KR102376876B1 - 무독성의 클로스트리디움 디피실 독소단백질-단편 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 무독성의 클로스트리디움 디피실 독소단백질-단편 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile, CD) 세균의 독소(toxin)가 유발하는 위막성 대장염(Pseudomembranous colitis) 등의 질환을 억제하기 위한 안전한 백신제로서, 키위 추출액을 이용하여 분해한 무독성의 클로스트리디움 디피실 독소단백질-단편, 이의 제조방법 및 용도를 제공한다. 본 발명에 따르면, 키위 추출액 속 식물성-단백질분해효소를 이용하여 클로스트리디움 디피실 독소단백질을 기질로써 분해하여 약 70 kDa 범위의 분자량을 갖는 독소단백질-단편을 제조할 수 있으며, 상기 독소단백질-단편은 무독성으로 안전하고, 이를 동물에 접종하는 경우 클로스트리디움 디피실 독소단백질을 중화시킬 수 있는 항체 생산이 가능하여 클로스트리디움 디피실 감염증 예방용 백신제로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

무독성의 클로스트리디움 디피실 독소단백질-단편 및 이의 용도 {Non-toxic Clostridium difficile toxin protein-fragments and uses thereof}

본 발명은 무독성의 클로스트리디움 디피실 독소단백질-단편 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile, CD) 세균의 독소(toxin)가 유발하는 위막성 대장염(Pseudomembranous colitis) 등의 질환을 억제하기 위한 안전한 백신제로서, 키위 추출액(식물성-단백질분해효소)을 이용하여 분해한 무독성의 클로스트리디움 디피실 독소단백질-단편, 이의 제조방법 및 용도에 관한 것이다.

클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile, CD)균이 분비하는 독소(독소 A 및 독소 B)가 위막성 대장염(Pseudomembranous colitis) 등의 원인 물질이라는 것은 이미 잘 알려져 있는 사실이다. 클로스트리디움 디피실(CD)의 독성에 의해 유발되는 위막성 대장염은 주로 병원입원과정에서 감염되어 나타나는 것으로 알려져 있다.

위막성 대장염은 항암 치료를 요하거나 장기적으로 항생제 투여를 요하는 환자에게서 발병할 경우, 치명적인 결과를 초래할 수 있다. 또한, 위막성 대장염은 항생제 사용으로 감소된 정상세균총 수가 문제가 되기도 한다. 이는 병원성 미생물인 클로스트리디움 디피실균의 성장을 억제하는 정상세균 총 수의 감소가 장염의 원인이 되기 때문이다.

일반적으로, 클로스트리디움 디피실균이 과잉 증식하면 독소를 분비하고, 분비된 독소가 대장내 상피세포를 공격하고 파괴하여 급성 장염을 유발하는 것으로 알려져 있다. 증가된 장내 상피세포 파괴는 장벽 기능 감소로 이어져 장내 물질들의 체내 침투를 허용하고 결국 급성 염증으로 발전한다.

이에, 종래 급성 장염의 직접적인 원인물질인 독소단백질을 백신제로 접종하여 항체 형성을 유도하고, 이를 통해 해당 질환을 치유하려는 시도들이 있었다. 한국 공개특허 제10-2013-0140206호 및 한국 공개특허 제10-2014-0130709호에도 위와 관련한 기술이 제시되어 있다.

또한, 최근에는 독성이 없는 독소단백질 일부를 재조합 단백질로 제작하여 백신화하려는 노력이 시도되고 있다. 하지만 독소단백질의 일부 구조만을 적용하여 백신화가 진행될 경우, 체내에 형성된 항체가 제한된 독소단백질 구조만을 인식하여 독소의 세포독성을 중화하는데 한계가 있을 수 있다.

따라서, 독소단백질의 전체 구조를 활용하면서도 세포독성을 획기적으로 낮출 수 있는 안전한 백신제 개발이 절실히 필요하다.

한국 공개특허 제10-2013-0140206호 한국 공개특허 제10-2014-0130709호

따라서, 본 발명은 독소단백질의 전체 구조를 활용하면서도 세포독성을 획기적으로 낮출 수 있는 무독성의 안전한 백신제로서, 클로스트리디움 디피실 독소단백질-단편의 제조방법을 제공하는 데에 목적이 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 무독성의 클로스트리디움 디피실 독소단백질-단편을 제공하는 데에 목적이 있다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 독소단백질-단편의 유용한 용도로서, 상기 독소단백질-단편을 유효성분으로 포함하는 클로스트리디움 디피실 감염증 예방용 백신 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 독소단백질-단편의 유용한 용도로서, 상기 독소단백질-단편을 이용하여 클로스트리디움 디피실 감염증의 예방용 또는 치료용 예방접종을 위한 백신제로 사용하는 방법을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 백신 조성물을 이용하여 클로스트리디움 디피실 세균에 대한 면역반응을 생성하는 방법을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은, 클로스트리디움 디피실 독소단백질에 대한 항체를 포함하는 혈청 제조방법, 상기 방법으로 제조된 혈청 및 상기 혈청을 유효성분으로 포함하는 클로스트리디움 디피실 감염증의 예방용 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 데에 있다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 키위 추출액 속 식물성-단백질분해해소를 이용하여 클로스트리디움 디피실 독소단백질을 분해하는 단계를 포함하는 클로스트리디움 디피실 독소단백질의 세포독성을 억제하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 키위 추출액 속 식물성-단백질분해효소를 이용하여 클로스트리디움 디피실 독소단백질을 분해하여 무독성의 클로스트리디움 디피실 독소단백질-단편을 형성한 다음, 이를 클로스트리디움 디피실 감염증의 예방접종을 위한 백신제로 사용하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 a) 클로스트리디움 디피실 독소단백질을 준비하는 단계; b) 상기 독소단백질에 키위 추출액을 처리하여 반응시키는 반응단계; 및 c) 상기 b) 단계 이후 65 ~ 75 kDa 범위의 분자량을 갖는 펩타이드를 분리하는 분리단계를 포함하는, 클로스트리디움 디피실 독소단백질-단편의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 b) 반응단계의 키위 추출액은 키위의 과육 부분을 파쇄한 다음, 파쇄물에 초음파 처리 후 원심분리하여 얻은 식물성-단백질분해효소를 포함하는 상등액을 포함한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 b) 반응단계는 35 ~ 40℃에서 20 ~ 28시간 동안 반응시킬 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 c) 분리단계에서 펩타이드 분리는 전기영동 또는 크로마토그래피를 통해 이루어질 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 무독성의 클로스트리디움 디피실 독소단백질-단편을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 단편을 유효성분으로 포함하는 클로스트리디움 디피실 감염증 예방용 백신 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 백신 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 클로스트리디움 디피실 세균에 대한 면역반응을 생성하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 1) 상기 단편에 면역증강제 및 생리식염수를 첨가하여 혼합물을 제조하는 단계; 2) 상기 혼합물을 인간을 제외한 동물에 투여하는 단계; 및 3) 투여 2일 ~ 5일 후에 채혈하고 상온에서 응고시킨 후 혈청을 분리하는 단계를 포함하는, 클로스트리디움 디피실 독소단백질에 대한 항체를 포함하는 혈청 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 2) 단계에서 투여는 1회 또는 2회일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 혈청으로서, 클로스트리디움 디피실 독소단백질에 대한 항체를 포함하는 혈청을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 혈청은 클로스트리디움 디피실 독소를 중화할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 혈청을 유효성분으로 포함하는 클로스트리디움 디피실 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 클로스트리디움 디피실 독소단백질을 기질로 하여 천연 식물성-단백질분해효소를 함유한 키위 추출액을 이용하여 분해함으로써 약 70 kDa 범위의 분자량을 갖는 독소단백질-단편을 제조할 수 있다.

또한, 본 발명에 따르면, 키위 추출액에 의해 분해되어 형성된 독소단백질-단편은 무독성으로서 안전하고, 이를 동물에 접종하는 경우 생체독성 없이 안전하게 독소단백질 인식-항체를 생성시킬 수 있음을 확인하였다. 이는 클로스트리디움 디피실 독소단백질을 중화시킬 수 있는 무독성의 안전한 항체 생산이 가능함에 따라, 클로스트리디움 디피실 감염증 예방용 백신 제조를 위한 면역원성 소재로서 유용하게 사용될 수 있다.

부가적으로, 본 발명에 따르면, 독소단백질의 분해 및 이를 통한 무독성의 독소단백질-단편을 제조함에 있어, 가격이 저렴하고도 소재 확보가 용이한 키위 추출액을 이용함으로 인해, 상업적으로 유용하고 실용화가 높은 효과를 갖는다.

도 1은 클로스트리디움 디피실 독소단백질에 키위 추출액을 처리한 후 분해된 독소단백질을 톡신A-특이 항체를 이용한 웨스턴 블랏 분석을 통해 분자량별로 확인한 결과로서, 이는 키위 추출액에 함유된 식물성-단백질분해효소가 클로스트리디움 디피실 배양상등액 내의 독소단백질을 기질로 인식하고 분해할 수 있음을 보여준다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 클로스트리디움 디피실 독소단백질-단편을 생쥐에 접종한 후 생쥐의 생존 여부를 확인한 결과로서, 이는 키위 추출액 속 식물성-단백질분해효소에 의해 분해 후 형성된 독소단백질-단편이 동물에 대해 독성이 없으며 예방접종의 백신제로 안전하게 사용 가능함을 보여준다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 클로스트리디움 디피실 독소단백질-단편을 생쥐에 접종하여 얻은 혈청에서 항체 형성 여부를 웨스턴 블랏 분석을 통해 확인한 결과로서, 이는 독소단백질-단편의 접종에 의해 생쥐에서 생성된 항체들이 온전한 독소단백질과 강하게 결합할 수 있음을 보여준다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 클로스트리디움 디피실 독소단백질-단편을 생쥐에 접종하여 얻은 혈청을 온전한 구조의 독소단백질과 함께 인간 대장상피세포에 처리한 후, 대장상피세포의 모양변화를 관찰하여 독성여부를 평가한 결과로서, 이는 독소단백질-단편의 접종으로 생성된 항체들이 온전한 구조의 독소단백질이 야기하는 세포독성(독소단백질에 의해 유발되는 전형적인 세포-원형화 독성)을 차단하는 중화기능이 있음을 보여준다.

클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile, CD)은 인간에서 위장관 질환과 연관되는 그람-양성 혐기성 박테리아로서, 이는 주요 병독성 인자인 독소 A 및 독소 B (각각 308 및 270 kDa)의 분비를 통해 항생제-연관 설사 및 위막성 대장염을 일으킬 수 있다. 독소 A 및 독소 B는 19 kb 병원성 유전자좌 (PaLoc) 내에서 각각 유전자 tcdA 및 tcdB에 의해 코딩된다.

본 발명자들은, 키위 추출액 속 식물성-단백질분해효소가 위와 같은 클로스트리디움 디피실 독소단백질을 분해하여 독소단백질-단편을 형성하고, 이를 통해 형성된 독소단백질-단편은 무독성으로서 클로스트리디움 디피실 독소단백질의 세포독성을 낮추어 안전한 백신제로 작용함을 알게 되어 본 발명을 완성하였다.

구체적으로, 본 발명자들은 키위 추출액의 단백질분해 효소 활성을 이용하여 약 70 kDa 크기를 갖는 클로스트리디움 디피실 독소단백질-단편을 제조하였으며, 상기 클로스트리디움 디피실 독소단백질-단편은 독성이 없고(무독성), 이를 동물에 접종하는 경우 클로스트리디움 디피실 독소단백질을 중화시킬 수 있는 항체 생산이 가능함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

한편, 본 발명자들은 키위 추출액 이외에 드릅나무의 잎과 뿌리 추출액, 소나무의 잎과 뿌리 추출액, 느티나무의 잎과 뿌리의 추출액 등과 같은 여러 가지 과실(과욕)과 나무의 잎과 뿌리를 이용하여 클로스트리디움 디피실 독소단백질 분해물을 제조하였으나, 이들 단백질 분해물은 모두 세포독성(쥐에 투여하는 경우 생존하지 못함)을 가짐을 알 수 있었다. 반면에, 특이하게도 키위 추출액에서만 세포독성이 없는 것을 확인할 수 있었다.

위와 같은 견지에 기초하여, 본 발명은 제1형태에 따라서, 키위 추출액의 신규한 용도로서, 키위 추출액을 이용하여 클로스트리디움 디피실 독소단백질을 분해하는 단계를 포함하는 클로스트리디움 디피실 독소단백질의 세포독성을 억제하는 방법을 제공한다.

본 발명은 제2형태에 따라서, 키위 추출액을 이용하여 클로스트리디움 디피실 독소단백질을 분해하여 무독성의 클로스트리디움 디피실 독소단백질-단편을 형성한 다음, 상기 무독성의 클로스트리디움 디피실 독소단백질-단편을 클로스트리디움 디피실 감염증의 예방접종을 위한 백신제로 사용하는 방법을 제공한다.

본 발명은 제3형태에 따라서, 키위 추출액을 이용한 클로스트리디움 디피실 독소단백질-단편의 제조방법을 제공한다. 상기 클로스트리디움 디피실 독소단백질-단편은 클로스트리디움 디피실 감염증을 예방할 수 있는 면역원성 항원으로 작용할 수 있다.

하나의 실시형태에 따라서, 본 발명에 따른 클로스트리디움 디피실 독소단백질-단편의 제조방법은 a) 독소단백질을 준비하는 단계; b) 상기 독소단백질에 키위 추출액을 처리하여 반응시키는 반응단계; 및 c) 상기 b) 반응단계 이후 65 ~ 75 kDa 범위의 분자량을 갖는 펩타이드를 분리하는 분리단계를 포함할 수 있다.

상기 a) 단계는 클로스트리디움 디피실 독소단백질을 준비하는 단계로서, 이는 특별히 제한되지 않는다. 상기 a) 단계에서, 클로스트리디움 디피실 독소단백질은 클로스트리디움 디피실 균주를 직접 배양하여 얻을 수 있고, 이는 또한 상업적으로 판매되는 독소단백질을 구매하여 준비할 수 있다.

본 발명의 일구체예에서, 상기 독소단백질은 클로스트리디움 디피실 독소 A 및/또는 클로스트리디움 디피실 독소 B일 수 있으며, 바람직하게는 클로스트리디움 디피실 독소 A일 수 있다.

클로스트리디움 디피실 독소 A는 308 kDa을 갖는 단백질로서, 전장 2710 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있다.

클로스트리디움 디피실 독소 A는 예를 들어, GenBank 등록번호(Accession number) AAA23283.1, AGG91568.1, AGG91566.1, AGG91565.1, AGG91563.1, AGG91561.1, AGG91560.1, AGG91559.1, AGG91558.1, AGG91557.1, AGG91556.1, AGG91553.1, AGG91552.1, AGG91551.1, AGG91549.1, AGG91548.1, AGG91547.1, AGG91546.1, AGG91545.1, AGG91544.1, AGG91543.1, AGG91542.1, AGG91541.1, AGG91540.1, AGG91539.1, AGG91538.1, AGG91537.1, AGG91536.1, AGG91535.1, AGG91533.1, AGG91532.1, AGG91530.1, AGG91528.1, AGG91527.1, AGG91526.1, AGG91522.1, AGG91521.1, AGG91519.1, AGG91518.1, AGG91517.1, AGG91515.1, AGG91513.1, AGG91512.1, AGG91511.1, AGG91508.1, AGG91507.1, AGG91505.1, AGG91504.1, AGG91503.1 및 ARE61564.1 등을 예시할 수 있으나, 이에 의해 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일구체예에서, 클로스트리디움 디피실 독소 A는 서열번호 1(GenBank: AGG91568.1)의 아미노산 서열, 또는 이와 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "상동성"은 주어진 폴리펩티드 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 폴리펩티드 서열과 동일하거나 유사한 활성을 갖는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 상기 상동성은 예를 들면, 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 예를 들어 BLAST 2.0을 이용하거나, 정의된 엄격한 조건하에서 썼던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 당업자에게 잘 알려진 방법으로 결정될 수 있다.

본 발명의 b) 반응단계는 독소단백질에 키위 추출액을 처리하여 반응시키는 단계로서, 자세하게는 상기 a) 단계에서 준비된 클로스트리디움 디피실 독소단백질에 키위 추출액을 처리(예, 혼합)하여, 예를 들어 35 ~ 40℃에서 20 ~ 28시간 동안 반응시키는 방법으로 진행될 수 있다.

본 발명의 b) 반응단계에서 키위 추출액은 천연 단백질 분해효소를 포함하고 있으며, 이러한 키위 추출액으로 처리하는 경우 키위 속 식물성-단백질분해효소가 클로스트리디움 디피실 독소단백질을 가수분해할 수 있다.

본 발명의 일구체예에서, 상기 키위 추출액은 키위의 과육 파쇄물을 원심분리하여 얻은 상등액을 포함한다. 구체적인 예를 들어, 상기 b) 반응단계에서 키위 추출액은 키위의 과육 부분(껍질 제거)을 파쇄한 다음, 파쇄물에 초음파 처리 후 원심분리하여 상등액만을 분리하는 과정을 통해 제조될 수 있다.

본 발명의 c) 분리단계는 키위 추출액으로 가수분해된 독소단백질의 단편을 분리하는 단계로서, 자세하게는 상기 b) 반응단계를 통해 수득한 반응물에서 65 ~ 75 kDa 범위의 분자량을 갖는 펩타이드를 분리하는 단계이다.

본 발명의 c) 분리단계에서 펩타이드 분리는 전기영동 또는 크로마토그래피를 통해 이루어질 수 있으나, 이는 펩타이드를 분리할 수 있는 방법이라면 특별히 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 클로스트리디움 디피실 독소단백질-단편을 제공한다.

본 발명의 상기 단편은 독소 활성이 없으므로(무독성) 클로스트리디움 디피실 감염증을 예방할 수 있는 면역원성 항원으로서 안전하게 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 단편을 포함하는 클로스트리디움 디피실 감염증 예방용 백신 조성물(또는 면역원성 조성물)을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "백신"은 개체에 면역을 주는 항원을 함유한 생물학적인 제제로서, 감염증의 예방을 위하여 사람이나 동물에 주사하거나 경구 투여함으로써 생체에 면역이 생기게 하는 면역원 또는 항원성 물질을 말한다.

본 발명의 백신 조성물은 수의학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 용어, "수의학적으로 허용 가능한 담체"란 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항원보강제, 안정제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장성 작용제, 흡착지연제 등을 포함한다. 백신 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 희석제로는 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 글리세린, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 본 발명의 백신용 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다.

상기 백신 조성물은 다양한 형태로 개체에 주입될 수 있다. "주입"은 피하주사, 근육내 주사, 피하내 주사, 복막내 주사, 비강투여, 구강투여, 경피투여 및 경구투여로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 방법으로 수행될 수 있다.

상기 백신 조성물은 면역반응을 개선 또는 강화시키기 위하여 하나 이상의 보조제 등을 포함할 수 있다. 적절한 보조제에는 펩티드, 알루미늄 하이드록시드, 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 옥시드 및 Marcol 52 같은 미네랄 오일 또는 식물성 오일 및 하나 이상의 유화제로 구성된 조성물 또는 리졸세시틴, 다가 양이온, 다가 음이온 같은 표면 활성물질 등이 포함된다.

또한, 본 발명은 상기 백신 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 클로스트리디움 디피실 세균에 대한 면역반응을 생성하는 방법 또는 클로스트리디움 디피실 세균에 대한 예방접종 방법을 제공한다.

상기 면역반응 생성 방법에서 상기 백신 조성물은 달리 언급하지 않는 한 상기한 바와 같다.

본 발명에서 사용되는 용어 "면역 반응"은 항원의 도입에 대한 반응으로의 숙주의 면역계, 예를 들어 포유동물의 면역계의 활성화를 의미한다. 면역 반응은 세포 반응 또는 체액 반응, 또는 둘 모두의 형태일 수 있다.

상기 면역반응 생성 방법에서, 본 발명의 백신 조성물은 효과량의 유효성분, 즉, 클로스트리디움 디피실 독소단백질-단편을 약학적으로 허용가능한 담체 및 보조제와 함께 포함할 수 있다. 상기 개체는 동물일 수 있으며, 바람직하게 인간일 수 있다. 용어 "효과량"은 백신의 성분이 백신접종되는 동물에서 클로스트리디움 디피실 독소단백질에 대해 특이적 면역 반응을 유도하기에 충분한 양임을 의미한다. 효과량은 당 분야의 숙련자에 의해 쉽게 결정될 수 있고, 예를 들면 동물에서의 통상적인 실험을 통해 결정될 수 있다.

또한, 본 발명은 1) 클로스트리디움 디피실 독소단백질-단편에 면역증강제 및 생리식염수를 첨가하여 혼합물을 제조하는 단계; 2) 상기 혼합물을 인간을 제외한 동물에 투여하는 단계; 및 3) 투여 2일 ~ 5일 후에 채혈하고 상온에서 응고시킨 후 혈청을 분리하는 단계를 포함하는, 클로스트리디움 디피실 독소단백질에 대한 항체 또는 상기 항체를 포함하는 혈청 제조방법을 제공한다.

본 발명의 상기 1) 단계는 항원이 되는 클로스트리디움 디피실 독소단백질-단편과 면역증강제 및 생리식염수를 첨가하여 혼합하는 단계이다.

상기 면역증강제는 독소단백질-단편에 대한 면역 반응을 증가시키기 위한 것으로서, 이는 면역 증강 및/또는 보조적(Adjuvant) 기능을 가지는 임의의 화합물들로부터 선택될 수 있다. 면역증강제는, 예를 들어 명반, 인산알루미늄, 암모늄 수산화물, MF59(4.3% w/v 스쿠알렌, 0.5% w/v 폴리소르베이트 80(Tween 80), 0.5% w/v 소르비탄 트리올리에이트(Span 85)), CpG-내포 핵산, QS21(사포닌 어쥬번트), MPL(모노포스포릴 지질 A), 3DMPL(3-O-탈아실화된 MPL), 아퀼라(Aquilla)로부터 추출물, ISCOMS(예로서, Sjolander et al. (1998) J. Leukocyte Biol. 64:713; WO90/03184; W096/11711; WO 00/48630; W098/36772; WO00/41720; WO06/134423과 WO07/026190 참조), LT/CT 돌연변이체, 폴리(D,L-락티드-코-글리콜리드)(PLG) 마이크로입자, Quil A, 인터류킨, 프레운드, N-아세틸-무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민(thr-MDP), N-아세틸-노르-무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민(CGP 11637, 노르-MDP로 지칭됨), N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'-2'-딥-알미토일-sn-글리세로-3-히드록시포스포릴옥시)-에틸아민(CGP 19835A, MTP-PE로 지칭됨), 그리고 2% 스쿠알렌/Tween 80 에멀젼에서 박테리아로부터 추출된 3가지 성분, 모노포스포릴 지질 A, 트레할로스 디미콜레이트 및 세포벽 골격을 내포하는 RIBI(MPL+TDM+CWS) 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 2) 단계는 상기 1) 단계를 통해 준비된 혼합물(또는 백신 조성물)을 개체에게 투여하는 단계로서, 상기 투여는 1회, 2회 또는 수회 투여일 수 있다.

투여대상이 되는 개체는 임의의 동물, 예를 들면, 토끼, 생쥐, 랫트, 햄스터, 염소, 말, 원숭이, 비비 및 인간 등일 수 있으나, 특별히 그 종류를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 하기 실시예에서는 클로스트리디움 디피실 독소단백질-단편에 면역증강제 및 생리식염수를 첨가한 혼합물을 수컷 생쥐에 1차 접종하고 15일 후에 다시 2차 접종함으로써 항체생성량을 극대화시켰다.

본 발명의 상기 3) 단계는 항체가 형성된 혈청을 분리하는 단계로서, 자세하게는 혼합물(또는 백신 조성물) 투여 2일 ~ 5일 후에 채혈한 다음, 상온에서 응고시킨 후 혈청만을 분리하는 단계이다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 클로스트리디움 디피실 독소단백질에 대한 항체 또는 상기 항체를 포함하는 혈청을 제공한다.

본 발명의 혈청은 클로스트리디움 디피실 독소단백질에 대한 항체를 포함하고 있으므로, 상기 혈청은 클로스트리디움 디피실 독소를 효과적으로 중화시킬 수 있다.

본 발명의 항체 또는 항체를 포함하는 혈청은 포유류 개체에게 운반을 위한 조성물로 제형화될 수 있다. 상기 조성물은 단독으로 투여되거나, 약제학적으로 수용 가능한 비이클 또는 부형제와 함께 혼합되어 투여될 수 있다. 비이클은, 예를 들어 물, 염수, 덱스트로즈, 글리세롤, 에탄올 및 이의 조합으로부터 선택될 수 있다. 또한, 비이클은 가습 또는 유화 물질들, pH 완충 물질들, 또는 아쥬반트(Adjuvant)와 같은 소량의 보조 물질들을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 항체 또는 항체를 포함하는 혈청을 유효성분으로 포함하는 클로스트리디움 디피실 감염증(예를 들어, 위막성 대장염)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 약학적 조성물은 액체 용액 또는 현탁액과 같은 주사 가능한, 또는 주사에 앞서 액체 비이클에 용액 또는 현탁액으로 적합한 고체형태로 준비될 수 있다. 약학적 조성물은 고체형태, 유화된 형태 또는 리포좀 비이클 또는 지연 운반에 이용되는 기타 미립자 운반체들에 포집된 활성 성분으로 준비될 수 있다. 약학적 조성물은, 예를 들어 오일 유액(emulsion), 유중수 유액, 수중유수(물-in-oil-in-물) 유액, 부위-특이적 유액, 장기-체류 유액, 점성 유액, 마이크로유액, 나노유액, 리포좀, 극미립자, 미소구(microsphere), 나노구(nanosphere) 및 나노입자 등의 형태를 가질 수 있다.

상기 약학적 조성물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에게 투여함으로써, 개체의 클로스트리듐 디피실균 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 약학적 조성물의 투여 경로는 정맥내, 근육내, 피하, 경구, 국소, 피하, 피내(intradermal), 경피, 장관외, 직장, 척추 또는 상피 투여를 포함할 수 있으나, 이에 의해 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 실시예를 예시한다. 이하의 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위해 제공되는 것일 뿐, 본 발명의 기술적 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

키위 추출액의 처리에 따른 클로스트리디움 디피실 독소단백질 분해

본 실험에서는 키위 추출액 속 단백질분해효소들이 클로스트리디움 디피실 독소단백질을 기질로 인식하여 분해할 수 있는지 확인해 보고자 하였다.

<1-1> 식물 추출액 제조

키위 추출액의 분리과정은 다음과 같다.

골드키위(뉴질랜드산)를 구매하고 껍질 부분을 제거하고 과육 0.5 g(약 0.5 ㎤) 부분만을 막자(pestle)로 갈고, 열발생으로 식물성-단백질분해효소가 불활성화되는 것을 막아주기 위해 30초씩 2번으로 나누어 초음파 파쇄를 추가 수행한 뒤 저온에서 12,000 rpm에서 15분 동안 원심분리하여 식물성-단백질분해효소가 포함된 상등액만을 분리하였다.

두릅 추출액의 분리과정은 다음과 같다.

채집한 두릅의 잎 20 g을 막자사발에 넣고 증류수 100 ml 속에서 갈아주었다. 초음파 파쇄를 추가로 수행하여 완전히 파쇄하였다. 열발생으로 식물성-단백질분해효소가 불활성화되는 것을 막아주기 위해 30초씩 2번으로 나누어 실시하였다. 그 후 저온에서 12,000 rpm에서 15분 동안 원심분리하여 식물성-단백질분해효소가 포함된 상등액만을 분리하였다. 효소의 불활성화를 최소화 하기 위해, 동결건조를 통해 최초 추출액 농도를 10배로 농축한 다음, 실험에 이용하였다.

<1-2> 클로스트리디움 디피실 독소단백질 분리

독소단백질 분리를 위해, Clostridium difficile(VPI10463, American Type Culture Collection, USA)을 meat broth에서 혐기조건에서 7일간 배양하였다. 12000 rpm으로 원심분리하여 독소가 포함된 상등액만을 분리한 다음 0.22 ㎛ 주사기필터를 이용하여 남아있는 세균을 완전 제거하였다. 그 다음, cutoff membrane column을 이용하여 독소단백질을 10배 이상 농축하여 실험에 사용하였다. 일반적으로 클로스트리디움 디피실 세균으로부터 독소 A(enterotoxin)와 독소 B(cytotoxin)가 분비된다고 잘 알려져 있다. 따라서 농축을 끝낸 상등액에는 독소 A (300 kDa)와 독소 B(270 kDa)가 포함되어 있다.

<1-3> 클로스트리디움 디피실 독소단백질 분해 유도

상기 실시예 <1-1>을 통해 제조된 키위 추출액 10 ul를 상기 실시예 <1-2>를 통해 분리된 CD균 배양상등액 독소단백질(독소 A와 독소 B) 10 ul와 혼합하여 37

에서 24시간 동안 반응하여 독소단백질 분해를 유도하였다. 그 후 반응용액 속 독소단백질의 분해 여부를 확인하기 위하여 독소 A-항체를 이용하여 웨스턴 블랏 분석을 실시하였다.

이를 위해 5% 폴리아크릴아마이드 젤을 제작한 뒤 반응용액을 로딩하고 러닝 버퍼(running buffer)에서 60V 90분간 전기하였다. 트랜스 버퍼(transfer buffer)에서 120V로 약 2시간 동안 단백질을 멤브레인으로 옮겨준 후 2.5% 스킴 밀크(skim milk)에 독소 A 항체(creative diagnostics사)를 1000:1로 넣어주고 4℃에서 밤새 반응하였다. 그 후 TBST로 5분씩 3회 수세하고 2차 항체(santa cruz biotechnology사)를 넣어주어 상온에서 1시간동안 반응하였다. 발색용액에 멤브레인을 반응시킨 후 chemiluminescence image analyzer로 단백질 변화를 검출하였다.

그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 무처리군은 300 kDa인 독소단백질(독소 A)은 온전한 크기 그대로 300 kDa 근처에서 관찰되지만 키위 추출액을 처리한 독소단백질은 70 kDa 부근에 여러 개의 다른 크기로 분산되어 검출되었다. 상기 절단 단백질들이 독소 A 특이 항체에 의해 검출되었기 때문에 독소 A 단편으로 규정될 수 있다. 상기와 같은 결과는 키위 추출액 속 단백질분해효소가 클로스트리디움 디피실 독소 A 단백질을 기질로 인지한 후 분해할 수 있음을 보여주는 것이다.

상기 실험 결과를 통해 수득한 약 70 kDa의 독소 A-단편을 하기 실험에서 사용하였다.

<실시예 2>

독소 A-단편의 세포독성 평가

본 실험에서는 상기 실시예 <1-3>에서 수득한 독소 A-단편의 세포독성 여부를 확인하였다.

본 실험은 6주령의 수컷 생쥐를 이용하였으며, 생쥐의 등쪽에 피하주사한 후 생쥐들의 생존 여부를 확인하였다. ICR 생쥐(바이오링크, 충북 음성군, 한국)를 구입하여 실험동물실에 1 주일간 적응시키고, 임의로 각 군당 6 마리씩 구성하였다. 실험군으로 상기 실시예 <1-3>에서 수득한 독소단백질-단편을 투여하였고, 음성대조군으로는 생리식염수만을 투여하였으며, 온전한 독소단백질만을 10 ul 투여 군을 양성대조군으로 사용하였다. 그리고 키위 추출액의 효능을 두릅 추출액과 비교하기 위해, 실시예 <1-1>을 통해 제조된 두릅 추출액 10 ul를 실시예 <1-2>를 통해 분리한 온전한 독소단백질 10 ul와 혼합하고 37℃에서 24시간 동안 반응한 후 생쥐에 주입하였다. 상기 생쥐들은 사료와 물을 제한 없이 자유 공급하였으며, 온도는 22±2 ℃, 습도는 50±10 %를 유지시키고, 명암은 12 시간을 주기(09:00 ~ 21:00)로 조절하였다.

그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 온전한 독소단백질만을 주입한 생쥐는 6시간 이내에 모두 죽었다. 두릅 추출액과 온전한 독소단백질을 섞고 24시간 반응 후 주입시킨 생쥐들도 모두 죽었다. 하지만 키위 추출액으로 분해시켜 생성한 독소단백질-단편을 주입한 생쥐들은 모두 생존하는 것을 확인하였다. 이는 키위 속 단백질분해효소에 의해 분해된 독소단백질-단편이 세포독성을 완전히 잃어버린다는 사실을 보여준다.

<실시예 3>

독소 A-단편의 접종에 따른 항체 형성 여부 확인

상기 실험을 통해 키위 추출액 속 단백질분해효소가 독소단백질을 분해할 수 있으며 이로 인해 세포독성 효과가 사라짐을 확인하였다. 이에, 본 실험에서는 상기 실시예 <1-3>에서 수득한 독소 A-단편을 생쥐(ICR)에 접종하여 항체를 형성시킨 후, 형성된 항체가 온전한 구조의 독소단백질과 결합하는지를 조사하였다. 항체형성 여부와 온전한 독소단백질에 대한 결합여부는 웨스턴 블랏 분석을 통해 확인하였다.

먼저, 항체형성 유도를 위해, 상기 실시예 <1-3>에서 수득한 독소 A-단편(20 ul)에 면역증진제(Freund's Adjuvant, Sigma-Aldrich사) 150 ul와 생리식염수 180 ul를 넣어 섞어 주고 6주령 수컷 생쥐(ICR)에게 주입하였다. 각 그룹 당 생쥐 6마리씩 이용하였으며 인슐린주사기를 이용하여 생쥐 등 6곳에 주사하였다. 항체 생성량을 극대화시켜주기 위해서 15일 후 상기 방법으로 2차 접종을 동일하게 실시하였다. 그리고 3일 후 생쥐 경동맥에서 채혈하고 상온에서 5분간 응고시킨 뒤, 원심분리(12000 rpm) 실시 후 상등액만 취하여 혈청만을 분리하였다. 분리한 혈청을 이용하여 웨스턴 블랏 분석을 실시하였다. 이때 검출을 목적으로 사용한 독소 A는 C. difficile 세균에서 분리한 온전한 독소단백질을 그대로 사용하였다.

그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 독소 A 항체(creative diagnostics사)를 반응시킨 조건에서 온전한 독소단백질 크기인 300 kDa 부근에서 단백질 띠가 검출되었다. 한편, 생쥐에게 독소 A-단편 접종 후 생성된 혈청도 온전한 구조의 독소단백질을 검출할 수 있음을 확인하였다(동일한 위치의 단백질 띠로 톡신A임을 추정할 수 있음). 이 결과는 상기 실시예 <1-3>에서 수득한 독소 A-단편이 항원으로 작용하여 체내 항체 생성을 잘 유도할 뿐만 아니라, 이렇게 형성된 항체가 온전한 독소단백질의 다양한 구조도 잘 인식하여 결합할 수 있음을 보여준다. 각각의 생쥐에서 분리한 혈청을 동일한 조건으로 희석하여 반응(1000:1)했음에도 불구하고 독소단백질 검출 정도가 다르게 확인되었는데, 이는 독소 A-단편 접종 후 생성되는 항체의 양이 생쥐 별로 달라서 나타난 결과로 해석된다.

<실시예 4>

독소 A-단편 접종 후 생성된 혈청 속 항체의 독성 중화 효능

본 실험에서는 상기 실시예 <1-3>에서 수득한 독소 A-단편을 접종하여 생성시킨 항체들이 온전한 독소단백질의 세포독성을 실제로 억제하는 효능이 있는지를 확인해보고자 하였다.

이를 확인하기 위해 인간 대장상피세포인 HT29세포를 배양하였다. HT-29 세포는 McCoy’s 5A 배지, 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신이 포함되어 있는 배양액을 사용하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 12 웰 플레이트에서 90% 밀집도를 보이도록 세포를 준비한 뒤 실험에 이용하였다. 온전한 독소단백질 10 ul와 개별 생쥐로부터 분리한 혈청 10 ul를 섞어서 상온에서 1시간 동안 항원/항체 반응을 유도하였다. 그 후 세포에 처치하고 12시간 동안 배양하였다. 양성대조군은 온전한 독소단백질과 일반 생쥐 혈청을 반응하여 비교 실험하였다.

그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에서, (a)는 증류수만을 처리한 음성대조군의 결과이고, (b)는 독소단백질에 일반 생쥐혈청을 처리한 양성대조군의 결과이며, (c)는 본 발명의 실시예에 따라 독소단백질에 독소단백질-단편접종-유래 항체를 처리한 결과이다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 증류수만 처치한 대조군에서 전형적인 대장상피세포의 모양이 관찰되었다. 세포 간 강한 결합으로 개별 세포의 형태가 명확하게 구분되지 않으며, 넓게 펼쳐진 인간대장상피세포의 모양이 확인되었다. 그러나, 온전한 독소단백질과 일반 생쥐혈청을 반응시킨 세포에서는 동그랗게 변형되는 세포원형화(cell rounding)가 나타났다. 반면에, 상기 실시예 <1-3>에서 수득한 독소 A-단편을 접종 후 분리한 혈청과 온전한 독소단백질을 반응시킨 다음 세포에 처치한 경우, 세포원형화가 전혀 나타나지 않음을 확인하였다. 이는 본 발명의 독소 A-단편 접종을 통해 생성된 항체들이 온전한 구조를 가지는 독소단백질에 결합하여 세포독성을 유의하게 억제할 수 있음을 보여준다.

이상의 실험예를 통해 확인되는 바와 같이, 본 발명에 따르면, 급성 위막성대장염의 원인물질로 알려져 있는 클로스트리디움 디피실 독소단백질을 저렴한 가격의 키위 추출액을 이용하여 무독성의 독소단백질-단편으로 분해할 수 있음을 알 수 있으며, 이를 통해 형성된 독소단백질-단편은 안전하게 사용할 수 있는 새로운 백신제로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

상기 실험예(실시예)에서는 독소단백질을 소량의 키위 추출액으로 독소단백질-단편으로 분해할 수 있음을 보여주고 있다. 그리고 분해된 독소단백질-단편은 완전하게 세포독성을 잃어버린다는 사실도 보여주고 있다. 또한, 독소단백질의 일부 서열만을 이용하는 방식이 아닌, 전체 독소단백질의 서열을 포함하지만 키위 추출액에 의해 절단되어 독성을 잃어버리게 됨으로써 온전한 독소단백질을 접종했을 때와 유사한 항체 형성을 유도할 수 있음을 알 수 있다. 특히, 독소단백질-단편을 접종으로 생성시킨 항체들이 온전한 독소단백질의 세포독성을 중화시키는 기능이 매우 강함을 확인할 수 있다.

<110> Daejin University Center for Educational Industrial Cooperation <120> Non-toxic Clostridium difficile toxin protein-fragments and uses thereof <130> 0001 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2710 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 1 Met Ser Leu Ile Ser Lys Glu Glu Leu Ile Lys Leu Ala Tyr Ser Ile 1 5 10 15 Arg Pro Arg Glu Asn Glu Tyr Lys Thr Ile Leu Thr Asn Leu Asp Glu 20 25 30 Tyr Asn Lys Leu Thr Thr Asn Asn Asn Glu Asn Lys Tyr Leu Gln Leu 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asp Val Phe Met Asn Lys Tyr Lys Thr 50 55 60 Ser Ser Arg Asn Arg Ala Leu Ser Asn Leu Lys Lys Asp Ile Leu Lys 65 70 75 80 Glu Val Ile Leu Ile Lys Asn Ser Asn Thr Ser Pro Val Glu Lys Asn 85 90 95 Leu His Phe Val Trp Ile Gly Gly Glu Val Ser Asp Ile Ala Leu Glu 100 105 110 Tyr Ile Lys Gln Trp Ala Asp Ile Asn Ala Glu Tyr Asn Ile Lys Leu 115 120 125 Trp Tyr Asp Ser Glu Ala Phe Leu Val Asn Thr Leu Lys Lys Ala Ile 130 135 140 Val Glu Ser Ser Thr Thr Glu Ala Leu Gln Leu Leu Glu Glu Glu Ile 145 150 155 160 Gln Asn Pro Gln Phe Asp Asn Met Lys Phe Tyr Lys Lys Arg Met Glu 165 170 175 Phe Ile Tyr Asp Arg Gln Lys Arg Phe Ile Asn Tyr Tyr Lys Ser Gln 180 185 190 Ile Asn Lys Pro Thr Val Pro Thr Ile Asp Asp Ile Ile Lys Ser His 195 200 205 Leu Val Ser Glu Tyr Asn Arg Asp Glu Thr Val Leu Glu Ser Tyr Arg 210 215 220 Thr Asn Ser Leu Arg Lys Ile Asn Ser Asn His Gly Ile Asp Ile Arg 225 230 235 240 Ala Asn Ser Leu Phe Thr Glu Gln Glu Leu Leu Asn Ile Tyr Ser Gln 245 250 255 Glu Leu Leu Asn Arg Gly Asn Leu Ala Ala Ala Ser Asp Ile Val Arg 260 265 270 Leu Leu Ala Leu Lys Asn Phe Gly Gly Val Tyr Leu Asp Val Asp Met 275 280 285 Leu Pro Gly Ile His Ser Asp Leu Phe Lys Thr Ile Ser Arg Pro Ser 290 295 300 Ser Ile Gly Leu Asp Arg Trp Glu Met Ile Lys Leu Glu Ala Ile Met 305 310 315 320 Lys Tyr Lys Lys Tyr Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Glu Asn Phe Asp Lys 325 330 335 Leu Asp Gln Gln Leu Lys Asp Asn Phe Lys Leu Ile Ile Glu Ser Lys 340 345 350 Ser Glu Lys Ser Glu Ile Phe Ser Lys Leu Glu Asn Leu Asn Val Ser 355 360 365 Asp Leu Glu Ile Lys Ile Ala Phe Ala Leu Gly Ser Val Ile Asn Gln 370 375 380 Ala Leu Ile Ser Lys Gln Gly Ser Tyr Leu Thr Asn Leu Val Ile Glu 385 390 395 400 Gln Val Lys Asn Arg Tyr Gln Phe Leu Asn Gln His Leu Asn Pro Ala 405 410 415 Ile Glu Ser Asp Asn Asn Phe Thr Asp Thr Thr Lys Ile Phe His Asp 420 425 430 Ser Leu Phe Asn Ser Ala Thr Ala Glu Asn Ser Met Phe Leu Thr Lys 435 440 445 Ile Ala Pro Tyr Leu Gln Val Gly Phe Met Pro Glu Ala Arg Ser Thr 450 455 460 Ile Ser Leu Ser Gly Pro Gly Ala Tyr Ala Ser Ala Tyr Tyr Asp Phe 465 470 475 480 Ile Asn Leu Gln Glu Asn Thr Ile Glu Lys Thr Leu Lys Ala Ser Asp 485 490 495 Leu Ile Glu Phe Lys Phe Pro Glu Asn Asn Leu Ser Gln Leu Thr Glu 500 505 510 Gln Glu Ile Asn Ser Leu Trp Ser Phe Asp Gln Ala Ser Ala Lys Tyr 515 520 525 Gln Phe Glu Lys Tyr Val Arg Asp Tyr Thr Gly Gly Ser Leu Ser Glu 530 535 540 Asp Asn Gly Val Asp Phe Asn Lys Asn Thr Ala Leu Asp Lys Asn Tyr 545 550 555 560 Leu Leu Asn Asn Lys Ile Pro Ser Asn Asn Val Glu Glu Ala Gly Ser 565 570 575 Lys Asn Tyr Val His Tyr Ile Ile Gln Leu Gln Gly Asp Asp Ile Ser 580 585 590 Tyr Glu Ala Thr Cys Asn Leu Phe Ser Lys Asn Pro Lys Asn Ser Ile 595 600 605 Ile Ile Gln Arg Asn Met Asn Glu Ser Ala Lys Ser Tyr Phe Leu Ser 610 615 620 Asp Asp Gly Glu Ser Ile Leu Glu Leu Asn Lys Tyr Arg Ile Pro Glu 625 630 635 640 Arg Leu Lys Asn Lys Glu Lys Val Lys Val Thr Phe Ile Gly His Gly 645 650 655 Lys Asp Glu Phe Asn Thr Ser Glu Phe Ala Arg Leu Ser Val Asp Ser 660 665 670 Leu Ser Asn Glu Ile Ser Ser Phe Leu Asp Thr Ile Lys Leu Asp Ile 675 680 685 Ser Pro Lys Asn Val Glu Val Asn Leu Leu Gly Cys Asn Met Phe Ser 690 695 700 Tyr Asp Phe Asn Val Glu Glu Thr Tyr Pro Gly Lys Leu Leu Leu Ser 705 710 715 720 Ile Met Asp Lys Ile Thr Ser Thr Leu Pro Asp Val Asn Lys Asn Ser 725 730 735 Ile Thr Ile Gly Ala Asn Gln Tyr Glu Val Arg Ile Asn Ser Glu Gly 740 745 750 Arg Lys Glu Leu Leu Ala His Ser Gly Lys Trp Ile Asn Lys Glu Glu 755 760 765 Ala Ile Met Ser Asp Leu Ser Ser Lys Glu Tyr Ile Phe Phe Asp Ser 770 775 780 Ile Asp Asn Lys Leu Lys Ala Lys Ser Lys Asn Ile Pro Gly Leu Ala 785 790 795 800 Ser Ile Ser Glu Asp Ile Lys Thr Leu Leu Leu Asp Ala Ser Val Ser 805 810 815 Pro Asp Thr Lys Phe Ile Leu Asn Asn Leu Lys Leu Asn Ile Glu Ser 820 825 830 Ser Ile Gly Asp Tyr Ile Tyr Tyr Glu Lys Leu Glu Pro Val Lys Asn 835 840 845 Ile Ile His Asn Ser Ile Asp Asp Leu Ile Asp Glu Phe Asn Leu Leu 850 855 860 Glu Asn Val Ser Asp Glu Leu Tyr Glu Leu Lys Lys Leu Asn Asn Leu 865 870 875 880 Asp Glu Lys Tyr Leu Ile Ser Phe Glu Asp Ile Ser Lys Asn Asn Ser 885 890 895 Thr Tyr Ser Val Arg Phe Ile Asn Lys Ser Asn Gly Glu Ser Val Tyr 900 905 910 Val Glu Thr Glu Lys Glu Ile Phe Ser Lys Tyr Ser Glu His Ile Thr 915 920 925 Lys Glu Ile Ser Thr Ile Lys Asn Ser Ile Ile Thr Asp Val Asn Gly 930 935 940 Asn Leu Leu Asp Asn Ile Gln Leu Asp His Thr Ser Gln Val Asn Thr 945 950 955 960 Leu Asn Ala Ala Phe Phe Ile Gln Ser Leu Ile Asp Tyr Ser Ser Asn 965 970 975 Lys Asp Val Leu Asn Asp Leu Ser Thr Ser Val Lys Val Gln Leu Tyr 980 985 990 Ala Gln Leu Phe Ser Thr Gly Leu Asn Thr Ile Tyr Asp Ser Ile Gln 995 1000 1005 Leu Val Asn Leu Ile Ser Asn Ala Val Asn Asp Thr Ile Asn Val Leu 1010 1015 1020 Pro Thr Ile Thr Glu Gly Ile Pro Ile Val Ser Thr Ile Leu Asp Gly 1025 1030 1035 1040 Ile Asn Leu Gly Ala Ala Ile Lys Glu Leu Leu Asp Glu His Asp Pro 1045 1050 1055 Leu Leu Lys Lys Glu Leu Glu Ala Lys Val Gly Val Leu Ala Ile Asn 1060 1065 1070 Met Ser Leu Ser Ile Ala Ala Thr Val Ala Ser Ile Val Gly Ile Gly 1075 1080 1085 Ala Glu Val Thr Ile Phe Leu Leu Pro Ile Ala Gly Ile Ser Ala Gly 1090 1095 1100 Ile Pro Ser Leu Val Asn Asn Glu Leu Ile Leu His Asp Lys Ala Thr 1105 1110 1115 1120 Ser Val Val Asn Tyr Phe Asn His Leu Ser Glu Ser Lys Lys Tyr Gly 1125 1130 1135 Pro Leu Lys Thr Glu Asp Asp Lys Ile Leu Val Pro Ile Asp Asp Leu 1140 1145 1150 Val Ile Ser Glu Ile Asp Phe Asn Asn Asn Ser Ile Lys Leu Gly Thr 1155 1160 1165 Cys Asn Ile Leu Ala Met Glu Gly Gly Ser Gly His Thr Val Thr Gly 1170 1175 1180 Asn Ile Asp His Phe Phe Ser Ser Pro Ser Ile Ser Ser His Ile Pro 1185 1190 1195 1200 Ser Leu Ser Ile Tyr Ser Ala Ile Gly Ile Glu Thr Glu Asn Leu Asp 1205 1210 1215 Phe Ser Lys Lys Ile Met Met Leu Pro Asn Ala Pro Ser Arg Val Phe 1220 1225 1230 Trp Trp Glu Thr Gly Ala Val Pro Gly Leu Arg Ser Leu Glu Asn Asp 1235 1240 1245 Gly Thr Arg Leu Leu Asp Ser Ile Arg Asp Leu Tyr Pro Gly Lys Phe 1250 1255 1260 Tyr Trp Arg Phe Tyr Ala Phe Phe Asp Tyr Ala Ile Thr Thr Leu Lys 1265 1270 1275 1280 Pro Val Tyr Glu Asp Thr Asn Ile Lys Ile Lys Leu Asp Lys Asp Thr 1285 1290 1295 Arg Asn Phe Ile Met Pro Thr Ile Thr Thr Asn Glu Ile Arg Asn Lys 1300 1305 1310 Leu Ser Tyr Ser Phe Asp Gly Ala Gly Gly Thr Tyr Ser Leu Leu Leu 1315 1320 1325 Ser Ser Tyr Pro Ile Ser Thr Asn Ile Asn Leu Ser Lys Asp Asp Leu 1330 1335 1340 Trp Ile Phe Asn Ile Asp Asn Glu Val Arg Glu Ile Ser Ile Glu Asn 1345 1350 1355 1360 Gly Thr Ile Lys Lys Gly Lys Leu Ile Lys Asp Val Leu Ser Lys Ile 1365 1370 1375 Asp Ile Asn Lys Asn Lys Leu Ile Ile Gly Asn Gln Thr Ile Asp Phe 1380 1385 1390 Ser Gly Asp Ile Asp Asn Lys Asp Arg Tyr Ile Phe Leu Thr Cys Glu 1395 1400 1405 Leu Asp Asp Lys Ile Ser Leu Ile Ile Glu Ile Asn Leu Val Ala Lys 1410 1415 1420 Ser Tyr Ser Leu Leu Leu Ser Gly Asp Lys Asn Tyr Leu Ile Ser Asn 1425 1430 1435 1440 Leu Ser Asn Thr Ile Glu Lys Ile Asn Thr Leu Gly Leu Asp Ser Lys 1445 1450 1455 Asn Ile Ala Tyr Asn Tyr Thr Asp Glu Ser Asn Asn Lys Tyr Phe Gly 1460 1465 1470 Ala Ile Ser Lys Thr Ser Gln Lys Ser Ile Ile His Tyr Lys Lys Asp 1475 1480 1485 Ser Lys Asn Ile Leu Glu Phe Tyr Asn Asp Ser Thr Leu Glu Phe Asn 1490 1495 1500 Ser Lys Asp Phe Ile Ala Glu Asp Ile Asn Val Phe Met Lys Asp Asp 1505 1510 1515 1520 Ile Asn Thr Ile Thr Gly Lys Tyr Tyr Val Asp Asn Asn Thr Asp Lys 1525 1530 1535 Ser Ile Asp Phe Ser Ile Ser Leu Val Ser Lys Asn Gln Val Lys Val 1540 1545 1550 Asn Gly Leu Tyr Leu Asn Glu Ser Val Tyr Ser Ser Tyr Leu Asp Phe 1555 1560 1565 Val Lys Asn Ser Asp Gly His His Asn Thr Ser Asn Phe Met Asn Leu 1570 1575 1580 Phe Leu Asp Asn Ile Ser Phe Trp Lys Leu Phe Gly Phe Glu Asn Ile 1585 1590 1595 1600 Asn Phe Val Ile Asp Lys Tyr Phe Thr Leu Val Gly Lys Thr Asn Leu 1605 1610 1615 Gly Tyr Val Glu Phe Ile Cys Asp Asn Asn Lys Asn Ile Asp Ile Tyr 1620 1625 1630 Phe Gly Glu Trp Lys Thr Ser Ser Ser Lys Ser Thr Ile Phe Ser Gly 1635 1640 1645 Asn Gly Arg Asn Val Val Val Glu Pro Ile Tyr Asn Pro Asp Thr Gly 1650 1655 1660 Glu Asp Ile Ser Thr Ser Leu Asp Phe Ser Tyr Glu Pro Leu Tyr Gly 1665 1670 1675 1680 Ile Asp Arg Tyr Ile Asn Lys Val Leu Ile Ala Pro Asp Leu Tyr Thr 1685 1690 1695 Ser Leu Ile Asn Ile Asn Thr Asn Tyr Tyr Ser Asn Glu Tyr Tyr Pro 1700 1705 1710 Glu Ile Ile Val Leu Asn Pro Asn Thr Phe His Lys Lys Val Asn Ile 1715 1720 1725 Asn Leu Asp Ser Ser Ser Phe Glu Tyr Lys Trp Ser Thr Glu Gly Ser 1730 1735 1740 Asp Phe Ile Leu Val Arg Tyr Leu Glu Glu Ser Asn Lys Lys Ile Leu 1745 1750 1755 1760 Gln Lys Ile Arg Ile Lys Gly Ile Leu Ser Asn Thr Gln Ser Phe Asn 1765 1770 1775 Lys Met Ser Ile Asp Phe Lys Asp Ile Lys Lys Leu Ser Leu Gly Tyr 1780 1785 1790 Ile Met Ser Asn Phe Lys Ser Phe Asn Ser Glu Asn Glu Leu Asp Arg 1795 1800 1805 Asp His Leu Gly Phe Lys Ile Ile Asp Asn Lys Thr Tyr Tyr Tyr Asp 1810 1815 1820 Glu Asp Ser Lys Leu Val Lys Gly Leu Ile Asn Ile Asn Asn Ser Leu 1825 1830 1835 1840 Phe Tyr Phe Asp Pro Ile Glu Phe Asn Leu Val Thr Gly Trp Gln Thr 1845 1850 1855 Ile Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asp Ile Asn Thr Gly Ala Ala Leu 1860 1865 1870 Thr Ser Tyr Lys Ile Ile Asn Gly Lys His Phe Tyr Phe Asn Asn Asp 1875 1880 1885 Gly Val Met Gln Leu Gly Val Phe Lys Gly Pro Asp Gly Phe Glu Tyr 1890 1895 1900 Phe Ala Pro Ala Asn Thr Gln Asn Asn Asn Ile Glu Gly Gln Ala Ile 1905 1910 1915 1920 Val Tyr Gln Ser Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe 1925 1930 1935 Asp Asn Asn Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp Arg Ile Ile Asn Asn Glu 1940 1945 1950 Lys Tyr Tyr Phe Asn Pro Asn Asn Ala Ile Ala Ala Val Gly Leu Gln 1955 1960 1965 Val Ile Asp Asn Asn Lys Tyr Tyr Phe Asn Pro Asp Thr Ala Ile Ile 1970 1975 1980 Ser Lys Gly Trp Gln Thr Val Asn Gly Ser 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Claims (5)

1. 삭제
2. 클로스트리디움 디피실 독소단백질에 키위 추출액을 처리하여 반응시키는 반응단계; 및
   상기 반응단계 이후 65 ~ 75 kDa 범위의 분자량을 갖는 펩타이드를 분리하는 분리단계를 포함하는 무독성의 클로스트리디움 디피실 독소단백질-단편의 제조방법.
3. 제2항에 있어서,
   상기 키위 추출액은 키위의 과육 부분을 파쇄한 다음, 파쇄물에 초음파 처리 후 원심분리하여 얻은 상등액을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제2항에 있어서,
   상기 반응단계는 35 ~ 40℃에서 20 ~ 28시간 동안 반응시키는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 삭제

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