry, VOL. 284, N.° 6, páginas 3389-3395, 2009) estudiaron la actividad proteasa intrínseca en fragmentos de toxina B deC. difficile.

Sumario de la invención

En el presente documento la invención proporciona estos y otros objetivos.

La invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjunto.

En un aspecto, la invención se refiere a una composición inmunogénica que incluye una toxina B deC. difficilecomo se define en las reivindicaciones adjuntas.

En un aspecto, la invención se refiere a una composición inmunogénica que comprende un polipéptido aislado que incluye la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 6, en la que el resto de metionina en la posición 1 no está presente opcionalmente, y en la que el polipéptido incluye una cadena lateral de aminoácido modificada químicamente por 1 -etil-3- (3-dimetilaminopropil)carbodiimida) (<e>D<c>) y N-hidroxisuccinimida (NHS).

En un aspecto adicional, la invención se refiere a una composición inmunogénica que incluye una toxina B deC. difficilemutante, que incluye la SEQ ID NO: 6, en la que al menos un aminoácido de la toxina B deC. difficilemutante está químicamente entrecruzado.

En un aspecto, la invención se refiere a una composición inmunogénica que incluye una toxina A deC. difficilemutante, que incluye la SEQ ID NO: 4, y una toxina B deC. difficilemutante, que incluye la SEQ ID NO: 6, en la que al menos un aminoácido de cada una de las toxinas deC. difficilemutante está entrecruzado químicamente.

En un aspecto, la composición inmunogénica incluye un polipéptido aislado que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 4, en la que el resto de metionina en la posición 1 no está presente opcionalmente, y un polipéptido aislado que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 6, en la que el resto de metionina en la posición 1 no está presente opcionalmente, y en la que los polipéptidos tienen al menos una cadena lateral de aminoácido modificada químicamente por 1 -etil-3- (3-dimetilaminopropil)carbodiimida) (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS).

En una realización, el polipéptido incluye al menos uno de cualquiera de: a) a) al menos un resto de beta-alanina unido a una cadena lateral de un resto de lisina del polipéptido; b) al menos un entrecruzamiento entre una cadena lateral de un resto de lisina del polipéptido y una cadena lateral de un resto de ácido aspártico; y c) al menos un entrecruzamiento entre una cadena lateral de un resto de lisina del polipéptido y una cadena lateral de un resto de ácido glutámico.

En una realización, el polipéptido aislado tiene una CE<50>de al menos aproximadamente 100 pg/ml.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: alineamiento de la secuencia de la toxina A deC. diffidlede tipo silvestre de las cepas 630, VPI10463, R20291, CD196, y toxina A mutante que tiene la SEQ ID NO: 4, utilizando el alineamiento CLu St ALW, parámetros por defecto.

Figura 2: alineamiento de la secuencia de la toxina B deC. difficilede tipo silvestre de las cepas 630, VPI10463, R20291, CD196 y la toxina B mutante que tiene la SEQ ID NO: 6, utilizando el alineamiento CLUSTALW, parámetros por defecto.

Figura 3: gráfico que muestra la identificación de cepas deC. difficilenegativas para la toxina de tipo silvestre. Se ensayó mediante ELISA la presencia de toxina A en medios de cultivo de 13 cepas deC. difficile.Tal como se ilustra, siete cepas expresaron toxina A y 6 cepas no lo hicieron (cepas 1351, 3232, 7322, 5036, 4811 y VPI 11186). Figura 4A y B: resultados de SDS-PAGE que ilustran que el triple mutante A (SEQ ID NO: 4), el doble mutante B (SEQ ID NO: 5) y el triple mutante B (SEQ ID NO: 6) no glucosilan las GTPasas Rac1 o RhoA en ensayos de glucosilaciónin vitrocon UDP-<14>C-glucosa; mientras que de 10 pg a 1 ng de toxina B de tipo silvestre glucosilan Rac1.

Figura 5: transferencia de western que indica la anulación de la actividad de cisteína proteasa en toxinas mutantes A y B (SEQ ID NO: 4 y 6, respectivamente), en comparación con la observación de fragmentos escindidos de toxinas A y B de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1 y 2, respectivamente). Véase el Ejemplo 13.

Figura 6: gráficos que muestran que las toxinas triples mutantes A y B (SEQ ID NO: 4 y 6, respectivamente) presentan citotoxicidad residual cuando se ensayan a altas concentraciones (por ejemplo, aproximadamente 100 pg/ml) mediante un ensayo de citotoxicidadin vitroen células IMR-90.

Figura 7: gráfico que muestra que los valores de CE<50>son similares para la toxina B triple mutante (SEQ ID NO: 6) y la toxina B hepta mutante (<s>E<q>ID NO: 8).

Figura 8: gráfico que representa los resultados de los ensayos de citotoxicidadin vitroen los que se representan niveles de ATP (URL) frente a concentraciones crecientes del triple mutante TcdA (SEQ ID NO: 4) (panel superior) y del triple mutante TcdB (SEQ ID NO: 6) (panel inferior). La citotoxicidad residual de las toxinas mutantes A y B puede anularse completamente con anticuerpos neutralizantes específicos para la toxina A mutante (panel superior-pAb A y Acm A3-25 A60-22) y la toxina B mutante (panel inferior-pAb B).

Figura 9: imágenes de la morfología celular de IMR-90 72 horas después del tratamiento. El panel A muestra células de control tratadas de forma simulada. El panel B muestra la morfología celular después del tratamiento con TcdB mutante inactivada con formalina (SEQ ID NO: 6). El panel C muestra la morfología celular después del tratamiento con TcdB mutante inactivada con EDC (SEQ ID NO: 6). El panel D muestra la morfología celular después del tratamiento con toxina B de tipo silvestre (SEQ ID NO: 2). El panel E muestra la morfología celular después del tratamiento con triple mutante TcdB (SEQ ID NO: 6). Se observaron resultados similares para los tratamientos con TcdA.

Figura 10: gráfico que muestra los títulos de anticuerpos neutralizantes como se describe en el Ejemplo 25 (estudio muCdiff2010-06).

Figura 11: gráfico que muestra los títulos de anticuerpos neutralizantes como se describe en el Ejemplo 26 (estudio muCdiff2010-07).

Figura 12: gráfico que muestra las respuestas de anticuerpos neutralizantes contra las toxinas A y B en hámsteres después de cuatro inmunizaciones como se describe en el Ejemplo 27 (estudio hamC.difficile2010-02)Figura 13: gráfico que muestra las respuestas de anticuerpos neutralizantes en hámsteres después de la vacunación con toxinas mutantes genéticas inactivadas químicamente y toxoides de List Biological, como se describe en el Ejemplo 27 (estudio hamC.difficile2010-02).

Figura 14: curvas de supervivencia para tres grupos inmunizados de hámsteres en comparación con los controles no inmunizados, descrito en el Ejemplo 28 (estudio hamC.diffícile2010-02,continuación).

Figura 15: gráfico que muestra la respuesta relativa de anticuerpos neutralizantes contra diferentes formulaciones de toxinas mutantes deC. difficileen hámsteres (estudio hamC.difficile2010-03),como se describe en el Ejemplo 29.

Figura 16A-B: gráficos que muestran una fuerte respuesta relativa de anticuerpos neutralizantes contra toxinas A y B mutantes genéticas inactivadas químicamente (SEQ ID NO: 4 y 6, respectivamente) en macacos cynomolgus, tal como se describe en el Ejemplo 30. Figura 17: Secuencias de aminoácidos de regiones variables de cadenas ligeras (VL) y pesadas (HL) de IgE Acm A3-25. Péptido señal - resaltado; CDR - en cursiva y subrayadas; Región constante: en negrita y subrayada (no se muestra la secuencia completa).

Figura 18: gráfico que muestra la titulación de anticuerpos monoclonales de la toxina A individual en el ensayo de neutralización de toxinas utilizando los niveles de ATP (cuantificados por unidades relativas de luz - URL) como indicador de la viabilidad celular. En comparación con el control de toxina (4xCE<50>), los Acm A80-29, A65-33, A60-22 y A3-25 tuvieron efectos neutralizantes crecientes sobre la toxina A con la concentración pero no hasta el nivel del control positivo de conejo anti-toxina A. Los Acm A50-10, A56-33 y A58-46 no neutralizaron la toxina A. El control de célula solamente fue de 1 -1,5x10<6>URL.

Figura 19: Mapeo de 8 grupos de epítopos de Acm de toxina B por BiaCore

Figura 20A-C: actividades neutralizadoras sinérgicas de combinaciones de Acm de toxina A: la adición de diferentes diluciones de anticuerpos neutralizantes A60-22, A65-33 y A80-29 para aumentar las concentraciones de Acm A3-25 aumentó sinérgicamente la neutralización de la toxina A independientemente de la dilución. Se ilustran las URL del control de toxina A solamente (4x CE<50>) (<0,3x10<6>) y los controles de célula solamente fueron de 2-2,5 x10<6>URL como se representa en los gráficos que se muestran en la Figura 20B y la Figura 20C.

Figura 21: actividades neutralizadoras sinérgicas de Acm de toxina B: en la Figura 21A se ilustra la neutralización de la toxina B por Acm 8-26, B60-2 y B59-3. La neutralización de la toxina B aumenta de forma sinérgica después de combinar B8-26 con diluciones de B59-3 (Figura 21B)

Figura 22: transferencia de western que muestra que la expresión de la GTPasa Rac1 se reduce en extractos de toxina B mutante genética (SEQ ID NO: 6) de 24 a 96 horas, pero no en extractos tratados con toxina B de tipo silvestre (SEQ ID NO: 2). La transferencia también muestra que Rac1 está glucosilada en extractos tratados con toxina B, pero no en extractos tratados con toxina B mutante genética.

Figura 23A-K: gráfico que representa resultados de ensayos de citotoxicidadin vitroen los que se representan los niveles de ATP (URL) frente a concentraciones crecientes de medios de cultivo deC. difficiley las reservas de suero de hámster (■); toxina en bruto (recolección del cultivo) de la cepa respectiva y las reservas de suero de hámster (•); toxina purificada (toxina comercial obtenida de List Biologicals) y las reservas de suero de hámster (A); toxina en bruto (▼), control; y toxina purificada (♦), control. Las toxinas de las cepas respectivas se añadieron a las células a valores de 4xCE<50>. La Figura 23 muestra que una composición inmunogénica que incluye TcdA mutante (SEQ ID NO: 4) y TcdB mutante (SEQ ID NO: 6), en la que las toxinas mutantes se inactivaron con EDC, de acuerdo con, por ejemplo, el Ejemplo 29, Tabla 15, descrito en el presente documento, indujo anticuerpos neutralizantes que presentaban actividad neutralizante contra toxinas de al menos las siguientes 16 cepas CDC diferentes deC. difficile,en comparación con el control de toxina solamente respectivo: 2007886 (Figura 23A); 2006017 (Figura 23B); 2007070 (Figura 23C); 2007302 (Figura 23D); 2007838 (Figura 23E); 2007886 (Figura 23F); 2009292 (Figura 23G); 2004013 (Figura 23H); 2009141 (Figura 23I); 2005022 (Figura 23J); 2006376 (Figura 23K). Figura 24: ilustración de una inactivación EDC/NHS ejemplar de toxinas deC. difficilemutantes, que produce al menos tres tipos posibles de modificaciones: entrecruzamientos, aductos de glicina y aductos de beta-alanina. El panel A ilustra el entrecruzamiento. Mediante la adición de EDC y NHS se activan restos carboxílicos de toxinas triple mutantes. Los ésteres activados reaccionan con aminas primarias para formar enlaces de amida estables, dando como resultado entrecruzamientos intra- e intermoleculares. El panel B ilustra la formación de aductos de glicina. Después de la inactivación, los ésteres activados residuales se inactivan mediante la adición de glicina formando enlaces amida estables. El panel C ilustra la formación de aductos de beta-alanina. Tres moles de NHS pueden reaccionar con un mol de e Dc para formar beta-alanina activada. Esto después reacciona con aminas primarias para formar enlaces amida estables.

Figura 25: ilustración de una inactivación EDC/NHS ejemplar de toxinas deC. difficilemutantes, que dan como resultado al menos uno de los siguientes tipos de modificaciones: (A) entrecruzamientos, (B) aductos de glicina y (C) aductos de beta-alanina.

Breve descripción de las secuencias

La SEQ ID NO: 1 expone la secuencia de aminoácidos para la toxina A (TcdA) deC. difficile630 de tipo silvestre. La SEQ ID NO: 2 expone la secuencia de aminoácidos para la toxina B (TcdB) deC. difficile630 de tipo silvestre. La SEQ ID NO: 3 expone la secuencia de aminoácidos para una TcdA mutante que tiene una mutación en las posiciones 285 y 287, en comparación con la SEQ ID NO: 1.

La SEQ ID NO: 4 expone la secuencia de aminoácidos para una TcdA mutante que tiene una mutación en las posiciones 285, 287 y 700, en comparación con la SEQ ID NO: 1.

La SEQ ID NO: 5 expone la secuencia de aminoácidos para una TcdB mutante que tiene una mutación en las posiciones 286 y 288, en comparación con la SEQ ID NO: 2.

La SEQ ID NO: 6 expone la secuencia de aminoácidos para una TcdB mutante que tiene una mutación en las posiciones 286, 288 y 698, en comparación con la SEQ ID NO: 2.

La SEQ ID NO: 7 expone la secuencia de aminoácidos para una TcdA mutante que tiene una mutación en las posiciones 269, 272, 285, 287, 460, 462 y 700, en comparación con la SEQ ID NO: 1

La SEQ ID NO: 8 expone la secuencia de aminoácidos para una TcdB mutante que tiene una mutación en las posiciones 270, 273, 286, 288, 461, 463 y 698, en comparación con la SEQ ID NO: 2

La SEQ ID NO: 9 expone una secuencia de ADN que codifica una toxina A (TcdA) deC. difficile630 de tipo silvestre.

La SEQ ID NO: 10 expone una secuencia de ADN que codifica una toxina B (TcdB) deC. difficile630 de tipo silvestre.

La SEQ ID NO: 11 expone una secuencia de ADN que codifica la SEQ ID NO: 3

La SEQ ID NO: 12 expone una secuencia de ADN que codifica la SEQ ID NO: 4

La SEQ ID NO: 13 expone una secuencia de ADN que codifica la SEQ ID NO: 5

La SEQ ID NO: 14 expone una secuencia de ADN que codifica la SEQ ID NO: 6

La SEQ ID NO: 15 expone la secuencia de aminoácidos para TcdA deC. difficileR20291 de tipo silvestre.

La SEQ ID NO: 16 expone una secuencia de ADN que codifica la SEQ ID NO: 15.

La SEQ ID NO: 17 expone la secuencia de aminoácidos para TcdA deC. difficileCD196 de tipo silvestre.

La SEQ ID NO: 18 expone una secuencia de ADN que codifica la SEQ ID NO: 17.

La SEQ ID NO: 19 expone la secuencia de aminoácidos para TcdA deC. difficileVPI10463 de tipo silvestre. La SEQ ID NO: 20 expone una secuencia de ADN que codifica la SEQ ID NO: 19.

La SEQ ID NO: 21 expone la secuencia de aminoácidos para TcdB deC. difficileR20291 de tipo silvestre.

La SEQ ID NO: 22 expone una secuencia de ADN que codifica la SEQ ID NO: 21.

La SEQ ID NO: 23 expone la secuencia de aminoácidos para TcdB deC. difficileCD196 de tipo silvestre.

La SEQ ID NO: 24 expone una secuencia de ADN que codifica la SEQ ID NO: 23.

La SEQ ID NO: 25 expone la secuencia de aminoácidos para TcdB deC. difficileVPI10463 de tipo silvestre. La SEQ ID NO: 26 expone una secuencia de ADN que codifica la SEQ ID NO: 25.

La SEQ ID NO: 27 expone una secuencia de ADN de un locus de patogenicidad deC. difficileVPI10463 de tipo silvestre.

La SEQ ID NO: 28 expone la secuencia de aminoácidos para los restos 101 a 293 de la SEQ ID NO: 1.

La SEQ ID NO: 29 expone la secuencia de aminoácidos para los restos 1 a 542 de la SEQ ID NO: 1.

La SEQ ID NO: 30 expone la secuencia de aminoácidos para los restos 101 a 293 de la SEQ ID NO: 2.

La SEQ ID NO: 31 expone la secuencia de aminoácidos para los restos 1 a 543 de la SEQ ID NO: 2.

La SEQ ID NO: 32 expone la secuencia de aminoácidos para los restos 543 a 809 de la SEQ ID NO: 1.

La SEQ ID NO: 33 expone la secuencia de aminoácidos para los restos 544 a 767 de la SEQ ID NO: 2.

La SEQ ID NO: 34 expone la secuencia de aminoácidos para una TcdA mutante, en la que los restos 101, 269, 272, 285, 287, 460, 462, 541, 542, 543, 589, 655 y 700 pueden ser cualquier aminoácido.

La SEQ ID NO: 35 expone la secuencia de aminoácidos para una TcdB mutante, en la que 102, 270, 273, 286, 288, 384, 461,463, 520, 543, 544, 587, 600, 653, 698 y 751 pueden ser cualquier aminoácido.

La SEQ ID NO: 36 expone la secuencia de aminoácidos para la cadena ligera variable de un anticuerpo neutralizante de TcdA deC. difficile(Acm A3-25).

La SEQ ID NO: 37 expone la secuencia de aminoácidos para la cadena pesada variable de un anticuerpo neutralizante de TcdA deC. difficile(Acm A3-25).

La SEQ ID NO: 38 expone la secuencia de aminoácidos para CDR1 de la cadena ligera variable del anticuerpo neutralizante de TcdA deC. difficile(Acm A3-25).

La SEQ ID NO: 39 expone la secuencia de aminoácidos para CDR2 de la cadena ligera variable del anticuerpo neutralizante de TcdA deC. difficile(Acm A3-25).

La SEQ ID NO: 40 expone la secuencia de aminoácidos para CDR3 de la cadena ligera variable del anticuerpo neutralizante de TcdA deC. difficile(Acm A3-25).

La SEQ ID NO: 41 expone la secuencia de aminoácidos para la CDR1 de la cadena pesada variable del anticuerpo neutralizante de TcdA deC. difficile(Acm A3-25).

La SEQ ID NO: 42 expone la secuencia de aminoácidos para la CDR2 de la cadena pesada variable del anticuerpo neutralizante de TcdA deC. difficile(Acm A3-25).

La SEQ ID NO: 43 expone la secuencia de aminoácidos para la CDR3 de la cadena pesada variable del anticuerpo neutralizante de TcdA deC. difficile(Acm A3-25).

La SEQ ID NO: 44 expone una secuencia de ADN que codifica la SEQ ID NO: 3.

La SEQ ID NO: 45 expone una secuencia de ADN que codifica la SEQ ID NO: 4.

La SEQ ID NO: 46 expone una secuencia de ADN que codifica la SEQ ID NO: 5.

La SEQ ID NO: 47 expone una secuencia de ADN que codifica la SEQ ID NO: 6.

La SEQ ID NO: 48 expone la secuencia de nucleótidos del oligonucleótido inmunoestimulador ODN CpG 24555. La SEQ ID NO: 49 expone la secuencia de aminoácidos para la cadena pesada variable de un anticuerpo neutralizante de TcdB deC. difficile(Acm B8-26).

La SEQ ID NO: 50 expone la secuencia de aminoácidos para el péptido señal de la cadena pesada variable de un anticuerpo neutralizante de TcdB deC. difficile(Acm B8-26).

La SEQ ID NO: 51 expone la secuencia de aminoácidos para la CDR1 de la cadena pesada variable de un anticuerpo neutralizante de TcdB deC. difficile(Acm B8-26).

La SEQ ID NO: 52 expone la secuencia de aminoácidos para la CDR2 de la cadena pesada variable de un anticuerpo neutralizante de TcdB deC. difficile(Acm B8-26).

La SEQ ID NO: 53 expone la secuencia de aminoácidos para la CDR3 de la cadena pesada variable de un anticuerpo neutralizante de TcdB deC. difficile(Acm B8-26).

La SEQ ID NO: 54 expone la secuencia de aminoácidos para la región constante de la cadena pesada variable de un anticuerpo neutralizante de TcdB deC. difficile(Acm B8-26).

La SEQ ID NO: 55 expone la secuencia de aminoácidos para la cadena ligera variable de un anticuerpo neutralizante de TcdB deC. difficile(Acm B8-26).

La SEQ ID NO: 56 expone la secuencia de aminoácidos para el péptido señal de la cadena ligera variable de un anticuerpo neutralizante de TcdB deC. difficile(Acm B8-26).

La SEQ ID NO: 57 expone la secuencia de aminoácidos para la CDR1 de la cadena ligera variable de un anticuerpo neutralizante de TcdB deC. difficile(Acm B8-26).

La SEQ ID NO: 58 expone la secuencia de aminoácidos para la CDR2 de la cadena ligera variable de un anticuerpo neutralizante de TcdB deC. difficile(Acm B8-26).

La SEQ ID NO: 59 expone la secuencia de aminoácidos para la CDR3 de la cadena ligera variable de un anticuerpo neutralizante de TcdB deC. difficile(Acm B8-26).

La SEQ ID NO: 60 expone la secuencia de aminoácidos para la cadena pesada variable de un anticuerpo neutralizante de TcdB deC. difficile(Acm B59-3).

La SEQ ID NO: 61 expone la secuencia de aminoácidos para el péptido señal de la cadena pesada variable de un anticuerpo neutralizante de TcdB deC. difficile(Acm B59-3).

La SEQ ID NO: 62 expone la secuencia de aminoácidos para la CDR1 de la cadena pesada variable de un anticuerpo neutralizante de TcdB deC. difficile(Acm B59-3).

La SEQ ID NO: 63 expone la secuencia de aminoácidos para la CDR2 de la cadena pesada variable de un anticuerpo neutralizante de TcdB deC. difficile(Acm B59-3).

La SEQ ID NO: 64 expone la secuencia de aminoácidos para la CDR3 de la cadena pesada variable de un anticuerpo neutralizante de TcdB deC. difficile(Acm B59-3).

La SEQ ID NO: 65 expone la secuencia de aminoácidos para la región constante de la cadena pesada variable de un anticuerpo neutralizante de TcdB deC. difficile(Acm B59-3).

La SEQ ID NO: 66 expone la secuencia de aminoácidos para la cadena ligera variable de un anticuerpo neutralizante de TcdB deC. difficile(Acm B59-3).

La SEQ ID NO: 67 expone la secuencia de aminoácidos para el péptido señal de la cadena ligera variable de un anticuerpo neutralizante de TcdB deC. difficile(Acm B59-3).

La SEQ ID NO: 68 expone la secuencia de aminoácidos para la CDR1 de la cadena ligera variable de un anticuerpo neutralizante de TcdB deC. difficile(Acm B59-3).

La SEQ ID NO: 69 expone la secuencia de aminoácidos para la CDR2 de la cadena ligera variable de un anticuerpo neutralizante de TcdB deC. difficile(Acm B59-3).

La SEQ ID NO: 70 expone la secuencia de aminoácidos para la CDR3 de la cadena ligera variable de un anticuerpo neutralizante de TcdB deC. difficile(Acm B59-3).

La SEQ ID NO: 71 expone la secuencia de aminoácidos para la cadena pesada variable de un anticuerpo neutralizante de TcdB deC. difficile(Acm B9-30).

La SEQ ID NO: 72 expone la secuencia de aminoácidos para el péptido señal de la cadena pesada variable de un anticuerpo neutralizante de TcdB deC. difficile(Acm B9-30).

La SEQ ID NO: 73 expone la secuencia de aminoácidos para la CDR1 de la cadena pesada variable de un anticuerpo neutralizante de TcdB deC. difficile(Acm B9-30).

La SEQ ID NO: 74 expone la secuencia de aminoácidos para la CDR2 de la cadena pesada variable de un anticuerpo neutralizante de TcdB deC. difficile(Acm B9-30).

La SEQ ID NO: 75 expone la secuencia de aminoácidos para la CDR3 de la cadena pesada variable de un anticuerpo neutralizante de TcdB deC. difficile(Acm B9-30).

La SEQ ID NO: 76 expone la secuencia de aminoácidos para la región constante de la cadena pesada variable de un anticuerpo neutralizante de TcdB deC. difficile(Acm B9-30).

La SEQ ID NO: 77 expone la secuencia de aminoácidos para la cadena ligera variable de un anticuerpo neutralizante de TcdB deC. difficile(Acm B9-30).

La SEQ ID NO: 78 expone la secuencia de aminoácidos para el péptido señal de la cadena ligera variable de un anticuerpo neutralizante de TcdB deC. difficile(Acm B9-30).

La SEQ ID NO: 79 expone la secuencia de aminoácidos para la CDR1 de la cadena ligera variable de un anticuerpo neutralizante de TcdB deC. difficile(Acm B9-30).

La SEQ ID NO: 80 expone la secuencia de aminoácidos para la CDR2 de la cadena ligera variable de un anticuerpo neutralizante de TcdB deC. difficile(Acm B9-30).

La SEQ ID NO: 81 expone la secuencia de aminoácidos para la CDR3 de la cadena ligera variable de un anticuerpo neutralizante de TcdB deC. difficile(Acm B9-30).

La SEQ ID NO: 82 expone la secuencia de aminoácidos para una TcdB mutante, en la que un resto en las posiciones 102, 270, 273, 286, 288, 384, 461, 463, 520, 543, 544, 587, 600, 653, 698 y 751 puede ser cualquier aminoácido.

La SEQ ID NO: 83 expone la secuencia de aminoácidos para una toxina A deC. difficilemutante que tiene una mutación en las posiciones 285, 287 y 700, en comparación con SEQ ID NO: 1, en la que la metionina en la posición 1 está ausente.

La SEQ ID NO: 84 expone la secuencia de aminoácidos para una toxina B deC. difficilemutante que tiene una mutación en las posiciones 286, 288 y 698, en comparación con SEQ ID NO: 2, en la que la metionina en la posición 1 está ausente.

La SEQ ID NO: 85 expone la secuencia de aminoácidos para una TcdA mutante que tiene una mutación en las posiciones 269, 272, 285, 287, 460, 462 y 700, en comparación con la SEQ ID NO: 1, en la que está ausente la metionina en la posición 1.

La SEQ ID NO: 86 establece la secuencia de aminoácidos para una toxina B mutante deC. difficileque tiene una mutación en las posiciones 270, 273, 286, 288, 461, 463 y 698, en comparación con la SEQ ID NO: 2, en la que está ausente la metionina en la posición 1.

La SEQ ID NO: 87 expone la secuencia de aminoácidos para TcdA deC. difficile2004013 de tipo silvestre. La SEQ ID NO: 88 expone la secuencia de aminoácidos para TcdA deC. difficile2004111 de tipo silvestre.

La SEQ ID NO 89 expone la secuencia de aminoácidos para TcdA deC. difficile2004118 de tipo silvestre. La SEQ ID NO 90 expone la secuencia de aminoácidos para TcdA deC. difficile2004205 de tipo silvestre. La SEQ ID NO 91 expone la secuencia de aminoácidos para TcdA deC. difficile2004206 de tipo silvestre. La SEQ ID NO 92 expone la secuencia de aminoácidos para TcdA deC. difficile2005022 de tipo silvestre. La SEQ ID NO 93 expone la secuencia de aminoácidos para TcdA deC. difficile2005088 de tipo silvestre. La SEQ ID NO 94 expone la secuencia de aminoácidos para TcdA deC. difficile2005283 de tipo silvestre. La SEQ ID NO 95 expone la secuencia de aminoácidos para TcdA deC. difficile2005325 de tipo silvestre. La SEQ ID NO 96 expone la secuencia de aminoácidos para TcdA deC. difficile2005359 de tipo silvestre. La SEQ ID NO 97 expone la secuencia de aminoácidos para TcdA deC. difficile2006017 de tipo silvestre. La SEQ ID NO 98 expone la secuencia de aminoácidos para TcdA deC. difficile2007070 de tipo silvestre. La SEQ ID NO 99 expone la secuencia de aminoácidos para TcdA deC. difficile2007217 de tipo silvestre. La SEQ ID NO 100 expone la secuencia de am noácidos para TcdA deC. difficile2007302 de tipo si lvestre. La SEQ ID NO 101 expone la secuencia de am noácidos para TcdA deC. difficile2007816 de tipo si lvestre. La SEQ ID NO 102 expone la secuencia de am noácidos para TcdA deC. difficile2007838 de tipo si lvestre. La SEQ ID NO 103 expone la secuencia de am noácidos para TcdA deC. difficile2007858 de tipo si lvestre. La SEQ ID NO 104 expone la secuencia de am noácidos para TcdA deC. difficile2007886 de tipo si lvestre. La SEQ ID NO 105 expone la secuencia de am noácidos para TcdA deC. difficile2008222 de tipo si lvestre. La SEQ ID NO 106 expone la secuencia de am noácidos para TcdA deC. difficile2009078 de tipo si lvestre. La SEQ ID NO 107 expone la secuencia de am noácidos para TcdA deC. difficile2009087 de tipo si lvestre. La SEQ ID NO 108 expone la secuencia de am noácidos para TcdA deC. difficile2009141 de tipo si lvestre. La SEQ ID NO 109 expone la secuencia de am noácidos para TcdA deC. difficile2009292 de tipo si lvestre. La SEQ ID NO 110 expone la secuencia de am noácidos para TcdB deC. difficile2004013 de tipo si lvestre. La SEQ ID NO 111 expone la secuencia de am noácidos para TcdB deC. difficile2004111 de tipo si lvestre. La SEQ ID NO 112 expone la secuencia de am noácidos para TcdB deC. difficile2004118 de tipo si lvestre. La SEQ ID NO 113 expone la secuencia de am noácidos para TcdB deC. difficile2004205 de tipo si lvestre. La SEQ ID NO 114 expone la secuencia de am noácidos para TcdB deC. difficile2004206 de tipo si lvestre. La SEQ ID NO 115 expone la secuencia de am noácidos para TcdB deC. difficile2005022 de tipo si lvestre. La SEQ ID NO 116 expone la secuencia de am noácidos para TcdB deC. difficile2005088 de tipo si lvestre. La SEQ ID NO 117 expone la secuencia de am noácidos para TcdB deC. difficile2005283 de tipo si lvestre. La SEQ ID NO 118 expone la secuencia de am noácidos para TcdB deC. difficile2005325 de tipo si lvestre. La SEQ ID NO 119 expone la secuencia de am noácidos para TcdB deC. difficile2005359 de tipo si lvestre. La SEQ ID NO 120 expone la secuencia de am noácidos para TcdB deC. difficile2006017 de tipo si lvestre. La SEQ ID NO 121 expone la secuencia de am noácidos para TcdB deC. difficile2006376 de tipo si lvestre. La SEQ ID NO 122 expone la secuencia de am noácidos para TcdB deC. difficile2007070 de tipo si lvestre. La SEQ ID NO 123 expone la secuencia de am noácidos para TcdB deC. difficile2007217 de tipo si lvestre. La SEQ ID NO 124 expone la secuencia de am noácidos para TcdB deC. difficile2007302 de tipo si lvestre. La SEQ ID NO 125 expone la secuencia de am noácidos para TcdB deC. difficile2007816 de tipo si lvestre. La SEQ ID NO 126 expone la secuencia de am noácidos para TcdB deC. difficile2007838 de tipo si lvestre. La SEQ ID NO 127 expone la secuencia de am noácidos para TcdB deC. difficile2007858 de tipo si lvestre. La SEQ ID NO 128 expone la secuencia de am noácidos para TcdB deC. difficile2007886 de tipo si lvestre. La SEQ ID NO 129 expone la secuencia de am noácidos para TcdB deC. difficile2008222 de tipo si lvestre. La SEQ ID NO 130 expone la secuencia de am noácidos para TcdB deC. difficile2009078 de tipo si lvestre. La SEQ ID NO 131 expone la secuencia de am noácidos para TcdB deC. difficile2009087 de tipo si lvestre. La SEQ ID NO 132 expone la secuencia de am noácidos para TcdB deC. difficile2009141 de tipo si lvestre. La SEQ ID NO 133 expone la secuencia de am noácidos para TcdB deC. difficile2009292 de tipo si lvestre. La SEQ ID NO 134 expone la secuencia de am noácidos para TcdA deC. difficile014 de tipo si lvestre. La SEQ ID NO 135 expone la secuencia de am noácidos para TcdA deC. difficile015 de tipo si lvestre. La SEQ ID NO 136 expone la secuencia de am noácidos para TcdA deC. difficile020 de tipo si lvestre. La SEQ ID NO 137 expone la secuencia de am noácidos para TcdA deC. difficile023 de tipo si lvestre. La SEQ ID NO 138 expone la secuencia de am noácidos para TcdA deC. difficile027 de tipo si lvestre. La SEQ ID NO 139 expone la secuencia de am noácidos para TcdA deC. difficile029 de tipo si lvestre. La SEQ ID NO 140 expone la secuencia de am noácidos para TcdA deC. difficile046 de tipo si lvestre. La SEQ ID NO 141 expone la secuencia de am noácidos para TcdB deC. difficile014 de tipo si lvestre. La SEQ ID NO 142 expone la secuencia de am noácidos para TcdB deC. difficile015 de tipo si lvestre. La SEQ ID NO 143 expone la secuencia de am noácidos para TcdB deC. difficile020 de tipo si lvestre. La SEQ ID NO 144 expone la secuencia de am noácidos para TcdB deC. difficile023 de tipo si lvestre. La SEQ ID NO 145 expone la secuencia de am noácidos para TcdB deC. difficile027 de tipo si lvestre. La SEQ ID NO 146 expone la secuencia de am noácidos para TcdB deC. difficile029 de tipo si lvestre. La SEQ ID NO 147 expone la secuencia de am noácidos para TcdB deC. difficile046 de tipo si lvestre. La SEQ ID NO 148 expone la secuencia de am noácidos para TcdA deC. difficile001 de tipo si lvestre. La SEQ ID NO 149 expone la secuencia de am noácidos para TcdA deC. difficile002 de tipo si lvestre. La SEQ ID NO 150 expone la secuencia de am noácidos para TcdA deC. difficile003 de tipo si lvestre. La SEQ ID NO 151 expone la secuencia de am noácidos para TcdA deC. difficile004 de tipo si lvestre. La SEQ ID NO 152 expone la secuencia de am noácidos para TcdA deC. difficile070 de tipo si lvestre. La SEQ ID NO 153 expone la secuencia de am noácidos para TcdA deC. difficile075 de tipo si lvestre. La SEQ ID NO 154 expone la secuencia de am noácidos para TcdA deC. difficile077 de tipo si lvestre.

La SEQ ID NO 155 expone la secuencia de aminoácidos para TcdA deC. difficile081 de tipo silvestre

La SEQ ID NO 156 expone la secuencia de aminoácidos para TcdA deC. difficile117 de tipo silvestre

La SEQ ID NO 157 expone la secuencia de aminoácidos para TcdA deC. difficile131 de tipo silvestre

La SEQ ID NO 158 expone la secuencia de aminoácidos para TcdB deC. difficile001 de tipo silvestre

La SEQ ID NO 159 expone la secuencia de aminoácidos para TcdB deC. difficile002 de tipo silvestre

La SEQ ID NO 160 expone la secuencia de aminoácidos para TcdB deC. difficile003 de tipo silvestre

La SEQ ID NO 161 expone la secuencia de aminoácidos para TcdB deC. difficile004 de tipo silvestre

La SEQ ID NO 162 expone la secuencia de aminoácidos para TcdB deC. difficile070 de tipo silvestre

La SEQ ID NO 163 expone la secuencia de aminoácidos para TcdB deC. difficile075 de tipo silvestre

La SEQ ID NO 164 expone la secuencia de aminoácidos para TcdB deC. difficile077 de tipo silvestre

La SEQ ID NO 165 expone la secuencia de aminoácidos para TcdB deC. difficile081 de tipo silvestre

La SEQ ID NO 166 expone la secuencia de aminoácidos para TcdB deC. difficile117 de tipo silvestre

La SEQ ID NO 167 expone la secuencia de aminoácidos para TcdB deC. difficile131 de tipo silvestre

La SEQ ID NO 168 expone la secuencia de aminoácidos para TcdA deC. difficile053 de tipo silvestre

La SEQ ID NO 169 expone la secuencia de aminoácidos para TcdA deC. difficile078 de tipo silvestre

La SEQ ID NO 170 expone la secuencia de aminoácidos para TcdA deC. difficile087 de tipo silvestre

La SEQ ID NO 171 expone la secuencia de aminoácidos para TcdA deC. difficile095 de tipo silvestre

La SEQ ID NO 172 expone la secuencia de aminoácidos para TcdA deC. difficile126 de tipo silvestre

La SEQ ID NO 173 expone la secuencia de aminoácidos para TcdB deC. difficile053 de tipo silvestre

La SEQ ID NO 174 expone la secuencia de aminoácidos para TcdB deC. difficile078 de tipo silvestre

La SEQ ID NO 175 expone la secuencia de aminoácidos para TcdB deC. difficile087 de tipo silvestre

La SEQ ID NO 176 expone la secuencia de aminoácidos para TcdB deC. difficile095 de tipo silvestre

La SEQ ID NO 177 expone la secuencia de aminoácidos para TcdB deC. difficile126 de tipo silvestre

Descripción detallada

Sorprendentemente, los inventores descubrieron, entre otras cosas, una toxina A y toxina B mutantes deC. difficiley procedimientos de las mismas. Los mutantes se caracterizan, en parte, por ser inmunogénicos y presentar citotoxicidad reducida en comparación con una forma de tipo silvestre de la toxina respectiva. La presente divulgación también se refiere a porciones inmunogénicas de las mismas, a equivalentes biológicos de las mismas y a polinucleótidos aislados que incluyen secuencias de ácido nucleico que codifican cualquiera de los anteriores.

Las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento demostraron de manera inesperada la capacidad de inducir nuevos anticuerpos neutralizantes contra toxinas deC. difficiley pueden tener la capacidad de conferir protección activa y/o pasiva contra una exposición aC. difficile.Los nuevos anticuerpos están dirigidos contra diversos epítopos de toxina A y toxina B. Los inventores descubrieron además que una combinación de al menos dos de los anticuerpos monoclonales neutralizantes puede presentar un efecto inesperadamente sinérgico en la respectiva neutralizaciónin vitrode la toxina A y la toxina B.

Las composiciones de la invención descritas en el presente documento pueden usarse para tratar, prevenir, disminuir el riesgo de, disminuir la aparición de, disminuir la gravedad de y/o retrasar el inicio de una infección porC. diffiále,una afección, síndrome o enfermedad asociada aC. difficile(CDAD), síntoma y/o complicación de la misma en un mamífero, en comparación con un mamífero al que no se le ha administrado la composición.

Además, los inventores descubrieron una célula deC. difficileasporogénica recombinante que puede expresar de manera estable la toxina A y la toxina B mutantes deC. difficiley nuevos procedimientos para producirla.

Composiciones inmunogénicas

En un aspecto, La invención se refiere a una composición inmunogénica que incluye una toxina mutante deC. difficilecomo se define en las reivindicaciones adjuntas. La toxina mutante deC. difficileincluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una mutación en un dominio de glucosiltransferasa y al menos una mutación en un dominio de cisteína proteasa, con respecto a la toxina deC. difficilede tipo silvestre correspondiente.

La expresión "tipo silvestre", como se usa en el presente documento, Se refiere a la forma encontrada en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptido o polinucleótido de tipo silvestre es una secuencia presente en un organismo que puede aislarse a partir de una fuente en la naturaleza y que no se ha modificado de forma intencionada por manipulación humana. La presente invención también se refiere a polinucleótidos aislados que incluyen secuencias de ácido nucleico que codifican cualquiera de los anteriores. Además, la presente invención se refiere al uso de cualquiera de las composiciones anteriores para tratar, prevenir, disminuir el riesgo de, disminuir la gravedad de, disminuir la aparición y/o retrasar el inicio de una infección porC. difficile,afección, síndrome o enfermedad asociada aC. difficile, síntoma y/o complicación de la misma en un mamífero, en comparación con un mamífero al que no se le ha administrado la composición, así como a procedimientos para preparar dichas composiciones.

Tal como se usa en el presente documento, una "composición inmunogénica" o "inmunógeno" se refiere a una composición que induce una respuesta inmunitaria en un mamífero al que se administra la composición.

Una "respuesta inmunitaria" se refiere al desarrollo de una respuesta humoral (mediada por anticuerpos) y/o celular (mediada por linfocitos T específicos de antígeno o sus productos de secreción) dirigida contra una toxina deC. diffidleen un paciente receptor. La respuesta inmunitaria puede ser humoral, celular o de ambos tipos.

La respuesta inmunitaria puede ser una respuesta activa inducida por la administración de una composición inmunogénica, un inmunógeno. Como alternativa, La respuesta inmunitaria puede ser una respuesta pasiva inducida por la administración de anticuerpos o linfocitos T cebados.

La presencia de una respuesta inmunitaria humoral (mediada por anticuerpos) se puede determinar, por ejemplo, por ensayos basados en células conocidos en la técnica, tales como un ensayo de anticuerpos neutralizantes, ELISA, etc.

Una respuesta inmunitaria celular se induce típicamente mediante la presentación de epítopos polipeptídicos en asociación con moléculas del MHC de Clase I o de Clase II para activar linfocitos T auxiliares CD4 específicos de antígeno y/o linfocitos T citotóxicos CD8 . La respuesta también puede implicar la activación de monocitos, macrófagos, células NK, basófilos, células dendríticas, astrocitos, células de microglía, eosinófilos u otros componentes de la inmunidad innata. La presencia de una respuesta inmunológica mediada por células puede determinarse mediante ensayos de proliferación (linfocitos T CD4 ) o ensayos de CTL (linfocitos T citotóxicos) conocidos en la técnica.

En una realización, la composición inmunogénica es una composición de vacuna. Tal como se usa en el presente documento, una "composición de vacuna" es una composición que induce una respuesta inmunitaria en un mamífero al que se administra la composición. La composición de vacuna puede proteger al mamífero inmunizado contra la exposición posterior por un agente inmunizante o un agente con reacción inmunológica cruzada. La protección puede ser completa o parcial con respecto a la reducción de los síntomas o la infección en comparación con un mamífero no vacunado en las mismas condiciones.

Las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento tienen reactividad cruzada, lo cual se refiere a que tienen la característica de poder inducir una respuesta inmunitaria eficaz (por ejemplo, respuesta inmunitaria humoral) contra una toxina producida por otra cepa deC. difficileque es diferente de la cepa de la cual procede la composición. Por ejemplo, las composiciones inmunogénicas (por ejemplo, derivadas deC. difficile630) descritas en el presente documento pueden inducir anticuerpos con reactividad cruzada que pueden unirse a toxinas producidas por múltiples cepas deC. difficile(por ejemplo, toxinas producidas porC. difficileR20291 y VPI10463). Véanse, por ejemplo, el Ejemplo 37. La reactividad cruzada es indicativa del potencial de protección cruzada del inmunógeno bacteriano, y viceversa.

La expresión "protección cruzada", como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad de la respuesta inmunitaria inducida por una composición inmunogénica para prevenir o atenuar la infección por una cepa bacteriana diferente o especies del mismo género. Por ejemplo, una composición inmunogénica (por ejemplo, derivada deC. difficile630) descrita en el presente documento puede inducir una respuesta inmunitaria eficaz en un mamífero para atenuar una infección porC. difficiley/o para atenuar una enfermedad deC. difficilecausada por una cepa distinta de 630 (por ejemplo,C. difficileR20291) en el mamífero.

Los mamíferos ejemplares en los que la composición inmunogénica o inmunógeno induce una respuesta inmunitaria incluyen cualquier mamífero, tal como, por ejemplo, ratones, hámsteres, primates y seres humanos. En una realización preferida, la composición inmunogénica o inmunógeno induce una respuesta inmunitaria en un ser humano al que se administra la composición.

Como se ha descrito anteriormente, la toxina A (TcdA) y la toxina B (TcdB) son glucosiltransferasas homólogas que inactivan GTPasas pequeñas de la familia Rho/Rac/Ras. La acción de TcdA y TcdB en células diana de mamífero depende de un mecanismo de múltiples etapas de endocitosis mediada por receptor, translocación a través de la membrana, procesamiento autoproteolítico y monoglucosilación de GTPasas. Muchas de estas actividades funcionales se han atribuido a regiones discretas dentro de la secuencia primaria de las toxinas, y se han tomado imágenes de las toxinas para demostrar que estas moléculas tienen una estructura similar.

El gen de tipo silvestre para TcdA tiene aproximadamente 8130 nucleótidos que codifican una proteína que tiene un peso molecular deducido de aproximadamente 308 kDa, que tiene aproximadamente 2710 aminoácidos. Tal como se usa en el presente documento, una TcdA deC. difficilede tipo silvestre incluye una TcdA deC. difficilede cualquier cepa deC. difficilede tipo silvestre. Una TcdA deC. difficilede tipo silvestre puede incluir una secuencia de aminoácidos de TcdA deC. difficilede tipo silvestre que tiene al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, preferentemente aproximadamente un 98%, más preferentemente aproximadamente un 99% o aún más preferentemente aproximadamente un 100% de identidad con la SEQ ID NO: 1 (longitud completa) cuando están alineadas de manera óptima, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT que utilizan ponderaciones de huecos por defecto.

En una realización preferida, la TcdA deC. difficilede tipo silvestre incluye una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1, que describe la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre para TcdA de la cepa 630 deC. difficile(también divulgada en el número de referencia del GenBank YP_001087137.1 y/o CAJ67494.1). En la técnica se sabe que la cepa 630 deC. difficilees una cepa del ribotipo 012 por PCR. La SEQ ID NO: 9 describe el gen de tipo silvestre para TcdA de la cepa 630 deC. difficile,que también se divulga en el número de registro del GenBank NC_009089.1.

Otro ejemplo de una TcdA deC. diffidlede tipo silvestre incluye una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 15, que describe la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre para TcdA de la cepa R20291 deC. difficile(también divulgada en el número de registro del GenBank YP_003217088.1). En la técnica se sabe que la cepa R20291 deC. difficilees una cepa hipervirulenta y una cepa de ribotipo 027 por PCR. La secuencia de aminoácidos para TcdA de la cepa R20291 deC. difficiletiene aproximadamente un 98% de identidad con la SEQ ID NO: 1. La SEQ ID NO: 16 describe el gen de tipo silvestre para TcdA de la cepa R20291 deC. difficile,que también se divulga en el número de registro del GenBank NC_013316.1.

Un ejemplo adicional de una TcdA deC. difficilede tipo silvestre incluye una secuencia de aminoácidos expuesta en la s Eq ID NO: 17, que describe la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre para TcdA de la cepa CD196 deC. difficile(también divulgada en el número de registro del GenBank CBA61156.1). CD196 es una cepa de un brote canadiense reciente, y se conoce en la técnica como una cepa de ribotipo 027 por PCR. La secuencia de aminoácidos para TcdA de la cepa CD196 deC. difficiletiene aproximadamente un 98% de identidad con la SEQ ID NO: 1 y tiene una identidad de aproximadamente el 100% con TcdA de la cepa R20291 deC. difficile.La SEQ ID NO: 18 describe el gen de tipo silvestre para TcdA de la cepa CD196 deC. difficile,que también se divulga en el número de registro del GenBank FN538970.1.

Otros ejemplos de una secuencia de aminoácidos para una TcdA deC. difficilede tipo silvestre incluyen la SEQ ID NO: 19, que describe la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre para TcdA de la cepa VPI10463 deC. difficile(también divulgada en el número de registro del GenBank CAA63564.1). La secuencia de aminoácidos para TcdA de la cepa VPI10463 deC. difficiletiene aproximadamente el 100% (99,8%) de identidad con la SEQ ID NO: 1. La SEQ ID NO: 20 describe el gen de tipo silvestre para TcdA de la cepa VPI10463 deC. difficile,que también se divulga en el número de registro del GenBank X92982.1.

Otros ejemplos de una TcdA deC. difficilede tipo silvestre incluyen TcdA de cepas deC. difficilede tipo silvestre que se pueden obtener a partir de los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC, Atlanta, GA). Los inventores descubrieron que la secuencia de aminoácidos de la TcdA de las cepas deC. difficilede tipo silvestre que se pueden obtener a partir de los CDC incluye al menos de aproximadamente un 99,3% a un 100% de identidad, cuando se alinea de manera óptima, con los restos de aminoácido 1 a 821 de la SEQ ID NO: 1 (TcdA deC. difficile630). Véase la Tabla 1.

Los inventores también descubrieron que la secuencia de aminoácidos de TcdA de cepas deC. difficilede tipo silvestre puede incluir al menos de aproximadamente un 90%, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, a aproximadamente un 100% de identidad, cuando se alinea de manera óptima (por ejemplo, cuando se alinean de manera óptima secuencias de longitud completa) con la SEQ ID NO: 1.

Tabla 1: cepas deC. difficile detipo silvestre obtenidas de CDC y el porcentaje de identidad de los restos de aminoácido 1-821 de TcdA de la cepa deC. difficilede tipo silvestre respectiva con los restos de aminoácido 1-821 de la SEQ ID NO: 1, cuando se alinean de manera óptima.

En consecuencia, en una realización, la secuencia de aminoácidos de la TcdA deC. diffidlede tipo silvestre incluye una secuencia de al menos aproximadamente 500, 600, 700 u 800 restos contiguos, que tiene al menos aproximadamente un 90%, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, preferentemente aproximadamente un 98%, más preferentemente aproximadamente un 99%, o aún más preferentemente aproximadamente un 100% de identidad con una secuencia de igual longitud entre los restos 1 a 900 de la SEQ ID NO: 1 cuando se alinean de manera óptima, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT que utilizan ponderaciones de huecos por defecto. Los ejemplos incluyen las cepas descritas anteriormente (por ejemplo, R20291, CD196, etc.) y las enumeradas en la Tabla 1.

En otra realización, la secuencia de aminoácidos de la TcdA deC. difficilede tipo silvestre incluye una secuencia que tiene al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, preferentemente aproximadamente un 97%, preferentemente aproximadamente un 98%, más preferentemente aproximadamente un 99% o aún más preferentemente aproximadamente un 100% de identidad con cualquier secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 87-109 cuando se alinean de manera óptima. Véase la Tabla 1-a.

El gen de tipo silvestre para TcdB tiene aproximadamente 7098 nucleótidos que codifican una proteína con un peso molecular deducido de aproximadamente 270 kDa, que tiene aproximadamente 2366 aminoácidos. Tal como se usa en el presente documento, una TcdB deC. diffidlede tipo silvestre incluye una TcdB deC. difficilede cualquier cepa deC. difficilede tipo silvestre. Una TcdB deC. difficilede tipo silvestre puede incluir una secuencia de aminoácidos de tipo silvestre que tiene al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, preferentemente aproximadamente un 98%, más preferentemente aproximadamente un 99% o aún más preferentemente aproximadamente un 100% de identidad con la SEQ ID NO: 2 cuando se alinean de manera óptima, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT que utilizan ponderaciones de huecos por defecto. En una realización preferida, la TcdB deC. difficilede tipo silvestre incluye una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2, que describe la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre para TcdB de la cepa 630 deC. difficile(también divulgada en el número de registro del GenBank YP_001087135.1 y/o CAJ67492). La SEQ ID NO: 10 describe el gen de tipo silvestre para TcdB de la cepa 630 deC. difficile,que también se divulga en el número de registro del GenBank NC_009089.1.

Otro ejemplo de una TcdB deC. difficilede tipo silvestre incluye una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 21, que describe la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre para TcdB de la cepa R20291 deC. difficile(también divulgada en el número de registro del GenBank YP_003217086.1 y/o CBE02479.1). La secuencia de aminoácidos para TcdB de la cepa R20291 deC. difficiletiene aproximadamente un 92% de identidad con la SEQ ID NO: 2. La SEQ ID NO: 22 describe el gen de tipo silvestre para TcdB de la cepa R20291 deC. difficile,que también se divulga en el número de registro del GenBank NC_013316.1.

Un ejemplo adicional de una TcdB deC. difficilede tipo silvestre incluye una secuencia de aminoácidos expuesta en la s Eq ID NO: 23, que describe la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre para TcdB de la cepa CD196 deC. difficile(también divulgada en el número de registro del GenBank YP_003213639.1 y/o CBA61153.1). La SEQ ID NO: 24 describe el gen de tipo silvestre para TcdB de la cepa CD196 deC. difficile,que también se divulga en el número de registro del GenBank NC_013315.1. La secuencia de aminoácidos para TcdB de la cepa CD196 deC. difficiletiene aproximadamente un 92% de identidad con la SEQ ID NO: 2.

Otros ejemplos de una secuencia de aminoácidos para una TcdB deC. difficilede tipo silvestre incluyen la SEQ ID NO: 25, que describe la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre para TcdB de la cepa VPI10463 deC. difficile(también divulgada en el número de registro del GenBank P18177 y/o CAA37298). La secuencia de aminoácidos para TcdB de la cepa VPI10463 deC. difficiletiene una identidad del 100% con la SEQ ID NO: 2. La SEQ ID NO: 26 describe el gen de tipo silvestre para TcdB de la cepa VPI10463 deC. difficile,que también se divulga en el número de registro del GenBank X53138.1.

Otros ejemplos de una TcdB deC. difficilede tipo silvestre incluyen TcdB de cepas deC. difficilede tipo silvestre que se pueden obtener a partir de los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC, Atlanta, GA). Los inventores descubrieron que la secuencia de aminoácidos de la TcdB de las cepas deC. difficilede tipo silvestre que se pueden obtener a partir de los CDC incluye al menos de aproximadamente un 96 % a un 100% de identidad, cuando se alinea de manera óptima, con los restos de aminoácido 1 a 821 de la SEQ ID NO: 2 (TcdB deC. difficile630). Véase la Tabla 2.

Tabla 2: cepas deC. difficilede tipo silvestre obtenidas de CDC y el % de identidad de los restos de aminoácido 1 821 de TcdB de la cepa deC. difficilede tipo silvestre respectiva con los restos de aminoácido 1-821 de la SEQ ID NO: 2, cuando se alinean de manera óptima.

En consecuencia, en una realización, una secuencia de aminoácidos de la TcdB deC. diffiálede tipo silvestre incluye una secuencia de al menos aproximadamente 500, 600, 700 u 800 restos contiguos, que tiene al menos aproximadamente un 90%, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, preferentemente aproximadamente un 97 %, preferentemente aproximadamente un 98%, más preferentemente aproximadamente un 99 % o aún más preferentemente aproximadamente un 100% de identidad con una secuencia de igual longitud entre los restos 1 a 900 de la SEQ ID NO: 2 cuando se alinean de manera óptima, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT que utilizan ponderaciones de huecos por defecto. Los ejemplos incluyen las cepas descritas anteriormente (por ejemplo, R20291, CD196, etc.) y las enumeradas en la Tabla 2.

En otra realización, la secuencia de aminoácidos de la TcdB deC. difficilede tipo silvestre incluye una secuencia que tiene al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, preferentemente aproximadamente un 97 %, preferentemente aproximadamente un 98%, más preferentemente aproximadamente un 99% o aún más preferentemente aproximadamente un 100% de identidad con cualquier secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 110-133 cuando se alinean de manera óptima. Véase la Tabla 2-a.

Los genes de las toxinas A y B(tcdAytcdB)forman parte de un locus genético de 19,6 kb (el locus de patogenicidad, PaLoc) que incluye 3 marcos pequeños adicionales de lectura abierta (ORF),tcdD, tcdEytcdC,y pueden considerarse útiles para la virulencia. Se sabe que PaLoc es estable y está conservado en cepas toxigénicas. Está presente en el mismo sitio de integración cromosómica en todas las cepas toxigénicas que se han analizado hasta la fecha. En cepas no toxigénicas, el locus de patogenicidad (PaLoc) no está presente. En consecuencia, una característica de las cepas deC. difficilede tipo silvestre descritas en el presente documento es la presencia de un locus de patogenicidad. Otra característica preferida de las cepas deC. difficilede tipo silvestre descritas en el presente documento es la producción tanto de TcdA como de TcdB.

En un aspecto, la cepa deC. difficilede tipo silvestre es una cepa que tiene un locus de patogenicidad que es al menos aproximadamente un 90%, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, preferentemente aproximadamente un 98%, más preferentemente aproximadamente un 99% o aún más preferentemente aproximadamente un 100% idéntico al deC. diffidle630 o VPI10463. La secuencia total del locus de patogenicidad deC. difficileVPI10463, está registrada en la base de datos EMBL con el número de registro de secuencia X92982, también mostrada en la SEQ ID NO: 26. Las cepas en las que el PaLoc es idéntico al de la cepa de referencia VPI10463 se denominan cepas de toxinotipo 0. Las cepas de toxinotipos I-VII, IX, XII-XV y XVIII-XXIV producen tanto TcdA como TcdB a pesar de las variaciones en sus genes de toxinas.

En el extremo N de las toxinas, está localizado el dominio glucosiltransferasa. La actividad glucosiltransferasa de las toxinas está asociada con la función citotóxica de las toxinas. Sin pretender quedar vinculados a ningún mecanismo o teoría, se cree que la actividad glucosiltransferasa en ambas toxinas cataliza la monoglucosilación de proteínas pequeñas de unión a GTP en la superfamilia Rho/Rac/Ras. Después de la glucosilación de estas proteínas de unión a GTP, la fisiología celular se modifica de manera espectacular, dando como resultado una pérdida de integridad estructural y la interrupción de rutas de señalización esenciales de las células huésped infectadas por las toxinas. El motivo Asp-Xaa-Asp (DXD), que está involucrado en la unión de manganeso, de difosfato de uridina (UDP) y de glucosa, es una característica típica del dominio glucosiltransferasa. Sin pretender quedar vinculados a ningún mecanismo o teoría, se cree que ciertos restos críticos para la actividad catalítica, tales como el motivo DXD, no varían entre una TcdB de una cepa "histórica" conocida, tal como 630, y una TcdB de una cepa hipervirulenta, tal como R20291. El motivo DXD está situado en los restos 285 a 287 de una TcdA deC. diffidlede tipo silvestre, de acuerdo con la numeración de la SEQ ID NO: 1, y en los restos 286 a 288 de un TcdB deC. difficilede tipo silvestre, de acuerdo con la numeración de la SEQ ID NO: 2.

En la técnica se conocen algoritmos de alineación global (por ejemplo, programas de análisis de secuencias) y pueden usarse para alinear de manera óptima dos o más secuencias de toxinas de aminoácidos para determinar si la toxina incluye un motivo de firma particular (por ejemplo, DXD en el dominio de glucosiltransferasa, DHC en el dominio de cisteína proteasa descrito más adelante, etc.). La secuencia o secuencias alineadas de manera óptima se comparan con una secuencia de referencia respectiva (por ejemplo, la SEQ ID NO: 1 para TcdA o la SEQ ID NO: 2 para TcdB) para determinar la existencia del motivo de la firma. "Alineamiento óptimo" se refiere a un alineamiento que proporciona el mayor porcentaje de puntuación de identidad. Dicho alineamiento se puede realizar utilizando programas de análisis de secuencias conocidos. En una realización, se usa un alineamiento CLUSTAL (tal como CLUSTALW) bajo parámetros por defecto para identificar toxinas de tipo silvestre adecuadas mediante la comparación de la secuencia de consulta con la secuencia de referencia. La numeración relativa de los restos de aminoácido conservados se basa en la numeración de restos de la secuencia de aminoácidos de referencia para tener en cuenta pequeñas inserciones o deleciones (por ejemplo, de cinco aminoácidos de menos) dentro de la secuencia alineada.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "de acuerdo con la numeración de" se refiere a la numeración de los restos de una secuencia de referencia cuando la secuencia de aminoácidos o polinucleotídica dada se compara con la secuencia de referencia. En otras palabras, se designa el número o la posición de restos de un polímero dado con respecto a la secuencia de referencia en lugar de por la posición numérica real del resto dentro de la secuencia de aminoácidos o polinucleotídica dada.

Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos dada, tal como la de una cepa hipervirulenta deC. difficilede tipo silvestre, puede alinearse con una secuencia de referencia (por ejemplo, tal como la de una cepa histórica deC. difficilede tipo silvestre, por ejemplo, 630) introduciendo huecos, si es necesario, para optimizar las coincidencias de restos entre las dos secuencias. En estos casos, aunque estén presentes los huecos, la numeración del resto en la secuencia de aminoácidos o polinucleotídica dada se realiza con respecto a la secuencia de referencia con la que se ha alineado. Tal como se usa en el presente documento, una "secuencia de referencia" se refiere a una secuencia definida usada como base para una comparación de secuencias.

A menos que se indique otra cosa, todas las referencias en el presente documento a las posiciones de aminoácidos de una TcdA se refieren a la numeración de la SEQ ID NO: 1. A menos que se indique otra cosa, todas las referencias en el presente documento a las posiciones de aminoácidos de una TcdB se refieren a la numeración de la SEQ ID NO: 2.

El dominio de glucosiltransferasa de TcdA, como se usa en el presente documento, puede comenzar en el resto ejemplar 1, 101 o 102, y puede terminar en el resto ejemplar 542, 516 o 293 de una TcdA deC. difficilede tipo silvestre, por ejemplo, SEQ ID NO: 1. Puede combinarse cualquier posición mínima de resto con una posición máxima de resto entre los restos 1 y 542 de TcdA para definir una secuencia para el dominio de glucosiltransferasa siempre que se incluya la región del motivo DXD. Por ejemplo, en una realización, el dominio de glucosiltransferasa de TcdA incluye la SEQ ID NO: 27, que es idéntica a los restos 101-293 de la SEQ ID NO: 1, e incluye la región del motivo DXD. En otra realización, el dominio de glucosiltransferasa de TcdA incluye la SEQ ID NO: 28, que es idéntica a los restos 1 542 de la SEQ ID NO: 1.

El dominio de glucosiltransferasa de TcdB, como se usa en el presente documento, puede comenzar en el resto ejemplar 1, 101 o 102, y puede terminar en el resto ejemplar 543, 516 o 293 de una TcdB deC. difficilede tipo silvestre, por ejemplo, SEQ ID NO: 2. Puede combinarse cualquier posición mínima de resto con una posición máxima de resto entre los restos 1 y 543 de TcdB para definir una secuencia para el dominio de glucosiltransferasa siempre que se incluya la región del motivo DXD. Por ejemplo, en una realización, el dominio de glucosiltransferasa de TcdB incluye la SEQ ID NO: 29, que es idéntica a los restos 101-293 de la SEQ ID NO: 2, e incluye la región del motivo DXD. En otra realización, el dominio de glucosiltransferasa de TcdB incluye la SEQ ID NO: 30, que es idéntica a los restos 1 543 de la SEQ ID NO: 2.

Sin quedar ligado a ninguna teoría o mecanismo, se cree que el extremo N de TcdA y/o TcdB se escinde mediante un proceso autoproteolítico para que el dominio de glucosiltransferasa se transloque y se libere en el citosol de la célula huésped, en la que puede interactuar con GTPasas Rac/Ras/Rho. Se ha demostrado que la TcdA deC. difficilede tipo silvestre se escinde entre L542 y S543. Se ha demostrado que la TcdB deC. difficilede tipo silvestre se escinde entre L543 y G544.

El dominio de cisteína proteasa está asociado con la actividad proteolítica autocatalítica de la toxina. El dominio de cisteína proteasa está situado cadena abajo del dominio de glucosiltransferasa y se puede caracterizar por la tríada catalítica aspartato, histidina y cisteína (DHC), por ejemplo, D589, H655 y C700 de una TcdA de tipo silvestre y D587, H653 y C698 de una TcdB de tipo silvestre. Sin pretender quedar vinculados a ningún mecanismo o teoría, se cree que la tríada catalítica está conservada entre una toxina de una cepa "histórica", tal como 630, y una TcdB de una cepa hipervirulenta, tal como R20291.

El dominio de cisteína proteasa de TcdA, como se usa en el presente documento, puede comenzar en el resto ejemplar 543, y puede terminar en el resto ejemplar 809 769, 768, o 767 de una TcdA de tipo silvestre, por ejemplo, S<e>Q ID NO: 1. Cualquier posición mínima de resto puede combinarse con una posición máxima de resto entre 543 y 809 de una TcdA de tipo silvestre para definir una secuencia para el dominio de cisteína proteasa siempre que se incluya la región del motivo DHC de la tríada catalítica. Por ejemplo, en una realización, el dominio de cisteína proteasa de TcdA incluye la SEQ ID NO: 32, que tiene la región del motivo DHC situada en los restos 47, 113 y 158 de la SEQ ID NO: 32, que corresponden respectivamente a D589, H655 y C700 de un TcdA de tipo silvestre se acuerdo con la numeración de la SEQ ID NO: 1. La SEQ ID NO: 32 es idéntica a los restos 543 a 809 de la SEQ ID NO: 1, TcdA.

El dominio de cisteína proteasa de TcdB, como se usa en el presente documento, puede comenzar en el resto ejemplar 544, y puede terminar en el resto ejemplar 801, 767, 755, o 700 de una TcdB de tipo silvestre, por ejemplo, SEQ ID NO: 2. Cualquier posición mínima de resto puede combinarse con una posición máxima de resto entre 544 y 801 de una TcdB de tipo silvestre para definir una secuencia para el dominio de cisteína proteasa siempre que se incluya la región del motivo DHC de la tríada catalítica. Por ejemplo, en una realización, el dominio de cisteína proteasa de TcdB incluye la SEQ ID NO: 33, que incluye la región del motivo DHC situada en los restos 44, 110 y 115 de la SEQ ID NO: 33, que corresponden respectivamente a D587, H653 y C698 de una TcdB de tipo silvestre de acuerdo con la numeración de la SEQ ID No : 2. La SEQ ID NO: 33 es idéntica a los restos 544 a 767 de la SEQ ID NO: 2, TcdB. En otra realización, el dominio de cisteína proteasa de TcdB incluye los restos 544-801 de la SEQ ID NO: 2, TcdB.

En la presente invención, la composición inmunogénica incluye una toxina mutante deC. diffiále.El término "mutante", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula que muestra una estructura o secuencia que difiere de la estructura o secuencia de tipo silvestre correspondiente, por ejemplo, por tener entrecruzamientos en comparación con la estructura de tipo silvestre correspondiente y/o por tener al menos una mutación, en comparación con la secuencia de tipo silvestre correspondiente cuando se alinea de manera óptima, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT que utilizan ponderaciones de huecos por defecto. El término "mutante", como se usa en el presente documento, incluye además una molécula que presenta una propiedad funcional (por ejemplo, actividad de glucosiltransferasa anulada y/o actividad de cisteína proteasa anulada) que difiere de la molécula de tipo silvestre correspondiente.

Se puede usar una toxina deC. difficilede cualquiera de las cepas de tipo silvestre descritas anteriormente como fuente a partir de la cual se produce una toxina mutante deC. difficile.Preferentemente,C. difficile630 es la fuente a partir de la cual se produce una toxina mutante deC. difficile.

La mutación puede implicar una sustitución, deleción, truncamiento o modificación del resto de aminoácido de tipo silvestre normalmente situado en esa posición. Preferentemente, La mutación es una sustitución de aminoácido no conservativa. La presente divulgación también contempla polinucleótidos aislados que incluyen secuencias de ácido nucleico que codifican cualquiera de las toxinas mutantes descritas en el presente documento.

Una sustitución de aminoácido "no conservativa", como se usa en el presente documento, se refiere a un intercambio de un aminoácido de una clase por un aminoácido de otra clase, de acuerdo con la siguiente Tabla 3:

Los ejemplos de una sustitución de aminoácidos no conservativa incluyen una sustitución en la que un resto de ácido aspártico (Asp, D) se reemplaza por un resto de alanina (Ala, A). Otros ejemplos incluyen reemplazar un resto de ácido aspártico (Asp, D) con un resto de asparagina (Asn, N); o reemplazar un resto de arginina (Arg, R), ácido glutámico (Glu, E), lisina (Lys, K) y/o histidina (His, H) con un resto de alanina (Ala, A).

Una sustitución conservativa se refiere a un intercambio entre aminoácidos de la misma clase, por ejemplo, de acuerdo con la Tabla 3.

Las toxinas mutantes de la invención se pueden preparar mediante técnicas conocidas en este campo para preparar mutaciones, tal como, por ejemplo, mutagénesis dirigida, mutagénesis usando un mutágeno (por ejemplo, luz UV), etc. Preferentemente, se utiliza la mutagénesis dirigida. Como alternativa, puede sintetizarse directamente una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia objetivo. En la técnica se conocen estos procedimientos de síntesis química.

En la presente divulgación, la toxina mutante deC. difficileincluye al menos una mutación en un dominio de glucosiltransferasa, con respecto a la toxina deC. difficilede tipo silvestre correspondiente. En una realización, el dominio de glucosiltransferasa incluye al menos dos mutaciones. Preferentemente, la mutación disminuye o anula la actividad de la enzima glucosiltransferasa de la toxina, en comparación con la actividad de la enzima glucosiltransferasa de la toxina deC. difficilede tipo silvestre correspondiente.

Los restos de aminoácido ejemplares en un dominio de glucosiltransferasa de TcdA que pueden sufrir una mutación incluyen al menos uno de los siguientes, o cualquier combinación de los mismos: W101, D269, R272, D285, D287, E460, R462, S541 y L542, en comparación con una TcdA deC. difficilede tipo silvestre, de acuerdo con la numeración de la SEQ ID NO: 1.

Las mutaciones ejemplares en un dominio de glucosiltransferasa de TcdA incluyen al menos una de las siguientes, o cualquier combinación de las mismas: W101A, D269A, R272A, D285A, D287A, E460A, R462A, S541A y L542G, en comparación con una TcdA deC. difficilede tipo silvestre. En un aspecto preferido, el dominio de glucosiltransferasa de TcdA incluye una mutación L542G, en comparación con una TcdA deC. difficilede tipo silvestre. En otro aspecto preferido, el dominio de glucosiltransferasa de TcdA incluye una mutación D285A y D287a , en comparación con una TcdA deC. difficilede tipo silvestre.

Los restos de aminoácido ejemplares en un dominio de glucosiltransferasa de TcdB que pueden sufrir una mutación incluyen al menos uno de los siguientes, o cualquier combinación de los mismos: W102, D270, R273, D286, D288, N384, D461, K463, W520 y L543, en comparación con una toxina B deC. difficilede tipo silvestre, de acuerdo con la numeración de la SEQ ID NO: 2.

Las mutaciones ejemplares en un dominio de glucosiltransferasa de TcdB incluyen al menos una de las siguientes, o cualquier combinación de las mismas: W102A, D270A, D270N, R273A, D286A, D288A, N384A, D461A, D461R, K463A, K463E, W520A y L543A, en comparación con una TcdB deC. difficilede tipo silvestre. En un aspecto preferido, el dominio de glucosiltransferasa de TcdB incluye un L543A, en comparación con una TcdB deC. difficilede tipo silvestre. En otro aspecto preferido, el dominio de glucosiltransferasa de TcdB incluye una mutación D286A y una mutación D288A, en comparación con una TcdB deC. difficilede tipo silvestre.

Cualquiera de las mutaciones descritas anteriormente en el presente documento se puede combinar con una mutación en un dominio de cisteína proteasa. En la presente divulgación, la toxina mutante deC. difficileincluye al menos una mutación en un dominio de cisteína proteasa, con respecto a la toxina deC. difficilede tipo silvestre correspondiente. Preferentemente, la mutación disminuye o anula la actividad de la cisteína proteasa de la toxina, en comparación con la actividad de la cisteína proteasa de la toxina deC. difficilede tipo silvestre correspondiente.

Los restos de aminoácido ejemplares en un dominio de cisteína proteasa de TcdA que pueden sufrir una mutación incluyen al menos uno de los siguientes, o cualquier combinación de los mismos: S543, D589, H655 y C700, en comparación con una TcdA deC. difficilede tipo silvestre, de acuerdo con la numeración de la SEQ ID NO: 1. Las mutaciones ejemplares en un dominio de glucosiltransferasa de TcdA incluyen al menos una de las siguientes, o cualquier combinación de las mismas: S543A, D589A, D589N, H655A, C700A, en comparación con una TcdA deC. difficilede tipo silvestre. En un aspecto preferido, el dominio de cisteína proteasa de TcdA incluye una mutación C700A, en comparación con una TcdA deC. difficilede tipo silvestre.

Los restos de aminoácido ejemplares en un dominio de cisteína proteasa de TcdB que pueden sufrir una mutación incluyen al menos uno de los siguientes, o cualquier combinación de los mismos: G544, D587, H653 y C698, en comparación con una TcdB deC. difficilede tipo silvestre, de acuerdo con la numeración de la SEQ ID NO: 2. Las mutaciones ejemplares en un dominio de glucosiltransferasa de TcdB incluyen al menos una de las siguientes, o cualquier combinación de las mismas: G544A, D587A, D587N, H653A, C698A, en comparación con una TcdB deC. difficilede tipo silvestre. En una realización preferida, el dominio de cisteína proteasa de TcdB incluye una mutación C698A, en comparación con una TcdB deC. difficilede tipo silvestre. Otros restos de aminoácido adicionales en un dominio de cisteína proteasa de TcdB que pueden sufrir una mutación incluyen: K600 y/o R751, en comparación con un TcdB de tipo silvestre. Las mutaciones ejemplares incluyen K600E y/o R751E.

En consecuencia, la toxina mutante deC. difficilede la invención incluye un dominio de glucosiltransferasa que tiene una mutación y un dominio de cisteína proteasa que tiene una mutación, con respecto a la toxina deC. difficilede tipo silvestre correspondiente.

Una TcdA mutante deC. difficileejemplar incluye un dominio de glucosiltransferasa que incluye la SEQ ID NO: 29 que tiene una sustitución de aminoácidos en las posiciones 285 y 287, y un dominio de cisteína proteasa que comprende la SEQ ID NO: 32 que tiene una sustitución de aminoácidos en la posición 158, con respecto a la toxina A deC. difficilede tipo silvestre correspondiente. Por ejemplo, dicha TcdA mutante deC. difficileincluye la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 4, en la que, opcionalmente, no está presente la metionina inicial. En otro aspecto, la toxina A mutante deC. difficileincluye la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 83.

Otros ejemplos de una toxina A mutante deC. difficileincluyen la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 7, que tiene una mutación D269A, R272A, D285A, D287a , E460A, R462A y C700A, en comparación con la SEQ ID NO: 1, en la que, opcionalmente, no está presente la metionina inicial. En otro aspecto, la toxina A mutante deC. difficileincluye la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 85.

Otra TcdA mutante ejemplar incluye la SEQ ID NO: 34, en la que los restos en las posiciones 101, 269, 272, 285, 287, 460, 462, 541, 542, 543, 589, 655 y 700 pueden ser cualquier aminoácido.

En algunas realizaciones, la toxina mutante deC. difficilemuestra un procesamiento autoproteolítico disminuido o anulado en comparación con la toxina deC. difficilede tipo silvestre correspondiente. Por ejemplo, una TcdA mutante deC. difficilepuede incluir una mutación en uno de los siguientes restos, o cualquier combinación de las mismas: S541, L542 y/o S543, en comparación con la TcdA deC. difficilede tipo silvestre correspondiente. Preferentemente, la TcdA mutante deC. difficileincluye al menos una de las siguientes mutaciones, o cualquier combinación de las mismas: S541A, L542G y S543A, en comparación con la TcdA deC. difficilede tipo silvestre correspondiente.

Otra TcdA mutante deC. difficileejemplar incluye una mutación S541A, L542, S543 y C700, en comparación con la TcdA deC. difficilede tipo silvestre correspondiente.

Una toxina B mutante deC. difficileejemplar incluye un dominio de glucosiltransferasa que comprende la SEQ ID NO: 31 que tiene una sustitución de aminoácidos en las posiciones 286 y 288, y un dominio de cisteína proteasa que comprende la SEQ ID NO: 33 que tiene una sustitución de aminoácidos en la posición 155, con respecto a la toxina B deC. difficilede tipo silvestre correspondiente. Por ejemplo, dicha TcdB mutante deC. difficileincluye la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 6, en la que, opcionalmente, no está presente la metionina inicial. En otra realización, la toxina B mutante deC. difficileincluye la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 84.

Otros ejemplos de una TcdB mutante deC. difficileincluyen la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 8, que tiene una mutación D270A, R273A, D286A, D288<a>, D461A, K463A y C698A, en comparación con la SEQ ID NO: 2. En la SEQ ID NO: 8 opcionalmente no está presente la metionina inicial. En otra realización, la toxina B mutante deC. difficileincluye la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 86.

Otra TcdB mutante ejemplar incluye la SEQ ID NO: 35, en la que los restos en las posiciones 101, 269, 272, 285, 287, 460, 462, 541, 542, 543, 589, 655 y 700 pueden ser cualquier aminoácido.

Como otro ejemplo, una TcdB mutante deC. difficilepuede incluir una mutación en las posiciones 543 y/o 544, en comparación con la TcdB deC. difficilede tipo silvestre correspondiente. Preferentemente, la TcdB mutante deC. difficileincluye una mutación L543 y/o g 544, en comparación con la TcdB deC. difficilede tipo silvestre correspondiente. Más preferentemente, la TcdB mutante deC. difficileincluye una mutación L543G y/o G544A, en comparación con la TcdB deC. difficilede tipo silvestre correspondiente.

Otra TcdB mutante deC. difficileejemplar incluye una mutación L543G, G544A y C698, en comparación con la TcdB deC. difficilede tipo silvestre correspondiente.

En un aspecto, la divulgación se refiere a un polipéptido aislado que tiene una mutación en cualquier posición desde el resto de aminoácido 1 a 1500 de acuerdo con la numeración de la SEQ ID NO: 2, para definir una toxina B mutante deC. difficileejemplar. Por ejemplo, en un aspecto, el polipéptido aislado incluye una mutación entre los restos de aminoácidos 830 y 990 de la SEQ ID NO: 2. Las posiciones ejemplares para mutaciones incluyen las posiciones 970 y 976 de acuerdo con la numeración de la SEQ ID NO: 2. Preferentemente, la mutación entre los restos 830 y 990 es una sustitución. En un aspecto, la mutación es una sustitución no conservativa en la que un resto de aminoácido Asp (D) y/o Glu (E) se reemplaza por un resto de aminoácido que no se neutraliza tras la acidificación, tal como, por ejemplo, lisina (K), arginina (R) e histidina (H). Las mutaciones ejemplares incluyen: E970K, E970R, E970H, E976k , E976R, E976H de SEQ ID NO: 2, para definir una toxina B deC. difficilemutante.

En otro aspecto, la divulgación se refiere a un polipéptido aislado que tiene una mutación en cualquier posición desde el resto de aminoácido 1 a 1500 de acuerdo con la numeración de la SEQ ID NO: 1, para definir una toxina A mutante deC. difficileejemplar. Por ejemplo, en un aspecto, el polipéptido aislado incluye una mutación entre los restos de aminoácidos 832 y 992 de la SEQ ID NO: 1. Las posiciones ejemplares para mutaciones incluyen las posiciones 972 y 978 de acuerdo con la numeración de la SEQ ID NO: 1. Preferentemente, la mutación entre los restos 832 y 992 es una sustitución. En una realización, la mutación es una sustitución no conservativa en la que un resto de aminoácido Asp (D) y/o Glu (E) se reemplaza por un resto de aminoácido que no se neutraliza tras la acidificación, tal como, por ejemplo, lisina (K), arginina (R) e histidina (H). Las mutaciones ejemplares incluyen: D972K, D972R, D972H, D978K, D978R, D978H de SEQ ID N<o>: 1, para definir una toxina A mutante deC. difficile.

Los polipéptidos de la invención pueden incluir un resto de metionina inicial, en algunos casos como resultado de un proceso mediado por células huésped. Dependiendo de, por ejemplo, la célula huésped utilizada en un procedimiento de producción recombinante y/o las condiciones de fermentación o crecimiento de la célula huésped, se sabe en la técnica que la metionina N-terminal codificada por el codón de iniciación de la traducción puede eliminarse de un polipéptido después de la traducción en células o la metionina N-terminal puede permanecer presente en el polipéptido aislado.

En consecuencia, en un aspecto, la divulgación se refiere a un polipéptido aislado que incluye la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 4, en la que la metionina inicial (en la posición 1) no está presente opcionalmente. En una realización, la metionina inicial de la SEQ ID NO: 4 está ausente. En un aspecto, la invención se refiere a un polipéptido aislado que incluye la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 83, que es idéntica a la SEQ ID NO: 4, excepto por la ausencia de la metionina inicial.

En otro aspecto, el polipéptido aislado incluye la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 6, en la que la metionina inicial (en la posición 1) no está presente opcionalmente. En una realización, la metionina inicial de la SEQ ID NO: 6 está ausente. En un aspecto, la invención se refiere a un polipéptido aislado que incluye la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 84, que es idéntica a la s Eq ID NO: 6, excepto por la ausencia de la metionina inicial.

En un aspecto adicional, el polipéptido aislado incluye la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 7, en la que la metionina inicial (en la posición 1) no está presente opcionalmente. En un aspecto, la divulgación se refiere a un polipéptido aislado que incluye la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 85, que es idéntica a la SEQ ID NO: 7, excepto por la ausencia de la metionina inicial. En otro aspecto más, el polipéptido aislado incluye la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 8, en la que la metionina inicial (en la posición 1) no está presente opcionalmente. En una realización, el polipéptido aislado incluye la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 86, que es idéntica a la SEQ ID NO: 8, excepto por la ausencia de la metionina inicial.

En un aspecto, la invención se refiere a una composición inmunogénica que incluye la SEQ ID NO: 4, en la que la metionina inicial (en la posición 1) no está presente opcionalmente. En otro aspecto, la invención se refiere a una composición inmunogénica que incluye la SEQ ID NO: 6, en la que la metionina inicial (en la posición 1) no está presente opcionalmente. En un aspecto adicional, la invención se refiere a una composición inmunogénica que incluye la SEQ ID NO: 7, en la que la metionina inicial (en la posición 1) no está presente opcionalmente. En otro aspecto más, la invención se refiere a una composición inmunogénica que incluye la SEQ ID NO: 8, en la que la metionina inicial (en la posición 1) no está presente opcionalmente.

En otro aspecto, la invención se refiere a una composición inmunogénica que incluye la SEQ ID NO: 83. En un aspecto, La invención se refiere a una composición inmunogénica que incluye la SEQ ID NO: 84. En un aspecto, La invención se refiere a una composición inmunogénica que incluye la SEQ ID NO: 85. En otro aspecto, La invención se refiere a una composición inmunogénica que incluye la SEQ ID NO: 86.

Además de generar una respuesta inmunitaria en un mamífero, las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento también tienen una citotoxicidad reducida en comparación con la toxina deC. diffidlede tipo silvestre correspondiente. Preferentemente, las composiciones inmunogénicas son seguras y tienen una citotoxicidad de mínima (por ejemplo, aproximadamente una reducción de 6-8 log 10) a nula, con respecto a la citotoxicidad de una toxina de tipo silvestre respectiva, para la administración en mamíferos.

Tal como se usa en el presente documento, el término citotoxicidad es un término entendido en la técnica y se refiere a la muerte celular apoptótica y/o a un estado en el que una o más funciones bioquímicas o biológicas habituales de una célula están comprometidas de forma aberrante, en comparación con una célula idéntica en condiciones idénticas, pero en ausencia del agente citotóxico. La toxicidad puede cuantificarse, por ejemplo, en células o en mamíferos, como la cantidad de un agente necesario para inducir un 50 % de muerte celular (es decir, CE50 o DE50, respectivamente) o por otros procedimientos conocidos en la técnica.

En la técnica se conocen ensayos para indicar la citotoxicidad, tales como ensayos de redondeo de células (véase, por ejemplo, Kuehne et al. Nature. 7 de octubre de 2010; 467 (7316): 711-3). La acción de TcdA y TcdB hace que las células se redondeen (por ejemplo, pierdan la morfología) y mueran, y este fenómeno es visible mediante microscopía óptica. Véanse, por ejemplo, la Figura 9.

Otros ensayos de citotoxicidad ejemplares adicionales conocidos en la técnica incluyen ensayos de glucosilación relacionados con la formación de imágenes por fósforo de Ras marcado con ensayos de [14 C]glucosa (como se describe en Busch et al., J Biol Chem. 31 de julio de 1998; 273 (31): 19566-72) y, preferentemente, el ensayo de citotoxicidadin vitrodescrito en los ejemplos proporcionados a continuación, en los que la CE50 puede hacer referencia a una concentración de una composición inmunogénica que presenta al menos aproximadamente el 50% del efecto citopático (ECP) en una célula, preferentemente una célula fibroblástica diploide humana (por ejemplo, una célula IMR90 (ATCC CCL-186™), en comparación con una célula idéntica en condiciones idénticas en ausencia de la toxina. El ensayo de citotoxicidadin vitrotambién se puede usar para evaluar la concentración de una composición que inhibe al menos aproximadamente el 50 % del efecto citopático (ECP) inducido por toxina deC. difficilede tipo silvestre en una célula, preferentemente una célula fibroblástica diploide humana (por ejemplo, una célula IMR90 (ATCC CCL-186™), en comparación con una célula idéntica en condiciones idénticas en ausencia de la toxina. Otros ensayos de citotoxicidad ejemplares adicionales incluyen los descritos en Doern et al., J Clin Microbiol. Agosto de 1992; 30 (8): 2042-6. La citotoxicidad también se puede determinar midiendo los niveles de ATP en células tratadas con toxina. Por ejemplo, se puede usar un sustrato basado en luciferasa tal como CELLTITERGLO® (Promega), que emite luminiscencia medida como una unidad relativa de luz (URL). En este ensayo, la viabilidad celular puede ser directamente proporcional a la cantidad de ATP en las células o los valores de u Rl .

En una realización, la citotoxicidad de la composición inmunogénica se reduce al menos aproximadamente 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 11000, 12000, 13000 veces, 14000 veces, 15000 veces o más, en comparación con la toxina deC. difficilede tipo silvestre correspondiente. Véanse, por ejemplo, Tabla 20.

En otra realización, la citotoxicidad de la composición inmunogénica se reduce en al menos aproximadamente 2 log<10>, más preferentemente en aproximadamente 3 log<10>y aún más preferentemente en aproximadamente 4 log<10>o más, con respecto a la toxina de tipo silvestre correspondiente en condiciones idénticas. Por ejemplo, una TcdB deC. diffidlemutante puede tener un valor de CE<50>de aproximadamente 10<-9>g/ml, medido en un ensayo estándar de efecto citopático (ECP), en comparación con una TcdB deC. difficilede tipo silvestre ejemplar que puede tener un valor de CE<50>de al menos aproximadamente 10<-12>g/ml. Véanse, por ejemplo, las Tablas 7A, 7B, 8A y 8B en la sección de Ejemplos proporcionada más adelante.

En otra realización adicional, la citotoxicidad de la toxina deC. difficilemutante tiene una CE<50>de al menos aproximadamente 50 pg/ml, 100 pg/ml, 200 pg/ml, 300 pg/ml, 400 pg/ml, 500 pg/ml, 600 pg/ml, 700 pg/ml, 800 pg/ml, 900 pg/ml, 1000 pg/ml o mayor, tal como se mide, por ejemplo, en un ensayo de citotoxicidadin vitro,tal como uno de los descritos en el presente documento. En consecuencia, en una realización preferida, las composiciones inmunogénicas y las toxinas mutantes son biológicamente seguras para la administración a mamíferos.

Sin pretender quedar vinculados a ningún mecanismo o teoría, una TcdA que tiene una mutación D285 y D287, en comparación con una TcdA de tipo silvestre, y una TcdB que tiene una mutación D286 y D288, en comparación con una TcdB de tipo silvestre, era de esperar que fueran defectuosas en la actividad de la glucosiltransferasa y, por lo tanto, defectuosas en la inducción de un efecto citopático. Además, era de esperar que una toxina que tuviera una mutación en el motivo DHC fuera defectuosa en el procesamiento autocatalítico y, por lo tanto, careciera de cualquier efecto citotóxico.

Sin embargo, los inventores sorprendentemente descubrieron, entre otras cosas, que una TcdA mutante ejemplar que tenía la SEQ ID NO: 4 y una TcdB mutante ejemplar que tenía la SEQ ID NO: 6 inesperadamente presentaban citotoxicidad (aunque significativamente reducida en el caso de las toxinas deC. difficile630 de tipo silvestre) a pesar de presentar actividad de glucosiltransferasa disfuncional y actividad de cisteína proteasa disfuncional. Sin pretender quedar vinculados a ningún mecanismo o teoría, se cree que las toxinas mutantes efectúan la citotoxicidad a través de un nuevo mecanismo. Sin embargo, la TcdA mutante ejemplar que tiene la SEQ ID NO: 4 y la TcdB mutante ejemplar que tiene la SEQ ID NO: 6 fueron sorprendentemente inmunogénicas. Véanse los Ejemplos proporcionados más adelante.

Aunque el entrecruzamiento químico de una toxina de tipo silvestre puede fallar en la inactivación de la toxina, los inventores descubrieron además que el entrecruzamiento químico de al menos un aminoácido de una toxina mutante reducía aún más la citotoxicidad de la toxina mutante, con respecto a una toxina mutante idéntica que carece de entrecruzamientos químicos y con respecto a la toxina de tipo silvestre correspondiente. Preferentemente, la toxina mutante se purifica antes del contacto con el agente de entrecruzamiento químico.

Además, a pesar del potencial de los agentes de entrecruzamiento químico para alterar epítopos útiles, los inventores descubrieron sorprendentemente que una toxina mutante deC. difficilemodificada genéticamente que tiene al menos un aminoácido entrecruzado químicamente daba como resultado composiciones inmunogénicas que inducían múltiples anticuerpos neutralizantes o fragmentos de unión de los mismos. En consecuencia, después del entrecruzamiento químico, inesperadamente se conservaban epítopos asociados con moléculas de anticuerpos neutralizantes.

El entrecruzamiento (también denominado "inactivación química" o "inactivación" en el presente documento) es un proceso de unión química de dos o más moléculas mediante un enlace covalente. Las expresiones "reactivos de entrecruzamiento", "agentes de entrecruzamiento" y "reticulantes" se refiere a moléculas que son capaces de reaccionar con y/o unirse químicamente a grupos funcionales específicos (aminas primarias, sulfhidrilos, carboxilos, carbonilos, etc.) en péptidos, polipéptidos y/o proteínas. En una realización, la molécula puede contener dos o más extremos reactivos que pueden reaccionar con y/o unirse químicamente a grupos funcionales específicos (aminas primarias, sulfhidrilos, carboxilos, carbonilos, etc.) en péptidos, polipéptidos y/o proteínas. Preferentemente, el agente de entrecruzamiento químico es soluble en agua. En otra realización preferida, el agente de entrecruzamiento químico es un reticulante heterobifuncional. En otra realización, el agente de entrecruzamiento químico no es un reticulante bifuncional. En la técnica se conocen agentes de entrecruzamiento químico.

En una realización preferida, el agente de entrecruzamiento químico es un agente de entrecruzamiento de longitud cero. Un reticulante de "longitud cero" se refiere a un agente de entrecruzamiento que mediará o producirá un entrecruzamiento directo entre grupos funcionales de dos moléculas. Por ejemplo, en el entrecruzamiento de dos polipéptidos, un reticulante de longitud cero dará como resultado la formación de un puente, o un entrecruzamiento entre un grupo carboxilo de una cadena lateral de aminoácido de un polipéptido y un grupo amino de otro polipéptido, sin integrar materia extrínseca. Los agentes de entrecruzamiento de longitud cero pueden catalizar, por ejemplo, la formación de enlaces éster entre los restos hidroxilo y carboxilo, y/o la formación de enlaces amida entre los restos carboxilo y amino primario.

Los agentes de entrecruzamiento químico adecuados ejemplares incluyen formaldehído; formalina; acetaldehído; propionaldehído; carbodiimidas solubles en agua (RN=C=NR '), que incluyen 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC), clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida, meto-p-toluensulfonato de 1-ciclohexil-3-(2-morfolinil- (4-etil)carbodiimida (CMC), N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC) y N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC), y sus derivados; y N-hidroxisuccinimida (NHS); fenilglioxal; y/o UDP-dialdehído.

Preferentemente, el agente de entrecruzamiento es EDC. Cuando un polipéptido de toxina mutante deC. difficilese modifica químicamente por EDC (por ejemplo, al poner en contacto el polipéptido con EDC), en una realización, el polipéptido incluye(a)al menos un entrecruzamiento entre una cadena lateral de un resto de ácido aspártico del polipéptido y una cadena lateral de un resto de lisina del polipéptido. En un aspecto, el polipéptido incluye(b)al menos un entrecruzamiento entre una cadena lateral de un resto de ácido glutámico del polipéptido y una cadena lateral de un resto de lisina del polipéptido. En un aspecto, el polipéptido incluye (c) al menos un entrecruzamiento entre el grupo carboxilo en el extremo C del polipéptido y el grupo amino del extremo N del polipéptido. En un aspecto, el polipéptido incluye(d)al menos un entrecruzamiento entre el grupo carboxilo en el extremo C del polipéptido y una cadena lateral de un resto de lisina del polipéptido. En un aspecto, el polipéptido incluye(e)al menos un entrecruzamiento entre una cadena lateral de un resto de ácido aspártico del polipéptido y una cadena lateral de un resto de lisina de un segundo polipéptido aislado. En un aspecto, el polipéptido incluye(f)al menos un entrecruzamiento entre una cadena lateral de un resto de ácido glutámico del polipéptido y una cadena lateral de un resto de lisina de un segundo polipéptido aislado. En un aspecto, el polipéptido incluye(g)al menos un entrecruzamiento entre el grupo carboxilo en el extremo C del polipéptido y el grupo amino del extremo N de un segundo polipéptido aislado. En un aspecto, el polipéptido incluye(h)al menos un entrecruzamiento entre el grupo carboxilo en el extremo C del polipéptido y una cadena lateral de un resto de lisina de un segundo polipéptido aislado. Véanse, por ejemplo, la Figura 24 y la Figura 25.

El "segundo polipéptido aislado" se refiere a cualquier polipéptido aislado que esté presente durante la reacción con EDC. En una realización, el segundo polipéptido aislado es un polipéptido de toxina deC. difficilemutante que tiene una secuencia idéntica a la del primer polipéptido aislado. En otra realización, el segundo polipéptido aislado es un polipéptido de toxina deC. difficilemutante que tiene una secuencia diferente del primer polipéptido aislado.

En un aspecto, el polipéptido incluye al menos dos modificaciones seleccionadas de las modificaciones (a)-(d). En un aspecto ejemplar, el polipéptido incluye(a)al menos un entrecruzamiento entre una cadena lateral de un resto de ácido aspártico del polipéptido y una cadena lateral de un resto de lisina del polipéptido y(b)al menos un entrecruzamiento entre una cadena lateral de un resto de ácido glutámico del polipéptido y una cadena lateral de un resto de lisina del polipéptido. En un aspecto adicional, el polipéptido incluye al menos tres modificaciones seleccionadas de las modificaciones (a)-(d). En otro aspecto más, el polipéptido incluye las modificaciones (a), (b), (c) y (d).

Cuando está presente más de un polipéptido mutante durante la modificación química por EDC, en un aspecto, la composición resultante incluye al menos una de cualquiera de las modificaciones (a)-(h). En un aspecto, la composición incluye al menos dos modificaciones seleccionadas de las modificaciones (a)-(h). En un aspecto adicional, la composición incluye al menos tres modificaciones seleccionadas de las modificaciones (a)-(h). En otro aspecto más, la composición incluye al menos cuatro modificaciones seleccionadas de las modificaciones (a)-(h). En otro aspecto, la composición incluye al menos una de cada una de las modificaciones (a)-(h).

En un aspecto ejemplar, la composición resultante incluye(a)al menos un entrecruzamiento entre una cadena lateral de un resto de ácido aspártico del polipéptido y una cadena lateral de un resto de lisina del polipéptido; y(b)al menos un entrecruzamiento entre una cadena lateral de un resto de ácido glutámico del polipéptido y una cadena lateral de un resto de lisina del polipéptido. En un aspecto, la composición incluye además(c)al menos un entrecruzamiento entre el grupo carboxilo en el extremo C del polipéptido y el grupo amino del extremo N del polipéptido; y(d)al menos un entrecruzamiento entre el grupo carboxilo en el extremo C del polipéptido y una cadena lateral de un resto de lisina del polipéptido.

En otro aspecto ejemplar, la composición resultante incluye(e)al menos un entrecruzamiento entre una cadena lateral de un resto de ácido aspártico del polipéptido y una cadena lateral de un resto de lisina de un segundo polipéptido aislado;(f)al menos un entrecruzamiento entre una cadena lateral de un resto de ácido glutámico del polipéptido y una cadena lateral de un resto de lisina de un segundo polipéptido aislado;(g)al menos un entrecruzamiento entre el grupo carboxilo en el extremo C del polipéptido y el grupo amino del extremo N de un segundo polipéptido aislado; y(h)al menos un entrecruzamiento entre el grupo carboxilo en el extremo C del polipéptido y una cadena lateral de un resto de lisina de un segundo polipéptido aislado.

En otro aspecto ejemplar, la composición resultante incluye(a)al menos un entrecruzamiento entre una cadena lateral de un resto de ácido aspártico del polipéptido y una cadena lateral de un resto de lisina del polipéptido;(b)al menos un entrecruzamiento entre una cadena lateral de un resto de ácido glutámico del polipéptido y una cadena lateral de un resto de lisina del polipéptido;(e)al menos un entrecruzamiento entre una cadena lateral de un resto de ácido aspártico del polipéptido y una cadena lateral de un resto de lisina de un segundo polipéptido aislado; y(f)al menos un entrecruzamiento entre una cadena lateral de un resto de ácido glutámico del polipéptido y una cadena lateral de un resto de lisina de un segundo polipéptido aislado.

En un aspecto preferido, el agente de entrecruzamiento químico incluye formaldehído, más preferentemente, un agente que incluye formaldehído en ausencia de lisina. Como inactivador en las reacciones de entrecruzamiento puede usarse glicina u otro compuesto apropiado con una amina primaria. En consecuencia, en otro aspecto preferido, el agente químico incluye formaldehído y uso de glicina.

En otro aspecto preferido más, el agente de entrecruzamiento químico incluye EDC y NHS. Como se sabe en la técnica, en los protocolos de acoplamiento de EDC puede incluirse NHS. Sin embargo, los inventores descubrieron sorprendentemente que la NHS puede facilitar una reducción adicional de la citotoxicidad de la toxina mutante deC. diffidle,en comparación con la toxina de tipo silvestre correspondiente, en comparación con una toxina mutada genéticamente y en comparación con una toxina mutada genéticamente que se ha sometido a entrecruzamiento químico por EDC. Véanse, por ejemplo, el Ejemplo 22. En consecuencia, sin pretender quedar vinculados a ningún mecanismo o teoría, un polipéptido de toxina mutante que tiene un resto de beta-alanina unido a una cadena lateral de al menos un resto de lisina del polipéptido (por ejemplo, como resultado de una reacción del polipéptido de toxina mutante, EDC y NHS) pueden facilitar una mayor disminución de la citotoxicidad de la toxina mutante, en comparación con, por ejemplo, una toxina deC. difficile(de tipo silvestre o mutante) en la que está ausente un resto de beta-alanina.

El uso de EDC y/o NHS también puede incluir el uso de glicina u otro compuesto apropiado con una amina primaria como inactivador. Cualquier compuesto que tenga una amina primaria puede usarse como inactivador, tal como, por ejemplo, glicina metil éster y alanina. En una realización preferida, el compuesto inactivador es una amina primaria hidrófila no polimérica. Los ejemplos de una amina primaria hidrófila no polimérica incluyen, por ejemplo, aminoazúcares, aminoalcoholes y aminopolioles. Los ejemplos específicos de una amina primaria hidrófila no polimérica incluyen glicina, etanolamina, glucamina, polietilenglicol funcionalizado con amina y oligómeros de etilenglicol funcionalizados con amina.

En un aspecto, la divulgación se refiere a un polipéptido de toxina mutante deC. difficileque tiene al menos una cadena lateral de aminoácido modificada químicamente por EDC y una amina primaria hidrófila no polimérica, preferentemente glicina. Los aductos de glicina resultantes (por ejemplo, de una reacción de toxinas triple mutantes tratadas con EDC, NHS e inactivadas con glicina) pueden facilitar la disminución de la citotoxicidad de la toxina mutante en comparación con la toxina de tipo silvestre correspondiente.

En un aspecto, cuando un polipéptido de toxina mutante deC. difficilese modifica químicamente por EDC y glicina, el polipéptido incluye al menos una modificación cuando el polipéptido se modifica por EDC (por ejemplo, al menos una de cualquiera de las modificaciones (a)-(h) descritas anteriormente), y al menos una de las siguientes modificaciones ejemplares:(i)un resto de glicina unido al grupo carboxilo en el extremo C del polipéptido;(j)un resto de glicina unido a una cadena lateral de al menos un resto de ácido aspártico del polipéptido; y(k)un resto de glicina unido a una cadena lateral de al menos un resto de ácido glutámico del polipéptido. Véanse, por ejemplo, la Figura 24 y la Figura 25.

En un aspecto, al menos un aminoácido de la TcdA mutante deC. difficileestá entrecruzado químicamente y/o al menos un aminoácido de la TcdB mutante deC. difficileestá entrecruzado químicamente. En otro aspecto, al menos un aminoácido de la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 y/o SEQ ID NO: 8 está entrecruzado químicamente. Por ejemplo, dicho al menos un aminoácido puede estar entrecruzado químicamente por un agente que incluye una carbodiimida, tal como EDC. Las carbodiimidas pueden formar un enlace covalente entre grupos carboxilo libre (por ejemplo, de las cadenas laterales de ácido aspártico y/o ácido glutámico) y grupos amino (por ejemplo, en la cadena lateral de restos de lisina) para formar enlaces de amida estables.

Como otro ejemplo, dicho al menos un aminoácido puede estar entrecruzado químicamente por un agente que incluye NHS. Los reticulantes activados con éster de NHS pueden reaccionar con aminas primarias (por ejemplo, en el extremo N de cada cadena polipeptídica y/o en la cadena lateral de restos de lisina) para producir un enlace amida.

En otro aspecto, dicho al menos un aminoácido puede entrecruzarse químicamente por un agente que incluye EDC y NHS. Por ejemplo, en un aspecto, la divulgación se refiere a un polipéptido aislado que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 4, en la que el resto de metionina en la posición 1 que no está presente opcionalmente, en el que el polipéptido incluye al menos una cadena lateral de aminoácido modificada químicamente por EDC y NHS. En otra realización, la invención se refiere a un polipéptido aislado que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 6, en la que el resto de metionina en la posición 1 que no está presente opcionalmente, en el que el polipéptido incluye al menos una cadena lateral de aminoácido modificada químicamente por EDC y NHS. En otro aspecto más, la divulgación se refiere a un polipéptido aislado que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8. El polipéptido se modifica poniendo en contacto el polipéptido con EDC y NHS. Véanse, por ejemplo, la Figura 24 y la Figura 25.

Cuando un polipéptido de toxina mutante deC. difficilese modifica químicamente mediante (por ejemplo, por contacto) EDC y NHS, en un aspecto, el polipéptido incluye al menos una modificación cuando el polipéptido se modifica por EDC (por ejemplo, al menos una de cualquiera de las modificaciones (a)-(h) descritas anteriormente), y(l)un resto de beta-alanina unido a una cadena lateral de al menos un resto de lisina del polipéptido.

En otro aspecto, la divulgación se refiere a un polipéptido de toxina mutante deC. difficileen el que el polipéptido incluye al menos una cadena lateral de aminoácido modificada químicamente por EDC, NHS y una amina primaria hidrófila no polimérica, preferentemente glicina. En un aspecto, el polipéptido incluye al menos una modificación cuando el polipéptido se modifica por EDC (por ejemplo, al menos una de cualquiera de las modificaciones (a)-(h) descritas anteriormente), al menos una modificación cuando el polipéptido se modifica por glicina (por ejemplo, al menos una de cualquiera de las modificaciones (i)-(k) descritas anteriormente) e (I) un resto de beta-alanina unido a una cadena lateral de al menos un resto de lisina del polipéptido. Véanse, por ejemplo, la Figura 24 y la Figura 25.

En un aspecto, la divulgación se refiere a un polipéptido de toxina mutante deC. difficile,en el que una cadena lateral de al menos un resto de lisina del polipéptido está unida a un resto de beta-alanina. En un aspecto, una cadena lateral de un segundo resto de lisina del polipéptido está unida a una cadena lateral de un resto de ácido aspártico y/o a una cadena lateral de un resto de ácido glutámico. El "segundo" resto de lisina del polipéptido incluye un resto de lisina del polipéptido que no está unido a un resto de beta-alanina. La cadena lateral de un ácido aspártico y/o la cadena lateral de un ácido glutámico a la que se une el segundo resto de lisina puede ser la del polipéptido para formar un entrecruzamiento intramolecular, o la de un segundo polipéptido para formar un entrecruzamiento intermolecular. En otro aspecto, una cadena lateral de al menos un resto de ácido aspártico y/o una cadena lateral de al menos un resto de ácido glutámico del polipéptido está unida a un resto de glicina. El resto de ácido aspártico y/o el resto de ácido glutámico que está unido a un resto de glicina no está también unido a un resto de lisina.

Como otro ejemplo más de un polipéptido de toxina mutante deC. difficileentrecruzado químicamente, dicho al menos un aminoácido puede estar entrecruzado químicamente por un agente que incluye formaldehído. El formaldehído puede reaccionar con el grupo amino de un resto de aminoácido N-terminal y las cadenas laterales de la arginina, cisteína, histidina y lisina. El formaldehído y la glicina pueden formar un aducto de base de Schiff, que puede unirse a grupos amino N-terminales primarios, restos de arginina y de tirosina, y en menor grado restos de asparagina, glutamina, histidina y triptófano.

Se dice que un agente de entrecruzamiento químico reduce la citotoxicidad de una toxina si la toxina tratada tiene menos toxicidad (por ejemplo, aproximadamente un 100 %, 99 %, 95 %, 90 %, 80 %, 75 %, 60 %, 50 %, 25 % o 10 % menos de toxicidad) que la toxina no tratada en condiciones idénticas, tal como se mide, por ejemplo, por un ensayo de citotoxicidadin vitro,o por toxicidad en animales.

Preferentemente, el agente de entrecruzamiento químico reduce la citotoxicidad de la toxina mutante deC. difficileen al menos una reducción de 2 log™, más preferentemente una reducción de aproximadamente 3 log-10 y aún más preferentemente una reducción de aproximadamente 4-log-i0 o mayor, con respecto a la toxina mutante en condiciones idénticas, pero en ausencia del agente de entrecruzamiento químico. En comparación con la toxina de tipo silvestre, el agente de entrecruzamiento químico preferentemente reduce la citotoxicidad de la toxina mutante en al menos aproximadamente una reducción de 5 log-10, aproximadamente una reducción de 6 log-10, aproximadamente una reducción de 7 logi0, aproximadamente una reducción de 8 logi0, o mayor.

En otro aspecto preferido, la toxina mutante deC. difficileinactivada químicamente presenta un valor de CE50 mayor que o al menos de aproximadamente 50 pg/ml, 100 pg/ml, 200 pg/ml, 300 pg/ml, 400 pg/ml, 500 pg/ml, 600 pg/ml, 700 pg/ml, 800 pg/ml, 900 pg/ml, 1000 pg/ml o mayor, tal como se mide, por ejemplo, en un ensayo de citotoxicidadin vitro,tal como uno de los descritos en el presente documento.

Las condiciones de reacción para poner en contacto la toxina mutante con el agente de entrecruzamiento químico están dentro del alcance de la experiencia de un experto en la materia, y las condiciones pueden variar dependiendo del agente utilizado. Sin embargo, los inventores sorprendentemente descubrieron condiciones de reacción óptimas para poner en contacto un polipéptido de toxina mutante deC. difficilecon un agente de entrecruzamiento químico, mientras se conservan epítopos funcionales y se reduce la citotoxicidad de la toxina mutante, en comparación con la toxina de tipo silvestre correspondiente.

Preferentemente, las condiciones de reacción se seleccionan para poner en contacto una toxina mutante con el agente de entrecruzamiento, en las que la toxina mutante tiene una concentración mínima de aproximadamente 0,5, 0,75, 1,0, 1,25, 1,5, 1,75, 2,0 mg/ml hasta un máximo de aproximadamente 3,0, 2,5, 2,0, 1,5 o 1,25 mg/ml. Cualquier valor mínimo se puede combinar con cualquier valor máximo para definir un intervalo de concentraciones adecuadas de una toxina mutante para la reacción. Aún más preferentemente, la toxina mutante tiene una concentración de aproximadamente 1,0 -1,25 mg/ml para la reacción.

En un aspecto, el agente utilizado en la reacción tiene una concentración mínima de aproximadamente 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM o 50 mM, y una concentración máxima de aproximadamente 100 mM, 90 mM, 80 mM, 70 mM, 60 mM u 50 mM. Cualquier valor mínimo se puede combinar con cualquier valor máximo para definir un intervalo de concentraciones adecuadas del agente químico para la reacción.

En un aspecto preferido en el que el agente incluye formaldehído, la concentración utilizada es preferentemente cualquier concentración entre aproximadamente 2 mM y 80 mM, aún más preferentemente aproximadamente 40 mM. En otro aspecto preferido en el que el agente incluye EDC, la concentración utilizada es preferentemente cualquier concentración entre aproximadamente 1,3 mM y aproximadamente 13 mM, más preferentemente de aproximadamente 2 mM a 3 mM, aún más preferentemente aproximadamente 2,6 mM.

Los tiempos de reacción ejemplares en los que la toxina mutante se pone en contacto con el agente de entrecruzamiento químico incluyen un mínimo de aproximadamente 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 24, 36, 48 o 60 horas, y un máximo de aproximadamente 14 días, 12 días, 10 días, 7 días, 5 días, 3 días, 2 días, 1 día o 12 horas. Cualquier valor mínimo se puede combinar con cualquier valor máximo para definir un intervalo de tiempos de reacción adecuados.

En un aspecto preferido, la etapa de poner en contacto la toxina mutante con el agente de entrecruzamiento químico se realiza durante un período de tiempo que es suficiente para reducir la citotoxicidad de la toxina mutante deC. diffidlea un valor de CE<50>de al menos aproximadamente 1O0O pg/ml en una célula humana adecuada, por ejemplo, células IMR-90, en un ensayo de citotoxicidadin vitroestándar, en comparación con una toxina mutante idéntica en ausencia del agente de entrecruzamiento. Más preferentemente, la etapa de reacción se lleva a cabo durante un tiempo que es al menos dos veces más largo y, más preferentemente, al menos tres veces más largo o más, que el período de tiempo suficiente para reducir la citotoxicidad de la toxina mutante a un valor de CE<50>de al menos aproximadamente 1000 pg/ml en una célula humana adecuada. En un aspecto, el tiempo de reacción no excede aproximadamente 168 horas (o 7 días).

Por ejemplo, en un aspecto en el que el agente incluye formaldehído, la toxina mutante se pone en contacto preferentemente con el agente durante aproximadamente 12 horas, que según se demostró era un periodo de tiempo ejemplar que era suficiente para reducir la citotoxicidad de la toxina mutante deC. difficilea un valor de CE<50>de al menos aproximadamente 1000 g/ml en una célula humana adecuada, por ejemplo, células IMR-90, en un ensayo de citotoxicidadin vitroestándar, en comparación con una toxina mutante idéntica en ausencia del agente de entrecruzamiento. En un aspecto más preferido, la reacción se lleva a cabo durante aproximadamente 48 horas, que es al menos aproximadamente tres veces más largo que el período de tiempo suficiente para la reacción. En tal aspecto, el tiempo de reacción preferentemente no es mayor que aproximadamente 72 horas.

En otra realización en la que el agente incluye EDC, la toxina mutante se pone en contacto preferentemente con el agente durante aproximadamente 0,5 horas, más preferentemente al menos aproximadamente 1 hora, o aún más preferentemente aproximadamente 2 horas. En tal realización, el tiempo de reacción preferentemente no es mayor que aproximadamente 6 horas.

El pH ejemplar al que la toxina mutante se pone en contacto con el agente de entrecruzamiento químico incluye un mínimo de aproximadamente pH 5,5, 6,0, 6,5, 7,0 o 7,5, y un máximo de aproximadamente pH 8,5, 8,0, 7,5, 7,0 o 6,5. Cualquier valor mínimo se puede combinar con cualquier valor máximo para definir un intervalo de pH adecuado. Preferentemente, la reacción se realiza a pH 6,5 a 7,5, preferentemente a pH 7,0.

Las temperaturas ejemplares a las que la toxina mutante se pone en contacto con el agente de entrecruzamiento químico incluyen un mínimo de aproximadamente 2 °C, 4 °C, 10 °C, 20 °C, 25 °C o 37 °C, y una temperatura máxima de aproximadamente 40 °C, 37 °C, 30 °C, 27 °C, 25 °C o 20 °C. Cualquier valor mínimo se puede combinar con cualquier valor máximo para definir un intervalo de temperaturas de reacción adecuadas. Preferentemente, la reacción se realiza a aproximadamente 20 °C a 30 °C, más preferentemente a aproximadamente 25 °C.

Las composiciones inmunogénicas descritas anteriormente pueden incluir una toxina mutante deC. difficile(A o B). En consecuencia, las composiciones inmunogénicas pueden ocupar viales separados (por ejemplo, un vial separado para una composición que incluye la toxina A mutante deC. difficiley un vial separado para una composición que incluye la toxina B mutante deC. difficile)en la preparación o kit. Las composiciones inmunogénicas pueden estar destinadas al uso simultáneo, secuencial o separado.

En otro aspecto, las composiciones inmunogénicas descritas anteriormente pueden incluir ambas toxinas mutantes deC. difficile(A y B). Cualquier combinación de toxina A mutante deC. difficiley toxina B mutante deC. difficiledescrita puede combinarse para una composición inmunogénica. En consecuencia, las composiciones inmunogénicas se pueden combinar en un solo vial (por ejemplo, un solo vial que contiene una composición que incluye TcdA mutante deC. difficiley una composición que incluye TcdB mutante deC. difficile).Preferentemente, las composiciones inmunogénicas incluyen una TcdA mutante deC. difficiley una TcdB mutante deC. difficile.

Por ejemplo, en una realización, la composición inmunogénica incluye la SEQ ID NO: 4 y la SEQ ID NO: 6, en la que al menos un aminoácido de cada una de las SEQ ID NO: 4 y SEQ iD NO: 6 está entrecruzado químicamente. En otro aspecto, la composición inmunogénica incluye una toxina A mutante deC. difficile,que incluye la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 7, y una toxina B mutante deC. difficile,que comprende la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 8, en la que al menos un aminoácido de cada una de las toxinas mutantes deC. difficileestá entrecruzado químicamente.

En otro aspecto, la composición inmunogénica incluye cualquier secuencia seleccionada de la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 83 y SEQ ID NO: 85, y cualquier secuencia seleccionada de la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 84 y SEQ ID NO: 86. En otro aspecto, la composición inmunogénica incluye la SEQ ID NO: 83 y una composición inmunogénica que incluye la SEQ ID NO: 84. En otro aspecto, la composición inmunogénica incluye la SEQ ID NO: 85 y una composición inmunogénica que incluye la s Eq ID NO: 86. En otro aspecto, la composición inmunogénica incluye la SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 86 y SEQ ID NO: 85.

Se entiende que cualquiera de las composiciones de la invención, por ejemplo, composiciones inmunogénicas que incluyen una toxina A mutante y/o una toxina B mutante, se pueden combinar en diferentes proporciones o cantidades para conseguir un efecto terapéuticos. Por ejemplo, la TcdA mutante deC. difficiley la TcdB mutante deC. difficilepueden estar presentes en una composición inmunogénica en una proporción en el intervalo de 0,1:10 a 10:0,1, A:B. En otra realización, por ejemplo, la TcdB mutante deC. difficiley la TcdA mutante deC. difficilepueden estar presentes en una composición inmunogénica en una proporción en el intervalo de 0,1:10 a 10:0,1, B:A. En una realización preferida, la relación es tal que la composición incluye una cantidad total mayor de una TcdB mutante que la cantidad total de TcdA mutante.

En un aspecto, una composición inmunogénica es capaz de unirse a un anticuerpo neutralizante o fragmento de unión del mismo. Preferentemente, el anticuerpo neutralizante o fragmento de unión del mismo es uno descrito en el presente documento más adelante. En una realización ejemplar, una composición inmunogénica es capaz de unirse a un anticuerpo anti-toxina A o fragmento de unión del mismo, en la que el anticuerpo anti-toxina A o su fragmento de unión incluye una cadena ligera variable que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 36 y una cadena pesada variable que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 37. Por ejemplo, la composición inmunogénica puede incluir una TcdA mutante deC. difficile,SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 7. Como otro ejemplo, la composición inmunogénica puede incluir la SEQ ID NO: 83 o la SEQ ID NO: 85.

En otra realización ejemplar, una composición inmunogénica es capaz de unirse a un anticuerpo anti-toxina B o fragmento de unión del mismo, en la que el anticuerpo anti-toxina B o su fragmento de unión incluye una cadena ligera variable de B8-26 y una cadena pesada variable de B8-26. Por ejemplo, la composición inmunogénica puede incluir una TcdB mutante deC. difficile,SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8. Como otro ejemplo, la composición inmunogénica puede incluir la SEQ ID NO: 84 o la SEQ ID NO: 86.

Célula recombinante

En otro aspecto, la divulgación se refiere a una célula recombinante o descendencia de la misma. En un aspecto, la célula o su descendencia incluye un polinucleótido que codifica una TcdA mutante deC. difficiley/o una TcdB mutante deC. difficile.

En otro aspecto, la célula recombinante o su descendencia incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, preferentemente aproximadamente un 98%, más preferentemente aproximadamente un 99% o más preferentemente aproximadamente un 100% de identidad con cualquiera de las SEQ Id NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8, cuando se alinea de manera óptima, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT que utilizan ponderaciones de huecos por defecto.

En otro aspecto, la célula recombinante o su descendencia incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, preferentemente aproximadamente un 98%, más preferentemente aproximadamente un 99% o más preferentemente aproximadamente un 100% de identidad con cualquiera de las SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 83 o SEQ ID NO: 85, cuando se alinea de manera óptima, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT que utilizan ponderaciones de huecos por defecto.

En un aspecto adicional, la célula recombinante o su descendencia incluye una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos aproximadamente un 90%, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, preferentemente aproximadamente un 98%, más preferentemente aproximadamente un 99% o más preferentemente aproximadamente un 100% de identidad con cualquiera de las SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46 o SEQ ID NO: 47, cuando se alinea de manera óptima, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT que utilizan ponderaciones de huecos por defecto.

La célula recombinante puede proceder de cualquier célula útil en la producción recombinante de un polipéptido de la presente divulgación, por ejemplo, un procariota o un eucariota. Preferentemente, la célula recombinante procede de cualquier célula que sea adecuada para expresar secuencias de ácido nucleico heterólogas mayores de aproximadamente 5000, 6000, preferentemente aproximadamente 7000 y, más preferentemente, aproximadamente 8000 nucleótidos o más. La célula huésped procariota puede ser cualquier bacteria gramnegativa o grampositiva. En aspectos ejemplares, la célula huésped procariota carece de un polinucleótido endógeno que codifica una toxina y/o espora.

Las bacterias gramnegativas incluyen, aunque no de forma limitativa,Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, SalmonellayUreaplasma.Por ejemplo, la célula recombinante puede proceder de una célulaPseudomonas fluorescens,como se describe en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos 2010013762, párrafos [0201]-[0230].

Las bacterias grampositivas incluyen, aunque no de forma limitativa,Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, StreptococcusyStreptomyces.Preferentemente, la célula procede de una célula deC. difficile.

Los inventores identificaron cepas deC. difficilede tipo silvestre que carecen de un polinucleótido endógeno que codifica una toxina deC. difficile.Las cepas que carecen de genes endógenos de toxina A y B incluyen las siguientes cepas, que están disponibles a través de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) (Manassas, VA):C. difficile1351 (ATCC 43593™),C. difficile3232 (ATCC BAA-1801 ™),C. difficile7322 (ATCC 43601 ™),C. difficile5036 (ATCC 43603™),C. difficile4811 (ATCC 43602™) yC. difficileVPI 11186 (ATCC 700057™).

En consecuencia, en un aspecto, la célula deC. difficilerecombinante procede de una cepa descrita en el presente documento. Preferentemente, la célula deC. difficilerecombinante o su descendencia procede del grupo que consiste enC. difficile1351,C. difficile5036 yC. difficileVPI 11186. Más preferentemente, la célula deC. difficilerecombinante o su descendencia procede de una célula deC. difficileVPI 11186.

En un aspecto preferido, el gen de esporulación de la célula deC. difficilerecombinante o su descendencia está inactivado. Las esporas pueden ser infecciosas, altamente resistentes y facilitan la persistencia deC. difficileen ambientes aeróbicos fuera del huésped. Las esporas también pueden contribuir a la supervivencia deC. difficiledentro del huésped durante la terapia antimicrobiana. En consecuencia, una célula deC. difficileque carece de un gen de esporulación es útil para producir una composición inmunogénica segura para la administración a mamíferos. Además, el uso de tales células facilita la seguridad durante la fabricación, por ejemplo, seguridad para proteger la instalación, futuros productos y personal.

Los ejemplos de genes de esporulación para una inactivación dirigida incluyen, entre otros,spoOA, spollE, a E, a° y aK.Preferentemente, el genspoOAestá inactivado.

En la técnica se conocen procedimientos para inactivar un gen de esporulación deC. difficile.Por ejemplo, un gen de esporulación puede inactivarse por inserción dirigida de un marcador seleccionable, tal como, un marcador de resistencia a antibióticos. Véanse, por ejemplo, Heap et al., J Microbiol Methods. enero de 2010; 80 (1): 49-55; Heap et al., J. Microbiol. Methods, septiembre de 2007; 70 (3): 452-464; y Underwood et al., J. Bacteriol. diciembre de 2009; 191 (23): 7296-305. Véanse también, por ejemplo, Minton et al., documento WO2007/148091, titulado, "DNA Molecules and Methods", de las páginas 33-66, o la publicación de Estados Unidos correspondiente US 20110124109 A1, párrafos [00137]-[0227].

Procedimiento de producción de una toxina mutante de C. difficile

En un aspecto, la divulgación se refiere a un procedimiento para producir una toxina mutante deC. difficile.En un aspecto, el procedimiento incluye cultivar cualquier célula recombinante o su descendencia descrita anteriormente, en condiciones adecuadas para expresar un polipéptido.

En otro aspecto, el procedimiento incluye cultivar una célula recombinante o su descendencia en condiciones adecuadas para expresar un polinucleótido que codifica una toxina mutante deC. difficile, en el que la célula incluye el polinucleótido que codifica la toxina mutante deC. difficile,y en el que el mutante incluye un dominio de glucosiltransferasa que tiene al menos una mutación y un dominio de cisteína proteasa que tiene al menos una mutación, con respecto a la toxina deClostridium difficilede tipo silvestre correspondiente. En un aspecto, la célula carece de un polinucleótido endógeno que codifica una toxina.

En un aspecto adicional, el procedimiento incluye cultivar una célula deC. difficilerecombinante o su descendencia en condiciones adecuadas para expresar un polinucleótido que codifica una toxina mutante deC. difficile,en el que la célula incluye el polinucleótido que codifica la toxina mutante deC. difficiley la célula carece de un polinucleótido endógeno que codifica una toxina deC. difficile.

En otro aspecto, la divulgación se refiere a un procedimiento para producir una toxina mutante deC. difficile.El procedimiento incluye las etapas de: (a) poner en contacto una célula deC. difficilecon una célula deEscherichia colirecombinante, en el que la célula deC. difficilecarece de un polinucleótido endógeno que codifica una toxina deC. difficiley la célula deE. coliincluye un polinucleótido que codifica una toxina mutante deC. difficile;(b) cultivar la célula deC. difficiley la célula deE. colien condiciones adecuadas para la transferencia del polinucleótido desde la célula deE. colia la célula deC. difficile;(c) seleccionar la célula deC. difficileque comprende el polinucleótido que codifica la toxina mutante deC. difficile;(d) cultivar la célula deC. difficilede la etapa (c) en condiciones adecuadas para expresar el polinucleótido; y (e) aislar la toxina mutante deC. difficile.

En el procedimiento de la invención, la célula deE. colirecombinante incluye un polinucleótido heterólogo que codifica la toxina mutante deC. difficile,descrita en el presente documento. El polinucleótido puede ser ADN o ARN. En un aspecto ejemplar, el polinucleótido que codifica la toxina mutante deC. difficiletiene codones optimizados para el uso de codones deE. coli.En la técnica se conocen procedimientos para optimizar codones de un polinucleótido.

En un aspecto, el polinucleótido incluye una secuencia de ácido nucleico que es al menos aproximadamente un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a un polinucleótido que codifica una TcdA mutante deC. difficile,tal como se ha descrito anteriormente. Un polinucleótido ejemplar que codifica una toxina A mutante deC. difficileincluye la SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 45.

En otro aspecto, el polinucleótido incluye una secuencia de ácido nucleico que es al menos aproximadamente un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a un polinucleótido que codifica una TcdB mutante deC. difficile,tal como se ha descrito anteriormente. Un polinucleótido ejemplar que codifica una toxina B mutante deC. difficileincluye la SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14,<s>E<q>ID NO: 46 y S<e>Q ID N<o>: 47. En otro aspecto, el polinucleótido codifica la SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85 o SEQ ID NO: 86.

En un aspecto, la célula deE. colique incluye el polinucleótido heterólogo es una célula deE. colique alberga de manera estable el polinucleótido heterólogo, que codifica la toxina mutante deC. difficile.Las células deE. coliejemplares incluyen una célula seleccionada del grupo que consiste en Células Competentes deE. coliMAX Efficiency® Stbl2™ (Invitrogen, Carlsbad, CA),E. coliOne Shot® Stbl3™ químicamente competente (Invitrogen, Carlsbad, CA), Células competentes deE. coliElectroMAX™ Stbl4™ (Invitrogen yE. coliCA434). En un aspecto preferido, la célula huésped de clonación deE. colino es DH5a. Más preferentemente, la célula huésped de clonación deE. colies una célula competente deE. coliMAX Efficiency® Stbl2™.

El procedimiento de la invención incluye además una etapa de cultivo de la célula deC. difficiley la célula deE. colien condiciones adecuadas para la transferencia del polinucleótido desde la célula de E.colia la célula deC. difficile,que da como resultado una célula deC. difficilerecombinante. En un aspecto preferido, las condiciones de cultivo son adecuadas para la transferencia del polinucleótido desde la célula deE. coli(la célula donante) al interior de la célula deC. difficile(la célula receptora), y dan como resultado una herencia genéticamente estable.

Aún más preferentemente, las condiciones de cultivo son adecuadas para la conjugación bacteriana, que se conocen en la técnica. "Conjugación" se refiere a un proceso particular de transferencia de un polinucleótido en el que se produce una transferencia unidireccional de un polinucleótido (por ejemplo, desde un plásmido bacteriano) de una célula bacteriana (es decir, el "donante") a otra (es decir, el "receptor"). El proceso de conjugación implica el contacto entre la célula donante y la célula receptora. Preferentemente, la célula deE. colidonante es una célula deE. coliCA434.

Las condiciones ejemplares adecuadas (conjugación) para transferir el polinucleótido desde la célula deE. colia la célula deC. difficileincluyen el crecimiento de cultivos líquidos deC. difficileen caldo de infusión de cerebro-corazón (BHI; Oxoid) o caldo Schaedlers anaerobio (SAB; Oxoid). En otro aspecto, pueden dejarse crecer cultivos sólidos deC. difficileen agar sangre fresco (FBA) o agar BHI. Preferentemente,C. difficilese cultiva a 37 °C en un ambiente anaerobio (por ejemplo, 80 % de N 2, 10 % de CO2 y 10 % de H 2 [vol/vol]). En un aspecto, las condiciones adecuadas incluyen el cultivo aerobio deE. colien caldo Luria-Bertani (LB) o en agar LB a 37 °C. Para la transferencia conjugativa aC. difficile,una condición adecuada ejemplar incluye el crecimiento deE. colien condiciones anaerobias en FBA. Como es conocido en la técnica, pueden incluirse antibióticos en los medios líquidos y sólidos. Los ejemplos de tales antibióticos incluyen cicloserina (250 pg/ml), cefoxitina (8 pg/ml), cloranfenicol (12.5 pg/ml), tiamfenicol (15 pg/ml) y eritromicina (5 pg/ml).

El procedimiento de la invención incluye adicionalmente una etapa de selección de la célula deC. difficilerecombinante resultante que incluye el polinucleótido que codifica la toxina mutante deC. difficile.En un aspecto ejemplar, la célula deC. difficilerecombinante es un receptor del polinucleótido que codifica la toxina mutante deC. difficilede la célula deE. colirecombinante a través de la conjugación.

El procedimiento de la invención incluye una etapa de cultivar de la célula recombinante o su descendencia en condiciones adecuadas para expresar el polinucleótido que codifica la toxina mutante deC. difficile,que tiene como resultado la producción de una toxina mutante deC. difficile.Las condiciones adecuadas para que una célula recombinante exprese el polinucleótido incluyen condiciones de cultivo adecuadas para el crecimiento de una célula deC. difficile,que se conocen en la técnica. Por ejemplo, las condiciones adecuadas pueden incluir el cultivo de los transformantes deC. difficileen caldo de infusión cerebro corazón (BHI; Oxoid) o caldo Schaedlers anaerobio (SAB; Oxoid). En otro aspecto, pueden dejarse crecer cultivos sólidos deC. difficileen agar FBA o BHI. Preferentemente,C. difficilese cultiva a 37 °C en un ambiente anaerobio (por ejemplo, 80 % de N 2, 10 % de CO2 y 10 % de H 2 [vol/vol]).

En un aspecto, el procedimiento de la invención incluye una etapa de aislamiento de la toxina mutante deC. difficileresultante. En la técnica se conocen procedimientos para aislar una proteína deC. difficile.

En otro aspecto, el procedimiento incluye una etapa de purificación de la toxina mutante deC. difficileresultante. En la técnica se conocen procedimientos de purificación de un polipéptido, tal como cromatografía.

En un aspecto ejemplar, el procedimiento incluye además una etapa de puesta en contacto de la toxina mutante deClostridium difficileaislada con un agente de entrecruzamiento químico descrito anteriormente. Preferentemente, el agente incluye formaldehído, etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida, o una combinación de EDC y NHS. Las condiciones de reacción ejemplares se han descrito anteriormente y en la sección de ejemplos presentada a continuación.

En otro aspecto, la invención se refiere a una composición inmunogénica que incluye una toxina mutante deC. difficiledescrita en el presente documento, producida por cualquier procedimiento, preferentemente por cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente.

Anticuerpos

Sorprendentemente, las composiciones inmunogénicas de la invención descritas anteriormente indujeron nuevos anticuerposin vivo,lo que sugiere que las composiciones inmunogénicas incluyen una estructura nativa conservada (por ejemplo, un epítopo antigénico conservado) de la toxina deC. difficiletipo silvestre respectiva y que las composiciones inmunogénicas incluyen un epítopo. Los anticuerpos producidos contra una toxina de una cepa deC.

diffidlepueden ser capaces de unirse a una toxina correspondiente producida por otra cepa deC. difficile.Es decir, los anticuerpos y fragmentos de unión de los mismos pueden tener "reactividad cruzada", que se refiere a la capacidad de reaccionar con sitios antigénicos similares en toxinas producidas a partir de múltiples cepas deC. difficile.La reactividad cruzada también incluye la capacidad de un anticuerpo para reaccionar o unirse a un antígeno que no estimuló su producción, es decir, la reacción entre un antígeno y un anticuerpo que se generó contra un antígeno diferente pero similar.

En un aspecto, los inventores sorprendentemente descubrieron anticuerpos monoclonales que tienen un efecto neutralizante sobre toxinas deC. difficiley procedimientos para producirlos. Los anticuerpos de la invención pueden neutralizar la citotoxicidad de la toxina deC. difficile in vitro,inhibir la unión de la toxina deC. difficilea células de mamífero y/o pueden neutralizar la enterotoxicidad de la toxina deC. difficile in vivo.La presente divulgación también se refiere a polinucleótidos aislados que incluyen secuencias de ácido nucleico que codifican cualquiera de los anteriores. Además, la presente divulgación se refiere al uso de cualquiera de las composiciones anteriores para tratar, prevenir, disminuir el riesgo de, disminuir la gravedad de, disminuir la aparición y/o retrasar el inicio de una infección porC. difficile,afección, síndrome o enfermedad asociada aC. difficile,síntoma y/o complicación de la misma en un mamífero, en comparación con un mamífero al que no se le ha administrado la composición, así como a procedimientos para preparar dichas composiciones.

Los inventores descubrieron además que una combinación de al menos dos de los anticuerpos monoclonales neutralizantes puede presentar un efecto inesperadamente sinérgico en la neutralización respectiva de TcdA o TcdB. Los anticuerpos anti-toxina o fragmentos de unión de los mismos pueden ser útiles en la inhibición de una infección porC. difficile.

Un "anticuerpo" es una proteína que incluye al menos una o dos regiones variables de cadena pesada (H) (abreviadas en el presente documento como VH), y al menos una o dos regiones variables de cadena ligera (L) (abreviadas en el presente documento como VL). Las regiones VH y VL se pueden subdividir además en regiones de hipervariabilidad, denominadas "regiones determinantes de complementariedad" ("CDR"), entremezcladas con regiones que están más conservadas, denominadas "regiones marco" (FR). La extensión de la región marco y las CDR se ha definido con precisión (véase, Kabat, E. A., et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Estados Unidos. Department of Health and Human Services, Publicación NIH N.° 91-3242, 1991, y Chothia, C. et al., J. Mol. Biol. 196: 901-917, 1987). El término "anticuerpo" incluye inmunoglobulinas intactas de los tipos IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (así como sus subtipos), en las que las cadenas ligeras de la inmunoglobulina pueden ser de tipo kappa o lambda.

Las moléculas de anticuerpo pueden ser de longitud completa (por ejemplo, un anticuerpo IgG1 o IgG4). Los anticuerpos pueden ser de los diferentes isotipos, que incluyen: IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA1, IgA2, IgD o IgE. En un aspecto preferido, el anticuerpo es un isotipo de IgG, por ejemplo, IgG1. En otro aspecto preferido, el anticuerpo es un anticuerpo IgE.

En otro aspecto, la molécula de anticuerpo incluye un "fragmento de unión a antígeno" o "fragmento de unión", como se usa en el presente documento, que se refiere a una porción de un anticuerpo que se une específicamente a una toxina deC. difficile(por ejemplo, la toxina A). El fragmento de unión es, por ejemplo, una molécula en la que una o más cadenas de inmunoglobulina no es de longitud completa, pero que se une específicamente a una toxina.

Entre los ejemplos de porciones de unión incluidas dentro de la expresión "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo se incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab ligados por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, v) un fragmento dAb (Ward et al. (1989) Nature, 341:544-546), que consiste en un dominio VH; y (vi) una región determinante de complementariedad (CDR) aislada que tiene marco suficiente para la unión específica, por ejemplo, una porción de unión a antígeno de una región variable.

Un fragmento de unión de una región variable de cadena ligera y un fragmento de unión de una región variable de cadena pesada, por ejemplo, los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, se pueden unir, utilizando procedimientos recombinantes, mediante un enlazador sintético que permite fabricarlos como una proteína monocatenaria en el que las regiones VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv monocatenario (scFv); véase, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Dichos anticuerpos monocatenarios están abarcados también en la expresión "fragmento de unión" de un anticuerpo. Estas porciones de anticuerpo se obtienen utilizando técnicas conocidas en este campo, y se evalúa la utilidad de las porciones de la misma manera que en los anticuerpos intactos.

Tal como se usa en el presente documento, un anticuerpo que "se une específicamente" o es "específico" para un polipéptido particular o un epítopo en un polipéptido particular es un anticuerpo que se une a ese polipéptido o epítopo particular en un polipéptido particular sin unirse sustancialmente a ningún otro polipéptido o epítopo de polipéptido. Por ejemplo, cuando se refiere a una biomolécula (por ejemplo, proteína, ácido nucleico, anticuerpo, etc.) que "se une específicamente" a una diana, la biomolécula se une a su molécula diana y no se une en una cantidad significativa a otras moléculas en una población heterogénea de moléculas que incluyen la diana, según se mide en condiciones designadas (por ejemplo, condiciones de inmunoensayo en el caso de un anticuerpo). La reacción de unión entre el anticuerpo y su diana es determinante de la presencia de la diana en la población heterogénea de moléculas. Por ejemplo, "unión específica" o "se une específicamente" se refiere a la capacidad de un anticuerpo o fragmento de unión del mismo para unirse a una toxina mutante y/o de tipo silvestre deC. difficilecon una afinidad que es al menos dos veces mayor que su afinidad por un antígeno no específico.

En un aspecto ejemplar, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico. Un anticuerpo quimérico se puede producir mediante técnicas de ADN recombinante conocidas en este campo. Por ejemplo, un gen que codifica la región constante de Fc de una molécula de anticuerpo monoclonal murino (o de otra especie) puede digerirse con enzimas de restricción para eliminar la región que codifica el Fc murino, y se sustituye por la porción equivalente de un gen que codifica una región constante de Fc humana. También se puede crear un anticuerpo quimérico mediante técnicas de ADN recombinante en el que el ADN que codifica las regiones variables murinas se puede ligar al ADN que codifica las regiones constantes humanas.

En otro aspecto ejemplar, El anticuerpo o fragmento de unión del mismo se humaniza mediante procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, una vez obtenidos los anticuerpos murinos, una CDR del anticuerpo puede reemplazarse por al menos una porción de una CDR humana. Los anticuerpos humanizados también pueden generarse reemplazando secuencias de la región variable Fv murina que no están directamente implicadas en la unión al antígeno con secuencias equivalentes de regiones variables Fv humanas. En la técnica se conocen procedimientos generales para generar anticuerpos humanizados.

Por ejemplo, Los anticuerpos monoclonales dirigidos haciaTcdA de C. difficileo TcdB deC. difficiletambién pueden producirse mediante técnicas estándar, tales como una técnica de hibridoma (véase, por ejemplo, Kohler y Milstein, 1975, Nature, 256: 495-497). En resumen, una línea celular inmortal se fusiona con un linfocito de un mamífero inmunizado con TcdA deC. diffidle,TcdB deC. diffidle,o una toxina mutante deC. difficiledescrita en el presente documento, y los sobrenadantes de cultivo de las células de hibridoma resultantes se seleccionan para identificar un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal que se une a TcdA deC. difficileoTcdB de C. difficile.Típicamente, la línea celular inmortal deriva de las mismas especies de mamíferos que los linfocitos. Las células de hibridoma que producen un anticuerpo monoclonal de la invención se detectan seleccionando los sobrenadantes de cultivo del hibridoma en busca de anticuerpos que se unan a TcdA deC. difficileo TcdB deC. difficileutilizando un ensayo, tal como ELISA. Se pueden preparar hibridomas humanos de forma similar.

Como alternativa a la producción de anticuerpos por inmunización y selección, los anticuerpos de la divulgación también pueden identificarse seleccionando una biblioteca de inmunoglobulina combinatoria recombinante con una TcdA deC. difficile,TcdBC. difficileo una toxina mutante deC. difficiledescrita en el presente documento. La biblioteca de anticuerpos recombinantes puede ser una biblioteca de scFv o una biblioteca de Fab, por ejemplo. Además, los anticuerpos de la invención descritos en el presente documento pueden usarse en estudios de unión competitiva para identificar anticuerpos anti-TcdA o anti-TcdB adicionales y fragmentos de unión de los mismos. Por ejemplo, los anticuerpos anti-TcdA o anti-TcdB adicionales y sus fragmentos de unión pueden identificarse seleccionando una biblioteca de anticuerpos humanos e identificando moléculas dentro de la biblioteca que compitan con los anticuerpos de la invención descritos en el presente documento en un ensayo de unión competitiva.

Además, los anticuerpos abarcados por la presente divulgación incluyen anticuerpos recombinantes que pueden generarse usando procedimientos de presentación en fagos conocidos en la técnica. En los procedimientos de presentación de fagos, se puede usar un fago para presentar dominios de unión a antígeno expresados a partir de un repertorio o biblioteca de anticuerpos (por ejemplo, humano o murino). Los fagos que expresan un dominio de unión a antígeno que se une a un inmunógeno descrito en el presente documento (por ejemplo, una toxina mutante deC. difficile) se pueden seleccionar o identificar con antígeno, por ejemplo, utilizando antígeno marcado.

También están dentro del ámbito de la divulgación anticuerpos y fragmentos de unión de los mismos en los que se han sustituido, eliminado o añadido aminoácidos específicos. En particular, los anticuerpos preferidos tienen sustituciones de aminoácidos en la región marco, tal como para mejorar la unión al antígeno. Por ejemplo, un pequeño número seleccionado de restos del marco aceptor de la cadena de inmunoglobulina puede reemplazarse por los correspondientes aminoácidos donadores. Las localizaciones preferidas de las sustituciones incluyen restos de aminoácido adyacentes a la CDR, o que son capaces de interactuar con una CDR. Los criterios para seleccionar aminoácidos del donador se describen en la Patente de Estados Unidos N.° 5.585.089 (por ejemplo, columnas 12-16). El marco aceptor puede ser una secuencia marco de anticuerpo humano maduro o una secuencia consenso.

Tal como se usa en el presente documento, un "anticuerpo neutralizante o fragmento de unión del mismo" se refiere a un anticuerpo respectivo o fragmento de unión del mismo que se une a un patógeno (por ejemplo, una TcdA o TcdB deC. difficile)y reduce la infectividad y/o una actividad del patógeno (por ejemplo, reduce la citotoxicidad) en un mamífero y/o en un cultivo celular, en comparación con el patógeno en condiciones idénticas en ausencia del anticuerpo neutralizante o fragmento de unión del mismo. En un aspecto, el anticuerpo neutralizante o fragmento de unión del mismo es capaz de neutralizar al menos aproximadamente el 70%, 75 %, 8o %, 85 %, 90 %, 95 %, 99%, o más de una actividad biológica del patógeno, en comparación con la actividad biológica del patógeno en condiciones idénticas en ausencia del anticuerpo neutralizante o fragmento de unión del mismo.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "anticuerpo anti-toxina o fragmento de unión del mismo" se refiere a un anticuerpo o fragmento de unión del mismo que se une a la respectiva toxina deC. diffiále(por ejemplo, una toxina A o toxina B deC. diffiále).Por ejemplo, un anticuerpo antitoxina A o un fragmento de unión del mismo se refiere a un anticuerpo o fragmento de unión del mismo que se une a TcdA.

Los anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos descritos en el presente documento pueden generarse en cualquier mamífero, de tipo silvestre y/o transgénico, incluyendo, por ejemplo, ratones, seres humanos, conejos y cabras.

Cuando una composición inmunogénica descrita anteriormente es una que se ha administrado previamente a una población, tal como para la vacunación, la respuesta de anticuerpos generada en los sujetos puede usarse para neutralizar toxinas de la misma cepa y de una cepa que no estimuló la producción del anticuerpo. Véanse, por ejemplo, el Ejemplo 37, que muestra estudios relacionados con la reactividad cruzada, generada por la composición inmunogénica, entre la cepa 630 y las toxinas de varias cepas deC. diffiálede tipo silvestre.

En un aspecto, la divulgación se refiere a un anticuerpo o fragmento de unión del mismo específico para TcdA deC. diffiále.Los anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a TcdA incluyen A65-33; A60-22; A80-29 y/o, preferentemente, A3-25.

En un aspecto, la divulgación se refiere a un anticuerpo o fragmento de unión del mismo específico para una TcdA de cualquier cepa deC. diffiálede tipo silvestre, tales como los descritos anteriormente, por ejemplo, para la SEQ ID NO: 1. En otro aspecto, la divulgación se refiere a un anticuerpo o fragmento de unión del mismo específico para una composición inmunogénica descrita anteriormente. Por ejemplo, en una realización, el anticuerpo o fragmento de unión del mismo es específico para una composición inmunogénica que incluye la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 7. En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión del mismo es específico para una composición inmunogénica que incluye la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 7, en el que al menos un aminoácido de la Se Q ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 7 está entrecruzado por formaldehído, EDC, NHS o una combinación de EDC y NHS. En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión del mismo es específico para una composición inmunogénica que incluye la SEQ ID NO: 83 o la SEQ ID NO: 85.

Los anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos que tienen una cadena pesada variable y regiones de cadena ligera variables que tienen al menos aproximadamente un 90%, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, preferentemente aproximadamente un 98%, más preferentemente aproximadamente un 99% o aún más preferentemente aproximadamente un 100% de identidad con las regiones de cadena pesada y ligera variables de A65-33; A60-22; A80-29 y/o, preferentemente, A3-25 también puede unirse a TcdA.

En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye una región de cadena pesada variable que incluye una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 60%, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99% o 100% idéntico a una secuencia de aminoácidos de la región de cadena pesada variable de A3-25 como se establece en la SEQ ID NO: 37.

En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye una región de cadena ligera variable que incluye una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 60%, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99% o 100% idéntico a una secuencia de aminoácidos de la región de cadena ligera variable de A3-25 como se establece en la SEQ ID NO: 36.

En otro aspecto más, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye una región de cadena pesada variable que incluye una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 60%, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99% o 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos de la región de cadena pesada variable expuesta en la SEQ ID NO: 37, y una región de cadena ligera variable que incluye una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 60%, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99% o 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos de la región de cadena ligera variable establecida en la SEQ ID NO: 36.

En otra realización, los anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos que tienen regiones determinantes de complementariedad (CDR) de cadenas pesadas variables y/o cadenas ligeras variables de A65-33; A60-22; A80-29 y/o, preferentemente, A3-25 también puede unirse a TcdA. Las CDR de la región de cadena pesada variable de A3-25 se muestran en la Tabla 4, a continuación.

Las CDR de la región variable de cadena ligera de A3-25 se muestran en la Tabla 5, a continuación.

En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión del mismo incluye secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de cadena pesada como las mostradas en las SEQ ID NO: 41 (CDR H1), 42 (CDR H2) y 43 (CDR H3), y/o las secuencias de aminoácidos de las CDR de cadena ligera como las mostradas en las SEQ ID NO: 38 (CDR L1), 39 (CDR L2) y 40 (CDR L3).

En una realización ejemplar, el anticuerpo o fragmento de unión del mismo específico para la toxina A deC. diffiálese une específicamente a un epítopo dentro de la región N-terminal de TcdA, por ejemplo, un epítopo entre los aminoácidos 1-1256 de una TcdA, de acuerdo con la numeración de la SEQ ID NO: 1.

En una realización preferida, el anticuerpo o fragmento de unión del mismo específico para la toxina A deC. difficilese une específicamente a un epítopo dentro de la región C terminal de la toxina A, por ejemplo, un epítopo entre los aminoácidos 1832 a 2710 de una TcdA, de acuerdo con la numeración de la SEQ ID NO: 1. Los ejemplos incluyen A3-25; A65-33; A60-22; A80-29.

En otra realización adicional, el anticuerpo o fragmento de unión del mismo específico para la toxina A deC. difficilese une específicamente a un epítopo dentro de la región de "translocación" de la toxina A deC. difficile,por ejemplo, un epítopo que incluye preferentemente los restos 956-1128 de una TcdA, de acuerdo con la numeración de la SEQ ID NO: 1, tal como un epítopo entre los aminoácidos 659-1832 de una TcdA, de acuerdo con la numeración de la SEQ ID NO: 1.

En otro aspecto, la divulgación se refiere a un anticuerpo o fragmento de unión del mismo específico para TcdB deC. difficile.Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento de unión del mismo puede ser específico para una TcdB de cualquier cepa deC. difficilede tipo silvestre, tales como los descritos anteriormente, por ejemplo, para la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, la divulgación se refiere a un anticuerpo o fragmento de unión del mismo específico para una composición inmunogénica descrita anteriormente. Por ejemplo, en una realización, el anticuerpo o fragmento de unión del mismo es específico para una composición inmunogénica que incluye la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 8.

En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión del mismo es específico para una composición inmunogénica que incluye la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 8, en el que al menos un aminoácido de la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 8 está entrecruzado por formaldehído, EDC, NHS o una combinación de EDC y NHS. En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión del mismo es específico para una composición inmunogénica que incluye la SEQ ID NO: 84 o la SEQ ID NO: 86.

Los anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a TcdB incluyen anticuerpos producidos por los clones B2-31; B5-40, B70-2; B6-30; B9-30; B59-3; B60-2; B56-6; y/o, preferentemente,<b>8-26 descritos en el presente documento.

Los anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos que también pueden unirse a TcdB incluyen los que tienen una cadena pesada variable y regiones de cadena ligera variables que tienen al menos aproximadamente un 90%, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, preferentemente aproximadamente un 98%, más preferentemente aproximadamente un 99% o aún más preferentemente aproximadamente un 100% de identidad con las regiones de cadena pesada y ligera variables de B2-31; B5-40, B70-2; B6-30; B9-30; B59-3; B60-2; B56-6, preferentemente B8-26, B59-3 y/o B9-30.

En un aspecto, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye una región de cadena pesada variable que incluye una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 60%, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99% o 100% idéntico a una secuencia de aminoácidos de la región de cadena pesada variable de A3-25 como se establece en la SEQ ID NO: 49.

En un aspecto, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye una región de cadena pesada variable que incluye una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 60%, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99% o 100% idéntico a una secuencia de aminoácidos de la región de cadena pesada variable de A3-25 como se establece en la SEQ ID NO: 60.

En un aspecto, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye una región de cadena pesada variable que incluye una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 60%, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99% o 100% idéntico a una secuencia de aminoácidos de la región de cadena pesada variable de A3-25 como se establece en la SEQ ID NO: 71.

En otro aspecto, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye una región de cadena ligera variable que incluye una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 60%, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99% o 100% idéntico a una secuencia de aminoácidos de la región de cadena ligera variable de A3-25 como se establece en la SEQ ID NO: 55.

En otro aspecto, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye una región de cadena ligera variable que incluye una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 60%, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99% o 100% idéntico a una secuencia de aminoácidos de la región de cadena ligera variable de A3-25 como se establece en la SEQ ID NO: 66.

En otro aspecto, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye una región de cadena ligera variable que incluye una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 60%, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99% o 100% idéntico a una secuencia de aminoácidos de la región de cadena ligera variable de A3-25 como se establece en la SEQ ID NO: 77.

La secuencia de aminoácidos para la cadena pesada variable de un anticuerpo neutralizante de TcdB deC. dilfidle(Acm B8-26) se expone en la SEQ ID NO: 49. Véase la Tabla 25-a.

La secuencia de aminoácidos para la cadena ligera variable de un anticuerpo neutralizante de TcdB deC. dilfidle(Acm B8-26) se expone en la SEQ ID NO: 55. Véase la Tabla 25-b.

En un aspecto, el anticuerpo o fragmento de unión del mismo incluye secuencias de aminoácidos de las CDR de cadena pesada como las mostradas en las SEQ ID NO: 51 (CDR H1), 52 (CDR H2) y 53 (CDR H3), y/o las secuencias de aminoácidos de las CDR de cadena ligera como las mostradas en las SEQ ID NO: 57 (CDR L1), 58 (CDR L2) y 59 (CDR L3).

La secuencia de aminoácidos para la cadena pesada variable de un anticuerpo neutralizante de TcdB deC. dilfidle(Acm B59-3) se expone en la SEQ ID NO: 60. Véase la Tabla 26-a.

La secuencia de aminoácidos para la cadena ligera variable de un anticuerpo neutralizante de TcdB deC. dilfidle(Acm B59-3) se expone en la SEQ ID NO: 66. Véase la Tabla 26-b.

En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión del mismo incluye secuencias de aminoácidos de las CDR de cadena pesada como las mostradas en las SEQ ID NO: 62 (CDR H1), 63 (CDR H2) y 64 (CDR H3), y/o las secuencias de aminoácidos de las CDR de cadena ligera como las mostradas en las SEQ ID NO: 68 (CDR L1), 69 (CDR L2) y 70 (CDR L3).

La secuencia de aminoácidos para la cadena pesada variable de un anticuerpo neutralizante de TcdB deC. diffidle(Acm B9-30) se expone en la SEQ ID NO: 71. Véase la Tabla 27-a.

La secuencia de aminoácidos para la cadena ligera variable de un anticuerpo neutralizante de TcdB deC. difficile(Acm B9-30) se expone en la SEQ ID NO: 77. Véase la Tabla 27-b.

En un aspecto, el anticuerpo o fragmento de unión del mismo incluye secuencias de aminoácidos de las CDR de cadena pesada como las mostradas en las SEQ ID NO: 73 (CDR H1), 74 (CDR H2) y 75 (CDR H3), y/o las secuencias de aminoácidos de las CDR de cadena ligera como las mostradas en las SEQ ID NO: 79 (CDR L1), 80 (CDR L2) y 81 (CDR L3).

En un aspecto, la divulgación se refiere a un anticuerpo o fragmento de unión del mismo específico para una tcdB deC. difficilede tipo silvestre de cualquier cepa deC. difficile,tales como los descritos anteriormente, por ejemplo, para la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, la divulgación se refiere a un anticuerpo o fragmento de unión del mismo específico para una composición inmunogénica descrita anteriormente. Por ejemplo, en un aspecto, el anticuerpo o fragmento de unión del mismo es específico para una composición inmunogénica que incluye la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 8. En otro aspecto, el anticuerpo o fragmento de unión del mismo es específico para una composición inmunogénica que incluye la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 8, en el que al menos un aminoácido de la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 8 está entrecruzado por formaldehído, EDC, NHS o una combinación de EDC y NHS.

Los anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos que tienen una cadena pesada variable y regiones de cadena ligera variables que tienen al menos aproximadamente un 90%, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, preferentemente aproximadamente un 98%, más preferentemente aproximadamente un 99% o aún más preferentemente aproximadamente un 100% de identidad con las regiones de cadena pesada y ligera variables de B2-31; B5-40, B70-2; B6-30; B9-30; B59-3; B60-2; B56-6; y/o, preferentemente, B8-26 también puede unirse a TcdB.

En un aspecto, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye una región de cadena pesada variable que incluye una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 60%, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99% o 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos de la región de cadena pesada variable de B8-26 (SEQ ID NO: 49).

En otro aspecto, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye una región de cadena ligera variable que incluye una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 60%, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99% o 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos de la región de cadena ligera variable de B8-26 (SEQ ID NO: 55).

En otro aspecto más, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye una región de cadena pesada variable que incluye una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 60%, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99% o 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos de la región de cadena pesada variable de B8-26 (SEQ ID NO: 49), y una región de cadena ligera variable que incluye una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 60%, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99% o 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos de la región de cadena ligera variable de B8-26 (SEQ ID NO: 55).

En otro aspecto, los anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos que tienen CDR de cadenas pesadas variables y/o cadenas ligeras variables de B2-31; B5-40, B70-2; B6-30; B9-30; B59-3; B60-2; B56-6; y/o, preferentemente, B8-26 también puede unirse a TcdB.

En un aspecto, el anticuerpo o fragmento de unión del mismo incluye secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (CDR) de B8-26, y/o las secuencias de aminoácidos de las CDR de cadena ligera de B8-26.

En un aspecto preferido, el anticuerpo o fragmento de unión del mismo específico para la toxina B deC. difficilese une específicamente a un epítopo dentro de la región N-terminal de la toxina B, por ejemplo, un epítopo entre los aminoácidos 1-1256 de una TcdB, de acuerdo con la numeración de la SEQ ID NO: 2. Los ejemplos incluyen B2-31; B5-40; B8-26; B70-2; B6-30; y B9-30.

En un aspecto ejemplar, el anticuerpo o fragmento de unión del mismo específico para la toxina B deC. diffiálese une específicamente a un epítopo dentro de la región C terminal de la toxina B, por ejemplo, un epítopo entre los aminoácidos 1832 a 2710 de una TcdB, de acuerdo con la numeración de la SEQ ID NO: 2.

En otro aspecto más, el anticuerpo o fragmento de unión del mismo específico para la toxina B deC. difficilese une específicamente a un epítopo dentro de la región de "translocación" de la toxina B deC. diffiále,por ejemplo, un epítopo que incluye preferentemente los restos 956-1128 de una TcdB, de acuerdo con la numeración de la SEQ ID NO: 2, tal como un epítopo entre los aminoácidos 659-1832 de una TcdB. Los ejemplos incluyen B59-3; B60-2; y B56-6.

Combinaciones de anticuerpos

El anticuerpo anti-toxina o el fragmento de unión del mismo puede administrarse en combinación con otros anticuerpos anti-toxina deC. difficile(por ejemplo, otros anticuerpos monoclonales, gammaglobulina policlonal) o un fragmento de unión de los mismos. Las combinaciones que se pueden usar incluyen un anticuerpo anti-toxina A o un fragmento de unión del mismo y un anticuerpo anti-toxina B o un fragmento de unión del mismo.

En otro aspecto, una combinación incluye un anticuerpo anti-toxina A o fragmento de unión del mismo y otro anticuerpo anti-toxina A o fragmento de unión del mismo. Preferentemente, la combinación incluye un anticuerpo monoclonal neutralizante anti-toxina A o fragmento de unión del mismo y otro anticuerpo monoclonal neutralizante anti-toxina A o fragmento de unión del mismo. Sorprendentemente, los inventores descubrieron que dicha combinación daba como resultado un efecto sinérgico en la neutralización de la citotoxicidad de la toxina A. Por ejemplo, la combinación incluye una combinación de al menos dos de los siguientes anticuerpos monoclonales neutralizantes anti-toxina A: A3-25; A65-33; A60-22; y A80-29. Más preferentemente, La combinación incluye el anticuerpo A3-25 y al menos uno de los siguientes anticuerpos monoclonales neutralizantes anti-toxina A: A65-33; A60-22; y A80-29. Aún más preferentemente, La combinación incluye los cuatro anticuerpos: A3-25; A65-33; A60-22; y A80-29.

En un aspecto adicional, una combinación incluye un anticuerpo anti-toxina B o fragmento de unión del mismo y otro anticuerpo anti-toxina B o fragmento de unión del mismo. Preferentemente, la combinación incluye un anticuerpo monoclonal neutralizante anti-toxina B o fragmento de unión del mismo y otro anticuerpo monoclonal neutralizante anti-toxina B o fragmento de unión del mismo. Sorprendentemente, los inventores descubrieron que dicha combinación daba como resultado un efecto sinérgico en la neutralización de la citotoxicidad de la toxina B. Más preferentemente, la combinación incluye una combinación de al menos dos de los siguientes anticuerpos monoclonales neutralizantes anti-toxina B: B8-26; B9-30 y B59-3. Aún más preferentemente, la combinación incluye los tres anticuerpos: B8-26; B9-30 y B59-3.

En otro aspecto más, una combinación incluye un anticuerpo anti-toxina B o fragmento de unión del mismo y otro anticuerpo anti-toxina B o fragmento de unión del mismo. Como se ha indicado anteriormente, Los inventores descubrieron que una combinación de al menos dos de los anticuerpos monoclonales neutralizantes puede presentar un efecto inesperadamente sinérgico en la respectiva neutralización de la toxina A y la toxina B.

En otro aspecto, los agentes de la divulgación pueden formularse como una mezcla, o unirse química o genéticamente usando técnicas reconocidas en este campo, dando como resultado anticuerpos unidos covalentemente (o fragmentos de anticuerpos unidos covalentemente), que tienen propiedades de unión tanto anti-toxina A como anti-toxina B. La formulación combinada puede guiarse por una determinación de uno o más parámetros tales como la afinidad, avidez o eficacia biológica del agente solo o en combinación con otro agente.

Tales terapias de combinación son preferentemente aditivas y/o sinérgicas en su actividad terapéutica, por ejemplo, en la inhibición, prevención (por ejemplo, de recaída) y/o tratamiento de enfermedades o trastornos relacionados conC. difficile.La administración de tales terapias de combinación puede disminuir la dosis del agente terapéutico (por ejemplo, anticuerpo o mezcla de fragmentos de anticuerpos, o anticuerpos o fragmentos de anticuerpos biespecíficos entrecruzados o fusionados genéticamente) necesarios para lograr el efecto deseado.

Se entiende que cualquiera de las composiciones de la invención, por ejemplo, un anticuerpo anti-toxina A y/o anti toxina B o fragmento de unión del mismo, se pueden combinar en diferentes proporciones o cantidades para conseguir un efecto terapéuticos. Por ejemplo, el anticuerpo antitoxina A y anti-toxina B o su fragmento de unión respectivo pueden estar presentes en una composición en una proporción en el intervalo de 0,1:10 a 10:0.1, A:B. En otro aspecto, el anticuerpo anti-toxina A y anti-toxina B o su fragmento de unión respectivo pueden estar presentes en una composición en una proporción en el intervalo de 0,1:10 a 10:0.1, B:A.

En otro aspecto, la divulgación se refiere a un procedimiento para producir un anticuerpo neutralizante contra una TcdA deC. difficile.El procedimiento incluye administrar una composición inmunogénica como se ha descrito anteriormente a un mamífero y recuperar el anticuerpo del mamífero. En un aspecto preferido, la composición inmunogénica incluye una TcdA mutante deC. difficileque tiene la SEQ ID NO: 4, en la que al menos un aminoácido de la TcdA mutante deC. difficileestá entrecruzado químicamente, preferentemente por formaldehído o 1 -etil-3- (3-dimetilaminopropil)carbodiimida. Los ejemplos de anticuerpos neutralizantes contra TcdA que pueden producirse incluyen A65-33; A60-22; A80-29 y/o A3-25.

En otro aspecto más, la divulgación se refiere a un procedimiento para producir un anticuerpo neutralizante contra una TcdB deC. difficile.El procedimiento incluye administrar una composición inmunogénica como se ha descrito anteriormente a un mamífero y recuperar el anticuerpo del mamífero. En un aspecto preferido, la composición inmunogénica incluye una TcdB mutante deC. difficilecon la SEQ ID NO: 6, en la que al menos un aminoácido de la TcdB mutante deC. difficileestá entrecruzado químicamente, preferentemente por formaldehído o 1 -etil-3- (3-dimetilaminopropil)carbodiimida. Los ejemplos de anticuerpos neutralizantes contra TcdB que pueden producirse incluyen B2-31; B5-40, B70-2; B6-30; B9-30; B59-3; B60-2; B56-6; y/o B8-26.

Formulaciones

Las composiciones de la presente divulgación (tales como, por ejemplo, composiciones que incluyen una toxina deC. difficilemutante, composiciones inmunogénicas, anticuerpos y/o fragmentos de unión a anticuerpos de los mismos descritos en el presente documento) pueden estar en una diversidad de formas. Estos incluyen, por ejemplo, formas de dosificación semisólidas y sólidas, supositorios, formas líquidas, tales como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones infundibles e inyectables), dispersiones o suspensiones, liposomas, y/o en forma seca, tal como, por ejemplo, forma de polvo liofilizado, forma de secado por congelación, forma de secado por pulverización y/o forma de secado por espuma. Para los supositorios, los aglutinantes y vehículos incluyen, por ejemplo, polialquilenglicoles o triglicéridos; dichos supositorios pueden formarse a partir de mezclas que contienen las composiciones de la invención. En una realización de ejemplo, la composición está en una forma que es adecuada para solución o suspensión en, vehículos líquidos antes de la inyección. En otra realización ejemplar, la composición se emulsiona o encapsula en liposomas o micropartículas, tales como polilactida, poliglicolida o copolímero.

En una realización preferida, la composición se liofiliza y se reconstituye de forma extemporánea antes de su uso.

En un aspecto, la presente divulgación se refiere a composiciones farmacéuticas que incluyen cualquiera de las composiciones descritas en el presente documento (tales como, por ejemplo, composiciones que incluyen una toxina deC. difficilemutante, composiciones inmunogénicas, anticuerpos y/o fragmentos de unión a anticuerpos de los mismos descritos en el presente documento), formuladas junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los "vehículos farmacéuticamente aceptables" incluyen cualquier disolvente, medios de dispersión, estabilizante, diluyente y/o tampón que sea fisiológicamente adecuado.

Los estabilizantes ejemplares incluyen carbohidratos, tales como sorbitol, manitol, almidón, dextrano, sacarosa, trehalosa, lactosa y/o glucosa; proteínas inertes, tales como albúmina y/o caseína; y/u otras macromoléculas grandes que se metabolizan lentamente, tales como polisacáridos tales como quitosano, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos y copolímeros (tales como agarosa SEPHAROSE™ funcionalizada con látex, agarosa, celulosa, etc./), aminoácidos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y agregados de lípidos (tales como gotas de aceite o liposomas). Adicionalmente, estos vehículos pueden funcionar como agentes inmunoestimuladores (es decir, adyuvantes).

Preferentemente, la composición incluye trehalosa. Las cantidades preferidas de trehalosa (% en peso) incluyen desde un mínimo de aproximadamente un 1%, 2 %, 3% o 4% hasta un máximo de aproximadamente un 10%, 9 %, 8 %, 7 %, 6% o 5%. Cualquier valor mínimo se puede combinar con un valor máximo para definir un intervalo adecuado. En una realización, la composición incluye aproximadamente un 3% - 6% de trehalosa, aún más preferentemente, un 4,5% de trehalosa, por ejemplo, por dosis de 0,5 ml.

Los ejemplos de diluyentes adecuados incluyen agua destilada, solución salina, solución salina tamponada con fosfato fisiológica, glicerol, alcohol (tales como etanol), soluciones de Ringer, solución de dextrosa, soluciones salinas equilibradas de Hanks y/o un excipiente de liofilización.

Los tampones ejemplares incluyen tampones fosfato (tal como fosfato potásico, fosfato sódico); acetato (tal como acetato sódico); succinato (tal como succinato sódico); glicina; histidina; carbonato, tris(tris(hidroximetil)aminometano) y/o bicarbonato (tal como bicarbonato amónico). Preferentemente, la composición incluye tampón tris. Las cantidades preferidas de tampón tris incluyen desde un mínimo de aproximadamente 1 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM hasta un máximo de aproximadamente 100 mM, 50 mM, 20 mM, 19 mM, 18 mM, 17 mM, 16 mM, 15 mM, 14 mM, 13 mM, 12 mM u 11 mM. Cualquier valor mínimo se puede combinar con un valor máximo para definir un intervalo adecuado. En una realización, la composición incluye tampón tris de aproximadamente 8 mM a 12 mM, aún más preferentemente, tampón tris 10 mM, por ejemplo, por dosis de 0,5 ml.

En otra realización preferida, la composición incluye tampón histidina. Las cantidades preferidas de tampón histidina incluyen desde un mínimo de aproximadamente 1 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM hasta un máximo de aproximadamente 100 mM, 50 mM, 20 mM, 19 mM, 18 mM, 17 mM, 16 mM, 15 mM, 14 mM, 13 mM, 12 mM u 11 mM. Cualquier valor mínimo se puede combinar con un valor máximo para definir un intervalo adecuado. En una realización, la composición incluye tampón histidina de aproximadamente 8 mM a 12 mM, aún más preferentemente, tampón histidina 10 mM, por ejemplo, por dosis de 0,5 ml.

En otra realización preferida más, la composición incluye tampón fosfato. Las cantidades preferidas de tampón fosfato incluyen desde un mínimo de aproximadamente 1 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM hasta un máximo de aproximadamente 100 mM, 50 mM, 20 mM, 19 mM, 18 mM, 17 mM, 16 mM, 15 mM, 14 mM, 13 mM, 12 mM u 11 mM. Cualquier valor mínimo se puede combinar con un valor máximo para definir un intervalo adecuado. En una realización, la composición incluye tampón fosfato de aproximadamente 8 mM a 12 mM, aún más preferentemente, tampón fosfato 10 mM, por ejemplo, por dosis de 0,5 ml.

El pH del tampón se elegirá generalmente para estabilizar el material activo de elección, y los expertos en la técnica pueden determinarlo mediante procedimientos conocidos. Preferentemente, el pH del tampón estará en el intervalo de pH fisiológico. Por lo tanto, los intervalos de pH preferidos son de aproximadamente 3 a aproximadamente 8; más preferentemente, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 8,0; aún más preferentemente, de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,5; y aún más preferentemente, de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,2.

En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas pueden incluir un tensioactivo. Es adecuado cualquier tensioactivo, ya sea anfótero, no iónico, catiónico o aniónico. Los tensioactivos ejemplares incluyen los tensioactivos de ésteres de polioxietilén sorbitán (por ejemplo, TWEEN®), tales como polisorbato 20 y/o polisorbato 80; éteres grasos de polioxietileno derivados de alcoholes laurílico, cetílico, estearílico y oleílico (conocidos como tensioactivos Brij), tales como éter monolaurílico de trietilenglicol (Brij 30); Tritón X 100 o t-octilfenoxipolietoxietanol; y ésteres de sorbitán (comúnmente conocidos como SPAN), tales como trioleato de sorbitán (Span 85) y monolaurato de sorbitán, y combinaciones de los mismos. Los tensioactivos preferidos incluyen polisorbato 80 (monooleato de polioxietilén sorbitán).

Las cantidades preferidas de polisorbato 80 (% en peso) incluyen desde un mínimo de aproximadamente un 0,001%, 0,005% o 0,01%, hasta un máximo de aproximadamente un 0,010%, 0,015%, 0,025 % o 1,0%. Cualquier valor mínimo se puede combinar con un valor máximo para definir un intervalo adecuado. En una realización, la composición incluye aproximadamente un 0,005% - 0,015% de polisorbato 80, aún más preferentemente, un 0,01% de polisorbato 80.

En una realización de ejemplo, la composición inmunogénica incluye trehalosa y fosfato 80. En otra realización ejemplar, la composición inmunogénica incluye tampón tris y polisorbato 80. En otra realización ejemplar, la composición inmunogénica incluye tampón histidina y polisorbato 80. En todavía otra realización ejemplar, la composición inmunogénica incluye tampón fosfato y polisorbato 80.

En una realización ejemplar, la composición inmunogénica incluye trehalosa, tampón tris y polisorbato 80. En otra realización ejemplar, la composición inmunogénica incluye trehalosa, tampón histidina y polisorbato 80. En todavía otra realización ejemplar, la composición inmunogénica incluye trehalosa, tampón fosfato y polisorbato 80.

Las composiciones descritas en el presente documento pueden incluir además componentes procedentes del petróleo, animal, vegetal, o de origen sintético, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de soja y/o aceite mineral. Los ejemplos incluyen glicoles tales como propilenglicol o polietilenglicol.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica incluye además formaldehído. Por ejemplo, en una realización preferida, una composición farmacéutica que incluye además formaldehído tiene una composición inmunogénica, en la que la toxina mutante deC. difficilede la composición inmunogénica se ha puesto en contacto con un agente de entrecruzamiento químico que incluye formaldehído. La cantidad de formaldehído presente en la composición farmacéutica puede variar desde un mínimo de aproximadamente un 0,001%, 0,002 %, 0,003 %, 0,004 %, 0,005 %, 0,006 %, 0,007 %, 0,008 %, 0,009%, 0,010%, 0,013% o 0,015%, hasta un máximo de aproximadamente un 0,020 %, 0,019 %, 0,018 %, 0,017%, 0,016%, 0,015 %, 0,014 %, 0,013 %, 0,012%, 0,011% o 0,010%. Cualquier valor mínimo se puede combinar con un valor máximo para definir un intervalo adecuado. En una realización, la composición farmacéutica incluye aproximadamente un 0,010% de formaldehído.

En algunas realizaciones alternativas, las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento no incluyen formaldehído. Por ejemplo, en una realización preferida, una composición farmacéutica que no incluye formaldehído tiene una composición inmunogénica, en la que al menos un aminoácido de la toxina mutante deC. difficileestá entrecruzada químicamente por un agente que incluye EDC. Más preferentemente, en tal realización, la toxina mutante deC. difficileno ha entrado en contactado con un agente de entrecruzamiento químico que incluye formaldehído. Como otra realización ejemplar, una composición farmacéutica que está en forma liofilizada no incluye formaldehído.

En otra realización, las composiciones descritas en el presente documento pueden incluir un adyuvante, como se describe a continuación. Los adyuvantes preferidos aumentan la respuesta inmunitaria intrínseca a un inmunógeno sin causar cambios conformacionales en el inmunógeno que puedan afectar la forma cualitativa de la respuesta inmunitaria.

Los adyuvantes ejemplares incluyen monofosforil lípido A 3 des-O-acilado (MPL™) (véase el documento GB 2220211 (GSK)); un gel de hidróxido de aluminio tal como Alhydrogel™ (Brenntag Biosector, Dinamarca); sales de aluminio (tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio y sulfato de aluminio), que se pueden usar con o sin un agente inmunoestimulador tal como MPL o 3-DMP, QS-21, aminoácidos poliméricos o monoméricos tales como ácido poliglutámico o polilisina.

Otro adyuvante ejemplar es un oligonucleótido inmunoestimulador tal como un oligonucleótido CpG (véanse, por ejemplo, los documentos WO 1998/040100 y WO2010/067262), o una saponina y un oligonucleótido inmunoestimulador, tal como un oligonucleótido CpG (véase, por ejemplo, el documento WO 00/062800). En una realización preferida, el adyuvante es un oligonucleótido CpG, aún más preferentemente oligodesoxinucleótidos CpG (ODN CpG). Los ODN CpG preferidos son de la clase B que activan preferentemente las células B. En aspectos de la invención, el ODN CpG tiene la secuencia de ácido nucleico 5' t*C*g*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*G*C*T*T*T*T 3' (SEQ ID NO: 48) en la que * indica un enlace de fosforotioato. El ODN CpG de esta secuencia se conoce como CpG 24555, que se describe en el documento WO2010/067262. En una realización preferida, CpG 24555 se usa junto con una sal de hidróxido de aluminio tal como Alhydrogel.

Una clase adicional de adyuvantes ejemplares incluye adyuvantes de saponina, tales como Stimulon™ (QS-21, que es un glucósido de triterpeno o saponina, Aquila, Framingham, Mass.) o partículas generadas a partir de los mismos, tales como ISCOM (complejos inmunoestimuladores) y adyuvante ISCOMATRIX®. En consecuencia, las composiciones de la presente invención se pueden administrar en forma de ISCOM, ISCOM que contienen CTB, liposomas o encapsuladas en compuestos tales como acrilatos o poli(DL-lactida-co-glucósido) para formar microesferas de un tamaño adecuado para la adsorción. Típicamente, el término "ISCOM" se refiere a complejos inmunogénicos formados entre glucósidos, tales como saponinas triterpenoides (particularmente Quil A) y antígenos que contienen una región hidrófoba. En una realización preferida, el adyuvante es un adyuvante ISCOMATRIX.

Otros adyuvantes ejemplares incluyen RC-529, GM-CSF y adyuvante completo de Freund (CFA) y adyuvante incompleto de Freund (<i>F<a>).

Otra clase más de adyuvantes ejemplares son análogos de glucolípidos entre los que se incluyen N-glucosilamidas, N-glucosilureas y N-glucosilcarbamatos, cada uno de los cuales está sustituido en el resto de azúcar por un aminoácido.

Opcionalmente, la composición farmacéutica incluye dos o más adyuvantes diferentes. Las combinaciones preferidas de adyuvantes incluyen cualquier combinación de adyuvantes que incluyen, por ejemplo, al menos dos de los siguientes adyuvantes: alumbre, MPL, QS-21, ISCOMATRIX, CpG y Alhydrogel. Una combinación ejemplar de adyuvantes incluye una combinación de CpG y Alhydrogel.

Como alternativa, en una realización, la composición se administra al mamífero en ausencia de un adyuvante.

Las composiciones descritas en el presente documento pueden administrarse por cualquier vía de administración, tal como, por ejemplo, parenteral, tópica, intravenosa, mucosa, oral, subcutánea, intraarterial, intracraneal, intratecal, intraperitoneal, intranasal, intramuscular, intradérmica, infusión, rectal y/o transdérmica para aplicaciones profilácticas y/o terapéuticas. En una realización preferida, la vía de administración de la composición es parenteral, más preferentemente la administración intramuscular. La administración intramuscular típica se realiza en músculos de los brazos o las piernas.

Las composiciones descritas en el presente documento pueden administrarse en combinación con terapias que son al menos parcialmente eficaces en la prevención y/o tratamiento de la infección porC. diffidle.Por ejemplo, una composición de la invención se puede administrar antes, al mismo tiempo o después de una bioterapia; terapia probiótica; implantes de heces; inmunoterapia (tal como inmunoglobulina intravenosa); y/o un estándar de atención aceptado para el tratamiento con antibióticos de la enfermedad asociada conC. difficile(DACD), tales como metronidazol y/o vancomicina.

Una composición de la presente invención relacionada con la toxina A y la toxina B puede administrarse al mamífero en cualquier combinación. Por ejemplo, una composición inmunogénica que incluye una TcdA mutante deC. difficilepuede administrarse al mamífero antes, al mismo tiempo o después de la administración de una composición inmunogénica que incluye una TcdB mutante deC. difficile.Por el contrario, una composición inmunogénica que incluye una TcdB mutante deC. difficilepuede administrarse al mamífero antes, al mismo tiempo o después de la administración de una composición inmunogénica que incluye una TcdA mutante deC. difficile.

En otro aspecto, una composición que incluye un anticuerpo anti-toxina A o fragmento de unión del mismo puede administrarse al mamífero antes, al mismo tiempo o después de la administración de una composición que incluye un anticuerpo anti-toxina B o un fragmento de unión del mismo. Por el contrario, una composición que incluye un anticuerpo anti-toxina B o fragmento de unión del mismo puede administrarse al mamífero antes, al mismo tiempo o después de la administración de una composición que incluye un anticuerpo antitoxina A o un fragmento de unión del mismo.

En una realización adicional, una composición de la presente invención se puede administrar al mamífero antes, al mismo tiempo o después de la administración de un vehículo farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, un adyuvante se puede administrar antes, al mismo tiempo o después de la administración de una composición que incluye una toxina mutante deC. difficile.En consecuencia, una composición de la presente invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable pueden envasarse en el mismo vial o pueden envasarse en viales separados y mezclarse antes de su uso. Las composiciones pueden formularse para la administración de una sola dosis y/o para la administración de dosis múltiples.

Procedimientos para proteger y/o tratar la infección por C. difficile en un mamífero

En un aspecto, la divulgación se refiere a un procedimiento para inducir una respuesta inmunitaria a una toxina deC. difficileen un mamífero. El procedimiento incluye administrar una cantidad eficaz de una composición descrita en el presente documento al mamífero. Por ejemplo, el procedimiento puede incluir administrar una cantidad eficaz para generar una respuesta inmunitaria a la toxina deC. difficilerespectiva en el mamífero.

En un aspecto ejemplar, la divulgación se refiere a un procedimiento para inducir una respuesta inmunitaria a una TcdA deC. difficileen un mamífero. El procedimiento incluye administrar una cantidad eficaz de una composición inmunogénica que incluye una TcdA mutante deC. difficileal mamífero. En otro aspecto ejemplar, la divulgación se refiere a un procedimiento para inducir una respuesta inmunitaria a una TcdB deC. difficileen un mamífero. El procedimiento incluye administrar una cantidad eficaz de una composición inmunogénica que incluye una TcdB mutante deC. difficileal mamífero.

En un aspecto adicional, el procedimiento incluye administrar una cantidad eficaz de una composición inmunogénica que incluye una TcdA mutante deC. difficiley una cantidad eficaz de una composición inmunogénica que incluye una TcdB mutante deC. difficileal mamífero. En aspectos adicionales, las composiciones descritas en el presente documento pueden usarse para tratar, prevenir, disminuir el riesgo de, disminuir la gravedad de, disminuir las apariciones de y/o retrasar el inicio de una infección porC. difficile, afección, síndrome o enfermedad asociada aC. difficile, síntoma y/o complicación de la misma en un mamífero, en comparación con un mamífero al que no se le administra la composición. El procedimiento incluye administrar una cantidad eficaz de la composición al mamífero.

Se reconocen tres síndromes clínicos causados por la infección porC. difficile,basados en la gravedad de la infección. La forma más grave es la colitis seudomembranosa (CSM), que se caracteriza por una diarrea profusa, dolor abdominal, signos sistémicos de enfermedad y un aspecto endoscópico del colon característico.

La colitis asociada a antibióticos (CAA) también se caracteriza por diarrea profusa, dolor abdominal y sensibilidad, signos sistémicos (por ejemplo, fiebre) y leucocitosis. La lesión intestinal en la CAA es menos grave que en CSM, está ausente el aspecto endoscópico del colon característico de la CSM y la mortalidad es baja.

Por último, la diarrea asociada a antibióticos (DAA, también conocida como diarrea asociada aC. difficile(DACD) es un síndrome relativamente leve y se caracteriza por diarrea de leve a moderada, que carece de inflamación del intestino grueso (caracterizada por, por ejemplo, dolor abdominal y sensibilidad) y signos sistémicos de infección (por ejemplo, fiebre).

Estos tres síndromes distintos suelen aparecer en un orden de frecuencia creciente. Es decir, La CSM típicamente se produce con menos frecuencia que la CAA, y la DAA es generalmente la presentación clínica más frecuente de la enfermedad porC. difficile.

Una complicación frecuente de la infección porC. difficilees una enfermedad recurrente o recidivante, que se produce en hasta el 20% de todos los sujetos que se recuperan de la enfermedad porC. difficile.La recaída se puede caracterizar clínicamente como DAA,<c>A<a>o CSM. Los pacientes que recaen una vez tienen más probabilidad de recaer nuevamente.

Tal como se usa en el presente documento, las condiciones de una infección porC. difficileincluyen, por ejemplo, Infección leve, de leve a moderada, moderada y grave porC. difficile.La condición de la infección porC. difficilepuede variar dependiendo de la presencia y/o la gravedad de los síntomas de la infección.

Los síntomas de una infección porC. difficilepueden incluir síntomas fisiológicos, bioquímicos, histológicos y/o conductuales tales como, por ejemplo, diarrea; colitis; colitis con calambres, fiebre, leucocitos fecales e inflamación observada en una biopsia de colon; colitis seudomembranosa; hipoalbuminemia; anasarca; leucocitosis; septicemia; dolor abdominal; transmisión asintomática; y/o complicaciones y fenotipos patológicos intermedios presentes durante el desarrollo de la infección, y sus combinaciones, etc. En consecuencia, por ejemplo, la administración de una cantidad eficaz de las composiciones descritas en el presente documento puede, por ejemplo, tratar, prevenir, disminuir el riesgo de, disminuir la gravedad de, disminuir la aparición y/o retrasar el inicio de la diarrea; dolor abdominal, calambres, fiebre, inflamación observada en una biopsia de colon, hipoalbuminemia, anasarca, leucocitosis, septicemia y/o transmisión asintomática, etc., en comparación con un mamífero al que no se le ha administrado la composición.

Los factores de riesgo de una infección porC. difficilepueden incluir, por ejemplo, uso presente o inmediato de un antimicrobiano (se incluye cualquier agente antimicrobiano con un espectro antibacteriano y/o actividad contra bacterias anaerobias, incluyendo, por ejemplo, antibióticos que causan alteración de la microbiota colónica normal, por ejemplo, clindamicina, cefalosporinas, metronidazol, vancomicina, fluoroquinolonas (incluyendo levofloxacina, moxifloxacina, gatifloxacina y ciprofloxacina), linezolid, etc.); retirada actual o en un futuro inmediato de metronidazol o vancomicina prescritos; admisión actual o en un futuro inmediato en un centro de atención médica (tal como un hospital, un centro de atención crónica, etc.) y profesionales de la salud; tratamiento actual o en un futuro inmediato con inhibidores de la bomba de protones, antagonistas de H2 y/o metotrexato, o una combinación de los mismos; enfermedades gastrointestinales presentes o riesgo de padecerlas, tales como enfermedad inflamatoria del intestino; cirugía gastrointestinal o procedimiento gastrointestinal en el pasado, actualmente o en un futuro inmediato en el mamífero; recurrencia pasada o actual de una infección porC. difficiley/o una DACD, por ejemplo, pacientes que han tenido una infección porC. difficiley/o una DACD una o más de una vez; y seres humanos de al menos aproximadamente 65 años o más.

En los procedimientos descritos en el presente documento, el mamífero puede ser cualquier mamífero, tal como, por ejemplo, ratones, hámsteres, primates y seres humanos. En una realización preferida, el mamífero es un ser humano. De acuerdo con la presente invención, el ser humano puede incluir individuos que han presentado una infección porC. difficile,enfermedad, síndrome o afección asociada conC. difficile,síntoma y/o complicación de la misma; individuos que actualmente presentan una infección porC. difficile,enfermedad, síndrome o afección asociada aC. difficile,síntoma y/o complicación de la misma; e individuos que tienen riesgo de padecer una infección porC. difficile,enfermedad, síndrome o afección asociada conC. difficile,síntoma y/o complicación de la misma.

Los ejemplos de individuos que han mostrado síntomas de infección porC. difficileincluyen individuos que han mostrado o muestran síntomas descritos anteriormente; individuos que han tenido o tienen una infección porC. difficiley/o una enfermedad asociada aC. difficile(DACD); e individuos que tienen una recurrencia de una infección porC. difficiley/o DACD.

Los ejemplos de pacientes que tienen riesgo de padecer una infección porC. difficileincluyen individuos con riesgo o que se están sometiendo actualmente a un uso antimicrobiano planificado; individuos con riesgo o que se están sometiendo actualmente a una retirada de metronidazol o vancomicina prescritos; individuos que están en riesgo o que se están sometiendo actualmente a una admisión planificada en un centro de atención médica (tal como un hospital, un centro de atención crónica, etc.) y profesionales de la salud; y/o individuos con riesgo de o que se están sometiendo actualmente a un tratamiento planificado con inhibidores de la bomba de protones, antagonistas de H2 y/o metotrexato, o una combinación de los mismos; individuos que han tenido o están sufriendo enfermedades gastrointestinales, tales como enfermedad inflamatoria del intestino; individuos que han sido sometidos o se están sometiendo a cirugía gastrointestinal o procedimientos gastrointestinales; e individuos que han tenido o tienen una recurrencia de una infección porC. difficiley/o una DACD, por ejemplo, pacientes que han tenido una infección porC. difficiley/o una DACD una o más de una vez; individuos que tienen aproximadamente 65 años o más. Estos pacientes con riesgo pueden o no presentar actualmente síntomas de una infección porC. difficile.

En pacientes asintomáticos, la profilaxis y/o el tratamiento pueden comenzar a cualquier edad (por ejemplo, a aproximadamente los 10, 20 o 30 años de edad). En un aspecto, sin embargo, no es necesario comenzar el tratamiento hasta que el paciente alcance al menos aproximadamente 45, 55, 65, 75 u 85 años de edad. Por ejemplo, las composiciones descritas en el presente documento pueden administrarse a un ser humano asintomático que tenga de 50 a 85 años de edad.

En un aspecto, el procedimiento de la prevención, reducción del riesgo de, reducción de la gravedad de, reducción de las apariciones y/o retraso del inicio de una infección porC. difficile,enfermedad, síndrome o afección asociada aC. difficile,síntoma y/o complicación de la misma en un mamífero incluye la administración de una cantidad eficaz de una composición descrita en el presente documento a un mamífero que lo necesite, un mamífero con riesgo y/o un mamífero susceptible a una infección porC. difficile.Una cantidad eficaz incluye, por ejemplo, una cantidad suficiente para prevenir, disminuir el riesgo de, disminuir la gravedad de, disminuir las apariciones de y/o retrasar el inicio de una infección porC. difficile,afección, síndrome o enfermedad asociada aC. difficile,síntoma y/o complicación de la misma en un mamífero, en comparación con un mamífero al que no se le administra la composición. La administración de una cantidad eficaz de las composiciones descritas en el presente documento puede, por ejemplo, prevenir, disminuir el riesgo de, disminuir la gravedad de, disminuir la aparición y/o retrasar el inicio de la diarrea; dolor abdominal, calambres, fiebre, inflamación observada en una biopsia de colon, hipoalbuminemia, anasarca, leucocitosis, septicemia y/o transmisión asintomática, etc., en comparación con un mamífero al que no se le ha administrado la composición. En un aspecto preferido, el procedimiento incluye administrar una cantidad eficaz de una composición inmunogénica descrita en el presente documento al mamífero que lo necesite, al mamífero con riesgo y/o al mamífero susceptible a una infección porC. difficile.

En un aspecto adicional, el procedimiento de tratamiento, reducción de la gravedad y/o retraso del inicio de una infección porC. difficile,enfermedad, síndrome o afección asociada aC. difficile,síntoma y/o complicación de la misma en un mamífero incluye la administración de una cantidad eficaz de una composición descrita en el presente documento a un mamífero sospechoso de, o que actualmente padece una infección porC. difficile.Una cantidad eficaz incluye, por ejemplo, una cantidad suficiente para tratar, disminuir la gravedad de y/o retrasar el inicio de una infección porC. difficile,afección, síndrome o enfermedad asociada aC. difficile,síntoma y/o complicación de la misma en un mamífero, en comparación con un mamífero al que no se le administra la composición.

La administración de una cantidad eficaz de la composición puede mejorar al menos un signo o síntoma de infección porC. difficileen el sujeto, tales como los que se describen a continuación. La administración de una cantidad eficaz de las composiciones descritas en el presente documento puede, por ejemplo, disminuir la gravedad de y/o disminuir la aparición de diarrea; disminuir la gravedad de y/o disminuir la aparición de dolor abdominal, calambres, fiebre, inflamación observada en una biopsia de colon, hipoalbuminemia, anasarca, leucocitosis, septicemia y/o transmisión asintomática, etc., en comparación con un mamífero al que no se le ha administrado la composición. Opcionalmente, la presencia de síntomas, signos y/o factores de riesgo de una infección se determinan antes de comenzar el tratamiento. En un aspecto preferido, el procedimiento incluye administrar una cantidad eficaz de un anticuerpo y/o fragmento de unión del mismo descrito en el presente documento al mamífero sospechoso de, o que actualmente padece, una infección porC. difficile.

En consecuencia, una cantidad eficaz de la composición se refiere a una cantidad suficiente para lograr un efecto deseado (por ejemplo, efecto profiláctico y/o terapéutico) en los procedimientos de la presente divulgación. Por ejemplo, la cantidad de un inmunógeno para administración puede variar desde un mínimo de aproximadamente 1 |jg, 5 jg , 25 jg , 50 jg , 75 jg , 100 jg , 200 jg , 500 jg o 1 mg hasta un máximo de aproximadamente 2 mg, 1 mg, 500 jg o 200 jg por inyección. Cualquier valor mínimo se puede combinar con un valor máximo para definir un intervalo adecuado. Típicamente, se usan aproximadamente 10, 20, 50 o 100 jg por inmunógeno para cada inyección humana.

La cantidad de una composición de la invención administrada al sujeto puede depender del tipo y la gravedad de la infección y/o de las características del individuo, tales como estado de salud general, edad, el sexo, peso corporal y tolerancia a fármacos. También puede depender del grado, gravedad y tipo de enfermedad. Una cantidad eficaz también puede variar dependiendo de factores, tales como la vía de administración, sitio diana, estado fisiológico del paciente, edad del paciente, si el paciente es un ser humano o un animal, otras terapias administradas, y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. El experto en la materia podrá determinar las cantidades adecuadas dependiendo de estos y otros factores.

Una cantidad eficaz puede incluir una dosis eficaz o múltiples dosis eficaces (tales como, por ejemplo, 2, 3, 4 dosis, o más) para su uso en los procedimientos del presente documento. Es posible que sea necesario ajustar las dosis eficaces para optimizar la seguridad y la eficacia.

Una combinación de cantidad y frecuencia de la dosis adecuada para lograr usos profilácticos y/o terapéuticos se define como un régimen profiláctica o terapéuticamente eficaz. En un régimen profiláctico y/o terapéutico, la composición se administra típicamente en más de una dosis hasta que se haya logrado una respuesta inmunitaria suficiente. Típicamente, se supervisa la respuesta inmunitaria y se administran dosis repetidas si la respuesta inmunitaria comienza a disminuir.

Las composiciones pueden administrarse en múltiples dosis durante un período de tiempo. El tratamiento puede controlarse analizando el anticuerpo, o las respuestas de linfocitos T o B activados al agente terapéutico (por ejemplo, la composición inmunogénica que incluye una toxina mutante deC. diffiále)a lo largo del tiempo. Si la respuesta cae, está indicada una dosis de refuerzo.

Ejemplos

Ejemplo 1: Identificación de cepas de C. difficile negativas para toxina

Para identificar cepas deC. difficileque carecen de genes de toxina (A y B) y de expresión de toxina, se ensayaron 13 cepas deC. difficile.En medios de cultivo de 13 cepas deC. difficilese analizó la presencia de toxina A mediante ELISA. Siete cepas expresaron toxina A:C. difficile14797-2,C. difficile630,C. difficileBDMS,C. difficileW1194,C. difficile870,C. difficile1253 yC. difficile2149. Véase la figura 3.

Seis cepas no expresaban la toxina A y carecían de todo el locus de patogenicidad:C. difficile1351 (ATCC 43593™),C. difficile3232 (ATCC BAA-1801™),C. difficile7322 (ATCC 43601™),C. difficile5036 (ATCC 43603™),C. difficile4811 (4 ATCC 3602™) yC. difficileVPI 11186 (ATCC 700057™). Se seleccionó VPI 11186 basándose en su eficacia para captar ADN plasmídico por conjugación.

Las mismas 13 cepas se ensayaron en un ensayo de PCR multiplex utilizando cebadores fuera del locus de patogenicidad (PaLoc; Braun et al.,Gene.28 de noviembre de 1996; 181 (1-2): 29-38.). Los resultados de la PCR demostraron que el ADN de las 6 cepas negativas para la toxina A mediante ELISA no amplificó ningún gen de PaLoc (tcdA-tcdE). Las secuencias flanqueantes de PaLoc(cdd3ycdu2)estaban presentes (datos no mostrados).

Ejemplo 2: Inactivación de la ruta de esporulación en C. difficile VPI 11186

La inactivación de la función de formación de esporas de la cepa de producción deC. difficilefacilita la fermentación a gran escala en un entorno de fabricación seguro. Se utilizó sistema ClosTron para crear una cepa deC. difficileasporogénica. Véase Heap et al., J Microbiol Methods. julio de 2009; 78 (1): 79-85. El sistema ClosTron permite la inactivación de genes dirigida con un intrón del grupo II para la inactivación por inserción dirigida de un gen clostridialspo0A1.La cepa VPI11186 sin producción de toxina se sometió a inactivación de esporulación mediante la tecnología ClosTron. Se seleccionaron mutantes resistentes a la eritromicina y la presencia del casete de inserción se confirmó mediante PCR (no se muestra). Se confirmó la incapacidad de dos clones independientes para formar esporas.

Ejemplo 3: Modificación genética de los genes de toxina A y B para inactivar la función de citotoxicidadSe diseñaron marcos de lectura abiertos (ORF) de toxinas mutantes A y B de longitud completa basándose en secuencias del genoma de la cepa 630A para la síntesis personalizada en Blue Heron Biotech. Véanse, por ejemplo, las SEQ ID NO: 9-14. El sitio activo para la actividad glucosiltransferasa responsable de la toxicidad celular se alteró por dos sustituciones alélicas: D285A/D287A (véase la SEQ ID NO: 3) para toxina A y D286A/D288A (véase la SEQ ID NO: 5) para toxina B. Se mutaron dos nucleótidos en cada codón de aspartato (D) para crear el codón para la alanina (A). Véanse, por ejemplo, las SEQ ID NO: 9-14. Además, se construyó un par de vectores que expresaban toxinas mutantes que carecen de restos de cisteína siguiendo una síntesis personalizada en Blue Heron Biotech. Siete restos de cisteína de la toxina A mutante y 9 restos de cisteína de la toxina B mutante fueron reemplazados con alanina. Las sustituciones incluyen cisteínas catalíticas de la proteasa autocatalítica de las toxinas A y B. Asimismo, se introdujeron mutaciones silenciosas cuando fue necesario para eliminar los sitios de enzimas de restricción utilizados para la construcción del vector.

Ejemplo 4: Vector de expresión pMTL84121fdx

El vector lanzadera de plásmido utilizado para la expresión del antígeno de toxina mutante deC. diffiálese seleccionó del sistema modular de la serie pMTL800o desarrollado por el laboratorio de Minton (véase Heap et al., J. Microbiol Methods. julio de 2009; 78 (1): 79-85). El vector elegido pMTL84121fdx contiene el replicón Gram+ del plásmido pCD6 deC. difficile,el marcador seleccionablecatP(cloranfenicol/tiamfenenicol), la funcióntray el replicón Gram- de p15a y el promotor de ferredoxina de C.sporogenes (fdx)y el sitio de clonación múltiple distal (MCS). Los datos empíricos sugirieron que el replicón de p15a de bajo número de copia confiere mayor estabilidad enE. colique la alternativa ColEI. Se seleccionó el promotorfdxporque producía una expresión más alta que otros promotores ensayados en experimentos con construcciones de informador CAT (por ejemplo,tcdA, tcdB;o tetR o xylR heterólogo (datos no mostrados).

Ejemplo 5: Clonación de las ORF de toxinas modificadas en pMTL84121fdx

Se subclonaron marcos de lectura abierta (ORF) de toxina A y B mutantes de longitud completa basados en secuencias del genoma de la cepa 630A utilizando sitiosNdelyBglIIde clonación múltiple del vectorpMTL84121 fdxutilizando técnicas estándar de biología molecular. Para facilitar la clonación, los ORF estaban flanqueados por un sitioNdelproximal que contenía el codón de inicio y un sitioBglIIjusto corriente abajo del codón de terminación.

Ejemplo 6: Mutagénesis dirigida de TcdA para crear un triple mutante

Se sustituyó el resto de cisteína catalítica del dominio de la proteasa autocatalítica (es decir, C700A para TcdA y C698A para TcdB) en las SEQ ID NO: 3 y 5, es decir, en cada uno de los "dobles mutantes". Para la mutagénesis de la toxina A mutante, se subclonó un fragmentoNdeI-HindIIIde 2,48 kb del plásmido de expresión D285A/D287A de TcdA en pUC19 (cortado con las mismas) y se realizó mutagénesis dirigida en este molde. Una vez confirmados los nuevos alelos por análisis de la secuencia de ADN, los fragmentosNdeI-HindIIImodificados se reintrodujeron en el vector de expresión pMTL84121fdxpara crear los "triples mutantes", es decir, la SEQ ID NO: 4 y la SEQ ID NO: 6,

Ejemplo 7: Mutagénesis dirigida de TcdB para crear un triple mutante

Para la mutagénesis de la toxina B mutante, se modificó y reintrodujo un fragmentoNdeI-EcoNI de3,29 kb delplásmidode toxina B mutante. Como el sitio EcoNI no está presente en los vectores de clonación disponibles, se subclonó un fragmentoNdeI-EcoRVde 3,5 kb ligeramente más grande en pUC19 (preparado conNdeI-SmaI).Después de la mutagénesis, el fragmentoNdeI-EcoNIinterno modificado de 3,3 kb se escindió y se usó para reemplazar el fragmento de pMTL84121fdxdel vector de expresión de la toxina B mutante correspondiente. Como se observó que la eficacia de clonación de esta estrategia direccional era bastante baja, se intentó en paralelo una estrategia alternativa para introducir el alelo C698A que implica el reemplazo de un DraIII de 1,5 kb. Ambas estrategias produjeron de manera independiente los recombinantes deseados.

Ejemplo 8: Creación de variantes adicionales de toxinas mutantes por mutagénesis dirigida

Se construyeron al menos doce variantes diferentes de toxina mutante deC. difficile.Se introdujeron sustituciones alélicas en fragmentos del gen de la toxina mutante N-terminal mediante mutagénesis dirigida (kit Quickchange®). También se diseñaron por ingeniería genética toxinas recombinantes como controles de referencia para evaluar la capacidad de este sistema basado en plásmidos para generar proteínas cuantitativamente equivalentes en actividad biológica a toxinas nativas purificadas a partir de cepas deC. difficilede tipo silvestre. En este caso, se introdujeron sustituciones alélicas para revertir las sustituciones originales de glucosiltransferasa. Además, se construyó un par de vectores de toxinas mutantes sin cisteína siguiendo una síntesis personalizada en Blue Heron Biotech.

Las doce variantes de toxinas incluyen (1) una toxina A mutante deC. difficileque tiene una mutación D285A/D287A (SEQ ID NO: 3); (2) una toxina B mutante deC. difficileque tiene una mutación D286A/D288A (SEQ ID NO: 5); (3) una toxina A mutante deC. difficileque tiene una mutación D285A/D287A C700A (SEQ ID NO: 4); (4) una toxina B mutante deC. difficileque tiene una mutación D286A/D288A C698A (SEQ ID NO: 6); (5) una toxina A recombinante que tiene la SEQ ID NO: 1; (6) una toxina B recombinante que tiene la SEQ ID NO: 2; (7) una toxina A mutante deC. difficileque tiene una mutación C700A; (8) una toxina B mutante deC. difficileque tiene una mutación C698A; (9) una toxina A mutante deC. difficileque tiene una mutación C700A C597S, C1169S, C1407S, C1623S, C2023S y c 2236S; (10) una toxina B mutante deC. difficileque tiene una mutación C698A C395S, C595S, C824S, C870S, C1167S, Cl625S, C1687S y C2232S; (11) una toxina A mutante deC. difficileque tiene una mutación D285A, D287A, C700A, D269A, R272A, e460A y R462A (SEQ ID NO: 7); y (12) una toxina B mutante deC. difficileque tiene una mutación D270A, R273A, D286A, D288A, D461A, K463A y C698A (SEQ ID NO: 8)

Ejemplo 9: Estabilidad de los transformantes

Se obtuvieron plásmidos reordenados con la cepa de laboratorio DH5a deE. colicomúnmente utilizada. En cambio, las transformaciones usando el huésped de Invitrogen Stbl2™E. coliprodujeron recombinantes de toxina mutante de longitud completa de crecimiento lento después de tres días de crecimiento a 30 °C en placas de cloranfenicol LB (25 |jg/ml). Se obtuvieron menores eficacias de clonación con las cepas deE. coliStbl3™ y Stbl4™ relacionadas, aunque se observó que estas líneas eran estables para el mantenimiento del plásmido. Los transformantes se propagaron posteriormente en agar o en cultivo líquido bajo selección con cloranfenicol a 30 °C. También se observó que el uso de medios LB (Miller) mejora la recuperación y el crecimiento de los transformantes en comparación con los medios basados en triptona y soja sin componentes animales.

Ejemplo 10: Transformación de C. difficile con pMTL84121 fdx que codifica genes de toxinas mutantes genéticas o de tipo silvestre

La transformación deC. difficilepor transferencia conjugativa deE. colise realizó esencialmente como se describe en Heap et al., Journal of Microbiological Methods, 2009. 78 (1): p. 79-85. El huéspedE. coliCA434 se transformó con pMTL84121fdx quecodifica genes de toxina mutante variante o de tipo silvestre. El huéspedE. coliCA434 es el intermedio para movilizar los plásmidos de expresión en la cepa de producción deC. difficileVPI 11186 spo0A1. CA434 es un derivado deE. coliHB101. Esta cepa alberga el plásmido conjugativo R702 Tra+ Mob+ que confiere resistencia a Km, Tc, Su, Sm/Spe y Hg (debido a Tn1831). Se prepararon células CA434 químicamente competentes 0 electrocompetentes y se seleccionaron transformantes del vector de expresión en placas LB CAM de Miller a 30 °C. Se seleccionaron colonias de crecimiento lento que aparecieron después de 3 días y se amplificaron en 3 ml de cultivos de cloranfenicol LB hasta la mitad de la fase logarítmica (~24 h, 225 rpm, agitador orbital a 30 °C). Los cultivos deE. colise recogieron mediante centrifugación a baja velocidad (5.000 g) para evitar romper los pili, y los sedimentos celulares se resuspendieron suavemente con una pipeta de transferencia de gran diámetro en 1 ml de PBS. Las células se concentraron por centrifugación a baja velocidad. La mayor parte del PBS se retiró por inversión y los gránulos drenados se transfirieron a la cámara anaeróbica y se resuspendieron con 0,2 ml de cultivo deC. difficile,se aplicaron como puntos en placas de agar BHIS y se dejaron crecer durante 8 h o toda la noche. En el caso de los transformantes de la toxina A mutante, se lograron mejores resultados con la conjugación durante la noche. Se rasparon parches de células en 0,5 ml de PBS y se cultivaron en placa 0,1 ml en medio de selección BHIS complementado con 15 jg/m l de tiamfenicol (análogo más potente del cloranfenicol) y D-cicloserina/cefoxitina para destruir las célulasE. colidonadoras. Los transformantes que aparecieron 16-24 h más tarde se purificaron volviendo a raspar en una nueva placa BHIS (más suplementos) y en los cultivos posteriores se ensayó la expresión de toxinas recombinantes o toxinas mutantes. Se prepararon permanentes de glicerol y soluciones madre seminales a partir de clones que mostraron una buena expresión. También se prepararon minipreparaciones de plásmidos a partir de cultivos de 2 ml utilizando un procedimiento de kit Qiagen modificado en el que las células se trataron previamente con lisozima (no esencial). El ADN miniprep deC. difficilese usó como molde para la secuenciación por PCR para verificar la integridad del clon. Como alternativa, se preparó ADN de plásmido maxiprep a partir de tansformantesE. ColiStbl2™ y se secuenció.

Ejemplo 11: Análisis de la expresión de C. difficile del triple mutante de la toxina A y B (SEQ ID NO: 4 y 6, respectivamente) y el heptamutante B (SEQ ID NO: 8)

Los transformantes se cultivaron en cultivos de 2 ml (para análisis de rutina) o en matraces tapados con ventilación (para experimentos de curso temporal). Las muestras (2 ml) se centrifugaron brevemente (10.000 rpm, 30 s) para concentrar las células: los sobrenadantes se decantaron y se concentraron 10x (Amicon-ultra 30k); Los sedimentos se escurrieron y se congelaron a -80 °C. Los sedimentos celulares se descongelaron en hielo, se resuspendieron en 1 ml de tampón de lisis (Tris-HCl pH 7,5; EDTA 1 mM, glicerol al 15%) y se sonicaron (1x20s ráfagas con microtip). El lisado se centrifugó a 4 °C y el sobrenadante se concentró 5 veces. Las muestras de sobrenadante y lisado se combinaron con tampón de muestra y se trataron térmicamente (10 min, 80 °C) antes de cargarlas en geles de SDS-PAGE de Tris-acetato al 3-8 % por duplicado (Invitrogen). Un gel se tiñó con Coomassie, El segundo se sometió a electrotransferencia para el análisis de western. Se usaron antisueros de conejo específico de Toxina A y específico de Toxina B (Fitgerald; Biodesign) para detectar variantes mutantes de toxina A y B. La expresión de la toxina B heptamutante (SEQ ID NO: 8) también se confirmó por hibridación de transferencia de western.

Ejemplo 12: Anulación de la actividad glucosiltransferasa de las toxinas mutantes

Las toxinas genéticas doble mutantes (DM) A y B (SEQ ID NO: 3 y 5, respectivamente) y las toxinas A y B triple mutantes (TM) (SEQ ID NO: 4 y 6, respectivamente) no transferían 14C-glucosa a 10 jg de GTPasas RhoA, Rac1 y Cdc42 en ensayos de glucosilacióninvitro en presencia de UDP-14C-glucosa [30 jM ], HEPES 50 mM, pH 7,2, KCI 100 mM, MgCl24 mM, MnCh 2 mM, DTT 1 mM y 0,1 jg / j l de BSA. Sin embargo, controles de toxinas A y B de tipo silvestre (que tienen los SEQ ID NO: 1 y 2, respectivamente) transferían 14C-glucosa a GTPasas de manera eficiente a una dosis baja de 10 y 1 ng cada una (e inferiores, datos no mostrados) (Figuras 4A y 4B), incluso en presencia de 100 |jg de toxina mutante (Figura 4B) que indica una reducción de al menos 100.000 veces en comparación con las respectivas toxinas de tipo silvestre. Se detectaron resultados similares para la GTPasa Cdc42 (datos no mostrados).

Específicamente, en la Fig. 4B, se incubaron toxina A y toxina B de tipo silvestre (1 ng) o toxina A triple mutante y toxina B triple mutante (100 g) con GTPasa RhoA en presencia de UDP-14C-glucosa durante 2 horas a 30 °C. Tal como se ilustra, 1 ng de TcdA y TcdB de tipo silvestre transfirió 14C-glucosa a RhoA, pero 100 jg de toxina A triple mutante y toxina B triple mutante no lo hicieron. Cuando se introdujo 1 ng de TcdA o TcdB de tipo silvestre en la reacción con los 100 jg respectivos de toxina A triple mutante o toxina B triple mutante, se detectó glucosilación de RhoA, lo que indica la ausencia de inhibidores de glucosilación. La sensibilidad de detección para la actividad de glucosilación se estableció como 1 ng de toxina de tipo silvestre en un fondo de 100 jg de toxina mutante (proporción de 1:100.000). Los resultados muestran que las mutaciones en el sitio activo de la glucosiltransferasa en la toxina A triple mutante y en la toxina B triple mutante redujeron cualquier actividad de glucosiltransferasa medible (actividad menos de 100.000 veces menor en comparación con la actividad de las toxinas de tipo silvestre respectivas). También se desarrolló un ensayo similar para cuantificar la actividad de la glucosiltransferasa por precipitación con TCA de GTPasas glucosiladas.

Ejemplo 13: Anulación de la actividad autocatalítica de cisteína proteasa

La función de la escisión autocatalítica se anuló en los triples mutantes genéticos A y B (TM) (SEQ ID NO: 4 y 6, respectivamente) cuando se mutó el sitio de escisión de la cisteína proteasa. Como se ilustra en la Figura 5, las toxinas de tipo silvestre (ts) A y B (SEQ ID NO): 3 y 5, respectivamente) se escinden en presencia de inositol-6-fosfato. Las toxinas A y B dobles mutantes (SEQ ID NO: 3 y 5, respectivamente) también se escinden en presencia de inositol-6-fosfato (datos no mostrados), de manera similar a las de tipo silvestre. La toxina A (SEQ ID NO: 3) se escinde de 308 kDa en 2 fragmentos de 245 y 60 kDa. La toxina B (SEQ ID NO: 5) se escinde de 270 kDa en dos fragmentos de 207 y 63 kDa. Los triples mutantes genéticos A y B (TM) (SEQ ID NO: 4 y 6, respectivamente) no se ven afectados a 308 y 270 kDa respectivamente, incluso en presencia de inositol-6-fosfato. Véase la figura 5. Por lo tanto, La actividad de la cisteína proteasa se inactivó por modificación genética.

Más específicamente, en la figura 5, un jg de triple mutante A y triple mutante B se incubó durante 90 minutos a temperatura ambiente (21 ± 5 °C) en paralelo con TcdA y TcdB de tipo silvestre de List Biologicals. La reacción de escisión se realizó en un volumen de 20 j l en Tris-HCl, pH 7,5, DTT 2 mM en presencia o ausencia de inositol-6-fosfato (10 mM para TcdA y 0,1 mM para TcdB). El volumen de reacción completo se cargó luego en una SDS/PAGE al 3-8%; las bandas de proteína se visualizaron mediante tinción con plata. Tal como se ilustra, Tcd A y TcdB ts se escindieron en dos bandas de proteínas de 245 kD y 60 kD y 207 kD y 63 kD, respectivamente, En presencia de inositol-6-fosfato. La toxina triple mutante A y la toxina triple mutante B no se escindieron, confirmando así la mutación C700A en la toxina A triple mutante y la mutación C698A en la escisión bloqueada de la toxina B triple mutante.

Ejemplo 14: Citotoxicidad residual de toxinas A y B triples mutantes (SEQ ID NO: 4 y 6, respectivamente)

Las toxinas mutantes genéticas se evaluaron para determinar su citotoxicidad mediante un ensayo de citotoxicidadin vitroen células IMR90, una línea celular de fibroblasto de pulmón diploide humano. Estas células son sensibles tanto a la toxina A como a la B. Como una realización preferida alternativa, se pueden usar células renales normales deCercopithecus aethiopsen el ensayo de citotoxicidad, ya que se observó que tienen sensibilidades razonables a las toxinas A y B. Preferentemente, No se usan células de adenocarcinoma colorrectal humano HT-29 en el ensayo de citotoxicidad porque han mostrado sensibilidades significativamente reducidas a las toxinas, en comparación con las líneas celulares Vero e IMR90. Véanse, por ejemplo, la Tabla 6 mostrada a continuación.

Se añadieron muestras diluidas en serie de toxina mutante genética o toxina ts a las monocapas de células cultivadas en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos. Después de la incubación a 37 °C durante 72 h, se evaluaron las placas para detectar células metabólicamente activas midiendo los niveles de ATP celular mediante la adición de reactivo CellTiterGlo® basado en luciferasa (Promega, Madison, WI) que genera luminiscencia expresada como unidades relativas de luminiscencia (URL). Los valores altos de URL muestran que las células son viables, los valores bajos de URL muestran que las células no son metabólicamente activas y se están muriendo. El nivel de citotoxicidad, expresado como CE50, se define como la cantidad de toxinatso toxina mutante genética que provoca una reducción del 50% en las URL en comparación con los niveles en los controles de cultivo celular (los detalles de este ensayo se proporcionan a continuación). Como se muestra en la Figura 6, Tablas 7A y Tabla 8A, los valores de CE50 de TcdA y TcdB fueron de aproximadamente 0,92 ng/ml y 0,009 ng/ml, respectivamente. Los valores de CE50 de la toxina A triple mutante y la toxina B triple mutante fueron de aproximadamente 8600 ng/ml y 74 ng/ml, respectivamente. A pesar de una reducción aproximada de 10.000 veces en la citotoxicidad con respecto a las toxinasts,ambas toxinas mutantes genéticas seguían demostrando bajos niveles residuales de citotoxicidad. Esta citotoxicidad residual podría bloquearse neutralizando anticuerpos monoclonales antitoxina, lo que indica que era específica para las toxinas triple mutantes, pero probablemente no estaba relacionada con las actividades enzimáticas conocidas de las toxinas ts (glucosilación o autoproteolisis).

Ambas toxinas ts presentan una potente citotoxicidadin vitro,siendo suficientes pequeñas cantidades de toxinas para causar diversos efectos en células de mamíferos, tales como el redondeo celular (efecto citopático o ECP) y la falta de actividad metabólica (medida por los niveles de ATP). En consecuencia, se han desarrollado dos ensayosin vitro(un ECP o un ensayo de redondeo celular y un ensayo de ATP) para verificar que no queda citotoxicidad residual en las sustancias farmacéuticas de toxina mutante. Los resultados se expresan como CE50, que es la cantidad de toxina o toxina mutante que hace que 1) el 50% de las células desarrollen e Cp o 2) una reducción del 50% en los niveles de ATP, medida en unidades relativas de luz.

En el ensayo de ECP, una muestra de sustancia farmacéutica se diluye en serie y se incuba con células IMR90, en las que se observa un posible efecto citopático. El ensayo de ECP se califica en una escala de 0 (células normales) a 4 (-100% de redondeo celular) y una puntuación de 2 (-50% de redondeo celular) se define como el valor de CE50 de la muestra de ensayo. Este procedimiento se utiliza para ensayar la sustancia farmacéutica de toxina mutante a una concentración de 1000 pg/ml, que es la concentración máxima tolerable que se puede ensayar en este ensayo sin interferencia de la matriz. En consecuencia, no se informa de ninguna citotoxicidad detectable como CE50 > 1000 pg/ml.

El ensayo de ATP se basa en la medición de la cantidad de señal de luminiscencia generada a partir de ATP, que es proporcional al número de células metabólicamente activas. La concentración máxima tolerable que se puede ensayar en este ensayo sin interferencia en el ensayo es de aproximadamente 200 pg/ml. Por lo tanto, ninguna citotoxicidad detectable en este ensayo se informa como CE50 > 200 pg/ml.

Se agregaron diferentes concentraciones de toxina mutante A y B a células en paralelo con controles de toxina. Los puntos finales del ensayo fueron la viabilidad celular determinada por los niveles de ATP celular utilizando el CellTiter-Glo® (Promega). El grado de luminiscencia es proporcional a los niveles de ATP o al número de células viables.

La citotoxicidadin vitro(CE50) de la toxina A de tipo silvestre (ts) fue de 920 pg/ml y de 9 pg/ml para la toxina B. La citotoxicidadin vitro(CE50) de la toxina A mutante (SEQ ID NO: 4) fue de 8600 ng/ml y de 74 ng/ml para la toxina B mutante (SEQ ID NO: 6). Aunque estos valores representan reducciones de 9348 y 8222 veces, respectivamente, se detectó citotoxicidad residual en ambas toxinas mutantes.

En otras palabras, la citotoxicidad de las toxinas triple mutantes A y B (SEQ ID NO: 4 y 6, respectivamente) se redujeron significativamente en el ensayo de citotoxicidadin vitro encélulas IMR-90 en relación con la citotoxicidad de las toxinas A y B ts (SEQ ID NO: 1 y 2, respectivamente). Como se ilustra en la Figura 6, aunque ambas toxinas triple mutantes mostraron una reducción significativa en la citotoxicidad (104 veces) con respecto a la toxina ts, se observó citotoxicidad residual a concentraciones más altas de ambas toxinas triple mutantes.

Además, la citotoxicidad residual de cada toxina triple mutante podría neutralizarse por completo (por ejemplo, al menos una reducción de 6-8 log-10 en la toxicidad, con respecto a la toxicidad de la toxina de tipo silvestre) por los anticuerpos específicos de la toxina. Véase el Ejemplo 16, a continuación.

Los ensayos de cultivo celular son más sensibles para la detección de citotoxicidad que los modelos animalesin vivo.Cuando se administra mediante una vía ip o iv en el modelo de exposición letal de ratón, la TcdA ts tiene una DL50 de -50 ng por ratón, mientras que la TcdB ts es más potente con una DL50 de ~5 ng por ratón. En cambio, los ensayosin vitrobasados en cultivos de células descritos anteriormente tienen valores de CE50 de 100 pg por pocillo para TcdA ts y de 2 pg por pocillo para TcdB ts.

Ejemplo 15: Citotoxicidad residual de la toxina B heptamutante genética (SEQ ID NO: 8)

Como se ilustra en la Figura 7, los valores de CE50 son similares para los mutantes toxina B triple mutante (SEQ ID NO: 6) (20,78 ng/ml) y toxina B heptamutante (SEQ ID NO: 8) (35,9 ng/ml), lo que indica que las cuatro mutaciones adicionales para modificar adicionalmente el sitio activo de la glucosiltransferasa y el sitio de unión al sustrato de la GTPasa no reducían adicionalmente la citotoxicidad de las toxinas mutantes genéticas. Los valores de CE50 también fueron similares para la toxina B doble mutante (SEQ ID NO: 5), así como para las toxinas triple y heptamutantes (datos no mostrados). Esta observación sugiere que el mecanismo para la citotoxicidad de las toxinas mutantes es sorprendentemente independiente de la glucosiltransferasa y del mecanismo de reconocimiento del sustrato.

Ejemplo 16: Citotoxicidad residual de toxinas A y B triples mutantes (SEQ ID NO: 4 y 6, respectivamente)

Para seguir evaluando la naturaleza de la citotoxicidad residual, las toxinas mutantes (SEQ ID NO: 4 y 6) se mezclaron e incubaron con sus respectivos anticuerpos neutralizantes anteriores y la mezcla se añadió a una monocapa de células IMR90.

Los resultados (Figura 8) mostraron que la citotoxicidad residual de las toxinas A y B mutantes (SEQ ID NO: 4 y 6, respectivamente) puede anulare completamente con anticuerpos neutralizantes específicos para la toxina A mutante (panel superior, Figura 8) y la toxina B mutante (panel inferior, Figura 8). Las concentraciones crecientes de toxina A mutante (panel superior) y B (panel inferior) se incubaron con anticuerpo policlonal de conejo anti-toxina (Acp, dilución 1:10) o anticuerpo monoclonal murino (dilución 1:50 de una solución de reserva que contiene 3,0 mg de IgG/ml) antes de añadirse a las células IMR90. Después de una incubación de tratamiento de 72 horas con células IMR90 a 37 °C, se agregó el sustrato CellTiter-Glo® y se midieron las unidades relativas de luz (URL) en un espectrofotómetro con el programa de luminiscencia para medir los niveles de ATP. Cuanto menor sea el nivel de ATP, mayor será la toxicidad. Los controles incluyeron TcdA y TcdB agregados a 4 veces sus valores de CE50 correspondientes.

Los informes publicados sugieren que las mutaciones en el dominio de la glucosiltransferasa o de la proteasa autocatalítica de las toxinas dan como resultado la inactivación completa de la toxicidad. Sin embargo, los datos de los presentes inventores no están de acuerdo con estos informes publicados y esto podría atribuirse a las mayores concentraciones de las toxinas mutantes altamente purificadas ensayadas en los estudios de los presentes inventores, a diferencia de los lisados de cultivo en bruto de los informes publicados; a los mayores puntos de tiempo a los que se observó redondeo celular de células tratadas con toxina mutante (por ejemplo, 24 horas), 48 horas), 72 horas o 96 horas) a diferencia de las observaciones realizadas en menos de 12 horas; al uso de líneas celulares que presentan sensibilidades significativamente más altas a las toxinas en los presentes ensayos de citotoxicidad a diferencia de las células de adenocarcinoma colorrectal humano HT-29 en los ensayos de citotoxicidad divulgados en informes publicados; y/o a una actividad o proceso desconocido, distinto de la glucosilación, que podría estar impulsando la toxicidad residual de las toxinas mutantes.

Ejemplo 17: Nuevo mecanismo de citotoxicidad de toxinas mutantes genéticas

Para investigar el mecanismo de citotoxicidad residual de las toxinas mutantes genéticas, se trataron células IMR-90 con toxina B (SEQ ID NO: 2) o toxina B mutante genética (SEQ ID NO: 6), y se estudió la glucosilación de la GTPasa Rac1 con el tiempo de tratamiento. Se recogieron muestras de 24 a 96 horas y se prepararon extractos celulares. La Rac1 glucosilada se distingue de la Rac1 no glucosilada por transferencias de western con dos anticuerpos contra Rac1. Un anticuerpo reconoce ambas formas de Rac1 (23A8) y el otro (102) solo reconoce Rac1 no glucosilada. Como se ilustra en la Figura 22, para la toxina B, los niveles totales de Rac1 se mantuvieron sin cambios a lo largo del tiempo estando glucosilada la mayor parte de Rac1. El tratamiento con la toxina B mutante genética (SEQ ID NO: 6), por otro lado, tuvo como resultado una reducción significativa de la Rac1 total, sin embargo, la Rac1 no estaba glucosilada en todos los puntos de tiempo. Esto muestra que el nivel de Rac1 se vio afectado negativamente por el tratamiento con la toxina mutante genética, pero no por la toxina ts. Como se ilustra en la Figura 22, el nivel de actina fue similar en las células tratadas con toxina y con la toxina B mutante genética y similar a las células tratadas de forma simulada en los puntos de tiempo indicados. Esto mostró que las toxinas mutantes genéticas ejercían citotoxicidad por un mecanismo que es diferente de la vía de glucosilación dirigida por toxina de tipo silvestre.

Ejemplo 18: Tratamiento químico de toxinas mutantes genéticas

Aunque se prefieren las toxinas mutantes modificadas genéticamente que mostraron una reducción de 4 log en la actividad citotóxica, se consideró una reducción adicional (2 a 4 log) en la actividad citotóxica. Se han evaluado dos estrategias de inactivación química.

El primer procedimiento utiliza formaldehído y glicina para inactivar las toxinas mutantes. La inactivación del formaldehído se produce al formarse una base de Schiff (imina) entre el formaldehído y las aminas primarias en la proteína. Las bases de Schiff pueden reaccionar después con varios restos de aminoácido (Arg, His, Trp, Tyr, Gln, Asn) para formar entrecruzamientos intra o intermoleculares. Este entrecruzamiento fija la estructura de la proteína, volviéndola inactiva. Además, el formaldehído puede reaccionar con glicina de una base de Schiff. La base de glicil Schiff puede reaccionar después con los restos de aminoácido para formar entrecruzamientos de proteína-glicina intermoleculares. El formaldehído redujo la actividad citotóxica de las toxinas mutantes genéticas por debajo de los límites detectables (reducción en la citotoxicidad >8 log-iü para el triple mutante B (SEQ ID NO: 6) y >6 log-iü para el triple mutante A (SEQ ID NO: 4). Sin embargo, se observó una reversión a lo largo del tiempo cuando las toxinas triple mutantes inactivadas con formaldehído (FI) se incubaron a 25 °C. La reversión citotóxica se puede prevenir mediante la adición de una cantidad baja de formaldehído (0,01-0,02%) en la solución de almacenamiento de toxinas triple mutantes-FI. Véase el Ejemplo 23.

Otro procedimiento utiliza el tratamiento con 1 -etil-3- (3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC)/N-hidroxisuccinimida (NHS) para generar toxinas mutantes inactivadas. En este procedimiento, EDC/NHS reacciona con grupos carboxílicos presentes en la proteína para formar ésteres activados. Los ésteres activados pueden reaccionar después con aminas primarias de la proteína para formar enlaces amida estables. Como ocurre con la reacción de formaldehído, esta reacción da lugar a entrecruzamientos intra e intermoleculares. El enlace amida formado por tratamiento con EDC/NHS es más estable e irreversible que el enlace imina lábil formado por la inactivación con formalina. Además de los entrecruzamientos formados por la reacción de ésteres activados con aminas primarias en el polipéptido, se pueden formar aductos tanto de glicina como de beta-alanina. Sin pretender quedar vinculados a ningún mecanismo o teoría, se producen aductos de glicina cuando se añade glicina para inactivar los ésteres activados que no han reaccionado. La amina de la glicina reacciona con el éster activado en el polipéptido para formar enlaces amida estables. Sin pretender quedar vinculados a ningún mecanismo o teoría, los aductos de beta-alanina se forman por la reacción de beta-alanina activada con aminas primarias en el polipéptido. Esta reacción da como resultado enlaces amida estables. La beta-alanina activada se produce por la reacción de tres moles de NHS con un mol de EDC.

Para lograr la reducción de 2-4 log de la actividad citotóxica con respecto a las toxinas mutantes modificadas genéticamente (6-8 log, con respecto a las toxinas nativas), las toxinas mutantes inactivadas químicamente deben tener valores de CE50 de >1000 pg/ml. Además de la reducción de la actividad citotóxica, sería ventajoso retener epítopos clave según lo determinado por el análisis Dot-Blot. Hasta la fecha, se han identificado varias condiciones de reacción que cumplen tanto con los criterios de citotoxicidad de reducción como con los de reconocimiento de epítopo. Se han preparado varios lotes de toxinas mutantes inactivadas para estudios en animales, y se muestran datos analíticos de unos pocos lotes representativos en las Tablas 7A y 7B, Tabla 8A y 8B.

Ejemplo 19: Purificación

Al final de la fermentación, se enfría el fermentador. La suspensión celular se recupera mediante centrifugación continua y se resuspende en el tampón apropiado. La lisis de la suspensión celular se logra mediante homogeneización a alta presión. Para la toxina A mutante, el homogeneizado se flocula y la solución floculada se somete a centrifugación continua. Esta solución se filtra y luego se transfiere para su procesamiento posterior. Para la toxina B mutante, el homogeneizado se clarifica mediante centrifugación continua y después se transfiere para su procesamiento posterior.

La toxina A mutante (SEQ ID NO: 4) se purifica utilizando dos etapas cromatográficas seguidas de un intercambio de tampón final. El lisado clarificado se carga en una columna de cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) y la toxina mutante unida se eluye utilizando un gradiente de citrato sódico. Después, el grupo de productos de la columna HIC se carga en una columna de intercambio catiónico (CEX) y la toxina mutante unida A se eluye utilizando un gradiente de cloruro sódico. El conjunto de CEX que contiene la toxina A mutante purificada se somete a intercambio a tampón final mediante diafiltración. La toxina A mutante purificada se somete a intercambio a tampón intermedio de la sustancia farmacéutica final mediante diafiltración. Después de la diafiltración, el retenido se filtra a través de un filtro de 0,2 micrómetros antes de la inactivación química para obtener una sustancia farmacéutica final. La concentración de proteínas está dirigida a 1-3 mg/ml.

La toxina B mutante (SEQ ID NO: 6) se purifica utilizando dos etapas cromatográficas seguidas de un intercambio de tampón final. El lisado clarificado se carga en una columna de intercambio aniónico (AEX), y la toxina mutante unida se eluye utilizando un gradiente de cloruro sódico. Se añade citrato sódico al grupo de productos de la columna AEX y se carga en una columna de cromatografía de interacción hidrófoba (HIC). La toxina mutante unida se eluye utilizando un gradiente de citrato sódico. El conjunto de HIC que contiene el polipéptido de toxina mutante purificado (SEQ ID NO: 6) se somete a intercambio a tampón final mediante diafiltración. La toxina B mutante purificada se somete a intercambio a tampón intermedio de la sustancia farmacéutica final mediante diafiltración. Después de la diafiltración, el retenido se filtra a través de un filtro de 0,2 micrómetros antes de la inactivación química para obtener una sustancia farmacéutica final. La concentración de proteínas está dirigida a 1-3 mg/ml.

Ejemplo 20: Inactivación por formaldehído/glicina

Tras la purificación, las toxinas mutantes genéticas A y B (SEQ ID NO: 4 y 6, respectivamente) se inactivan durante 48 horas a 25 °C utilizando formaldehído 40 mM (1,2 mg/ml). La inactivación se lleva a cabo a pH 7,0 ± 0,5 en fosfato 10 mM, tampón cloruro sódico 150 mM que contiene glicina 40 mM (3 mg/ml). El período de inactivación se establece para que exceda tres veces el período necesario para la reducción de la CE50 en células IMR90 a más de 1000 ug/ml. Después de 48 horas, la actividad biológica se reduce de 7 a 8 log 10 con respecto a la toxina nativa. Tras la incubación de 48 horas, la toxina mutante inactivada se somete a intercambio a tampón de la sustancia farmacéutica final mediante diafiltración. Por ejemplo, utilizando un casete de ultrafiltración de acetato de celulosa regenerada de 100 kD, la toxina inactivada se concentra a 1-2 mg/ml y se somete a intercambio de tampón.

Ejemplo 21: Inactivación por N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida (EDC)/N-hidroxisuccinimida (NHS)

Tras la purificación, las toxinas mutantes genéticas (SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 6) se inactivan durante 2 horas a 25 °C utilizando 0,5 mg de EDC y 0,5 mg de NHS por mg de toxina A y B mutante genética purificada (aproximadamente 2,6 mM y 4,4 mM respectivamente). La reacción se detiene mediante la adición de glicina a una concentración final de 100 mM y las reacciones se incuban durante 2 horas más a 25 °C. La inactivación se lleva a cabo a pH 7,0 ± 0,5 en tampón fosfato 10 mM, cloruro sódico 150 mM. El período de inactivación se establece para que exceda tres veces el período necesario para la reducción de la CE50 en células IMR90 a más de 1000 ug/ml. Después de 2 horas, la actividad biológica se reduce de 7 a 8 log 10 con respecto a la toxina nativa. Tras la incubación de 4 horas, la toxina mutante inactivada se somete a intercambio a tampón de la sustancia farmacéutica final mediante diafiltración. Por ejemplo, utilizando un casete de ultrafiltración de acetato de celulosa regenerada de 100 kD, la toxina inactivada se concentra a 1-2 mg/ml y se somete a intercambio de tampón.

Salvo que se indique otra cosa, los siguientes términos, como se usan en la sección de Ejemplos, se refieren a una composición producida de acuerdo con la presente descripción en el Ejemplo 21: "Toxina triple mutante tratada con EDC/NHS"; "Toxina mutante inactivada por EDC"; "sustancia farmacéutica de toxina [A/B] mutante"; "EI-toxina mutante"; "EDC/NHS-toxina triple mutante". Por ejemplo, los siguientes términos son sinónimos: "Toxina A triple mutante tratada con EDC/NHS"; "Toxina A mutante inactivada por EDC"; "sustancia farmacéutica de toxina A mutante"; "EI-toxina A mutante"; "EDC/NHS-toxina A triple mutante". Como otro ejemplo, los siguientes términos son sinónimos: "Toxina B triple mutante tratada con EDC/NHS"; "Toxina B mutante inactivada por EDC"; "sustancia farmacéutica de toxina B mutante"; "EI-toxina B mutante"; "EDC/NHS-toxina triple mutante B".

La sustancia farmacéutica de toxina A mutante y la sustancia farmacéutica de toxina B mutante se fabrican, cada una, utilizando un proceso por lotes, que incluye (1) la fermentación de una cepa deC. diffiálenegativa para la toxina (VPI 11186) que contiene un plásmido que codifica el polipéptido de toxina triple mutante genético respectivo (en un medio que incluye hidrolizado de soja, extracto de levadura Hy YEST™ 412 (Sheffield Bioscience), glucosa y tiamfenicol), (2) purificación de la toxina mutante genética mutante (el "intermedio de la sustancia farmacéutica") a partir del lisado sin células usando procedimientos cromatográficos de intercambio iónico e interacción hidrófoba hasta una pureza de al menos más del 95%, (3) inactivación química por tratamiento con EDC/NHS seguido de inactivación/protección terminal con glicina y (4) intercambio en la matriz de tampón final.

Ejemplo 22: Estudios que confirman las condiciones de inactivación y formulación

Para optimizar la inactivación química de las toxinas mutantes genéticas, se realizó un diseño estadístico del experimento (DOE). Los factores examinados en el DOE incluyeron la temperatura, concentración de formaldehído/glicina, concentración de EDC/NHS y tiempo (Tablas 9 y 10). Para supervisar la pérdida de actividad biológica, se determinaron los valores de CE50 en células IMR90. Además, también se observó la morfología celular de las células IMR-90 en diversos puntos de tiempo posteriores al tratamiento. Véase la Figura 9, que muestra la morfología a las 72 horas después del tratamiento. Para determinar el efecto sobre la estructura de la proteína, se supervisó el reconocimiento de epítopos utilizando un análisis dot-blot que usa un panel de anticuerpos monoclonales inducidos contra diferentes dominios de la toxina.

En la inactivación por formaldehído/glicina de toxinas mutantes deC. diffiále,las condiciones de reacción finales se eligieron de manera que se lograra el nivel de reducción deseado de la actividad citotóxica (7 a 8 log™) al mismo tiempo que se maximizaba el reconocimiento de epítopo. Véase el Ejemplo 20 mostrado anteriormente.

En la inactivación por EDC/NHS de toxinas mutantes deC. difficile,las condiciones de reacción finales se eligieron de manera que se lograra el nivel de reducción deseado de la actividad citotóxica (7 a 8 log10) al mismo tiempo que se maximizaba el reconocimiento de epítopo. Véase el Ejemplo 21 mostrado anteriormente.

En una realización alternativa, la reacción de EDC-NHS se inactivó mediante la adición de alanina, lo que inactivó suficientemente la reacción. El uso de alanina puede dar como resultado una modificación en la proteína de toxina mutante que es similar a la modificación cuando la reacción se inactiva con glicina. Por ejemplo, la inactivación mediante la adición de alanina puede dar como resultado un resto de alanina en una cadena lateral de un resto de ácido glutámico y/o ácido aspártico de la toxina mutante. En otra realización alternativa, la reacción de EDC-NHS se inactivó mediante la adición de éster metílico de glicina, lo que inactivó suficientemente la reacción.

La producción de toxina A y toxina B deC. difficiletriple mutante químicamente inactiva en condiciones optimizadas tuvo como resultado una reducción adicional de citotoxicidad residual a un nivel indetectable (>1000 g/ml - la concentración más alta ensayada mediante el ensayo de ECP), reteniendo al mismo tiempo la antigenicidad medida por su reactividad con los anticuerpos neutralizantes específicos de la toxina. Los resultados mostrados en la Tabla 28 demuestran una reducción gradual de la citotoxicidad de la toxina ts a las toxinas triple mutantes tratadas con EDC/NHS. El marcaje con inmunofluorescencia confirmó que las toxinas triple mutantes (SEQ ID NO: 4 y 6) y las sustancias farmacéuticas de toxina mutante mostraron una unión comparable a las células IMR-90, lo que sugiere que la pérdida de citotoxicidad no se debía a una unión reducida a las células (datos no mostrados). En comparación con la sustancia farmacéutica de toxina A mutante, la sustancia farmacéutica de toxina B mutante logró una mayor reducción en veces de la citotoxicidad, lo cual es coherente con la potencia observada ~600 veces mayor de TcdB en comparación con TcdA.

Tabla 28. Resumen de citotoxicidad

También se evaluaron los resultados del ensayo de citotoxicidad para la toxina B mutante modificada por EDC solo, o por EDC y sulfo-NHS. Véase la Tabla 29.

Tabla 29

Condiciones: Se modificó la toxina B triple mutante ("TM TcdB") (SEQ ID NO: 6) en las relaciones en peso toxina B mutante:EDC:sulfo-NHS = 1:0,5:0,94. Esta relación es el equivalente molar (corregido para un mayor PM de sulfo-NHS) a la reacción estándar de EDC/NHS como se describe en el Ejemplo 21. Para determinar el efecto de sulfo-NHS, la relación de sulfo-NHS se varió de 0,5x a 2x la relación estándar. Las reacciones por duplicado se realizaron en 1 x PBS pH 7,0 a 25 °C, y se iniciaron mediante la adición de una solución de EDC. Después de 2 horas, las reacciones se inactivaron mediante la adición de glicina 1 M, pH 7,0 (concentración final 0,1 M) y se incubaron durante 2 horas más. Las reacciones inactivadas se desalinizaron y la sustancia farmacéutica de toxina B mutante ("TM TcdB-EDC") se concentró utilizando dispositivos Vivaspin 20 y se filtró de forma estéril en viales estériles y se sometió a evaluación en un ensayo de citotoxicidad.

En la misma relación molar, la sulfo-NHS redujo la CE50 a aproximadamente 250 ug/ml en comparación con >1000 ug/ml para NHS. Incluso al doble de la relación molar, la sulfo-NHS no parece ser tan eficaz como la NHS en la disminución de la citotoxicidad. Véase la Tabla 30.

Tabla 30

Producto de digestión de

Modificación<Producto de digestión de>Producto de digestión dereferencia (TcdB EDC 004)control NHS (TcdB EDC

001) muestra de sulfo-NHS aducto de glicina (+57 da) 49 29 35

beta-alanina (+71 da) 24 19 0

entrecruzamientos (-18 da) 7 4 3

deshidroalanina (-34 da) 6 5 4

Sin modificar 273 195 217

Para determinar el número y tipo de modificaciones, se realizó un mapeo de péptidos en muestras de toxina B triple mutante inactivada tanto con EDC/NHS como con EDC/sulfo-NHS. En ambas muestras se observaron cantidades similares de aductos de glicina, entrecruzamientos y modificaciones de deshidroalanina. Sin embargo, en la muestra de sulfo-NHS, no se observó beta-alanina.

La toxina B de tipo silvestre (SEQ ID NO: 2) se inactivó usando el protocolo estándar (véase el Ejemplo 21); toxina B:EDC:NHS 1:0,5:0,5, 25 °C durante 2 horas en 1 x PBS pH 7,0, después inactivar con glicina 1 M (concentración final 0,1 M) e incubar durante 2 horas más. La muestra se desalinizó, se concentró y se sometió a un ensayo de citotoxicidad. La CE50 para estas muestras fue <244 ng/ml.

Ejemplo 23: Estudios de reversión

Para determinar si se produce una reversión con formaldehído/glicina o con toxinas mutantes deC. diffiáleinactivadas con EDC/NHS, se incubaron muestras de toxinas mutantes inactivadas (1 mg/ml) a 25 °C durante cinco-seis semanas. Se extrajeron alícuotas cada semana y se determinaron los valores de CE50 en células IMR90. Una muestra inactivada con formaldehído/glicina no contenía formaldehído y una muestra contenía un 0,01% de formaldehído. La CE50 se midió mediante el ensayo de ECP.

A 25 °C en ausencia de formaldehído residual, se observa reversión parcial (Tabla 11). Después de cinco semanas, la actividad citotóxica aumentó aproximadamente 3 veces. Aunque la actividad citotóxica aumentó, después de cinco semanas todavía había una reducción de 7 log-10 con respecto a la toxina nativa. La reversión se evitó completamente mediante la inclusión de formalina a una concentración de 0,010%. No se observó reversión en la muestra inactivada con EDC/NHS. A lo largo de las 6 semanas de incubación, los valores de CE50 se mantuvieron en el nivel inicial de >1000pg/ml para los cuatro lotes tanto de toxina A triple mutante tratada con EDC/NHS (SEQ ID NO: 4) como de toxina B triple mutante tratada con EDC/NHS (SEQ ID NO: 6). En cambio, los valores de CE50 de la toxina A triple mutante tratada con Fl (SEQ ID NO: 4) y la toxina B triple mutante tratada con Fl (SEQ ID NO: 6) no fueron estables y se redujeron a valores CE50 inaceptablemente bajos, lo que indica un aumento en la citotoxicidad o reversión de la inactivación. Véase la Tabla 11.

Además de reducir de forma estable la citotoxicidad a un nivel indetectable (>1000pg/ml, medido por el ensayo de ECP), las toxinas mutantes inactivadas utilizando EDC/NHS retuvieron epítopos importantes que son dianas de Acm neutralizantes de toxinas. Véase la Tabla 31. Las toxinas mutantes FI mostraron una pérdida de los mismos determinantes antigénicos.

Tabla 31. La inactivación por EDC/NHS redujo la citotoxicidad de toxinas mutantes genéticas y mantuvo determinantes antigénicos importantes

Ejemplo 24: Estudios Preclínicos de inmunogenicidad

Los objetivos preclínicos clave incluyen composiciones de ensayo que incluyen las toxinas A y B mutantes deC. diffidleen animales pequeños y primates no humanos (PNH). Se inmunizaron ratones y hámsteres para determinar, entre otras cosas, si las composiciones deC. difficileson capaces de inducir anticuerpos neutralizantes contra las toxinas mutantes A y B. Los antígenos se ensayaron para determinar la inducción de respuestas de anticuerpos neutralizantes del suero después de una serie de inmunizaciones en ratones, hámsteres y macacos cynomolgus. Las toxinas mutantes genéticas y/o inactivadas químicamente se formularon en un tampón neutro, tampón de fosfato de aluminio o tampón que contiene ISCOMATRIX como adyuvante en algunas realizaciones. Las respuestas de anticuerpos neutralizantes generalmente se ensayaron aproximadamente de dos a cuatro semanas después de cada refuerzo o de la dosis final.

El ensayo de neutralización de toxinas demuestra la capacidad de un antisuero para neutralizar el efecto citotóxico mediado por TcdA o TcdB deC. difficiley, por lo tanto, es capaz de medir la actividad funcional de anticuerpos que están presentes en una muestra. Se realizó un ensayo de neutralización de toxinas en una línea celular de fibroblastos de pulmón humano, IMR-90, que es sensible tanto a TcdA como a TcdB. En resumen, se sembró una placa de microtitulación de 96 pocillos con células IMR-90 que sirven como diana de la citotoxicidad mediada por toxina. Cada muestra de suero de ensayo se analizó por separado para determinar la capacidad de neutralizar TcdA y TcdB. Se mezclaron diluciones en serie apropiadas de antisueros de ensayo con una concentración fija de TcdA o TcdB y se incubaron a 37 °C durante 90 minutos en un incubador humidificado (37 °C/5% de CO2) para permitir que se produzca la neutralización de las toxinas. Para el control de calidad, todas las placas incluyeron un patrón de referencia y controles que incluyen anticuerpos antitoxina de título conocido. Después de 90 minutos, la mezcla de toxina y antisuero se agregó a la monocapa de células IMR-90 y las placas se incubaron durante 72 horas más. Posteriormente, se añadió sustrato CellTiter-Glo® a la placa de ensayo para determinar los niveles de trifosfato de adenosina (ATP) presentes en células metabólicamente activas y se midió como Unidades Relativas de Luminiscencia (URL). Un nivel alto de ATP indica una alta viabilidad celular, y los niveles son directamente proporcionales a la cantidad de neutralización de la toxina por el anticuerpo presente en la muestra. Para datos preclínicos, los datos de URL se representaron en función del valor de dilución de la muestra de antisueros de ensayo para generar una curva de ajuste de respuesta de regresión logística de cuatro parámetros (4-PL). Los títulos de neutralización se expresaron como el valor de dilución de la muestra que mostró una reducción del 50% en la citotoxicidad.

Ejemplo 25: Estudio de inmunogenicidad en ratones: muC. d/ff/c/le2010-06

El fin de este estudio fue evaluar la inmunogenicidad de dos formas de la toxina B mutante deC. difficile(SEQ ID NO: 6), cada una de ellas inactivada químicamente por diferentes procedimientos. En este estudio, se usó como control la toxina B mutante no tratada (SEQ ID NO: 6) (inactivada genéticamente pero no inactivada químicamente), con y sin adyuvante.

Se inmunizaron grupos de 10 ratones por vía intramuscular con 10 |jg de un inmunógeno de acuerdo con la Tabla 12.

Tabla 12. Ensayo de toxina B mutante inactivada químicamente (SEQ ID NO: 6) en ratones

Resultados: No hubo eventos adversos en los ratones después de cada administración de los candidatos de las vacunas. Como se ilustra en la Figura 10, los ratones de cada grupo desarrollaron anticuerpos neutralizantes anti toxina B sólidos significativos después de la tercera dosis con las toxinas mutantes respectivas.

Basándose en los títulos de la semana 12, parece ser que en ratones, la toxina B mutante inactivada por EDC (Grupo 2) y las toxinas mutantes inactivadas por formalina (Grupo 1) generaron respuestas neutralizantes potentes.

En ausencia de inactivación química, la toxina B mutante genética (SEQ ID NO: 6) generó respuestas neutralizantes después de dos dosis (Grupos 3-4, semana 8), que se elevaron después de la tercera dosis (Grupos 3-4, semana 12).

Ejemplo 26: Estudio de inmunogenicidad en ratones: muC. d/ff/c/le2010-07:

El fin de este estudio fue evaluar la inmunogenicidad de toxinas A y B mutantes deC. difficileinactivadas químicamente (SEQ ID NO: 4 y 6, respectivamente), individualmente o en combinación. Los inmunógenos para todos los grupos se formularon con fosfato de aluminio como adyuvante.

Se inmunizaron grupos de 5 ratones por vía intramuscular con 10 jg de un inmunógeno de acuerdo con la Tabla 13.

Tabla 13. Ensayo de toxinas mutantes A y B genéticas inactivadas químicamente (SEQ ID NO: 4 y 6,

respectivamente) en ratones

Resultados: No hubo eventos adversos en los ratones después de cada administración de los candidatos de las vacunas. Como se ilustra en la Figura 11, después de dos dosis de toxinas mutantes genéticas inactivadas químicamente, los anticuerpos neutralizantes anti-toxina A (Grupos 3-5) se elevaron a títulos entre 3 y 4 log-10 mientras que los anticuerpos neutralizantes anti-toxina B (Grupos 1-2, 5) permanecieron a un nivel de bajo a indetectable, lo cual es coherente con los datos del estudio de ratón descrito anteriormente (Figura 10). Los anticuerpos neutralizantes anti-toxina B se elevaron a 2-3 log-10 en los grupos 1, 2 y 5 después de la tercera dosis (títulos de la semana 12) y alcanzaron su máximo dos semanas después de la cuarta dosis (títulos de la semana 14). Los títulos de anticuerpos neutralizantes anti-toxina A en los grupos 3-5 aumentaron ligeramente después de la tercera (títulos de la semana 12) y la cuarta inmunización (títulos de la semana 14).

Ejemplo 27: Estudio de inmunogenicidad en hámster: hamC. difficile2010-02:

El fin de este estudio fue evaluar la inmunogenicidad y el potencial protector de triple mutantes deC. diffiáley toxinas mutantes A y B inactivadas químicamente en el modelo de hámster sirio dorado. El modelo de hámster sirio dorado representa el mejor modelo de exposición disponible para simular DACD humana. En este estudio se usaron los mismos lotes de toxinas mutantes A y B utilizados en el estudio con ratones muC.difficile 2010-07.Como control, un grupo recibió toxinas mutantes sin adyuvante que contiene aluminio.

Se inmunizaron grupos de 5 hámsteres sirios dorados por vía intramuscular con 10 |jg de un inmunógeno de acuerdo con la Tabla 14.

Tabla 14. Ensayo de Toxinas Mutantes A y B Inactivadas Químicamente (SEQ ID NO): 4 y 6, respectivamente) en Hámsteres (hamC.difficile2010-02)

Resultados: No se observaron acontecimientos adversos después de la inmunización con las toxinas mutantes. Como se ilustra en la Figura 12, después de una sola dosis de toxinas mutantes, las respuestas neutralizantes anti-toxina A estuvieron entre 2-3 log-10 para las toxinas mutantes inactivadas con formalina (Grupos 1-2) y entre 3-4 log-10 para las toxinas mutantes inactivadas con EDC (Grupo 3). Después de la segunda dosis, se elevaron los anticuerpos anti toxina A en los tres grupos. Los anticuerpos anti-toxina A en los tres grupos no parecían aumentar después de la tercera dosis. Se observó un resultado similar después de la cuarta inmunización, donde se observó un aumento en el título en el grupo inactivado con formalina que no contenía el adyuvante de aluminio (Grupo 2).

Las respuestas neutralizantes anti-toxina B fueron indetectables en los grupos de toxinas mutantes inactivadas con formalina (Grupos 1-2) y fueron poco más de 2 log-10 para las toxinas mutantes inactivadas con EDC (Grupo 3) después de una sola dosis. Después de la segunda dosis, los títulos de anticuerpos neutralizantes anti-toxina B en los dos grupos inactivados con formalina (Grupos 1-2) aumentaron a

3-4 log 10 mientras que los del grupo inactivado con EDC (Grupo 3) aumentaron a 4-5 logm Para los tres grupos, se observaron aumentos en los títulos de anticuerpos neutralizantes anti-toxina B después de la tercera y/o cuarta dosis, alcanzando todos los grupos un título máximo en la semana 16 (después de la última dosis). Véase la figura 12.

En la Figura 13, el nivel de respuestas de anticuerpos neutralizantes contra toxinas mutantes genéticas inactivadas químicamente (Figura 12) se comparó con las inducidas por toxoides de List Biological Laboratories, Inc. (Campbell, California) (también denominado en el presente documento "List Bio" o "List Biologicals") (es decir, los toxoides comprados en List Biological Laboratories se prepararon mediante la inactivación con formalina de toxinas de tipo silvestre; reactivo de control utilizado para establecer el modelo de exposición de hámster).

Tal como se usa en el presente documento, "FI" en las figuras y tablas se refiere al tratamiento con formalina/glicina de las toxinas, 2 días a 25 °C, a menos que se indique otra cosa. Tal como se usa en el presente documento, "EI" en figuras y tablas se refiere al tratamiento con EDC/n Hs durante 4 horas a 30 °C, a menos que se indique otra cosa. En la Figura 13, se trataron 5 hámsteres con la composición de toxina mutante respectiva, mientras que 11 hámsteres se trataron con el toxoide comprado de List Biological.

Los datos en la Figura 13 muestran que, en los hámsteres que recibieron la administración de acuerdo con la Tabla 14, los títulos de anticuerpos neutralizantes respectivos contra la toxina A (Figura 13A) y la toxina B (Figura 13B) inducidos por la composición inmunogénica que incluye toxinas mutantes inactivadas con EDC después de dos dosis son más altos que los títulos de anticuerpos neutralizantes respectivos inducidos por los toxoides de List Biologicals.

Ejemplo 28: Estudio de inmunogenicidad en hámster: ham2010-02 de C. difficile (continuación)

Para evaluar la eficacia protectora de las toxinas mutantes, a hámsteres inmunizados, junto con un grupo de control de animales no inmunizados, se les administró primero una dosis oral de antibiótico clindamicina (30 mg/kg) para alterar la flora intestinal normal. Después de cinco días, los hámsteres se expusieron a una dosis oral de esporas deC. difficilede tipo silvestre (cepa 630, 100 ufc por animal). Los animales se supervisaron diariamente durante once días después de la exposición para detectar signos de DACD, que en los hámsteres se conoce como cola mojada. Utilizando un sistema de puntuación clínica de varios parámetros diferentes, se sacrificaron los animales que, según se determinó, tenían DAC<d>grave. Los parámetros incluyeron actividad después de la estimulación, deshidratación, excremento, temperatura y peso, etc., que se conocen en la técnica.

En el día 11, se terminó el estudio y se sacrificaron todos los animales supervivientes. La Figura 14 muestra las curvas de supervivencia para cada uno de los tres grupos inmunizados (Grupos 1-3, de acuerdo con la Tabla 14) en comparación con los controles no inmunizados. Como puede verse, todos los animales no inmunizados desarrollaron DACD grave y requirieron eutanasia entre los días 1 y 3 después de la exposición (0% de supervivencia). Los dos grupos administrados con toxina mutante inactivada con formalina tuvieron curvas de supervivencia del 60 %, sin que los animales requirieran eutanasia hasta el día 3 (Grupo 1) o el día 4 (Grupo 2). El grupo administrado con toxina mutante inactivada con EDC tuvo una curva de supervivencia del 80%, requiriendo eutanasia 1 (de 5) animales el día 7. En consecuencia, los hámsteres estaban protegidos de una exposición letal a esporas deC. diffiále.

Ejemplo 29: Estudio de inmunogenicidad en hámster: hamC. difficile2010-03: Inmunogenicidad de toxinas mutantes de C. difficile genéticas e inactivadas químicamente

El fin de este estudio fue evaluar la inmunogenicidad de toxinas A y B mutantes inactivadas químicamente y triple mutantes deC. difficilesin adyuvante (SEQ ID NO): 4 y 6, respectivamente) en el modelo de hámster sirio dorado. En este estudio se usaron los mismos lotes de toxinas mutantes A y B (SEQ ID NO: 4 y 6, respectivamente) que se utilizaron en el estudio con ratones muC.difficile 2010-07.Como control, a un grupo (Grupo 1) se le administró una solución salina tamponada con fosfato como placebo.

Grupos de cinco o diez hámsteres sirios dorados se inmunizaron con un inmunógeno de acuerdo con la Tabla 15. A los animales se les administraron tres dosis. Además, a los animales se les dosificó cada dos semanas.

Resultados: Véase la figura 15. No se observaron anticuerpos anti-toxina A o B en el grupo de control con placebo. Después de una dosis, se observaron anticuerpos neutralizantes anti-toxina A entre 2-3 log-10 para los grupos de toxinas inactivada con formalina (Grupo 2) y mutante genética (Grupo 4) y entre 3-4 log-10 para el grupo inactivado con EDC (Grupo 3). Los anticuerpos neutralizantes anti-toxina A aumentaron en cada uno de estos grupos (2-4) después de la segunda inmunización con las toxinas mutantes relevantes (comparénse los títulos de la semana 2 a la semana 3 en la Figura 15). Después de la tercera dosis de toxinas mutantes (administradas en la semana 4), los títulos de anticuerpos neutralizantes de antitoxina A en los Grupos 2-4 aumentaron en comparación con los títulos de la semana 4.

Pudieron detectarse anticuerpos neutralizantes anti-toxina B después de la segunda dosis, aumentando los anticuerpos neutralizantes anti-toxina B inactivados con formalina (Grupo 2) e inactivados con EDC (Grupo 3) entre 3 4 logio y entre 2-3 log-io para el triple mutante genético (Grupo 4). Después de la tercera inmunización (semana 4), los títulos de anticuerpos neutralizantes anti-toxina B se elevaron a entre 3-4 logio para las toxinas mutantes inactivadas con formalina (Grupo 2) y las toxinas mutantes genéticas (Grupo 4) y entre 4-5 logio para las toxinas mutantes inactivadas por EDC (Grupo 3).

Para los anticuerpos neutralizantes tanto anti-toxina A como anti-toxina B, se observaron títulos máximos en la semana 6 (después de la dosis 3) para todos los grupos vacunados (Grupos 2-4).

Evaluación de composiciones inmunogénicas con Alhydrogel/CpG o ISCOMATRIX como adyuvante

Los hámsteres inmunizados con una composición inmunogénica que incluye una toxina mutante inactivada químicamente formulada con Alhydrogel, ISCOMATRIX o Alhydrogel/CpG24555 (Alh/CpG) desarrollaron antisueros de antitoxina neutralizantes robustos. Se observó que las respuestas máximas antitoxina A y antitoxina B eran 2-3 veces más altas y estadísticamente significativas en los grupos inmunizados con toxinas mutantes formuladas en Alh/CpG o ISCOMATRIX en comparación con la vacuna formulada con Alhydrogel solo. Véase la Tabla 32 que muestra los títulos de neutralización del 50 %. Se inmunizaron hámsteres (n = 10/grupo) IM a las 0, 2 y 4 semanas con 10 |jg de cada una de las siguientes: sustancia farmacéutica de toxina A mutante y sustancia farmacéutica de toxina B mutante formuladas con 100 jg de Alhydrogel, o 200 jg de CpG 24555 100 jg de Alhydrogel, o 10 U de ISCOMATRIX. Se recogieron los sueros en cada punto de tiempo y se analizaron en el ensayo de neutralización de toxina para determinar la actividad antitoxina funcional. Los títulos medios geométricos se proporcionan en la Tabla 32. Los asteriscos (*) indican significado estadístico (p <0,05) cuando se comparan con los títulos del grupo de Alhydrogel.

Se ensayó la eficacia protectora de la composición inmunogénica que incluye sustancias farmacéuticas de toxina mutante formuladas con estos adyuvantes. Los hámsteres se inmunizaron y recibieron clindamicina oral (30 mg/kg) en la semana 5 y se expusieron de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente. Se incluyó un grupo de hámsteres no inmunizados (n = 5) como control. Se observó una mayor eficacia en hámsteres inmunizados con sustancias farmacéuticas de toxina mutante con Alh/CpG o ISCOMATRIX como adyuvante (100% de supervivencia) en comparación con Alhydrogel solo (70% de supervivencia). En consecuencia, los hámsteres estaban protegidos de una exposición letal a esporas deC. difficile.

Ejemplo 30: Vacunación con Clostridium difficile en macacos cynomolgus

El fin de este estudio fue ensayar la inmunogenicidad de dosis bajas y altas de toxinas mutantes deC. difficileinactivadas con EDC e inactivadas con formalina en macacos cynomolgus. Todas las toxinas mutantes se formularon en ISCOMATRIX® como adyuvante a excepción de un grupo, que sirvió de control sin adyuvante (Grupo 5).

Resultados: La Figura 16 muestra las respuestas de anticuerpos neutralizantes anti-toxina en estos animales en las semanas 0, 2, 3, 4, 6, 8 y 12. Los títulos de anti-toxina A estuvieron entre 2-3 log-10 para los cinco grupos después de una sola dosis (títulos de la semana 2). Estos títulos se elevaron después de cada dosis posterior para cada grupo. En estos animales, no hubo caída en el título entre las semanas 3 y 4. Para todos los grupos, los títulos máximos estuvieron entre 4-5 log-10. En todos los puntos de tiempo, el grupo sin adyuvante ISCOMATRIX (Grupo 5) tuvo los títulos más bajos, lo que indica la utilidad de ISCOMATRIX en el refuerzo de las respuestas inmunitarias. El grupo de control sin adyuvante (Grupo 5) alcanzó títulos máximos en la semana 12, al igual que el grupo inmunizado con la dosis alta de toxinas mutantes inactivadas por EDC (Grupo 4); todos los demás grupos alcanzaron títulos máximos en la semana 6, dos semanas después de la última dosis. Los títulos en todos los grupos se elevaron después de la segunda dosis (punto de tiempo semana 3). Como ocurrió con las respuestas anti-toxina A, las respuestas anti-toxina B no disminuyeron de la semana 3 a la semana 4. Después de la tercera dosis (punto de tiempo semana 6), los títulos de anticuerpos neutralizantes anti-toxina B en todos los grupos estaban entre 3-4 log-10, excepto en el grupo inactivado con formalina de baja dosis (Grupo 1) y el grupo inactivado con EDC de dosis alta (Grupo 4), teniendo ambos títulos ligeramente >4 log 10. Los títulos máximos se observaron en la semana 12 para todos los grupos excepto el grupo inactivado con EDC de dosis baja (Grupo 3), que tuvo títulos máximos en la semana 8. Todos los grupos tuvieron títulos máximos >4 logm

Ejemplo 31: Producción de anticuerpos monoclonales

Aunque las toxinas A y B comparten mucha homología estructural, se observó que las actividades neutralizantes de los anticuerpos eran específicas de la toxina. En esta divulgación, se identificaron varios anticuerpos que son específicos para toxinas individuales y se dirigen a diversos epítopos y dominios funcionales, y tienen una alta afinidad y una potente actividad neutralizadora hacia las toxinas nativas. Se aislaron anticuerpos de ratones que se inmunizaron con una toxina mutante inactivada con formalina (FI) disponible en el mercado o una toxina holo-mutante recombinante (SEQ ID NO: 4 y 6) se volvieron no tóxicos al introducir mutaciones específicas en su sitio catalítico para producir Acm de toxina A y B, respectivamente. El mapeo de epítopos de los anticuerpos mostró que la inmensa mayoría de los Acm contra la toxina A (49 de 52) estaban dirigidos al dominio C terminal no catalítico de la toxina.

Los monoclonales contra la toxina B estaban dirigidos a tres dominios de la proteína. De un total de 17 Acm específicos para la toxina B, 6 fueron específicos para el extremo N (por ejemplo, los aminoácidos 1-543 de una TcdB deC. diffiálede tipo silvestre, tal como 630), 6 para el extremo C (por ejemplo, los aminoácidos 1834-2366 de una TcdB deC. difficilede tipo silvestre, tal como 630) y 5 para el dominio de translocación media (por ejemplo, los aminoácidos 799 1833 de una TcdB deC. difficilede tipo silvestre, tal como 630). El enfoque de usar toxinas mutantes deC. difficile(por ejemplo, SEQ ID NO: 4 y 6) como antígenos de inmunización ofrece la ventaja clave de que se presentan la mayoría de, si no todos, los epítopos antigénicos en comparación con el proceso de inactivación con formalina que tiende a afectar de forma adversa a la estructura antigénica de la toxina mutante.

Ejemplo 32: Caracterización del Acm de toxina A, A3-25, que incluye una cadena ligera variable que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 36 y una cadena pesada variable que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 37.

El Acm A3-25 fue de particular interés ya que este anticuerpo desafió todos los intentos de definir su isotipado de inmunoglobulina (Ig) utilizando los kits de isotipado comúnmente disponibles para IgG, IgM e IgA. Otro análisis por transferencia western utilizando antisueros específicos de cadena H de Ig mostró que el A3-25 es de isotipo IgE, un caso raro en la producción de Acm. Esto se confirmó adicionalmente mediante la secuenciación de nucleótidos de ARNm aislado de células de hibridoma A3-25. Las secuencias de aminoácidos deducidas a partir de las secuencias de nucleótidos de las regiones variables de la cadena H y L de A3-25 se muestran en la Figura 17.

Para seguir evaluando el Acm A3-25 en un modelo animal para la infección y la enfermedad porC. difficile,su isotipo de Ig se cambió a IgG1 murino por injerto molecular de la región variable de la cadena £ H en la cadena pesada y murina de acuerdo con los procedimientos publicados.

Ejemplo 33: Capacidad de neutralización y mapeo de epítopos de anticuerpos específicos de toxinas

Además, en un esfuerzo por identificar anticuerpos funcionales/neutralizantes, se evaluó la capacidad de todos los monoclonales para neutralizar toxinas de tipo silvestre en un ensayo de efecto citopático (ECP) estándar o en un ensayo más riguroso y cuantitativo basado en la medición de ATP como indicador de viabilidad celular.

De un total de 52 anticuerpos específicos para la toxina A, cuatro Acm (A3-25, A65-33, A60-22 y A80-29 (Tabla 17 y Figura 18) presentaron niveles variados de actividad neutralizadora. Se realizaron el ensayo de unión competitiva BiaCore y ensayos de inhibición de la hemaglutinación (HI) para mapear los epítopos de anticuerpo. Los resultados indicaron que estos anticuerpos pueden dirigirse a diferentes epítopos de la proteína toxina A (Tabla 17). Para identificar mejor la situación de los sitios de unión en la proteína, los anticuerpos se evaluaron individualmente en ensayos de transferencia de western o dot blot usando fragmentos de toxina de secuencias conocidas. Se observó que los 4 Acm neutralizantes se dirigían a la región C-terminal de la toxina.

De un total de 17 anticuerpos específicos para la toxina B, se observó que 9 eran neutralizantes. De los nueve Acm neutralizantes, seis de ellos se dirigieron al extremo N y los otros tres al dominio de translocación de la toxina B (Tabla 18). Basándose en el ensayo de unión competitiva de Biacore, los nueve anticuerpos monoclonales neutralizantes pueden agruparse en cuatro grupos de epítopos como se muestra en la Figura 19.

TABLA 17: Características del Acm de toxina A seleccionado

TABLA 18: Características del Acm de Toxina B seleccionado

Ejemplo 34: Identificación de nuevas combinaciones de anticuerpos de toxina A con una actividad neutralizadora significativamente mejorada:

Los cuatro Acm de toxina A (A3-25, A65-33, A60-22 y A80-29) mostraron una neutralización incompleta o parcial de la toxina A cuando se ensayaron individualmente en el ensayo de neutralización basado en ATP. El Acm A3-25 fue el anticuerpo más potente y los otros tres fueron menos neutralizantes, estando A80-29 apenas por encima del nivel de fondo (Figura 18). Sin embargo, cuando se combinó A3-25 con cualquiera de los otros tres Acm, se observó un efecto sinérgico en la neutralización en las tres combinaciones que fue mucho mayor que la suma total de la neutralización de anticuerpos individuales como se muestra en la Figura 20A-C. Además, las tres combinaciones presentaron una capacidad de neutralización completa normalmente observada con anticuerpos policlonales anti-toxina A.

Ejemplo 35: Identificación de nuevas combinaciones de anticuerpos de toxina B que muestran una actividad neutralizadora significativamente mejorada:

También se observó una neutralización sinérgica con los Acm de toxina B de los diferentes grupos de epítopos identificados por el análisis BiaCore. El Acm de Toxina B B8-26, el Acm más dominante del grupo 1, se combinó con múltiples Acm del grupo 3. Las combinaciones se evaluaron en un ensayo de neutralización específico de toxina B y los resultados se muestran en la Figura 21 y la Tabla 19.

El efecto de neutralización sinérgica se observó cuando B8-26 se combinó con un Acm de epítopo del grupo 3 (Figura 21B), pero con ningún otro Acm (datos no mostrados).

Ejemplo 36: Selección in vitro por Acm de composiciones de toxina mutante seguras y eficaces:

Las toxinas mutantes genéticas A y B deC diffidle(por ejemplo, SEQ ID NO: 4 y 6) generadas mediante ingeniería genética mostraron citotoxicidad residual utilizando un ensayo de citotoxicidadin vitro.Aunque se ha logrado una reducción logarítmica de -4 en la citotoxicidad para cada toxina mutante deC. difficile(Tabla 20), se prefirió la inactivación química adicional de las toxinas mutantes, tal como con tratamiento con formalina. Sin embargo, los tratamientos de inactivación química pueden ser duros y pueden afectar negativamente a los epítopos antigénicos clave de estas toxinas o toxinas mutantes.

Para la optimización del bioproceso, se realizó un diseño estadístico del experimento (DOE) para la inactivación química de Tcd A y B triple mutantes (1 mg/ml) utilizando formalina y tratamiento con EDC/NHS. Para optimizar la inactivación con formalina de la TcdA triple mutante, se variaron las concentraciones de formalina/glicina (20-40 mM), pH (6,5-7,5) y la temperatura (25-40 °C). Para la TcdB triple mutante, se varió la concentración de formalina/glicina de 2 a 80 mM y la temperatura y el pH fueron de 25 °C y 7,0 respectivamente. El tiempo de incubación para todos los tratamientos con formalina fue de 24 horas. Para la inactivación con formalina, "40/40" en las Tablas 21 y 23 representa la concentración de formalina y glicina usada en la reacción. Para el tratamiento con EDC/NHS, se variaron las concentraciones de EDC/NHS de 0,25 a 2,5 mg/mg de TcdA triple mutante y de 0,125 a 2,5 mg/mg de TcdB triple mutante y se incubaron durante cuatro horas a 25 °C. Al final de las reacciones, todas las muestras se desalinizaron en fosfato 10 mM, pH 7,0. Tras la purificación, Las Tcd tratadas se analizaron para determinar la citotoxicidad residual y el reconocimiento de Acm de epítopos mediante análisis dot-blot. El objetivo fue identificar las condiciones de tratamiento que reducen la citotoxicidad al nivel deseado (CE50 > 1000 pg/ml) sin impactar negativamente en epítopos reconocidos por un panel de Acm neutralizantes (++++ o ++). Las condiciones de tratamiento (marcadas con una marca de verificación "l" en las Tablas 21-24) produjeron composiciones inmunogénicas potencialmente seguras y eficaces que retuvieron la reactividad a al menos cuatro Acm neutralizantes mientras presentaban una reducción de 6-8 log-10 en la citotoxicidad, con respecto a la citotoxicidad de la toxina de tipo silvestre respectiva. Los resultados seleccionados se ilustran en las Tablas 21 a 24. En la Tabla 33 y la Tabla 34 se muestran datos adicionales de diferentes condiciones de tratamiento en las toxinas triple mutantes y los datos de los ensayos de citotoxicidad y neutralización de toxinasin vitro.Véanse también, por ejemplo, los Ejemplos 20 y 21 mostrados anteriormente, que proporcionan detalles adicionales con respecto a las condiciones de tratamiento de entrecruzamiento preferidas de las toxinas mutantes.

Tabla 33

Condiciones de reacción de entrecruzamiento químico para las muestras de toxina A triple mutante (SEQ ID NO: 4) mencionadas en la Tabla 33

Las muestras 1-4 se modificaron con EDC/NHS. Condiciones: 30 °C, MES 20 mM/NaCI 150 mM pH 6,5. Las reacciones se iniciaron mediante la adición de EDC. Después de 2 horas de reacción, las muestras A, B y C tenían glicina 1 M añadida a la concentración final de glicina 50 mM. La muestra D no tenía glicina añadida. Las reacciones se establecieron con diferentes relaciones en peso de toxina A mutante (SEQ ID NO: 4):EDC:NHS como se indica a continuación.

1 L44166-157A 1: 0,25: 0,25 p: p: p

2 L44166-157B 1: 1,25: 1,25

3 L44166-157C 1: 2,5: 2,5

4 L44166-157D 1: 2,5: 2,5

Muestra 5 L44905-160A HCHO 80 mM, Glicina 80 mM, NaPO4 80 mM pH 7, 1 mg/ml de Proteína de Toxina A mutante (SEQ ID NO: 4), 48 h de reacción a 25 °C.

Muestra 6 L44166-166 Modificación por EDC/NHS de la toxina A mutante (SEQ ID NO: 4) a 25 °C en MES 20 mM/NaCl 150 mM pH 6,5. Toxina mutante A (SEQ ID NO: 4):EDC:NHS = 1:0,5:0,5. Reacción iniciada por adición de EDC. Después de 2 horas de reacción, Se añadió glicina 1 M a una concentración final de glicina 0,1 M y se incubó 2 horas más. Después de este periodo de tiempo, El tampón de reacción se cambió a 1 X PBS en Sephadex G25.

Muestra 7 L44905-170A HCHO 80 mM, Glicina 80 mM, NaPO480 mM pH 7, 1 mg/ml de Proteína de Toxina A mutante (SEQ ID NO: 4), 48 h de reacción a 35 °C. Esta reacción de formalina estaba dirigida a producir un entrecruzamiento excesivo de tal forma que la unión del antígeno disminuyera profundamente.

Muestra 8 L44897-61 HCHO 32 mM/glicina 80 mM, 72 h de reacción a 25 °C.

Muestra 9 L44897-63 HCHO 80 mM/glicina 80 mM, 72 h de reacción a 25 °C.

Las siguientes reacciones tuvieron, todas ellas, un tiempo de reacción de 24 horas.

Muestra 10 L44897-72 Tubo n.° 125 °C, NaPi 80 mM, pH 6,5, HCHO 20 mM/glicina 20 mM

Muestra 11 L44897-72 Tubo n.° 225 °C, NaPi 80 mM, pH 6,5, HCHO 40 mM/glicina 40 mM

Muestra 12 L44897-72 Tubo n.° 332,5 °C, NaPi 80 mM, pH 7,0, HCHO 30 mM/glicina 30 mM

Muestra 13 L44897-72 Tubo n.° 432,5 °C, NaPi 80 mM, pH 7,0, HCHO 30 mM/glicina 30 mM

Muestra 14 L44897-72 Tubo n.° 532,5 °C, NaPi 80 mM, pH 7,0, HCHO 30 mM/glicina 30 mM

Muestra 15 L44897-75 Tubo n.° 625 °C, NaPi 80 mM, pH 7,5, HCHO 20 mM/glicina 20 mM

Muestra 16 L44897-75 Tubo n.° 725 °C, NaPi 80 mM, pH 7,5, HCHO 40 mM/glicina 40 mM

Muestra 17 L44897-75 Tubo n.° 840 °C, NaPi 80 mM, pH 6,5, HCHO 20 mM/glicina 20 mM

Muestra 18 L44897-75 Tubo n.° 940 °C, NaPi 80 mM, pH 6,5, HCHO 40 mM/glicina 40 mM

Muestra 19 L44897-75 Tubo n.° 1040 °C, NaPi 80 mM, pH 7,5, HCHO 20 mM/glicina 20 mM

Muestra 20 L44897-75 Tubo n.° 1140 °C, NaPi 80 mM, pH 7,5, HCHO 40 mM/glicina 40 mM

Las siguientes 8 muestras se hicieron reaccionar a 25 °C durante los tiempos indicados en NaPi 80 mM, pH 7,0, que contenía HCHO 78 mM y glicina 76 mM

Muestra 21 L44897-101 (pre-modificación) muestra de control a tiempo cero, TxA de control, no modificada o expuesta a HCHO/glicina

Muestra 22 L44897-101,2 h Muestra 23 L44897-101, 4 h

Muestra 24 L44897-101, 6 h

Muestra 25 L44897 102, 24 h

Muestra 26 L44897-103, 51 h

Muestra 27 L44897-104, 74 h

Muestra 28 L44897-105, 120 h

La muestra 29 (L44980-004) era toxina A mutante modificada con EDC/NHS (SEQ ID NO: 4) (toxina A triple mutante (SEQ iD NO: 4)-Ed C). Las condiciones de reacción son: 25 °C, el tampón fue MES 20 mM/NaCl 150 mM pH 6,6. Toxina A triple mutante (SEQ ID NO: 4):EDC:NHS = 1:0,5:0,5 p: p: p. Reacción iniciada por adición de EDC. Después de 2 horas de reacción, se añadió glicina a una concentración final de 0,1 M y se hizo reaccionar 2 horas más a 25 °C. La reacción se terminó por desalinización en Sephadex G25.

Las siguientes 12 muestras y 2 controles fueron experimentos de reversión en los que las muestras se incubaron a 25 °C y 37 °C.

Reacción 1 = 25 °C, NaPi 80 mM, pH 7,0, HCHO 40 mM solo (sin glicina), reacción de 24 horas.

Reacción 2 = 25 °C, NaPi 80 mM, pH 7,0, HCHO 40 mM/glicina 40 mM, reacción de 24 horas

Muestra Reacción

30 Reacción n.° 1 Semana 0, 25 °C

31 Reacción n.° 1 Semana 1, 25 °C

32 Reacción n.° 1 Semana 2, 25 °C

33 Reacción n.° 1 Semana 3, 25 °C

34 Reacción n.° 1 Semana 4, 25 °C

35 Reacción n.° 1 Semana 3, 37 °C

36 Reacción n.° 2 Semana 0, 25 °C

37 Reacción n.° 2 Semana 1, 25 °C

38 Reacción n.° 2 Semana 2, 25 °C

39 Reacción n.° 2 Semana 3, 25 °C

40 Reacción n.° 2 Semana 4, 25 °C

41 Reacción n.° 2 Semana 3, 37 °C

42 Control de TxA Semana 3 25 °C

43 Control de TxA Semana 3 37 °C

Las siguientes 4 muestras se generaron por reacción durante los tiempos indicados a 25 °C en NaPi 80 mM a pH 7,0, HCHO 40 mM/glicina 40 mM

44 L44897-116-629,5 h

45 L44897-116-757,5 h

46 L44897-116-879,5 h

47 L44897-116-9 123,5 h

Muestra 48 L44897-13948 horas de reacción a 25 °C, NaPi 80 mM, pH 7,0, HCHO 40 mM/glicina 40 mM.

Muestra 49 L44166-204 Modificación por EDC/NHS de la toxina A mutante (SEQ ID NO: 4). 25 C, tampón 1 x PBS pH 7,0. Toxina A mutante (SEQ ID No : 4):EDC:NHS = 1:0,5: 0,5 p: p: p. 2 horas de reacción con EDC/NHS, después se añadió glicina 1 M a una concentración final de 0,1 M y otras 2 horas de reacción. El tampón se intercambió en Sephadex G25 a L-histidina 20 mM/NaCl 100 mM pH 6,5.

Condiciones de reacción de entrecruzamiento químico para las muestras de toxina B mutante mencionadas en la Tabla 34

La toxina B triple mutante (SEQ ID NO: 6) se sometió a entrecruzamiento químico y se ensayó de acuerdo con las siguientes condiciones de reacción. Las muestras L44905-86 se ensayaron en un experimento que implicaba tres variaciones de reacción de formalina y dos temperaturas de incubación. Cada día, se tomaron 6 muestras para un total de 18 muestras. La primera muestra en la lista es el control no tratado (que hace 19 muestras en total). El control no tratado incluía un polipéptido de toxina B triple mutante no tratado (SEQ ID NO: 6).

Reacción 1 ("Rxn1") = HCHO 80 mM, Glicina 80 mM, NaPO480 mM pH 7, 1 mg/ml de Proteína de toxina B triple mutante (SEQ ID NO: 6)

Reacción 2 ("Rxn2") = HCHO 80 mM, Sin glicina, NaPO4 80 mM pH 7, 1 mg/ml de Proteína de toxina B triple mutante (SEQ ID NO: 6)

Reacción 3 ("Rxn3") = HCHO 80 mM, Sin glicina, NaPO4 80 mM pH 7, 1 mg/ml de Proteína de Toxina B triple mutante (SEQ ID NO: 6) protección terminal de cianoborohidruro. La protección terminal de cianoborohidruro implicaba CNBrH480 mM añadido a la reacción de desalinización final e incubación durante 24 horas a 36 °C.

Para la muestra L34346-30A 0,5 g de EDC y NHS por gramo de toxina B triple mutante (SEQ ID NO: 6), 4 horas a 30 °C, en MES 20 mM, NaCl 150 mM, pH 6,5.

Para la muestra L34346-30B 0,5 g de EDC y NHS por gramo de toxina B triple mutante (SEQ ID NO: 6), 2 horas a 30 °C seguido de la adición de glicina (concentración final de g/l) e incubación durante otras 2 horas a 30 °C, en MES 20 mM, NaCl 150 mM, pH 6,5. La única diferencia entre las dos reacciones para L34346-30A y L34346-30B es la adición de glicina a la reacción L34346-30B.

Ejemplo 37: Los anticuerpos inducidos por composiciones inmunogénicas son capaces de neutralizar toxinas de varias cepas de C. difficile

Para evaluar si los anticuerpos inducidos por las composiciones inmunogénicas que incluyen las sustancias farmacéuticas de toxina mutante pueden neutralizar un amplio espectro de diversas secuencias de toxinas, se secuenciaron cepas que representan diversos ribotipos y toxinotipos para identificar el grado de diversidad genética entre las diversas cepas en comparación con las sustancias farmacéuticas de toxina mutante. Después se ensayaron sobrenadantes de cultivos que contenían toxinas secretadas de varias cepas en un ensayo de neutralizaciónin vitroutilizando sueros de hámsteres inmunizados para determinar la cobertura de la composición inmunogénica y para determinar la capacidad de la composición inmunogénica para proteger contra diversas toxinas de cepas clínicas circulantes.

Se usaron tanto células HT-29 (línea celular de carcinoma de colon) como células IMR-90 para ensayar la neutralización de toxinas expresadas a partir de cepas de CDC. Las células HT-29 son más sensibles a TcdA; la CE50 de la TcdA purificada en estas células es de 100 pg/ml en comparación con 3,3 ng/ml para TcdB. Por otro lado, las células IMR-90 son más sensibles a TcdB; la CE50 de la TcdB purificada en estas células varía entre 9-30 pg/ml en comparación con 0,92-1,5 ng/ml para TcdA. La especificidad del ensayo tanto para TcdA como para TcdB en estas líneas celulares se confirmó mediante el uso de anticuerpos específicos de toxina tanto policlonales como monoclonales. Para la normalización del ensayo, se ensayaron filtrados de cultivo de los 24 aislados de CDC a una concentración cuatro veces mayor que su valor de CE50 respectivo. Tres de las cepas tenían niveles de toxina que eran demasiado bajos para ensayarse en el ensayo de neutralización.

Veinticuatro cepas que representan diversos ribotipos/toxinotipos que cubren más del 95 % de las cepas circulantes deC. difficileen los Estados Unidos y Canadá se obtuvieron de los CDC. Entre estos aislados se encontraban cepas que representaban ribotipos 027, 001 y 078, tres cepas epidémicas de DACD en los Estados Unidos, Canadá y Reino Unido. Las cepas 2004013 y 2004118 representaron el ribotipo 027; la cepa 2004111 representó el ribotipo 001 y las cepas 2005088, 2005325 y 2007816 representaron el ribotipo 078. Para identificar el grado de diversidad genética entre los aislados clínicos que causan la enfermedad y la cepa 630, se secuenciaron satisfactoriamente los genes de toxinas(tcdAytcdB)de estas cepas clínicas. Véase la Tabla 35. Las secuencias de aminoácidos de las toxinas se alinearon utilizando ClustalW en el programa Megalign™ (DNASTAR® Lasergene®) y se analizaron para determinar la identidad de la secuencia. ParatcdA,el análisis de alineamiento genómico mostró que todos los aislados clínicos y la cepa 630 compartían en general aproximadamente un 98-100% de identidad de secuencia de aminoácidos. La porción C-terminal del gentcdAfue ligeramente más divergente. Se realizó el mismo análisis para el gentcdBque presentó una mayor divergencia de secuencia. Cabe destacar que las cepas 2007838/NAP7/126 y 2007858/NAP1/unk5 presentaron los patrones más divergentes de la cepa 630 en los dominios N-terminal (79-100%) y C-terminal (88-100%; datos no mostrados).

Se recogió un conjunto de suero de hámster (HS) de los hámsteres sirios dorados que se inmunizaron con un inmunógeno que incluía TcdA mutante (SEQ ID NO: 4) y TcdB mutante (SEQ ID NO: 6), en los que las toxinas mutantes se habían inactivado con EDC, de acuerdo con, por ejemplo, el Ejemplo 29, Tabla 15, descrito anteriormente, y se habían formulado con fosfato de aluminio. Los resultados de la Tabla 35 muestran que se neutralizó al menos la toxina B de los sobrenadantes de cultivo respectivos, en un ensayo de neutralizaciónin vitro, por sueros de los hámsteres inmunizados.

Tabla 35. Descripción de cepas de C. difficile de CDC y la capacidad de sueros inmunitarios de hámster para neutralizar varias toxinas

La Figura 23 representa los resultados del ensayo de neutralización utilizando preparaciones de toxinas de varias cepas deC. difficileen células IMR-90. Los datos muestran que los anticuerpos neutralizantes de TcdB en los antisueros de hámster eran capaces de neutralizar toxinas de los 21 aislados analizados, incluyendo cepas hipervirulentas y una cepa negativa para TcdA, positiva para TcdB. Se obtuvieron al menos 16 cepas diferentes deC. difficilede los CDC (Atlanta, GA) (descritos anteriormente) y se cultivaron en medios de cultivo deC. difficileen condiciones adecuadas como se conoce en la técnica y como se ha descrito anteriormente. Se analizaron los sobrenadantes de cultivo que contenían las toxinas secretadas para determinar su citotoxicidad (CE50) en monocapas de IMR-90 y posteriormente se analizaron en un ensayo de neutralizaciónin vitroestándar a 4 veces la CE50 usando diversas diluciones de sueros de hámsteres inmunizados con sustancia farmacéutica de toxina A mutante y sustancia farmacéutica de toxina B mutante, formuladas con fosfato de aluminio. La toxina en bruto obtenida a partir de sobrenadantes de cultivo de cada cepa y la toxina purificada (toxina comercial obtenida de List Biologicals) (no purificada a partir de los sobrenadantes respectivos) se ensayaron con respecto a la citotoxicidad para las células IMR-90 utilizando el ensayo de citotoxicidadin vitrodescrito anteriormente.

En las figuras 23A-K, los gráficos muestran los resultados de las pruebas de citotoxicidadin vitro(descritas anteriormente) en las que se representan los niveles de ATP (URL) frente a concentraciones crecientes de: medios de cultivo deC. difficiley el conjunto de suero de hámster (■); toxina en bruto y el conjunto de suero de hámster (•); toxina purificada y el conjunto de suero de hámster (A); toxina en bruto (▼), control; y toxina purificada (♦), control. Las toxinas de las cepas respectivas se añadieron a las células a valores de 4xCE50.

Como se muestra en las Figuras 23A-K, los hámsteres que recibieron el inmunógeno descrito desarrollaron sorprendentemente anticuerpos neutralizantes que mostraron actividad neutralizante contra toxinas de al menos las siguientes 16 cepas diferentes de CDC deC. difficile, en comparación con el control de toxina solamente respectivo: 2007886 (Figura 23A); 2006017 (Figura 23B); 2007070 (Figura 23C); 2007302 (Figura 23D); 2007838 (Figura 23E); 2007886 (Figura 23F); 2009292 (Figura 23G); 2004013 (Figura 23H); 2009141 (Figura 23I); 2005022 (Figura 23J); 2006376 (Figura 23K). Consúltese también la Tabla 35 para ver las cepas adicionales deC. difficilede las que se ensayaron toxinas y se neutralizaron por la composición inmunogénica que incluye una sustancia farmacéutica de toxina A mutante y una sustancia farmacéutica de toxina B mutante, formuladas en fosfato de aluminio.

En otro estudio, se ensayaron sobrenadantes de cultivo que contenían toxinas secretadas de las diversas cepas deC. difficile(obtenidas de los CDC y del Leeds Hospital, UK, Reino Unido) en el ensayo de neutralizaciónin vitroutilizando sueros de hámsteres a los que se administraron sustancia farmacéutica de toxina A mutante y sustancia farmacéutica de toxina B mutante, formuladas con Alhydrogel. Véase el diseño experimental en la Tabla 36. Los resultados se muestran en la Tabla 37 y la Tabla 38.

Ejemplo 38: Mapeo de péptidos de toxinas triple mutantes EDC/NHS

Para caracterizar las toxinas triple mutantes inactivadas por EDC/NHS, se realizaron experimentos de mapeo de péptidos en cuatro lotes de toxina A triple mutante tratada con EDC/NHS (SEQ ID NO: 4) y cuatro lotes de triple mutante B tratado con EDC/NHS (SEQ ID NO: 6). Después de digerir las toxinas mutantes con tripsina, los fragmentos peptídicos resultantes se separaron usando HPLC de fase inversa. Se utilizó el análisis de espectro de masas para identificar las modificaciones que se producían como resultado del proceso de inactivación. Tanto para la sustancia farmacéutica de toxina A mutante como para la sustancia farmacéutica de toxina B mutante, se identificaron más del 95% de los péptidos trípticos teóricos. Se identificaron entrecruzamientos y aductos de glicina (se usó glicina como agente de protección terminal). Tanto en la sustancia farmacéutica de toxina A mutante como en la sustancia farmacéutica de toxina B mutante, también se observaron aductos de beta-alanina. Sin pretender quedar vinculados a ningún mecanismo o teoría, los aductos de beta-alanina parecen ser el resultado de la reacción de tres moles de NHS con un mol de EDC que forma beta-alanina activada por NHS. Esta molécula puede reaccionar después con grupos de lisina para formar aductos de beta-alanina (+70 Da). En las muestras de la toxina B triple mutante tratada con EDC/NHS, también se observaron niveles bajos (0,07 moles/mol de proteína) de deshidroalanina (-34 Da). La deshidroalanina es el resultado de la desulfonación de un resto de cisteína. Se observó el mismo tipo y grado de modificación en los cuatro lotes de cada toxina mutante, lo que indica que el proceso produce un producto consistente. El mapeo de péptidos (con una cobertura de secuencia superior al 95%) confirma que están presentes modificaciones. En la Tabla 39 se muestra un resumen de las modificaciones. Véanse también las Figuras 24-25. Además, el tamaño y la heterogeneidad de carga de la sustancia farmacéutica de toxina A triple mutante y de la sustancia farmacéutica de toxina B triple mutante aumentaron, en comparación con el tamaño y la heterogeneidad de carga de la toxina A triple mutante y la toxina B triple mutante respectivas en ausencia de inactivación química. Como resultado, los perfiles de cromatografía de exclusión por tamaño (SEQ) y cromatografía de intercambio aniónico (AEX) tuvieron picos relativamente amplios (datos no mostrados).

Tabla 39. Resumen de modificaciones observadas en sustancias farmacéuticas de toxina mutante

Ejemplo 39: Producción de productos farmacéuticos

La composición inmunogénica deC. diffidle(producto farmacéutico) contiene dos ingredientes farmacéuticos activos (sustancia farmacéutica de toxina A mutante y sustancia farmacéutica de toxina B mutante): □. Un producto farmacéutico ejemplar es una formulación liofilizada que contiene tampón Tris 10 mM pH 7,4, 4,5 % (p/p) de trehalosa dihidratada y 0,01 % (p/v) de polisorbato 80, que incluye cada una de una sustancia farmacéutica de toxina A mutante y una sustancia farmacéutica de toxina B mutante. Véase la Tabla 40. La composición inmunogénica se prepara para inyección resuspendiendo la vacuna liofilizada con diluyente o con un diluyente que contiene Alhydrogel. El placebo incluirá una solución salina normal estéril inyectable (cloruro sódico al 0,9%).

Tabla 40

Preparación del tampón

Se agrega agua para inyección (API) a un recipiente de composición. Mientras se mezcla, se añaden los excipientes y se disuelven hasta su disolución. Se mide el pH. Si se requiere, El pH se ajusta a 7,4 ± 0,1 con HCl. La solución se diluye hasta el peso final con API y luego se filtra usando un filtro Millipore Express SHC XL150 de 0,22 |jm. Antes de la filtración, se toma una muestra de reducción de carga biológica pre-filtración. Se toman muestras del tampón filtrado para determinar la osmolalidad y el pH.

Preparación de la formulación

Las sustancias farmacéuticas de toxina mutante descongelada se agrupan en el recipiente de formulación en función de las cantidades precalculadas en el siguiente orden de operación: en primer lugar se añade al recipiente un 50 % del volumen deseado de tampón de dilución para conseguir 0,6 mg/ml, seguido de la adición de la sustancia farmacéutica de la toxina A mutante y se mezcla durante 5 minutos a 100 rpm. Después se añade la sustancia farmacéutica de la toxina B mutante al recipiente y la solución se diluye adicionalmente hasta un punto de dilución de 0,6 mg/ml y después se mezcla durante otros 5 minutos a 100 rpm. Se extrae una muestra y se ensaya la concentración total de toxina mutante. La solución se diluye a un volumen del 100 por ciento basado en el valor de la concentración de toxina mutante en proceso y luego se mezcla durante 15 minutos a 100 rpm. Se recogen muestras del producto farmacéutico formulado para comprobar el pH y la carga biológica pre-filtración. El producto farmacéutico formulado se filtra después utilizando un Millipore Express SHC XL150 para almacenamiento durante la noche, o se lleva a la línea de llenado para la filtración estéril.

El conjunto de producto formulado se lleva al área de llenado, se toman muestras para determinar la carga biológica y después se filtra de forma estéril con dos filtros Millipore Express SHC XL150 en serie. El conjunto de producto formulado se introduce en viales de vidrio despirogenados a un volumen de llenado diana de 0,73 ml. Los viales llenos se tapan parcialmente y luego se cargan en el liofilizador. El ciclo de liofilización se ejecuta como se muestra en la Tabla 41. Al finalizar el ciclo, la cámara de liofilización se rellena con nitrógeno hasta 0,8 atm y después se asientan completamente los tapones. La cámara se descarga y los viales se tapan con sellos de fácil apertura.

Tabla 41. Puntos de ajuste del ciclo de liofilización del producto farmacéutico de C. difficile

Etapas Temperatura (°C) Rampa (minutos) Remojo (minutos) PresiónCarga 5 °C NR 60 -Congelación 1 -50 °C 183 60 -Templado -10 °C 133 180

Congelación 2 -45 °C 117 90

Iniciación de vacío -45 °C - 60 50

Secado primario -30 °C 75 3420 50

Secado Secundario 30 °C 300 600 50 Almacenamiento 5 °C 50 - 50

Los datos de estabilidad del producto farmacéutico se resumen en la Tabla 42. Los datos sugieren que el producto farmacéutico es física y químicamente estable durante el almacenamiento a 2-8 °C durante al menos 3 meses o al menos 1 mes a 25 ° o 40 °C. En ambas condiciones de almacenamiento, no cambio el nivel de impurezas detectado por cromatografía de exclusión por tamaño (SEQ), ni tampoco hubo cambios en la antigenicidadin vitroa través de los últimos puntos de tiempo ensayados.

Tabla 42: Estabilidad del producto farmacéutico liofilizadoa

Ejemplo 40: Diluyentes de vacuna

Para la solución salina, se usa NaCl 60 mM como diluyente para el producto farmacéutico liofilizado sin ningún adyuvante para asegurar una solución isotónica tras la reconstitución.

A lhydrogel: Alhydrogel "85" 2% (Brenntag) es un producto de calidad de Buenas Prácticas de Fabricación (GMP) disponible en el mercado, compuesto por láminas cristalinas octaédricas de hidróxido de aluminio. En la Tabla 43 se muestra una formulación de diluyente de Alhydrogel ejemplar. La formulación ejemplar se puede usar en combinación con el producto farmacéutico descrito anteriormente.

Los estudios con el adyuvante Alhydrogel muestran una unión del 100% de la sustancia farmacéutica de toxina A mutante y la sustancia farmacéutica de toxina B mutante a 1 mg de AI/ml de Alhydrogel de pH 6,0 a 7,5. Se observó la unión máxima de las dos sustancias farmacéuticas a la máxima concentración de proteína ensayada (300 pg/ml de cada una).

También se ensayó la unión de las proteínas a Alhydrogel con la formulación del producto farmacéutico liofilizado que contenía 200 pg/ml de cada sustancia farmacéutica y Alhydrogel que varía de 0,25 a 1,5 mg/ml. El producto farmacéutico se reconstituyó con diluyentes que contenían concentraciones variables de Alhydrogel y se midió el porcentaje de cada toxina mutante unida. Todas las concentraciones ensayadas de Alhydrogel demostraron la unión del 100% de los antígenos.

También se evaluaron las cinéticas de unión de las proteínas a Alhydrogel a la dosis diana de sustancia farmacéutica de toxina A mutante y sustancia farmacéutica de toxina B mutante (200 pg/ml de cada una). Los resultados muestran que el 100 % de las sustancias farmacéuticas de la toxina mutante se unieron a Alhydrogel a lo largo de las 24 horas de RT.

CpG 24555 y Alhydrogel: CpG 24555 es un oligodesoxinucleótido (ODN) sintético 21-mero que tiene una secuencia 5-TCG TCG TTTTTC GGT GCT TTT-3 (SEQ ID NO: 48). En la Tabla 44 se muestra una formulación ejemplar para una combinación de CpG 24555 y Alhydrogel como diluyentes. La formulación ejemplar se puede usar en combinación con el producto farmacéutico descrito anteriormente.

ISCOMATRIX®: El adyuvante ISCOMATRIX® es un adyuvante basado en saponina conocido en la técnica. En la Tabla 45 se muestra una formulación ejemplar para la formulación de adyuvante ISCOMATRIX®. La formulación ejemplar se puede usar en combinación con el producto farmacéutico descrito anteriormente.

Ejemplo 41: Inmunogenicidad de composiciones de sustancias farmacéuticas de toxina mutante con alhydrogel como adyuvante en el modelo de PNH y prueba de concepto preclínica

Se evaluó la inmunogenicidad de composiciones de sustancia farmacéutica de toxina A mutante y de sustancia farmacéutica de toxina B mutante con Alhydrogel como adyuvante en PNH, específicamente macacos cynomolgus. Los PNH inmunizados a intervalos de dos semanas (semanas 0, 2, 4) con 10 |jg de cada una de las composiciones de sustancia farmacéutica de toxina A mutante y sustancia farmacéutica de toxina B mutante (formuladas con Alhydrogel) por dosis, desarrollaron respuestas neutralizantes antitoxina robustas. Véase la Tabla 46. Las respuestas neutralizantes tanto antitoxina A como antitoxina B alcanzaron un intervalo protector después de la tercera inmunización y se mantuvieron dentro o por encima del intervalo protector al menos hasta la semana 33 (último punto de tiempo estudiado).

Se inmunizaron macacos Cynomolgus (n = 8) IM a las 0, 2 y 4 semanas con 10 jg de cada una de las siguientes: sustancia farmacéutica de toxina A mutante y sustancia farmacéutica de toxina B mutante formuladas en 250 jg de Alhydrogel. Se recogieron los sueros en cada punto de tiempo y se analizaron en el ensayo de neutralización de toxina para determinar la actividad antitoxina funcional. Los GMT se proporcionan en la Tabla 46. El intervalo de títulos de protección proporcionado en la tabla representa el intervalo de títulos de anticuerpos neutralizantes que se correlaciona con una reducción significativa en la recurrencia de la infección porC. difficileen el ensayo de terapia con anticuerpos monoclonales de Merck.

Correlación de los títu los de anticuerpos protectores humanos del ensayo de terapia con Acm de Merck con los títulos inducidos por el candidato de vacuna de Pfizer en PNH

El estudio de eficacia de Fase 2 con Acm de Merck/Medarex (Lowy et al., N Engl J Med. 21 de enero de 2010; 362 (3): 197-205 pareció demostrar una correlación entre el nivel de Acm neutralizantes antitoxina en el suero y la prevención de la recurrencia de DACD. Después de la administración de Acm específicos de toxina a seres humanos, los niveles de anticuerpos séricos en los receptores humanos en el intervalo de 10 a 100 pg/ml parecen proteger contra las recurrencias (70% de reducción en la recurrencia de DACD).

Se ensayaron composiciones inmunogénicas que incluían las sustancias farmacéuticas de toxina mutante para calibrar si las composiciones inmunogénicas son capaces de inducir respuestas de anticuerpos neutralizantes potencialmente eficaces en humanos comparando los datos publicados del estudio de fase 2 de Merck/Medarex con los niveles de anticuerpos inducidos por las composiciones inmunogénicas en el modelo de PNH. Esto se consiguió utilizando las características publicadas previamente de los Acm de Merck/Medarex para convertir el intervalo de estos Acm en el suero obtenido de sujetos que no mostraron signos de recurrencia (10-100 pg/ml) en títulos de neutralización del 50 % y comparando estos títulos ("intervalo de título de protección") con los títulos observados en los modelos preclínicos descritos en el presente documento. Como se muestra en la Tabla 46, las composiciones inmunogénicas que incluyen la sustancia farmacéutica de toxina A mutante y la sustancia farmacéutica de toxina B mutante con Alhydrogel como adyuvante generaron respuestas inmunitarias en los PNH que alcanzaron el "intervalo de protección" después de la tercera dosis y se mantuvieron dentro o por encima de este intervalo hasta la semana 33. El nivel de anticuerpos neutralizantes de toxinas inducidos en los PNH por la composición inmunogénica deC. difficilede la invención es comparable a los niveles de anticuerpos séricos en los sujetos de ensayo de Merck/Medarex que parecían estar protegidos de las recurrencias de DACD.

Ejemplo 42: Inmunogenicidad de composiciones de sustancia farmacéutica de toxina mutante con ISCOMATRIX o Alhydrogel/CpG 24555 (Alh/CpG) como adyuvantes en el modelo de PNH

En los PNH, tanto ISCOMATRIX como Alh/CpG mejoraron de una forma estadísticamente los títulos de neutralización de antitoxina A y B en comparación con la vacuna administrada con Alhydrogel solo (Tabla 47). Las respuestas de antitoxina por encima del nivel de fondo se obtuvieron en momentos anteriores mediante una vacuna administrada con Alh / CpG o ISCOMATRIX (semana 2-4) en comparación con Alhydrogel solo (semana 4-6), que puede tener un efecto importante en la protección contra la recurrencia de DACD en humanos. En comparación con Alhydrogel, la composición inmunogénica con Alh/CpG o con ISCOMATRIX como adyuvantes generó títulos de neutralización antitoxina que alcanzaron el intervalo de protección (véase también el Ejemplo 41) más rápidamente y que se mantuvieron dentro o por encima de este intervalo hasta la semana 33.

Como se muestra en la Tabla 47, Se inmunizaron macacos Cynomolgus IM en las semanas 0, 2 y 4 con 10 pg de cada una de las siguientes: sustancia farmacéutica de toxina A mutante y sustancia farmacéutica de toxina B mutante formuladas en 250 pg de Alhydrogel (n = 8), o 500 pg de CpG 250 pg de Alhydrogel (n = 10), o 45 U de ISCOMATRIX (n = 10). Se recogieron los sueros en cada punto de tiempo y se analizaron en el ensayo de neutralización de toxina descrito anteriormente para determinar la actividad antitoxina funcional. En las tablas se enumeran los GMT. Los asteriscos (*) indican significado estadístico (p <0,05) cuando se comparan con los títulos del grupo de Alhydrogel. El intervalo de títulos de protección representa el intervalo de títulos de anticuerpos neutralizantes que se correlaciona con una reducción significativa en la recurrencia de la infección porC. difficilede acuerdo con el ensayo de terapia con Acm de Merck/Medarex.

También se evaluó la dosis de sustancia farmacéutica de toxina A mutante y sustancia farmacéutica de toxina B mutante administrada, en presencia de ISCOMATRIX o Alh/CpG como adyuvantes, sobre los títulos de anticuerpos antitoxina neutralizantes generados en los PNH. En un estudio, a los PNH se les administró una dosis baja (10 p g) o alta (100 p g) de cada sustancia farmacéutica de toxina mutante formulada en ISCOMATRIX. Se compararon las respuestas en cada punto de tiempo después de la inmunización. Como se muestra en la Tabla 48, Los títulos de neutralización antitoxina fueron robustos en ambos grupos de tratamiento. Los títulos de antitoxina A fueron casi equivalentes en la mayoría de los puntos de tiempo entre los grupos de dosis baja y dosis alta, mientras que hubo una tendencia a que los títulos de antitoxina B fueran más altos en el grupo de dosis alta.

Como se muestra en la Tabla 48, Se inmunizaron macacos Cynomolgus (n = 5) IM en las semanas 0, 2 y 4 con 10 |jg o 100 jg de cada una de la sustancia farmacéutica de la toxina A mutante y la sustancia farmacéutica de la toxina B mutante formuladas con 45 U de ISCOMATRIX. Se recogieron los sueros en cada punto de tiempo y se analizaron en el ensayo de neutralización de toxina para determinar la actividad antitoxina funcional. En la tabla se enumeran los GMT. El intervalo de títulos de protección representa el intervalo de títulos de anticuerpos neutralizantes que se correlaciona con una reducción significativa en la recurrencia de la infección porC. difficileen el ensayo de terapia con Acm de Merck/Medarex.

En un esfuerzo por mejorar la cinética de las respuestas antitoxina B, se inmunizaron PNH con una dosis constante de sustancia farmacéutica de toxina A mutante (10 jg ) que se mezcló con una dosis creciente de sustancia farmacéutica de toxina B mutante (10, 50 o 100 jg ) en presencia de ISCOMATRIX o Alh/CpG como adyuvantes. Independientemente del adyuvante, hubo una tendencia en los grupos que recibieron dosis más altas de sustancia farmacéutica de toxina B mutante (50 o 100 jg ) a inducir mayores respuestas neutralizantes antitoxina B en comparación con la dosis de 10 jg del fármaco de toxina B mutante (Tabla 50, marcado con * para indicar aumentos estadísticamente significativos). Esta tendencia se observó en la mayoría de los puntos de tiempo después de la inmunización final. Sin embargo, en algunos casos, Las respuestas neutralizantes antitoxina A mostraron una disminución estadísticamente significativa (marcada por A en la Tabla 49) cuando se incrementó la cantidad de toxina B mutante.

Como se muestra en la Tabla 49 y la Tabla 50, se inmunizaron PNH (10 por grupo) IM en las semanas 0, 2 y 4 con diferentes proporciones de sustancia farmacéutica de toxina A mutante y sustancia farmacéutica de toxina B mutante (10 jg de sustancia farmacéutica de toxina A mutante más 10, 50 o 100 jg de sustancia farmacéutica de toxina B mutante; denominadas 10A:10B, 10A:50B y 10A:100B, respectivamente, en la Tabla 49 y la Tabla 50), formuladas con ISCOMATRIX (45 U por dosis) o con Alh/CpG/(250 jg/500 jg por dosis). La tabla 49 muestra los títulos de antitoxina A. La tabla 50 muestra los títulos de antitoxina B. En las tablas se enumeran los GMT. El intervalo de títulos de protección representa el intervalo de títulos de anticuerpos neutralizantes que se correlaciona con una reducción significativa en la recurrencia de la infección porC. difficileen el ensayo de terapia con Acm de Merck. El símbolo<a>, representa una disminución estadísticamente significativa en los títulos de neutralización (p <0,05) en comparación con el grupo 10A:10B. El símbolo asterisco, *, representa un aumento estadísticamente significativo en los títulos de neutralización (p<0,05) en comparación con el grupo 10A:10B.

Ejemplo 43: Estudio de toxicidad IM de cinco semanas con dosis repetidas con una composición inmunogénica en monos Cynomolgus, con un período de recuperación de 4 semanas

El estudio de toxicidad de dosis repetidas IM de 5 semanas con PF-06425095 (una composición inmunogénica que incluye sustancia farmacéutica de toxina A triple mutante y sustancia farmacéutica de toxina B triple mutante en una combinación con adyuvantes de hidróxido de aluminio y CpG 24555) en monos Cynomolgus se realizó para evaluar la toxicidad e inmunogenicidad potenciales de la sustancia farmacéutica de toxina A triple mutante deC. diffidley la sustancia farmacéutica de toxina B triple mutante en una combinación con los adyuvantes hidróxido de aluminio y CpG 24555 (PF-06425095). Se administraron PF-06425095 a 0,2 o 0,4 mg/dosis de sustancia farmacéutica de toxina A triple mutante y sustancia farmacéutica de toxina B triple mutante (grupos de composición inmunogénica de dosis alta y baja, respectivamente), 0,5 mg de aluminio como hidróxido de aluminio y 1 mg de CpG 24555 y la combinación de adyuvantes sola (hidróxido de aluminio CpG 24555; PF-06376915) IM a monos Cynomolgus (6/sexo/grupo) como una dosis inicial seguida de 3 dosis de refuerzo (días 1, 8, 22 y 36). Un grupo separado de animales (6/sexo) recibió solución salina isotónica al 0,9% a un pH aproximado de 7,0. El vehículo de la composición inmunogénica estaba compuesto por tampón Tris 10 mM a pH 7,4, trehalosa dihidratada al 4,5% y polisorbato 80 al 0,1%. El vehículo de control adyuvante estaba compuesto por tampón de histidina 10 mM con NaCl 60 nM a pH 6,5. El volumen total de dosis fue de 0,5 ml por inyección. Todas las dosis se administraron en el músculo cuádriceps izquierdo y/o derecho. Los animales seleccionados se sometieron a un período de observación sin dosis de 4 semanas para evaluar la reversibilidad de cualquier efecto observado durante la fase de dosificación del estudio.

No hubo hallazgos adversos en este estudio. PF-06425095 se toleró bien y produjo solo una reacción inflamatoria local sin evidencia de toxicidad sistémica. Durante la fase de dosificación, se observaron aumentos dependientes de la dosis desde antes del ensayo en el fibrinógeno (23,1% a 2,3x) en los días 4 y 38 y en la proteína C reactiva en los días 4 (2,1x a 27,5x) y 38 (2,3x a 101,5x), y en la globulina (11,1% al 24,1%) en el día 36 y/o 38, en grupos tratados con la composición inmunogénica y fueron coherentes con la respuesta inflamatoria esperada a la administración de una composición inmunogénica con adyuvante.

Los aumentos en fibrinógeno y proteína C reactiva detectados el día 4 se recuperaron parcialmente el día 8 con aumentos en fibrinógeno (del 25,6% al 65,5%) y proteína C reactiva (4,5x y 5,6x) solamente en el grupo de composición inmunogénica de dosis altas. Se observaron aumentos en la interleucina (IL)-6 en los grupos de composición inmunogénica de dosis baja y alta en el día 1, hora 3 (8,3x a 127,2x valores individuales día 1, hora 0, sensible a la dosis) y día 36, hora 3 (9,4x a 39,5x valores individuales día 36, hora 0). No se observaron cambios en las otras citocinas (IL-10, IL-12, proteína inducible por interferón (IP-10) y factor de necrosis tumoral a (TNF-a). Los aumentos en estas proteínas de fase aguda y citocinas fueron parte de la respuesta fisiológica normal esperada a la administración de antígeno extraño. No hubo alteraciones relacionadas con PF 06425095 ni relacionadas con el adyuvante en estos parámetros de patología clínica en la fase de recuperación (no se evaluaron las citocinas durante la fase de recuperación). Además, hubo cambios localizados en los sitios de inyección, que fueron de incidencia y gravedad similares en el grupo de control con adyuvante y en los grupos de composición inmunogénica de dosis baja y alta; por tanto, no estaban directamente relacionados con PF-06425095. Durante la fase de dosificación, los cambios incluyeron una inflamación activa crónica de mínima a moderada que se caracterizó por la separación de fibras musculares por infiltrados de macrófagos, que a menudo contenía material granular basófilo (interpretado como adyuvante que contiene aluminio), linfocitos, células plasmáticas, neutrófilos, eosinófilos, restos necróticos y edema. El material granular basófilo también estaba presente extracelularmente dentro de estos focos de inflamación activa crónica. Al final de la fase de recuperación, hubo infiltrado de células mononucleares e inflamación crónica de mínima a moderada y fibrosis mínima. Estos hallazgos en el sitio de la inyección representan una respuesta inflamatoria local al adyuvante. Otros cambios microscópicos incluyeron una celularidad linfoide aumentada de mínima a moderada en el ganglio linfático ilíaco (de drenaje) y una celularidad aumentada mínima en los centros germinales en el bazo que se detectaron durante la fase de dosificación en el grupo de control de adyuvante y en los grupos de composición inmunogénica de dosis baja y alta. Al final de la fase de recuperación, Estos hallazgos microscópicos fueron de menor gravedad. Estos efectos representan una respuesta inmunológica a la estimulación antigénica y fueron una respuesta farmacéutica al adyuvante o PF-06425095. No hubo un aumento relacionado con el artículo de ensayo en los anticuerpos anti-ADN.

Basándose en la ausencia de hallazgos adversos, el nivel sin efectos adversos observados (NOAEL) en este estudio es el grupo de composición inmunogénica de dosis altas (0,4 mg de sustancia farmacéutica de toxina A triple mutante y sustancia farmacéutica de toxina B triple mutante/dosis como PF-06425095) administrada como dos inyecciones de 0,5 ml para cuatro dosis.

Ejemplo 44: Eficacia de sueros de PNH seropositivos transferidos pasivamente a hámsteres

A grupos de 5 hámsteres dorados sirios se les administró una dosis oral de antibiótico clindamicina (30 mg/kg) para alterar la flora intestinal normal. Después de cinco días, los hámsteres se expusieron a una dosis oral de esporas deC. difficilede tipo silvestre (630 cepas, 100 ufc por animal) y se administraron por vía intraperitoneal (IP) con sueros de PNH de acuerdo con la Tabla 51. Sin pretender quedar vinculados a ningún mecanismo o teoría, los síntomas de la enfermedad después de la exposición a las esporas típicamente se manifiestan comenzando aproximadamente 30 48 horas después de la exposición.

Los sueros de PNH que se administraron a los hámsteres se agruparon a partir de muestras de suero de PNH que mostraron el título más alto (sueros anti-toxina A y sueros anti-toxina B) después de tres inmunizaciones con la sustancia farmacéutica de toxina A mutante y la sustancia farmacéutica de toxina B mutante (relaciones A:B 10:10, 10:50, y 10:100), formulada con ISCOMATRIX (véase el Ejemplo 42, Tabla 49, y Tabla 50). Los sueros de PNH se recogieron en puntos de tiempo en las semanas 5, 6 y 8 (las inmunizaciones se produjeron en las semanas 0, 2 y 4), como se describe en el Ejemplo 42. Los resultados se muestran en las Tablas 52-54 mostradas a continuación. El símbolo "+" indica una media geométrica (GM) en () que no incluye el animal # 3, no respondedor. "* TB" representa extracción de sangre terminal, el día que el animal fue sacrificado, que no es el mismo para todos los animales.

En otro estudio, A hámsteres dorados sirios se les administró una dosis oral de antibiótico clindamicina (30 mg/kg) para alterar la flora intestinal normal. Después de cinco días, los hámsteres se expusieron a una dosis oral de esporas deC. diffidlede tipo silvestre (cepa 630, 100 ufc por animal) y se administraron por vía intraperitoneal (IP) sueros de PNH de acuerdo con la Tabla 55. Sin pretender quedar vinculados a ningún mecanismo o teoría, los síntomas de la enfermedad después de la exposición a las esporas típicamente se manifiestan comenzando aproximadamente 30 48 horas después de la exposición.

Los sueros de PNH que se administraron a los hámsteres se agruparon de muestras recogidas de PNH después de tres inmunizaciones con sustancia farmacéutica de toxina A mutante y sustancia farmacéutica de toxina B mutante (relaciones A:B 10:10, 10:50 y 10:100), formulada con Alhydrogel y CpG 24555 (véase el Ejemplo 42, Tabla 49, y Tabla 50). Los sueros de PNH se recolectaron en puntos de tiempo en las semanas 5, 6, 8 y 12 como se describe en el Ejemplo 42 (los PNH se inmunizaron en las semanas 0, 2 y 4). Los resultados se muestran en las Tablas 56-59 mostradas a continuación. Los sueros de los hámsteres se investigaron adicionalmente para determinar el valor de la concentración inhibidora (CI50), que se determinó utilizando el ensayo de neutralización de toxinas descrito anteriormente. El nivel de anticuerpos neutralizantes de toxinas inducidos en los hámsteres por la composición inmunogénica deC. difficilede la invención es comparable a los niveles de anticuerpos séricos en los sujetos de ensayo de Merck/Medarex que parecían estar protegidos de las recurrencias de DACD.

Ejemplo 45: Caracterización de sustancias farmacéuticas de toxina mutante

La estructura primaria de la toxina A triple mutante se muestra en la SEQ ID NO: 4. El resto de Met NH2-terminal en la posición 1 de la SEQ ID NO: 4 se origina en el codón de iniciación de la SEQ ID NO: 12 y está ausente en la proteína aislada (por ejemplo, véase la SEQ ID NO: 83). En consecuencia, en el Ejemplo 12 al Ejemplo 45, "SEQ ID NO: 4" se refiere a SEQ ID NO: 4 en la que la metionina inicial (en la posición 1) está ausente. Tanto la toxina A triple mutante purificada (SEQ ID NO: 4) (Intermedio de la sustancia farmacéutica - Lote L44993-132) como la toxina A triple mutante tratada con EDC/NHS (SEQ ID NO: 4) ("sustancia farmacéutica de toxina A mutante" - Lote L44898-012) presentaron una sola secuencia NH2-terminal que comenzaba en SLISKEELIKLAYSI (posiciones 2-16 de la SEQ ID NO: 4).

La estructura primaria de la toxina B triple mutante se muestra en la SEQ ID NO: 6. El resto de Met NH2-terminal en la posición 1 de la SEQ ID NO: 6 se origina en el codón de iniciación y está ausente en proteína aislada (por ejemplo, véase la SEQ ID NO: 84). En consecuencia, en el Ejemplo 12 al Ejemplo 45, "SEQ ID NO: 6" se refiere a SEQ ID No : 6 en la que la metionina inicial (en la posición 1) está ausente. Tanto la toxina B triple mutante purificada (SEQ ID NO: 6) (Intermedio de la sustancia farmacéutica - Lote 010) como la toxina B triple mutante tratada con EDC/NHS (SEQ ID NO: 6) ("Sustancia farmacéutica de toxina B mutante" - Lote L44906-153) presentó una sola secuencia NH2-terminal que empezaba en SLVNRKQLEKMANVR (posiciones 2-16 de la SEQ ID NO: 6).

Se utilizó espectroscopia de dicroísmo circular (DC) para evaluar la estructura secundaria y terciaria del triple mutante A (SEQ ID NO: 4) y de la sustancia farmacéutica de toxina A mutante. También se usó espectroscopia DC para evaluar la estructura secundaria y terciaria de la toxina B triple mutante (SEQ ID NO: 6) y la sustancia farmacéutica de toxina B mutante. También se usó espectroscopia DC para evaluar los efectos potenciales del pH sobre la estructura. El efecto del tratamiento con EDC sobre la toxina A triple mutante se analizó comparando los datos de DC obtenidos para la sustancia farmacéutica de toxina A mutante con los datos obtenidos para la toxina A triple mutante. Los efectos del tratamiento con EDC sobre la toxina B triple mutante (SEQ ID NO: 6) se analizaron comparando los datos de DC obtenidos para la sustancia farmacéutica de toxina B mutante con los datos obtenidos para la toxina B triple mutante.

Los datos de DC UV lejano de la sustancia farmacéutica de toxina A mutante se obtuvieron a diversos pH. Los espectros registrados a pH 5,0-7,0 son indicativos de una alta proporción de hélices a en la estructura secundaria, lo que sugiere que el esqueleto polipeptídico de la proteína adopta una conformación bien definida dominada por las hélices a.

También se obtuvieron espectros de DC UV cercano de sustancia farmacéutica de toxina A mutante. Una fuerte elipticidad negativa entre 260 y 300 nm es una indicación de que las cadenas laterales aromáticas se encuentran en un entorno rígido único, es decir, la sustancia farmacéutica de toxina A mutante posee una estructura terciaria. De hecho, dentro del espectro se pueden distinguir rasgos característicos que surgen de los tipos individuales de cadenas laterales aromáticas: saliente a -290 nm y el pico negativo más grande a ~283 nm se deben a la absorbancia de la luz polarizada por cadenas laterales de triptófano ordenadas, el pico negativo a 276 nm proviene de las cadenas laterales de tirosina y los salientes menores a 262 y 268 nm son indicativos de los restos de fenilalanina que participan en los contactos terciarios. Los resultados del UV lejano y cercano proporcionan pruebas de que sustancia farmacéutica de toxina A mutante conserva la estructura plegada de manera compacta a un pH fisiológico. Los espectros de DC UV lejano y cercano casi idénticos observados a pH 5,0 - 7,0 indican que no se están produciendo cambios estructurales detectables dentro de este intervalo de pH. No pudieron recogerse datos de DC a pH 3,0 y 4,0, ya que la proteína era insoluble a estos puntos de pH. Al comparar los espectros de DC UV lejano y cercano de la sustancia farmacéutica de toxina A mutante con los de la toxina A triple mutante, los espectros de ambas proteínas son esencialmente idénticos en todas las condiciones experimentales estudiadas, lo que indica que el tratamiento con EDC no tuvo efectos detectables sobre la estructura secundaria y terciaria de la toxina A triple mutante. Este hallazgo está de acuerdo con los resultados de filtración en gel y ultracentrifugación analítica, que no muestran cambios detectables en los radios de Stokes y los coeficientes de sedimentación/fricción, respectivamente.

La sustancia farmacéutica de toxina A mutante (así como la toxina A triple mutante) contiene 25 restos de triptófano que están diseminados a lo largo de la secuencia primaria y pueden servir como sondas de fluorescencia intrínseca convenientes. Se obtuvieron espectros de emisión de fluorescencia de sustancia farmacéutica de toxina A mutante entre 300 y 400 nm en función de la temperatura. A 6,8 °C, la sustancia farmacéutica de toxina A mutante muestra un espectro característico de emisión de fluorescencia de triptófano tras la excitación a 280 nm. El máximo de emisión de fluorescencia se observa a ~335 nm, lo que indica que los restos de triptófano están en un entorno no polar, típico de interiores de proteínas en lugar de ambientes acuosos polares. Los resultados de los espectros de emisión de fluorescencia, junto con los resultados de los experimentos de DC presentados en este informe, confirman que la sustancia farmacéutica de toxina A mutante conserva la estructura plegada compacta.

Se utilizó la fluorescencia de la sonda extrínseca ácido 8-anilino-1-naftaleno sulfónico (ANS) para caracterizar los posibles cambios conformacionales en la sustancia farmacéutica de toxina A mutante y la toxina A triple mutante ante los cambios en el pH. Como se puede ver por los resultados, esencialmente no hay un aumento en la intensidad de la fluorescencia de ANS cuando la sustancia farmacéutica de toxina A mutante o la toxina A triple mutante se titulan con la sonda a pH 7,0, lo que sugiere que no se exponen superficies hidrófobas en las proteínas en estas condiciones. El cambio de pH a 2,6 conduce a un aumento espectacular en el rendimiento cuántico de fluorescencia de ANS al aumentar la concentración de la sonda, hasta que el rendimiento cuántico de fluorescencia alcanza la saturación aparente. Este aumento en el rendimiento cuántico de fluorescencia de ANS indica que a un pH bajo (2,6), tanto la sustancia farmacéutica de toxina A mutante como la toxina A triple mutante experimentan un cambio conformacional inducido por el pH que expone las superficies hidrófobas. Dichos cambios conformacionales indican que la modificación e inactivación inducidas por EDC de la toxina A triple mutante no restringió la plasticidad conformacional de la sustancia farmacéutica de toxina A mutante (DS).

El efecto del tratamiento con EDC sobre las propiedades hidrodinámicas de la toxina A triple mutante se evaluó usando cromatografía de exclusión por tamaño en una columna G4000 SWXL. Se inyectaron sustancia farmacéutica de toxina A mutante y toxina A triple mutante se inyectaron en la columna G4000 SWXL equilibrada a pH 7,0, 6,0 y 5,0. Los datos indican que no se pueden detectar diferencias en el radio de Stokes de la sustancia farmacéutica de toxina A mutante y de la toxina A triple mutante usando cromatografía de exclusión por tamaño. Por lo tanto, El tratamiento con EDC no ha afectado drásticamente a las propiedades hidrodinámicas y, de forma correspondiente, a la forma molecular global de la toxina triple mutante A.

Se realizó un análisis adicional de la toxina A triple mutante y la sustancia farmacéutica de toxina A mutante utilizando la técnica de dispersión de luz láser multi-ángulo (MALLS). El tratamiento de la toxina A triple mutante con EDC tuvo como resultado la generación de una mezcla heterogénea compuesta de diversas especies multiméricas y monoméricas. Dicha heterogeneidad refleja la introducción de un gran número de enlaces covalentes inter- e intramoleculares inducidos por EDC entre carboxilos y aminas primarias de la proteína.

Los datos obtenidos proporcionan características físicas y químicas de la toxina A triple mutante y la sustancia farmacéutica de toxina A mutante (toxina A triple mutante tratada con EDC) y describen las características clave de su estructura primaria, secundaria y terciaria. Los datos generados demuestran que el tratamiento de la toxina A triple mutante con EDC tuvo como resultado una modificación covalente de su cadena polipeptídica, pero no afectó a las estructuras secundaria y terciaria de la proteína. El tratamiento con EDC conduce a un entrecruzamiento intra- e intermolecular. Los parámetros bioquímicos y biofísicos obtenidos para la sustancia farmacéutica de toxina A mutante (así como para la toxina A triple mutante) se presentan en la Tabla 60.

Los datos de DC UV lejano de la sustancia farmacéutica de toxina B mutante se obtuvieron a diversos pH. Los espectros registrados a pH 5,0-7,0 son indicativos de una alta proporción de hélices a en la estructura secundaria, lo que sugiere que el esqueleto polipeptídico de la proteína adopta una conformación bien definida dominada por las hélices a.

También se obtuvieron espectros de DC UV cercano de sustancia farmacéutica de toxina B mutante. Una fuerte elipticidad negativa entre 260 y 300 nm es una indicación de que las cadenas laterales aromáticas se encuentran en un entorno rígido único, es decir, la sustancia farmacéutica de toxina B mutante posee una estructura terciaria. De hecho, dentro del espectro se pueden distinguir rasgos característicos que surgen de los tipos individuales de cadenas laterales aromáticas: el saliente a ~290 nm y el pico negativo más grande a ~283 nm se deben a la absorbancia de la luz polarizada por cadenas laterales de triptófano ordenadas, el pico negativo a 276 nm proviene de las cadenas laterales de tirosina y los salientes menores a 262 y 268 nm son indicativos de los restos de fenilalanina que participan en los contactos terciarios. Los espectros de CD UV lejano y cercano proporcionan pruebas de que sustancia farmacéutica de toxina B mutante conserva la estructura plegada de manera compacta a un pH fisiológico. Los espectros de DC UV lejano y cercano muy similares observados a pH 5,0 - 7,0 indican que no se están produciendo cambios estructurales secundarios o terciarios detectables dentro de este intervalo de pH. No pudieron recogerse datos de DC a pH 3,0 y 4,0, ya que la proteína era insoluble a estos puntos de pH.

Al comparar los espectros de DC UV lejano y cercano de la sustancia farmacéutica de toxina B mutante con los de la toxina B triple mutante, Los espectros de ambas proteínas son muy similares entre pH 5.0 y 7.0, lo que indica que el tratamiento con EDC no tuvo efectos detectables sobre la estructura secundaria y terciaria de la proteína.

La toxina B triple mutante contiene 16 restos de triptófano que están diseminados a lo largo de la secuencia primaria y pueden servir como sondas de fluorescencia intrínseca convenientes. Se obtuvieron espectros de emisión de fluorescencia de sustancia farmacéutica de toxina B mutante entre 300 y 400 nm en función de la temperatura. A 7 °C, la sustancia farmacéutica de toxina B mutante muestra un espectro característico de emisión de fluorescencia de triptófano tras la excitación a 280 nm. El máximo de emisión de fluorescencia se observa a ~335 nm, lo que indica que los restos de triptófano están en un entorno no polar, típico de interiores de proteínas en lugar de ambientes acuosos polares. Este resultado, junto con los resultados de los experimentos de DC (véase anteriormente), confirman que la sustancia farmacéutica de toxina B mutante conserva la estructura plegada compacta.

Se utilizó la fluorescencia de la sonda extrínseca ácido 8-anilino-1-naftaleno sulfónico (ANS) para caracterizar los posibles cambios conformacionales en la sustancia farmacéutica de toxina B mutante y la toxina B triple mutante ante los cambios en el pH. Como se puede ver por los resultados, esencialmente no hay un aumento en la intensidad de la fluorescencia de ANS cuando la sustancia farmacéutica de toxina B mutante o la toxina B triple mutante se titulan con la sonda a pH 7,0, lo que sugiere que no se exponen superficies hidrófobas en las proteínas en estas condiciones. El cambio de pH a 2,6 conduce a un aumento espectacular en el rendimiento cuántico de fluorescencia de ANS al aumentar la concentración de la sonda en presencia de la sustancia farmacéutica de toxina B mutante, hasta que el rendimiento cuántico de fluorescencia alcanza la saturación aparente. Este aumento en el rendimiento cuántico de fluorescencia de ANS indica que a un pH bajo (2,6), la sustancia farmacéutica de toxina B mutante experimenta un cambio conformacional inducido por el pH que expone las superficies hidrófobas. Dichos cambios conformacionales indican que la modificación e inactivación inducidas por EDC de la toxina B triple mutante no restringió la plasticidad conformacional de la sustancia farmacéutica de toxina B mutante (DS).

El efecto del tratamiento con EDC sobre las propiedades hidrodinámicas de la toxina B triple mutante se evaluó usando cromatografía de exclusión por tamaño en una columna G4000 SWXL. La sustancia farmacéutica de toxina B mutante y la toxina B triple mutante se inyectaron en la columna G4000 SWXL equilibrada a pH 7,0, 6,0 y 5,0. Los datos indican que no se pueden detectar diferencias en el radio de Stokes de la sustancia farmacéutica de toxina B mutante y de toxina B triple mutante usando cromatografía de exclusión por tamaño, por lo tanto, el tratamiento con EDC no ha afectado drásticamente a las propiedades hidrodinámicas y, de forma correspondiente, a la forma molecular global de la proteína.

Se realizó un análisis adicional de la toxina B triple mutante y la sustancia farmacéutica de toxina B mutante utilizando la técnica de dispersión de luz láser multi-ángulo (MALLS). El tratamiento de la toxina B triple mutante con EDC tuvo como resultado la generación de una mezcla más heterogénea que está compuesta de diversas especies multiméricas y monoméricas. Dicha heterogeneidad refleja la introducción de un gran número de enlaces covalentes inter- e intramoleculares inducidos por EDC entre carboxilos y aminas primarias de la proteína.

Los datos obtenidos proporcionan características físicas y químicas de la toxina B triple mutante y la sustancia farmacéutica de toxina B mutante (toxina B triple mutante tratada con EDC) y describen las características clave de su estructura primaria, secundaria y terciaria. Los datos generados demuestran que el tratamiento de la toxina B triple mutante con EDC tuvo como resultado una modificación covalente de su cadena polipeptídica, pero no afectó a las estructuras secundaria y terciaria de la proteína. El tratamiento con EDC conduce a un entrecruzamiento intra- e intermolecular. Los principales parámetros bioquímicos y biofísicos obtenidos para la sustancia farmacéutica de toxina B mutante (así como para la toxina B triple mutante) se presentan en la Tabla 61.

continuación

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición inmunogénica que comprende una toxina B deClostridium difficilemutante, en donde la toxina B deClostridium difficilemutante comprende SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8, en la que al menos un aminoácido de la toxina B deClostridium difficilemutante está químicamente entrecruzado y en el que dicha toxina B deClostridium difficilemutante exhibe una citotoxicidad disminuida en relación con la toxina B deClostridium difficilede tipo silvestre correspondiente.

2. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el aminoácido está entrecruzado químicamente por 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC).

3. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en la que al menos un aminoácido está entrecruzado mediante N-hidroxisuccinimida (NHS).

4. Una composición inmunogénica que comprende un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 6, en la que el residuo de metionina en la posición 1 opcionalmente no está presente, y en la que el polipéptido comprende una cadena lateral de aminoácido modificada químicamente por 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida) (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS).

5. La composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 4, en la que al menos una cadena lateral de un residuo de ácido aspártico del polipéptido o al menos una cadena lateral de un residuo de ácido glutámico del polipéptido está modificada químicamente por glicina.

6. La composición inmunogénica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4-5, en la que el polipéptido comprende:

a) al menos un entrecruzamiento entre una cadena lateral de un residuo de ácido aspártico del polipéptido y una cadena lateral de un residuo de lisina del polipéptido; y

b) al menos un entrecruzamiento entre una cadena lateral de un residuo de ácido glutámico del polipéptido y una cadena lateral de un residuo de lisina del polipéptido.

7. La composición inmunogénica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4-6, en la que el polipéptido incluye una fracción de beta-alanina enlazada a una cadena lateral de al menos un residuo de lisina del polipéptido.

8. La composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 7, en la que el polipéptido incluye una fracción de glicina enlazada a una cadena lateral de un residuo de ácido aspártico del polipéptido o a una cadena lateral de un residuo de ácido glutámico del polipéptido.

9. La composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 4, en la que una cadena lateral de al menos un residuo de lisina del polipéptido está enlazado a una fracción de beta-alanina.

10. La composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 8 o 9, en la que una cadena lateral de un segundo residuo de lisina del polipéptido está enlazada a una cadena lateral de un residuo de ácido aspártico o a una cadena lateral de un residuo de ácido glutámico.

11. La composición inmunogénica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8-10, en la que una cadena lateral de un residuo de ácido aspártico o una cadena lateral de un residuo de ácido glutámico del polipéptido está enlazada a una fracción de glicina.

12. La composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 4, que comprende un polipéptido aislado que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 4, en la que el residuo de metionina en la posición 1 opcionalmente no está presente, y un polipéptido aislado que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 6, en la que el residuo de metionina en la posición 1 opcionalmente no está presente, y en la que los polipéptidos tienen al menos una cadena lateral de aminoácido modificada químicamente por 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida) (EDC) y N-Hidroxisuccinimida (NHS), en la que dichos polipéptidos incluyen al menos uno de cualquiera de:

a) al menos una fracción de beta-alanina enlazada a una cadena lateral de un residuo de lisina del polipéptido;

b) al menos un entrecruzamiento entre una cadena lateral de un residuo de lisina del polipéptido y una cadena lateral de un residuo de ácido aspártico; y

c) al menos un entrecruzamiento entre una cadena lateral de un residuo de lisina del polipéptido y una cadena lateral de un residuo de ácido glutámico.

13. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en la que dicha composición comprende además un adyuvante.

14. La composición de acuerdo con la reivindicación 13, en la que el adyuvante es una sal de aluminio.

15. La composición de acuerdo con la reivindicación 13, en la que el adyuvante comprende gel de hidróxido de aluminio y un oligonucleótido CpG.

16. La composición de acuerdo con la reivindicación 13, en la que el adyuvante comprende ISCOMATRIX®.

17. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-16, en la que la composición está liofilizada.

18. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-17, en la que la composición comprende además trehalosa.

19. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-18, en la que la composición comprende además polisorbato-80.

20. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-19 para uso como medicamento.

21. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-19 para uso como vacuna.